CN111315398A - 白介素-10与免疫检查点途径抑制剂的组合的组合物和使用方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了治疗哺乳动物受试者中的肿瘤疾病的方法，所述方法包括将施用IL‑10试剂与施用至少一种免疫检查点途径的至少一种调节剂组合。本公开进一步提供了用于***疾病(其中所述肿瘤具有低或中等肿瘤突变负荷、低或中等水平的免疫检查点分子的表达)或转移性肿瘤疾病的方法。

Description

白介素-10与免疫检查点途径抑制剂的组合的组合物和使用 方法

本发明涉及使用IL-10试剂与免疫检查点途径抑制剂的组合来治疗或预防疾病和病症(包括癌症和免疫相关病症)的方法。

细胞因子白介素-10 (IL-10)是通过对T细胞、B细胞、巨噬细胞以及抗原呈递细胞(APC)的作用来调节多种免疫应答的多效性细胞因子。IL-10可以通过抑制IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、GM-CSF以及G-CSF在活化的单核细胞和活化的巨噬细胞中的表达来阻抑免疫应答，并且它还通过NK细胞来阻抑IFN-γ的产生。尽管IL-10主要在巨噬细胞中表达，但在活化的T细胞、B细胞、肥大细胞以及单核细胞中也检测到表达。除了阻抑免疫应答以外，IL-10表现出免疫刺激特性，包括刺激IL-2和IL-4治疗的胸腺细胞的增殖、增强B细胞的活力以及刺激MHC II类的表达。

由于其多效性活性，IL-10已与广泛范围的疾病、病症和病况联系起来，所述疾病、病症和病况包括炎性病况、免疫相关病症、纤维变性病症、代谢病症以及癌症。针对许多此类疾病、病症和病况用IL-10进行的临床和预临床评估已经巩固了其在多种应用中的治疗中的治疗潜力。此外，IL-10的变体，诸如聚乙二醇化的IL-10，已在多种治疗应用(包括癌症的治疗)中证明效力(参见例如，美国专利号8,865,652和9,364,517)。

癌细胞特征性的广泛范围的遗传和表观遗传变化提供了一组不同的抗原，免疫***可以使用所述组抗原来将肿瘤细胞与其正常相应物区分开。在T细胞介导的应答的情况下，由T细胞受体(TCR)的抗原识别引发的免疫应答的幅度(例如，细胞因子产生或增殖的水平)和质量(例如，产生的免疫应答的类型，诸如细胞因子产生的模式)通过共刺激信号和抑制信号之间的平衡来调节。尽管调节T细胞活化的共刺激性和抑制性受体和配体在癌症中相对于正常组织往往不是过表达的，但调节组织中的T细胞效应子功能的抑制性配体和受体在肿瘤细胞上或与肿瘤微环境相关的非转化细胞上是通常过表达的。

T细胞介导的免疫包括多个连续步骤，其中每个步骤通过平衡刺激信号和抑制信号来调节以便优化应答。在正常条件下，刺激性和抑制性的平衡在预防自身免疫(即维持自身耐受性)和确保适当的应答中发挥重要作用，当免疫***响应于病原体感染时，所述应答使组织损伤最小化。尽管免疫应答的几乎所有刺激或抑制信号最终都调节细胞内信号传导途径，但许多是通过膜受体引发的，所述膜受体的配体是膜结合的或可溶的。

免疫检查点途径是指整合至免疫***中的一系列途径，所述抑制性途径对于维持自身耐受性和调节外周组织中的生理免疫应答的持续时间和幅度以便使附带组织损伤最小化而言是至关重要的。在一些情况下，肿瘤将对某些免疫检查点途径的控制假定为免疫抵抗、尤其是针对对于肿瘤抗原特异性的T细胞的主要机制。参见，例如，Stagg和Allard,(2013) Ther. Adv. Med. Oncol. 5(3):169-81。因为通过许多免疫检查点途径的信号传导由配体-受体相互作用引发，所以免疫检查点途径可以通过各种试剂(诸如抗体、配体或受体的重组形式以及小分子化合物)进行调节。与目前批准用于癌症治疗的大多数针对肿瘤特异性抗原的抗体相对比，免疫检查点的调节剂并不直接靶向肿瘤细胞，而是靶向淋巴细胞受体或其配体以便调节内源性抗肿瘤活性。参见Pardoll, (2012) Nature Rev.Cancer 12:252-64。

也许，免疫检查点途径及其与癌症的关系的最深入研究的实例是PD1途径。通过PD1(程序性细胞死亡蛋白1；也称为CD279)与其对应物PDL1(PD1配体；也称为B7-H1)的相互作用活化的免疫检查点途径负调节T细胞。PD1限制组织内的T细胞效应子功能。肿瘤可以通过表达PD-L1逃脱宿主免疫监视，所述PD-L1通过与T细胞上的PD1相互作用来负调节免疫应答。Iwai Y, 等人(2002) PNAS(USA) 99:12293–7。通过上调PDL1的表达，肿瘤细胞可以阻断肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫应答并诱导T细胞耗尽。来自临床样品的数据证明，PD1配体在肿瘤上的表达升高与预后不良相关。Thompson RH, 等人 (2004) PNAS(USA) 101:17174–9; 和Thompson RH, 等人 (2007) PNAS(USA) 19:813–24。干扰PD1/PDL1结合的试剂的施用导致PD1免疫检查点途径的抑制，从而逆转T细胞的耗尽，恢复细胞因子产生并加强抗原依赖性T细胞的扩增。干扰PD1与PDL1和/或PDL2的结合的试剂已在许多疾病、病症和病况(包括移植，感染，肿瘤和自身免疫性疾病)中证明效用和/或前景(Wu等人, (2012)Int. J. Biol. Sci. 8:1420-30)。

然而，此类免疫检查点途径调节剂的临床有效性在一些肿瘤中，尤其是在具有低肿瘤突变负荷的那些肿瘤中以及在其中PDL1和/或IFNγ相关的基因表达低的那些肿瘤中，显示减弱的效力。本发明提供了采用IL-10试剂和免疫检查点途径的调节剂的联合作用来***疾病的组合物和方法。

本公开提供了治疗哺乳动物受试者中的肿瘤疾病的方法，所述方法包括将施用IL-10试剂与施用至少一种免疫检查点途径的至少一种调节剂组合。

本公开进一步提供了治疗哺乳动物受试者中的肿瘤疾病的方法，所述方法包括将施用IL-10试剂与施用至少一种免疫检查点途径的至少一种调节剂组合，其中肿瘤具有低或中等的肿瘤突变负荷。

本公开进一步提供了治疗哺乳动物受试者中的肿瘤疾病的方法，所述方法包括将施用IL-10试剂与施用至少一种免疫检查点途径的至少一种调节剂组合，其中所述肿瘤具有低或中等水平的免疫检查点分子的表达。

本公开进一步提供了治疗哺乳动物受试者中的转移性肿瘤疾病的方法，所述方法包括将施用IL-10试剂与施用至少一种免疫检查点途径的至少一种调节剂组合。

本公开进一步提供了治疗哺乳动物受试者中的肿瘤疾病的方法，所述方法包括施用IL-10试剂与PD1免疫检查点途径抑制剂的组合。

本公开进一步提供了治疗哺乳动物受试者中的肿瘤疾病的方法，所述方法包括施用IL-10试剂与派姆单抗组合用于***疾病。

在另一个实施方案中，本发明提供了IL-10试剂与尼沃单抗组合的药物制剂，其用于治疗癌症。

图1提供了人临床试验中获得的结果的图形说明，所述人临床试验经设计以评估患有非小细胞肺癌(NSCLC)的受试者对IL-10试剂(AM0010)与抗PD1抗体尼沃单抗和派姆单抗的组合的施用关于肿瘤PDL1表达和肿瘤突变负荷的应答。该图说明AM0010与抗PD1抗体治疗的组合的施用在具有低或中等肿瘤突变负荷和低或中等PDL1表达水平的患者中有效地产生有利的临床效果。

图2提供了人临床试验中获得的结果的图形说明，所述人临床试验评估患有非小细胞肺癌(NSCLC)的受试者对IL-10试剂(AM0010)与抗PD1抗体尼沃单抗和派姆单抗的组合关于包含基因STAT1、HLA-DRA、CXCL9、IDO、IFN-γ和CXCL10的表达干扰素γ基因表达概况和肿瘤突变负荷的应答。该图说明AM0010与抗PD1抗体治疗的组合的施用在具有低IFN-γ表达概况和低PDL1表达水平的患者中有效地产生有利的临床效果。

图3提供了人临床试验中获得的结果的图形说明，所述人临床试验经设计以评估患有非小细胞肺癌(NSCLC)的受试者对IL-10试剂(AM0010)和抗PD1抗体尼沃单抗和派姆单抗的组合随着组合治疗的治疗的持续时间的肿瘤负荷(百分比)的变化，如下更充分描述。

图4提供了人临床试验中获得的结果的图形说明，所述人临床试验经设计以评估患有肾细胞癌(RCC)的受试者对IL-10试剂(AM0010)和抗PD1抗体尼沃单抗和派姆单抗的组合的施用随着组合治疗的治疗的持续时间的肿瘤负荷(百分比)的变化，如下更充分描述。

图5(小图A和B)提供了在根据下文更充分描述的治疗方案用IL-10试剂(AM0010)和派姆单抗抗PD1治疗的组合治疗前(小图A)和治疗7个月后(小图B)从患有非小细胞肺癌(NSCLC)的受试者的人临床试验获得的肝组织的组织学检查。图5(小图A)中的箭头举例说明肝脏中存在转移性病变。小图B举例说明，响应于IL-10试剂和免疫检查点途径的调节剂的组合的施用，此类病变已经被显著减少或消除。

图6提供了通过从患有非小细胞肺癌(NSCLC)的人临床试验受试者获得的肝组织的组织学检查确定的可测量的肝病变的数目随着根据下文更充分地描述的治疗方案用AM0010和派姆单抗的组合治疗的周数的变化的图形表示。该图举例说明，AM0010和派姆单抗的组合导致NSCLC患者中的可测量肝病变的显著减少，表明IL-10试剂和免疫检查点途径调节剂的组合的施用在转移性疾病的治疗中的有效性。

在进一步描述本公开之前，应理解本公开不限于本文阐述的具体实施方案，并且还应理解本文所使用的术语仅是出于描述具体实施方案的目的，而不意在限制性。

在提供数值范围的情况下，应理解在该范围的上下限和在该规定范围的任何其他规定或中间值之间的各个中间值(除非上下文另外明确地规定，否则至下限的单位的十分之一)都涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也涵盖在本发明内，受限于所述规定范围内任何明确排除在外的界限。当规定的范围包括一个或两个限值时，排除那些包括的限值中的任一个或两个限值的范围也包括在本发明中。除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

必须注意，如在本文中和在所附权利要求中所使用，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“所述(the)”包括复数指代，除非上下文另外清楚地指出。应进一步注意，所述权利要求可以经拟订以排除任何任选的要素。因此，本声明意图用作与权利要求要素的叙述相关的此类排除性术语诸如“只是”、“仅仅”的使用或“否定”限制的使用的前提基础。

除非另外指出，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度(℃)并且压力是大气压或接近大气压。使用标准缩写，包括以下：bp = 碱基对；kb = 千碱基；pl =皮升；s或sec = 秒；min = 分钟；h或hr = 小时；aa = 氨基酸；kb = 千碱基；nt = 核苷酸；pg = 皮克；ng = 纳克；μg = 微克；mg = 毫克；g = 克；kg = 千克；dl或dL = 分升；μl或μL= 微升；ml或mL = 毫升；l或L = 升；μM = 微摩尔；mM = 毫摩尔；M = 摩尔；kDa = 千道尔顿；i.m. =肌肉内(地)；i.p. = 腹膜内(地)；SC或SQ = 皮下(地)；QD = 每天；BID = 每天两次；QW = 每周；QM = 每月；HPLC = 高效液相色谱法；BW = 体重；U = 单位；ns = 无统计学意义；PBS = 磷酸盐缓冲盐水；PCR = 聚合酶链反应；NHS = N-羟基琥珀酰亚胺；HSA =人血清白蛋白；MSA = 小鼠血清白蛋白；DMEM = 杜氏改良培养基；GC = 基因组拷贝；EDTA= 乙二胺四乙酸。

分子生物学中的标准方法被描述于科学文献(参见，例如，Sambrook和Russell(2001) Molecular Cloning，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor，N.Y.；以及Ausubel等人，(2001) Current Protocols in MolecularBiology, 第1-4卷，John Wiley and Sons, Inc. New York, N.Y.，其描述了细菌细胞中的克隆和DNA诱变(第1卷)、哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)、糖缀合物和蛋白表达(第3卷)以及生物信息学(第4卷))。

所述科学文献描述了用于蛋白纯化的方法，包括免疫沉淀反应、色谱法、电泳、离心和结晶，以及化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生以及蛋白的糖基化(参见，例如，Coligan等人，(2000) Current Protocols in Protein Science，第1-2卷，JohnWiley and Sons, Inc., NY)。

除非另外指明，否则以下术语意图具有下文阐述的含义。在整个说明书的其他地方定义了其他术语。

如本文所使用，术语“活性”是指当分子与另一分子接触时导致可测量的应答的分子的特性。分子的“活性”的实例包括但不限于：(a)分子结合配体或受体的能力；(b)分子诱导或抑制酶的催化活性的能力；(c)分子刺激基因表达或细胞信号转导、 分化或成熟的能力；抗原性活性；(d)分子调节其他分子的活性的能力。“活性”可以被定量，并且通常表示为相对于分子数量的作用程度，例如，[催化活性]/[mg蛋白]或[免疫活性]/[mg蛋白]。术语“生物活性”用于描述试剂在生物***中的活性。

如本文所使用，术语“施用(administration)”和“施用(administer)”可互换使用，是指使受试者与试剂接触(包括使受试者的体外、体内或离体细胞、组织、器官或生物流体与试剂接触)的行为。当所述试剂是IL-10试剂时，术语“施用(administration)”、“施用(administer)”和“治疗”它是指受试者或受试者的细胞、组织、器官或生物流体在体外、体内或离体与包含IL-10试剂的组合物的接触。试剂的施用可以通过各种本领域公认的方法中的任一种来实现，所述方法包括但不限于局部，静脉内，包括静脉内输注，皮内，皮下，肌肉内，腹膜内，颅内，肿瘤内，皮下，经皮，经粘膜，***内，胃内，***内，血管内，包括静脉内，动脉内，膀胱内(至膀胱)，离子电渗疗法，呼吸，眼内，腹内，病变内，卵巢内，脑内，心脑室注射(iracerebroventricular injection, ICVI)等。术语“施用”包括试剂与细胞的接触以及试剂与流体的接触，其中流体与细胞接触。

如本文所使用，术语“不良事件”是指与在患者中使用化合物相关的任何不期望的经历。不良事件不一定是由化合物引起。不良事件可以是轻度、中度或严重的。如本文所使用的不良事件的分类根据美国卫生与公共服务部、美国国立卫生研究院国立癌症研究所在2010年6月14日发布的不良事件的通用术语标准v4.03 (CTCAE)。

如本文所使用，术语“激动剂”是指与靶标相互作用以引起或促进靶标的活化的增加的分子。活化剂或激动剂是增加、活化、促进、增强活化、敏化或上调例如基因、蛋白、配体、受体、生物学途径(包括免疫检查点途径)或细胞的分子。

如本文所使用，术语“拮抗剂”或“抑制剂”是指与激动剂的作用相反的分子。拮抗剂防止、减少、抑制或中和激动剂的活性，并且拮抗剂甚至在不存在鉴别的激动剂的情况下也可以防止、抑制或减少靶标例如靶标受体的组成型活性。抑制剂是减少、阻断、阻止、延迟活化、失活、脱敏或下调例如基因、蛋白、配体、受体、生物学途径(包括免疫检查点途径)或细胞的分子。

如本文所使用，术语“抗体”统指：(a)特异性结合靶标分子的糖基化和非糖基化免疫球蛋白(包括但不限于哺乳动物免疫球蛋白类别IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)和(b)免疫球蛋白衍生物，包括但不限于IgG(1-4)δC_H2、F(ab’)₂、Fab、ScFv、V_H、V_L、四体、三体、双体、dsFv、F(ab’)₃、scFv-Fc和(scFv)₂，其与其所衍生的免疫球蛋白竞争结合靶标分子。术语抗体不限于源自任何特定哺乳动物物种的免疫球蛋白，并且包括鼠、人、马、骆驼和人抗体。术语“抗体”涵盖可从天然来源分离的天然存在的抗体以及工程改造的抗体，包括单克隆抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、CDR-移植的、镶饰的(veneered)或去免疫的(例如，以除去T细胞表位)抗体。术语“抗体”不应解释为限于任何特定的合成方式，并且包括可从天然来源分离的天然存在的抗体，以及通过“重组”方式获得的工程改造的抗体分子，包括从对于人免疫球蛋白基因转基因的转基因动物或由其制备的杂交瘤分离的抗体，从用导致抗体的表达的核酸构建体转化的宿主细胞分离的抗体，从组合抗体文库(包括噬菌体展示文库)分离的抗体。在一个实施方案中，“抗体”是哺乳动物免疫球蛋白，其为包含提供结合和效应子功能的可变和恒定结构域的“全长抗体”。在大多数情况下，全长抗体包含两条轻链和两条重链，每条轻链都包含可变区和恒定区。在一个实施方案中，所述抗体是包含两条轻链和两条重链的“全长抗体”，每条轻链都包含提供结合和效应子功能的可变区和恒定区。在一个优选实施方案中，所述恒定区和可变区是“人”的(即具有人免疫球蛋白特征性的氨基酸序列)。

如本文所使用，术语“循环肿瘤细胞(CTC)”是指从肿瘤块脱落至外周循环中的肿瘤细胞。

如本文所使用，术语“相当的”用于描述可评估参数的两次测量中的差异程度。例如，在可评估参数(例如，如通过IL-10测定法所测定的IL-10活性)的第一测量值和可评估参数的第二测量值不偏离超过可接受范围(即，技术人员会认识到在该情况下在两个结果之间没有产生效果的统计学显著差异的范围)的情况下，两个测量值将被视为“相当的”。在一些情况下，如果一个测量值与另一个偏离小于35%、小于30%、小于25%、小于20%、小于15%、小于10%、小于7%、小于5%、小于4%、小于3%、小于2%或小于1%，则测量值可以被认为是“相当的”。在具体实施方案中，如果一个测量值与参考标准的偏差小于15%、小于10%或小于5%，所述结果与参考标准是相当的。

如本文所使用，关于靶标病变的术语“完全应答(CR)”、“部分应答(PR)”、“疾病稳定(SD)”和“疾病进展(PD)”以及关于非靶标病变的术语“完全应答(CR)、“不完全应答/疾病稳定(SD)”和疾病进展(PD)被理解为如RECIST标准中所定义。

如本文所使用的术语“衍生自”在氨基酸序列或多核苷酸序列(例如，“衍生自”IL-10多肽的氨基酸序列)的背景下意指多肽或核酸具有基于参考多肽或核酸(例如，天然存在的IL-10多肽或IL-10-编码核酸)的序列的序列，并且不意图对产生蛋白或核酸的来源或方法作出限制。通过实例的方式，术语“衍生自”包括参考氨基酸或DNA序列的同源物或突变蛋白。

如本文所使用，术语“驱动子突变”是指肿瘤性细胞中的突变，其有助于肿瘤的生长和存活且由此赋予选择性优势。

如本文所使用，术语“免疫相关的完全应答(irCR)”、“免疫相关的部分应答(irPR)”、“免疫相关的疾病进展(irPD)”和“免疫相关的疾病稳定(irSD)”如根据免疫相关应答标准(irRC)所定义。

如本文所使用，术语“DNA”、“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”等在本文中可互换使用来意指任何长度的核苷酸的聚合形式(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其类似物。多核苷酸的非限制性实例包括线性和环状核酸、信使RNA (mRNA)、互补DNA (cDNA)、重组多核苷酸、载体、探针、引物等。

如本文所使用，术语“免疫相关应答标准(irRC)”是指如Wolchok等人 (2009)Guidelines for the Evaluation of Immune Therapy Activity in Solid Tumors: Immune-Related Response Criteria, Clinical Cancer Research 15(23): 7412-7420中所述的用于评估对免疫治疗的应答的***。

如本文所使用，术语“与…组合”是指将第一试剂和第二试剂施用于受试者。为了本发明的目的，如果在施用第二药物时由第一试剂的施用导致的生物作用在受试者中持续、使得所述第一试剂和第二试剂的治疗效果重叠，则一种试剂(例如和IL-10试剂)被认为与第二试剂(例如免疫检查点途径的调节剂)组合施用。例如，PD1免疫检查点抑制剂(例如，尼沃单抗或派姆单抗)通常每两周或每三周通过IV输注施用，同时本发明所考虑的与此类分子组合的试剂、诸如hIL-10或聚乙二醇化的hIL-10通常每天皮下施用。然而，第一试剂的施用在延长的时间内提供了治疗效果，而第二试剂的施用提供了其治疗效果，而第一试剂的治疗效果仍然在进行，使得第二试剂被认为与第一试剂组合施用，即使第一试剂可能已经在与第二试剂的施用时间相距很远(例如数天或数周)的时间点施用。在一个实施方案中，如果第一试剂和第二试剂同时(在彼此的30分钟内)、同期或依次施用，则一种试剂(例如和IL-10试剂)被认为与第二试剂(例如免疫检查点途径的调节剂)组合施用。在本发明的背景下，在分子的作用的持续时间显著的情况下，如果第一试剂和第二试剂在彼此的约24小时内、优选在彼此的约12小时内、优选在彼此的约6小时内、优选在彼此的约2小时内或优选在彼此的约30分钟内，则第一试剂被认为与第二试剂“同期”施用。术语“与…组合”也应被理解为适用于这样的情况，其中将第一药物(例如PEG-IL-10药物)和第二药物(例如PD1免疫检查点抑制剂拮抗剂抗体)共同配制于单一药学上可接受的制剂(例如用于IV施用的缓冲的等渗溶液)中，并且将共制剂施用于受试者。

如本文所使用，关于待施用于需要治疗的受试者的治疗剂的量使用术语“以足以实现改变的量”，使得在施用特定治疗剂之前(例如，基线水平)和之后测量的指标的水平之间存在可检测的差异。指标包括任何客观参数(包括但不限于irCR、irRC应答标准、CR、PR或SD RECIST应答标准)或主观参数(例如，受试者的健康感)。

如本文所使用，术语“需要预防”是指根据医师的判断，基于在确定发展病理性病况的可能性的领域中接受的可用信息，对于治疗过程确定所述受试者需要预防性护理或将从预防性护理受益。

如本文所使用，术语“需要治疗”是指医师基于用于鉴别疾病、病症或病况的领域中接受的可用信息(包括但不限于X-射线、CT-扫描、常规实验室诊断测试(例如血液计数等)、基因组数据、蛋白表达数据、免疫组织化学)关于受试者确定所述受试者需要治疗或将从治疗受益。

如本文所使用，术语“肿瘤内异质性(ITH)”是指肿瘤内或同一患者的单独肿瘤病变之间的遗传和表型变异。

如本文所使用，术语“富含”意指样品不是天然操纵的(例如，由科学家操纵)，使得目标分子(例如，多肽)以：(a)比起始样品诸如生物样品(例如，多肽天然地存在其中或多肽在施用之后才存在其中的样品)中的目标分子的浓度更大的浓度(例如，至少大3倍、至少大4倍、至少大8倍、至少大64倍、或更多倍)存在；或(b)比在其中制备目标分子的环境(例如，重组细菌细胞)更大的浓度存在。

如本文所使用，术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”、“预防(prevention)”等是指以下作用过程(诸如施用IL-10或包含IL-10的药物组合物)，所述作用过程以一种方式(例如，在疾病、病症、病况或其症状发作之前)引发以便暂时地或永久性地防止、阻抑、抑制或减缓受试者发生疾病、病症、病况等的风险(如通过例如临床症状的消失来确定)，或者通常在受试者有患有特定疾病、病症或病况的倾向的情况下延迟它们的发作。

如本文所使用，术语“转移”描述癌细胞从原发性肿瘤向周围组织以及向远处器官的扩散。

如本文所使用，术语“调节(modulate)”、“调节(modulation)”等是指试剂在***(包括生物***或生物化学途径)中实现应答(阳性或阴性或直接或间接)的能力。术语调节剂包括激动剂和拮抗剂。

如本文所使用，术语“下一代测序(NGS)”是指使用大规模平行处理的过程而不是对单独DNA链进行测序的几种高通量DNA测序方法中的任一种。

如本文所使用，术语“肿瘤疾病”是指受试者中由于细胞过度增殖或细胞调节上调(或失调)而引起的病症或病况。术语肿瘤疾病是指由于受试者中的肿瘤的存在而引起的病症。肿瘤可以被分类为：(1)良性，(2)恶性前(或“癌前”)；或(3)恶性(或“癌性”)。适于使用本发明的组合物和方法治疗的良性肿瘤的实例包括但不限于腺瘤、纤维瘤、血管瘤和脂质瘤。适于使用本发明的组合物和方法治疗的恶性前肿瘤的实例包括但不限于增生、非异性、化生和发育不良。适于使用本发明的组合物和方法治疗的恶性肿瘤的实例包括但不限于癌(源自上皮组织、诸如皮肤或内衬内脏器官的组织的癌)，白血病，淋巴瘤和通常源自骨骼脂肪、肌肉、血管或***的肉瘤)。术语“肿瘤疾病”包括癌症，诸如乳腺癌；肉瘤(包括但不限于骨肉瘤和血管肉瘤)和纤维肉瘤)，白血病，淋巴瘤，泌尿生殖***癌症(包括但不限于卵巢癌、尿道癌、膀胱癌和***癌)；胃肠道癌(包括但不限于结肠食道癌和胃癌)；肺癌；骨髓瘤；胰腺癌；肝癌；肾癌；内分泌癌；皮肤癌；以及脑或中枢和外周神经(CNS)***肿瘤(恶性或良性)，包括神经胶质瘤和神经母细胞瘤，星形细胞瘤，骨髓增生病症；宫颈原位癌；肠息肉病；黏膜白斑病；组织细胞增多病、过度增生性瘢痕，包括瘢瘤性疤痕，血管瘤；过度增生性动脉狭窄，牛皮癣，炎性关节炎；角化过度和丘疹鳞屑性爆发，包括关节炎。还包括病毒诱导的肿瘤，诸如疣和EBV诱导的疾病(即，传染性单核细胞增多症)，疤痕形成，过度增生性血管疾病，包括内膜平滑肌细胞增生，再狭窄和血管闭塞等。术语“肿瘤疾病”包括骨髓瘤和淋巴瘤。每个类别含有不同类型的具有定义的形态学、病理学、治疗和/或预后特征的造血细胞癌。正确的分类连同可能影响预后或对化疗的反应的另外的因子的鉴别对于允许最佳治疗而言是必要的。骨髓瘤包括但不限于骨髓增殖性肿瘤、嗜酸粒细胞增多的骨髓细胞和淋巴细胞病症、骨髓增殖/骨髓增殖异常肿瘤、骨髓增殖异常综合征、急性髓细胞性白血病和相关前体肿瘤以及谱系未定的急性白血病。淋巴瘤包括但不限于前体淋巴瘤、成熟B细胞瘤、成熟T细胞瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s Lymphoma)以及免疫缺陷相关的淋巴组织增殖性病症。造血***的其他癌症包括但不限于组织细胞和树突细胞瘤。术语“肿瘤疾病”包括肿瘤相关的疾病、病症和病况，是指与肿瘤疾病直接或间接相关的病况，并且包括例如血管生成和癌前病况，诸如发育不良。

如本文所使用，术语“癌基因成瘾”是指其中癌细胞的存活取决于突变的癌基因的继续活性的现象。

如本文所使用，术语“过客突变”是指在肿瘤发展期间由于突变率增加而产生、但对肿瘤的生长没有贡献的突变。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，是指作为任何长度的氨基酸的聚合形式的分子，包括已被化学或生物化学修饰的那些分子。多肽可以并入天然存在的氨基酸，非天然存在的氨基酸，或衍生化的氨基酸，以及诸如通过并入非酰胺键具有修饰的多肽主链的多肽。术语多肽包括融合蛋白，包括，但不限于，由衍生自不同来源的结构域构成的融合蛋白，具有信号肽前导序列的成熟蛋白的前体形式；由直接重组表达产生的具有N-末端甲硫氨酸或N-甲酰基甲硫氨酸残基的多肽；免疫活性的蛋白(例如抗原性白喉或破伤风毒素片段)的融合蛋白；等。

如本文所使用，术语“增殖活性”涵盖促进例如正常细胞***以及癌症、肿瘤、发育异常、细胞转化、肿瘤转移和血管生成，对它们而言必要的或确切地与它们相关的细胞活性。

如本文所使用，术语“减少或抑制”关于试剂单独或组合提供可观察的参数相对于在暴露于试剂之前的预先存在的状态减少20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更大的能力使用。

如本文所使用，术语“应答”是指可评估参数的变化，所述可评估参数包括细胞、组织、器官、生物体或受试者响应于试剂的施用的客观(例如生物化学或生理参数)或主观(例如健康感)。

如本文所使用，术语“实体瘤的应答评估标准(RECIST)”是指如以下中所述的规则集合：Therasse, 等人, (2000) New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors (RECIST Guidelines) J. Natl. Cancer Inst. 92:205–216，如Eisenhauer, 等人, (2009) New response evaluation criteria in solid tumours: Revised RECIST guideline (version 1.1) European Journal of Cancer 45(2):228-247中所更新。

如本文所使用，术语“RNA测序(RNA-Seq)”是指使用NGS来测定样品中的转录组或RNA转录物的完整集合的序列。

术语“特异性结合”在本文中用于指一个分子结合另一个的选择性或亲和力的程度。在结合对(例如配体/受体、抗体/抗原、抗体/配体、抗体/受体结合对)的背景下，当结合对的第一分子不以显著量结合样品中存在的其他组分时，结合对的第一分子被称为特异性结合结合对的第二分子。当第一分子对于第二分子的亲和力比第一分子对于样品中存在的其他组分的亲和力大至少两倍、大至少十倍、大至少20倍或大至少100倍时，结合对的第一分子被称为特异性结合结合对的第二分子。在一个具体实施方案中，在结合对的第一分子是抗体的情况下，如果抗体对于结合对的第二分子的亲和力大于约10⁹升/摩尔、或者大于约10¹⁰升/摩尔、大于约10¹¹升/摩尔、大于约10¹²升/摩尔(如通过例如Scatchard分析(Munsen, 等人 1980 Analyt. Biochem. 107:220-239)所测定)，则所述抗体特异性结合结合对的第二分子(例如蛋白、抗原、配体或受体)。可以使用本领域中已知的技术(包括但不限于竞争ELISA、BIACORE®测定法和/或KINEXA®测定法)来评价特异性结合。

如本文所使用，术语“小分子”是指分子量小于约10kDa、小于约2kDa、或小于约1kDa的化学化合物。小分子包括但不限于无机分子、有机分子、含有无机组分的有机分子、包含放射性原子的分子以及合成分子。

如本文所使用，术语“体细胞突变”是指由细胞获取的遗传改变，其可以传递至突变细胞的后代，但其不存在于种系DNA(***或卵)中。

如本文所使用，术语“基本上纯的”指示组分(例如，多肽)构成组合物总含量的大于约50%，以及通常总含量的大于约60%。更通常，“基本上纯的”是指总组合物的至少75%、至少85%、至少90%或更多是目标组分的组合物。在一些情况下，所述目标组分将构成组合物的总含量的大于约90%、或大于约95%、或大于约99%。

如本文所使用，术语“受试者”是指人或非人哺乳动物。非人哺乳动物物种的实例包括犬(狗)、马(马)、猫(猫)、猪(猪)、牛(牛)。当受试者是人时，术语“患者”在本文中与术语“受试者”可互换使用。

如本文所使用，术语“治疗有效量”是指当施用于患有疾病、病症或病况的受试者时提供对所述疾病、病症或病况的任何症状、方面或特征的客观积极作用或主观积极作用(例如，受试者的健康感)的试剂的量。有助于确定试剂的治疗有效量的因素包括但不限于可容易鉴别的标记，诸如年龄、重量、性别、总体健康、ECOG评分、可观察的生理参数(例如，体温、血压等)、另外病况(例如糖尿病、代谢综合征)、受试者的分析(例如x-射线、超声、CT-扫描、体液的分析)、生物标志物(诸如炎性细胞因子、IFN-γ、粒酶等)。有助于确定试剂的治疗有效量的另外因素包括但不限于待治疗的特定疾病的特征，包括疾病类型、疾病进展的状态、肿瘤负荷以及治疗方式以及所述组合物与其他试剂的其他共同施用组合施用是否可能导致不相容性或交叉反应。可以在受试者的治疗过程中关于给药方案和/或受试者的病况的评估和前述因素的变化来调整治疗有效量。在一个实施方案中，治疗有效量是当单独或与另一种试剂组合使用时，试剂在向哺乳动物受试者施用的过程中不导致不可逆的严重不良事件的量。

如本文所使用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等是指向受试者施用包含试剂的组合物的行为，其中所述受试者受困于疾病、病症或病况或其症状，以便临时、暂时或永久消除、减少、阻抑、减轻或改善这种疾病、病症或病况的原因或至少一种症状，但不一定指示完全消除困扰受试者的所有病症症状。术语“治疗”包括中止或减慢疾病、病症或病况的进展或抑制其进展至有害或否则不期望的状态。

如本文所使用，如本文所使用的术语“肿瘤突变负荷(TMB)”是指存在于肿瘤样品中的体细胞突变数，其表示为如通过核酸测序测定的每兆碱基的突变数，其中对肿瘤样品中至少0.2兆碱基的核酸进行测序，可替代地其中对肿瘤样品中至少0.5兆碱基的核酸进行测序，可替代地其中对肿瘤样品中至少1兆碱基的核酸进行测序，或者可替代地其中对肿瘤样品中至少5兆碱基的核酸进行测序，或者可替代地其中对肿瘤样品中至少10兆碱基的核酸进行测序。如Chalmers, 等人(2017) Genome Medicine 9:34中所述，使用FoundationOne测定法(Foundation Medicine, Cambridge MA，如描述于Frampton, 等人(2013) Development and validation of a clinical cancer genomic profiling test based on massively parallel DNA sequencing. Nature Biotechnology 31:1023–31;He, 等人 (2016) Integrated genomic DNA/RNA profiling of hematologic malignancies in the clinical setting. Blood 127:3004–14)提高评价低肿瘤突变负荷(低TMB)的准确度，其测序的核酸量更多，但百分比偏差在具有TMB的样品中较低，使得可以通过仅数百个基因的靶向测序有效地鉴别高TMB(在本研究中定义为每兆碱基> 20个突变)，而通过测序的至少0.5 Mb的序列提高中等TMB，而通过肿瘤样品中5兆碱基、可替代地10兆碱基或更多的核酸的测序提高对低TMB的可靠评价。可以通过各种本领域公认的方法(包括部分基因组测序、WES或WGS(其使用NGS))中的任一种来实现评价TMB的测序。如果在肿瘤样品中对基本上整个基因组进行测序，则肿瘤突变负荷可以表示为基因组中的突变的总数。肿瘤突变负荷也可以表示为在肿瘤样品中测序的每兆碱基核酸的突变数。应理解，肿瘤突变负荷的比率在肿瘤疾病间变化，所以应当在给定疾病类型的背景下评价肿瘤突变负荷。例如，某些类型的癌症表现出每兆碱基少于1个突变至每兆碱基数百个突变的宽范围的突变率。一般而言，术语“低肿瘤突变负荷”意指以下肿瘤突变负荷：每测序的兆碱基小于或等于15个突变，每测序的兆碱基小于或等于10个突变，可替代地每测序的兆碱基小于或等于7个突变，可替代地每测序的兆碱基小于或等于5个突变，可替代地每测序的兆碱基小于或等于2个突变，或可替代地每测序的兆碱基小于或等于1个突变。术语“中等肿瘤突变负荷”意指在特定背景下大于应用于术语低突变负荷的肿瘤突变负荷的水平的上限阈值的肿瘤突变负荷。在一些实施方案中，术语中等肿瘤突变负荷大于每测序的兆碱基约15个突变、但小于每测序的兆碱基约100个突变，可替代地大于每测序的兆碱基约10个突变、但小于每测序的兆碱基75个突变，可替代地大于每测序的兆碱基约5个突变、但小于每测序的兆碱基50个突变，可替代地大于每测序的兆碱基约1个突变、但小于每测序的兆碱基30个突变，可替代地大于每测序的兆碱基约1个突变、但小于每测序的兆碱基20个突变。术语高肿瘤突变是超出中等肿瘤突变负荷的以下肿瘤突变负荷：每测序的兆碱基大于或等于100个突变，可替代地每测序的兆碱基大于或等于75个突变，可替代地每测序的兆碱基大于或等于50个突变，可替代地每测序的兆碱基大于或等于30个突变，可替代地每测序的兆碱基大于或等于20个突变，或可替代地每测序的兆碱基大于或等于10个突变。

如本文所使用，“低PD-L1表达”是指小于1%的细胞表面PD-L1表达的水平；“中等PD-L1表达”是指1%至49%的细胞表面PD-L1表达的水平；且“高PD-L1表达”是指等于或大于50%的细胞表面PD-L1表达的水平，其中PD-L1表达根据本领域中可用的方法(诸如Rizzi等人(2015) Science 348:124-128中)进行评价。

如本文所使用，术语“变体”是指多肽的天然存在的衍生物和非天然存在的衍生物，其包含与所述变体所衍生的亲本多肽不同的氨基酸序列。天然存在的变体包括同源物(一个物种与另一个物种的氨基酸或核苷酸序列分别不同的多肽和核酸)以及等位变体(一种物种内的一个个体与另一个个体的氨基酸或核苷酸序列分别不同的多肽和核酸)。包含对氨基酸序列的一个或多个修饰的多肽的非天然存在变体(其中人工引入氨基酸序列中的改变)在本文中被称为“突变蛋白”。示例性IL-10突变蛋白描述于在2015年2月2日公开的Eaton等人，美国专利申请公开号S2015/0038678A1；在2003年10月2日公开的Hansen等人，美国专利申请公开号US203/0186386A1和在2016年3月10日公开的Van Vlasselaer等人，美国专利申请公开号US20160068583 A1。

如本文所使用，术语“全外显子组测序(WES)”是指测定基因组中的蛋白编码基因内的所有外显子的DNA序列的方法。

如本文所使用，术语“全基因组测序(WGS)”是指以单次测序以测定生物体的基因组的完整DNA序列，通常是肿瘤学研究中的体细胞癌基因组。

将了解，贯穿本公开，根据单字母或三字母代码来参考天然存在的氨基酸。为了读者方便，以下表1中提供了单字母和三字母氨基酸代码：

在多肽的结构的背景下，如本文所使用的术语“N-末端”(或“氨基末端”)和“C-末端” (或“羧基末端”)分别是指多肽的氨基最末端和羧基最末端，而术语“N-末端”和“C-末端”分别是指多肽中朝向N-末端和C-末端的氨基酸序列中的相对位置，并且分别可以包括N-末端和C-末端处的残基。“紧邻N-末端”或“紧邻C-末端”是指第一氨基酸残基相对于第二氨基酸残基的位置，其中第一氨基酸残基和第二氨基酸残基共价地结合以提供连续的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明提供了通过施用IL-10试剂(例如，PEG-IL-10)与至少一种免疫检查点途径调节剂的组合来治疗哺乳动物受试者中的肿瘤疾病(例如，癌症)的方法。如本文所使用，术语“免疫检查点途径调节剂”是指在生物***(包括免疫活性哺乳动物)中抑制或刺激免疫检查点途径的活性的分子。免疫检查点途径调节剂可以通过结合免疫检查点蛋白(诸如在抗原呈递细胞(APC)诸如癌细胞和/或免疫T效应子细胞的表面上表达的那些免疫检查点蛋白)而发挥作用，或者可以发挥其对免疫检查点途径中的上游和/或下游反应的作用。例如，免疫检查点途径调节剂可以调节SHP2(一种参与PD-1和CTLA-4信号传导的酪氨酸磷酸酶)的活性。术语“免疫检查点途径调节剂”涵盖能够至少部分下调抑制性免疫检查点的功能的免疫检查点途径调节剂(本文中称为“免疫检查点途径抑制剂”或“免疫检查点途径拮抗剂”)和能够至少部分上调刺激性免疫检查点的功能的免疫检查点途径调节剂(本文中称为“免疫检查点途径效应子”或“免疫检查点途径激动剂”)两者。

在一个实施方案中，与IL-10试剂组合采用的免疫检查点途径调节剂是阴性免疫检查点途径抑制剂/拮抗剂。在另一个实施方案中，与IL-10试剂组合采用的免疫检查点途径调节剂是阳性免疫检查点途径激动剂。在另一个实施方案中，与IL-10试剂组合采用的免疫检查点途径调节剂是免疫检查点途径拮抗剂。

本公开的具体实施方案考虑施用IL-10试剂(例如，PEG-IL-10)与至少一种免疫检查点途径调节剂加上一种或多种另外的抗肿瘤剂(例如，化疗剂)或抗肿瘤治疗方式(例如放射)的组合。另外的试剂的确定将在很大程度上取决于正在治疗的潜在病况的性质(例如，烷化剂诸如顺铂的添加在膀胱癌的治疗中可能是适当的)。下文进一步描述其中结合IL-10试剂和一种或多种免疫检查点途径抑制剂的组合施用一种或多种另外的治疗剂或预防剂(例如，化疗剂)的实施方案。

术语“免疫检查点途径”是指通过抗原呈递细胞(APC)上表达的第一分子(例如，蛋白诸如PD1)与免疫细胞(例如T细胞)上表达的第二分子(例如，蛋白诸如PDL1)的结合而触发的生物应答，所述免疫细胞(例如T细胞)通过免疫应答的刺激(例如，T细胞活性的上调)或抑制(例如，T细胞活性的下调)来调节免疫应答。参与调节免疫应答的结合对的形成的分子通常称为“免疫检查点”。通过此类免疫检查点途径调节的生物应答由细胞内信号传导途径介导，所述细胞内信号传导途径导致下游免疫效应子途径，诸如细胞活化、细胞因子产生、细胞迁移、细胞毒性因子分泌和抗体产生。免疫检查点途径通常由第一细胞表面表达的分子与和免疫检查点途径缔合的第二细胞表面分子的结合(例如，PD1与PDL1的结合，CTLA4与CD28的结合等)触发。免疫检查点途径的活化可以导致免疫应答的刺激或抑制。

其活化导致免疫应答的刺激的免疫检查点途径在本文中称为“阳性免疫检查点途径”。术语阳性免疫检查点途径包括，但不限于，通过ICOSL与ICOS(CD278)、B7-H6与NKp30、CD155与CD96、OX40L与OX40、CD70与CD27、CD40与CD40L和GITRL与GITR的结合介导的生物途径。激动阳性免疫检查点的分子(诸如刺激免疫应答的结合对的组分的天然或合成配体)可用于上调免疫应答。此类阳性免疫检查点激动剂的实例包括但不限于这样的激动剂抗体，其结合T细胞活化受体，诸如ICOS (诸如JTX-2011, Jounce Therapeutics)，OX40 (诸如MEDI6383, Medimmune或)，CD27 (诸如varlilumab, Celldex Therapeutics)，CD40 (诸如dacetuzmumab CP-870,893, Roche, Chi Lob 7/4)，HVEM,，CD28，CD137 4-1BB，CD226和GITR (诸如MEDI1873, Medimmune; INCAGN1876, Agenus)。

其活化导致免疫应答的抑制或下调的免疫检查点在本文中称为“阴性免疫检查点途径”。由阴性免疫检查点的活化导致的免疫应答的抑制减弱宿主免疫***识别外源抗原诸如肿瘤相关抗原的能力。术语阴性免疫检查点途径包括，但不限于，通过PD1与PDL1、PD1与PDL2和CTLA4与CDCD80/86的结合调节的生物途径。此类阴性免疫检查点拮抗剂的实例包括但不限于这样的拮抗剂(例如拮抗剂抗体)，其结合T细胞抑制受体，包括但不限于PD1(也称为CD279)，TIM3(T细胞膜蛋白3；也称为HAVcr2)，BTLA(B和T淋巴细胞弱化子；也称为CD272)，VISTA (B7-H5)受体，LAG3(淋巴细胞活化基因3；也称为CD233)和CTLA4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 ；也称为CD152)。

通过免疫检查点途径介导的免疫应答不限于T细胞介导的免疫应答。例如，NK细胞的KIR受体调节由NK细胞介导的对肿瘤细胞的免疫应答。肿瘤细胞表达被称为HLA-C的分子，其抑制NK细胞的KIR受体，导致缩减(dimunition)或抗肿瘤免疫应答。拮抗HLA-C与KIR受体的结合的试剂(诸如抗KIR3单抗(例如lirilumab，BMS))抑制HLA-C结合NK细胞抑制受体(KIR)的能力，由此恢复NK细胞来检测和攻击癌细胞的能力。因此，由HLA-C与KIR受体的结合介导的免疫应答是阴性免疫检查点途径的实例，其抑制导致非T细胞介导的免疫应答的活化。

如先前所论述，“阴性免疫检查点途径抑制剂”是指这样的免疫检查点途径调节剂，其干扰导致免疫应答的上调或增强的阴性免疫检查点途径的活化。示例性阴性免疫检查点途径抑制剂包括但不限于程序性死亡-1(PD1)途径抑制剂，程序性死亡配体-1(PDL1)途径抑制剂，TIM3途径抑制剂和抗细胞毒性T-淋巴细胞抗原4(CTLA4)途径抑制剂。

在一个实施方案中，所述免疫检查点途径调节剂是抑制PD1与PDL1和/或PDL2的结合的阴性免疫检查点途径的拮抗剂(“PD1途径抑制剂”)。PD1途径抑制剂导致刺激一系列有利的免疫应答，诸如T细胞耗竭的逆转，细胞因子产生的恢复以及抗原依赖性T细胞的扩增。PD1途径抑制剂已被认为是来自USFDA的有效的各种癌症接收批准，用于治疗各种癌症，包括黑色素瘤、肺癌、肾癌、霍奇金淋巴瘤、头颈癌、膀胱癌和尿路上皮癌。

术语PD1途径抑制剂包括干扰PD1与PDL1和/或PDL2的结合的单克隆抗体。抗体PD1途径抑制剂是本领域中众所周知的。干扰PD1与PDL1和/或PDL2的结合的单克隆抗体的市售的PD1途径抑制剂的实例包括尼沃单抗(Opdivo®, BMS-936558, MDX1106, 由BristolMyers Squibb, Princeton NJ市售)，派姆单抗(Keytruda® MK-3475,lambrolizumab, 由Merck and Company, Kenilworth NJ市售)和阿特珠单抗(Tecentriq®, Genentech/Roche, South San Francisco CA)。另外PD1途径抑制剂抗体正在临床开发中，包括但不限于度伐单抗 (MEDI4736, Medimmune/AstraZeneca)，pidilizumab (CT-011, CureTech), PDR001 (Novartis)，BMS-936559 (MDX1105, BristolMyers Squibb)和阿维单抗(MSB0010718C, Merck Serono/Pfizer)和SHR-1210 (Incyte)。另外抗体PD1途径抑制剂描述于在2012年7月10日发布的美国专利号8,217,149 (Genentech，Inc)；在2012年5月1日发布的美国专利号8,168,757 (Merck Sharp and Dohme Corp.)，在2011年8月30日发布的美国专利号8,008,449 (Medarex)，在2011年5月17日发布的美国专利号7,943,743(Medarex, Inc)。

在本发明的一个实施方案中，所述PD1免疫检查点途径调节剂是包含下表2中提供的CDR序列的抗体：

术语“互补决定区”及其缩写“ CDR”是通常在免疫球蛋白分子中提供的确定本文使用的结合特性的那些序列，其是指免疫球蛋白的可变结构域的高变结构域。Kabat(Kabat等人, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版,United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda)已经开发了CDR中包括的残基的***鉴别。本文的CDR位置的编号根据Kabat编号惯例提供。

在本发明的一个实施方案中，所述PD1免疫检查点途径抑制剂是包含下表3中提供的可变结构域序列(SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)的抗体：

在本发明的一个实施方案中，所述PD1-拮抗剂抗体是AM0001：具有λ2轻链和在位置228处具有丝氨酸至脯氨酸取代(S228P)以提供“铰链-稳定的”重链的IgG4的单克隆抗体，其特征在于具有对应于如上文表2中所示的SEQ ID NO:1- 6的氨基酸序列的VL和VHCDR，特征在于SEQ ID NO:7的序列的轻链可变区和特征在于SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区。AM0001抗体的特征在于在25℃下对于人和食蟹猴PD-1的结合亲和力(K_d)为约10 pM或更小。

通过生物层干涉法(BLI)测量的AM0001的结合亲和力显示于下表4中。

下面提供了AM0001的重链和轻链的全长氨基酸序列。

PD-1途径抑制剂抗体可以通过重组方式产生。本发明包括编码SEQ ID NO. 1、SEQID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQID NO. 8、SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 12的氨基酸序列的核酸序列。在一个实施方案中，本公开提供了当所述PD1-拮抗剂抗体是AM0001时的核酸序列，编码AM0001的重链和轻链(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)的核酸序列在下面分别示为SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO.14。

术语PD1途径抑制剂不限于拮抗剂抗体。非抗体生物PD1途径抑制剂也在临床开发中，包括AMP-224(PD-L2 IgG2a融合蛋白)和AMP-514(PDL2融合蛋白)（其在Amplimmune和Glaxo SmithKline的临床开发中）。适体化合物也在文献中被描述为可用作PD1途径抑制剂(Wang, 等人. Selection of PD1/PD-L1 X-Aptamers, Biochimie, 印刷中; 2017年9月11日在线提供，网址为：https://doi.org/10.1016/j.biochi.2017.09.006。

术语PD1途径抑制剂包括肽基PD1途径抑制剂，诸如在2016年8月23日发布的Sasikumar等人，美国专利号9,422,339和在2014年12月9日发布的Sasilkumar等人，美国专利号8,907,053中描述的那些。CA-170 (AUPM-170，Aurigene/Curis)据报道是口服生物可利用的小分子，其靶向免疫检查点PDL1和VISTA。Pottayil Sasikumar, 等人 Oral immune checkpoint antagonists targeting PD-L1/VISTA or PD-L1/Tim3 for cancer therapy. [摘要]. : Proceedings of the 107th Annual Meeting of the AmericanAssociation for Cancer Research; 2016 Apr 16-20; New Orleans, LA.Philadelphia (PA): AACR; Cancer Res 2016;76(14 Suppl): 摘要号4861。CA-327(AUPM-327，Aurigene/Curis)据报道为口服可用的小分子，其抑制免疫检查点，程序性死亡配体-1(PDL1)和T细胞免疫球蛋白以及含粘蛋白结构域的蛋白-3(TIM3)。

术语PD1途径抑制剂包括小分子PD1途径抑制剂。可用于实施本发明的小分子PD1途径抑制剂的实例描述于本领域中，包括Sasikumar, 等人 1,2,4-oxadiazole and thiadiazole compounds as immunomodulators (在2016年3月7日提交的PCT/IB2016/051266，在2016年9月15日作为WO2016142833A1公开)和Sasikumar, 等人 3-substituted- 1,2,4-oxadiazole and thiadiazole compounds as immunomodulators (在2016年3月9日提交且作为WO2016142886A2公开的PCT申请系列号PCT/IB2016/051343)，具有以下结构的BMS-1166和BMS-1001 (Skalniak, 等人(2017) Oncotarget 8(42): 72167–72181)：

和

Chupak LS和Zheng X. Compounds useful as immunomodulators. Bristol-MyersSquibb Co. 2015 WO 2015/034820 A1，EP3041822 B1，在2017年8月9日授权；WO2015034820 A1; 和Chupak, 等人 Compounds useful as immunomodulators.Bristol-Myers Squibb Co. 2015 WO 2015/160641 A2. WO 2015/160641 A2，Chupak, 等人 Compounds useful as immunomodulators. Bristol-Myers Squibb Co. Sharpe, 等人 Modulators of immunoinhibitory receptor PD-1, and methods of use thereof，在2011年7月7日公开的WO 2011082400 A2；在2009年2月10日发布的美国专利号7,488,802(Wyeth)。

在一个实施方案中，所述免疫检查点途径调节剂是抑制CTLA4与CD28的结合的阴性免疫检查点途径的拮抗剂(“CTLA4途径抑制剂”)。免疫检查点受体CTLA4属于受体的免疫球蛋白超家族，其还包括PD1；BTLA；淋巴细胞衰减因子；TIM3以及T细胞活化的V结构域免疫球蛋白阻抑剂。CD80 (又称为B7.1)和CD86 (又称为B7.2)已被鉴别为CTLA4受体配体。对待临床靶向的第一免疫检查点受体CTLA4排他地在T细胞上表达，其中CTLA4主要调节T细胞活化的早期阶段的幅度。已显示CTLA4对抗T细胞共刺激性受体CD28的活性。

在抗原识别后，CD28信号转导使T细胞受体信号转导强烈扩增以活化T细胞。参见，例如，Riley等人, (2002) Proc. Natl Acad. Sci. USA 99:11790-95。CTLA4在T细胞活化之后被转录性地诱导。尽管CTLA4通过活化的CD8+效应T细胞表达，但其主要生理学作用据信通过对CD4+ T细胞的两个主要子集的不同作用而显现：i)下调辅助T细胞活性，以及ii)增强调节T细胞免疫阻抑活性。具体地，CTLA4阻断导致依赖于辅助T细胞的免疫应答增强，而调节T细胞的CTLA4接合增加其阻抑功能。参见，例如，Fontenot等人, (2003) Nat.Immunol. Proc. 4:330-36。CTLA4途径抑制剂的实例是本领域中众所周知的(参见，例如，在2004年1月27日发布的美国专利号6,682,736 (Abgenix)；在2007年5月29日发布的美国专利号6,984,720 (Medarex, Inc.)；在2009年10月20日发布的美国专利号7,605,238(Medarex, Inc.)。

目前，CTLA4途径抑制剂抗体治疗方法并不是没有缺点。通过实例的方式，已报道用人源化的抗CTLA4拮抗性抗体治疗转移性黑色素瘤引起某些自身免疫毒性(例如，肠炎和皮炎)，从而提示要求确定耐受的治疗窗口(Wu等人, (2012) Int. J. Biol. Sci. 8:1420-30)。CTLA4途径抑制剂(例如，抗体，诸如伊匹木单抗)与IL-10试剂(例如，PEG-IL-10)的组合的增强的治疗效力提供了在维持治疗效力的同时减少剂量的潜能。

在一个实施方案中，所述免疫检查点途径调节剂是抑制BTLA与HVEM的结合的阴性免疫检查点途径的拮抗剂(“BTLA途径抑制剂”)。BTLA是结构上和功能上与CTLA-4和PD-1相关的共抑制性分子。尽管BTLA在病毒特异性人CD8+ T细胞上表达，但BTLA在其从原初表型分化为效应子表型之后逐渐下调(Paulos等人，(2010年1月) J. Clin. Invest. 120(1):76-80)。在某些肿瘤细胞类型(例如，黑色素瘤)和肿瘤相关内皮细胞上表达的疱疹病毒进入介质(HVEM；又称为TNFRSF14)已被鉴别为BTLA配体。由于BTLA和HVEM之间的相互作用是复杂的，BTLA的治疗抑制策略不如其他免疫检查点途径抑制性受体和配体的治疗抑制策略那么显而易见。Pardoll, (2012) Nature Rev. Cancer 12:252-64。已经评估了使用抗BTLA抗体和拮抗性HVEM-Ig靶向BTLA/HVEM途径的多种方法，并且此类方法已表明在包括移植、感染、肿瘤和自身免疫疾病的许多疾病、病症和病况中有所希望的效用(Wu等人，(2012)Int. J. Biol. Sci. 8:1420-30)。

在一个实施方案中，所述免疫检查点途径调节剂是抑制TIM3结合TIM3-活化配体的能力的阴性免疫检查点途径的拮抗剂(“TIM3途径抑制剂”)。TIM3抑制T辅助1 (TH1)细胞应答，并且已显示抗TIM3抗体增强抗肿瘤免疫。半乳凝素9，参与TIM3途径的调节的分子，在包括乳腺癌的各种类型的癌症中被上调。已报道TIM3与PD1在肿瘤特异性CD8+ T细胞上共表达。当受到睾丸癌抗原NY-ESO-1刺激时，两种分子的双重抑制显著增强人T细胞的体外增殖和细胞因子产生。此外，在动物模型中，报道PD1和TIM3的协作阻断在其中仅观察到来自每个单独分子的阻断的适度作用的情况下增强抗肿瘤免疫应答。参见，例如，Pardoll,(2012) Nature Rev. Cancer 12:252-64; Zhu等人, (2005) Nature Immunol. 6:1245-52; Ngiow等人, (2011) Cancer Res. 71:3540-51)。TIM3途径抑制剂的实例是本领域中已知的，并且代表性的非限制性实例描述于2016年9月15日公开的美国专利公开号PCT/US2016/021005；2016年9月8日公开的Lifke, 等人，美国专利公开号US 20160257749 A1(F. Hoffman-LaRoche), 2017年4月27日发布的Karunsky, 美国专利号9,631,026；2014年9月23日发布的Karunsky, Sabatos-Peyton, 等人 美国专利号8,841,418；美国专利号9,605,070；和2013年10月8日发布的Takayanagi, 等人，美国专利号8552156。

已显示LAG3在增强调节T (T_调节)细胞的功能中以及独立地在抑制CD8+效应T细胞功能中发挥作用。MHC II类分子(LAG3的配体)在一些上皮癌上被上调(常常响应于IFNγ)，并且还在浸润肿瘤的巨噬细胞和树突细胞上表达。尽管并未明确阐述LAG3-MHC II类相互作用的作用，但所述相互作用可以是LAG3在增强T_调节细胞功能的作用中的关键组分。

LAG3是在T_调节细胞和无反应性T细胞两者上协作上调的几种免疫检查点受体之一。在与一种受体单独的阻断相比时，LAG3和PD1的同时阻断可以引起无反应性状态的增强的逆转。事实上，已显示LAG3和PD1的阻断在慢性感染的环境下协同地逆转肿瘤特异性CD8+ T细胞和病毒特异性CD8+ T细胞中的无反应性。在黑色素瘤、乳腺癌和肾细胞癌中评价IMP321 (ImmuFact)。一般参见Woo等人，(2012) Cancer Res 72:917-27; Goldberg等人,(2011) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 344:269-78; Pardoll, (2012) Nature Rev.Cancer 12:252-64; Grosso等人, (2007) J. Clin. Invest. 117:3383-392。

A2aR通过刺激CD4+ T细胞朝向T_调节细胞发育来抑制T细胞应答。A2aR在肿瘤免疫中是特别重要的，因为在细胞更新中肿瘤中的细胞死亡的速率高，并且正在死亡的细胞释放为A2aR的配体的腺苷。此外，A2aR的缺失已经与感染的增强的且有时病理性的炎性应答相关。A2aR的抑制可以通过阻断腺苷结合的抗体或通过腺苷类似物来实现。此类试剂可以用于病症诸如癌症和帕金森病。一般参见，Zarek等人, (2008) Blood 111:251-59;Waickman等人, (25 Nov 2011) Cancer Immunol. Immunother. (doi: 10. 1007/s00262-011-1155-7)]。

IDO (吲哚胺2,3-双加氧酶)是在肿瘤细胞和活化免疫细胞中正常表达的免疫调节酶。IDO下调通过色氨酸的氧化介导的免疫应答。这导致T细胞活化的抑制和T细胞凋亡的诱导，产生肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞在其中变得不具有功能活性或不再能够攻击受试者的癌症细胞的环境。Indoximod (NewLink Genetics)是在转移性乳腺癌中被评估的IDO抑制剂。

描述了多克隆和单克隆抗体的产生、纯化和片段化(例如，Harlow和Lane (1999)Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY)；用于表征配体/受体相互作用的标准技术是可用的(参见，例如，Coligan等人，(2001)Current Protocols in Immunology，第4卷，John Wiley, Inc., NY)；流式细胞术的方法，包括荧光活化细胞分选法(FACS)，是可用的(参见，例如，Shapiro (2003) Practical FlowCytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ)；并且适合于修饰包括核酸引物和探针的核酸、多肽以及抗体的例如用作诊断试剂的荧光试剂是可用的(Molecular Probes(2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR；Sigma-Aldrich (2003)Catalog, St. Louis, MO.)。

如前所述，本发明提供了通过施用IL-10试剂(例如，PEG-IL-10)与调节至少一种免疫检查点途径的试剂(包括调节两种、三种或更多种免疫检查点途径的免疫检查点途径调节剂)的组合来治疗哺乳动物受试者中的肿瘤疾病(例如，癌症)的方法。

在一个实施方案中，可以通过施用多功能分子来调节多种免疫检查点途径，所述多功能分子能够充当多个免疫检查点途径的调节剂。此类多种免疫检查点途径调节剂的实例包括但不限于双特异性或多特异性抗体。能够充当多种免疫检查点途径的调节剂的多特异性抗体的实例是本领域中已知的。例如，美国专利公开号2013/0156774描述了用于靶向共表达PD1和TIM3的细胞的双特异性和多特异性试剂(例如，抗体)，以及其使用方法。此外，已显示BTLA和PD1的双重阻断增强抗肿瘤免疫(Pardoll, (2012) Nature Rev. Cancer12:252-64)。本公开考虑使用IL-10试剂与靶向多种免疫检查点途径的免疫检查点途径调节剂(包括但不限于结合PD1和LAG3两者的双特异性抗体)的组合。因此，可以在多个水平增强抗肿瘤免疫力，并且可以基于各种机理考量来产生组合策略。

其他实施方案考虑施用IL-10试剂与多种检查点途径调节剂的组合，并且又进一步的实施方案考虑施用IL-10试剂与三种或更多种免疫检查点途径调节剂的组合。IL-10试剂与多种免疫检查点途径调节剂的此类组合可以是有利的，因为免疫检查点途径可以具有不同的作用机制，这提供了从多个独特的治疗角度攻击潜在的疾病、病症或病况的机会。可以与IL-10试剂的施用组合的免疫检查点途径调节剂的代表性组合(其中一些在临床试验中如下鉴别)包括但不限于：

(a) PD1/PDL1途径抑制剂(包括但不限于尼沃单抗、派姆单抗、PDR001；MEDI4736、阿特珠单抗和度伐单抗)与LAG3拮抗剂抗体(例如BMS-986016，临床试验识别码NCT01968109)、CTLA4拮抗剂抗体(伊匹木单抗)、B7-H3拮抗剂抗体(例如依诺单抗，例如临床试验识别码NCT01968109)、KIR拮抗剂抗体(例如enoblituzumab，例如临床试验识别码NCT01714739)；

(b) PD1/PDL1途径抑制剂(包括但不限于尼沃单抗、派姆单抗、PDR001；MEDI4736、阿特珠单抗和度伐单抗)与阳性免疫检查点激动剂抗体，诸如针对4-1BB的激动剂抗体(relumab，临床试验识别码NCT02253992)，针对ICOS的激动剂抗体(例如JTX-2011，例如临床试验识别码NCT02904226)，针对CD27的激动剂抗体(例如varlilumab，例如临床试验识别码NCT02335918)，针对GITR的激动剂抗体(例如GWN323，例如临床试验识别码NCT02740270)和针对OX40的激动剂抗体(例如MEDI6383，例如临床试验识别号NCT02221960)。

(c) CTLA4途径抑制剂(包括但不限于伊匹木单抗)与LAG3拮抗剂抗体(例如BMS-986016)；TIM3拮抗剂抗体。

可以通过添加IL-10试剂而补充的其他代表性的具有PD1/PDL1途径抑制剂的组合治疗包括PD1/PDL1途径抑制剂与以下的组合：BRAF/MEK抑制剂，激酶抑制剂诸如舒尼替尼(NCT02484404)，PARP抑制剂诸如奥拉帕尼(NCT02484404)，EGFR抑制剂诸如奥希替尼(Ahn, 等人 (2016) J Thorac Oncol.11:S115)，IDO抑制剂诸如epacadostat和溶瘤病毒诸如talimogene laherparepvec (T-VEC)。其他代表性的可以通过添加IL-10试剂而补充的具有CTL4途径抑制剂的组合治疗包括CTL4途径抑制剂与IL2、GMCSF和IFN-α的组合。

IL-10试剂：

如本文所使用，术语“IL-10试剂”是指具有IL-10活性的二聚分子，其包含两个IL-10多肽，其结合IL-10受体并调节与IL-10相同的信号传导途径，并且能够引发IL-10特征性的生物学应答。术语IL-10试剂包括IL-10类似物和IL-10变体以及修饰的IL-10试剂。

术语IL-10多肽应当广义地解释并且包括例如人和非人IL-10相关多肽，包括同源物、变体(包括突变蛋白)及其片段、以及具有例如前导序列(例如，信号肽)和前述部分的修饰形式的IL-10多肽。在另外的具体实施方案中，IL-10、IL-10多肽和IL-10试剂是激动剂。如本文所使用的术语“IL-10类似物”是指通过IL-10试剂起作用的IL-10试剂，包括IL-10类似物和IL-10变体，其通过与IL-10相同的作用机理起作用(即，其特异性结合并调节IL-10受体的活性并以其类似的方式调节与IL-10相同的信号传导途径)，并能够引发与IL-10相当(或更高)的生物学应答。

术语“IL10多肽”包括包含保守性氨基酸取代的IL-10多肽。术语“保守性氨基酸取代”是指通过如下保留蛋白的活性的取代：将蛋白中的氨基酸置换为侧链具有与所述蛋白的侧链相似的酸度、碱度、电荷、极性或大小的氨基酸。保守性氨基酸取代通常要求在以下组内的氨基酸残基的取代：1) L、I、M、V、F；2) R、K；3) F、Y、H、W、R；4) G、A、T、S；5) Q、N；以及6) D、E。取代、***或缺失的指导原则可以基于来自不同物种的一种或多种不同变体蛋白的氨基酸序列的比对。因此，除了任何天然存在的IL-10多肽以外，本公开涵盖具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，通常不超过20、10或5个氨基酸取代，其中所述取代通常是保守性氨基酸取代。

在一些情况下，IL-10多肽除了肽键以外还包括一个或多个键，例如，至少两个邻近氨基酸通过除了酰胺键以外的键连接，以减少或消除不期望的蛋白水解或其他降解方式，和/或增加血清稳定性，和/或限制或增加构象柔性，可以取代IL-10的主链内的一个或多个酰胺键。IL-10多肽中的一个或多个酰胺键(-CO-NH-)可以由作为酰胺键的电子等排体的键置换，所述键诸如-CH2NH-、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH=CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH₂-或-CH₂SO-。IL-10中的一个或多个酰胺键还可以由例如还原型电子等排体假肽键置换。参见Couder等人，(1993) Int. J. Peptide Protein Res. 41:181-184。此类置换和如何实现所述置换是本领域普通技术人员已知的。

术语“IL-10多肽”包括这样的IL-10多肽，其包含一个或多个氨基酸取代，包括但不限于：a) 烷基取代的疏水性氨基酸的取代，所述烷基取代的疏水性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、正亮氨酸、(S)-2-氨基丁酸、(S)-环己基丙氨酸或由来自C₁-C₁₀碳的脂族侧链取代的其他简单的α-氨基酸，所述取代包括支链、环状和直链烷基、烯基或炔基取代；

b) 芳族取代的疏水性氨基酸的取代，所述芳族取代的疏水性氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、磺基酪氨酸、联苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、2-苯并噻吩基丙氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、组氨酸，包括上文所列的芳族氨基酸的氨基、烷基氨基、二烷基氨基、氮杂、卤化(氟代、氯代、溴代或碘代)或者烷氧基(来自C₁-C₄)-取代形式，所述取代形式的说明性实例是：2-、3-或4-氨基苯丙氨酸；2-、3-或4-氯苯丙氨酸；2-、3-或4-甲基苯丙氨酸；2-、3-或4-甲氧苯丙氨酸；5-氨基-、5-氯-、5-甲基-或5-甲氧基色氨酸；2'-、3'-或4'-氨基-，2'-、3'-或4'-氯-，2、3或4-联苯丙氨酸；2'-、3'-或4'-甲基-，2-、3-或4-联苯丙氨酸以及2-或3-吡啶基丙氨酸；c) 含有碱性侧链的氨基酸的取代，所述含有碱性侧链的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸、2,3-二氨基丙酸、高精氨酸，包括前述氨基酸的烷基、烯基、或芳基取代的(来自C₁-C₁₀支链、支链或环状)的衍生物，无论取代基是在杂原子(诸如α氮，或者一个或多个末端氮)上还是在α碳上，例如位于前R位置。充当说明性实例的化合物包括：N-ε-异丙基-赖氨酸、3-(4-四氢吡啶基)-甘氨酸、3-(4-四氢吡啶基)-丙氨酸、N,N-γ,γ'-二乙基-高精氨酸。还包括化合物诸如α-甲基-精氨酸、α-甲基-2,3-二氨基丙酸、α-甲基-组氨酸、α-甲基-鸟氨酸，其中烷基占据α碳的前R位置。也包括由烷基、芳族、杂芳族(其中杂芳族基团单独地或组合地具有一个或多个氮、氧或硫原子)、羧酸或者许多众所周知的活化衍生物诸如酰基氯、活性酯、活性氮杂内酯和相关衍生物中任一个形成的酰胺，以及赖氨酸、鸟氨酸或2,3-二氨基丙酸；d) 酸性氨基酸的取代，所述酸性氨基酸包括天冬氨酸，谷氨酸，高谷氨酸，酪氨酸，2,4-二氨基丙酸的烷基、芳基、芳烷基和杂芳基磺酰胺，鸟氨酸或赖氨酸以及四唑-取代的烷基氨基酸；e) 侧链酰胺残基的取代，所述侧链酰胺残基包括天冬酰胺、谷氨酰胺以及天冬酰胺或谷氨酰胺的烷基或芳族取代的衍生物；以及f) 含有羟基的氨基酸的取代，包括丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸、2,3-二氨基丙酸以及丝氨酸或苏氨酸的烷基或芳族取代的衍生物。

术语“IL-10多肽”包括这样的IL-10多肽，其包含一种或多种天然存在的非遗传编码的L-氨基酸、合成L-氨基酸、或氨基酸的D-对映异构体。例如，IL-10可以仅包含D-氨基酸。例如，IL-10多肽可以包含以下残基中的一种或多种：羟脯氨酸、β-丙氨酸、o-氨基苯甲酸、间-氨基苯甲酸、对-氨基苯甲酸、间-氨基甲基苯甲酸、2,3-二氨基丙酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸(肌氨酸)、鸟氨酸、瓜氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、正亮氨酸、萘基丙氨酸、吡啶基丙氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、青霉胺、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、β-2-噻吩基丙氨酸、蛋氨酸亚砜、高精氨酸、N-乙酰基赖氨酸、2,4-二氨基丁酸、ρ-氨基苯丙氨酸、N-甲基缬氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、ε-氨基己酸、ω-氨基己酸、ω-氨基庚酸、ω-氨基辛酸、ω-氨基癸酸、ω-氨基十四烷酸、环己基丙氨酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、δ-氨基戊酸以及2,3-二氨基丁酸。

术语“IL10多肽”包括这样的IL-10多肽，其包含一个或多个另外的半胱氨酸残基或半胱氨酸类似物，以促进IL-10多肽通过二硫键与另一多肽的连接或提供IL-10多肽的环化。引入半胱氨酸或半胱氨酸类似物的方法是本领域中已知的；参见，例如，美国专利号8,067,532。

术语“IL10多肽”包括环化的多肽。环化键可以用氨基酸(或用氨基酸和-(CH2)_n-CO-或-(CH2)_n-C₆H₄-CO-)与允许引入桥的官能团的任何组合产生。一些实例是二硫化物、二硫化物模拟物，诸如-(CH2)_n-碳桥、硫缩醛、硫醚桥(胱硫醚或羊毛硫胺酸)以及含酯和醚的桥。在这些实例中，n可以是任何整数；但往往小于10。

术语“IL-10多肽”包括另外的修饰，包括例如N-烷基(或芳基)取代(ψ[CONR])，或用于构建内酰胺和其他环状结构的主链交联。其他衍生物包括C-末端羟甲基衍生物、o-修饰的衍生物(例如，C-末端羟甲基二苯醚)、N-末端修饰的衍生物，包括取代的酰胺，诸如烷基酰胺和酰肼。

术语“IL-10多肽”包括逆向反转类似物(参见，例如，Sela和Zisman (1997) FASEBJ. 11:449)。逆向反转肽类似物是线性多肽的异构体，其中氨基酸序列的方向被逆转(retro)，并且其中一个或多个氨基酸的手性D-或L-被反转(inverso)，例如，使用D-氨基酸而不是L-氨基酸。[参见，例如，Jameson等人，(1994) Nature 368:744；以及Brady等人，(1994) Nature 368:692]。

术语“IL-10多肽”包括修饰以包括“蛋白转导结构域”(PTD)。术语“蛋白转导结构域”意是指促进横穿脂质双层、胶束、细胞膜、细胞器膜或囊泡膜的多肽、多核苷酸、碳水化合物或者有机分子或无机分子。附接至另一个分子的PTD促进分子横穿膜，例如从细胞外空隙进入细胞内空隙或细胞溶质进入细胞器内。在一些实施方案中，PTD共价地连接至IL-10多肽的氨基末端，而在其他实施方案中，PTD共价地连接至IL-10多肽的羧基末端。示例性蛋白转导结构域包括但不限于最小的十一肽蛋白转导结构域(对应于包含YGRKKRRQRRR的HIV-1 TAT的残基47-57；SEQ ID NO:15)；包含足以进入细胞中的多个精氨酸残基(例如，3、4、5、6、7、8、9、10或10-50个精氨酸)的聚精氨酸序列；VP22结构域(Zender等人，(2002)Cancer Gene Ther. 9(6):489-96)；果蝇触角蛋白转导结构域(Noguchi等人，(2003)Diabetes 52(7):1732-1737)；截短型人降钙素肽(Trehin等人，(2004) Pharm. Research21:1248-1256)；聚赖氨酸(Wender等人，(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13003-13008)；RRQRRTSKLMKR (SEQ ID NO:16)；运输蛋白GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQID NO:17)；KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (SEQ ID NO:18)；和RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:19)。示例性PTD包括但不限于YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:15)，RKKRRQRRR (SEQID NO:20)；具有3个精氨酸残基至50个精氨酸残基的精氨酸均聚物；示例性PTD结构域氨基酸序列包括但不限于以下的任何序列：YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:15)；RKKRRQRR (SEQ IDNO:21)；YARAAARQARA (SEQ ID NO:22)；THRLPRRRRRR (SEQ ID NO:23)；和GGRRARRRRRR(SEQ ID NO:24)。

IL-10多肽的C-末端处的氨基酸的羧基COR₃可以游离形式(R3 = OH)存在，或者以生理上耐受的碱金属盐或碱土金属盐，诸如例如钠盐、钾盐或钙盐的形式存在。羧基还可以用伯、仲或叔醇，诸如例如甲醇、支链或非支链的C1-C6烷基醇，例如乙醇或叔丁醇来酯化。羧基也可以用伯或仲胺，诸如氨水、支链或非支链的C1-C6烷基胺或C1-C6二烷基胺，例如甲胺或二甲胺来酰胺化。

IL-10多肽的N-末端处的氨基酸NR1R2的氨基可以游离形式(R1 = H和R2 = H)存在，或者以生理上耐受的盐诸如例如氯化物或乙酸盐的形式存在。氨基也可以用酸来乙酰化，使得R1 = H并且R2 =乙酰基、三氟乙酰基或金刚烷基。氨基可以存在于受肽化学中常规使用的氨基保护基团保护的形式中，诸如上文提供的那些(例如，Fmoc、苯氧基羰基(Z)、Boc以及Alloc)。氨基可以是N-烷基化的，其中R₁和/或R₂ = C₁-C₆烷基或C₂-C₈烯基或C₇-C₉芳烷基。烷基残基可以是直链的、支链的或环状的(例如，分别为乙基、异丙基和环己基)。

术语“IL10多肽”包括IL-10多肽的活性片段。术语“活性IL-10多肽片段”是指这样的IL-10多肽，其是天然存在的IL-10种类的片段(例如，亚序列)，其包含衍生自天然存在的IL-10种类的连续氨基酸残基，其能够与另一个IL-10多肽二聚化，这种二聚体具有IL-10活性。肽或多肽子序列的连续氨基酸残基的长度根据衍生所述子序列的特定的天然存在的氨基酸序列而变化。一般而言，肽和多肽可以为约20个氨基酸至约40个氨基酸、约40个氨基酸至约60个氨基酸、约60个氨基酸至约80个氨基酸、约80个氨基酸至约100个氨基酸、约100个氨基酸至约120个氨基酸、约120个氨基酸至约140个氨基酸、约140个氨基酸至约150个氨基酸、约150个氨基酸至约155个氨基酸、约155个氨基酸直至全长肽或多肽。

此外，IL-10多肽在限定长度的连续氨基酸(例如，“比较窗口”)内与参考序列相比可以具有限定的序列同一性。比对用于比较的序列的方法是本领域中众所周知的。用于比较的序列的最佳比对可以通过以下方式来实施：例如Smith & Waterman, Adv. Appl.Math. 2:482 (1981)的局部同源性算法；Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443(1970)的同源性比对算法；Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444(1988)的相似性方法的搜索；这些算法的计算机化实现方式(Wisconsin GeneticsSoftware Package, Madison, Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)；或人工比对和视觉检查(参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等人编著，1995增刊))。用于确定例如抗原片段、前导序列、蛋白折叠、功能结构域、糖基化位点以及序列比对的软件包和数据库是可用的(参见，例如GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc.,San Diego, CA)；以及DeCypher™ (TimeLogic Corp., Crystal Bay, NV)。

作为一个实例，合适的IL-10多肽可以包含一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与约20个氨基酸至约40个氨基酸、约40个氨基酸至约60个氨基酸、约60个氨基酸至约80个氨基酸、约80个氨基酸至约100个氨基酸、约100个氨基酸至约120个氨基酸、约120个氨基酸至约140个氨基酸、约140个氨基酸至约150个氨基酸、约150个氨基酸至约155个氨基酸、约155个氨基酸直至全长肽或多肽的连续片段具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%或至少约99%的氨基酸序列同一性。

如下文进一步论述，IL-10多肽可以从天然来源(例如，除了其天然存在的环境以外的环境)分离并且也可以重组制得(例如，在遗传修饰的宿主细胞诸如细菌、酵母、毕赤酵母属、昆虫细胞等中)，其中遗传修饰的宿主细胞用包含编码多肽的核苷酸序列的核酸来修饰。IL-10多肽也可以是合成产生的(例如，通过不含细胞的化学合成)。

本公开考虑由从各种哺乳动物和非哺乳动物来源获得的IL-10多肽(包括直系同源物及其修饰形式)构成的IL-10试剂。除了人多肽和编码人多肽的核酸分子以外，本公开还考虑来自其他物种的IL-10多肽和相应的核酸分子，所述其他物种包括鼠、大鼠(登录号NP_036986.2；GI 148747382)；牛(登录号NP_776513.1；GI 41386772)；绵羊(登录号NP_001009327.1；GI 57164347)；狗(登录号ABY86619.1；GI 166244598)；和兔(登录号AAC23839.1；GI 3242896)。

源自非哺乳动物来源的IL-10试剂的实例包括源自以下的病毒IL-10：疱疹病毒科疱疹病毒亚科，巨细胞病毒属，包括人巨细胞病毒(Genbank登录号AAR31656和ACR49217)，绿猴巨细胞病毒(Genbank登录号AEV80459)，猕猴巨细胞病毒(Genbank登录号AAF59907)，狒狒巨细胞病毒(Genbank登录号AAF63436)，枭猴巨细胞病毒(Genbank登录号AEV80800)和松鼠猴巨细胞病毒(Genbank登录号AEV80955)；伽马疱疹病毒科，淋巴隐病毒属Epstein-Barr病毒(Genbank登录号CAD53385)，倭黑猩猩疱疹病毒(Genbank登录号XP_003804206.1)，猕猴淋巴隐病毒(Genbank登录号AAK95412)，狒狒淋巴隐病毒(Genbank登录号AAF23949)；马卡病毒属，包括绵羊疱疹病毒2(Genbank登录号AAX58040)；percavirus属，包括马疱疹病毒2(Genbank登录号AAC13857)；异疱疹病毒科(alloherpesviridea)，cyprinivirus属，包括鲤疱疹病毒3(Genbank登录号ABG429610)，鳗疱疹病毒1(Genbank登录号AFK25321)；痘病毒科，chodopoxvirinae亚科，副痘病毒属，包括orf病毒(Genbank登录号AAR98352)，牛丘疹性口炎病毒(Genbank登录号AAR98483)，假牛痘病毒(Genbank登录号ADC53770)；羊痘病毒属，包括块状皮肤病病毒(Genbank登录号AAK84966)，绵羊痘病毒(Genbank登录号NP_659579)，山羊痘病毒(Genbank登录号YP_00129319)和禽痘病毒，包括金丝雀痘病毒(Genbank登录号NP_955041)。

术语“IL-10活性”是指IL-10试剂通常通过结合IL-10受体而发挥其作用。IL-10受体(II型细胞因子受体)由α和β亚基组成，所述α和β亚基还分别称为R1和R2。受体活化要求结合α和β两者。二聚IL-10的一个IL-10单体结合α，且IL-10的另一IL-10单体结合β。IL-10活性可以通过本领域中众所周知的测定法来评价。例如，可以通过使用TNF-α抑制测定、MC9增殖测定、CD8 T细胞IFNγ分泌测定或在如下所提供的肿瘤模型和肿瘤分析中测定IL-10试剂的IL-10活性。然而，技术人员理解，以下测定法是测定IL-10活性的代表性的测定法，而不是排他性的。技术人员将理解，可以单独使用或组合使用任何本领域公认的测量IL-10活性的测定法或方法来评估本文所述的IL-10试剂的活性。

IL-10试剂的IL-10活性可以基本上根据以下TNFα抑制测定法来评价。简而言之，U937细胞(可得自Sigma-Aldrich (#85011440)；St. Louis, MO的来自肺的淋巴母细胞人细胞系)的PMA-刺激引起细胞分泌TNFα，并且随后用具有IL-10活性的测试剂处理这些TNFα分泌细胞将导致TNFα分泌以剂量依赖性方式减少。示例性TNFα抑制测定可以使用以下方案来进行。在含有10% FBS/FCS和抗生素的RMPI中培养U937细胞之后，将1 x 10⁵，90%活U937细胞铺板在96孔平底板中(可以使用任何血浆处理的组织培养板(例如，Nunc; ThermoScientific, USA))，在每种条件下一式三份。将细胞铺板以提供以下条件(全部至少一式三份；对于“单独培养基”，将孔的数目加倍，因为一半将用于与10 nM PMA孵育之后的活力)：5 ng/ml LPS单独；5 ng/mL LPS + 0.1 ng/mL rhIL-10；5 ng/mL LPS + 1 ng/mLrhIL-10；5 ng/mL LPS + 10 ng/mL rhIL-10；5 ng/mL LPS + 100 ng/mL rhIL-10；5 ng/mL LPS + 1000 ng/mL rhIL-10；5 ng/mL LPS + 0.1ng/mL PEG-rhIL-10；5 ng/mL LPS +1 ng/mL PEG-rhIL-10；5 ng/mL LPS + 10 ng/mL PEG-rhIL-10；5 ng/mL LPS + 100 ng/mL PEG-rhIL-10；和5 ng/mL LPS + 1000 ng/mL PEG-rhIL-10。将每个孔暴露于200 µL的10 nM PMA 24小时，在37℃下，在5% CO₂孵育箱中培养，在此时间之后应该附着约90%的细胞。将三个额外的孔再次悬浮，并且计数细胞以评价活力(>90%应该是有活力的)。用新鲜的不含PMA的培养基温和、但彻底地洗涤3次，确保细胞仍处于孔中。向每孔添加100 µL含有适当浓度的IL-10试剂(在体积稀释100%时为2倍)的培养基，在37℃下在5% CO₂孵育箱中孵育30分钟。向每孔添加100 µL 10 ng/mL LPS储备液以在每个孔中实现5 ng/mL LPS的最终浓度，并且在37℃下在5% CO₂孵育箱中孵育18-24小时。移取上清液并且根据制造商的说明来进行TNFα ELISA。在ELISA中按一式二份对每种调节的上清液进行操作。

IL-10试剂的IL-10活性可以基本上根据以下MC/9细胞增殖测定法来评价。简而言之，将具有IL-10活性的化合物施用于MC/9细胞引起细胞增殖以剂量依赖性方式增加。MC/9是鼠细胞系，其特征在于可得自Cell Signaling Technology; Danvers, MA的肥大细胞。Thompson-Snipes, L.等人((1991) J. Exp. Med. 173:507-10)描述了标准测定方案，其中MC/9细胞补充有IL3 + IL10和IL3 + IL4 + IL10。本领域普通技术人员将能够修改Thompson-Snipes, L.等人中描述的标准测定方案，使得细胞仅补充有IL-10。

IL-10试剂的IL-10活性可以基本上根据以下CD8 T细胞IFNγ分泌测定法来评价。简而言之，活化的原代人CD8 T细胞在用具有IL-10活性的化合物处理且然后用抗CD3抗体处理时分泌IFNγ。以下方案提供了示例性CD8 T细胞IFNγ分泌测定。人原代外周血单核细胞(PBMC)可以根据任何标准方案来分离(参见，例如，Fuss等人，(2009) CurrentProtocols in Immunology，第7.1单元，John Wiley, Inc., NY)。在任何标准组织培养物处理的6孔板(BD; Franklin Lakes, NJ)中，每孔可以用含有以下物质的完全RPMI来培养2.5 mL PBMC (细胞密度为1千万个细胞/mL)：RPMI (Life Technologies; Carlsbad,CA)、10 mM HEPES (Life Technologies; Carlsbad, CA)、10%胎牛血清(Hyclone ThermoFisher Scientific; Waltham, MA)以及青霉素/链霉素混合物(Life Technologies;Carlsbad, CA)。然后以100 ng/mL的最终浓度向孔中添加IL-10试剂；还可以添加最终浓度为10 µg/mL的阻断抑制性/检查点受体的功能的抗体，使其与IL-10试剂组合。可以在具有5% CO₂的潮湿的37℃孵育箱中将细胞孵育6-7天。在孵育之后，使用Miltenyi Biotec’sMACS细胞分离技术基本上根据制造商的说明(Miltenyi Biotec; Auburn, CA)来分离CD8T细胞。然后可以在任何标准组织培养板中用含有1 µg/mL抗CD3抗体(AffymetrixeBioscience; San Diego, CA)的完全RPMI将分离的CD8 T细胞培养4小时。在4小时孵育之后，收集培养基并且使用商业的ELISA试剂盒(例如，Affymetrix eBioscience; SanDiego, CA)基本上根据制造商的说明来测定培养基的IFNγ。

肿瘤模型可用于评估IL-10试剂对各种肿瘤的活性。下文描述的肿瘤模型和肿瘤分析代表可以被利用的那些。以10⁴、10⁵或10⁶个细胞/肿瘤接种皮下或皮内注射同源小鼠肿瘤细胞。可以使用Ep2乳腺癌、CT26结肠癌、PDV6皮肤鳞状癌和4T1乳癌模型(参见，例如，Langowski等人(2006) Nature 442:461-465)。可以使用免疫活性Balb/C或B细胞缺陷Balb/C小鼠。可以将基于鼠IL-10物种的IL-10试剂施用于具有免疫能力的小鼠，通常在B细胞缺陷小鼠中提供基于人IL-10或其他非鼠物种IL-10的IL-10试剂的治疗。通常使用电子卡尺每周两次监测肿瘤生长。可以使用公式(宽度² x 长度/2)(其中长度是较长尺寸)来计算肿瘤体积。在施用IL-10测试剂之前，允许肿瘤达到90-250 mm³的大小。IL-10试剂或缓冲液对照在远离肿瘤植入的位点施用。通常使用上述电子卡尺每周两次监测施用IL-10测试剂后的肿瘤生长，并且随着时间评估响应于IL-10测试剂的施用对肿瘤体积的影响。在各个端点收获肿瘤组织和淋巴器官以测量许多炎性标志物的mRNA表达并且针对几种炎性细胞标志物进行免疫组织化学。在液氮中快速冷冻组织并且储存在-80℃下。

在一个实施方案中，所述IL-10多肽是人IL-10多肽。如本文所使用，术语“人IL-10”或“hIL10”是指由两个人iIL-10多肽构成的IL10试剂。在一个实施方案中，人IL-10多肽是具有以下氨基酸序列(氨基至羧基末端)的160个氨基酸的多肽：

在一个实施方案中，人IL-10多肽是具有以下氨基酸序列(氨基至羧基末端)的161个氨基酸的多肽：

在一个实施方案中，人IL-10多肽是具有以下氨基酸序列(氨基至羧基末端)的161个氨基酸的多肽：

应注意，结合本公开的多肽和核酸分子对“人”的任何提及并不意图对多肽或核酸获得的方式或来源作出限制，而是仅对序列作出参考，因为所述序列可以对应于天然存在的人多肽或核酸分子的序列。

IL-10多肽可以从天然来源(例如，除了其天然存在的环境以外的环境)分离并且也可以重组制得(例如，在遗传修饰的宿主细胞诸如细菌、酵母、毕赤酵母属、昆虫细胞等中)，其中遗传修饰的宿主细胞用包含编码多肽的核苷酸序列的核酸来修饰。IL-10多肽也可以是合成产生的(例如，通过不含细胞的化学合成)。

在IL-10多肽是化学合成的情况下，合成可以通过液相或固相来进行。固相肽合成(SPPS)允许并入非天然氨基酸和/或肽/蛋白主链修饰。各种形式的SPPS诸如9-芴甲氧基羰基(Fmoc)和叔丁氧基羰基(Boc)可用于合成本公开的多肽。化学合成的细节是本领域中已知的(例如，Ganesan A. (2006) Mini Rev. Med. Chem. 6:3-10; 和Camarero J.A.等人,(2005) Protein Pept Lett. 12:723-8)。

固相肽合成可以根据下文描述来进行。α官能团(Nα)和任何反应性侧链用酸不稳定或碱不稳定基团保护。保护基团在用于连接酰胺键的条件下是稳定的，但可以在不损坏已形成的肽链的情况下容易地裂解。用于α-氨基官能团的合适的保护基团包括但不限于以下：Boc、苄氧基羰基(Z)、O-氯苄氧基羰基、二-苯基异丙基氧基羰基、叔戊氧基羰基(Amoc)、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基-苄氧基羰基、o-硝基氧硫基、2-氰基-叔丁氧基-羰基、Fmoc、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己基-1-亚基)乙基(Dde)等。

合适的侧链保护基团包括但不限于：乙酰基、烯丙基(All)、烯丙氧基羰基(Alloc)、苄基(Bzl)、苄氧基羰基(Z)、叔丁氧基羰基(Boc)、苄氧基甲基(Bom)、o-溴苄氧基羰基、叔丁基(tBu)、叔丁基二甲基甲硅烷基、2-氯苄基、2-氯苄氧基羰基、2,6-二氯苄基、环己基、环戊基、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己基-1-亚基)乙基(Dde)、异丙基、4-甲氧基-2,3-6-三甲基苄基磺酰基(Mtr)、2,3,5,7,8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)、新戊酰基、四氢吡喃-2-基、甲苯磺酰(Tos)、2,4,6-三甲氧基苄基、三甲基甲硅烷基以及三苯甲基(Trt)。

在固相合成中，C-末端氨基酸偶联至合适的支持材料。合适的支持材料是对于合成过程的逐步缩合和裂解反应的试剂和反应条件而言是惰性的并且不溶解于所使用的反应介质中的那些。市售的支持材料的实例包括苯乙烯/二乙烯苯共聚物，其已用反应性基团和/或聚乙二醇修饰；氯甲基化苯乙烯/二乙烯苯共聚物；羟甲基化或氨基甲基化的苯乙烯/二乙烯苯共聚物；等。当期望制备肽核酸时，可以使用聚苯乙烯(1%)-二乙烯苯或用4-苄氧基苄基-醇(Wang-锚定物)或2-氯三苯甲基氯衍生的TentaGel®。在肽酰胺的情况下，可以使用聚苯乙烯(1%)二乙烯苯或用5-(4'-氨基甲基)-3',5'-二甲氧基苯氧基)戊酸(PAL-锚定物)或对-(2,4-二甲氧基苯基-氨基甲基)-苯氧基(Rink酰胺锚定物)衍生的TentaGel®。

与聚合支持物的连接可以通过以下方式实现：通过在室温或高温(例如，在40℃和60℃之间)下，以及在例如2至72小时的反应时间下将活化试剂添加于乙醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷、四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮或类似溶剂中使C-末端Fmoc保护的氨基酸与支持材料反应。

Nα-保护的氨基酸(例如，Fmoc氨基酸)与PAL、Wang或Rink锚定物的偶联可以例如在1-羟基苯并***或1-羟基-7-氮杂苯并***存在或不存在下，借助于偶联剂(诸如N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)或其他碳二亚胺、2-(1H-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)或其他脲盐、O-酰基脲、苯并***-1-基-三-吡咯烷-膦六氟磷酸盐(PyBOP)或其他磷盐，N-羟基琥珀酰亚胺、其他N-羟基酰亚胺或肟)，例如借助于TBTU，伴随添加HOBt，添加或不添加碱诸如例如二异丙基乙胺(DIEA)、三乙胺或N-甲基吗啉，例如二异丙基乙胺来执行，其中反应时间是2至72小时(例如，在1.5至3倍过量氨基酸和偶联剂中(例如，在2倍过量中)，以及在约10℃和50℃之间例如25℃的温度下在溶剂诸如二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮或二氯甲烷，例如二甲基甲酰胺中持续3个小时)。

代替偶联剂，在上述条件下，还可能使用活性酯(例如，五氟苯基、对-硝基苯基等)，Nα-Fmoc-氨基酸的对称酸酐，其酰基氯或酰基氟。

Nα-保护的氨基酸(例如，Fmoc氨基酸)可以在添加DIEA的二氯甲烷中偶联至2-氯三苯甲基树脂，具有10至120分钟、例如20分钟的反应时间，但不限于该溶剂和该碱的使用。

受保护的氨基酸的成功偶联可以根据肽合成中的常规方法，通常在自动化肽合成仪中实施。通过用例如哌啶(10%至50%)在二甲基甲酰胺中处理5至20分钟，例如用50%哌啶在DMF中处理2 x 2分钟并用20%哌啶在DMF中处理1 x 15分钟进行固相上的偶联的氨基酸的Nα-Fmoc保护基团的裂解之后，3至10倍过量、例如10倍过量的下一受保护的氨基酸在惰性的非水性极性溶剂、诸如二氯甲烷、DMF或两者的混合物中以及在约10℃和50℃之间、例如25℃的温度下偶联至先前的氨基酸。前述用于将第一Nα-Fmoc氨基酸偶联至PAL、Wang或Rink锚定物的试剂适合用作偶联剂。受保护的氨基酸的活性酯、或氯化物或氟化物或其对称酸酐也可以用作替代物。

在固相合成结束时，从支持材料裂解肽，与此同时裂解侧链保护基团。裂解可以在存在三氟醋酸或其他强酸性介质的情况下，通过添加5%-20% V/V清除剂诸如二甲基硫醚、乙基甲基硫醚、苯甲硫醚、甲苯硫酚、间甲苯酚、苯甲醚、乙二硫醇、苯酚或水，例如，15% v/v二甲基硫醚/乙二硫醇/间甲苯酚1:1:1来在0.5至3小时、例如2小时内实施。具有完全保护侧链的肽通过用冰醋酸/三氟乙醇/二氯甲烷2:2:6裂解2-氯三苯甲基锚定物来获得。受保护的肽可以通过在硅胶上进行色谱法来纯化。如果肽通过Wang锚定物连接至固相并且如果意图获得具有C-末端烷基酰胺化的肽，则裂解可以通过用烷基胺或氟代烷基胺进行氨解来实施。氨解在约-10℃和50℃之间(例如，约25℃)的温度，以及约12和24小时之间(例如，约18小时)的反应时间下实施。此外，可以通过例如用甲醇进行再次酯化来从支持物裂解肽。

获得的酸性溶液可以与3至20倍量的冷***或正己烷，例如10倍过量的二***混合，以便将肽沉淀并且因此分离残留在***中的清除剂和裂解的保护基团。进一步纯化可以通过使肽从冰醋酸再沉淀几次来实施。获得的沉淀物可以溶解在水或叔丁醇或两种溶剂的混合物(例如，1:1叔丁醇/水的混合物)中，并且进行冷冻干燥。

获得的肽可以通过各种色谱方法来纯化，包括用乙酸盐形式的弱碱性树脂上的离子交换；非衍生化的聚苯乙烯/二乙烯苯共聚物(例如，Amberlite® XAD)上的疏水性吸附色谱法；硅胶上的吸附色谱法；例如羧甲基纤维素上的离子交换色谱法；例如在Sephadex®G-25上的分配色谱法；逆流分配色谱法；或高效液相色谱法(HPLC)，例如在辛基或十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)相上的反相HPLC。

描述制备人和小鼠IL-10的方法可见于例如美国专利号5,231,012，所述专利教导了用于产生具有IL-10活性的蛋白的方法，包括重组技术和其他合成技术。IL-10可以是病毒来源的，并且Moore等人，(1990) Science 248:1230中公开了来自埃-巴二氏病毒(BCRF1蛋白)的病毒IL-10的克隆和表达。IL-10可以使用本领域中已知的标准技术诸如本文描述的那些以多种方式来获得。重组人IL-10还可商购自例如PeproTech, Inc., Rocky Hill,N.J。

本公开考虑编码IL-10试剂的核酸分子，包括其天然存在的和非天然存在的亚型、等位变体和剪接变体。本公开还考虑核酸序列，由于遗传密码的简并性，所述核酸序列与天然存在的DNA序列相比存在一个或多个碱基的变化，但仍翻译成对应于IL-10多肽的氨基酸序列。

在多肽使用重组技术产生的情况下，多肽可以使用任何合适的构建体和任何合适的宿主细胞分别产生作为细胞内蛋白或作为分泌性蛋白，所述构建体和宿主细胞可以是原核生物或真核生物细胞诸如细菌(例如，大肠杆菌)或酵母宿主细胞。可以用作宿主细胞的真核细胞的其他实例包括昆虫细胞、哺乳动物细胞和/或植物细胞。在使用哺乳动物宿主细胞的情况下，它们可以包括人细胞(例如，HeLa、293、H9和Jurkat细胞)；小鼠细胞(例如，NIH3T3、L细胞和C127细胞)；灵长类动物细胞(例如，Cos 1、Cos 7和CV1)；以及仓鼠细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)。

适合于表达多肽的各种宿主-载体***可以根据本领域中已知的标准程序来采用。参见，例如，Sambrook等人，1989 Current Protocols in Molecular Biology ColdSpring Harbor Press，New York；以及Ausubel等人，1995 Current Protocols inMolecular Biology, Wiley and Sons编。用于将遗传物质引入宿主细胞中的方法包括例如转化、电穿孔、缀合、磷酸钙法等。可以选择转移方法以便提供对引入的多肽编码核酸的稳定表达。多肽编码核酸可以提供为可遗传的游离元件(例如，质粒)或可以是基因组整合的。用于产生目标多肽的各种适当的载体是市售的。

载体可以在宿主细胞中提供染色体外维持或可以提供用于整合至宿主细胞基因组中。表达载体提供转录和翻译调节序列，并且可以提供用于诱导型或组成型表达，其中在转录起始区的转录控制下可操作地连接编码区、以及转录和翻译终止区。一般而言，转录和翻译调节序列可以包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或活化因子序列。启动子可以是组成型的或诱导型的，并且可以是强组成型启动子(例如，T7)。

表达构建体通常具有位于启动子序列附近的便利的限制性位点以提供用于***编码目标蛋白的核酸序列。在表达宿主中可操作的可选择标志物可以存在来促进含有载体的细胞的选择。此外，表达构建体可以包括另外的元件。例如，表达载体可以具有一个或两个复制***，因此允许所述表达载体能够维持在多种生物体中，例如维持在哺乳动物或昆虫细胞中以用于表达并且维持在原核宿主中以用于克隆和扩增。此外，表达构建体可以含有可选择标志物基因以允许选择转化的宿主细胞。可选择基因是本领域中众所周知的，并且将随着所使用的宿主细胞而变化。

蛋白的分离和纯化是根据本领域中已知的方法来完成。例如，蛋白可以从细胞裂解物分离，所述细胞经遗传修饰来组成型地和/或在诱导之后表达蛋白；或通过免疫亲和纯化从合成反应混合物分离，这通常涉及使样品与抗蛋白抗体接触，洗涤以除去非特异性结合的物质并且洗脱特异性结合的蛋白。分离的蛋白可以进一步通过透析和蛋白纯化中正常采用的其他方法来纯化。在一个实施方案中，蛋白可以使用金属螯合色谱方法来分离。蛋白可以含有多个修饰以促进分离。

多肽可以基本上纯的或分离(例如，不含其他多肽)的形式制备。多肽可以存在于相对于可能存在的其他组分(例如，其他多肽或其他宿主细胞组分)而言富集所述多肽的组合物中。例如，可以提供纯化的多肽，使得所述多肽存在于基本上不含其他表达的蛋白，例如，小于约90%、小于约60%、小于约50%、小于约40%、小于约30%、小于约20%、小于约10%、小于约5%或小于约1%的组合物中。

IL-10多肽可以使用重组技术以操纵本领域中已知的不同IL-10相关核酸，以提供能够编码IL-10多肽的构建体来产生。将了解，在提供具体氨基酸序列时，普通技术人员鉴于其在例如分子生物学方面的背景和经验将认识到编码这种氨基酸序列的各种不同的核酸分子。

术语“修饰的IL-10试剂”是已通过一种或多种修饰进行修饰的IL-10试剂，所述修饰包括聚乙二醇化糖基化(N-和O-连接)；多唾液酸化；包含血清白蛋白(例如，人血清白蛋白(HSA)、猕猴血清白蛋白或牛血清白蛋白(BSA))的白蛋白融合分子；通过例如缀合的脂肪酸链结合(酰化)的白蛋白；以及Fc-融合蛋白。可以制备修饰的IL-10试剂以便增强一种或多种特性，例如调节免疫原性；增加水溶性、生物利用率、血清半衰期和/或治疗半衰期的方法；和/或调节生物活性。某些修饰还可以用于例如激发抗体以用于检测测定(例如，表位标签)中并且为蛋白纯化提供便利。

在一个实施方案中，修饰的IL-10试剂是PEG-IL10试剂。术语“PEG-IL-10试剂”是指修饰的IL-10试剂，其包含共价附接(缀合)至IL-10多肽的至少一个氨基酸残基的至少一个聚乙二醇(PEG)分子。术语“单聚乙二醇化的IL-10试剂”和“单-PEG-IL-10试剂”是指具有通常通过接头共价地附接至IL-10二聚体的一个IL-10多肽上的单个氨基酸残基的聚乙二醇分子的IL-10试剂。如本文所使用，术语“二聚乙二醇化的IL-10”和“二-PEG-IL-10”指示至少一个聚乙二醇分子通常通过接头附接至IL-10二聚体的每个亚基上的IL-10多肽。

IL-10试剂的聚乙二醇化导致某些特性的改进，包括药代动力学参数(例如血清半衰期)、活性的增强、提高的物理和热稳定性、针对对酶促降解的容易性的保护、增加的溶解度、更长的体内循环半衰期和降低的清除率、减少的免疫原性和抗原性以及减少的毒性。除了聚乙二醇化对药代动力学参数的有益作用以外，聚乙二醇化自身可以增强活性。例如，已显示PEG-IL-10比非聚乙二醇化的IL-10针对某些癌症更有效(参见，例如，EP 206636A2)。

在某些实施方案中，本公开中使用的PEG-IL-10试剂是单-PEG-IL-10试剂，其中1至9个PEG分子通过接头共价地附接至IL-10二聚体的一个IL-10多肽的N-末端处的氨基酸残基的α-氨基。一个IL-10多肽的单聚乙二醇化通常由于亚基改组而产生非聚乙二醇化、单聚乙二醇化和二聚乙二醇化的IL-10多肽的非均匀混合物。本公开的具体实施方案包括通过本文描述的方法产生的单聚乙二醇化和二聚乙二醇化的IL-10试剂的混合物的施用。在某些实施方案中，IL-10试剂作为单和二聚乙二醇化的IL-10种类的混合物提供，所述混合物具有约50%的单-PEG-IL-10和约50%的二-PEG-IL-10，可替代地具有约40%的单-PEG-IL-10和约60%的二-PEG-IL-10，可替代地具有约60%的单-PEG-IL-10和约40%的二-PEG-IL-10，可替代地具有约55%的单-PEG-IL-10和约45%的二-PEG-IL-10，或者可替代地具有约45%的单-PEG-IL-10和约55%的二-PEG-IL-10。

PEG-IL-10试剂的生物活性通常通过评价受试者血清中的炎性细胞因子(例如，TNF-α或IFN-γ)的水平来测量，所述受试者用细菌抗原(脂多糖(LPS))攻击并且用PEG-IL-10来治疗，如美国专利号7,052,686中所述。

尽管PEG与IL-10的附接的方法或位点不是至关重要的，但在某些实施方案中，聚乙二醇化并不改变或仅最小程度改变IL-10试剂的活性。在某些实施方案中，半衰期的增加大于生物活性的任何降低。

适合于与IL-10多肽序列缀合的PEG在室温下通常可溶于水中，并且具有通式R(O-CH₂-CH₂)_nO-R，其中R是氢或保护基团，诸如烷基或烷醇基，并且其中n是1至1000的整数。当R是保护基团时，其通常具有1至8个碳。缀合至多肽序列的PEG可以是直链的或支链的。

本公开考虑支链PEG衍生物，“星状-PEG”和多臂PEG。

本公开中使用的PEG的分子量不限于任何具体范围。PEG-IL-10试剂的PEG组分可以具有大于约5kDa、大于约10kDa、大于约15kDa、大于约20kDa、大于约30kDa、大于约40kDa或大于约50kDa的分子量。在一些实施方案中，分子量是约5kDa至约10kDa、约5kDa至约15kDa、约5kDa至约20kDa、约10kDa至约15kDa、约10kDa至约20kDa、约10kDa至约25kDa或约10kDa至约30kDa。

本公开还考虑缀合物的组合物，其中PEG具有不同的n值，并且因此各种不同的PEG以特定比率存在。例如，一些组合物包含缀合物的混合物，其中n=1、2、3和4。在一些组合物中，在n=1时，缀合物的百分比是18%-25%；在n=2时，缀合物的百分比是50%-66%；在n=3时，缀合物的百分比是12%-16%；并且在n=4时，缀合物的百分比最多达5%。此类组合物可以通过本领域中已知的反应条件和纯化方法来产生。色谱法可以用于解析缀合物级分，并且然后鉴别含有例如附接有期望数目的PEG的缀合物的级分，将所述级分纯化使其不含未修饰的蛋白序列并且不含附接有其他数目的PEG的缀合物。

适合于与IL-10多肽序列缀合的PEG在室温下通常可溶于水中，并且具有通式R(O-CH₂-CH₂)_nO-R，其中R是氢或保护基团，诸如烷基或烷醇基，并且其中n是1至1000的整数。当R是保护基团时，其通常具有1至8个碳。

两种广泛使用的第一代活化单甲氧基PEG (mPEG)是琥珀酰亚胺碳酸酯PEG(SC-PEG；参见，例如，Zalipsky等人(1992) Biotehnol. Appl. Biochem 15:100-114；以及Miron和Wilcheck (1993) Bio-conjug. Chem. 4:568-569)；以及苯并***碳酸酯PEG(BTC-PEG；参见，例如，Dolence等人，美国专利号5,650,234)，其优先与赖氨酸残基反应以形成氨基甲酸酯键，但也已知与组氨酸和酪氨酸残基反应。已显示与某些分子(例如，IFNα)上的组氨酸残基的键是水解不稳定的咪唑氨基甲酸酯键(参见，例如，Lee和McNemar，美国专利号5,985,263)。第二代聚乙二醇化技术已被设计来避免这些不稳定的键以及残基反应性的选择性的缺乏。PEG-醛接头的使用通过还原氨化靶向多肽的N-末端上的单一位点。

缀合至多肽序列的PEG可以是直链的或支链的。本公开考虑支链PEG衍生物，“星状-PEG”和多臂PEG。可用于实施本发明的PEG的具体实施方案包括10kDa线性PEG-醛(例如，Sunbright® ME-100AL, NOF America Corporation, One North Broadway, WhitePlains, NY 10601 USA)，10kDa线性PEG-NHS酯(例如，Sunbright® ME-100CS, Sunbright® ME-100AS, Sunbright® ME-100GS, Sunbright® ME-100HS, NOF)，20kDa线性PEG-醛(例如，Sunbright® ME-200AL, NOF)，20kDa线性PEG-酯(例如，Sunbright® ME-200CS,Sunbright® ME-200AS, Sunbright® ME-200GS, Sunbright® ME-200HS, NOF)，20kDa2-臂支链PEG-醛，包含两个10kDA线性PEG分子的20kDA PEG-醛((例如，Sunbright® GL2-200AL3, NOF)，20kDa 2-臂支链PEG-NHS酯，包含两个10kDA线性PEG分子的20 kDA PEG-NHS酯(例如，Sunbright® GL2-200TS, Sunbright® GL200GS2, NOF)，40kDa 2-臂支链PEG-醛，包含两个20kDA线性PEG分子的40 kDA PEG-醛(例如，Sunbright® GL2-400AL3)，40kDa2臂支链PEG-NHS酯，包含两个20kDA线性PEG分子的40 kDA PEG-NHS酯(例如，Sunbright®GL2-400AL3, Sunbright® GL2-400GS2, NOF)，线性30kDa PEG-醛(例如，Sunbright®ME-300AL)和线性30kDa PEG-NHS酯。

聚乙二醇化最常发生于多肽的N-末端处的α-氨基、赖氨酸残基的侧链上的ε-氨基以及组氨酸残基的侧链上的咪唑基处。由于大多数重组多肽具有单个α以及多个ε-氨基和咪唑基，许多位置异构体可以根据接头化学性质来产生。本文可以应用本领域中已知的一般聚乙二醇化策略。

PEG可以通过末端反应性基团(“间隔基”)结合至本公开的IL-10多肽，所述末端反应性基团在多肽序列中的一个或多个的游离氨基或羧基和聚乙二醇之间介导键合。具有间隔基的可以结合至游离氨基的PEG包括N-羟基琥珀酰亚胺聚乙二醇，其可以通过用N-羟基琥珀酰亚胺活化聚乙二醇的琥珀酸酯来制备。可以结合至游离氨基酸的另一种活化的聚乙二醇是2,4-双(O-甲氧基聚乙二醇)-6-氯-s-三嗪，其可以通过使聚乙二醇单甲醚与氰尿酰氯反应来制备。结合至游离羧基的活化的聚乙二醇包括聚氧乙烯二胺。

本公开的IL-10多肽序列中的一个或多个与具有间隔基的PEG的缀合可以通过各种常规方法来实施。例如，缀合反应可以在pH为5至10的溶液中、在4℃至室温的温度下利用4:1至30:1的试剂与蛋白的摩尔比来实施30分钟至20小时。可以选择反应条件来将反应朝向主要产生期望取代程度引导。一般而言，低温、低pH (例如，pH=5)和短反应时间倾向于减少附接的PEG的数目，而高温、中性至高pH (例如，pH≥7)和较长反应时间倾向于增加附接的PEG的数目。本领域中已知的各种方式可以用于终止反应。在一些实施方案中，所述反应通过将反应混合物酸化并在例如-20℃冷冻来终止。例如在美国专利号5,252,714、5,643,575、5,919,455、5,932,462以及5,985,263中论述了各种分子的聚乙二醇化。例如在美国专利号7,052,686中描述了PEG-IL-10。考虑用于本文中使用的具体反应条件陈述于实验部分。

聚乙二醇化最常发生于多肽的N-末端处的α氨基、赖氨酸残基的侧链上的ε-氨基以及组氨酸残基的侧链上的咪唑基处。由于大多数重组多肽具有单个α以及多个ε-氨基和咪唑基，许多位置异构体可以根据接头化学性质来产生。本文可以应用本领域中已知的一般聚乙二醇化策略。

本公开的多肽序列中的一个或多个与具有间隔基的PEG的缀合可以通过各种常规方法来实施。例如，缀合反应可以在pH为5至10的溶液中、在4℃至室温的温度下利用4:1至30:1的试剂与蛋白的摩尔比来实施30分钟至20小时。可以选择反应条件来将反应朝向主要产生期望的取代程度引导。一般而言，低温、低pH (例如，pH=5)和短反应时间倾向于减少附接的PEG的数目，而高温、中性到高pH (例如，pH≥7)和较长反应时间倾向于增加附接的PEG的数目。本领域中已知的各种方式可以用于终止反应。在一些实施方案中，所述反应通过将反应混合物酸化并在例如-20℃冷冻来终止。例如在美国专利号5,252,714、5,643,575、5,919,455、5,932,462以及5,985,263中论述了各种分子的聚乙二醇化。例如在美国专利号7,052,686中描述了PEG-IL-10。

尽管本公开考虑通过技术人员已知的任何方式合成聚乙二醇化的IL-10，以下提供的用于产生单-PEG-IL-10和单-/二-PEG-IL-10的混合物的几种替代合成方案意图仅是说明性的。尽管单-PEG-IL-10和单-/二-PEG-IL-10的混合物两者具有许多相当的特性，但选择性聚乙二醇化的单-和二-PEG-IL-10的混合物提高最终聚乙二醇化产物的产率(参见，例如，美国专利号7,052,686和美国专利公布号2011/0250163)。除了在适合于实施本公开的PEG (以及其他药物递送技术)的产生和使用中利用其自身的技能，技术人员还熟悉许多PEG相关技术(以及其他药物递送技术)的商业供应商。通过实例的方式，NOF America Corp(Irvine, CA)供应单-官能线性PEG、双官能PEG、多臂PEG、支链PEG、杂官能PEG、分叉PEG以及可释放的PEG；并且Parchem (New Rochelle, NY)是PEG产品和其他特殊原材料的全球分销商。

示例性PEG-IL-10合成方案No.1。针对10 mM磷酸钠pH 7.0、100 mM NaCl对IL-10进行透析。使用透析缓冲液将透析的IL-10稀释3.2倍至约0.5至12 mg/mL的浓度。在添加接头SC-PEG-12K (Delmar Scientific Laboratories, Maywood, Ill.)之前，将1体积pH为9.1的100 mM四硼酸钠添加至9体积的稀释IL-10中以将IL-10溶液的pH升高至8.6。将SC-PEG-12K接头溶解于透析缓冲液中，并且将适当体积的接头溶液(1.8至3.6摩尔接头/摩尔IL-10)添加至稀释的IL-10溶液中以起始聚乙二醇化反应。在5℃下实施反应以便控制反应速率并且温和地搅动反应溶液。当如通过大小排阻HPLC (SE-HPLC)确定的单-PEG-IL-10产率接近40%时，通过添加1M甘氨酸溶液至30 mM的最终浓度来停止反应。使用HCl溶液将反应溶液的pH缓慢调节至7.0，并且以0.2微米过滤反应物并储存在-80℃下。

示例性PEG-IL-10合成方案No.2。使用甲氧基-PEG-醛(PALD-PEG)作为接头(Inhale Therapeutic Systems Inc., Huntsville, AL；也可得自NOF America Corp(Irvine, CA))来制备单-PEG-IL-10。PALD-PEG可以具有5 KDa、12 KDa或20 KDa的分子量。如上所述透析和稀释IL-10，例外的是反应缓冲液的pH是在6.3和7.5之间。以1:1摩尔比将活化的PALD-PEG接头添加至反应缓冲液。将水性氰基氢硼酸盐添加至反应混合物中至0.5至0.75 mM的最终浓度。在室温(18℃-25℃)下，在温和搅动下实施反应，持续15-20小时。将反应物用1M甘氨酸淬灭。通过SE-HPLC分析产率。通过凝胶过滤色谱法将单-PEG-IL-10与未反应的IL-10、PEG接头和二-PEG-IL-10分离，并且通过RP-HPLC和生物测定(例如，刺激IL-10-应答细胞或细胞系)来对所述单-PEG-IL-10进行表征。

示例性PEG-IL-10合成方案No.3。针对pH范围为5-7.4的50 mM磷酸钠、100 mM氯化钠对IL-10 (例如，啮齿类动物或灵长类动物)进行透析。在0.75-30 mM氰基硼氢化钠存在的情况下，在1-12 mg/mL的浓度下以1:1 - 1:7摩尔比使5K PEG-丙醛与IL-10反应。可替代地，反应可以类似的方式用甲基吡啶甲硼烷来活化。将反应物在5℃-30℃下孵育3-24小时。将聚乙二醇化反应物的pH调节至6.3，并且使7.5 mg/mL的hIL-10与PEG反应，以使IL-10与PEG接头的比率为1:3.5。氰基氢硼酸盐的最终浓度为约25 mM，并且在15℃下将反应实施12-15小时。单-和二-PEG IL-10是反应的最大产物，其中各浓度在终止时为约45%-50%。可以使用氨基酸诸如甘氨酸或赖氨酸，或者可替代地Tris缓冲液来淬灭反应。可以采用多种纯化方法诸如凝胶过滤、阴离子和阳离子交换色谱法以及大小排阻HPLC (SE-HPLC)以分离期望的聚乙二醇化的IL-10分子。

在本发明的一个实施方案中，修饰的IL-10试剂是糖基化的IL-10。出于本公开的目的，“糖基化”意图广义是指将聚糖附接至蛋白、脂质或其他有机分子的酶促过程。结合本公开使用的术语“糖基化”通常意指添加或缺失一个或多个碳水化合物部分(通过除去潜在的糖基化位点或通过经由化学和/或酶促方式缺失糖基化)，和/或添加在天然序列中可能存在或不存在的一个或多个糖基化位点。此外，所述短语包括天然蛋白的糖基化中的性质变化，其涉及存在的各种碳水化物部分在性质和比例上的变化。糖基化可以显著影响多肽诸如IL-10的物理特性(例如，溶解度)并且对于蛋白稳定性、分泌和亚细胞定位来说可能也是重要的。糖基化的多肽还可以表现出增强的稳定性或者可以改进一种或多种药代动力学特性诸如半衰期。此外，溶解度改进可以例如使得能够产生与包含非聚乙二醇化的多肽的制剂相比更适合于药物施用的制剂。

糖基化位点的添加可以通过改变IL-10多肽的氨基酸序列来完成。对IL-10多肽的改变可以例如通过添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(针对O-连接糖基化位点)或天冬酰胺残基(针对N-连接糖基化位点)或用其取代来进行。N-连接和O-连接的寡糖以及在各类型中存在的糖残基的结构可以是不同的。在两者中都常见的一种类型的糖是N-乙酰神经氨酸(下文称为唾液酸)。唾液酸通常是N-连接和O-连接的寡糖两者的末端残基，并且凭借其负电荷，可以为糖蛋白赋予酸性特性。本公开的一个具体实施方案包括N-糖基化变体的产生和使用。包含修饰的氨基酸序列以并入糖基化位点的IL-10多肽的实例提供于，例如，2016年3月10日公开的Van Vlasselaer, 等人, 美国专利申请公开号US20160068583 A1。本公开的IL-10多肽序列可以任选地通过核酸水平的变化，特别是通过使编码多肽的核酸在预先选择的碱基处突变以使得产生将翻译成期望氨基酸的密码子以促进糖基化位点的引入来改变。

在本发明的一个实施方案中，修饰的IL-10试剂是多唾液酸化的IL-10。术语“多唾液酸化”是指多肽缀合至天然存在的、生物可降解的α-(2→8)连接的唾液酸(“PSA”)以便改进多肽的稳定性和体内药代动力学。PSA是生物可降解的、无毒的天然聚合物，其是高度亲水的，这赋予其在血液中的增加其血清半衰期的高表观分子量。此外，一系列肽和蛋白治疗剂的多唾液酸化已导致蛋白水解的显著减少、体内活性的保留以及免疫原性和抗原性的降低(参见，例如，G. Gregoriadis等人，Int. J. Pharmaceutics 300(1-2):125-30)。各种用于位点特异性多唾液酸化的技术是可用的(参见，例如，T. Lindhout等人, PNAS 108(18)7397-7402 (2011))。

在本发明的一个实施方案中，将修饰的IL-10试剂缀合至白蛋白，在本文中称为“IL-10白蛋白融合体”。在IL-10白蛋白融合体的背景下所用的术语“白蛋白”包括白蛋白诸如人血清白蛋白(HSA)、猕猴血清白蛋白和牛血清白蛋白(BSA)。根据本公开，白蛋白可以在羧基末端、氨基末端、羧基末端和氨基酸两者以及内部缀合至IL-10多肽(例如，本文描述的多肽) (参见，例如，USP 5,876,969和USP 7,056,701)。在本公开所涵盖的HSA-IL-10多肽缀合物中，可以使用各种形式的白蛋白，诸如白蛋白分泌前序列及其变体、片段及其变体以及HSA变体。此类形式通常具有一种或多种期望的白蛋白活性。在另外的实施方案中，本公开涉及融合蛋白，所述融合蛋白包含直接或间接地融合至白蛋白、白蛋白片段和白蛋白变体等的IL-10多肽，其中融合蛋白具有比非融合的药物分子更高的血浆稳定性和/或融合蛋白保留非融合的药物分子的治疗活性。在一些实施方案中，间接融合通过接头诸如肽接头或其修饰形式来实现。

可替代地，IL-10白蛋白融合体包含IL-10多肽，其为包含白蛋白结合结构域(ABD)多肽序列和IL-10多肽的融合蛋白。如上所述，包含白蛋白结合结构域(ABD)多肽序列和IL-10多肽的融合蛋白可以例如通过遗传操纵、使得编码HSA或其片段的核酸连接至编码一个或多个IL-10多肽序列的核酸来实现。

用于缀合至IL-10试剂的另外合适的组分和分子包括例如甲状球蛋白；破伤风类毒素；白喉类毒素；聚氨基酸诸如聚(D-赖氨酸:D-谷氨酸)；轮状病毒的VP6多肽；流感病毒血凝素、流感病毒核蛋白；钥孔䗩血蓝蛋白(KLH)；以及乙型肝炎病毒核心蛋白和表面抗原；或前述的任何组合。

本公开考虑一种或多种另外的组分或分子在多肽序列的N-末端和/或C-末端处的缀合，所述组分或分子诸如另一种多肽(例如，具有与本多肽异源的氨基酸序列的多肽)或载体分子。因此，示例性多肽序列可以提供为与另一种组分或分子缀合的缀合物。

IL-10多肽还可以缀合至大的代谢缓慢的大分子诸如蛋白；多糖，诸如琼脂糖凝胶、琼脂糖、纤维素或纤维素珠粒；多聚氨基酸，诸如聚谷氨酸或聚赖氨酸；氨基酸共聚物；灭活病毒颗粒；灭活细菌毒素，诸如来自白喉、破伤风、霍乱或白细胞毒素分子的毒素；灭活细菌；以及树突细胞。此类缀合形式(如果期望)可以用于产生针对本公开的多肽的抗体。

另外用于缀合的候选组分和分子包括适合于分离或纯化的那些组分和分子。具体的非限制性实例包括结合分子，诸如生物素(生物素-抗生物素蛋白特异性结合对)、抗体、受体、配体、凝集素或包含固体支持物的分子，所述固体支持物包括例如塑料或聚苯乙烯珠粒、板或珠粒、磁珠、测试条和膜。

在某些实施方案中，本公开的IL-10多肽序列的氨基末端或羧基末端可以与免疫球蛋白Fc区(例如，人Fc)融合以形成融合缀合物(或融合分子)。已显示Fc融合缀合物增加生物药剂的***半衰期，并且因此生物药剂产品可以要求较低频率的施用。Fc结合内衬在血管内的内皮细胞中的新生Fc受体(FcRn)，并且在结合后，Fc融合分子被保护免于降解和再释放至循环中，将分子更长久地保持在循环中。这种Fc结合据信是内源性IgG保留其长血浆半衰期的机制。与传统的Fc-融合缀合物相比，更近来的Fc-融合技术将生物药剂的单一拷贝连接至抗体的Fc区以优化生物药剂的药代动力学和药效学特性。

本公开考虑IL-10试剂的用于改进一种或多种特性的目前已知的或将来开发的其他修饰的使用。实例包括羟乙基淀粉化，其各个方面被描述于例如美国专利申请号2007/0134197和2006/0258607中；以及包含作为融合标签的SUMO的IL10多肽融合分子(LifeSensors, Inc.; Malvern, PA)。

本公开还考虑IL-10试剂，其中所述IL-10多肽是IL-10多肽和PEG模拟物的融合蛋白。已经开发了保留PEG的属性(例如，增强的血清半衰期)、同时赋予几种另外的有利特性的多肽PEG模拟物。通过实例的方式，可以重组地产生能够形成与PEG类似的延展构象、已融合至目标肽或蛋白药物的简单的多肽链(包含例如Ala、Glu、Gly、Pro、Ser以及Thr) (例如，Amunix’ XTEN技术；Mountain View, CA)。可以通过重组方式通过表达编码该融合蛋白的核酸序列来产生包含此类多肽序列的融合蛋白的IL-10试剂，而在制造过程期间无需另外的缀合步骤。此外，确立的分子生物学技术使得能够控制多肽链的侧链组成，允许优化免疫原性和生产特性。

上文已描述了接头及其使用。用于修饰本公开的多肽序列的前述组分和分子中的任一个可以任选地通过接头来缀合至IL-10试剂或IL-10多肽。合适的接头包括“柔性接头”，所述柔性接头通常具有足够的强度以允许在修饰的多肽序列和连接的组分和分子之间的一些移动。接头分子通常是约6-50个原子长。接头分子还可以是例如芳基乙炔基、含有2-10个单体单元的乙二醇寡聚物、二胺、二酸、氨基酸或其组合。可以容易地选择合适的接头，并且所述合适的接头可以具有任何合适的长度，诸如1个氨基酸(例如，Gly)、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30、30-50或多于50个氨基酸。

柔性接头的实例包括甘氨酸聚合物(G)_n，甘氨酸-丝氨酸聚合物(例如，(GS)_n、GSGGS_n (SEQ ID NO:9)和GGGS_n (SEQ ID NO:10)，其中n是至少为1的整数)，甘氨酸-丙氨酸聚合物，丙氨酸-丝氨酸聚合物以及其他柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，并且因此可以用作组分之间的中性栓系物(tether)。

柔性接头的另外的实例包括甘氨酸聚合物(G)_n，甘氨酸-丙氨酸聚合物，丙氨酸-丝氨酸聚合物，甘氨酸-丝氨酸聚合物(例如，(G_mS_o)_n、(GSGGS)_n (SEQ ID NO:28)、(G_mS_oG_m)_n,(G_mS_oG_mS_oG_m)_n (SEQ ID NO:29)、(GSGGS_m)_n (SEQ ID NO:30)、(GSGS_mG)_n (SEQ ID NO:31)和(GGGS_m)_n (SEQ ID NO:32)以及其组合，其中m、n和o各自独立地选自至少1至20，例如1-18、2-16、3-14、4-12、5-10、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数)以及其他柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，并且因此可以用作组分之间的中性栓系物。柔性接头的实例包括但不限于GGSG (SEQ ID NO:33)、GGSGG (SEQ ID NO:34)、GSGSG (SEQ ID NO:35)、GSGGG (SEQ ID NO:36)、GGGSG (SEQ ID NO:37)和GSSSG (SEQ ID NO:38)。

另外的柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)_n或甘氨酸-丝氨酸聚合物(例如，(GS)_n、(GSGGS)_n (SEQ ID NO:9)、(GGGS)_n (SEQ ID NO:10)和(GGGGS)_n (SEQ ID NO:39)，其中n=1至50，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30、30-50。示例性柔性接头包括但不限于GGGS (SEQ ID NO:40)、GGGGS (SEQ ID NO:41)、GGSG (SEQ ID NO:33)、GGSGG (SEQ IDNO:34)、GSGSG (SEQ ID NO:35)、GSGGG (SEQ ID NO:36)、GGGSG (SEQ ID NO:37)和GSSSG(SEQ ID NO:38)。这些接头序列的多聚体(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30或30-50)可以连接在一起以提供可以用于将异源氨基酸序列缀合至本文公开的多肽的柔性接头。如本文所述，异源氨基酸序列可以是信号序列和/或融合配偶体，诸如白蛋白、Fc序列等。

肿瘤疾病的治疗：

本公开考虑施用IL-10试剂(例如，PEG-IL-10)与一种或多种免疫检查点途径调节剂的组合，用于治疗和/或预防受试者中的肿瘤疾病以及与肿瘤疾病相关的疾病、病症或病况。

本公开的组合物和方法特别适合于***病况，对于所述肿瘤病况，PD1途径抑制剂已经通过FDA批准用于治疗该疾病或在临床试验中证明临床效力而在人类中证明临床效果，所述肿瘤病况包括但不限于黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈癌、肾细胞癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫***、子宫肉瘤、胃癌、食道癌、 DNA错配修复缺陷的结肠癌、DNA错配修复缺陷的子宫内膜癌、肝细胞癌、乳腺癌、默克尔细胞癌、甲状腺癌、霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、外周性T细胞淋巴瘤。

对免疫检查点途径抑制剂的治疗应答通常比对传统化疗、诸如酪氨酸激酶抑制剂的应答迟很多来表现自身。在一些情况下，在用免疫检查点途径抑制剂开始治疗之后，可能花六个月或更多个月才能观察到治疗应答的客观指标。此外，在涉及抗CTLA4抗体治疗的一些情况下，转移性病变在后续消退之前通过计算机断层成像(CT)或磁共振成像(MRI)扫描发现大小实际上是增加的[参见，例如，Pardoll, (2012) Nature Rev. Cancer 12:252-64]。因此，关于是否用免疫检查点途径抑制剂与本公开的IL-10试剂(例如，PEG-IL-10)的组合进行治疗的决定必须在往往比常规化疗剂更长的进展时间内作出。期望的应答可以是在多种情况下被认为有利的任何结果。在一些实施方案中，期望的应答是疾病、病症或病况的进展的预防，而在其他实施方案中，期望的应答是疾病、病症或病况的一个或多个特征的消退或稳定(例如，肿瘤大小的减小)。在还有其他实施方案中，期望的应答是与所述组合的一种或多种试剂相关的一种或多种副作用的减少或消除。

确定治疗癌症的临床效力通常与获得一种或多种本领域公认的参数相关，所述参数诸如病变的减少，尤其是减少转移性病变的减少，转移的减少，肿瘤体积的减小，ECOG评分的改善等。确定对治疗的应答可以通过测量生物标志物来评价，所述生物标志物可以提供可用于IL-10或免疫检查点途径调节剂的任何方面中的可复制信息，包括受试者对这种治疗的应答的存在和程度以及由这种治疗引起的不利作用的存在和程度。通过实例的方式，但不限制，与PD1/PDL1相关的生物标志物包括IFNγ的增强以及粒酶A、粒酶B和穿孔素的上调；与BTLA相关的生物标志物包括CD8+ T细胞数目和功能的增加；与CTLA4相关的生物标志物包括IFNγ的增强，粒酶A、粒酶B和穿孔素的上调以及CD8+ T细胞上ICOS表达的增加；与TIM3相关的生物标志物包括粒酶A、粒酶B以及穿孔素的上调；并且与LAG3相关的生物标志物包括IL-10表达T_调节细胞的增强。已知效应分子IP-10 (可诱导蛋白10)和MIG (由IFNγ诱导的单核因子)的表达在某些表达IL-10的肿瘤中通过LPS或IFNγ增加；这些效应分子也可以用作通过本文描述的组合治疗可以增强的潜在的血清生物标志物。对治疗的应答可以通过临床效力的常规量度来表征，可以采用所述临床效力的常规量度，诸如完全应答(CR)、部分应答(PR)、疾病稳定(SD)，和关于靶标病变，如通过RECIST所定义的完全应答(CR)、不完全应答/疾病稳定(SD)以及所定义的免疫相关的应答标准(irRC)、免疫相关的部分应答(irPR)和免疫相关的疾病稳定(irSD)。免疫相关的应答标准(irRC)可以被视为证明在***疾病方面的效力。

另外的实施方案包括用于确定组合中的试剂的最佳量的方法或模型。最佳量可以是例如在受试者或受试者群体内实现最佳效果的量，或实现治疗效果，同时最小化或消除与所述试剂中的一种或多种相关的副作用的量。在一些实施方案中，已知或已确定IL-10和免疫检查点途径抑制剂的组合自身有效治疗或预防受试者(例如，人)或受试者群体中的本文描述的疾病、病症或病况(例如，癌症)，并且一种试剂的量是逐步增加的，而另一种试剂的量保持恒定。通过以此方式操纵试剂的量，临床医师能够确定对于例如治疗特定疾病、病症或病况，或者消除副作用或者减少副作用而言最有效的试剂的比率，使得所述试剂在多种情况下是可接受的。

也许已经用抗PD1单克隆抗体派姆单抗(Keytruda®)和尼沃单抗获得了最深入研究的具有最丰富临床经验的免疫治疗。这些产品已证明显著的有效性，并且现在目前享有用于各种各样癌症的多项批准。这些试剂的临床经验已经证明指向最大成功机会的一系列参数。抗PD1治疗已经证明在其中存在高水平的PDL1表达(Garon等人 (2015) New EnglandJournal of Medicine 372:2018-2028)、其中所述肿瘤具有肿瘤突变负荷(Rizvi等人,Science (2015) Science 348:124-128; Carbone等人 (2017) New England Journal ofMedicine 376:2415-2426)、其中肿瘤中存在高水平的CD8+ T细胞(Tumeh等人, (2014)Nature 515:568-571)，与IFNγ相关的免疫活化特征(Prat等人 (2017) Cancer Research77(13):OF1-OF11), Cancer Res. 2017; Ayers等人 (2107) J. ClinicalInvestigation 127:2930-2940)，以及缺乏转移性疾病、尤其是肝转移(Tumeh等人 (2017)Cancer Imm. Research 5:417-424); Pillai等人 (2017) ) J. Clin. Oncology 34:15suppl. e20665-e20665的那些肿瘤中的最高水平的有效性。这些因素将PD1治疗的有效性限于相对小范围的肿瘤。各种各样的肿瘤具有低的新抗原负荷与稀有的新抗原特异性CD8+t细胞，且具有高的新抗原负荷的肿瘤已经最终逃避ICI。在其他情况下，肿瘤微环境中存在免疫沙漠，再那里，T细胞已耗尽并凋亡，T细胞表达的缺乏导致肿瘤中的粒酶和IFNγ表达水平低。IL-10单一治疗解决了这些参数中的许多。已经观察到IL-10增加肿瘤内CD8+ T细胞的活性，增加粒酶、FasL和IFNγ的水平。Mumm等人, (2011) Cancer Cell 20(6):781- 796; Emmerich,等人, (2012) Cancer Research 72(14):3570-81; Oft, (2014) Cancer Immunology Research.72(14):3570-81)。由于IL-10在解决这些障碍方面确立的效用，我们评估IL-10试剂与抗PD1 Mab治疗的组合。

AM0010，包含单-和双-聚乙二醇化的IL-10的混合物的hIL-10的聚乙二醇化形式，已在多项临床试验中进行评估，并且已显示作为单一试剂被良好耐受(144名患者依从性良好，在开始治疗后最长达2.5年)。术语AM0010是指重组人白介素10 (rHuIL-10)，其包含单和双聚乙二醇化的IL-10多肽的混合物，并采用通过接头附接至IL-10多肽的N-末端的5kDa聚乙二醇(PEG)。AM0010是非糖基化的同二聚蛋白，其由两个非共价缔合的rHuIL-10多肽单体构成，其中每个单体由161个氨基酸构成，包括由直接重组产生导致的天然人IL-10多肽中不存在的N-末端甲硫氨酸，每个单体包含两个分子内二硫键，第一个在161个氨基酸的rHuIL-10多肽的位置13和109处的半胱氨酸之间，且第二个在161个氨基酸的rHuIL-10多肽的位置63和115处的半胱氨酸之间(对应于天然存在的hIL-10多肽的位置12和108以及位置62和114处的半胱氨酸)。从AM0010单一治疗观察到的TrAE是可控和可逆的，并且没有持久的自身免疫相关的TrAE，诸如结肠炎、肺炎、肝炎或内分泌失调。在这些研究中，每天皮下剂量为20微克/kg的AM0010单一治疗诱导肾细胞癌(RCC，25% ORR)、葡萄膜黑色素瘤中的客观应答以及皮肤T细胞淋巴瘤中的CR(其具有最长达2.5年的持久应答)并延长CRC和PDAC中的疾病稳定。

没有AM0010的情况下，CD8+ T细胞识别肿瘤细胞，被耗尽并经历凋亡。有AM0010的情况下，识别肿瘤的CD8+ T细胞被活化并增殖。AM0010抑制CD8+ T细胞凋亡，并诱导粒酶和FasL(其诱导肿瘤细胞死亡)，并且AM0010引发持续的免疫记忆。AM10单一治疗的主要剂量是每天皮下施用的2 mg或(20微克/kg)。

为了评估IL-10试剂与免疫检查点调节剂的组合，进行涉及57名患有肾细胞癌(RCC)的人受试者的临床试验，以比较AM0010单一治疗与两个不同剂量的AM0010各自与抗PD1免疫检查点途径拮抗剂派姆单抗和尼沃单抗组合的组合。患者群体和研究设计概述于下表3中。

表3. RCC临床试验设计

派姆单抗(Keytruda®, Merck and Co, Rahway NJ)以160 mg (2mg/kg)的剂量施用，其每三周静脉内施用。尼沃单抗(Opdivo®, BristolMyers Squibb, Princeton NJ)根据240 mg (3mg/kg)的修订标签批准剂量施用，其每两周静脉内施用。在单一治疗组中，AM0010以20微克/kg的剂量每天皮下施用，并且在每个抗PD1组合治疗组中，AM0010以10微克/kg和20微克/kg各自每天皮下施用。该研究的结果概述于下表4和表5中以及附图的图4中。

表4. RCC临床试验结果

表5. RCC临床试验结果

如从上面呈现的数据可见，AM0010单一治疗组中的56%的可评估患者表现出持久的临床应答(DCR)，其具有近似25%的客观应答率(ORR)。然而，前述数据显示，与AM0010单一治疗或抗PD1单一治疗(基于文献报道的结果)相比，AM0010与PD1检查点抑制剂的组合导致显著改进的结果。AM0010与派姆单抗(Keytruda®)的组合显示在100%的接受AM0010与10和20微克/kg剂量两者的派姆单抗的组合的患者中的DCR以及50%的总ORR。类似地，在接受尼沃单抗与AM0010(剂量为10毫克/kg)的组合的患者中显示100% DCR，并且70%的20 毫克/kg剂量的AM0010的患者显示81%的DCR以及42%的组合ORR。在RCC中施用尼沃单抗后RCC中的应答率的文献报道证明近似57-65%的ORR以及近似20-22%的ORR (Motzer, 等人, Nivolumab for Metastatic Renal Cell Carcinoma: Results of a Randomized Phase II Trial,(2015) Journal of Clinical Oncology 33(13):1430-1437)和25%的ORR (Mazza, 等人(2017) Nivolumab in renal cell carcinoma: latest evidence and clinical potential, Therapeutic Advances in Medical Oncology Vol. 9(3) 171–18)。这些数据证明，IL-10试剂(AM0010)与免疫检查点途径抑制剂(例如，尼沃单抗和派姆单抗)的组合在治疗人受试者中的肾细胞癌中导致治疗结果的显著改善。

该研究的第二个焦点是评估与组合治疗相关的不良事件。由该研究产生的不良事件的结果显示于下表6中。

表6. RCC试验不良事件

前述数据证明，在每种剂量的AM0010与派姆单抗(2mg/kg, q3w)或尼沃单抗(3mg/kg, q2w)的组合下，AM10和抗PD-1的组合在肾细胞癌患者中被良好耐受。尽管所有3级和4级不良事件都是短暂的且已解决，但根据上述效力数据，基于此有限的临床数据，剂量为10mcg/kg的AM10与PD1途径抑制剂的组合看起来是优选的。

与前述RCC研究平行，在患有非小细胞肺癌(NSCLC)的受试者中进行另一项临床研究，以评估人受试者中的IL-10试剂(AM0010)组合PD1免疫检查点途径抑制剂(例如尼沃单抗和派姆单抗)的组合。在该研究中，评估肿瘤样品的PDL1表达水平。该研究设计类似于上述RCC研究，其中患者群体在研究开始前未接受抗PD1治疗。研究设计和患者群体数据概述于下表7中。“低PD-L1表达”是指小于1%的细胞表面PD-L1表达的水平；“中等PD-L1表达”是指1%至49%的细胞表面PD-L1表达的水平；且“高PD-L1表达”是指等于或大于50%的细胞表面PD-L1表达的水平，其中PD-L1表达根据本领域中可用的方法(诸如Rizzi等人(2015)Science 348:124-128中)进行评价。

表7. NSCLC临床试验设计

派姆单抗(Keytruda®)以160 mg (2mg/kg)的剂量施用，其每三周静脉内施用。尼沃单抗(Opdivo®)根据240 mg (3mg/kg)的修订标签批准剂量施用，其每两周静脉内施用。AM0010基本上如上制备，并且在单一治疗组中，AM0010以20微克/kg的剂量每天皮下施用，并且在每个抗PD1组合治疗组中，AM0010以10微克/kg和20微克/kg各自每天皮下施用。该研究的结果概述于下表8中以及附图的图3中。

表8. NSCLC临床试验结果

如从上面呈现的数据可见，AM0010单一治疗组中的57%的可评估患者(7/9)表现出持久的临床应答(DCR)。然而，数据显示，与AM0010单一治疗或抗PD1单一治疗(基于文献报道的结果)相比，AM0010与PD1检查点抑制剂的组合提供了显著增强的治疗结果。AM0010与派姆单抗(Keytruda®)的组合显示在100%的接受AM0010与10和20微克/kg剂量两者的派姆单抗的组合的患者中的DCR(针对组合的两种AM0010剂量的数据)以及40%的总ORR(针对组合的两种AM0010剂量的数据)。类似地，在接受尼沃单抗与AM0010(剂量为10和20微克/kg)的组合的患者中，显示82%的DCR(针对组合的两种AM0010剂量的数据)与42%的ORR(针对组合的两种AM0010剂量的数据)。施用派姆单抗后NSCLC中的应答率的文献报道证明，抗PD1单一治疗的DCR为41%，且ORR为近似20-22% (Garon, 等人 (2015) NEJM 372:2018-28)。这些数据证明，IL-10试剂(AM0010)与免疫检查点途径抑制剂(例如，尼沃单抗和派姆单抗)的组合在治疗人受试者中的非小细胞肺癌中导致治疗结果的显著改善。

值得注意的是，在该研究中基于PDL1状态观察到的应答。如先前注意到的，低PDL1状态通常与响应于抗PD1途径抑制剂(诸如派姆单抗和尼沃单抗)的不良预后相关。与作为PDL1表达的因素的ORR相关的数据概述于下表中。

表9. 相对于PDL1表达的NSCLC试验结果

如前述数据所示，通过将AM0010与抗PD1抗体派姆单抗和尼沃单抗组合(上文收集的数据)，表明在PDL1的所有表达水平上的ORR的显著增加。然而，也许最值得注意的是，NSCLC在低(<1%) PDL1表达水平的应答率(其中组合显示33%的ORR(相比于派姆单抗单一治疗历史数据，ORR增加362%))和在中等(1%-49%) PDL1表达水平的应答率，其显示67%的ORR(相比于派姆单抗单一治疗历史数据，ORR改善429%)。这些数据证明，IL-10试剂(AM0010)与免疫检查点途径抑制剂(例如，尼沃单抗和派姆单抗)的组合在治疗人受试者中的非小细胞肺癌中导致治疗结果的显著改善，甚至在肿瘤中PDL1的表达水平低或中等的情况下。

具有低肿瘤突变负荷的肿瘤中的效果：

在上述NSCLC研究的过程中评估的另一个参数是肿瘤突变负荷。如Carbone等人所报道，111名具有低或中等肿瘤突变负荷的NSCLC患者中的23名(21%)具有对单独的尼沃单抗的应答率(n = 23/111，21%)。与之相比，具有低或中等TMB的八名患者中的五名(60%)表现出对AM0010与抗PD1的组合的PR，如下表10和附图的图1中所概述。

这些数据证明，IL-10试剂(AM0010)与免疫检查点途径抑制剂(例如，尼沃单抗和派姆单抗)的组合在治疗具有低TMB的人受试者中的非小细胞肺癌中导致治疗结果的显著改善，甚至在低或中等PDL1表达水平(两种因素被认为针对PD1治疗缓解)存在的情况下。

AM0010与派姆单抗的组合对转移性疾病的影响。

转移是癌症发病率和死亡率的主要原因，占癌症死亡的近似90%。Chaffer &Weinberg (2011). A perspective on cancer cell metastasis, Science. 331:1559–64. 具有肝转移的患者具有对免疫检查点抑制的较低总体应答率。Tumeh等人 (2017);Pillai等人(2017) 同上。在前述NSCLC研究中，进行肝转移的评估，并且结果呈现于附图的图5和6中。如所举例说明，在治疗的过程中，AM0010与派姆单抗的组合导致可测量的肝转移病变的显著减少。

根据IFNγ-相关基因表达概况的AM0010与抗PD1 Mab治疗的组合的影响

如文献中所报道，具有低IFNγ-相关基因表达概况(例如STAT1、HLA-DRA、CXCL9、IDO、IFNγ和CXCL10的表达)的患者具有对派姆单抗的降低应答率(Prat等人 (2017) 同上;Ayers等人 (2017) 同上。作为上述NSCLC研究的一部分，评估根据IFNg-相关基因表达概况的对AM0010组合抗PD1 mAb治疗的组合的治疗应答。结果呈现于附图的图2中。如所举例说明，具有低IFNγ-相关基因表达概况的(五名患者中的)两名患者具有响应于AM0010与抗PD-1 mAb治疗的组合的部分应答，其中另外2名受试者表现出持续超过6个月的稳定疾病。

在患有肿瘤疾病的人受试者中产生的前述临床数据证明，IL-10试剂的施用与至少一种免疫检查点途径的至少一种调节剂的施用的组合(其中所述调节剂为阳性免疫检查点途径的激动剂或阴性免疫检查点途径的拮抗剂)有效地治疗哺乳动物受试者中的肿瘤疾病。

在患有肿瘤疾病的人受试者中产生的前述临床数据证明，IL-10试剂的施用与至少一种免疫检查点途径的至少一种调节剂的施用的组合(其中所述调节剂为阳性免疫检查点途径的激动剂或阴性免疫检查点途径的拮抗剂)有效地治疗其中肿瘤具有低或中等肿瘤突变负荷的哺乳动物受试者中的肿瘤疾病。

在患有肿瘤疾病的人受试者中产生的前述临床数据证明，IL-10试剂的施用与至少一种免疫检查点途径的至少一种调节剂的施用的组合(其中所述调节剂为阳性免疫检查点途径的激动剂或阴性免疫检查点途径的拮抗剂)有效地治疗其中肿瘤具有低或中等水平的免疫检查点分子的表达的哺乳动物受试者中的肿瘤疾病。

在患有肿瘤疾病的人受试者中产生的前述临床数据证明，IL-10试剂的施用与至少一种免疫检查点途径的至少一种调节剂的施用的组合(其中所述调节剂为阳性免疫检查点途径的激动剂或阴性免疫检查点途径的拮抗剂)有效地治疗哺乳动物受试者中的转移性肿瘤疾病。

在患有肿瘤疾病的人受试者中产生的前述临床数据证明，IL-10试剂的施用与至少一种免疫检查点途径的至少一种调节剂的施用的组合(其中所述调节剂为阳性免疫检查点途径的激动剂或阴性免疫检查点途径的拮抗剂)有效地治疗具有低或中等IFNγ-相关基因表达概况的受试者中的肿瘤疾病，所述IFNγ-相关基因表达概况包含选自以下的基因中的一种或多种：STAT1、HLA-DRA、CXCL9、IDO、IFNγ和CXCL10。

本公开进一步提供了用IL-10试剂(例如，PEG-IL-10)、一种或多种免疫检查点途径调节剂和至少一种另外治疗或诊断试剂***疾病的方法。此类进一步的组合被称为“补充组合”、“补充组合治疗”，并且被添加至IL-10和一种或多种免疫检查点途径调节剂的组合的试剂可以被称为“补充剂”。

此类“补充剂”的实例包括化疗剂。术语“化疗剂”包括但不限于烷化剂，诸如噻替哌及环磷酰胺；烷基磺酸酯，诸如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮杂环丙烷，诸如苯柔多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、甲基多巴(meturedopa)及普力多巴(uredopa)；乙烯亚胺及甲基三聚氰胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙烯三聚氰胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺及三羟甲基三聚氰胺；氮芥，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酸胺、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、盐酸二氯甲基二乙胺氧化物、马法兰、新氮芥(novembichin)、苯芥胆固醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥末；亚硝基脲，诸如卡莫司汀、氯脲菌素(chlorozotocin)、福替目丁(fotemustine)、洛莫司汀、嘧啶亚硝脲(nimustine)、雷莫司汀(rani mustine)；抗生素，诸如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、蒽霉素(authramycin)、重氮乙酰丝氨酸、博来霉素(bleomycin)、放线菌素(cactinomycin)、卡奇霉素(calicheamicin)、卡拉比辛(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、更生霉素、柔红霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、紫菜霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢剂，诸如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧旋(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、氨甲蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、氮杂胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷、5-FU；雄激素，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺(aldophosphamide)葡糖苷；氨基乙酰丙酸；安丫啶(amsacrine)；贝曲布索(bestrabucil)；比山群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；迪氟法迈(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾氟米辛(elformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidamine)；丙酮双脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)，吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸；2-乙基肼；甲基苄肼；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三乙撑亚胺苯醌(triaziquone)；2,2',2''-三氯三乙胺；聚胺酯(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴脱氧己六醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；嘉胞苷(gacytosine)；阿糖胞苷("Ara-C")；环磷酰胺；塞替派；紫杉醇，例如例如太平洋紫杉醇和多西紫杉醇、苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；氨甲蝶呤；铂和铂配位复合物，诸如顺铂及卡铂；长春碱；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷；柔红霉素；氨基喋呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT11；拓扑异构酶抑制剂；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸；埃斯波霉素(esperamicin)；卡培他滨；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。术语“化疗剂”还包括调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗***，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制剂4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛西芬(keoxifene)、奥那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene)；以及抗雄激素，诸如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、醋酸亮丙瑞林和戈舍瑞林(goserelin)；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方案中，所述补充剂可以是本领域中鉴别为可用于***疾病的一种或多种化学或生物学试剂，包括但不限于细胞因子或细胞因子拮抗剂诸如IL-12、INFα或抗表皮生长因子受体，放射治疗，针对肿瘤抗原的抗体，单克隆抗体和毒素的复合物，T细胞佐剂，骨髓移植或抗原呈递细胞(例如，树突细胞治疗)、抗肿瘤疫苗、能够复制的病毒和CAR-t细胞。

在此类补充组合治疗中，各种补充活性剂往往具有与IL-10和/或免疫检查点途径调节剂不同的作用机制。这种补充组合治疗通过促进一种或多种试剂的剂量减少，由此减少或消除与一种或多种试剂相关的副作用而可能是特别有利的。另外，这种补充组合治疗可以对潜在疾病、病症或病况具有累加或协同治疗性或预防性作用。在本公开的一些实施方案中，所述补充剂是诊断剂。

在本公开的一些实施方案中，IL-10试剂(例如，PEG-IL-10)、免疫检查点途径调节剂和补充剂中的每一种可以呈单独的剂型。通过实例的方式，PEG-IL-10可以呈适合于SC施用的制剂形式，免疫检查点途径调节剂可以呈适合于IV施用的制剂形式，并且补充剂可以呈适合于口服施用的制剂形式；在此背景下，所述试剂中的每一种可以单独容纳或所述试剂中的两种或更多种可以容纳在一起(例如，作为试剂盒的不同组分)。在本公开的其他实施方案中，IL-10试剂(例如，PEG-IL-10)、免疫检查点途径调节剂和补充剂中的两种或更多种是呈相同剂型。例如，PEG-IL-10、免疫检查点途径调节剂和补充剂可以被配制用于IV施用；在此背景下，所述试剂中的一种或多种可以是共同配制的(例如，作为注射器中的活性治疗剂)。本公开考虑上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

在某些实施方案中，与其他试剂组合(包括依次)施用或施加IL-10试剂、免疫检查点途径调节剂和补充剂(例如，化疗剂)，例如，其中首先施用IL-10试剂，其次施用免疫检查点途径调节剂，并且最后施用补充剂。在其他实施方案中，同时施用IL-10试剂、免疫检查点途径调节剂和补充剂，例如，其中同时施用所述试剂中的两种，并且在此之前或之后施用第三种试剂。无论IL-10试剂、免疫检查点途径调节剂和补充剂是依次、同时施用或以其某一变型施用，它们出于本公开的目的都被认为是作为补充组合治疗施用。

本公开考虑在这些情况下可能是可接受的、适当的或最佳的且不会导致诱导不可逆的4级或4级不良事件的补充组合治疗的给药方案的使用。以下描述的方案是示例性的而非排他性的。在一个实施方案中，在一个时间段内维持用IL-10试剂(例如，PEG-IL-10)、免疫检查点途径调节剂和补充剂的治疗。在另一个实施方案中，在一个时间段内(例如，在受试者稳定时)减少或继续用IL-10试剂、免疫检查点途径调节剂和补充剂的治疗。在另一个实施方案中，在恒定给药方案下，减少或停止(例如，在受试者稳定时)用补充剂的治疗，同时维持用IL-10试剂和免疫检查点途径调节剂的治疗。在另外的实施方案中，在恒定给药方案下，减少或停止(例如，在受试者稳定时)用补充剂的治疗，减少用IL-10试剂的治疗(例如，更低剂量、更低频率给药或更短治疗方案)，并且维持用免疫检查点途径调节剂的治疗。在另外的实施方案中，在恒定给药方案下，减少或停止(例如，在受试者稳定时)用补充剂的治疗，减少用IL-10试剂的治疗(例如，更低剂量、更低频率给药或更短治疗方案)，并且维持用免疫检查点途径调节剂的治疗。

施用：

本公开考虑本文描述的IL-10试剂(例如，PEG-IL-10)及其组合物与一种或多种免疫检查点途径抑制剂的组合用于治疗和/或预防各种疾病、病症和病况(例如，癌症)和/或其症状的用途。在一些实施方案中，所述IL10试剂通过肠胃外注射(在某些实施方案中包括皮下注射)施用。鉴于调节剂的性质和待调节的免疫检查点途径，一种或多种免疫检查点途径调节剂也可以通过任何有效途径施用。在一些实施方案中，IL-10试剂和免疫检查点途径调节剂可以通过相同途径(例如，IV)施用，而在其他实施方案中，它们可以通过不同途径施用(例如，IL-10试剂可以皮下施用，且免疫检查点途径调节剂可以静脉内施用)。

在本公开的某些方面中，这种治疗或预防通过利用特定给药参数来实现，所述特定给药参数用于使与施用其自身的单一治疗相关的任何不利影响最小化。通过实例的方式，将PEG-IL-10方案添加至包含伊匹木单抗(抗CTLA4 mAb)的方案中可能允许减少实现治疗目标所需的伊匹木单抗的量，因此减轻伊匹木单抗的免疫介导的不良反应。当组合使用时，特定IL-10和免疫检查点途径抑制剂(连同例如治疗目标)影响施用、给药方案，给药参数等。

本公开的IL-10试剂(例如，PEG-IL-10)和免疫检查点途径调节剂可以一定量向受试者施用，所述量取决于例如施用目标(例如，期望的消退(resolution)程度)；受试者的年龄、重量、性别以及健康和身体状况；所施用制剂；施用途径；以及疾病、病症、病况或其症状的性质。给药方案还可能考虑与所施用的试剂相关的任何副作用的存在、性质和程度。有效剂量的量和给药方案可以从例如安全性和剂量递增试验、体内研究(例如，动物模型)以及技术人员已知的其他方法容易地确定。

本文描述的方法中的IL-10试剂的血浆水平可以几种方式表征，包括：(1)高于某一指定水平或处于水平范围内的平均IL-10试剂血清谷浓度；(2)持续一定量时间高于某一指定水平的平均IL-10试剂血清谷浓度；(3)高于或低于某一指定水平或处于水平范围内的稳态IL-10试剂血清浓度水平；或者(4)高于或低于某一指定水平或处于某一水平范围内的浓度特征的C_最大值。如本文所阐述，已发现平均IL-10试剂血清谷浓度对于某些适应症的效力来说是特别重要的。

在一些实施方案中，本公开考虑施用IL-10试剂以实现某些血清谷浓度和/或维持某些平均血清谷浓度。在本公开的一些实施方案中，平均IL-10试剂血清谷浓度是在1.0pg/mL至100 pg/mL；0.1 ng/mL至1.0 ng/mL；1.0 ng/mL至10 ng/mL；0.5 ng/mL至5.0 ng/mL；0.75 ng/mL至1.25 ng/mL或0.9 ng/mL至1.1 ng/mL的范围内。在本公开的具体实施方案中，平均IL-10试剂血清谷浓度是至少1.25 ng/mL、至少1.5 ng/mL、至少1.6 ng/mL、至少1.7 ng/mL、至少1.8 ng/mL、至少1.85 ng/mL、至少1.9 ng/mL、至少1.95 ng/mL、至少1.97ng/mL和至少1.98 ng/mL、至少1.99 ng/mL、至少2.0 ng/mL或大于2 ng/mL。在另外的实施方案中，前述时间段是至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少6周、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少9个月、或大于12个月。在本公开的具体实施方案中，持续至少85%的时间段、至少90%、至少96%、至少98%、至少99%或100%的时间段维持平均IL-10试剂血清谷浓度。

在本公开的一些实施方案中，可以产生的血浆和/或血清水平浓度概况包括：大于约1.0 pg/mL、大于约10.0 pg/mL、大于约20.0 pg/mL、大于约30 pg/mL、大于约40 pg/mL、大于约50.0 pg/mL、大于约60.0 pg/mL、大于约70.0 pg/mL、大于约80.0 pg/mL、大于约90pg/mL、大于约0.1 ng/mL、大于约0.2 ng/mL、大于约0.3 ng/mL、大于约0.4 ng/mL、大于约0.5 ng/mL、大于约0.6 ng/mL、大于约0.7 ng/mL、大于约0.8 ng/mL、大于约0.9 ng/mL、大于约1.0 ng/mL、大于约1.5 ng/mL、大于约2.0 ng/mL、大于约2.5 ng/mL、大于约3.0 ng/mL、大于约3.5 ng/mL、大于约4.0 ng/mL、大于约4.5 ng/mL、大于约5.0 ng/mL、大于约5.5ng/mL、大于约6.0 ng/mL、大于约6.5 ng/mL、大于约7.0 ng/mL、大于约7.5 ng/mL、大于约8.0 ng/mL、大于约8.5 ng/mL、大于约9.0 ng/mL、大于约9.5 ng/mL或大于约10.0 ng/mL的平均IL-10试剂血浆和/或血清谷浓度。

在本公开的具体实施方案中，平均IL-10试剂血清谷浓度在1.0 pg/mL至10 ng/mL的范围内。在一些实施方案中，平均IL-10试剂血清谷浓度在1.0 pg/mL至100 pg/mL的范围内。在其他实施方案中，平均IL-10试剂血清谷浓度在0.1 ng/mL至1.0 ng/mL的范围内。在还有其他实施方案中，平均IL-10试剂血清谷浓度在1.0 ng/mL至10 ng/mL的范围内。应理解，本公开考虑结合本文阐述的那些范围所涵盖的任何浓度的范围，即使在此类范围未被明确叙述的情况下。通过实例的方式，一个实施方案中的平均IL-10试剂血清浓度可以在0.5 ng/mL至5 ng/mL的范围内。通过另外的实例的方式，本公开的具体实施方案包括约0.5ng/mL至约10.5 ng/mL、约1.0 ng/mL至约10.0 ng/mL、约1.0 ng/mL至约9.0 ng/mL、约1.0ng/mL至约8.0 ng/mL、约1.0 ng/mL至约7.0 ng/mL、约1.5 ng/mL至约10.0 ng/mL、约1.5ng/mL至约9.0 ng/mL、约1.5 ng/mL至约8.0 ng/mL、约1.5 ng/mL至约7.0 ng/mL、约2.0ng/mL至约10.0 ng/mL、约2.0 ng/mL至约9.0 ng/mL、约2.0 ng/mL至约8.0 ng/mL以及约2.0 ng/mL至约7.0 ng/mL的范围内的平均IL-10试剂血清谷浓度。

本公开考虑导致维持上文阐述的任何IL-10试剂血清谷浓度的任何剂量和给药方案的施用。通过实例的方式，但不限制，当受试者是人时，非聚乙二醇化的hIL-10可以以下剂量施用：大于0.5 µg/kg/天、大于1.0 µg/kg/天、大于2.5 µg/kg/天、大于5 µg/kg/天、大于7.5 µg/kg、大于10.0 µg/kg、大于12.5 µg/kg、大于15 µg/kg/天、大于17.5 µg/kg/天、大于20 µg/kg/天、大于22.5 µg/kg/天、大于25 µg/kg/天、大于30 µg/kg/天或大于35 µg/kg/天。此外，通过实例的方式，但不限制，当受试者是人时，包含相对较小PEG (例如，5kDa单-二-PEG-hIL-10)的聚乙二醇化的hIL-10试剂可以以下剂量施用：约0.5 µg/kg/天/SC、可替代地约0.75 µg/kg/天/SC、可替代地约1 µg/kg/天/SC、可替代地约1.5 µg/kg/天/SC、可替代地约1.75 µg/kg/天、可替代地约2.0 µg/kg/天/SC、可替代地约3 µg/kg/天/SC、可替代地约4 µg/kg/天/SC、可替代地约5 µg/kg/天/SC、可替代地约8 µg/kg/天/SC、可替代地约10 µg/kg/天/SC、可替代地约12 µg/kg/天/SC、可替代地约15 µg/kg/天/SC、可替代地约20 µg/kg/天/SC。

设想的是，足以维持期望的稳态血清谷浓度(例如，1 ng/mL)的给药方案可以导致高于期望的稳态血清谷浓度的初始血清谷浓度。由于IL-10在哺乳动物受试者中的药效学和药代动力学特征，初始谷浓度(例如通过施用一个或多个负荷剂量，随后施用一系列维持剂量来实现)在一个时间段内逐渐但持续下降，甚至当给药参数(量和频率)保持恒定时。在该时间段之后，逐渐但持续的下降结束，并且稳态血清谷浓度得到维持。通过实例的方式，要求向小鼠(例如，C57BL/6小鼠)肠胃外施用(例如，SC和IV)约0.1 mg/kg/天的IL-10试剂(例如，mIL-10)以维持2.0 ng/mL的稳态血清谷浓度。然而，无法实现该稳态血清谷浓度，直至在以0.1 mg/kg/天开始给药之后(以及还有在任何负荷剂量之后)约30天。相反，在已实现初始血清谷浓度(例如，2.5 ng/mL)之后，该浓度在治疗的过程中逐渐但持续地下降，在此时间之后，期望的稳态血清谷浓度(2.0 ng/mL)得到维持。本领域技术人员将能够使用例如ADME和患者特定参数来确定维持期望的稳态谷浓度所需的剂量。

一般而言，给药参数指示剂量的量应小于可能对受试者产生不可逆的毒性的量(即，最大耐受剂量，“MTD”)并且不小于产生对受试者的可测量效果所要求的量。考虑施用途径和其他因素，此类量通过例如与ADME相关的药代动力学和药效学参数来确定。

有效剂量(ED)是试剂在服用所述试剂的受试者的某一部分中产生治疗应答或期望效果的剂量或量。试剂的“中值有效剂量”或ED50是试剂在施用所述试剂的50%的群体中产生治疗应答或期望效果的剂量或量。尽管ED50通常用作试剂的效果的合理预期的量度，但它不一定是临床医师可能在考虑所有相关因素的情况下认为适当的剂量。因此，在一些情况下，有效量可以大于计算的ED50；在其他情况下，有效量可以小于计算的ED50；并且在还有其他情况下，有效量可以与计算的ED50相同。此外，本公开的IL-10试剂(例如，PEG-IL-10)的有效剂量可以是在以一个或多个剂量向受试者施用时相对于健康受试者产生期望结果的量。例如，对于经历特定病症的受试者，有效剂量可以是将该病症的诊断参数、量度、标志物等提高以下各项的有效剂量：至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或大于90%，其中100%被定义为由正常受试者表现出的诊断参数、量度、标志物等。所述IL-10试剂的有效量可以通过本领域中已知且在本文其他地方描述的IL-10活性测定来测定。通过实例的方式，在肿瘤背景下，合适的IL-10活性包括例如浸润至肿瘤部位中的CD8+ T细胞，来自这些浸润细胞的炎性细胞因子诸如IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10和RANK-L的表达以及生物样品中的TNF-α或IFN-γ的增加的水平。

在一些实施方案中，例如，所述IL-10试剂是通过连续静脉内输注来施用以递送约50至800 µg蛋白/kg体重/天(例如，约1至16 µg蛋白/kg体重/天的PEG-IL-10试剂)的PEG-IL-10试剂。输注速率可以基于例如不良作用和血细胞计数的评估来变化。本文其他地方描述了IL-10试剂的其他特定给药参数。

在某些实施方案中，IL-10试剂和免疫检查点途径调节剂的剂量以“单位剂型”提供。短语“单位剂型”是指物理上离散的单位，各单位含有本公开的IL-10试剂和免疫检查点途径调节剂单独地或组合一种或多种另外的试剂足以产生期望效果的预定量。将了解，单位剂型的参数将取决于特定试剂和待实现的效果。

在一些实施方案中，本公开考虑以下方法，其中每天至少一次、每48小时至少一次、每72小时至少一次、每周至少一次、每2周至少一次、每月至少一次、每2个月至少一次或每3个月或更长时间至少一次向受试者施用IL-10试剂和免疫检查点途径调节剂。在某些实施方案中，IL-10试剂与派姆单抗(Keytruda®, Merck and Co, Rahway NJ)以160 mg(2mg/kg)的剂量组合施用，其每三周静脉内施用。在某些实施方案中，IL-10试剂与尼沃单抗(Opdivo®, BristolMyers Squibb, Princeton NJ)根据240 mg (3mg/kg)的修订标签批准剂量组合施用，其每两周静脉内施用。伊匹木单抗的推荐剂量是每3周静脉内施用3mg/kg，持续总共4个剂量。在某些实施方案中，IL-10试剂与免疫检查点途径抑制剂伊匹木单抗(YERVOY, Bristol-Myers Squibb)组合施用，所述伊匹木单抗是结合细胞毒性T-淋巴细胞-相关抗原4 (CTLA4)的重组人单克隆抗体。在一个示例性实施方案中，可以同时或几乎同时开始包含PEG-1L-10和伊匹木单抗的组合治疗。在包含用PEG-IL-10和伊匹木单抗的组合治疗的另一个示例性实施方案中，可以首先开始伊匹木单抗治疗(每3周施用)，并且其后一周可以开始每周PEG-IL-10治疗，在此之后两周施用第二剂量的伊匹木单抗。在一些实施方案中，治疗方案包括洗出期(“停药期”)，其中PEG-IL-10、伊匹木单抗或两者的血清水平下降至期望水平以允许受试者从与伊匹木单抗相关的任何不良作用(例如，免疫相关不良反应)恢复。技术人员(例如，肿瘤学专家)将能够定制治疗方案，所述治疗方案考虑IL-10和免疫检查点途径抑制剂试剂的特征(例如，它们的药代动力学参数)、患者特定特征(例如，肾功能)以及治疗目标。

尽管关于IL-10试剂血清浓度、剂量和对于实现特定IL-10血清浓度而言必要的治疗方案等的先前论述涉及用IL-10试剂(例如，PEG-IL-10)的单一治疗，但在某些实施方案中，此类剂量、治疗方案等还与包含IL-10试剂和一种或多种免疫检查点途径抑制剂的组合的治疗方案有关。例如，PEG-IL-10给药方案在其单独施用时或在其组合PD1拮抗剂施用时可以是相同的，因为PEG-IL-10和PD1拮抗剂具有独特的作用机制，所述作用机制允许所述试剂在其给药参数未修改的情况下组合。然而，此类组合可以允许PEG-IL-10和/或免疫检查点途径抑制剂的正常给药方案的修改。例如，可以减少一种或两种试剂的治疗剂量，可以降低一种或两种试剂的给药频率，和/或可以缩短一种或两种试剂的治疗持续时间，同时保留期望的治疗效果。

技术人员(例如，药理学家)能够确定IL-10试剂(例如，PEG-IL-10)组合免疫检查点途径抑制剂施用时的最佳给药方案。通过实例的方式，在一些实施方案中，最佳PEG-IL-10给药方案可以要求减少每个剂量施用的PEG-IL-10的量(例如，小于1.0 µg/kg/天、小于0.75 µg/kg/天、小于0.5 µg/kg/天、小于0.25 µg/kg/天或小于0.125 µg/kg/天)。在本公开的某些示例性实施方案中，平均IL-10试剂血清谷浓度可以在约0.1 ng/mL至约9.5 ng/mL、约0.25 ng/mL至约8.0 ng/mL、约0.5 ng/mL至约7.0 ng/mL、约0.75 ng/mL至约6.0 ng/mL或约1.0 ng/mL至约5.0 ng/mL的范围内。

当IL-10试剂组合免疫检查点途径抑制剂施用时，可以修改适用于单一治疗的IL-10试剂的给药参数中的一种或多种，而适用于单一治疗的免疫检查点途径抑制剂的给药参数可以保持不变；适用于单一治疗的IL-10试剂的给药参数中的一种或多种可以保持不变，而可以修改适用于单一治疗的免疫检查点途径抑制剂的给药参数中的一种或多种；可以修改适用于单一治疗的IL-10试剂和免疫检查点途径抑制剂的给药参数中的一种或多种；或者适用于单一治疗的IL-10试剂和免疫检查点途径抑制剂中每一个的给药参数可以保持不变。

本公开的IL-10试剂和免疫检查点途径抑制剂可以呈适合于施用于受试者的组合物的形式。一般而言，此类组合物是包含IL-10和/或免疫检查点途径抑制剂以及一种或多种药学上可接受的或生理上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的“药物组合物”。在某些实施方案中，IL-10试剂和免疫检查点途径抑制剂各自以治疗上可接受的量存在。药物组合物可以用于本公开的方法中；因此，例如，药物组合物可以向受试者离体或体内施用以便实践本文描述的治疗性和预防性方法以及用途。

本公开的具体实施方案涉及药物组合物，其包含治疗上可接受的量的IL-10试剂组合治疗上可接受的量的免疫检查点途径抑制剂连同一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体和/或赋形剂(例如，等渗注射溶液)。药物组合物通常是适合于人施用的药物组合物。另外，在一些实施方案中，所述药物组合物包含至少一种另外的补充剂。

本发明的一个实施方案提供了包含IL-10试剂和至少一种免疫检查点途径调节剂的药物制剂，或任选地含有补充治疗剂的多重免疫检查点途径调节剂的药物制剂。

在药学上和生理上可接受的制剂存在的情况下，药物组合物通常包含治疗有效量的IL-10多肽和/或治疗有效量的免疫检查点途径调节剂、任选补充剂。合适的药学上可接受的或生理上可接受的稀释剂、载体或赋形剂包括但不限于抗氧化剂(例如，抗坏血酸和硫酸氢钠)、防腐剂(例如，苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯)、乳化剂、助悬剂、分散剂、溶剂、填料、膨化剂、洗涤剂、缓冲剂、媒介物、稀释剂和/或佐剂。例如，合适的媒介物可以是生理盐水溶液或柠檬酸盐缓冲盐水，其可能补充有在用于肠胃外施用的药物组合物中常用的其他材料。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外的示例性媒介物。本领域技术人员将容易识别可以用于本文考虑的药物组合物和剂型中的各种缓冲剂。典型的缓冲剂包括但不限于药学上可接受的弱酸、弱碱或其混合物。作为一个实例，缓冲剂组分可以是水溶性材料，诸如磷酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、醋酸、抗坏血酸、天冬氨酸、谷氨酸以及其盐。可接受的缓冲剂包括例如Tris缓冲剂、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸) (HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸钠盐(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)以及N-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)。

药物组合物可以呈无菌可注射水性或油性混悬液的形式。可以根据已知的技术使用本文提及的那些合适的分散剂或湿润剂以及助悬剂来配制这种混悬液。无菌可注射制剂也可能是无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬液，例如，作为1,3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的稀释剂、溶剂和分散介质包括水，林格氏溶液，等渗氯化钠溶液、Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，乙醇，多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)以及其合适的混合物。此外，无菌、不挥发性油通常用作为溶剂或混悬介质。出于这个目的，可以采用任何温和不挥发性油，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。另外，脂肪酸诸如油酸发现可用于可注射制剂中。特定可注射制剂的延缓吸收可以通过包括延缓吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝或明胶)来实现。

含有活性试剂的药物组合物可以呈适合于口服使用的形式，例如作为片剂、胶囊、糖锭、锭剂、水性或油性混悬液、可分散粉剂或颗粒剂、乳剂、硬质或软质胶囊或糖浆、溶液、微珠粒或酏剂。在具体实施方案中，活性试剂或与本文描述的IL-10试剂共同施用的试剂呈适合于口服施用的形式。意图用于口服使用的药物组合物可以根据本领域中已知的用于制造药物组合物的任何方法来制备，并且此类组合物可以含有一种或多种试剂，诸如例如增甜剂、调味剂、着色剂以及防腐剂，以便提供药学上优良且适口的制剂。片剂、胶囊等含有与药学上可接受的无毒赋形剂混合的活性成分，所述赋形剂适于片剂的制造。这些赋形剂可以是例如稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或***胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。

试剂的制剂也可以设计成提供活性试剂的延长释放。延长释放制剂是本领域中已知的，且包括生物可降解或生物相容的颗粒或聚合物，诸如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚乙烯吡咯烷酮、聚酸酐、聚乙醇酸、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素、硫酸鱼精蛋白、或丙交酯/乙交酯共聚物、聚交酯/乙交酯共聚物、或乙烯乙酸乙烯酯共聚物，以便控制施用组合物的递送。例如，口服试剂可以包封于通过凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊中(通过分别使用羟甲基纤维素或明胶-微胶囊、或聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，或包封于胶体药物递送***中。胶体分散***包括大分子复合物、纳米胶囊、微球体、微珠粒以及基于脂质的***，包括水包油乳剂、胶束、混合的胶束以及脂质体。用于制备上述制剂的方法对于本领域技术人员而言将是显而易见的。所述试剂的制剂可以是积存注射剂，其通常皮下或肌肉内施用，也可以用于在限定时间段内释放本文公开的活性试剂。

水性混悬液含有与适于制造水性混悬液的赋形剂混合的活性材料。此类赋形剂可以是助悬剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶以及***树胶；分散剂或润湿剂，例如天然存在的磷脂(例如，卵磷脂)，或环氧烷与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如十七元环氧乙基十六醇)，或环氧乙烷与源于脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)，或环氧乙烷与源于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如，聚乙烯山梨聚糖单油酸酯)。水性混悬液还可以含有一种或多种防腐剂。

本公开的药物组合物也可以是油性混悬液，其可以通过使活性成分混悬于植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(诸如液体石蜡)中来配制。油性混悬液可以含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或十六醇。可以添加增甜剂(诸如以上列出的那些)和调味剂以提供适口的口服制剂。

本公开的药物组合物也可以是适合于通过添加水来制备水性混悬液的可分散粉剂和颗粒剂，其提供了与分散剂或润湿剂、混悬剂以及一种或多种防腐剂混合的活性成分。本文中举例说明了合适的分散剂或润湿剂和助悬剂。

本公开的药物组合物也可以呈水包油乳剂的形式。油相可以是植物油(例如，橄榄油或花生油)或矿物油(例如，液体石蜡)或这些的混合物。合适的乳化剂可以是例如，天然存在的树胶，例如***树胶或黄蓍胶；天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂以及衍生自脂肪酸的酯或偏酯；己糖醇酐(例如，脱水山梨糖醇单油酸酯)；以及偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。

本公开的药物组合物还可以包括用于保护组合物免于从身体快速降解或消除的载体，诸如控释制剂，包括植入物、脂质体、水凝胶、前药以及微囊化的递送***。例如，可以单独或与蜡组合采用延时材料诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

本公开的药物组合物也可以呈用于直肠施用的栓剂的形式。栓剂可以通过将药物与合适的无刺激赋形剂混合来制备，所述无刺激赋形剂在常温下为固体但是在直肠温度下为液体，并且因此将在直肠中熔融以释放药物。此类材料包括但不限于可可脂和聚乙二醇。

本公开的药物组合物也可以呈目前已知的或将来开发的任何其他合适的药物组合物(例如，鼻用或吸入使用的喷雾)的形式。

呈现：

在已配制药物组合物之后，其可以作为溶液、混悬液、凝胶、乳液、固体或者脱水或冻干粉末储存在无菌小瓶中。此类制剂可以以即用形式、在使用前要求重构的冻干形式、在使用前要求稀释的液体形式或其他可接受的形式来储存。在一些实施方案中，药物组合物提供在一次性容器(例如，一次性小瓶、安瓿、注射器或自动注射器 (类似于例如EpiPen®))中，而多次使用性容器(例如，多次使用性小瓶)提供在其他实施方案中。任何药物递送装置可以用于递送IL-10，包括植入物(例如，可植入泵)和导管***、缓慢注射泵以及装置，其全部对于技术人员而言都是众所周知的。通常皮下或肌肉内施用的积存注射剂也可以用于在限定时间段内释放本文公开的多肽。积存注射剂通常是基于固体的或基于油的，并且通常包含本文阐述的制剂组分中的至少一种。本领域普通技术人员熟悉积存注射剂的可能的制剂和用途。

本公开的某些实施方案考虑无菌容器，其含有上述药物组合物之一以及任选地一种或多种另外的组分。通过实例的方式，但不限制，无菌容器可以是注射器，尤其是即用于施用的预填充的注射器。在还有另外的实施方案中，无菌容器是试剂盒中的一个部件；所述试剂盒还可以含有例如第二无菌容器，所述第二无菌容器包含至少一种预防剂或治疗剂，所述预防剂或治疗剂的实例在本文中进行阐述。

本公开还考虑包含IL-10试剂和免疫检查点途径调节剂的药物制剂的试剂盒。试剂盒通常呈如下所述容纳各种组分的物理结构的形式，并且可以例如用于实践上文描述的方法。试剂盒可以包括在无菌容器中提供的本文公开的IL-10试剂的一种或多种药物制剂(例如，PEG-IL-10)和免疫检查点途径调节剂的一种或多种药物制剂，药物制剂提供于无菌容器中。药物制剂IL-10试剂和药物制剂免疫检查点途径调节剂可以可立即使用的形式或在施用前要求例如重构或稀释的形式提供。在IL-10试剂和/或免疫检查点途径调节剂提供需要由使用者重构的形式时，试剂盒还可以包括与IL-10试剂或免疫检查点途径调节剂一起或分开包装的缓冲液、药学上可接受的赋形剂等。类似地，当考虑补充治疗(例如，IL-10试剂、免疫检查点途径抑制剂和补充剂)时，试剂盒可以单独地含有几种试剂或者它们中的两种或更多种可以已经组合在试剂盒中。本公开的试剂盒可以针对适当地维持其中容纳的组分所必需的条件(例如，冷藏或冷冻)而进行设计。

试剂盒可以含有标签或包装说明书，包括其中所含组分的鉴别信息及其说明书(例如，给药参数；活性成分的临床药理学，包括作用机制、药代动力学和药效学；副作用；禁忌证等)。试剂盒中的每种组分可以包封在单个容器中，并且所有不同容器可以在单一包装内。标签或插页可以包括制造商信息，诸如批号和失效日期。标签或包装插页可以例如整合至容纳组分的物理结构中，单独包含在物理结构内或附于试剂盒的部件(例如，安瓿瓶、注射器或小瓶)。

标签或插页可以另外包括或整合至计算机可读介质，诸如盘(例如，硬盘、卡、存储盘)，光盘诸如CD-或DVD-ROM/RAM、DVD、MP3、磁带或电存储介质诸如RAM和ROM或者这些的杂合物，诸如磁/光存储介质、FLASH介质或存储器型卡。在一些实施方案中，实际说明书不存在于试剂盒中，但提供用于从远程来源，例如通过因特网网站获得说明书的方式。

本文中描述了本发明的具体实施方案，包括发明人已知用于实施本发明的最佳模式。在阅读前述内容之后，所公开的实施方案的变化对于本领域技术人员而言可能变得显而易见，并且所预期的是，技术人员可以适当地采用此类变化。因此，意图以与本文具体描述不同的方式实践本发明，并且本发明包括适用法律允许的所附权利要求中叙述的主题的所有修改和等效方案。此外，除非本文另外指示或明显地与上下文矛盾，否则本发明考虑其所有可能变体中的上述元素的任何组合。

本说明书中引用的所有出版物、专利申请、登录号和其他参考文献都通过引用并入本文，如同特别地且单独地指出每个单独的出版物或专利申请都通过引用并入本文。

Claims (46)

1.治疗或预防哺乳动物受试者中的肿瘤疾病的方法，其包括向所述受试者施用：

a) 治疗有效量的免疫检查点途径调节剂，和

b) 治疗有效量的IL-10试剂。

2.权利要求1的方法，其中所述肿瘤疾病是具有中等肿瘤突变负荷或低肿瘤突变负荷的肿瘤疾病。

3.权利要求2的方法，其中所述肿瘤疾病是原发性肿瘤。

4.权利要求1的方法，其中所述IL-10试剂经施用足以在治疗过程中维持至少1.0 ng/mL的平均IL-10试剂血清谷浓度。

5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述IL-10试剂包含两个IL-10多肽，其各自具有SEQ ID 25的氨基酸序列。

6.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述IL-10试剂包含两个IL-10多肽，其各自具有SEQ ID 26的氨基酸序列。

7.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述IL-10试剂包含两个IL-10多肽，其各自具有SEQ ID 27的氨基酸序列。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述IL-10试剂是聚乙二醇化的。

9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述免疫检查点途径调节剂选自针对CTLA4、PD1、PDL1、BTLA、TIM3、LAG3、A2aR和杀伤细胞抑制性受体的拮抗剂抗体。

10.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述免疫检查点途径调节剂选自针对CTLA4、PD1、PDL1和BTLA的拮抗剂抗体。

11.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述免疫检查点途径调节剂是PD1免疫检查点途径抑制剂。

12.权利要求1-11中任一项的方法，其中PD-L1的细胞表面表达在肿瘤疾病中是中等或低的。

13.权利要求12的方法，其中所述PD1免疫检查点途径抑制剂选自派姆单抗、尼沃单抗和AM0001。

14.权利要求13的方法，其中所述PD1免疫检查点途径抑制剂是小分子。

15.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述免疫检查点途径调节剂是CTLA4免疫检查点途径抑制剂。

16.权利要求15的方法，其中所述CTLA4免疫检查点途径抑制剂是伊匹木单抗。

17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述肿瘤疾病、病症或病况是癌症。

18.权利要求17的方法，其中所述癌症是实体瘤或血液病。

19.权利要求18的方法，其中所述癌症选自黑色素瘤、肺癌、肾癌和乳腺癌。

20.权利要求1-16中任一项的方法，所述方法包括添加第二免疫检查点途径调节剂。

21.权利要求1-20中任一项的方法，其中所述IL-10试剂包含至少一个修饰以形成修饰的IL-10试剂，其中所述修饰不改变所述IL-10试剂的氨基酸序列。

22.权利要求21的方法，其中所述修饰的IL-10试剂是PEG-IL-10试剂。

23.权利要求22的方法，其中所述PEG-IL-10试剂包含共价地附接至IL-10的至少一个亚基的至少一个氨基酸残基的至少一个PEG分子。

24.权利要求21的方法，其中所述PEG-IL-10试剂包含单-聚乙二醇化的和二-聚乙二醇化的IL-10的混合物。

25.权利要求21-24中任一项的方法，其中所述PEG-IL-10试剂的所述PEG组分具有约5kDa至约50kDa的分子量。

26.权利要求21-24中任一项的方法，其中所述PEG-IL-10试剂的所述PEG组分具有约20kDa至约40kDa的分子量。

27.权利要求21-26中任一项的方法，其中所述修饰包含接头。

28.权利要求1-20的方法，其中所述修饰的IL-10试剂是Fc融合分子。

29.权利要求1-20的方法，其中所述修饰的IL-10试剂包含血清白蛋白或白蛋白结合结构域(ABD)。

30.权利要求1-20的方法，其中所述修饰的IL-10试剂是糖基化的或羟乙基淀粉化的。

31.权利要求1-30中任一项的方法，其中所述免疫检查点途径调节剂和所述IL-10试剂的施用通过肠胃外注射。

32.权利要求31的方法，其中所述IL-10试剂的施用通过皮下注射。

33.权利要求1-32中任一项的方法，其中同时施用所述免疫检查点途径调节剂和所述IL-10试剂。

34.权利要求1-32中任一项的方法，其中依次施用所述免疫检查点途径调节剂和所述IL-10试剂。

35.权利要求1-32中任一项的方法，其进一步包括施用至少一种另外的预防剂或治疗剂。

36.权利要求35的方法，其中所述预防剂或治疗剂是化疗剂。

37.权利要求1-36中任一项的方法，其中所述受试者是人。

38.药物组合物，其包含

a)治疗有效量的免疫检查点途径调节剂；和

b) 治疗有效量的IL-10试剂和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。

39.权利要求38的组合物，其中所述免疫检查点途径调节剂是PD1免疫检查点途径抑制剂，且所述IL-10试剂是包含具有在20 kDa至40kDa之间的分子量的PEG的PEG IL-10试剂。

40.权利要求38或权利要求39的药物组合物，其中所述组合物适合于人施用。

41.权利要求38-41中任一项的药物组合物，其进一步包含至少一种另外的预防剂或治疗剂。

42.权利要求38-41中任一项的药物组合物，其中所述预防剂或治疗剂是化疗剂。

43.无菌容器，其包含权利要求38-42中任一项的药物组合物。

44.权利要求43的无菌容器，其中所述无菌容器是注射器。

45.试剂盒，其包含权利要求43或44的无菌容器。

46.权利要求45的试剂盒，其进一步包含第二无菌容器，所述第二无菌容器包含至少一种另外的预防剂或治疗剂。

Images