ES2929858T3 - Composición de aditivo para piensos - Google Patents

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Marion Bernardeau
Luis Fernando Romero Millan
Elijah Gituanjah Kiarie
Susan Lund Arent
Päivi Helena Nurminen
Sofia Forssten
Mari Ellen Davis
Daniel Petri
Elizabeth Ann Galbraith
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Abstract

Una composición de aditivo para piensos que comprende una microbiota de alimentación directa (DFM), en combinación con una xilanasa (p. ej., endo-1,4-beta-d-xilanasa) y una beta-glucanasa (y opcionalmente una enzima degradadora de fibra adicional), en la que la DFM se selecciona del grupo que consiste en una cepa productora de enzimas; una cepa fermentadora de azúcar C5; una cepa productora de ácidos grasos de cadena corta; una cepa promotora de la microflora endógena fibrolítica; o combinaciones de los mismos. El DFM se puede seleccionar del grupo que consiste en: Bacillus subtilis AGTP BS3BP5, Bacillus subtilis AGTP BS442, B. subtilis AGTP BS521, B. subtilis AGTP BS918, Bacillus subtilis AGTP BS1013, B. subtilis AGTP BS1069, B. subtilis AGTP 944, B. pumilus AGTP BS 1068 o B. pumilus KX11-1, Enterococcus faecium ID7, Propionibacterium acidipropionici P169, Lactobacillus rhamnosus CNCM-l-3698, Lactobacillus farciminis CNCM-l-3699, una cepa con todas sus características, cualquier derivado o variante de los mismos, y combinaciones de los mismos y la enzima degradante de fibra adicional pueden seleccionarse del grupo que consiste en una celobiohidrolasa (EC 3.2.1.176 y EC 3.2.1.91), una beta-glucosidasa (EC 3.2.1.21), una beta-xilosidasa (EC 3.2.1.37), una feruloil esterasa (EC 3.1.1.73), una alfa-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55), una pectinasa (por ejemplo, una endopoligalacturonasa (EC 3.2.1.15), una exopoligalacturonasa (EC 3.2.1.67) o un pectato liasa (EC 4.2.2.2)), o combinaciones de los mismos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composición de aditivo para piensos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a procedimientos para mejorar las composiciones de piensos que utilizan un microbio de alimentación directa específico en combinación con una xilanasa y una p-glucanasa, y a una composición de aditivo para piensos que comprende un microbio de alimentación directa en combinación con una xilanasa y una p-glucanasa. La presente invención se refiere además a usos y kits. El alcance de la presente invención está definido por las reivindicaciones.
Antecedentes de la invención
Los suplementos enzimáticos se utilizan como aditivos para piensos para animales, en particular piensos para aves de corral y ganado porcino, como medio para mejorar la utilización de nutrientes y las características de rendimiento de producción. Para mejorar el valor nutricional de dietas que contienen granos de cereales, harina de soja, harinas de proteína animal o subproductos alimenticios e industriales ricos en fibra están disponibles mezclas de enzimas.
El concepto de microbios de alimentación directa (DFM) implica la alimentación de animales tales como pollos o cerdos con microbios benéficos vivos, de tal manera que cuando se administran en cantidades adecuadas confieren un beneficio para la salud del huésped. Otro término para esta categoría de aditivos para piensos es probióticos. Se ha demostrado que los probióticos o DFM mejoran el rendimiento animal en estudios controlados. Los DFM incluyen bacterias de alimentación directa y/o productos a base de levadura.
Aunque se han contemplado combinaciones de DFM con algunas enzimas, la interacción entre DFM y enzimas nunca se ha entendido completamente. La presente invención se refiere a nuevas combinaciones específicas que sorprendentemente mejoran significativamente las características de rendimiento de producción de los animales.
La presión continua sobre los mercados mundiales de cereales forrajeros se ha traducido en las industrias porcina y avícola en la tendencia a buscar opciones rentables alternativas de ingredientes, tales como coproductos (subproductos) de las industrias de biocombustibles y harineras. Sin embargo, una característica de los ingredientes alternativos es su alto contenido en polisacáridos no amiláceos (NSP; fibra) que para los no rumiantes son de bajo valor nutritivo ya que no son digeribles, limitan la ingesta de nutrientes de un animal e influyen negativamente en la utilización de energía y nutrientes. De ello se deduce que la aplicación exitosa de ingredientes fibrosos alternativos en dietas para monogástricos dependerá de la disponibilidad de tecnologías para utilizar eficazmente la energía contenida en la fibra dietética y mitigar los riesgos asociados con sus propiedades antinutricionales y de los potenciales beneficios económicos cuando se formulan correctamente en las dietas. Los documentos CN102499326 y CN102422996 divulgan material de pienso para cerdos desprovisto de antibióticos fermentado por varios microorganismos, incluido el Bacillus subtilis.
El documento US 6.436.451 divulga un pienso para reducir el colesterol en huevos de gallina.
El documento CN102100311 divulga un aditivo para piensos que comprende Bacilo licheniformis y enzimas que incluyen xilanasa y p-glucanasa.
El documento WO 2012/110778 divulga una composición de aditivo para piensos que comprende un microbio de alimentación directa en combinación con una proteasa, una xilanasa, una amilasa y una fitasa.
El documento WO 2012/110777 divulga una composición de aditivo para piensos que comprende un microbio de alimentación directa en combinación con una proteasa y una fitasa.
Khan et al. investigaron los efectos del aporte suplementario de probióticos multienzimáticos y multiespecie sobre el rendimiento de producción, la calidad del huevo, el nivel de colesterol y el sistema inmunitario en gallinas ponedoras (Khan et al. 2011, Journal of Applied Animal Research, vol. 39, N° 4, 386-398).
Sumario de la invención
Un hallazgo fundamental de la presente invención es que la degradación del material dietético derivado de partículas de la pared celular vegetal, que tiene un alto contenido de polisacáridos no amiláceos (NSP), por xilanasas se puede optimizar para mejorar el rendimiento animal cuando se combinan la xilanasa y una p-glucanasa con uno o varios microbios de alimentación directa (DFM) específicos seleccionados por su capacidad para digerir carbohidratos estructurales de la pared celular vegetal y/o su capacidad de producir ácidos grasos de cadena corta (SCFA) a partir de pentosas (por ejemplo, arabinoxilanos) contenidas en la fracción NSP de ingredientes en condiciones anaeróbicas.
La razón por la que esta combinación mejora el rendimiento es que la solubilización de la fibra, específicamente de la hemicelulosa, de la dieta se maximiza en el aparato gastrointestinal (TGI) de los animales. Esta solubilización de la hemicelulosa no siempre sería suficiente para aumentar el rendimiento, dado que los azúcares C5 liberados no son una fuente eficaz de energía para los animales cuando se absorben (Savory C., J. Br. J. Nut. 1992, 67: 103-114), pero son una fuente de energía más eficaz cuando se convierten en ácidos grasos de cadena corta (SCFA), ya sea por microorganismos presentes en el TGI o por DFM.
Por lo tanto, el valor energético de los productos vegetales (por ejemplo, trigo, maíz, avena, cebada y coproductos (subproductos) de cereales o una dieta de cereales mixtos fácilmente accesible para monogástricos) se puede optimizar combinando xilanasa y una p-glucanasa y DFM específicos que pueden producir SCFA a partir de pentosas de la fracción NSP en condiciones anaeróbicas o pueden modular las poblaciones microbianas en el TGI para aumentar la producción de SCFA a partir de los azúcares liberados. Los DFM pueden adaptar su metabolismo para aumentar sinérgicamente la hidrólisis de fibra en combinación con xilanasa y p-glucanasa. El uso de DFM con enzimas fibrolíticas puede proporcionar beneficios adicionales y maximizar los beneficios de las carbohidrasas.
Los DFM específicos seleccionados por sus actividades enzimáticas se pueden considerar como una cadena alimentaria bacteriana impulsada por glicanos. Los DFM seleccionados específicamente que se enseñan en el presente documento pueden utilizar preferentemente fibras dietéticas, un rasgo que les permite llevar a cabo las etapas iniciales de digestión de glicanos para liberar polisacáridos más cortos y solubles para otras bacterias, por ejemplo otra microflora del GIT endógena. Los DFM específicos se seleccionaron por su metabolismo, que se ajusta según los glucanos liberados por las enzimas (por ejemplo, xilanasa y p-glucanasa) para mejorar la eficacia de la combinación de enzimas que se enseñan en el presente documento y DFM en comparación con el uso de una combinación de enzimas únicamente o el uso de DFM únicamente.
Sin pretender vincularse a ninguna teoría, en la presente invención, el material dietético derivado de partículas de la pared celular vegetal, que es rica en glicanos de fuentes específicas, tales como celulosa, hemicelulosa y pectina (material vegetal) o glicosaminoglicanos, ingresa en el intestino distal en forma de partículas que son atacadas por los degradadores de glicanos de los DFM específicos que son capaces de unirse directamente a estas partículas insolubles y digerir sus componentes de glicano. Después de esta degradación inicial de las partículas que contienen glicanos, los fragmentos de glicanos más solubles pueden digerirse por los degradadores secundarios de glicanos presentes en el ciego, que contribuyen al grupo liberado de productos de fermentación de ácidos grasos de cadena corta (SCFA) que se derivan de ambos tipos de degradadores. Dado que los SCFA surgen de la fermentación de carbohidratos y/o la fermentación de proteínas y la desaminación por parte de la microflora anaeróbica autóctona del TGI, la concentración de SCFA puede ser un índice de la población de organismos anaeróbicos. Los SCFA, de hecho, pueden proporcionar una serie de beneficios para el animal huésped, actuando como combustible metabólico para el tejido intestinal, muscular, renal, cardiaco, hepático y cerebral, y también proporcionado propiedades bacteriostáticas y bactericidas contra organismos tales como Salmonela y E. coli.
El valor nutricional de la fibra en los no rumiantes puede obtenerse principalmente mediante la producción de ácidos grasos de cadena corta (SCFA) a través de la fermentación de fibras solubilizadas o degradadas por medio de enzimas degradadoras de fibra eficaces (por ejemplo, una xilanasa y una p-glucanasa, adecuadamente en combinación con una enzima degradadora de fibra adicional). La xilanasa de piensos por sí sola no es suficiente para el uso de ingredientes fibrosos en las dietas de los animales (especialmente los no rumiantes). Existe una gran variedad de características químicas entre los ingredientes de piensos de origen vegetal. La aplicación de una enzima depende de las características del material vegetal (pienso). Solo a modo de ejemplo, en el grano de trigo predominan los arabinoxilanos; sin embargo, en harinillas de trigo (un coproducto o subproducto de granos triturados de trigo), el contenido de p-glucano aumenta de 8 g-1 de MS (en grano) hasta un exceso de 26 g kg-1 de MS.
Los SCFA poseen diferentes valores energéticos y algunos pueden servir como precursores de la glucosa y algunos pueden contribuir al mantenimiento de la integridad y la salud intestinal. Los inventores han descubierto que las combinaciones específicas que se enseñan en el presente documento mueven preferentemente el proceso de fermentación en el TGI de un animal hacia la producción de SCFA más valiosos/útiles tales como el ácido butírico y/o los ácidos propiónicos.
En un aspecto, la presente invención proporciona una composición de aditivo para piensos que comprende al menos las cepas de microbios de alimentación directa (DFM) Bacillus AGTP BS3BP5, Bacillus AGTP BS918 y Bacillus AGTP BS1013, una xilanasa y una p-glucanasa, en la que la xilanasa y la p-glucanasa son exógenas con respecto a las cepas de DFM.
La presente invención proporciona además un procedimiento para:
i) mejorar el rendimiento de un sujeto, o
ii) mejorar la digestibilidad de una materia prima en un pienso (por ejemplo, digestibilidad de nutrientes, tal como la digestibilidad de aminoácidos), o
iii) mejorar la retención de nitrógeno, o
iv) mejorar la tasa de conversión alimenticia (FCR), o
v) mejorar la ganancia de peso en un sujeto, o
vi) mejorar la eficacia alimenticia en un sujeto, o
vii) desplazar el proceso de fermentación en el aparato gastrointestinal del sujeto hacia la producción de ácido butírico y/o ácido propiónico,
procedimiento que comprende administrar a un sujeto una composición de aditivo para piensos según la presente invención.
La presente invención también proporciona una composición de aditivo para piensos según la presente invención formulada como una premezcla que además comprende al menos una vitamina y/o al menos un mineral. La presente invención proporciona además el uso de una composición de aditivo para piensos según la invención para:
i) mejorar el rendimiento de un sujeto, o
ii) mejorar la digestibilidad de una materia prima en un pienso (por ejemplo, digestibilidad de nutrientes, tal como la digestibilidad de aminoácidos), o
iii) mejorar la retención de nitrógeno, o
iv) mejorar la tasa de conversión alimenticia (FCR), o
v) mejorar la ganancia de peso en un sujeto, o
vi) mejorar la eficacia alimenticia en un sujeto, o
vii) desplazar el proceso de fermentación en el aparato gastrointestinal del sujeto hacia la producción de ácido butírico y/o ácido propiónico.
Otro aspecto se refiere a un kit que comprende una composición de aditivo para piensos según la invención.
Divulgaciones adicionales
En el presente documento se describe un pienso que comprende una composición de aditivo para piensos según la presente invención o una premezcla según la presente invención.
En el presente documento se describe un pienso que comprende un microbio de alimentación directa (DFM), en combinación con una xilanasa y una p-glucanasa, en el que el DFM se selecciona del grupo que consiste en una cepa productora de enzimas; una cepa fermentadora de azúcar C5; una cepa productora de ácidos grasos de cadena corta; una cepa promotora de la microflora endógena fibrolítica; o combinaciones de las mismas.
En el presente documento se describe un procedimiento para preparar un producto alimenticio que comprende mezclar un componente de pienso con una composición de aditivo para piensos según la presente invención o una premezcla según la presente invención.
En el presente documento se describe un procedimiento para preparar un producto alimenticio que comprende mezclar un componente de pienso con un microbio de alimentación directa (DFM), en combinación con una xilanasa y una pglucanasa, en el que el DFM se selecciona del grupo que consiste en una cepa productora de enzimas; una cepa fermentadora de azúcar C5; una cepa productora de ácidos grasos de cadena corta; una cepa promotora de la microflora endógena fibrolítica; o combinaciones de las mismas.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra los efectos de la xilanasa y la p-glucanasa sin o con microbios de alimentación directa (DFM) de Bacillus en recuentos fecales de lactobacilos y E. coli (unidad formadora de colonias transformada logarítmicamente/gramo de heces, Log10 ufc/g).
Descripción detallada de la invención
Preferentemente, la o las enzimas utilizadas en la presente invención son exógenas al DFM. En otras palabras, la o las enzimas preferentemente se añaden al DFM o se mezclan con el mismo.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la técnica a la que pertenece la presente divulgación. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, Nueva York (1994), y Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) proporcionan al experto un diccionario general de muchos de los términos utilizados en la presente divulgación.
La presente divulgación no está limitada por los procedimientos y materiales de ejemplo divulgados en el presente documento, y puede utilizarse cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la práctica o el ensayo de las formas de realización de la presente divulgación. Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. A menos que se indique lo contrario, cualquier secuencia de ácido nucleico se escribe de izquierda a derecha en orientación de 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación de amino a carboxi, respectivamente.
Los encabezados proporcionados en el presente documento no son limitaciones de los diversos aspectos o formas de realización de la presente divulgación que se pueden obtener por referencia a la memoria descriptiva en su conjunto. Por consiguiente, los términos definidos inmediatamente a continuación se definen más completamente por referencia a la memoria descriptiva en su conjunto.
En el presente documento se hace referencia a los aminoácidos usando el nombre del aminoácido, la abreviatura de tres letras o la abreviatura de una sola letra.
El término "proteína", tal como se utiliza en el presente documento, incluye proteínas, polipéptidos y péptidos.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "polipéptido" y/o el término "proteína". En algunos casos, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "péptido". En algunos casos, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "enzima".
Los términos "proteína" y "polipéptido" se utilizan indistintamente en el presente documento. En la presente divulgación y reivindicaciones, se pueden utilizar los códigos convencionales de una letra y de tres letras para residuos de aminoácidos. El código de 3 letras para aminoácidos se proporciona tal como se define de conformidad con la Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) de la IUPAC-IUB. También se entiende que un polipéptido puede codificarse por más de una secuencia de nucleótidos debido a la degeneración del código genético.
Todas las clasificaciones de enzimas de E.C. a las que se hace referencia en el presente documento se refieren a clasificaciones proporcionadas en Enzyme Nomenclature - Recommendations (1992) del comité de nomenclatura de la International Union of Biochemistry and Molecular Biology - ISBN 0-12-226164-3.
Otras definiciones de términos pueden aparecer a lo largo de la memoria descriptiva. Antes de que se describan las formas de realización de ejemplo con más detalle, se debe comprender que la presente divulgación no se limita a las formas de realización particulares descritas, ya que estas pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento tiene únicamente el propósito de describir formas de realización particulares, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente divulgación estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre los límites superior e inferior de ese intervalo también se divulga específicamente. Cada intervalo más pequeño entre cualquier valor establecido o valor intermedio en un intervalo establecido y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido se incluye dentro de la presente divulgación. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse o excluirse de forma independiente en el intervalo, y cada intervalo en el que ninguno de los límites, alguno de los límites, o ambos, están incluidos en los intervalos más pequeños también se incluye dentro de la presente divulgación, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo establecido incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen alguno o ambos límites incluidos también se incluyen en la presente divulgación.
Debe señalarse que tal como se utiliza en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", "el” y "la" incluyen las referencias al plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una enzima" incluye una pluralidad de dichos agentes candidatos y la referencia a "el pienso" incluye la referencia a uno o varios piensos y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente.
Las publicaciones presentadas en el presente documento se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada de lo contenido en el presente documento debe interpretarse como una admisión de que dichas publicaciones constituyen una técnica anterior con respecto a las reivindicaciones adjuntas al presente documento.
Las enzimas para su uso en la presente invención pueden producirse mediante cultivo sólido o sumergido, incluidos procesos por lotes, semicontinuos y de flujo continuo. El cultivo se lleva a cabo en un medio de cultivo que comprende un medio acuoso de sales minerales, factores de crecimiento orgánicos, el material fuente de carbono y energía, oxígeno molecular y, por supuesto, un inóculo inicial de una o más especies de microorganismos particulares que se van emplear.
Un DFM para su uso en la presente invención es una cepa productora de enzimas.
Un DFM para su uso en la presente invención es una cepa fermentadora de azúcar C5.
Un DFM para su uso en la presente invención puede ser una cepa productora de ácidos grasos de cadena corta.
Un DFM para su uso en la presente invención puede ser una cepa promotora de la microflora endógena fibrolítica.
En el presente documento se describe una cepa productora de enzimas y/o una cepa fermentadora de azúcar C-5 y/o una cepa productora de ácidos grasos de cadena corta y/o una cepa promotora de microflora endógena fibrolítica que puede seleccionarse del grupo que consiste en los géneros siguientes: Bacillus, Enterococcus, Lactobacillus, Propionibacterium y combinaciones de los mismos.
En el presente documento se describe una cepa productora de enzimas y/o una cepa fermentadora de azúcar C-5 y/o una cepa productora de ácidos grasos de cadena corta y/o una cepa promotora de la microflora endógena fibrolítica seleccionada del género Bacillus, en particular Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens o B. pumilus.
En el presente documento se describe una cepa productora de enzimas y/o una cepa fermentadora de azúcar C-5 y/o una cepa productora de ácidos grasos de cadena corta y/o una cepa promotora de la microflora endógena fibrolítica seleccionada del género Enterococcus, en particular Enterococcus faecium. Las cepas de DFM que se describen en el presente documento pueden seleccionarse del grupo que consiste en: Bacillus AGTP BS3BP5, Bacillus AGTP BS442, Bacillus AGTP BS521, Bacillus AGTP BS918, Bacillus AGTP BS1013, Bacillus AGTP BS1069, Bacillus AGTP 944, Bacillus BS 2084 (NRRL B-50013), Bacillus LSSAO1 (NRRL B-50104), Bacillus 3A-P4 (PTA-6506), Bacillus 22C-P1 (PTA-6508), Bacillus BS-27 (NRRL B-50105), Bacillus BS18 (NRRL B-50633), Bacillus 15A-P4 (PTA-6507), Bacillus BS278 (NRRL B-50634) y combinaciones de los mismos. En el presente documento se describen Bacillus licheniformis Bl21 (NRRL B-50134), Bacillus licheniformis BL842 (NRRL B-50516), B. pumilus AGTPBS 1068, B. pumilus KX11 -1, Enterococcus faecium ID7, Propionibacterium acidipropionici P169, Lactobacillus rhamnosus CNCM-I-3698, Lactobacillus farciminis CNCM-I-3699, cepas que tienen todas las características de las mismas, derivados y variantes de las mismas, y combinaciones de las mismas.
Una cepa de DFM para su uso en la presente invención es preferentemente una bacteria viable.
Una cepa de DFM para su uso en la presente invención puede estar en forma de endospora.
La xilanasa para su uso en la presente invención es preferentemente una endo-1,4-p-d-xilanasa (E.C. 3.2.1.8).
En algunas formas de realización, preferentemente, la xilanasa y la p-glucanasa se usan en combinación con al menos una enzima degradadora de fibra adicional. La enzima degradadora de fibra (adicional) puede seleccionarse del grupo que consiste en una celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.176 y E.C. 3.2.1.91), una p-glucosidasa (E.C. 3.2.1.21), una pxilosidasa (E.C. 3.2.1.37), una feruloil esterasa (E.C. 3.1.1.73), una a-arabinofuranosidasa (E.C. 3.2.1.55), una pectinasa (por ejemplo, una endopoligalacturonasa (E.C. 3.2.1.15), una exopoligalacturonasa (E.C. 3.2.1.67) o una pectato liasa (E.C. 4.2 .2.2)), o combinaciones de las mismas.
Adecuadamente, puede haber más de una enzima degradadora de fibra adicional, adecuadamente más de dos, adecuadamente más de tres, adecuadamente más de cuatro, adecuadamente más de cinco.
Adecuadamente, la composición de aditivo para piensos según la presente invención o la composición que comprende un DFM en combinación con una xilanasa, una p-glucanasa y al menos otra enzima degradadora mueven el proceso de fermentación en el aparato gastrointestinal del sujeto hacia la producción de ácido butírico y/o o ácido propiónico.
Microbio de alimentación directa (DFM)
El término "microbio" en el presente documento se utiliza indistintamente con "microorganismo".
Un DFM para su uso tal como se describe en el presente documento puede ser cualquier DFM adecuado de la especie Bacillus subtilis que sea una "cepa productora de enzimas". Para determinar si un DFM es una "cepa productora de enzimas", puede usarse el ensayo DFM definido en el presente documento como "ensayo de DFM productor de enzimas". Se considera que un DFM es un DFM productor de enzimas si se clasifica como un DFM productor de enzimas utilizando el "ensayo de DFM productor de enzimas" que se enseña en el presente documento.
Un DFM para su uso tal como se describe en el presente documento puede ser cualquier DFM adecuado de la especie Bacillus subtilis que sea una "cepa fermentadora de azúcar C5". Para determinar si un DFM es una "cepa fermentadora de azúcar C5" puede utilizarse el ensayo de DFM definido en el presente documento como "ensayo de DFM fermentador de azúcar C5". Se considera que un DFM es un DFM fermentador de azúcar C5 si se clasifica como fermentador de azúcar C5 utilizando el "ensayo de DFM fermentador de azúcar C5" que se enseña en el presente documento.
Un DFM para su uso tal como se describe en el presente documento puede ser cualquier DFM adecuado de la especie Bacillus subtilis que sea una "cepa productora de ácidos grasos de cadena corta (SCFA)". Para determinar si un DFM es una "cepa productora de SCFA" puede utilizarse el ensayo de DFM definido en el presente documento como "ensayo de DFM productor de SCFA". Se considera que un d Fm es un DFM productor de SCFA si se clasifica como productor de SCFA utilizando el "ensayo de DFM productor de SCFA" que se enseña en el presente documento.
Un DFM para su uso tal como se describe en el presente documento puede ser cualquier DFM adecuado de la especie Bacillus subtilis que sea una "cepa promotora de la microflora endógena fibrolítica". Para determinar si un DFM es una "cepa promotora de la microflora endógena fibrolítica" puede utilizarse el ensayo de DFM definido en el presente documento como "ensayo de DFM promotor de la microflora endógena fibrolítica". Un DFM se considera que es un DFM promotor de la microflora endógena fibrilítica si promueve o estimula la microflora fibrolítica endógena utilizando el ensayo que se enseña en el presente documento.
Un DFM para su uso tal como se describe en el presente documento puede ser cualquier DFM adecuado de la especie Bacillus subtilis que sea una "cepa productora de enzimas", una "cepa fermentadora de azúcar C5", una "cepa productora de SCFA", una "cepa promotora de la microflora endógena fibrolítica" o combinaciones de las mismas. Adecuadamente, un DFM para su uso tal como se describe en el presente documento puede ser un DFM de la especie Bacillus subtilis que sea una cepa que se clasificaría como una "cepa productora de enzimas" y/o una "cepa fermentadora de azúcar C5" y/o una "cepa productora de SCFA" y/o una "cepa promotora de la microflora endógena fibrolítica". Adecuadamentemente, el DFM puede ser una cepa que se clasifique con más de un tipo de actividad, por ejemplo al menos 2, adecuadamente al menos 3, adecuadamente las 4 actividades, por ejemplo la actividad productora de enzimas, la actividad fermentadora de azúcar C5, la actividad productora de SCFA y/o la actividad promotora de la microflora endógena fibrolítica.
Los DFM según la presente invención proporcionan beneficios a los animales alimentados con altos niveles de subproductos vegetales ricos en fibra, tales como granos de destilería secos con solubles (DDGS).
Ensayo de DFM productor de enzimas:
El cribado de alto rendimiento de estas cepas de ensayo se realizó mediante plaqueado puntual (spotplating) replicado de 2 microlitros de cultivo líquido en 15,0 ml de varios tipos de medios de sustrato de interés en placas de rejilla de 100 x 100 x 15 mm. Las actividades de celulasa, a-amilasa, zeinasa, proteasa de soja, esterasa, lipasa y xilanasa se determinaron en función de la utilización específica del sustrato por las cepas individuales. Los componentes de los medios utilizados para evaluar las propiedades de utilización del sustrato a partir de la actividad enzimática de las cepas de origen medioambiental se describen en la tabla 1. Las placas de ensayo se dejaron secar durante 30 minutos después de la aplicación del cultivo y después se incubaron a 32 °C durante 24 horas. Las actividades enzimáticas para cada cepa se determinaron midiendo la zona de degradación del sustrato en milímetros, tal como se indica mediante el aclaramiento del borde circundante de crecimiento de la colonia. Se registraron los valores medios de las placas replicadas.
Tabla 1. Componentes de medios utilizados para evaluar las actividades enzimáticas ilustradas por las propiedades de utilización de sustratos de Bacillus de origen medioambiental.
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En una forma de realización, la cepa productora de enzimas produce una o más de las siguientes actividades enzimáticas: actividad de celulasa, actividad de a-amilasa, actividad de xilanasa, actividad de esterasa, actividad de lipasa, actividad de p-mananasa, actividad de proteasa (por ejemplo, actividad de zeinasa o proteasa de soja) y combinaciones de las mismas.
En una forma de realización, preferentemente, la cepa productora de enzimas produjo una o más de las siguientes actividades enzimáticas: actividad de celulosa, actividad de xilanasa, actividad de p-mananasa o combinaciones de las mismas.
La cepa de DFM productor de enzimas tal como se describe en el presente documento es de la especie Bacillus subtilis. En el presente documento se describen Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens y mezclas de los mismos.
Tal como se describe en el presente documento, la cepa de DFM productor de enzimas se selecciona del grupo que consiste en:
Bacillus AGTP BS3BP5 (NRRL B-50510),
Bacillus AGTP BS442 (NRRL B-50542),
Bacillus AGTP BS521 (NRRL B-50545),
Bacillus AGTP BS918 (NRRL B-50508),
Bacillus AGTP BS1013 (NRRL B-50509),
Bacillus BS-27 (NRRL B-50105),
Bacillus BS18 (NRRL B-50633),
Bacillus BS278 (NRRL B-50634),
Bacillus AGTP BS1069 (NRRL B-50544),
Bacillus AGTP 944 (NRRL B-50548),
Bacillus 15A-P4 (PTA-6507),
Bacillus BS 2084 (NRRL B-50013),
Bacillus LSSAO1 (NRRL B-50104),
Bacillus 3A-P4 (PTA-6506),
Bacillus 22C-P1 (PTA-6508),
y combinaciones de los mismos.
En el presente documento se describen
Bacillus pumilus AGTP BS 1068 (NRRL B-50543),
Bacillus pumilus AGTP KXII-1 (NRRL B-50546),
Bacillus licheniformis BL21 (n Rr L B-50134),
Bacillus licheniformis BL842 (NRRL B-50516),
derivados y variantes de los mismos,
y combinaciones de los mismos.
La cepa de DFM productor de enzimas descrita en el presente documento puede ser una o más de las cepas que se enseñan en los documentos US 61/527.371 y US61/526.881.
Ensayo de DFM fermentador de azúcar C5:
Las cepas de Bacillus se cultivan durante la noche en placas de agar de soja Tryptic (Difco) a 32 °C, y las bacterias acidolácticas se cultivan durante la noche en agar MRS (Difco) en condiciones anaeróbicas a 37 °C. Los medios API 50 CHB y API 50 CHL (bioMerieux, Marcy l'Etoile, Francia) se inoculan con DFM de cultivo puro (ya sea Bacillus o bacterias acidolácticas respectivamente) y se aplican a tiras de API 50CH® según las instrucciones del fabricante. Las tiras se incuban a 32 °C (Bacillus) o 37 °C en condiciones anaeróbicas (bacterias acidolácticas) y se supervisan a las 24 y 48 horas para determinar cambios colorimétricos.
El término "azúcar C5", tal como se utiliza en el presente documento, significa cualquier azúcar que tenga 5 carbonos. Los azúcares C5 pueden denominarse en el presente documento pentosas.
Los azúcares C5 incluyen D-arabinosa, L-arabinosa, D-ribosa, D-xilosa y L-xilosa.
Tal como se describe en el presente documento, la cepa fermentadora de azúcar C5 de DFM se selecciona del grupo que consiste en:
Bacillus 15A-P4 (PTA-6507)
Bacillus AGTP BS918 (NRRL B-50508)
Bacillus BS 2084 (NRRL B-50013)
Bacillus LSSAO1 (NRRL B-50104)
o combinaciones de los mismos.
En el presente documento se describen
Enterococcus faecium ID7
Lactobacillus lactis DJ6 (PTA 6102)
Lactococcus lactis ID7 (PTA 6103),
y combinaciones de los mismos.
Ensayo de DFM productor de ácidos grasos de cadena corta (SCFA):
Se utiliza un inóculo al 1% vol/vol de un cultivo de 48 h de DFM para inocular tubos de 10 ml de caldo de lactato de sodio (NLB) modificado (1% de lactato de sodio, Sigma-Aldrich, St Louis, MO; 1% de triptona; Oxoid Ltd., Hampshire, Inglaterra, 0,5% de extracto de levadura, Oxoid Ltd. y 0,5% de KH2 PO4) desprovisto de lactato de sodio y suplementado con una cantidad proporcional (1% p/vol) de uno de nueve carbohidratos diferentes (lactato, glucosa, galactosa, arabinosa, sacarosa, almidón, xilosa, celobiosa, fructosa; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Los cultivos se cultivan en condiciones anaerobias a 32 °C y, después de 0, 24, 48 y 72 horas de incubación, los tubos duplicados se centrifugan a 5000 x g durante 10 min y el caldo gastado se recoge de cada cultivo. La producción de ácidos grasos de cadena corta en el caldo gastado se midió mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Se extraen muestras duplicadas de 1 ml de caldo de cultivo gastado de cada tubo de muestreo y se mezclan con 10 ml de H2SO40,005 M. Tres ml de cada muestra diluida se filtran a través de un filtro de 0,2 micrómetros en viales de HPLC y se tapan. Las muestras se analizan para determinar acetato, lactato, ácido propiónico y ácido butírico con un módulo de separación Waters 2695 (Milford, Ma) utilizando una columna Bio-Rad (Hercules, c A) Aminex HPX-87H de 300 x 7,8 mm. Todos los analitos se detectan con un detector Waters 2410 RI.
Una cepa productora de ácidos grasos de cadena corta (SCFA) descrita en el presente documento es Propionibacterium acidipropionici P169.
Una cepa productora de ácidos grasos de cadena corta (SCFA) descrita en el presente documento es Enterococcus faecium ID7.
El término "ácido graso de cadena corta", tal como se utiliza en el presente documento, incluye ácidos grasos volátiles así como ácido láctico.
En una forma de realización, los SCFA se pueden seleccionar del grupo que consiste en: ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido valérico, ácido isovalérico, ácidos 2-metilbutíricos y ácido láctico.
En una forma de realización, el SCFA puede ser ácido butírico.
Ensayo de DFM promotor de la microflora endógena fibrolítica: Se lleva a cabo un ensayo en un corral para determinar los efectos de un DFM sobre pollos de engorde en comparación con un control sin DFM. Las muestras se recogen los días 11 y 42 del ensayo. En cada fecha de muestreo se recoge un ave de cada corral para totalizar ocho aves por tratamiento. Las aves se sacrifican y se recoge el aparato gastrointestinal (GIT) total desde debajo de la molleja hasta la unión ileocecal de cada ave. Las muestras de ciego de cada ave se abren en rodajas y la digesta y el tejido cecal se recogen en una bolsa Whirl-pak y se mastican en 99 ml de peptona al 0,1% a 7,0 golpes/s durante 60 segundos para liberar las células bacterianas asociadas a la mucosa del tejido cecal. Se congelan instantáneamente partes alícuotas de la solución masticada que contiene bacterias de la mucosa cecal y la digesta en nitrógeno líquido y se almacenan a -20 °C hasta su posterior análisis. El ADN genómico se aísla de 250 ql de cada muestra mediante extracción con fenol-cloroformo y se purifica utilizando el kit de purificación de plantillas de PCR High Pure de Roche Applied Science (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN). El ADN de dos aves por tratamiento se combina en cantidades iguales y se somete a pirosecuenciación como una sola muestra, lo que da como resultado cuatro muestras por tratamiento para cada edad. La pirosecuenciación de amplicón FLX codificado con etiqueta bacteriano se realiza tal como se ha descrito anteriormente (Dowd et al. BMC Microbiol. 2008 24 de julio; 8:125). La región V1-V3 del gen 16S rRNA se amplifica en cada muestra combinada utilizando los cebadores 28 F (5'-GAGTTTGATCNTGGCTCAG) y 519R (5'-GTNTTACNGCGGCKGCTG). Los datos de pirosecuenciación se procesan y se analizan utilizando la tubería informática Qiime v.1.4.0. Brevemente, los datos de secuencia brutos se criban y se recortan en función de la calidad. Todas las secuencias se recortan a 350 pb. Las secuencias se agrupan por muestras individuales en función de las secuencias de códigos de barras. Las etiquetas de código de barras y los cebadores se retiran de las secuencias y las secuencias ribosómicas no bacterianas se eliminan. Las secuencias se agrupan en unidades taxonómicas operativas (OTU) con una similitud del 97% utilizando uclust. A continuación, las secuencias representativas de cada OTU se alinean mediante PyNAST y la taxonomía se asigna mediante comparación de secuencias a secuencias del gen 16S rRNA bacteriano conocido en la base de datos SILVA por medio del clasificador RDP. Se realiza un submuestreo aleatorio de secuencias para normalizar cada muestra de modo que se analice el mismo número de secuencias. El análisis de varianza (ANOVA) se utiliza para determinar si alguna microflora fibrolítica (taxones) se ve significativamente afectada por el tratamiento.
El término "microflora fibrolítica", tal como se utiliza en el presente documento, significa un grupo de microorganismos que son capaces de procesar polisacáridos vegetales complejos debido a su capacidad para sintetizar enzimas celulolíticas y hemicelulolíticas.
El término "endógeno", tal como se utiliza en el presente documento, significa presente en (o que se origina en) el TGI de un sujeto (por ejemplo, un animal). En otras palabras, la microflora endógena fibrolítica no es un DFM. La microflora endógena fibrolítica no se añade al pienso del sujeto.
Preferentemente, la cepa productora de enzimas y/o la cepa fermentadora de azúcar C-5 y/o las cepas productoras de ácidos grasos de cadena corta y/o la cepa promotora de la microflora endógena fibrolítica para su uso tal como se describe en el presente documento comprenden un microorganismo viable. Preferentemente, la cepa productora de enzimas y/o la cepa fermentadora de azúcar C-5 y/o las cepas productoras de ácidos grasos de cadena corta y/o la cepa promotora de la microflora endógena fibrolítica comprenden una bacteria viable o una levadura viable o un hongo viable.
Tal como se describe en el presente documento, la cepa productora de enzimas y/o la cepa fermentadora de azúcar C-5 y/o las cepas productoras de ácidos grasos de cadena corta y/o la cepa promotora de la microflora endógena fibrolítica comprenden una bacteria viable.
El término "microorganismo viable" significa un microorganismo que es metabólicamente activo o capaz de diferenciarse.
Tal como se describe en el presente documento, la cepa productora de enzimas y/o la cepa fermentadora de azúcar C-5 y/o las cepas productoras de ácidos grasos de cadena corta y/o la cepa promotora de la microflora endógena fibrolítica pueden ser bacterias formadoras de esporas y, por lo tanto, el término DFM puede estar compuesto por, o contener, esporas, por ejemplo esporas bacterianas. Por lo tanto, tal como se describe en el presente documento, el término "microorganismo viable", tal como se utiliza en el presente documento, puede incluir esporas microbianas, tales como endosporas o conidios.
Tal como se describe en el presente documento, la cepa productora de enzimas y/o la cepa fermentadora de azúcar C-5 y/o las cepas productoras de ácidos grasos de cadena corta y/o la cepa promotora de la microflora endógena fibrolítica en la composición de aditivo para piensos según la presente la invención no están compuestas por, o no contienen, esporas microbianas, por ejemplo endosporas o conidios.
El microorganismo puede ser un microorganismo de origen natural o puede ser un microorganismo transformado. El microorganismo también puede ser una combinación de microorganismos adecuados. En el presente documento se describe una cepa productora de enzimas y/o una cepa fermentadora de azúcar C-5 y/o cepas productoras de ácidos grasos de cadena corta y/o una cepa promotora de la microflora endógena fibrolítica que son una bacteria, una levadura o un hongo.
Preferentemente, la cepa productora de enzimas y/o la cepa fermentadora de azúcar C-5 y/o las cepas productoras de ácidos grasos de cadena corta y/o la cepa promotora de la microflora endógena fibrolítica según la presente invención son un microorganismo probiótico.
El término microbio de alimentación directa (DFM) abarca bacterias de alimentación directa, levadura de alimentación directa, hongos de alimentación directa y combinaciones de los mismos.
Tal como se describe en el presente documento, la cepa productora de enzimas y/o la cepa fermentadora de azúcar C-5 y/o las cepas productoras de ácidos grasos de cadena corta y/o la cepa promotora de la microflora endógena fibrolítica son una bacteria de alimentación directa.
Adecuadamente, la cepa productora de enzimas y/o la cepa fermentadora de azúcar C-5 y/o las cepas productoras de ácidos grasos de cadena corta y/o la cepa promotora de la microflora endógena fibrolítica pueden comprender una bacteria de uno o más de los géneros siguientes: Bacillus, Lactobacillus, Propionibacterium y combinaciones de los mismos.
En el presente documento se describe una cepa productora de enzimas y/o una cepa fermentadora de azúcar C-5 y/o cepas productoras de ácidos grasos de cadena corta y/o una cepa promotora de la microflora endógena fibrolítica seleccionadas del género Bacillus.
La cepa productora de enzimas y/o la cepa fermentadora de azúcar C-5 y/o las cepas productoras de ácidos grasos de cadena corta y/o la cepa promotora de la microflora endógena fibrolítica presente en la composición tal como se describe en el presente documento se selecciona de la especie: Bacillus subtilis. En el presente documento se describen cepas de Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, B. pumilus, B. coagulans, B. amyloliquefaciens, B. stearothermophilus, B. brevis, B. alkalophilus, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. circulans, B. lautus, B. thuringiensis y B. lentus.
Tal como se describe(n) en el presente documento, la(s) cepa(s) de Bacillus es/son Bacillus AGTP BS3BP5, Bacillus AGTP BS442, Bacillus AGTP BS521, Bacillus AGTP BS918, Bacillus AGTP BS1013, Bacillus AGTP BS1069, Bacillus AGTP 944.
Tal como se describe(n) en el presente documento, la(s) cepa(s) de Bacilus es/son Bacillus 15A-P4 (PTA-6507), LSSAO1 (NRRL B-50104).
La cepa de B. pumilus descrita en el presente documento es B. pumilus AGTP BS 1068 o B. pumilus KX11-1. Las cepas 3A-P4 (PtA-6506), 15A-P4 (PTA-6507) y 22C-P1 (PTA-6508) están disponibles públicamente en la American Type Culture Collection (ATCC). Las cepas 2084 (NRRL B-500130); LSSA01 (NRRL-B-50104); BS27 (NRRL B-50105) están disponibles públicamente en la Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL). A veces se hace referencia a la cepa de Bacilus LSSA01 como B. subtilis 8. Estas cepas se enseñan en el documento US 7.754.469 B2. Danisco USA, Inc. de Waukesha, Wisconsin, Estados Unidos depositó en virtud del Tratado de Budapest los siguientes depósitos biológicos en la Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL) con las fechas de los depósitos originales y los números de acceso que se detallan a continuación:
Figure imgf000011_0003
Danisco USA, Inc. de Waukesha, Wisconsin, Estados Unidos, ha autorizado a DuPont Nutrition Biosciences ApS de Langebrogade 1, PO Box 17, DK-1001, Copenhague K, Dinamarca a hacer referencia a estos materiales biológicos depositados en la presente solicitud de patente y ha dado su consentimiento sin reservas e irrevocable para que el material depositado se ponga a disposición del público.
AgTech Products, Inc. de W227 N752 Westmound Drive, Waukesha, WI 53186, Estados Unidos ha depositado en virtud del Tratado de Budapest el siguiente depósito biológico en la Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL) con la fecha del depósito original y el número de acceso que se detalla a continuación:
Bacilo licheniformis BL21
Figure imgf000011_0001
NRRL B-50134 15 abril de 2008
Figure imgf000011_0002
AgTech Products, Inc. ha autorizado a DuPont Nutrition Biosciences ApS de Langebrogade 1, PO Box 17, DK-1001, Copenhague K, Dinamarca a hacer referencia a este material biológico depositado en la presente solicitud de patente y ha dado su consentimiento irrevocable y sin reservas para que el material depositado se ponga a disposición del público.
La siguiente tabla resume las capacidades de producción de enzimas de las cepas seleccionadas utilizando el "ensayo de DFM productor de enzimas" anterior:
Resumen de la actividad enzimática de las cepas candidatas microbianas de alimentación directa.3
Tabla 2. Actividades de celulasa, xilanasa y p-mananasa de cepas de Bacillus.
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1Mananasa (por ejemplo, p-mananasa) es el nombre dado a una clase de enzimas que pueden hidrolizar enlaces 1,4-p-D-glucosídicos de p-manano, galactomanano y glucomanano en oligosacáridos de manano y manosa, descomponiendo así la hemicelulosa, uno de los principales componentes de las paredes celulares vegetales, que contiene manano. La p-mananasa es endo-1,4-p-D-mananasa (E.C. 3.2.1.78).
La cepa productora de enzimas y/o la cepa termentadora de azúcar C-5 y/o las cepas productoras de ácidos grasos de cadena corta y/o las cepas promotoras de la microtlora endógena tibrolítica descritas en el presente documento incluyen cepas seleccionadas del género Propionibacterium. Las cepas de DFM descritas en el presente documento incluyen cepas seleccionadas de la especie Propionibacterium acidipropionici. Una cepa de DFM descrita en el presente documento es Propionibacterium acidipropionici P169.
Agtech Products, Inc. de W227 N752 Westmound Dr. Waukesha, WI 53186, Estados Unidos depositó el 28 de julio de 2003 en virtud del Tratado de Budapest Propionibacterium acidipropionici P169 en la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA 20110-2209, Estados Unidos con el número de acceso PTA-5271. Se hace referencia a Propionibacterium acidipropionici P169 en la patente concedida US6.951.643B2 y está disponible públicamente en la ATCC.
La cepa productora de enzimas y/o la cepa termentadora de azúcar C-5 y/o las cepas productoras de ácidos grasos de cadena corta y/o las cepas promotoras de la microtlora endógena tibrolítica descritas en el presente documento incluyen cepas del género Enterococcus.
Las cepas de DFM descritas en el presente documento incluyen cepas seleccionadas de la especie Enterococcus faecium.
Una cepa de DFM descrita en el presente documento es Enterococcus faecium ID7.
Lactococcus lactis ID7 (que posteriormente se reclasiticó como Enterococcus faecium ID7) se depositó el 22 de junio de 2004 en virtud del Tratado de Budapest como Lactococcus lactis ID7 en la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA 20110-2209, Estados Unidos, con el número de acceso PTA-6103. A Lactococcus lactis ID7 (que posteriormente se reclasiticó como Enterococcus faecium ID7) se hizo reterencia en la patente concedida US7.384.628 y está disponible públicamente en la ATCC. Cuando se utiliza en el presente documento "Enterococcus faecium ID7", se entenderá que el nombre de este organismo es intercambiable con "Lactococcus lactis ID7", que se depositó con el número de acceso PTA-6103. Enterococcus faecium ID7 también está disponible públicamente de Danisco Animal Nutrition, Dinamarca.
La cepa productora de enzimas y/o la cepa fermentadora de azúcar C-5 y/o las cepas productoras de ácidos grasos de cadena corta y/o las cepas promotoras de la microflora endógena fibrolítica descritas en el presente documento incluyen cepas del género Lactobacillus.
La cepa productora de enzimas y/o la cepa fermentadora de azúcar C-5 y/o las cepas productoras de ácidos grasos de cadena corta y/o la cepa promotora de la microflora endógena fibrolítica descritas en el presente documento incluyen Lactobacillus spp: Lactobacillus buchneri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus bifidus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus lactis, Lactobacillus delbreuckii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsoniiy Lactobacillus jensenii, y combinaciones de cualquiera de los mismos.
Las cepas de DFM descritas en el presente documento incluyen: Lactobacillus rhamnosus CNCM-I-3698 y Lactobacillus farciminis CNCM-I-3699. Estas cepas se depositaron en la Collection Nationale de Cultures de Microorganims (CNCM) 25, Rue due Docteur Roux, F75724 París Cedex 15, Francia, el 8 de diciembre de 2006 por Sorbial, Route de Spay 72700 Allonnes, Francia, y todos los derechos, títulos e intereses sobre los depósitos se transfirieron posteriormente a Danisco France SAS de 20, Rue de Brunei, 75017 París, Francia.
Danisco France SAS ha autorizado a DuPont Nutrition Biosciences ApS de Langebrogade 1, PO Box 17, DK-1001, Copenhague K, Dinamarca a hacer referencia a estos materiales biológicos depositados en la presente solicitud de patente y ha dado su consentimiento irrevocable y sin reservas para que el material depositado esté disponible para el público.
Las cepas de DFM descritas en el presente documento son Lactobacillus lactis DJ6 (PTA 6102) y/o Lactococcus lactis ID7 (PTA 6103).
AgTech Products, Inc. de W227 N752 Westmound Drive, Waukesha, WI 53186, Estados Unidos depositó en virtud del Tratado de Budapest los siguientes depósitos biológicos en la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA 20110-2209, Estados Unidos con las fechas de depósitos originales y números de acceso que se detallan a continuación:
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AgTech Products, Inc. ha autorizado a DuPont Nutrition Biosciences ApS de Langebrogade 1, PO Box 17, DK-1001, Copenhague K, Dinamarca a hacer referencia a estos materiales biológicos depositados en la presente solicitud de patente y ha dado su consentimiento irrevocable y sin reservas para que el material depositado sea puesto a disposición del público.
Tal como se describe en el presente documento, más de una de las cepas están combinadas.
Por lo tanto, la cepa productora de enzimas y/o la cepa fermentadora de azúcar C-5 y/o la cepa productora de ácidos grasos de cadena corta y/o la cepa promotora de la microflora endógena fibrolítica utilizadas tal como se describe en el presente documento puede ser una combinación de al menos dos, adecuadamente al menos tres, adecuadamente al menos cuatro cepas de DFM, por ejemplo cepas de DFM seleccionadas del grupo que consiste en Bacillus AGTP BS3BP5, Bacillus AGTP BS442, Bacillus AGTP BS521, Bacillus AGTP BS918, Bacillus AGTP BS1013, Bacillus AGTP BS1069 o Bacillus AGTP 944.
Tal como se describe en el presente documento, el DFM puede ser uno o más del grupo que consiste en Bacillus AGTP BS3BP5, Bacillus AGTP BS442, Bacillus AGTP BS521, Bacillus AGTP BS918, Bacillus AGTP BS1013, Bacillus AGTP BS1069, Bacillus AGTP 944, y una combinación de los mismos.
En el presente documento se describen derivados y variantes de Bacillus, Lactobacillus o Propionibacterium. Tal como se describen en el presente documento, las cepas de variantes de Bacillus subtilis que tienen todas las características de Bacillus AGTP BS3BP5, Bacillus AGTP BS442, Bacillus AGTP BS521, Bacillus AGTP BS918, Bacillus AGTP BS1013, Bacillus AGTP BS1069 o Bacillus AGTP 944 también se incluyen y son útiles en los procedimientos descritos y reivindicados en el presente documento.
Tal como se utiliza en el presente documento, una "variante" tiene al menos el 80% de identidad de secuencias genéticas con las cepas divulgadas utilizando análisis de reacción en cadena de la polimerasa de ADN polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD-PCR). El grado de identidad de las secuencias genéticas puede variar. En algunas formas de realización, la variante tiene al menos el 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencias genéticas con las cepas divulgadas utilizando un análisis RAPD-PCR.
Los seis cebadores que se pueden utilizar para el análisis RAPD-PCR incluyen los siguientes:
Cebador 1 (5'-GGTGCGGGAA-3'), Cebador 2 (5'-GTTTCGCTCC-3'), Cebador 3 (5'-GTAGACCCGT-3'), Cebador 4 (5'-AAGAGCCCGT-3'), Cebador 5 (5'-AACGCGCAAC-3'), Cebador 6 (5'-CCCGTCAGCA-3'). El análisis RAPD se puede realizar utilizando perlas de análisis RAPD Ready-to-Go™ (Amersham Biosciences, Suecia), que están diseñadas como reacciones premezcladas y predispensadas para realizar análisis RAPD.
La bacteria de alimentación directa utilizada tal como se describe en el presente documento puede ser del mismo tipo (género, especie y cepa) o puede comprender una mezcla de cepas.
Preferentemente, un DFM que se va a utilizar según la presente invención es un microorganismo que generalmente se reconoce como seguro y que preferentemente está aprobado por GRAS.
Un experto en la técnica conocerá fácilmente especies y/o cepas específicas de microorganismos pertenecientes a los géneros descritos en el presente documento que se utilizan en las industrias alimentaria y/o agrícola y que generalmente se consideran adecuados para el consumo animal.
Preferentemente, un DFM que se utiliza según la presente invención es uno que sea adecuado para el consumo animal.
Ventajosamente, cuando el producto es una composición de pienso o aditivo para piensos, el DFM viable debe seguir siendo eficaz a lo largo del periodo que abarca hasta la fecha normal de "vencimiento" o "caducidad" del producto durante el que el minorista ofrece a la venta el pienso o la composición de aditivo para piensos. Los periodos de tiempo deseados y la vida útil normal variarán de un producto alimenticio a otro y los expertos en la técnica reconocerán que los tiempos de vida útil variarán según el tipo de producto alimenticio, el tamaño del producto alimenticio, las temperaturas de almacenamiento, las condiciones de procesamiento, el material de envasado y el equipo de envasado.
En algunas formas de realización, es importante que el DFM sea tolerante al calor, es decir, sea termotolerante. Este es en particular el caso cuando el pienso se granula. Por lo tanto, en una forma de realización, el DFM puede ser un microorganismo termotolerante, tal como una bacteria termotolerante, en particular cepas de Bacillus de la presente invención.
En algunas formas de realización, los DFM de la presente invención son bacterias productoras de esporas. Los bacilos pueden formar endosporas estables cuando las condiciones de crecimiento son desfavorables y son muy resistentes al calor, el pH, la humedad y los desinfectantes.
Adecuadamente, el DFM no es un microorganismo inactivado.
En una forma de realización, el DFM puede ser un microorganismo viable o no viable que se usa en forma aislada o semiaislada. El DFM se puede usar en combinación con o sin el medio de cultivo en el que se ha cultivado.
En una forma de realización, el DFM es capaz de producir unidades formadoras de colonias cuando se cultiva en un medio apropiado. Los medios apropiados pueden comprender (o consistir en) un pienso o un constituyente del pienso. En una forma de realización, el DFM es incapaz de producir unidades formadoras de colonias cuando se cultiva en un medio apropiado. Los medios apropiados pueden comprender (o consistir en) un pienso o un componente del pienso. Independientemente de si el DFM es capaz o incapaz de producir unidades formadoras de colonias cuando se cultiva en un medio apropiado, las células pueden seguir siendo metabólicamente activas (por ejemplo, incluso si no pueden dividirse).
En una forma de realización, el DFM se puede administrar como células inviables.
En una forma de realización, el DFM se puede administrar como un microorganismo viable.
El DFM se puede dosificar adecuadamente.
Adecuadamente, las dosis de DFM en el pienso pueden encontrarse entre aproximadamente 1 x 103 UFC/g de pienso a aproximadamente 1 x 109 UFC/g de pienso, adecuadamente entre aproximadamente 1 x 104 UFC/g de pienso a aproximadamente 1 x 108 UFC/g de pienso, adecuadamente entre aproximadamente 7,5 x 104 UFC/g de pienso a aproximadamente 1 x 107 UFC/g de pienso.
En una forma de realización, el DFM se dosifica en el producto alimenticio a más de aproximadamente 1 x 103 UFC/g de pienso, adecuadamente más de aproximadamente 1 x 104 UFC/g de pienso, adecuadamente más de aproximadamente 7,5 x 104 UFC/g de pienso.
Adecuadamente, las dosis de DFM en la composición del aditivo para piensos pueden encontrarse entre aproximadamente 1 x 105 UFC/g de composición a aproximadamente 1 x 1013 UFC/g de composición, adecuadamente entre aproximadamente 1 x 106 UFC/g de composición y aproximadamente 1 x 1012 UFC/g de composición, adecuadamente entre aproximadamente 3,75 x 107 UFC/g de composición y aproximadamente 1 x 1011 UFC/g de composición.
En una forma de realización, el DFM se dosifica en la composición de aditivo para piensos a más de aproximadamente 1 x 105 UFC/g de composición, adecuadamente más de aproximadamente 1 x 106 UFC/g de composición, adecuadamente más de aproximadamente 3,75 x 107 UFC/g de composición.
En una forma de realización preferida, el DFM se puede dosificar en la composición del aditivo para piensos a entre aproximadamente 5 x 107 y aproximadamente 1 x 109 UFC/g, adecuadamente entre aproximadamente 1 x 108 y aproximadamente 5 x 108 UFC/g de composición.
En otra forma de realización preferida, el DFM se puede dosificar en la composición del aditivo para piensos a entre aproximadamente 5 x 103 y aproximadamente 5 x 105 U/g, adecuadamente a entre aproximadamente 1 x 104 y aproximadamente 1 x 105 UFC/g de composición.
Enzimas degradadoras de fibra
Las cepas de DFM de la invención se usan en combinación con al menos una xilanasa y al menos una p-glucanasa (y opcionalmente al menos una enzima degradadora de fibra adicional).
p-glucanasa o endo-glucanasa es el nombre dado a una clase de enzimas que pueden hidrolizar enlaces (1,3)-p-D-glucosídicos y/o (1,4)-p-D-glucosídicos de (1,4)-p-glucano, (1,3;1,4)-p-glucano y celulosa en oligosacáridos de glucosa y glucosa, descomponiendo así la celulosa y la hemicelulosa, los principales componentes de las paredes celulares vegetales.
La p-glucanasa para su uso en la presente invención puede ser cualquier p-glucanasa comercialmente disponible. En una forma de realización, la p-glucanasa es una endoglucanasa, por ejemplo una endo-1,4-p-D-glucanasa (clasificada como E.C. 3.2.1.4).
Adecuadamente, la p-glucanasa para su uso en la presente invención puede ser una p-glucanasa de Bacillus, Trichoderma, Aspergillus, Thermomyces, Fusarium y Penicillium.
En una forma de realización, la enzima degradadora de fibra puede ser una p-glucanasa producida a partir de uno o más de los huéspedes de expresión seleccionados del grupo que consiste en: Bacillus lentus, Aspergillus niger, Trichoderma reesei, Penicillium funiculosum, Trichoderma longibrachiatum, Humicola insolens, Bacillus amyloliquefaciens, Aspergillus aculeatus, Aspergillus aculeatus.
En una forma de realización, la enzima degradadora de fibra puede ser uno o más de los siguientes productos comerciales que comprenden al menos una enzima degradadora de fibra p-glucanasa:
Econase® GT o Econase® BG (disponibles de AB Vista), Rovabio Excel® (disponible de Adisseo), Endofeed® CC y Amylofeed® (disponibles de Andres Pintaluba S.A.), AveMix® XG10 (de Aveve), Natugrain®, Natugrain®TS o Natugrain® TS/L (disponibles de BASF), Avizyme® 1210, Avizyme® SX, Grindazym® GP, Grindazym® GV, Porzyme® 8100, Porzyme® 9102, Porzyme® tp100, AXTRA® XB, Avizyme® 1100, Avizyme® 1110, Avizyme® 1202, Porzyme® sf o Porzyme® SP (disponibles de Danisco Animal Nutrition), Bio-Feed Plus®, Ronozyme A®, Ronozyme VP® o Roxazyme G2® (disponibles de DSM), Hostazym C® (disponible de Huvepharma), Kemzyme W seco o Kemzyme W líquido (disponibles de Kemin), Biogalactosidase BL (disponible de Kerry Ingredients), Safizyme G (disponible de Le Saffre) o Feedlyve AGL (disponible de Lyven).
En una forma de realización, la p-glucanasa se puede obtener de Axtra®XB. La p-glucanasa se puede dosificar en cualquier cantidad adecuada.
En una forma de realización, la p-glucanasa para su uso en la presente invención puede estar presente en el producto alimenticio en un intervalo de aproximadamente 50 BGU/kg de pienso a aproximadamente 50000 BGU/kg de pienso, adecuadamente de aproximadamente 100 BGU/kg de pienso a aproximadamente 1000 BGU/kg de pienso.
La p-glucanasa para su uso en la presente invención puede estar presente en el producto alimenticio en un intervalo de aproximadamente 75 BGU/kg de pienso a aproximadamente 400 BGU/kg de pienso, adecuadamente de aproximadamente 150 BGU/kg de pienso a aproximadamente 200 BGU/kg de pienso.
En una forma de realización, la p-glucanasa está presente en el producto alimenticio a menos de 1000 BGU/kg de pienso, adecuadamente menos de aproximadamente 500 BGU/kg de pienso, adecuadamente menos de 250 BGU/kg de pienso.
En una forma de realización, la p-glucanasa está presente en el producto alimenticio a más de 75 BGU/kg de pienso, adecuadamente más de 100 BGU/kg de pienso.
Adecuadamente, la p-glucanasa está presente en la composición de aditivo para piensos en el intervalo de aproximadamente 150 BGU/g de composición a aproximadamente 3000 BGU/g de composición, adecuadamente en el intervalo de aproximadamente 300 BGU/g de composición a aproximadamente1500 BGU/g de composición. En una forma de realización, la p-glucanasa está presente en la composición de aditivo para piensos a menos de 5000 BGU/g de composición, adecuadamente a menos de 4000 BGU/g de composición, adecuadamente a menos de 3000 BGU/g de composición, adecuadamente a menos de 2000 BGU/g de composición.
En una forma de realización, la p-glucanasa está presente en la composición de aditivo para piensos a más de 50 BGU/g de composición, adecuadamente a más de 100 BGU/g de composición, adecuadamente a más de 125 BGU/g de composición.
En algunas formas de realización, la actividad de la p-glucanasa se puede calcular utilizando el "ensayo de actividad de la p-glucanasa (BGU)" tal como se enseña en el presente documento.
En una forma de realización, la p-glucanasa para su uso en la presente invención puede tener actividad de p-glucanasa según se determina utilizando el "ensayo de actividad de p-glucanasa (CMC U/g)" que se enseña en el presente documento.
El término "enzima degradadora de fibra", tal como se utiliza en el presente documento, puede incluir una o más de las siguientes enzimas degradadoras de fibra: una xilanasa (por ejemplo, una endo-1,4-p-D-xilanasa (E.C. 3.2.1.8) o una 1,4 p-xilosidasa (E.C. 3.2.1.37)), una p-glucanasa (E.C. 3.2.1.4), una celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.176 y E.C.
3.2.1.91), una p-glucosidasa (E.C. 3.2.1.21), una feruloil esterasa (E.C. 3.1.1.73), una a-arabinofuranosidasa (E.C.
3.2.1.55), una pectinasa (por ejemplo, una endopoligalacturonasa (E.C. 3.2.1.15), una exopoligalacturonasa (E.C.
3.2.1.67) o una pectato liasa (E.C. 4.2.2.2)), o combinaciones de las mismas.
El tirmino "enzima degradadora de fibra adicional", tal como se utiliza en el presente documento, puede incluir una o mas de las siguientes enzimas degradadoras de fibra: una celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.176 y E.C. 3.2.1.91), una pglucosidasa (E.C. 3.2.1.21), una p-xilosidasa (E.C. 3.2.1.37), una feruloil esterasa (E.C. 3.1.1.73), una aarabinofuranosidasa (E.C. 3.2.1.55), una pectinasa (por ejemplo, una endopoligalacturonasa (E.C. 3.2.1.15), una exopoligalacturonasa (E.C. 3.2.1.67 ) o una pectato liasa (E.C. 4.2.2.2)), o combinaciones de las mismas.
Un experto en la técnica también entenderá que "una enzima degradadora de fibra adicional" puede abarcar múltiples enzimas degradadoras de fibra adicionales.
En una forma de realización, las cepas de DFM de la invención pueden utilizarse en combinación con al menos una xilanasa, al menos una p-glucanasa y al menos una enzima degradadora de fibra adicional.
En otra forma de realización, las cepas de DFM de la invención pueden utilizarse en combinación con al menos una xilanasa, al menos una p-glucanasa y dos (o al menos dos) enzimas degradadoras de fibra adicionales.
En otra forma de realización, las cepas de DFM de la invención pueden utilizarse en combinación con al menos una xilanasa, al menos una p-glucanasa y tres (o al menos tres) enzimas degradadoras de fibra adicionales.
En otra forma de realización, las cepas de DFM de la invención pueden utilizarse en combinación con al menos una xilanasa, al menos una p-glucanasa y cuatro (o al menos cuatro) enzimas degradadoras de fibra adicionales.
En una forma de realización, las cepas de DFM de la invención pueden utilizarse en combinación con un caldo o un producto de fermentación en estado sólido que contiene actividad o actividades enzimáticas medibles de la presente invención.
En una forma de realización, las cepas de DFM de la invención pueden utilizarse en combinación con las enzimas de la presente invención, enzimas que están en forma aislada o purificada.
En una forma de realización, las cepas de DFM de la invención pueden utilizarse en combinación con las enzimas de la presente invención, enzimas que son exógenas al DFM presente en la composición (por ejemplo, si el DFM es una cepa productora de enzimas).
Preferentemente, la(s) enzima(s) degradadora(s) de fibra está(n) presente(s) en el producto alimenticio en el intervalo de aproximadamente 0,05 a 5 g de proteína enzimática por tonelada métrica (TM) de pienso (o mg/kg).
Adecuadamente, cada enzima degradadora de fibra puede estar presente en el producto alimenticio en el intervalo de aproximadamente 0,05 a 5 g de proteína enzimática por tonelada métrica (TM) de pienso (o mg/kg).
Adecuadamente, las enzimas degradadoras de fibra en total están presentes en el producto alimenticio en el intervalo de aproximadamente 0,05 a 5 g de proteína enzimática por tonelada métrica (TM) de pienso (o mg/kg).
Preferentemente, la(s) enzima(s) degradadora(s) de fibra está(n) presente(s) en la composición del aditivo para piensos (o premezcla) en el intervalo de aproximadamente 0,05 a 100 mg de proteína/g de composición (por ejemplo, con una inclusión total en la dieta de 50 a 1000 g/TM).
Adecuadamente, cada enzima degradadora de fibra está presente en la composición de aditivo para piensos (o premezcla) en el intervalo de aproximadamente 0,05 a 100 mg de proteína/g de composición (por ejemplo, en una inclusión total en la dieta de 50 a 1000 g/TM).
Adecuadamente, las enzimas degradadoras de fibra en total están presentes en la composición de aditivo para piensos (o premezcla) en el intervalo de aproximadamente 0,05 a 100 mg de proteína/g de composición (por ejemplo, en una inclusión total en la dieta de 50 a 1000 g/TM).
En una forma de realización preferida, la enzima degradadora de fibra (por ejemplo, cada enzima degradadora de fibra o las enzimas degradadoras de fibra en total) puede encontrarse en la composición de aditivo para piensos (o premezcla) en el intervalo de aproximadamente 50 a aproximadamente 700 g/TM de pienso. Adecuadamente, la enzima degradadora de fibra (por ejemplo, cada enzima degradadora de fibra o las enzimas degradadoras de fibra en total) puede encontrarse en la composición de aditivo para piensos (o premezcla) en aproximadamente 100 a aproximadamente 500 g/TM de pienso.
En una forma de realización, la(s) enzima(s) degradadora(s) de fibra adicional(es) para su uso en la presente invención puede(n) comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) una celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.176 y E.C.
3.2.1.91) .
En otra forma de realización, la(s) enzima(s) degradadora(s) de fibra adicional(es) para su uso en la presente invención puede(n) comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) una p-glucosidasa (E.C. 3.2.1.21). Adecuadamente, la enzima degradadora de fibra adicional puede comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) una celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.176 y E.C. 3.2.1.91), una p-glucosidasa (E.C. 3.2.1.21) o combinaciones de las mismas.
En otra forma de realización, la(s) enzima(s) degradadora(s) de fibra adicional(es) para su uso en la presente invención puede(n) comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) una p-xilosidasa (E.C. 3.2.1.37).
En una forma de realización, la(s) enzima(s) degradadora(s) de fibra para su uso en la presente invención puede(n) comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) una feruloil esterasa (E.C. 3.1.1.73).
En otra forma de realización, la enzima degradadora de fibra adicional para su uso en la presente invención puede comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) una a-arabinofuranosidasa (E.C. 3.2.1.55).
En otra forma de realización más, la(s) enzima(s) degradadora(s) de fibra adicional(es) para su uso en la presente invención puede(n) comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) una pectinasa (por ejemplo, una endopoligalacturonasa (E.C. 3.2.1.15), una exopoligalacturonasa (E.C. 3.2. 1.67) o una pectato liasa (E.C. 4.2.2.2)). En una forma de realización preferida, la(s) enzima(s) degradadora(s) de fibra adicional(es) para su uso en la presente invención puede(n) comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) una o más (adecuadamente dos o dos o más, adecuadamente tres) pectinasas seleccionadas del grupo que consiste en: una endopoligalacturonasa (E.C.
3.2.1.15), una exopoligalacturonasa (E.C. 3.2.1.67) y una pectato liasa (E.C. 4.2.2.2).
En una forma de realización, la(s) enzima(s) degradadora(s) de fibra adicional(es) para su uso en la presente invención puede(n) comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) una celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.176 y E.C.
3.2.1.91) , una p-glucosidasa (E.C. 3.2 .1.21), una p-xilosidasa (E.C. 3.2.1.37), una feruloil esterasa (E.C. 3.1.1.73), una a-arabinofuranosidasa (E.C. 3.2.1.55) y/o una pectinasa (por ejemplo, una endopoligalacturonasa (E.C. 3.2.1.15), una exopoligalacturonasa (E.C. 3.2.1.67) o una pectato liasa (E.C. 4.2.2.2).
En el presente documento se describe la combinación de al menos una xilanasa, con al menos una p-glucanasa y al menos dos cepas específicas de DFM de la especie Bacillus subtilis tal como se enseña en el presente documento.
Tal como se describe en el presente documento, la, al menos una, xilanasa, la, al menos una, p-glucanasa y las, al menos dos, cepas de DFM específicas de la especie Bacillus subtilis tal como se enseñan en el presente documento puede combinarse con una enzima degradadora de fibra adicional tal como se enseña en el presente documento. En el presente documento se describe la combinación de al menos una xilanasa y al menos una p-glucanasa, con al menos dos, tal como al menos tres o al menos cuatro o al menos cinco, enzimas degradadoras de fibra adicionales y al menos dos cepas de DFM específicas de la especie Bacillus subtilis tal como se enseña en el presente documento. Xilanasa es el nombre dado a una clase de enzimas que degradan el polisacárido lineal beta-1,4-xilano en xilosa, descomponiendo así la hemicelulosa, uno de los principales componentes de las paredes celulares vegetales. La xilanasa para su uso en la presente invención puede ser cualquier xilanasa comercialmente disponible. Adecuadamente, la xilanasa puede ser una endo-1,4-p-d-xilanasa (clasificada como E.C. 3.2.1.8).
En una forma de realización, preferentemente, la xilanasa es una endoxilanasa, por ejemplo una endo-1,4-p-dxilanasa. La clasificación para una endo-1,4-p-d-xilanasa es E.C. 3.2.1.8.
En una forma de realización, la presente invención se refiere a cepas de DFM de la invención en combinación con una endoxilanasa, por ejemplo una endo-1,4-p-d-xilanasa y una p-glucanasa.
Todas las clasificaciones de enzimas de la E.C. a las que se hace referencia en el presente documento se refieren a las clasificaciones proporcionadas en Enzyme Nomenclature - Recommendations (1992) del comité de nomenclatura de la International Union of Biochemistry and Molecular Biology - ISBN 0-12-226164-3.
Adecuadamente, la xilanasa para su uso en la presente invención puede ser una xilanasa de Bacillus o Trichoderma. En una forma de realización, la xilanasa puede ser una xilanasa que comprende (o consiste en) una secuencia de aminoácidos que se muestra en el presente documento como SEQ ID NO: 1, una xilanasa que comprende (o consiste en) una secuencia de aminoácidos que se muestra en el presente documento como SEQ ID NO: 2 o una xilanasa que comprende (o consiste en) una secuencia de aminoácidos que se muestra en el presente documento como SEQ ID NO: 3 (FveXyn4), una xilanasa de Trichoderma reesei, Econasa XT™ o Rovabio Excel™.
En una forma de realización, la xilanasa puede ser la xilanasa presente en Axtra XAP® o Avizyme 1502® o AxtraXB™, todos productos comercialmente disponibles de Danisco A/S.
En una forma de realización preferida, la xilanasa para su uso en la presente invención puede ser una o más de las xilanasas presentes en uno o más de los siguientes productos comerciales:
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En una forma de realización, la xilanasa puede ser una xilanasa que comprende (o consiste en) una secuencia polipeptídica que se muestra en el presente documento como SEQ iD NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ iD NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 , SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12; o una variante, homólogo, fragmento o derivado de la misma que tenga al menos el 75% de identidad (tal como al menos el 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad) con la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 , SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12; o una secuencia polipeptídica que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12 con una sustitución conservadora de al menos uno de los aminoácidos. En una forma de realización, la xilanasa puede comprender una secuencia polipeptídica que se muestra en el presente documento como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, o una variante, homólogo, fragmento o derivado de la misma que tiene al menos el 98,5% (por ejemplo, al menos el 98,8 o 99 o 99,1 o 99,5%) de identidad con la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3
SEQ ID NO: 1: mkissflvtasIvaa/Pra/EPftCWKPSINKLIKNKGKLWGTlTDPNLLGVAKDTAIIKADFGAVrPEN SGKWDATEPSQGKFNFGSFDQWNFAQQNGLKVRGHTLVWHSQLPQVWKNINDKATLTK VIENHVTQWGRYKGKIYAWDWNEIFEWDGTLRKDSHFNNVFGNDDYVGIAFRAARKADP NAKLYINDYSLDSGSASKVTKGMVPSVKKWLSQGVPVDGIGSQTHLDPGAAGQIQGALTAL ANSGVKEVAITELDIRTAPANDYATVTKACLNVPKCIGITVWGVSDKNSWRKEHDSLLFDAN YNPKPAYTAWNALR SEQ ID NO: 2:
/PTA/frP/?QAADSINKLIKNKGKLYYGTITDPNLLGVAKDTAllKADFGAVTPENSGKWDATEP SQGKFNFGSFDQWNFAQQNGLKVRGHTLVWHSQLPQWVKNINDKATLTKVIENHVTQW GRYKGKIYAWDWNESFEWDGTLRKDSHFNNVFGNDDYVGIAFRAARKADPNAKLYINDYS LDSGSASKVTKGMVPSVKKWLSQGVPVDGIGSQTHLDPGAAGQIQGALTALANSGVKEVAI TELDIRTAPANDYATVTKACLNVPKCIGITVWGVSDKNSWRKEHDSLLFDANYNPKPAYTAV VNALR SEQ ID NO: 3:
QAADSINKLIKNKGKLYYGTITDPNLLGVAKDTA1IKADFGAVTPENSGKWDATEPSQGKFNF GSFDQWNFAQQNGLKVRGHTLVWHSQLPQWVKNINDKATLTKVIENHVTQWGRYKGKIY
AWDWNEIFEWDGTLRKDSHFNNVFGNDDYVG1AFRAARKADPNAKLYINDYSLDSGSASK VTKGMVPSVKKWLSQGVPVDGIGSQTHLDPGAAGQIQGALTALANSGVKEVAITELDIRTAP ANDYATVTKACLNVPKCIGITVWGVSDKNSWRKEHDSLLFDANYNPKPAYTAWNALR SEQ ID NO: 4:
mklssflvtasIvaa/PFA/EPffQASDSIN KLIKN KG KLYYGTÍTDPN LLGVAKDTAIIKADFGAVTPEN SGKWDATEPSQGKFNFGSFDQWNFAQQNGLKVRGHTLVWHSQLPQWVKNINDKATLTK VIENHVTNWGRYKGKIYAWDWNEIFDWDGTLRKDSHFNNVFGNDDYVGIAFRAARKADP NAKLYINDYSLDSGSASKVTKGMVPSVKKWLSQGVPVDGIGSQTHLDPGAAGQIQGALTAL ANSGVKEVAITELDIRTAPANDYATVTKACLNVPKCIG1TVWGVSDKNSWRKEHDSLLFDAN YNPKAAYTAWNALR SEQ ID NO: 5
/PrA/EPRQASDSINKLIKNKGKLYYGTlTDPNLLGVAKDTAIIKADFGAVTPENSGKWDATEP SQGKFNFGSFDQWNFAQQNGLKVRGHTLVWHSQLPQWVKNINDKATLTKVIENHVTNW G RYKG Kl YAWDWNEIFDWDGTLRKDS HFNNVFGNDDYVGIAFRAARKADPN AKLYINDYS LDSGSASKVTKGMVPSVKKWLSQGVPVDGIGSQTHLDPGAAGQiQGALTALANSGVKEVAI TELDIRTAPANDYATVTKACLNVPKCIGITVWGVSDKNSWRKEHDSLLFDANYNPKAAYTAV VNALR SEQ ID NO: 6:
QASDSINKLIKNKGKLYYGTITDPNLLGVAKDTA1IKADFGAVTPENSGKWDATEPSGGKFNF GSFDQWNFAQQNGLKVRGHTLVWHSQLPQWVKNINDKATLTKVIENHVTNWGRYKGKIY AWDWNEIFDWDGTLRKDSHFNNVFGNDDYVG1AFRAARKADPNAKLYINDYSLDSGSASK VTKGMVPSVKKWLSQGVPVDGIGSQTHLDPGAAGQIQGALTALANSGVKEVAITELDIRTAP ANDYATVTKACLNVPKCIG1TVWGVSDKNSWRKEHDSLLFDANYNPKAAYTAWNALR SEQ ID NO: 7:
mvsfkylfiaasalgalaAPVEVEESSWFNETALHEFAERAGTPSSTGWNNGYYYSFWTDNGGTV NYQNGNGGSYSVQWKDTGNFVGGKGWNPGSARTINYSGSFNPSGNAYLTVYGWTTNPLV EYYIVENYGTYNPGNGGTYRGSVYSDGANYNIYTATRYNAPSIEGDKTFTQYWSVRQSKRT GGTVTTANHFNAWAQLGMSLGTHNYQIVATEGYQSSGSSSITVY SEQ ID NO: 8:
APVEVEESSWFNETALHEFAERAGTPSSTGWNNGYYYSFWTDNGGTVNYQNGNGGSYSV QWKDTGNFVGGKGWNPGSARTINYSGSFNPSGNAYLTVYGWTTNPLVEYYIVENYGTYNP GNGGTYRGSVYSDGANYNIYTATRYNAPSIEGDKTFTQYWSVRQSKRTGGTVTTANHFNA WAQLGMSLGTHNYQIVATEGYQSSGSSSITVY SEQ ID NO: 9:
AGTPSSTGWNNGYYYSFWTDNGGTVNYQNGNGGSYSVQWKDTGNFVGGKGWNPGSAR TINYSGSFNPSGNAYLTVYGWTTNPLVEYYIVENYGTYNPGNGGTYRGSVYSDGANYNIYT ATRYNAPSIEGDKTFTQYWSVRQSKRTGGTVTTANHFNAWAQLGMSLGTHNYQiVATEGY QSSGSSSITVY
SEQ ID NO: 10:
MVSFTSLLAAVSAVTGVMALPSAQPVDGMSWERDPPTNVLDKRTQPTTGTS GGYYFSFWTDTPNSVTYTNGNGGQFSMQWSGNGNHVGGKGWMPGTSRTIKY SGSYNPNGNSYLAVYGWTRNPLIEYYIVENFGTYNPSSGGQKKGEVNVDGSVYD IYVSTRVNAPSIDGNKTFQQYWSVRRNKRSSGSVNTGAHFQAWKNVGLNLGTHD YQILAVEGYYSSGSASMTVSQ SEQ ID NO: 11:
LPSA QPVDGMS VVERDPPTNVLDKKTCtPJTGJS GG'YYFSFWTDTPNSVTYTNG N GGQFS MQWSG NGNHVG G KG WMPGTSRTIKYSGSYNPNGNSYLAVYGWTRNPLIEYYIVENFGTY NPSSGGQKKGEVNVDGSVYDIYVSTRVNAPSIDGNKTFQQYWSVRRNKRSSGSVNTGAHF QAWKNVGLNLGTHDYQILAVEGYYSSGSASMTVSQ
SEQ ID NO: 12:
TQPTTGTSGGYYFSFWTDTPNSVTYTNGNGGQFSMQWSGNGNHVGGKGWMPGTSRTIK
YSGSYNPNGNSYLAVYGWTRNPLIEYYIVENFGTYNPSSGGQKKGEVNVDGSVYDIYVSTR
VNAPSIDGNKTFQQYWSVRRNKRSSGSVNTGAHFQAWKNVGLNLGTHDYQILAVEGYYSS
GSASMTVSQ
Preferentemente, la xilanasa está presente en el producto alimenticio en un intervalo de aproximadamente 500 XU/kg a aproximadamente 16.000 XU/kg de pienso, de forma más preferida de aproximadamente 750 XU/kg de pienso a aproximadamente 8000 XU/kg de pienso, y de forma incluso más preferida de aproximadamente 1000 XU/kg de pienso a aproximadamente 4000 XU/kg de pienso
En una forma de realización, la xilanasa está presente en el producto alimenticio a más de aproximadamente 500 XU/kg de pienso, adecuadamente más de aproximadamente 600 XU/kg de pienso, adecuadamente más de aproximadamente 700 XU/kg de pienso, adecuadamente más de aproximadamente 800 XU/kg de pienso, adecuadamente más de aproximadamente 900 XU/kg de pienso, adecuadamente más de aproximadamente 1000 XU/kg de pienso.
En una forma de realización, la xilanasa está presente en el producto alimenticio a menos de aproximadamente 16.000 XU/kg de pienso, adecuadamente menos de aproximadamente 8000 XU/kg de pienso, adecuadamente menos de aproximadamente 7000 XU/kg de pienso, adecuadamente menos de aproximadamente 6000 XU/kg de pienso, adecuadamente menos de aproximadamente 5000 XU/kg de pienso, adecuadamente menos de aproximadamente 4000 XU/kg de pienso.
Preferentemente, la xilanasa está presente en la composición del aditivo para piensos en un intervalo de aproximadamente 100 XU/g a aproximadamente 320.000 XU/g de composición, de forma más preferida de aproximadamente 300 XU/g de composición a aproximadamente 160.000 XU/g de composición, y de forma incluso más preferida de aproximadamente 500 XU/g de composición a aproximadamente 50.000 XU/g de composición, y de forma incluso más preferida de aproximadamente 500 XU/g de composición a aproximadamente 40.000 XU/g de composición.
En una forma de realización, la xilanasa está presente en la composición de aditivo para piensos a más de aproximadamente 100 XU/g de composición, adecuadamente más de aproximadamente 200 XU/g de composición, adecuadamente más de aproximadamente 300 XU/g de composición, adecuadamente más de aproximadamente 400 XU/g de composición, adecuadamente más de aproximadamente 500 XU/g de composición.
En una forma de realización, la xilanasa está presente en la composición de aditivo para piensos a menos de aproximadamente 320 000 XU/g de composición, adecuadamente menos de aproximadamente 160 000 XU/g de composición, adecuadamente menos de aproximadamente 50000 XU/g de composición, adecuadamente menos de aproximadamente 40 000 XU/g composición, adecuadamente menos de aproximadamente 30000 XU/g de composición.
La actividad de xilanasa puede expresarse en unidades de xilanasa (XU) medidas tal como se enseña en el "ensayo de actividad de xilanasa (XU)" que se enseña en el presente documento. Véase también Bailey, M.J. Biely, P. y Poutanen, K., Journal of Biotechnology, volumen 23, (3), mayo de 1992, 257-270 cuyas enseñanzas se incorporan al presente documento por referencia.
En una forma de realización, la enzima se clasifica adecuadamente usando la clasificación E.C. anterior, y la clasificación E.C. designa una enzima que tiene esa actividad cuando se somete a ensayo en el "ensayo de actividad de xilanasa (XU)" que se enseña en el presente documento para determinar 1 XU.
En una forma de realización, la xilanasa para su uso en la presente invención puede tener actividad de xilanasa según se determina utilizando el "ensayo de actividad de xilanasa (ABX U/g)" que se enseña en el presente documento.
Actividades enzimáticas y ensayos
En una forma de realización, la actividad de xilanasa se puede calcular utillizando el "ensayo de actividad de xilanasa (XU)" que se enseña en el presente documento.
En otra forma de realización, la actividad de p-glucanasa se puede calcular utilizando el "ensayo de actividad de pglucanasa (BGU)" que se enseña en el presente documento.
Adecuadamente, las cepas de DFM en combinación con una xilanasa y una p-glucanasa se pueden dosificar tal como se establece en la tabla siguiente:
Figure imgf000023_0001
La actividad enzimática presentada en unidades se puede calcular para cada enzima tal como se enseña en las secciones anteriores.
Tal como se describe en el presente documento, la composición del aditivo para piensos puede comprender dos cepas de DFM de la especie Bacillus subtilis en combinación con una xilanasa, una p-glucanasa y una enzima degradadora de fibra adicional tal como se enseña en el presente documento.
Adecuadamente, las cepas de DFM, la xilanasa, la p-glucanasa y las enzimas degradadoras de fibra adicionales pueden dosificarse tal como se indica en la tabla siguiente:
Figure imgf000023_0002
En una forma de realización, preferentemente, el producto alimenticio comprende lo siguiente:
una xilanasa a al menos 1000 XU/kg a 5000 XU/kg (adecuadamente a al menos 2000 XU/kg a 4500 XU/kg) de pienso;
una p-glucanasa a al menos 100 BGU/kg a 4000 BGU/kg (adecuadamente a al menos 150 BGU/kg a 3000 BGU/kg); y
cepas de DFM de la invención a al menos 50.000 UFC/g a 200.000 UFC/g (adecuadamente a al menos 70.000 UFC/g a 175.000 UFC/g) de pienso.
En otra forma de realización, preferentemente, el producto alimenticio comprende lo siguiente:
una p-glucanasa a al menos 100 BGU/kg a 4000 BGU/kg (adecuadamente a al menos 150 BGU/kg a 3000 BGU/kg); y
cepas de DFM de la invención a al menos 37.500 UFC/g a 100.000 UFC/g (adecuadamente a al menos 37.500 UFC/g a 75.000 UFC/g) de pienso.
En otra forma de realización, preferentemente, el producto alimenticio comprende lo siguiente:
una xilanasa a al menos 1000 XU/kg a 5000 XU/kg (adecuadamente a al menos 2000 XU/kg a 4500 XU/kg) de pienso;
una p-glucanasa a al menos 200-2000 CMC U/kg (adecuadamente a al menos 500-1500 CMC U/kg) de pienso; cepas de DFM de la invención a al menos 50.000 UFC/g a 200.000 UFC/g (adecuadamente a al menos 70.000 UFC/g a 175.000 UFC/g) de pienso; y
una mezcla de enzimas degradadoras de fibra adicionales que comprende al menos 800-3500 ABX U/kg (adecuadamente al menos 1000-2750 ABX U/g) de pienso y 500-3000 pNPG U/kg (adecuadamente al menos 6002000 pNPG U/kg) de pienso
En otra forma de realización, preferentemente, el producto alimenticio comprende lo siguiente:
una xilanasa a al menos 1000 XU/kg a 5000 XU/kg (adecuadamente a al menos 2000 XU/kg a 4500 XU/kg) de pienso;
una p-glucanasa a al menos 200-2000 CMC U/kg (adecuadamente a al menos 500-1500 CMC U/kg) de pienso; cepas de DFM de la invención a al menos 37.500 UFC/g a 100.000 UFC/g (adecuadamente al menos 37.500 UFC/g a 75.000 UFC/g) de pienso; y
una mezcla de enzimas degradadoras de fibra adicionales que comprende al menos 800-3500 ABX U/kg (adecuadamente al menos 1000-2750 ABX U/g) de pienso y 500-3000 pNPG U/kg (adecuadamente al menos 600­ 2000 pNPG U/kg) de pienso
En una forma de realización, las cepas de DFM se pueden dosificar según el número de unidades de xilanasa presentes en la composición. En una forma de realización, las cepas de DFM se pueden dosificar en el intervalo de 6,25 x 101 UFC de DFM: 1 XU de enzima a 2 x 109 UFC de DFM: 1 XU de enzima; preferentemente en el intervalo de 1,88 x 104 UFC de DFM: 1 XU de enzima a 1,0 x 107 UFC de DFM: 1 XU de enzima. Las cepas de DFM de la invención se pueden usar en combinación con una xilanasa y una p-glucanasa.
En otra forma de realización, las cepas de DFM de la invención pueden usarse en combinación con una xilanasa, una p-glucanasa y una enzima degradadora de fibra adicional. En una forma de realización preferida, la enzima degradadora de fibra adicional puede ser una p-glucosidasa.
En una forma de realización, la xilanasa para su uso en la presente invención puede tener actividad de xilanasa según se determina usando el "ensayo de actividad de xilanasa (ABX U/g)" que se enseña en el presente documento. En una forma de realización adicional, la p-glucanasa para su uso en la presente invención puede tener actividad de p-glucanasa según se determina usando el "ensayo de actividad de p-glucanasa (CMC U/g)" que se enseña en el presente documento.
En otra forma de realización adicional, la p-glucosidasa para su uso en la presente invención puede tener actividad de p-glucosidasa según se determina usando el “ensayo de actividad de p-glucosidasa (pNPG U/g)” que se enseña en el presente documento.
En una forma de realización, las cepas de DFM de la invención se pueden usar en combinación con una xilanasa y una p-glucanasa, en la que la xilanasa y la p-glucanasa tienen las actividades que se indican en las tablas siguientes:
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000024_0002
En una forma de realización preferida, las cepas de DFM de la invención se pueden usar en combinación con una xilanasa, una p-glucanasa y una p-glucosidasa, en la que la xilanasa, la p-glucanasa y la p-glucosidasa tienen las actividades que se indican en las tablas siguientes:
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000025_0002
En una forma de realización, la xilanasa y la p-glucanasa para su uso en la presente invención pueden comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) más de aproximadamente 3000 ABX u/g de actividad de xilanasa y aproximadamente 2000-2600 CMC u/g de actividad de p-glucanasa, respectivamente.
Adecuadamente, la xilanasa, p-glucanasa y p-glucosidasa para su uso en la presente invención pueden comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) más de aproximadamente 3000 ABX u/g de actividad de xilanasa, aproximadamente 2000-2600 CMC u/g de actividad de p-glucanasa y más de aproximadamente 2000 pNPG u/g de actividad de p-glucosidasa, respectivamente.
En una forma de realización, la xilanasa para su uso en la presente invención puede comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) al menos 2000 ABX u/g de actividad de xilanasa (adecuadamente, al menos 2500 ABX u/g de actividad, adecuadamente al menos 3000 ABX u/g). g) según se determina utilizando el "ensayo de actividad de xilanasa (ABX U/g)".
Adecuadamente, la xilanasa para su uso en la presente invención puede comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) aproximadamente 2000 a aproximadamente 5000 ABX u/g de actividad de xilanasa (adecuadamente al menos aproximadamente 2500 a aproximadamente 4000 ABX u/g de actividad, adecuadamente en menos aproximadamente 3000 a aproximadamente 4000 ABX u/g de actividad) según se determina usando el "ensayo de actividad de xilanasa (ABX U/g)".
En otra forma de realización, la p-glucanasa para su uso en la presente invención puede comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) al menos 1000 CMC u/g de actividad de p-glucanasa (adecuadamente al menos 1500 CMC u/g de actividad, adecuadamente al menos 2000 CMC u/g de actividad) según se determina utilizando el "ensayo de actividad de p-glucanasa (CMC U/g)".
Adecuadamente, la p-glucanasa para su uso en la presente invención puede comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) aproximadamente 600 a aproximadamente 4000 CMC u/g de actividad de p-glucanasa (adecuadamente al menos aproximadamente 1000 a aproximadamente 3000 CMC u/g de actividad, adecuadamente al menos aproximadamente 1500 a aproximadamente 2600 CMC u/g de actividad) según se determina usando el "ensayo de actividad de p-glucanasa (CMC U/g)".
En una forma de realización adicional, la p-glucosidasa para su uso en la presente invención puede comprender (o consistir esencialmente en o consistir en) al menos 300 pNPG u/g de actividad de p-glucosidasa (adecuadamente al menos 500 pNPG u/g de actividad, adecuadamente al menos 1000 pNPG u/g de actividad o adecuadamente al menos 2000 pNPG u/g de actividad) según se determina utilizando el "ensayo de actividad de p-glucosidasa (pNPG U/g)". Adecuadamente, la p-glucosidasa para su uso en la presente invención puede comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) aproximadamente 200 a aproximadamente 4000 pNPG u/g de actividad de p-glucosidasa (adecuadamente al menos aproximadamente 300 a aproximadamente 3000 pNPG u/g actividad, adecuadamente al menos aproximadamente 1000 a aproximadamente 3000 pNPG u/g de actividad o adecuadamente al menos aproximadamente 2000 a aproximadamente 3000 pNPG u/g de actividad) según se determina usando el "ensayo de actividad de p-glucosidasa (pNPG U/g)".
Adecuadamente, las cepas de DFM de la invención pueden usarse en combinación con una xilanasa y una pglucanasa que comprenden (o consisten esencialmente en o consisten en) al menos 2000 ABX u/g de actividad de xilanasa (adecuadamente al menos 2500 ABX u/g de actividad, adecuadamente al menos 3000 ABX u/g de actividad) según se determina usando el "ensayo de actividad de xilanasa (ABX U/g)"; y al menos 1000 CMC u/g de actividad de p-glucanasa (adecuadamente al menos 1500 CMC u/g de actividad, adecuadamente al menos 2000 CMC u/g de actividad) según se determina usando el "ensayo de actividad de p-glucanasa (CMC U/g)" .
Adecuadamente, las cepas de DFM de la invención pueden usarse en combinación con una xilanasa, una p-glucanasa y una p-glucosidasa que comprenden (o consisten esencialmente en, o consiste en) al menos 2000 ABX u/g de actividad de xilanasa (adecuadamente al menos 2500 ABX u/g de actividad, adecuadamente al menos 3000 ABX u/g de actividad) según se determina usando el "ensayo de actividad de xilanasa (ABX U/g)"; y al menos 1000 CMC u/g de actividad de p-glucanasa (adecuadamente al menos 1500 CMC u/g de actividad, adecuadamente al menos 2000 CMC u/g de actividad) según se determina usando el "ensayo de actividad de p-glucanasa (CMC U/g)"; y al menos 300 pNPG u/g de actividad de p-glucosidasa (adecuadamente, al menos 500 pNPG u/g de actividad, adecuadamente al menos 1000 pNPG u/g de actividad o adecuadamente al menos 2000 pNPG u/g de actividad) según se determina usando el “ensayo de actividad de p-glucosidasa (pNPG U/g)".
En una forma de realización, las cepas de DFM de la invención pueden usarse en combinación con una xilanasa y una p-glucanasa que comprenden (o consisten esencialmente en, o consisten en) aproximadamente 2000 a aproximadamente 5000 ABX u/g de actividad de xilanasa (adecuadamente al menos aproximadamente 2500 a aproximadamente 4000 ABX u/g de actividad, adecuadamente al menos aproximadamente 3000 a aproximadamente 4000 ABX u/g de actividad) según se determina usando el "ensayo de actividad de xilanasa (ABX U/g)"; y aproximadamente 600 a aproximadamente 4000 CMC u/g de actividad de p-glucanasa (adecuadamente al menos aproximadamente 1000 a aproximadamente 3000 CMC u/g de actividad, adecuadamente al menos aproximadamente 1500 a aproximadamente 2600 CMC u/g de actividad) según se determina usando el “ensayo de actividad de pglucanasa (CMC U/g)".
Adecuadamente, las cepas de DFM de la invención pueden usarse en combinación con una xilanasa, una p-glucanasa y una p-glucosidasa que comprenden (o consisten esencialmente en, o consisten en) aproximadamente 2000 a aproximadamente 5000 ABX u/g de actividad de xilanasa (adecuadamente al menos aproximadamente 2500 a aproximadamente 4000 ABX u/g de actividad, adecuadamente al menos aproximadamente 3000 a aproximadamente 4000 ABX u/g de actividad) según se determina usando el “ensayo de actividad de xilanasa (ABX U/g)”; aproximadamente 600 a aproximadamente 4000 CMC u/g de actividad de p-glucanasa (adecuadamente al menos aproximadamente 1000 a aproximadamente 3000 CMC u/g de actividad, adecuadamente al menos aproximadamente 1500 a aproximadamente 2600 CMC u/g de actividad) según se determina usando el “ensayo de actividad de pglucanasa (CMC U/g)"; y aproximadamente 200 a aproximadamente 4000 pNPG u/g de actividad de p-glucosidasa (adecuadamente al menos aproximadamente 300 a aproximadamente 3000 pNPG u/g de actividad, adecuadamente al menos aproximadamente 1000 a aproximadamente 3000 pNPG u/g de actividad o adecuadamente al menos aproximadamente 2000 a aproximadamente 3000 pNPG u/g de actividad) según se determina utilizando el "ensayo de actividad de p-glucosidasa (pNPG U/g)".
"Ensayo de actividad de xilanasa (XU)"
La actividad de xilanasa se puede expresar en unidades de xilanasa (XU) medidas a pH 5,0 con AZCL-arabinoxilano (arabinoxilano de trigo reticulado con azurina, Xylazyme 100 mg en comprimidos, Megazyme) como sustrato. La hidrólisis por endo-(1 -4)-p-D-xilanasa (xilanasa) produce fragmentos teñidos solubles en agua, y la tasa de liberación de estos (aumento de la absorbancia a 590 nm) puede relacionarse directamente con la actividad enzimática. Las unidades de xilanasa (XU) se determinan con respecto a un patrón enzimático (Danisco Xylanase, disponible de Danisco Animal Nutrition) en condiciones de reacción estándar, que son 40 °C, 10 min de tiempo de reacción en tampón Mcllvaine, pH 5,0.
La actividad de xilanasa de la enzima estándar se determina como la cantidad de grupos terminales de azúcares reductores liberados de un sustrato de xilano de avena-espelta por minuto a pH 5,3 y 50 °C. Los grupos terminales de azúcares reductores reaccionan con ácido 3,5-dinitrosalicílico y la formación del producto de reacción puede medirse como un aumento en la absorbancia a 540 nm. La actividad enzimática se cuantifica con respecto a una curva patrón de xilosa (equivalentes de azúcares reductores). Una unidad de xilanasa (XU) es la cantidad de enzima estándar que libera 0,5 pmol de equivalentes de azúcar reductor por minuto a pH 5,3 y 50 °C.
"Ensayo de actividad de xilanasa (ABX U/g)"
La actividad de xilanasa se puede expresar en unidades de xilanasa de madera de abedul de ácido (ABX U) medidas a pH 5,3 con 4-O metil glucuronoxilano de madera de abedul como sustrato. Pipetear 1,8 ml de solución de sustrato de 4-O metil glucuronoxilano de madera de abedul al 1% en cada tubo de ensayo. Incubar durante 10-15 minutos, permitiendo que se equilibre a 502C. Pipetear 0,2 ml de dilución de enzima utilizando pipetas de desplazamiento positivo o equivalentes. Agitar en vórtice para realizar el mezclado. Incubar cada muestra a 50 °C durante exactamente 5 minutos. Añadir 3 ml de solución de sal sódica del ácido 3,5 nitrosalicílico (DNS) al 1% y mezclar. Cubrir la parte superior de los tubos de ensayo con tapas para evitar la evaporación. Disponer los tubos de ensayo en un baño hirviendo durante exactamente 5 minutos. Enfriar los tubos de ensayo durante 10 minutos en un baño de hielo/agua. Incubar el tubo de ensayo durante 10 minutos a temperatura ambiente. Transferir el contenido del tubo de ensayo a cubetas y medir a 540 nm frente a agua desionizada. Corregir la absorbancia del color de fondo restando el blanco de enzima correspondiente. La actividad enzimática se cuantifica con respecto a una curva patrón de xilosa (equivalentes de azúcares reductores).
Una unidad ABX se define como la cantidad de enzima necesaria para generar 1 pmol de equivalentes de azúcar reductor de xilosa por minuto a 50 °C y pH 5,3.
"Ensayo de actividad de p-glucanasa (CMC U/g)"
La actividad de p-glucanasa se puede expresar en unidades de CMC medidas a pH 4,8 con sal sódica de carboxilmetilcelulosa (CMC) como sustrato. Pipetear 1 ml de solución de sal sódica de carboxilmetilcelulosa (CMC) al 1% (preparada con tampón de acetato de sodio 0,05 M) en tubos de muestra y en blanco. Incubar los tubos en un baño de agua a 50 °C durante 10 minutos. Pipetear 1 ml de dilución de enzima a intervalos de 15 segundos en los tubos de muestra. Mezclar los tubos después de cada adición. Después de 10 minutos, añadir 3 ml de sal sódica del ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS) al 1 % en el mismo orden y en el mismo momento que la adición de enzima a los tubos de muestra. Añadir 3 ml de DNS a los tubos de muestra en blanco. Después de añadir el DNS, retirar los tubos de ensayo a otra gradilla que no esté en el baño de agua a 50 °C. Añadir 1 ml de enzima diluida al blanco de muestra correspondiente. Tapar los tubos y ebullir durante exactamente 5 minutos. Retirarlos del baño de agua a 100 °C y disponerlos en un baño de hielo durante 10 minutos. Dejar a temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Transferir a cubetas de 3 ml. Usando el blanco de reactivo para poner a cero el espectrofotómetro, se lee cada muestra a 540 nm frente a agua desionizada. La actividad enzimática se cuantifica con respecto a una curva patrón de glucosa (equivalentes de azúcares reductores).
Una unidad de actividad CMC libera 1 pmol de azúcares reductores (expresados como equivalentes de glucosa) en un minuto a 50 °C y pH 4,8.
"Ensayo de actividad de p-glucanasa (BGU)"
La actividad de beta-glucanasa se puede expresar en unidades de beta-glucanasa (BGU) medidas a pH 5,0 con AZCL-glucano (p-glucano de cebada reticulado con azurina, Glucazyme 100 mg en comprimidos, Megazyme) como sustrato. La hidrólisis por beta-glucanasa produce fragmentos teñidos solubles, y la tasa de liberación de estos (aumento de la absorbancia a 590 nm) puede relacionarse directamente con la actividad enzimática. Las unidades de beta-glucanasa (BGU) se determinan con respecto a un patrón enzimático (Multifect BGL, disponible de Danisco Animal Nutrition) en condiciones de reacción estándar, que son 50 °C, 10 min de tiempo de reacción en tampón de acetato 0,1 M, pH 5,0.
La actividad de beta-glucanasa de la enzima estándar se determina como la cantidad de grupos terminales de azúcares reductores liberados por minuto a partir de un sustrato de glucano de cebada a pH 5,0 y 50 °C. Los grupos terminales de azúcares reductores reaccionan con ácido 3,5-dinitrosalicílico y la formación del producto de reacción se puede medir como un aumento en la absorbancia a 540 nm. La actividad enzimática se cuantifica con respecto a una curva patrón de glucosa (equivalentes de azúcares reductores). Una unidad de beta-glucanasa (BGU) es la cantidad de enzima estándar que libera 2,4 pmol de equivalentes de azúcar reductor por minuto a pH 5,0 y 50 °C.
"Ensayo de actividad de p-glucosidasa (pNPG U/g)"
La actividad de p-glucosidasa se puede expresar en unidades de pNPG medidas a pH 4,8 con para-nitrofenil-B-D-glucopiranósido (pNPG) como sustrato. Pipetear 1 ml de solución de nitrofenil-beta-D-glucopiranósido (pNPG) al 3% (preparada con tampón de acetato de sodio 0,05 M) en tubos de ensayo por duplicado para cada muestra y control. Disponerlos en baño de agua a 50 °C durante 5 minutos. Añadir 200 pl de control o muestra a sus respectivos tubos duplicados a intervalos de 15 a 30 segundos. Añadir al tubo de blanco de reactivo 200 pl de tampón de acetato de sodio. Agitar en vórtice cada tubo después de la adición de la muestra. Dejar que los tubos se incuben durante exactamente 10 minutos. Después de la incubación de 10 minutos, añadir 500 pl de solución de carbonato de sodio 1 M para detener la reacción. Agitar en vórtice cada tubo después de la adición y disponer el tubo en una gradilla fuera del baño de agua. Añadir 10 ml de agua milli-Q a cada tubo y agitar para realizar el mezclado. Utilizando el blanco de reactivo para poner a cero el espectrofotómetro, se mide la concentración de 4-nitrofenol leyendo cada muestra a 400 nm.
Una unidad de pNPG representa 1 pmol de nitrofenol liberado por minuto a 50 °C y pH 4,8 a partir de para-nitrofenil-B-D-glucopiranósido.
Ventajas
La interacción de los DFM con la xilanasa y la p-glucanasa (y, opcionalmente, al menos una enzima degradadora de fibra adicional) es complicada y, sin pretender vincularse a ninguna teoría, es muy sorprendente que podamos observar un aumento en la producción de ácidos grasos de cadena corta en el TGI de los animales.
Se ha encontrado que la combinación de los DFM específicos de la invención con al menos una xilanasa y al menos una p-glucanasa (y opcionalmente al menos una enzima degradadora de fibra adicional) es particularmente ventajosa en productos alimenticios y/o en un sujeto que se alimenta con un producto alimenticio con alto contenido de subproductos fibrosos (por ejemplo, de las industrias de biocombustibles y harineras).
Sorprendentemente, se ha descubierto que el valor nutricional y la digestibilidad de los productos alimenticios que contienen cantidades sustanciales (a veces del 30 al 60%) de subproductos fibrosos (que tienen un alto contenido de polisacáridos no amiláceos, por ejemplo, fibra) se pueden mejorar significativamente, al igual que el rendimiento y la ganancia de peso de un sujeto alimentado con dichos productos alimenticios.
Una ventaja de la presente invención es la mejora de la tasa de conversión alimenticia (FCR) observada al usar la combinación de la presente invención.
Sin pretender vincularse a ninguna teoría, la degradación del material dietético derivado de partículas de la pared celular vegetal que tiene un alto contenido de polisacáridos no amiláceos (NSP) por las xilanasas puede optimizarse para mejorar el rendimiento animal combinando la xilanasa (por ejemplo, endo-1,4-p -d-xilanasa) con una o más pglucanasas (y opcionalmente en combinación con una o más enzimas degradadoras de fibra adicionales (por ejemplo, una celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.176 y E.C. 3.2.1.91), una p-glucosidasa (E.C. 3.2.1.21 ), una p-xilosidasa (E.C.
3.2.1.37), una feruloil esterasa (E.C. 3.1.1.73), una a-arabinofuranosidasa (E.C. 3.2.1.55), una pectinasa (por ejemplo, una endopoligalacturonasa (E.C. 3.2.1.15), una exopoligalacturonasa (E.C. 3.2.1.67) o una pectato liasa (E.C.
4.2.2.2)), o combinaciones de las mismas)) y uno o más microbios de alimentación directa (DFM) específicos seleccionados por su capacidad para producir enzimas y/o su capacidad para producir ácidos grasos de cadena corta (SCFA) a partir de pentosas de fracción NSP en condiciones anaeróbicas y/o su capacidad para promover poblaciones endógenas de microflora fibrolítica en el TGI de un sujeto y/o su capacidad para degradar azúcares C5.
La razón por la que esta combinación mejora el rendimiento es que la solubilización de la fibra, específicamente de la hemicelulosa, de la dieta se maximiza en el aparato gastrointestinal (TGI) de los animales. Esta solubilización de la hemicelulosa no siempre sería suficiente para aumentar el rendimiento porque los azúcares C5 liberados no son una fuente eficaz de energía para los animales cuando se absorben (Savory C.J. Br. J. Nut. 1992, 67: 103-114), pero son una fuente de energía más eficaz cuando se convierten en ácidos grasos de cadena corta (SCFA), ya sea por microorganismos presentes en el GIT o por DFM.
Por lo tanto, el valor energético de los productos vegetales (por ejemplo, trigo, maíz, avena, cebada y coproductos (subproductos) de cereales o una dieta mixta de cereales fácilmente accesible para los monogástricos) se puede optimizar combinando xilanasa (por ejemplo, endo-1,4-p-d-xilanasa) y p-glucanasa (y opcionalmente al menos una enzima degradadora de fibra adicional (que incluye, pero sin limitación, una celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.176 y E.C.
3.2.1.91), una p-glucosidasa (E.C. 3.2.1.21), una p-xilosidasa (E.C. 3.2.1.37), una feruloil esterasa (E.C. 3.1.1.73), una a-arabinofuranosidasa (E.C. 3.2.1.55), una pectinasa (por ejemplo, una endopoligalacturonasa (E.C. 3.2.1.15), una exopoligalacturonasa (E.C. 3.2 .1.67) o una pectato liasa (E.C. 4.2.2.2)), o combinaciones de las mismas)) y DFM específicos que pueden producir SCFA a partir de pentosas de fracción NSP en condiciones anaeróbicas y/o que pueden modular las poblaciones microbianas en el GIT para aumentar la producción de SCFA de los azúcares liberados y/o que pueden utilizar azúcares C-5. Los DFM pueden adaptar su metabolismo para aumentar sinérgicamente la hidrólisis de fibra en combinación con xilanasa y p-glucanasa (y opcionalmente al menos una enzima degradadora de fibra adicional). El uso de DFM que pueden producir enzimas (fibrolíticas) puede proporcionar beneficios adicionales y maximizar los beneficios de las enzimas añadidas.
Los DFM específicos seleccionados por sus actividades enzimáticas se pueden considerar como una cadena alimentaria bacteriana impulsada por glicanos. Los DFM específicamente seleccionados que se enseñan en el presente documento pueden utilizar preferentemente fibras dietéticas, una característica que les permite llevar a cabo las etapas iniciales de digestión de glicanos para liberar polisacáridos más cortos y solubles para otras bacterias, por ejemplo otra microflora endógena del GIT. Los DFM específicos se han seleccionado por su metabolismo que se ajusta según los glucanos liberados por las enzimas (por ejemplo, xilanasa y p-glucanasa (y opcionalmente al menos una enzima degradadora de fibra adicional)) para mejorar la eficacia de la combinación de enzimas que se enseñan en el presente documento y los DFM en comparación con el uso de una combinación de enzimas solas o el uso de DFM solos.
Sin pretender vincularse a ninguna teoría, en la presente invención, el material dietético derivado de partículas de la pared celular vegetal que es rico en glicanos de fuente específica, tales como celulosa, hemicelulosa y pectina (material vegetal) o glicosaminoglicanos, ingresa al intestino distal en forma de partículas que son atacadas por los degradadores de glicanos de DFM específicos que son capaces de unirse directamente a estas partículas insolubles y digerir sus componentes de glicanos. Después de esta degradación inicial de las partículas que contienen glicanos, los fragmentos de glicanos más solubles pueden ser digeridos por los degradadores secundarios de glicanos presentes en el ciego, que contribuyen al grupo liberado de productos de fermentación de ácidos grasos de cadena corta (SCFA) que se deriva de ambos tipos de degradadores. Dado que los SCFA surgen de la fermentación de carbohidratos y/o la fermentación de proteínas y la desaminación por parte de la microflora anaeróbica autóctona presente en el TGI, la concentración de SCFA puede ser un índice de la población de organismos anaeróbicos. Los SCFA en realidad pueden proporcionar una serie de beneficios para el animal huésped, actuando como combustible metabólico para el tejido intestinal, muscular, renal, cardiaco, hepático y cerebral, y también proporcionando propiedades bacteriostáticas y bactericidas contra organismos tales como Salmonela y E. coli.
El valor nutricional de la fibra en los no rumiantes puede derivarse principalmente de la producción de ácidos grasos de cadena corta (SCFA) a través de la fermentación de fibras solubilizadas o degradadas mediante enzimas degradadoras de fibra eficaces (por ejemplo, xilanasas y p-glucanasa y/u una enzima degradadora de fibra adicional tal como se enseña en el presente documento). La xilanasa de piensos por sí sola no es suficiente para usar ingredientes fibrosos en las dietas de los animales (especialmente los no rumiantes). Existe una gran variedad de características químicas entre los ingredientes de piensos de base vegetal. La aplicación de enzimas depende de las características del material vegetal (pienso). Solo a modo de ejemplo, en el grano de trigo predominan los arabinoxilanos, sin embargo, en las harinillas de trigo (un coproducto (subproducto) de la molienda del trigo), el contenido de p-glucano aumenta de 8 g-1 de MS (en grano) hasta un exceso de 26 g kg-1 de MS. Una matriz enzimática que contiene un complejo de xilanasa y p-glucanasa (y opcionalmente al menos una enzima degradadora de fibra adicional) puede mejorar el valor nutricional de productos alimenticios con alto contenido de dietas basadas en coproductos (subproductos).
Los SCFA tienen diferentes valores energiticos y algunos pueden servir como precursores de la glucosa y algunos pueden contribuir al mantenimiento de la integridad y la salud intestinal. Los inventores han encontrado que las combinaciones especvficas que se ensepan en el presente documento mueven preferentemente el proceso de fermentación en el GIT de un animal hacia la producción de SCFA mas valiosos/itiles.
Sin pretender vincularse a ninguna teorva, los presentes inventores han descubierto que los NSP pueden degradarse eficazmente mediante una combinación de DFM segin la presente invención y una xilanasa y una p-glucanasa (y opcionalmente al menos una enzima degradadora de fibra adicional). Además, se ha descubierto que esta combinación específica libera azúcares C-5 que normalmente tienen solo un valor nutricional marginal para el animal. Sin embargo, usando combinaciones como las reivindicadas en el presente documento, es posible que los microorganismos presentes en el GIT (ya sea el DFM de la presente invención) o la microflora fibrolítica endógena (que están estimulados por las combinaciones (de DFM) de la presente invención) conviertan estos C-5 azúcares en componentes útiles y valiosos desde el punto de vista nutricional, a saber, ácidos grasos de cadena corta. Estos ácidos grasos de cadena corta pueden ser utilizados por el animal. Así, el sistema mejora el valor nutritivo de un producto alimenticio para un animal.
Ventajosamente, la combinación de cepas microbianas de alimentación directa de la invención, una xilanasa y una pglucanasa (y opcionalmente al menos una enzima degradadora de fibra adicional) aumenta sorprendentemente la degradación de fibra en una composición de aditivo para piensos, premezcla, pienso o producto alimenticio, lo que conduce a mejora del rendimiento de un sujeto. En particular, la combinación de la presente invención mejora la digestibilidad de una materia prima en un producto alimenticio, lo que da como resultado un aumento en la biodisponibilidad de los nutrientes (por ejemplo, la digestibilidad de los nutrientes) y la energía metabolizable en los mismos.
Formulación del DFM con las enzimas
Los DFM de la presente invención y las enzimas pueden formularse de cualquier forma adecuada para garantizar que la formulación comprenda DFM viables y enzimas activas.
En una forma de realización, los DFM y las enzimas se pueden formular como un polvo seco o un gránulo. El polvo seco o los gránulos se pueden preparar por medios conocidos por los expertos en la técnica, tales como en un mezclador de microingredientes.
Para algunas formas de realización, los DFM y/o la(s) enzima(s) se pueden recubrir, por ejemplo, encapsular. Adecuadamente, los DFM y las enzimas pueden formularse dentro del mismo recubrimiento o encapsularse dentro de la misma cápsula. Alternativamente, una o dos o tres o cuatro de las enzimas pueden formularse dentro del mismo recubrimiento o encapsularse dentro de la misma cápsula y los DFM pueden formularse en un recubrimiento separado de una o más o todas las enzimas. En algunas formas de realización, tales como cuando los DFM son capaces de producir endosporas, los DFM se pueden proporcionar sin ningún recubrimiento. En dichas circunstancias, las endosporas de DFM pueden mezclarse simplemente con una o dos o tres o cuatro enzimas. En el último caso, las enzimas pueden recubrirse, por ejemplo encapsularse, por ejemplo, una o más o todas las enzimas pueden recubrirse, por ejemplo encapsularse. Las enzimas se pueden encapsular en forma de mezclas (es decir, que comprenden una o más, dos o más, tres o más o todas) de enzimas o se pueden encapsular por separado, por ejemplo como enzimas individuales. En una forma de realización preferida, las cuatro enzimas pueden recubrirse, por ejemplo encapsularse, conjuntamente.
En una forma de realización, el recubrimiento protege las enzimas del calor y puede considerarse un termoprotector.
En una forma de realización, la composición de aditivo para piensos se formula como un polvo seco o gránulos tal como se describe en el documento WO2007/044968 (denominados gránulos de TPT).
En algunas formas de realización, los DFM (por ejemplo, endosporas de DFM, por ejemplo) se pueden diluir utilizando un diluyente, tal como polvo de almidón, caliza o similar.
En otra forma de realización, la composición de aditivo para piensos se puede formular aplicando, por ejemplo pulverizando, la(s) enzima(s) sobre un sustrato portador, tal como trigo molido, por ejemplo.
En una forma de realización, la composición de aditivo para piensos según la presente invención se puede formular como una premezcla. A modo de ejemplo, solo la premezcla puede comprender uno o varios componentes del pienso, tal como uno o varios minerales y/o una o varias vitaminas.
En una forma de realización, los DFM y/o las enzimas para su uso en la presente invención se formulan con al menos un vehículo fisiológicamente aceptable seleccionado de al menos uno de maltodextrina, caliza (carbonato de calcio), ciclodextrina, trigo o un componente de trigo, sacarosa, almidón, Na2SO4, talco, PVA, sorbitol, benzoato, sorbato, glicerol, sacarosa, propilenglicol, 1,3-propanodiol, glucosa, parabenos, cloruro de sodio, citrato, acetato, fosfato, calcio, metabisulfito, formiato y mezclas de los mismos.
Envasado
En una forma de realización, la composición de aditivo para piensos y/o la premezcla y/o el pienso o el producto alimenticio según la presente invención se envasa.
En una forma de realización preferida, la composición de aditivo para piensos y/o la premezcla y/o el pienso o el producto alimenticio se envasan en una bolsa, tal como una bolsa de papel.
En una forma de realización alternativa, la composición de aditivo para piensos y/o la premezcla y/o el pienso o el producto alimenticio se pueden sellar en un recipiente. Se puede utilizar cualquier recipiente adecuado.
Subproductos
La industria de piensos para animales ha visto un aumento en la alimentación de subproductos, por ejemplo desde el procesamiento de biocombustibles hasta los animales (aumentando esta forma de alimentación animal del 0-10% a los extremos actuales del 30-60%). Estos ahorros en los costes de la dieta han sido una gran oportunidad para que la industria ahorre en los costes de insumos de piensos, pero también conllevan una serie de desafíos. Los subproductos suelen ser productos ricos en fibra (por ejemplo, al menos aproximadamente el 40% de fibra). En consecuencia, la inclusión de subproductos con alto contenido de fibra (por ejemplo, DDGS) puede tener un efecto negativo sobre el rendimiento de crecimiento animal y las características de la canal. Además de los efectos negativos sobre el crecimiento animal y la calidad de la canal, las alteraciones en la digestibilidad de los nutrientes tienen implicaciones en la manipulación, el almacenamiento y la descomposición del estiércol (por ejemplo, estiércol porcino).
El término "subproducto", tal como se utiliza en el presente documento, significa cualquier material vegetal fibroso, por ejemplo uno que comprende al menos aproximadamente el 20% o el 30% de fibra).
En una forma de realización, el término subproducto significa cualquier subproducto de un material de alimentación con alto contenido de fibra. En una forma de realización, el subproducto al que se hace referencia en el presente documento puede seleccionarse de uno o más de los siguientes productos: harina de germen de maíz, salvado de maíz, pienso de maíz nixtamalizado, pienso de gluten de maíz, granos secos de destilería y solubles (DDGS), granos secos de destilería (DDG), harina de gluten, moyuelos de trigo, harinillas de trigo o combinaciones de los mismos.
En una forma de realización, el producto alimenticio de la presente invención comprende un subproducto fibroso tal como harina de germen de maíz, salvado de maíz, pienso de maíz nixtamalizado, pienso de gluten de maíz, granos secos de destilería y solubles (DDGS), granos secos de destilería (DDG), harina de gluten, moyuelos de trigo, harinillas de trigo o combinaciones de los mismos.
En una forma de realización, el sujeto al que se administra la combinación de DFM, xilanasa y p-glucanasa (y opcionalmente al menos una enzima degradadora de fibra adicional) de la presente invención o la composición de aditivo para piensos de la presente invención, también recibe un producto alimenticio que comprende un subproducto fibroso tal como harina de germen de maíz, salvado de maíz, pienso de maíz nixtamalizado, pienso de gluten de maíz, granos secos de destilería y solubles (DDGS), granos secos de destilería (DDG), harina de gluten, moyuelos de trigo, harinillas de trigo o combinaciones de los mismos.
Descomposición o degradación
La enzima (o composición que comprende la enzima) de la presente invención o tal como se divulga en el presente documento puede usarse para descomponer (degradar) arabinoxilano insoluble (AXinsol) o arabinoxilano soluble (AXsol) o combinaciones de los mismos, o productos de degradación de AXinsol. El término "descomposicón" o "degradación" es sinónimo de hidrólisis.
Polisacáridos no amiláceos (NSP)
Una parte principal de los ingredientes comunes de los piensos vegetales consiste en carbohidratos, lo que hace que los carbohidratos sean un factor crucial en la producción animal. Además de nutrientes fácilmente digeribles, tales como almidón y azúcares, la fracción de carbohidratos de origen vegetal incluye componentes no digeribles (fibrosos), tales como celulosa, hemicelulosa, pectinas, beta-glucanos y lignina.
Todos estos componentes poco digeribles, excluyendo la lignina, se clasifican como un grupo al que se hace referencia en el presente documento como polisacáridos no amiláceos (NSP). La fracción NSP es bien conocida por los efectos antinutricionales que puede ejercer.
En una forma de realización, el término fibra se puede usar de forma intercambiable con el término NSP.
Dentro del grupo de NSP, la propia hemicelulosa es un subgrupo heterogéneo compuesto predominantemente por xilanos, arabinanos, galatanos, glucanos y mananos. El arabinoxilano es la fracción principal de NSP en varias de las materias primas para piensos más importantes, incluidos el trigo y el maíz.
Arabinoxilano (AX)
El término "arabinoxilanos" (AX), tal como se utiliza en el presente documento, significa un polisacárido que consiste en un esqueleto de xilano (unidades de xilosa unidas en 1,4) con L-arabinofuranosa (L-arabinosa en su forma de anillo de 5 átomos) unida aleatoriamente por enlaces 1 a ^2 y/o 1 a ^3 a las unidades de xilosa a lo largo de la cadena. El arabinoxilano es una hemicelulosa que se encuentra tanto en las paredes celulares tanto primarias como secundarias de las plantas. El arabinoxilano se puede encontrar en el salvado de cereales tales como el trigo, el maíz, el centeno y la cebada.
El arabinoxilano (AX) se encuentra en estrecha asociación con la pared celular vegetal, donde actúa como un pegamento que une varios componentes básicos de la pared celular vegetal y el tejido, lo que le da fuerza estructural y rigidez.
Dado que la xilosa y la arabinosa (los constituyentes de los arabinoxilanos) son ambas pentosas, los arabinoxilanos generalmente se clasifican como pentosanos.
El AX es la fracción principal de polisacáridos no amiláceos (NSP) en varias de las materias primas más importantes para piensos, incluidos el trigo y el maíz.
Su abundancia, ubicación dentro del material vegetal y estructura molecular hacen que AX tenga un efecto negativo grave sobre la digestibilidad del pienso, reduciendo eficazmente el valor nutricional de las materias primas en las que está presente. Esto convierte a AX en un importante factor antinutricional que reduce la eficacia de la producción animal.
Los AX también pueden retener cantidades sustanciales de agua (lo que se puede denominar su capacidad de retención de agua); esto puede provocar que los arabinoxilanos solubles sean responsables de una viscosidad (alta), lo que representa una desventaja en muchas aplicaciones.
Arabinoxilano insoluble en agua (AXinsol)
El arabinoxilano insoluble en agua (AXinsol), también conocido como arabinoxilano no extraíble en agua (WU-AX), constituye una proporción significativa de la materia seca del material vegetal.
En trigo, el AXinsol puede representar el 6,3% de la materia seca. En el salvado de trigo y los DDGS de trigo, el AXinsol puede representar aproximadamente el 20,8% o el 13,4% de la materia seca (p/p).
En centeno, el AXinsol puede representar el 5,5% de la materia seca.
En maíz, el AXinsol puede representar el 5,1% de la materia seca. En los DDGS de maíz, los AXinsol pueden representar el 12,6% de la materia seca.
El AXinsol provoca el atrapamiento de nutrientes en el pienso. Grandes cantidades de nutrientes bien digeribles, tales como almidón y proteínas, permanecen encerrados en agrupaciones de material de la pared celular o unidos a las cadenas laterales del AX. Estos nutrientes atrapados no estarán disponibles para su digestión y posterior absorción en el intestino delgado.
Arabinoxilano soluble en agua (AXsol)
El arabinoxilano soluble en agua (AXsol), también conocido como arabinoxilano extraíble en agua (WE-AX), puede causar problemas en la producción de biocombustibles y/o el malteado y/o la elaboración de cerveza y/o en los piensos, ya que pueden provocar un aumento de la viscosidad debido a la capacidad de unión al agua del AXsol. En los piensos, el AXsol puede tener un efecto antinutricional, especialmente en monogástricos, ya que causa un aumento considerable de la viscosidad del contenido intestinal, provocado por la extraordinaria capacidad de retención de agua del AXsol. El aumento de la viscosidad puede afectar a la digestión del pienso y al uso de nutrientes, ya que puede evitar el mezclado adecuado del pienso con las enzimas digestivas y las sales biliares y/o ralentiza la disponibilidad y la absorción de nutrientes y/o estimula la fermentación en el intestino posterior.
En trigo, el AXsol puede representar el 1,8% de la materia seca. En el salvado de trigo y los DDGS de trigo, el AXsol puede representar aproximadamente el 1,1% o el 4,9% de la materia seca (p/p).
En centeno, el AXsol puede representar el 3,4% de la materia seca.
En cebada, el AXsol puede representar 0,4-0,8% de la materia seca.
En maíz, el AXsol puede representar el 0,1% de la materia seca. En los DDGS de maíz, el AXinsol puede representar el 0,4% de la materia seca.
Sin embargo, además de la cantidad de AXsol presente en el material vegetal, cuando una xilanasa solubiliza AXinsol en el material vegetal, este puede liberar pentosanos y/u oligómeros que contribuyen al contenido de AXsol del material vegetal.
Una ventaja significativa de algunas de las xilanasas descritas en el presente documento es que tienen la capacidad tanto de solubilizar AXinsol como de descomponer rápidamente y eficazmente los oligómeros y/o pentosanos solubilizados, por lo que las enzimas pueden solubilizar AXinsol sin aumentar la viscosidad y/o disminuir viscosidad. La descomposición de AXsol puede disminuir la viscosidad.
La descomposición de AXsol puede liberar nutrientes.
Viscosidad
La presente invención se puede utilizar para reducir la viscosidad en cualquier proceso en el que la capacidad de retención de agua de AXsol provoque un aumento no deseado de la viscosidad.
La presente invención se refiere a la reducción de la viscosidad mediante la descomposición (degradación) de AXsol o la descomposición (degradación) de los polímeros y/u oligómeros producidos mediante la solubilización de AXinsol. En la presente invención, se puede calcular una reducción de la viscosidad comparando una muestra que comprende la xilanasa de la presente invención (o que se enseña en el presente documento) con otra muestra comparable sin la xilanasa de la presente invención (o que se enseña en el presente documento). La comparación de los perfiles de reducción de la viscosidad de la xilanasa de la presente invención con los de las xilanasas de referencia en el mercado demuestra el rendimiento de la enzima. El objetivo es mejorar el rendimiento de la enzima en comparación con la referencia del mercado. Las enzimas de referencia para las aplicaciones individuales se proporcionan en los ejemplos siguientes.
En una forma de realización de la presente invención, las xilanasas que se enseñan en el presente documento son reductores de la viscosidad.
Piensos o productos alimenticios
La enzima o la composición de aditivo para piensos de la presente invención se pueden usar como un pienso o en la preparación del mismo.
El término "pienso" se utiliza en el presente documento como sinónimo de "producto alimenticio".
En una forma de realización, el producto alimenticio de la presente invención comprende material de pienso con alto contenido de fibra y/o al menos un subproducto del, al menos un, material de pienso con alto contenido de fibra, tal como harina de germen de maíz, salvado de maíz, pienso de maíz nixtamalizado, pienso de gluten de maíz, granos secos de destilería y solubles (DDGS), granos secos de destilería (DDG), harina de gluten, moyuelos de trigo, harinillas de trigo o combinaciones de los mismos.
En una forma de realización, el sujeto al que se administra la combinación de DFM, xilanasa y p-glucanasa (opcionalmente en combinación con una enzima degradadora de fibra adicional) de la presente invención o la composición de aditivo para piensos de la presente invención, también se alimenta con un producto alimenticio que comprende un material de pienso con alto contenido de fibra y/o al menos un subproducto del, al menos un, material de pienso con alto contenido de fibra, tal como harina de germen de maíz, salvado de maíz, pienso de maíz nixtamalizado, pienso de gluten de maíz, granos secos de destilería y solubles (DDGS), granos secos de destilería (DDG), harina de gluten, moyuelos de trigo, harinillas de trigo o combinaciones de los mismos.
Adecuadamente, en una forma de realización, el componente de cereales de la dieta de un sujeto avícola puede ser trigo o cebada con centeno, harinillas de trigo, salvado de trigo, avena, cáscaras de avena, mientras que los componentes vegetales pueden ser harina de soja con o sin otros ingredientes proteicos tales como canola, harina de semillas de colza, etc., siempre que la dieta contenga trigo y cebada como ingredientes principales y esté formulada de forma que cumpla con los requisitos de nutrientes de las aves alimentadas.
El pienso según la presente invención puede estar en forma de una solución o como un sólido, dependiendo del uso y/o el modo de aplicación y/o el modo de administración. Cuando se utiliza como un pienso, o en la preparación del mismo, tal como un pienso funcional, la enzima o composición de la presente invención se puede utilizar junto con uno o más de: un vehículo nutricionalmente aceptable, un diluyente nutricionalmente aceptable, un excipiente nutricionalmente aceptable, un adyuvante nutricionalmente aceptable, un ingrediente nutricionalmente activo.
En una forma de realización preferida, la enzima o la composición de aditivo para piensos de la presente invención se mezcla con un componente de pienso para formar un producto alimenticio.
El término "componente de pienso", tal como se utiliza en el presente documento, significa todo o parte del producto alimenticio. Parte del producto alimenticio puede significar un componente del producto alimenticio o más de un componente del producto alimenticio, por ejemplo, 2 o 3 o 4. En una forma de realización, el término "componente de pienso" abarca una premezcla o constituyentes de premezcla.
Preferentemente, el pienso puede ser un forraje o una premezcla del mismo, un pienso compuesto o una premezcla del mismo. En una forma de realización, la composición de aditivo para piensos según la presente invención se puede mezclar con un pienso compuesto, un componente de pienso compuesto o una premezcla de un pienso compuesto o un forraje, un componente de forraje o una premezcla de forraje.
El término forraje, tal como se utiliza en el presente documento, significa cualquier alimento que se proporciona a un animal (en lugar de que el animal tenga que buscarlo por sí mismo). El forraje abarca las plantas que han sido cortadas.
El término forraje incluye ensilaje, piensos comprimidos y granulados, aceites y raciones mixtas, y también granos y leguminosas germinados.
El forraje se puede obtener de una o más de las plantas seleccionadas de: maíz, alfalfa (Lucerna), cebada, trébol pata de pájaro, plantas del género Brassica, Chau moellier, col rizada, colza (canola), colinabo (nabo sueco), nabo, trébol, trébol alsike, trébol rojo, trébol subterráneo, trébol blanco, festuca, bromo, mijo, avena, sorgo, soja, árboles (brotes de árboles desmochados para heno), trigo y legumbres.
El término "pienso compuesto" significa un pienso comercial en forma de harina, gránulos, nueces, torta o migas. Los piensos compuestos pueden formarse a partir de la combinación de diversas materias primas y aditivos. Estas combinaciones se formulan según los requerimientos específicos del animal diana.
Los piensos compuestos pueden ser piensos completos que aportan todos los nutrientes necesarios diariamente, concentrados que aportan una parte de la ración (proteínas, energía) o suplementos que solo aportan micronutrientes adicionales, tales como minerales y vitaminas.
Los principales ingredientes utilizados en los piensos compuestos son los cereales forrajeros, que incluyen maíz, trigo, salvado de trigo, soja, sorgo, avena y cebada.
Adecuadamente, una premezcla a la que se hace referencia en el presente documento puede ser una composición compuesta de microingredientes tales como vitaminas, minerales, conservantes químicos, antibióticos, productos de fermentación y otros ingredientes esenciales. Las premezclas suelen ser composiciones adecuadas para su combinación en raciones comerciales.
Cualquier producto alimenticio que comprenda la composición de aditivo para piensos de la presente invención puede comprender uno o más materiales de pienso seleccionados del grupo que comprende a) cereales, tales como granos pequeños (por ejemplo, trigo, cebada, centeno, avena, triticale y combinaciones de los mismos) y/o granos grandes tales como maíz o sorgo; b) subproductos de cereales, tales como harina de germen de maíz, salvado de maíz, pienso de maíz nixtamalizado, pienso de gluten de maíz, granos secos de destilería y solubles (DDGS), granos secos de destilería (DDG), harina de gluten, moyuelos de trigo, harinillas de trigo o combinaciones de los mismos; c) proteína obtenida de fuentes tales como soja, girasol, cacahuete, altramuces, guisantes, habas, algodón, canola, harina de pescado, proteína de plasma deshidratada, harina de carne y huesos, proteína de patata, suero de leche, copra, sésamo; d) aceites y grasas obtenidos de fuentes vegetales y animales; e) minerales y vitaminas.
En una forma de realización, el producto alimenticio comprende o consiste en maíz, DDGS (tal como DDGSm), trigo, salvado de trigo o una combinación de los mismos.
En una forma de realización, el componente de pienso puede ser maíz, DDGS (por ejemplo, DDGSm), trigo, salvado de trigo o una combinación de los mismos.
En una forma de realización, el producto alimenticio comprende o consiste en maíz, DDGS (tal como DDGSm) o una combinación de los mismos.
En una forma de realización, un componente de pienso puede ser maíz, DDGS (tal como DDGS de maíz (DDGSm)) o una combinación de los mismos.
Un producto alimenticio que comprende la composición de aditivo para piensos de la presente invención puede contener al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50% o al menos el 60% en peso de maíz y harina de soja o maíz y soja entera, o harina de trigo o harina de girasol.
Un producto alimenticio que comprende la composición de aditivo para piensos de la presente invención puede contener entre aproximadamente el 5 y aproximadamente el 40% de DDGS de maíz. Para las aves de corral, el producto alimenticio puede contener en promedio de aproximadamente el 7 al 12% de DDGS de maíz. Para porcinos (cerdos), el producto alimenticio puede contener en promedio del 5 al 40% de DDGS de maíz.
Un producto alimenticio que comprende la composición de aditivo para piensos de la presente invención puede contener maíz como único grano, en cuyo caso el producto alimenticio puede comprender entre aproximadamente el 35% y aproximadamente el 85% de maíz.
En piensos que comprenden cereales mixtos, por ejemplo que comprenden maíz y trigo, por ejemplo, el producto alimenticio puede comprender al menos el 10% de maíz.
Adicionalmente o como alternativa, un producto alimenticio que comprende la composición de aditivo para piensos de la presente invención puede comprender al menos un material de pienso con alto contenido de fibra y/o al menos un subproducto del, al menos un, material de pienso con alto contenido de fibra para proporcionar un producto alimenticio con alto contenido de fibra. Los ejemplos de materiales de pienso con alto contenido de fibra incluyen: trigo, cebada, centeno, avena, subproductos de cereales, tales como harina de germen de maíz, torta húmeda, granos secos de destilería (DDG), granos secos de destilería y solubles (DDGS), salvado de trigo, harinillas de trigo, moyuelos de trigo, salvado de arroz, cascarilla de arroz, cascarilla de avena, palmiste y pulpa de cítricos. Algunas fuentes de proteínas también pueden considerarse ricas en fibra: proteínas obtenidas de fuentes tales como el girasol, los altramuces, las habas y el algodón.
En una forma de realización, el producto alimenticio que comprende la composición de aditivo para piensos de la presente invención comprende al menos un material con alto contenido de fibra y/o al menos un subproducto del, al menos un, material de pienso con alto contenido de fibra seleccionado del grupo que consiste en granos secos de destilería y solubles (DDGS), particularmente DDGS de maíz (DDGSm), torta húmeda, granos secos de destilería (DDG), particularmente DDG de maíz (DDGm), salvado de trigo y trigo, por ejemplo.
En una forma de realización, el producto alimenticio que comprende la composición de aditivo para piensos de la presente invención comprende al menos un material con alto contenido de fibra y/o al menos un subproducto del, al menos un, material de pienso con alto contenido de fibra seleccionado del grupo que consiste en granos secos de destilería y solubles (DDGS), particularmente DDGSm, salvado de trigo y trigo, por ejemplo.
En la presente invención, el producto alimenticio puede ser uno o más de los siguientes: un pienso compuesto y una premezcla, que incluye gránulos, nueces o torta (de ganado); un cultivo o residuo de cultivo: maíz, soja, sorgo, avena, cebada, copra, paja, residuos de remolacha azucarera; harina de pescado; harina de carne y huesos; melaza; torta de aceite y torta de prensa; oligosacáridos; plantas forrajeras conservadas: ensilaje; algas marinas; semillas y granos, ya sean enteros o preparados mediante trituración, molienda, etc.; granos y legumbres germinados; extracto de levadura.
El término pienso, en lo que se refiere a la presente invención, también abarca alimentos para mascotas. Un alimento para mascotas es un material vegetal o animal destinado al consumo de mascotas, tal como alimento para perros o alimento para gatos. El alimento para mascotas, tal como alimento para perros y gatos, puede estar en forma seca, tal como croquetas para perros, o en forma húmeda enlatada. El alimento para gatos puede contener el aminoácido taurina.
El término pienso, en lo que se refiere a la presente invención, también abarca alimento para peces. Un alimento para peces normalmente contiene macronutrientes, oligoelementos y vitaminas necesarias para mantener a los peces en cautiverio en buen estado de salud. El alimento para peces puede estar en forma de escamas, gránulos o comprimidos. Las formas granuladas, algunas de las cuales se hunden rápidamente, a menudo se usan para peces más grandes o especies que se alimentan en el fondo. Algunos alimentos para peces también contienen aditivos, tales como betacaroteno u hormonas sexuales, para realzar artificialmente el color de los peces ornamentales.
El término pienso, en lo que se refiere a la presente invención, también abarca alimento para aves. El alimento para aves incluye alimento que se utiliza tanto en comederos para aves como para alimentar a las aves de compañía. Por lo general, el alimento para aves se compone de una diversidad de semillas, pero también puede incluir sebo (grasa de ternera o cordero).
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "puesto en contacto" se refiere a la aplicación indirecta o directa de la composición de la presente invención al producto (por ejemplo, el pienso). Los ejemplos de los procedimientos de aplicación que se pueden utilizar incluyen, pero sin limitación, el tratamiento del producto en un material que comprende la composición de aditivo para piensos, la aplicación directa mezclando la composición de aditivo para piensos con el producto, la pulverización de la composición de aditivo para piensos sobre la superficie del producto o la inmersión del producto en una preparación de la composición de aditivo para piensos.
En una forma de realización, la composición de aditivo para piensos de la presente invención se mezcla preferentemente con el producto (por ejemplo, producto alimenticio). Alternativamente, la composición de aditivo para piensos puede incluirse en la emulsión o en los ingredientes brutos de un producto alimenticio.
Para algunas aplicaciones, es importante que la composición esté disponible sobre o en la superficie de un producto que se va a ver afectado/se va a tratar. Esto permite que la composición imparta una o más de las siguientes características favorables: beneficios de rendimiento.
La composición de la presente invención se puede aplicar de forma que se intercale en, recubra y/o impregne un producto (por ejemplo, producto alimenticio o ingredientes brutos de un producto alimenticio) con una cantidad controlada de dicha enzima.
Adecuadamente, la composición de aditivo para piensos puede administrarse simplemente al sujeto al mismo tiempo que se alimenta al animal con un producto alimenticio.
Preferentemente, la composición de la presente invención será térmicamente estable al tratamiento térmico hasta aproximadamente 70 °C; hasta aproximadamente 85 °C; o hasta aproximadamente 95 °C. El tratamiento térmico se puede realizar hasta aproximadamente 1 minuto; hasta aproximadamente 5 minutos; hasta aproximadamente 10 minutos; hasta aproximadamente 30 minutos; hasta aproximadamente 60 minutos. El término térmicamente estable significa que al menos aproximadamente el 75% de la enzima que estaba presente/activa en el aditivo antes de calentar a la temperatura especificada todavía está presente/activa después de enfriarse a temperatura ambiente. Preferentemente, al menos aproximadamente el 80% de la enzima que está presente y activa en el aditivo antes del calentamiento a la temperatura especificada todavía está presente y activa después de enfriarse a temperatura ambiente.
En una forma de realización particularmente preferida, la composición de la presente invención se homogeneiza para producir un polvo.
En una forma de realización preferida alternativa, la composición de la presente invención se formula en gránulos tal como se describe en el documento WO2007/044968 (denominados gránulos de TPT).
En otra forma de realización preferida, cuando la composición de aditivo para piensos se formula en gránulos, los gránulos comprenden una sal de barrera hidratada que recubre el núcleo de proteína. La ventaja de dicho recubrimiento de sal es una tolerancia térmica mejorada, una estabilidad de almacenamiento mejorada y la protección contra otros aditivos alimentarios que, de otro modo, tendrían un efecto adverso sobre la enzima. Preferentemente, la sal utilizada para el recubrimiento de sal tiene una actividad de agua superior a 0,25 o una humedad constante superior al 60% a 202C.
Preferentemente, el recubrimiento de sal comprende un Na2SO4.
El procedimiento para preparar una composición de la presente invención también puede comprender la etapa adicional de granular el polvo. El polvo se puede mezclar con otros componentes conocidos en la técnica. El polvo, o la mezcla que comprende el polvo, se puede forzar a través de un troquel y las hebras resultantes se cortan en gránulos adecuados de longitud variable.
Opcionalmente, la etapa de granulación puede incluir un tratamiento con vapor, o etapa de acondicionamiento, antes de la formación de los gránulos. La mezcla que comprende el polvo puede disponerse en un acondicionador, por ejemplo una mezcladora con inyección de vapor. La mezcla se calienta en el acondicionador hasta una temperatura específica, tal como de 60 a 100 °C, siendo las temperaturas típicas 70 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C o 95 °C. El tiempo de residencia puede ser variable desde segundos hasta minutos e incluso horas, tal como 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 30 segundos, 1 minuto 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos y 1 hora.
Se entenderá que la composición de la presente invención es adecuada para su adición a cualquier material de pienso apropiado.
El experto en la técnica entenderá que diferentes animales requieren diferentes productos alimenticios, e incluso el mismo animal puede requerir diferentes productos alimenticios, dependiendo del propósito para el que se cría al animal.
Opcionalmente, el producto alimenticio también puede contener minerales adicionales tales como, por ejemplo, calcio y/o vitaminas adicionales.
Preferentemente, el producto alimenticio es una mezcla de harina de soja y de maíz.
En una forma de realización, preferentemente el pienso no es un alimento para mascotas.
En el presente documento se describe un procedimiento para producir un producto alimenticio. El producto alimenticio se produce típicamente en molinos de piensos en las que las materias primas se muelen en primer lugar a un tamaño de partícula adecuado y después se mezclan con los aditivos apropiados. A continuación, el producto alimenticio puede producirse en forma de puré o gránulos; estos últimos generalmente implican un procedimiento en el que la temperatura se eleva a un nivel objetivo y después el pienso se hace pasar a través de un troquel para producir gránulos de un tamaño particular. Los gránulos se dejan enfriar. Posteriormente se pueden añadir aditivos líquidos tales como grasas y enzimas. La producción de productos alimenticios también puede implicar una etapa adicional que incluye extrusión o expansión antes de la granulación, en particular mediante técnicas adecuadas que pueden incluir al menos el uso de vapor.
El producto alimenticio puede ser un producto alimenticio para un animal monogástrico, tal como aves de corral (por ejemplo, pollos de engorde, gallinas ponedoras, reproductoras de pollos de engorde, pavos, patos, gansos, aves acuáticas), porcinos (todas las categorías de edad), una mascota (por ejemplo, perros, gatos ) o peces, siendo preferentemente el producto alimenticio para aves de corral.
El producto alimenticio puede ser un producto alimenticio para un animal monogástrico, tal como aves de corral (por ejemplo, pollos de engorde, gallinas ponedoras, reproductoras de pollos de engorde, pavos, patos, gansos, aves acuáticas), porcinos (todas las categorías de edad), una mascota (por ejemplo, perros, gatos ) o peces, siendo preferentemente el producto alimenticio para aves de corral.
El producto alimenticio puede no ser para una gallina ponedora.
Solamente a modo de ejemplo, un producto alimenticio para pollos, por ejemplo pollos de engorde, puede contener uno o más de los ingredientes enumerados en la tabla siguiente, por ejemplo, en los porcentajes indicados en la tabla siguiente:
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Solamente a modo de ejemplo, la especificación de la dieta para pollos, tales como pollos de engorde, puede ser tal como se indica en la tabla siguiente:
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Solamente a modo de ejemplo, un producto alimenticio para gallinas ponedoras puede contener uno o más de los ingredientes enumerados en la tabla siguiente, por ejemplo, en los porcentajes indicados en la tabla siguiente:
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Solamente a modo de ejemplo, la especificación de la dieta para gallinas ponedoras puede ser tal como se indica en la tabla siguiente:
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Solamente a modo de ejemplo, un producto alimenticio para pavos puede comprender uno o más de los ingredientes enumerados en la tabla siguiente, por ejemplo, en los porcentajes indicados en la tabla siguiente:
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Solamente a modo de ejemplo, la especificación de la dieta para pavos puede ser tal como se indica en la tabla siguiente:
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Solamente a modo de ejemplo, un producto alimenticio para lechones puede comprender uno o más de los ingredientes enumerados en la tabla siguiente, por ejemplo, en los porcentajes indicados en la tabla siguiente:
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Solamente a modo de ejemplo, la especificación de la dieta para lechones puede ser tal como se indica en la tabla siguiente:
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Solamente a modo de ejemplo, un producto alimenticio para cerdos en crecimiento/finalización puede contener uno o más de los ingredientes enumerados en la tabla siguiente, por ejemplo, en los porcentajes indicados en la tabla siguiente:
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A modo de ejemplo, solo la especificación de la dieta para cerdos en crecimiento/finalización puede ser tal como se indica en la tabla siguiente:
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Torta húmeda, granos secos de destilería (DDG) y granos secos de destilería y solubles (DDGS)
La torta húmeda, los granos secos de destilería y los granos secos de destilería y solubles son productos obtenidos después de la eliminación del alcohol etílico por destilación de la fermentación de levadura de un grano o una mezcla de granos mediante procedimientos empleados en la industria de destilación de granos.
La vinaza procedente de la destilación (por ejemplo, agua, restos del grano, células de levadura, etc.) se separa en una parte "sólida" y una parte líquida.
La parte sólida se denomina "torta húmeda" y puede utilizarse como pienso para animales como tal.
La parte líquida se evapora (parcialmente) dando un jarabe (solubles).
Cuando la torta húmeda se seca, se denomina granos secos de destilería (DDG).
Cuando la torta húmeda se seca junto con el jarabe (solubles) se denomina granos secos de destilería y solubles (DDGS).
La torta húmeda se puede usar en operaciones de lácteos y corrales de engorde de ganado vacuno.
Los DDGS secos pueden usarse en ganado, por ejemplo lácteo, bovino y porcino) y piensos para aves.
Los DDGS de maíz son una fuente de proteínas muy buena para las vacas lecheras.
Harina de gluten de maíz
El subproducto del maíz puede ser harina de gluten de maíz (CGM).
La CGM es un subproducto en polvo de la industria de molienda de maíz. La CGM tiene utilidad, por ejemplo, en piensos para animales. Se puede utilizar como una fuente económica de proteínas para piensos tales como alimentos para mascotas, piensos para ganado y piensos para aves de corral. Es una fuente especialmente buena del aminoácido cisteína, pero debe equilibrarse con otras proteínas para lisina.
Composición del aditivo para piensos
La composición de aditivo para piensos de la presente invención y/o el producto alimenticio que comprende la misma se puede utilizar en cualquier forma adecuada.
La composición de aditivo para piensos de la presente invención se puede usar en forma de preparaciones sólidas o líquidas o alternativas de las mismas. Los ejemplos de preparaciones sólidas incluyen polvos, pastas, bolos, cápsulas, microgránulos, comprimidos, polvos y gránulos que pueden ser humectables, secados por pulverización o liofilizados. Los ejemplos de preparaciones líquidas incluyen, pero sin limitación, soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas, orgánicas o acuoso-orgánicas.
En algunas aplicaciones, las composiciones de aditivos para piensos de la presente invención pueden mezclarse con piensos o administrarse en el agua de bebida.
En el presente documento se describe un procedimiento para preparar una composición de aditivo para piensos, que comprende mezclar una xilanasa, una p-glucanasa (y opcionalmente al menos una enzima degradadora de fibra adicional) y un DFM tal como se enseña en el presente documento con un vehículo, diluyente o excipiente aceptable para piensos, y (opcionalmente) envasarse.
Premezcla
El producto alimenticio y/o la composición de aditivo para piensos puede combinarse con al menos un mineral y/o al menos una vitamina. Las composiciones derivadas de esta forma pueden denominarse en el presente documento una premezcla.
Formas
La composición de aditivo para piensos de la presente invención y otros componentes y/o el producto alimenticio que los comprende se pueden utilizar en cualquier forma adecuada.
La composición de aditivo para piensos de la presente invención se puede utilizar en forma de preparaciones sólidas o líquidas o alternativas de las mismas. Los ejemplos de preparaciones sólidas incluyen polvos, pastas, bolos, cápsulas, microgránulos, comprimidos, polvos y gránulos que pueden ser humectables, secados por pulverización o liofilizados. Los ejemplos de preparaciones líquidas incluyen, pero sin limitación, soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas, orgánicas o acuoso-orgánicas.
En algunas aplicaciones, las composiciones de aditivos para piensos de la presente invención pueden mezclarse con piensos o administrarse en el agua de bebida. En una forma de realización, el intervalo de dosificación para su inclusión en el agua es de aproximadamente 1 x 103 UFC/animal/día a aproximadamente 1x1010 UFC/animal/día, y de forma más preferida aproximadamente 1x107 UFC/animal/día.
Los ejemplos adecuados de formas incluyen uno o más de: polvos, pastas, bolos, microgránulos, comprimidos, píldoras, cápsulas, óvulos, soluciones o suspensiones, que pueden contener agentes saborizantes o colorantes, para aplicaciones de liberación inmediata, retardada, modificada, mantenida, pulsada o controlada.
A modo de ejemplo, si la composición de la presente invención se usa en forma sólida, por ejemplo forma granulado, también puede contener uno o más de: excipientes tales como celulosa microcristalina, lactosa, citrato de sodio, carbonato de calcio, fosfato de calcio dibásico y glicina; disgregantes tales como almidón (preferentemente almidón de maíz, de patata o de tapioca), glicolato de almidón sódico, croscarmelosa sódica y determinados silicatos complejos; aglutinantes de granulación tales como polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxipropilcelulosa (HPC), sacarosa, gelatina y goma arábiga; pueden incluirse agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico, behenato de glicerilo y talco.
Los ejemplos de vehículos nutricionalmente aceptables para su uso en la preparación de las formas incluyen, por ejemplo, agua, soluciones salinas, alcohol, silicona, ceras, vaselina, aceites vegetales, polietilenglicoles, propilenglicol, liposomas, azúcares, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, tensioactivos, ácido silícico, parafina viscosa, aceite de perfume, monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos petroetrales, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.
Los excipientes preferidos para las formas incluyen lactosa, almidón, celulosa, azúcar de leche o polietilenglicoles de alto peso molecular.
Para suspensiones acuosas y/o elixires, la composición de la presente invención puede combinarse con diversos agentes edulcorantes o saborizantes, colorantes o tintes, con agentes emulsionantes y/o suspensores y con diluyentes tales como agua, propilenglicol y glicerina, y combinaciones de los mismos.
El suero de leche no higroscópico se usa a menudo como vehículo para DFM (en particular, DFM bacterianos) y es un buen medio para iniciar el crecimiento.
Las pastas que contienen DFM bacteriano pueden formularse con aceite vegetal e ingredientes gelificantes inertes. Los productos fúngicos pueden formularse con subproductos de cereales como vehículos.
En una forma de realización, preferentemente, la composición de aditivo para piensos según la presente invención no está en forma de un sistema de micropartículas, tal como el sistema de micropartículas que se enseña en el documento WO2005/123034.
Dosificación
La composición de aditivo para piensos según la presente invención se puede diseñar para una dosificación única o se puede diseñar para la alimentación diaria.
La cantidad óptima de la composición (y de cada uno de sus componentes) que se va a utilizar en la combinación de la presente invención dependerá del producto que se va a tratar y/o del procedimiento de puesta en contacto del producto con la composición y/o del uso previsto para la misma. La cantidad de DFM y enzimas utilizada en las composiciones deberá ser una cantidad suficiente para que sea eficaz y siga siendo lo suficientemente eficaz como para mejorar el rendimiento de los productos de pienso para alimentación animal que contienen dicha composición. Este periodo de tiempo de eficacia debe prolongarse hasta por lo menos el tiempo de utilización del producto (por ejemplo, composición del aditivo para piensos o pienso que lo contiene).
Combinación con otros componentes
El DFM y la(s) enzima(s) para su uso en la presente invención se pueden utilizar en combinación con otros componentes. Así, la presente invención también se refiere a combinaciones. Los DFM de la presente invención en combinación con la xilanasa y una p-glucanasa (y opcionalmente al menos una enzima degradadora de fibra adicional) pueden denominarse en el presente documento "la composición de aditivo para piensos de la presente invención". En una forma de realización preferida, "la composición de aditivo para piensos de la presente invención" puede comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) DFM de la invención en combinación con la xilanasa y una p-glucanasa y una enzima degradadora de fibra adicional tal como se enseña en el presente documento (por ejemplo, adecuadamente al menos dos, adecuadamente al menos tres enzimas degradadoras de fibra adicionales).
En otra forma de realización preferida, "la composición de aditivo para piensos de la presente invención" puede comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) DFM de la invención en combinación con la xilanasa y una p-glucanasa y una enzima degradadora de fibra adicional tal como se enseña en el presente documento (por ejemplo, adecuadamente al menos cuatro, adecuadamente al menos cinco enzimas degradadoras de fibra adicionales). La combinación de la presente invención comprende la composición de aditivo para piensos de la presente invención (o uno o más de los constituyentes de la misma) y otro componente que sea adecuado para el consumo animal y sea capaz de proporcionar un beneficio médico o fisiológico al consumidor.
En una forma de realización, preferentemente, el "otro componente" no es una enzima adicional o un DFM adicional. Los componentes pueden ser prebióticos. Los prebióticos suelen ser carbohidratos no digeribles (oligosacáridos o polisacáridos) o un alcohol de azúcar que no se degrada ni se absorbe en el sistema digestivo superior. Los prebióticos conocidos utilizados en productos comerciales y útiles según la presente invención incluyen inulina (fructooligosacárido o FOS) y transgalacto-oligosacáridos (GOS o TOS). Los prebióticos adecuados incluyen palatinoseoligosacárido, oligosacárido de soja, alginato, xantano, pectina, goma garrofín (LBG), inulina, goma guar, galactooligosacárido (GOS), fructooligosacárido (FOS), almidón no degradable, lactosacarosa, lactulosa, lactitol, maltitol, maltodextrina, polidextrosa (es decir, Litesse®), lactitol, lactosacarosa, oligosacáridos de soja, palatinosa, isomalto-oligosacáridos, gluco-oligosacáridos y xilo-oligosacáridos.
En una forma de realización, la presente invención se refiere a la combinación de la composición de aditivo para piensos según la presente invención (o uno o más de sus constituyentes) con un prebiótico. En otra forma de realización, la presente invención se refiere a una composición de aditivo para piensos que comprende (o consiste esencialmente en o consiste en) cepas de DFM de la invención en combinación con una xilanasa, una p-glucanasa, una amilasa, una fitasa, una proteasa y un prebiótico.
El prebiótico se puede administrar simultáneamente con (por ejemplo, mezclado o administrado simultáneamente por la misma vía o por vías diferentes) o secuencialmente a (por ejemplo, por la misma vía o por vías diferentes) la composición de aditivo para piensos (o sus componentes) según la presente invención.
Otros componentes de las combinaciones de la presente invención incluyen polidextrosa, tal como Litesse®, y/o una maltodextrina y/o lactitol. Estos otros componentes se pueden añadir opcionalmente a la composición del aditivo para piensos para ayudar al proceso de secado y ayudar a la supervivencia del DFM.
Otros ejemplos de otros componentes adecuados incluyen uno o más de: espesantes, agentes gelificantes, emulsionantes, aglutinantes, modificadores cristalinos, edulcorantes (incluidos los edulcorantes artificiales), modificadores de la reología, estabilizantes, antioxidantes, colorantes, enzimas, portadores, vehículos, excipientes, diluyentes, agentes lubricantes, agentes aromatizantes, materia colorante, agentes de suspensión, disgregantes, aglutinantes de granulación, etc. Estos otros componentes pueden ser naturales. Estos otros componentes pueden prepararse mediante el uso de técnicas químicas y/o enzimáticas.
En una forma de realización, los DFM y/o las enzimas pueden encapsularse. En una forma de realización, la composición de aditivo para piensos y/o los DFM y/o las enzimas se formulan como un polvo seco o un gránulo tal como se describe en el documento WO2007/044968 (denominados gránulos de TPT).
En una forma de realización preferida, los DFM y/o las enzimas para su uso en la presente invención se pueden utilizar en combinación con uno o más lípidos.
Por ejemplo, los DFM y/o las enzimas para su uso en la presente invención se pueden utilizar en combinación con una o más micelas lipídicas. La micela lipídica puede ser una micela lipídica simple o una micela lipídica compleja.
La micela lipídica puede ser un agregado de moléculas orientadas de sustancias anfipáticas, tal como un lípido y/o un aceite.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "espesante o agente gelificante" se refiere a un producto que previene la separación ralentizando o evitando el movimiento de partículas, ya sean gotas de líquidos inmiscibles, aire o sólidos insolubles. El espesamiento se produce cuando las moléculas hidratadas individuales provocan un aumento de la viscosidad, lo que ralentiza la separación. La gelificación tiene lugar cuando las moléculas hidratadas se unen para formar una red tridimensional que atrapa las partículas, inmovilizándolas de esta forma.
El término "estabilizante", tal como se utiliza en el presente documento, se define como un ingrediente o combinación de ingredientes que evita que un producto (por ejemplo, un producto alimenticio) cambie a lo largo del tiempo.
El término "emulsionante", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un ingrediente (por ejemplo, un ingrediente de pienso) que evita la separación de las emulsiones. Las emulsiones son dos sustancias inmiscibles, una presente en forma de gotas, contenida dentro de la otra. Las emulsiones pueden consistir en aceite en agua, en las que las gotas o la fase dispersa es aceite y la fase continua es agua; o agua en aceite, en las que el agua se convierte en la fase dispersa y la fase continua es el aceite. Las espumas, que son gas en líquido, y las suspensiones, que son sólido en líquido, también se pueden estabilizar mediante el uso de emulsionantes.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "aglutinante" se refiere a un ingrediente (por ejemplo, un ingrediente para piensos) que aglutina el producto mediante una reacción física o química. Durante la "gelificación", por ejemplo, el agua se absorbe, proporcionando un efecto aglutinante. No obstante, los aglutinantes pueden absorber otros líquidos, tales como aceites, reteniéndolos dentro del producto. En el contexto de la presente invención, los aglutinantes se utilizarían típicamente en productos sólidos o con bajo contenido de humedad, por ejemplo, productos de panadería: pasteles, dónuts, pan y otros.
Los "portadores" o "vehículos" significan materiales adecuados para la administración de DFM y/o enzimas e incluyen cualquier material conocido en la técnica tal como, por ejemplo, cualquier líquido, gel, disolvente, diluyente líquido, solubilizante o similar que no sea tóxico y que no interaccione con ningún componente de la composición de forma perjudicial.
En una forma de realización, la composición de aditivo para piensos de la presente invención se puede mezclar con al menos un vehículo fisiológicamente aceptable seleccionado de al menos uno de maltodextrina, caliza (carbonato de calcio), ciclodextrina, trigo o un componente de trigo, sacarosa, almidón, Na2SO4, talco, PVA, sorbitol, benzoato, sorbato, glicerol, sacarosa, propilenglicol, 1,3-propanodiol, glucosa, parabenos, cloruro de sodio, citrato, acetato, fosfato, calcio, metabisulfito, formiato y mezclas de los mismos.
Los ejemplos de excipientes incluyen uno o más de: celulosa microcristalina y otras celulosas, lactosa, citrato de sodio, carbonato de calcio, fosfato de calcio dibásico, glicina, almidón, azúcar de leche y polietilenglicoles de alto peso molecular.
Los ejemplos de disgregantes incluyen uno o más de: almidón (preferentemente almidón de maíz, patata o tapioca), glicolato de almidón sódico, croscarmelosa sódica y determinados silicatos complejos. Los ejemplos de aglutinantes de granulación incluyen uno o más de: polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxipropilcelulosa (HPC), sacarosa, maltosa, gelatina y goma arábiga.
Los ejemplos de agentes lubricantes incluyen uno o más de: estearato de magnesio, ácido esteárico, behenato de glicerilo y talco.
Los ejemplos de diluyentes incluyen uno o más de: agua, etanol, propilenglicol y glicerina, y combinaciones de los mismos.
Los otros componentes se pueden utilizar simultáneamente (por ejemplo, mezclándolos entre sí o incluso administrándolos por vías diferentes) o secuencialmente (por ejemplo, se pueden administrar por vías diferentes).
Preferentemente, cuando la composición de aditivo para piensos de la presente invención se mezcla con otro(s) componente(s), los DFM siguen siendo viables.
En una forma de realización, preferentemente, la composición de aditivo para piensos según la presente invención no comprende cromo ni cromo orgánico.
En una forma de realización, preferentemente, el aditivo para piensos según la presente invención no contiene ácido sórbico.
Concentrados
Los DFM para su uso en la presente invención pueden estar en forma de concentrados. Normalmente, estos concentrados comprenden una concentración sustancialmente alta de un DFM.
Las composiciones de aditivos para piensos según la presente invención pueden tener un contenido de células viables (unidades formadoras de colonias, UFC) que se encuentra en el intervalo de al menos 104 UFC/g (adecuadamente incluyendo al menos 105 UFC/g, tal como al menos 106 UFC/g, por ejemplo al menos 107 UFC/g, al menos 108 UFC/g, tal como al menos 109 UFC/g) a aproximadamente 1010 UFC/g (o incluso aproximadamente 1011 UFC/g o aproximadamente 1012 UFC/g).
Cuando un DFM está en forma de concentrado, las composiciones de aditivos para piensos según la presente invención pueden tener un contenido de células viables en el intervalo de al menos 109 UFC/g a aproximadamente 1012 UFC/g, preferentemente de al menos 1010 UFC/g a aproximadamente 1012 UFC/g.
Los polvos, gránulos y composiciones líquidas en forma de concentrados pueden diluirse con agua o resuspenderse en agua u otros diluyentes adecuados, por ejemplo un medio de cultivo apropiado tal como leche o aceites minerales o vegetales, para dar composiciones listas para su uso.
La composición de aditivo para piensos de la presente invención o las combinaciones de la presente invención en forma de concentrados se pueden preparar según procedimientos conocidos en la técnica.
En un aspecto de la presente invención, las enzimas o el pienso se ponen en contacto con una composición en forma concentrada.
Las composiciones de la presente invención pueden secarse por pulverización o liofilizarse mediante procedimientos conocidos en la técnica.
Los procesos típicos para fabricar partículas utilizando un proceso de secado por pulverización implican un material sólido que se disuelve en un disolvente apropiado (por ejemplo, un cultivo de un DFM en un medio de fermentación). Alternativamente, el material se puede suspender o emulsionar en un no-disolvente para formar una suspensión o emulsión. Opcionalmente, en esta etapa se pueden añadir otros ingredientes (tal como se explicó anteriormente) o componentes tales como agentes antimicrobianos, agentes estabilizantes, tintes y agentes que ayuden con el proceso de secado.
Después, la solución se atomiza para formar una fina niebla de gotas. Las gotas ingresan inmediatamente a una cámara de secado en la que entran en contacto con un gas de secado. El disolvente se evapora de las gotas al gas de secado para solidificar las gotas, formando así partículas. A continuación, las partículas se separan del gas de secado y se recogen.
Sujeto
El término "sujeto", tal como se utiliza en el presente documento, significa un animal al que se le va a administrar o se le ha administrado una composición de aditivo para piensos según la presente invención o un producto alimenticio que comprende dicha composición de aditivo para piensos según la presente invención.
El término "sujeto", tal como se utiliza en el presente documento, significa un animal. Preferentemente, el sujeto es un mamífero, un ave, un pez o un crustáceo que incluye, por ejemplo, ganado o un animal doméstico (por ejemplo, una mascota). En una forma de realización, el "sujeto" es el ganado.
El término "ganado", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier animal de granja. Preferentemente, el ganado es uno o más de vacas o toros (incluidos terneros), aves de corral, cerdos (incluidos lechones), aves de corral (incluidos pollos de engorde, pollos y pavos), pájaros, peces (incluidos peces de agua dulce, tales como el salmón, el bacalao, la trucha y la carpa, por ejemplo, carpa koi, y peces marinos, tales como la lubina), crustáceos (tales como gambas, mejillones y vieiras), caballos (incluidos los caballos de carreras), ovejas (incluidos los corderos).
En una forma de realización, el término ganado y/o aves de corral y/o pollos no incluye gallinas ponedoras de huevos.
En otra forma de realización, el "sujeto" es un animal doméstico o una mascota o un animal mantenido en un entorno zoológico.
El término "animal domesticado o mascota o animal mantenido en un entorno zoológico", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier animal relevante, incluidos caninos (por ejemplo, perros), felinos (por ejemplo, gatos), roedores (por ejemplo, cobayas, ratas, ratones), aves, peces (incluidos peces de agua dulce y peces marinos), y caballos.
Producción de ácidos grasos de cadena corta (SCFA)
El término "ácido graso de cadena corta", tal como se utiliza en el presente documento, incluye ácidos grasos volátiles así como ácido láctico. En una forma de realización, los SCFA pueden seleccionarse del grupo que consiste en: ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido valérico, ácido isovalérico, ácidos 2-metilbutíricos y ácido láctico, preferentemente ácido propiónico y/o ácido butírico.
En una forma de realización, el SCFA puede ser ácido butírico y/o ácido propiónico.
Los ácidos grasos de cadena corta (en particular, los ácidos grasos volátiles, por ejemplo, ácido propiónico y ácido butírico, y ácido láctico) pueden analizarse utilizando el siguiente procedimiento:
Análisis cromatográfico de ácidos grasos volátiles y ácido láctico, por ejemplo SCFA, que se realizará a partir de muestras de simulación con ácido piválico como patrón interno, tal como se ha descrito anteriormente (Ouwehand et al., febrero de 2009; 101(3):367-75). Se determinan las concentraciones de ácidos acético, propiónico, butírico, isobutírico, valérico, isovalérico, 2-metilbutírico y ácido láctico.
Rendimiento
Tal como se utiliza en el presente documento, el "rendimiento animal" puede determinarse por la eficacia alimenticia y/o la ganancia de peso del animal y/o por la tasa de conversión alimenticia y/o por la digestibilidad de un nutriente en un pienso (por ejemplo, digestibilidad de aminoácidos) y/o energía digerible o energía metabolizable en un pienso y/o por retención de nitrógeno.
Preferentemente, el "rendimiento animal" se determina por la eficacia alimenticia y/o la ganancia de peso del animal y/o por la tasa de conversión alimenticia.
Por "rendimiento animal mejorado" se entiende que hay una mayor eficacia alimenticia y/o una mayor ganancia de peso y/o una tasa de conversión alimenticia reducida y/o una digestibilidad mejorada de nutrientes o energía en un pienso y/o una retención de nitrógeno mejorada como resultado del uso de la composición de aditivo para piensos de la presente invención en piensos en comparación con piensos que no comprenden dicha composición de aditivos para piensos.
Preferentemente, por "rendimiento animal mejorado" se entiende que hay una mayor eficacia alimenticia y/o una mayor ganancia de peso y/o una tasa de conversión alimenticia reducida.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término eficacia alimenticia se refiere a la cantidad de ganancia de peso en un animal que se produce cuando el animal es alimentado ad libitum o con una cantidad específica de comida durante un periodo de tiempo.
Por "mayor eficacia alimenticia" se entiende que el uso de una composición de aditivo para piensos según la presente invención en piensos da como resultado una mayor ganancia de peso por unidad de consumo de pienso en comparación con un animal alimentado sin que esté presente dicha composición de aditivo para piensos.
Tasa de conversión alimenticia (FCR)
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "tasa de conversión alimenticia" se refiere a la cantidad de pienso que se suministra a un animal para aumentar el peso del animal en una cantidad específica.
Una tasa de conversión alimenticia mejorada significa una tasa de conversión alimenticia más baja.
Por "tasa de conversión alimenticia más baja" o "tasa de conversión alimenticia mejorada" se entiende que el uso de una composición de aditivo para piensos en el pienso da como resultado que se requiera alimentar al animal con una menor cantidad de pienso para aumentar el peso del animal en una cantidad especificada en comparación con la cantidad de pienso requerida para aumentar el peso del animal en la misma cantidad cuando el pienso no comprende dicha composición de aditivo para piensos.
Digestibilidad de nutrientes
Digestibilidad de nutrientes, tal como se utiliza en el presente documento, significa la fracción de un nutriente que desaparece del aparato gastrointestinal o un segmento específico del aparato gastrointestinal, por ejemplo el intestino delgado La digestibilidad de nutrientes puede medirse como la diferencia entre lo que se administra al sujeto y lo que se expulsa en las heces del sujeto, o entre lo que se administra al sujeto y lo que permanece en la digesta en un segmento específico del aparato gastrointestinal, por ejemplo el íleon.
La digestibilidad de nutrientes, tal como se utiliza en el presente documento, puede medirse por la diferencia entre la ingesta de un nutriente y el nutriente excretado por medio de la recolección total de excrementos durante un periodo de tiempo; o con el uso de un marcador inerte que no absorbe el animal, y permite al investigador calcular la cantidad de nutriente que ha desaparecido en todo el aparato gastrointestinal o en un segmento del aparato gastrointestinal. Dicho marcador inerte puede ser dióxido de titanio, óxido de cromo o ceniza insoluble en ácido. La digestibilidad se puede expresar como un porcentaje del nutriente en el pienso, o como unidades de masa de nutriente digerible por unidad de masa de nutriente en el pienso.
La digestibilidad de nutrientes tal como se utiliza en el presente documento, abarca la digestibilidad de almidón, la digestibilidad de grasas, la digestibilidad de proteínas y la digestibilidad de aminoácidos.
Digestibilidad de energía, tal como se utiliza en el presente documento, significa la energía bruta del pienso consumido menos la energía bruta de las heces o la energía bruta del pienso consumido menos la energía bruta de la digesta remanente en un segmento específico del aparato gastrointestinal del animal, por ejemplo el íleon. Energía metabolizable, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la energía metabolizable aparente y significa la energía bruta del pienso consumido menos la energía bruta contenida en las heces, la orina y los productos gaseosos de la digestión. La digestibilidad de energía y la energía metabolizable pueden medirse como la diferencia entre la ingesta de energía bruta y la energía bruta excretada en las heces o la digesta presente en un segmento específico del aparato gastrointestinal utilizando los mismos procedimientos que para medir la digestibilidad de nutrientes, con correcciones apropiadas para la excreción de nitrógeno para calcular la energía metabolizable del pienso.
Retención de nitrógeno
Retención de nitrógeno, tal como se utiliza en el presente documento, significa la capacidad de un sujeto para retener nitrógeno de la dieta como masa corporal. Se produce un balance de nitrógeno negativo cuando la excreción de nitrógeno excede la ingesta diaria y, a menudo, se observa cuando se pierde músculo. Un balance de nitrógeno positivo a menudo se asocia con el crecimiento muscular, particularmente en animales en crecimiento.
La retención de nitrógeno puede medirse como la diferencia entre la ingesta de nitrógeno y el nitrógeno excretado por medio de la recolección total de excrementos y orina durante un periodo de tiempo. Se entiende que el nitrógeno excretado incluye proteína no digerida del pienso, secreciones proteicas endógenas, proteína microbiana y nitrógeno urinario.
Rendimiento en canal y rendimiento en carne
El término rendimiento en canal, tal como se utiliza en el presente documento, significa la cantidad de canal como una proporción del peso corporal vivo, después de un proceso de sacrificio comercial o experimental. El término canal significa el cuerpo de un animal que se ha sacrificado para alimento, sin la cabeza, las entrañas, parte de las extremidades y las plumas o la piel. El término rendimiento en carne, tal como se utiliza en el presente documento, significa la cantidad de carne comestible como proporción del peso corporal vivo, o la cantidad de un corte de carne específico como proporción del peso corporal vivo.
Ganancia de peso
La presente invención proporciona además un procedimiento para aumentar la ganancia de peso en un sujeto, por ejemplo aves de corral o cerdos, que comprende alimentar dicho sujeto con un pienso que comprende una composición de aditivo para piensos según la presente invención.
Una "mayor ganancia de peso" se refiere a un animal que tiene un mayor peso corporal cuando se le alimenta con un pienso que comprende una composición de aditivo para piensos en comparación con un animal que se alimenta con un pienso en el que no está presente dicha composición de aditivo para piensos.
Otras propiedades
En una forma de realización, la composición de aditivo para piensos o el procedimiento según la presente invención pueden no modular (por ejemplo, mejorar) la respuesta inmunitaria del sujeto.
En una forma de realización adicional, la composición de aditivo para piensos o el procedimiento según la presente invención pueden no mejorar la supervivencia (por ejemplo, reducir la mortalidad) del sujeto.
En una forma de realización preferida, la composición de aditivo para piensos o el procedimiento según la presente invención pueden no modular (por ejemplo, mejorar) la respuesta inmunitaria o no mejorar la supervivencia (por ejemplo, reducir la mortalidad) del sujeto.
Probiótico
Para algunas aplicaciones, se cree que los DFM presentes en la composición de la presente invención pueden ejercer un efecto de cultivo probiótico. También está dentro del alcance de la presente invención añadir a la composición de la presente invención probióticos y/o prebióticos adicionales.
En el presente documento, un prebiótico es:
"un ingrediente alimentario no digerible que afecta beneficiosamente al huésped estimulando selectivamente el crecimiento y/o la actividad de una bacteria beneficiosa o de un número limitado de las mismas".
El término "cultivo probiótico", tal como se utiliza en el presente documento, define microorganismos vivos (incluidas, por ejemplo, bacterias o levaduras) que, por ejemplo, cuando se ingieren o se aplican localmente en cantidades suficientes, afectan beneficiosamente al organismo huésped, es decir, confieren uno o más beneficios para la salud demostrables en el organismo huésped. Los probióticos pueden mejorar el equilibrio microbiano en una o más superficies mucosas. Por ejemplo, la superficie mucosa puede ser el intestino, el aparato urinario, el aparato respiratorio o la piel. Si bien no existen límites inferiores o superiores para la ingesta de probióticos, se ha sugerido que al menos 106-1012, preferentemente al menos 106-1010, preferentemente 108-109, ufc como dosis diaria serán eficaces para lograr los efectos beneficiosos para la salud en un sujeto.
Aislada
En un aspecto, preferentemente la enzima utilizada en la presente invención está en forma aislada. El término "aislada" significa que la enzima está al menos sustancialmente desprovista de al menos otro componente con el que la enzima está asociada de forma natural en la naturaleza y como se encuentra en la naturaleza. La enzima de la presente invención se puede proporcionar en una forma que esté sustancialmente desprovista de uno o más contaminantes con los que la sustancia podría estar asociada de otro modo. Así, por ejemplo, puede estar sustancialmente desprovista de uno o más polipéptidos y/o moléculas de ácido nucleico potencialmente contaminantes.
Purificada
En un aspecto, preferentemente la enzima y/o el DFM según la presente invención está en forma purificada. El término "purificada" significa que la enzima y/o el DFM está presente en un alto nivel. La enzima y/o el DFM es, de forma deseable, el componente predominante presente en una composición. Preferentemente, está presente a un nivel de al menos aproximadamente el 90%, o al menos aproximadamente el 95% o al menos aproximadamente el 98%, determinándose dicho nivel sobre una base de peso seco/peso seco con respecto a la composición total en cuestión.
Está previsto dentro del alcance de la presente invención que las formas de realización de la invención puedan combinarse de manera que las combinaciones de cualquiera de las características descritas en el presente documento estén incluidas dentro del alcance de la presente invención. En particular, se contempla dentro del alcance de la presente invención que cualquiera de los efectos terapéuticos de las bacterias pueda mostrarse de forma concomitante.
Secuencias de aminoácidos
El alcance de la presente invención también abarca secuencias de aminoácidos de enzimas presentes en composiciones de la invención.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "polipéptido" y/o el término "proteína". En algunos casos, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "péptido". En algunos casos, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "enzima".
La secuencia de aminoácidos se puede preparar/aislar de una fuente adecuada, o se puede producir sintéticamente o se puede preparar mediante el uso de técnicas de ADN recombinante.
Preferentemente, la secuencia de aminoácidos cuando se refiere a, y cuando está abarcada por, el alcance per se de la presente invención no es una enzima nativa. A este respecto, el término "enzima nativa" significa una enzima completa que se encuentra en su entorno nativo y cuando se ha expresado por su secuencia de nucleótidos nativa.
Identidad de secuencia u homología de secuencia
En el presente documento se describe el uso de secuencias que tienen un grado de identidad de secuencia u homología de secuencia con la(s) secuencia(s) de aminoácidos de un polipéptido que tiene las propiedades específicas definidas en el presente documento o de cualquier secuencia de nucleótidos que codifica dicho polipéptido (en lo sucesivo denominadas "secuencia(s) homóloga(s)". En el presente documento, el término "homólogo" significa una entidad que tiene una determinada homología con las secuencias de aminoácidos objeto y las secuencias de nucleótidos objeto. En el presente documento, el término "homología" puede equipararse con "identidad".
La secuencia de aminoácidos y/o la secuencia de nucleótidos homólogas deben proporcionar y/o codificar un polipéptido que conserva la actividad funcional y/o mejora la actividad de la enzima.
El término "secuencia de nucleótidos" incluye ADN genómico, ADNc, ADN sintético y ARN. Preferentemente significa ADN, de forma más preferida secuencia de ADNc que codifica enzimas presentes en la composición de la presente invención.
En el presente contexto, se puede considerar que una secuencia homóloga incluye una secuencia de aminoácidos o de nucleótidos que puede ser al menos el 97% idéntica, preferentemente al menos el 98 o 99% idéntica a la secuencia objeto.
Puede tomarse una secuencia homóloga de forma que incluya una secuencia de aminoácidos o de nucleótidos que puede ser al menos el 85% idéntica, preferentemente al menos el 90 o 95% idéntica a la secuencia objeto.
Típicamente, los homólogos comprenderán los mismos sitios activos, etc. que la secuencia de aminoácidos objeto, por ejemplo. Aunque la homología también se puede considerar en términos de similitud (es decir, residuos de aminoácidos que tienen propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente invención se prefiere expresar la homología en términos de identidad de secuencia.
Se puede considerar que una secuencia homóloga incluye una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos que tiene una o varias adiciones, deleciones y/o sustituciones en comparación con la secuencia objeto.
En el presente documento se describe una proteína cuya secuencia de aminoácidos se representa en el presente documento o una proteína derivada de esta proteína (parental) por sustitución, deleción o adición de uno o varios aminoácidos, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 aminoácidos o más aminoácidos, tal como 10 o más de 10 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la proteína parental y que tienen la actividad de la proteína parental.
Típicamente, los homólogos comprenderán las mismas secuencias que codifican los sitios activos, etc. que la secuencia objeto. Aunque la homología también se puede considerar en términos de similitud (es decir, residuos de aminoácidos que tienen propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente invención se prefiere expresar la homología en términos de identidad de secuencia.
Las comparaciones de homología se pueden realizar a simple vista o, más normalmente, con la ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas informáticos disponibles comercialmente pueden calcular el % de homología entre dos o más secuencias.
El % de homología se puede calcular sobre secuencias contiguas, es decir, una secuencia se alinea con la otra secuencia y cada aminoácido de una secuencia se compara directamente con el aminoácido correspondiente de la otra secuencia, un residuo cada vez. Esto se denomina alineamiento "sin huecos". Por lo general, dichos alineamientos sin huecos se realizan solo sobre un número relativamente corto de residuos.
Aunque este es un procedimiento muy simple y coherente, no tiene en cuenta que, por ejemplo, en un par de secuencias idénticas, una inserción o deleción provocará el desalineamiento de los residuos de aminoácidos siguientes, lo que podría dar como resultado una gran reducción en el % de homología cuando se realiza un alineamiento global. En consecuencia, la mayor parte de los procedimientos de comparación de secuencias están diseñados para producir alineamientos óptimos que tengan en cuenta las posibles inserciones y deleciones sin penalizar indebidamente la puntuación de homología general. Esto se logra insertando "huecos" en el alineamiento de secuencias para intentar maximizar la homología local.
Sin embargo, estos procedimientos más complejos asignan "penalizaciones por hueco" a cada hueco que se produce en el alineamiento, de modo que, para el mismo número de aminoácidos idénticos, un alineamiento de secuencias con la menor cantidad de huecos posible, lo que refleja una mayor relación entre las dos secuencias comparadas, logrará una puntuación más alta que uno con muchos huecos. Normalmente se utilizan "costes de hueco afines" que cobran un coste relativamente alto por la existencia de un hueco y una penalización menor por cada residuo subsiguiente en el hueco. Este es el sistema de puntuación de huecos más utilizado. Por supuesto, las penalizaciones por huecos elevadas producirán alineamientos optimizados con menos huecos. La mayor parte de los programas de alineamiento permiten que se modifiquen las penalizaciones por hueco. Sin embargo, se prefiere usar los valores predeterminados cuando se utiliza dicho programa informático para comparaciones de secuencias. Por lo tanto, el cálculo del % máximo de homología requiere en primer lugar la producción de un alineamiento óptimo, teniendo en cuenta las penalizaciones por hueco. Un programa informático adecuado para llevar a cabo dicho alineamiento es el Vector NTI (Invitrogen Corp.). Los ejemplos de programas informáticos que pueden realizar comparaciones de secuencias incluyen, pero sin limitación, el paquete BLAST (véase Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4a edición - capítulo 18), BLAST 2 (véanse FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 y [email protected]), FASTA (Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410) y AlignX, por ejemplo. Al menos BLAST, BLAST 2 y FASTA están disponibles para búsquedas en línea y fuera de línea (véase Ausubel et al 1999, páginas 7-58 a 7-60).
Aunque el % de homología final se puede medir en términos de identidad, el proceso de alineamiento en sí mismo no suele basarse en una comparación de pares de todo o nada. En cambio, generalmente se usa una matriz de puntuación de similitud a escala que asigna puntuaciones a cada comparación por pares en función de la similitud química o la distancia evolutiva. Un ejemplo de una matriz de este tipo comúnmente utilizada es la matriz BLOSUM62, la matriz predeterminada para el conjunto de programas BLAST. Los programas de Vector NTI generalmente usan los valores predeterminados públicos o una tabla de comparación de símbolos personalizada, si se proporciona (véase el manual del usuario para obtener más detalles). Para algunas aplicaciones, se prefiere utilizar los valores predeterminados para el paquete Vector NTI.
Alternativamente, las homologías porcentuales se pueden calcular utilizando la función de alineamiento múltiple de Vector NTI (Invitrogen Corp.), basada en un algoritmo, análogo a CLUSTAL (Higgins DG y Sharp PM (1988), Gene 73 (1), 237-244).
Una vez que el programa informático ha producido un alineamiento óptimo, es posible calcular el % de homología, preferentemente el % de identidad de secuencia. El programa informático normalmente realiza esto como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico.
En caso de que se utilicen penalizaciones por hueco al determinar la identidad de la secuencia, entonces preferentemente se utilizan los siguientes parámetros para el alineamiento por pares:
Figure imgf000049_0002
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CLUSTAL se puede usar con la penalización de hueco y la extensión de hueco definidas anteriormente.
Adecuadamente, el grado de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos se determina sobre al menos 20 residuos de aminoácidos contiguos, preferentemente sobre al menos 30 residuos contiguos, preferentemente sobre al menos 40 residuos contiguos, preferentemente sobre al menos 50 residuos contiguos, preferentemente sobre al menos 60 residuos contiguos, preferentemente sobre al menos 100 residuos contiguos.
Adecuadamente, el grado de identidad con respecto a la secuencia de aminoácidos puede determinarse sobre la secuencia completa que se enseña en el presente documento.
Las secuencias también pueden tener deleciones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoácidos que producen un cambio silencioso y dan como resultado una sustancia funcionalmente equivalente. Se pueden realizar sustituciones deliberadas de aminoácidos sobre una base de similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos siempre que se conserve la actividad de unión secundaria de la sustancia. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polares no cargados que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina.
Se pueden realizar sustituciones conservadoras, por ejemplo, según la tabla siguiente. Los aminoácidos presentes en el mismo bloque en la segunda columna y preferentemente en la misma línea en la tercera columna pueden sustituirse entre sí:
Figure imgf000050_0001
En el presente documento se describe la sustitución homologa (sustitución y reemplazo se utilizan ambos en el presente documento para indicar el intercambio de un residuo de aminoácido existente por un residuo alternativo) que puede producirse, es decir, una sustitución entre similares tal como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc. También puede producirse una sustitución no homóloga, es decir, de una clase de residuo a otra o, alternativamente, que implique la inclusión de aminoácidos no naturales tales como ornitina (en lo sucesivo, Z), ácido diaminobutírico ornitina (en lo sucesivo, B), norleucina ornitina (en lo sucesivo denominada O), piriilalanina, tienilalanina, naftilalanina y fenilglicina.
También se pueden realizar reemplazos por aminoácidos no naturales que incluyen; aminoácidos alfa* y alfadisustituidos*, N-alquilaminoácidos*, ácido láctico*, derivados de haluro de aminoácidos naturales tales como trifluorotirosina*, p-Cl-fenilalanina*, p-Br-fenilalanina*, p-l-fenilalanina* , L-alil-glicina*, B-alanina*, ácido L-a-amino butírico*, ácido L-Y-amino butírico*, ácido L-a-amino isobutírico*, ácido L-s-amino caproico#, ácido 7-amino heptanoico*, L-metionina sulfona#*, L-norleucina*, L-norvalina*, p-nitro-L-fenilalanina*, L-hidroxiprolina#, L-tioprolina*, derivados metílicos de fenilalanina (Phe) tales como 4-metil-Phe*, pentametil-Phe*, L-Phe (4-amino)#, L-Tyr (metilo)*, L-Phe (4-isopropilo)*, L-Tic (ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico)*, ácido L-diaminopropiónico# y L-Phe (4-bencilo)*. La notación * se ha utilizado a los efectos de la descripción anterior (con respecto a la sustitución homóloga o no homóloga), para indicar la naturaleza hidrófoba del derivado, mientras que # se ha utilizado para indicar la naturaleza hidrófila del derivado, #* indica características anfipáticas.
Las secuencias de aminoácidos variantes pueden incluir grupos espaciadores adecuados que pueden insertarse entre dos residuos de aminoácidos cualesquiera de la secuencia, incluidos grupos alquilo tales como grupos metilo, etilo o propilo además de espaciadores de aminoácidos tales como residuos de glicina o p-alanina. Una forma adicional de variación que implica la presencia de uno o más residuos de aminoácidos en forma de peptoide será bien entendida por los expertos en la técnica. Para evitar dudas, "la forma de peptoide" se usa para referirse a residuos de aminoácidos variantes en los que el grupo sustituyente del carbono a se encuentra en el átomo de nitrógeno del residuo en lugar de en el carbono a. Los procesos para preparar péptidos en forma de peptoide son conocidos en la técnica, por ejemplo Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 y Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134.
En una forma de realización, la xilanasa para su uso en la presente invención puede comprender una secuencia polipeptídica en el presente documento con una sustitución conservadora de al menos uno de los aminoácidos.
Adecuadamente, puede haber al menos 2 sustituciones conservadoras, tal como al menos 3 o al menos 4 o al menos 5.
Adecuadamente, puede haber menos de 15 sustituciones conservativas, tal como menos de 12, menos de 10 o menos de 8 o menos de 5.
Ejemplos
Ejemplo 1: Respuestas de pollos de engorde alimentados con dietas a base de trigo que contienen xilanasa, pglucanasa y microbios de alimentación directa
Material y procedimientos
El uso de animales y el protocolo experimental se aprobaron por el Institutional Animal Experiment Committee. Se formuló una dieta de forma que estuviera equilibrada en energía y nutrientes para pollos de engorde jóvenes (0-21 días de vida) (tabla 1, Dieta I). El componente de cereal de la dieta era trigo, cebada, centeno, harinillas de trigo, salvado de trigo o combinaciones de los mismos, mientras que el componente proteico era harina de soja y la fuente de grasa era aceite de colza. No se incluyeron antimicrobianos sintéticos ni fármacos anticoccidiales, y la dieta se suministró en forma de puré. La dieta basal se dividió en porciones y se añadieron las respectivas enzimas y DFM para constituir las dietas experimentales identificadas en la tabla 2.
Cada suplemento se proporcionó en una premezcla y se añadió a la mezcladora durante la preparación de la dieta. Las dietas que contenían el DFM se mezclaron en primer lugar y la mezcladora se enjuagó entre cada dieta para evitar la contaminación cruzada. Se recogieron muestras de cada dieta de tratamiento al comienzo, a la mitad y al final de cada lote y se mezclaron entre sí para confirmar las actividades enzimáticas y la presencia de DFM en el pienso antes de comenzar el ensayo con animales. Se retuvieron y almacenaron muestras adicionales de cada dieta de tratamiento hasta que se necesitaron a -20 °C ± 2 °C para análisis.
Se obtuvieron pollos de engorde machos (Ross 308) de un día de edad de un criadero comercial. Los pollos se pesaron individualmente y se distribuyeron en 32 jaulas de cría (8 pollos por jaula) de modo que el peso medio de las aves por jaula fuera similar. Después, los 4 tratamientos dietéticos (tabla 2) se asignaron al azar a 8 jaulas cada uno. El día 12, las aves se transfirieron a jaulas de engorde. La asignación de espacio por ave en las jaulas de cría y de engorde fue de 530 y 640 cm2, respectivamente. Las jaulas de cría y de engorde se alojaron en habitaciones de ambiente controlado. La temperatura se mantuvo a 31 °C la primera semana y después se redujo gradualmente hasta 22 °C al final de la tercera semana. Las aves recibieron 20 horas de iluminación fluorescente y se les permitió el libre acceso a las dietas y al agua. Las dietas se ofrecieron desde el día 0 hasta el día 21. Los pesos corporales se registraron a intervalos semanales a lo largo del periodo experimental de 21 días. La mortalidad se registró diariamente. Los datos se analizaron utilizando el procedimiento de modelos lineales generales (GLM) de SAS.
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Tabla 2: identificación de los tratamientos
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Resultados
Tabla 3: Efectos de la xilanasa, la p-glucanasa y microbios de alimentación directa basados en Bacillus sobre el rendimiento de crecimiento de un pollo de engorde joven.
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Los pollos alimentados con una combinación de xilanasa, una enzima degradadora de fibra (p-glucanasa) y un DFM basado en Bacillus crecieron más rápido que el control y numéricamente mejor que los pollos alimentados con dietas únicamente de enzimas. El peso corporal a los 21 días y la ganancia de peso corporal fueron numéricamente mejores en los pollos alimentados con combinaciones de tres vías de xilanasa, p-glucanasa y DFM con respecto al control.
II. Nutrientes y retención/digestibilidad de energía
Material y procedimientos
El uso de animales y el protocolo experimental se aprobaron por el Institutional Animal Experiment Committee. Se formuló una dieta a base de trigo y cebada de forma que estuviera equilibrada en energía y nutrientes para pollos de engorde jóvenes (0-21 días de vida) (tabla 1, Dieta II). Se incluyó dióxido de titanio al 0,30% para permitir la determinación de la retención de componente dietético. No se incluyeron antimicrobianos sintéticos ni fármacos anticoccidiales, y la dieta se suministró en forma de puré. La dieta basal se dividió en porciones y se añadieron las respectivas enzimas y DFM para constituir las dietas experimentales identificadas en la tabla 4. Cada suplemento se mezcló previamente y la mezcladora se enjuagó para evitar la contaminación cruzada de las dietas tratadas. Se recogieron muestras de cada dieta de tratamiento al comienzo, a la mitad y al final de cada lote y se mezclaron entre sí para confirmar las actividades enzimáticas y la presencia de DFM en el pienso antes de comenzar el ensayo con animales. Se retienen muestras adicionales de cada dieta de tratamiento y se almacenan hasta que se requieran a -20 °C±2 °C para análisis.
Tabla 4: identificación de los tratamientos
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El estudio involucró un ensayo en jaula, que se llevó a cabo para obtener muestras de excrementos para mediciones de la digestibilidad de energía y nutrientes. Se obtuvieron pollos de engorde machos de un día (Ross 308) de un criadero comercial. Los pollos se pesaron individualmente a su llegada y se estratificaron por peso corporal y se alojaron en 30 jaulas (cinco pollos por jaula) de modo que el peso medio de las aves por jaula fuera similar. Después se asignaron al azar los cuatro tratamientos dietéticos a seis jaulas replicadas. El ensayo se llevó a cabo del día 0 al 21, periodo durante el cual las aves tuvieron libre acceso a los tratamientos dietéticos asignados y al agua. Las temperaturas de la criadora y la temperatura ambiente se fijaron en 32 y 29 °C, respectivamente, durante la primera semana. A partir de entonces, se desconectó el suministro de calor en la criadora y la temperatura ambiente se mantuvo a 29 °C durante todo el experimento. Se proporcionó luz durante 24 h durante todo el experimento. Los días 17, 18, 19 y 20 se recogieron muestras de excrementos y se almacenaron congeladas a -20 °C para la determinación la retención/digestibilidad de energía y nutrientes. Se tuvo cuidado durante la recolección de muestras de excrementos para evitar la contaminación con plumas y otros materiales extraños. Las muestras de excrementos se agruparon dentro de una jaula, se mezclaron bien con una mezcladora y se tomaron dos muestras representativas por jaula. Las muestras se liofilizaron. Las muestras secas se molieron hasta que pasaran por un tamiz de 0,5 mm y se almacenaron en recipientes de plástico herméticos a -4 °C hasta los análisis químicos. Se analizaron muestras de dietas y excrementos para determinar la materia seca, la proteína bruta (como nitrógeno), la energía bruta, la grasa (como extractos de hexano) y la fibra detergente neutra según los procedimientos de análisis oficiales de la AOAC). El titanio (marcador de digestibilidad) se analizó según los procedimientos descritos por Lomer et al. (2000, Analyst 125:2339-2343). La retención/digestibilidad se calculó utilizando los procedimientos estándar (Adeola, O. 2001. Digestion and balance techniques in pigs. Páginas 903-916 en Swine Nutrition, 2a ed. A. J. Lewis y L. L. Southern, ed. CRC Press, Washington, D.C.). Los datos se analizaron utilizando el procedimiento de modelos lineales generales de SAS (2004).
Resultados
Tabla 5: Efectos de la xilanasa, una enzima degradadora de fibra y microbios de alimentación directa basados en Bacillus sobre la retención/digestibilidad de nutrientes y la metabolizabilidad de la energía en un pollo de engorde joven.
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Una combinación de xilanasa, p-glucanasa y un microbio de alimentación directa basado en Bacillus mejoró la utilización de la energía dietética en pollos de engorde jóvenes en comparación con el control o la xilanasa sola o una combinación de xilanasa y p-glucanasa (tabla 5). Esto podría estar relacionado con un aumento en la retención de nutrientes productores de energía, tales como fibra, grasa y nitrógeno (tabla 5). La retención de grasa mejorada debido a las combinaciones de tres vías es notable y podría estar relacionada con una mejor digestión y absorción de grasa en la dieta y también con la producción y absorción de ácidos grasos de cadena corta de la fermentación. Los beneficios observados de la combinación de tres vías de xilanasa, p-glucanasa, DFM de Bacillus/propiónico, mejor en la utilización de energía y nutrientes, también podrían relacionarse especulativamente con una mejora de la salud y la función intestinal a través de la modulación positiva de la microbiota y la función digestiva/de absorción intestinal.
III Producción de ácido láctico en el ciego
Materiales y procedimientos
Simulación in vitro de ciego de pollo
Se desarrolló un modelo de ciego de pollo a partir de un sistema de colon humano in vitro descrito anteriormente (Makivuokko et al. 2006; Nutrition and Cancer 52:94-104, Makelainen et al. 2009; International Dairy Journal 19: 675­ 683). Este modelo de ciego in vitro se compone de cuatro recipientes conectados inoculados con microbios cecales frescos. Se formuló una dieta basal basada en trigo y salvado de trigo de forma que estuviera equilibrada en energía y nutrientes para pollos de engorde jóvenes (tabla 1, Dieta III). No se incluyeron antimicrobianos sintéticos ni fármacos anticoccidiales en la dieta basal. La dieta basal se dividió en porciones y se añadieron las respectivas enzimas y DFM para constituir las dietas experimentales identificadas en la tabla 6. Los diferentes piensos se sometieron a una digestión simulada del aparato gastrointestinal superior antes de alimentarlos al sistema de ciego in vitro durante una simulación de 5 horas. Los recipientes modelan los compartimentos de ciego del pollo, cada uno con el mismo pH (6,25). El análisis cromatográfico de ácido láctico de las muestras de simulación cecal se realizó con ácido piválico como patrón interno de manera similar a la descrita anteriormente (Ouwehand et al. 2009; The British Journal of Nutrition 101: 367-375).
Tabla 6: Identificación de los tratamientos
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Resultados
Tabla 7: Efectos de la xilanasa, una mezcla de enzimas degradadoras de fibra y un microbio de alimentación directa sobre la producción de ácido láctico en el ciego de pollo
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La combinación de xilanasa una mezcla de otras enzimas degradadoras de fibra microbios de alimentación directa a base de Bacillus aumentó la producción de ácido láctico cecal en comparación con una sola enzima o combinaciones de enzimas solas. El ácido láctico es producido por las bacterias acidolácticas, en las que predominan los lactobacilos y los estreptococos; se sabe que estas bacterias tienen propiedades que promueven la salud en el intestino (Walter, 2008; Applied and Environmental Microbiology 74: 4985-4996). El ácido láctico tiene efectos antibacterianos sobre patógenos tales como E. co liy especies de Salmonella (Nout et al. 1989; International Journal of Food Microbiology 8, 351-361), y los lactobacilos pueden inhibir la adhesión de E. coli a los intestinos (Hillman et al. 1994; Journal of Applied Microbiology 76: 294-300). Las altas concentraciones de ácido láctico debido a una combinación de tres vías de xilanasa, enzimas degradadoras de fibra y microbios de alimentación directa deberán reflejar, por lo tanto, un aumento de la población y la actividad de estos microbios relacionados con la salud intestinal.
IV. Población microbiana cecal
Materiales y procedimientos
Se asignan pollos de engorde a corrales según el peso corporal inicial y se les asigna dietas experimentales aleatoriamente utilizando un diseño experimental reconocido. Las aves tienen libre acceso a las dietas experimentales durante un periodo comprendido entre el día 0 y el 21.
Se recogen muestras de excrementos diariamente desde el día d18 al d20 y se almacenan a -20 °C. El día 21 las aves se sacrifican por dislocación cervical, y se obtiene el contenido de los ciegos y se almacena congelado a -20 °C para la determinación de AGV cecales.
Extracción de ADN: se suspendieron 0,2 g de digesta cecal en PBS, y después se realizó un aislado adicional mediante una etapa de golpeo con perlas y después automáticamente con MagMax utilizando un kit comercial, kit de aislamiento de ácido nucleico total MagMAX™ (Applied biosystems). La cantidad de ADN aislado se determinó utilizando un espectrofotómetro UV/Vis de espectro completo Nanodrop ND-1000 (Wilmington, DE, Estados Unidos). Se utilizó citometría de flujo tal como se ha descrito anteriormente (Apajalahti et al. 2002, Appl Environ Microbiol 68(10): 4986­ 4995) para la enumeración de bacterias totales o específicas de las muestras.
Procedimientos PCR: El ADN aislado se analiza mediante qPCR (reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa) utilizando un biosistema aplicado. Se utilizan cebadores específicos para detectar específicamente géneros microbianos interesantes, tal como se describe en 3.
Tabla 8: Referencias donde se pueden encontrar cebadores específicos de género para la cuantificación por qPCR de la población microbiana de la digesta
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La combinación de xilanasa (mananasa o p-glucanasa) DFM induce un cambio en la población microbiana cecal a favor de Lactobacillus y/u otros grupos específicos conocidos como bacterias fibrolíticas: Ruminococcus, Bacteroides, Roseburia.
Ejemplo 2: Efecto de 2 xilanasas y otras enzimas degradadoras de fibra (mezcla FDE) y DFM (microbio de alimentación directa basado en Bacillus; microbios de alimentación directa basados en Lactobacillus cuando se alimentan individualmente o en combinación sobre el rendimiento de crecimiento y ácidos grasos volátiles cecales en pollos de engorde jóvenes alimentados con dietas a base de maíz
Experimento 1
Material y procedimientos
El uso de animales y el protocolo experimental se aprobaron por el institutional Animal Experiment Committee. La dieta basal, tal como se suministra, está formulada de forma que esté equilibrada en energía y proteína, y de forma que cumpla con los requerimientos de las aves en crecimiento de esta edad y genotipo (tabla 9). El componente de cereal de la dieta es el maíz, y el componente de proteína puede ser harina de soja con o sin otros ingredientes proteicos tales como canola, harina de colza, etc. Se pueden incluir coproductos de maíz tales como DDGS o harina de germen de maíz o pienso de gluten de maíz, ya sea individualmente o en combinación, siempre que la dieta esté formulada de forma que cumpla con los requerimientos de nutrientes de las aves que se están alimentando. No se incluyen antimicrobianos sintéticos ni fármacos anticoccidiales, y la dieta se suministra en forma de puré. Se incluye un marcador de digestibilidad común (dióxido de titanio, óxido de cromo o celite) a 3 g/kg para permitir la determinación de la digestibilidad de los componentes de la dieta. La dieta basal se divide en porciones y se añaden las respectivas enzimas y DFM para constituir las dietas experimentales identificadas en la tabla 10. Cada suplemento se mezcla previamente y la mezcladora se enjuaga para evitar la contaminación cruzada de las dietas tratadas. Se recogieron muestras de cada dieta de tratamiento al comienzo, a la mitad y al final de cada lote y se mezclan para confirmar las actividades enzimáticas y la presencia de DFM en el pienso antes de comenzar el ensayo con animales. Se retienen muestras adicionales de cada dieta de tratamiento y se almacenan hasta que se requieran a -20 °C±2 °C para análisis.
Tabla 9: Composición de la dieta basal de maíz (%, tal como se suministra) para pollos de engorde d 0-21
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Tabla 10: identificación de dietas experimentales
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Se asignan pollos de engorde a corrales según el peso corporal inicial y se les asigna dietas experimentales aleatoriamente utilizando un diseño experimental reconocido. A las aves se les permite el libre acceso a las dietas experimentales durante un periodo entre el día 0 y el 21. Se registran el peso corporal (BW), el consumo de pienso (FI) y las mortalidades para calcular la ganancia de peso corporal (BWG), la tasa de conversión alimenticia (FCR) y la eficacia de conversión alimenticia (FCE).
Se recogen muestras de excrementos diariamente desde el día d18 al d20 y se almacenan a -20 °C para determinar la retención de nutrientes y fibra, y los contenidos de AME y AMEn. El día 21, las aves se sacrifican por dislocación cervical y se obtiene el contenido del íleon (desde el divertículo de Meckel hasta aproximadamente 1 cm por encima de la unión ileocecal) y el ciego y se almacena congelado a -20 °C para determinar la digestibilidad ileal de los componentes y AGV cecal.
Las muestras diarias de excrementos se agrupan para cada jaula y se secan al horno a 60 °C, mientras que las muestras de digesta ileal se agrupan en una base de jaula/corral y se liofilizan. Las muestras de las dietas, los excrementos y la digesta ileal se muelen finamente y se mezclan a fondo para su análisis. Todas las muestras se analizan para determinar materia seca, nitrógeno, grasa y energía bruta según procedimientos de A.O.A.C. (2005). Los polisacáridos no amiláceos solubles e insolubles se analizan en dietas y excrementos según Englyst et al. (1988) mientras que la fibra detergente neutra, el nitrógeno insoluble detergente neutro se analizan según los procedimientos de Tilley y Terry (1962). El marcador de digestibilidad se analiza según el procedimiento estándar del marcador seleccionado.
El análisis cromatográfico de ácidos grasos volátiles y ácido láctico, por ejemplo los SCFA, se realizará a partir de muestras de simulación con ácido piválico como patrón interno de forma similar a la descrita anteriormente (Ouwehand et al., febrero de 2009;101(3):367-75). Se determinan las concentraciones de ácidos acético, propiónico, butírico, isobutírico, valérico, isovalérico, 2-metilbutírico y ácido láctico.
El coeficiente de digestibilidad aparente ileal y el coeficiente de retención aparente de los componentes se calculan según Adeola et al., 2010 (Poult Sci., septiembre de 2010; 89(9):1947-54).
La jaula (corral) es la unidad experimental. El ANOVA se realiza utilizando los modelos lineales generales de SAS (SAS inst. Inc., Cary, NC). Cuando las relaciones F indican significancia, las medias de tratamientos se separan.
Resultados
Los grupos tratados alimentados con la combinación completa: xilanasa más una(s) enzima(s) secundaria(s) degradadora(s) de fibra y un DFM (Bacillus o LB), tienen una BWG más alta (g/ave/día) y/o una FCR más baja (g de ganancia de BW/g de consumo de pienso) y/o mejor digestibilidad/retención de nutrientes, energía y fibra que el control o estos aditivos suministrados solos o en combinación de dos vías.
La combinación de xilanasas (xilanasa 1 y/o 2) mezcla FDE DFM aumenta significativamente los AGV totales ileales y/o cecales y la concentración de ácido butírico o ácido propiónico en la digesta ileal y/o cecal de pollos de engorde.
II. Rendimiento de crecimiento
Experimento I
Materiales y procedimientos
El uso de animales y el protocolo experimental se aprobaron por el Institutional Animal Experiment Committee. Se formuló una dieta a base de maíz/soja de forma que estuviera equilibrada en energía y nutrientes para pollos de engorde jóvenes (0-21 días de vida) (tabla 9, Dieta I). No se incluyeron antimicrobianos sintéticos ni fármacos anticoccidiales, y la dieta se suministró en forma de puré. La dieta basal se dividió en porciones y se añadieron las respectivas enzimas y DFM para constituir las dietas experimentales identificadas en la tabla 11.
Tabla 11: Identificación de los tratamientos utilizados en el experimento I
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Todos los suplementos se proporcionaron en una premezcla que se añadió a la mezcladora durante la preparación de la dieta. Las dietas que contenían DFM se mezclaron en primer lugar y la mezcladora se enjuagó entre cada dieta para evitar la contaminación cruzada. Se recogieron muestras de cada dieta de tratamiento al comienzo, a la mitad y al final de cada lote y se mezclaron entre sí para confirmar las actividades enzimáticas y la presencia de DFM en el pienso antes de comenzar el ensayo con animales. Se retuvieron muestras adicionales de cada dieta de tratamiento y se almacenaron hasta que se necesitaron a -20 °C ± 2 °C para análisis. Se obtuvieron pollos de engorde machos (Hubbard-Cobb) de un día de edad de un criadero comercial. El día 0, los pollos se pesaron individualmente y se distribuyeron en 72 jaulas (8 pollos por jaula) de modo que el peso medio de las aves por jaula fuera similar. Los 9 tratamientos dietéticos (tabla 11) se asignaron al azar a 8 jaulas cada uno. Las jaulas se alojaron en habitaciones de ambiente controlado. La temperatura se mantuvo a 31 °C en la primera semana y después se redujo gradualmente hasta 22 °C al final de la tercera semana. Las aves recibieron 20 horas de iluminación fluorescente y se les permitió el libre acceso a las dietas y al agua durante la duración del estudio. Se registraron los pesos corporales y el consumo de pienso al principio y al final del periodo experimental de 21 días. La mortalidad se registró diariamente. Las tasas de conversión alimenticia se calcularon dividiendo el consumo total de pienso por la ganancia de peso de las aves vivas más las muertas. Los datos se analizaron usando los modelos lineales generales de SAS (SAS Inst. Inc., Cary, NC). Cuando las relaciones F indican significancia, las medias de tratamientos se separan.
Resultados, experimento I
Tabla 12: Efectos de la xilanasa, la p-glucanasa y microbios de alimentación directa basados en Bacillus sobre el crecimiento de un pollo de engorde joven.
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Los grupos tratados alimentados con la combinación completa: combinación de xilanasa p-glucanasa DFM de Bacillus tuvieron una BWG más alta (g/ave/día) y una FCR más baja (ganancia de peso en g/g de consumo de pienso) que el control o que cuando estos aditivos se administraron solos o en combinación de dos vías (tabla 12). Este fue el caso cuando se administraron tanto Xilanasa 1 como Xilanasa 2.
Experimento II
Materiales y procedimientos
El uso de animales y el protocolo experimental se aprobaron por el Institutional Animal Experiment Committee. Se formuló una dieta a base de maíz/soja de forma que estuviera equilibrada en energía y nutrientes para pollos de engorde jóvenes (0-21 días de vida) (tabla 9, Dieta I). No se incluyeron antimicrobianos sintéticos ni fármacos anticoccidiales, y la dieta se suministró en forma de puré. La dieta basal se dividió en porciones y se añadieron las respectivas enzimas y DFM para constituir las dietas experimentales identificadas en la tabla 13.
Tabla 13: Identificación de tratamientos para el Experimento II
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Todos los suplementos se proporcionaron en una premezcla que se añadió a la mezcladora durante la preparación de la dieta. Las dietas que contenían DFM se mezclaron en primer lugar y la mezcladora se enjuagó entre cada dieta para evitar la contaminación cruzada. Se recogieron muestras de cada dieta de tratamiento al comienzo, a la mitad y al final de cada lote y se mezclaron entre sí para confirmar las actividades enzimáticas y la presencia de DFM en el pienso antes de comenzar el ensayo con animales. Se retuvieron muestras adicionales de cada dieta de tratamiento y se almacenaron hasta que se necesitaron a -20 °C ± 2 °C para análisis. Se obtuvieron pollos de engorde machos (Hubbard-Cobb) de un día de edad de un criadero comercial. El día 0, los pollos se pesaron individualmente y se distribuyeron en 72 jaulas (8 pollos por jaula) de modo que el peso medio de las aves por jaula fuera similar. Los 9 tratamientos dietéticos (tabla 13) se asignaron al azar a 8 jaulas cada uno. Las jaulas se alojaron en habitaciones de ambiente controlado. La temperatura se mantuvo a 31 °C en la primera semana y después se redujo gradualmente hasta 22 °C al final de la tercera semana. Las aves recibieron 20 horas de iluminación fluorescente y se les permitió el libre acceso a las dietas y al agua durante la duración del estudio. Los pesos corporales se registraron al principio y al final del periodo experimental de 21 días. La mortalidad se registró diariamente. Los datos se analizaron utilizando el procedimiento GLM de SAS.
Resultados, Experimento II
Tabla 14: Efectos de la xilanasa, la p-glucanasa y un microbio de alimentación directa basado en Enterococcus sobre el crecimiento de un pollo de engorde joven
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Hubo una mejora numérica en la ganancia de peso corporal de los pollos de engorde cuando la combinación de xilanasa p-glucanasa DFM de Enterococcus se suplementó a xilanasa p-glucanasa o xilanasa DFM de Enterococcus (tabla 14).
III Producción de ácidos grasos volátiles en el ciego
Materiales y procedimientos
Se formuló una dieta basal a base de harina de maíz, harina de soja y harina de colza de forma que estuviera equilibrada en energía y nutrientes para pollos de engorde jóvenes (tabla 9, Dieta II). No se incluyeron antimicrobianos sintéticos ni fármacos anticoccidiales en la dieta basal. La dieta basal se dividió en porciones y se añadieron las respectivas enzimas y DFM para constituir las dietas experimentales identificadas en la tabla 15. Los procedimientos posteriores se siguieron de forma similar a los descritos para el ejemplo 1, parte III. El análisis cromatográfico de ácidos grasos volátiles de muestras de simulación (véase el ejemplo 1, parte III) se realizó con ácido piválico como patrón interno de forma similar a la descrita anteriormente (Ouwehand et al. 2009; The British Journal of Nutrition 101: 367-375 cuya enseñanza se incorpora al presente documento por referencia). Se determinaron las concentraciones de los ácidos acético, propiónico, butírico, isobutírico, valérico, isovalérico y 2-metilbutírico.
Tabla 15: identificación de tratamientos
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Resultados
Tabla 16: Efectos de la xilanasa, la p-glucanasa y un microbio de alimentación directa sobre la producción de ácido acético y ácido butírico y ácidos grasos volátiles (AGV) total en el ciego de pollos
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La combinación de xilanasa p-glucanasa microbios de alimentación directa aumentó la producción de ácido acético, ácido butírico y ácidos grasos volátiles (AGV) cecales en comparación con DFM, enzimas o combinaciones de enzimas solos (tabla 16). Los ácidos grasos volátiles pueden proporcionar una cantidad significativa de energía al pollo. También se sabe que el ácido butírico mejora la salud gastrointestinal y reduce la incidencia de cáncer de colon en seres humanos (Brons et al., 2002, Trends Food Science and Technology 13:251-261).
Ejemplo 3: Efecto de la xilanasa y otras enzimas fibrolíticas (p-glucanasa o mezcla de enzimas degradadoras de fibra (mezcla FDE)) y DFM ("microbio de alimentación directa basado en Bacillus) cuando se alimentan individualmente o en combinación sobre el rendimiento de crecimiento y la digestibilidad de nutrientes en cerdos (25 a 60 kg) alimentados con dietas mixtas basadas en granos
Material y procedimientos
El uso de animales y el protocolo experimental se aprobaron por el Animal Experiment Committee. La dieta basal, tal como se suministra, se formula de forma que esté equilibrada en energía y proteína, y de forma que cumpla con los requerimientos para cerdos en crecimiento de esta edad y genotipo (tabla 17). La composición de los principales ingredientes (tipo y niveles de inclusión) en la dieta basal puede variar, tal como se muestra en la tabla 17, siempre que la dieta esté formulada de forma que cumpla con los requerimientos de nutrientes de los cerdos alimentados. Se incluye un marcador de digestibilidad común (dióxido de titanio, óxido de cromo o celite) a 3 g/kg para permitir la determinación de la digestibilidad de los componentes de la dieta. No se incluyen antimicrobianos sintéticos ni fármacos anticoccidiales, y la dieta se suministra en forma de puré. La dieta basal se divide en porciones que después se tratan con las enzimas y los DFM identificados en la tabla 18. Durante el mezclado del pienso, la mezcladora se enjuaga para evitar la contaminación cruzada de la dieta. Se recogen muestras de cada dieta de tratamiento al comienzo, a la mitad y al final de cada lote y se mezclan para confirmar las actividades enzimáticas y la presencia de DFM en el pienso. Se retienen muestras de cada dieta de tratamiento durante el mezclado y se almacenan a -20 °C hasta que se necesiten.
Tabla 17: Ejemplos de composición de la dieta basal para cerdos de 20 a 60 kg de peso corporal (%, tal como se suministra)
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Tabla 18: Identificación de dietas experimentales
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El experimento se planifica y se realiza de forma que corresponda a la fase de crecimiento (< 25 a ~60 kg de peso corporal). Las dietas experimentales se alimentan durante 42 días de 6 semanas. Un grupo de cerdos hembras y machos cercanos al cuerpo inicial objetivo se obtienen de la misma manada (genética). A su llegada, los cerdos se pesan y se asignan a los tratamientos dietéticos utilizando un diseño experimental reconocido de modo que cada tratamiento tenga un mínimo de 8 corrales replicados. El peso corporal y el consumo de pienso se controlan semanalmente para calcular la eficacia de conversión alimenticia de la eficacia de ganancia corregida para las mortalidades. Se recogen muestras fecales frescas en las semanas 3 y 6 para permitir el cálculo de la digestibilidad de los componentes de la dieta.
Se equipan cerdos castrados en crecimiento (peso corporal inicial de 30 kg) con una cánula en T en el íleon distal para el propósito del experimento. Los cerdos se alojan en corrales individuales (1,2 x 1,5 m) en una habitación de ambiente controlado. Cada corral estaba equipado con un comedero y un bebedero de boquilla y tenía pisos de hormigón completamente en forma de listones. El experimento está diseñado y se realiza para dar un mínimo de 6 réplicas por tratamiento. Todos los cerdos se alimentan a un nivel de 3 veces su requerimiento de energía de mantenimiento (106 kcal EM por kg075; NRC, 1998), y el alimento se les proporciona en dos porciones iguales a las 08:00 y 17:00 h. Los animales tienen libre acceso al agua a través de un bebedero tipo cuenco. Se registran los pesos de los cerdos al principio y al final de cada periodo y se registra la cantidad de pienso suministrada cada día. El periodo experimental tiene una duración de 15 d. Los 10 días iniciales de cada periodo se consideran un periodo de adaptación a la dieta. Se recogen muestras fecales frescas al azar los días 11 a 13 y se recoge digesta ileal durante 8 horas los días 14 y 15 utilizando procedimientos operativos estándar. Para la recolección de digesta ileal, se sujeta una bolsa de plástico al cilindro de la cánula y la digesta fluye hacia la bolsa de recolección. Las bolsas se retiran cada vez que se llenan con digesta, o al menos una vez cada 30 minutos y se congelan inmediatamente a -20 °C.
Las muestras fecales e ileales se descongelan, se mezclan para cada animal y dieta, y se recoge una submuestra para análisis químico. También se recoge y se analiza una muestra de la dieta basal. Las muestras de digesta se liofilizaron y se molieron finamente antes del análisis químico. Las muestras fecales se secan en un horno y se muelen finamente para su análisis. Todas las muestras se analizaron para determinar materia seca, marcador de digestibilidad, energía bruta, proteína bruta, grasa y fibra detergente neutra según procedimientos estándar (AOAC, 2005).
Los valores de digestibilidad ileal y total aparente de energía y nutrientes se calculan tal como se ha descrito anteriormente (Stein et al., 2007. J. Anim. Sci. 85:172-180). El corral es la unidad experimental. Los datos están sujetos a los procedimientos MIXED de SAS.
Resultados
Los grupos tratados recibieron la combinación completa: xilanasa más una enzima degradadora de fibra secundaria (p-glucanasa o mezcla FDE) y un DFM (microbio de alimentación directa basado en Bacillus), tienen una BWG más alta y/o una FCR más baja (g de ganancia de BW / g de consumo de pienso) y/o alta digestibilidad de nutrientes y/o energía y/o materia seca y/o fibra.
Ejemplo 4: Efectos de la xilanasa, la p-glucanasa y una cepa productora de ácido propiónico de microbios de alimentación directa basados en bacterias sobre la retención/digestibilidad de nutrientes y la metabolización de la energía en un pollo de engorde joven.
Composición de las dietas experimentales a base de trigo usadas en el ejemplo 4
Tabla 19: Composición de dieta de dietas basales de trigo para pollos de engorde (% tal como se suministra)
Figure imgf000063_0001
Figure imgf000064_0002
Material y procedimientos
El uso de animales y el protocolo experimental se aprobaron por el Institutional Animal Experiment Committee. Se formuló una dieta a base de trigo y cebada de forma que estuviera equilibrada en energía y nutrientes para pollos de engorde jóvenes (0-21 días de vida) (tabla 19). Se incluyó dióxido de titanio al 0,30% para permitir la determinación de la retención de componente dietético. No se incluyeron antimicrobianos sintéticos ni fármacos anticoccidiales, y la dieta se suministró en forma de puré. La dieta basal se dividió en porciones y se añadieron las respectivas enzimas y DFM para constituir las dietas experimentales identificadas en la tabla 20. Cada suplemento se mezcló previamente y la mezcladora se enjuagó para evitar la contaminación cruzada de las dietas tratadas. Se recogieron muestras de cada dieta de tratamiento al comienzo, a la mitad y al final de cada lote y se mezclaron entre sí para confirmar las actividades enzimáticas y la presencia de DFM en el pienso antes de comenzar el ensayo con animales. Se retienen muestras adicionales de cada dieta de tratamiento y se almacenan hasta que se requieran a -20 °C±2 °C para análisis.
Tabla 20: Identificación de tratamientos
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El estudio involucró un ensayo en jaula, que se llevó a cabo para obtener muestras de excrementos para mediciones de digestibilidad de energía y nutrientes. Se obtuvieron pollos de engorde machos de un día de edad (Ross 308) de un criadero comercial. Los pollos se pesaron individualmente a su llegada y se estratificaron por peso corporal y se distribuyeron en 30 jaulas (cinco pollos por jaula) de modo que el peso medio de las aves por jaula fuera similar. Los cuatro tratamientos dietéticos se asignaron después al azar a seis jaulas replicadas. El ensayo se llevó a cabo del día 0 al 21, periodo durante el cual las aves tuvieron libre acceso a los tratamientos dietéticos asignados y al agua. Las temperaturas de la criadora y la temperatura ambiente se fijaron en 32 y 29 °C, respectivamente, durante la primera semana. A partir de entonces, se desconectó el suministro de calor en la criadora y la temperatura ambiente se mantuvo a 29 °C durante todo el experimento. Se proporcionó luz durante 24 h durante todo el experimento. Los días 17, 18, 19 y 20 se recogieron muestras de excrementos y se almacenaron congeladas a -20 °C para la determinación de la retención/digestibilidad de energía y nutrientes. Se tuvo cuidado durante la recolección de muestras de excrementos para evitar la contaminación con plumas y otros materiales extraños. Las muestras de excrementos se agruparon dentro de una jaula, se mezclaron bien con una mezcladora y se tomaron dos muestras representativas por jaula. Las muestras se liofilizaron. Las muestras secas se molieron hasta que pasaron por un tamiz de 0,5 mm y se almacenaron en recipientes de plástico herméticos a -4 °C hasta los análisis químicos. Se analizaron muestras de dietas y excrementos para determinar la materia seca, la proteína bruta (como nitrógeno), la energía bruta, la grasa (como extractos de hexano) y la fibra detergente neutra según procedimientos de análisis oficiales de la AOAC. El titanio (marcador de digestibilidad) se analizó según procedimientos descritos por Lomer et al. (2000, Analyst 125:2339-2343). La retención/digestibilidad se calculó utilizando procedimientos estándar (Adeola, O. 2001. Digestion and balance techniques in pigs. Páginas 903-916 en Swine Nutrition, 2a ed. A. J. Lewis y L. L. Southern, ed. CRC Press, Washington, D.C.). Los datos se analizaron utilizando el procedimiento de modelos lineales generales de SAS (2004).
Resultados
Tabla 21: Efectos de la xilanasa, una enzima degradadora de fibra y microbios de alimentación directa basados en una cepa de bacterias productoras de ácido propiónico sobre la retención/digestibilidad de nutrientes y la metabolizabilidad de la energía en un pollo de engorde joven.
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Una combinación de xilanasa, p-glucanasa y un microbio de alimentación directa basado en Bacillus mejoró la utilización de la energía dietética en comparación con el control o la xilanasa sola o una combinación de xilanasa y pglucanasa (tabla 20). Esto podría estar relacionado con una mayor retención de nutrientes que producen energía en la materia seca, tal como grasa (tabla 20). La mayor retención de grasas debido a las combinaciones de tres vías es notable y podría estar relacionada con una mejor digestión y absorción de grasas en la dieta y también con la producción y absorción de ácidos grasos de cadena corta de la fermentación. Los beneficios observados de la combinación de tres vías de xilanasa, p-glucanasa, DFM de Bacillus/propiónico, mejor en la utilización de energía y nutrientes, también podrían relacionarse especulativamente con una mejor salud y función intestinal a través de la modulación positiva de la microbiota y la función digestiva/de absoción intestinal.
Ejemplo 5: Respuestas de pollos de engorde cuando se alimentan con dietas a base de maíz que contienen xilanasa, otras enzimas degradadoras de fibra y microbios de alimentación directa productores de ácido propiónico
Composición de las dietas experimentales utilizadas en el ejemplo 5
Tabla 22. Composición de dieta de dietas basales de maíz para pollos de engorde (% tal como se suministra)
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Materiales y procedimientos
El uso de animales y el protocolo experimental se aprobaron por el Institutional Animal Experiment Committee. Se formuló una dieta a base de maíz de forma que estuviera equilibrada en energía y nutrientes para pollos de engorde jóvenes (0-21 días de vida) (tabla 22). No se incluyeron antimicrobianos sintéticos ni fármacos anticoccidiales, y la dieta se suministró en forma de puré. La dieta basal se dividió en porciones y se añadieron las respectivas enzimas y DFM para constituir las dietas experimentales identificadas en la tabla 23. Cada suplemento se mezcló previamente y la mezcladora se enjuagó para evitar la contaminación cruzada de las dietas tratadas. Se recogieron muestras de cada dieta de tratamiento al comienzo, a la mitad y al final de cada lote y se mezclaron entre sí para confirmar las actividades enzimáticas y la presencia de DFM en el pienso antes de comenzar el ensayo con animales. Se retienen muestras adicionales de cada dieta de tratamiento y se almacenan hasta que se requieran a -20 °C±2 °C para análisis.
Tabla 23: Identificación de tratamientos
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Se obtuvieron pollos de un día de un criadero comercial y, al llegar, las aves se pesaron y se marcaron para su identificación y se asignaron en seis bloques por peso corporal, y se asignaron aleatoriamente a 4 tratamientos (tabla 23) dentro de un bloque con diez aves por corral en un diseño de bloque completo al azar. Desde el d 1 también se les permitió ad libitum acceso a agua potable limpia. Los pollos se pesaron los días 0 y 21 y se registraron sus pesos, también se supervisó y se documentó el consumo de pienso en los días de pesaje de los pollos. Los pollos se supervisaron diariamente y se registraron las variaciones en su apariencia o comportamiento. Al final de cada periodo de alimentación, se determinaron parámetros tales como la ganancia de peso, el consumo de pienso, la tasa de conversión alimenticia, la eficacia alimenticia y la mortalidad. Los datos se analizaron como un diseño de bloque completo al azar utilizando el procedimiento GLM del programa informático SAS (SAS Institute, Inc. 2006).
Resultados
Tabla 24: Efectos de la xilanasa, una mezcla de otras enzimas degradadoras de fibra y microbios de alimentación directa basados en propiónico sobre el rendimiento de crecimiento de un pollo de engorde joven.
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Los pollos alimentados con una combinación de xilanasa, una mezcla de otras enzimas degradadoras de fibra y un DFM basado en propiónico tuvieron mejor FCR que el control y numéricamente mejor que los pollos alimentados con dietas únicamente de enzimas (tabla 24).
Ejemplo 6: Efectos de la xilanasa y la p-glucanasa sin o con microbios de alimentación directa basados en cepas de Bacillus sobre el rendimiento de crecimiento, los recuentos microbianos y la digestibilidad de los nutrientes en cerdos de acabado en crecimiento
Composición de las dietas experimentales utilizadas en el ejemplo 6
Tabla 25: Composición de la dieta de pienso para cerdos en crecimiento (20-60 kg de peso corporal) (% tal como se suministra)
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Materiales y procedimientos
Se realizaron dos experimentos para evaluar el rendimiento de crecimiento, los recuentos microbianos fecales y los efectos de la digestibilidad de una mezcla de enzimas de xilanasa y p-glucanasa alimentada sin o con microbios de alimentación directa basados en cepas de Bacillus en cerdos en crecimiento. El Institutional Animal Care and Use Committee aprobó el uso de los cerdos y se utilizaron las guías de bienestar pertinentes para el país. En el experimento 1 se utilizaron un total de 42 cerdos ([$Yorkshire x Landrace] x Duroc) alojados en grupos de dos y en el experimento 2 se utilizaron 72 cerdos de la misma raza alojados en grupos de tres. Cada corral tenía lados de plástico transparente liso y piso de lámina metálica expandida recubierta de plástico en una habitación con temperatura controlada (22 ± 2 °C). Las dietas basales respectivas se formularon de forma que cumplieran con las recomendaciones nutricionales de NRC para cerdos (NRC, 1998, tabla 25, dieta I para el experimento 1 y dieta II para el experimento 2). En cada experimento, se produce un lote de la dieta basal y se divide en dos porciones y cada porción se mezcla posteriormente con los aditivos identificados en la tabla 26.
Tabla 26: identificación de tratamientos
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Los tratamientos identificados en la tabla 26 se asignaron a 7 y 8 corrales replicados en el experimento 1 y 2, respectivamente. La asignación de los corrales a los tratamientos se aleatorizó en función del peso corporal de los cerdos al comienzo del experimento. El peso corporal y el consumo de pienso se registraron semanalmente y se usaron para calcular la tasa de conversión alimenticia. A los cerdos se les ofrecieron las dietas experimentales durante 42 días en ambos experimentos. El pienso y el agua estuvieron disponibles libremente en todo momento durante el experimento. En el experimento 2, se recogieron muestras fecales frescas los días 38, 39 y 40 para determinar la digestibilidad de nutrientes, energía y fibra, así como el recuento microbiano fecal. Se diluyó un gramo de la muestra fecal compuesta de cada corral con 9 ml de caldo de peptona al 1% (Becton, Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ) y después se homogeneizó. A continuación se realizaron recuentos viables de bacterias en las muestras fecales plaqueando diluciones en serie de 10 veces (en una solución de peptona al 1%) en placas de agar MacConkey (Difco Laboratories, Detroit, MI) y placas de agar con medio de lactobacilos III (Medium 638, DSMZ, Braunschweig , Alemania) para aislar el E. coli y Lactobacillus, respectivamente. A continuación, las placas de agar con medio de lactobacilos III se incubaron durante 48 horas a 39 °C en condiciones anaeróbicas. Las placas de agar MacConkey se incubaron durante 24 h a 37 °C. Se contaron las colonias de E. coli y Lactobacillus inmediatamente después de sacarlas de la incubadora. Antes del análisis químico, las muestras fecales se descongelaron y se secaron a 60 °C durante 72 h, después de lo cual se molieron finamente a un tamaño que pudiera pasar a través de un tamiz de 1 mm. Todas las muestras de pienso y heces se analizaron después para determinar materia seca, energía bruta y fibra detergente ácida siguiendo los procedimientos descritos por la AOAC (procedimientos oficiales de análisis). El cromo (marcador de digestibilidad) se analizó siguiendo el procedimiento descrito por Williams et al. 1962, J. Anim. Sci.
59:381 -389. La digestibilidad se calculó utilizando procedimientos estándar (Adeola, O. 2001. Digestion and balance techniques in pigs. Páginas 903-916 en Swine Nutrition, 2a ed. A. J. Lewis y L. L. Southern, ed. CRC Press, Washington, D.C.). Los datos de rendimiento de crecimiento (BW, ADFI, ADG y FCR) se sometieron a los procedimientos GLM de SAS con tratamientos, experimentos e interacciones como efectos en el modelo. El análisis inicial reveló que las interacciones no eran significativas y, como tales, se redujeron en análisis posteriores; posteriormente se presentan los efectos principales de los tratamientos. Los datos de recuento microbiano se transformaron logarítmicamente y, junto con la digestibilidad, se sometieron a Anova unidireccional utilizando los procedimientos GLM de SAS.
Resultados
Tabla 27: Efectos de la xilanasa y la p-glucanasa sin o con microbios de alimentación directa basados en cepas de Bacillus sobre el rendimiento de crecimiento en cerdos de acabado en crecimiento
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Tabla 28: Efectos de la xilanasa y la p-glucanasa sin o con microbios de alimentación directa basados en cepas de Bacillus sobre la digestibilidad de materia seca, nitrógeno, fibra y energía (%) en cerdos de acabado en crecimiento
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Una combinación de xilanasa, p-glucanasa y un microbio de alimentación directa que contenía cualquiera de los Bacillus mejoró el rendimiento de crecimiento de los cerdos en crecimiento y la utilización de los nutrientes y la energía de la dieta en comparación con el control o la enzima solamente (tablas 27 y 28). También se observó que las combinaciones de tres vías dieron como resultado una mayor degradación de la fibra y promovieron la proliferación de bacterias de Lactobacillus en el intestino (figura 1).
Ejemplo 7: Efectos de la xilanasa, otras enzimas degradadoras de fibra y microbios de alimentación directa sobre la producción de ácidos grasos de cadena corta en el intestino posterior porcino
Composición de las dietas experimentales utilizadas en el ejemplo 7
Tabla 29: Composición del pienso para cerdos en crecimiento (20-60 kg de peso corporal) (% tal como se suministra)
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Materiales y procedimientos
Para establecer un modelo de intestino posterior porcino, se adaptó un procedimiento de (Boisen y Fernandez 1997, Animal Feed Science and Technology 68: 277-286) para generar efluente ileal porcino in vitro. En resumen, se combinaron 1,35 kg de pienso en puré completo (a base de maíz y trigo, detalles en la tabla 29) con 3,00 l de tampón de fosfato (0,1 M, pH 6) y 1,20 l de HCl 0,2 M en una cubeta de 3 galones con un tapa resellable. El pH se ajustó a 2 utilizando HCl 10 M o NaOH. Después se añadieron 120 ml de una solución de pepsina preparada previamente (250 mg de pepsina (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO) por ml de agua). La cubeta se selló y se incubó a 39 °C durante 2 horas con agitación para simular la digestión estomacal. Para la simulación de la digestión en el intestino delgado, se añadieron a la solución 1,20 l de tampón de fosfato (0,2 M, pH 6,8) y 600 ml de NaOH 0,6 M y el pH se ajustó a 6,8 usando NaOH 10 M o HCl como anteriormente. Después de la neutralización, se añadieron 120 ml de solución de pancreatina preparada previamente (1000 mg de pancreatina (Sigma-Aldrich) por ml de agua), se selló la cubeta y se incubó a 39 °C durante 4 horas con agitación. Después de la incubación, el líquido se filtró usando una media bolsa de colada de doble capa y doblada dos veces (Jumbo Nylon Coarse, LD Carlson Company, Kent, OH). La suspensión restante se homogeneizó y se dividió en porciones de 128 g, cada una de las cuales se pesó en botellas Pyrex de 250 ml separadas. Posteriormente, las botellas se almacenaron a -20 °C. Como inoculante para la microbiota del intestino grueso, se recogió el contenido cecal de 12 cerdos de engorde. Los contenidos se homogeneizaron, se mezclaron con glicerol al 10% y se pesaron partes alícuotas de 14 g en conos de 15 ml. A continuación, los conos se sellaron y almacenaron a -80 °C.
Los experimentos de simulación del intestino posterior porcino se realizaron por duplicado, cada uno con 1 control y 3 tratamientos (tabla 30). Cada tratamiento se sometió a ensayo por triplicado. Para cada ensayo in vitro de fermentación de intestino posterior porcino, se utilizaron un total de 24 botellas Pyrex con efluente ileal simulado y un cono de 15 ml con contenido cecal. Las botellas se descongelaron durante la noche y se añadieron a cada botella 240 ml de solución tampón de fosfato 0,1 M estéril (pH 6) con 4 g/l de mucina (Sigma-Aldrich), de forma similar a los procedimientos descritos en (Christensen et al. 1999, Journal of the Science of Food and Agriculture 79, 755-762) y Aristoteli y Willcox, 2003, Infection and immunity 71: 5565-5575). El inoculante se descongeló durante 30 minutos a temperatura ambiente mientras que las botellas Pyrex se precalentaron a 39 °C durante 30 minutos en un baño de agua con agitación, después se añadieron los tratamientos en 1 ml de solución de peptona al 1% y 450 pl de tampón de fosfato 0,1 M (véase la tabla 30).
Tabla 30: Tratamientos sometidos a ensayo para fermentación en el intestino posterior in vitro porcino*
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Las botellas se purgaron con CO2 gaseoso durante 30 segundos mientras se añadían 250 pl de inoculante cecal (basado en Coles et al. 2005, Animal Feed Science and Technology 123: 421-444) y se recogió una muestra de referencia de 10 ml, se determinó el pH de referencia y la muestra se almacenó a -202C. Las botellas se taparon, se mezclaron suavemente y se dispusieron en un baño de agua con agitación a 39 °C y 160 rpm. Después de 12 h, se recogieron otros 10 ml de muestra, se determinó el pH y la muestra se almacenó a -20 °C. Para la cuantificación de ácidos grasos volátiles (AGV) mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), las muestras se descongelaron y se centrifugaron a 16,1 rad durante 20 minutos, y el sobrenadante se filtró a través de una membrana de éster de celulosa mixta de 0,22 pm (Milex-GS, EMD Millipore Corp., Billerica, MA). Del filtrado, se inyectaron 20 pl en un módulo de separaciones Waters Alliance 2695 (Waters Corp., Milford, MA) equipado con una precolumna Shodex SH-G (Waters) y una columna Aminex HPX-87H de 300 x 7,8 mm (Biorad Laboratories, Inc., Hércules, CA). Se aplicó un procedimiento isocrático con una fase móvil que consistía en ácido fosfórico 16,8 mM en agua/acetonitrilo (98:2, v/v) a un caudal de 0,525 ml/min y una temperatura de columna de 35 °C. Los ácidos grasos volátiles se detectaron utilizando un detector de matriz de fotodiodos (PDA) Waters 2996 (Waters) a una absorción de 211 nm. El control del instrumento, la adquisición de datos y el procesamiento de datos se realizaron con el programa informático Waters Empower 3 (Waters). Los ácidos grasos volátiles se cuantificaron utilizando curvas patrón generadas a partir de reactivos de alta calidad (> 99,9%) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Se prepararon diluciones lineales de patrones en ácido fosfórico 16,8 mM en agua/acetonitrilo (98:2, v/v) a 6 concentraciones que oscilaban entre el 0,05% y el 2,0%. Se determinaron las concentraciones de ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido valérico, ácido isovalérico (cuya suma se presenta como AGV totales) y ácido láctico. El análisis estadístico para cada experimento se realizó como ANOVA unidireccional bloqueado por corrida usando el procedimiento GLM de SPSS (versión 17, SPSS Inc., Chicago, IL). Se declaró significancia para P < 0,10, las medias de tratamientos se separaron utilizando la prueba de rango múltiple de Duncan.
Resultados
En dietas a base de trigo, se observó un aumento significativo en la producción total de AGV y ácido láctico después de 12 h de simulación del intestino posterior porcino cuando se añadieron xilanasa NGX, la mezcla de enzimas degradadoras de fibra Accelerase Trio y un DFM y se compararon con el control sin aporte suplementario (tabla 31, experimento 1 y 2). El uso de DFM basado en Propionibacterium acidipropionici P169 aumentó significativamente más los niveles de propionato y tuvo una mayor acidificación del contenido colónico simulado en el tratamiento combinado en comparación con el control (tabla 31, experimento 1). En las dietas a base de maíz, el tratamiento combinado de xilanasa Y5, la enzima degradadora de fibra Accelerase Trio y DFM aumentó significativamente los niveles de butirato en comparación con el control después de 12 h de fermentación simulada en el intestino posterior porcino, con un aumento adicional de los AGV totales cuando se usó DFM basado en Propionibacterium acidipropionici P169 (tabla 31, experimento 3 y 5). El reemplazo de la mezcla de enzimas Accelerase Trio por Axtra® XB p-glucanasa y el uso de DFM de Bacillus basado en la dieta de maíz con Y5 dio como resultado un aumento significativo de AGV total y lactato en comparación con el tratamiento de control (tabla 31, experimento 4).
Tabla 31: Abundancia media de propionato, butirato, ácidos grasos volátiles totales (AGV) y lactato (% tal cual), así como las diferencias de pH en comparación con las muestras de referencia después de 12 h de fermentación en intestino posterior porcino in vitro.
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Ejemplo 8: Efectos de la xilanasa, otras enzimas fibrolíticas y microbios de alimentación directa sobre la degradación de la fibra en el intestino posterior porcino
Composición de la dieta experimental utilizada en el ejemplo 8
Tabla 32: Composición de la dieta de pienso para cerdos en crecimiento (20-60 kg de peso corporal) (% tal como se suministra)
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Para demostrar la desaparición de la materia seca (MS) y la degradación de la fibra, se generaron efluentes ileales y se estableció la fermentación en el intestino posterior tal como se describe en el ejemplo 7. En resumen, la dieta basada en trigo (CW, véase la tabla 32) se usó como control sin ningún tratamiento, así como CW además de xilanasa Y5 (tratamiento 1), CW con Y5 y mezcla de enzimas degradadoras de fibra Accelerase Trio (tratamiento 2), CW con Y5, Accelerase en combinación con un microbio de alimentación directa de tres cepas de Bacillus (tratamiento 3), los detalles de los tratamientos con enzimas y DFM se encuentran en la tabla 33.
Tabla 33: Identificación de tratamientos*
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Efectos del tratamiento sobre la desaparición de MS y fibra. A las 0 y 48 horas del experimento se filtró el líquido y se recogieron los sólidos remanentes y se enviaron para análisis nutricional aproximado de materia seca (MS), fibra detergente ácida y neutra (ADF y NDF, respectivamente), estas últimas se generaron en MS según los procedimientos descritos en (Association of Analytical Chemists (AOAC) 2007, 18a edición. AOAC, Washington, D. C.). Los datos se calcularon como porcentaje de desaparición, el análisis estadístico se realizó como ANOVA unidireccional bloqueado por ejecución utilizando el procedimiento GLM de SPSS (versión 17, SPSS Inc., Chicago, IL). Se declaró significancia para P < 0,10, las medias de tratamientos se separaron mediante la prueba de rango múltiple de Duncan.
Resultados
En la dieta a base de trigo sometida a ensayo, el tratamiento combinado con xilanasa Y5, la mezcla de enzimas degradadoras de fibra Accelerase Trio y DFM basado en tres Bacillus tuvo la mayor desaparición de MS, ADF y NDF en comparación con CW sin ningún suplemento de enzima y DFM (tabla 34).
Tabla 34: Porcentaje de desaparición de materia seca, fibra detergente ácida y neutra durante 48 h de fermentación en el intestino posterior porcino in vitro
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Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Una composición de aditivo para piensos que comprende al menos las cepas microbianas de alimentación directa (DFM) Bacillus AGTP BS3BP5, Bacillus AGTP BS918 y Bacillus AGTP BS1013, una xilanasa y una p-glucanasa, en la que la xilanasa y la p-glucanasa son exógenas a las cepas de DFM.
2. Una composición de aditivo para piensos según la reivindicación 1, en la que:
a. al menos una de las cepas de DFM es una cepa productora de ácidos grasos de cadena corta; y/o
b. al menos una de las cepas de DFM es una cepa promotora de la microflora endógena fibrolítica; y/o c. el DFM es una bacteria viable; y/o
d. el microbio de alimentación directa se encuentra en forma de endospora.
3. Una composición de aditivo para piensos según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la composición comprende una enzima degradadora de fibra adicional.
4. Una composición de aditivo para piensos según la reivindicación 3, en la que la enzima degradadora de fibra adicional se selecciona del grupo que consiste en una celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.176 y E.C. 3.2.1.91), una pglucosidasa (E.C. 3.2.1.21), una p-xilosidasa (E.C. 3.2.1.37), una feruloil esterasa (E.C. 3.1.1.73), una aarabinofuranosidasa (E.C. 3.2.1.55), una pectinasa (por ejemplo, una endopoligalacturonasa (E.C. 3.2.1.15), una exopoligalacturonasa (E.C. 3.2.1.67) o una pectato liasa (E.C. 4.2.2.2)), o combinaciones de las mismas, preferentemente la enzima degradadora de fibra adicional se selecciona del grupo que consiste en una celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.176 y E.C. 3.2.1.91), una p-glucosidasa (E.C. 3.2. 1.21) o combinaciones de las mismas.
5. Una composición de aditivo para piensos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 formulada como una premezcla que comprende además al menos una vitamina y/o al menos un mineral.
6. Un procedimiento para los siguientes usos: mejorar el rendimiento de un sujeto o mejorar la digestibilidad de una materia prima en un pienso (por ejemplo, digestibilidad de nutrientes, tal como la digestibilidad de aminoácidos), o mejorar la retención de nitrógeno, o mejorar la tasa de conversión alimenticia (FCR), o mejorar la ganancia de peso en un sujeto, o mejorar la eficacia alimenticia en un sujeto, o desplazar el proceso de fermentación en el aparato gastrointestinal del sujeto hacia la producción de ácido butírico y/o ácido propiónico, procedimiento que comprende administrar a un sujeto una composición de aditivo para piensos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Uso de una composición de aditivo para piensos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para mejorar el rendimiento de un sujeto o para mejorar la digestibilidad de una materia prima en un pienso (por ejemplo, digestibilidad de nutrientes, tal como la digestibilidad de aminoácidos) o para mejorar la retención de nitrógeno, o para mejorar la tasa de conversión alimenticia (FCR), o para mejorar la ganancia de peso en un sujeto, o para mejorar la eficacia alimenticia en un sujeto, o para desplazar el proceso de fermentación en el aparato gastrointestinal del sujeto hacia la producción de ácido butírico y/o ácido propiónico.
8. Un kit que comprende una composición de aditivo para piensos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
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