ES2938833T3

ES2938833T3 - Métodos de inactivación térmica de adenovirus

Info

Publication number: ES2938833T3
Application number: ES17776462T
Authority: ES
Inventors: Christopher Morrison; James Maratt
Original assignee: Ultragenyx Pharmaceutical Inc
Current assignee: Ultragenyx Pharmaceutical Inc
Priority date: 2016-03-28
Filing date: 2017-03-28
Publication date: 2023-04-17
Anticipated expiration: 2037-03-28
Also published as: IL261914B1; AU2017241777B2; KR102389674B1; EP3436593A4; HUE061100T2; PT3436593T; BR112018069703A2; LT3436593T; JP2021072838A; US11944658B2; CA3018380A1; AU2017241777A1; WO2017172772A1; EP3436593A1; DK3436593T3; EP4159867A1; US20190083554A1; JP7356224B2; IL261914A; US11013774B2

Abstract

La presente divulgación generalmente se refiere a métodos para proteger la integridad genómica y/o la actividad biológica de partículas virales de AAV en una muestra que contiene partículas de AAV y partículas de virus auxiliares durante la inactivación por calor. Los métodos incluyen el calentamiento, a una temperatura superior o igual a 45 °C, de una muestra que contiene partículas de virus auxiliares, partículas de AAV y un tampón. El tampón incluye una concentración de 10 mM o más de sales cosmotrópicas y/o una concentración de 10 mM o más de cationes divalentes o trivalentes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de inactivación térmica de adenovirus

Antecedentes de la invención

El virus adenoasociado (AAV) es un parvovirus no patógeno cuya replicación es defectuosa. Los vectores de AAV tienen muchas características únicas que los hacen atractivos como vectores para la terapia génica. En particular, los vectores de AAV pueden liberar genes terapéuticos en células en división y en no división, y estos genes pueden persistir durante largos periodos de tiempo sin integrarse en el genoma de la célula objetivo. Sin embargo, para producir vectores de AAV, se deben proporcionar funciones de virus auxiliar, a veces en forma de un virus infeccioso activo como el adenovirus (AV). Durante el proceso de purificación del vector de AAV para aislar los vectores de AAV terapéuticos, se deben inactivar las partículas de virus auxiliar. Sin embargo, los métodos comunes de inactivación del virus auxiliar, por ejemplo, la inactivación por calor, también pueden provocar la destrucción o degradación del genoma del vector de AAV, disminuyendo la calidad y cantidad del vector de AAV que puede recuperarse del proceso de inactivación. Esto es particularmente cierto para los genomas de vectores de AAV más grandes. Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de desarrollar métodos para proteger la integridad de los vectores de AAV durante la inactivación por calor del virus auxiliar.

El documento US 5,688,676 se refiere a un método para el empaquetado in vitro de partículas de virus adenoasociados. El procedimiento implica la preparación de extractos libres de células que contienen todos los componentes esenciales para el empaquetado.

Breve descripción de la invención

La invención se define por las reivindicaciones anexas 1 a 15. La presente divulgación se refiere en general a métodos para proteger la integridad genómica y/o la actividad biológica de partículas virales de AAV en una muestra que contiene tanto partículas de AAV como partículas de virus auxiliar durante la inactivación por calor. Estos métodos generalmente permiten la inactivación selectiva de partículas de virus auxiliar al tener un efecto sobre las partículas de virus auxiliar que es superior a su efecto sobre las partículas de AAV. Los métodos incluyen calentar, a una temperatura superior o igual a 45 °C, una muestra que contiene partículas de virus auxiliar, partículas de AAV y un amortiguador. El amortiguador incluye una concentración de 10 mM o superior de sales cosmotrópicas y/o una concentración de 10 mM o superior de cationes divalentes o trivalentes.

En particular, la presente invención proporciona un método de inactivación de virus auxiliar en una muestra que contiene partículas de virus auxiliar, partículas de virus adenoasociados, y un amortiguador, el método comprende: calentar la muestra a una temperatura superior o igual a 45 °C durante entre 1 minuto y 6 horas, en donde el amortiguador comprende una concentración de entre 25 mM y 500 mM de cationes divalentes o trivalentes, o una concentración de entre 0,5 M y 0,6 M de sal cosmotrópica.

Los métodos incluyen calentar la muestra a una temperatura superior o igual a 45 °C, superior o igual a 46 °C, superior o igual a 47 °C, superior o igual a 48 °C, superior o igual a 49 °C, superior o igual a 50 °C, o superior o igual a 51 °C. En determinadas realizaciones, la muestra se calienta a una temperatura entre 45 °C y 65 °C, entre 45 °C y 60 °C, entre 45 °C y 55 °C, entre 47 °C y 53 °C, entre 48 °C y 51 °C, o entre 48 °C y 50 °C. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la muestra se calienta entre 48 °C y 50 °C, o a 48 °C o 49 °C.

El periodo de tiempo durante el cual se calienta la muestra puede variar. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la muestra se calienta a la temperatura objetivo durante un período de tiempo de entre 1 minuto y 6 horas, como entre 10 y 180 minutos, entre 20 y 180 minutos, entre 20 y 60 minutos, o entre 20 y 40 minutos. Generalmente, se utilizan temperaturas más altas u otras condiciones que aceleran la inactivación de las partículas de virus auxiliar junto con tiempos de calentamiento comparativamente breves, y viceversa.

En algunos métodos se utiliza un amortiguador que contiene una concentración de 10 mM o superior de cationes metálicos divalentes o trivalentes. Los cationes ejemplares incluyen los de los metales siguientes: Mg, Ca, Mn, Ni, Zn, Co, Sr, Cu, Cr, Fe, y Sc ue forman cationes como Mg2+, Ca2+, Mn2+, Ni2+, Zn2+, Co2+, Sr2+, Cu2+, Cr2+ y Sc3+. En ciertas realizaciones, el amortiguador incluye Mg2+ y/o Ca2+ a una concentración de 10 mM o superior.

En un subconjunto de esos amortiguadores que contienen una concentración de 10 mM o superior de cationes metálicos divalentes o trivalentes, la concentración es superior a 15 mM. Por ejemplo, la concentración de cationes puede ser superior a 20 mM, superior a 50 mM, superior a 100 mM o superior a 200 mM. En otro subconjunto de amortiguadores que contienen una concentración de 10 mM o superior de cationes metálicos divalentes o trivalentes, la concentración es de 10 mM a 500 mM. Por ejemplo, la concentración de cationes puede ser de 20 mM a 400 mM, de 30 mM a 300 mM, de 50 mM a 250 mM, de 70 mM a 200 mM, o a una concentración de 50 mM, 100 mM, 150 mM, o 200 mM. En la presente invención, el amortiguador puede comprender una concentración de entre 25 mM y 500 mM de cationes divalentes o trivalentes.

En algunos métodos se utiliza un amortiguador con una concentración de 10 mM o superior de sales cosmotrópicas. Las sales cosmotrópicas ejemplares incluyen sulfato de amonio, acetato de amonio, citrato de sodio, acetato de sodio, sulfato de sodio, fosfato de potasio y cloruro de cesio, ya sea por separado o en cualquier combinación. Si están presentes, las sales cosmotrópicas se utilizan típicamente a una concentración superior a 10 mM, tal como entre 0,1 M y 1 M; entre 0,2 M y 0,8 M; entre 0,3 M y 0,7 M; entre 0,4 M y 0,6 M; o 0,5 M. En la presente invención, el amortiguador puede comprender una concentración de entre 0,5 M y 0,6 M de sales cosmotrópicas.

En algunos métodos, el amortiguador utilizado contiene una sal caotrópica. En un subconjunto de amortiguadores que contienen una sal caotrópica, la sal caotrópica es una sal de urea, o una sal de guanidina. En algunos métodos, el amortiguador utilizado contiene un poliol. En un subconjunto de amortiguadores que contienen un poliol, el poliol es glicerol, propilenglicol o 1,6-hexanodiol.

En algunos métodos, el amortiguador mantiene el pH en un intervalo de temperaturas entre 4 °C y 70 °C. Un subconjunto de amortiguadores mantiene el pH entre 3,0 y 10,0 a temperaturas entre 4 °C y 70 °C. Otro subconjunto de estos amortiguadores mantiene el pH entre 7,0 y 9,0 a temperaturas entre 4 °C y 70 °C.

En algunos métodos, el amortiguador es un amortiguador tris, un amortiguador fosfato, un amortiguador triazolamina o un amortiguador bis-tris propano. En un subconjunto de amortiguadores tris y bis-tris propano, el amortiguador contiene ingredientes adicionales, como HEPES, citrato, NaCl y Pluronic F68. En un subconjunto de amortiguadores de bis-tris propano, el amortiguador comprende 40 mM de bis-tris propano, 20 mM de HEPES, 20 mM de citrato, 200 mM de NaCl y 0,001 % (p/v) de Pluronic F68.

Los métodos divulgados en la presente son útiles para preservar la integridad genómica de cualquier partícula AAV. En algunos métodos, la partícula de AAV comprenderá un genoma de aproximadamente 4,7 kb de ADN, de más de 4,7 kb de ADN, de más de 5,0 kb de ADN, o de aproximadamente 5,1 kb de ADN. Alternativamente, la partícula de AAV puede comprender un genoma de menos de 4,0 kb de ADN, o de aproximadamente 3,0 kb de ADN. Los métodos divulgados en la presente pueden utilizarse con las partículas de AAV con genomas que son de una sola hebra o que son sustancialmente autocomplementarios.

Algunos métodos de inactivación de la presente invención consiguen una reducción logarítmica de virus auxiliar activo superior a 5,0. Un subconjunto de estos métodos consigue una reducción logarítmica del virus auxiliar superior a 6,0, o superior a 6,3. En algunos métodos, el virus auxiliar será un adenovirus, un herpesvirus o un baculovirus. En un subconjunto de los métodos en los que el virus auxiliar es un adenovirus, el adenovirus es Ad5.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 representa un gráfico de contorno que muestra el logaritmo de reducción del virus (LRV) de Ad5 en función de la temperatura de exposición y del tiempo transcurrido a la temperatura de exposición. Se utilizó un ensayo de infectividad de Ad5 para determinar el nivel de inactivación de las partículas de Ad5. Los puntos de datos reales se muestran mediante puntos negros, con el mapa de contorno interpolado entre dichos puntos de datos. El límite de cuantificación de LRV en este ensayo fue de 6,3. Una reducción superior a 6,3 no era detectable.

La FIG. 2 representa gráficos de contorno que muestran el rendimiento porcentual de diversos productos de AAV en función de la temperatura de exposición y del tiempo transcurrido a la temperatura de exposición. La FIG. 2A muestra los resultados de un producto truncado de serotipo hu37 producido en HEK293, la FIG. 2B representa los resultados de un producto sobredimensionado de serotipo hu37 producido en HeLa, la FIG. 2C representa los resultados de un producto de una sola hebra de serotipo AAV8 producido en HEK293 y la FIG. 2D representa los resultados de un producto autocomplementario de serotipo AAV8 producido en HEK293. Se utilizó un ensayo qPCR de partículas resistentes a la DNasa (DRP-qPCR) para determinar los niveles de producto de AAV antes y después de la exposición. Los puntos de datos reales se muestran mediante puntos negros, con el mapa de contorno interpolado entre dichos puntos de datos.

La FIG. 3 muestra una comparación de los resultados de recuperación porcentual determinados mediante un ensayo DRP-qPCR (barras oscuras) y un ensayo de infectividad TCID50 (barras claras). Las muestras analizadas fueron las mismas que las mostradas en la FIG. 2B para el tiempo de exposición de 20 minutos. El "control" fue una muestra de carga que permaneció congelada durante todo el experimento.

La FIG. 4 representa un gráfico de contorno que muestra el porcentaje de rendimiento de dos productos de AAV en función de la temperatura de exposición y del tiempo transcurrido a la temperatura de exposición. La FIG. 4A muestra los resultados de un producto sobredimensionado de serotipo hu37 producido en HeLa, y la FIG. 4B muestra los resultados de un producto sobredimensionado de serotipo hu37 producido en HEK293. Se utilizó un ensayo DRP-qPCR para determinar los niveles del producto de AAV antes y después de la exposición. Los puntos de datos reales se muestran mediante puntos negros, con el mapa de contorno interpolado entre dichos puntos de datos.

La FIG. 5 representa un gráfico de contorno que muestra el rendimiento porcentual del producto sobredimensionado de serotipo hu37 producido en HEK293 en diferentes amortiguadores de fondo en función de la temperatura de exposición y del tiempo transcurrido a la temperatura de exposición. La FIG. 5A muestra los resultados para un amortiguador de fondo de 40 mM de bis-tris propano, HEPES 20 mM, citrato 20 mM, NaCI 200 mM, 0,001 % (p/v) de Pluronic F68, pH a 8,0, la FIG. 5B muestra los resultados para el amortiguador de fondo con sulfato de amonio 0,5 M añadido. Se utilizó un ensayo DRP-qPCR para determinar los niveles del producto de AAV antes y después de la exposición. Los puntos de datos reales se muestran mediante puntos negros, con el mapa de contorno interpolado entre dichos puntos de datos. Una línea de puntos a 47 °C indica la temperatura a la que se produce la inactivación completa de Ad5 (como se determinó en el Ejemplo 1, véase la FIG. 1).

La FIG. 6 representa una comparación del porcentaje de recuperación de un vector de AAV sobredimensionado de serotipo hu37 producido en HEK293 en siete amortiguadores diferentes en función del tiempo de exposición a 47 °C. Se utilizó un amortiguador de fondo de bis-tris propano 40 mM, HEPES 20 mM, citrato 20 mM, NaCl 200 mM, 0,001 % (p/v) de Pluronic F68, pH a 8,0, o un amortiguador de fondo suplementado con MgCh 0,1 mM, 10 mM, 25 mM, 50 mM, o 100 mM. Se utilizó un ensayo DRP-qPCR para determinar los niveles del producto de AAV antes y después de la exposición. El "control" fue una muestra de carga que permaneció congelada durante todo el experimento.

La FIG. 7 representa una comparación del porcentaje de recuperación de un vector de AAV sobredimensionado de serotipo hu37 producido en HEK293 en siete amortiguadores diferentes en función del tiempo de exposición a 49 °C. Se utilizó un amortiguador de fondo de bis-tris propano 40 mM, HEPES 20 mM, citrato 20 mM, NaCl 200 mM, 0,001 % (p/v) de Pluronic F68, pH a 8,0, o un amortiguador de fondo suplementado con MgCh 0,1 mM, 100 mM, 25 mM, 50 mM, o 200 mM. Se utilizó un ensayo DRP-qPCR para determinar los niveles del producto de AAV antes y después de la exposición. El "control" fue una muestra de carga que permaneció congelada durante todo el experimento.

La FIG. 8 representa una comparación del porcentaje de recuperación de un vector de AAV sobredimensionado de serotipo hu37 producido en HEK293 en siete amortiguadores diferentes en función del tiempo de exposición a 51 °C. Se utilizó un amortiguador de fondo de bis-tris propano 40 mM, HEPES 20 mM, citrato 20 mM, NaCl 200 mM, 0,001 % (p/v) de Pluronic F68, pH 8,0, o un amortiguador de fondo suplementado con MgCh 0,1 mM, 100 mM, 25 mM, 50 mM, o 200 mM. Se utilizó un ensayo DRP-qPCR para determinar los niveles del producto de AAV antes y después de la exposición. El "control" fue una muestra de carga que permaneció congelada durante todo el experimento.

La FIG. 9 representa una comparación del porcentaje de recuperación de un vector de AAV sobredimensionado de serotipo hu37 producido en HEK293 en siete amortiguadores diferentes en función del tiempo de exposición a 53 °C. Se utilizó un amortiguador de fondo de bis-tris propano 40 mM, HEPES 20 mM, citrato 20 mM, NaCl 200 mM, 0,001 % (p/v) de Pluronic F68, pH 8,0, o un amortiguador de fondo suplementado con MgCh 0,1 mM, 100 mM, 25 mM, 50 mM, o 200 mM. Se utilizó un ensayo DRP-qPCR para determinar los niveles del producto de AAV antes y después de la exposición. El "control" fue una muestra de carga que permaneció congelada durante todo el experimento.

La FIG. 10 representa un gráfico de contorno que muestra el rendimiento porcentual de producto sobredimensionado de serotipo hu37 producido en HEK293 en un fondo de 40 mM bis-tris propano, HEPES 20 mM, citrato 20 mM, NaCl 200 mM, 0,001 % (p/v) de Pluronic F68, pH a 8,0, suplementado con MgCh 100 mM. Se utilizó un ensayo DRP-qPCR para determinar los niveles del producto de AAV antes y después de la exposición. Los puntos de datos reales se muestran mediante puntos negros, con el mapa de contorno interpolado entre dichos puntos de datos.

La FIG. 11 representa un gráfico de contorno que muestra el rendimiento porcentual de producto sobredimensionado de serotipo hu37 producido en HEK293 en un fondo de 40 mM bis-tris propano, HEPES 20 mM, citrato 20 mM, NaCl 200 mM, 0,001 % (p/v) de Pluronic F68, pH a 8,0, suplementado con MgCh 200 mM. Se utilizó un ensayo DRP-qPCR para determinar los niveles del producto de AAV antes y después de la exposición. Los puntos de datos reales se muestran mediante puntos negros, con el mapa de contorno interpolado entre dichos puntos de datos.

Descripción detallada de la invención

En la presente se describen métodos de inactivación de virus auxiliares, como AV, en muestras que contienen virus auxiliares y partículas de AAV, lo que da como resultado una mayor recuperación de partículas de AAV con genomas intactos y/o actividad biológica. El método comprende calentar una muestra que contiene virus auxiliar y partículas de AAV y un amortiguador a temperatura suficiente y durante tiempo suficiente para inactivar las partículas del virus auxiliar. Se ha demostrado inesperadamente que la adición de iones metálicos divalentes o trivalentes o sales cosmotrópicas al amortiguador de acuerdo con la presente invención da lugar a una mayor recuperación de partículas de a Av que contienen genomas intactos.

Virus adenoasociado

El AAV es un pequeño virus icosaédrico no envuelto del género Dependoparvovirus de la familia Parvovirus. Los AAV tienen un genoma de ADN lineal de de una sola hebra de aproximadamente 4,7 kb. Los AAV incluyen numerosos tipos distinguibles serológicamente, incluidos los serotipos AAV-1 a AAV-12, así como más de 100 serotipos de primates no humanos. Véase, por ejemplo, Srivastava, J. Cell Biochem., 105(1): 17-24 (2008); Gao et al., J. Virol., 78(12), 6381-6388 (2004). En los métodos de la presente invención puede utilizarse cualquier tipo de AAV. El AAV es capaz de infectar tanto células en división como células quiescentes de varios tipos de tejidos, con diferentes serotipos de AAV que muestran diferente tropismo tisular. El AAV se replica de forma no autónoma y tiene un ciclo de vida con una fase latente y una fase infecciosa. En la fase latente, después de que una célula se infecta con un AAV, el AAV se integra específicamente en el genoma del huésped como un provirus. La fase infecciosa no se produce a menos que la célula también esté infectada con un virus auxiliar (por ejemplo, el AV o virus del herpes simple), lo que permite que el AAV se replique y de lugar a la producción de partículas tanto de AAV como de virus auxiliar. Esta producción de una población mixta de partículas de AAV y partículas de virus auxiliares crea un problema importante si el AAV se va a utilizar como vector terapéutico, ya que los virus auxiliares contaminantes deben eliminarse o inactivarse debido a su patogenicidad y/o inmunogenicidad potenciales.

El genoma de tipo silvestre del AAV contiene dos repeticiones terminales invertidas (ITR) de 145 nucleótidos, que contienen secuencias de señalización que dirigen la replicación del AAV, la encapsidación y la integración del genoma. Además de las ITR, tres promotores del AAV, p5, p19 y p40, dirigen la expresión de dos marcos de lectura abiertos que codifican los genes rep y cap. Dos promotores rep, junto con el empalme diferencial del único intrón del AAV, dan lugar a la producción de cuatro proteínas rep (Rep 78, Rep 68, Rep 52 y Rep 40) a partir del gen rep. Las proteínas Rep son responsables de la replicación genómica. El gen cap se expresa a partir del promotor p40 y codifica tres proteínas de la cápside, VP1, VP2 y VP3, que son variantes de empalme del gen cap. Estas proteínas forman la cápside de la partícula de AAV.

Dado que las señales de acción c/s para la replicación, encapsidación e integración están contenidas en los ITR, parte o la totalidad del genoma interno de 4,3 kb puede sustituirse por ADN extraño, por ejemplo, un casete de expresión para una proteína exógena de interés. En este caso, las proteínas rep y cap se proporcionan en trans en, por ejemplo, un plásmido. Para producir un vector de AAV, una línea celular permisiva para la replicación de AAV debe expresar los genes rep y cap, el casete de expresión flanqueado por ITR y las funciones auxiliares proporcionadas por un virus auxiliar, por ejemplo, los genes de AV E1a, E1b55K, E2a, E4orf6 y VA. (Weitzman et al., Adeno-associated virus biology. Adeno-Associated Virus: Methods and Protocols, pp. 1-23, 2011) La producción del vector de AAV también puede dar lugar a la producción de partículas de virus auxiliares, que deben eliminarse o inactivarse antes de utilizar el vector de AAV. Numerosos tipos celulares son adecuados para la producción de vectores de AAV, incluidas las células HEK293, COS, HeLa y Vero, así como las células de insectos (véase, por ejemplo, la patente estadounidense núm. 6,156,303, la patente estadounidense núm. 5,387,484, la patente estadounidense núm. 5,741,683, la patente estadounidense núm. 5,691,176, la patente estadounidense núm. 5,688,676, la patente estadounidense núm. 8,163,543, US 20020081721, WO 00/47757, WO 00/24916, y WO 96/17947). Los vectores de AAV se producen habitualmente en estos tipos celulares mediante un plásmido que contiene el casete de expresión flanqueado por ITR, y uno o más plásmidos adicionales que proporcionan los genes de AAV y del virus auxiliar adicionales.

En la presente invención pueden utilizarse vectores de AAV de cualquier serotipo. Del mismo modo, se contempla que pueden usarse tipos de AV, y una persona experta en la técnica podrá identificar tipos de AAV y AV adecuados para la producción de su vector de AAV deseado. Las partículas de AAV y AV pueden purificarse mínimamente, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad, gradiente yodixonal o gradiente de CsCl. Las muestras que contienen partículas de AAV y AV que se han purificado más también pueden utilizarse en los métodos de la presente invención, al igual que las muestras que se han purificado menos.

El genoma del AAV de tipo silvestre es ADN de una sola hebra y tiene 4,7 kb. Los vectores de AAV pueden tener genomas monocatenarios de un tamaño de 4,7 kb, o mayores o menores que 4,7 kb, incluidos genomas de gran tamaño de hasta 5,2 kb, o tan pequeños como 3,0 kb. Además, los genomas vectoriales pueden ser sustancialmente autocomplementarios, de modo que dentro del virus el genoma es sustancialmente de doble cadena. Como se ha demostrado en la presente, los vectores de AAV con genomas sobredimensionados son más susceptibles a la degradación por calor. Por lo tanto, se prefieren los vectores de AAV con genomas sobredimensionados para su uso en el método de la presente invención. Sin embargo, se entenderá por los expertos en la técnica que el aumento de la estabilidad de todos los tipos de vectores de AAV durante la inactivación por calor es valioso porque permite condiciones de inactivación cada vez más estrictas. Por lo tanto, los vectores de AAV que contienen genomas de todos los tipos son adecuados para su uso en el método de la presente invención.

Virus auxiliar

Como se ha comentado anteriormente, el AAV requiere la coinfección con un virus auxiliar para entrar en la fase infecciosa de su ciclo de vida. Los virus auxiliares incluyen el adenovirus (AV) y el virus del herpes simple (HSV, por sus siglas en inglés), y existen sistemas para producir AAV en células de insecto utilizando baculovirus. También se ha propuesto que los virus del papiloma pueden desempeñar una función de ayuda para los AAV. Véase, Hermonat et al., Molecular Therapy 9, S289-S290 (2004). Los virus auxiliares incluyen cualquier virus capaz de crear un AAV que permita la replicación. En la presente invención puede utilizarse cualquier virus auxiliar, siempre que presente una estabilidad térmica inferior a la del AAV. El AV es un virus de ADN nuclear no encapsulado con un genoma de ADN de doble cadena de aproximadamente 36 kb. El AV es capaz de rescatar provirus AAV latentes en una célula, proporcionando genes E1a, E1b55K, E2a, E4orf6 y VA, permitiendo la replicación y encapsidación del AAV.

El HSV es una familia de virus que tienen un genoma de ADN lineal de doble cadena relativamente grande encapsidado en una cápside icosaédrica, que está envuelta en una bicapa lipídica. Los HSV son infecciosos y altamente transmisibles. Se identificaron las siguientes proteínas de replicación del HSV-1 como necesarias para la replicación del AAV: el complejo helicasa/primasa (UL5, UL8 y UL52) y la proteína de unión al ADN ICP8 codificada por el gen UL29, con otras proteínas que potencian la función de ayuda.

Otros virus auxiliares, como el baculovirus, pueden utilizarse con la presente invención, siempre que sean capaces de soportar la replicación del AAV, de forma natural o modificada, y que presenten un nivel de estabilidad térmica inferior al del AAV.

Producción del vector de AAV

Los vectores de AAV pueden producirse en células de mamíferos o de insectos mediante muchos métodos conocidos en la técnica. Cualquier método de producción será adecuado para producir material de partida para la presente invención siempre que el resultado del método de producción sea una muestra que contenga tanto AAV como virus auxiliar. El proceso de fabricación incluye proporcionar a las células un plásmido que contenga el genoma del vector de AAV, con las funciones de los genes de ^{a A v}rep y cap, así como funciones ayudantes adicionales. Las funciones auxiliares adicionales pueden ser proporcionadas, por ejemplo, por una infección por AV, por un plásmido que porta todos los genes de función auxiliar de ^{A v}requeridos, o por otros virus como HSV o baculovirus. Los métodos de producción de AAV adecuados para su uso con los métodos de la presente invención incluyen los divulgados en Clark et al., Human Gene Therapy 6:1329-1341 (1995); Martin et al., Human Gene Therapy Methods 24:253-269 (2013); Thorne et al., Human Gene Therapy 20:707-714 (2009); Fraser Wright, Human Gene Therapy 20:698-706 (2009); Virag et al., Human Gene Therapy 20:807-817 (2009).

El producto de AAV se obtiene de un lisado celular o del medio de cultivo celular. Las etapas primarias de purificación incluyen la cromatografía de afinidad y de intercambio iónico para eliminar los contaminantes celulares. La muestra purificada se filtra y se almacena a <- 60 °C.

Lisis celular

Las partículas de AAV pueden obtenerse a partir de células infectadas lisándolas. La lisis de las células infectadas con AAV puede realizarse mediante métodos que tratan química o enzimáticamente las células para liberar las partículas virales infectadas. Estos métodos incluyen el uso de nucleasas como la benzonasa o la DNAasa, proteasas como la tripsina, o detergentes o tensoactivos. También puede utilizarse la disrupción física, como la homogeneización o la trituración, o la aplicación de presión a través de una célula de presión de un microfluidizador, o ciclos de congelacióndescongelación. Alternativamente, puede recogerse sobrenadante de células infectadas con AAV sin necesidad de lisis celular.

Purificación de las partículas virales

Antes de los métodos de inactivación de la presente invención, puede ser necesario purificar la muestra que contiene partículas de AAV y virus auxiliar para eliminar, por ejemplo, los restos celulares resultantes de la lisis celular. Los métodos de purificación mínima de partículas de virus auxiliar y de AAV son conocidos en la técnica, y puede utilizarse cualquier método apropiado para preparar muestras que contengan partículas de AAV y de virus auxiliar para su uso en los métodos de la presente invención. Dos métodos de purificación ejemplares son la purificación en gradiente de densidad basada en cloruro de cesio (CsCl) y en iodixanol. Ambos métodos se describen en Strobel et al., Human Gene Therapy Methods, 26(4): 147-157 (2015). También se puede realizar una purificación mínima mediante cromatografía de afinidad utilizando, por ejemplo, resina de afinidad AVB Sepharose (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Suecia). Los métodos de purificación de AAV utilizando resina de afinidad AVB Sepharose se describen en, por ejemplo, Wang et al., Mol Ther Methods Clin Dev., 2:15040 (2015).

Inactivación por calor

Las técnicas de inactivación por calor se basan en las diferentes estabilidades térmicas de las partículas de AAV y de virus auxiliares. Por ejemplo, las partículas de AAV pueden calentarse a temperaturas de hasta 56 °C y permanecer intactas, mientras que las partículas de AV se vuelven inactivas. Conway et al., Gene Therapy 6, 986-993, 1999, describe la inactivación diferencial por calor del VHS en muestras que contienen AAV. La inactivación por calor puede llevarse a cabo mediante cualquier metodología conocida. En los ejemplos que se describen a continuación, la inactivación por calor se llevó a cabo utilizando un termociclador para calentar y enfriar rápidamente volúmenes de muestra de 300 mL o menos. Se eligió este sistema porque se basa en una transferencia de calor que es principalmente conductiva, lo que lo convierte en un modelo viable tanto para sistemas de flujo continuo como para sistemas por lotes más grandes que emplean una mezcla activa. Los ejemplos de sistemas de flujo continuo incluyen el paso de la muestra a través de un intercambiador de calor de flujo continuo, como el intercambiador de calor DHX™ de un solo uso para fabricación bioterapéutica (Thermo Fisher Scientific, Millersburg, PA). Estos sistemas permiten al operador controlar el proceso de inactivación por calor mediante el control del caudal de la muestra a través del intercambiador de calor, controlando así la duración del proceso de calentamiento, y la temperatura del intercambiador de calor, controlando así la temperatura de inactivación por calor.

Alternativamente, la inactivación por calor puede llevarse a cabo utilizando sistemas por lotes de diversos tamaños. Por ejemplo, la inactivación por calor puede realizarse a escala de 1L, colocando la muestra que contiene AAV en una botella PETG de 1L y colocando la botella en un baño de agua a la temperatura de inactivación deseada durante el período de tiempo deseado, mezclando, por ejemplo, las muestras pueden calentarse a 47 °C durante 20 minutos. A mayor escala, la inactivación por calor puede lograrse colocando la muestra que contiene AAV en una bolsa de bioprocesamiento de 5 L en una plataforma oscilante de temperatura controlada a la temperatura de inactivación deseada, durante el período de tiempo deseado. Por ejemplo, la plataforma oscilante puede ajustarse a 49 °C a una velocidad de oscilación de 30 RPM, con un ángulo de mezcla de 12° durante 40 minutos.

La inactivación por calor puede producirse a cualquier temperatura en la que haya una diferencia suficiente en la estabilidad entre las partículas de AAV y las partículas de virus auxiliar, de modo que las partículas de virus auxiliar se inactiven sustancialmente mientras permanecen las partículas de AAV activas. En la invención actual, las muestras que contienen AAV y partículas de virus auxiliar se calientan a una temperatura mayor o igual a 45 °C, y generalmente a una temperatura de entre 45 °C y 55 °C, siendo las temperaturas de 49 °C ±

2°C las más utilizadas. La muestra se mantiene generalmente a temperatura durante un período de 1 a 60 minutos, siendo 10 a 40 minutos los más utilizados. Sin embargo, como se muestra en la FIG. 1, la inactivación por calor es en gran medida independiente del tiempo, por lo que la duración de la etapa de calentamiento estará en función del tiempo necesario para llevar toda la muestra a la temperatura. Por ejemplo, una muestra de 300 mL puede alcanzar una temperatura uniforme en cuestión de segundos, mientras que un tanque de varios litros puede tardar varios minutos en alcanzar una temperatura uniforme. Además, una persona experta en la técnica comprenderá que pueden ser necesarias temperaturas más altas para lograr mayores niveles de reducción de AV.

Medición de la eficacia de la inactivación

Una vez realizada la inactivación por calor, puede ser necesario o deseable determinar la eficacia de la inactivación. La eficacia de un protocolo de inactivación se determina mediante ensayos que detectan la presencia de virus auxiliares competentes para la replicación, como el ensayo de placas. Los ensayos de placa para virus auxiliares son bien conocidos por los expertos en la técnica, incluidos los ensayos de placa para ^{A v ,}HSV, baculovirus y otros. Los ensayos de placa de adenovirus pueden realizarse utilizando cualquier tipo celular apropiado, por ejemplo, células HeLa o HEK293. Los protocolos estándar de ensayo en placa se describen, por ejemplo, en Current Protocols in Human Genetics, 2003. Los ensayos alternativos para medir los títulos adenovirales incluyen los que permiten la identificación de células infectadas en cultivo mediante la detección de proteínas virales, como las proteínas hexón, utilizando tinción inmunocitoquímica. Entre estos ensayos se incluye el kit de inmunoensayo de títulos de adenovirus QuickTiter™ (Cell Biolabs, San Diego, CA). La eficacia de la inactivación se indica generalmente como la reducción logarítmica del virus (LRV).

Cuantificación de las partículas de AAV

La cuantificación de las partículas de AAV es complicada por el hecho de que la infección por AAV no produce un efecto citopático in vitro y, por lo tanto, no se pueden utilizar ensayos de placas para determinar los títulos infecciosos. Sin embargo, las partículas de AAV pueden cuantificarse mediante diversos métodos, como la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) (Clark et al., Hum. Gene Ther. 10, 1031-1039 (1999)) o por hibridación puntual (Samulski et al., J. Virol. 63, 3822-3828 (1989)), o por densidad óptica de preparaciones de vectores altamente purificados (Sommer et al., Mol. Ther. 7, 122-128 (2003)). Las partículas resistentes a la DNasa (DRP) pueden cuantificarse mediante reacción en cadena de la polimerasa (qPCR) cuantitativa en tiempo real (DRP-qPCR) en un termociclador (por ejemplo, un termociclador iCycler iQ de formato de bloque de 96 pocillos (Bio-Rad, Hercules, CA)). Las muestras que contienen partículas de AAV se incuban en presencia de DNasa I (100 U/ml; Promega, Madison, WI) a 37 °C durante 60 min, seguidas de digestión con proteinasa K (Invitrogen, Carlsbad, CA) (10 U/mL) a 50 °C durante 60 min, y después se desnaturalizan a 95 °C durante 30 min. El conjunto iniciador-sonda utilizado debe ser específico de una porción no nativa del genoma del vector de AAV, por ejemplo, la secuencia poli(A) de la proteína de interés. El producto de la PCR puede amplificarse utilizando cualquier conjunto apropiado de parámetros de ciclado, basándose en la longitud y composición de los iniciadores, la sonda y la secuencia amplificada. Se divulgan protocolos alternativos en, por ejemplo, Lock et al., Human Gene Therapy Methods 25(2): 115-125 (2014).

La infectividad de las partículas de AAV puede determinarse mediante un ensayo TCID⁵⁰(dosis infecciosa en cultivo tisular al 50 %), como se describe, por ejemplo, en Zhen et al., Human Gene Therapy 15:709-715 (2004). En este ensayo, las partículas del vector de AAV se diluyen en serie y se utilizan para coinfectar una línea celular que expresa Rep/Cap junto con partículas de AV en placas de 96 pocillos. 48 horas después de la infección, se extrae el ADN celular total de los pocillos infectados y de control. A continuación, se mide la replicación del vector de AAV mediante qPCR con sonda y iniciadores específicos del transgén. La infectividad TCID⁵⁰por mililitro (TCID⁵⁰/ml) se calcula con la ecuación de Karber, utilizando las proporciones de pocillos positivos para AAV en diluciones seriadas de 10 veces.

Amortiguador de fondo

Los métodos de la presente invención incluyen el uso de un amortiguador de fondo. El amortiguador de fondo puede ser cualquier amortiguador capaz de mantener un pH estable en un amplio intervalo de temperaturas, por ejemplo, mantener el pH en un intervalo de 3,0 a 10,0 cuando el amortiguador cambia de temperatura de 4 °C y 70 °C. El amortiguador también puede mantener un pH de entre 7,0 y 9,0 cuando el amortiguador cambia la temperatura de 4 °C y 70 °C. Los amortiguadores de fondo ejemplares incluyen sistemas amortiguados por glicina, citrato, succinato, acetato, MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico), bis-tris (bis-(2-hidroxietil)-imino-tris-(hidroxi-metil)-metano), fosfato, pipes (ácido 1,4-piperazindietanosulfónico), mopso (ácido 3-mor-folino-2-hidroxipropanosulfónico), BTP (1, 3-bis(tris(hidroximetil)metilamino)propano), MOPS (ácido 3-morfolin- propan-1-sulfónico), TES ácido 2-[[1,3-dihidroxi-2-(hidroximetil)propan-2-il]amino]etanosulfónico, HEPES (ácido 4-(2- hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico), TEA (tris base, ácido acético y EDTA), tris, tricina, bicina, lactato, formiato y MMA (ácido 2-metilpropanedioico). Un amortiguador de fondo ejemplar incluye: bis-tris propano 40 mM, HEPES 20 mM, citrato 20 mM, NaCl 200 mM, y 0,001 % (p/v) Pluronic F68, y está a pH 8,0 a temperatura ambiente.

Iones metálicos di y trivalentes

Un subconjunto de los amortiguadores utilizados en la presente invención contienen uno o más cationes metálicos divalentes o trivalentes, por ejemplo, Mg2+, Ca2+, Mn2+, Ni2+, Zn2+, Co2+, Sr2+, Cu2+, Cr2+, y Sc3+. También pueden emplearse sales de los cationes mencionados. Cuando se emplean en la presente invención, los cationes di o trivalentes están presentes en una concentración total de entre 25 mM y 500 mM. En los ejemplos de referencia, los cationes di o trivalentes están presentes en una concentración total mayor a 10 mM. Como se muestra en los Ejemplos siguientes, todos los amortiguadores que contenían más de 10 mM de cationes di o trivalentes que se probaron proporcionaron una protección significativa en relación con las muestras calentadas en el amortiguador de control. Los niveles más altos de protección se observaron en amortiguadores que contenían de MgCh 50 mM a 200 mM. Para los iones metálicos que son altamente solubles, como los cationes de Ca o Mg, los expertos en la técnica entenderán que aumentar la concentración del catión más allá de la cantidad necesaria para lograr la máxima protección del AAV no tendrá efectos negativos sobre la protección del AAV y producirá resultados equivalentes. El amortiguador de la presente invención también puede incluir sales caotrópicas, incluidas sales de urea o guanidina. El amortiguador también puede incluir un poliol, siendo los polioles preferidos el glicerol, el propilenglicol y el 1,6-hexanodiol.

Sales cosmotrópicas

Un subconjunto de los amortiguadores utilizados en la presente invención contienen sales cosmotrópicas. Las sales cosmotrópicas son codisolventes que contribuyen a la estabilidad y estructura de las interacciones agua-agua. Las sales cosmotrópicas también estabilizan proteínas, membranas y agregados hidrófobos en solución. En una realización de la presente invención, el amortiguador incluye una o más sales cosmotrópicas, en particular una sal cosmotrópica fuerte como sulfato de amonio, acetato de amonio, citrato de sodio, acetato de sodio, sulfato de sodio, fosfato de potasio y cloruro de cesio. Las sales cosmotrópicas son útiles en la presente invención a una concentración de 0,5 M a 0,6 M. Las sales cosmotrópicas son útiles en los ejemplos de referencia a una concentración superior a 10 mM, por ejemplo, a una concentración de 0,1 M a 1 M, de 0,2 M a 0,8 M, de 0,3 M a 0,7 M, de 0,4 M a 0,6 M, o de 0,5 M.

Ejemplos

Los ejemplos que siguen no pretenden en modo alguno limitar el alcance de esta invención, sino que se proporcionan para ilustrar aspectos de los métodos divulgados. Muchas otras realizaciones de esta invención serán evidentes para un experto en la técnica.

Ejemplo 1

Las partículas Ad5 AV se produjeron mediante técnicas estándar y se purificaron mínimamente mediante gradiente de CsCl. Las partículas Ad5 se dializaron en amortiguador de fondo (40 mM bis-tris propano, HEPES 20 mM, citrato 20 mM, NaCl 200 mM, 0,001% (p/v) Pluronic F68, pH 8,0). El calentamiento se llevó a cabo utilizando un termociclador para calentar inmediatamente una muestra a la temperatura deseada, mantenerla a la temperatura deseada y, a continuación, enfriar inmediatamente las muestras. Las muestras de partículas Ad5 en amortiguador estaban contenidas en tubos de polipropileno y tenían un volumen igual o inferior a 300 mL. Las muestras de Ad5 AV se calentaron a 45 °C, 47 °C, 49 °C o 51 °C, durante 10 minutos, 15 minutos o 40 minutos, con la excepción de las muestras de Ad5 AV calentadas a 51 °C, que sólo se mantuvieron a esa temperatura durante 10 minutos. Tras el tratamiento térmico, se midió la infectividad de Ad5 utilizando el QuickTiter™ Adenovirus Titer Immunoassay Kit (Cell Biolabs, San Diego, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los datos de inactivación por calor del virus Ad5 AV se muestran en la FIG. 1 como reducción de log en virus de (LRV) del virus Ad5, siendo deseable un LRV > 6. Como puede verse en la FIG. 1, la inactivación del material Ad5 depende en gran medida de la temperatura, sin que el tiempo a temperatura tenga un gran impacto en la inactivación. Basándose en estos datos, es deseable llevar a cabo la etapa de inactivación a una temperatura de 47 °C o superior.

Ejemplo 2

Se ensayaron vectores de AAV de diferentes serotipos y que contenían diferentes tipos y tamaños de genoma para comprobar el efecto de los protocolos de inactivación térmica de los AV sobre la estabilidad genómica de los AAV. Se ensayaron dos serotipos, AAV8 y hu37, con tres genomas diferentes. Se ensayaron los siguientes vectores AAV: (A) cápside hu37 que contiene un constructo de una sola hebra (4,7 kb)

(B) cápside hu37 que contiene un constructo de una sola hebra sobredimensionada (5,1 kb)

(C) cápside AAV8 que contiene un pequeño constructo e una sola hebra (4,1 kb)

(D) cápside AAV8 que contiene un constructo autocomplementaria (4,6 kb)

Los vectores AAV (A) (C) y (D) se produjeron en células HEK293, la partícula (B) se produjo en células HeLa. Todos los vectores se purificaron mínimamente mediante cromatografía de afinidad o gradiente yodixonal utilizando técnicas estándar. Los vectores se dializaron en amortiguador de fondo (bis-tris propano 40 mM, HEPES 20 mM, citrato 20 mM, NaCl 200 mM, 0,001% (p/v) Pluronic F68, pH 8,0). El calentamiento se llevó a cabo utilizando un termociclador para calentar inmediatamente una muestra de vector a la temperatura deseada, mantenerla a la temperatura deseada y, a continuación, enfriar inmediatamente las muestras. Las muestras de vectores estaban contenidas en tubos de polipropileno y tenían un volumen igual o inferior a 300 mL. Las muestras de vectores se expusieron a las condiciones de inactivación por calor de la siguiente manera: Los vectores (A), (B) y (C) se calentaron a 45 °C, 47 °C o 49 °C, el vector (B) se calentó a 45 °C, 47 °C, 49 °C, 51 °C o 53 °C. Todos los vectores se analizaron tras calentarlos durante 10, 20 o 40 minutos. Tras el tratamiento térmico, se analizó la estabilidad del genoma de las muestras mediante el ensayo DRP-qPCR.

Los datos de este experimento se muestran en la FIG. 2. La degradación genómica del producto AAV tras los protocolos de inactivación se determinó mediante el ensayo DRP-qPCR y se representó como el % de rendimiento qPCR. El porcentaje de rendimiento qPCR se determinó comparándolo con una muestra inicial que no se expuso a temperaturas elevadas y se mantuvo a 4 °C. Como puede verse en la figura, para el serotipo de AAV8 con una sola hebra o constructo autocomplementaria de < 4,7 kb de longitud (FIG. 2C y FIG. 2D respectivamente), las temperaturas elevadas y el tiempo a temperatura no degradaron significativamente el material del AAV. Por el contrario, el serotipo hu37 con un constructo de una sola hebra (4,7 kb) fue más sensible al calor y al tiempo al calor en comparación con un constructo de tamaño similar producido en el AAV8 (FIG. 2A frente a la FIG. 2C). Por último, para el serotipo hu37, un constructo sobredimensionado (5,1 kb) tuvo un impacto significativamente negativo en la estabilidad frente al calor en comparación con un constructo de tamaño de genoma normal (4,7 kb) (FIG. 2B frente a la FIG. 2A). Estos resultados indican que los diferentes serotipos tienen diferentes perfiles de estabilidad frente al calor, pero lo que es más importante, que el tamaño del constructo tiene un impacto significativo calor en la estabilidad de la cápside.

Ejemplo 3

Se compararon dos métodos para determinar la integridad del genoma de los vectores de AAV. Las muestras del vector hu37 que contenían un genoma sobredimensionado (5,1 kb) se calentaron a 22 °C, 45 °C, 47 °C, 49°C, 51°C o 53°C durante 20 minutos, y la recuperación se midió mediante el ensayo DRP-qPCR o mediante un ensayo de infectividad TCID⁵⁰. Las muestras de control se mantuvieron congeladas hasta que se realizaron las mediciones de integridad del genoma.

La FIG. 3 presenta una comparación de los datos recogidos mediante DRP-qPCR frente al ensayo de infectividad TCID⁵⁰. Como puede verse en la figura, las recuperaciones resultantes de las dos técnicas dieron resultados cualitativamente similares, y dieron la misma tendencia en la disminución de la calidad de la cápside con el aumento de la temperatura. Estos datos refuerzan el uso del ensayo DRP-qPCR como modelo para llevar a cabo investigaciones preliminares destinadas a mitigar la degradación de la cápside cuando se expone a temperaturas elevadas.

Ejemplo 4

El efecto del sistema de producción celular sobre la sensibilidad al calor se comprobó comparando la estabilidad al calor de los vectores de AAV producidos utilizando diferentes tipos celulares. Los vectores del serotipo hu37, que contienen un genoma sobredimensionado (5,1 kb), se produjeron utilizando células HeLa o células HEK293. Las muestras de vectores se calentaron a 45 °C, 47 °C, 49 °C, 51 °C o 53 °C durante 10, 20 o 40 minutos. La integridad genómica se midió mediante DRP-qPCR. Como se muestra en la FIG. 4, no se repitieron todos los puntos de datos para ambos tipos de vectores. Sin embargo, los resultados de los dos experimentos fueron cualitativamente similares. Estos datos sugieren que el sistema de producción de la línea celular utilizado para crear el material AAV no tuvo un impacto significativo en la estabilidad térmica del AAV resultante. Además, estos datos apoyan el hallazgo general de que el serotipo hu37, que contiene un material de construcción sobredimensionado, es altamente sensible a las condiciones de calentamiento requeridas para la inactivación de Ad5 (como se muestra en la FIG. 1).

Ejemplo 5

Las muestras de vectores AAV del serotipo hu37 que contienen un genoma sobredimensionado se produjeron como se describe en el Ejemplo 2. Las muestras se dializaron en (A) amortiguador de fondo estándar (bis-tris propano 40 mM , HEPES 20 mM, citrato 20 mM, NaCl 200 mM, 0,001% (p/v) Pluronic F68, pH 8,0) o (B) amortiguador de fondo estándar que contenía 0,5 M de sulfato de amonio. Las muestras se calentaron como sigue: 45 °C durante 10 y 40 minutos, 47 °C durante 20 minutos, 49 °C durante 10 minutos y 40 minutos, y 51 °C durante 20 minutos. La integridad genómica se midió mediante DRP-qPCR.

Como se muestra en la FIG. 5, al añadir 0,5 M de sulfato de amonio al amortiguador de fondo se mejoró la estabilidad térmica del vector de AAV (FIG. 5A frente a la FIG. 5B). Estos datos demuestran que añadiendo sales cosmotrópicas fuertes a la formulación amortiguador utilizada durante la etapa de inactivación por calor, se puede proteger al vector de AAV del impacto degradante de las temperaturas elevadas.

Estos datos demuestran que el AAV puede ser sensible a las condiciones requeridas para la inactivación térmica del virus Ad5. La estabilidad del AAV parece depender del serotipo, y el uso de construcciones sobredimensionadas (por sobredimensionada se entiende una construcción de 4,7 kb de longitud o mayor) puede tener un impacto significativamente perjudicial en la estabilidad del material de AAV. Los datos mostrados en este informe también sugieren que la adición de sales cosmotrópicas puede tener un impacto beneficioso, aumentando la estabilidad del material de AAV cuando se expone a temperaturas elevadas.

Ejemplo 6

Las muestras de vectores AAV del serotipo hu37 que contienen un genoma sobredimensionado se produjeron como se describe en el Ejemplo 2. Las muestras se dializaron en (A) amortiguador de fondo estándar (bis-tris propano 40 mM, HEPES 20 mM, citrato 20 mM, NaCl 200 mM, 0,001% (p/v) Pluronic F68, pH 8.0) amortiguador de fondo estándar que contenía (B) MgCh 0,1 mM, (C) MgCh 10 mM, (D) MgCh 25 mM, (E) MgCh 50 mM , (F) MgCh 100 mM, o (G) MgCh 200 mM. Las muestras se calentaron a las temperaturas y durante los periodos indicados en la Tabla 1. La integridad genómica de las partículas de AAV se midió por DRP- qPCR. Los resultados del experimento se presentan en la Tabla 2. El título residual se determinó comparándolo con una muestra inicial que no se expuso a temperaturas elevadas y se mantuvo a 4 °C, y se presenta como porcentaje. También se indica el coeficiente de variación (% CV).

La FIG. 6 muestra la recuperación de vectores de AAV en amortiguador que contiene de MgCh 0 a 100 mM a 47 °C, durante 40 minutos. Las muestras en amortiguador que contenían menos de MgCh 25 mM tuvieron una recuperación significativamente menor en todos los puntos temporales.

La FIG. 7 muestra la recuperación de vectores de AAV en amortiguador conteniendo MgCh 100 mM o 200 mM a 49 °C durante 180 minutos. La FIG. 8 muestra la recuperación de vectores de AAV en amortiguador que contiene MgCh 100 mM o 200 mM a 51 °C durante 180 minutos. La FIG. 9 muestra la recuperación de vectores de AAV en amortiguador que contiene MgCh 100 mM o 200 mM a 53 °C durante 180 minutos. En general, estos datos sugieren que el amortiguador que contiene MgCh 200 mM proporciona una protección ligeramente mejor contra la degradación durante el calentamiento prolongado. Estas diferencias se representan en las FIG. 10 y 11, que muestran un ligero aumento de la pérdida de vectores con el aumento de la duración y la temperatura para el amortiguador que contiene MgCh 100 mM frente al amortiguador que contiene MgCh 200 mM.

Tabla 1

Tabla 2

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de inactivación del virus auxiliar en una muestra que contiene partículas de virus auxiliar, partículas de virus adenoasociado y un amortiguador, el método comprende:

calentar la muestra a una temperatura superior o igual a 45 °C durante entre 1 minuto y 6 horas, en donde el amortiguador comprende una concentración de entre 25 mM y 500 mM de cationes divalentes o trivalentes, o una concentración de entre 0,5 M y 0,6 M de sal cosmotrópica.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra se calienta a una temperatura entre 45 °C y 65 °C; entre 45 °C y 60 °C; entre 45 °C y 55 °C; entre 47 °C y 53 °C; o una temperatura de 48 °C o 49 °C.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra se mantiene a la temperatura durante un período de tiempo de entre 10 y 180 minutos, entre 20 y 180 minutos, entre 20 y 60 minutos, o entre 20 y 40 minutos.

4. El método de la reivindicación 1, en donde el método da como resultado una reducción log del virus auxiliar de 6,0 o mayor.

5. El método de la reivindicación 1, en donde la partícula de virus adenoasociado comprende un genoma

a) de más de 4,7 kb de ADN;

b) de aproximadamente 5,1 kb de ADN;

c) de aproximadamente 4,7 kb de ADN;

d) de menos de 4,0 kb de ADN

e) de aproximadamente 3,0 kb de ADN;

o

f) que es sustancialmente autocomplementario.

6. El método de la reivindicación 1, en donde el amortiguador además comprende:

a) una sal caotrópica; opcionalmente en donde la sal caotrópica es una sal de urea, o una sal de guanidina;

o

b) un poliol seleccionado del grupo que comprende: glicerol, propilenglicol y 1,6-hexanodiol.

7. El método de la reivindicación 1, en donde el amortiguador mantiene el pH entre 3,0 y 10,0, o entre 7,0 y 9,0, a temperaturas entre 4 °C y 70 °C.

8. El método de la reivindicación 1, en donde el amortiguador además comprende: bis-tris propano 40 mM, HEPES 20 mM, citrato 20 mM, NaCl 200 mM, y 0,001 % (p/v) Pluronic F68.

9. El método de la reivindicación 7, en donde el amortiguador es un amortiguador Tris; un amortiguador fosfato; o un amortiguador triazolamina.

10. El método de la reivindicación 1, en donde el virus ayudante es un adenovirus; opcionalmente, en donde el adenovirus es Ad5.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la concentración de cationes divalentes o trivalentes es:

a) 25 mM a 400 mM;

b) 30 mM a 300 mM;

c) 50 mM a 250 mM;

o

d) 70 mM a 200 mM.

12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde los cationes divalentes o trivalentes se seleccionan del grupo formado por: Mg, Ca, Mn, Ni, Zn, Co, Sr, Cu, Cr, Fe, y Sc; opcionalmente en donde:

a) los cationes divalentes se seleccionan del grupo formado por: Mg2+, Ca2+, Mn2+, Ni2+, Zn2+, Co2+, Sr2+, Cu2+y Cr2+; o

b) los cationes trivalentes son Sc3+.

13. El método de la reivindicación 12, en donde los cationes son Mg2+.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la sal cosmotrópica se selecciona del grupo que consiste en sulfato de amonio, acetato de amonio, citrato de sodio, acetato de sodio, sulfato de sodio, fosfato de potasio y cloruro de cesio.

15. El método de la reivindicación 14, en donde la concentración de la sal cosmotrópica es 0,5 M.