ES2925007T3

ES2925007T3 - Composiciones de glicósidos de esteviol glicosilados

Info

Publication number: ES2925007T3
Application number: ES17732653T
Authority: ES
Inventors: Joshua Fletcher; Ryan Woodyer; Mikhail Gololobov; Ryan Gross; John Smythe; Salma Siraj; Xian Chen; James Gaddy
Original assignee: Tate and Lyle Solutions USA LLC
Current assignee: Tate and Lyle Solutions USA LLC
Priority date: 2016-06-06
Filing date: 2017-06-05
Publication date: 2022-10-13
Anticipated expiration: 2037-06-05
Also published as: CA3026627A1; KR102481954B1; EP3464607A1; KR20190015334A; US20190297932A1; MX2018014533A; MY198645A; AR124510A2; AR108770A1; CN109689878A; EP4108778A1; BR112018075210A2; JP7293110B2; PL3464607T3; JP2019517823A; CN116210879A; EP3464607B1; WO2017214026A1; US20230404122A1; JP2021168678A

Abstract

Los procesos para la preparación de composiciones de glucósidos de esteviol glicosilados, edulcorantes y modificadores del sabor útiles en productos alimenticios y bebidas y similares, se mejoran mediante el uso de condiciones básicas antes, durante y/o después de una glicosilación catalizada por enzimas de una composición de glucósidos de esteviol. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones de glicósidos de esteviol glicosilados

Campo de la invención

[0001] La presente invención se refiere a composiciones que comprenden glicósidos de esteviol y glicósidos de esteviol glicosilados, edulcorantes y mezclas que incluyen dichas composiciones, y al uso de dichas composiciones como edulcorantes y modificadores del sabor en productos comestibles como los alimentos y las bebidas.

Estado de la técnica

[0002] En los últimos años, el desarrollo de edulcorantes de alta intensidad basados en productos naturales ha despertado mucho interés. Dichos edulcorantes pueden sustituir al azúcar en los productos alimenticios y de bebida, de modo que se reduce potencialmente el azúcar y posiblemente también el contenido calórico de dichos productos. Los glicósidos de esteviol extraídos y aislados de las hojas de la planta de Stevia han sido objeto de numerosas investigaciones y de atención comercial, ya que la mayoría de dichos compuestos son mucho más dulces que el azúcar (sacarosa). Las variedades más antiguas de plantas de Stevia contienen esteviósido como componente principal de los glicósidos de esteviol, junto con cantidades más pequeñas de rebaudiósido A y otros glicósidos de esteviol menores. Aunque el esteviósido es aproximadamente entre 100 y 300 veces más dulce que la sacarosa, se considera que su calidad del sabor es considerablemente inferior a la del rebaudiósido A. En consecuencia, se han desarrollado nuevas variedades de plantas de Stevia con un nivel de rebaudiósido A mucho más alto y formas de procesar las hojas de Stevia para obtener rebaudiósido A de gran pureza (95 % ). No obstante, incluso el rebaudiósido A muy purificado no presenta un perfil de sabor completamente comparable con el de la sacarosa; por lo tanto, la formulación de alimentos y bebidas con bajo contenido de azúcar mediante la utilización únicamente de rebaudiósido A purificado ha seguido siendo todo un reto.

[0003] Los glicósidos de esteviol se caracterizan por presentar moléculas de glucosa unidas a una fracción central de esteviol (terpenoide). Hace un tiempo, se descubrió que los glicósidos de esteviol de origen natural como el esteviósido y el rebaudiósido A podrían modificarse al hacer que una alfa-glucosiltransferasa reaccione en una solución acuosa que contiene uno o más glicósidos de esteviol y un donante de glucosa como el almidón o la ciclodextrina, de tal manera que una o más unidades de glucosa son transferidas desde el donante de glucosa al/a los glicósido(s) de esteviol. Los productos de reacción obtenidos de esta forma, que se denominan en general «glicósidos de esteviol glicosilados», pueden presentar características sensoriales modificadas/mejoradas en comparación con el/los glicósido(s) de esteviol inicial(es). En la patente estadounidense n.° 4,219,571 y la patente estadounidense con n.° de publicación 2007/0082102, se describen ejemplos de dichas reacciones, que se puede considerar que implican glicosilación o transglicosilación.

[0004] No obstante, serían deseables más mejoras en lo que se refiere a la tecnología de la glicosilación de los glicósidos de esteviol. Por ejemplo, los rendimientos del/de los glicósido(s) de esteviol glicosilado(s) obtenidos en dichas reacciones tienden a ser bajos. Adicionalmente, el sabor y el gusto de los glicósidos de esteviol glicosilados preparados mediante la utilización de los métodos conocidos, aunque tal vez sean mejores que el del/de los glicósido(s) de esteviol inicial(es), puede que no sean totalmente ideales, por el hecho de que difieren de forma notable de las características sensoriales que posee la sacarosa.

JUNG, SW., KIM, TK., Lee, KW. et al., Biotechnol. Bioprocess Eng. 12, 207 (2007) hace referencia a las propiedades catalíticas de la p-ciclodextrina glucanotransferasa (p-CGTasa) del alcalófilo Bacillus sp. BL-12 específica para la transglicosilación intermolecular del esteviósido. Kochikyan, V.T., Markosyan, A.A., Abelyan, L.A. et al., Appl. Biochem. Microbiol. 42, 31-37 (2006) se refiere a la modificación enzimática combinada de esteviósido y rebaudiósido A.

Jaitak, V., Kaul, V.K., Bandna et al., Biotechnol. Lett. 31, 1415 (2009) se refiere a la transglicosilación enzimática de esteviósido por la p-ciclodextrina glucanotransferasa de Bacillus firmus.

[0005] US 2010/166679 A1 se refiere a un proceso para producir un edulcorante muy purificado a partir del extracto de la planta de Stevia rebaudiana Bertoni y su uso en diversos productos alimenticios y bebidas.

[0006] Sha Li, Wei Li, Qiu-yan Xiao, Yongmei Xia. Food Chem. 138, 2064-2069 (2013) se refiere a la transglicosilación de esteviósido mediante sustitución inferior utilizando hidrolizado de almidón de maíz y CGTasa.

[0007] US 2007082102 A1 se refiere a un proceso para producir un edulcorante muy purificado a partir del extracto de la planta Stevia rebaudiana Bertoni y su uso en diversos productos alimenticios y bebidas.

[0008] US 4,219,571 A se refiere a un proceso para producir un edulcorante, caracterizado por dejar que actúe una alfa-glucosiltransferasa, durante la producción del edulcorante, en una solución acuosa que contiene esteviósido y compuesto de azúcar alfa-glucosil para formar esteviósido alfa-glicosil y para obtener el esteviósido alfa-glicosil o un esteviósido alfa-glicosil que contiene edulcorante.

[0009] WO 2012/112180 A1 se refiere a un proceso para producir un ingrediente alimenticio muy purificado a partir del extracto de la planta Stevia rebaudiana Bertoni y su uso en diversos productos alimenticios y bebidas.

[0010] WO 2016/074761 A1 se refiere a una composición que comprende una mezcla de glicósidos de esteviol comprendiendo al menos un glicósido de esteviol glicosilado, y un agente de enmascaramiento natural, pudiendo obtenerse dicho agente de enmascaramiento natural de la algarroba y/o de una fruta cítrica, un modificador del sabor, un potenciador del sabor o un potenciador del dulzor comprendiendo dicha composición, el uso de dicha composición y un método de elaboración de la composición.

Sumario de la invención

[0011] La presente invención proporciona:

Aspecto 1. Una composición que comprende glicósidos de esteviol y glicósidos de esteviol glicosilados, donde:

la composición comprende glicósidos de esteviol y glicósidos de esteviol glicosilados en una cantidad total de al menos el 85 % de la composición, en peso seco; y

el rebaudiósido glicosilado B, el esteviolbiósido glicosilado, el esteviolbiósido y el rebaudiósido B están presentes cada uno de ellos y juntos comprenden del 5 al 50 %, en peso seco, de la composición.

Aspecto 2. La composición de acuerdo con el aspecto 1, donde el rebaudiósido B glicosilado, el esteviolbiósido glicosilado, el esteviolbiósido y el rebaudiósido B juntos comprenden del 10 al 25 %, en peso seco, de la composición.

Aspecto 3. La composición de acuerdo con el aspecto 1, donde el rebaudiósido B glicosilado y el esteviolbiósido glicosilado juntos comprenden del 5 al 15 %, en peso seco, de la composición.

Aspecto 4. La composición de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 3, que presenta una cantidad total de glicósidos de esteviol y de glicósidos de esteviol glicosilados de al menos el 90 % de la composición, en peso seco.

Aspecto 5. La composición de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 3, que presenta una cantidad total de glicósidos de esteviol y de glicósidos de esteviol glicosilados de al menos el 95 % de la composición, en peso seco.

Aspecto 6. La composición de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 3, donde la composición comprende del 15 % en peso al 40 % en peso de glicósido de esteviol no glicosilado y del 60 % en peso al 85 % en peso de glicósido de esteviol glicosilado sobre una base de materia seca, donde el peso total de glicósido de esteviol no glicosilado y glicósido de esteviol glicosilado es de al menos el 90 %, en peso seco, del peso total de la composición.

Aspecto 7. La composición de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 3, donde la composición comprende del 20 % en peso al 35 % en peso de glicósido de esteviol no glicosilado y del 65 % en peso al 80 % en peso de glicósido de esteviol glicosilado sobre una base de materia seca, donde el peso total de glicósido de esteviol no glicosilado y glicósido de esteviol glicosilado es de al menos el 95 %, en peso seco, del peso total de la composición.

Aspecto 8. Un producto alimenticio, de bebida, cosmético o farmacéutico que comprende i) la composición de acuerdo con cualquiera de los aspectos 1 a 7 y ii) al menos un ingrediente alimenticio, de bebida, cosmético o farmacéutico adicional.

Aspecto 9. Un método de elaboración de un producto alimenticio, de bebida, cosmético o farmacéutico que comprende la combinación de i) la composición de acuerdo con el aspecto 1 y ii) al menos un ingrediente alimenticio, de bebida, cosmético o farmacéutico adicional.

Aspecto 10. El método de acuerdo con el aspecto 9, donde el al menos un ingrediente alimenticio, de bebida, cosmético o farmacéutico adicional incluye del 2 al 8 % en peso de rebaudiósido B además de la composición de acuerdo con el aspecto 1 basándose en el peso seco total de rebaudiósido B y la composición de acuerdo con el aspecto 1.

Aspecto 11. Una composición edulcorante preparada mediante la combinación de a) una composición de acuerdo con el aspecto 1 y b) rebaudiósido B, donde la composición edulcorante contiene del 2 al 8 % en peso de rebaudiósido B basándose en el peso seco total de a) y b).

Aspecto 12. La composición edulcorante de acuerdo con el aspecto 11, donde la composición edulcorante contiene del 3 al 6 % en peso de rebaudiósido B basándose en el peso seco total de a) y b).

Aspecto 13. Un producto alimenticio, de bebida, cosmético o farmacéutico que comprende i) una composición edulcorante de acuerdo con el aspecto 11 o 12 y ii) al menos un ingrediente alimenticio, de bebida, cosmético o farmacéutico adicional.

Aspecto 14. Un método de elaboración de un producto alimenticio, de bebida, cosmético o farmacéutico que comprende la combinación de i) una composición edulcorante de acuerdo con el aspecto 11 o 12 y ii) al menos un ingrediente alimenticio, de bebida, cosmético o farmacéutico adicional.

Descripción de los dibujos

[0012]

La figura 1 es un diagrama de flujo de proceso que ilustra esquemáticamente diversos métodos y la manera en la que pueden ponerse en práctica conjuntamente.

Las figuras 2-8 son cromatogramas LC-MS de diversas composiciones de glicósidos de esteviol y glicósidos de esteviol glicosilados, tal y como se explica en detalle en los ejemplos.

La figura 9 muestra el formato de un formulario de evaluación de muestra de prueba utilizado en relación con la obtención de determinados datos de rendimiento de prueba, tal y como se describe en los ejemplos.

Descripción detallada

[0013] La expresión «glicósido de esteviol», tal y como se emplea en la presente memoria, se refiere a un compuesto de glicósido de esteviol (un glicósido de esteviol) que se encuentra en la planta de Stevia, tal como el rebaudiósido A, el rebaudiósido B, el rebaudiósido C, el rebaudiósido D, el rebaudiósido E, el rebaudiósido F, el rebaudiósido M (en ocasiones, también denominado rebaudiósido X), el rubusósido, el dulcósido o el esteviósido. En los glicósidos de esteviol de origen natural, las unidades de glucosa de la cadena principal de esteviol están unidas en la configuración beta.

[0014] La expresión «glicósido de esteviol glicosilado», tal y como se emplea en la presente memoria, se refiere a un glicósido de esteviol que está glicosilado en una o más posiciones (p. ej., una, dos, tres o más fracciones de glucosa han sido añadidas al glicósido de esteviol, por medio de enlaces glicosídicos covalentes). En concreto, un glicósido de esteviol glicosilado es un glicósido de esteviol en el que una o más fracciones de glucosa o polímeros de glucosa unidos mediante enlaces alfa 1-4 (p. ej., maltosa, maltotriosa, maltotetrosa) se introducen en una molécula de glicósido de esteviol original mediante enlaces 1-4 con una fracción de azúcar en el glicósido de esteviol original. En un glicósido de esteviol glicosilado, la/las unidad(es) de glucosa añadida(s) mediante la reacción de glicosilación enzimática se unen en la configuración alfa. En consecuencia, un glicósido de esteviol glicosilado presenta una estructura diferente de la de un glicósido de esteviol de origen natural.

[0015] La expresión «composición(es) de glicósidos de esteviol glicosilados», tal y como se emplea en la presente memoria, se refiere a una composición que incluye uno o más glicósidos de esteviol glicosilados, pero que también puede incluir una o más sustancias que no sean glicósidos de esteviol glicosilados (como, por ejemplo, glicósido(s) de esteviol que no haya(n) reaccionado y/o donante de glucosa que no haya reaccionado y/o productos de hidrato de carbono obtenidos a partir del donante de glucosa. La composición de acuerdo con la presente invención es una composición de glicósidos de esteviol glicosilados (composición que comprende glicósidos de esteviol y glicósidos de esteviol glicosilados) según se define en las reivindicaciones.

[0016] En la presente memoria, se exponen métodos correspondientes a al menos tres métodos primarios, que se denominarán generalmente método A, método B y método C, y que se describen con mayor detalle a continuación. Estos métodos primarios pueden ponerse en práctica independientemente o en combinación entre sí.

Método A

[0017] El método A implica un método de elaboración de una composición de glicósidos de esteviol glicosilados, donde el método comprende poner en contacto una composición inicial de glicósidos de esteviol, un donante de glucosa y una ciclodextrina glicosiltransferasa en un medio acuoso con un pH superior a 7,5 y no superior a 10 durante un tiempo eficaz para producir la composición de glicósidos de esteviol glicosilados. Se ha descubierto que, al llevar a cabo la glicosilación en tales condiciones, se proporciona una o más de las siguientes ventajas, en comparación con la glicosilación catalizada por la CGTasa a valores de pH más bajos: mayor rendimiento de los glicósidos de esteviol glicosilados, composiciones de glicósidos de esteviol glicosilados con mejor sabor, y/o composiciones de glicósidos de esteviol glicosilados con mayor dulzor.

Composiciones iniciales de glicósidos de esteviol

[0018] La composición inicial de glicósidos de esteviol puede comprender uno o más glicósidos de esteviol, que pueden ser glicósidos de esteviol naturales (es decir, glicósidos de esteviol que se encuentran en la naturaleza en las hojas de una planta de Stevia) y/o glicósidos de esteviol no naturales (es decir, glicósidos de esteviol que no se encuentran en las hojas de Stevia ni en otras fuentes naturales). La composición inicial de glicósidos de esteviol puede caracterizarse como una composición que tiene uno o más atributos, en particular una o más características sensoriales, que se han identificado como necesitadas de mejora. Por ejemplo, el atributo que necesita mejorarse puede seleccionarse del grupo que consiste en el amargor, el regusto dulce, la intensidad del dulzor, el sabor a regaliz, la astringencia y sus combinaciones. La composición inicial de glicósidos de esteviol puede comprender una o más sustancias distintas de los glicósidos de esteviol, en particular una o más de las sustancias de glicósidos no esteviol presentes junto con los glicósidos de esteviol en un material vegetal de Stevia, un extracto obtenido o preparado a partir de un material vegetal de Stevia o una composición de glicósidos de esteviol preparada sintéticamente. Sin embargo, la composición inicial de glicósidos de esteviol puede estar compuesta, en total, por al menos el 50, al menos el 60, al menos el 70, al menos el 80, al menos el 90, al menos el 95 o al menos el 99 % en peso de glicósido(s) de esteviol, sobre una base de materia seca.

[0019] Los glicósidos de esteviol ilustrativos adecuados para su uso en la composición inicial de glicósidos de esteviol pueden seleccionarse del grupo que consiste en esteviósido, rebaudiósido A, rebaudiósido B, rebaudiósido C, rebaudiósido D, rebaudiósido E, rebaudiósido F, rebaudiósido X (M), rebaudiósido N, rebaudiósido O, dulcósido A, esteviolbiósido, rubusósido y sus combinaciones. La composición inicial de glicósidos de esteviol puede ser un extracto de glicósidos de esteviol de las hojas de una planta de Stevia, incluyendo cualquiera de las variedades conocidas (naturales e hibridadas) de la planta de Stevia. Dichos extractos son generalmente mezclas de diferentes glicósidos de esteviol, siendo típicamente el esteviósido y el rebaudiósido A los glicósidos de esteviol presentes en mayor abundancia (en función de la variedad de planta de Stevia de la que se haya obtenido el extracto). La composición inicial de glicósidos de esteviol puede comprender un 10-70 % de esteviósido y un 20-70 % de rebaudiósido A en peso seco, donde la cantidad total de esteviósido y rebaudiósido A no es inferior al 70 % en peso seco, con otros glicósidos de esteviol opcionalmente presentes para proporcionar un contenido total de glicósidos de esteviol no inferior al 90 % o no inferior al 95 % en peso seco. Por ejemplo, la composición inicial de glicósidos de esteviol puede ser un extracto compuesto (en peso seco) por un 28-30 % de esteviósido, un 50-55 % de rebaudiósido A, un 9-12 % de rebaudiósido C, un 1-3 % de rebaudiósido F y otros glicósidos de esteviol, lo que supone un contenido total de glicósidos de esteviol de al menos el 90 % o al menos el 95 %. La composición inicial de glicósidos de esteviol puede ser un extracto compuesto (en peso seco) por un 25-30 % de esteviósido, un 55 65 % de rebaudiósido A y otros glicósidos de esteviol, con un contenido total de glicósidos de esteviol de al menos el 95 %. La composición inicial de glicósidos de esteviol puede ser un extracto compuesto (en peso seco) por un 55-65 % de rebaudiósido A, un 20-30 % de esteviósido y de un 3 a un 8 % en total de rebaudiósido C y dulcósido A, con un contenido total de glicósidos de esteviol de al menos el 90 %. Alternativamente, pueden emplearse extractos de Stevia con diferentes proporciones de glicósidos de esteviol, así como glicósidos de esteviol muy purificados (por ejemplo, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % de pureza) como el esteviósido, el rebaudiósido A, el rebaudiósido B, el rebaudiósido C, el rebaudiósido D, el rebaudiósido E, el rebaudiósido F, el rebaudiósido X (M), el rebaudiósido N, el rebaudiósido O, el dulcósido A, el esteviolbiósido o el rubusósido.

[0020] Por ejemplo, la composición inicial de glicósidos de esteviol puede estar compuesta por al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % de rebaudiósido B en peso seco. La composición inicial de glicósidos de esteviol puede estar compuesta por al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % de rebaudiósido A en peso seco. La composición inicial de glicósidos de esteviol puede estar compuesta por al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % de esteviósido en peso seco. La composición inicial de glicósidos de esteviol puede estar compuesta por al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % de esteviolbiósido en peso seco.

[0021] También es adecuada para su uso como composición inicial de glicósidos de esteviol una composición de glicósidos de esteviol que ha sido tratada con base de acuerdo con el método B de. Donante de glucosa

[0022] Los donantes de glucosa adecuados para su uso incluyen cualquiera de las formas oligoméricas, poliméricas y cíclicas de la glucosa que son capaces de reaccionar en presencia de una CGTasa para, en efecto, escindir una o más unidades de glucosa que se transfieren a las moléculas de glicósidos de esteviol presentes en la composición inicial de glicósidos de esteviol. Entre los donantes de glucosa adecuados se incluyen, por ejemplo y sin limitación, los almidones (incluidos los almidones de diferentes fuentes como el trigo, el maíz, la patata, la tapioca y el sagú), los almidones licuados (incluidos los almidones que han sufrido una hidrólisis parcial catalizada, por ejemplo, por ácido y/o enzimas como las amilasas), las dextrinas (incluidas las maltodextrinas), las ciclodextrinas y similares, y sus combinaciones. El donante de glucosa puede ser una maltodextrina con un valor de Dextrosa Equivalente (De ) de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10.

[0023] Una composición adecuada de donante de glucosa puede prepararse tratando el almidón u otro polisacárido adecuado con una mezcla de una amilasa y una CGTasa en condiciones eficaces para licuar el polisacárido. Por ejemplo, puede combinarse almidón y agua para formar una suspensión de almidón, a la que se añade una aamilasa y una CGTasa. La mezcla resultante puede incubarse a continuación a una temperatura adecuada (por ejemplo, de unos 50 °C a unos 90 °C o de unos 70 °C a unos 90 °C) durante un período de tiempo (por ejemplo, de unas 0,2 a unas 6 horas) eficaz para licuar el almidón (lo que da lugar a una disminución de su peso molecular y a un aumento de su valor de DE). A continuación, la amilasa puede inactivarse mediante cualquier método adecuado, como el tratamiento térmico a bajo pH, para obtener una composición de donante de glucosa que, a continuación, se combina con la composición inicial de glicósidos de esteviol y una porción adicional de CGTasa y se somete a las condiciones de glicosilación.

[0024] En la reacción de glicosilación, puede utilizarse una cantidad de donante de glucosa eficaz para proporcionar una relación de peso entre el donante de glucosa y el glicósido de esteviol (en peso seco) de aproximadamente 0,5:1 a aproximadamente 2:1. La relación de peso entre el donante de glucosa y el glicósido de esteviol puede ser de 1:1 a 2:1 o de 1,5:1 a 2:1.

CGTasa

[0025] La ciclodextrina glicosiltransferasa (CGTasa) puede ser cualquiera de las enzimas conocidas en la técnica capaz de catalizar la adición de unidades de glucosa a los glicósidos de esteviol. Pueden utilizarse combinaciones de diferentes enzimas CGTasa. La CGTasa puede ser producida por bacilos mesófilos, termófilos, alcalófilos y halófilos. Las enzimas CGTasa adecuadas pueden, por ejemplo, cultivarse o derivarse de especies de Bacillus como Bacillus stearothermophilus, Bacillus macerans, Bacillus circulans, Bacillus alcalophilus y/o Bacillus halophilus, así como de cepas de Thermoanaerobacter o Thermoanaerobium. Los ejemplos de tales CGTasas incluyen, por ejemplo, aquellas que son enzimas naturales o recombinantes derivadas de especies de los microorganismos mencionados. Por ejemplo, una CGTasa puede prepararse inoculando un medio de cultivo esterilizado con una especie adecuada de Bacillus y, a continuación, cultivando el medio inoculado, preferiblemente con aireación y agitación, a una temperatura de entre unos 20 °C y unos 90 °C durante un período de tiempo de entre 12 y 48 horas, filtrando el caldo de cultivo obtenido para separar las células de Bacillus, y concentrando además el permeado libre de células utilizando, por ejemplo, la ultrafiltración. Dichas enzimas también pueden utilizarse en combinación con una o más amilasas para licuar un almidón con el fin de proporcionar un donante de glucosa adecuado para su uso en la reacción de glicosilación. La(s) enzima(s) CGTasa(s) puede(n) estar en forma de un caldo de cultivo libre de células, un caldo de cultivo líquido concentrado libre de células, un caldo de cultivo libre de células secado por aspersión o liofilizado, o una proteína de gran pureza. Pueden utilizarse preparaciones enzimáticas libres, así como inmovilizadas. La CGTasa puede inmovilizarse en un soporte adecuado (por ejemplo, por atrapamiento en gel, adsorción o enlace covalente). Una CGTasa adecuada también puede producirse según un procedimiento en el que se aísla un gen de CGTasa de un microorganismo seleccionado (por ejemplo, una especie o cepa de Thermoanaerobacter) y se clona en un microorganismo huésped adecuado, como E. coli, en el que se expresa la CGTasa. Existen CGTasas adecuadas disponibles en fuentes comerciales como, por ejemplo, Novozymes y Amano.

[0026] La enzima CGTasa puede cultivarse o derivarse de un organismo no alcalófilo (es decir, un organismo que no es un organismo alcalófilo, lo que se entiende como un organismo que presenta un crecimiento óptimo a un pH de 9 o superior). Por consiguiente, la enzima CGTasa se cultiva preferiblemente o se deriva de un organismo que presenta un crecimiento óptimo a un pH inferior a 9. La enzima CGTasa puede cultivarse o derivarse de una cepa de Thermoanaerobacter, como Thermoanaerobacter sp. ATCC53627. Por consiguiente, una CGTasa de Thermoanaerobacter, como la enzima CGTasa vendida con la marca Toruzyme® 3.0 L por Novozymes, se emplea preferiblemente en la reacción de glicosilación. La glicosilación de una composición inicial de glicósidos de esteviol puede llevarse a cabo utilizando una CGTasa con una secuencia de aminoácidos al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 % o incluso el 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la CGTasa que tiene el número de acceso al GenBank Z35484 (véase Joergensen et al, Cloning and nucleotide sequence of a thermostable cyclodextrin glycosyltransferase gene from Thermoanaerobacter sp. ATCC 53627 and its expression in Escherichia coli" Biotechnol. Lett. 19, 1027-1031 (1997)).

[0027] La literatura publicada anteriormente sobre la glicosilación del esteviósido utilizando CGTasas de Thermoanaerobacter, como la CGTasa Toruzyme® 3.0 L, mostró claramente que el pH óptimo para la glicosilación es de aproximadamente 5,5, con una marcada disminución del porcentaje de esteviósido convertido cuando el pH se incrementa a 7 (Li et al., "Transglycosylation of stevioside to improve the edulcorant quality by lower substitution using cornstarch hydrolyzate and CGTase" Food Chem. 138, 2013 2064-2069). Un pH óptimo similar fue encontrado por Mathew et al. como se informó en "Regioselective glycosylation of hydroquinone to a-arbutin by cyclodextrin glucanotransferase from Thermoanaerobacter sp. Biochem. Eng. J. 79, 2013, 187-193", quienes demostraron que un pH de alrededor de 5,5 es óptimo para múltiples sustratos con esta enzima. Además, cuando se utilizó para producir ciclodextrina a partir de almidón, se descubrió que Toruzyme® 3.0 L tiene un pH operativo óptimo de 5 con una disminución de la actividad cuando el pH se incrementa de un pH de 6 a 10. Así, en una amplia gama de reacciones, incluida la glicosilación de los glicósidos de esteviol, se ha demostrado que el pH óptimo esperado estaría en el rango de 5-6 para una CGTasa como Toruzyme® 3.0L. Por consiguiente, el hallazgo de los presentes inventores de que, de hecho, se consiguen ciertos beneficios al llevar a cabo una glicosilación de una composición de glicósidos de esteviol en un medio acuoso que tiene un pH de más de 7,5 a no más de 10 en presencia de una CGTasa como Toruzyme® 3.0 L y un donante de glucosa fue inesperado y no podría haberse predicho razonablemente basándose en los conocimientos previos en la materia. Estos beneficios pueden incluir, sin carácter limitativo, mejoras en el rendimiento (es decir, un mayor rendimiento del glicósido de esteviol glicosilado en un período de tiempo predeterminado), la calidad del sabor (es decir, la composición de glicósidos de esteviol glicosilados obtenida tiene mejores propiedades sensoriales) y/o el grado de glicosilación [es decir, la producción de una composición de glicósidos de esteviol glicosilados que tiene un mayor número de fracciones de glucosa añadidas al/a los glicósido(s) de esteviol inicial(es)].

[0028] La cantidad de CGTasa utilizada en la reacción de glicosilación puede ser de unas 0,02 a unas 10 unidades de CGTasa por gramo de donante de glucosa (en sólidos).

Condiciones de glicosilación

[0029] Como se ha mencionado anteriormente, la glicosilación de la composición inicial de glicósidos de esteviol se lleva a cabo mediante la puesta en contacto de la composición inicial de glicósidos de esteviol con el donante de glucosa en presencia de al menos una CGTasa en un medio acuoso. Se ha descubierto que el rendimiento de los productos glicosilados obtenidos en 24 horas puede aumentarse significativamente al proporcionar un pH algo básico al medio acuoso, por ejemplo, un pH superior a 7,5 pero no superior a 10, un pH de 8 a 10, un pH de 8 a 9 o un pH de aproximadamente 8,5. Este resultado fue sorprendente, ya que anteriormente lo tradicional era llevar a cabo la glicosilación catalizada por CGTasa de glicósidos de esteviol a valores de pH que eran ligeramente ácidos (por ejemplo, un pH de 5,5 a 6,5), particularmente cuando la CGTasa utilizada es una CGTasa no alcalófila como Toruzyme® 3.0 L. El pH del medio acuoso puede ajustarse al valor deseado mediante la utilización de cualquier base adecuada o la combinación de bases adecuadas; las bases adecuadas pueden incluir tanto bases débiles como fuertes. La base puede ser una base inorgánica (por ejemplo, un hidróxido de metal alcalino, carbonato o bicarbonato) o una base orgánica (por ejemplo, aminas orgánicas, bases conjugadas de ácidos orgánicos). La base o las bases pueden solubilizarse en el medio acuoso. El medio acuoso puede estar tamponado o no tamponado al pH básico seleccionado. Al menos una parte de la base que se necesita para dar el pH deseado al medio acuoso puede suministrarse por medio de la base presente en el producto de reacción obtenido al tratar con base una composición inicial de glicósidos de esteviol de acuerdo con el método B, como se describe en otra parte del presente documento. Es decir, una composición de glicósidos de esteviol tratada con base puede utilizarse como la composición inicial de glicósidos de esteviol en el método A.

[0030] El medio acuoso está compuesto por agua, aunque es posible que el medio acuoso esté compuesto adicionalmente por uno o más disolventes distintos del agua. Típicamente, dicho(s) disolvente(s) adicional(es), si está(n) presente(s), sería(n) miscible(s) con el agua y estaría(n) presente(s) en cantidades relativamente pequeñas en relación con la cantidad de agua (por ejemplo, la cantidad de disolvente distinto del agua puede ser menos del 20, menos del 10 o menos del 5 % en peso basándose en el peso total de agua y disolvente). El medio acuoso puede no contener ningún disolvente distinto del agua.

[0031] La temperatura a la que se lleva a cabo la reacción de glicosilación no se considera fundamental, pero típicamente la glicosilación se realiza dentro del rango de temperatura que va desde la temperatura ambiente (por ejemplo, 20 °C) hasta aproximadamente 95 °C. La temperatura de la reacción de glicosilación puede ser de aproximadamente 45 °C a aproximadamente 70 °C. La temperatura de la reacción de glicosilación puede ser de aproximadamente 45 °C a aproximadamente 55 °C. El contacto de los reactivos se lleva a cabo durante un período de tiempo eficaz para lograr una conversión deseada de los glicósidos de esteviol iniciales en glicósidos de esteviol glicosilados. Por ejemplo, puede lograrse una conversión del 60 % al 85 % o del 65 % al 80 % de los glicósidos de esteviol iniciales; el grado de conversión puede controlarse fácilmente mediante métodos analíticos de HPLC y/o LC-MS. El contenido de glicósido de esteviol glicosilado y el contenido de glicósido de esteviol sin reaccionar en una composición de glicósidos de esteviol glicosilados (obtenida como producto de la reacción de glicosilación) pueden determinarse mediante los procedimientos descritos en las páginas 257-258 de la octava edición de las especificaciones y normas de Japón para los aditivos alimentarios, publicada en 2009 por el Ministerio de Sanidad, Trabajo y Bienestar.

[0032] En general, los tiempos de reacción de 1 a 250 horas o de 1 a 168 horas pueden ser adecuados, en función de la temperatura, la actividad de la CGTasa, la composición de la composición inicial de glicósidos de esteviol, la concentración de enzima y otros factores. El tiempo de reacción puede ser de aproximadamente 12 a aproximadamente 24 horas. Cuando la composición inicial de glicósidos de esteviol incluye esteviósido, por ejemplo, la mezcla de reacción obtenida puede ser una mezcla relativamente compleja de productos que están mono-, di-, tri- y más altamente glicosilados tanto en la unidad 19-O-glucosilo como en la unidad glucosilo terminal de la fracción 13-O-soforosilo.

[0033] La reacción de glicosilación puede llevarse a cabo en condiciones eficaces para lograr sólo una conversión parcial de los glicósidos de esteviol presentes en el material de partida. Por ejemplo, la reacción de glicosilación puede detenerse una vez aproximadamente el 60-85 % de los glicósidos de esteviol iniciales hayan reaccionado (es decir, se hayan glicosilado con una o más fracciones de glucosa), dejando aproximadamente un 15-40 % de glicósidos de esteviol iniciales sin reaccionar en la mezcla de reacción (donde la cantidad total de glicósido de esteviol glicosilado glicósido de esteviol sin reaccionar = 100 %). La glicosilación puede llevarse a cabo hasta que aproximadamente el 65-80 % de los glicósidos de esteviol iniciales hayan reaccionado (es decir, se hayan glicosilado con una o más fracciones de glucosa), dejando aproximadamente un 20-35 % de glicósidos de esteviol iniciales en la mezcla de reacción (donde la cantidad total de glicósido de esteviol glicosilado glicósido de esteviol sin reaccionar = 100 %).

[0034] La reacción de glicosilación puede llevarse a cabo mediante la utilización de entre aproximadamente un 4 y aproximadamente un 6 % en peso de composición inicial de glicósidos de esteviol y entre aproximadamente un 8 y aproximadamente un 12 % en peso de dextrina (siendo la relación de peso de dextrina y glicósido de esteviol inicial de entre aproximadamente 1,5:1 y aproximadamente 2,5:1) en agua (pH inicial de aproximadamente 8 a aproximadamente 8,4). Esta mezcla se incuba con CGTasa durante aproximadamente 0,5 a aproximadamente 30 horas a entre aproximadamente 40 °C y aproximadamente 60 °C para obtener un producto de reacción que contiene los glicósidos de esteviol glicosilados deseados. A continuación, se desactiva la enzima y se purifica el producto de reacción con resina adsorbente, filtración por carbón e intercambio iónico.

[0035] Una vez alcanzado el grado de conversión deseado (que puede determinarse mediante técnicas estándar de cromatografía líquida de alto rendimiento [HPLC] o de cromatografía líquida-espectrometría de masas [LC-MS]), el producto de reacción puede tratarse o procesarse adicionalmente. Por ejemplo, la CGTasa puede desactivarse (por ejemplo, mediante un tratamiento térmico, en el que el producto de reacción se calienta a una temperatura eficaz para dejar a la CGTasa inactiva con respecto a su capacidad de catalizar una mayor glicosilación). El producto de reacción puede tratarse además con base de acuerdo con el método C descrito en el presente documento. La composición de glicósidos de esteviol glicosilados puede tratarse con un tipo de enzima diferente adicional, en particular con una amilasa u otra enzima capaz de escindir los enlaces glucosa-glucosa (por ejemplo, una amilasa maltogénica, como una amilasa maltogénica derivada de Bacillus subtilis). Por ejemplo, una a-amilasa puede combinarse con el producto de la reacción de glicosilación y la mezcla resultante incubarse durante aproximadamente 6 a 24 horas a entre aproximadamente 55 °C y aproximadamente 95 °C, seguida de la desactivación de la a-amilasa (utilizando, por ejemplo, el calentamiento a un pH bajo). Una amilasa, como una amilasa maltogénica, puede combinarse con el producto de la reacción de glicosilación y la mezcla resultante incubarse durante unas 12 a 36 horas a una temperatura entre aproximadamente 25 °C y aproximadamente 40 °C. Dicho tratamiento enzimático adicional sirve para alterar el perfil de composición de la composición de glicósidos de esteviol glicosilados, lo que posiblemente conduce a mejoras adicionales en el perfil de sabor de la composición. La composición de glicósidos de esteviol glicosilados puede someterse adicional o alternativamente a una o más de las etapas de procesamiento adicionales descritas en el presente documento (por ejemplo, en la sección titulada "Purificación de las composiciones de glicósidos de esteviol glicosilados").

Método B

[0036] El método B proporciona un método de elaboración de una composición de glicósidos de esteviol glicosilados, que comprende a) poner en contacto una composición inicial de glicósidos de esteviol con un medio acuoso básico o una resina básica para obtener una composición de glicósidos de esteviol tratada con base y b) poner en contacto la composición de glicósidos de esteviol tratada con base, un donante de glucosa y una ciclodextrina glicosiltransferasa en un medio acuoso durante un tiempo eficaz para producir la composición de glicósidos de esteviol glicosilados. El método B puede ponerse en práctica en combinación con uno de entre el método A y el método C o con ambos pero, alternativamente, puede llevarse a cabo por sí mismo o en combinación con otras etapas de procesamiento conocidas en el ámbito de los glicósidos de esteviol glicosilados. Al tratar con base una composición inicial de glicósidos de esteviol de la manera que se indica en la presente memoria, el sabor de la composición de glicósidos de esteviol glicosilados obtenida a partir de la composición de glicósidos de esteviol puede mejorarse mediante la reducción de sabores no deseados, amargor, regusto prolongado y similares (lo que hace que el sabor de la composición de glicósidos de esteviol glicosilados se parezca más a la sacarosa) y/o mediante el aumento de la intensidad del dulzor de la composición de glicósidos de esteviol glicosilados.

[0037] La composición inicial de glicósidos de esteviol puede corresponder a cualquiera de las composiciones iniciales de glicósidos de esteviol mencionadas previamente en relación con el método A. No obstante, en ciertos aspectos del método B, la composición inicial de glicósidos de esteviol contiene al menos uno entre el rebaudiósido A y el esteviósido o tanto el rebaudiósido A como el esteviósido. Uno de entre el rebaudiósido A y el esteviósido, o ambos, puede(n) ser el/los glicósido(s) de esteviol predominante(s) (>50 % en peso, >60 % en peso, >70 % en peso, >80 % en peso, >90 % en peso) presente(s) en la composición inicial de glicósidos de esteviol. Por ejemplo, el rebaudiósido A y el esteviósido pueden comprender conjuntamente >50 % en peso, >60 % en peso, >70 % en peso, >80 % en peso, >90 % en peso del glicósido de esteviol presente en la composición inicial de glicósidos de esteviol.

[0038] El pH del medio acuoso básico puede ser superior a 7,5, al menos 8, o al menos 9 y no superior a 14. Por ejemplo, el medio acuoso básico puede presentar un pH de 8 a 14, de 9 a 14 o de aproximadamente 10 a aproximadamente 14. El pH del medio acuoso puede ajustarse al valor deseado utilizando cualquier base adecuada o combinación de bases adecuadas; las bases adecuadas pueden incluir tanto bases débiles como fuertes. La base puede ser una base inorgánica (por ejemplo, un hidróxido de metal alcalino, carbonato o bicarbonato) o una base orgánica. La base o las bases pueden solubilizarse en el medio acuoso. El medio acuoso puede estar tamponado o no tamponado al pH básico seleccionado.

[0039] Cuando la composición inicial de glicósidos de esteviol se pone en contacto con una resina básica, la resina básica puede ser, por ejemplo, una resina polimérica débilmente básica o (preferiblemente) fuertemente básica (por ejemplo, un poliestireno reticulado) que tiene grupos funcionales básicos (como grupos amino primarios, secundarios y/o terciarios o grupos de amonio cuaternario) unidos a la misma. Los sulfonatos de poliestireno reticulados (por ejemplo, poliestirenos reticulados con divinilbenceno y sulfonados), donde los grupos sulfonato contienen cationes de amonio cuaternario como el trimetilamonio, constituyen un tipo de resina fuertemente básica. La amina de polietileno es un ejemplo de resina débilmente básica adecuada. La composición inicial de glicósidos de esteviol puede disolverse en un medio acuoso cuando se pone en contacto con la resina básica.

[0040] La temperatura a la que se lleva a cabo el tratamiento con base de la composición inicial de glicósidos de esteviol no se considera fundamental, pero típicamente el tratamiento se realiza dentro del intervalo de temperaturas que va desde la temperatura ambiente (por ejemplo, 20 °C) hasta aproximadamente 100 °C. Por ejemplo, la temperatura del tratamiento con base puede ser de entre aproximadamente 40 °C y aproximadamente 60 °C. El tratamiento con base se lleva a cabo durante un período de tiempo eficaz para lograr una conversión deseada de los glicósidos de esteviol iniciales, que se cree que posiblemente implique la eliminación de una o más unidades de glucosa de los glicósidos de esteviol individuales (en particular, la eliminación de las unidades de glucosa en la posición C-19), convirtiéndolos así, al menos en parte, en otros glicósidos de esteviol. Por ejemplo, si el rebaudiósido A está presente en la composición inicial de glicósidos de esteviol, al menos una parte del rebaudiósido A puede convertirse en rebaudiósido B y, si el esteviósido está presente, al menos una parte del esteviósido puede convertirse en esteviolbiósido. Aparentemente, el rebaudiósido B y el esteviolbiósido son menos dulces que el rebaudiósido A y el esteviósido, respectivamente, caracterizándose el esteviolbiósido por presentar un perfil de sabor particularmente malo y un poder edulcorante bajo. Sin embargo, se acaba de descubrir que los productos de glicosilación de estos compuestos (rebaudiósido B y esteviolbiósido) son sorprendentemente más dulces que los productos de glicosilación obtenidos mediante la glicosilación de los glicósidos de esteviol «originales» respectivos (rebaudiósido A y esteviósido).

[0041] En términos generales, unos tiempos de reacción de entre 1 y 168 horas pueden ser adecuados, en función de la temperatura, el pH, la concentración de base, la identidad de la base y otros factores. Puede utilizarse hidróxido de sodio para ajustar el pH del medio acuoso a entre aproximadamente 13 y aproximadamente 14 y la mezcla se calienta a entre aproximadamente 40 °C y aproximadamente 60 °C durante entre aproximadamente 18 y aproximadamente 30 horas.

[0042] La composición de glicósidos de esteviol tratada con base así obtenida es sometida, a continuación, a glicosilación al reaccionar con un donante de glucosa adecuado en presencia de una CGTasa. Antes de la glicosilación, la composición de glicósidos de esteviol tratada con base puede someterse opcionalmente a una o más etapas de procesamiento o purificación, como la neutralización/acidificación, la precipitación y similares. Las CGTasas y los donantes de glucosa adecuados pueden ser cualquiera de los descritos anteriormente en relación con el método A. Las condiciones de glicosilación también pueden ser las mismas que las descritas anteriormente. El pH del medio acuoso puede ser superior a 7,5 (de acuerdo con el método A). Sin embargo, en otros aspectos, el pH del medio acuoso no es superior a 7,5 (por ejemplo, de 5,5 a 7,5 o de 5,5 a 6,5). La composición de glicósidos de esteviol glicosilados así obtenida como producto de reacción puede someterse posteriormente a una o más etapas de procesamiento y/o purificación adicionales, como se describe en otra parte del presente documento o como puede ser conocido en la técnica, para proporcionar un producto final adecuado para su uso como ingrediente en composiciones consumibles.

Método C

[0043] También se proporciona un método para mejorar una o más características sensoriales de una composición de glicósidos de esteviol glicosilados, que comprende poner en contacto la composición de glicósidos de esteviol glicosilados con un medio acuoso básico o una resina básica. Este método puede ponerse en práctica mediante la utilización de cualquier composición de glicósidos de esteviol glicosilados, es decir, cualquier composición obtenida al someter una composición de glicósidos de esteviol a una reacción de glicosilación. Por ejemplo, la composición de glicósidos de esteviol glicosilados puede ser una composición de glicósidos de esteviol glicosilados producida de acuerdo con el método A o una composición de glicósidos de esteviol glicosilados producida mediante la glicosilación de una composición de glicósidos de esteviol tratados con base producida de acuerdo con el método B. Alternativamente, la composición de glicósidos de esteviol glicosilados que se trata con base puede prepararse mediante la utilización de cualquier otro método de glicosilación conocido en la técnica. Mediante el procesamiento que se describe en la presente memoria, puede mejorarse el sabor de la composición de glicósidos de esteviol glicosilados mediante la reducción de sabores no deseados, amargor, regusto prolongado y similares (lo que hace que el sabor de la composición de glicósidos de esteviol glicosilados se parezca más a la sacarosa) y/o mediante el aumento de la intensidad del dulzor de la composición de glicósidos de esteviol glicosilados.

[0044] El pH del medio acuoso básico puede ser superior a 7,5, al menos 8 o al menos 9, o al menos 10 e inferior a 14. Por ejemplo, el medio acuoso básico puede presentar un pH de entre 8 y 14 o entre 8,5 y 12, o entre 9 y 11 o de aproximadamente 10. El pH del medio acuoso puede ajustarse al valor deseado utilizando cualquier base adecuada o combinación de bases adecuadas; las bases adecuadas pueden incluir tanto bases débiles como fuertes. La base puede ser una base inorgánica (por ejemplo, un hidróxido de metal alcalino, carbonato o bicarbonato) o una base orgánica. La base o las bases pueden solubilizarse en el medio acuoso. El medio acuoso puede estar tamponado o no tamponado al pH básico seleccionado.

[0045] Cuando la composición de glicósidos de esteviol glicosilados se pone en contacto con una resina básica, la resina básica puede, por ejemplo, ser una resina polimérica débilmente básica o fuertemente básica (p. ej., un poliestireno reticulado) que tiene grupos funcionales básicos (como grupos amino primarios, secundarios y/o terciarios o grupos de amonio cuaternario) unidos a la misma. Los sulfonatos de poliestireno reticulados (por ejemplo, poliestirenos reticulados con divinilbenceno y sulfonados), donde los grupos sulfonato contienen cationes de amonio cuaternario como el trimetilamonio, constituyen un tipo de resina fuertemente básica. La amina de polietileno es un ejemplo de resina débilmente básica adecuada. La composición de glicósidos de esteviol glicosilados puede disolverse en un medio acuoso cuando se pone en contacto con la resina básica.

[0046] La temperatura a la que se lleva a cabo el tratamiento con base de la composición de glicósidos de esteviol glicosilados no se considera fundamental, pero típicamente el tratamiento se lleva a cabo dentro del rango de temperatura que va desde la temperatura ambiente (por ejemplo, 20 °C) hasta aproximadamente 100 °C. Por ejemplo, la temperatura puede ser de entre aproximadamente 40 °C y aproximadamente 60 °C o aproximadamente 50 °C. El tratamiento con base se lleva a cabo durante un período de tiempo eficaz para lograr una conversión deseada de los glicósidos de esteviol glicosilados iniciales, que se cree que posiblemente implique la conversión del rebaudiósido A glicosilado o del esteviósido glicosilado en rebaudiósido B glicosilado o en esteviolbiósido glicosilado, respectivamente, y/o el acortamiento de las cadenas de glucosa añadidas en los productos de glicósidos de esteviol glicosilados. En términos generales, unos tiempos de reacción de entre 1 y 168 horas pueden ser adecuados (p. ej., entre aproximadamente 12 y aproximadamente 36 horas o entre aproximadamente 18 y aproximadamente 30 horas), en función de la temperatura, el pH, la concentración de base, la identidad de la base y otros factores. Por ejemplo, cuando se utiliza hidróxido de sodio como base y el medio acuoso presenta un pH de entre aproximadamente 9 y aproximadamente 11, la temperatura de reacción puede oscilar entre aproximadamente 40 °C y aproximadamente 60 °C y el tiempo de reacción puede oscilar entre aproximadamente 18 y aproximadamente 30 horas.

[0047] La composición de glicósidos de esteviol glicosilados así obtenida como producto de reacción puede someterse posteriormente a una o más etapas de procesamiento y/o purificación adicionales, como se describe en otra parte del presente documento o como puede ser conocido en la técnica, para proporcionar un producto final adecuado para su uso como ingrediente en composiciones consumibles.

Purificación de las composiciones de glicósidos de esteviol glicosilados

[0048] Las composiciones de glicósidos de esteviol glicosilados preparadas de acuerdo con cualquiera de los métodos divulgados en la presente memoria pueden procesarse y/o purificarse aún más antes de ser incorporadas o utilizadas como ingredientes en alimentos, bebidas, productos cosméticos y farmacéuticos, como se describirá posteriormente con más detalle.

[0049] Las técnicas de purificación/procesamiento adecuadas incluyen, sin carácter limitativo, la desactivación de enzima, la neutralización u otro ajuste del pH, la filtración, la esterilización, la decoloración, la desalación, el fraccionamiento mediante cromatografía y similares, el secado, la concentración, la precipitación, la cristalización, el tratamiento con adsorbentes (por ejemplo, adsorbentes poliméricos como los adsorbentes macroporosos y las resinas hidrofóbicas, el carbón activado), el tratamiento con resinas de intercambio iónico y similares y combinaciones de los mismos. Si la composición de glicósidos de esteviol glicosilados se obtiene en forma de solución acuosa (p. ej., un jarabe), puede emplearse como tal o convertirse, opcionalmente, en forma seca, como mediante secado por pulverización. La composición de glicósidos de esteviol glicosilados puede combinarse con uno o más componentes distintos (p. ej., un edulcorante u otro modificador del sabor) antes o después de secarse.

[0050] Las composiciones de glicósidos de esteviol glicosilados de la presente exposición pueden procesarse y/o purificarse utilizando uno o más de los métodos mencionados anteriormente, de modo que su contenido de glicósidos de esteviol [incluyendo tanto el/los glicósido(s) de esteviol inicial(es) sin reaccionar, si lo(s) hubiera, como los productos de glicosilación del/de los glicósido(s) de esteviol inicial(es)] sea al menos del 50 %, al menos del 60 %, al menos del 70 %, al menos del 80 %, al menos del 90 %, al menos del 95 % o al menos del 99 %, en peso seco. La composición de glicósidos de esteviol glicosilados de acuerdo con la invención comprende glicósidos de esteviol y glicósidos de esteviol glicosilados en una cantidad total de al menos el 85 % de la composición, en peso seco. La cantidad de glicósidos de esteviol glicosilados producida puede cuantificarse mediante la medición de la reducción de la cantidad de glicósidos de esteviol iniciales utilizando HPLC.

[0051] En función de las condiciones de procesamiento/purificación adicional empleadas, la composición de glicósidos de esteviol glicosilados obtenida puede contener cierta cantidad de donante de glucosa residual y/o productos de hidrato de carbono obtenidos a partir del donante de glucosa (como las maltodextrinas, donde el donante de glucosa era un almidón). La composición puede, adicional o alternativamente, contener una parte de los glicósidos de esteviol presentes en la composición inicial de glicósidos de esteviol (p. ej., glicósidos de esteviol sin reaccionar).

[0052] La composición de glicósidos de esteviol glicosilados de acuerdo con la invención puede procesarse y/o purificarse para proporcionar una composición destinada o adecuada para su uso como ingrediente en un artículo consumible (por ejemplo, un producto alimenticio o de bebida) como edulcorante y/o aromatizante. Por ejemplo, dicha composición de glicósidos de esteviol glicosilados puede comprender de un 15 % en peso a un 40 % en peso de glicósido de esteviol sin reaccionar y de un 60 % en peso a un 85 % en peso de glicósido de esteviol glicosilado sobre una base de materia seca, donde el peso total de glicósido de esteviol sin reaccionar y de glicósido de esteviol glicosilado es al menos el 90 %, en peso seco, del peso total de la composición de glicósidos de esteviol glicosilados. Alternativamente, la composición de glicósidos de esteviol glicosilados según la invención puede estar compuesta por un 20 % en peso a un 35 % en peso de glicósido de esteviol sin reaccionar y un 65 % en peso a un 80 % en peso de glicósido de esteviol glicosilado sobre una base de materia seca, donde el peso total de glicósido de esteviol sin reaccionar y de glicósido de esteviol glicosilado es al menos el 95 %, en peso seco, del peso total de la composición de glicósidos de esteviol glicosilados.

[0053] La composición de glicósidos de esteviol glicosilados según la presente invención contiene rebaudiósido B glicosilado, esteviolbiósido glicosilado, esteviolbiósido y rebaudiósido B. Estos componentes juntos comprenden del 5 al 50 % o, por ejemplo, del 10 al 25 %, en peso seco, de la composición de glicósidos de esteviol glicosilados según la presente invención. El resto de la composición de glicósidos de esteviol glicosilados puede estar compuesto predominantemente o en su totalidad por uno o más glicósidos de esteviol y glicósidos de esteviol glicosilados distintos del rebaudiósido B glicosilado, el esteviolbiósido glicosilado, el esteviolbiósido y el rebaudiósido B (p. ej., rebaudiósido A, rebaudiósido C, rebaudiósido D, rebaudiósido E, rebaudiósido F, rebaudiósido I, rebaudiósido H, rebaudiósido L, rebaudiósido K, rebaudiósido J, rebaudiósido M (también denominado rebaudiósido X), rebaudiósido N, rebaudiósido O, dulcósido A, dulcósido B, rubusósido, esteviósido y sus derivados glicosilados). La cantidad total de glicósidos de esteviol y de glicósidos de esteviol glicosilados en la composición de glicósidos de esteviol glicosilados según la presente invención es de al menos el 85 %, por ejemplo, de al menos el 90 % o de al menos el 95 % de la composición de glicósidos de esteviol glicosilados, en peso seco. Además de los glicósidos de esteviol glicosilados y glicósidos de esteviol mencionados anteriormente, la composición de glicósidos de esteviol glicosilados puede comprender una cantidad relativamente menor de donante de glucosa residual y/o productos de hidrato de carbono obtenidos a partir del donante de glucosa (por ejemplo, hasta el 5 o hasta el 10 % en total de donante de glucosa residual y/o productos de hidrato de carbono obtenidos a partir del donante de glucosa, en peso seco). Se ha comprobado que las composiciones de glicósidos de esteviol glicosilados descritas anteriormente poseen propiedades sensoriales especialmente favorables.

Explicación adicional de etapas de proceso ilustrativas

[0054] En la figura 1, se muestra, de forma esquemática, una serie de etapas de procesamiento que pueden realizarse para convertir una composición inicial de glicósidos de esteviol en una composición de glicósidos de esteviol glicosilados adecuada para su uso (por ejemplo, como edulcorante o aromatizante) en un producto consumible como un producto alimenticio, de bebida, cosmético o farmacéutico. La numeración de las etapas individuales de la figura 1 se proporciona con fines de referencia únicamente y no pretende implicar que dichas etapas se hayan de realizar en orden numérico ni que todas las etapas indicadas se hayan de realizar necesariamente. No obstante, al menos una entre la etapa 1 (método B), la etapa 3 (método A) o la etapa 8 (método C) se lleva a cabo.

[0055] En la etapa 1, una composición inicial de glicósidos de esteviol puede someterse opcionalmente a un tratamiento con base, de acuerdo con el método B. La composición de glicósidos de esteviol tratada con base puede, a continuación, ponerse en contacto con un donante de glucosa en presencia de una CGTasa en condiciones eficaces para glicosilar al menos una parte de los glicósidos de esteviol presentes en la composición de glicósidos de esteviol tratada con base (etapas 3 y 4). Se ha comprobado que dicho tratamiento con base ayuda a mejorar una o más características sensoriales de la composición de esteviol glicosilada finalmente obtenida, al menos cuando ciertos tipos de glicósidos de esteviol están presentes en la composición inicial de glicósidos de esteviol. Alternativamente (no se muestra en la figura 1), la reacción de glicosilación puede llevarse a cabo utilizando una composición inicial de glicósidos de esteviol que no haya sido tratada con una base de acuerdo con el método B. En la etapa 3, correspondiente al método A, la glicosilación se lleva a cabo utilizando un medio acuoso con un pH superior a 7,5 (por ejemplo, un pH de al menos 8). Se ha descubierto que la glicosilación en dichas condiciones de pH más altas conduce a mejoras en el rendimiento, la calidad del sabor y/o el grado de glicosilación. Alternativamente, como se muestra en la etapa 4, pueden emplearse condiciones de pH convencionales (p. ej., pH = 5,5 -7,5).

[0056] El donante de glucosa utilizado en la etapa 3 o 4 puede ser un oligosacárido o polisacárido sin modificar o sin tratar como la dextrina o el almidón. No obstante, puede resultar ventajoso, como se muestra en la etapa 2, tratar previamente el donante de glucosa al someterlo a una etapa de licuefacción en la que se pone en contacto con amilasa o una mezcla de amilasa y CGTasa, seguido de la inactivación de la amilasa (mediante tratamiento térmico a pH bajo, por ejemplo).

[0057] Una vez que la reacción de glicosilación de la etapa 3 o 4 ha alcanzado el grado deseado de conversión de la composición inicial de glicósidos de esteviol (que puede controlarse mediante HPLC o LC-MS una vez que se ha establecido una especificación, determinándose la especificación mediante el análisis organoléptico del producto obtenido), la CGTasa puede inactivarse mediante tratamiento térmico u otro medio adecuado (etapa 5). A continuación, el producto de reacción así obtenido puede someterse directamente a la purificación (etapa 9) para proporcionar una composición de glicósidos de esteviol glicosilados adecuada para su uso en consumibles, como se ha descrito en la presente memoria. Alternativamente, como se ilustra en la etapa 8, el producto de reacción puede tratarse con base de acuerdo con el método C, antes de la etapa 9 de purificación. En una variante más (etapa 6), el producto de reacción que contiene glicósidos de esteviol glicosilados puede ponerse en contacto con una amilasa u otra enzima que escinde el enlace glucosa-glucosa en condiciones eficaces para provocar la escisión de al menos ciertos enlaces glucosa-glucosa presentes en los glicósidos de esteviol glicosilados, de tal forma que se alteran los tipos y/o las cantidades relativas de glicósidos de esteviol glicosilados individuales presentes en el producto de reacción. A continuación, la amilasa u otra enzima puede ser inactivada (etapa 7) antes de la purificación adicional del producto de reacción (etapa 9).

[0058] Las etapas de procesamiento descritas en la presente memoria pueden combinarse y llevarse a cabo de acuerdo con el siguiente flujo de procesos ilustrativo:

I) . Tratamiento con base de una composición inicial de glicósidos de esteviol (opcional si se lleva a cabo III o VII).

II) . Tratamiento de dextrina u otro donante de glucosa con amilasa y CGTasa (opcional).

III) . Poner en contacto la composición inicial de glicósidos de esteviol (que puede tratarse con base o no) con CGTasa y donante de glucosa a pH >7,5 (también puede llevarse a cabo a pH <7,5 si se lleva a cabo I o VII). IV) . Inactivación de CGTasa (mediante tratamiento térmico, por ejemplo).

V) . Poner en contacto la composición de glicósidos de esteviol glicosilados con una amilasa u otra enzima que escinde el enlace glucosa-glucosa (opcional).

VI) . Inactivación de amilasa u otra enzima (mediante calentamiento, por ejemplo).

VII) . Tratamiento con base de composición de glicósidos de esteviol glicosilados (opcional si se lleva a cabo I o III).

VIII) . Purificación de la composición de glicósidos de esteviol glicosilados (mediante tratamiento con carbón activado, resina de intercambio iónico y/o resina hidrofóbica y/u otros métodos para eliminar impurezas).

Usos de las composiciones de glicósidos de esteviol g licosilados

[0059] Las composiciones de glicósidos de esteviol glicosilados preparadas de acuerdo con los métodos expuestos en la presente memoria pueden utilizarse como ingredientes o componentes de productos que se pretende consumir, incluidos, por ejemplo, los alimentos, las bebidas, los productos cosméticos (de cuidado personal) y los productos farmacéuticos. Las composiciones de glicósidos de esteviol glicosilados son, por ejemplo, útiles como edulcorantes y/o modificadores o potenciadores del sabor, ya sea como único ingrediente edulcorante o modificador del sabor o en combinación con otros edulcorantes y/o modificadores del sabor.

[0060] Algunos edulcorantes adecuados que pueden utilizarse en combinación con las composiciones de glicósidos de esteviol glicosilados incluyen edulcorantes tanto naturales como sintéticos, edulcorantes nutritivos y no nutritivos, así como edulcorantes de alta intensidad y baja intensidad. Los edulcorantes pueden seleccionarse, entre otros, del grupo que consiste en sacarosa, gliceraldehído, dihidroxiacetona, eritrosa, treosa, eritrulosa, lixosa, ribosa, xilosa, ribulosa xilulosa, alosa, altrosa, galactosa, glucosa, gulosa, idosa, manosa, talosa, fructosa, alulosa (psicosa), sorbosa, tagatosa, manoheptulosa, sedoheptulosa, octolosa, fucosa, ramnosa, arabinosa, turanosa, sialosa, rebaudiósido A, rebaudiósido B, rebaudiósido C, rebaudiósido D, rebaudiósido E, rebaudiósido F, rebaudiósido I, rebaudiósido H, rebaudiósido L, rebaudiósido K, rebaudiósido J, rebaudiósido M (también denominado rebaudiósido X), rebaudiósido N, rebaudiósido O, dulcósido A, dulcósido B, rubusósido, extractos de Stevia, esteviósido, mogrósido IV, mogrósido V, extractos de Luo Han Guo, siamenosido, monatina y sus sales (monatina SS, RR, RS, SR), curculina, ácido glicirrícico y sus sales, taumatina, monelina, mabinlina, brazzeína, hernandulcina, filodulcina, glicifilina, floridzina, trilobatina, baiyunósido, osladina, polipodósido A, pterocariósido A, pterocariósido B, mukuroziósido, flomisósido I, periandrina I, abrusósido A, esteviolbiósido y ciclocariosido I, alcoholes de azúcar como el eritritol, la sucralosa, el acesulfamo de potasio, el ácido de acesulfamo y sus sales, el aspartamo, el alitamo, la sacarina y sus sales, la dihidrocalcona de neohesperidina, el ciclamato, el ácido ciclámico y sus sales, el neotamo, el advantamo, los glicósidos de esteviol glucosilados (GSG, por sus siglas en inglés) preparados mediante métodos distintos de los descritos en la presente memoria y sus combinaciones.

[0061] Las composiciones de glicósidos de esteviol glicosilados pueden combinarse con una cantidad de rebaudiósido B eficaz para mejorar las características de gusto y sabor de la composición de glicósidos de esteviol glicosilados.

[0062] Se ha descubierto que la combinación de rebaudiósido B con una composición de glicósidos de esteviol glicosilados (p. ej., una composición de glicósidos de esteviol obtenida de acuerdo con la presente invención) puede mejorar significativamente las propiedades hedonistas de la composición de glicósidos de esteviol glicosilados. Preferiblemente, la composición de glicósidos de esteviol glicosilados es una composición que se ha producido de acuerdo con el método A (el aspecto de la invención en el que se ponen en contacto una composición inicial de glicósidos de esteviol, un donante de glucosa y una ciclodextrina glicosiltransferasa en un medio acuoso con un pH superior a 7,5 pero inferior a 10). En una realización de la invención, se proporciona una composición edulcorante que comprende, consiste esencialmente o consiste en la composición de glicósidos de esteviol glicosilados de la invención y del 2 al 8 % en peso de rebaudiósido B, preferiblemente al menos el 3 % en peso de rebaudiósido B, basándose en el peso seco total de la composición de glicósidos de esteviol glicosilados y rebaudiósido B. La composición de glicósidos de esteviol glicosilados puede contener menos del 2 %, menos del 1 % o menos del 0,5 % de rebaudiósido B, en peso seco. La composición edulcorante puede contener, en diversas realizaciones, no más del 7 % en peso, no más del 6 % en peso, o no más del 5 % en peso de rebaudiósido B, basándose en el peso seco total de la composición de glicósidos de esteviol glicosilados y rebaudiósido B. Por ejemplo, la composición edulcorante puede contener del 3 al 6 % en peso o aproximadamente el 4 % en peso de rebaudiósido B, basándose en el peso total de la composición de glicósidos de esteviol glicosilados y rebaudiósido B.

[0063] También pueden obtenerse composiciones edulcorantes ventajosamente mejoradas combinando composiciones de glicósidos de esteviol glicosilados elaboradas de acuerdo con diferentes aspectos de la presente divulgación.

[0064] Por ejemplo, el rendimiento sensorial de una composición de glicósidos de esteviol glicosilados elaborada mediante la puesta en contacto de una composición inicial de glicósidos de esteviol, un donante de glucosa y una ciclodextrina glicosiltransferasa en un medio acuoso con un pH superior a 7,5 e inferior a 10, pero sin tratamiento con base de la composición inicial de glicósidos de esteviol antes o después de la glicosilación ("Composición de GSG tipo A"), puede mejorarse mediante la combinación de dicha composición con una composición de glicósidos de esteviol glicosilados elaborada mediante a) la puesta en contacto de una composición inicial de glicósidos de esteviol con un medio acuoso básico o una resina básica para obtener una composición de glicósidos de esteviol tratada con base y b) la puesta en contacto de la composición de glicósidos de esteviol tratada con base, un donante de glucosa y una ciclodextrina glicosiltransferasa en un medio acuoso (con cualquier pH adecuado, por ejemplo, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 10; puede obtenerse un mayor rendimiento de la composición de esteviol glicosilado a un pH algo básico, por ejemplo, un pH de entre aproximadamente 8 y aproximadamente 9) ("Composición de GSG tipo B"). Los beneficios de dichas mezclas son particularmente evidentes en concentraciones relativamente elevadas de la composición edulcorante en un producto consumible (p. ej., al menos 1000 ppm de glicósido de esteviol glicosilado total). La cantidad de composición de GSG tipo B en la composición edulcorante puede ser de al menos el 5 % en peso y no más del 50 % en peso (o no más del 35 % en peso), basándose en el peso seco total de la composición de GSG tipo A y de la composición de GSG tipo B. Correspondientemente, la cantidad de composición de GSG tipo A en la composición edulcorante puede ser de al menos el 50 % en peso y no más del 95 % en peso (o no más del 65 % en peso), basándose en el peso seco total de la composición de GSG tipo A y de la composición de GSG tipo B.

[0065] En otro ejemplo, el rendimiento sensorial de una composición de glicósidos de esteviol glicosilados elaborada mediante la puesta en contacto de una composición inicial de glicósidos de esteviol, un donante de glucosa y una ciclodextrina glicosiltransferasa en un medio acuoso con un pH superior a 7,5 e inferior a 10, pero sin tratamiento con base de la composición inicial de glicósidos de esteviol antes o después de la glicosilación ("Composición de GSG tipo A"), puede mejorarse mediante la combinación de dicha composición con una composición de glicósidos de esteviol glicosilados elaborada mediante la puesta en contacto de una composición de glicósidos de esteviol glicosilados con un medio acuoso básico o una resina básica ("Composición de GSG tipo C"). Los beneficios de dichas mezclas son particularmente evidentes en concentraciones relativamente elevadas de la composición edulcorante en un producto consumible (p. ej., al menos 1000 ppm de glicósido de esteviol glicosilado total). La cantidad de composición de GSG tipo C en la composición edulcorante puede ser de al menos el 5 % en peso y no más del 50 % en peso, basándose en el peso seco total de la composición de GSG tipo A y de la composición de GSG tipo C. Correspondientemente, la cantidad de composición de GSG tipo A en la composición edulcorante puede ser de al menos el 50 % en peso y no más del 95 % en peso, basándose en el peso seco total de la composición de GSG tipo A y de la composición de GSG tipo C.

[0066] Se proporciona una composición edulcorante que comprende, consiste esencialmente o consiste en:

a) entre aproximadamente un 10 y aproximadamente un 25 (o entre aproximadamente un 15 y aproximadamente un 20) % en peso, sobre una base de materia seca, de una composición de glicósidos de esteviol glicosilados tratada con base, preparada de acuerdo con el método C de la invención, donde la composición de glicósidos de esteviol glicosilados se ha obtenido mediante glicosilación de una composición inicial de glicósidos de esteviol compuesta por (en peso seco) un 25-30 % de esteviósido, un 55-65 % de rebaudiósido A y otros glicósidos de esteviol, con un contenido total de glicósidos de esteviol de al menos el 95 %, o una composición inicial de glicósidos de esteviol compuesta por (en peso seco) un 55-65 % de rebaudiósido A, un 20-30 % de esteviósido y de un 3 a un 8 % en total de rebaudiósido C y dulcósido A, con un contenido total de glicósidos de esteviol de al menos el 90 %;

b) entre aproximadamente un 65 y aproximadamente un 90 (o entre aproximadamente un 70 y aproximadamente un 85) % en peso, sobre una base de materia seca, de una composición de glicósidos de esteviol glicosilados que no ha sido tratada con base de acuerdo con el método C de la invención, donde la composición de glicósidos de esteviol glicosilados se ha obtenido mediante glicosilación de una composición inicial de glicósidos de esteviol compuesta por (en peso seco) un 25-30 % de esteviósido, un 55-65 % de rebaudiósido A y otros glicósidos de esteviol, con un contenido total de glicósidos de esteviol de al menos el 95 %, o una composición inicial de glicósidos de esteviol compuesta por (en peso seco) un 55-65 % de rebaudiósido A, un 20-30 % de esteviósido y de un 3 a un 8 % en total de rebaudiósido C y dulcósido A, con un contenido total de glicósidos de esteviol de al menos el 90 %; y

c) entre un 0 y aproximadamente un 10 (o entre un 0 y aproximadamente un 5) % en peso en total, sobre una base de materia seca, de donante de glucosa residual y/o productos de hidrato de carbono obtenidos a partir del donante de glucosa.

[0067] Se proporciona una composición edulcorante adicional, que comprende, consiste esencialmente o consiste en:

a) entre aproximadamente un 10 y aproximadamente un 25 (o entre aproximadamente un 15 y aproximadamente un 20) % en peso, sobre una base de materia seca, de una composición de glicósidos de esteviol glicosilados preparada de acuerdo con el método A de la invención, donde la composición de glicósidos de esteviol glicosilados se ha obtenido mediante el tratamiento con base de una composición inicial de glicósidos de esteviol compuesta por (en peso seco) un 25-30 % de esteviósido, un 55-65 % de rebaudiósido A y otros glicósidos de esteviol, con un contenido total de glicósidos de esteviol de al menos el 95 %, o una composición inicial de glicósidos de esteviol compuesta por (en peso seco) un 55-65 % de rebaudiósido A, un 20-30 % de esteviósido y de un 3 a un 8 % en total de rebaudiósido C y dulcósido A, con un contenido total de glicósidos de esteviol de al menos el 90 % para obtener una composición inicial de glicósidos de esteviol tratada con base que, a continuación, se glicosila;

b) entre aproximadamente un 65 y aproximadamente un 90 (o entre aproximadamente un 70 y aproximadamente un 85) % en peso, sobre una base de materia seca, de una composición de glicósidos de esteviol glicosilados obtenida mediante glicosilación de una composición inicial de glicósidos de esteviol compuesta por (en peso seco) un 25-30 % de esteviósido, un 55-65 % de rebaudiósido A y otros glicósidos de esteviol, con un contenido total de glicósidos de esteviol de al menos el 95 %, o una composición inicial de glicósidos de esteviol compuesta por (en peso seco) un 55-65 % de rebaudiósido A, un 20-30 % de esteviósido y de un 3 a un 8 % en total de rebaudiósido C y dulcósido A, con un contenido total de glicósidos de esteviol de al menos el 90 %, donde la composición inicial de glicósidos de esteviol no ha sido tratada con base antes de la glicosilación; y

[0068] Un aspecto de la presente invención proporciona un producto alimenticio que comprende una composición de glicósidos de esteviol glicosilados de acuerdo con la invención o una combinación de dichas composiciones de glicósidos de esteviol glicosilados, por lo general en combinación con al menos un ingrediente alimenticio adicional. Opcionalmente, pueden utilizarse uno o más glicósidos de esteviol individuales, incluido el rebaudiósido B en concreto, en combinación con dicha(s) composición(es) de glicósidos de esteviol glicosilados. Por ejemplo, el producto alimenticio puede comprender entre un 1 y un 10 % en peso, entre un 2 y un 8 % en peso, entre un 3 y un 6 % en peso o aproximadamente un 4 % en peso de rebaudiósido B además de dicha composición de glicósidos de esteviol glicosilados, basándose en el peso seco total de rebaudiósido B y composición de glicósidos de esteviol glicosilados. La cantidad de composición de glicósidos de esteviol glicosilados en el producto alimenticio puede variar según se desee para lograr un resultado concreto deseado, como, por ejemplo, un aumento del dulzor y/o una mejora del sabor. Por ejemplo, el producto alimenticio puede comprender una composición de glicósidos de esteviol glicosilados en una cantidad subedulcorante o una cantidad edulcorante. La concentración de composición de glicósidos de esteviol glicosilados en el producto alimenticio, en peso seco, puede ser de entre 5 y 2000 ppm. En otras realizaciones, el producto alimenticio contiene una cantidad de composición de glicósidos de esteviol glicosilados eficaz para dar un SEV de al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10, o al menos 11 al producto alimenticio, pero por lo general, no más de 20 o 15, donde el producto alimenticio puede contener adicionalmente uno o más edulcorantes distintos que también contribuyen al SEV. La composición de glicósidos de esteviol glicosilados puede añadirse a un producto alimenticio que también contiene uno o más edulcorantes distintos en una cantidad eficaz para aumentar el SEV del producto alimenticio a al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10 o al menos 11, de tal forma que se proporciona un producto alimenticio con un dulzor predeterminado deseado. En consecuencia, el producto alimenticio puede presentar, en diversas realizaciones de la invención, un SEV de 1-20, 5-15 o 7-13.

[0069] Entre los ejemplos no limitativos de un producto alimenticio se incluye un producto de confitería (incluyendo, sin carácter limitativo, los caramelos de gelatina, los caramelos duros y los chicles), un producto de postre como el yogur (incluyendo, sin carácter limitativo, los yogures lácteos con toda la grasa, con poca grasa y sin grasa, así como los yogures no lácteos y sin lactosa y los equivalentes congelados de todos ellos), los postres congelados (incluyendo, sin carácter limitativo, los postres lácteos congelados como el helado -incluido el helado normal, el helado de crema y todos los demás tipos de helados- y postres congelados no lácteos, como helados no lácteos, sorbetes y similares), productos de panadería dulces (incluyendo, sin carácter limitativo, magdalenas, pasteles, bollos, tartas, y galletas), mezclas de panadería dulces ya preparadas para elaborar productos de panadería dulces, rellenos de tartas (incluyendo, sin carácter limitativo, rellenos de tartas de frutas y rellenos de tartas de frutos secos, como el relleno de tartas de nueces pecanas), un producto de cereal como los cereales azucarados para el desayuno (incluyendo, sin carácter limitativo, los cereales extruidos para el desayuno, los cereales en copos para el desayuno y los cereales inflados para el desayuno), composiciones de recubrimiento de cereales, alimentos horneados incluidos los productos de panadería (incluyendo, sin carácter limitativo, los panes leudados y los panes ácimos, los panes con levadura y sin levadura, como los panes de soda, los panes que comprenden cualquier tipo de harina de trigo, los panes que comprenden cualquier tipo de harina que no sea de trigo (como las harinas de patata, arroz y centeno), panes sin gluten), mezclas de pan ya preparadas para elaborar productos de panadería, productos lácteos congelados, carnes, productos lácteos, condimentos, barritas para picar (incluyendo, sin carácter limitativo, las barritas de cereales, frutos secos, semillas y/o frutas), sopas, aderezos, mezclas, alimentos preparados, alimentos para bebés, preparados dietéticos, jarabes, recubrimientos alimentarios, fruta deshidratada, salsas, jugos de carne, pastas para untar (incluyendo, sin carácter limitativo, mermeladas/jaleas, mantequillas y otras conservas y confituras para untar, y similares). Otros tipos de productos alimenticios no mencionados aquí pero que incluyen, convencionalmente, uno o más edulcorantes nutritivos pueden contemplarse en el contexto de la presente invención, especialmente aquellos productos con contenido en azúcar reducido o con poco azúcar. El producto alimenticio puede ser un producto destinado a la alimentación animal, como un alimento para animales domésticos. El producto alimenticio de la invención puede comprender la composición edulcorante como recubrimiento o cobertura que se forma en la superficie del producto. Este recubrimiento puede mejorar el sabor del producto alimenticio, así como su tiempo de caducidad.

[0070] Las composiciones de glicósidos de esteviol glicosilados de la presente invención también resultan de utilidad en los productos dietéticos medicinales (alimentos cuya formulación es especial y está destinada al tratamiento dietético de una enfermedad que presenta necesidades nutricionales características que no pueden cubrirse con una dieta normal únicamente).

[0071] Otro aspecto de la invención proporciona un producto de bebida que comprende una composición de glicósidos de esteviol glicosilados de acuerdo con la presente invención o una combinación de composiciones de glicósidos de esteviol glicosilados de acuerdo con la presente invención, opcionalmente modificada con uno o más glicósidos de esteviol individuales como el rebaudiósido B. Por ejemplo, el producto de bebida puede comprender entre un 1 y un 10 % en peso, entre un 2 y un 8 % en peso, entre un 3 y un 6 % en peso o aproximadamente un 4 % en peso de rebaudiósido B además de dicha composición de glicósidos de esteviol glicosilados, basándose en el peso seco total de rebaudiósido B y composición de glicósidos de esteviol glicosilados. La cantidad de composición de glicósidos de esteviol glicosilados en el producto de bebida puede variar según se desee para lograr un resultado concreto deseado, como, por ejemplo, un aumento del dulzor y/o una mejora del sabor. Por ejemplo, el producto de bebida puede comprender una composición de glicósidos de esteviol glicosilados en una cantidad subedulcorante o una cantidad edulcorante. La concentración de composición de glicósidos de esteviol glicosilados (sobre una base de materia seca) en el producto de bebida puede ser de entre 5 y 2000 ppm. En una realización, el producto de bebida está compuesto por entre 800 y 1800 ppm (en seco) de composición de glicósidos de esteviol glicosilados. En otras realizaciones, el producto de bebida contiene una cantidad de composición de glicósidos de esteviol glicosilados eficaz para dar un SEV de al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10, o al menos 11 al producto de bebida, pero típicamente, no más de 20 o 15, donde el producto de bebida puede contener adicionalmente uno o más edulcorantes distintos que también contribuyen al SEV. La composición de glicósidos de esteviol glicosilados puede añadirse a un producto de bebida que también contiene uno o más edulcorantes distintos en una cantidad eficaz para aumentar el SEV del producto de bebida a al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10 o al menos 11, de tal forma que se proporciona un producto de bebida con un dulzor predeterminado deseado. Por ejemplo, un refresco no dietético normalmente contiene 12 gramos de sacarosa por 100 mL de agua, es decir, un 12 % de sacarosa. En consecuencia, un refresco dietético con un dulzor equivalente puede formularse utilizando una cantidad de composición de glicósidos de esteviol glicosilados suficiente (junto con uno o más edulcorantes diferentes que pueden estar presentes) para lograr un SEV de 12. En consecuencia, el producto de bebida puede presentar, en diversas realizaciones de la invención, un SEV de 1 20, 5-15 o 7-13.

[0072] Entre los ejemplos no limitativos de un producto de bebida se incluye una bebida carbonatada (incluyendo, sin carácter limitativo, bebidas suaves carbonatadas), una bebida no carbonatada (incluyendo, sin carácter limitativo, bebidas suaves no carbonatadas como aguas con sabores y té dulce o bebidas a base de café), una bebida con sabor a fruta, un zumo de fruta, té, leche, café, especialmente aquellos productos con contenido en azúcar reducido o con poco azúcar. Los productos de bebida congelados (en ocasiones denominados granizados) también se contemplan explícitamente. Otros tipos de productos de bebida no mencionados aquí pero que incluyen, convencionalmente, uno o más edulcorantes nutritivos también pueden contemplarse en el contexto de la presente invención, especialmente aquellos productos con contenido en azúcar reducido o con poco azúcar.

[0073] El edulcorante de la presente invención puede ser un edulcorante de mesa. El edulcorante de mesa puede, opcionalmente, incluir uno o más ingredientes adicionales seleccionados del grupo que consiste en agentes de carga (como la maltodextrina, la polidextrosa, las gomas como la goma xantana o la goma guar, la fibra de maíz soluble [SCF, por sus siglas en inglés], los almidones y los polioles), sabores naturales y/o artificiales, potenciadores del sabor, colores naturales y/o artificiales, fibra, acidulantes, vitaminas, antioxidantes, conservantes, hidrolizados de almidón y similares. En una realización, el edulcorante de mesa comprende tanto al menos una composición de esteviol glicosilado de acuerdo con la invención como al menos un glicósido de esteviol individual como el rebaudiósido B.

[0074] De acuerdo con una realización, el edulcorante de mesa es un edulcorante de mesa seco. Por ejemplo, puede presentar la forma de pastillas, gránulos o un polvo. También pueden contemplarse los edulcorantes de mesa líquidos, que suelen adoptar la forma de una solución acuosa de los componentes.

[0075] De acuerdo con una realización, el edulcorante de mesa puede comprender además uno o más edulcorantes nutritivos. El edulcorante nutritivo puede seleccionarse del grupo que consiste en sacarosa, glucosa, jarabe de glucosa, isoglucosa, fructosa, jarabe de glucosa-fructosa, maltosa, lactosa, jarabe de maíz, jarabe de maíz de alto contenido en fructosa, azúcar invertido, melaza, miel y agave. El edulcorante nutritivo es sacarosa en una realización preferida. En los casos en los que el producto de mesa incluye un edulcorante nutritivo, dicho edulcorante nutritivo puede estar presente en una cantidad de hasta aproximadamente el 30 % en peso basándose en el peso total del edulcorante de mesa. Por ejemplo, el edulcorante nutritivo puede estar presente en una cantidad de hasta aproximadamente el 26 % en peso basándose en el peso total del edulcorante de mesa. De acuerdo con una realización, el edulcorante de mesa puede comprender además uno o más coedulcorantes seleccionados del grupo que consiste en edulcorantes de alta intensidad y polialcoholes. También pueden utilizarse diversos edulcorantes sintéticos de alta potencia a modo del uno o más coedulcorantes. Entre los ejemplos específicos, se incluye la sucralosa, el aspartamo y el acesulfamo de potasio (Ace K). También pueden utilizarse diversos polialcoholes a modo del uno o más coedulcorantes de la presente invención. Entre los ejemplos específicos, se incluye el maltitol, el xilitol y el eritritol.

[0076] Los edulcorantes de mesa de acuerdo con la presente invención pueden utilizarse normalmente para endulzar bebidas, especialmente bebidas calientes, como el té o el café.

[0077] Otro aspecto de la presente invención proporciona un agente de carga que comprende una composición de glicósidos de esteviol glicosilados de acuerdo con la presente invención.

[0078] Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un agente de recubrimiento que comprende una composición de glicósidos de esteviol glicosilados de acuerdo con la presente invención.

[0079] Un aspecto independiente de la presente invención proporciona un producto farmacéutico que comprende una composición de glicósidos de esteviol glicosilados de acuerdo con la invención y al menos otro ingrediente farmacéutico como un ingrediente activo o excipiente. Entre los productos farmacéuticos ilustrativos, se incluyen los jarabes para la tos, las pastillas masticables, las pastillas para chupar, los preparados vitamínicos y similares.

[0080] Otro aspecto de la presente invención proporciona un producto nutricional o deportivo que comprende una composición de glicósidos de esteviol glicosilados de acuerdo con la presente invención.

[0081] Otro aspecto de la presente invención proporciona un producto cosmético (de cuidado personal) que comprende una composición de glicósidos de esteviol glicosilados de acuerdo con la presente invención y al menos un ingrediente cosmético. Entre los productos cosméticos ilustrativos, se incluye la pasta de dientes y el enjuague bucal, entre otros.

[0082] Cabe observar que la cantidad de una composición de glicósidos de esteviol glicosilados obtenida de acuerdo con la invención que está presente en un producto alimenticio, un producto de bebida, un producto farmacéutico, un producto nutricional, un producto deportivo o un producto cosmético, dependerá del dulzor, el gusto, el sabor y otros atributos sensoriales de la composición de glicósidos de esteviol glicosilados y del/de los tipo(s) y la(s) cantidad(es) de otro(s) edulcorante(s) y/o modificador(es) del sabor presente(s) en el producto y del dulzor deseado u otras características de sabor del producto, así como de otros factores como el contenido calórico deseado del producto. La composición de glicósidos de esteviol glicosilados puede utilizarse como potenciador del sabor a una concentración en el producto inferior a su límite de detección de dulzor (la concentración mínima a la que el glicósido de esteviol glicosilado da un sabor dulce perceptible al producto, en ausencia de cualquier otro edulcorante) o como edulcorante a una concentración en el producto igual o superior a su límite de detección de dulzor.

[0083] Un aspecto alternativo de la presente invención proporciona el uso de la composición edulcorante de la invención en un producto alimenticio, un producto de bebida, un producto farmacéutico, un producto nutricional, un producto deportivo o un producto cosmético, como agente de carga o como agente de recubrimiento.

[0084] Una composición de glicósidos de esteviol glicosilados preparada de acuerdo con la presente invención puede formularse en cualquier forma ingerible, por ejemplo, como jarabe, en forma de polvo, en forma de pastillas, en forma de gránulos, en una solución o en cualquier otra forma adecuada, incluyendo bebidas y productos alimenticios.

Ejemplos

Ejemplo 1

[0085] En este ejemplo, se utilizó una combinación de gran pureza de glicósidos de esteviol (incluido el rebaudiósido A como componente predominante) como material de partida y, en primer lugar, se glicosiló. A continuación, la composición de glicósidos de esteviol glicosilados resultante fue tratada con base.

Materiales

[0086]

1) Maltodextrina (Dextrosa Equivalente = 1).

2) Ciclodextrina glucotransferasa (CGTasa).

3) Amilasa maltogénica.

4) Mezcla de glicósidos de esteviol SG95 procedente de GLG Life Tech Corporation (una combinación de gran pureza de nueve glicósidos de esteviol dulces que se encuentran en las hojas de Stevia, representando el Reb A aproximadamente el 60 % en peso de la mezcla y representando el esteviósido aproximadamente el 30 % en peso de la mezcla).

5) Carbón activado granular, regenerado.

6) Resina aniónica de base fuerte y resina catiónica de ácido fuerte, mezcladas en una proporción de 60:40 en peso entre resina aniónica de base fuerte y resina catiónica de ácido fuerte.

7) Resina adsorbente macroporosa (un polímero acrílico alifático no iónico con una estructura macrorreticular y una elevada superficie, en forma de perlas).

Reacción

[0087] El procedimiento se llevó a cabo en fermentadores de 500 mL. Se prepararon tres muestras (véase la tabla 1) de cada reacción en paralelo con el siguiente procedimiento:

1) Suspender 20 g de glicósidos de esteviol SG95 en 340 mL de agua caliente en un vaso de precipitados de 1000 mL.

2) Añadir 40 g de maltodextrina (DE = 1) a la suspensión y mezclar para sumergir el material.

3) Ajustar el pH a 8,2 con hidróxido de sodio.

4) Añadir 2 mL de la enzima CGTasa a la solución.

5) Incubar durante 24 horas a 50 °C con agitación a 200 rpm.

6) Transferir a un matraz y calentar la mezcla de reacción durante 30 min en agua hirviendo (aproximadamente a 95 °C) para desnaturalizar la enzima CGTasa y, a continuación, dejar enfriar a temperatura ambiente.

7) Devolver la mezcla al vaso de precipitados del fermentador, enjuagar el matraz con agua desionizada para garantizar la transferencia completa del material del matraz al vaso de precipitados y para obtener un volumen total de la mezcla de aproximadamente 500 ml.

8) Añadir 5 mL (1 %) de la amilasa maltogénica a la solución.

9) Incubar durante 24 horas a 30 °C con agitación a 150 rpm.

10) Calentar la mezcla de reacción durante 30 min en agua hirviendo (aproximadamente a 95 °C) para inactivar la amilasa maltogénica y, a continuación, dejar enfriar a temperatura ambiente.

11) Filtrar la solución por un embudo Büchner para eliminar los sólidos/dextrinas sin reaccionar.

12) Enjuagar el carbón activado con agua desionizada para eliminar las partículas finas. Llenar 1 columna encamisada de #15 x 300 mm con carbón activado granular. Precalentar la columna de carbón a 50 °C y continuar el enjuague con 1,5 L de agua desionizada para eliminar las partículas finas.

13) Preparar resina de lecho mixto mediante el enjuague de 29,95 g de resina aniónica de base fuerte y 20,00 g de resina catiónica de ácido fuerte con agua desionizada. Llenar 1 columna encamisada de #15 x 300 mm con resina de lecho mixto. Precalentar la columna a 25 °C y continuar el enjuague con 1,5 L de agua desionizada.

14) Filtrar la solución de reacción a través de las columnas de carbón y de resina de lecho mixto en secuencia a una tasa de flujo de 1,5 mL/min. Enjuagar columna con agua.

15) Enjuagar la columna de adsorbente macroporoso con 1500 g de agua desionizada desgasificada.

16) Filtrar la solución de reacción a través de la columna de adsorbente macroporoso.

17) Enjuagar la columna de adsorbente macroporoso con 1500 g de agua desionizada desgasificada.

18) Enjuagar la columna de adsorbente macroporoso con 1500 g de una solución de etanol al 50 % (758,68 g de agua desionizada desgasificada y 750,63 g de etanol con una graduación alcohólica de 95 %).

19) Recoger la solución enjuagada de etanol y evaporar el etanol de la solución.

20) Transferir la solución (740,11 g) a un vaso de precipitados de vidrio de 2 L. Medir el pH (4,24) y ajustarlo a un pH final de 10,03 con hidróxido de sodio. Calentar la solución a 50 °C y agitar a 350 rpm durante 24 horas.

21) Enfriar la solución y ajustar el pH de 8,20 a 5,00 con un 7 % p/p de ácido clorhídrico.

22) Colocar la solución en el liofilizador.

23) Recoger el material secado (24,17 g en total) y entregar para ensayo analítico.

Tabla 1. Pesos reales utilizados

Resultados

[0088] La principal técnica analítica utilizada en estas muestras fue la LC-MS. El espectrómetro de masas (MS) informa del peso molecular (dividido por la carga, que normalmente era 1) de los picos de la cromatografía (LC). Se espera que los glicósidos de esteviol tengan pesos moleculares como los que se muestran en la tabla siguiente. Los residuos de azúcar más comunes añadidos al núcleo de esteviol son la glucosa, la ramnosa, la xilosa, la 6-desoxiglucosa y la fructosa. Desde el punto de vista de la masa, glucosa = fructosa, y ramnosa = 6-desoxiglucosa. Otro fenómeno de la espectrometría de masas es que se pueden formar aductos durante la ionización. Estos productos de reacción añaden masa respecto a la relación masa/carga esperada. Para este experimento, el m/z 687 visto en la figura 2 corresponde al rubusósido con un aducto de ácido fórmico. Este pico m/z también se observa en un estándar de glicósido de esteviol que contiene rubusósido. La figura 2 muestra que la mayoría de los productos de reacción corresponden a glicósidos de esteviol mono, di y triglicosilados, siendo los picos más altos de 965 y 803 el rebaudiósido A y el esteviósido, respectivamente.

Tabla 2. Referencia para datos de espectrometría de masas

[0089] Como se observa en la tabla 2 anterior, el esteviósido presenta un m/z de 803 y el rebaudiósido A presenta un m/z de 965. En las figuras 2 y 3, estos corresponden a los grandes picos que eluyen en tiempos de retención entre 9 y 12 minutos.

Tabla 3. Progreso de la reacción en condiciones de la invención y convencionales

Análisis

[0090] Los principales productos esperados de este procedimiento eran el rebaudiósido B glicosilado y el esteviolbiósido glicosilado, ya que el rebaudiósido B y el esteviolbiósido son los principales productos del tratamiento con base del material de partida. Se espera que estos productos aparezcan en la LC-MS después de 10 minutos. En general, los grados más altos de glicosilación se correlacionan con tiempos de retención más bajos, por lo que se esperaría que los productos con picos grandes antes de los 7 minutos contengan cantidades significativas de glicósidos de esteviol con un mayor grado de glicosilación. Aunque se producen algunos de estos productos, estos no parecen ser más frecuentes de lo que lo son en la muestra preparada de forma más típica (figura 4). La diferencia más notable entre estas figuras es la supresión de los picos m/z de 1127 y 1451 en torno a los 7,5 minutos cuando se compara la figura 3 con la figura 4. Estos picos corresponden probablemente al rebaudiósido A di y triglicosilado y al esteviósido triglicosilado. Ambos procedimientos parecen producir una menor abundancia de componentes con altos grados de glicosilación en relación con un producto comercial de glicósidos de esteviol glicosilados (figura 5).

Ejemplo 2

[0091] En este ejemplo, se muestra el tratamiento con base inicial de una composición de glicósidos de esteviol, seguida de transglicosilación para producir una composición de glicósidos de esteviol glicosilados.

Tratamiento con base

[0092]

1) Se disolvieron 39,99 g de una mezcla de glicósidos de esteviol (SG95, GLG Life Tech Corporation) en 360,00 g de una solución de hidróxido de sodio 1,25 N. El pH de la mezcla resultante era de 13,6.

2) La mezcla se calentó a 50 °C y se agitó a 360 rpm durante 24 horas.

3) A continuación, se enfrió la mezcla en un baño de hielo.

4) Una vez enfriada, el pH de la mezcla se estableció en 5 (pH inicial de 13,60, pH final de 4,99) con ácido clorhídrico al 7 % p/p.

5) El material resultante se centrifugó tres veces (a 4500 rpm durante 30 min a 25 °C en tubos de 50 mL) y se secó. Se analizó el precipitado para observar el contenido de glicósido de esteviol y se utilizó en la etapa de transglicosilación.

Transglicosilación

[0093]

1) Se suspendieron 20 g de glicósido de esteviol SG95 tratado con base en 340 mL de agua caliente en un vaso de precipitados de 1000 mL

2) Se añadieron 40 g de maltodextrina (DE = 1) a la suspensión y se mezclaron para sumergir el material. 3) Se ajustó el pH a 8,2 y se mantuvo la mezcla a 50 °C.

4) Se añadieron 2 mL de la enzima CGTasa a la solución.

5) Se incubó la mezcla durante 24 horas a 50 °C con agitación a 200 rpm.

6) A continuación, se transfirió la mezcla de reacción a un matraz y se calentó durante 30 min en agua casi hirviendo (aproximadamente 95 °C); a continuación, se dejó enfriar la muestra a temperatura ambiente. 7) Se devolvió la mezcla al fermentador y se enjuagó el matraz con agua desionizada para garantizar la transferencia completa del material del matraz al vaso de precipitados. El volumen total de la mezcla era de aproximadamente 500 ml.

8) Se añadieron 5 mL (1 %) de amilasa maltogénica a la solución.

9) A continuación, se incubó la mezcla durante 24 horas a 30 °C con agitación a 150 rpm.

10) A continuación, se transfirió la mezcla de reacción a un matraz y se calentó durante 30 min en agua casi hirviendo (aproximadamente 95 °C); a continuación, se dejó enfriar la muestra a temperatura ambiente. 11) A continuación, se filtró la mezcla a través de papel de filtro para eliminar las dextrinas mal dispersas. 12) A continuación, se enjuagó el carbón activado granular con agua desionizada y se colocó en una columna encamisada de 15 x 300 mm. A continuación, se precalentó la columna de carbón a 50 °C y se enjuagó con 1,5 L de agua desionizada para eliminar las partículas finas.

13) A continuación, se hizo pasar el filtrado de la etapa 11 a través de la columna de carbón a una tasa de flujo de 1,5 mL/min. A continuación, se enjuagó la columna con agua.

14) Se enjuagaron 24,13 g de resina aniónica de base fuerte junto con 16,10 g de resina catiónica de ácido fuerte con agua desionizada y se colocaron en una columna encamisada de 15 x 300 mm. A continuación, se calentó la columna de lecho mixto a 25 °C y se enjuagó con 1,5 L de agua desionizada.

15) A continuación, se hizo pasar el filtrado de la etapa 13 a través de la columna de lecho mixto a una tasa de flujo de 1,5 mL/min. A continuación, se enjuagó la columna con agua.

16) Se enjuagó una columna de adsorbente macroporoso con 1500 g de agua desionizada desgasificada. 17) A continuación, se hizo pasar el filtrado de la etapa 15 a través de la columna de adsorbente macroporoso, seguido de 1500 g de agua desionizada desgasificada.

18) A continuación, se enjuagó la columna de adsorbente macroporoso con 1500 g de una solución de etanol al 50 % (760,69 g de agua desionizada desgasificada y 729,07 g de etanol con una graduación alcohólica del 95 %).

19) Se recogió la fracción etanólica y se secó mediante un evaporador rotativo y un liofilizador.

20) A continuación, el material seco (20,07 g) se entregó para el ensayo analítico de metales pesados, disolventes residuales y análisis de glicósido.

Resultados

[0094] El análisis de LC-MS de la mezcla de glicósidos de esteviol SG95 tratada con base antes del tratamiento enzimático muestra picos correspondientes al rebaudiósido B y al esteviolbiósido (figura 6).

[0095] El cromatograma LC-MS del material tratado con enzima se muestra en la figura 7. Todas las masas asignadas corresponden a adiciones de azúcar (glucosa) al núcleo de esteviol.

[0096] Se espera que los glicósidos de esteviol tengan pesos moleculares como los que se muestran en la tabla 4 (la designación "X glc" se refiere al número de unidades de glucosa añadidas a un núcleo de esteviol):

Tabla 4. Referencia para datos de espectrometría de masas

[0097] Los picos grandes 641 y 803 que eluyen después de 17 minutos son el rebaudiósido B y el esteviolbiósido. Los picos que siguen a estos con m/z de 787 y 773 corresponden al dulcósido B y a un rebaudiósido F desglicosilado; estos serían productos esperados del tratamiento con base del rebaudiósido C y del rebaudiósido F. Los residuos de ramnosa y xilosa en estos productos probablemente inhiben su glicosilación.

[0098] El tratamiento con base de la mezcla de glicósidos de esteviol SG95 parece producir esteviolbiósido y rebaudiósido B, como se esperaba. En condiciones de glicosilación utilizando un pH elevado (básico) con una proporción de 2:1 entre el donante de glucosa y el glicósido de esteviol (p/p), se predijo que la mayor parte del rebaudiósido B (y probablemente también el esteviolbiósido) no reaccionaría. Los picos pequeños de 6 a 11 minutos de la figura 7 son un tanto inesperados en comparación con los resultados anteriores obtenidos con el rebaudiósido B (figura 8), donde la glicosilación se llevó a cabo con un pH ligeramente ácido y una proporción de 1:1 (p/p) de donante de glucosa: glicósido de esteviol. Por ejemplo, el cromatograma de la figura 7 muestra 4 picos que tienen m/z de 803; estos sólo pueden ser esteviósido, esteviolbiósido monoglicosilado y rebaudiósido B. Esto implica que, o bien el esteviolbiósido puede estar glicosilado en múltiples posiciones, o bien que se están registrando picos de fragmentación en el cromatograma. Sin embargo, la complejidad relativa de la figura 7 con respecto a la figura 8 implica claramente que la glicosilación del esteviolbiósido es compleja con respecto al rebaudiósido B.

[0099] La diferencia estructural entre el esteviolbiósido y el rebaudiósido B es que el rebaudiósido B tiene una fracción de glucosa enlazada 1-2, 1-3, mientras que el esteviolbiósido sólo tiene la fracción enlazada 1-2. Es posible que la reducción del impedimento estérico permita que ambos residuos de glucosa del esteviolbiósido sean glicosilados, mientras que desfavorece considerablemente esta posibilidad para el rebaudiósido B.

Ejemplo 3

[0100] Se evaluó el rendimiento del sabor de diversas composiciones de glicósidos de esteviol y composiciones de glicósidos de esteviol glicosilados. Las composiciones evaluadas se describen de la manera siguiente:

Reb A = rebaudiósido A, 97 % de pureza.

Reb A G = rebaudiósido A glicosilado (glicosilado a pH 5,5-6,0, relación de peso de dextrina: glicósido de esteviol = 1:1).

Reb B G = rebaudiósido B glicosilado (glicosilado a pH 5,5-6,0, relación de peso de dextrina: glicósido de esteviol = 1:1).

SG95 B-G = mezcla de glicósidos de esteviol SG95 glicosilados (procedente de GLG Life Tech Corporation, con aproximadamente un 60 % en peso de rebaudiósido A y aproximadamente un 30 % en peso de esteviósido), tratada con base antes de la glicosilación (glicosilada a un pH de aproximadamente 8,5, relación de peso de dextrina:glicósido de esteviol = 2:1).

SG95 G-B = mezcla de glicósidos de esteviol SG95 glicosilados (procedente de GLG Life Tech Corporation, con aproximadamente un 60 % en peso de rebaudiósido A y un 30 % en peso de esteviósido), tratada con base después de la glicosilación (glicosilada a un pH de aproximadamente 8,5, relación de peso de dextrina:glicósido de esteviol = 2:1).

Esteviósido G = esteviósido glicosilado (glicosilado a pH 5,5-6,0, relación de peso de dextrina: glicósido de esteviol = 1:1).

Steviten = Producto comercial de glicósido de esteviol glicosilado, vendido con la marca "Steviten" por Daepyung Co., Ltd.

[0101] Las composiciones Reb A G, Reb B G, SG95 B-G, SG95 G-B y Esteviósido G se prepararon poniendo en contacto la composición inicial de glicósidos de esteviol y la dextrina con CGTasa durante 24 horas a 50 °C. Después de una etapa de destrucción por calor (desactivación de enzima), cada una de las composiciones obtenidas se acortó en cadena tratándola con amilasa durante 24 horas a 30 °C. Tras una segunda etapa de destrucción de enzima, las composiciones se purificaron mediante resina de intercambio iónico, filtración por carbón y resina adsorbente. A continuación, todas las composiciones se secaron mediante liofilización.

[0102] Cada producto de estevia fue probado en dos niveles en un solo día de pruebas, probando en tasas de uso tanto de 500 ppm como de 1000 ppm. Debido a los efectos de arrastre conocidos, los productos se sirvieron en concentración ascendente para permitir lecturas más limpias en ambos puntos de datos. Las soluciones se sirvieron en tazas de soufflé de 2 onzas (59,14 ml) marcadas con códigos de 3 dígitos a temperatura ambiente. Los miembros del jurado disponían de agua osmotizada y galletitas sin sal para limpiar el paladar antes y durante las pruebas. Cada estudio diario se dirigía a 30 personas, aunque a veces se analizaban solamente 28 miembros del jurado debido a los requisitos de exclusión (es decir, las personas en periodo de lactancia, embarazadas, con medicación, etc., que comienzan el estudio, pero luego lo abandonan en el proceso).

[0103] El estudio se diseñó como un estudio de valoración utilizando una escala anclada de referencias de soluciones de sacarosa en agua de pH neutro. En este estudio, los miembros del jurado recibieron una serie de muestras de referencia etiquetadas e identificadas con su equivalencia de SEV. La gama superaba el dulzor esperado de la muestra de prueba y los miembros del jurado calificaron el dulzor utilizando un máximo de 15 puntos que supera el dulzor esperado de la muestra de prueba.

[0104] La preselección de las soluciones de prueba sugirió que la mayoría de los individuos percibirían estas soluciones como 10 SEV o menos. Dado que no se puede predecir eficazmente la sensibilidad de todos los individuos antes de la prueba, se utilizó una gama más amplia de referencias. Concretamente, las referencias SEV fueron las siguientes (tabla 5):

Tabla 5

[0105] En primer lugar, se pidió a los miembros del jurado que se familiarizaran con la intensidad de cada solución de referencia y su correspondiente SEV. A continuación, esperaron 30 segundos y se limpiaron el paladar con agua y una galletita. A continuación, se pidió a los miembros del jurado que probaran la muestra de prueba (identificada por un código aleatorio de 3 dígitos). A continuación, se les indicó que arrastraran un marcador sobre una escala de líneas para que emparejaran el dulzor de sus muestras de prueba con las referencias indicadas anteriormente, con una escala que iba de 0 a 15. Un recuadro a la derecha de la escala de líneas mostraba a los miembros del jurado los valores a los que arrastraban para asegurarse de que no se confundían sobre la equivalencia de dulzor que estaban calificando. Una vez completado esto, se hicieron preguntas relacionadas con el agrado de la muestra de prueba, la similitud del sabor de la muestra de prueba con el azúcar, la intensidad de cualquier sabor no deseado y la identidad de cualquier sabor no deseado, utilizando el formato mostrado en la figura 9.

[0106] Los valores utilizados para la escala de agrado eran una escala hedónica estándar de 7 puntos que iba de 1 a 7, la escala de similitud era una escala estándar de intensidad de 5 puntos que iba de 1 a 5, y la escala de sabor no deseado era una escala de intensidad de 6 puntos anclada en cero que iba de 0 a 5. La descripción del sabor no deseado era abierta para permitir a los miembros del jurado dar los nombres que quisieran a las posibles notas desagradables.

[0107] Los datos de rendimiento gustativo obtenidos se resumen en la siguiente tabla (tabla 6). SEV es el valor de equivalencia de la sacarosa (% de solución de sacarosa). La expresión "valor de equivalencia de sacarosa" o "SEV" es la cantidad de edulcorante sin sacarosa necesaria para proporcionar el dulzor de un determinado porcentaje de sacarosa en el mismo alimento, bebida o solución. El % de inversión es el porcentaje de miembros del jurado que calificaron la muestra de 500 ppm como más dulce que la muestra de 1000 ppm. Esto indica que se está cerca de la meseta de la curva de potencia y que el amargor u otros sabores no deseados enmascaran el dulzor a altas concentraciones. Un valor bajo de % de inversión es óptimo, junto con un SEV alto y un valor de agrado alto. También es deseable que las puntuaciones de diferencia con el azúcar sean bajas, que las desviaciones estándar del SEV sean bajas y que las puntuaciones de sabores no deseados sean bajas.

Tabla 6

[0108] Los datos sobre el sabor indican que todas las muestras glicosiladas obtuvieron mejores resultados que el rebaudiósido A en todas las matrices diferentes de SEV. A 1000 ppm, se puede considerar que varias de las muestras están en paridad con el rebaudiósido A en cuanto a dulzor, aunque tienen una desviación estándar menor en la calificación. Esto implica que la población general de consumidores tendría una experiencia más consistente con estos productos en relación con el rebaudiósido A como ingredientes en productos consumibles como alimentos y bebidas, proporcionando así una ventaja en la formulación de dichos productos. De las composiciones probadas, el SG95 G-B fue especialmente potente a 500 ppm. Por lo tanto, sería lógico que esta composición tuviera el umbral de dulzor más bajo de las composiciones probadas. Este atributo sería beneficioso para utilizar dicha composición como potenciador del sabor a niveles bajos. La ventaja de la potencia de esta composición es más evidente en comparación con la de Steviten. Dado que un producto de tipo SG95 glicosilado, como se ha visto con el SG95 G-B, consiste principalmente en rebaudiósido A, esteviósido y sus productos glicosilados, es lógico que su rendimiento gustativo esté entre el del rebaudiósido A glicosilado y el del esteviósido glicosilado. Sin embargo, sorprendentemente, se descubrió que el SG95 G-B era más dulce que cualquiera de los productos mencionados. Asimismo, el SG95 B-G se compone en gran medida de rebaudiósido B, esteviolbiósido y los productos glicosilados. Dado que se ha informado de que el esteviolbiósido no es dulce en relación con el rebaudiósido A, el rebaudiósido B o el esteviósido y que su calidad gustativa es pobre, también fue sorprendente que este producto (SG95 B-G) se comporte de forma muy similar al rebaudiósido B glicosilado.

Ejemplo 4

[0109] En este ejemplo, se analizaron las siguientes muestras de glicósido de esteviol glicosilado.

SG95 G = mezcla de glicósidos de esteviol SG 95 glicosilados (procedente de Sweet Green Fields Corporation, con aproximadamente un 60 % en peso de rebaudiósido A y aproximadamente un 25 % en peso de esteviósido), glicosilada a un pH de aproximadamente 8,5, relación de peso de dextrina: glicósido de esteviol = 2:1.

SG95 G con un 4 % de Reb B = 96 % de SG95 G como anteriormente con un 4 % de rebaudiósido B (mezcla seca).

SG95 G con un 15 % de SG95 B-G = 85 % de SG95 G con un 15 % de SG95 B-G (como se describe en el ejemplo 3).

SG95 G con un 20 % de G-B = mezcla de glicósidos de esteviol SG 95 glicosilados (procedente de Sweet Green Fields Corporation, con aproximadamente un 60 % en peso de rebaudiósido A y aproximadamente un 25 % en peso de esteviósido), glicosilado a un pH de aproximadamente 8,5, relación de peso de dextrina:glicósido de esteviol = 2:1, donde el 20 % del material se trata con base después de la glicosilación.

[0110] La muestra SG95 G se preparó poniendo en contacto la composición inicial de glicósidos de esteviol y la dextrina con CGTasa durante un máximo de 24 horas a 50 °C. A continuación, este producto se acortó en cadena con amilasa durante 24 horas a 30 °C. Tras una etapa de destrucción de enzima (calentamiento a 95 °C durante 30 minutos), el producto se purificó mediante resina de intercambio iónico, filtración por carbón y resina adsorbente. A continuación, se secó la muestra por aspersión.

[0111] La muestra SG95 G con un 20 % de G-B se preparó poniendo en contacto la composición inicial de glicósidos de esteviol y la dextrina con CGTasa durante un máximo de 18 horas a 80 °C. A continuación, este producto se acortó en cadena con amilasa durante 2 horas a 50 °C. Tras una etapa de destrucción de enzima (calentamiento a 95 °C durante 30 minutos), se eliminaron los hidratos de carbono residuales. A continuación, un 20 % de la solución se trató con base a 80 °C. Tras la neutralización, el material se recombinó con la solución original y se trató con resina de intercambio iónico y filtración por carbón. A continuación, se secó la muestra con liofilización.

[0112] Las muestras fueron analizadas según se describe en el ejemplo 3, evaluándose concentraciones adicionales, incluida 1500 ppm. Los resultados obtenidos se resumen en la tabla 7.

Tabla 7

[0113] Como se puede ver en la tabla 7, el SG95 G (aunque es intensamente dulce) tiene un sabor no deseado más alto y puntuaciones de agrado más bajas que los otros productos probados en este experimento. Se descubrió que la inclusión de un 4 % de rebaudiósido B mejoró las puntuaciones de agrado y sabor no deseado del SG95 G. Se descubrió que la inclusión de estevia glicosilada tratada con base (con tratamiento con base antes o después de la glicosilación), mejoró aún más el rendimiento gustativo del edulcorante mediante la reducción de los sabores no deseados y/o el aumento del agrado. Además, se pueden obtener niveles de edulcoración más altos, probablemente debido a la reducción del sabor no deseado amargo en relación con la solución de 1500 ppm de SG95 G.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende glicósidos de esteviol y glicósidos de esteviol glicosilados, donde:

2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, donde el rebaudiósido B glicosilado, el esteviolbiósido glicosilado, el esteviolbiósido y el rebaudiósido B juntos comprenden del 10 al 25 %, en peso seco, de la composición.

3. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, donde el rebaudiósido B glicosilado y el esteviolbiósido glicosilado juntos comprenden del 5 al 15 %, en peso seco, de la composición.

4. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que presenta una cantidad total de glicósidos de esteviol y glicósidos de esteviol glicosilados de al menos el 90 % de la composición, en peso seco.

5. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que presenta una cantidad total de glicósidos de esteviol y glicósidos de esteviol glicosilados de al menos el 95 % de la composición, en peso seco.

6. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la composición comprende del 15 % en peso al 40 % en peso de glicósido de esteviol no glicosilado y del 60 % en peso al 85 % en peso de glicósido de esteviol glicosilado sobre una base de materia seca, donde el peso total de glicósido de esteviol no glicosilado y glicósido de esteviol glicosilado es de al menos el 90 %, en peso seco, del peso total de la composición.

7. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la composición comprende del 20 % en peso al 35 % en peso de glicósido de esteviol no glicosilado y del 65 % en peso al 80 % en peso de glicósido de esteviol glicosilado sobre una base de materia seca, donde el peso total de glicósido de esteviol no glicosilado y glicósido de esteviol glicosilado es de al menos el 95 %, en peso seco, del peso total de la composición.

8. Un producto alimenticio, de bebida, cosmético o farmacéutico que comprende i) la composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y ii) al menos un ingrediente alimenticio, de bebida, cosmético o farmacéutico adicional.

9. Un método de elaboración de un producto alimenticio, de bebida, cosmético o farmacéutico que comprende la combinación de i) la composición de acuerdo con la reivindicación 1 y ii) al menos un ingrediente alimenticio, de bebida, cosmético o farmacéutico adicional.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, donde el al menos un ingrediente alimenticio, de bebida, cosmético o farmacéutico adicional incluye del 2 al 8 % en peso de rebaudiósido B además de la composición de acuerdo con la reivindicación 1 basándose en el peso seco total de rebaudiósido B y la composición de acuerdo con la reivindicación 1.

11. Una composición edulcorante preparada mediante la combinación de a) una composición de acuerdo con la reivindicación 1 y b) rebaudiósido B, donde la composición edulcorante contiene del 2 al 8 % en peso de rebaudiósido B basándose en el peso seco total de a) y b).

12. La composición edulcorante de acuerdo con la reivindicación 11, donde la composición edulcorante contiene del 3 al 6 % en peso de rebaudiósido B basándose en el peso seco total de a) y b).

13. Un producto alimenticio, de bebida, cosmético o farmacéutico que comprende i) una composición edulcorante de acuerdo con la reivindicación 11 o 12 y ii) al menos un ingrediente alimenticio, de bebida, cosmético o farmacéutico adicional.

14. Un método de elaboración de un producto alimenticio, de bebida, cosmético o farmacéutico que comprende la combinación de i) una composición edulcorante de acuerdo con la reivindicación 11 o 12 y ii) al menos un ingrediente alimenticio, de bebida, cosmético o farmacéutico adicional.