ES2930058T3

ES2930058T3 - Receptores quiméricos y métodos de uso de los mismos

Info

Publication number: ES2930058T3
Application number: ES17776859T
Authority: ES
Inventors: Jed Wiltzius; Rodriguez Ruben Alvarez; Alice Bakker; Lawren Wu; Tara Arvedson
Original assignee: Amgen Inc; Kite Pharma Inc
Current assignee: Amgen Inc; Kite Pharma Inc
Priority date: 2016-04-01
Filing date: 2017-03-31
Publication date: 2022-12-05
Anticipated expiration: 2037-03-31
Also published as: JP2024069310A; KR20220157517A; JP2019513370A; US20200115457A1; UA123276C2; KR20180129889A; TW202041529A; CN113150170A; PE20200400A1; AU2020203990A1; WO2017173384A1; EP4180449A1; MA43603A1; JP7134204B2; CA3177398A1; IL262041A; AR108066A1; DK3436030T3; RS63735B1; CA3019650A1

Abstract

Las moléculas de unión a antígeno, los receptores quiméricos y las células inmunitarias manipuladas se describen de acuerdo con la invención. La invención se refiere además a vectores, composiciones y métodos de tratamiento y/o detección usando moléculas de unión a antígeno y células inmunitarias manipuladas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Receptores quiméricos y métodos de uso de los mismos

Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos núm. 62/317,068, presentada el 1 de abril de 2016.

Listado de secuencias

La aplicación instantánea contiene un listado de secuencias.

Antecedentes de la invención

La lectina 1 tipo C (CLL-1, también conocida como CLEC-1, CLEC12A, MICL, Lectina 1 asociada a la célula dendrítica (DCAL-1) y Dc AL-2) es un receptor de glicoproteína y miembro de una familia de receptores tipo lectina tipo C implicados en la regulación de la proliferación celular y la regulación inmunitaria. CLL-1 se expresa en células hematopoyéticas, principalmente en células inmunitarias innatas, que incluye los monocitos, granulocitos, células dendríticas, así como también las células progenitoras mieloides. Van Rhenen y otros, Blood 2007:110(7). CLL-1 se ha implicado en la regulación de la proliferación y diferenciación de las células mieloidesBakkery otros, Cancer Res.

64:8443-8450 (2004)); Marshall y otros, J. Biol. Chem 279:14792-14802 (2004))), y está presente en las células de la leucemia mieloide (mielógena) aguda (AML), así como también en las células madre leucémicas (Zhao y otros, Haematologica 2010, 95(1):71-78).

En consecuencia, CLL-1 se ha implicado en múltiples enfermedades, que incluye, entre otras, leucemia mieloide (mielógena) aguda (AML), leucemia mieloide (mielógena) crónica (CML), leucemia mielomonocítica crónica (CMML), leucemia mielomonocítica juvenil, leucemia mielomonocítica atípica, leucemia promielocítica aguda (APL), leucemia monocítica aguda, leucemia monoblástica aguda, leucemia eritroide aguda, leucemia megacarioblástica aguda, síndrome mielodisplásico (MDS), trastorno mieloproliferativo, neoplasia mieloide, sarcoma mieloide), neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas (BPDCN), o sus combinaciones.

CLL-1 puede desempeñar adicionalmente un papel en las enfermedades inflamatorias o autoinmunitarias como la artritis reumatoide, la psoriasis, las alergias, el asma, la enfermedad de Crohn, IBD, IBS, la fibromialga, la mastocitosis y la enfermedad celíaca.

La proteína CLL-1 humana comprende un polipéptido de la siguiente secuencia de aminoácidos:

M SEEVT Y AD LQ F QN S SEMEKIPEIGKF GEKAPPAP SHVWRP A A L F L T L L C L L

LL IG LG V LA S M FH V TLK IE M K K M N K LQ N IS E E LQ R N IS LQ LM S N M N IS N K IR

N LSTTLQ TIATKLC R ELYSKEQ EH KC KPC PR RW IW HKD SC YFLSD DVQ TW Q

ES KM AC AA Q N ASLLKIN N KN ALEFIKSQ SRSYD YW LG LSPEEDSTRG M R VD

N IIN S S A W V IR N A P D LN N M Y C G Y IN R LY V Q Y Y E tC TYK KR M IC EKM AN P VQ LG STYFREA (SEQ ID NO. 140).

La información de secuencia adicional se encuentra en la lista de CLL-1 Uniprot en: http: //www.uniprot.org/uniprot/Q5QGZ9, así como también la secuencia de referencia NCBI NP_612210.4 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP 612210.4).

Cuando se hace referencia a CLL-1, se apreciará que la referencia a la misma abarca sus fragmentos, así como también los polipéptidos relacionados, que incluye, entre otros, variantes alélicas, variantes de corte y empalme, variantes derivadas, variantes de sustitución, variantes de deleción y/o variantes de inserción que incluye la adición de una metionina N-terminal, la fusión de polipéptidos y los homólogos entre especies. En determinadas modalidades, un polipéptido de CLL-1 incluye residuos terminales, tales como, entre otros, residuos de secuencia líder, residuos de direccionamiento, residuos de metionina amino terminal, residuos de lisina, residuos de etiqueta y/o residuos de proteína de fusión.

Ciertos anticuerpos contra CLL-1 se describen en la Patente de Estados Unidos núm. 8,536,310 y en la Patente de Estados Unidos núm. 9,163,090.

Se ha demostrado que las células inmunitarias modificadas poseen las cualidades deseadas en tratamientos terapéuticos, particularmente en oncología. Dos tipos principales de células inmunitarias modificadas son las que contienen receptores de antígenos quiméricos (denominados "CAR" o "CAR-T") y receptores de células T ("TCR"). Estas células modificadas están diseñadas para dotarlas de especificidad antigénica mientras retienen o mejoran su capacidad para reconocer y matar una célula objetivo. Los receptores de antígenos quiméricos pueden comprender, por ejemplo, (i) un componente específico de antígeno ("molécula de unión a antígeno"), (ii) un dominio extracelular, (iii) uno o más dominios coestimuladores y (iv) uno o más dominios de activación. Cada dominio puede ser heterogéneo, es decir, estar compuesto por secuencias derivadas de (o correspondientes a) diferentes cadenas de proteínas. Las células inmunitarias que expresan los receptores de antígenos quiméricos (tales como las células T) pueden usarse en diversas terapias, que incluye las terapias contra el cáncer. Se apreciará que los dominios coestimuladores pueden usarse para potenciar la activación de las células que expresan CAR frente a los antígenos objetivo y, por lo tanto, aumentar la potencia de la inmunoterapia adoptiva.

Ciertos CAR para CLL-1 se han descrito en, por ejemplo, el documento WO2016/014535.

Las células T pueden diseñarse para que posean especificidad para uno o más objetivos deseados. Por ejemplo, las células T pueden transducirse con ADN u otro material genético que codifica una molécula de unión a antígeno, como uno o más fragmentos variables de cadena sencilla ("scFv") de un anticuerpo, junto con una o más moléculas de señalización, y/o uno o más dominios de activación, tal como CD3 zeta.

Además de la capacidad de las células CAR-T para reconocer y destruir las células objetivo, la terapia exitosa de células T se beneficia de la capacidad de las células CAR-T para persistir y mantener la capacidad de proliferar en respuesta a un antígeno.

Los receptores de células T (TCR) son moléculas que se encuentran en la superficie de las células T y son responsables de reconocer fragmentos de antígenos como péptidos unidos a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). El TCR se compone de dos cadenas proteicas diferentes: en aproximadamente el 95 % de los TCR humanos, el TCR consiste en una cadena alfa (a) y beta (p). En aproximadamente el 5 % de las células T humanas, el TCR consiste en cadenas gamma y delta (^y/§). Cada cadena está compuesta de dos dominios extracelulares: una región variable (V) y una región constante (C), ambas de la superfamilia de inmunoglobulinas. Como en otras inmunoglobulinas, los dominios variables de las cadenas a y p del TCR (o cadenas gamma y delta (Y/5)) tienen cada uno tres regiones hipervariables o determinantes de la complementariedad (CDR). Cuando el TCR interactúa con el péptido antigénico y el MHC (péptido/MHC), la célula T se activa, lo que le permite atacar y destruir la célula objetivo.

Sin embargo, las terapias actuales han mostrado niveles variables de efectividad con efectos secundarios no deseados. Por lo tanto, existe la necesidad de identificar las terapias nuevas y mejoradas para tratar enfermedades y trastornos relacionados con CLL-1.

Resumen de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones anexas. Se relaciona con receptores de antígenos quiméricos (CAR) que comprenden una molécula de antígeno que se une específicamente a CLL-1; las células inmunitarias modificadas correspondientes; y los usos médicos de los mismos.

Resumen de las enseñanzas técnicas

La presente descripción proporciona enseñanzas que en algunos aspectos van más allá de la descripción de la invención como tal, que se define en las reivindicaciones anexas. Las enseñanzas se proporcionan para situar la invención real en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Tal información técnica adicional que no cae dentro del alcance de las reivindicaciones anexas no es parte de la invención. En particular, los términos "modalidad", "enseñanza", "descripción" y "aspecto" no deben interpretarse como una referencia necesaria a la invención reivindicada, a menos que el objeto en cuestión esté dentro del alcance de las reivindicaciones. Por ejemplo, se proporcionan enseñanzas generales con respecto a las células inmunitarias diseñadas (como CAR o TCR), moléculas de unión a antígeno (que incluyen, entre otros, anticuerpos, scFv, cadenas pesadas y/o ligeras y CDR de estas moléculas de unión a antígeno) con especificidad para CLL-1. También se proporciona una

Secuencia extracelular (bisagra) de CD28 útil como dominio coestimulador en estas células.

Los receptores de antígenos quiméricos de la enseñanza típicamente comprenden: (i) una molécula de unión a antígeno específica de CLL-1, (ii) un dominio extracelular (que puede comprender una bisagra), (iii) uno o más dominios coestimuladores y (iv) uno o más dominios activadores. Se apreciará que cada dominio puede ser heterogéneo, por lo tanto compuesto por secuencias derivadas de (o correspondientes a) diferentes cadenas de proteínas.

En algunas modalidades, la enseñanza se refiere a un receptor de antígeno quimérico que comprende una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a CLL-1, en donde la molécula de unión a antígeno comprende al menos uno de: a) una CDR1 de cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 17, 51, 73 y 95, b) una cadena pesada variable CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18, 52, 74 y 96, c) una cadena pesada variable CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 19, 53, 75 y 97, d) una CDR1 de cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 22, 56, 78, y 100, e) una cadena ligera variable CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO. 23, 57, 79, y 101, y f) una cadena ligera variable CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO. 24, 58, 80, y 102. El receptor de antígeno quimérico puede comprender además al menos un dominio coestimulador. El receptor de antígeno quimérico de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende además al menos un dominio de activación.

En ciertas modalidades, la enseñanza se refiere a receptores de antígenos quiméricos que tienen al menos alrededor del 75 %, al menos alrededor del 80 %, al menos alrededor del 85 %, al menos alrededor del 90 %, al menos alrededor del 95 %, al menos alrededor del 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o 100 % idénticos a los receptores de antígenos quiméricos expuestos en la presente descripción.

Las enseñanzas también abarcan los receptores de antígenos quiméricos que no tienen más de 8 sustituciones de aminoácidos en los mismos.

En ciertas modalidades, el dominio coestimulador comprende un dominio de señalización (u otra porción adecuada) de CD28, OX-40, 4-1BB/CD137, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, Muerte Programada-1 (PD-1), Coestimulador inducible por células T (ICOS), antígeno asociado a la función de los linfocitos 1 (LFA-1, CDl-la/CD18), CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD247, CD276 (B7-H3), LIGHT, (TNFSF14), NKG2C, Ig alfa (CD79a), DAP-10, receptor Fc gamma, molécula MHC de clase 1, proteínas receptoras de TNF, una proteína de inmunoglobulina, receptor de citocinas, integrinas, moléculas de señalización de activación linfocítica (proteínas SLAM), receptores de células NK activadoras, BTLA, receptor de ligando Toll, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7Ralfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1 1d, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDl lc, ITGBl, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB 7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, un ligando que se une específicamente con CD83, o cualquiera de sus combinaciones.

En algunas modalidades, el dominio coestimulador puede comprender la totalidad o una porciones de la secuencia de ácido nucleico 4-1BB establecida en la SEQ ID NO. 141, y la secuencia de aminoácidos correspondiente como se establece en la SEQ ID NO. 142. En otras modalidades, el dominio coestimulador puede comprender toda o una porción de la secuencia de aminoácidos de OX40 como se establece en la SEQ ID NO. 143. Ver también Hombach y otros, Oncoinmunology. 2012 Jul. 1; 1(4): 458-466. En aún otras modalidades, el dominio coestimulador puede comprender la totalidad o una porción de la molécula ICOS como se describió en Guedan y otros, Agosto 14, 2014; Blood: 124 (7) y Shen y otros, Journal of Hematology & Oncology (2013) 6:33. En aún otras modalidades, el dominio coestimulador puede comprender todo o una porción de CD27 como se describió en Song y otros, Oncoinmunology.

2012 Jul. 1; 1(4): 547-549.

Las modalidades preferidas incluyen la incorporación en los CAR de la enseñanza de una o más de las siguientes secuencias: SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6, y SEQ ID NO. 8. Las modalidades preferidas adicionales ^{incluyen la incorporación en los CAR de la enseñanza de la secuencia expuesta en la SEQ ID}N^o.^14.

En otras modalidades, el dominio de activación comprende CD3, preferentemente CD3 zeta, con mayor preferencia ^{CD3 zeta que tiene la secuencia establecida en la s}E^{q ID NO. 10.}

En otras modalidades, la enseñanza se refiere a un receptor de antígeno quimérico que comprende una molécula de unión a antígeno que comprende además la SEQ ID NO. 2 y que comprende además la SEQ ID NO. 10.

La enseñanza se refiere además a polinucleótidos aislados que codifican los receptores de antígenos quiméricos y vectores que comprenden los polinucleótidos. Cualquier vector conocido en la técnica puede ser adecuado para la presente enseñanza. En algunas modalidades, el vector es un vector viral. En algunas modalidades, el vector es un vector retroviral (tal como pMSVG1), un vector de ADN, un vector de virus de leucemia murina, un vector SFG, un plásmido, un vector de ARN, un vector adenoviral, un vector baculoviral, un vector viral de Epstein Barr, un vector papovaviral, un vector viral vaccinia, un vector viral herpes simplex, un vector asociado a adenovirus (AAV), un vector lentiviral (tal como pGAR), o cualquiera de sus combinaciones. La secuencia de pGAR es la siguiente:

CTGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGG TTACGCGCAGCGTG ACCG CTACACTTG CCAG CG CCCTAGCGCCCGCTCCTTT CGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTC TAAATC G G G G G CTCCCTTTAG G G TTCCG ATTTAG TG CTTTACG G CACCTCG A C C CC AAAAAAC TTG ATTAG G G TG ATG G TTCAC G TAG TG G G C CATCG CC C TG A TAG ACG G TTTTTC G C C C TTTG AC G TTG G AG TC C AC G TTC TTTAATAG TG G AC T C TTG TTC C AA AC TG G AAC AAC AC TC AAC C C TATC TC G G TC TATTC TTTTG ATT TA TA A G G G A TTTTG C C G A TTTC G G C C TATTG G TTAA AA AATG A G C TG ATTTA A C A A A A A T T T A A C G C G A A T T T T A A C A A A A T A T T A A C G C T T A C A A T T T G C C A T TCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGG AAG GGCGATCGG TG CG GGCCTCTT CGCT A T T ACGCC AG CT GG CG AAAG G G G G AT GT GCT GC AAG G C G ATT AA G TT GGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTG AATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGACCCGGGGATGGCGCGCCAGTAAT CAATTACG GGGTCATTAG TTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATA ACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTG ACGTCAATAATG ACG 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A A A A A T A A AC A A A T AG GGGTT C C GC GC ACATTTCCCC G A A A AG T GC C AC

El mapa del vector pGAR se establece más abajo:

Los vectores ilustrativos adicionales adecuados incluyen, por ejemplo, pBABE-puro, pBABE-neo largeTcDNA, pBABE-hygro-hTERT, pMKO.1 GFP, MSCV-IRES-GFP, pMSCV PIG (plásmido vacío Puro IRES GFP), pMSCV-loxp-dsRedloxp-eGFP-Puro-WPRE, MSCV IRES Luciferasa, pMIG, MDH1-PGK-GFP_2.0, TtRMPVIR, pMSCV-IRES-mCherry FP, pRetroX GFP T2A Cre, pRXTN, pLncEXP y pLXIN-Luc.

Las células inmunitarias ilustrativas incluyen, entre otras, las células T, los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), las células NK, las células que expresan Tc R, las células dendríticas o células NK-T. Las células T pueden serautólogas, alogénicas o heterólogas. En otras modalidades, la enseñanza se refiere a las composiciones farmacéuticas que comprenden las células inmunitarias descritas en la presente descripción.

En ciertas modalidades, la enseñanza se refiere a moléculas de unión a antígenos (y receptores de antígenos quiméricos que comprenden estas moléculas) que comprende al menos uno de:

(a) una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21;

(b) una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 y una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55;

(c) una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72 y una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77;

(d) una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94 y una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 99;

y en donde la región o regiones VH y VL están unidas por al menos un enlazador. Las enseñanzas también abarcan los receptores de antígenos quiméricos y/o las moléculas de unión a antígenos que no tienen más de 8 sustituciones de aminoácidos en los mismos.

El enlazador puede ser, por ejemplo, un enlazador poli-Gly tal como GGGGGSGGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 130) o GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 145).

En otras modalidades, la enseñanza se refiere a moléculas de unión a antígeno (y receptores de antígeno quiméricos que comprenden estas moléculas) en donde el enlazador comprende al menos uno de la SEQ ID NO. 130 y la SEQ ID NO. 132.

En ciertas modalidades, la enseñanza se refiere a moléculas de unión a antígenos y/o receptores de antígenos quiméricos que tienen al menos alrededor del 75 %, al menos alrededor del 80 %, al menos alrededor del 85 %, al menos alrededor del 90 %, al menos alrededor del 95 %, al menos alrededor del 96 %, al menos alrededor del 97 %, al menos alrededor del 98 %, al menos alrededor del 99 % o 100 % idénticos a las moléculas de unión a antígeno y/o receptores de antígeno quiméricos establecidos en la presente descripción.

En otras modalidades, la enseñanza se refiere a los polinucleótidos aislados que comprende al menos uno de: SEQ ID NO. 27; SEQ ID NO. 31; SEQ ID NO. 35; SEQ ID NO. 39; SEQ ID NO. 43; SEQ ID NO. 47; SEQ ID NO. 61; SEQ ID NO. 65; SEQ ID NO. 69; SEQ ID NO. 83; SEQ ID NO. 87; SEQ ID NO. 91; SEQ ID NO. 105; SEQ ID NO. 109; SEQ ID NO. 113; SEQ ID NO. 117; SEQ ID NO. 121; y SEQ ID NO. 125.

En ciertas modalidades, la enseñanza se refiere a los polinucleótidos aislados que tienen al menos alrededor del 75 %, al menos alrededor del 80 %, al menos alrededor del 85 %, al menos alrededor del 90 %, al menos alrededor del 95 %, al menos alrededor del 96 %, al menos alrededor del 97 %, al menos alrededor del 98 %, al menos alrededor del 99 % o 100 % idénticos a los polinucleótidos establecidos en la presente descripción.

La enseñanza se refiere además a vectores que comprenden estos polinucleótidos, así como también a células transducidas mediante el uso de estos vectores.

En las modalidades adicionales, la enseñanza se refiere a polipéptidos aislados que comprenden la secuencia de aminoácidos establecida en al menos uno de: SEQ ID NO. 28; SEQ ID NO. 32; SEQ ID NO. 36; SEQ ID NO. 40; SEQ ID NO. 44; SEQ ID NO. 48; SEQ ID NO. 62; SEQ ID NO. 66; SEQ ID NO. 70; SEQ ID NO. 84; SEQ ID NO. 88; SEQ ID NO. 92; SEQ ID NO. 106; SEQ ID NO. 110; SEQ ID NO. 114; SEQ ID NO. 118; SEQ ID NO. 122; y SEQ ID NO.

126. En otras modalidades, la enseñanza se refiere a vectores que codifican estos polipéptidos, células inmunitarias que comprenden estos polipéptidos. Las células inmunitarias preferidas incluyen las células T, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), células N^k, células que expresan TCR, células dendríticas o células NK-T. Las células T pueden ser autólogas, alogénicas o heterólogas. Las enseñanzas también abarcan los receptores de antígenos quiméricos que no tienen más de 8 sustituciones de aminoácidos en los mismos.

En otras modalidades, la enseñanza se refiere a los polinucleótidos aislados que codifican un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR) que comprende una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a CLL-1, en donde la molécula de unión a antígeno comprende una cadena variable pesada (Vh) CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 19, 53, 75 y 97. Las enseñanzas también abarcan los receptores de antígenos quiméricos que no tienen más de 8 sustituciones de aminoácidos en los mismos. Los polinucleótidos pueden comprender además un dominio de activación. En las modalidades preferidas, el dominio activador es CD3, con mayor preferencia CD3 zeta, con mayor preferencia la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO. 9.

En otras modalidades, la enseñanza incluye un dominio coestimulador que comprende el dominio de señalización (u otra porción adecuada) de CD28, CD28T, OX40, 4-1BB/CD137, CD2, CD3 (alfa, beta, delta, épsilon, gamma, zeta), CD4, CD5, CD7, CD9, CD16, CD22, CD27, CD30, CD 33, CD37, CD40, CD 45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, PD-1, ICOS, antígeno asociado a la función de los linfocitos 1 (LFA-1 (CD1 la/CD 18), CD247, CD276 (B7-H3), LIGHT (miembro 14 de la superfamilia del factor de necrosis tumoral; TNFSF14), NKG2C, Ig alfa (CD79a), DAP-10, receptor Fc gamma, molécula MHC de clase I, TNF, TNFr, integrina, molécula de activación linfocítica de señalización, BTLA, receptor de ligando Toll, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl-ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl-la, LFA-1, ITGAM, CDl-lb, ITGAX, CDl-lc, ITGBl, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD 162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/ Cbp, CD19a, ligando de CD83, o fragmentos o sus combinaciones. Los dominios coestimuladores preferidos se enumeran a continuación.

En otras modalidades, la enseñanza se refiere a los polinucleótidos aislados que codifican un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR), en donde dicho CAR o TCR comprende una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a CLL-1, y en donde la molécula de unión a antígeno comprende una cadena variable ligera (Vl) CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 24, 58, 80, y 102. El polinucleótido puede comprender además un dominio de activación. El polinucleótido puede comprender además un dominio coestimulador.

En otras modalidades, la enseñanza se refiere a los polinucleótidos aislados que codifican un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR) que comprende una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a CLL-1, en donde la cadena pesada de la molécula de unión a antígeno comprende CDR1 (SEQ ID n O: 17), CDR2 (SEQ ID NO: 18) y CDR3 (s Eq ID NO: 19) y la cadena ligera de la molécula de unión a antígeno comprende CDR1 (SEQ ID NO: 22), CDR2 (SEQ ID NO: 23) y CDR3 (SEQ ID NO: 24).

En ciertas modalidades, la enseñanza se refiere a los polinucleótidos aislados que tienen al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 % o 100 % idénticas a las secuencias anteriores.

En otras modalidades, la enseñanza se refiere a los polinucleótidos aislados que codifican un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR) que comprende una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a CLL-1, en donde la cadena pesada de la molécula de unión a antígeno comprende CDR1 (SEQ ID n O: 51), CDR2 (SEQ ID NO: 52) y CDR3 (s Eq ID NO: 53) y la cadena ligera de la molécula de unión a antígeno comprende CDR1 (SEQ ID NO: 56), CDR2 (SEQ ID NO: 57) y CDR3 (SEQ ID NO: 58).

En otras modalidades, la enseñanza se refiere a los polinucleótidos aislados que codifican un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR) que comprende una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a CLL-1, en donde la cadena pesada de la molécula de unión a antígeno comprende CDR1 (SEQ ID ⁿO: 73), CDR2 (SEQ ID NO: 74) y CDR3 (^sE^qID NO: 75) y la cadena ligera de la molécula de unión a antígeno comprende CDR1 (SEQ ID NO: 78), CDR2 (SEQ ID NO: 79) y CDR3 (SEQ ID NO: 80).

En otras modalidades, la enseñanza se refiere a los polinucleótidos aislados que codifican un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR) que comprende una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a CLL-1, en donde la cadena pesada de la molécula de unión a antígeno comprende CDR1 (SEQ ID ⁿO: 95), CDR2 (SEQ ID NO: 96) y CDR3 (^sE^qID NO: 97) y la cadena ligera de la molécula de unión a antígeno comprende CDR1 (SEQ ID NO: 100), CDR2 (SEQ ID NO: 101) y CDR3 (SEQ ID NO: 102).

En otras modalidades, la enseñanza se refiere a los polinucleótidos aislados que codifican un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR) que comprende una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a CLL-1, y en donde la molécula de unión a antígeno comprende:

(a) una región determinante de complementariedad (CDR) 1 de región variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos GX2X3X4X5X6X7X8X9 (SEQ ID NO: 134), en donde X2 es G, F o Y; X3 es S o T; X4 es I, F o L; X5 es S o T; X6 no está presente o S; X7 no está presente o G; X8 no está presente ni E ni G; y X9 es F, L o Y;

(b) una región determinante de complementariedad (CDR) 2 de región variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos X1X2X3X4X5X6 (SEQ ID NO: 135), en donde X1 es D, H, S o Y; X2 es H, P o Y; X3 es D, E o S; X4 es D o G; X5 es G o S; y X6 no está presente de D o E;

(c) una región determinante de complementariedad (CDR) 3 de región variable de cadena pesada (VH), que comprende la secuencia de aminoácidos X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12DY (SEQ ID NO: 136), en donde X1 es E o L; X2 es R, S o V; X3 es R o Y; X4 es C, G o S; X5 no está presente ni G ni I; X6 no está presente o G; X7 no está presente o D; X8 no está presente o C; X9 no está presente ni W ni Y; X10 no está presente ni P ni S; X11 no está presente ni G ni Y; y X12 es F o R;

(d) una región variable de cadena ligera (VL) CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos X1ASQX5X6X7X8X9LX11 (SEQ ID NO: 137), en donde X1 es Q o R; X5 es D o S; Xa es I o V; X7 es N o S; Xs es N o S; X9 es F, Lo Y; yX-n es N o T;

(e) una región variable de cadena ligera (VL) CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos X1ASX4X5X6X7 (SEQ ID NO: 138), en donde X1 es D o G; X4 es N, S o T; X5 es L o R; X6 es A, E o K; y X7 es S o T; y/o (f) una región variable de cadena ligera (VL) CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQX3X4X5X6PX8T (SEQ ID NO: 139), en donde X3 es S o Y; X4 es D, G o Y; X5 es N, S o T; Xa es L, T o Y; y Xs es F o I.

La enseñanza se refiere además a moléculas de unión de antígeno a CLL-1 que comprenden al menos una secuencia CDR3 de cadena pesada variable o CDR3 de cadena ligera variable como se establece en la presente descripción. La enseñanza se refiere además a moléculas de unión de antígeno a CLL-1 que comprenden al menos una secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada variable como se describió en la presente descripción. La enseñanza se refiere además a moléculas de unión de antígeno a CLL-1 que comprenden al menos una secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera variable como se describió en la presente descripción. La enseñanza se refiere además a moléculas de unión de antígeno a CLL-1 que comprenden secuencias de CDR1, CDR2, CDR3 de cadena pesada variable y CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera variable como se describió en la presente descripción.

La enseñanza se refiere además a métodos para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto moléculas de unión a antígeno, CAR, TCR, polinucleótidos, vectores, células o composiciones de acuerdo con la enseñanza. Las enfermedades adecuadas para el tratamiento incluyen, entre otras, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mielógena crónica (CML), leucemia mielomonocítica crónica (CMML), leucemia mielomonocítica juvenil, leucemia mieloide crónica atípica, leucemia promielocítica aguda (APL), leucemia monoblástica, leucemia eritroide aguda, leucemia megacarioblástica aguda, síndrome mielodisplásico (MDS), trastorno mieloproliferativo, neoplasia mieloide, sarcoma mieloide), neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas (BPDCN), o sus combinaciones. Enfermedades adicionales incluyen enfermedades inflamatorias y/o autoinmunitarias tales como artritis reumatoide, psoriasis, alergias, asma, enfermedad de Crohn, IBD, IBS, fibromialga, mastocitosis y enfermedad celíaca.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la expresión de CLL-1 en diferentes líneas celulares de cáncer.

La Figura 2 muestra la expresión de CLL-1 CAR determinada por la proteína L 6 horas después de la electroporación del ARNm.

La Figura 3 muestra los resultados de un ensayo de liberación de citocinas de diferentes construcciones de células CLL-1 CAR-T 24 horas después de la electroporación del ARNm.

La Figura 4 muestra la actividad citolítica de diferentes construcciones de células CLL-1 CAR-T 24 horas después de la electroporación del ARNm.

La Figura 5 muestra la actividad citolítica de diferentes construcciones de células CLL-1 CAR-T 24 horas después de la electroporación del ARNm.

La Figura 6 muestra la expresión de CLL-1 CAR determinada por la proteína L el día 12 después de la transducción. La Figura 7 muestra el ensayo de liberación de citocinas de células CLL-1 CAR-T 16 horas después del cocultivo con diferentes líneas celulares objetivo.

La Figura 8 muestra la actividad citolítica de células CLL-1 CAR-T 16 horas y 40 horas después del cocultivo con diferentes líneas de células objetivo.

Las Figuras 9A-9D exponen los alineamientos de secuencias de las moléculas de unión al antígeno CLL-1 de la enseñanza. Los CDR se anotan en los recuadros.

La Figura 10 expone los resultados de bioluminiscencia en ratones NSG tratados con CAR de acuerdo con la enseñanza.

Descripción detallada de la enseñanza

Se apreciará que los receptores de antígenos quiméricos (CAR o CAR-T) y los receptores de células T (TCR) son receptores modificados genéticamente. Estos receptores modificados pueden insertarse fácilmente y expresarse en las células inmunitarias, incluidas las células T, de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica. Con un CAR, puede programarse un solo receptor para reconocer un antígeno específico y, cuando se une a ese antígeno, activar la célula inmunitaria para atacar y destruir la célula que contiene ese antígeno. Cuando estos antígenos existen en las células tumorales, una célula inmunitaria que expresa el CAR puede atacar y matar la célula tumoral.

Los CAR pueden modificarse para unirse a un antígeno (tal como un antígeno de la superficie celular) mediante la incorporación de una molécula de unión al antígeno que interactúa con ese antígeno objetivo. Preferentemente, la molécula de unión a antígeno es un fragmento de anticuerpo de la misma, y con mayor preferencia uno o más fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla ("scFv"). Un scFv es un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla que tiene unidas entre sí las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo. Vea las patentes de Estados Unidos núms. 7,741,465, y 6,319,494 así como también Eshhar y otros, Cancer Immunol Immunotherapy (1997) 45: 131-136. Un scFv retiene la capacidad del anticuerpo original para interactuar específicamente con el antígeno objetivo. Se prefieren los scFv para su uso en receptores de antígenos quiméricos porque se pueden diseñar para que se expresen como parte de una cadena sencilla junto con los otros componentes de CAR. Id. Vea también Krause y otros, J. Exp. Med., Volumen 188, No. 4, 1998 (619-626); Finney y otros, Journal of Immunology, 1998, 161: 2791-2797. Se apreciará que la molécula de unión al antígeno está típicamente contenida dentro de la porción extracelular del CAR de manera que es capaz de reconocer y unirse al antígeno de interés. Las CAR biespecíficas y multiespecíficas se contemplan dentro del alcance de la enseñanza, con especificidad a más de un objetivo de interés.

Dominios coestimuladores.

Los receptores de antígenos quiméricos pueden incorporar dominios coestimuladores (señalización) para aumentar su potencia. Vea las patentes de Estados Unidos núms. 7,741,465, y 6,319,494, así como también Krause y otros y Finney y otros (supra), Song y otros, Blood 119: 696-706 (2012); Kalos y otros, Sci Transl. Med. 3:95 (2011)); Porter y otros, N. Engl. J. Med. 365:725-33 (2011), y Gross y otros, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 56:59-83 (2016). Por ejemplo, CD28 es una proteína coestimuladora que se encuentra naturalmente en las células T. En la presente descripción se establecen una variedad de moléculas coestimuladoras, pero se apreciará que también se incluyen moléculas coestimuladoras adicionales dentro del alcance de esta enseñanza.

La secuencia de aminoácidos nativos completa de CD28 se describe en la Secuencia de Referencia de NCBI: NP_006130.1. La secuencia de ácido nucleico nativa completa de CD28 se describe en la Secuencia de Referencia de NCBI: NM_006139.1.

Ciertos dominios CD28 se han usado en receptores de antígenos quiméricos. De acuerdo con la presente enseñanza, ahora se ha encontrado que una nueva construcción extracelular (bisagra) de CD28, denominada "CD28T", inesperadamente proporciona ciertos beneficios cuando se utiliza en una construcción CAR. Esta construcción demuestra la capacidad de retener (y a veces exceder) las propiedades de los CAR que contienen CD28, a pesar del truncamiento (eliminación) de múltiples aminoácidos de la secuencia extracelular de CD28. Estos beneficios incluyen una producción de citocinas equivalente o superior, actividad citolítica equivalente o superior y/o niveles de expresión de CAR equivalentes o superiores.

La secuencia de nucleótidos de la molécula CD28T, que incluye el dominio extracelular, y los dominios transmembrana e intracelular de CD28 se establece en la SEQ ID NO. 1:

C TTG AT A A T G A A A A G T C AA A C G G A A C A A T C A T T C ACG T GAAGGGC AAG C

ACCTCTG TCCGTCACCCTTGTTCCCTG GTCCATCCAAGCCATTCTGG GTGT

TGGTCGTAG TG GGTGGAGTCCTCGCTTGTTACTCTCTGCTCGTCACCG TG

G C TTTTATAATC TTC TG G G TTAG ATC C AAAAG AAG C C G C C TG C TC C ATAG

CG ATTAC ATG AATATG AC TC CACG CC G C C C TG G C C CC ACAAG G AAACAC

TACCAG CCTTACG CACCACCTAG AG ATTTCG CTG CCTATCG G AG C

La secuencia de aminoácidos correspondiente se establece en la SEQ ID NO. 2: LDNEKSNGTNHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVWGGVLACYSLlVTVAF IIFWVRSK RSRLLHSDYM NMTPRRPGPT RKHYQPYAPP RDFAAYRS

La secuencia de nucleótidos de la porción extracelular de CD28T se establece en la SEQ ID NO. 3:

CTTG AT A A T G A A A A G T C AA AC G G A AC A A T C A T T C ACG T GAAGGGC AAG C

ACCTCTG TCCGTCACCCTTGTTCCCTG GTCCATCCAAGCCA

La secuencia de aminoácidos correspondiente del dominio extracelular de CD28T se establece en la SEQ ID NO. 4: LDNEKSNGTI IHVKGKHLCP SPLFPGPSKP

La secuencia de nucleótidos del dominio transmembrana de CD28 se establece en la SEQ ID NO. 5:

TTCTG GGTGTTGGTCGTAG TG GGTGGAGTCCTCGCTTGTTACTCTCTGCTC

G TC ACCG TG G CTTTTATAATCTTCTG G G TT

La secuencia de aminoácidos del dominio transmembrana de CD28 se establece en la SEQ ID NO. 6: FWVLVVVGGV LACYSLLVTV AFIIFWV

La secuencia de nucleótidos del dominio de señalización intracelular de CD28 se establece en la SEQ ID NO. 7:

AG ATC C AAAAG AAG C C G C C TG C TC C ATAG C G ATTAC ATG AATATG AC TC

CACGCCGCCCTGG CCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGCACCACC

TAGAGATTTCGCTGCCTATCGG AGC

La secuencia de aminoácidos del dominio de señalización intracelular de CD28 se establece en la SEQ ID NO. 8: RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS

Las secuencias de CD28 adicionales adecuadas para su uso en la enseñanza incluyen la secuencia de nucleótidos de CD28 establecida en la SEQ ID NO. 11:

ATTG AG G TG ATG TATC C A C C G C C TTAC C TG G ATA AC G AA AAG AG TA AC G

G TACCATC ATTC AC G TG AAAG G TAAAC AC C TG TG TCC TTC TC C C C TC TTC

CCCGGGCCATCAAAGCCC

La secuencia de aminoácidos correspondiente se establece en la SEQ ID NO. 12: IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP

Se apreciará que la enseñanza se refiere a las moléculas de unión a antígeno, CAR, TCR y similares que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico aislada de la SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 3. Se apreciará además que la enseñanza se refiere a las moléculas de unión a antígeno, CAR, TCR y similares en las que la porción extracelular consiste en al menos una secuencia de ácido nucleico aislada de la SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 3. Adicionalmente, se apreciará que la enseñanza se refiere a las moléculas de unión a antígeno, CAR, TCR y similares en las que la porción extracelular consiste esencialmente en al menos una secuencia de ácido nucleico aislada de la SEQ ID NO.

1 o SEQ ID NO. 3.

Se apreciará que la enseñanza se refiere a moléculas de unión a antígeno, CAR, TCR y similares que comprenden al menos una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 2 o SEQ ID NO. 4. Se apreciará además que la enseñanza se refiere a moléculas de unión a antígeno, CAR, TCR y similares en las que la porción extracelular consiste en al menos una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 2 o SEQ ID NO. 4. También se apreciará que la enseñanza se refiere a moléculas de unión a antígeno, CAR, TCR y similares en las que la porción extracelular consiste esencialmente en ^{al menos una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 2 o SEQ ID}N^o.^4.

Otra fuente adecuada de dominios extracelulares y/o transmembrana puede derivar de (o corresponder a) parte o la totalidad de CD8. La secuencia de nucleótidos de un dominio transmembrana y extracelular de CD8 adecuado se establece en la SEQ ID NO. 13:

G C TG C AG C A TTG AG C AA C TC AA TAATG TA TTTTA G TC A C TTTG TA C C AG T

G TTCTTG CCGG CTAAGCCTACTACCACACCCG CTCCACGGCCACCTACCC

CAGCTCCTACCATCG CTTCACAG CCTCTGTCCCTGCGCCCAGAG GCTTGC

CGACCGGCCGCAG GGGGCGCTGTTCATACCAG AGGACTG GATTTCGCCT

G CGATATCTATATCTG GGCACCCCTGG CCGG AACCTGCGGCGTACTCCTG

CTG TCCCTG G TC ATC AC G C TC TATTG TAATC AC AG G AAC

La secuencia de aminoácidos correspondiente se establece en la SEQ ID NO. 14:

AAALSNSIM YFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAA

G G AVHTRG LDF A C D IY IW A P L A G TC G V LLL SL V IT L Y CNHRN

Se apreciará que los dominios coestimuladores adecuados pueden derivar de (o corresponder a) por ejemplo, CD28, CD28T, OX40, 4-1BB/CD137, CD2, CD3 (alfa, beta, delta, épsilon, gamma, zeta), CD4, CD5, CD7, CD9, CD16, CD22, CD27, CD30, CD 33, CD37, CD40, CD 45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, PD-1, ICOS, antígeno 1 ^{asociado a la función de los linfocitos}(L^fA-1 ^{(CDl la/CD 18), CD247, CD276 (B7-H3),}LⁱGHT ^{(miembro 14 de la}superfamilia del factor de necrosis tumoral; TNFSF14), NKG2C, Ig alfa (CD79a), DAP-10, receptor gamma Fc, MHC molécula de clase I, TNF, TNFr, integrina, molécula de activación linfocítica de señalización, BTLA, receptor de ligando Toll, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA- 6, CD49f, ITGAD, CDl-ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl-la, LFA-1, ITGAM, CDl-lb, ITGAX, CDl-lc, ITGBl, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD 162), ^LTBR,L^aT, ^{GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, ligando CD83, o fragmentos o sus combinaciones. Se apreciará que}las moléculas coestimuladoras adicionales, o fragmentos de las mismas, no enumeradas anteriormente están dentro del ámbito de la enseñanza.

Activación de Dominios.

CD3 es un elemento del receptor de células T en las células T nativas y se ha demostrado que es un elemento activador intracelular importante en las CAR. En una modalidad preferida, el CD3 es CD3 zeta, cuya secuencia de nucleótidos se establece en la SEQ ID NO. 9:

AG G G T G A AG TTTTC C A G A T C T GC A G A T GC AC C AG C GT ATC AGC AGGGC C

A G A A C C AA C TG TA TAAC G A G C TC A AC C TG G G A C G C A G G G A AG AG TATG

AC G TTTTG G ACAAG C G C AG AG G AC G G G AC CC TG AG ATG G G TG G C AAAC C

AA G AC G A AA A A A C C C C C A G G A G G G TC TC TA TA A TG A G C TG C A G A A G G A

T A A G A T GGC T G A AG C C T A TT C T G A A A T AGGC A T G A A AG G AG AG C GGAG

AAG G G G AAAAG G G C AC G AC G G TTTG TACC AG G G ACTC AG CAC TG CTACG

AAG G ATAC TTATG AC G C TC TC C AC ATG C AAG C C C TG C C AC C TAG G

El aminoácido correspondiente de CD3 zeta intracelular se establece en la SEQ ID NO. 10:

R VKF SRS AD A PAYQ Q G Q NQ L YN ELN LG RR EEYD VLDKRRG RDPEM G G KPR

RKNPQEGL Y N E LQ K D K M A E A Y SEIGM KGERRRGKGHDGL Y QGL ST A T K D T

YD A LH M Q A LP P R

Orientación del dominio con relación a la célula

Estructuralmente, se apreciará que los dominios descritos en la presente descripción corresponden a ubicaciones con relación a una célula inmunitaria o de otro tipo. Por tanto, estos dominios pueden formar parte del (i) dominio "bisagra" o extracelular (EC), (ii) el dominio transmembrana (TM) y/o (iii) el dominio intracelular/citoplasmático (IC). El componente intracelular frecuentemente comprende, en parte, un dominio activador tal como una porción de un miembro de la familia CD3, preferentemente CD3 zeta. Este dominio es capaz de activar la célula T tras la unión de la molécula de unión al antígeno a su objetivo. Se apreciará que el dominio intracelulartípicamente comprende además una o más moléculas coestimuladoras como se describió en la presente descripción.

"Activación" o "Estimulación" como se usa en la presente, se refiere a una respuesta primaria inducida por la unión de una molécula activadora con su ligando afín, en donde la unión media en un evento de transducción de señales.

Una "molécula activadora" o "molécula estimulante" se refiere a una molécula en una célula T, por ejemplo, el complejo TCR/CD3 que se une específicamente con un ligando estimulador afín presente en una célula presente en el antígeno. Las moléculas de activación adecuadas se describen en la presente descripción.

Una “molécula coestimuladora”, como se usa en la presente, se refiere a una molécula que proporciona una señal que media en una respuesta de células T, que incluye, entre otras, proliferación, activación, diferenciación y similares. Las moléculas coestimuladoras pueden proporcionar una señal además de la señal principal proporcionada por una molécula activadora como se describió en la presente descripción.

Las moléculas coestimuladoras adecuadas incluyen, entre otras, la totalidad o porciones de CD28, CD28T, OX40, 4-1BB/CD137, CD2, CD3 (alfa, beta, delta, épsilon, gamma, zeta), CD4, CD5, CD7, CD9, CD16, CD22, CD27, CD30, CD 33, CD37, CD40, CD 45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, PD-1, ICOS, antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos (LFA-1 ( CD1 la/CD 18), CD247, CD276 (B7-H3), LIGHT (miembro 14 de la superfamilia del ^{factor de necrosis tumoral; TNFSF14), NKG2C, Ig alfa (CD79a), d}A^p-10, ^{receptor Fc gamma, molécula}M^hC ^{de clase}I, TNF, TNFr, integrina, molécula de activación linfocítica de señalización, BTLA, receptor de ligando Toll, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2Rbeta, IL2R gamma, IL7Ralfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl-ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl-la, LFA-1, ITGAM, CDl-lb, ITGAX, CDl-lc, ITGBl, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, ligando CD83, o fragmentos o sus combinaciones. Se apreciará que la región bisagra puede contener parte o la totalidad de un miembro de la familia de inmunoglobulinas tal como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE, IgM o fragmentos de las mismas.

En algunas modalidades, el dominio extracelular se coloca entre la molécula de unión al antígeno y el dominio transmembrana.

Las construcciones ilustrativas de CAR de acuerdo con la enseñanza se establecen en la Tabla 1.

Tabla 1

Como se indicó, las células T modificadas de la enseñanza comprenden una molécula de unión a antígeno (tal como un scFv), un dominio extracelular (que puede comprender un dominio "bisagra"), un dominio transmembrana y un dominio intracelular. El dominio intracelular puede comprender al menos en parte un dominio activador, preferentemente compuesto por un miembro de la familia CD3 tal como CD3 zeta, CD3 épsilon, CD3 gamma, o porciones de los mismos.

Se apreciará además que la molécula de unión a antígeno (por ejemplo, uno o más scFv) está diseñado de manera que se ubica en la porción extracelular de la molécula/construcción, de manera que es capaz de reconocer y unirse a su objetivo u objetivos.

Dominio extracelular

Los dominios extracelulares de uso particular en esta enseñanza pueden derivarse de (es decir, comprende) todo o parte de CD28, OX-40, 4-1BB/CD137, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, muerte programada-1 (PD-1), coestimulador de células T inducible (ICOS), función asociada de linfocitos antígeno-1 (LFA-1, CDl-la/CD18), CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD247, CD276 (B7-H3), LIGHT, (TNFSF14), NKG2C, Ig alfa (CD79a), DAP-10, receptor Fc gamma, molécula MHC de clase 1, proteínas receptoras de TNF, una proteína de inmunoglobulina, receptor de citocinas, integrinas, moléculas de activación linfocítica de señalización (proteínas SLAM), receptores de células NK activadoras, BTLA, un receptor de ligando Toll, ICAM-1, B7- H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LUZ, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7Ralfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1 1d, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CD1 lc, ITGBl, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, un ligando que se une específicamente con CD83, o cualquier combinación de los mismos. El dominio extracelular puede derivarse de una fuente natural o sintética.

Los dominios extracelulares a menudo comprenden la porción de bisagra, a veces denominada región "espadadora". Puede emplearse una variedad de bisagras de acuerdo con la enseñanza, incluidas las porciones o derivados de las moléculas descritas en la presente descripción.

En ciertas modalidades, la región bisagra comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos alrededor del 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 % o 100 % idénticas a las secuencias de aminoácidos del dominio extracelular establecidas en la presente descripción.

En determinadas modalidades, la región bisagra comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 % o 100 % idénticas a las secuencias de aminoácidos de nucleótidos extracelulares establecidas en la presente descripción.

Dominio transmembrana.

El CAR puede diseñarse con un dominio transmembrana que se fusiona con el dominio extracelular del CAR. De manera similar, puede fusionarse con el dominio intracelular del CAR. En algunos casos, el dominio transmembrana puede seleccionarse o modificarse mediante sustitución de aminoácidos para evitar la unión de dichos dominios a los dominios transmembrana de las mismas o diferentes proteínas de membrana de superficie para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor. El dominio transmembrana puede derivarse de una fuente natural o sintética. Cuando la fuente es natural, el dominio puede derivarse de cualquier proteína unida a la membrana o transmembrana. Las regiones transmembrana de uso particular en esta enseñanza pueden derivarse de (comprender o corresponder a) CD28, CD28T, OX-40, 4-1BB/CD137, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, muerte programada-1 (PD-1), coestimulador inducible de células T (ICOS), antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos (LFA-1, CDl-la/CD18), CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD247, CD276 (B7-H3), LIGHT, (TNFSF14), NKG2C, Ig alfa (CD79a), DAP-10, receptor gamma Fc, molécula MHC de clase 1, proteínas receptoras de TNF, una proteína de inmunoglobulina, receptor de citocinas, integrinas, moléculas de activación linfocítica de señalización (proteínas SLAM), células NK activadoras receptores, BTLA, un receptor de ligando Toll, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1 1d, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDl lc, ITGBl, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, un ligando que se une específicamente con CD83, o cualquier combinación de los mismos.

Opcionalmente, los enlazadores cortos pueden formar enlaces entre cualquiera o algunos de los dominios extracelular, transmembrana e intracelular del CAR.

En otras modalidades, el dominio transmembrana en el CAR de la enseñanza es un dominio transmembrana CD8. En una modalidad, el dominio transmembrana de CD8 comprende la porción transmembrana de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 13. En otra modalidad, el dominio transmembrana de CD8 comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos transmembrana contenida en la SEQ ID NO: 14.

En ciertas modalidades, el dominio transmembrana en el CAR de la enseñanza es el dominio transmembrana CD28. En una modalidad, el dominio transmembrana de CD28 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5. En una modalidad, el dominio transmembrana de CD28 comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. En otra modalidad, el dominio transmembrana CD28 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

Dominio intracelular (citoplasmático)

El dominio intracelular (citoplasmático) de las células T modificadas de la enseñanza puede proporcionar la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmunitaria. La función efectora de una célula T, por ejemplo, puede referirse a la actividad citolítica o actividad auxiliar, que incluye la secreción de citocinas.

Se apreciará que las moléculas intracelulares adecuadas incluyen (es decir, comprenden), entre otros, dominios de señalización derivados de (o correspondientes a) CD28, CD28T, Ox -40, 4-1BB/CD137, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, muerte programada-1 (PD-1), coestimulador inducible de células T (ICOS), antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos (LFA-1, CDl-la/CD18), CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD247, CD276 (B7-H3), LIGHT, (TNFSF14 ), NKG2C, Ig alfa (CD79a), DAP-10, receptor Fc gamma, molécula MHC de clase 1, proteínas receptoras de TNF, una proteína de inmunoglobulina, receptor de citocinas, integrinas, moléculas de activación linfocítica de señalización (proteínas SLAM), receptores de células NK activadores, BTLA, un receptor de ligando Toll, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1 1d, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDl lc, ITGBl, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR 2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTBA, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD 162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, un ligando que específicamente se une con CD83, o cualquier combinación de los mismos.

En una modalidad preferida, el dominio intracelular/citoplasmático del CAR puede diseñarse para comprender el dominio CD3 zeta por sí mismo o combinado con cualquier otro dominio intracelular deseado útil en el contexto del CAR de la enseñanza. Por ejemplo, el dominio intracelular de CAR puede comprender una porción de la cadena CD3 zeta y una porción de una molécula de señalización coestimuladora. Las secuencias de señalización intracelular dentro de la porción de señalización intracelular del CAR de la enseñanza pueden vincularse entre sí en un orden aleatorio o especificado.

En otra modalidad preferida, el dominio intracelular está diseñado para comprender el dominio activador de CD3 zeta y un dominio de señalización de CD28. En otra modalidad, el dominio intracelular está diseñado para comprender el dominio activador de CD3 zeta y un dominio de señalización de 4-1BB. En otra modalidad, el dominio intracelular en CAR está diseñado para comprender una porción de CD28 y CD3 zeta, en donde el CD28 intracelular comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO. 8. La secuencia de ácido nucleico de CD3 zeta se establece en la SEQ ID NO: 9 y la secuencia de aminoácidos se establece en la SEQ ID NO. 8.

Se apreciará que una orientación preferida de los CAR comprende una molécula de unión a antígeno (tal como scFv) junto con un dominio extracelular y/o bisagra, un dominio coestimulador y un dominio activador. Se apreciará además que pueden utilizarse múltiples dominios en tándem.

En algunas modalidades, se proporcionan ácidos nucleicos aislados que comprenden un promotor enlazado operativamente a un primer polinucleótido que codifica una molécula de unión a antígeno, al menos una molécula coestimuladora y un dominio de activación. En algunas modalidades, la construcción del ácido nucleico está contenida dentro de un vector. En algunas modalidades, el vector viral se selecciona del grupo que consiste en vectores retrovirales, vectores de virus de leucemia murina, vectores SFG, vectores adenovirales, vectores lentivirales, vectores de virus adenoasociados (AAV), vectores de virus Herpes y vectores de virus vaccinia. En algunas modalidades, el ácido nucleico se contiene dentro de un plásmido.

En algunas modalidades, la célula inmunitaria modificada es una célula T, un linfocito infiltrante de tumor (TIL), una célula NK, una célula que expresa TCR, una célula dendrítica o una célula NK-T. En algunas modalidades, la célula se obtiene o prepara a partir de sangre periférica. En algunas modalidades, la célula se obtiene o prepara de una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC). En algunas modalidades, la célula se obtiene o prepara a partir de la médula ósea. En algunas modalidades, la célula se obtiene o prepara a partir de sangre de cordón umbilical. En algunas modalidades, la célula es una célula humana. En algunas modalidades, la célula es transfectada o transducida por el vector de ácido nucleico mediante el uso de un método seleccionado del grupo que consiste en electroporación, sonoporación, biolística (por ejemplo, pistola de genes), transfección de lípidos, transfección de polímeros, nanopartículas o poliplejos.

En algunas modalidades, los receptores de antígenos quiméricos se expresan en las células inmunitarias diseñadas que comprenden los ácidos nucleicos de la presente solicitud. Estos receptores de antígenos quiméricos de la presente solicitud pueden comprender, en algunas modalidades, (i) una molécula de unión a antígeno (tal como un scFv), (ii) una región transmembrana y (iii) una molécula o región de activación de células T.

Se debe entender además que dondequiera se describan los aspectos en la presente descripción con el lenguaje "que comprende", se proporcionan también de cualquier otra manera los aspectos análogos descritos en los términos de "que consiste de" y/o "que consiste esencialmente de".

Adicionalmente, los términos "aproximadamente" o "que comprende esencialmente de" se refieren a un valor o composición que se encuentra dentro de un intervalo de error aceptable para el valor o composición en particular según lo determine un experto en la técnica, que dependerá en parte de cómo se mide o determina el valor o la composición, es decir, las limitaciones del sistema de medida. Por ejemplo, "aproximadamente" o "que comprende esencialmente de" puede significar dentro de 1 o más de 1 desviación estándar, conforme a la práctica en la técnica. Alternativamente, "aproximadamente" o "que comprende esencialmente de" puede significar un intervalo de hasta 10 % (es decir, ±10 %). Por ejemplo, aproximadamente 3 mg puede incluir cualquier número entre 2,7 mg y 3,3 mg (para el 10 %). Además, particularmente con respecto a los sistemas o procesos biológicos, los términos pueden significar hasta un orden de magnitud o hasta 5 veces un valor. Cuando se proporcionan valores o composiciones particulares en la solicitud y las reivindicaciones, a menos que se indique de cualquier otra manera, debe suponerse que el significado de "aproximadamente" o "que comprende esencialmente de" está dentro de un intervalo de error aceptable para ese valor o composición en particular.

Moléculas de unión a antígeno

Una "molécula de unión a antígeno", como se usa en la presente, significa cualquier proteína que se une a un antígeno objetivo específico. En la presente descripción, el antígeno objetivo especificado es la proteína CLL-1 o un fragmento de la misma. Las moléculas de unión a antígeno incluyen, entre otros, anticuerpos y partes de unión de los mismos, tales como fragmentos inmunológicamente funcionales. Los pepticuerpos (es decir, las moléculas de fusión Fc que comprenden los dominios de unión a péptidos) son otro ejemplo de moléculas de unión a antígeno adecuadas.

En ciertas modalidades, la enseñanza se dirige a una molécula de unión a antígeno que comprende:

(d) una región variable de cadena ligera (VL) CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos X1ASQX5X6X7X8X9LX11 (SEQ ID NO: 137), en donde X1 es Q o R; X5 es D o S; Xa es I o V; X7 es N o S; Xa es No S; X9 es F, Lo Y; yX-n es N o T;

(e) una región variable de cadena ligera (VL) CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos X1ASX4X5X6X7 (SEQ ID NO: 138), en donde X1 es D o G; X4 es N, S o T; X5 es L o R; X6 es A, E o K; y X7 es S o T; y/o (f) una región variable de cadena ligera (VL) CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQX3X4XsXaPX8T (SEQ ID NO: 139), en donde X3 es S o Y; X4 es D, G o Y; X5 es N, S o T; Xa es L, T o Y; y X8 es F o I.

En algunas modalidades, la enseñanza se refiere a moléculas de unión a antígeno que comprenden al menos uno de: (a) una CDR1 de la región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 17, 51, 73, 95, 5 y 97; (b) una CDR2 de cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18, 52, 74, 96; (c) una CDR3 de cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 19, 53, 75, y 97; (d) una CDR1 de la región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 22, 56, 78, y 100; (e) una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO. 23, 57, 79, y 101; (f) una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO. 24, 58, 80, y 102.

En otras modalidades, la enseñanza se refiere a moléculas de unión a antígenos (y receptores de antígenos quiméricos que comprenden estas moléculas) que comprende al menos uno de: (a) una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (b) una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 y una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55; (c) una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72 y una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77, (d) una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94 y una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 99; y en donde la región o regiones VH y VL están enlazadas por al menos un enlazador. En otras modalidades, la enseñanza se refiere a moléculas de unión a antígeno (y receptores de antígeno quiméricos que comprenden estas moléculas) en donde el enlazador comprende al menos uno de la SEQ ID NO. 130 y la SEQ ID NO. 132.

En otra modalidad, la enseñanza se relaciona con moléculas de unión a antígeno que comprende una región variable de cadena ligera (Vl) CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 24, 58, 80, y 102.

En otras modalidades, la enseñanza se refiere a los polinucleótidos aislados que codifican una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a CLL-1, en donde la cadena pesada de la molécula de unión a antígeno comprende CDR1 (SEQ ID NO: 17), CDR2 (SEQ ID NO: 18) y CDR3 (SEQ ID NO: 19) y la cadena ligera de la molécula de unión a antígeno comprende CDR1 (SEQ ID NO: 22), CDR2 (SEQ ID NO: 23) y CDR3 (SEQ ID NO: 24).

En otras modalidades, la enseñanza se refiere a una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a CLL-1, en donde la cadena pesada de la molécula de unión a antígeno comprende CDR1 (SEQ ID NO: 51), CDR2 (SEQ ID NO: 52) y CDR3 (SEQ ID NO: 53) y la cadena ligera de la molécula de unión a antígeno comprende CDR1 (SEQ ID NO: 56), CDR2 (SEQ ID NO: 57) y CDR3 (SEQ ID NO: 58).

En otras modalidades, la enseñanza se refiere a una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a CLL-1, en donde la cadena pesada de la molécula de unión a antígeno comprende CDR1 (SEQ ID NO: 73), CDR2 (SEQ ID NO: 74) y CDR3 (SEQ ID NO: 75) y la cadena ligera de la molécula de unión a antígeno comprende CDR1 (SEQ ID NO: 78), CDR2 (SEQ ID NO: 79) y CDR3 (SEQ ID NO: 80).

En otras modalidades, la enseñanza se refiere a los polinucleótidos aislados que codifican una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a CLL-1, en donde la cadena pesada de la molécula de unión a antígeno comprende CDR1 (SEQ ID NO: 95), CDR2 (SEQ ID NO: 96) y CDR3 (SEQ ID NO: 97) y la cadena ligera de la molécula de unión a antígeno comprende CDR1 (SEQ ID NO: 100), CDR2 (SEQ ID NO: 101) y CDR3 (SEQ ID NO: 102).

En ciertas modalidades, la presente enseñanza está dirigida a un polinucleótido aislado que codifica una molécula de unión a antígeno anti-CLL-1 que compite de forma cruzada con uno o más anticuerpos descritos en la presente descripción o una molécula de unión a antígeno de los mismos codificada por el polinucleótido. En una modalidad, la enseñanza se dirige a polinucleótidos aislados que codifican una molécula de unión a antígeno anti-CLL-1 de los mismos que se une al mismo epítopo que una o más de las moléculas de unión a antígeno descritas en la presente descripción.

En algunas modalidades, la molécula de unión a antígeno se une a un antígeno en una célula tumoral. En algunas modalidades, la molécula de unión a antígeno se une a un antígeno en una célula involucrada en una enfermedad hiperproliferativa o a un antígeno viral o bacteriano. En otras modalidades, la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo o un fragmento de la misma, que incluye una o más de sus regiones determinantes de complementariedad (CDR). En otras modalidades, la molécula de unión a antígeno es un fragmento variable de cadena sencilla (scFv).

El término "fragmento inmunológicamente funcional" (o "fragmento") de una molécula de unión a antígeno es una especie de molécula de unión a antígeno que comprende una porción (independientemente de cómo se obtenga o sintetice esa porción) de un anticuerpo que carece al menos de algunos de los aminoácidos ácidos presentes en una cadena de longitud completa pero que todavía es capaz de unirse específicamente a un antígeno. Dichos fragmentos son biológicamente activos porque se unen al antígeno objetivo y pueden competir con otras moléculas de unión a antígeno, que incluye los anticuerpos intactos, para unirse a un epítopo dado. En algunas modalidades, los fragmentos son fragmentos neutralizantes. En algunas modalidades, los fragmentos pueden bloquear o reducir la actividad de CLL-1. En un aspecto, tal fragmento retendrá al menos una CDR presente en la cadena ligera o pesada de longitud completa, y en algunas modalidades comprenderá una única cadena pesada y/o una cadena ligera o una porción de la misma. Estos fragmentos pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante, o pueden producirse mediante escisión enzimática o química de moléculas de unión a antígeno, incluidos los anticuerpos intactos.

Los fragmentos de inmunoglobulina inmunológicamente funcionales incluyen, entre otros, fragmentos scFv, fragmentos Fab (Fab', F(ab')2, y similares), una o más CDR, un diacuerpo (dominio variable de cadena pesada en el mismo polipéptido que un dominio variable de cadena ligera, conectado a través de un enlazador peptídico corto que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena ), anticuerpos de dominio y anticuerpos monocatenarios. Estos fragmentos pueden derivarse de cualquier fuente de mamíferos, que incluye, entre otros, humanos, ratones, ratas, camélidos o conejos. Como apreciará un experto en la técnica, una molécula de unión a antígeno puede incluir componentes no proteicos.

Las variantes de las moléculas de unión a antígeno también están dentro del alcance de la enseñanza, por ejemplo, las cadenas ligeras variables y/o cadenas pesadas variables que tienen cada una al menos 70-80 %, 80-85 %, 85-90 %, 90-95 %, 95-97 %, 97-99 % o más del 99 % de identidad con las secuencias de aminoácidos de las secuencias descritas en la presente descripción. En algunos casos, tales moléculas incluyen al menos una cadena pesada y una cadena ligera, mientras que en otros casos las formas variantes contienen dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas (o subpartes de las mismas). Un experto en la materia será capaz de determinar las variantes adecuadas de las moléculas de unión a antígeno como se establece en la presente descripción mediante el uso de técnicas bien conocidas. En ciertas modalidades, un experto en la técnica puede identificar las áreas adecuadas de la molécula que pueden cambiarse sin destruir la actividad mediante la selección de regiones que no cree que son importantes para la actividad.

En determinadas modalidades, la estructura polipeptídica de las moléculas de unión a antígeno se basa en anticuerpos, que incluye, entre otros, anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (a veces denominados en la presente descripción "anticuerpos miméticos"), anticuerpos quiméricos anticuerpos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, fusiones de anticuerpos (a veces denominados en el presente documento "conjugados de anticuerpos") y fragmentos de los mismos, respectivamente. En algunas modalidades, la molécula de unión a antígeno comprende o consiste en avímeros.

En algunas modalidades, se administra una molécula de unión a antígeno a CLL-1 como parte de CAR, TCR u otra célula inmunitaria. En tales células inmunitarias, la molécula de unión del antígeno a CLL-1 puede estar bajo el control de la misma región promotora o de un promotor separado. En ciertas modalidades, los genes que codifican agentes proteicos y/o una molécula de unión a antígeno para CLL-1 pueden estar en vectores separados.

La enseñanza proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de unión de antígeno a CLL-1 junto con un diluyente, portador, solubilizante, emulsionante, conservante y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas incluirán más de una molécula de unión a antígeno diferente para CLL-1. En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas incluirán más de una molécula de unión a antígeno a CLL-1 en donde las moléculas de unión a antígeno a CLL-1 se unen a más de un epítopo. En algunas modalidades, las diversas moléculas de unión a antígeno no competirán entre sí para unirse a CLL-1.

En otras modalidades, la composición farmacéutica puede seleccionarse para administración parenteral, para inhalación o para administración a través del tracto digestivo, como por vía oral. La preparación de tales composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de la capacidad de un experto en la técnica. En ciertas modalidades, los tampones se usan para mantener la composición a pH fisiológico o a pH ligeramente inferior, típicamente dentro del intervalo de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8. En ciertas modalidades, cuando se contempla la administración parenteral, una composición terapéutica puede estar en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable libre de pirógenos que comprende una molécula de unión de antígeno deseada a CLL-1, con o sin agentes terapéuticos adicionales, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En determinadas modalidades, un vehículo para inyección parenteral es agua destilada estéril en la que se formula una molécula de unión de antígeno a CLL-1, con o sin al menos un agente terapéutico adicional, como una solución isotónica estéril, conservada adecuadamente. En ciertas modalidades, la preparación puede implicar la formulación de la molécula deseada con compuestos poliméricos (tales como ácido poliláctico o ácido poliglicólico), cuentas, o liposomas, que pueden proporcionar para la liberación controlada o sostenida del producto que puede después entregarse a través de una inyección de depósito. En determinadas modalidades, pueden usarse dispositivos de administración de fármacos implantables para introducir la molécula deseada.

En algunas modalidades, la molécula de unión a antígeno se usa como herramienta de diagnóstico o validación. La molécula de unión a antígeno puede usarse para ensayar la cantidad de CLL-1 presente en una muestra y/o sujeto. En algunas modalidades, la molécula de unión a antígeno de diagnóstico no es neutralizante. En algunas modalidades, las moléculas de unión a antígeno descritas en la presente descripción se usan o se proporcionan en un kit de ensayo y/o método para la detección de CLL-1 en tejidos o células de mamíferos para detectar/diagnosticar una enfermedad o trastorno asociado con cambios en los niveles de CLL-1. El kit puede comprender una molécula de unión a antígeno que se une a CLL-1, junto con medios para indicar la unión de la molécula de unión a antígeno con CLL-1, si está presente, y opcionalmente los niveles de proteína de CLL-1.

Las moléculas de unión a antígeno se entenderán mejor a la vista de las definiciones y descripciones más abajo.

Una región "Fc" comprende dos fragmentos de cadena pesada que comprende los dominios CH1 y CH2 de un anticuerpo. Los dos fragmentos de cadena pesada se mantienen unidos por dos o más enlaces disulfuro y por interacciones hidrófobas de los dominios CH3.

Un "fragmento Fab" comprende una cadena ligera y las regiones CH1 y variable de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula Fab no puede formar un enlace disulfuro con otra molécula de cadena pesada. Un "fragmento Fab" comprende una cadena ligera y una porción de una cadena pesada que contiene el dominio VH y el dominio CH1 y también la región entre los dominios CH1 y CH2, de manera que se puede formar un enlace disulfuro entre cadenas entre los dos cadenas pesadas de dos fragmentos Fab' para formar una molécula F(ab')2. Un "fragmento F (a b V contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que contiene una porción de la región constante entre los dominios CH1 y CH2, de manera que se forma un enlace disulfuro entre cadenas entre las dos cadenas pesadas. Un fragmento F(ab')2 por tanto, se compone de dos fragmentos Fab' que se mantienen unidos por un enlace disulfuro entre las dos cadenas pesadas.

La "región Fv" comprende las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, pero carece de las regiones constantes.

"Fragmento variable de cadena sencilla" ("scFv", también denominado "anticuerpo de cadena sencilla") se refiere a moléculas Fv en las que las regiones variables de cadena ligera y pesada se han conectado mediante un enlazador flexible para formar una cadena polipeptídica sencilla, que forma un región de unión al antígeno. Vea la solicitud PCT WO88/01649 y las patentes de Estados Unidos núms. 4,946,778 y 5,260,203.

Una "molécula de unión a antígeno bivalente" comprende dos sitios de unión a antígeno. En algunos casos, los dos sitios de unión tienen las mismas especificidades de antígeno. Las moléculas de unión a antígeno bivalentes pueden ser biespecíficas. Una "molécula de unión a antígeno multiespecífica" es aquella que se dirige a más de un antígeno o epítopo. Una molécula de unión a antígeno "biespecífica", "de doble especificidad" o "bifuncional" es una molécula de unión a antígeno híbrida o un anticuerpo, respectivamente, que tiene dos sitios de unión a antígeno diferentes. Los dos sitios de unión de una molécula de unión a antígeno biespecífico se unirán a dos epítopos diferentes, que pueden residir en las mismas o diferentes proteínas objetivos.

Se dice que una molécula de unión a antígeno "se une específicamente" a su antígeno objetivo cuando la constante de disociación (Kd) es ~ 1x1°'7 M. La molécula de unión al antígeno se une específicamente al antígeno con "alta afinidad" cuando la Kd es 1-5x1°'9 M, y con "muy alta afinidad" cuando la Kd es 1-5x10'1° M. En una modalidad, la molécula de unión a antígeno tiene una Kd de 10-9 M. En una modalidad, la tasa de descuento es <1x10-5 En otras modalidades, las moléculas de unión a antígeno se unirán a la CLL-1 humana con una Kd de aproximadamente 10-7

M y 10-13 M, y en otra modalidad más, las moléculas de unión a antígeno se unirán con un Kd 1,0-5x10-10

En algunas modalidades, las moléculas de unión a anticuerpos o antígenos de la presente enseñanza se unen específicamente a CLL-1 (por ejemplo, hCLL-1). En determinadas modalidades, un anticuerpo anti-CLL-1 o una molécula de unión a antígeno de la presente enseñanza se une a la CLL-1 humana con una Kd de menos de 1 x 10-6

M, menos de 1 x 10-7 M, menos de 1 x 10-8 M, o menos de 1 x 10-9 M. En una modalidad particular, el anticuerpo anti-CLL-1 o las moléculas de unión a antígeno se unen a la CLL-1 humana con un K^dde menos de 1 x 10-7 M. En otra modalidad, el anticuerpo anti-CLL-1 o las moléculas de unión a antígeno se unen a la CLL-1 humana con una Kd de menos de 1 x 10‘8 M. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CLL-1 o las moléculas de unión a antígeno se unen a la CLL-1 humana con una Kd de aproximadamente 1 x 10'7 M, aproximadamente 2 x 10‘7 M, aproximadamente 3 x

10'7 M, aproximadamente 4 x 10'7 M, aproximadamente 5 x 10'7 M, aproximadamente 6 x 10'7 M, aproximadamente 7 x 10'7 M, aproximadamente de 8 x 10'7 M, aproximadamente 9 x 10'7 M, aproximadamente 1 x 10'8 M, aproximadamente 2 x 10‘8 M, aproximadamente 3 x 10'8 M, aproximadamente 4 x 10‘8 M, aproximadamente 5 x 10'8

M, aproximadamente 6 x 10‘8 M, aproximadamente 7 x 10'8 M, aproximadamente 8 x 10‘8 M, aproximadamente 9x10 '

8 M, aproximadamente 1 x 10‘9 M, aproximadamente 2 x 10‘9 M, aproximadamente 3 x 10‘9 M, aproximadamente 4 x

10‘9 M, aproximadamente 5 x 10‘9 M, aproximadamente 6 x 10‘9 M, aproximadamente 7 x 10‘9 M, aproximadamente 8 x 10‘9 M, aproximadamente 9 x 10‘9 M, aproximadamente 1 x 10‘1° M, o aproximadamente 5 x 10‘1° M. En ciertas modalidades, la Kd se calcula como el cociente de k disoc/k asoc, y la kdisoc y kasoc se determinan mediante el uso de un anticuerpo monovalente, como un fragmento Fab, medido por, por ejemplo, tecnología de resonancia de plasmones superficiales BIAcore®. En otras modalidades, la Kd se calcula como el cociente de k disoc/k asoc, y la kdisoc y kasoc se determinan mediante el uso de un anticuerpo bivalente, como un fragmento Fab, medido por, por ejemplo, tecnología de resonancia de plasmones superficiales BIAcore®.

En otras modalidades, el anticuerpo anti-CLL-1 o la molécula de unión a antígeno se une a CLL-1-Fc humana con un

K^dde menos de 1 x 10‘9 M, menos de 3 x 10‘9 M, menos de 5 x 10‘9 M, menos de 1 x 10■1° M, menos de 3 x 10■1° M, o menos de 5 x 10■1° M. En otras modalidades, el anticuerpo anti-CLL-1 o las moléculas de unión a antígeno se unen a cino CLL-1-Fc con una Kd de menos de 1 x 10‘5 M, menos de 1 x 10‘6 M, menos de 1 x 10‘7 M, menos de 1 * 10‘8M, menos de 1 x 10‘9 M, o menos de 1 x 10■1° M.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CLL-1 o la molécula de unión a antígeno se une a la CLL-1 humana con una tasa de asociación (kasoc) de menos de 1 x 10‘4 M_1 s-1, menos de 2 x 10‘4 M_1 s-1, menos de 3 x 10‘4 M_1 s-1, menos de 4 x 10‘4 M’1 s-1, menos de 5 x 10‘4 M_1 s-1, menos de 6 x 10‘4 M_1 s-1, menos de 7 x 10‘4 M_1 s-1, menos de 8 x 10‘4

M’1 s-1, menos de 9 x 10‘4 M_1 s-1, menos de 1 x 10‘5 M_1 s-1, menos de 2 x 10‘5 M_1 s-1, menos de 3 x 10‘5 M_1 s-1, menos de 4 x 10‘5 M_1 s-1, menos de 5 x 10‘5 M_1 s-1, menos de 6 x 10‘5 M_1 s-1, menos de 7 x 10‘5 M_1 s-1, menos de 8 x 10‘5

M_1 s-1, menos de 9 x 10‘5 M_1 s-1, menos de 1 x 10‘6 M_1 s-1, menos de 2 * 10‘6 M_1 s-1, menos de 3 x 10‘6 M_1 s-1, menos de 4 x 10‘6 M_1 s-1, menos de 5 x 10‘6 M_1 s-1, menos de 6 x 10‘6 M_1 s-1, menos de 7 x 10‘6 M_1 s-1, menos de 8 x 10‘6

M_1 s-1, menos de 9 x 10‘6 M_1 s-1, o menos de 1 x 10‘7 M_1 s-1. En ciertas modalidades, la kasoc se determina mediante el uso de un anticuerpo monovalente, como un fragmento Fab, medido por, por ejemplo, tecnología de resonancia de plasmones superficiales BIAcore®. En otras modalidades, la kasoc se determina mediante el uso de un anticuerpo bivalente medido por, por ejemplo, tecnología de resonancia de plasmones superficiales BIAcore®.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CLL-1 o la molécula de unión a antígeno se une a la CLL-1 humana con una velocidad de disociación (kdisoc) de menos de 1 x 10‘2 s-1, menos de 2 x 10‘2 s-1, menos de 3 x 10‘2 s-1, menos de

4 x 10-2 s-1, menos de 5 x 10‘2 s_1, menos de 6 x 10-2 s-1, menos de 7 x 10-2 s-1, menos de 8 x 10-2 s-1, menos de 9 x 10

2 s-1, menos de 1 x 10‘3 s-1, menos de 2 x 10‘3 s-1, menos de 3 x 10‘3 s-1, menos de 4 x 10‘3 s-1, menos de 5 x 10‘3 s-1, menos de 6 x 10‘3 s-1, menos de 7 x 10‘3 s-1, menos de 8 x 10‘3 s-1, menos de 9 x 10‘3 s-1, menos de 1 x 10‘4 s-1, menos de 2 x 10‘4 s-1, menos de 3 x 10‘4 s-1, menos de 4 x 10‘4 s-1, menos de 5 x 10‘4 s-1, menos de 6 x 10‘4 s-1, menos de 7 x 10‘4 s-1, menos de 8 x 10‘4 s-1, menos de 9 x 10‘4 s-1, menos de 1 x 10‘4 s-1, o menos de 5 x 10‘4 s-1. modalidades, la kdisoc se determina mediante el uso de un anticuerpo monovalente, como un fragmento Fab, medido por, por ejemplo, tecnología de resonancia de plasmones superficiales BIAcore®. En otras modalidades, la kdisoc se determina mediante el uso de un anticuerpo bivalente medido por, por ejemplo, tecnología de resonancia de plasmones superficiales BIAcore®.

Se dice que una molécula de unión a antígeno es "selectiva" cuando se une a un objetivo con más fuerza que a un segundo objetivo.

El término "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina intacta de cualquier isotipo, o un fragmento del mismo que puede competir con el anticuerpo intacto por la unión específica al antígeno objetivo, e incluye, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, humanizados, completamente humanos y biespecíficos. Un "anticuerpo" es una especie de molécula de unión a antígeno como se define en la presente descripción. Un anticuerpo intacto comprenderá generalmente al menos dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa, pero en algunos casos puede incluir menos cadenas, como los anticuerpos que se encuentran de forma natural en los camélidos, que pueden comprender solo cadenas pesadas. Los anticuerpos pueden derivarse únicamente de una sola fuente o pueden ser quiméricos, es decir, diferentes porciones del anticuerpo pueden derivarse de dos anticuerpos diferentes como se describió más abajo. Las moléculas de unión al antígeno, anticuerpos o fragmentos de unión pueden producirse en hibridomas, por técnicas de ADN recombinante, o por escisión química o enzimática de los anticuerpos intactos. A menos que se indique de otra forma, el término "anticuerpo" incluye, además de los anticuerpos que comprenden dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa, derivados, variantes, fragmentos y muteínas de los mismos, cuyos ejemplos se describen más abajo. Además, a menos que se excluya explícitamente, los anticuerpos incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, minicuerpos, dominios de anticuerpos, anticuerpos sintéticos (referidos a veces en la presente descripción como "anticuerpos miméticos"), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, fusiones de anticuerpo (referidos a veces como "anticuerpos conjugados"), y los fragmentos de cada uno respectivamente.

Las regiones variables típicamente exhiben la misma estructura general de regiones armazón relativamente conservadas (FR) unidas por las 3 regiones hipervariables (es decir, "CDR"). Las CDR de las dos cadenas de cada par típicamente están alineadas por las regiones armazón, lo que puede permitir la unión a un epítopo específico. De N-terminal a C-terminal, las regiones variables de cadena ligera y pesada típicamente comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Por convención, las regiones CDR en la cadena pesada se denominan típicamente como HC CDR1, CDR2 y CDR3. Las regiones CDR en la cadena ligera se denominan típicamente como LC CDR1, CDR2 y CDR3. La asignación de aminoácidos a cada dominio están típicamente de acuerdo con las definiciones de Kabat, Chothia o la definición de AbM.

El término “numeración de Kabat” y los términos similares se reconocen en la técnica y se refieren a un sistema de numeración de residuos de aminoácidos en las regiones variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno de estas. En ciertos aspectos, las CDR de un anticuerpo pueden determinarse de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (vea, por ejemplo, Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391 y Kabat EA y otros, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos, Publicación de NIH núm. 91-3242). Mediante el uso del sistema de numeración de Kabat, las CDR dentro de una molécula de cadena pesada de anticuerpo se encuentran típicamente en las posiciones de aminoácidos 31 a 35, que opcionalmente pueden incluir uno o dos aminoácidos adicionales, después de la posición 35 (referidas en el esquema de numeración de Kabat como 35A y 35B) (CDR1), las posiciones de aminoácidos 50 a 65 (CDR2), y las posiciones de aminoácidos 95 a 102 (CDR3). Mediante el uso del sistema de numeración de Kabat, las CDR dentro de una molécula de cadena ligera de anticuerpo se encuentran típicamente en las posiciones de aminoácidos 24 a 34 (CDR1), las posiciones de aminoácidos 50 a 56 (CDR2), y las posiciones de aminoácidos 89 a 97 (CDR3). En una modalidad específica, las CDR de los anticuerpos descritos en la presente descripción se han determinado de acuerdo con el esquema de la numeración de Kabat.

En ciertos aspectos, las CDR de un dominio de unión a antígeno pueden determinarse de acuerdo con el esquema de numeración de Chothia, que se refiere a la ubicación de lazos estructurales de inmunoglobulina (vea, por ejemplo, Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani B y otros, (1997) J Mol Biol 273: 927-948; Chothia C y otros, (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano A y otros, (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82; y la patente de Estados Unidos núm. 7,709,226). Típicamente, cuando se usa la convención de numeración de Kabat, el lazo CDR-H1 de Chothia está presente en los aminoácidos de cadena pesada 26 a 32, 33, o 34, el lazo H2 de CDR de Chothia está presente en los aminoácidos de cadena pesada 52 a 56, y el lazo H3 de CDR de Chothia está presente en los aminoácidos de cadena pesada 95 a 102, mientras que el lazo L1 de CDR de Chothia está presente en los aminoácidos de cadena ligera 24 a 34, el lazo L2 de CDR de Chothia está presente en los aminoácidos de cadena ligera 50 a 56, y el lazo L3 de CDR de Chothia está presente en los aminoácidos de cadena ligera 89 a 97. El extremo del lazo CDR-HI de Chothia cuando se enumera mediante el uso de la convención de numeración de Kabat varía entre H32 y H34 en dependencia de la longitud del lazo (esto se debe a que el esquema de numeración de Kabat sitúa las inserciones en H35A y H35B, si ni 35A ni 35B está presente, el lazo termina en 32, si solo 35A está presente, el lazo termina en 33, si tanto 35A como 35B están presentes, el lazo termina en 34).

En una modalidad específica, las CDR de los anticuerpos descritos en la presente descripción se han determinado de acuerdo con el esquema de la numeración de Kabat.

Comúnmente se utilizan varias definiciones de los CDR: Numeración Kabat, numeración Chothia, numeración AbM o numeración de contactos. La definición de AbM es un compromiso entre las dos usadas por el programa de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. La definición de contacto se basa en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles.

Tabla 2: Numeración de CDR

Como se usa en la presente descripción, el término “cadena pesada” cuando se usa en referencia a un anticuerpo ^{puede referirse a cualquier tipo diferente, por ejemplo, alfa (a), delta (8), épsilon}(^e), ^gamma(^y), ^{y mu (p), en base a}la secuencia de aminoácidos del dominio constante, los que dan origen a las clases de anticuerpos IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, respectivamente, que incluyen las subclases de IgG, por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, e IgG4.

Como se usa en la presente, el término “cadena ligera” cuando se usa en referencia a un anticuerpo puede referirse ^{a cualquier tipo diferente, por ejemplo, kappa}(^k) ^{o lambda}(^á) ^{en base a la secuencia de aminoácidos de los dominios}constantes. Las secuencias de aminoácidos de cadena ligera se conocen bien en la técnica. En modalidades específicas, la cadena ligera es una cadena ligera humana.

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere a una porción de las cadenas ligera y/o pesada de un anticuerpo, que normalmente incluye aproximadamente los 120 a 130 aminoácidos amino terminales en la cadena pesada y alrededor de 100 a 110 aminoácidos amino terminales en la cadena ligera. La región variable de un anticuerpo típicamente determina la especificidad de un anticuerpo particular para su objetivo.

La variabilidad no se distribuye uniformemente a lo largo de los dominios variables de anticuerpos o moléculas de unión a antígeno; se concentra en subdominios de cada una de las regiones variables de cadena ligera y pesada. Estos subdominios se denominan "regiones hipervariables" o "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR), como se describe más adelante en la presente descripción. Las porciones más conservadas (es decir, no hipervariables) de los dominios variables se denominan regiones "armazón" (FRM o FR) y proporcionan un andamiaje para las seis CDR en un espacio tridimensional para formar una superficie de unión al antígeno. Los dominios variables de cada una de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprende cuatro FR (FR1, FR2, FR3 y FR4, respectivamente), que adoptan en gran medida una configuración de hoja p, conectados mediante tres regiones hipervariables, que forman lazos que conectan, y en algunos casos, forman parte de la estructura de hoja p. Las regiones hipervariables de cada cadena se mantienen unidas muy cerca por el FRM y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno (ver Kabat y otros, descrito más adelante en la presente descripción.

Típicamente, las CDR forman una estructura de lazo que se puede clasificar como una estructura canónica. El término "estructura canónica" se refiere a la conformación de la cadena principal que adoptan los lazos de unión a antígeno (CDR). A partir de estudios estructurales comparativos, se ha encontrado que cinco de los seis lazos de unión a antígeno tienen solo un repertorio limitado de conformaciones disponibles. Cada estructura canónica puede caracterizarse por los ángulos de torsión de la cadena principal del polipéptido. Los lazos correspondientes entre anticuerpos pueden, por lo tanto, tener estructuras tridimensionales muy similares, a pesar de la alta variabilidad de la secuencia de aminoácidos en la mayoría de las partes de los lazos.Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 1987, 196: 901; Chothia y otros, Nature, 1989, 342: 877; Martin y Thornton, J. Mol. Biol, 1996, 263: 800). Además, existe una relación entre la estructura de lazo adoptada y las secuencias de aminoácidos que la rodean. La conformación de una clase canónica particular está determinada por la longitud del lazo y los residuos de aminoácidos que residen en las posiciones clave dentro del lazo, así como también dentro del armazón conservado (es decir, fuera del lazo). Por lo tanto, la asignación a una clase canónica particular puede realizarse en función de la presencia de estos residuos de aminoácidos clave.

El término "estructura canónica" también puede incluir consideraciones sobre la secuencia lineal del anticuerpo, por ejemplo, según lo catalogado por Kabat (Kabat y otros, en la presente descripción). El esquema (sistema) de numeración de Kabat es un estándar ampliamente adoptado para numerar los residuos de aminoácidos de un dominio variable de anticuerpo de manera consistente y es el esquema preferido aplicado en la presente enseñanza como también se menciona en otra parte en la presente descripción. También pueden usarse consideraciones estructurales adicionales para determinar la estructura canónica de un anticuerpo. Por ejemplo, aquellas diferencias que no se reflejan completamente en la numeración de Kabat pueden describirse mediante el sistema de numeración de Chothia y otros y/o revelado por otras técnicas, por ejemplo, cristalografía y modelado computacional bidimensional o tridimensional. En consecuencia, una secuencia de anticuerpo dada puede colocarse en una clase canónica que permite, entre otras cosas, identificar las secuencias de bastidor apropiadas (por ejemplo, en base al deseo de incluir una variedad de estructuras canónicas en una biblioteca). La numeración de Kabat de secuencias de aminoácidos de anticuerpos y consideraciones estructurales como se describió por Chothia y otros (en la presente descripción) y sus implicaciones para construir aspectos canónicos de la estructura del anticuerpo, se describen en la literatura. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas se conocen bien en la técnica. Para una revisión de la estructura del anticuerpo, vea Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow y otros, 1988.

La CDR3 de la cadena ligera y, particularmente, la CDR3 de la cadena pesada pueden constituir los determinantes más importantes en la unión al antígeno dentro de las regiones variables de la cadena ligera y pesada. En algunas construcciones de anticuerpos, la CDR3 de la cadena pesada parece constituir la principal área de contacto entre el antígeno y el anticuerpo. Los esquemas de selección in vitro en los que solo se varía CDR3 pueden usarse para variar las propiedades de unión de un anticuerpo o determinar qué residuos contribuyen a la unión de un antígeno. Por lo tanto, la CDR3 suele ser típicamente la mayor fuente de diversidad molecular dentro del sitio de unión del anticuerpo. H3, por ejemplo, puede tener tan solo dos residuos de aminoácidos o más de 26 aminoácidos.

Como se usa en la presente, el término “región constante” o “dominio constante” son intercambiables y tienen su significado común en la técnica. La región constante es una porción de anticuerpo, por ejemplo, una porción carboxilo terminal de una cadena ligera y/o pesada que no está implicada directamente en la unión de un anticuerpo al antígeno pero que puede mostrar varias funciones efectoras, tales como interacción con el receptor de Fc. La región constante de una molécula de inmunoglobulina generalmente tiene una secuencia de aminoácidos más conservada con relación a un dominio variable de inmunoglobulina.

La "afinidad de unión" se refiere generalmente a la resistencia de la suma total de las interacciones no covalentes entre un sitio de unión único de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su pareja de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique de cualquier otra manera, como se usa en la presente, la "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción de 1:1 entre los miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su pareja Y puede representarse generalmente mediante la constante de disociación (Kd). La afinidad puede medirse y/o expresarse en una variedad de formas conocidas en la técnica, que incluyen, entre otras, la constante de equilibrio de disociación (K^d), y constante de equilibrio de asociación (K^a). La K^dse calcula a partir del cociente de kdisoc/kasoc, mientras que la K^ase calcula a partir del cociente de kasoc/kdisoc. La kasoc se refiere a la constante de velocidad de asociación de, por ejemplo, un anticuerpo a un antígeno, y la k disoc se refiere a la disociación de, por ejemplo, un anticuerpo a un antígeno. Las kasoc y kdisoc pueden determinarse mediante técnicas conocidas por un experto en la técnica, tales como BIAcore® o KinExA.

El término "neutralizante" se refiere a una molécula de unión a antígeno, scFv o anticuerpo, respectivamente, que se une a un ligando y previene o reduce el efecto biológico de ese ligando. Esto puede hacerse, por ejemplo, mediante el bloqueo directamente de un sitio de unión en el ligando o al unir al ligando y alterar la capacidad del ligando para unirse por medios indirectos (como alteraciones estructurales o energéticas en el ligando). En algunas modalidades, el término también puede indicar una molécula de unión a antígeno que evita que la proteína a la que se une realice una función biológica.

El término "objetivo" o "antígeno" se refiere a una molécula o una porción de una molécula capaz de unirse a una molécula de unión a antígeno. En ciertas modalidades, un objetivo puede tener uno o más epítopos.

El término "competir", cuando se usa en el contexto de moléculas de unión a antígeno que compiten por el mismo epítopo, significa competencia entre moléculas de unión a antígeno determinada por un ensayo en el que la molécula de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional del mismo) que se analiza evita o inhibe (por ejemplo, reduce) la unión específica de una molécula de unión a antígeno de referencia a un antígeno. Pueden usarse numerosos tipos de ensayos de unión competitiva, por ejemplo: radioinmunoensayo (RIA) directo o indirecto en fase sólida, inmunoensayo enzimático (EIA) directo o indirecto en fase sólida, ensayo de competencia de tipo sándwich (vea Stahli C y otros, (1983) Methods Enzymol 9:242-253); EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (ver Kirkland TN y otros, (1986) J Immunol 137: 3614-3619); ensayo de etiquetado directo en fase sólida, ensayo de tipo sándwich de etiquetado directo en fase sólida (vea Harlow E & Lane D, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA de etiquetado directo en fase sólida mediante el uso de la etiqueta 1-125 (vea Morel GA y otros, (1988) Mol. Immunol 25: 7-15); EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (Cheung RC y otros, (1990) Virology 176:546-552); y RIA de etiquetado directo (Moldenhauer y otros, 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82).

Como se usa en la presente, el término “epítopo” se refiere a una región localizada de un antígeno a la que un anticuerpo puede unirse específicamente. Un epítopo puede ser, por ejemplo, aminoácidos contiguos de un polipéptido (epítopo lineal o contiguo) o un epítopo puede formarse, por ejemplo, a partir de dos o más regiones no contiguas de un polipéptido o polipéptidos (epítopo conformacional, no lineal, discontinuo, o no contiguo). En ciertas modalidades, el epítopo al que un anticuerpo se une puede determinarse mediante, por ejemplo, espectroscopía de NMR, estudios de cristalografía por difracción de rayos X, ensayos ELISA, intercambio de hidrógeno/deuterio acoplado a espectrometría de masas (por ejemplo, espectrometría de masas por electropulverización con cromatografía líquida), ensayos de barrido de oligopéptidos basados en arreglos, y/o mapeo por mutagénesis (por ejemplo, mapeo por mutagénesis dirigida a sitio). Para la cristalografía por rayos X, la cristalización puede realizarse mediante el uso de cualquiera de los métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, Giege R. y otros, (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen NE (1997) Structure 5: 1269 1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303). Los cristales de anticuerpo:antígeno pueden estudiarse mediante el uso de técnicas de difracción de rayos X bien conocidas y pueden refinarse mediante el uso de programas informáticos tales como X-PLOR (Universidad de Yale, 1992, distribuido por Molecular Simulations, Inc.; vea por ejemplo Meth Enzymol (1985) volúmenes 114 & 115, eds Wyckoff HW y otros,; el documento U.S. 2004/0014194), y BU^sT^eR (Bricogne G (1993) Acta CrystallogrD Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Cárter CW; Roversi P y otros, (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323). Los estudios de mapeo por mutagénesis pueden realizarse mediante el uso de cualquier método conocido por un experto en la técnica. Vea, por ejemplo, Champe M y otros, (1995) J Biol Chem 270: 1388-1394 y Cunningham BC & Wells JA (1989) Science 244: 1081-1085 para una descripción de técnicas de mutagénesis, que incluye técnicas de mutagénesis por barrido de alanina.

Como se usa en la presente, los términos "marcar" o "marcado" se refieren a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, mediante la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión a un polipéptido de restos de biotina que pueden detectarse mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse por métodos ópticos o colorimétricos). En ciertas modalidades, la etiqueta o marcador también puede ser terapéutico. Se conocen en la técnica y pueden usarse varios métodos para etiquetar polipéptidos y glicoproteínas.

Aplicaciones terapéuticas

Mediante el uso de la inmunoterapia adoptiva, las células T nativas pueden (i) extraerse de un paciente, (ii) manipularse genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) que se une a al menos un antígeno tumoral (iii) expandirse ex-vivo en una población más grande de células T manipuladas y (iv) reintroducidas en el paciente. Vea, por ejemplo, patentes de Estados Unidos núms. 7,741,465, y 6,319,494, Eshhar y otros (Cancer Immunol, supra); Krause y otros (supra); Finney y otros (supra). Después de que las células T modificadas se reintroducen en el paciente, median una respuesta inmunitaria contra las células que expresan el antígeno tumoral. Vea por ejemplo, Krause y otros, J. Exp. Med., Volumen 188, No. 4, 1998 (619-626). Esta respuesta inmunitaria incluye la secreción de IL-2 y otras citocinas por parte de las células T, la expansión clonal de las células T que reconocen el antígeno tumoral y la destrucción específica de células objetivos positivas mediada por células T. Vea Hombach y otros, Journal of Immun. 167: 6123-6131 (2001).

El término "linfocito", como se usa en la presente, incluye células asesinas naturales (NK), células T o células B. Las células NK son un tipo de linfocito citotóxico (tóxico para las células) que representa un componente principal del sistema inmunitario inherente. Las células NK rechazan los tumores y las células infectadas por virus. Actúa mediante el proceso de apoptosis o muerte celular programada. Se denominaron "asesinos naturales" porque no requieren activación para matar las células. Las células T juegan un papel importante en la inmunidad mediada por células (sin participación de anticuerpos). Sus receptores de células T (TCR) se diferencian de otros tipos de linfocitos. El timo, un órgano especializado del sistema inmunitario, es el principal responsable de la maduración de las células T. Hay seis tipos de células T, específicamente: Células T colaboradoras (por ejemplo, células CD4+), células T citotóxicas (también conocidas como TC, linfocitos T citotóxicos, CTL, células T asesinas, células T citolíticas, células T CD8+ o células T asesinas), células T de memoria ((i) células T de memoria madre scm, como las células vírgenes, son CD45RO-, CCR7+, CD45RA+, CD62L+ (L-selectina), CD27+, CD28+ e IL-7Ra+, pero también expresan grandes cantidades de CD95, IL-2Rp, CXCR3 y LFA-1, y muestran numerosos atributos funcionales distintivos de las células de memoria); (ii) las células T de memoria central ^cmexpresan L-selectina y CCR7, secretan IL-2, pero no IFN^yo IL-4, y (iii) las células T de memoria ^em, sin embargo, las células no expresan L-selectina o CCR7 pero producen citocinas efectoras como IPNy e IL-4), células T reguladoras (Treg, células T supresoras o células T reguladoras CD4+CD25+), células T asesinas naturales (NKT) y células T gamma delta. Las células B, por otro lado, juegan un papel principal en la inmunidad humoral (con participación de anticuerpos). Produce anticuerpos y antígenos y desempeña el papel de células presentadoras de antígenos (APC) y se convierte en células B de memoria después de la activación por interacción con el antígeno. En los mamíferos, las células B inmaduras se forman en la médula ósea, de donde deriva su nombre.

El término "modificado genéticamente" o "modificado" se refiere a un método para modificar el genoma de una célula, que incluye, entre otros, la eliminación de una región codificante o no codificante o una porción de la misma o la inserción de una región codificante o una porción de la misma. En algunas modalidades, la célula que se modifica es un linfocito, por ejemplo, una célula T, que puede obtenerse de un paciente o de un donante. La célula puede modificarse para expresar una construcción exógena, tal como, por ejemplo, un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR), que se incorpora al genoma de la célula.

Una "respuesta inmunitaria" se refiere a la acción de una célula del sistema inmunitario (por ejemplo, linfocitos T, linfocitos B, células asesinas naturales (NK), macrófagos, eosinófilos, mastocitos, células dendríticas y neutrófilos) y macromoléculas solubles producidas por cualquiera de estas células o el hígado (incluidos Ab, citocinas y complemento) que da como resultado la selección, unión, daño, destrucción y/o eliminación del cuerpo de un vertebrado de patógenos invasores, células o tejidos infectados con patógenos, células cancerosas u otras células anormales o, en casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales.

El término "inmunoterapia" se refiere al tratamiento de un sujeto afectado por, o en riesgo de contraer o sufrir una recurrencia de una enfermedad mediante un método que comprende inducir, potenciar, suprimir o modificar de cualquier otra manera una respuesta inmunitaria. Los ejemplos de inmunoterapia incluyen, entre otros, las terapias de células T. La terapia con células T puede incluirterapia con células T adoptivas, inmunoterapia con linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), terapia con células autólogas, terapia con células autólogas diseñadas (eACT) y trasplante alogénico de células T. Sin embargo, un experto en la técnica reconocería que los métodos de acondicionamiento descritos en la presente descripción mejorarían la efectividad de cualquier terapia de células T trasplantadas. Los ejemplos de terapias de células T se describen en las patentes de Estados Unidos núms. 2014/0154228 y 2002/0006409, la patente de Estados Unidos núm. 5.728.388, y la Publicación Internacional núm. WO 2008/081035.

Las células T de la inmunoterapia pueden provenir de cualquier fuente conocida en la técnica. Por ejemplo, las células T pueden diferenciarse in vitro de una población de células madre hematopoyéticas, o pueden obtenerse células T de un sujeto. Las células efectoras inmunitarias pueden obtenerse de, por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica (PBMC), médula ósea, tejido de los ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. Además, las células T pueden derivarse de una o más líneas de células T disponibles en la técnica. Las células T pueden obtenerse también a partir de una unidad de sangre recolectada de un sujeto mediante el uso de cualquier cantidad de técnicas conocidas por los expertos en la técnica, tales como la separación de Ficoll™ y o aféresis. Métodos adicionales de aislamiento de células T para una terapia de células T se describen en la patente de Estados Unidos núm. 2013/0287748.

El término "terapia de células autólogas modificadas", que puede abreviarse como "eACT™, también conocida como transferencia celular adoptiva, es un proceso mediante el cual se recolectan las propias células T de un paciente y subsecuentemente se modifican genéticamente para reconocer y dirigirse a uno o más antígenos expresados en la superficie celular de una o más células tumorales o malignidades específicas. Las células T pueden diseñarse para expresar, por ejemplo, receptores de antígenos quiméricos (CAR) o receptores de células T (TCR). Las células T CAR positivas (+) están diseñadas para expresar un fragmento variable de cadena sencilla extracelular (scFv) con especificidad para un antígeno tumoral particular vinculado a una parte de señalización intracelular que comprende al menos un dominio coestimulador y al menos un dominio activador. El dominio coestimulador puede derivarse de (o corresponder a), por ejemplo, CD28, y el dominio activador puede derivar de (o corresponder a) por ejemplo, CD3-zeta. En ciertas modalidades, el CAR está diseñado para tener dos, tres, cuatro o más dominios coestimuladores.

El término "autólogo" se refiere a cualquier material derivado del mismo individuo al que se le va a volver a introducir más tarde. Por ejemplo, el método de terapia celular autóloga modificada (eACT™) descrito en la presente descripción implica la recolección de linfocitos de un paciente, que luego se modifican para expresar, por ejemplo, una construcción c Ar , y luego se vuelve a administrar al mismo paciente.

El término "alogénico" se refiere a cualquier material derivado de un individuo que luego se introduce en otro individuo de la misma especie, por ejemplo, trasplante de células T alogénicas.

En algunos aspectos, la enseñanza por lo tanto proporciona un método para tratar o prevenir una condición asociada con niveles elevados y/o no deseados de CLL-1 en un paciente, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad efectiva de al menos una molécula de unión a antígeno aislada, CAR o TCR descritos en la presente descripción.

Se proporcionan métodos para tratar enfermedades o trastornos, incluido el cáncer. En algunas modalidades, la enseñanza se refiere a la creación de una respuesta inmunitaria mediada por células T en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de las células inmunitarias modificadas por ingeniería genética de la presente solicitud. En algunas modalidades, la respuesta inmunitaria mediada por células T se dirige contra una célula o células objetivos. En algunas modalidades, la célula inmunitaria manipulada comprende un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR). En algunas modalidades, la célula objetivo es una célula tumoral. En algunos aspectos, la enseñanza comprende un método para tratar o prevenir una neoplasia maligna, dicho método que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad efectiva de al menos una molécula de unión a antígeno aislada descrita en la presente descripción. En algunos aspectos, la enseñanza comprende un método para tratar o prevenir una neoplasia maligna, dicho método comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad efectiva de al menos una célula inmunitaria, en donde la célula inmunitaria comprende al menos un receptor de antígeno quimérico, un receptor de célula T y/o una molécula de unión a antígeno aislada como se describió en la presente descripción.

En algunos aspectos, la enseñanza proporciona una composición farmacéutica que comprende al menos una molécula de unión a antígeno como se describió en la presente descripción y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, la composición farmacéutica comprende además, un agente activo adicional.

Las moléculas de unión a antígeno, CAR, TCR, células inmunitarias y similares de la enseñanza pueden usarse para tratar enfermedades mieloides que incluyen, entre otras, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mielógena crónica (CML), leucemia mielomonocítica crónica (CMML), leucemia mielomonocítica juvenil, leucemia mieloide crónica atípica, leucemia promielocítica aguda (APL), leucemia monoblástica aguda, leucemia eritroide aguda, leucemia megacarioblástica aguda, síndrome mielodisplásico (MDS), trastorno mieloproliferativo, neoplasia mieloide, sarcoma mieloide), neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas (BPDCN), o sus combinaciones. Enfermedades adicionales incluyen enfermedades inflamatorias y/o autoinmunitarias tales como artritis reumatoide, psoriasis, alergias, asma, enfermedad de Crohn, IBD, IBS, fibromialga, mastocitosis y enfermedad celíaca.

Se apreciará que las dosis objetivo para las células CAR+/ CAR-T7 TCR+ pueden estas en el intervalo desde 1x106 -2x1010 células/kg, preferentemente 2x106 células/kg, con mayor preferencia. Se apreciará que las dosis por encima y por debajo de este intervalo pueden ser apropiadas para ciertos sujetos, y el proveedor de atención médica puede determinar los niveles de dosis apropiados según sea necesario. Además, pueden proporcionarse múltiples dosis de células de acuerdo con la enseñanza.

También se proporcionan métodos para reducir el tamaño de un tumor en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una célula modificada de la presente enseñanza, en donde la célula comprende un receptor de antígeno quimérico, un receptor de células T o un receptor de células T basado en un receptor de antígeno quimérico que comprende una molécula de unión a antígeno se une a un antígeno en el tumor. En algunas modalidades, el sujeto tiene un tumor sólido o una neoplasia maligna de la sangre tal como linfoma o leucemia. En algunas modalidades, la célula modificada se suministra a un lecho tumoral. En algunas modalidades, el cáncer está presente en la médula ósea del sujeto. En algunas modalidades, las células manipuladas son células T autólogas. En algunas modalidades, las células modificadas son células T alogénicas. En algunas modalidades, las células modificadas son células T heterólogas. En algunas modalidades, las células diseñadas de la presente solicitud se transfectan o transducen in vivo. En otras modalidades, las células manipuladas se transfectan o transducen ex vivo. Como se usa en la presente, el término "célula in vitro" se refiere a cualquier célula que se cultiva ex vivo. En particular, una célula in vitro puede incluir una célula T.

Los métodos pueden comprender además administrar uno o más agentes quimioterapéuticos. En determinadas modalidades, el agente quimioterapéutico es un quimioterapéutico (preacondicionamiento) que agota los linfocitos. Los regímenes de tratamiento de preacondicionamiento beneficiosos, junto con los biomarcadores beneficiosos correlativos se describen en las solicitudes de patentes provisionales de los Estados Unidos núms. 62/262,143 y 62/167,750. Estos describen, por ejemplo, métodos para acondicionar a un paciente que necesita una terapia de células T que comprende administrar al paciente dosis beneficiosas especificadas de ciclofosfamida (entre 200 mg/m2/día y 2000 mg/m2/día) y dosis especificadas de fludarabina (entre 20 mg/m2/día y 900 mg/m2/día). Un régimen de dosificación preferido implica el tratamiento de un paciente que comprende la administración diaria al paciente de aproximadamente 500 mg/m2/día de ciclofosfamida y alrededor de 60 mg/m2/día de fludarabina durante tres días antes de la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de células T modificadas al paciente.

En otras modalidades, la molécula de unión a antígeno, las células transducidas (o modificadas de cualquier otra manera) (tales como CAR o TCR) y el agente quimioterapéutico se administran cada uno en una cantidad efectiva para tratar la enfermedad o afección en el sujeto.

En determinadas modalidades, las composiciones que comprenden las células efectoras inmunitarias que expresan CAR descritas en la presente descripción pueden administrarse junto con cualquier cantidad de agentes quimioterapéuticos. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN™); sulfonatos de alquilo tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, uracilo mostaza; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos como aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptongrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antisuprarrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defamina; demecolcina; diazicuona; elformitina; acetato de eliptinio; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinán; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenómeno; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2- etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofirán; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2, 2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL™, Bristol-Myers Squibb) y doxetaxel (TAXOTERE®, Rhóne-Poulenc Rorer); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; ombligo; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS2000; difluorometilomitina (DMFO); derivados del ácido retinoico como Targretin™ (bexaroteno), Panretin™, (alitretinoína); ONTAK™ (denileucina diftitox); esperamicinas; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. En esta definición se incluyen, además, los agentes anti-hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en tumores, tales como anti-estrógenos que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de la aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno (Fareston); y anti-andrógenos, tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, y goserelina; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores. También se administran combinaciones de agentes quimioterapéuticos cuando corresponde, que incluye, entre otros, CHOP, es decir, ciclofosfamida (Cytoxan®), doxorrubicina (hidroxidoxorrubicina), vincristina (Oncovin®) y prednisona.

En algunas modalidades, el agente quimioterapéutico se administra al mismo tiempo o dentro de una semana después de la administración de la célula, polipéptido o ácido nucleico modificado por ingeniería genética. En otras modalidades, el agente quimioterapéutico se administra de 1 a 4 semanas o de 1 semana a 1 mes, 1 semana a 2 meses, 1 semana a 3 meses, 1 semana a 6 meses, 1 semana a 9 meses o 1 semana a 12 meses después de la administración de la célula, polipéptido o ácido nucleico modificado. En otras modalidades, el agente quimioterapéutico se administra al menos 1 mes antes de administrar la célula, el polipéptido o el ácido nucleico. En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar dos o más agentes quimioterapéuticos.

Puede usarse una variedad de agentes terapéuticos adicionales junto con las composiciones descritas en la presente ^{descripción. Por ejemplo, agentes terapéuticos adicionales potencialmente útiles que incluye inhibidores de p}D-1 ^comonivolumab (Opdivo®), pembrolizumab (Keytruda®), pembrolizumab, pidilizumab y atezolizumab.

Los agentes terapéuticos adicionales adecuados para su uso en combinación con la enseñanza incluyen, entre otros, ibrutinib (Imbruvica®), ofatumumab (Arzerra®), rituximab (Rituxan®), bevacizumab (Avastin®), trastuzumab (Herceptin®), trastuzumab emtansina (KADCYLA®), imatinib (Gleevec®), cetuximab (Erbitux®), panitumumab (Vectibix®), catumaxomab, ibritumomab, ofatumumab, tositumomab, brentuximab, alemtuzumab, gemtuzumab, erlotinib, gefitinib, vandetanib, afatinib, lapatinib, neratinib, axitinib, masitinib, pazopanib, sunitinib, sorafenib, toceranib, lestaurtinib, axitinib, cediranib, nintedanib, lendanib, pazopanib, regorafenib, semaxanib, sorafenib, sunitinib, tivozanib, toceranib, vandetanib, entrectinib, cabozantinib, imatinib, dasatinib, nilotinib, ponatinib, radotinib, bosutinib, lestaurtinib, ruxolitinib, pacritinib, cobimetinib, selumetinib, trametinib, binimetinib, alectitinib, ceritinib, crizotinib, aflibercept, adipotide, denileukin diftitox, inhibidores de mTOR como Everolimus y Temsirolimus, inhibidores de la vía Hedgehog como sonidegib y vismodegib, inhibidores de CDK tal como el inhibidor de CDK (palbociclib).

En modalidades adicionales, la composición que comprende inmunidad que contiene CAR se puede administrarse con un agente antiinflamatorio. Los agentes o medicamentos antiinflamatorios incluyen, entre otros, esteroides y glucocorticoides (incluidos betametasona, budesonida, dexametasona, acetato de hidrocortisona, hidrocortisona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, triamcinolona), medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (NSAIDS) que incluyen aspirina, ibuprofeno, naproxeno, metotrexato, sulfasalazina, leflunomida, medicamentos anti-TNF, ciclofosfamida y micofenolato. Los ejemplos ilustrativos de NSAID incluyen ibuprofeno, naproxeno, naproxeno sódico, inhibidores de Cox-2 y sialilatos. Los ejemplos ilustrativos de analgésicos incluyen paracetamol, oxicodona, tramadol o clorhidrato de proporxifeno. Los glucocorticoides ilustrativos incluyen cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona o prednisona. Los modificadores de respuesta biológica ilustrativos incluyen moléculas dirigidas contra marcadores de superficie celular (por ejemplo, CD4, CD5, etc.), inhibidores de citocinas, como los antagonistas del TNF, (por ejemplo, etanercept (ENBREL®), adalimumab (HUMIRA®) e infliximab (REMICADE®), inhibidores de quimiocinas e inhibidores de moléculas de adhesión. Los modificadores de la respuesta biológica incluyen anticuerpos monoclonales así como formas recombinantes de moléculas. Los DMARD ilustrativos incluyen azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina, metotrexato, penicilamina, leflunomida, sulfasalazina, hidroxicloroquina, Gold (oral (auranofina) e intramuscular) y minociclina.

En determinadas modalidades, las composiciones descritas en la presente descripción se administran junto con una citocina. Por "citocina" como se usa en la presente se pretende referirse a las proteínas liberadas por una población celular que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de dichas citocinas son linfocinas, monocinas, y hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citocinas incluidas están la hormona de crecimiento, tal como la hormona del crecimiento humano, hormona de crecimiento humano N-metionil, y hormona de crecimiento bovino; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas de glicoproteínas, tales como la hormona estimulante del folículo (FSH), hormona estimulante de la tiroides (TSH), y la hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepático, factor de crecimiento de fibroblasto (FGF); prolactina; lactógeno placentario; sustancia inhibidora mülleriana; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento del nervio (NGF) tales como el NGF-beta; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento transformantes (TGF) tales como TGF-alfa y TGF beta; factor de crecimiento I y II similar a la insulina; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos, interferones tales como el interferón alfa, beta y gamma, factores estimulantes de colonias (CSF), tales como macrófagos-CSF (M-CSF); y granulocitos-macrófagos-CSF (GM-CSF) y granulocitos-CSF (G-CSF), interleucinas (IL), tal como la IL-1, IL-Ialfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, factor de necrosis tumoral como el TNF-alfa o TNF-beta; y otros factores polipeptídicos que incluyen LIF y ligando kit (KL). Tal como se usa en la presente, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.

En algunos aspectos, la enseñanza proporciona una molécula de unión a antígeno que se une a CLL-1 con una Kd que es menor que 100 pM. En algunas modalidades, la molécula de unión a antígeno se une con una Kd que es menor que 10 pM. En otras modalidades, la molécula de unión a antígeno se une con una Kd que es menos de 5 p.m.

Métodos de elaboración

Puede utilizarse una variedad de técnicas conocidas para fabricar los polinucleótidos, polipéptidos, vectores, moléculas de unión a antígeno, células inmunitarias, composiciones y similares de acuerdo con la enseñanza.

Antes de la manipulación in vitro o modificación genética de las células inmunitarias descritas en la presente descripción, las células pueden obtenerse de un sujeto. En algunas modalidades, la célula inmunitaria comprende una célula T. Las células T pueden obtenerse de varias fuentes, que incluyen las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), médula ósea, tejido de los ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. En algunas modalidades, las células T pueden obtenerse de una unidad de sangre recogida de un sujeto mediante el uso de cualquier número de técnicas conocidas por un técnico con experiencia, tal como la separación con FICOLL™. Las células pueden obtenerse preferentemente de la sangre circulante de un individuo por aféresis. El producto de aféresis típicamente contiene linfocitos, que incluyen las células T, monocitos, granulocitos, células B, otras células blancas nucleadas de la sangre, células rojas de la sangre, y plaquetas. En ciertas modalidad, las células colectadas por aféresis pueden lavarse para eliminar la fracción de plasma y para colocar las células en un tampón o medio adecuado para posteriores etapas de procesamiento. Las células pueden lavarse con PBS. Como se apreciará, puede utilizarse una etapa de lavado, como mediante el uso de una centrífuga semiautomática de flujo continuo, por ejemplo, el Procesador de células Cobe™ 2991, el Baxter CytoMate™, o similar. Después del lavado, las células pueden resuspenderse en una variedad de tampones biocompatibles u otra solución salina con o sin tampón. En ciertas modalidades, los componentes no deseados de la muestra de aféresis pueden eliminarse.

En determinadas modalidades, las células T se aíslan de las PBMC mediante la lisis de los glóbulos rojos y el agotamiento de los monocitos, por ejemplo, mediante el uso de centrifugación a través de un gradiente de PERCOLL™. Una subpoblación específica de células T, tal como las células CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA", y CD45RO+ pueden aislarse además por técnicas de selección positivas o negativas conocidas en la técnica. Por ejemplo, el enriquecimiento de una población de células T mediante selección negativa puede lograrse con una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores de superficie únicos para las células negativamente seleccionadas. Un método para su uso en la presente descripción es la separación de células y/o la selección a través de inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que utiliza un cóctel de anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de superficie celular presentes en las células negativamente seleccionadas. Por ejemplo, para enriquecer en células CD4+ por selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales incluye típicamente anticuerpos para CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, y CD8. La citometría de flujo y la clasificación de células también pueden usarse para aislar poblaciones de células de interés para usar en la presente enseñanza.

Las PBMC pueden usarse directamente para la modificación genética con las células inmunitarias (tales como CAR o TCR) mediante el uso de métodos como se describió en la presente descripción. En ciertas modalidades, después de aislar las PBMC, los linfocitos T pueden aislarse más y los linfocitos T auxiliares y citotóxicos pueden clasificarse en subpoblaciones de células T vírgenes, de memoria y efectoras antes o después de la modificación y/o expansión genética.

En algunas modalidades, las células CD8+ se clasifican en células vírgenes, de memoria central y efectoras mediante la identificación de antígenos de superficie celular que están asociados con cada uno de estos tipos de células CD8+. En algunas modalidades, la expresión de marcadores fenotípicos de células T de memoria central incluye CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 y CD127 y son negativos para granzima B. En algunas modalidades, las células T de memoria central son células T CD45RO+, CD62L+, CD8+. En algunas modalidades, las células T efectoras son negativas para CD62L, CCR7, CD28 y CD127, y positivas para granzima B y perforina. En ciertas modalidades, las células T CD4+ se clasifican además en subpoblaciones. Por ejemplo, las células T auxiliares CD4+ pueden clasificarse en células vírgenes, de memoria central y efectoras mediante la identificación de poblaciones celulares que tienen antígenos de superficie celular.

Las células inmunitarias, como las células T, pueden modificarse genéticamente después del aislamiento mediante el uso de métodos conocidos, o las células inmunitarias pueden activarse y expandirse (o diferenciarse en el caso de progenitores) in vitro antes de ser modificada genéticamente. En otra modalidad, las células inmunitarias, como las células T, se modifican genéticamente con los receptores de antígenos quiméricos descritos en la presente descripción (por ejemplo, se transducen con un vector viral que comprende una o más secuencias de nucleótidos que codifican un CAR) y luego se activan y/o expanden in vitro. Los métodos para activar y expandir las células T son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos núm. 6,905,874; patente de Estados Unidos núm. 6,867,041; patente de Estados Unidos núm. 6,797,514; y el documento PCT W02012/079000. Generalmente, dichos métodos incluyen poner en contacto PBMC o células T aisladas con una molécula estimuladora y una molécula coestimuladora, tal como anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, generalmente adheridos a una perla u otra superficie, en un medio de cultivo con citocinas apropiadas, tal como IL-2. Los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 unidos a la misma perla sirven como una célula presentadora de antígeno (APC) "sustituta". Un ejemplo es el sistema Dynabeads®, un sistema activador/estimulador de CD3/CD28 para la activación fisiológica de células T humanas. En otras modalidades, las células T pueden activarse y estimularse para que proliferen con células alimentadoras y anticuerpos y citocinas apropiadas mediante el uso de métodos como los descritos en la patente de Estados Unidos núm.

6,040,177; patente de Estados Unidos núm. 5,827,642; y el documento WO2012129514.

Ciertos métodos para hacer las construcciones y las células inmunitarias modificadas de la enseñanza se describen en la solicitud PCT PCT/US15/14520. Pueden encontrarse métodos adicionales para hacer las construcciones y las células en la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos núm. 62/244036.

Se apreciará que las PBMC pueden incluir además otros linfocitos citotóxicos tales como células NK o células NKT. Un vector de expresión que porta la secuencia codificante de un receptor quimérico como se describe en la presente descripción puede introducirse en una población de células T, células NK o células NKT de un donante humano. Los linfocitos T transducidos con éxito que portan el vector de expresión pueden clasificarse mediante el uso de citometría de flujo para aislar linfocitos T CD3 positivos y luego propagarse para aumentar el número de estos linfocitos T que expresan CAR además de la activación celular mediante el uso de anticuerpos anti-CD3 e IL-2 u otros métodos conocidos en la técnica como se describió en otra parte en la presente descripción. Se usan procedimientos estándar para la crioconservación de células T que expresan CAR para almacenamiento y/o preparación para su uso en un sujeto humano. En una modalidad, la transducción in vitro, el cultivo y/o la expansión de las células T se realizan en ausencia de productos derivados de animales no humanos tales como suero de ternera fetal y suero bovino fetal.

Para la clonación de polinucleótidos, el vector puede introducirse en una célula huésped (una célula huésped aislada) para permitir la replicación del propio vector y, de esta manera, amplificar las copias del polinucleótido contenido en él. Los vectores de clonación pueden contener componentes de secuencia que generalmente incluyen, sin limitación, un origen de replicación, secuencias promotoras, secuencias de iniciación de la transcripción, secuencias potenciadoras y marcadores seleccionables. Estos elementos pueden ser seleccionados según corresponda por un experto en la técnica. Por ejemplo, el origen de la replicación puede seleccionarse para promover la replicación autónoma del vector en la célula huésped.

En ciertas modalidades, la presente descripción proporciona células huésped aisladas que contienen el vector proporcionado en la presente descripción. Las células huésped que contienen el vector pueden ser útiles en la expresión o clonación del polinucleótido contenido en el vector. Las células huésped adecuadas pueden incluir, sin limitación, células procarióticas, células fúngicas, células de levadura o células eucarióticas superiores tales como células de mamífero. Los organismos procariotas adecuados incluyen, sin limitación, eubacteria, tal como los organismos gramnegativos o grampositivos, por ejemplo, Enterohacteriaceae tal como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como también Bacilos tales como B. subtilis y B. licheniformis, Pseudomonas, y Streptomyces.

El vector puede introducirse en la célula huésped mediante el uso de cualquier método adecuado conocido en la técnica, que incluye, entre otros, el suministro mediado por DEAE-dextrano, el método del precipitado de fosfato de calcio, el suministro mediado por lípidos catiónicos, la transfección mediada por liposomas, la electroporación, el bombardeo con microproyectiles, suministro génico mediado por receptor, suministro mediado por polilisina, histona, quitosano y péptidos. Los métodos estándar para la transfección y transformación de células para la expresión de un vector de interés se conocen bien en la técnica. En una modalidad adicional, puede usarse una mezcla de diferentes vectores de expresión para modificar genéticamente una población donante de células efectoras inmunitarias en donde cada vector codifica un CAR diferente como se describe en la presente descripción. Las células efectoras inmunitarias transducidas resultantes forman una población mixta de células modificadas, con una proporción de células modificadas que expresan más de un c Ar diferente.

En una modalidad, la enseñanza proporciona un método para almacenar células manipuladas genéticamente que expresan CAR o TCR que se dirigen a una proteína CLL-1. Esto implica crioconservar las células inmunitarias de manera que las células permanezcan viables tras la descongelación. Una fracción de las células inmunitarias que expresan las CAR puede crioconservarse mediante métodos conocidos en la técnica para proporcionar una fuente permanente de dichas células para el tratamiento futuro de pacientes afectados por una neoplasia maligna. Cuando sea necesario, las células inmunitarias transformadas crioconservadas pueden descongelarse, cultivar y expandir para obtener más células de este tipo.

Como se usa en la presente, "crioconservar" se refiere a la conservación de células enfriándolas a temperaturas bajo cero, tal como (típicamente) 77 Kelvin o -196 °C (el punto de ebullición del nitrógeno líquido). Los agentes crioprotectores a menudo se usan a temperaturas bajo cero para evitar que las células conservadas se dañen debido a la congelación a bajas temperaturas o al calentamiento a temperatura ambiente. Los agentes crioconservadores y las velocidades de enfriamiento óptimas pueden proteger contra el daño celular. Los agentes crioprotectores que pueden usarse de acuerdo con la enseñanza incluyen, entre otros, a: sulfóxido de dimetilo (DMSO) (Lovelock & Bishop, Nature (1959); 183: 1394-1395; Ashwood-Smith, Nature (1961); 190: 1204-1205), glicerol, polivinilpirrolidina (Rinfret, Ann. N.Y. Acad. Sci. (1960); 85: 576), y polietilenglicol (Sloviter y Ravdin, Nature (1962); 196: 48). La velocidad de enfriamiento preferida es de 1 - 3 °C/minuto.

El término "sustancialmente puro" se usa para indicar que un componente dado está presente en un nivel alto. El componente es convenientemente el componente predominante presente en una composición. Preferentemente está presente a un nivel de más del 30 %, de más del 50 %, de más del 75 %, de más del 90 %, o incluso de más del 95 %, determinado dicho nivel sobre peso en seco/peso en seco base con respecto a la composición total bajo consideración. A niveles muy altos (por ejemplo a niveles de más del 90 %, de más del 95 % o de más del 99 %, el componente puede considerarse en "forma pura". Las sustancias biológicamente activas de la presente enseñanza (CAR, TCR, polipéptidos aislados, moléculas de ácido nucleico aisladas, moléculas de unión a antígeno, fracciones) pueden proporcionarse en una forma que esté sustancialmente libre de uno o más contaminantes con los que la sustancia podría estar asociada de cualquier otra manera. Cuando una composición está sustancialmente libre de un contaminante dado, el contaminante estará en un nivel bajo (por ejemplo, a un nivel de menos del 10 %, menos del 5 % o menos del 1 % sobre la base de peso en seco/peso en seco establecido anteriormente).

En algunas modalidades, las células se formulan en primer lugar al cosecharlas de su medio de cultivo, y después lavar y concentrar las células en un medio y un sistema contenedor adecuado para una administración (un portador "farmacéuticamente aceptable") en una cantidad efectiva para el tratamiento. El medio de infusión adecuado puede ser cualquier formulación de medio isotónico, típicamente solución salina normal, Normosol™ R (Abbott) o Plasma-Lyte™ A (Baxter), pero también puede utilizarse dextrosa al 5 % en agua o lactato de Ringer. El medio de infusión puede suplementarse con albúmina de suero humano.

Las cantidades de tratamiento deseadas de células en la composición son generalmente al menos 2 células (por ejemplo, al menos 1 linfocito T de memoria central CD8+ y al menos 1 subconjunto de células T auxiliares CD4+) o es más típicamente mayor que 102 células y hasta 106, hasta y que incluye 108 o 109 células y pueden ser más de 1010 células. El número de células dependerá del uso final para el que está destinada la composición, y el tipo de células incluidas en esta. La densidad de las células deseadas es típicamente mayor que 106 células/ml y generalmente es mayor que 107 células/ml, generalmente 108 células/ml o mayor. El número clínicamente relevante de células inmunitarias puede distribuirse en múltiples infusiones que acumulativamente igualan o exceden 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, o 1012 células. En algunos aspectos de la presente enseñanza, particularmente dado que todas las células infundidas se redirigirán a un antígeno objetivo particular (CLL-1), un número menor de células, en el intervalo de 106/kilogramo (106 - 1011 por paciente) pueden ser administrados. Los tratamientos de CAR pueden administrarse múltiples veces en dosis dentro de estos intervalos. Las células pueden ser autólogas, alogénicas o heterólogas para el paciente que se somete a la terapia.

Las poblaciones de células T que expresan CAR de la presente enseñanza pueden administrarse solas, o como una composición farmacéutica en combinación con diluyentes y/o con otros componentes tales como IL-2 u otras citocinas o poblaciones celulares. Las composiciones farmacéuticas de la presente enseñanza pueden comprender una población de células que expresan CAR o TCR, tal como las células T, como se describió en la presente descripción, en combinación con uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente o fisiológicamente aceptables. Tales composiciones pueden comprender tampones tales como solución salina tamponada neutra, solución salina tamponada con fosfato y similares; carbohidratos tales como glucosa, manosa, sacarosa o dextranos, manitol; proteínas; polipéptidos o aminoácidos tales como glicina; antioxidantes; agentes quelantes tales como EDTA o glutatión; adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio); y conservantes. Las composiciones de la presente enseñanza se formulan preferentemente para administración intravenosa.

Las composiciones farmacéuticas (soluciones, suspensiones o similares), pueden incluir uno o más de los siguientes: diluyentes estériles tal como agua para inyección, solución salina, preferentemente salina fisiológica, solución de Ringer, cloruro de sodio isotónico, aceites fijos tal como mono o diglicéridos sintéticos que pueden servir como solventes o medio de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabeno; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tal como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. La preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico. Una composición farmacéutica inyectable es preferentemente estéril.

Se apreciará que los eventos adversos pueden minimizarse al transducir las células inmunitarias (que contienen uno o más CAR o TCR) con un gen suicida. También se puede desear incorporar un interruptor inducible de "encendido" o "acelerador" en las células inmunitarias. Las técnicas adecuadas incluyen el uso de caspasa-9 inducible (Solicitud de los Estados Unidos 2011/0286980) o una timidina quinasa, antes, después o al mismo tiempo que las células se transducen con la construcción CAR de la presente enseñanza. Los métodos adicionales para introducir los genes suicidas y/o interruptores de "encendido" incluyen TALENS, dedos de zinc, ARNi, ARNip, ARNhc, tecnología antisentido y otras técnicas conocidas en la técnica.

De acuerdo con la enseñanza, pueden incorporarse en la presente descripción técnicas adicionales de encendidoapagado u otros tipos de interruptores de control. Estas técnicas pueden emplear el uso de dominios de dimerización y activadores opcionales de dicho dominio de dimerización. Estas técnicas incluyen, por ejemplo, las descritas por Wu y otros, Science 2014 350 (6258) mediante el uso de sistemas de dimerización FKBP/Rapalog en ciertas células. La tecnología de dimerización adicional se describe en, por ejemplo, Fegan y otros Chem. Rev. 2010, 110, 3315-3336 así como también las patentes de Estados Unidos núms. 5,830,462; 5,834,266; 5,869,337; y 6,165,787. Los pares de dimerización adicionales pueden incluir ciclosporina-A/ciclofilina, receptor, receptor de estrógeno/estrógeno (mediante el uso de opcionalmente tamoxifeno), receptor de glucocorticoides/glucocorticoides, receptor de tetraciclina/tetraciclina, receptor de vitamina D/vitamina D. Se pueden encontrar más ejemplos de tecnología de dimerización en, por ejemplo, el documento WO 2014/127261, el documento WO 2015/090229, el documento US 2014/0286987, el documento US2015/0266973, el documento US2016/0046700, la patente de Estados Unidos núm.

8,486,693, el documento US 2014/0171649, y el documento US 2012/0130076.

Definiciones

Como se utiliza de acuerdo con la presente descripción, los siguientes términos, a menos que se indique de otra forma, deben tener los siguientes significados:

El uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique de cualquier otra manera. Además, el uso del término "que incluye", así como también otras formas, tales como "incluye" e "incluyen", no es limitativo. Además, términos como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique de cualquier otra manera.

El término "actividad de CLL-1" incluye cualquier efecto biológico de CLL-1. En ciertas modalidades, la actividad de CLL-1 incluye la capacidad de CLL-1 para interactuar o unirse a un sustrato o receptor.

El término "polinucleótido", "nucleótido" o "ácido nucleico" incluye polímeros de nucleótidos tanto monocatenarios como bicatenarios. Esto incluye preferiblemente polinucleótidos, nucleótidos o ácidos nucleicos aislados como se define en la presente descripción. Los nucleótidos que comprenden el polinucleótido pueden ser ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. Dichas modificaciones incluyen modificaciones de bases tales como derivados de bromouridina e inosina, modificaciones de ribosa tales como 2',3'-didesoxirribosa y modificaciones de enlaces internucleotídicos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fósforo-diselenoato, fósforo-anilotioato, fosforaniladato y fosforoamidato.

El término "oligonucleótido" se refiere a un polinucleótido que comprende 200 nucleótidos o menos. Los oligonucleótidos pueden ser monocatenarios o bicatenarios, por ejemplo, para su uso en la construcción de un gen mutante. Los oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos sentido o antisentido. Un oligonucleótido puede incluir un marcador, incluido un radiomarcador, un marcador fluorescente, un hapteno o un marcador antigénico, para ensayos de detección. Los oligonucleótidos pueden usarse, por ejemplo, como cebadores de PCR, cebadores de clonación o sondas de hibridación.

El término "secuencia control" se refiere a las secuencias de polinucleótidos que afectan la expresión y procesamiento de las secuencias codificantes a las cuales están ligadas. La naturaleza de tales secuencias control dependen del organismo huésped. En modalidades particulares, las secuencias de control para procariotas pueden incluir un promotor, un sitio de unión al ribosoma y una secuencia de terminación de la transcripción. Por ejemplo, las secuencias de control para eucariotas pueden incluir promotores que comprenden uno o una pluralidad de sitios de reconocimiento para factores de transcripción, secuencias potenciadoras de la transcripción y secuencias de terminación de la transcripción. Las "secuencias de control" pueden incluir secuencias líder (péptidos señal) y/o secuencias de pareja de fusión.

En algunas modalidades, el polinucleótido de la presente enseñanza codifica un CAR o un TCR que además comprende una secuencia líder o un péptido (también denominado en la presente descripción "péptido señal"). En ciertas modalidades, el péptido líder comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos MAPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 144). En algunas modalidades, el péptido líder comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 144.

Como se usa en la presente, "enlazado operativamente" significa que los componentes a los que se aplica el término están en una relación que les permite llevar a cabo sus funciones inherentes en condiciones adecuadas.

El término "vector" significa cualquier molécula o entidad (por ejemplo., ácido nucleico, plásmido, bacteriófago o virus) usado para transferir información de codificación de proteínas a una célula huésped. El término "vector de expresión" o "construcción de expresión" se refiere a un vector que es adecuado para la transformación de una célula huésped y contiene secuencias de ácido nucleico que dirigen y/o controlan (junto con la célula huésped) la expresión de uno o más regiones codificantes heterólogas enlazadas operativamente a la misma. Una construcción de expresión puede incluir, entre otros, secuencias que afectan o controlan la transcripción, la traducción y, si hay intrones presentes, afectan el corte y empalme del ARN de una región codificante enlazada operativamente a la misma.

El término "célula huésped" se refiere a una célula que se ha transformado, o es capaz de transformarse, con una secuencia de ácido nucleico y, por lo tanto, expresa un gen de interés. El término incluye la progenie de la célula progenitora, ya sea que la progenie sea o no idéntica en morfología o en composición genética a la célula progenitora original, siempre que el gen de interés esté presente.

El término "transformación" se refiere a un cambio en unas características genéticas de las células, y una célula se ha transformado cuando se ha modificado para contener nuevo ADN o ARN. Por ejemplo, una célula se transforma cuando se modifica genéticamente a partir de su estado nativo mediante la introducción de nuevo material genético mediante transfección, transducción u otras técnicas. Después de la transfección o transducción, el ADN transformante puede recombinarse con el de la célula para integrarse físicamente en un cromosoma de la célula, o puede mantenerse transitoriamente como un elemento episomal sin replicarse, o puede replicarse independientemente como un plásmido. Una célula se considera que se ha "transformado de forma estable" cuando el ADN transferido se replica con la división de la célula.

El término "transfección" se refiere a la captación de ADN extraño o exógeno por una célula. Un número de técnicas de transfección se conocen bien en la técnica y se describen en la presente descripción. Vea, por ejemplo, Graham y otros, 1973, Virology 52:456; Sambrooky otros, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis y otros, 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu y otros, 1981, Gene 13:197.

El término "transducción" se refiere al proceso de manera que se introduce ADN extraño en una célula a través de un vector viral. Vea Jones y otros, (1998). Genetics: principles and analysis. Boston: Jones & Bartlett Publ.

Los términos "polipéptido" o "proteína" se refieren a una macromolécula que tiene la secuencia de aminoácidos de una proteína, que incluye las deleciones, adiciones y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de la secuencia nativa, y preferentemente no más de 8 sustituciones de aminoácidos en el mismo. Preferentemente, los polipéptidos o proteínas se aíslan como se define en la presente descripción. Los términos "polipéptido" y "proteína" abarcan específicamente moléculas de unión al antígeno CLL-1, anticuerpos o secuencias que tienen deleciones, adiciones y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de la proteína de unión al antígeno, y preferentemente no más de 8 sustituciones de aminoácidos en el mismo. El término "fragmento de polipéptido" se refiere a un polipéptido aislado que tiene una deleción amino-terminal, una deleción carboxilo-terminal, y/o una deleción interna en comparación con la proteína nativa de longitud completa. Dichos fragmentos también pueden contener aminoácidos modificados en comparación con la proteína nativa. Los fragmentos polipeptídicos útiles incluyen fragmentos inmunológicamente funcionales de moléculas de unión a antígeno. Los fragmentos útiles incluyen, entre otros, una o más regiones CDR, dominios variables de una cadena pesada y/o ligera, una porción de otras porciones de una cadena de anticuerpo y similares.

El término "aislado" significa (i) libre de al menos algunas otras proteínas con las que normalmente se encontraría, (ii) esencialmente libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, de la misma especie, (iii) separado de al menos aproximadamente el 50 por ciento de polinucleótidos, lípidos, carbohidratos u otros materiales con los que está asociado en la naturaleza, (iv) asociado operativamente (por interacción covalente o no covalente) con un polipéptido con el que no está asociado en la naturaleza, o (v) no ocurre en la naturaleza.

Una "variante" de un polipéptido (por ejemplo, una molécula de unión a antígeno o un anticuerpo) comprende una secuencia de aminoácidos en donde uno o más residuos de aminoácidos se insertan, eliminan y/o sustituyen en la secuencia de aminoácidos con relación a otra secuencia de polipéptido. Las variantes incluyen proteínas de fusión.

El término “identidad” se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más moléculas de polipéptidos o dos o más moléculas de ácido nucleico, según se determina mediante la comparación de las secuencias. "Por ciento de identidad" significa el porcentaje de residuos idénticos entre los aminoácidos o nucleótidos en las moléculas comparadas y se calcula en base al tamaño de la molécula más pequeña que se compara. Para estos cálculos, las brechas en las alineaciones (si las hay) se abordan preferentemente mediante un modelo matemático o programa de computadora en particular (es decir, un "algoritmo").

Para calcular el por ciento de identidad, las secuencias que se comparan típicamente se alinean de forma que proporcionen la mayor coincidencia entre las secuencias. Un ejemplo de un programa de computadora que puede usarse para determinar el por ciento de identidad es el paquete de programas GCG, que incluye GAP (Devereux y otros, 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Grupo de Computación Genética, Universidad de Wisconsin, Madison, Wis.). El algoritmo informático GAP se usa para alinear los dos polipéptidos o polinucleótidos para los que se va a determinar el por ciento de identidad de secuencia. Las secuencias se alinean para una coincidencia óptima de su aminoácido o nucleótido respectivo (el "intervalo coincidente", según lo determina el algoritmo). En ciertas modalidades, una matriz de comparación estándar (vea, Dayhoff y otros, 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 para la matriz de comparación P^aM 250; Henikoff y otros, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919 para la matriz de comparación BLOSUM 62) también es usado por el algoritmo.

Como se usa en la presente, los veinte aminoácidos convencionales (por ejemplo., que aparecen naturalmente) y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Vea Immunology - A Synthesis (2da edición, Golub and Gren, Eds., Sinauer Assoc., Sunderland, Mass. (1991)). Los estereoisómeros (por ejemplo, los D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, los aminoácidos no naturales tales como alfa-, aminoácidos alfa-disustituidos, aminoácidos N-alquilo, ácido láctico, y otros aminoácidos no convencionales podrían ser también componentes adecuados para polipéptidos de la presente enseñanza. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, gammacarboxiglutamato, épsilon-N,N,N-trimetil lisina, e-N-acetil lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, sigma-N-metilarginina, y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la anotación de polipéptido que se usa en la presente descripción, la dirección a la izquierda es la dirección del amino terminal y la dirección a la derecha es la dirección del carboxilo terminal, de acuerdo con el uso y convención estándar.

Las sustituciones conservadoras de aminoácidos además abarcan residuos de aminoácidos no naturales, que se incorporan típicamente mediante síntesis química de péptidos en lugar de síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomiméticos y otras formas inversas o invertidas de residuos de aminoácidos. Los residuos de origen natural se dividen en grupos en base a las propiedades comunes de la cadena lateral:

(a) a)hidrófobo: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(b) b) hidrófilo neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(c) c) ácido: Asp, Glu;

(d) d) básico: His, Lys, Arg;

(e) e) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y

(f) f) aromático: Trp, Tyr, Phe.

Por ejemplo, las sustituciones no conservadoras, en algunos aspectos, implican el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Dichos residuos sustituidos pueden introducirse, por ejemplo, en regiones de un anticuerpo humano que son homólogas con anticuerpos no humanos, o en las regiones no homólogas de la molécula. Las sustituciones ilustrativas de los aminoácidos se establecen en la Tabla 3.

Tabla 3

El término "derivado" se refiere a una molécula que incluye una modificación química distinta de una inserción, deleción o sustitución de aminoácidos (o ácidos nucleicos). En ciertas modalidades, los derivados comprenden modificaciones covalentes que incluyen, entre otros, enlaces químicos con polímeros, lípidos u otros residuos orgánicos o inorgánicos. En determinadas modalidades, una molécula de unión a antígeno modificada químicamente puede tener una semivida en circulación mayor que una molécula de unión a antígeno que no está modificada químicamente. En algunas modalidades, una molécula de unión a antígeno derivada se modifica covalentemente para incluir una o más uniones poliméricas solubles en agua, que incluyen, entre otros, polietilenglicol, polioxietilenglicol o polipropilenglicol.

Los análogos peptídicos se usan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a las del péptido molde. Estos tipos de compuesto no peptídicos se denominan "miméticos de péptidos" o "peptidomiméticos". Fauchere, J., Adv. Drug Res., 15:29 (1986); Veber & Freidinger, TINS, p.392 (1985); y Evans y otros, J. Med. Chem., 30:1229 (1987).

Una "cantidad terapéuticamente efectiva", "dosis efectiva", "cantidad efectiva" o "dosis terapéuticamente efectiva" de un agente terapéutico, por ejemplo, células CAR T modificadas, es cualquier cantidad que, cuando se usa sola o en combinación con otro agente terapéutico, protege a un sujeto contra la aparición de una enfermedad o promueve la regresión de la enfermedad evidenciada por una disminución en la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y la duración de los períodos libres de síntomas de la enfermedad, o la prevención del deterioro o discapacidad debido a la aflicción de la enfermedad. La capacidad de un agente terapéutico para promover la regresión de la enfermedad puede evaluarse mediante el uso de una variedad de métodos conocidos por el médico experto, tal como en sujetos humanos durante ensayos clínicos, en sistemas de modelos animales que predicen la eficacia en humanos, o mediante el análisis de la actividad del agente en ensayos in vitro.

Los términos "paciente" y "sujeto" se usan indistintamente e incluyen sujetos humanos y animales no humanos, así como también aquellos con trastornos formalmente diagnosticados, aquellos sin trastornos formalmente reconocidos, aquellos que reciben atención médica, aquellos en riesgo de desarrollar los trastornos, etc.

El término "tratar" y "tratamiento" incluye tratamientos terapéuticos, tratamientos profilácticos y aplicaciones en las que se reduce el riesgo de que un sujeto desarrolle un trastorno u otro factor de riesgo. El tratamiento no requiere la curación completa de un trastorno y abarca las modalidades en las que se reducen los síntomas o los factores de riesgo subyacentes. El término "prevenir" no requiere la eliminación del 100 % de la posibilidad de un evento. Más bien, denota que la posibilidad de que ocurra el evento se ha reducido en presencia del compuesto o método.

Las técnicas estándar pueden usarse para el ADN recombinante, la síntesis de oligonucleótidos, y el cultivo y transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación pueden realizarse de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se realiza comúnmente en la técnica o como se describió en la presente descripción. Las técnicas y procedimientos anteriores generalmente pueden realizarse de acuerdo con los métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describió en diversas referencias generales y más específicas que se mencionan y discuten a lo largo de la presente descripción. Vea, por ejemplo, Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2da ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).

Los siguientes ejemplos, que incluyen los experimentos realizados y los resultados obtenidos, se proporcionan con fines ilustrativos.

Ejemplo 1

Determinación de la actividad CAR de CLL-1 mediante electroporación de ARNm en PBMC humanas. Los plásmidos que codifican un promotor T7, una construcción CAR y una secuencia estabilizadora de globina beta se linealizaron mediante digestión de 10 ug de ADN con EcoRI y BamHI (NEB) durante la noche. Luego se digirió el ADN durante 2 horas a 50 °C con proteinasa K (Thermo Fisher™, 600 U/ml) purificado con fenol/cloroformo y precipitado por adición de acetato de sodio y dos volúmenes de etanol. A continuación, los sedimentos se secaron, se resuspendieron en agua libre de ARNasa/ADNasa y se cuantificaron. A continuación, se usó 1 ug del ADN lineal para generar la transcripción in vitro mediante el uso de mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra (Thermo Fisher™) según las instrucciones del fabricante. El ARN se purificó aún más mediante el uso del kit MEGAClear (Thermo Fisher™) según las instrucciones del fabricante, y se cuantificó mediante el uso de NanoDrop™. La integridad del ARNm se evaluó en una corrida en gel de agarosa.

Se evaluaron diferentes líneas celulares de cáncer para determinar la expresión de CLL-1. Las células Namalwa (ATCC), U937 (ATCC), HL-60 (ATCC), EoL-1 (Sigma), KG1a (ATCC) y MV4;11 (ATCC) se tiñeron con anticuerpo anti CLL-1 conjugado con PE (BD Pharmingen™) en tampón de tinción (BD Pharmingen™) durante 30 minutos a 4 °C. A continuación, las células se lavaron y se resuspendieron en tampón de tinción con yoduro de propidio (BD Pharmingen™) antes de la adquisición de datos. Luego, las muestras se adquirieron mediante citometría de flujo y los datos se analizaron y trazaron en histogramas mediante el uso de FlowJo.™. Los resultados de la expresión de CLL-1 pueden verse en la Figura 1.

Las PBMC se aislaron de leucopacos de donantes sanos (Hemacare™) mediante el uso de centrifugación de densidad con Ficoll-Paque según las instrucciones del fabricante. Las PBMC se estimularon mediante el uso de OKT3 (50 ng/ml, Miltenyi Biotec™) en medio RIO IL-2 (300 UI/ml, Proleukin®, Prometheus® Terapéutica y Diagnóstico). Siete días después de la estimulación, las células T se lavaron dos veces en Opti-MEM™ (Thermo Fisher Scientific™) y se resuspendió a una concentración final de 2,5*107 células/ml en Opti-MEM. Se usaron 10 |jg de ARNm por electroporación. La electroporación de las células se realizó mediante el uso de un sistema Gemini X2 (Harvard Apparatus BTX™) configurado para suministrar un solo pulso de 400 V durante 0,5 ms en cubetas de 2 mm (Harvard Apparatus BTX™). Las células se transfirieron inmediatamente a medio R10 IL-2 y se dejaron recuperar. Las células se mantuvieron a 0,5-2,0 * 106 células/ml antes de su uso en ensayos de actividad.

Seis horas después de la electroporación del ARNm, las células T se tiñeron con Proteína L biotinilada (Thermo Scientific™) en tampón de tinción (BD Pharmingen™) durante 30 minutos a 4 °C. A continuación, las células se lavaron y tiñeron con PE Streptavidina (BD Pharmingen™) en tampón de tinción durante 30 minutos a 4 °C. Luego, las células se lavaron y se resuspendieron en tampón de tinción con yoduro de propidio (BD Pharmingen™) antes de la adquisición de datos. Los resultados de la detección de CAR se muestran en la Figura 2.

Las células efectoras se cultivaron con células objetivos en una relación E:T de 1:1 en medio R10, 6 horas después de la electroporación del ARNm. Las líneas celulares probadas incluyeron Namalwa, U937, HL-60, EoL-1, KG1a y MV4;11. Dieciséis horas después del cocultivo, los sobrenadantes se analizaron por Luminex (EMD Millipore) según las instrucciones del fabricante y la viabilidad de las células objetivo se evaluó mediante análisis de citometría de flujo de la captación de yoduro de propidio (PI). Los resultados correspondientes al ensayo de liberación de citocinas pueden encontrarse en la Figura 3. Los resultados del ensayo de actividad citolítica pueden encontrarse en la Figura 4 y la Figura 5.

Ejemplo 2

Determinación de la actividad CAR de CLL-1 por transducción lentiviral de PBMC humanas. Se usó un vector de transferencia lentiviral de tercera generación que contiene la construcción CLL-1 CAR diferente junto con la mezcla de empaquetamiento de lentivirus ViraPower™ Lentiviral Packaging Mix (Life Technologies™) para generar los sobrenadantes lentivirales. Brevemente, se generó una mezcla de transfección al mezclar 15 ug de ADN y 22,5 ul de polietilenimina (Polysciences™, 1 mg/ml) en 600 ul de medio OptiMEM™. La mezcla se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Simultáneamente, las células 293T (ATCC) fueron tripsinizadas, contadas y un total de 10*106 células totales se sembraron en un matraz T75 a lo largo de la mezcla de transfección. Tres días después de la transfección, se recogieron los sobrenadantes y se filtraron a través de un filtro de 0,45 um y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

Las PBMC se aislaron de leucopacos de donantes sanos (Hemacare™) mediante el uso de centrifugación de densidad con Ficoll-Paque según las instrucciones del fabricante. Las PBMC se estimularon mediante el uso de OKT3 (50 ng/ml, Miltenyi Biotec™) en medio RIO IL-2 (300 UI/ml, Proleukin®, Prometheus® Terapéutica y Diagnóstico). Cuarenta y ocho horas después de la estimulación, las células se transdujeron mediante el uso de lentivirus a una MOI = 10. Las células se mantuvieron a 0,5-2,0 * 106 células/ml antes de su uso en ensayos de actividad.

En el día 12 después de la estimulación, las células T se tiñeron con Proteína L biotinilada (Thermo Scientific™) en tampón de tinción (BD Pharmingen™) durante 30 minutos a 4 °C. A continuación, las células se lavaron y tiñeron con PE Streptavidina (BD Pharmingen™) en tampón de tinción durante 30 minutos a 4 °C. Luego, las células se lavaron y se resuspendieron en tampón de tinción con yoduro de propidio (BD Pharmingen™) antes de la adquisición de datos. Los resultados de la detección de CAR se muestran en la Figura 6.

Las células efectoras se cultivaron con células objetivo en una relación E:T de 1:1 en medio R10, 12 días después de la estimulación de las células T. Las líneas celulares probadas incluyeron Namalwa, U937, HL-60, EoL-1, KG1a y MV4;11. 16 horas después del cocultivo, los sobrenadantes fueron analizados por Luminex (EMD Millipore™) según las instrucciones del fabricante y la viabilidad de las células objetivo se evaluó mediante análisis de citometría de flujo de la absorción de yoduro de propidio (PI). Los resultados correspondientes al ensayo de liberación de citocinas pueden encontrarse en la Figura 7. Los resultados del ensayo de actividad citolítica pueden encontrarse en la Figura 8.

Ejemplo 3

Ratones hembra Jackson NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1wjl/SzJ) de 5-6 semanas de edad se usaron en este estudio. Los ratones recibieron una dieta para roedores Harlan 2918.15 irradiada y agua adlibitum. Los ratones fueron alojados en jaula ventilada desechable Innovive™ con cama de mazorca de maíz dentro de salas limpias Biobubble® que proporcionan aire filtrado HEPA en el entorno de burbujas a 100 cambios de aire completos por hora. Todos los tratamientos, las determinaciones del peso corporal y las mediciones del tumor se llevaron a cabo en el entorno de la burbuja. El ambiente se controló a un rango de temperatura de 70±2 °F y un rango de humedad de 30-70 %. Todos los procedimientos se realizaron de conformidad con todas las leyes, reglamentos y directrices de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y con la aprobación del Comité de uso y cuidado de animales de Molecular Imaging, Inc.

Preparación de células tumorales

Las células U937-luc se obtuvieron en Solución de conservación Lifor®. Las células se centrifugaron a 200 rcf durante 8 minutos a 4 °C, se aspiró el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) fría mediante pipeteo. Se diluyó una alícuota de la suspensión celular homogénea en una solución de azul tripán y se contó mediante el uso de un contador de células automático Luna™. La suspensión celular se centrifugó a 200 rcf durante 8 minutos a 4 °C. Se aspiró el sobrenadante y se resuspendió el sedimento celular en medio frío sin suero para generar las concentraciones finales de células/ml que excluyen tripán. La suspensión celular se mantuvo en hielo húmedo durante la implantación. A los animales de prueba se les implantaron 1,00E+06 células por vía intravenosa a través de la vena lateral de la cola el día 0 en 0,2 ml mediante el uso de una aguja de calibre 27 y una jeringa.

Preparación de células T CAR

Se obtuvieron células T de acuerdo con las enseñanzas, se congelaron en hielo seco y se almacenaron en nitrógeno líquido. El día del tratamiento, los crioviales proporcionados se retiraron del almacenamiento criogénico y se descongelaron en un baño de agua a 37 °C. Para cada grupo, las células T proporcionadas se combinaron en un solo tubo cónico de 50 ml con RPMI 1640 tibio complementado con FBS al 10 %. Los tubos crioviales se enjuagaron con RPMI 1640 tibio con FBS al 10 % para minimizar la pérdida de células hasta alcanzar un volumen total de 50 ml en cada tubo cónico. Cada tubo cónico de 50 ml se centrifugó a 200 rcf durante 8 minutos a 4 °C. Los sobrenadantes se aspiraron y los sedimentos celulares se resuspendieron en 10 ml de DPBS a temperatura ambiente. Se diluyó una alícuota de la suspensión celular homogénea en una solución de azul tripán y se contó manualmente mediante el uso de un hemocitómetro. Las suspensiones celulares se centrifugaron de nuevo a 200 rcf durante 8 minutos a 4 °C. Los sobrenadantes se aspiraron y los sedimentos celulares se resuspendieron en DPBS a temperatura ambiente para generar las concentraciones finales requeridas. Las suspensiones celulares se mantuvieron en hielo húmedo durante la administración del tratamiento.

Imágenes de bioluminiscencia

La formación de imágenes por bioluminiscencia (BLI) in vivo se realizó mediante el uso de un IVIS Spectrum (Perkin Elmer, Hopkinton, MA). Se obtuvieron imágenes de hasta 5 animales a la vez bajo anestesia con gas isoflurano ~1-2 %. A cada ratón se le inyectó IP 150 mg/kg (15 mg/ml) de D-luciferina y se tomaron imágenes en posición prona y luego en posición supina, 10 minutos después de la inyección. Se usó una lectura de píxeles de grande a pequeño del chip CCD y se ajustó el tiempo de exposición (de 2 segundos a 2 minutos) para obtener al menos varios cientos de recuentos por imagen y además para evitar la saturación del chip CCD. Las imágenes BLI se recopilaron los días 3, 11, 18 y 25. Las imágenes se analizaron mediante el uso del programa Living Image versión 4.5 (Perkin Elmer, Hopkinton, MA). Se colocaron ROI de volumen fijo de todo el cuerpo en imágenes prona y supina para cada animal individual, y se etiquetaron según la identificación del animal. La radiancia total expresada en fotones/s (p/s) se calculó y exportó para todas las regiones de interés para facilitar los análisis entre grupos. Los ROI en decúbito prono y en decúbito supino se sumaron para estimar la carga tumoral de todo el cuerpo.

Tratamiento

Todos los ratones se clasificaron en grupos de estudio en función de la estimación de la carga tumoral en todo el cuerpo derivada de BLI. Los ratones se distribuyeron para garantizar que la carga tumoral media para todos los grupos estuviera dentro del 10 % de la carga tumoral media general para la población de estudio. El tratamiento con células CAR T comenzó el día 3. A todos los ratones se les dosificó un volumen fijo de 0,2 ml. Los resultados se establecen en la Figura 10.

Evaluación de los efectos secundarios

Todos los animales fueron observados en busca de signos clínicos al menos una vez al día. Los animales se pesaron cada día de tratamiento. Los pesos corporales individuales se registraron 3 veces por semana.

Las siguientes secuencias ejemplificarán adicionalmente la enseñanza.

ADN de CD28T Extracelular, transmembrana, intracelular

CTTG AT A A T G A A A A G T C A A A C G G A AC A A T C ATTC ACGT GAAG G G

CAAG CACCTCTGTCCGTCACCCTTGTTCCCTGGTCCATCCAAGCCA

TTCTG GGTGTTGGTCGTAG TG GGTGGAGTCCTCGCTTGTTACTCTC

TG C TCG TCACC G TG G C TTTTATAATC TTC TG G G TTAG ATC C AAAAG

AAG CCG CCTG C TC C ATAG C G ATTAC ATG AATATG ACTC C AC G C C G

C C CTG G CCCCACAAG G AAACACTACCAG CCTTACG CACCACCTAG

AG ATTTCG CTG CCTATCG G AG C (SEQ ID NO. 1)

AA de CD28T Extracelular, transmembrana, intracelular

LD N E K SN G T IIH V KG K H LC P SPLFPGP SKPF W V L V V V G G VL AC Y SLL

V T V A F IIF W VRSKRSRLLHSD YM NM TPRRPG PTRKHY QP Y APPRDF A

AYRS (SEQ ID NO. 2)

ADN de CD28T - Extracelular

CTTG AT A A T G A A A A G T C A A A C G G A AC A A T C ATTC ACG T GAAG G G

CAAGCACCTCTG TCCG TCACCCTTG TTCCCTG G TCCATCCAAG CCA

(SEQ ID NO. 3)

AA de CD28T - Extracelular

LDNEKSNGTI IHVKGKHLCP SPLFPGPSKP (SEQ ID NO: 4)

ADN de Dominio transmembrana CD28

TTCTGGGTGTTGGTCGTAG TG GGTGGAGTCCTCGCTTGTTACTCTC

TG CTCG TCACCG TG G CTTTTATAATCTTCTG G G TT (SEQ ID NO. 5)

AA de Dominio transmembrana CD28

FWVLVVVGGV LACYSLLVTV AFIIFWV (SEQ ID NO: 6)

ADN de Dominio intracelular CD28

AG ATC C A AA AG A AG C C G C C TG C TC C ATAG C G ATTAC ATG A ATATG

ACTCCACGCCG CCCTG G CCCCACAAG G AAACACTACCAG CCTTAC

G CACCACCTAG AG ATTTCG CTG CCTATCG G AG C (SEQ ID NO. 7)

AA de Dominio intracelular CD28 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 8)

ADN de CD3 zeta

AG GGT G A AG TTTTC C AG ATC TG C A G A T GC AC C AGC GT A T C AG C AG

G G C C AG AAC C AACTG TATAAC G AG C TCAAC C TG G G ACG CAG G G A

AG AG TATG AC G TTTTG G AC AAG C G C AG AG G ACG G G AC C C TG AG A

T GGGTGGC AA A C C A A G A C G A A A A A A C C C CC AG GAGG GTCT CT AT

A A TG A G C TG C AG AAG G ATA AG A TG G C TG AAG C C TATTC TG AA AT

AG G C ATG AAAG G AG AG C G G AG AAG G G G AAAAG G G C AC G AC G G T

TTGT ACC AG G G ACTC AGC ACTG CT AC G A A G G A T AC TT A T GACGCT

CTCCACATG CAAG CCCTG CCACCTAG G (SEQ ID NO. 9)

AA de CD3 zeta

RVKFSRSADAPAYQ Q G Q NQ LYNELNLG RREEYDVLDKRRG RDPEM

G G KPR R KN PQ EG LYN ELQ KD KM AEAYSEIG M KG ERR R G KG H DG LY

Q G LSTATK D TY D ALH M Q A LPP R (SEQ ID NO. 10)

AA de CD3 zeta variante

R VKFSRSADAPAYKQ G Q NQ LYNELNLG RREEYDVLDKRRG RDPEM

G G KPR R KN PQ EG LYN ELQ KD KM AEAYSEIG M KG ERR R G KG H DG LY

Q G LSTATK D TY D ALH M Q A LPP R (SEQ ID NO. 146) ADN de CD28

ATTG AG G TG ATG TATC C AC C G C C TTAC C TG G ATAAC G AAAAG AG T

AAC G G TAC C ATC ATTC AC G TG AAAG G TAAACAC CTG TG TC C TTCT

CCCCTCTTCCCCGGGCCATCAAAGCCC (SEQ ID NO. 11)

AA de CD28

IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (SEQ ID NO: 12)

ADN de Dominio transmembrana y extracelular CD8

G C TG C AG C ATTG AG C AAC TC AATAATG TATTTTAG TC AC TTTG TAC

CAGTGTTCTTGCCG GCTAAGCCTACTACCACACCCGCTCCACGG C

CACCTACCCCAG CTCCTACCATCGCTTCACAGCCTCTGTCCCTGCG

CCCAGAGGCTTGCCGACCGGCCGCAGGGGGCGCTGTTCATACCAG

AG G ACTG G ATTTCGCCTGCGATATCTATATCTGGG CACCCCTGGC

CGGAACCTGCGGCGTACTCCTGCTGTCCCTGGTCATCACGCTCTAT

TG TAA TC A C A G G A AC (SEQ ID NO. 13)

AA de Dominio extracelular y transmembrana CD8

A A A L SN SIMYF SHF VPVFLP AKPTTTP APRPPTP APTIASQPL SLRPEA

CRP A A G G A VH TR G LDF A C D IY IW APL A G T C G V LLL SL Y IT L Y CNHRN

(SEQ ID NO. 14)

ADN del Clon HC24C1

CAGG TG CAGCTGCAGG AATCCGGACCGG GGCTGGTGAAGCCCAG

C G AG AC TCTG AG TC TCACG TG TAC AG TTTC TG G AG G TAG C ATTAG

C TCC TACTATTG G TCATG G ATAAG G CAG CCCCCCG G G AAG G G ATT

G G A ATG G ATC G G C TATATTTAC TAC AG TG G G AG C A C C A ATTAC AA

C C C C TC AC TG AA G TC TAG AG TTAC AATC AG C G TTG AC AC C TC AAA

G A A T C AG T TC A G TTTG A A ATTG TC T AGC GT C AC AGC AGC T G AT AC

AG CCG TCTATTATTG TG TTTCTCTG G TCTATTG CG G TG G G G ATTG T

T AC AG T GGCTTTGACT A T T GGGGGC AG GGT ACT CTGGTT AC AG TT

TCTTCC (SEQ ID NO. 15)

AA del Clon HC 24C1 (CDR subrayados)

OVOLO ESG PGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYW SW IROPPGKG LEW I

GY

IYYSG STNYNP SLKSRYTIS V D T SKNQF SLKL S S Y T A A D T A Y Y Y C Y SL

VYC G G D C YSG FD YW GOGTLVTVSS (SEQ ID NO. 16) AA del Clon HC 24C1 CDR1: GGSISSY (SEQ ID NO: 17)

AA del Clon HC 24C1 CDR2: YYSGS (SEQ ID NO: 18)

AA del Clon HC 24C1 CDR3: LVYCGGDCYS GFDY (SEQ ID NO: 19)

ADN del Clon LC 24C1

GACATCCAGTTG ACACAG AGCCCGAGTTCCTTG TCCGCCTCCGTC

GGGGAT AG AG T GT C A TTT ACCTGT C AGGCCTCTC AG G AT A T T A AT

AA C TTTC TG AATTG G TATC AG C AAAAG C C C G G AAAG G C AC C C AAG

CTGTTGATTTACGACGCCAG TAACCTGGAG ACAGG CG TGCCCTCC

CG G TTTAG TG G TAG CG G AAG CG G TACG G ATTTTACCTTTACTATC

AG C TC TC TC C AAC C C G AAG AC ATTG C AAC C TAC TATTG TC AAC AA

TATG G AAACCTG CCTTTTACATTTG G CG G CG G CACCAAG G TG G AG

ATTAA G C G G (SEQ ID NO. 20)

AA del Clon LC 24C1(CDR subrayados)

DIOLTOSPSSLSASVGDRVSFTCO ASO D IN N FLN W YO O KP G K A P K LLI

YD A S N LE TGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCOOYGNLPFT

FG G G TKVEIKR (SEQ ID NO. 21)

AA del Clon LC 24C1 CDR1: QASQDINNFLN (SEQ ID NO: 22)

AA del Clon LC 24C1 CDR2: DASNLET (SEQ ID NO: 23)

AA del Clon LC 24C1 CDR3: QQYGNLPFT (SEQ ID NO: 24)

ADN del Clon CAR 24C1 CD28T CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras

ATGG CACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCC

TGCACGCCGCACGCCCG CAGGTCCAACTGCAAGAAAGCGG ACCC

GGACTG GTG AAG CCTTCTG AG ACACTTAG TCTG ACG TG CACG G TC

AG TG G CG G CTCCATCTCCTCCTATTATTG G TCATG G ATACG ACAA

CCCCCAG G TAAG G G C C TG G AATG G ATTG G C TATATCTACTATTC A

G G AAG C AC G AAC TAC AATC CC AG CC TG AAG TC C CG AG TG AC AATT

T C AG T A G AT AC C AG T A A A A AC C AG TTC AG TC TT A A ACTG T C A AGC

G TG ACAGCTGCCG ACACCGCTGTGTATTACTGCGTCTCACTG GTG

T A T T GT GG AG G G G ATTG TT A T AGC GGGTTC GATT A T T GGGGAC AG

G GA AC C C T GGT GAC T GT ATC TT C C GGC GGC GGC GGC T C AGGGGGT

G G CG G TAGTGGCGG TGGGGG TTCCGATATTCAACTGACACAATCC

CCCAGCTCACTCAGCGCCAGCGTGGGGGACAGGGTTAGCTTTACC

TG TC AAG C C TC TC A G G A TATAA ATAA C TTTC TG AAC TG G TA TC A A

CAG AAG CCTG G G AAG G CG CCCAAACTCCTG ATCTATG ATG CG TCC

AACCTGG AAACTG GCGTGCCTTCACGCTTTAGCGGCTCTGGCAG T

G G TACAG ACTTCACTTTTACCATCTCTTCACTTCAG CCG G AG G ACA

TCG C CAC ATATTAC TG TC AAC AG TAC G G AAAC TTG C C CTTTAC TTT

TG G AG G CG G CACCAAAG TTG AAATCAAAAG G G CCG CTG CCCTG G

A T A AC G A A A AG AG C A A T GGGAC T A T A A T AC A T GTT A A A G G A A A A

CACCTGTGTCCATCTCCCCTGTTCCCTGG ACCG TCAAAG CCATTTT

GGGTGCTCGTGGTTGTCGGTGGCGTTCTCGCCTGTTATAGCTTGCT

GGT GAC AG T AGC CTTC A T T A T C TTTT GGGT G AG A T C C A A A A G A AG

CCG CCTGCTCCATAGCGATTACATGAATATGACTCCACGCCGCCC

TG G CCCCAC AAG G AAAC AC TAC C AG C C TTAC G C AC C AC CTAG AG A

TTTCG CTG CCTATCG G AG CAG G G TG AAG TTTTCCAG ATCTG CAG A

TG CACCAG CG TATCAG CAG G G CCAG AACCAACTG TATAACG AG CT

C AACC TG G G ACG CAG G G AAG AG TATG ACG TTTTG G ACAAG CG CA

GAGGAC GGGAC C C T GAG A T GGGT GGC A A AC C A A G AC G A A A A A AC

CCCC AGGAGGGTCTCT A T AATG AG CTG C A G A A G G A T AAG ATG G CT

G A AGC CT A TTC TG A A A T AGGC A T G A A AG G AG AGC G G AG A AGGGG

AAAAG G G CACG ACG G TTTG TACCAG G G ACTCAG CACTG CTACG A

AG G ATACTTATG ACG CTCTCCACATG CAAG CCCTG CCACCTAG G T

A A (SEQ ID NO. 25)

AA del Clon CAR 24C1 CD28T CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras (Péptido señal en negritas)

MALP VTALLLPL ALLLHAARPQ ^{VQLQESGPGL VKP SETL SLTCT V S}

GGSIS S Y Y W S W IRQ PPG KG LEW IG YIY Y S GSTNYNP SLK SRYTIS Y D T

SKNQF SLKL S S V T A A D T A V Y Y C V SL VYCG G DC YSGFD Y W GQGTL V

TVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVSFTCQASQDI

NNFLNW YQQKPGKAPKLLIYDASNLETG VPSRFSGSG SGTDFTFTISS

LQ P E D IA T Y Y CQQ Y GNLPFTF G G G T K V E IK R A A A LD N E K S N G TIIH V

KG KH LC PSPLFPG PSKPFW VLVVVG G VLAC YSLLVTVAFIIFW VR SK

RSRLLHSD YM NM TPRRPG PTRKHY QP Y APPRDF A A YRSRVKF SRS A

DAPAYQ Q G Q N Q LYN ELN LG R R EEYD YLD KR R G R DPEM G G KPR RKN

PQEGL Y N E L Q K D K M A E A Y SEIG M KG ERRRG KG HDG L Y QGLST A T K

D T Y D A LH M Q A LPP R (SEQ ID NO. 26)

ADN del Clon CAR 24C1 CD28T CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras

CAG G TCCAACTG CAAG AAAG CG G ACCCG G ACTG G TG AAG CCTTCT

GAGACACTTAGTCTGACG TG CACGGTCAGTGG CG GCTCCATCTCC

TC CTATTATTG G TCATG G ATACG ACAACCCCCAG G TAAG G G CCTG

G AATG G ATTG G C TA TATC TAC TATTC A G G A AG C AC G A AC TAC AA T

C C CAG C CTG AAG TC C C G AG TG AC AATTTC AG TAG ATACC AG TAAA

AACCAG TTCAG TC TTAAAC TG TC AAG C G TG AC AG C TG CC G AC AC C

GCTGTGTATTACTGCGTCTCACTG G TG TATTG TG G AG G G G ATTG TT

ATAG C G G G TTCG ATTATTG G G G ACAG G G AACCCTG G TG ACTG TAT

CTTCCGGCGGCGGCGGCTCAGGGGGTGGCGGTAGTGGCGGTGGG

G G TTCCG ATATTCAACTG ACACAATCCCCCAG CTCACTCAG CG CC

AGCGTGGGGGAC AGGGTT AG CTTT ACCTGT C AAGCCTCTC AG G AT

A T A A A T AAC TTTC TG AACTG G T A T C A A C AG AAG CCTG G G AAG G CG

CCCAAACTCCTG ATCTATG ATG CG TCCAACCTG G AAACTG G CG TG

CCTTCACG CTTTAG CG G CTCTG G CAG TG G TACAG ACTTCACTTTTA

C C ATCTCTTCACTTCAG CCG G AG G ACATCG CCACATATTACTG TCA

ACAG TAC G G AAAC TTG C C CTTTAC TTTTG G AG G C G G C AC C AAAG T

TG AA ATC AA AAG G G C C G C TG C C C TG G ATAAC G AAAAG AG C AATG

G G AC TATAATAC ATG TTAAAG G AAAAC AC C TG TG TC C ATC TC C C C

TGTTCCCTGGACCG TCAAAG CCATTTTGGG TG CTCGTGG TTGTCGG

TG G CG TTCTCG CCTGTTATAGCTTGCTGG TG ACAGTAGCCTTCATT

ATCTTTTG G G TG AG ATC C AAAAG AAG C C G C C TG CTC C ATAG CG AT

TAC ATG AATATG ACTCCACG CCG CCCTG G CCCCACAAG G AAACAC

TACCAG CCTTACG CACCACCTAG AG ATTTCG CTG CCTATCG G AG C

AGGGT G A AG TTTTC C AG ATCTG C AG A T GC AC C AGC GT A T C AGC AG

G G C C AG AACCAACTG TATAACG AG CTCAACCTG G G ACG CAG G G A

AG AG TATG ACG TTTTG G ACAAG CG CAG AG G ACG G G ACCCTG AG A

T GGGTGGC A A AC C A A G A C G A A A A A A C C C CC AGGAGGGTCTCT AT

A A T GAGC T GC A G A AG G AT A A G A T GGC T G A AGC C T A T T C T G A A AT

AG G CATG AAAG G AG AG C G G AG AAG G G G AAAAG G G C AC G AC G G T

TTG TAC C AG G G AC TC AG C AC TG C TAC G AAG G ATAC TTATG AC G C T

CTCCACATG CAAG CCCTG CCACCTAG G (SEQ ID NO. 27)

AA del Clon CAR 24C1 CD28T CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYW SW IRQPPGKGLEW I

G Y IYYSG STN YN PSLKSR VTISVD TSKN Q FSLKLSSVTAAD TAVYYC

V SLVY CGGDC Y SG FDYW GQ GTLVT V S SGGGGSGGGGSGGGGSDIQ

LTQ SPSSLSASVG DRVSFTCQ ASQ DINNFLNW YQ Q KPG KAPKLLIYD

ASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYGNLPFTFG

GGTK V E IK R A A A LD N E K SN G T IIH V K G K H LC P SPLFPGP SKPF W V L Y

V V G G VL AC Y SLL V T V A F IIF W VRSKRSRLLHSD YM NMTPRRPGPTRK

H Y QP Y APPRDF AA YR SR VKF SRS A D AP A Y QQGQNQL YNELN LG RR E

EY D VLD K RR G R D PEM G G KPRR KN PQ EG LYN ELQ KD KM AEAYSEIG

M KG ER R R G K G H D G LYQ G LS TATKD TYD ALH M Q ALPPR (SEQ ID NO.

28)

ADN del Clon CAR 24C1 CD28 CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras

ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCC

TGCACGCCGCACGCCCGCAGGTGCAGCTGCAGGAATCCGGACCG

G G G CTG GTGAAGCCCAGCGAGACTCTGAGTCTCACGTG TACAGTT

TCTG G AG G TAG C ATTAG CTC C TAC TATTG G TC ATG G ATAAG G C AG

C C CCCCG G G AAG G G ATTG G AATG G ATCG G CTATATTTACTACAG T

G G G AG C AC C AATTAC AAC C C CTC AC TG AAG TC TAG AG TTAC AATC

AG CG TT GAC ACCTC A A A G A ATC AG TT C AG TTT G AAATTG TC T AGC

G TCACAG CAG CTG ATACAG CCG TCTATTATTG TG TTTCTCTG G TCT

ATTGCGG TG GGGATTG TT AC AG T GGCTTTGACT ATTGGGGGC AG G

GT ACTCTGGTT AC AGTTTCTTCCGGGGGGGGAGGCTCTGGGGGCG

GAGGCTC AG GT GGT GGAGGC AG C GAC ATCC AG TT GAC AC AG AGC

CCGAGTTCCTTG TCCGCCTCCGTCGGG GATAG AGTGTCATTTACCT

G TC AG G CC TC TCAG G ATATTAATAAC TTTC TG AATTG G TATC AG C

AAAAG C CC G G AAAG G C AC C C AAG CTG TTG ATTTACG AC G C C AG T

AACCTGG AGACAGGCGTGCCCTCCCGGTTTAGTGG TAGCGGAAGC

G G TACG G ATTTTAC C TTTACTATC AG C TC TC TCC AAC CC G AAG AC A

TTG C AAC C TAC TATTG TC AA C A ATATG G AAA C C TG C C TTTTA C A TT

T GGCGGC GGC AC C A AG G T GGAG A T T A AGCGGGC GGC AGC T ATTG

AG G TG ATG TATC C AC C G C C TTAC C TG G ATAAC G AAAAG AG TAAC G

G TACCATCATTCACG TG AAAG G TAAACACCTG TG TCCTTCTCCCCT

CTTCCCCGGGCCATCAAAGCCCTTCTGGGTTCTTGTGGTCGTGGGA

G G CG TG CTTGCTTGTTATTCTCTGCTCGTTACCG TG GCGTTTATCA

TTTTTTG G G TTAG ATC C AAAAG AAG CC G C C TG C TCC ATAG C G ATT

AC ATG AATATG ACTCCACG CCG CCCTG G CCCCACAAG G AAACACT

ACCAG CCTTACG CACCACCTAG AG ATTTCG CTG CCTATCG G AG CA

GGGT G A AG TTTTC C AG ATCTG C A G A T GC ACC AGC GT A T C AGC AG G

G CCAG AAC C AAC TG TATAAC G AG C TC AAC CTG G G AC G C AG G G AA

G AG TATG ACG TTTTG G ACAAG CG CAG AG G ACG G G ACCCTG AG AT

GGGT GGC AA AC C A A G A C G A A A A A A C C C C C AG GAGGGTCTCT A T A

A T GAGC T GC A G A AG G A T A A G A T GGC T G A AGC C T A T TC T G A A A T A

G G C ATG AAAG G AG AG CG G AG AAG G G G AAAAG G G C ACG AC G G TT

TG TACCAG G G ACTCAG CACTG CTACG AAG G ATACTTATG ACG CTC

TCCACATG CAAG CCCTG CCACCTAG G TAA (SEQ ID NO. 29)

AA del Clon CAR 24C1 CD28 CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras (Péptido señal en negritas)

M A L P V T A L L L P L A L L L H A A R P Q VQLQESGPGL VKP SETL SLTCT V S

GGSIS S Y Y W S W IR Q PPG KG LEW IG YIY Y S GSTNYNP SLK SRVTIS V D T

SKN QF SLKL S S V T A A D T A V Y Y C V SL V Y C GGDC Y S GFD Y W GQGTL V

TVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVSFTCQASQDI

NNFLNW YQQKPGKAPKLLIYDASNLETG VPSRFSGSG SGTDFTFTISS

LQ PEDI A T Y Y CQQ Y GNLPFTF G G G TK V E IK R A A A IE V M YPPP Y LD N E

K S N G TIIH VK G KH LC P SPLFPGPSKPFW VLVVV G G VLAC Y SLL V T V A

FIIFW VRSKRSRLLHSDYM NM TPRRPG PTRKHYQ PYAPPRDFAAYRS

RVKF SRS A D A P A Y Q Q G Q N Q LYNELNLG RREEYDVLDKRRG RDPEM

G G KPR R KN PQ EG LYN ELQ KD KM AEAYSEIG M KG ERR R G KG H DG LY

Q G LSTA TK D TY D ALH M Q A LPP R (SEQ ID NO. 30)

ADN del Clon CAR 24C1 CD28 CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras

CAGG TG CAG CTG CAG G AATCCG G ACCG G G G CTG G TG AAG CCCAG

C G AG AC TCTG AG TC TCACG TG TAC AG TTTC TG G AG G TAG C ATTAG

CTCCTACTATTG G TCATG G ATAAG G CAG CCCCCCG G G AAG G G ATT

G G A ATG G ATC G G C TATATTTAC TAC AG TG G G AG C AC C AATTAC AA

C C C C TC AC TG AAG TC TAG AG TTACAATC AG C G TTG AC AC CTC AAA

G A ATC AG TTC AG TTTG AAATTG TC TAG C G TC AC AG CAG C TG ATAC

AG CCGTCTATTATTG TG TTTCTCTG G TCTATTG CG G TG G G G ATTG T

T AC AG T GGCTTTGACT A TT GGGGGC AG GGT ACTCTGGTT AC AG TT

TCTTCCGGGGGGGGAGGCTCTGGGGGCGGAGGCTCAGGTGGTGG

AG GCAGCGACATCCAGTTG ACACAG AGCCCGAGTTCCTTG TCCGC

CTCCG TCGGG GATAGAGTGTCATTTACCTGTCAGGCCTCTCAGGA

T A TT A A T A AC TTTC TG AATT GGT A T C AGC AAAAG C CC G G AAAG G C

ACCCAAG CTG TTG ATTTACG ACG CCAG TAACCTG G AG ACAG G CG T

G CCCTCCCGGTTTAGTGG TAGCGGAAGCGG TACGGATTTTACCTT

TAC TATC AG C TC TCTC C AACC C G AAG ACATTG CAAC C TAC TATTG T

C AAC AATATG G AAAC CTG C C TTTTACATTTG G C G G C G G C AC C AAG

G TG G AG ATTAAG CG G G CG G CAG CTATTG AG G TG ATG TATCCACCG

C C TTAC C TG G ATAAC G AAAAG AG TAAC G G TAC C ATC ATTC AC G TG

AAAGG TAAACACCTG TG TCCTTCTCCCCTCTTCCCCG G G CCATCAA

AG CCCTTCTGGGTTCTTGTGGTCGTGGGAGGCGTGCTTGCTTGTTA

TTCTCTGCTCG TTACCG TG G CG TTTATCATTTTTTG G G TTAG ATCC

A A A A G A AGC C GC C T GC TC C A T AG C G ATT AC A T G A A T A T GAC T C C A

CGCCGCCCTGGCCCCACAAG GAAACACTACCAGCCTTACGCACCA

CCTAG AG ATTTCG CTG CCTATCG G AG CAG G G TG AAG TTTTCCAG A

TCTG CAG ATG CACCAG CG TATCAG CAG G G CCAG AACCAACTG TAT

AACG AG CTC AACCTGGGACGC AG G G AAG AG T A T GACG TTTTG G A

C A AGC GC AG AGGACGGGAC CC T G AG AT GGGT GGC A A AC C A AG AC

G A A A A A AC CC CC AG GAGG GT C TC T A T A A T GAGC T GC A G A AG G AT

A A G A T GGCTGAAGCCT A T T C T G A A A T AGGC A T G A AAG G AG AG C G

G AG AAG G G G AAAAG G G CACG ACG G TTTG TACCAG G G ACTCAG CA

CTG CTACG AAG G ATACTTATG ACG CTCTCCACATG CAAG CCCTG C

CACCTAGG (SEQ ID NO. 31)

AA del Clon CAR 24C1 CD28 CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYW SW IRQPPGKGLEW I

G YIYYSG STN YNPSLKSRVTISVDTSKN Q FSLKLSSVTAAD TAVYYC

Y S LY Y CGGDC Y SG FDYW G Q G TLVT V S SGGGGSGGGGSGGGGSDIQ

LTQ SPSSLSASVG DRVSFTCQ ASQ DINNFLNW YQ Q KPG KAPKLLIYD

ASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYGNLPFTFG

G G TK V E IK R A A A IE V M YPPP Y L D N E K SN G T IIH V K G KH LC P SPLFPGP

SKPF W V L V V V G G VL AC Y SLL V T V A F IIF W VRSKRSRLLHSD Y M N M T

PRRPGPTRKHY QP Y APPRDF AA YR SR VK F SRS A D AP A Y QQGQNQL Y

NELNLG R R EEYD VLDKR RG RD PEM G G KPR RKNPQ EG LYNELQ KD K

M A E A Y SEIGM KGERRRGKGHDGL Y QGLST A T K D T Y D A LH M Q A LP P R (SEQ ID NO. 32)

ADN del Clon CAR 24C1 CD8 CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras

ATGG CACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCC

TGCACGCCGCACGCCCGCAGGTGCAATTGCAAGAGTCCGGCCCCG

G ACTCG TTAAACCCAG TG AG ACG CTTAG CCTG ACCTG TACCG TCT

CAG G G G GCAG CATCTCCTCTTATTACTGG AGCTGGATCAGGCAG C

C TC C AG G AAAAG G C C TTG AATG G ATTG G G TACATCTACTACTC TG

G C TC AAC AAATTATAATC CATCC C TG AAG TC CC G C G TG AC TATCT

C TG TG G ACACC AG C AAG AATC AG TTTTC AC TG AAG TTG TC TAG TG

TTACCG CGGCCGACACCGCCGTATACTACTGTGTGTCTCTTG TG TA

CTGTGGCGGCGACTGCTATTCCGGGTTCGACTACTGGGGCCAAGG

GACTCTGGTAACCGTGTCCTCAGGCGGCGGCGGGTCAGGAGGAG

G CG GCAGTGGAGGTGGCGG CTCCGACATCCAGCTGACACAATCA

CCATCTTCCCTTTCAG CTTCAG TCG G G G ACAG AG TG TCCTTCACAT

G CCAG G CC AG C CAG G ATATCAATAAC TTC C TG AACTG G TAC CAAC

AG AAA C CC G G AAAG G C TC CAAAG CTC C TG ATC TATG ATG CTTC C A

ACCTGGAGACCGGCGTGCCCTCCAG GTTCAGTGGTTCAGG ATCAG

G CACTG ACTTTAC G TTC AC C ATATC C AG TC TTCAG C C CG AAG AC A

TTG C AAC C TATTAC TG C C AAC AATAC G G G AAC C TTCC C TTTAC ATT

CG G AG G C G G C AC C AAG G TG G AAATCAAAAG G G CTG C AG C ATTG A

G C AAC TC AATAATG TATTTTAG TCAC TTTG TACC AG TG TTCTTG C C

GGCTAAGCCTACTACCACACCCGCTCCACGGCCACCTACCCCAG C

TCCTACCATCGCTTCACAGCCTCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCTTGC

CGACCGGCCGCAG GGGGCGCTGTTCATACCAG AGGACTG GATTTC

GCCTGCGATATCTATATCTGGGCACCCCTGGCCGGAACCTGCGGC

GTACTCCTG CTG TCCCTG G TCATCACG CTCTATTG TAATCACAG G A

AC A G A T C C A A A A G A AGC CGC CTGCTCC A T AGC G ATT AC A T G A A T A

TGACTCCACGCCGCCCTGGCCCCACAAG GAAACACTACCAGCCTT

ACGCACCACCTAG AG ATTTCG CTG CCTATCG G AG CAG G G TG AAG T

TTTCCAG ATCTG CAG ATG CACCAG CG TATCAG CAG G G CCAG AACC

A AC T GT A T A AC GAGC T C A AC C T GGGAC GC AG G G A A G AG T A T GAC

G TTTTG G ACAAG CG CAG AG G ACG G G ACCCTG AG ATG G G TG G CAA

AC C AA G AC G AAAAAACC C C CAG G AG G G TC TC TATAATG AG C TG C

A G A AG G A T A A G A T GGC T G A AGC C T A TT C T G A A A T AGGC A T G A A A

G G AG AG CG G AG AAG G G G AAAAG G G CACG ACG G TTTG TACCAG G G

ACTC AG C ACTG C TAC G AAG G ATAC TTATG ACG CTC TC CACATG C A

AG CCCTG CCACCTAG G TAA (SEQ ID NO. 33)

AA del Clon CAR 24C1 CD8 CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras (Péptido señal en negritas)

M A L P V T A L L L P L A L L L H A A R P Q VQLQESGPGL VKP SETL SLTCT V S

GGSISS Y Y W SW IR Q PPG KG LEW IG YIYY SG STNYNPSLKSRVTISVDT

SKN QF SLKL S S V T A A D T A V Y Y C V SL V Y CGGD C YS GFD Y W GQG TL V

TVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVSFTCQASQDI

NNFLNW YQ Q KPG KAPKLLIYDASNLETG VPSRFSG SG SG TDFTFTISS

LQ PED IATYYC Q Q Y GNLPFTF G G G T K V E IK R A A A LS N SIMYF SHF VP V

FLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQ PLSLRPEACRPAAG G AVHTRG LDFA

C D IY IW APL AG T C G V L L L SL V IT L Y CNHRNRSKRSRLLHSD Y M N M T P

RRPGPTRKHYQ PYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQ Q G Q NQ LYN

ELN LG R R EEYD VLD KR R G R DPEM G G KPR R KN PQ EG LYN ELQ KD KM

A E A Y SEIGM KGERRRGKGHDGL Y QGLST A T K D T Y D A LH M Q A LP P R

(SEQ ID NO. 34)

ADN del Clon CAR 24C1 CD8 CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras

CAG G TG CAATTG CAAG AG TCCG G CCCCG G ACTCG TTAAACCCAG T

GAGACGCTTAGCCTGACCTGTACCGTCTCAGGGGG CAGCATCTCC

TCTTATTACTG G AG CTG G ATCAG G CAG CCTCCAG G AAAAG G CCTT

G AATG G ATTG G G TAC ATC TAC TAC TC TG G C TC A AC AA ATTATAA T

CCATCCCTG AAG TCCCG CG TG ACTATCTCTG TG G ACACCAG CAAG

AATCAG TTTTCACTG AAG TTG TCTAG TG TTACCG CG G CCG ACACC

GCCGTATACTACTGTGTGTCTCTTG TG TACTGTGGCGGCGACTG CT

ATTCCG GGTTCGACTACTGGG GCCAAGG GACTCTGGTAACCGTGT

CCTCAGGCGGCGGCGGGTCAGGAGGAGGCGGCAGTGGAGGTGGC

GGCTCCGACATCCAG CTG ACACAATCACCATCTTCCCTTTCAG CTT

CAG TCG G G G ACAG AG TG TCCTTCACATG CCAG G CCAG CCAG G ATA

TC AATAAC TTC C TG AAC TG G TAC C AAC AG AAAC C C G G AAAG G C TC

CAAAG CTCCTG ATCTATG ATG CTTCCAACCTG G AG ACCG G CG TG C

CCTCCAG G TTCAG TG G TTCAG G ATCAG G CACTG ACTTTACG TTCA

CCATATCCAG TCTTCAG CCCG AAG ACATTG CAACCTATTACTG CC

AACAATACG G G AAC CTTC C CTTTAC ATTC G G AG G C G G C ACC AAG G

T G G A A A T C A A A AGGGC T GC AGC ATTG AG C A AC TC A A T A A T GT ATT

TTAG TCACTTTG TACCAG TG TTCTTG CCG G CTAAG CCTACTACCAC

ACCCGCTCCACGG CCACCTACCCCAGCTCCTACCATCGCTTCACA

GCCTCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCTTGCCGACCGGCCGCAGGGGG

CG CTG TTCATACCAG AG G ACTG G ATTTCG CCTG CG ATATCTATATC

TGGGCACCCCTGGCCGGAACCTGCGGCGTACTCCTGCTGTCCCTG

GT C A T C ACGC TC T ATTG T A A T C AC AG G A AC AG A T C C A A A A G A AGC

CG CCTG CTCCATAG CG ATTACATG AATATG ACTCCACG CCG CCCT

G G C CCCACAAG G AAACACTACCAG CCTTACG CACCACCTAG AG AT

TTCG CTG CCTATCG G AG CAG G G TG AAG TTTTCCAG ATCTG CAG AT

G CACCAG CG TATCAG CAG G G CCAG AACCAACTG TATAACG AG CT

C AACC TG G G ACG CAG G G AAG AG TATG ACG TTTTG G ACAAG CG CA

GAGGAC GGGAC C C T G AG AT GGGT GGC A A AC C A A G AC G A A A A A AC

CCCC AGGAGGGTCTCT A T AATG AG CTG C A G A A G G A T AAG ATG G CT

G A AGC CT A TTC TG A A A T AGGC A T G A A AG G AG AGC G G AG A AGGGG

AAAAG G G CACG ACG G TTTG TACCAG G G ACTCAG CACTG CTACG A

AG G ATACTTATG ACG CTCTCCACATG CAAG CCCTG CCACCTAG G

(SEQ ID NO. 35)

AA del Clon CAR 24C1 CD8 CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras

QVQLQ ESG PGLVKPSETLSLTCTVSG GSISSYYW SW IRQPPGKGLEW I

GYIYYSGS TNYNP SLKSRVTIS V D T SKNQF SLKLS S V T A A D T A V Y Y C

V S LV Y CGGDC Y SGFD YW G Q G TLVT V S SGGGGSGGGGSGGGGSDIQ

LTQ SPSSLSASVG DRVSFTCQ ASQ DINNFLNW YQ Q KPG KAPKLLIYD

ASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYGNLPFTFG

G G T K V E IK R A A A LS N SIMYF SHF YPYFLPAKPTTTP APRPPTPAPTIAS

QPL SLRPE ACRP A AG G A VH TR G LDF A C D IY IW APL A G TC G V LLL SL V I

TLYCNHRNRSKRSRLLHSDYM NM TPRRPG PTRKHYQ PYAPPRDFAA

YRSRVKF SRS AD AP A Y QQGQNQL YN ELNLG RREEYDVLDKRRG RDP

EM G G KPR R KN PQ EG LYN ELQ KD KM AEAYSEIG M KG ERR R G KG H DG

LY Q G LS TA TK D T Y D A LH M Q A LP P R (SEQ ID NO. 36)

ADN del Clon CAR 24C1 CD28T CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras

ATGG CACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCC

TGCACGCCGCACGCCCG GATATCCAG CTCACGCAATCCCCCTCAA

GCTTGAGTGCCTCCGTGGGCGACCGGGTGTCCTTCACATGTCAGG

C A A G C C A A G A C A T A A A T A A T T T C C TG A A T T G G TA C C A A C A A A A A C

CCG G CAAG G CTCCCAAACTCCTG ATTTATG ATG CCTCCAATCTG G

AG ACCG G G G TCCCTTCTAG ATTCAG CG G AAG TG G CAG CG G CACA

G A C TTTAC ATTTAC TATC TC TTC TC TG C AAC C AG AG G ACATCG CC A

C ATACTATTG CCAG CAATACG G CAATCTG CCCTTCACCTTCG G AG

GCGGAACC A A G G T A G A A A T T AAAAG G G G C G G T GGAGGCTCCGGA

GGG GGGGGCTCTGGCGGAGGGGGCTCCCAAGTACAATTGCAGGA

G TCAG G G CCTG G ACTCG TG AAG CCTTCAG AAACTTTG TCACTG AC

ATG TACAG TG TCCG G CG G AAG CATTTCCAG TTACTATTG G TCCTG

G ATTAG AC AG C C AC C C G G C AAAG G AC TG G AATG G ATTG G ATATA

TC TAC TAC TC TG G ATC TA C AAA C TA TAATC C C A G C C TC A AATC C A

G G G TC AC TATTAG TG TG G ATAC ATC AAAG AATC AG TTC TC C TTG A

AG CTG AG CTCAG TCACTG CTG CCG ACACCG CAG TG TACTATTG TG

TG AG CCTGG TCTACTGCGGCGG AGATTG CTACAGCGGTTTCGATT

ACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTTACCGTTAGTTCCGCGGCTGCTC

TTG ATA AC G AG AAG TC C AA C G G TAC G A TTA TC C AC G TTAA G G G TA

AGCACCTTTGCCCTAGCCCGCTGTTCCCAGGCCCCAGTAAGCCCTT

TTGGGTCCTCGTTGTGGTAGGTGGGGTACTCGCCTGCTACTCCCTG

CTCG TCACTG TC G C ATTC ATC ATC TTCTG G G TC AG ATC C AAAAG A

AG CCG CCTG CTCCATAG CG ATTACATG AATATG ACTCCACG CCG C

C C TG G C CCCACAAG G AAACACTACCAG CCTTACG CACCACCTAG A

G ATTTCG CTG CCTATCG G AG CAG G G TG AAG TTTTCCAG ATCTG CA

G AT GC ACC AGCGT A T C AGC AGGGCC AG AAC C A ACTG T A T A A C G A

G CTCAACCTG G G ACG CAG G G AAG AG TATG ACG TTTTG G ACAAG C

G C AG AG G AC G G G ACC C TG AG ATG G G TG G C AAAC CAAG AC G AAAA

A AC CCC C AG GAGG GT C TC T A T A A T GAGCTGC A G A A G G AT A A G AT

GGCTGAAGCCT A T T C T G A A A T AGGC A T G AAAG G AG A G C G G A G AA

GGG GAAAAG GGC ACG ACG G TTTG T ACC AG GGACTC AGC ACTGCT

AC G AAG G ATACTTATG ACG CTCTCCACATG CAAG CCCTG CCACCT

A G G T A A (SEQ ID NO. 37)

M A L P V T A L L L P L A L L L H A A R P D IQ L T Q SP S SL S AS V G D R V SFTCQ AS

QDINNFLNW YQ Q KPG KAPKLLIYDASNLETG VPSRFSG SG SG TDFTF

TIS SLQPEDIAT YYCQ Q Y GNLPFTF GGGTKVEIKRGGGGSGGGGSGG

GGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYW SW IRQPPGKGL

EW IG YIYYSG STNYNP SLKSRVTIS V D T SKNQF SLKL S S V T A A D T A V Y

Y C V SL V Y CGGDC YSG FD YW G Q G TLVT V S S A A A LD N E K S N G T IIH V K

G KHLCPSPLFPG PSKPFW VLVVVG G VLACYSLLVTVAFIIFW VR SKR S

RLLHSDYM NM TPRRPG PTRKHYQ PYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADA

PAYQ Q G Q NQ LYNELNLG RREEYDVLDKRRG RDPEM G G KPRRKNPQ

E G LY N E LQ K D K M A E A Y SEIGM KGERRRGKGHDGL Y QGLST A T K D T

Y D A LH M Q ALPPR (SEQ ID NO. 38)

ADN del Clon CAR 24C1 CD28T CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras

G ATATCCAGCTCACG CAATCCCCCTCAAGCTTGAGTGCCTCCGTG

GGC GACC GGGT GT C CTT C AC A T GT C AGGC A AGCC A AG AC A T A A A T

AA TTTC C TG AA TTG G TAC C AAC A AAA AC C C G G C AAG G C TC C C AA A

CTCCTG ATTTATG ATG CCTCCAATCTG G AG ACCG G G G TCCCTTCTA

G ATTC AG CG G AAG TG G C AG CG G C AC AG AC TTTAC ATTTACTATC T

CTTCTC TG C AAC C AG AG G AC ATC G C CAC ATAC TATTG C C AG C AAT

ACG G CAATCTG CCCTTCACCTTCG G AG G CG G AACCAAG G TAG AAA

TTAAAAGG GGCGGTGGAGGCTCCGGAGGGGGGGGCTCTGGCGGA

G G G G GCTCCCAAGTACAATTGCAGGAGTCAGGG CCTGG ACTCG TG

AAG C C TTC AG AAAC TTTG TC AC TG ACATG TAC AG TG TC C G G C G G A

AG CATTTCCAG TTACTATTG G TCCTG G ATTAG ACAG CCACCCG G C

A A A G G A C TG G AA TG G A TTG G ATATA TC TAC TAC TC TG G ATC TAC A

AA C TA TAATC C C AG C C TC A AATC C AG G G TC AC TATTAG TG TG G AT

AC ATC AAAG AATC AG TTC TC C TTG AAG C TG AG C TC AG TC AC TG C T

GCCGACACCGCAG TGTACTATTGTGTGAG CCTGG TCTACTGCGGC

G G AG ATTG CTACAGCGGTTTCG ATTACTGGGG CCAG GGCACCCTG

G TTAC C G TTAG TTCCG CG G CTG CTCTTG ATAACG AG AAG TCCAAC

G G TACG ATTATCCACG TTAAG G G TAAG CACCTTTG CCCTAG CCCG

CTGTTCCCAGG CCCCAGTAAGCCCTTTTGGG TCCTCGTTGTGGTAG

GTGGGGTACTCGCCTGCTACTCCCTGCTCGTCACTGTCGCATTCAT

CATCTTC TG G G TCAG ATC C AAAAG AAG CC G C C TG C TCC ATAG C G A

TTAC ATG AATATG AC TC C AC G C C G C C CTG G CC C C AC AAG G AAAC A

CTACCAG CCTTACG CACCACCTAG AG ATTTCG CTG CCTATCG G AG

C AGGGT G AAG TTTTCC AG ATCTG C A G A T GC ACC AGCGT A T C AGC A

G G G CCAG AACCAACTG TATAACG AG CTCAACCTG G G ACG CAG G G

AAG AG TATG AC G TTTTG G ACAAG C G C AG AG G AC G G G AC CC TG AG

ATG G G TG G C AAAC C AAG AC G AAAAAAC C C C C AG G AG G G TC TC TA

T AATG AG CTG C A G A A G G A T A A G A T GGCTGAAGCCT A TTC T G A A A T

AG G C ATG AAAG G AG AG C G G AG AAG G G G AAAAG G G C AC G AC G G T

TTG TAC C AG G G AC TC AG C AC TG C TAC G AAG G ATAC TTATG AC G C T

CTCCACATG CAAG CCCTG CCACCTAG G (SEQ ID NO. 39)

AA del Clon CAR 24C1 CD28T CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras

DIQLTQ SPSSLSASVG DRVSFTCQ ASQ DINNFLNW YQ Q KPG KAPKLLI

Y D ASNLET GYP SRF S GS GS GTDF TFTIS SLQPEDI A T Y Y C QQ Y GNLPF T

FGGGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLT

CT VSGGSIS S Y Y W SW IRQ PPG KG LEW IG YIYYSG STNYNPSLKSRVTI

SVD TSKN Q FSLKLSSVTAADTAVYYC VSLVYCG G D CYSG FD YW G Q

G TL V T V S S A A A LD N E K S N G T IIH V K G K H LC P SPLFPGP SKPF W V L V V

YG G YLAC YSLLVTYAFIIFW YR SKR SR LLH SD YM N M TPR R PG PTR KH

Y QP Y APPRDF AA YR SR VKF SRS A D AP A Y QQGQNQL YNELNLG RREE

YD VLD KR R G R D PEM G G KPR R KN PQ EG LYN ELQ KD KM AEAYSEIG M

KG ER R R G KG H D G LYQ G LSTATKD TYD ALH M Q ALPPR (SEQ ID NO.

40)

ADN del Clon CAR 24C1 CD28 CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras

ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCC

TGCACGCCGCACGCCCGGATATCCAGCTGACCCAGTCTCCATCCT

CTTTGAGTGCCTCCGTGGGTGACCGCGTCTCTTTCACTTGCCAAGC

C AG C C AA G AC ATC AAC AAC TTTC TG AATTG G TAC C AG C AG AAAC C

AG G CAAAG CACCAAAG CTCCTCATCTACG ACG CCTCCAACCTG G A

AACCGGGGTGCCCAGCAGGTTTAGCGGGAGCGGTTCTGGCACGG

ATTTTACG TTCACCATCTCCTCTCTG CAG CCCG AG G ATATAG CTAC

TTATTACTG TCAG CAG TACG G G AATCTG CCATTTACTTTTG G G G G T

GGA AC T A AG GT G G A A A T C A A A AGGGGC GGC GGGGGA AGC GGGG

GCGGG GGCTCAGGTGGCGGAGGGAGCCAGGTGCAACTCCAGGAA

AG TG GCCCAGGATTGG TG AAG CCCAG CG AGACCCTTTCCCTTACT

TG TAC TG TTAG CG G AG G CAG CATAAG CAG CTACTATTG G TCCTG G

A T C AG AC AGCC ACC AG G G AAAG G G CTT G AATG G ATT GGCT AC A TT

TACTATTCCG G G TCCACCAACTACAACCCATCCCTCAAG TCCCG C

G TG ACAATTTC CG TC G AC AC AAG CAAG AAC C AG TTC TCC C TG AAA

C TTAG TAG CG TCACTG CTG CAG ATACAG CAG TG TACTATTG TG TC

AG CCTTGTCTACTGTGGCGGCGACTG CTACAGTGGCTTTGATTACT

GGGGACAGGGCACGCTCGTGACAGTGTCCAGCGCTGCGGCTATCG

AG GT A A T GT A T C C GC C AC C GT ATC T GG AC A AC G AG A AG T C T A A T G

GGACAATCATTCACG TG AAG G G G AAG CACCTG TG TCCATCCCCCC

TGTTTCCGG GTCCCAG TAAACCCTTCTGG GTGCTTG TTG TCGTTGG

CGGGGTGCTGGCCTGCTATTCCCTGCTGGTGACCGTCGCGTTTATT

ATTTTCTG G G TTAG ATCC AAAAG AAG C CG CC TG C TC CATAG C G AT

TACATG AATATG ACTCCACG CCG CCCTG G CCCCACAAG G AAACAC

TACCAG CCTTACG CACCACCTAG AG ATTTCG CTG CCTATCG G AG C

AGGGT G A AG TTTTC C AG ATCTG C A G A T GC AC C AGC GT A T C AGC AG

G G CCAG AACCAACTG TATAACG AG CTCAACCTG G G ACG CAG G G A

AG AG TATG ACG TTTTG G ACAAG CG CAG AG G ACG G G ACCCTG AG A

T GGGTGGC AA AC C A A G A C G A A A A A A C C C CC AGGAGGGTCTCT AT

A A T GAGC T GC A G A AG G AT A A G A T GGC T G A AGC C T A T T C T G A A AT

AG G C ATG AAAG G AG AG C G G AG AAG G G G AAAAG G G C AC G AC G G T

TTG TAC C AG G G AC TC AG C AC TG C TAC G AAG G ATAC TTATG AC G C T

CTCC ACATG C AAG CC C TG C CAC CTAG G TAA (SEQ ID NO. 41)

Q DINNFLNW YQ Q KPG KAPKLLIYDASNLETG VPSRFSG SG SG TDFTF

TISSLQ PEDIATYYCQQYGNLPFTFGGGTKVEIKRGGGGSGGGGSGG

GGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYW SW IRQPPGKGL

EW IG YIYYSG STNYNP SLKSRVTIS V D T SKNQF SLKL S S V T A A D T A V Y

Y C V SL V Y CGGDC YSGFD Y W GQGTL V T V S S AA A IE VM YP PP Y LD N E K

SN G T IIH V KG K H LC P SPLFPGP SKPF W V L V V V G G VL AC Y SLL V T V A F I

IF W VRSKRSRLLHSD YM N M TPRR PG PTR KH Y QP Y APPRDF A A YRSR

VK F SRS AD AP A Y Q Q G Q NQ LYNELNLG RREEYD VLDKRRG RDPEM G

GKPRRKNPQEGL Y N E LQ K D K M A E A Y SEIG M KG ERRRG KG HDG LY Q

G LS TATK D TY D A LH M Q ALPP R (SEQ ID NO. 42)

ADN del Clon CAR 24C1 CD28 CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras

G ATATCCAGCTG ACCCAGTCTCCATCCTCTTTGAGTGCCTCCGTGG

G TG ACCG CG TCTCTTTCACTTG CCAAG CCAG CCAAG ACATCAACA

AC TTTC TG AATTG G TA C C A G C AG A AAC C AG G C AAA G C AC C AAA G

CTCCTCATCTACGACGCCTCCAACCTG GAAACCGGGG TG CCCAG C

AG GTTTAG CG G G AG CG G TTCTG G CACG G ATTTTACG TTCACCATC

TCCTCTCTG CAG CCCG AG G ATATAG CTACTTATTACTG TCAG CAG T

AC G G G AATC TG C C ATTTAC TTTTG G G G G TG G AACTAAG G TG G AAA

TCAAAAGGGGCGGCGGGGGAAGCGGGGGCGGGGGCTCAGGTGGC

GGAGGGAGCC AG GT GC AAC TC C A G G A A A G T GGCCC AG G ATTG G T

G AAG CCCAG CG AG ACCCTTTCCCTTACTTG TACTG TTAG CG G AG G

CAG CATAAG C AG C TAC TATTG G TC CTG G ATC AG ACAG C C AC CAG G

G AAAG G G C TTG AATG G ATTG G C TAC ATTTAC TATTC C G G G TC C AC

C AACTACAACCCATCCCTCAAG TCCCG CG TG ACAATTTCCG TCG A

C AC AA G C AAG AAC C AG TTC TC CC TG AAAC TTAG TAG C G TC AC TG C

TG CAG ATACAG CAG TG TACTATTG TG TCAG CCTTG TCTACTG TG G C

GGCGACTG CTACAGTGGCTTTGATTACTGGG GACAG GGCACGCTC

G TG ACAGTGTCCAGCGCTGCGGCTATCGAG GTAATG TATCCGCCA

C C G TATC TG G AC AAC G AG AAG TC TAATG G G ACAATC ATTC AC G TG

AAGGGGAAGCACCTGTGTCCATCCCCCCTGTTTCCGGGTCCCAGT

AAACCCTTCTGGGTGCTTGTTGTCGTTGGCGGGGTGCTGGCCTGCT

ATTCCCTG CTG G TG ACCG TCG CG TTTATTATTTTCTG G G TTAG ATC

C AA AAG AAG C C G C C TG C TCC ATAG C G ATTAC ATG AATATG AC TCC

ACGCCGCCCTG GCCCCACAAGGAAACACTACCAG CCTTACGCACC

ACCTAG AG ATTTCG CTG CCTATCG G AG CAG G G TG AAG TTTTCCAG

ATCTGC A G A T GC AC C AGC GT A T C AGC AGGGC C A G A AC C A AC T GT A

TAACG AG CTCAACCTG G G ACG CAG G G AAG AG TATG ACG TTTTG G

AC AAGCGC AGAGGACGGGACC CTG AG AT GGGTGGC AA AC C A A G A

C G AA AAAACCCCC AG GAGG GTCTCT A T AATG AG CTG C AG A A G G A

T A A G A T GGC T G A AGC C T A T TC T G A A A T AGGC A T G A A AG GAGAGC

G G AG AAG G G G AAAAG G G C ACG ACG G TTT GT ACC AG GGACTC AGC

ACTG CTAC G AAG G ATAC TTATG AC G C TC TCC ACATG C AAG CC C TG

CCACCTAGG (SEQ ID NO. 43)

AA del Clon CAR 24C1 CD28 CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras

DIQ LTQ SPSSLSASVG DRVSFTCQ ASQ DINNFLNW YQ Q KPG KAPKLLI

Y D ASN LET GVP SRF S GS GS GTDF TFTIS SLQPEDI A T Y Y C QQ Y GNLPF T

FGGGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLT

CT VS GGSIS S Y Y W S W IRQ PPG KG LEW IG Y IY Y S GS TN YNP SLK SRVTI

SV D TS KN Q FSLKLSSVTAADTAVYYC VSLVYCG G D CYSG FD YW G Q

G TL V T V S S AAAIE VM YP PP Y LD N E K S N G TIIH V K G K H LC P SPLFPGP S

KPF W V L V V V G G VL AC Y SLL V T V A F IIF W VRSKRSRLLHSD Y M N M TP

RRPG PTRKHYQ PYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQ Q G Q NQ LYN

ELNLG R R EEYD VLD KR R G R DPEM G G KPR R KN PQ EG LYN ELQ KD KM

A E A Y SEIGM KGERRRGKGHDGL Y QGLST A T K D T Y D A LH M Q ALPPR

(SEQ ID NO. 44)

ADN del Clon CAR 24C1 CD8 CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras

ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCC

TGCACGCCGCACGCCCG GACATTCAATTG ACCCAGTCCCCTAGCA

GTCTCTCAGCAAGTGTGGGAGATAGGGTGTCATTCACCTGTCAGG

CTTCACAGGACATCAACAACTTCCTCAATTGGTATCAG CAGAAGC

C AGGGAAGGC AC C AAAGCTGC T C AT A T AT GACGC TT C AA AC CTTG

A A ACCGGAGT ACCT AGCCGCTTC AGCGGA AGCGGATC AGGGACT

GACTTCACTTTTACCATCTCTTCACTGCAGCCCGAAGACATCGCCA

CATACTACTGCCAGCAGTACGGAAACTTGCCTTTTACATTTGGGG

GCGGCACCAAAGTGGAGATTAAGCGAGGGGGAGGCGGCTCAGGA

GGCGGTGGCTCCGGAGGCGGGGGTTCCCAGGTCCAGCTCCAGGA

ATCCGGCCCAGGTCTGGTTAAGCCCAGTGAAACTTTGTCCCTCAC

GTGTACTGTGAGCGGTGGTTCAATCTCCTCATACTATTGGTCTTGG

ATACGGCAACCTCCTGGAAAGGGCCTCGAGTGGATCGGCTATATC

TACTATAG TGGCTCCACTAATTACAACCCTTCCCTCAAGTCCAGA

GTCACCATTTCCGTG GACACATCTAAGAACCAGTTCAGTCTG AAG

TTGTCCAGCGTTACAGCCGCAGACACAGCCGTTTATTACTGTGTGT

CTCTTGTTTACTGCGGGGGAGACTGTTATAGCGGCTTCGATTACTG

GGGCCAGGGCACCTTGGTCACAGTCTCTTCCGCGGCCGCCCTCTC

TAACAGTATTATGTACTTTTCTCATTTTGTACCCGTGTTCCTTCCCG

CTAAGCCAACTACTACCCCGGCCCCACGGCCGCCTACCCCTGCAC

CCACAATAGCCAGTCAGCCTTTGAGCCTGAGACCTGAGGCTTGTC

GGCCGGCTGCTGGGGGTGCAGTGCACACACGAGGTCTTGATTTTG

CTTGCGACATATACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGGACCTGTGGGG

TGCTGCTTCTGAGCTTGGTCATCACGCTCTATTGCAACCATCGCAA

CAGATCCAAAAG AAG CCG CCTG CTCCATAG CG ATTACATG AATAT

GACTCCACGCCGCCCTGGCCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTA

CGCACCACCTAGAGATTTCGCTGCCTATCGGAGCAGGGTGAAGTT

TTCCAGATCTGCAGATGCACCAGCGTATCAGCAGGGCCAGAACCA

ACTGTATAACGAG CTCAACCTGG GACGCAG GGAAGAGTATGACG

TTTTGGACAAGCGCAGAGGACGGGACCCTGAGATGGGTGGCAAA

CC AAG AC G AAAAAACC C C C AGGAGGGT C TCT AT A A T GAGCTGC A

G AAG G ATAAG ATG G CTG AAG CCTATTCTG AAATAG G CATG AAAG

GAGAGCGGAGAAGGGGAAAAGGGCACGACGGTTTGTACCAGGGA

CTCAGCACTGCTACGAAGGATACTTATGACGCTCTCCACATG CAA

GCCCTGCCACCTAGGTAA (SEQ ID NO 45)

Q DINNFLNW YQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTF

TISSLQPEDIATYYCQQYGNLPFTFGGGTKVEIKRGGGGSGGGGSGG

GGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYW SW IRQPPGKGL

EW IG YIYYSG STNYNP SLKSRVTIS V D T SKNQF SLKL S S V T A A D T A V Y

Y C V SL V Y CGGDC YSGFD Y W GQGTL V T V S S A A A L SN SIM YF SHF VP V

FLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA

C D IY IW APL AG T C G V LL L SL Y IT L Y CNHRNRSKRSRLLHSD Y M N M TP

RRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQ GQNQLYN

ELN LG R R EEYDVLDKRRG RDPEM G G KPRRKNPQ EG LYNELQ KDKM

A E A Y SEIGM KGERRRGKGHDGL Y QGLST A T K D T YD A LH M Q ALPPR

(SEQ ID NO. 46)

ADN del Clon CAR 24C1 CD8 CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras

G ACATTC AATTG AC C C AG TC C CC TAG CAG TC TC TC AG C AAG TG TG

GG AG AT AG GGT GTC A TT C ACCTGTC AGGCTTC AC AG G AC ATC AAC

AA C TTC C TC A ATTG G TATC AG C AG AAG C C AG G G AAG G C AC C AAA

G C TG C TCATATATG AC G C TTC AAAC C TTG AAAC CG G AG TACC TAG

C CG CTTCAG CG G AAG CG G ATCAG G G ACTG ACTTCACTTTTACCAT

C TCTTCACTG CAG CCCG AAG ACATCG CCACATACTACTG CCAG CA

G TACG G AAACTTG CCTTTTACATTTG G G G G CG G CACCAAAG TG G A

GATTAAGCGAGGGGGAGGCGGCTCAGGAGGCGGTGGCTCCGGAG

GCGGGGGTTCCCAGGTCCAGCTCCAGGAATCCGGCCCAGGTCTGG

TTAAG CCCAG TG AAACTTTG TCCCTCACG TG TACTG TG AG CG G TG

G TTCAATCTCCTCATACTATTG G TCTTG G ATACG G CAACCTCCTG G

AAAG G G CCTCG AG TG G ATCG G CTATATCTACTATAG TG G CTCCAC

TAATTACAAC C C TTC C C TC AAG TC C AG AG TCAC CATTTC C G TG G AC

AC ATC TAAG AAC CAG TTCAG TC TG AAG TTG TC C AG CG TTACAG C C

GCAG ACACAG CCG TTTATTACTG TG TG TCTCTTG TTTACTG CG G G G

GAGACTG TTATAG CG G CTTCG ATTACTG G G G CCAG G G CACCTTG G

TCACAG TCTCTTCCG CG G CCG CCCTCTCTAACAG TATTATG TACTT

TTCTCATTTTG TACCCG TG TTCCTTCCCG CTAAG CCAACTACTACC

CCGGCCCCACGGCCGCCTACCCCTGCACCCACAATAGCCAGTCAG

CCTTTGAGCCTGAGACCTGAGGCTTGTCGGCCGGCTGCTGGGGGT

G CAG TG CAC AC AC G AG G TC TTG ATTTTG CTTG C G ACATATAC ATC

TGGGCCCCTCTGGCCGGGACCTGTGGGGTGCTGCTTCTGAGCTTG

G TC ATC AC G C TC TATTG C AAC C ATC G C AAC AG ATC C AAAAG AAG C

CG CCTG CTCCATAG CG ATTACATG AATATG ACTCCACG CCG CCCT

G G CCCCAC AAG G AAAC AC TAC C AG C C TTAC G C AC C AC C TAG AG AT

TTCG CTG CCTATCG G AG CAG G G TG AAG TTTTCCAG ATCTG CAG AT

G CACC AG CG TATCAG C AG G G C CAG AAC CAAC TG TATAAC G AG C T

CAACC TG G G AC G C AG G G AAG AG TATG AC G TTTTG G AC AAG C G C A

GAGGAC GGGAC C C T G AG AT GGGT GGC A A AC C A A G AC G A A A A A AC

CCCC AGGAGG GTCTCT A T AATG AG C TG C A G A A G G A T AAG ATG G CT

G A AGC CT ATTC TG A A A T AGGC A T G A A AG G AG AG C G G AG A AGGGG

AAAAG G G C AC G AC G G TTTG TAC C AG G G AC TCAG C AC TG C TAC G A

AG G ATACTTATG ACG CTCTCCACATG CAAG CCCTG CCACCTAG G

(SEQ ID NO. 47)

AA del Clon CAR 24C1 CD8 CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras

D IQ LTQ SPSSLSASVG DRVSFTCQ ASQ DINNFLNW YQ Q KPG KAPKLLI

Y D ASNLET GVP SRF S GS GS GTDF TFTIS SLQPEDI A T Y Y C QQ Y GNLPF T

FGGGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLT

CT VS GGSIS S Y Y W S W IRQ PPG KGLEW IG Y IY Y S GS TN YNP SLK SRVTI

SVDTSKN Q FSLKLSSVTAD TAVYYC VSLVYC G G DC YSG FD YW G Q G T

L V T V S S A A A L SN SIMYF SHF VP VFLP AKPTTTP APRPPTP APTIASQPLS

LRPE ACRP A AG G A VH TR G LDF A C D IY IW APL AG T C G V LL L SL V IT L Y

CNHRNRSKRSRLLHSD YM NM TPRRPG PTRKHY QP Y APPRDF A AYRS

RVKF SRS A D A P A Y Q Q G Q NQ LYNELNLG REEYDVLDKRRG RDPEM G

GKPRRKNPQEGL Y N E LQ K D K M A E A Y SEIG M KG ERRRG KG HDG LY Q

G LSTATK D T Y D A L H M Q A LPPR (SEQ ID NO. 48)

ADN del Clon de cadena pesada (HC) 24C8

C AG GT AC AGCTGC AG G A A T CTGGGCCCGGACTT GT C AAG CC AA G T

C AG AC AC TTTC TC TTACATG TAC C G TG AG CG G C G G AAG TATAAG C

AG TG G AG G CTTTTACTG G TCTTG G ATACG G CAG CACCCAG G CAAA

G G C TTG G AG TG G ATTG G ATAC ATTC ATC ATTC AG G ATC TAC AC AC

TATAA TCC ATC C C TTAAG TC C C G G G TC AC C ATTAG CATTG ATAC G T

CTAAG AATCTG TTCAG TCTCAG G CTG TCCTCCG TCACTG CTG CCG A

CACAG CCGTGTACTACTGCGCCTCCTTGG TTTACTGCGG AGGCGA

CTGTT A T AG CG G CTTTG ATT A T T GGGGGC AGGGGACCCTCGT AAC

CGTGAGCTCT (SEQ ID NO. 48)

AA del Clon HC 24C8 (CDR en subrayado)

OVOLOESGPGLVKPSOTLSLTCTVSGGSISSGGFYW SW IROHPGKGL

E W IG Y IHHSGSTH YN PS LKS R VTIS ID TS KN LFS LR LSSV TAAD TAV YY

CASLYYC G G DC YSG FD YW GOGTLYTYSS (SEQ ID NO. 50)

AA del Clon 24C8 HC CDR1: GGSISSGGF (SEQ ID NO: 51)

AA del Clon 24C8 HC CDR2: HHSGS (SEQ ID NO: 52)

AA del Clon 24C8 HC CDR3: LVYCGGDCYS GFDY (SEQ ID NO: 53)

ADN del Clon de cadena ligera (LC) 24C8

G ATATCCAG CTCACTCAAAG CCCCTCTAG TCTCTCTG CCTCAG TG G

G G G ATC G G G TC AG TTTTAC TTG TC AAG CTTC AC AG G ATATC AAC A

AC TTC C TTAATTG G TATC AG C AG AAG C C AG G AAAAG C AC C C AAG C

TG C TCATCTATG ATG CCTCAAATTTG G AG ACG G G TG TTCCCAG TC

G ATTCTCTGGGTCAGG GTCCG GGACCGACTTTACGTTTACGATCTC

C TC TC TG C AG C C C G AAG AC ATC G C C AC ATACTATTG TC AAC AG TA

CG G CAACTTG CCTTTCACATTTG G G G G CG G G ACTAAG G TTG AAAT

C AAG AG G (SEQ ID NO. 54)

AA del Clon 24C8 LC (CDR en subrayado)

D IQ LTQ SP S SL S AS V G D R V SFTCQASQDINNFLNW YQ Q KPG K A P K L L I

YD A S N LE TGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCOOYGNLPFT

FG G G TKVEIKR (SEQ ID NO. 55)

AA del Clon 24C8 LC CDR1: QASQDINNFLN (SEQ ID NO: 56)

AA del Clon 24C8 LC CDR2: DASNLET (SEQ ID NO: 57)

AA del Clon 24C8 LC CDR3: QQYGNLPFT (SEQ ID NO: 58)

ADN del Clon CAR 24C8 CD28T CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras

ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCC

TGCACGCCGCACGCCCGCAGGTACAGCTGCAGGAATCTGGGCCCG

G AC TTG TC AAG C CAAG TC AG AC AC TTTCTC TTAC ATG TAC C G TG A

GCGGCGGAAGT A T AAG C AG T GGAGGCTTTT ACTG GTCTTGGAT AC

G G C AG CACCCAG G CAAAG G CTTG G AG TG G ATTG G ATACATTCATC

ATTC AG G ATC TAC AC AC TATAATCC ATC C C TTAAG TC C C G G G TC A

CCATTAG C ATTG ATAC G TC TAAG AATC TG TTCAG TC TC AG G C TG TC

CTCCGTCACTGCTGCCGACACAGCCGTGTACTACTGCGCCTCCTTG

GTTTACTGCG G AG G CG ACTG TTATAG CG G CTTTG ATTATTG G G G G

CAGGGGACCCTCGTAACCGTGAGCTCTGGAGGGGGTGGGAGCGG

GGGAGGAGGTT C AGGGGGGGGCGGCTC C G AT ATCC AGCTC AC T C

AAAGCCCCTCTAG TCTCTCTGCCTCAGTGG GGGATCGG GTCAGTT

TTAC TTG TCAAG C TTC AC AG G ATATC AA C A AC TTC C TTAA TTG G TA

T C AGC A G A AGCC AG G A A A AGC ACC C A AGC T GC T C ATC T A T G AT GC

CTCAAATTTG G AG ACG G G TG TTCCCAG TCG ATTCTCTG G G TCAG G

G TCCGGGACCGACTTTACG TTTACGATCTCCTCTCTGCAG CCCGAA

G ACATCG CC ACATAC TATTG TCAAC AG TAC G G C AACTTG C C TTTC

AC A T T T GGGGGC GGGAC T A AG G T T G A A A T C A AGAGGGC C GC TGC

ACTGGAC A A T G A G A AG T C C A AC GGC AC C A T C A T C C AC GT G A AG G

GCAAGCACCTGTGCCCTAG TCCTCTG TTCCCAGG CCCATCCAAAC

CTTTTTGGGTTCTTGTTGTGGTCGGGGGGGTGCTGGCCTGCTATTC

TCTG CTG G TCACG G TG G CCTTCATAATTTTCTG G G TTAG ATCCAAA

AG AAG CCG CCTG CTCCATAG CG ATTACATG AATATG ACTCCACG C

CGCCCTGG CCCCACAAGGAAACACTACCAG CCTTACGCACCACCT

AG AG ATTTCG CTG CCTATCG G AG CAG G G TG AAG TTTTCCAG ATCT

G C AG ATG C AC C AG C G TATC AG C AG G G CC AG AACC AAC TG TATAA

C G AG CTCAACCTG G G ACG CAG G G AAG AG TATG ACG TTTTG G ACA

AG CG CAG AG G ACG G G ACCCTG AG ATG G G TG G CAAACCAAG ACG A

AA AAAC C C C C AGGAGG GTCTCT A T AATG AG CTG C A G A A G G A T A A

G AT GGC T G A AGC C T A T TC T G A A A T AGGC A T G A A AG G A G AGC GGA

G A AG G G G A A A AGGGC AC GAC GGTT T GT AC C AGGGAC T C AGC AC T

G CTACG AAG G ATAC TTATG AC G C TC TCC ACATG C AAG CC C TG C CA

C C TAG G TAA (SEQ ID NO. 59)

AA del Clon CAR 24C8 CD28T CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras (péptido de señal en negritas)

M A L P V T A LLLP LA LLLH A A R P Q V Q LQ E S G P G LV K P S Q T LS LT C T V S

G G SISSGGFYW SW IRQHPGKGLEW IGYIHHSG STHYNPSLKSRVTISI

D TSKN LFSLR LSSVTAAD TAVYYC ASLVYC G G D C YSG FD YW G Q G TL

VTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVSFTCQASQ

D IN NFLNW YQ Q KPG KAPKLLIYDASNLETG VPSRFSG SG SG TDFTFTI

S SLQPEDIAT Y Y CQQ Y GNLPFTF G G G TK V E IK R A A A LD N E K S N G TIIH

VKG KH LC P SPLFPGP SKPFWVE V V V G G VL AC Y SLL V T V A F IIF WVRS

KRSRLLHSD YM NM TPRRPG PTRKHY QP Y APPRDF AA YR SR VKF SRS

ADAPAYQ Q G Q NQ LYNELN LG R REEYDVLD KR R G R D PEM G G KPR R K

N P Q E G LY N E LQ K D K M A E A Y SEIG M KG ERRRG KG HDG LY QGLSTAT

K D T Y D A LH M Q A LP P R (SEQ ID NO. 60)

ADN del Clon CAR 24C8 CD28T CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras

C AG GT AC AGCTGC AG GAATCTG G G CCCG G ACTT GT C AAG CC AA G T

C AG AC AC TTTC TC TTACATG TAC C G TG AG CG G C G G AAG TATAAG C

AG T GGAGGCTTTT ACTGGTCTT GGAT ACGGC AGC ACCC AGGC A A A

G G C TTG G AG TG G ATTG G ATAC ATTC ATC ATTC AG G ATC TAC AC AC

TATAATCC ATC C C TTAAG TC C C G G G TC AC C ATTAG CATTG ATAC G T

CTAAG AATCTG TTCAG TCTCAG G CTG TCCTCCG TCACTG CTG CCG A

CACAG CCGTGTACTACTGCGCCTCCTTGG TTTACTGCGG AGGCGA

CTGTT A T AG CG G CTTTG ATT A T T GGGGGC AGGGGACCCTCGT AAC

CGTGAG CTCTGGAGGGGGTGGGAGCGGGGGAGGAGGTTCAGGGG

G G G G CG GCTCCG ATATCCAGCTCACTCAAAG CCCCTCTAGTCTCT

CTGCCTCAG TG GGGG ATCGGGTCAG TTTTACTTGTCAAG CTTCAC

A G G A TA TC A A C A A C TTC C TTAA TTG G TATC AG C A G AA G C C A G G A A

AA G C AC C CAAG C TG C TC ATC TATG ATG C C TC AAATTTG G AG AC G G

G TGTTCCCAGTCGATTCTCTGG GTCAGGGTCCGGG ACCG ACTTTA

CGTTTACG ATCTCCTCTCTG CAG CCCG AAG ACATCG CCACATACT

ATTG TCAACAG TACG G CAACTTG CCTTTCACATTTG G G G G CG G G A

C TAAG G TTG AA ATC AAG AG G G C C G C TG C AC TG G A C AATG A G AA G

TCCAACG G CACCATCATCCACG TG AAG G G CAAG CACCTG TG CCCT

AG TC CTCTG TTCCCAG G CCCATCCAAACCTTTTTG G G TTCTTG TTG

TGGTCGGGGGGGTGCTGGCCTGCTATTCTCTGCTGGTCACGGTGG

C C TTC ATAATTTTC TG G G TTAG ATC C AAAAG AAG CC G C C TG C TCC

ATA G C G ATTAC ATG AATATG AC TCC ACG CC G C C C TG G C CC C AC AA

G G AAACAC TAC CAG C CTTACG CACC ACC TAG AG ATTTC G C TG C C T

ATCG G AG CAG G G TG AAG TTTTC C AG ATC TG CAG ATG C ACC AG C G T

A T C AGC AGGGCC AG AAC C A A C TG T A T AA C G AG C TC AAC CTG G G A

CGC AG G G AAG AG T A T G ACG TTTT GGAC AAG CG C AG AG G AC G G G A

C C C T G AG AT GGGT GGC A A AC C A AG AC G A A A A A AC C C C C AG G AG G

GTCTCT A T A A T GAGCTGC A G A A G G AT A A G A T GGCTGAAGCCT A TT

C TG A A A T AGGC A T G A AAG G AG A G C G G A G AA G G G G A AAAG G G C A

C G AC G G TTTG TACC AG G G ACTC AG CAC TG CTACG AAG G ATAC TTA

TG ACG CTCTCCACATG CAAG CCCTG CCACCTAG G (SEQ ID NO. 61)

AA del Clon CAR 24C8 CD28T CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGGFYW SW IRQHPGKGL

EW IG YIH HSG STH YN PSLKSR VTIS ID TSKN LFSLR LSSVTAAD TAVYY

C ASL V Y CGGDC YSG FDYW G Q G TL V T V S SGGGGSGGGGSGGGGSDI

Q LTQ SPSSLSASVG DRVSFTCQ ASQ DINNFLNW YQ Q KPG KAPKLLIY

DASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYGNLPFTF

GGGTK V E IK R A A A LD N E K SN G TIIH V K G K H LC P SPLFPGP SKPF W Y L

VVVG G VLAC YSLLVTVAFIIFW VR SKR SR LLH SD YM N M TPR R PG PTR

K H Y QP YAPPRDF AAYR SR VKF SRS A D AP AYQ Q G Q NQ L YN ELN LG RR

EEYDVLD KR R G R DPEM G G KPR RKN PQ EG LYN ELQ KD KM AEAYSEI

G M KG ER R R G KG H D G LYQ G LSTATKD TYD ALH M Q ALPPR (SEQ ID

NO. 62)

ADN del Clon CAR 24C8 CD28 CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras

ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCC

TGCACGCCGCACGCCCGCAGGTGCAGCTGCAGGAAAGCGGTCCG

GGACTTG TCAAGCCGTCCCAAACGCTGAG TCTGACGTGTACTGTC

TCTG GTGGCTCTATTTCTTCCG GGGG CTTTTATTGGTCTTG GATCA

G ACAAC AC C C TG G C AAAG G G CTG G AG TG G ATAG G G TATATTC AC

C AC TC TG G G TC CAC TC ACTACAAC C CATCATTG AAATC CAG AG TG

AC TATC TC AATC G AC AC ATC C AAG AAC C TTTTC AG C C TG AG G TTG

TCATCAGTTACCGCCGCTG ACACCGCGGTGTATTATTG CG CCTCTC

TCGTGTACTG CG G TG G CG ATTG TTATAG TG G CTTTG ACTACTG G G

G G CAGGGG ACATTGGTTACCGTTTCAAGTGG AGG CG GTGGGTCTG

GCGGGGGCGGTAGCGGAGGTGGGGGGAGCGACATACAGCTTACG

CAGAGCCCCTCCAGCCTTTCAGCCTCCGTGGGGGATAGGGTGTCC

TTTAC CTG CC AG G C TTC C C AG G AC ATAAAC AACTTC C TC AATTG G T

A T C AGC A A A AG CCCGGG AAAGC ACC AAAG C TG C TC ATC T AC G AT

G CCAGCAACCTG GAAACCG GAG TG CCGTCTCGCTTCTCTGGAAGT

G G CAG TG G G AC CG ATTTC ACTTTTAC AATCTC AAG TTTG CAG C C A

G AAG ACATTG CAAC ATACTACTG TC AAC AG TAC G G CAATC TCC C C

TTTAC ATTTG G G G G G G G AAC TAAAG TG G AG ATTAAG C G C G C TG C A

G C C ATTG AAG TTATG TATC C G C C CC C G TATC TG G ATAAC G AG AAA

TC TAATG G TAC C ATAATAC ATG TG AAG G G G AAG C AC C TC TG TC C A

TCACCG CTG TTCCCCG GCCCTTCAAAACCTTTCTGGG TACTCGTTG

TCGTGGGTGGAGTTCTGGCCTGCTATAGTCTGCTGGTGACCGTGG

CG TTTATCATCTTCTG G G TAAG ATCCAAAAG AAG CCG CCTG CTCC

ATAG CG ATTAC ATG AATATG AC TCC ACG CC G C C C TG G C CC C AC AA

G G AAACACTACCAG CCTTACG CACCACCTAG AG ATTTCG CTG CCT

ATC G G AG CAG G G TG AAG TTTTCCAG ATCTG CAG ATG CACCAG CG T

A T C AGC AGGGCC AG AAC C A A C TG T A T AAC G AG C TC AACCTG G G A

CGC AG G G AAG AG T A T G ACG TTTT GGAC AAGCGC AG AG G ACG G G A

C C C TG AG ATG G G TG G C AAAC C AAG AC G AAAAAAC C C C CAG G AG G

GTCTCT A T A A T GAGCTGC A G A A G G AT A A G A T GGCTGAAGCCT A TT

C TG AA AT AGGC A T G AAAG G AG AG C G G AG AAG G G G A AAAG G G C A

CG AC G G TTTG TACC AG G G ACTC AG CAC TG CTACG AAG G ATAC TTA

TG ACG CTCTCCACATG CAAG CCCTG CCACCTAG G TAA (SEQ ID NO.

63)

AA del Clon CAR 24C8 CD28 CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras (Péptido señal en negritas)

M A LP V T A LLLP LA LLLH A A R P Q V Q LQ E S G P G LV K P S Q T LS LT C T V S

G G SISSGGFYW SW IRQHPGKGLEW IGYIHHSG STHYNPSLKSRVTISI

D TSKN LFSLR LSSVTAAD TAVYYC ASLVYC G G D C YSG FD YW G Q G TL

VTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVSFTCQASQ

D IN NFLNW YQ Q KPG KAPKLLIYDASNLETG VPSRFSG SG SG TDFTFTI

S SLQPEDIAT Y Y CQQ Y GNLPFTF G G G TKVE IK R A A A IE V M Y P P P Y LD

N E K SN G T IIH V KG K H LC P SPLFPGP SKPF W VE V V V G G VL AC Y SLL VT

V A F IIF W VRSKRSRLLHSD YM N M TPRR PG PTR KH Y QP Y APPRDF A A Y

RSRVKFSRSADAPAYQ Q G Q NQ LYNELNLG RREEYDVLDKRRG RDPE

M G G KPR R KN PQ EG LYNELQ KD KM AEAYSEIG M KG ER R R G KG H D G L

YQ G LS TA TK D TY D A LH M Q A LP P R (SEQ ID NO. 64) ADN del Clon CAR 24C8 CD28 CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras

C AG GT GC AGCTGC AG G AAAG CG G TCCG G G ACTTG TC AAGCCGTCC

CAAACG CTG AG TCTG ACG TG TACTG TCTCTG G TG G CTCTATTTCTT

CCG G G G G CTTTTATTG G TCTTG G ATCAG ACAACACCCTG G CAAAG

G G CTG G AG TG G ATAG G G TATATTCACCACTCTG G G TCCACTCACT

A C A A C C C A TC A TTG AAA TC C AG AG TG A C TA TC TC AA TC G AC AC AT

CCAAG AACCTTTTCAG CCTG AG G TTG TCATCAG TTACCG CCG CTG

ACACCGCGG TG TATTATTGCGCCTCTCTCGTG TACTG CG GTGGCG

ATTG TT A T AG T GGCTTT GACT ACTGGGGGC AGGGGAC A TT GGTT A

CCGTTTC A A G T GGAGGCGGTGGGTCTGGCGGGGGCGGT AG CG GA

GGTG GGGGG AGCGACATACAGCTTACGCAG AGCCCCTCCAGCCTT

TCAGCCTCCGTGGGGGATAGGGTGTCCTTTACCTGCCAGGCTTCC

C AG G AC ATAA AC AAC TTC C TC AATTG G TATC AG C AAAAG C C C G G G

AA AG C A C C AA AG C TG C TC ATC TAC G ATG C C AG CAAC C TG G AAAC C

GGAGTGCCGTCTCGCTTCTCTGG AAG TG GCAGTGG GACCGATTTC

AC TTTT AC AA TC TC AA G TTT GC AGCC A G A A G A C ATTG C A A C A T AC

TAC TG TCAACAG TACG G CAATCTCCCCTTTACATTTG G G G G G G G A

ACT A A A G T G G AG ATT AAGCGCGCTGC AGCC A TTG A A G TT ATG T AT

C C G C C C C C G TATC TG G ATAAC G AG AAATC TAATG G TAC C ATAATA

CATGTGAAGG GGAAGCACCTCTGTCCATCACCGCTGTTCCCCGGC

CCTTCAAAACCTTTCTGGGTACTCGTTGTCGTGGGTGGAGTTCTGG

CCTG CTATAGTCTGCTG GTGACCGTGGCGTTTATCATCTTCTGG GT

AAG ATC C AAAAG AAG C C G C C TG C TC C ATA G C G ATTAC A TG AATA T

G ACTCCACG CCG CCCTG G CCCCACAAG G AAACACTACCAG CCTTA

CG CACCACCTAG AG ATTTCG CTG CCTATCG G AG CAG G G TG AAG TT

TTCCAG ATCTG CAG ATG CACCAG CG TATCAG CAG G G CCAG AACCA

AC TG TATAAC G AG CTC AAC CTG G G AC G C AG G G AAG AG TATG AC G

TTTTG G ACAAG CG CAG AG G ACG G G ACCCTG AG ATG G G TG G CAAA

CC A A G A C G A AAAA AC C C C C AG GAGG GT C TCT A T A A T GAGCTGC A

G A AG G AT A A G A T GGC T G A AG C C T A T TC T G A A A T AGGC A T G A A AG

G AG AG CG G AG AAG G G G AAAAG G G CACG ACG G TTTG TACCAG G G A

C TCAG C AC TG C TAC G AAG G ATAC TTATG AC G C TC TC C AC ATG CAA

GCCCTGCCACCTAGG (SEQ ID NO. 65)

AA del Clon CAR 24C8 CD28 CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGGFYW SW IRQHPGKGL

EW IG YIH H SG STH YN PSLKSR VTIS ID TSKN LFSLR LSSVTAAD TAVYY

C ASL V Y CGGDC YSG FDYW G Q G TL V T V S SGGGGSGGGGSGGGGSDI

QLTQSPSSLSASVG DRVSFTCQ ASQ DINNFLNW YQ Q KPG KAPKLLIY

DASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYGNLPFTF

GGGTKVEDCRAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPG

P SKPF W V L V V V G G VL AC Y SLL V T V AF IIF W VRSKRSRLLH SD Y M N M

TPRRPGPTRKHY QP Y APPRDF AA YR SR VK F SRS A D AP A Y QQGQNQL

YNELNLG RREEYDVLDKRRG RDPEM G G KPRRKNPQ EG LYNELQ KD

K M A E A Y SEIGM KGERRRGKGHDGL Y QGLST A T K D T Y D A LH M Q ALP

PR(SEQ ID NO. 66)

ADN del Clon CAR 24C8 CD8 CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras

ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCC

TGCACGCCGCACGCCCGCAGGTGCAGTTGCAGGAAAGCGGGCCT

GGCCTTGTGAAACCAAGCCAGACACTGAGCCTGACATGCACTGTG

TCCG GCGGGTCCATATCTTCCGG GGGTTTTTATTGGTCCTG GATAC

GCCAGCATCCCGGGAAAGGACTTGAATGGATTGGATATATCCACC

ATTC C G G AA G C AC C C AC TAC AATC C AAG C CTTAAATC C CG G G TG A

CAATCTCCATCGACACCTCAAAGAATCTTTTTTCCCTGCGGTTGTC

TTCAGTAACTG CCGCCGATACCGCTGTGTACTACTGTG CCAG CCTC

GTCT ATT GCGGCGGAGATTGTT ATTCTG G G TTCG ATT ATTGGGGT C

AAGGCACACTGG TAACTGTCAGCAG CG GAG GCGGCGGTTCCG GG

GGCGGGGGCAGTGGAGGGGGCGGATCTGACATTCAGCTTACGCA

GTCCCCATCTTCACTTAGCGCCAGCGTTGGCGATCGGGTCAGCTTC

AC G TG TC AA G C AA G TC AG G ATATC AAC AAC TTTC TTAAC TG G TAC

CAG CAG AAG CCAG G CAAG G CACCCAAG TTG CTG ATTTACG ATG CT

TCTAACCTCGAGACGGGAGTGCCTAGCCGCTTCTCCGGGAGCGGC

AG CG G CACAG ACTTTACCTTTACG ATTTCCAG TCTG CAG CCAG AG

G ATATAG C AAC TTATTAC TG TC AG C AG TATG G C AAC C TC C C TTTTA

CCTTCG G TG G TG G CACAAAG G TCG AG ATTAAAAG AG CCG CAG CG

TTG TCCAACTCCATAATG TATTTTTCTCATTTTG TG CCCG TCTTTCT

GCCTGCCAAACCTACCACCACCCCCGCCCCACGACCACCTACTCC

AGCCCCCACCATCGCCTCCCAGCCCCTCAGCCTGAGGCCAGAGGC

TTGTCGCCCTGCTGCGGGGGGCGCTGTCCATACCAGAGGACTCGA

CTTCGCCTGCGATATTTATATATGGGCCCCCCTCGCCGGCACCTGC

G G AG TCTTG CTCCTG AG CCTTG TG ATCACG CTTTATTG TAACCATC

G G AAT AG ATCC AAAAG AAG C CG CC TG C TC C A T AG CG ATT AC A T GA

ATATG ACTCCACG CCG CCCTG G CCCCACAAG G AAACACTACCAG C

CTTACG CACCACCTAG AG ATTTCG CTG CCTATCG G AG CAG G G TG A

AG TTTTCCAG ATCTG CAG ATG CACCAG CG TATCAG CAG G G CCAG A

AC C AACTG TATAAC G AG C TCAAC C TG G G ACG CAG G G AAG AG TAT

G ACG TTTTGGACAAG CG CAGAG GACGGG ACCCTGAGATG GGTGG

C AA AC C A AG AC G AAAAAAC C C C C AG G AG G G TC TC TATAATG AG C

T GC A G A AG G AT A A G AT GGC T G A AG C C T A T TC T G A A A T AGGC ATG

AAAG G AG AG C G G AG AAG G G G AAAAG G G CAC G AC G G TTTG TAC C A

G G G ACTCAG CACTG CTACG AAG G ATACTTATG ACG CTCTCCACAT

G CAAG CCCTG CCACCTAG G TAA (SEQ ID NO. 67) AA del Clon CAR 24C8 CD8 CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras (Péptido señal en Audaz)

M A LP V T A LLLP LA LLLH A A R P Q V Q LQ E S G P G LV K P S Q T LS LT C T V S

G G SISSG G FYW SW IRQ HPG KG LEW IG YM HSG STHYNPSLKSRVTISI

D TSKN LFSLR LSSVTAADTAVYYC ASLVYCG G D CYSG FD YW G Q G TL

YTYSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASYGDRYSFTCQASQ

D IN N FLN W Y QQKPGK A P K L L IY D ASNLET GVPRF S GS GS GTDF TF T I S

SLQPEDIAT Y Y C Q Y GNLPF TF GGG TK V E IK R A A A L SN SIM YF SHF VP V

FLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA

C D IY IW APL AG T C G V LL L SL V IT L Y CNHRNRSKRSRLLHSD Y M N M TP

RRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQ GQNQLYN

ELN LG R R EEYDVLDKRRG RDPEM G G KPRRKNPQ EG LYNELQ KDKM

A E A Y SEIGM KGERRRGKGHDGL Y QGLST A T K D T Y D A LH M Q ALPPR

(SEQ ID NO. 68)

ADN del Clon CAR 24C8 CD8 CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras

C AGGTGC AG TT GC AG GAAAGCGGG CCTGG CCTT GT G AAACC A A G

CCAGACACTG AGCCTGACATGCACTGTGTCCGGCGG GTCCATATC

TTCCGG GGGTTTTTATTGGTCCTG GATACGCCAG CATCCCGGG AA

AG G AC TTG AATG G ATTG G ATATATC C AC C ATTC CG G AAG C ACOCA

C TAC AATC C AAG C CTTAAATC C CG G G TG ACAATC TCC ATC G AC AC

CTCAAAG AATCTTTTTTCCCTG CG G TTG TCTTCAG TAACTG CCG CC

G ATACCG CTGTG TACTACTG TG CCAGCCTCGTCTATTGCGGCGGA

G ATTG TT ATTCTG G G TTCG ATT A T T GGGGT C AAGGC AC ACTGGT A

ACTG T C AGC AGCGGAGGCGGCGGTTCCGGGGGCGGGGGC AG T GG

AG GGG G CG G ATCTG ACATTCAG CTTACG CAG TCCCCATCTTCACT

TAG CGCCAG CG TTG GCGATCGGGTCAG CTTCACGTGTCAAGCAAG

TC AG G ATATC AAC AAC TTTC TTAAC TG G TAC C AG C AG AAG C C AG G

CAAG G CACCCAAG TTG CTG ATTTACG ATG CTTCTAACCTCG AG AC

GGG AGTGCCTAGCCGCTTCTCCGGGAGCGGCAGCGGCACAGACTT

TAC C TTTACG ATTTC C AG TC TG C AG C C AG AG G ATATAG C AAC TTA

TTACTGTCAGCAG TATGGCAACCTCCCTTTTACCTTCGG TG GTGGC

AC A A AG G TCG AG ATT A A A AG AGCC GC AGC GTT GTCC A AC T C C A T A

ATG TATTTTTCTCATTTTG TG CCCG TCTTTCTG CCTG CCAAACCTAC

CACCACCCCCGCCCCACGACCACCTACTCCAGCCCCCACCATCGC

CTCCCAGCCCCTCAGCCTGAGGCCAGAGGCTTGTCGCCCTGCTGC

GGGGGGCGCTGTCCATACCAGAGGACTCGACTTCGCCTG CG ATAT

TTATATATGGGCCCCCCTCGCCGGCACCTGCGGAGTCTTGCTCCTG

AG C C TTG TG A TC A C G C TTTATTG TAA C C A TC G G AA TA G ATC C AA A

AG AAG C C G C C TG C TCC ATAG C G ATTAC ATG AATATG AC TC CACG C

CGCCCTGG CCCCACAAG G AAACACTACCAG CCTTACG CACCACCT

AG AG ATTTC G C TG C C TATCG G AG C AG G G TG AAG TTTTC CAG ATC T

G C AG ATG C AC C AG C G TATC AG C AG G G C C AG AAC C AAC TG TATAA

CG AG CTC AAC CTG G G AC G C AG G G AAG AG TATG AC G TTTTG G ACA

AG CG CAG AG G AC G G G AC C CTG AG ATG G G TG G C AAAC C AAG AC G A

AAAA AC C C C C AG GAGG GTCTCT A T AATG AG C TG C A G A A G G A T A A

G AT GGC T G A AGC C T A T T C T G A A A T AGGC A T G A A AG G AG AGC GGA

G A AG G G G A A A AGGGC AC GAC GGTT T GT AC C AG GGAC T C AGC AC T

G CTAC G AAG G ATAC TTATG AC G C TC TCC ACATG C AAG CC C TG C CA

CCTAGG (SEQ ID NO. 69)

AA del Clon CAR 24C8 CD8 CD3 zeta Cadenas pesadas y ligeras

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGGFYW SW IRQHPGKGL

EW IG YIH H SG STH YN PSLKSR VTIS ID TSKN LFSLR LSSVTAAD TAVYY

C ASL V Y CGGDC YSG FDYW G Q G TL V T V S SGGGGSGGGGSGGGGSDI

QLTQSPSSLSASVG DRVSFTCQ ASQ DINNFLNW YQ Q KPG KAPKLLIY

DASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYGNLPFTF

G G G TKVE IKR AA ALSN SIMYF SHF VPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIA

S QPL SLRPE ACRP A AG G A VH TR G LDF A C D IY IW APL A G TC G V LLL SL

V IT L Y CNHRNRSKRSRLLHSD YM NM TPRRPG PTRKHY QP Y APPRDF

AAYR SR VKF SRS AD AP A Y Q Q G Q N Q LYN ELNLG R R EEYD VLDKRR G

R D PEM G G KPRRKNPQ EG LYNELQ KDKM AEAYSEIG M KG ERRRG KG

H D G LY Q G LSTA T K D T Y D A L H M QALPPR (SEQ ID NO. 70)

ADN del Clon 20C5.1 HC

C AGGTCC AACTG G T GC AG TCCG G AG CCG AAG T C A A G A A A C C AG G

TG CCTC C G TTAAAG TG AG TTG C AAAG TC TCTG G ATAC AC TC TG AC

CGAG CTCTCTATGCACTGGGTCCGGCAGGCCCCCGGCAAGGGATT

G G AAT GGAT GGG CG GGTTCGATCCTG AGG ACGGAGAGACT ATCT

AC G C TC AAAAATTC C AG G G AC G AG TG AC TG TG AC CG AAG AC AC T

AG TAC CG AC AC TG C C TAC ATG G AAC TTTC C TCTC TG C G ATC AG AA

G ATAC CG CAG TG TAC TAC TG TG C TAC TG AATCTAG G G G CATTG G A

TGGCCCTACTTCGATTACTGGGGTCAGGGAACTCTGGTGACTGTC

TCCAGC (SEQ ID NO. 71)

AA del Clon 20C5.1 HC (CDR en subrayado)

O VO LVO SG AEVKKPG ASVKVSC KVSG Y T L T E L SM HW VRO APG KG L

EW MGGFDPEDGET IY AO KF OGRVT VTE D T STDT A Y M E L S SLRSEDT

A V Y Y C A T ESRG IG W PYFDYW GOGTLVTYSS (SEO ID NO. 72) AA del Clon 20C5.1 HC CDR1: GYTLTEL (SEQ ID NO: 73)

AA del Clon 20C5.1 HC CDR2: DPEDGE (SEQ ID NO: 74)

AA del Clon de 20C5.1 HC CDR3: ESRGIGWPYFDY (SEQ ID NO: 75)

ADN del clon 20C5.1 LC

G ATATTCAG ATG ACTCAATCTCCTTCTTCTCTG TCCG CTTCCG TG G

G CG ATAG AG TG AC C ATTAC TTG TAG G G C G TCC C AG TC AATC TC C A

GTT A TTT G AATTG G T A T C AGC AG AAG CC C G G G AAAG C ACCT AAG C

TGTTGATCAG CG G G G CTTCTAG CCTG AAG AG TG G G G TACCTTCAC

GGTTCAGC GGAAGC GGAAGC G G AAC C G ATTTC AC C CTG AC TATCA

G CAG CCTG CCACCTG AG G ACTTTG CAACTTACTACTG CCAACAG T

CATACAG CACTCCG ATCACTTTCG G CCAG G G CACCCG G CTCG AAA

TCAAGCGC (SEQ ID NO. 76)

AA del Clon 20C5.1 LC (CDR en subrayado)

D IOM TOSPSSLSASVGDRVTITCRASOSISSYLNW Y O O K P G K A P K LLI

SGASSLKSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLPPEDFATYYCOOSYSTPITF

G Q G TRLEIKR (SEQ ID NO. 77)

AA del Clon 20C5.1 LC CDR1: RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 78)

AA del Clon 20C5.1 LC CDR2: GASSLKS (SEQ ID NO: 79)

AA del Clon 20C5.1 LC CDR3: QQSYSTPIT (SEQ ID NO: 80)

ADN del Clon 20C5.1 CD28T CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras

ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCC

TGCACGCCGCACGCCCGCAGGTCCAACTGGTGCAGTCCGGAGCCG

AAGTCAAG AAACCAG G TG CCTCCG TTAAAG TG AG TTG CAAAG TCT

CTGGAT ACACTCTGACCGAGCTCTCT ATGCACTGGGTCCGGCAGG

CCCCCGGCAAGGGATTGGAATGGATGGGCGGGTTCGATCCTGAG

GACGGAGAGACTATCTACGCTCAAAAATTCCAGG GACGAGTGAC

TGTGACCGAAGACACTAGTACCGACACTGCCTACATGG AACTTTC

CTCTCTGCGATCAGAAGATACCGCAGTGTACTACTGTGCTACTGA

ATCTAGGGGCATTGGATGGCCCTACTTCGATTACTGGGGTCAGGG

AACTCTGGTGACTGTCTCCAGCGGTGGAGGTGGCAGCGGTGGTGG

CGGAAGCGGGGGGGGCGGCTCTGATATTCAGATGACTCAATCTCC

TTCTTCTCTGTCCGCTTCCGTGGGCGATAGAGTGACCATTACTTGT

AG GGCGTCCCAGTCAATCTCCAGTTATTTG AATTGG TATCAGCAG

AAGCCCGGGAAAGCACCTAAGCTGTTGATCAGCGGGGCTTCTAGC

CTGAAGAGT GGGGT ACCTTC ACGGTT C AGCGGAAGCGGAAGCGG

AACCGATTTCACCCTGACTATCAGCAGCCTGCCACCTGAGGACTT

T GC AAC TT ACT ACTGCC A AC AGT C AT AC AGC ACTCCGAT C ACTTTC

GGCCAGGGCACCCGGCTCGAAATCAAGCGCGCTGCTGCTTTGGAC

A A T G AGA AGT C A A A C GGC AC C AT C AT AC AT GTT A AAG G T A A AC A

TCTGTGTCCCTCCCCGCTGTTCCCCGGCCCTTCCAAACCGTTCTGG

GTTCTGGTGGTGGTCGGAGGCGTACTCGCTTGCTATAGTCTGCTG

GTAACTG TCG CCTTCATCATCTTTTGGG TG AGATCCAAAAGAAGC

CGCCTGCTCCATAGCGATTACATGAATATGACTCCACGCCGCCCT

GGCCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGCACCACCTAGAGAT

TTCGCTGCCTATCGGAGCAGGGTGAAGTTTTCCAGATCTGCAGAT

GCACCAGCGTATCAGCAGGGCCAGAACCAACTGTATAACGAGCT

CAACCTGGGACGCAGGGAAGAGTATGACGTTTTGGACAAGCGCA

GAGGAC GGGAC C C T GAG AT GGGT GGC A A A C C A A G AC GA A A AA AC

CCCCAGGAGGGTCTCTATAATGAGCTGCAGAAGGATAAGATGGCT

GA AGC CT ATTC TG AAAT AGGC AT GAAAG GAGAGC GGAGAAGGGG

AAAAGGGCACGACGGTTTGTACCAGGGACTCAGCACTGCTACGA

AG GATACTTATGACGCTCTCCACATGCAAGCCCTGCCACCTAGGT

A A (SEQ ID NO. 81)

AA del Clon 20C5.1 CD28T CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras (Péptido señal en Audaz)

M A L P V T A LL LP L A L L L H A A R P Q V Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K V

SG YTLTEL SM HW VRQ APG KG LEW M G G FDPEDG ETIY AQ KFQ G RVT

VTEDTSTDTAYM ELSSLRSEDTAVYYCATESRG IG W PYFDYW G Q G T

L V T V S SGGGGSGGGGSGGGGSDIQMT Q SP S SL S AS V G D R V TIT CRAS

QSISSYLNW YQQKPGKAPKLLISGASSLKSGVPSRFSGSGSGTDFTLTI

S SLPPEDF A T Y Y CQQS YSTPITF G Q G TR LE IK R A A A LD N E K S N G TIIH Y

KG KH LC PSPLFPG PSKPFW VLVVVG G VLAC YSLLVTVAFIIFW VR SK

RSRLLHSD YM NM TPRRPG PTRKHY QP Y APPRDF A A YRSRVKF SRS A

D APAYQ Q G Q NQ LYNELNLG RREEYDVLDKRRG RDPEM G G KPRRKN

PQEGL Y N E LQ K D K M A E A Y SEIGM KGERRRGKGHDGL Y QGLST A T K

D TYD ALH M Q A LP PR (SEQ ID NO. 82)

ADN del Clon 20C5.1 CD28T CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras

C AGGTCC AAC TG G T GC AGTCCGGAGCC G A AG T C A A G A A A C C AG G

TG C C TC C G TTAAAG TG AG TTG C AAAG TC TCTG G ATAC AC TC TG AC

CGAGCTCTCTATGCACTGGGTCCGGCAG GCCCCCGGCAAGGGATT

G G AAT GGAT G G G CG GGTTCGATCCTG AGG ACGGAGAGACT ATC T

AC G C TC AAAAATTC C AG G G AC G AG TG AC TG TG AC C G AAG AC AC T

AG TAC CG AC AC TG C C TAC ATG G AAC TTTC C TCTC TG C G ATC AG AA

G ATAC CG CAG TG TAC TAC TG TG C TAC TG AATCTAG G G G CATTG G A

TGG CCCTACTTCG ATTACTG G G G TCAG G G AACTCTG G TG ACTG TC

T C C AGC GGT GGAGGT GGC AGC GGT GGT GGC G G A AGC GGGGGGGG

C G G C TCTG ATATTCAG ATG ACTCAATCTCCTTCTTCTCTG TCCG CT

TCCG TG G G CG ATAG AG TG ACCATTACTTG TAG G G CG TCCCAG TCA

ATC TC C A G TTATTTG AA TTG G TATC AG C AG AAG C C C G G G AAA G C A

CCTAAG CTG TTG ATCAG CG G G G CTTCTAG CCTG AAG AG TG G G G TA

CCTTCACG G TTCAG CG G AAG CG G AAG CG G AACCG ATTTCACCCTG

ACTATC AG CAG C C TG CC ACC TG AG G AC TTTG C AAC TTAC TAC TG C

C AACAG TCATACAG CACTCCG ATCACTTTCG G CCAG G G CACCCG G

CTCG AAATC AAGCGCGCT GCTGCTTT GGAC A A T G A G A A G T C A AAC

G G C A C C A TC ATAC ATG TTAAAG G TAAAC ATC TG TG TC C CTC C C CG

CTGTTCCCCGGCCCTTCCAAACCGTTCTGGGTTCTGGTGGTGGTCG

GAGGCGTACTCG CTTG CTATAG TCTG CTG G TAACTG TCG CCTTCAT

CATC TTTTG G G TG AG ATC CAAAAG AAG C C G C CTG C TC C ATAG C G A

TTAC ATG AATATG AC TC C AC G C C G C C CTG G CC C C AC AAG G AAAC A

CTACCAGCCTTACGCACCACCTAGAGATTTCGCTGCCTATCGGAG

C AGGGT G AAG TTTTCC AG ATCTG C A G A T GC ACC AGCGT A T C AGC A

GGGCCAGAACCAACTGTATAACGAGCTCAACCTGGGACGCAGGG

AAGAGTATGACGTTTTGGACAAGCGCAGAGGACGGGACCCTGAG

ATG G G TG G C AAAC C AAG AC G AAAAAAC C C C C AG G AG G G TC TC TA

T AATG AG CTG C A G A A G G A T A A G A T GGCTGAAGCCT A TTC T G A A A T

AG G C ATG AAAG G AG AG C G G AG AAG G G G AAAAG G G C AC G AC G G T

TTG TAC C AG G G AC TC AG C AC TG C TAC G AAG G ATAC TTATG AC G C T

CTCCACATG CAAG CCCTG CCACCTAG G (SEQ ID NO. 83)

AA del Clon 20C5.1 CD28T CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras

Q V QL V Q S GAE VKKPG AS V K V S CK V S G Y TL TEL SMHW VRQ APG KG L

EW M G G FDPEDG ETIY AQ KF QGRVT VTE D T STDT A Y M E L S SLRSEDT

AVYYCATESRGIGW PYFDYW GQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS

D IQ M TQ SP S SL S AS VG DRVTITCRASQ SIS S Y L N W Y Q Q K PG K AP KLLI

SGASSLKSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLPPEDFATYYCQQSYSTPITF

G Q G TRLEIKR A A A LD N E K SN G T IIH V K G K H LC P SPLFPGP SKPF W V L V

Y Y G G VL AC Y SLL Y T Y A F IIF W VRSKRSRLLHSD YM NMTPRRPGPTRK

H Y QP Y APPRDF AA YR SR VKF SRS A D AP A Y QQGQNQL YNELN LG RR E

EY D VLD K RR G R D PEM G G KPRR KN PQ EG LYN ELQ KD KM AEAYSEIG

M KG ER R R G K G H D G LYQ G LS TATKD TYD ALH M Q ALPPR (SEQ ID NO.

84)

ADN del Clon 20C5.1 CD28 CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras

ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCC

TGCACGCCGCACGCCCGCAGGTGCAGCTTGTGCAGAGCGGGGCC

G AG G TG AAG AAG CCCG G G G CCAG CG TCAAAG TG TCCTG TAAG G T

CAGCGG TTACACCCTCACCG AG CTG AG CATG CACTG G G TACG G CA

GGCTCCCGGC AA AG G TC TTG AG T GGATGGGT G G ATTT GATCC A G A

A G A T G G AG AG ACT ATC T ACGCCC AG AAG TTC C AGGGCCGGGT C A

C C G TAAC AG AAG AC AC C TCAAC TG AC ACC G C TTAC ATG G AG C TG A

GTTCACTGCGGTCCGAGG ACACGGCCGTGTATTATTGTG CCACCG

AG AGCCGCG G AATCG G ATG G CCTTACTTCG ACTACTG G G G ACAG G

GT AC ACTTG TT AC AG T A T C ATCCGGGGGT GGCGGCTCTGGTGGGG

GCGGCTCCGGAGGGGGTGGATC AG A T A T C C A A A T GACTC A A A G T

CCAAG TTCCCTG TCTG CCTCAG TCG G AG ATAG AG TCACCATAACC

TG CAG G G CAAG TCAG TCCATCTCCTCCTATCTG AACTG G TACCAA

CAGAAACCTG G AAAG G CG CCTAAG CTCCTG ATCTCCG G AG CCTCA

TCTTTGAAATCCGGTGTCCCATCTCGCTTCAGTGG CTCTGGAAGCG

G TAC AG ATTTTAC TTTG AC CATTAG C AG CC TC CC ACC G G AAG AC T

TTG C TAC ATATTAC TG C C AG C AG TCTTAC TC AACC C C AATC AC C TT

CGGGC AAGGC ACC A G AC TC G AAA T A A A A AG AG C AGCTGCT ATCG

AG G TTATG TAC C C AC C G C C G TAC TTG G ATAAC G AAAAAAG C AATG

GGACCATCATTCATG TG AAG G G TAAG CACCTTTG CCCTAG CCCAC

TGTTTCCTGGCCCGAG TAAACCCTTTTG GGTACTTGTGGTCGTCGG

CGGCGTGCTGGCCTGCTACTCACTCCTGGTTACCGTCGCATTCATC

ATCTTTTG G G TG AG ATC C AAAAG AAG C C G C C TG CTC C ATAG CG AT

TAC ATG AATATG ACTCCACG CCG CCCTG G CCCCACAAG G AAACAC

TACCAGCCTTACG CACCACCTAG AG ATTTCG CTG CCTATCG G AG C

AGGGT G A AG TTTTC C AG ATCTG C AG A T GC AC C AGC GT A T C AGC AG

G G CCAG AACCAACTG TATAACG AG CTCAACCTG G G ACG CAG G G A

AG AG TATG ACG TTTTG G ACAAG CG CAG AG G ACG G G ACCCTG AG A

T GGGTGGC A A AC C A A G A C G A A A A A A C C C CC AGGAGGGTCTCT AT

A A T GAGC T GC A G A AG G AT A A G A T GGC T G A AGC C T A T T C T G A A AT

AG G C ATG AAAG G AG AG C G G AG AAG G G G AAAAG G G C AC G AC G G T

TTG TACCAG G G ACTCAG CACTG CTACG AAG G ATACTTATG ACG CT

CTCCACATG CAAG CCCTG CCACCTAG G TAA (SEQ ID NO. 85)

AA del Clon 20C5.1 CD28 CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras (Péptido señal en negrita)

M A L P V T A L L L P L A L L L H A A R P Q V Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K V

SG YTLTELSM HW VRQ APG KG LEW M G G FDPEDG ETIYAQ KFQ G RVT

VTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATESRGIGWPYFDYWGQGT

L Y T Y S SGGGGSGGGGSGGGGSDIQMT Q SP S SL S AS Y G D R V TIT CRAS

QSISSYLNW YQQKPGKAPKLLISGASSLKSGVPSRFSGSGSGTDFTLTI

S SLPPEDF A T Y Y CQQ S YSTPITF G Q G TR LE IK R A A A IE V M YPPP Y LD N E

KS N G TIIH VK G KH LC PSPLFPG PSKPFW VLVVVG G VLAC YSLLVTVA

FIIFW VRSKRSRLLHSDYM NM TPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS

R VKF SRS A D A P A Y Q Q G Q NQ LYNELNLG RREEYDVLDKRRG RDPEM

G G KPRRKN PQ EG LYN ELQ KD KM AEAYSEIG M KG ERR R G KG H DG LY

QGLST A T K D T Y D A L H M Q ALPPR (SEQ ID NO. 86)

ADN del Clon 20C5.1 CD28 CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras

CAGGTGCAGCTTGTGCAGAGCGGGG CCGAGGTGAAGAAGCCCGG

GGCCAG CG TCAAAG TG TCCTG TAAG G TCAG CG G TTACACCCTCAC

CGAGCTGAGCATGCACTGG GTACGGCAG GCTCCCGGCAAAGG TCT

T GAGT GG A T GGGT G G ATTT GATCC A G A A G A T GGAG AG AC T ATC T A

CGCCCAG AAG TTCCAG G G CCG G G TCACCG TAACAG AAG ACACCT

CAACTGACACCGCTTACATGGAGCTGAGTTCACTGCGGTCCGAGG

ACACG G CCG TG TATTATTG TG CCACCG AG AG CCG CG G AATCG G AT

G G CCTTACTTCG ACTACTG G G G ACAG G G TACACTTG TTACAG TAT

C A T C C GGGGGT GGC GGC TC T GGT GGGGGC GGC T C C GGAGGGGGT

G G ATCAG ATATCC AAATG ACTC AAAG TC C AAG TTCC C TG TC TG CC

TCAG TCG G AG ATAG AG TCACCATAACCTG CAG G G CAAG TCAG TCC

ATCTCCTCCTATCTGAACTGGTACCAACAGAAACCTGGAAAGGCG

CCTAAGCTCCTG ATCTCCGGAGCCTCATCTTTGAAATCCGGTGTCC

C ATCTCG CTTCAG TG G CTCTG G AAG CG G TACAG ATTTTACTTTG AC

CATTAG C AG C CTC C C AC CG G AAG AC TTTG C TAC ATATTAC TG C C A

G CAG TCTTACTCAACCCCAATCACCTTCG G G CAAG G CACCAG ACT

C G A A A T A A A A AG AG C AGC T GC T ATC GAGGTT A T GT AC C C AC C GC C

GT ACTTG G AT A A C G A A A A A A G C A A T GGGACC ATC ATTC A T GT G A A

G G G TAAG CACCTTTGCCCTAGCCCACTGTTTCCTGG CCCGAGTAA

ACCCTTTTGGGTACTTGTGGTCGTCGGCGGCGTGCTGGCCTGCTAC

TC ACTCCTG G TTACCG TCG CATTCATCATCTTTTG G G TG AG ATCCA

AAAG AAG C C G C C TG C TC C ATAG C G ATTAC ATG AATATG AC TCC AC

GCCGCCCTGG CCCCACAAGGAAACACTACCAG CCTTACGCACCAC

CTAG AG ATTTCG CTG CCTATCG G AG CAG G G TG AAG TTTTCCAG AT

CTGC A G A T GC AC C AG CG T ATC AGC AGGGC C A G A AC C A ACTG T A T A

ACGAGCTC AACCTGG GACGC AG G G AA G AG T A T G ACG TTTT GGAC

AAG C G C AG AG G ACG G G AC C C TG AG ATG G G TG G CAAACC AAG ACG

AA AA A A C C C C C AG GAGG GTCTCT A T A A T GAGC TGC AG A A G G A T A

AG ATG G C TG A AG C C TATTC TG AAATAG G C ATG AAAG G AG AG C G G

AG AAG G G G AAAAG G G CACG AC G G TTTG TAC C AG G G AC TC AG C AC

TG CTACG AAG G ATACTTATG ACG CTCTCCACATG CAAG CCCTG CC

AC C TAG G (SEQ ID NO. 87)

AA del Clon 20C5.1 CD28 CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras

Q VQ LVQ SG AEVKKPG ASVKVSCKVSG YTLTELSM H W VR Q APG KG L

EW M G G FDPEDG ETIY AQ KF QGRVT VTED T STDT A Y M E L S SLRSEDT

AVYYCATESRGIGW PYFDYW GQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS

D IQ M TQ SP S SL S AS VG DRVTITCRASQ SIS S Y L N W Y QQKPGK A P K L L I

SGASSLKSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLPPEDFATYYCQQSYSTPITF

G Q G TRLEIKRAAAIEVM YPPPYLDNEKSNG THHVKG KHLCPSPLFPG

P SKPF W V L V V V G G VL AC Y SLL V T V AF IIF W VRSKRSRLLHSD Y M N M

TPRRPGPTRKHY QP Y APPRDF AAYR SR VKF SRS A D AP A Y QQGQNQL

YN ELNLG RREEYDVLDKRRG RDPEM G G KPRRKNPQ EG LYNELQ KD

K M A E A Y SEIGM KGERRRGKGHDGLYQGLST A T K D T Y D A L H M

QALPPR (SEQ ID NO. 88)

ADN del Clon 20C5.1 CD8 CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras

ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCC

TGCACGCCGCACGCCCGCAGGTGCAGTTGGTGCAAAGCGGCGCA

G AAG TTAAG AAAC C TG G G G C G TC AG TTAAG G TG TC TTG C AAAG TA

TCTG G CTATACCCTCACTG AG CTG TCCATG CATTG G G TAAG G CAG

GCTCCTG G AAAG G G G CTCG AAT GGAT G G G AG G ATTTG ACCCTG A

AG AC G G AG AG AC C ATC TAC G C C C AG AAATTC C AG G G TAG AG TAA

CAG TG AC TG AG G AC AC TAG C AC TG ACAC AG C G TAC ATG G AG CTG

AG TTCTCTG AG AAG TG AG G ACACAG CCG TTTACTACTG CG CTACC

G AG TCCAG AG G TATTG G CTG G CCATACTTCG ACTATTG G G G TCAG

GGCACCCTGGTTACAGTGAGTTCAGGAGGCGGGGGCTCTGGGGG

GGG CG GTTCCG G AG G G G G G G G CTCAG ATATACAG ATG ACG CAG A

G TCCATCAAG TCTCTCAG CCAG CG TG G G AG ATCG CG TG ACTATTA

CTTG CCG CG CCAG CCAG AG TATTAG CTCCTATCTG AATTG G TACC

AG CAAAAG CCCG G G AAG G CCCCTAAG CTTCTG ATTTCTG G CG CCT

C C TC TTTG AAG TCAG G TG TG CCAAG CAG ATTTAG CG G G TCTG G AA

GTGG CACTG ACTTTACACTTACTATCTCCAG CCTG CCCCCAG AG G

ATTTTG C C AC ATATTAC TG TC AG C AAAG C TAC TC TAC TC C AATC AC

TTTCG G CCAG G G CACAAG ATTG G AG ATTAAG AG G G CTG CCG CACT

TTC AAATTC C ATC ATG TATTTC AG C C ATTTTG TG C C TG TTTTTC TTC

CGGCCAAACCTACAACCACTCCCGCCCCACGCCCACCTACTCCCG

CCCCTACCATTGCCTCCCAGCCTCTG TCTCTTAGACCTGAGGCTTG

TAGACCTGCTGCCGGCGGAGCCGTGCACACTCGCGGTCTGGACTT

CGCCTGCGACATCTATATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACCTGCGG

C G TTCTCCTTCTCTCACTCG TAATCACACTCTATTG CAATCACAG G

AA C AG A TC C AA AAG AAG C C G C C TG C TC C A TA G C G ATTA C A TG AA T

ATG ACTCCACG CCG CCCTG G CCCCACAAG G AAACACTACCAG CCT

TACG CACCACCTAG AG ATTTCG CTG CCTATCG G AG CAG G G TG AAG

TTT TCC AG A T C T GC AG A T GC AC C AGC GT A T C AGC AGGGC C A G A AC

C A AC TGT A T A ACGAGC TC A ACC TGGGAC GC AG G G A AG AG T ATG A

CG TTTTG G ACAAGCGCAGAGGACG GGACCCTGAGATGGGTGG CA

AA C C A AG A C G AAA AA AC C C C C AG G AG G G TC TC TATA ATG AG C TG

C A G A AG G AT A A G A T GGC T G A AGC CT ATTC TG A A A T AGGC A T G A A

AG G AG AG CG G AG AAG G G G AAAAG G G CACG ACG G TTTG TACCAG G

G ACTCAG CACTG CTACG AAG G ATACTTATG ACG CTCTCCACATG C

AAG CCCTG CCACCTAG G TAA (SEQ ID NO. 89)

AA del Clon 20C5.1 CD8 CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras (Péptido señal en negrita)

SG YTLTEL SM HW VRQ APGKG LEW M G G FDPEDG ETIY AQ KFQ G RYT

VTEDTSTDTAYM ELSSLRSEDTAVYYCATESRG IG W PYFDYW G Q G T

L V T V S SGGGGSGGGGSGGGGSDIQMT Q SP S SL S AS V G D R V TIT CRAS

QSISSYLNW YQQKPGKAPKLLISGASSLKSGVPSRFSGSGSGTDFTLTI

S SLPPEDF A T Y Y CQQ S YSTPITF G Q G TR LE IK R AAA L SN SIMYF SHF VP

VFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDF

A C D IY IW APL AG T C G V LL L SL V IT L Y CNHRNRSKRSRLLHSD Y M N M T

PRRPGPTRKHY QP Y APPRDF AAYR SR VKF SRS A D AP A Y QQGQNQL Y

NELNLG R R EEYD VLDKR RG RD PEM G G KPR RKNPQ EG LYNELQ KD K

M A E A Y SEIGM KGERRRGKGHDGL Y QGLST A T K D T Y D A LH M Q A LP P

R (SEQ ID NO. 90)

A D N del C lon 20C 5.1 C D 8 C D 3 ze ta C A R C a de nas p e sad as y lige ra s

C AG G T GC AG TT GGT GC AAAGCGG CG C A G A A G TT A A G A A ACCTGG

G G C G TCAG TTAAG G TG TCTTG CAAAG TATCTG G CTATACCCTCAC

T GAGCTGTCC ATGC ATT GGGT AAG G C AG GCTCCTGGAAAG GGGCT

CG AATG G ATG G G AG G ATTTG ACCCTG AAG ACG G AG AG ACCATCT

AC G C C C AG AAATTC C AG G G TAG AG TAAC AG TG AC TG AG G AC ACT

AGC ACTGAC AC AGCGT AC A T G G AG CTG AG TTCTCTG AG AAG T GAG

GACACAG CCG TTTACTACTG CG CTACCG AG TCCAG AG G TATTG G C

T GGCC A T ACTTCG ACT ATTGG GGT C AGGGC ACCCTGGTT AC AG TG

AGTTCAGGAGGCGGGGGCTCTGGGGGGGGCGGTTCCGGAGGGGG

GGGCTC A G A T A T AC A G A T GAC GC AG AG T C C A T C A AG T C TCTC AGC

CAG CG TGG GAG ATCGCGTGACTATTACTTGCCGCGCCAGCCAGAG

T A T T AGCTCCT ATC TG AA TT GGT ACC AGC AAAAG CCCG G G AAG G C

CCCTAAGCTTCTGATTTCTGGCGCCTCCTCTTTGAAGTCAGGTGTG

CCAAG CAG ATTTAG CG G G TCTG G AAG TG G CACTG ACTTTACACTT

ACTATCTCCAG CCTG CCCCCAG AG G ATTTTG CCACATATTACTG TC

AG C AAAG C TAC TC TAC TC C AATC AC TTTCG G C CAG G G C ACAAG AT

TG G AG ATTAAG AG G G C TG C CG CAC TTTC AAATTC CATCATG TATT

TCAG CCATTTTG TG CCTG TTTTTCTTCCG G CCAAACCTACAACCAC

TCCCGCCCCACGCCCACCTACTCCCGCCCCTACCATTGCCTCCCAG

CCTCTGTCTCTTAGACCTGAGGCTTGTAGACCTGCTGCCGGCGGA

GCCGTGCACACTCGCGGTCTGGACTTCGCCTG CG ACATCTATATCT

GGGCCCCTCTGGCCGGCACCTGCGGCGTTCTCCTTCTCTCACTCGT

A A T C AC ACTCT A T T GC A A T C AC AG G AAC AG ATCC A A AAG AAG C C

G CCTG CTCCATAG CG ATTACATG AATATG ACTCCACG CCG CCCTG

G CCCCACAAG G AAAC AC TAC C AG C C TTAC G C AC CAC CTAG AG ATT

TCG CTG CCTATCG G AG CAG G G TG AAG TTTTCCAG ATCTG CAG ATG

C AC C AG CG TATCAG CAG G G CCAG AACCAACTG TATAACG AG CTC

AACCTG G G ACG CAG G G AAG AG TATG ACG TTTTG G ACAAG CG CAG

AG G AC G G G AC C CTG AG ATG G G TG G C AAAC C AAG AC G AAAAAACC

C C CAG G AG G G TC TCTATAATG AG C TG C AG AAG G ATAAG ATG G C T

G A AG C C TATTC TG AAA TAG G C A TG AAA G G A G AG C G G AG A AG G G G

AAAA G G G C ACG ACG G TTT GT ACC AG G G ACTC AGC ACTGCT AC G A

AG G ATAC TTATG AC G C TC TC C AC ATG C AAG C CC TG C C AC C TAG G

(SEQ ID NO. 91)

AA del Clon 20C5.1 CD8 CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras

Q V QL V Q S GAE VKKPG AS V K V S CK V S G Y TL TEL SMHW VRQ APG KG L

EW M G GFDPEDGETIY AQ KF QGRVT VTEDT STDT A Y M E L S SLRSEDT

AVYYCATESRGIGW PYFDYW GQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS

D IQ M TQ SP S SL S AS VG DRVTITCRASQ SIS S Y L N W Y QQKPGK A P K L L I

SGASSLKSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLPPEDFATYYCQQSYSTPITF

G Q G TR LEIKR AAALSN SIM YF SHF VPVFLPAKPTTTP APRPPTP A P T IA

S QPL SLRPE ACRP A AG G A VH TR G LDF A C D IY IW APL A G TC G V LLL SL

V IT L Y CNHRNRSKRSRLLHSD YM NM TPRRPG PTRKHY QP Y APPRDF

AAYR SR VKF SRS A D AP A Y Q Q G Q NQ LYNELNLG RREEYD V LD KR R G

R D PEM G G KPRRKNPQ EG LYNELQ KDKM AEAYSEIG M KG ERRRG KG

H D G LY Q G LS TA TK D TY D A LH M Q A LP P R (SEQ ID NO. 92)

ADN del Clon 20C5.2 HC

C AGGTCC AG TT G G TCG AAAG T GGCGGT GGTGT AG T GC AGCCGGGC

CG CAG TTTG AGGCTTTCCTGTGCGGCTTCAGGCTTTACTTTTTCCA

G CTATGG AATGCACTGG GTGCGGCAG GCCCCCGGCAAAGGACTT

G AG TG G G TG G CC G TC ATTTC TTATG AC G G ATC AG ATAAG TACTAC

G TG G ACAG CG TCAAG G G CAG ATTCACCATCTCTAG G G ACAACAG T

A A AA ATAG A C TC TAC C TC C A G ATG A ATAG C C TC AG A G C TG AA G AC

ACGG CCGTCTACTATTG TG CTCG G G AG CG G TATAG TG G CAG AG AC

TACTG G G G G CAG G G CACACTCG TTACAG TG AG TAG C (SEQ ID NO.

93)

AA del Clon 20C5.2 HC (CDR en subrayado)

OVOLVESGGGVVOPGRSLRLSCAASGFTFSSYG M HW VRO APG KG LE

W Y A V I SYDGSDK Y Y V D S VKG RF T I SRDN SKNRL Y L Q M N SLRAEDT A

Y Y Y C A R ER YSG RDYW GOGTLYTYSS (SEQ ID NO. 94) AA del Clon 20C5.2 HC CDR1: GFTFSSY (SEQ ID NO. 95)

AA del Clon 20C5.2 HC CDR2: SYDGSD (SEQ ID NO. 96)

AA del Clon 20C5.2 HC CDR3: ERYSGRDY (SEQ ID NO. 97)

ADN del clon 20C5.2 LC

G AG ATTG TTATG ACCCAG AG TCCTG CG ACCCTCTCAG TCAG CCCC

G G G G AG CG CG CAACTTTG TCTTGCAG AGCTAGTCAG TCCGTGTCC

TCTCTTCTG ACATG G TACCAG CAAAAG CCCG G G CAG G CTCCG CG C

C TTTTG ATCTTTG G G G CTTCAACAAG AG CCACTG G G ATTCCCG CA

CG ATTCTCTG GCTCCGGG AGCGGTACTG GTTTCACCCTGACGATT

AG CAG TCTCCAG AG CG AG G ACTTCG CCG TATACTACTG CCAG CAG

TAC G A TAC G TG G C C ATTC AC TTTTG G AC CAG G G AC TAAAG TG G AT

TTTAAG CG C (SEQ ID NO. 98)

A A de l C lon 20 C 5.2 LC (C D R en sub raya do )

EIVM TO SPATLSVSPGERATLSCRASOSVSSLLTW YO O KPG O APR LLI

FGASTRATGIPARFSGSGSGTGFTLTISSLQSEDFAVYYCOOYDTW PF

TFG PG TKVDFKR (SEQ ID NO. 99)

AA del Clon 20C5.2 LC CDR1: RASQSVSSLLT (SEQ ID NO: 100)

AA del Clon 20C5.2 LC CDR2: GASTRAT (SEQ ID NO. 101)

AA del Clon 20C5.2 LC CDR3: QQYDTWPFT (SEQ ID NO: 102)

ADN del Clon 20C5.2 CD28T CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras

ATGG CACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCC

TGCACGCCGCACGCCCGCAGGTCCAGTTGGTCGAAAGTGGCGGTG

GTGTAGTGCAGCCGGGCCGCAGTTTGAGGCTTTCCTGTGCGGCTT

CAG G CTTTACTTTTTCCAG CTATG G AATG CACTG G G TG CG G CAG G

CCCCCG G CAAAGG ACTTGAGTGG GTGGCCGTCATTTCTTATGACG

G AT C A G A T A A G T ACT ACGT GGAC AGCGTC AAGGGC A G ATT C ACC

ATC TC TA G G G AC AA C A G TA A A A A TA G A C TC TA C C TC C A G A TG A A T

AG CCTCAG AG CTG AAG ACACG G CCG TCTACTATTG TG CTCG G G AG

C GGT A T AG T GGC AG AG AC T AC T GGGGGC AGGGC AC AC TC GTT AC

AG T GAGT AG C GGC GGAGGAGGGAGT GGGGGC GGT GGC TC C GGT G

GAG G AG G TTCTG AG ATTG TTATG ACCCAG AG TCCTG CG ACCCTCT

CAGTCAG CCCCGGGG AGCGCGCAACTTTGTCTTGCAGAGCTAGTC

AG TCCG TG TCCTCTCTTCTG ACATG G TACCAG CAAAAG CCCG G G C

AG G CTCCG CG CCTTTTG ATCTTTG G G G CTTCAACAAG AG CCACTG

GGATTCCCGCACGATTCTCTGGCTCCGG GAGCGG TACTGGTTTCA

CCCTG ACG ATTAG CAG TCTCCAG AG CG AG G ACTTCG CCG TATACT

AC TG CCAG CAG TACG ATACG TG G CCATTCACTTTTG G ACCAG G G A

CT A A A G T G G ATTTT AAGCGCGCCGCCGCTCTCGAT A A C G A A A A G T

C AAATG G C AC C ATAATC CACG TCAAAG G C AAG CAC CTG TG CC C TT

CCCCGCTCTTCCCCG GACCCAGTAAACCATTTTGGGTGCTGGTTGT

TGTGGGGGGCGTGCTGGCCTGCTATAGCCTTTTGGTCACTGTAGC

C TTC ATTATTTTTTG G G TC AG ATC CAAAAG AAG C C G C C TG CTC C AT

AG CG ATTACATG AATATG ACTCCACG CCG CCCTG G CCCCACAAG G

AAAC AC TAC C AG C C TTAC G C AC C AC C TAG AG ATTTCG CTG CC TAT

CG G AG CAG G G TG AAG TTTTCCAG ATCTG CAG ATG CACCAG CG TAT

C AG C AGGGC C A G A AC C A AC T GT A T A ACGAGC TC A ACC TGGGACG

CAG G G AAG AG TATG ACG TTTTG G ACAAG CG CAG AG G ACG G G ACC

C TG AG ATG G G TG G CAAACC AAG ACG AAAAAAC CC C C AG G AG G G T

C TC TA TA ATG AG C TG C AG AAG G ATAAG ATG G C TG AAG C C TATTC T

G A AATA G G C ATG A AAG G AG AG C G G A G AA G G G G AA AAG G G C AC G

AC G G TTTG TAC C AG G G ACTC AG CAC TG CTACG AAG G ATAC TTATG

ACG CTCTCCACATG CAAG CCCTG CCACCTAG G TAA (SEQ ID NO.

103)

AA del Clon 20C5.2 CD28T CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras (Péptido señal en negritas)

M A LP V T A LLLP LA LLLH A A R P Q V Q LV E S G G G V V Q P G R S LR LS C A A

SGFTF S S Y G M H W VR Q APG KG LEW VAVIS YD G S D KYY VD S VKG R FTI

SRDN S K N R LYLQ M N S LR A E D TA V Y Y C ARERYSG RDYW G Q G TL V T V

S S GGGGS GGGGS GGGGSEIVMT Q SP A T L S V SPGER A T L S CRAS Q S V S S

LLTWYQQKPGQAPRLLIFGASTRATGIPARFSGSGSGTGFTLTISSLQS

EDFAVYYCQQYDTWPFTFGPGTKVDFKRAAALDNEKSNGTIIHVKG

KHLCP SPLFPGP SKPF W V L V V V G G VL AC Y SLL V T V A F IIF W VRSKRSR

LLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRYKFSRSADAP

AYQ Q G Q NQ LYNELNLG RREEYDVLDKRRG RDPEM G G KPRRKNPQ E

GL Y N E LQ K D K M A E A Y SEIGM KGERRRGKGHDGL Y QGL ST A T K

D TYD A LH M Q A LP P R (SEQ ID NO. 104)

A D N del C lon 20 C 5.2 C D 28 T C D 3 ze ta C A R C a d e n a s pe sadas y lige ras

C AGGTCC AG TT G G TCG AAAG T GGCGGT GGTGT AG T GC AGCCGGGC

CG CAG TTTG AGGCTTTCCTGTGCGGCTTCAGGCTTTACTTTTTCCA

G CTATGG AATGCACTGG GTGCGGCAG GCCCCCGGCAAAGGACTT

G AG TG G G TG G CC G TC ATTTC TTATG AC G G ATC AG ATAAG TACTAC

G TG G ACAG CG TCAAG G G CAG ATTCACCATCTCTAG G G ACAACAG T

A A AA ATAG A C TC TAC C TC C A G ATG A ATAG C C TC AG A G C TG AA G AC

ACGG CCGTCTACTATTG TG CTCG G G AG CG G TATAG TG G CAG AG AC

TACTGGG GGCAGG GCACACTCGTTACAGTGAGTAGCGG CG GAGG

AG GGAG T GGGGGCGGT GGCTCCGGTGGAGGAGGTTCTG AGATTG

TTATGACCCAGAGTCCTG CG ACCCTCTCAGTCAGCCCCG GGGAGC

G CGCAACTTTGTCTTGCAGAGCTAGTCAGTCCGTGTCCTCTCTTCT

GACATGGTACCAG CAAAAG CCCG G G CAG G CTCCG CG CCTTTTG AT

CTTTG G G G CTTCAACAAG AG CCACTG G G ATTCCCG CACG ATTCTC

TG GCTCCG GGAGCGGTACTGGTTTCACCCTGACGATTAGCAGTCT

CCAG AG CG AG G ACTTCG CCG TATACTACTG CCAG CAG TACG ATAC

G TG G CC ATTC AC TTTTG G AC C AG G G AC TAAAG TG G ATTTTAAG C G

C G C C G C C G CTC TC G ATAAC G AAAAG TC AAATG G CAC CATAATC C A

CGTCAAAGGCAAGCACCTGTGCCCTTCCCCGCTCTTCCCCGGACC

CAGTAAACCATTTTGGGTGCTGGTTGTTGTGGGGGGCGTGCTGGC

CTG CTATAG CCTTTTG G TCACTG TAG CCTTCATTATTTTTTG G G TC

AG ATC CAAAAG AAG C C G C C TG C TC C ATAG C G ATTAC ATG A ATATG

ACTCCACG CCG CCCTG G CCCCACAAG G AAACACTACCAG CCTTAC

G CACCACCTAG AG ATTTCG CTG CCTATCG G AG CAG G G TG AAG TTT

TCC AG ATCTG C A G A T GC AC C AG CG T ATC AGC AGGGC C A G A AC C A

ACTG T A T AACG AG CTC AACCTGG GACGC AG G G AAG AG T A T GACG

TTTTG G ACAAG CG CAG AG G ACG G G ACCCTG AG ATG G G TG G CAAA

CC A A G A C G A AAAA AC C C C C AG GAGG GT C TCT A T A A T GAGCTGC A

G A AG G AT A A G A T GGC T G A AGC C T A T TC T G A A A T AGGC A T G A A AG

G AG AG CG G AG AAG G G G AAAAG G G CACG ACG G TTTG TACCAG G G A

C TC AG C AC TG C TAC G AAG G ATAC TTATG AC G C TC TC C AC ATG CAA

GCCCTGCCACCTAGG (SEQ ID NO. 105)

AA del Clon 20C5.2 CD28T CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras

Q VQLVESGGGVVQPGRSLRLSC AASGFTF S S YG M H W VR Q APG KG LE

W V AV ISY D G SD KY YVD SV KG R FTIS R D N SK N R LYLQ M N S LR AE D TA

V Y Y C ARERYSGRD YW G Q G TL V T V S SGGGGSGGGGSGGGGSEIVMT

QSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSLLTW YQQKPGQAPRLLIFGAST

RATGIPARFSGSGSGTGFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYDTW PFTFGPG

TK VD FKR A A A LD N E K SN G T IIH V K G K H LC P SPLFPGP SKPF W V L Y Y Y

G G VLAC YSLLVTVAFIIFW YR SKR SR LLH SD YM N M TPR R PG PTR KH Y

QPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQ Q G Q NQ LYNELNLG RREEY

D VLDKR R G R D PEM G G KPR R KN PQ EG LYN ELQ KD KM AEAYSEIG M K

G ERR R G KG H D G LYQ G LSTATKD TYD ALH M Q ALPPR (SEQ ID NO.

106)

ADN del Clon 20C5.2 CD28 CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras

ATGG CACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCC

TGCACGCCGCACGCCCGCAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGCGGCG

GCGTGGTCCAGCCCGGCCGGTCCCTGCGCCTGTCCTGCGCCGCCA

GCGGGTTTACTTTTTCCTCCTACGGCATGCACTGGGTGCGCCAGGC

TCCCGG CAAGG GCCTCGAGTGGGTCGCCGTGATCTCATACGATGG

G TC AG AC AAATAC TATG TC G ATTC TG TTAAAG G G C G G TTTAC C AT

T T C A A G A G A T A AC TC T A A G A A T AGGC T GT A TT T GC A G A T G A AC AG

CCTG AG G G CTG AAG ATACCG CAG TG TACTATTG CG CTAG G G AG CG

GT A T AG T GGC C GC G ATT AC T GGGGAC AG GGT AC AC T GGT GAC C GT

GAGC TC T GGGGGT GGC GGA AGC GGGGGT GGC G G A AGC GGC GGAG

G G G G TAG TG AAATTG TG ATG ACCCAG TCTCCG G CTACACTTTCAG

TCTCCCCTG GGGAGAG AGCTACACTGTCATGCAG AGCGTCCCAGT

CCGTCTCTTCTCTCCTTACCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGC

TCCTCGACTGCTGATCTTCGGTGCCTCCACAAGG GCGACCGGGAT

TCCAG CCCG CTTCTCAGGTTCTGGGAGCGGAACTG GTTTCACTTTG

ACAATCAG TTCACTG CAG TCAG AG G ATTTCG CCG TG TACTACTG C

C AG C AATAC G ACACATG G C C ATTC AC TTTC G G AC CC G G TAC CAAA

G TC G ATTTCAAG AG AG CCG CG G CCATCG AG G TTATG TACCCACCA

C C ATATC TG G A C A A TG A A A A A A G C A A TG G A A C C A TTA TC C A TG TG

AAG G G TAAACACCTCTG CCCTAG CCCACTTTTCCCTG G CCCATCA

AAGCCCTTCTGGGTCTTGGTGGTCGTGGGGGGTGTGCTGGCCTGT

TACAG CCTTCTG G TG ACG G TTG CTTTCATTATCTTCTG G G TTAG AT

C C AAAAG AAG C C G C C TG CTC C ATAG CG ATTAC ATG AATATG AC TC

CACGCCGCCCTGG CCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGCAC

C AC C TAG AG ATTTCG CTG CCTATCG G AG CAG G G TG AAG TTTTCCA

GATCTGC A G A T GC ACC AGC GT A T C AGC AGGGC C A G A AC C A AC T GT

ATAAC G AG C TC AAC CTG G G AC G C AG G G AAG AG TATG AC G TTTTG

G ACAAG CG CAG AG G ACG G G ACCCTG AG ATG G G TG G CAAACCAAG

AC G A AAAA AC C C C C AG GAGG GTCTCT A T A A T GAGCTGC AG AAG G

A T AAG ATG G CTG AAG CC T A T T C T G A A A T AGGC A T G A AAG G AG A G

C G G AG AAG G G G AAAAG G G CACG ACG G TTTG TACCAG G G ACTCAG

C ACTG CTACG AAG G ATACTTATG ACG CTCTCCACATG CAAG CCCT

G CCACCTAG G TAA (SEQ ID NO. 107)

AA del Clon 20C5.2 CD28 CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras (Péptido Señal en negritas)

M A LP V T A LLLP LA LLLH A A R P Q V Q LV E S G G G V V Q P G R S LR LS C A A

SGFTFS S YG M H W VR Q APG KG LE W VA VIS YD G SD KYY VD S VK G R FTI

SRDN SKNRL Y L Q M N S LR A E D T A V Y Y CARERYSGRDYW G QGTL V T V

S S GGGGS GGGGS GGGGSEIVM T Q SP A T L S V SPGER A T L S CRAS Q S V S S

LLTW YQQKPGQAPRLLIFGASTRATGIPARFSGSGSGTGFTLTISSLQS

EDF A V Y Y CQQ YDTW PFTF G P G TKVD FKR AAAIEVM YPPP YLD NEKS

N G TIIH V K G K H LC P SPLFPGP SKPF W V L V V V G G VL AC Y SLL V T V A F II

F W VRSKRSRLLHSD YM NM TPRRPG PTRKHY QP Y APPRDF AAYR SR V

KFSRSADAPAYQ Q G Q NQ LYNELNLG RREEYDVLDKRRG RDPEM G G

KPRRKNPQEGL Y N E LQ K D K M A E A Y SEIGM KGERRRGKGHDGL Y QG

LS T A TK D TY D A LH M Q A LP P R (SEQ ID NO. 108)

ADN del Clon 20C5.2 CD28 CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras

C AG GT GC AGC T C GT GGAGT C T GGC GGC GGC GT GGT C C AGC C C GGC

CGGTCCCTGCGCCTGTCCTGCGCCGCCAGCGGGTTTACTTTTTCCT

CCTACGGCATGCACTGGGTGCGCCAGGCTCCCGGCAAGGGCCTCG

AG TG G G TC G C C G TG ATC TCATAC G ATG G G TC AG ACAAATAC TATG

TC G ATTC TG TTA AA G G G C G G TTTAC C ATTTC AAG AG A TAAC TC TA

A G A A T AGGC T GT ATTTG C A G A T G A AC AGCCTGAGGGC T G A A G A T

ACCG CAG TG TACTATTG CG CTAG G G AG CG G TATAG TG G CCG CG AT

T ACTGGGGAC AGGGT AC ACTGGTG ACCG T GAGCTCTGGGGGT GGC

GG A AGC GGGGGT GGC GG A AGC GGC GGAGGGGGT AG T G A A A T T GT

G ATG ACCCAGTCTCCGGCTACACTTTCAGTCTCCCCTGGGG AGAG

AG CTACACTG TCATG CAG AG CG TCCCAG TCCG TCTCTTCTCTCCTT

ACCTG G TATCAG CAGAAGCCCG GCCAGGCTCCTCGACTGCTGATC

TTCG GTGCCTCCACAAGGG CG ACCG GGATTCCAGCCCGCTTCTCA

G G TTCTG G G AG CG G AACTG G TTTCACTTTG ACAATCAG TTCACTG

C AG TC AG AG G ATTTC G C C G TG TAC TAC TG C C AG C AATAC G ACAC A

TG G C C ATTC AC TTTC G G AC C CG G TAC C AAAG TC G ATTTCAAG AG A

GCCG CG G CCATCG AG G TTATG TACCCACCACCATATCTG G ACAAT

G A A A A A A G C A A T G G A ACC A T T ATCC ATG T GAAG G G T A A A C ACCT

CTGCCCTAGCCCACTTTTCCCTGGCCCATCAAAGCCCTTCTGGGTC

TTGGTGGTCGTGGGGGGTGTGCTGGCCTGTTACAGCCTTCTGGTG

AC G G TTG CTTTC ATTATC TTC TG G G TTAG ATC C AAAAG AAG CC G C

CTG CTCCATAG CG ATTACATG AATATG ACTCCACG CCG CCCTG G C

C C C AC AAG G AAAC AC TAC C AG C C TTAC G C AC CAC CTAG AG ATTTC

G CTG CCTATCG G AG CAG G G TG AAG TTTTCCAG ATCTG CAG ATG CA

C C AG C G TATC AG CAG G G C C AG AAC C AACTG TATAAC G AG C TCAA

CCTG G G ACG CAG G G AAG AG TATG ACG TTTTG G ACAAG CG CAG AG

G ACG G G AC C C TG AG ATG G G TG G CAAACC AAG ACG AAAAAAC CC C

CAGG AG GGT C TC T A T A A T GAGC T GC A G A A G G AT A A G A T GGC T G A

AGC C T A T T C T G A A A T AGGC A T G A A AG G AG AG C G G AG A AG G G G A A

AAG G G C ACG ACG G TTTG TACCAG G G ACTCAG CACTG CTACG AAG

G ATAC TTATG ACG CTCTCCACATG CAAG CCCTG CCACCTAG G

(SEQ ID NO. 109)

AA del Clon 20C5.2 CD28 CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras

Q VQLVESGGGVVQPGRSLRLSC AASGFTF S S YG M H W VR Q APG KG LE

W V AV ISY D G SD KY YVD SV KG R FTIS R D N SK N R LYLQ M N S LR AE D TA

V Y YC AR ERY S GRD Y W GQGTL V T V S S GGGGS GGGGS GGGGSEIVMT

QSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSLLTW YQQKPGQAPRLLIFGAST

RATGIPARFSGSGSGTGFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYDTW PFTFGPG

T K VD FKR A A A IE V M YPPP Y L D N E K SN G T IIH V K G K H LC P SPLFPGP SK

P FW V LV V V G G V LA C Y S LLV TV A FIIFW V R S K R S R LLH S D Y M N M TP R

RPGPTRKHY QP Y APPRDF AA YR SR VKF SRS A D AP A Y QQGQNQL YN E

LN LG R R EEYD VLD KRR G R D PEM G G KPRR KNPQ EG LYN ELQ KD KM A

E A Y SEIGM KGERRRGKGHDGL Y QGL ST A T K D T Y D A LH M Q ALPPR

(SEQ ID NO. 110)

ADN del Clon 20C5.2 CD8 CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras

ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCC

TGCACGCCGCACGCCCG CAGGTGCAGTTG GTTGAATCAGGAG GG

GGTGTGGTGCAACCCGGTCGGTCACTGCGCCTCAGTTGTGCTGCT

TCCG GGTTTACTTTCAG CTCATATG G G ATG CACTG G G TACG G CAG

GCTCC AG GT AA AG G C TT G G AAT GGGTGGCGGT GAT C AG CT A T GAC

G G C TC TG AC AAATATTATG TG G AC TC CG TG AAAG G C AG ATTC AC C

A T C AG TCG AG AC AAC TC A A A G A A T AG AC TCT AC TT GC A G A T G A A T

AG CCTCCGGGCCGAAGATACTGCAGTCTATTATTG CG CCCGGG AG

CGCT AC AG T G G AAG AG AC T ATTGGGGGC A A G G A ACTCTT GT C AC A

GTCTCATCTGGCGGCGGCGGCAGCGGTGGGGGCGGATCTGGCGG

GGGCGGC AGC G A A A T C GTT A T GACTC A G AG T C CTGC C AC AC T GAG

C G TTAG CCCTG G TG AG AG AG CAACACTTAG CTG CAG AG CTAG TCA

G AG TG TTTCCAG TCTTTTG ACATG G TACCAACAG AAG CCCG G TCA

AGCTCCACGACTGCTCATCTTCGG TGCATCCACCCGCGCAACCG G

G ATACCCGCCCGGTTTTCCGG TTCTGGAAGTGG CACAGGATTCAC

G C TCACCATTTCTTCTCTG CAG TCTG AAG ACTTTG CCG TG TATTAC

TGCCAGC AG T ACGATACCTG GCCCTTTACCTTTGG CCC AG GT ACT

AAAG TG G ATTTTA AA C G AG C TG C TG C AC TTTC C AA TAG TATTATG

TACTTTTCACATTTTG TG CCCG TG TTCCTG CCTG CG AAG CCTACG A

CAACCCCAGCCCCTAGGCCGCCCACACCGGCCCCAACTATTGCCT

CCCAG CCATTG TCTCTG AG ACCCG AAG CTTG CAG ACCTG CTG CTG

G AG G C G CCG TTCACACCCG AG G ATTG G ATTTCG CATG TG ACATTT

ACATCTGGGCCCCTTTGGCCGGAACCTGCGGTGTGCTGCTGCTGT

C AC T C GT G A TT AC AC TTT ACTGC A AC C AC CG A A AC A G A T C C A A A A

G AAG CCG CC TG CTC C ATAG CG ATTAC ATG AATATG AC TC C AC G C C

G C C C TG G CCCCACAAG G AAACACTACCAG CCTTACG CACCACCTA

G AG ATTTCG CTG CCTATCG G AG CAG G G TG AAG TTTTCCAG ATCTG

C A G A T GC ACC AGC GT ATC AGC AGGGC C A G A ACC A AC T GT A T A AC

G AG C TC AAC C TG G G AC G C AG G G AAG AG TATG ACG TTTTG G AC AA

GCGC AG AG G AC GGGAC C CTG AG AT GGGT GGC A A AC C A AG AC G A A

AAAACC C C C AG GAGG GTCTCT A T AATG AG C TG C A G A A G G A T A A G

A T GGC T G A AGC C T A T TC T G A A A T AGGC A T G A A AG G AG AG C GGAG

A AG GGG A A A AGGGC ACG AC GGTTTGT AC C AG GGAC TC AGC AC T G

C TACG AAG G ATACTTATG ACG CTCTCCACATG CAAG CCCTG CCAC

C TAG G TA A (SEQ ID NO. 111)

AA del Clon 20C5.2 CD8 CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras (Péptido señal en negritas)

M A LP V T A LLLP LA LLLH A A R P Q V Q LV E S G G G V V Q P G R S LR LS C A A

SGFTFS S Y G M H W V R Q AP G KG LEW VA VIS YD G SD KYY VD S VKG R FTI

SRDN SKNRL Y L Q M N SLRAEDT A V Y Y C ARERYSGRD Y W GGTL V T V S

SGGGGSGGGGSGGGGSEIVMT Q SP A T L S V SPGERATL SCRASQ S V S S

LLTW YQQKPGQAPRLLIFGASTRATGIPARFSGSGSGTGFTLTISSLQS

EDF A V Y Y CQQ YDTW PFTF G PG TKVD FKR A A A LS N SIMYF SHF VPVFL

PAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFAC

D I Y IW A P L A G TC G V LLLS L V IT L Y CNHRNRSKRSRLLHSD YM N M TP R

RPGPTRKHY QP Y APPRDF AAYR SR VKF SRS A D AP A Y QQGQNQL YN E

LN LG R R EEYD VLD KRR G R D PEM G G KPRR KNPQ EG LYN ELQ KD KM A

E A Y SEIGM KGERRRGKGHDGL Y QGL ST A T K D T Y D A LH M Q ALPPR

(SEQ ID NO. 112)

ADN del Clon 20C5.2 CD8 CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras

C AGGT GC AGTT GGTTGAAT C AGGAGGGGGT GT GGT GC AAC CC GGT

CGGTCACTGCGCCTCAGTTGTGCTGCTTCCGGGTTTACTTTCAGCT

C AT AT GGGATGC ACTGGGT ACGGC AGGCTCC AGGTAAAGGCTTGG

AATGGGTGG CG GTGATCAG CTATG ACGGCTCTG ACAAATATTATG

TGGACTCCGTGAAAG GCAGATTCACCATCAG TCGAGACAACTCAA

A G A A T AGACTCT ACTTGC AG AT G AAT AGCCTCCGGGCCGAAGATA

CTGCAGTCTATTATTGCGCCCGGGAGCGCTACAGTGGAAGAGACT

ATTGGGGGCAAGGAACTCTTGTCACAGTCTCATCTGGCGGCGGCG

GC AGCGGT GGGGGCGGAT C T GGC GGGGGC GGC AGC G AA ATCGTT

ATGACTCAGAGTCCTGCCACACTGAGCGTTAGCCCTGGTGAGAGA

GCAACACTTAGCTGCAGAGCTAGTCAGAGTGTTTCCAGTCTTTTG

ACATGGTACCAACAGAAGCCCGGTCAAGCTCCACGACTGCTCATC

TTCGGTGCATCCACCCGCGCAACCGGGATACCCGCCCGGTTTTCC

GGTTCTGGAAGTGGCACAGGATTCACGCTCACCATTTCTTCTCTGC

AG TCTGAAGACTTTGCCGTGTATTACTGCCAGCAGTACGATACCT

GGCCCTTTACCTTTGGCCCAGGTACTAAAGTGGATTTTAAACGAG

CTGCTGCACTTTCCAATAGTATTATGTACTTTTCACATTTTGTGCC

CGTGTTCCTGCCTGCGAAGCCTACGACAACCCCAGCCCCTAGGCC

GCCCACACCGGCCCCAACTATTGCCTCCCAGCCATTGTCTCTGAG

ACCCGAAGCTTGCAGACCTGCTGCTGGAGGCGCCGTTCACACCCG

AGGATTGGATTTCGCATGTGACATTTACATCTGGGCCCCTTTGGCC

GGAACCTGCGGTGTGCTGCTGCTGTCACTCGTGATTACACTTTACT

GCAACCACCGAAACAGATCCAAAAG AAG CCGCCTGCTCCATAGC

GATTACATGAATATGACTCCACGCCGCCCTGGCCCCACAAGGAAA

CACTACCAGCCTTACGCACCACCTAGAGATTTCGCTGCCTATCGG

AGCAGGGTGAAGTTTTCCAGATCTGCAGATGCACCAGCGTATCAG

CAGGGCCAGAACCAACTGTATAACGAGCTCAACCTGGGACGCAG

GGAAGAGTATGACGTTTTGGACAAGCGCAGAGGACGGGACCCTG

AG AT GGGT GGC A AAC C A AG AC G AA A A AAC C C C C AGGAGGGT C T C

T AT A A T GAGCTGC AG AAG G AT AA G AT GGCT GAAG CCTATTCTG AA

ATAGGCATGAAAG GAG AGCGGAGAAGGG GAAAAG GGCACGACG

GTTTGTACCAGGGACTCAGCACTGCTACGAAGGATACTTATGACG

CTCTCCACATGCAAGCCCTGCCACCTAGG (SEQ ID NO. 113)

AA del Clon 20C5.2 CD8 CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras

Q VQLVESGGGVVQPGRSLRLSC AASGFTF S S YG M H W VR Q APG KG LE

W V AV ISY D G SD KY YVD SV KG R FTIS R D N SK N R LYLQ M N S LR AE D TA

V Y YC AR ERY S GRD Y W GQGTL V T V S S GGGGS GGGGS GGGGSEIVMT

QSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSLLTW YQQKPGQAPRLLIFGAST

RATGIPARFSGSGSGTGFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYDTW PFTFGPG

TKVDFKRAAALSNSIM YFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQ P

L SLRPE ACRP A AG G A VH TR G LDF A C D IY IW APL AG T C G V L L L SL V IT L

YCNHRNRSKRSRLLHSDYM NM TPRRPG PTRKHYQ PYAPPRDFAAYR

SRVKF SRS AD AP A Y QQG Q NQ LYNELNLG RREEYDVLDKRRG RDPE

M G G KPR R KN PQ EG LYNELQ KD KM AEAYSEIG M KG ER R R G KG H D G L

YQ G LS TA TK D TY D A LH M Q A LP P R (SEQ ID NO. 114) ADN del Clon 20C5.2 CD28T CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras

ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCC

TGCACGCCGCACGCCCG GAG ATTGTGATGACCCAG TCCCCTG CTA

CCCTGTCCGTCAGTCCGGGCGAGAGAGCCACCTTGTCATGCCGGG

C C AG CCAG TCCG TCAG CAG TCTCCTG ACTTG G TATCAG CAAAAAC

CAG G G CAGGCACCGCGG CTTTTGATTTTTGGTGCAAGCACACGCG

C C ACTG G CATTCCAG CTAG G TTTTCTG G AAG TG G ATCTG G G ACAG

G CTTCACTCTG ACAATCAG TAG CCTG CAG AG TG AG G ACTTTG CTG

TTTACTACTG TCAACAG TACG ACACCTG G CCATTCACATTCG G G C

CC GGC AC C A AGGTCGAC TT C A AGAGGGGCGGT GGAGGTT C AGGT

GGTGGCGGGTCAGGCGGCGGTGGGTCTCAGGTTCAACTGGTGGA

ATCAG GTGGCGGCGTTGTCCAACCGGG GCGATCACTTCGACTTTC

CTG TG CTG CCTCAG G CTTTACTTTTTCATCCTATG G G ATG CACTG G

GTTC GGC AGGC T C CCGGA A A AG G AC T C GAGT GGGTT GC AG T GAT C

TCTT AC G AT GGCTC AG AC A A G T A T T A T GT GGACTC AG T C AAG G G G

AG ATTC A C AATA AG C C G AG AC AA C TC C AAA AA C C G G C TTTATC TC

C AG A TG AACAG C C TTAG AG C G G AAG ATAC C G C G G TATAC TAC TG T

GCCCGCGAGAGGT ATTCCGGC AG AG A C T ACTGGG GAC AGGGC AC

AC TG G TCACCG TG AG TTCTG CCG CAG CG CTCG ATAACG AAAAG AG

CAACG G AACC ATTATC C AC G TTAAG G G C AAG C AC C TG TG C C CC AG

TCCCCTCTTCCCAG G ACCATCTAAACCCTTCTG G G TTCTG G TAG TA

GTTGGAGGGGTCCTTGCATGTTACTCCCTTTTGGTCACCGTCGCCT

TC ATTATTTTC TG G G TG AG ATCC AAAAG AAG C C G C CTG C TC C ATA

GCG ATTACATG AATATG ACTCCACG CCG CCCTG G CCCCACAAG G A

AACACTACCAG CCTTACG CACCACCTAG AG ATTTCG CTG CCTATC

GGAGC AGGGT G AAG TTTTCC AG ATCTG C A G A T GC ACC AG CG T ATC

AG CAG G G CCAG AACCAACTG TATAACG AG CTCAACCTG G G ACG C

AGGGAAGAGTATGACGTTTTGGACAAGCGCAGAGGACGGGACCC

T G AG AT GGGT GGC A A AC C A AG AC G A A A A A AC CCC C AG GAGG GT C

TC TA TAATG AG C TG C AG AAG G ATAAG ATG G C TG AAG C C TATTC TG

AAATAG G C ATG AA AG G AG A G C G G A G AA G G G G AAA AG G G C AC G A

C G G TTTG TAC C AG G G AC TC AG C AC TG C TAC G AAG G ATAC TTATG A

CG CTCTCCACATG CAAG CCCTG CCACCTAG G TAA (SEQ ID NO. 115)

M A L P V T A L L L P L A L L L H A A R P E IV M T Q SP A T L S V SPGERATLSCRA

SQSVSSLLTW YQQKPGQAPRLLIFGASTRATGIPARFSGSGSGTGFTL

TIS SLQSEDF A V Y Y CQQYDTW PFTF GPGTKVDFKRGGGGSGGGGSG

GGGSQ VQLVESGGGVVQPGRSLRLSC AASGFTF S S YG M H W VR Q APG

KG LE W VA VIS YD G S D K YY VD SVK G R FTISR D N S KN R LY LQ M N SLR A

E D T A V Y Y C ARERYSGRDYW GQGTL V T VSS A A A LD N E K S N G T IIH V K

G KHLCPSPLFPG PSKPFW VLVVVG G VLACYSLLVTVAFIIFW VRSKRS

RLLHSDYM NM TPRRPG PTRKHYQ PYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADA

PAYQQ GQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRG RDPEM GGKPRRKNPQ

EG L Y N E LQ K D K M A E A Y SEIGM KGERRRGKGHDGL Y QGL ST A TK D T

YD A LH M Q A LP P R (SEQ ID NO. 116)

ADN del Clon 20C5.2 CD28T CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras

GAGATTGTGATG ACCCAGTCCCCTGCTACCCTGTCCGTCAGTCCG

GGCGAGAGAGCCACCTTGTCATGCCGGGCCAGCCAGTCCGTCAGC

AG TCTCCTG ACTTGGT A T C AGC A A A A AC C AGGGC AGGC ACCGCGG

C TTTTG ATTTTTG G TG CAAG CACACG CG CCACTG G CATTCCAG CTA

G G TTTTCTG G AAG TG G ATCTG G G ACAG G CTTCACTCTG ACAATCA

G TAG CCTG CAG AG TG AG G ACTTTG CTG TTTACTACTG TCAACAG T

ACGACACCTGGCCATTCACATTCGGGCCCGGCACCAAGGTCGACT

T C A AGAGGGGC GGT GGAGGT T C AG GT GGT GGC GGGT C AGGC GGC

GGT GGGT C TC AG GT T C A AC T GGT GGA A T C AG GT GGC GGC GTT GT C

CAACCGG GGCGATCACTTCGACTTTCCTGTGCTGCCTCAGGCTTTA

CTTTTTCATCCTATGGGATGCACTGGGTTCGGCAG GCTCCCGGAA

A AG GAC TC GAGTGGGTT GC AG T GATC TC TT AC G AT GGC TC AG AC A

AG T A TT A T GT GGAC T C AG T C A AG G G G AG ATTC AC A A T A AGCC GAG

AC A AC TC C AA AA AC C G G C TTTATC TC C AG ATG AAC AG C C TTAG AG

CGG AAG ATACCG CG G TATACTACTG TG CCCG CG AG AG G TATTCCG

GC AG AG A C T ACTGGGGAC AGGGC AC ACTGGTC ACCGTGAGTTCTG

C C G C AG C G C TC G ATAAC G AAAAG AG C AACG G AAC CATTATCC AC

GTTAAGGGCAAGCACCTGTGCCCCAG TCCCCTCTTCCCAGGACCA

TCTAAACCCTTCTGG GTTCTGG TAGTAG TTG GAGG GGTCCTTGCAT

G TTACTCCCTTTTGGTCACCGTCG CCTTCATTATTTTCTGG GTGAG

ATC C AAAAG AAG C C G C C TG C TC C ATAG C G ATTAC ATG AATATG AC

TCCACGCCGCCCTGGCCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGC

ACCACCTAG AG ATTTCG CTG CCTATCG G AG CAG G G TG AAG TTTTC

C AG ATCTG C A G A T GC ACC AG CG T ATC AGC AGGGCC AG AAC C A AC

TG TATAAC G AG CTC AACC TG G G AC G C AG G G AAG AG TATG AC G TTT

TG G ACAAG CG CAG AG G ACG G G ACCCTG AG ATG G G TG G CAAACCA

AG AC G AA AAAAC C C C C AG G AG G G TC TC TATAATG AG C TG C AG AA

GGAT A A G A T GGCTGA AGCC T A TTC TG A A A T AGGC A T G A A AG G AG

AGC GG A G A AG G G G A A A AGGGC AC GAC GGTT T GT AC C AGGGAC T C

AG CAC TG CTACG AAG G ATACTTATG ACG CTCTCCACATG CAAG CC

CTGCCACCTAGG (SEQ ID NO. 117)

AA del Clon 20C5.2 CD28T CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras

E IV M TQ SP A T L S V SPGERATLSCRASQ S V S SLLTW Y QQKPGQ AP R LLI

FGASTRATGIPARFSGSGSGTGFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYDTW PF

TFGPGTKVDFKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLR

LSC AASG FTFSSYG M HW VR Q APG KG LEW VAVISYD G SD KYYVD SV

KG RFTISRDN SK N R LYLQ M N SLRAEDT A Y Y Y C ARERYSGRDYW GQ

G TL Y T Y S S A A A LD N E K S N G TIIH Y K G K H LC P SPLFPGP SKPF W V L V V

VG G VLAC YSLLVTVAFIIFW VR SKR SR LLH SD YM N M TPR R PG PTR KH

Y QP Y APPRDF AA YR SR VKF SRS A D AP A Y Q QG QNQLYNELNLGRREE

YD VLD KR R G R D PEM G G KPR R KN PQ EG LYN ELQ KD KM AEAYSEIG M

KG ER R RG KG H D G LYQ G LSTATKDTYE)ALHM Q ALPPR (SEQ ID NO.

118)

ADN del Clon 20C5.2 CD28 CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras

ATGG CACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCC

TG CACG CCG CACG CCCG G AG ATCG TCATG ACACAG AG TCCAG CTA

CCCTGAGCGTGTCCCCTGGAGAGAGAGCCACCCTGTCCTGTAGGG

C TAG TCAG AG TG TG TCCAG CCTCCTCACCTG G TATCAACAG AAG C

CTGGTCAAGCTCCCCGGCTGCTTATCTTCGGGGCCAGCACGCGAG

CCACAGGCATCCCGGCCAGATTCTCTGGCTCTGGCAGTGGCACCG

GGTTCACTCTCACG ATCTCATCCCTG CAG TCAG AG G ATTTCG CTG T

G TATTACTG TCAG CAG TACG ATACATG G CCCTTCACCTTCG G CCC

GGG CACAAAAGTAG ATTTCAAG CG CG G CG G CG G G G G TAG TG G G G

GCGGGGGAT C AGGAGGAGGGGGC TCC C A AG T AC AG CTGG TT GAG

AGCGGCGGCGGGGTGGTTCAGCCCGGGCGCAGCCTCAGGCTGAG

TTG C G C AG C ATC AG G ATTC AC ATTC AG TTC TTATG G AATG C ATTG

GGT C AG AC AGGCTCCCGGGAAGGGCCTT G A A T GGGT GGC AG TC A

TTAG C TAC G A C G G AA G C G ATA AG TAC TATG TG G AC TC AG TTAA AG

G G A G ATTTAC TATC AG C C G C G A C AATTC C AAA AAC A G ATTG TATT

T GC A G A T GAACTCCCTC AGGGCGGAGGAC ACTGCTGT A T A TT ACT

GCGCACG AG AG AG ATACTCCG G CCG AG ACTATTG G G G CCAAG G A

ACATTG G TAACTG TG AG CTCCG CCG CAG CTATTG AG G TCATG TAC

C C C C C AC C TTA TC TC G A TAATG A G AA G AG TA ATG G G AC TATAA TT

CACG TAAAGG GCAAACACCTG TG CCCTTCCCCGCTGTTTCCAGG T

CCAAGTAAGCCGTTCTGGGTCCTGGTTGTGGTGGGAGGGGTGCTG

G CCTG CTATTCTCTGTTGGTTACCGTGGCCTTTATCATTTTCTGGGT

G A G ATC C AAA AG AAG C C G C C TG C TC C ATAG C G ATTAC ATG AATAT

G ACTCCACG CCG CCCTG G CCCCACAAG G AAACACTACCAG CCTTA

CG CACCACCTAG AG ATTTCG CTG CCTATCG G AG CAG G G TG AAG TT

TTCCAG ATCTG CAG ATG CACCAG CG TATCAG CAG G G CCAG AACCA

ACTG T A T AACG AG CTC AACCTGG GACGC AG G G AAG AG T A T GACG

TTTTG G ACAAG CG CAG AG G ACG G G ACCCTG AG ATG G G TG G CAAA

CC A A G A C G A AAAA AC C C C C AG GAGG GT C TCT A T A A T GAGCTGC A

G A A G G A TA A G A TG G C TG A AG C C TATTC TG AAA TAG G C A TG AAA G

GAGAGC G G AG A AG G G G A A A AGGGC AC GAC GGT TT GT AC C AG G G A

C TC AG C AC TG C TAC G AAG G ATAC TTATG AC G C TC TC C AC ATG CAA

GCCCTG CCACCTAG GTAA (SEQ ID NO. 119)

M A L P V T A L L L P L A L L L H A A R P E IV M T Q SP A T L S V SPGERATLSCRA

SQSVSSLLTW YQQKPGQAPRLLIFGASTRATGIPARFSGSGSGTGFTL

TIS SLQSEDF A Y Y Y CQQYDTW PFTF GPGTKYDFKRGGGGSGGGGSG

GGGSQ VQLVESGGGVVQPGRSLRLSC AASGFTF S S YG M H W VR Q APG

KG LE W VA VIS YD G S D K YY VD SVK G R FTISR D N S KN R LY LQ M N SLR A

EDT A V Y Y C ARERYSGRD Y W GQGTL V T V S S A AA IEVM YPPP Y LD N E K

SN G T IIH V KG K H LC P SPLFPGP SKPF W V L V V V G G VL AC Y SLL V T V A F I

IF W VRSKRSRLLHSD YM NM TPRRPG PTRKHY QP Y APPRDF A A YRSR

VK F SRS A D AP A Y Q Q G Q NQ LYNELNLG RREEYD YLDKRRG RDPEM G

GKPRRKNPQEGL Y N E LQ K D K M A E A Y SEIG M KG ERRRG KG HDG LY Q

G LSTATKD TYD ALH M Q ALP PR (SEQ ID NO. 120)

ADN del Clon 20C5.2 CD28 CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras

G AG ATCG TCATG ACACAG AG TCCAG CTACCCTG AG CG TG TCCCCT

GG AG AG AG AG C C AC C C T GT C C T GT AGGGC T AG T C AG AG T GT GTC C

AG CCTCCTCACCTG G TATCAACAG AAG CCTG G TCAAG CTCCCCG G

CTGCTTATCTTCGGGGCCAGCACGCGAGCCACAGGCATCCCGGCC

AG ATTCTCTGGCTCTGGCAGTG GCACCG GGTTCACTCTCACGATCT

CATCCCTG CAG TCAG AG G ATTTCG CTG TG TATTACTG TCAG CAG T

ACG ATACATG G CCCTTCACCTTCG G CCCG G G CACAAAAG TAG ATT

TCAAG CGCGGCGGCGGGGGTAGTGGGGGCGGGGGATCAGGAGGA

GGG GGCTCCCAAGTACAGCTGGTTGAGAGCGGCGGCGGGGTGGT

TCAGCCCGGGCGCAG CCTCAGG CTGAGTTGCGCAGCATCAGGATT

C ACATTCAG TTCTTATG G AATG CATTG G G TCAG ACAG G CTCCCG G

G AAG G G CCTTG AATG G G TG G CAG TCATTAG CTACG ACG G AAG CG

A T A A G T AC T A T GT GGACTC AG TT A AA G G G A G ATTT AC T ATC AGCC

G C G A C A ATTC C A AA AAC AG ATTG TATTTG C AG A TG AA C TC C C TC A

G G G CG G AG G ACACTG CTG TATATTACTG CG CACG AG AG AG ATACT

CCGGCCGAGACT A TT GGGGCC A A G G A A C ATTG G T AAC TG T GAGCT

CCG CCG CAG CTATTG AG G TCATG TACCCCCCACCTTATCTCG ATA

A T G AG A AG AG T A A T GGGACT A T A A TT C AC GT A A AGGGC A A AC AC

CTGTGCCCTTCCCCGCTGTTTCCAGGTCCAAGTAAGCCGTTCTGGG

TCCTGGTTGT GGT GGGAGGGGT GCTGGCCTGCT ATTCTCTG TT GGT

TACC G TG G C C TTTATCATTTTC TG G G TG AG ATC C AAAAG AAG CC G

CCTG CTCCATAG CG ATTACATG AATATG ACTCCACG CCG CCCTG G

C C C C AC AAG G AAACAC TAC CAG C CTTACG CACC ACC TAG AG ATTT

CGCTG CCTATCG G AG CAG G G TG AAG TTTTCCAG ATCTG CAG ATG C

AC C AG C G TA TCAG C AG G G C CAG AAC CAAC TG TATAAC G AG C TC A

ACCTG G G AC G C AG G G AAG AG TATG AC G TTTTG G AC AAG C G C AG A

GGAC GGGAC C C T G AG AT GGGT GGC A A AC C A AG AC G A A A A A AC C C

C C AG GAGG GT C T C T A T A A T GAGC T GC A G A AG G AT A A G A T GGC T G

AAG CCT A T T C T G A A A T AGGC A T G AAAG G AG AG C G G AG AAG G G G A

AAAG G G C AC G AC G G TTTG TACC AG G G ACTC AG CAC TG CTACG AA

G G ATACTTATG ACG CTCTCCACATG CAAG CCCTG CCACCTAG G

(SEQ ID NO. 121)

AA del Clon 20C5.2 CD28 CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras

E IV M TQ SP A T L S V SPGERATLSCRASQ S V S SLLTW Y QQKPGQ AP R LLI

FGASTRATGIPARFSGSGSGTGFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYDTW PF

TFGPGTKVDFKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLR

LSC AASG FTFSSYG M HW VR Q APG KG LEW VAVISYD G SD KYYVD SV

KG RFTISRDN SKNRL Y L Q M N SLRAEDT A V Y Y C ARERYSGRDYW GQ

G TL Y T Y S S A A A IE V M YPPP YLD N E K S N G TIIH V K G K H LC P SPLFPGP S

KPF W V L V V V G G VL AC Y SLL V T V A F IIF W VRSKRSRLLHSD YM N M TP

RRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNf

ELN LG R R EEYDVLDKRRG RDPEM G G KPRRKNPQ EG LYNELQ KDKM

A E A Y SEIGM KGERRRGKGHDGL Y QGLST A T K D T Y D A LH M Q ALPPR

(SEQ ID NO. 122)

ADN del Clon 20C5.2 CD8 CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras

ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCC

TGCACGCCGCACGCCCGGAAATAGTGATGACTCAGTCCCCGGCCA

CCCTCAGCGTGTCCCCCGGGGAGCGAGCGACCCTGTCATGCAGGG

CTTCCCAGAGTGTCAGCTCCCTGCTCACTTGGTATCAGCAAAAGC

CGGGGCAGGCTCCCCGCCTCCTCATCTTCGGGGCATCAACTAGGG

CCACCGGCATTCCTGCAAGATTTTCCGGGTCTGGCAGCGGCACCG

GCTTCACCCTTACCATTAGCTCTCTGCAGTCTGAGGACTTCGCCGT

TTACTATTGTCAGCAGTATGATACTTGGCCCTTTACCTTCGGTCCC

GGA AC T A AGGT GGAC TT C A AGC GC GGGGGGGGT GGAT C T GGAGG

TGGTGGCTCCGGGGGCGGTGGAAGCCAGGTCCAGTTGGTTGAGA

GCGGCGGCGGAGTGGTGCAGCCCGGGAGGTCCTTGCGGCTGAGC

TGTGCAGCCTCCGGTTTTACTTTTTCTAGCTATGGAATGCATTGGG

T AAG AC AGGCTCCC GGAAAAGGCCTCGAGT GGGTGGCGGT C ATT

AGCT AT GAT GGAT CT GAT A A A T AC T AT GT GGACT C AG TT A AGGGG

CG CTTCACAATC TCAAG AG AC AATAG C AAAAATAG AC TG TAC C TG

CAGATGAATAGTCTGCGCGCCGAGGACACTGCCGTGTACTACTGC

GCC CGCGAGAGAT AC AGC GGAC GGGATT ACTGGGGCC AGGGT AC

CCTCGTAACGGTGTCCTCCGCTGCCGCCCTTAGCAACAGCATTAT

GTACTTTTCTCATTTCGTGCCAGTCTTTCTCCCAGCAAAGCCCACC

ACTACCCCGGCCCCCAGGCCGCCTACTCCTGCCCCCACTATCGCG

TCTCAGCCTCTCTCCTTGCGGCCCGAGGCCTGCCGGCCAGCCGCA

GGGGGCGCCGTACATACTCGGGGTTTGGATTTCGCTTGCGACATA

TATATTTGGGCCCCCCTCGCCGGCACATGTGGAGTGCTGCTCCTG

AG TCTCG TTATAAC CC TC TATTG C AAC C ATAG AAAC AG ATCC AAA

AG AAG CCGCCTGCTCCATAGCGATTACATG AATATGACTCCACG C

CGCCCTGGCCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGCACCACCT

AG AGATTTCGCTGCCTATCGGAGCAGGGTGAAGTTTTCCAGATCT

GCAG ATGCACCAGCGTATCAGCAGGG CCAGAACCAACTGTATAA

CGAGCTCAACCTGGGACGCAGGGAAGAGTATGACGTTTTGGACA

AG CGCAGAGGACGGGACCCTGAGATGGGTGGCAAACCAAGACGA

AAAAACCCCCAG G AG G G TCTCTATAATG AG CTG CAG AAG G ATAA

GAT GGCT G A AGC C T AT TC T G A A A T AGGC AT G A A AG G AG AGC GGA

GAAGGGGAAAAGGGCACGACGGTTTGTACCAGGGACTCAGCACT

GCTACGAAGGATACTTATGACGCTCTCCACATGCAAGCCCTGCCA

C C TAG G TAA (SEQ ID NO. 123)

M A L P V T A L L L P L A L L L H A A R P E IV M T Q SP A T L S V SPGERATLSCRA

SQSVSSLLTW YQQKPGQAPRLLIFGASTRATGIPARFSGSGSGTGFTL

TISSLQSEDFAVYYCQQYDTW PFTFGPGTKVDFKRGGGGSGGGGSG

GGGSQ VQLVESGGGVVQPGRSLRLSC AASGFTF S S YG M H W VR Q APG

K G LE W VA VIS YD G S D K YY VD SVK G R FTISR D N S KN R LY LQ M N SLR A

E D T A V Y Y C ARERYSGRDYW G Q G TLVT V S SAAALSN SIM YF SHFVPV

FLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA

C D IY IW APL AG T C G V LL L SL V IT L Y CNHRNRSKRSRLLHSD Y M N M TP

RRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNf

ELN LG R R EEYDVLDKRRG RDPEM G G KPRRKNPQ EG LYNELQ KDKM

A E A Y SEIGM KGERRRGKGHDGL Y QGLST A T K D T Y D A LH M Q ALPPR

(SEQ ID NO. 124)

ADN del Clon 20C5.2 CD8 CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras

G AAATAGTGATGACTCAGTCCCCGGCCACCCTCAG CG TG TCCCCC

GGGGAGCGAGCGACCCTGTCATGCAGGGCTTCCCAGAGTGTCAGC

TCCCTGCTCACTTGGTATCAGCAAAAGCCGGGGCAGGCTCCCCGC

CTCCTCATCTTCGG GGCATCAACTAGGGCCACCGGCATTCCTGCA

AG ATTTTCCGGG TCTGG CAGCGGCACCGGCTTCACCCTTACCATT

AG CTCTCTG CAG TCTG AG G ACTTCG CCG TTTACTATTG TCAG CAG T

ATG ATACTTG G CCCTTTACCTTCG G TCCCG G AACTAAG G TG G ACTT

CAAGCGCGGGGGGGGTGGATCTGGAGGTGGTGGCTCCGGGGGCG

GT GGAAGCC AGGTCC AG TTG G TT GAGAGCGGCGGCGGAGT GGT G

CAGCCCGGGAGGTCCTTGCGGCTGAGCTGTGCAGCCTCCGGTTTT

ACTTTTTC TAG CTATG G AATG C ATTG G G TAAG ACAG G C TC CC G G A

AAAG G CCTCG AG TG G G TG G CG G TCATTAG CTATG ATG G ATCTG AT

A A A T AC T ATG T GGACTC AG TT A AGGGGCGCTT C AC AATC TC A A G A

GAC A A T AGC A A A A A T AG AC T GT AC C T GC A G A T G A A T AGTC TGC GC

GCCGAG GACACTGCCGTGTACTACTGCGCCCG CG AGAGATACAGC

GGACGGGATTACTG GGGCCAGG GTACCCTCGTAACGGTGTCCTCC

G C TG CCG CCCTTAG CAACAG CATTATG TACTTTTCTCATTTCG TG C

CAGTCTTTCTCCCAGCAAAGCCCACCACTACCCCGGCCCCCAGGC

CGCCTACTCCTGCCCCCACTATCGCGTCTCAGCCTCTCTCCTTGCG

GCCCGAGGCCTGCCGGCCAGCCGCAGGGGGCGCCGTACATACTC

G G G GTTTG GATTTCGCTTG CG ACATATATATTTG GGCCCCCCTCGC

CG G CACATG TG G AG TG CTG CTCCTG AG TCTCG TTATAACCCTCTAT

TG C AAC C ATAG AA AC AG ATC C A AAA G A AG C C G C C TG C TC C ATAG

CG ATTAC ATG AATATG AC TC CACG CC G C C C TG G C C CC ACAAG G AA

ACACTACC AG CC TTAC G C AC C AC C TAG AG ATTTC G C TG C CTATC G

G AG CAG G G TG AAG TTTTC C AG ATCTG C AG ATG C AC C AG CG TATCA

GC AGGGCC AG AAC C AA C TG T A T AAC G AG C TC AACCTGG GACGC A

G G G AAG AG TATG ACG TTTTG G ACAAG CG CAG AG G ACG G G ACCCT

G AG AT GGGT GGC A A A C C A A G A C G A AA AA AC C C C C AGGAGGGTCT

CT A T A A T GAGCTGC A G A A G G A T AA G ATG G CTG AAG CC T ATTC TG A

AA TAG G C A TG AAAG G AG AG C G G AG AAG G G G AAAAG G G C AC G AC

G G TTTG TAC C AG G G AC TC AG C ACTG C TAC G AAG G ATAC TTATG AC

GCTCTCCACATG CAAG CCCTG CCACCTAG G (SEQ ID NO. 125)

AA del Clon 20C5.2 CD8 CD3 zeta CAR Cadenas pesadas y ligeras

E IV M TQ SP A T L S V SPGERATLSCRASQ S V S SLLTW Y QQKPGQ AP R LLI

FGASTRATGIPARFSGSGSGTGFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYDTW PF

TFGPGTKVDFKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLR

LSC AASG FTFSSYG M HW VR Q APG KG LEW VAVISYD G SD KYYVD SV

KG RFTISRDN SKNRL Y L Q M N SLRAEDT A V Y Y C ARERYSGRDYW GQ

G TL V T V S S A A A LS N SIMYF SHF VP VFLP AKPTTTPAPRPPTP APTIASQ

PL SLRPE ACRP A AG G A VH TR G LDF A C D IY IW APL AG T C G V LL L SL V IT

L Y CNHRNRSKRSRLLHSD YM NM TPRRPG PTRKHY QP Y APPRDF A A Y

RSRVKFSRSADAPAYQ Q G Q NQ LYNELNLG RREEYDVLDKRRG RDPE

M G G KPRRKN PQ EG LYNELQ KD KM AEAYSEIG M KG ER R R G KG H D G L

Y Q G LS TATKD TYD ALH M Q ALP PR (SEQ ID NO. 126) ADN del péptido señal de CAR

ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCC

TGCACGCCGCACGCCCG (SEQ ID NO. 127)

Péptido señal CAR: MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 128)

scFv ADN del enlazador G4S

GGCGGTGGAGGCTCCGGAGGGGGGGGCTCTGGCGGAGGGGGCTC

C (SEQ ID NO. 129)

enlazador scFv G4s: GGGGGSGGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 130)

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un receptor de antígeno quimérico que comprende

(i) una molécula de unión a antígeno que se une específicamente a CLL-1, (ii) un dominio extracelular, (iii) un dominio transmembrana, (iv) un dominio coestimulador y (v) un dominio activador,

en donde la molécula de unión a antígeno es un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) que comprende:

(a) una cadena pesada variable (VH) que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con las SEQ ID NO: 17, 18 y 19, respectivamente, y una cadena ligera variable (VL) que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con las SEQ ID NO: 22, 23, y 24, respectivamente, o

(b) una cadena pesada variable (VH) que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con las SEQ ID NO: 51, 52 y 53, respectivamente, y una cadena ligera variable (VL) que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con las SEQ ID NO: 56, 57, y 58, respectivamente.

2. El receptor de antígeno quimérico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde

(i) el dominio coestimulador es una región de señalización (u otra porción adecuada) de CD28, OX-40, 4-1BB/CD137, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, muerte programada-1 (^pD-1), coestimulador de células T inducible (ICOS), antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos (LFA-1 (CD11a/CD18), CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD247, CD276 (B7-H3), LIGHT, (TNFSF14), NKG2C, Ig alfa (CD79a), DAP-10, receptor Fc gamma, molécula MHC de clase I, proteínas receptoras de TNF, una proteína de inmunoglobulina, receptor de citocinas, integrinas, moléculas de activación linfocítica de señalización (proteínas SLAM), receptores de células NK activadoras, BTLA, un receptor de ligando Toll, ICAM-1, B7-H3, CDS, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD (CD11d), ITGAE (CD103), ITGAL (CD11a), LFA-1, ITGAM (CD11b), ITGAX(CD11c), ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SL AMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, un ligando que se une específicamente con CD83, o cualquiera de sus combinaciones, en donde el dominio coestimulador de CD28 comprende opcionalmente una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, y SEQ ID NO: 8 o en donde el dominio coestimulador de CD8 comprende opcionalmente la SEQ ID NO: 14;

(ii) el dominio de activación comprende un dominio citoplasmático de CD3, en donde el CD3 comprende opcionalmente CD3 zeta, en donde el CD3 zeta comprende opcionalmente la SEQ ID NO: 10; o

(iii) el receptor de antígeno quimérico comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 10.

3. El receptor de antígeno quimérico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 que comprende:

(a) una región VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y una región VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; o

en donde las regiones VH y VL están enlazadas por al menos un enlazador.

4. El receptor de antígeno quimérico de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el enlazador comprende al menos una de la SEQ ID NO: 130 y la SEQ ID NO: 132.

5. El receptor de antígeno quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en:

SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 66; o la SEQ ID NO: 70.

6. Un polinucleótido aislado que codifica el receptor de antígeno quimérico de acuerdo con la reivindicación 1.

7. El polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 6 que comprende la secuencia de nucleótidos establecida en:

SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 65; o la SEQ ID NO: 69.

8. Un vector que comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 6 o 7 o que codifica el receptor de antígeno quimérico de la reivindicación 5.

9. El vector de acuerdo con la reivindicación 8 que es un vector retroviral, un vector de ADN, un plásmido, un vector de ARN, un vector adenoviral, un vector asociado a adenovirus, un vector lentiviral o cualquier combinación de los mismos.

10. Una célula inmunitaria que comprende el vector de acuerdo con la reivindicación 8 o el receptor de antígeno quimérico de la reivindicación 3.

11. La célula inmunitaria de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la célula inmunitaria es una célula T, un linfocito infiltrante de tumores (TIL), una célula NK, una célula que expresa TCR, una célula dendrítica o una célula NK-T.

12. La célula inmunitaria de acuerdo con la reivindicación 11 que es una célula T autóloga o una célula T alogénica.

13. Una composición farmacéutica que comprende la célula inmunitaria de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.

14. El receptor de antígeno quimérico de acuerdo con la reivindicación 1,3 o 5, la célula inmunitaria de la reivindicación 10, el polinucleótido de la reivindicación 6 o la composición farmacéutica de la reivindicación 13 para su uso en terapia.

15. El receptor de antígeno quimérico para el uso de acuerdo con la reivindicación 14, la célula inmunitaria para el uso de acuerdo con la reivindicación 14, el polinucleótido para el uso de acuerdo con la reivindicación 14, o la composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde dicho uso es en un método para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto, en donde el tipo de enfermedad o trastorno se caracteriza por células que expresan CLL-1, en donde la enfermedad o trastorno es opcionalmente cáncer, en donde el cáncer es opcionalmente leucemia, linfoma o mieloma o en donde la enfermedad o trastorno es opcionalmente al menos uno de leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia mielomonocítica crónica (CMML), leucemia mielomonocítica juvenil, leucemia mieloide crónica atípica, leucemia promielocítica aguda (APL), leucemia monoblástica aguda, leucemia eritroide aguda, leucemia megacarioblástica aguda, síndrome mielodisplásico (MDS), trastorno mieloproliferativo, neoplasia mieloide, sarcoma mieloide), neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas (BPDCN), y enfermedad inflamatoria/autoinmunitaria, en donde la enfermedad inflamatoria/autoinmunitaria es opcionalmente al menos una de artritis reumatoide, psoriasis, alergias, asma, enfermedad de Crohn, IBD, IBS, fibromialga, mastocitosis y enfermedad celíaca.