ES2923478T3 - Determinación y análisis de resultados de una secuenciación con moléculas asociadas a una diana en una cuantificación asociada con dianas biológicas - Google Patents

Abstract

Las realizaciones de un método y/o sistema pueden incluir la generación de un conjunto de moléculas asociadas al objetivo (p. ej., moléculas de refuerzo) asociadas con uno o más objetivos biológicos; generar una o más mezclas adicionales basadas en el procesamiento del conjunto de moléculas asociadas al objetivo con una o más muestras que incluyen uno o más objetivos biológicos; realizar una o más operaciones de secuenciación de Sanger en una o más mezclas adicionales; determinar una o más métricas de abundancia basadas en salidas relacionadas con cromatogramas de una o más operaciones de secuenciación de Sanger; y/o facilitar la caracterización de una o más condiciones médicas en base a una o más métricas de abundancia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Determinación y análisis de resultados de una secuenciación con moléculas asociadas a una diana en una cuantificación asociada con dianas biológicas

Esta solicitud reivindica el beneficio del documento de solicitud provisional de EE.UU. con número de serie 62/541.565, presentada el 04 de agosto de 2017.

Esta descripción se refiere en general al campo de la genómica.

Zhidkov et al. (Nucleic Acids Research, 39(7), e47, 2011) se refieren a una herramienta para detectar inserciones y deleciones con poca abundancia en trazas de secuencia estándar. Brinkman et al. (Nucleic Acids Research, 42(22), ei68, 2014) se refieren a un método para caracterizar y cuantificar mutaciones genómicas inducidas. El documento WO 00/68410 se refiere a un método de secuenciación y cuantificación simultáneas de un analito de ácido nucleico diana en una muestra.

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Por ello, una realización de la presente invención proporciona un método para facilitar el diagnóstico prenatal de un trastorno genético a partir de una muestra materna asociada a una mujer embarazada, en donde el método comprende:

generar un primer conjunto de moléculas asociadas a una diana que comprende una primera secuencia asociada a una diana que comprende:

una primera región asociada a una diana con similitud de secuencia con una primera región de la secuencia diana de una primera secuencia diana de una diana biológica, en donde la diana biológica está asociada con el trastorno genético; y

una región de variación de una diana con disimilitud de secuencia con una región de la secuencia de la secuencia diana;

generar una mezcla adicional (del inglés “spike-in”) coamplificada basándose en la coamplificación del primer conjunto de moléculas asociadas a una diana y las primeras moléculas de ácido nucleico de la muestra materna, en donde las primeras moléculas de ácido nucleico comprenden la región de la secuencia diana;

secuenciar con el modo Sanger la mezcla adicional coamplificada para determinar al menos un resultado relacionado con el cromatograma que comprende los primeros picos asociados con la primera región asociada a una diana, la región de la secuencia diana de la diana biológica, la región de variación de la diana y la región de la secuencia de la diana biológica;

determinar un primer conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana, en donde cada medición de la abundancia asociada a una diana, del primer conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana, corres­ ponde a una pareja diferente de una base de la primera secuencia asociada a una diana y una base de la primera secuencia diana, en donde la determinación del primer conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana comprende, para cada una de las diferentes parejas:

determinar una medición de la intensidad del pico para la base de la primera secuencia asociada a una diana de la pareja, basándose en al menos un resultado relacionado con el cromatograma;

determinar una medición de la intensidad del pico para la base de la primera secuencia diana de la pareja, basándose en al menos un resultado relacionado con el cromatograma; y

determinar una medición de la abundancia asociada a una diana del primer conjunto de mediciones de la abun­ dancia asociada a una diana, basándose en la medición de la intensidad del pico para la base de la primera secuencia asociada a una diana y la medición de la intensidad del pico para la base de la primera secuencia diana;

determinar una medición de la abundancia global asociada a una diana basándose en el primer conjunto de medicio­ nes de la abundancia asociada a una diana; y

facilitar el diagnóstico prenatal del trastorno genético basándose en una comparación entre la medición de la abun­ dancia global asociada a una diana y una medición de la abundancia global asociada a una referencia que describe la abundancia de una referencia biológica en relación con las moléculas asociadas a una referencia.

Otro aspecto de la invención proporciona un método para facilitar la caracterización de una afección médica a partir de una muestra que comprende moléculas diana, comprendiendo el método:

generar un conjunto de moléculas asociadas a una diana que comprenden una secuencia asociada a una diana que comprende:

una primera región asociada a una diana con similitud de secuencia con una primera región de la secuencia diana de una secuencia diana de una diana biológica, en donde la diana biológica está asociada con el trastorno genético; y

una región de variación de la diana con disimilitud de secuencia con una región de una secuencia de la secuencia diana;

realizar una secuenciación de tipo Sanger basándose en el conjunto de moléculas asociadas a una diana y las molé­ culas diana que comprenden la secuencia diana, para determinar al menos un resultado relacionado con el cromatograma que comprende un primer conjunto de picos asociados con la primera región asociada a una diana, la primera región de la secuencia diana de la diana biológica, la región de variación de la diana y la región de la secuencia de la diana biológica;

determinar un conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana para un conjunto de diferentes parejas de bases basándose en el primer conjunto de picos de al menos un resultado relacionado con el cromatograma, en donde cada pareja de bases diferente, procedentes del conjunto de diferentes parejas de bases, corresponde a una pareja de una base de la secuencia asociada a una diana y una base de la secuencia diana; y

facilitar la caracterización de la afección médica basándose en el conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana y un conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una referencia que describen la abundancia de una referencia biológica en relación con moléculas asociadas a una referencia.

Otro aspecto de la invención proporciona un método para la cuantificación de dianas biológicas a partir de una muestra que comprende moléculas diana, comprendiendo el método: una secuenciación de tipo Sanger de una mezcla adicio­ nal coamplificada para generar al menos un resultado relacionado con el cromatograma asociado con un primer con­ junto de moléculas asociadas a una diana y un conjunto de moléculas diana, en donde:

el primer conjunto de moléculas asociadas a una diana comprende una primera secuencia asociada a una diana que comprende:

una primera región asociada a una diana con similitud de secuencia con una primera región de una secuencia diana de una primera secuencia diana de las moléculas diana, en donde el conjunto de moléculas diana comprende la primera región de la secuencia diana; y

una región de variación de la diana con disimilitud de secuencia con una región de una secuencia de la primera secuencia diana; y

la mezcla adicional coamplificada se generó basándose en la coamplificación del primer conjunto de moléculas aso­ ciadas a una diana y las primeras moléculas de ácido nucleico de una muestra, en donde las primeras moléculas de ácido nucleico comprenden la región de la secuencia diana;

determinar un primer conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana para diferentes conjuntos de bases basándose en al menos un resultado relacionado con el cromatograma, en donde cada conjunto diferente de bases, procedente de los diferentes conjuntos de bases, comprende al menos una base de la primera secuencia asociada a una diana y al menos una base de la primera secuencia diana;

determinar una primera medición de la abundancia global que describe una primera abundancia de la diana biológica para la muestra, basándose en el primer conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana; y cuantificar una cantidad de la diana biológica basándose en una comparación entre la medición de la abundancia global asociada a una diana y una medición de la abundancia global asociada a una referencia que describe la abun­ dancia de una referencia biológica en relación con las moléculas asociadas a una referencia.

Las características opcionales se establecen en las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de las Figuras

Las FIGURAS 1A-1C incluyen representaciones de diagramas de flujo de variaciones de realizaciones de un método; la FIGURA 2 incluye una representación esquemática de una variación de una realización de un método;

la FIGURA 3 incluye ejemplos específicos de una secuencia diana, una secuencia asociada a una diana y cebadores asociados;

la FIGURA 4 incluye un ejemplo específico de un cebador de PCR que incluye una secuencia de horquilla;

las FIGURAS 5A-5E incluyen un ejemplo específico de un producto de una amplificación con un cebador de PCR que incluye una secuencia de horquilla, en una variación de una realización del método;

las FIGURAS 6A-6B incluyen ejemplos específicos de resultados relacionados con cromatogramas y mediciones de la abundancia;

las FIGURAS 7A-7B incluyen ejemplos específicos de resultados relacionados con cromatogramas y mediciones de la abundancia;

la FIGURA 8 incluye una representación esquemática de una variación de una realización de un método;

la FIGURA 9 incluye una representación esquemática de una variación de una realización de un método;

la FIGURA 10 incluye representaciones gráficas de porciones de una variación de una realización de un método; y

la FIGURA 11 incluye un ejemplo específico de una secuencia diana y una secuencia asociada a una diana;

las FIGURAS 12A-12B incluyen representaciones gráficas de resultados de porciones de una validación de una varia­ ción de una realización de un método;

las FIGURAS 13A-13B incluyen una representación esquemática de porciones de una variación de una realización de un método.

Descripción de las realizaciones

La siguiente descripción de las realizaciones (por ejemplo, que incluye variaciones de realizaciones, ejemplos de rea­ lizaciones, ejemplos específicos de realizaciones, otras variantes adecuadas, etc.) se entiende que no está limitada a esas realizaciones, sino que más bien permite que cualquier persona experta en la técnica haga uso y la emplee.

1. Visión general

Como se muestra en las FIGURAS 1A-1C y 2, las realizaciones de un método 100 (p. ej., para determinar la abun­ dancia de una diana biológica; para facilitar la caracterización de una o más afecciones, etc.) pueden incluir: generar un conjunto de moléculas asociadas a una diana (p. ej., moléculas adicionales, etc.) asociadas con una o más dianas biológicas S110; generar una o más mezclas adicionales S120 (p. ej., basándose en un procesamiento del conjunto de moléculas asociadas a una diana con una o más muestras, tales como muestras biológicas y/o muestras sintéticas, incluyendo la diana o más dianas biológicas, etc.), como por ejemplo, en donde la mezcla o más mezclas adicionales pueden configurarse para facilitar una mayor precisión (p. ej., aunque se minimizan los sesgos de la amplificación, como los que se basan en la coamplificación de las moléculas asociadas con una diana con la diana biológica o más dianas biológicas, etc.) y/o una mayor capacidad de implementación (p. ej., a través de una compatibilidad con tecno­ logías de secuenciación como la secuenciación de tipo Sanger, etc.); realizar una o más operaciones de secuenciación S130 (p. ej., secuenciación de tipo Sanger, etc.), tal como las que se basan en la mezcla o más mezclas adicionales; y/o determinar una o más mediciones de la abundancia S140 (p. ej., una relación de la abundancia de las moléculas diana en relación con las moléculas asociadas a una diana, etc.), tal como basándose en la operación de secuencia­ ción o más operaciones de secuenciación para la mezcla o más mezclas adicionales (p. ej., basándose en las inten­ sidades relativas de los picos del cromatograma entre las bases endógenas y las bases adicionales, etc.).

Adicional o alternativamente, las realizaciones del método 100 pueden incluir uno o más entre: procesar un conjunto de moléculas asociadas a una referencia S115 (por ejemplo, asociadas con moléculas de una referencia en la muestra, en donde las mediciones de la abundancia determinadas en relación con el conjunto de moléculas asociadas con una referencia, pueden compararse con mediciones de la abundancia relacionadas con una diana para facilitar las carac­ terizaciones y/o los tratamientos para una o más afecciones, etc.); facilitar la caracterización de una o más afecciones S150, tal como basándose en la medición o más mediciones de la abundancia; facilitar el tratamiento S160 (por ejem­ plo, de la afección o más afecciones basándose en una o más mediciones de la abundancia, etc.); y/o validar S105, tal como validar una o más porciones de realizaciones del método 100; y/o cualquier otro procedimiento adecuado.

En un ejemplo específico, el método 100 (por ejemplo, para facilitar el diagnóstico prenatal de un trastorno genético, tal como uno o más trastornos cromosómicos y/o trastornos de un solo gen, a partir de una muestra materna asociada a una mujer embarazada, etc.) puede incluir: generar un conjunto de moléculas asociadas a una diana que incluyen una secuencia asociada a una diana que incluye: una región asociada a una diana con similitud de secuencia con una región de la secuencia diana de una secuencia diana de una diana biológica, en donde la diana biológica está asociada con el trastorno genético; y una región de variación de la diana con disimilitud de secuencia con una región de una secuencia de la secuencia diana; generar una mezcla adicional coamplificada basándose en la coamplificación del conjunto de moléculas asociadas a una diana y moléculas de ácido nucleico de la muestra materna, en donde las moléculas de ácido nucleico incluyen la región de la secuencia diana; secuenciar del modo Sanger la mezcla adicional coamplificada para determinar al menos un resultado relacionado con el cromatograma (por ejemplo, un cromatograma, picos correspondientes a bases, intensidades de los picos, etc.) incluyendo los picos asociados con la región asociada a una diana, la región de la secuencia diana de la diana biológica, la región de variación de la diana y la región de la secuencia de la diana biológica; determinar un conjunto de relaciones de la abundancia asociada con una diana (y/u otras mediciones de la abundancia adecuadas, etc.), en donde cada relación de la abundancia asociada con una diana, del conjunto de relaciones de la abundancia asociada con una diana, corresponde a una pareja dife­ rente de una base de la secuencia asociada a una diana y una base de la secuencia diana (p. ej., en donde las bases de la pareja comparten un mismo tipo de base; en donde las bases de la pareja comparten diferentes tipos de bases, etc.), en donde determinar el conjunto de relaciones de la abundancia asociada a una diana incluye, para cada una de las diferentes parejas: determinar una medición de la intensidad del pico (p. ej., intensidad máxima del pico; inten­ sidad global del pico; etc.) para la base de la secuencia asociada a una diana de la pareja, basándose en el al menos un resultado relacionado con el cromatograma (p. ej., basándose en valores de la intensidad de los picos, determina­ dos en base a la secuenciación de tipo Sanger, etc.); determinar una medición de la intensidad del pico para la base de la secuencia diana de la pareja, basándose en al menos un resultado relacionado con el cromatograma; y determi­ nar una relación de la abundancia asociada a una diana (p. ej., una relación entre la medición de la intensidad del pico para la base de la secuencia diana y la medición de la intensidad del pico para la base de la secuencia de la molécula asociada a una diana, etc.) del conjunto de relaciones de la abundancia asociada con una diana, basándose en la medición de la intensidad del pico para la base de la secuencia asociada a una diana y la medición de la intensidad del pico para la base de la secuencia diana; determinar una relación de la abundancia global asociada con una diana basándose en el conjunto de relaciones de la abundancia asociada con una diana; y/o facilitar el diagnóstico prenatal del trastorno genético basándose en una comparación entre la relación de la abundancia global asociada a una diana y una relación de la abundancia global asociada a una referencia (y/u otras mediciones de la abundancia asociada a una referencia adecuadas, etc.) que describen la abundancia de una referencia biológica en relación con las moléculas asociadas a una referencia.

En un ejemplo específico, el método 100 (por ejemplo, para facilitar la caracterización de una afección médica, como uno o más trastornos genéticos y/o afecciones cancerosas, a partir de una muestra que incluye moléculas diana, etc.) puede incluir: generar un conjunto de moléculas asociadas con una diana que incluyen una secuencia asociada a una diana que incluye: una región asociada a una diana con similitud de secuencia con una región de la secuencia diana de una secuencia diana de una diana biológica, en donde la diana biológica está asociada con el trastorno genético; y una región de variación de la diana con disimilitud de secuencia con una región de la secuencia de la secuencia diana; realizar una secuenciación de tipo Sanger basándose en el conjunto de moléculas asociadas a una diana y las moléculas diana que incluyen la secuencia diana, para determinar al menos un resultado relacionado con el cromatograma que incluye un conjunto de picos asociados con la región asociada a una diana, la región de la secuencia diana de la diana biológica, la región de la variación de la diana y la región de la secuencia de la diana biológica; determinar un conjunto de relaciones de la abundancia asociada a una diana (y/u otras mediciones de la abundancia adecuadas, etc.) para un conjunto de diferentes parejas de bases basándose en el conjunto de picos del al menos un resultado relacionado con el cromatograma, en donde cada pareja de bases diferente, procedente del conjunto de parejas de bases diferentes, corresponde a una pareja de una base de la secuencia asociada a una diana y una base de la secuencia diana; y/o facilitar la caracterización (p. ej., detección, diagnóstico, etc.) de la afección médica basándose en el conjunto de relaciones de la abundancia asociada a una diana y un conjunto de relaciones de la abundancia asociada a una referencia (y/u otras mediciones de la abundancia asociada a una referencia adecuadas; etc.) que describen la abundancia de una referencia biológica en relación con las moléculas asociadas a una referencia (p. ej., facilitando la caracterización basándose en una comparación entre una relación de la abundancia global asociada a una diana y una relación de la abundancia global asociada a una referencia; en donde la relación de la abundancia global asociada a una diana puede determinarse basándose en la combinación del conjunto de relaciones de la abun­ dancia asociada con una diana; en donde la relación de la abundancia global asociada con una referencia puede determinarse basándose en la combinación del conjunto de relaciones de la abundancia asociada con una referencia, etc.).

En un ejemplo específico, el método 100 (p. ej., para la cuantificación de dianas biológicas a partir de una muestra que incluye moléculas diana, etc.) puede incluir: determinar al menos un resultado relacionado con el cromatograma asociado con un conjunto de moléculas asociadas a una diana y un conjunto de moléculas diana, basándose en la secuenciación de tipo Sanger (p. ej., a través de una tercera parte, con cualquier entidad adecuada, etc.), asociado con el conjunto de moléculas asociadas a una diana y el conjunto de moléculas diana, en donde el conjunto de molé­ culas asociadas a una diana incluye una secuencia asociada a una diana que incluye: una región asociada a una diana con similitud de secuencia con una región de la secuencia diana de una secuencia diana de una diana biológica, en donde el conjunto de moléculas diana incluye la región de la secuencia diana; y una región de variación de la diana con disimilitud de secuencia con una región de una secuencia de la secuencia diana; determinar un conjunto de rela­ ciones de la abundancia asociada a una diana (y/u otras mediciones de la abundancia adecuadas, etc.) para diferentes conjuntos de bases basándose en el al menos un resultado relacionado con el cromatograma, en donde cada conjunto diferente de bases, procedente de los diferentes conjuntos de bases, incluye al menos una base de la secuencia asociada a una diana y al menos una base de la secuencia diana; y/o determinar una medición de la abundancia global que describe una abundancia de la diana biológica para la muestra, basándose en el conjunto de relaciones de la abundancia asociada a una diana.

En un ejemplo específico, el método 100 puede incluir: generar un conjunto de ácidos nucleicos asociados con una diana (p. ej., ácidos nucleicos adicionales; etc.), en donde los ácidos nucleicos que incluyen una o más regiones asociadas con una diana (p. ej., el conjunto de ácidos nucleicos asociados con una diana, que incluye una secuencia de ácido nucleico asociada a una diana, que incluye la región asociada a una diana; regiones de la secuencia que incluyen una secuencia de nucleótidos que coincide con una región de la secuencia diana de una secuencia diana de la molécula diana en la muestra, en donde las moléculas diana corresponden a la diana biológica, etc.) asociadas con un cromosoma diana (por ejemplo, el cromosoma 21; en donde se pueden generar diferentes conjuntos de ácidos nucleicos asociados con una diana, en donde diferentes conjuntos pueden corresponder a diferentes loci del cromo­ soma 21 y pueden incluir diferentes regiones asociadas con una diana con similitud de secuencia con diferentes re­ giones de la secuencia diana de secuencias diana, en donde las diferentes regiones de la secuencia diana o las secuencias diana pueden corresponder a diferentes loci; etc.) e incluir una o más regiones de una variación (p. ej., inserciones de secuencia; deleciones de secuencia; secuencias de variación con una pluralidad de bases aleatorizadas en relación con una secuencia diana, tal como una secuencia diana que identifica el cromosoma 21, etc.); combi­ nar el conjunto de ácidos nucleicos asociados con una diana con un conjunto de ácidos nucleicos diana (por ejemplo, moléculas de ADN endógeno que identifican el cromosoma 21) procedentes de una muestra (por ejemplo, una muestra de sangre materna de una mujer embarazada, etc.); coamplificar el conjunto de ácidos nucleicos asociados a una diana y el conjunto de ácidos nucleicos diana (p. ej., para cada conjunto diferente de ácidos nucleicos asociados a una diana correspondiente a un locus diferente, coamplificar el conjunto de ácidos nucleicos asociados con una diana con el conjunto de ácidos nucleicos diana correspondientes a los loci, etc.) basándose en un conjunto de cebadores asociados a la diana (por ejemplo, dirigidos a una secuencia compartida por los ácidos nucleicos asociados a la diana y los ácidos nucleicos diana), generando así uno o más en mezclas adicionales; realizar una secuenciación de tipo Sanger sobre una o más mezclas adicionales (y/o el conjunto de ácidos nucleicos asociados con una diana por sepa­ rado, los ácidos nucleicos diana por separado y/u otras moléculas adecuadas) para determinar el uno o más resultados relacionados con el cromatograma; realizar un análisis de estimación estadística (p. ej., regresión lineal general, míni­ mos cuadrados no negativos, detección de compresión, consenso de muestras aleatorias, etc.) en el uno o más resul­ tados relacionados con el cromatograma (p. ej., cromatogramas de la secuenciación de tipo Sanger; datos de los picos, tal como datos de la intensidad de los picos, incluidas las mediciones de la intensidad de los picos, procedentes de la secuenciación de tipo Sanger, etc.) para parejas de una base de la secuencia diana y una bases de la secuencia asociada a una diana (p. ej., para parejas del mismo tipo de base correspondientes a una posición de la secuencia original para la secuencia diana y una posición desplazada de la secuencia para la secuencia asociada a una diana, como cuando la región de la variación de la secuencia asociada a una diana incluye una o más inserciones y/o deleciones; en posiciones correspondientes a la región de la variación, como cuando la región de la variación incluye un conjunto de tipos de bases aleatorizadas en relación con la secuencia diana, etc.); para cada pareja, extraer una relación de la abundancia individual de endógeno a adicional, basándose en la comparación de una medición de la intensidad del pico (por ejemplo, una intensidad máxima del pico, una intensidad global del pico, etc.) (y/u otro resul­ tado adecuado de la secuenciación) para la base de la secuencia diana para una medición de la intensidad del pico (y/u otro resultado adecuado de la secuenciación) para la base de la secuencia asociada a una diana; generar una relación entre la abundancia global basándose en las relaciones de la abundancia individual (p. ej., promediar relacio­ nes de la abundancia individual para diferentes parejas de una base de la secuencia diana y una base de la secuencia asociada a una diana, asociadas con una pluralidad de loci diana para el cromosoma 21; promediar relaciones de la abundancia entre los loci, etc.); y facilitar una o más caracterizaciones de una o más afecciones (p. ej., diagnóstico del síndrome de Down, caracterizaciones de otras afecciones, análisis de los resultados de una secuenciación, etc.) ba­ sándose en las relaciones de la abundancia (p. ej., basándose en una comparación de la relación de la abundancia global para el cromosoma 21 con una relación de la abundancia global de una referencia, calculada para un cromo­ soma de una referencia como el cromosoma 18, basándose en el procesamiento de moléculas asociadas con una referencia con moléculas de una referencia procedentes de la muestra de acuerdo con porciones de una realización del método 100, en donde la comparación puede facilitar la caracterización del síndrome de Down y el síndrome de Edwards; etc.).

Las realizaciones del método 100 y/o el sistema 200 pueden servir para mejorar la rentabilidad (p. ej., aprovechando la tecnología de secuenciación de tipo Sanger, etc.), la capacidad de implementación (p. ej., en países con acceso limitado a sistemas de secuenciación del genoma, etc.) y la precisión (p. ej., asociada con un coeficiente de variación de menos del 1% y/o cualquier precisión adecuada, etc.) en relación con la determinación de mediciones de la abun­ dancia (p. ej., recuentos de moléculas) para una o más dianas biológicas. Las realizaciones del método 100 y/o el sistema 200 pueden servir adicional o alternativamente para aprovechar las mediciones de la abundancia para carac­ terizar (p. ej., diagnosticar) y/o tratar (p. ej., mediante una determinación del tratamiento, una evaluación del trata­ miento y una modificación a lo largo del tiempo, etc.) una o más afecciones. Las realizaciones del método 100 y/o el sistema 200 pueden servir adicional o alternativamente para superar problemas con enfoques convencionales, como por ejemplo, aumentando la capacidad de multiplexado en las aplicaciones (p. ej., PCR digital), mejorando la precisión en las aplicaciones (p. ej., qPCR) y/o cualquier otra mejora adecuada. Sin embargo, las realizaciones pueden incluir cualquier funcionalidad adecuada.

Las realizaciones del método 100 y/o el sistema 200 se pueden usar en asociación con una o más afecciones (por ejemplo, en asociación con procesos de caracterización, diagnóstico, tratamiento y/o realización, relacionados con una o más afecciones, etc.), en donde las afecciones pueden incluir y/o estar asociadas con una o más entre: pruebas prenatales no invasivas (NIPT) (p. ej., en relación con la detección genética de la presencia de anomalías cromosómicas, incluida una aneuploidía, tal como la trisomía 21 o el síndrome de Down, la trisomía 18 o el síndrome de Edwards), la trisomía 13 o el síndrome de Patau, aneuploidías de los cromosomas sexuales tal como el síndrome de Turner, otras aneuploidías adecuadas, anomalías cromosómicas, que incluyen el síndrome de DiGeorge, en relación con una detección genética de trastornos de un solo gen, afecciones raras asociadas a variantes, etc.); otras pruebas prena­ tales; análisis de aneuploidías y/u otros análisis adecuados fuera de un contexto prenatal; trastornos genéticos (p. ej., trastornos de un solo gen, que incluyen la enfermedad de células falciformes y/o afecciones raras asociada a variantes; anomalías cromosómicas; trastornos asociados con la amplificación de genes; deleción de genes; anomalías cromosómicas parciales; síndrome de deleción 22q11.2 o síndrome de DiGeorge; síndrome de Charcot-Marie-Tooth, fibrosis quística, enfermedad de Huntington, distrofia muscular de Duchenne, hemofilia, talasemia, afecciones raras asociada a variantes, etc.), otras afecciones asociadas con anomalías cromosómicas (p. ej., ADN cromosómico adi­ cional, faltante, irregular, etc.), afecciones raras asociadas a variantes, cáncer (p. ej., mediante el análisis de amplifi­ caciones génicas de oncogenes en biopsias tumorales; mediante análisis asociados con uno o más entre los oncogenes HER2, MET, MYC-N, MYC-C, EGFR, FGFR1, ER/PR, KRAS, UGT1A1, c-KIT, CD20, CD30, FIP1L1-PDGFRalfa, PDGFR, VCR/ABL, PML/RAR-alfa, TPMT, UGT1A1, EML4/ALK, BRAF y/o cualquier otro oncogén, biomarcador de cáncer y/u otras dianas adecuadas asociadas al cáncer; analizar muestras de biopsias para evaluar la prevalencia de un ADN tumoral circulante a lo largo del tiempo para determinar y/o evaluar tratamientos tal como herceptina; etc.), y/o cualquier otra afección adecuada. Las afecciones pueden incluir adicional o alternativamente: afecciones psiquiá­ tricas y de comportamiento (por ejemplo, un trastorno psicológico, depresión, psicosis, etc.); afecciones relacionadas con la comunicación (p. ej., trastorno del lenguaje expresivo, tartamudeo, trastorno fonológico, trastorno de autismo, afecciones de la voz, afecciones auditivas, afecciones oculares, etc.); afecciones relacionadas con el sueño (por ejem­ plo, insomnio, apnea del sueño, etc.); afecciones relacionadas con el sistema cardiovascular (p. ej., enfermedad de las arterias coronarias, presión arterial alta, etc.); afecciones relacionadas con el metabolismo (p. ej., diabetes, etc.), afecciones relacionadas de tipo reumatoide (p. ej., artritis, etc.); afecciones relacionadas con el peso (p. ej., obesidad, etc.); afecciones relacionadas con el dolor; afecciones relacionadas con el sistema endocrino; afecciones relacionadas con la genética; enfermedad crónica; y/o cualquier otro tipo de afecciones adecuadas.

Las realizaciones del método 100 y/o el sistema 200 pueden transformar adicional o alternativamente entidades (por ejemplo, muestras, dianas, referencias, moléculas sintetizadas, usuarios, sistemas de manejo de muestras, sistemas de secuenciación, sistemas informáticos, etc.) en diferentes estados o cosas. Por ejemplo, el método 100 puede incluir la síntesis de moléculas adicionales (p. ej., moléculas asociadas a una diana, etc.) que incluyen regiones compartidas (p. ej., una secuencia de nucleótidos compartida) y regiones de variación (p. ej., una secuencia de nucleótidos aleatorizada) en relación con una diana biológica, en donde esas moléculas adicionales se pueden procesar junto con las moléculas diana (p. ej., coamplificadas con las moléculas diana, utilizando los mismos cebadores, etc.) para transfor­ marlas en formas adecuadas para una determinación precisa de la abundancia y minimizar el sesgo de la amplificación (p. ej., la coamplificación se produce con la misma eficiencia tanto en las moléculas asociadas con una diana como en las moléculas diana, etc.), como mediante la realización de una secuenciación de tipo Sanger y un análisis infor­ mático asociado basándose en los resultados de la secuenciación de tipo Sanger con las mezclas adicionales. Esos procedimientos pueden permitir una cuantificación de la abundancia que antes no se podía realizar (p. ej., para molé­ culas diana, para moléculas de una referencia, etc.), caracterizaciones de afecciones (p. ej., diagnósticos mejorados para una o más afecciones, etc.) y/o tratamiento (p. ej., facilitando una precisión mejorada para una cuantificación significativa y comparaciones de moléculas adicionales y moléculas diana, tal como moléculas diana asociadas con diferentes loci; facilitando la determinación de la abundancia a lo largo del tiempo para la provisión y evaluación de un tratamiento a lo largo del tiempo, etc.). Sin embargo, las realizaciones del método 100 y/o el sistema 200 pueden proporcionar cualquier otro beneficio adecuado, como en el contexto del uso de componentes no generalizados de porciones de realizaciones del sistema 200 para realizar porciones no convencionales de realizaciones del método 100.

Adicional o alternativamente, los datos descritos en este documento (p. ej., mediciones de la abundancia, caracteriza­ ciones, resultados de secuenciación, relaciones, identificadores, diseños de moléculas tales como diseños de molé­ culas asociadas a dianas, diseños de moléculas asociadas a referencias, diseños de cebadores, diseños de experi­ mentos, diseños de secuencias, diseños de regiones de secuencias; resultados experimentales; resultados de valida­ ción; datos relacionados con la afección; datos relacionados con el tratamiento; etc.) se pueden asociar con cualquier indicador temporal adecuado (por ejemplo, segundos, minutos, horas, días, semanas, períodos de tiempo, puntos de tiempo, marcadores de tiempo, etc.) incluyendo uno o más entre: indicadores temporales que indican cuándo se reco­ pilaron, determinaron, transmitieron, recibieron y/o procesaron de otro modo los datos; indicadores temporales que proporcionan un contexto al contenido descrito por los datos, tales como indicadores temporales que indican diferentes estadios de la generación de mezclas adicionales y/o preparación y/o secuenciación de bancos de secuenciación adecuados; cambios en los indicadores temporales (p. ej., datos a lo largo del tiempo, tales como mediciones de la abundancia a lo largo del tiempo, que se pueden usar para facilitar la caracterización de una o más afecciones y/o facilitar el tratamiento, tal como en relación con el control del estado del cáncer; cambios en los datos; patrones de datos, tendencias de datos, extrapolación de datos y/u otra predicción, etc.); y/o cualquier otro indicador adecuado relacionado con el tiempo.

Adicional o alternativamente, los parámetros, mediciones, entradas, resultados y/u otros datos adecuados descritos en este documento se pueden asociar con tipos de valores que incluyen uno cualquiera o más entre: puntuaciones, valores binarios, clasificaciones, niveles de confianza, identificadores (por ejemplo, identificadores de muestras, identificadores de moléculas para cualquier molécula adecuada descrita en este documento, etc.), valores a lo largo de un espectro y/o cualquier otro tipo adecuado de valor. Cualquier tipo adecuado de dato descrito en este documento puede usarse como entrada, generarse como resultado y/o manipularse de cualquier manera adecuada para cualquier com­ ponente adecuado, asociado con las realizaciones del método 100 y/o el sistema 200.

Una o más ejemplos y/o partes de las realizaciones del método 100 y/o los procedimientos descritos en el presente documento se pueden realizar de forma asincrónica (p. ej., secuencialmente), concurrente (p. ej., en paralelo; proce­ samiento concurrente de muestras de forma múltiple automatizada; procesamiento informático concurrente de resultados producidos por una secuenciación de tipo Sanger, tales como datos de picos y/o cromatogramas para mejorar la capacidad de procesamiento del sistema; cualquier procesamiento informático concurrente adecuado para cualquier cantidad adecuada de muestras, mezclas, resultados de secuenciación y/u otros componentes; preparación de muestras múltiples y/u operaciones de secuenciación; etc.), en relación temporal con un evento desencadenante, y/o en cualquier otro orden adecuado en cualquier momento y frecuencia adecuados mediante y/o usando uno o más ejemplos del sistema 200, componentes y/o entidades descritas en este documento.

Las realizaciones del sistema 200 pueden incluir una o más redes de manejo de muestras, configuradas para generar moléculas (p. ej., moléculas asociadas a una diana, moléculas asociadas a una referencia, etc.), procesar muestras (p. ej., muestras biológicas, muestras sintéticas, muestras de usuarios, etc.) y/o realizar otros procesos adecuados; uno o más sistemas de secuenciación (p. ej., sistemas de secuenciación de tipo Sanger, etc.) configurados para secuenciar material genético procesado a partir de mezclas adicionales, otras mezclas y muestras adecuadas y/o cual­ quier componente adecuado; uno o más sistemas informáticos (p. ej., un sistema informático remoto, sistema infor­ mático local, etc.) configurados para analizar los resultados de la secuenciación del uno o más sistemas de secuen­ ciación (p. ej., para determinar una o más mediciones de la abundancia; para facilitar las caracterizaciones de una o más afecciones, para facilitar el tratamiento, etc.); y/o cualquier otro componente adecuado. Las porciones de realiza­ ciones del método 100 y/o el sistema 200 son preferiblemente realizadas por una primera parte, pero además o alter­ nativamente pueden ser realizadas por una o más terceras partes, usuarios y/o cualquier entidad adecuada (por ejem­ plo, profesionales sanitarios, técnicos de laboratorio, etc.).

Sin embargo, el método 100 y el sistema 200 se pueden configurar de cualquier manera adecuada.

2.1 Generación de moléculas asociadas a una diana

Las realizaciones del método 100 pueden incluir la generación de una o más moléculas S110 asociadas a una diana (por ejemplo, asociadas con una o más dianas biológicas, etc.), que pueden servir para sintetizar una o más moléculas que comparten una o más características (por ejemplo, características de secuencia, características funcionales, ca­ racterísticas estructurales, características evolutivas, etc.) con una o más dianas (p. ej., dianas biológicas, etc.), que pueden facilitar parámetros de procesamiento de muestras similares (p. ej., afecciones con secuenciación de tipo Sanger para la secuenciación de una mezcla adicional que incluye las moléculas asociadas a una diana y las molécu­ las diana, para secuenciar las moléculas asociadas a una diana individualmente o las moléculas diana individualmente; parámetros de amplificación similares durante la amplificación basándose en una PCR, tal como mediante una coam­ plificación de moléculas asociadas a una diana y moléculas diana, de moléculas asociadas a una referencia y molé­ culas de una referencia, etc.) para reducir el sesgo (p. ej., el sesgo de la amplificación, etc.) y/o para mejorar la preci­ sión durante el procesamiento posterior (por ejemplo, para una estimación estadística tal como una regresión lineal; análisis de picos; asociación y/o identificación de parejas y/o conjuntos de bases de diferente secuencia para facilitar la determinación de la relación de la abundancia; desconvolución; ejecución de múltiples ejemplos de realizaciones del método 100 a lo largo del tiempo; etc.).

Las moléculas asociadas a una diana incluyen preferiblemente una o más secuencias asociadas a una diana (p. ej., secuencias de nucleótidos; cada molécula asociada a una diana de un conjunto de moléculas asociadas a una diana correspondiente a una secuencia de moléculas asociadas a una diana igual o similar, etc.), en donde una secuencia asociada a una diana puede incluir una o más regiones asociadas a una diana. Por ejemplo, una secuencia asociada a una diana puede incluir una región asociada a una diana con similitud de secuencia (p. ej., similitud de secuencia completa; similitud de secuencia superior a un porcentaje y/o una cantidad umbral, etc.) con una o más regiones de una secuencia diana de una o más secuencias diana de una o más dianas biológicas (por ejemplo, una secuencia diana correspondiente a la diana biológica; etc.), en donde una o más dianas biológicas pueden estar asociadas con una o más afecciones médicas.

Las regiones asociadas a una diana (y/o las moléculas asociadas a una diana y/o las secuencias asociadas a una diana) se asocian preferiblemente con (por ejemplo, secuencias compartidas de nucleótidos; conjuntos compartidos de bases con una secuencia diana en posiciones correspondientes; con capacidad de ser procesadas; capacidad de ser secuenciadas con el modo Sanger; capacidad de ser amplificadas, como a través de una coamplificación; capaci­ dad de ser dirigidas por los mismos cebadores; complementarias a; que se dirigen a; asociadas digitalmente en un sistema informático; etc.) una o más dianas biológicas y/o moléculas diana (por ejemplo, moléculas diana correspon­ dientes a dianas biológicas; moléculas diana que incluyen regiones de una secuencia diana de dianas biológicas; etc.). Las dianas biológicas (p. ej., marcadores de dianas; que se corresponden con, causantes, contribuyentes, agentes terapéuticos en relación con, correlacionadas y/o asociadas de otro modo con una o más afecciones médicas; dianas de interés; dianas conocidas o identificadas; dianas desconocidas o no identificadas previamente; etc.) pueden incluir una o más regiones de una secuencia diana (por ejemplo, secuencias que identifican un cromosoma; secuencias indicativas de una afección; secuencias que son invariables en una población y/o cualquier conjunto adecuado de sujetos; secuencias conservadas; secuencias que incluyen mutaciones, polimorfismos; secuencias de nucleótidos; secuencias de aminoácidos; etc.), genes (p. ej., asociados con uno o más trastornos de un solo gen, etc.), loci, cro­ mosomas (p. ej., asociados con una o más anomalías cromosómicas, etc.) proteínas (p. ej., proteínas séricas, anti­ cuerpos, etc.), péptidos, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos (p. ej., ARN extracelular, microARN, ARN mensajero, en donde la determinación de la abundancia de las dianas de ARN puede incluir operaciones adecuadas de una transcriptasa inversa, etc.), células (p. ej., células completas, etc.), metabolitos, productos naturales, biomarcadores del cáncer (p. ej., moléculas secretadas por tumores; moléculas secretadas como respuesta a la presencia de un cáncer; etc.), biomarcadores de predisposición genética, biomarcadores de diagnóstico, biomarcadores de pronóstico, biomarcadores predictivos, otros biomarcadores moleculares, marcadores de expresión génica, biomarcadores de formación de imágenes y/u otros dianas adecuadas. Las dianas se asocian preferiblemente con las afecciones des­ critas en el presente documento, y adicional o alternativamente se pueden asociar con una o más afecciones que incluyen: síntomas, causas, enfermedades, trastornos y/o cualquier otro aspecto adecuado asociado con las afeccio­ nes. En un ejemplo, las moléculas asociadas a una diana pueden incluir secuencias de nucleótidos idénticas a una o más regiones de una secuencia diana de una molécula diana (p. ej., que identifican el cromosoma 21), en donde los cebadores pueden dirigirse simultáneamente tanto a las moléculas asociadas a una diana como a las moléculas diana mediante un direccionamiento hacia regiones idénticas (p. ej., para facilitar una coamplificación, tal como para reducir el sesgo de una amplificación, etc.). En un ejemplo, tal y como se muestra en la FIGURA 3, una secuencia asociada a una diana (p. ej., la secuencia ''spk'') puede incluir regiones asociadas a una diana con similitud de secuencia con regiones de una secuencia diana de la secuencia diana (p. ej., la secuencia "hg19"), como cuando un conjunto de cebadores (p. ej., para un primer proceso de PCR, para un segundo proceso de PCR; "chr21:14439004_PCR2_FP", "chr21:14439076_PCR2_RP_hp", "chr21:14439004_PCR1_FP", "chr21:14439076_PCR1_RP"; cebadores de PCR que incluyen una o más secuencias de horquilla, etc.) pueden dirigirse tanto a la secuencia asociada a una diana como a la secuencia diana (por ejemplo, para facilitar una coamplificación y la correspondiente reducción de los sesgos de una amplificación, etc.). En un ejemplo, las moléculas asociadas a una diana pueden incluir secuencias con cualquier identidad de secuencia adecuada con las secuencias diana, en donde se puede usar cualquier cantidad y/o tipo de cebadores para un direccionamiento simultáneo o por separado a las moléculas asociadas a una diana y a las molé­ culas diana. En un ejemplo específico, los dianas biológicas pueden incluir secuencias diana que identifican un cro­ mosoma correspondiente a una afección asociada a una aneuploidía (p. ej., en relación con NIPT para aneuploidías en los cromosomas 21, 18, 13, etc.). En un ejemplo específico, las dianas biológicas pueden incluir secuencias diana que identifican oncogenes (p. ej., en relación con la determinación de mediciones del estadio de un cáncer, la evalua­ ción de tratamientos contra el cáncer, etc.). Sin embargo, las dianas (p. ej., las dianas biológicas, etc.) pueden confi­ gurarse de cualquier manera adecuada. Adicional o alternativamente, las moléculas asociadas a una diana (p. ej., regiones asociadas a una diana de moléculas asociadas a una diana, etc.) pueden compartir cualquier característica adecuada (p. ej., componentes, etc.) con dianas biológicas (p. ej., con moléculas diana correspondientes a dianas biológicas; etc.), como para facilitar parámetros de procesamiento de muestras similares para poder generar poste­ riormente comparaciones significativas entre las mediciones de la abundancia para las moléculas asociadas a una diana y las moléculas diana. Sin embargo, las moléculas asociadas a una diana pueden configurarse de cualquier manera adecuada.

Como se muestra en la FIGURA 11, las moléculas asociadas a una diana incluyen preferiblemente regiones de varia­ ción de una diana (p. ej., regiones de variación de secuencias asociadas a una diana de moléculas asociadas a una diana; cada molécula asociada a una diana incluye una o más regiones de variación, etc.), en donde una región de variación puede incluir características diferentes de las características de la molécula diana. Las regiones de variación incluyen preferiblemente una o más variaciones (p. ej., inserciones, deleciones, sustituciones, etc.), tales como varia­ ciones que pueden capacitar una molécula asociada a una diana correspondiente (p. ej., la molécula asociada a una diana que incluye una secuencia asociada a una diana que incluye la región de variación; etc.) para proceder a través de las operaciones del procesamiento de muestras de manera similar a las moléculas diana correspondientes (por ejemplo, ácidos nucleicos que incluyen una región de la secuencia diana de una diana biológica; etc.), al tiempo que se facilita una diferenciación de las moléculas asociadas a una diana de la moléculas diana (p. ej., durante la determi­ nación de resultados de una secuenciación; durante la determinación de mediciones de la abundancia, tal como al realizar un análisis de estimación estadística; para facilitar las caracterizaciones y/o tratamientos de una o más afec­ ciones médicas; durante el procesamiento posterior de resultados relacionados con cromatogramas de una secuen­ ciación de tipo Sanger de mezclas adicionales y/o muestras adecuadas, como durante la desconvolución de picos superpuestos para parejas de una base asociada a una diana y una base diana, tales como parejas correspondientes a posiciones de regiones de variación y/u otras regiones adecuadas; durante análisis de estimación estadística para ajustar las abundancias de las secuencias asociadas a una diana y las secuencias diana; etc.). Esa diferenciación puede facilitar la determinación de diferentes mediciones de la abundancia correspondientes que pueden compararse significativamente (p. ej., una comparación cuantitativa entre las intensidades de los picos de unas parejas y/o con­ juntos de bases; una comparación y/o combinación de mediciones de la abundancia individual, como para determinar mediciones de la abundancia global; como para facilitar la caracterización y/o el tratamiento, etc.). En un ejemplo, la región de variación puede incluir una región de variación de una secuencia que incluye una secuencia de nucleótidos que difiere de una región de una secuencia de la secuencia diana de una molécula diana. En un ejemplo específico, tal y como se muestra en la FIGURA 3, una secuencia asociada a una diana (p. ej., una secuencia "spk", etc.), puede incluir una deleción (p. ej., una deleción de tres nucleótidos, etc.) en relación con una región de una secuencia de la secuencia diana (por ejemplo, en relación con una región de una secuencia "att" de la secuencia diana "hg19"; etc.). Adicional o alternativamente, las regiones de variación pueden incluir cualquier cantidad adecuada de sustituciones, inserciones, deleciones y/u otras modificaciones de cualquier tamaño adecuado (por ejemplo, inserciones y/o deleciones de cualquier cantidad adecuada de nucleótidos; cualquier cantidad adecuada de mutaciones puntuales, tales como mutaciones de 10 puntos, etc.) en relación con cualquier base adecuada y/o tipo de base.

En un ejemplo específico, las regiones de variación pueden facilitar la determinación de resultados de una secuenciación (p. ej., intensidades de picos, área de picos, datos de picos, cromatogramas, etc.) para cualquier base asociada a una diana (p. ej., de una secuencia asociada a una diana, etc.) y/o una base diana (p. ej., de una secuencia diana, etc.), como cuando un resultado de una secuenciación (p. ej., la medición de la intensidad de un pico) para una base asociada a una diana en una o más regiones (p. ej., una región asociada a una diana, una región de variación, etc.) se puede comparar con el resultado de una secuenciación (p. ej., una medición de la intensidad de un pico, etc.) para una base diana correspondiente en una posición diferente (p. ej., en donde una posición de una base correspondiente se puede desplazar debido a una o más inserciones y/o deleciones de una región de variación, etc.) o en la misma posición (p. ej., para sustituciones puntuales de una región de variación, etc.), como para determinar una o más me­ diciones de la abundancia. En un ejemplo específico, tal y como se muestra en la FIGURA 11, la molécula asociada a una diana puede incluir una región de variación de la secuencia de nucleótidos que difiere de la correspondiente secuencia de nucleótidos diana en 10 bases (p. ej., en donde la secuencia diana incluye una región "TCTTGGATAG" y en donde la región de variación incluye una región "CTGGTTTAGA" en las posiciones correspondientes, etc.), en donde cada una de las 10 diferencias en las bases puede permitir una medición de la relación entre la abundancia individual diferente de endógeno con adicional que se puede usar para generar una relación de la abundancia global de precisión mejorada. Adicional o alternativamente, la región de variación puede incluir diferencias (p. ej., en relación con una secuencia diana, etc.) de cualquier cantidad adecuada de bases.

Las regiones de variación se pueden diseñar en coordinación con las regiones asociadas a una diana para facilitar una disimilitud de secuencia y una similitud de secuencia apropiadas, respectivamente (p. ej., determinando caracte­ rísticas de las regiones de variación y/o las regiones asociadas a una diana para facilitar resultados de secuenciación mejorados proporcionando parámetros de secuenciación asociados con las tecnologías de secuenciación, como la secuenciación de tipo Sanger, etc.).

Las regiones de variación de una secuencia pueden diferir en las secuencias diana con cualquier cantidad y tipo de bases adecuados, en cualquier posición adecuada (p. ej., posiciones secuenciales, no secuenciales, etc.), a través de cualquier locus adecuado, para cualquier cromosoma adecuado y/u otra diana, y/o pueden diferir de las secuencias diana de cualquier forma adecuada. Las regiones de variación de una secuencia pueden incluir una o más sustitucio­ nes, inserciones, deleciones, cualquier tipo de mutación adecuada y/o cualquier modificación adecuada (p. ej., en relación con una o más regiones de una secuencia de una secuencia diana y/o una diana biológica; etc.).

En una variación, las regiones de variación de una secuencia pueden incluir bases mezcladas aleatoriamente (por ejemplo, con una relación igual de tipos de bases, en porciones predeterminadas para los tipos de bases, etc.). En una variación, el método 100 puede incluir la selección de bases de la secuencia diana para modificar (por ejemplo, basándose en la optimización de resultados de los obtenidos con la secuenciación de tipo Sanger, como mediante una selección de una secuencia específica de tipos de bases para tener en cuenta una dependencia de la calidad del resultado de la secuenciación de tipo Sanger en el orden de las bases y del tipo de bases en una secuencia; basándose en facilitar una estimación estadística, falta de mezcla, desconvolución durante el procesamiento posterior informático; basándose en una cantidad de diferencias de bases requerida para lograr una precisión de la medición umbral de la abundancia, mientras se minimizan los sesgos de la amplificación, etc.).

Adicional o alternativamente, las regiones de variación pueden incluir regiones de variación que no son secuencias, con características funcionales, estructurales, evolutivas y/u otras características adecuadas que son diferentes de las características de una o más moléculas diana (por ejemplo, de cualquier tipo adecuado, etc.). Sin embargo, las regio­ nes de variación se pueden configurar de cualquier manera adecuada, y las moléculas asociadas a una diana pueden incluir cualquier región de una secuencia de nucleótidos adecuada.

En las variaciones, las moléculas asociadas a una diana pueden incluir una o más regiones de secuenciación (p. ej., de moléculas de secuenciación, etc.) configuradas para ayudar en las operaciones de secuenciación S130 (p. ej., operación de sistemas de secuenciación; determinación de resultados de la secuenciación, como mayor precisión y/o de una forma que permita una comparación cuantitativa y/o cuantificación, etc.), determinando las mediciones de la abundancia S140 y/o cualquier porción adecuada del método 100 (p. ej., facilitando las caracterizaciones S150 y/o facilitando el tratamiento S16; etc.). En una variación, una molécula asociada a una diana (p. ej., una secuencia aso­ ciada a una diana de una molécula asociada a una diana, etc.) puede incluir (p. ej., mediante una adición, etc.) una o más regiones de secuencias asociadas a Sanger (p. ej., configurada para mejorar los resultados de una secuenciación de tipo Sanger, etc.) y/o cualquier región de secuenciación adecuada, que puede incluir una o más regiones adiciona­ les asociadas a una diana (p. ej., con similitud de secuencia con regiones de una secuencia diana adicionales de una o más secuencias diana, como secuencias diana iguales o diferentes, de una o más dianas biológicas, como dianas biológicas iguales o diferentes, etc.); repeticiones de secuencia (p. ej., de cualquier región adecuada de moléculas asociadas a una diana, moléculas diana, moléculas asociadas de una referencia, moléculas de una referencia, cual­ quier secuencia, región y/o molécula adecuada descrita en el presente documento, etc.); y/o cualquier región de se­ cuencia adecuada (p. ej., regiones de secuenciación descritas en el presente documento en relación con su adición a una o más moléculas, etc.).

En una variación, las regiones de secuencias asociadas a Sanger pueden incluir secuencias de nucleótidos específicos (p. ej., de una longitud predeterminada, con nucleótidos específicamente seleccionados, etc.) que preceden (y/o se encuentran en cualquier relación posicional adecuada con) a una región de variación de secuencia y/o a otra región adecuada de la molécula asociada a una diana, lo que puede facilitar un reposicionamiento de la región de variación de la secuencia para que esté en posiciones (p. ej., en las bases 100-500, en las bases 200-500, durante la secuenciación de tipo Sanger y/o en cualquier posición adecuada) correspondientes a resultados mejorados relacio­ nados con un cromatograma de secuenciación de tipo Sanger. En un ejemplo específico, se puede aplicar la química de Sanger BigDye 1.1 para mejorar la precisión en relación con las regiones iniciales de una secuencia (por ejemplo, en donde se pueden omitir LCR y/o RCA, como se muestra en las FIGURAS 13A-13B, etc.). En un ejemplo específico, la química de Sanger BigDye 3.1 se puede aplicar para permitir lecturas de secuenciación más largas, en donde se puede usar una región de secuencia inicial (p. ej., alrededor de 200 pb y/u otro tamaño adecuado) (p. ej., insertada antes de la región de la secuencia diana y/o la región de la secuencia asociada a una diana) para mejorar la precisión (p. ej., a través de LCR y/o RCA, como se muestra en las FIGURAS 13A-13B, lo que puede permitir una multiplexación). Sin embargo, las regiones de secuencias asociadas a Sanger se pueden configurar de cualquier manera ade­ cuada.

Adicional o alternativamente, las moléculas de secuenciación pueden incluir cebadores de secuenciación configurados para facilitar procesos mediante sistemas de secuenciación, secuencias adaptadoras y/u otros componentes adecua­ dos, asociados con cualquier sistema de secuenciación adecuado. Sin embargo, las moléculas de secuenciación pue­ den configurarse de cualquier manera adecuada.

Las moléculas asociadas a una diana (y/u otros componentes adecuados descritos en este documento, como molé­ culas asociadas a una referencia, componentes de mezclas adicionales, etc.) pueden tener cualquier tamaño ade­ cuado (p. ej., 100-500 pares de bases, 200-500 pares de bases, de longitud e incluir repeticiones de regiones de una secuencia, como regiones asociadas a una diana y/o regiones de variación; una longitud similar o diferente a la de las moléculas diana; 80-150 pares de bases de longitud, incluir una región de variación de 10 pares de bases de tipos de bases mezcladas, etc.). El conjunto de moléculas asociadas a una diana puede incluir cualquier cantidad de moléculas asociadas a una diana asociadas con cualquier cantidad adecuada de dianas (p. ej., cualquier cantidad de secuencias diana asociadas con cualquier cantidad de loci, cromosomas, biomarcadores de cáncer, biomarcadores diana, etc.), muestras (p. ej., sintetizar simultáneamente un lote de moléculas para usar con muestras de varios usuarios, para usar con varias muestras para un solo usuario, para mejorar la eficiencia del sistema de manipulación de muestras, etc.), afecciones (p. ej., un conjunto de moléculas asociadas a una diana asociadas con dianas biológicas asociadas con diferentes afecciones, etc.) y/u otros aspectos adecuados.

En variaciones, la generación de moléculas asociadas a una diana puede incluir la generación de diferentes tipos de moléculas asociadas a una diana (p. ej., que incluyen diferentes regiones asociadas a una diana, diferentes regiones de variación, moléculas de secuencias diferentes, etc.), como conjuntos de moléculas asociadas a una diana (p. ej., correspondiendo cada conjunto a un tipo diferente de moléculas asociadas a una diana, etc.). Las moléculas asociadas a una diana pueden incluir conjuntos de moléculas asociadas a una diana (p. ej., una pluralidad de conjuntos diferen­ tes, etc.), incluyendo cada conjunto una región asociada a una diana diferente asociada con (p. ej., con similitud de secuencia con, etc.) una región de una secuencia diana diferente (por ejemplo, diferentes regiones de una secuencia diana de una misma secuencia diana y/o una diana biológica tal como un cromosoma; diferentes regiones de una secuencia diana de diferentes secuencias diana y/o dianas biológicas tal como diferentes genes, etc.), que pueden facilitar diferentes pares y/o conjuntos de un tipo de región asociada a una diana (p. ej., correspondiente a una se­ cuencia específica de la región asociada a una diana, etc.) y un tipo de región de secuencia diana (p. ej., correspon­ diente a una secuencia diana específica de una diana biológica, etc.), y/o diferentes pares y/o conjuntos de bases (p. ej., en donde las bases de la pareja y/o el conjunto pueden proceder de una secuencia asociada a una diana y una secuencia diana, etc.), como para determinar mediciones de la abundancia correspondientes tales como relaciones de abundancias individuales (por ejemplo, correspondientes a las diferentes parejas; tales como relaciones de abun­ dancias individuales correspondientes a diferentes conjuntos de bases, en donde los diferentes conjuntos de bases pueden corresponder a diferentes loci de una diana biológica cromosómica; etc.), que se pueden utilizar para deter­ minar una medición de la abundancia global con mayor precisión, por ejemplo, promediando y/o realizando cualquier operación de combinación adecuada con las mediciones de abundancias individuales.

En un ejemplo específico, se pueden asociar diferentes conjuntos de moléculas asociadas a una diana con diferentes secuencias diana (y/o regiones de secuencias dianas, etc.) a través de diferentes loci. En un ejemplo específico, cada conjunto se puede asociar con un locus diferente para el mismo cromosoma (p. ej., un locus primero, segundo, tercero y cuarto para un cromosoma, como se muestra en la FIGURA 9, etc.), en donde una secuencia de una molécula asociada a una diana de un conjunto determinado puede incluir una región con una secuencia compartida con el locus correspondiente con el conjunto, y puede incluir una región de variación de secuencia que difiere (p. ej., por insercio­ nes, deleciones, sustituciones de bases, etc.) de la secuencia para el locus.

Se puede generar y/o asociar cualquier cantidad de conjuntos de moléculas asociadas a una diana y/o cualquier cantidad de tipos de moléculas asociadas a una diana con cualquier cantidad adecuada de dianas biológicas. En un ejemplo, la selección de diferentes conjuntos de moléculas asociadas a una diana puede basarse en parámetros de secuenciación, requisitos de precisión para una afección y/o aplicación determinada (p. ej., seleccionar una cantidad de conjuntos para lograr una cantidad adecuada correspondiente de mediciones de abundancias individuales con el fin de lograr una precisión en la diana para diagnosticar el síndrome de Down) y/o se puede seleccionar basándose en cualquier criterio adecuado (por ejemplo, parámetro a optimizar). Sin embargo, la generación de diferentes conjun­ tos de moléculas asociadas a una diana se puede realizar de cualquier manera adecuada.

La generación de moléculas asociadas a una diana puede incluir la determinación de secuencias diana (p. ej., regiones de una secuencia diana de secuencias diana; cualquier región adecuada de secuencias diana, etc.), lo que puede servir para seleccionar secuencias diana sobre las que se puede basar la generación de moléculas asociadas a una diana. La determinación de las secuencias diana puede basarse en uno cualquiera o más entre: afección (p. ej., se­ lección de secuencias diana que identifiquen el cromosoma 21 para facilitar el diagnóstico del síndrome de Down; selección de secuencias diana que identifiquen oncogenes, etc.), parámetros de secuenciación (p. ej., selección de secuencias diana de una determinada longitud, secuencia de nucleótidos y/u otro parámetro para optimizar la calidad de resultados relacionados con cromatogramas procedentes de una secuenciación de tipo Sanger; para generar re­ sultados relacionados con cromatogramas adecuados para un análisis de estimación estadística y/u otros parámetros adecuados; para reducir costes, mejorar la precisión, mejorar la reproducibilidad y/o para otras optimizaciones ade­ cuadas en relación con los sistemas de secuenciación y/o las operaciones, etc.); parámetros de amplificación (p. ej., selección de secuencias diana de una longitud particular, secuencia de nucleótidos y/u otro parámetro para optimizar la especificidad de la amplificación, como en relación con la especificidad del cebador para las secuencias diana en relación con una amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa, etc.), otros parámetros de procesamiento de muestras y/u otros criterios adecuados. En un ejemplo, la determinación de secuencias diana puede incluir la búsqueda informática en una base de datos (p. ej., base de datos de ADN, base de datos del genoma, base de datos de expresión génica, base de datos de fenotipos, base de datos de ARN, bases de datos de proteínas, etc.) para generar una lista de candidatos para una secuencia diana; y filtrar la lista de candidatos para una secuencia diana basándose en criterios descritos en el presente documento y/o cualquier criterio adecuado. En un ejemplo específico, la determinación de secuencias de direccionamiento puede incluir la extracción de una lista de candidatos para se­ cuencias diana (p. ej., basándose en una extracción del exoma; fusión en fragmentos de una cantidad adecuada de pares de bases; etc.); filtrar candidatos que incluyen tipos definidos de mutaciones y/o polimorfismos (por ejemplo, filtrar candidatos asociados con polimorfismos comunes de un solo nucleótido para obtener candidatos con invariancia relativa entre los sujetos de una población, etc.); identificar cebadores para los candidatos restantes (p. ej., con un Primer-BLAST para amplicones de 80-150 pb); y determinar las regiones candidatas que son adecuadas para la va­ riación al generar una región de variación de una molécula asociada a una diana (p. ej., mediante una mezcla de bases en posiciones relacionadas con un cebador directo y/u otra región de la secuencia, etc.). Sin embargo, la determinación de las secuencias diana se puede realizar de cualquier manera adecuada.

La generación de moléculas asociadas a una diana puede incluir la síntesis de las moléculas mediante la realización de uno cualquiera o más entre: amplificación (por ejemplo, amplificación con PCR, como con cebadores de PCR que incluyen una o más secuencias de horquilla, etc.), síntesis de ácido nucleico basándose en plásmidos (por ejemplo, incluyendo moléculas asociadas con una diana y moléculas asociadas con una referencia, respectivamente, corres­ pondientes a diferentes loci de un cromosoma diana y un cromosoma de referencia; utilizando plásmidos que incluyen cualquier sitio de corte adecuado, origen de sitios de replicación, sitios de clonación múltiples, marcadores seleccionables, marcadores informadores, estructuras principales y/u otros componentes; etc.), otras técnicas de síntesis de genes artificiales, técnicas de amplificación (p. ej., reacción en cadena de la polimerasa, amplificación con círculo rodante, etc.), técnicas de ligación (p. ej., reacción de ciclado de la ligasa, etc.), enfoques de fosforamidita, procesa­ miento post-sintético, purificación (por ejemplo, usando cromatografía líquida de alta resolución u otros enfoques cromatográficos, desalinización, lavado, centrifugado, etc.), técnicas de marcado (p. ej., técnicas de marcado molecular, técnicas de marcado fluorescente, técnicas de marcado de partículas, etc.), técnicas de clonación de moléculas y/o cualquier técnica adecuada para el procesamiento de muestras.

En una variación, la síntesis de moléculas asociadas a una diana puede incluir la generación de una secuencia aso­ ciada a una diana que incluye una pluralidad de regiones de secuencias asociadas con diferentes dianas (por ejemplo, diferentes loci en el mismo cromosoma, diferentes loci de diferentes cromosomas, diferentes oncogenes, etc.). En un ejemplo específico, se puede configurar un tipo de molécula asociada a una diana para reducir la cantidad de opera­ ciones de secuenciación requeridas (por ejemplo, un tipo de molécula asociada a una diana que facilita la generación de un resultado relacionado con el cromatograma, que informa sobre una pluralidad de dianas y se genera usando una única ejecución de la secuenciación de tipo Sanger, etc.); sin embargo, los tipos de moléculas asociadas a una diana se pueden sintetizar para optimizar cualquier parámetro adecuado. Adicional o alternativamente, se puede ge­ nerar cualquier cantidad adecuada de moléculas y/o tipos de moléculas asociadas con cualquier cantidad de dianas en cualquier momento y con una frecuencia adecuados.

Sin embargo, la generación de moléculas asociadas a una diana S110 se puede realizar de cualquier manera ade­ cuada.

2.2 Generación de una mezcla adicional

Las realizaciones del método 100 pueden incluir generar (p. ej., facilitar la generación de, etc.) una o más mezclas adicionales S120 (p. ej., basándose en el procesamiento del conjunto de moléculas asociadas a una diana con molé­ culas diana de una o más muestras procedentes de un usuario, etc.), que pueden servir para amplificar (p. ej., con parámetros de amplificación similares), realizar un preprocesamiento (p. ej., preparación de muestras, lisis, procesos basados en perlas, otras técnicas de purificación y/o extracción de ácidos nucleicos, etc.), modificar (p. ej., generar repeticiones de secuencias, combinar secuencias asociadas con diferentes dianas, etc.) y/o procesar de otro modo las moléculas asociadas a una diana, moléculas diana y/u otras moléculas adecuadas (p. ej., moléculas asociadas a una referencia, moléculas de una referencia, etc.) en una forma adecuada para el análisis posterior (p. ej., secuencia­ ción de tipo Sanger, etc.) y la determinación de una medición de la abundancia (p. ej., basándose en los resultados de la secuenciación de tipo Sanger, etc.). Las muestras recogidas (p. ej., muestras biológicas; recogidas utilizando recipientes para muestras proporcionados a los usuarios en kits de recogida de muestras) pueden incluir una cual­ quiera o más entre: sangre, plasma, suero, tejido, biopsias (p. ej., biopsias de tumores, etc.), sudor, orina, heces, semen, secreciones vaginales, lágrimas, fluido intersticial, otros fluidos corporales y/o cualquier otra muestra adecuada (por ejemplo, asociada con un usuario humano, animal, objeto como un alimento, microorganismos, etc.). En ejemplos, como para NIPT, las muestras biológicas pueden incluir una o más muestras maternas. Las muestras incluyen prefe­ rentemente moléculas diana (p. ej., moléculas de ácido nucleico que incluyen una o más secuencias diana y/o regiones de una secuencia diana, etc.) y/o moléculas de una referencia (p. ej., moléculas de ácido nucleico que incluyen una o más secuencias de una referencia y/o regiones de una secuencia de una referencia, etc.), como cuando las moléculas diana pueden amplificarse con las moléculas asociadas a una diana con parámetros similares; en donde las moléculas de una referencia pueden amplificarse con las moléculas asociadas a una referencia con parámetros similares; etc.). De manera adicional o alternativa, las muestras pueden incluir componentes (por ejemplo, moléculas diana) proce­ dentes de múltiples usuarios (por ejemplo, una muestra de sangre que incluye ácidos nucleicos de una madre y ácidos nucleicos del feto sin nacer de la madre, en donde la mezcla de ácidos nucleicos puede ser indicativa de una abun­ dancia anormal del cromosoma 21, etc.), componentes recogidos a lo largo de múltiples períodos de tiempo y/o com­ ponentes que varían en cualquier afección adecuada, de modo que la generación de mezclas adicionales se pueda realizar para cualquier cantidad y tipo adecuado de entidades.

La generación de una o más mezclas adicionales preferiblemente incluye combinar moléculas asociadas a una diana con moléculas diana (p. ej., ácidos nucleicos que incluyen regiones de una secuencia diana y/o secuencias diana, etc.) de la muestra; y/o combinar moléculas asociadas a una referencia con moléculas de una referencia; y/o combinar cualquier molécula adecuada. La combinación puede incluir uno o más entre: combinar cada una de las moléculas en una sola mezcla (p. ej., incluir diferentes subconjuntos de moléculas asociadas a una diana y subconjuntos correspon­ dientes de moléculas diana; etc.); submuestrear la muestra (p. ej., una muestra preprocesada) en una pluralidad de mezclas, cada una designada para un subconjunto diferente de moléculas asociadas a una diana (p. ej., correspon­ dientes a diferentes loci diana para un cromosoma diana, etc.); submuestrear la muestra en diferentes mezclas para moléculas asociadas a una diana y moléculas asociadas a una referencia; y/o cualquier otro enfoque adecuado para combinar las moléculas. En un ejemplo, las moléculas diana y las moléculas asociadas a una diana (por ejemplo, diferentes parejas de tipos de moléculas diana y moléculas asociadas a una diana; correspondientes a diferentes parejas de regiones asociadas a una diana y regiones de secuencia diana; asociadas con una pluralidad de dianas diferentes; etc.) pueden amplificarse en el mismo compartimento (p. ej., tubo, etc.) (y/o cualquier cantidad adecuada de compartimentos), como por ejemplo a través de una PCR múltiple y/o procesos de amplificación adecuados, que pueden facilitar la conservación de una muestra valiosa; y los productos de amplificación resultantes se pueden submuestrear posteriormente en mezclas distintas para una posterior secuenciación de tipo Sanger individual dirigida a diferentes tipos de dianas (por ejemplo, usando un cebador de secuenciación de tipo Sanger asociado con una región invariable, tal como una región con similitud de secuencia, compartida por la región asociada a una diana y la región de la secuencia diana, etc.). En los ejemplos, el submuestreo y/u otras operaciones de modificación de muestras se pueden realizar en cualquier orden adecuado.

Adicional o alternativamente, se pueden generar muestras distintas (por ejemplo, mezclas, soluciones, etc.) para dife­ rentes tipos de moléculas (por ejemplo, sin combinar diferentes tipos de moléculas). Por ejemplo, se puede generar una primera muestra que incluye moléculas asociadas a una diana (p. ej., sin moléculas diana), y se puede generar una mezcla de muestras que incluye moléculas diana (p. ej., sin moléculas asociadas a una diana), en donde la primera y la segunda mezcla se pueden utilizar por separado en un procesamiento posterior (p. ej., realizar ejecuciones distin­ tas de una secuenciación de tipo Sanger para generar resultados relacionados con cromatogramas distintos, como cromatogramas distintos que se pueden usar durante una estimación estadística, desconvolución y/u otras operacio­ nes de procesamiento informático, como para determinar mediciones de la abundancia, etc.). Sin embargo, se puede generar y/o procesar cualquier cantidad adecuada de muestras que incluya cualquier tipo distinto o combinado ade­ cuado de moléculas.

La combinación de moléculas incluye preferiblemente el uso de una abundancia conocida de moléculas asociadas a una diana, pero también se puede usar una abundancia desconocida de moléculas diana (p. ej., en donde los resul­ tados de ejecuciones de secuenciación previas con abundancia desconocida se pueden usar para dar cuenta de resultados a partir de ejecuciones de secuenciación posteriores, etc.). Además, la combinación de moléculas incluye preferiblemente el uso de abundancias iguales o sustancialmente similares en diferentes subconjuntos de moléculas asociadas a una diana (por ejemplo, asociadas con diferentes loci) y/o abundancias iguales o similares en relación con moléculas asociadas a una referencia. Adicional o alternativamente, se puede usar cualquier abundancia ade­ cuada para diferentes tipos de moléculas.

En una variación, la combinación de moléculas puede incluir una modificación (p. ej., durante el preprocesamiento) de las abundancias de moléculas asociadas a una diana, moléculas asociadas a una referencia y/u otros componentes adecuados. Por ejemplo, la modificación de la abundancia de las moléculas puede incluir la medición de la abundancia inicial de las moléculas (por ejemplo, la abundancia de las moléculas asociadas a una diana); y modificar las abun­ dancias (p. ej., mediante dilución, amplificación, etc.) basándose en las abundancias esperadas de las moléculas diana (p. ej., recuento esperado de moléculas diana endógenas en la muestra, etc.). En una variación, la generación de mezclas adicionales puede omitir una modificación (p. ej., durante el preprocesamiento) de las abundancias (p. ej., en donde los resultados de la abundancia para un primer ejemplo de una realización del método 100, pueden usarse para determinar un factor de corrección que va a ser utilizado en ejemplos posteriores de la realización del método 100, etc.). Sin embargo, la combinación de moléculas se puede realizar de cualquier manera adecuada.

La generación de la mezcla adicional preferiblemente incluye amplificar las moléculas asociadas a una diana con las moléculas diana. La amplificación puede incluir la realización de una cualquiera o más de las siguientes técnicas: técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (p. ej., PCR en fase sólida, RT-PCR, qPCR, PCR múltiple, PCR de contacto, nanoPCR, PCR anidada, PCR de inicio en caliente, etc.), amplificación dependiente de helicasa (HDA), amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), replicación de secuencias autosostenida (3SR), amplifi­ cación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), am­ plificación por círculo rodante (RCA), reacción en cadena de la ligasa, reacción de ciclación de la ligasa (LCR) y/o cualquier otra técnica de amplificación adecuada y/o protocolos asociados (por ejemplo, protocolos para minimizar el cuello de botella de una amplificación). En un ejemplo, tal y como se muestra en la FIGURA 3, generar una mezcla adicional puede incluir realizar una pluralidad de rondas de PCR (p. ej., cualquier cantidad de rondas de PCR) para coamplificar las moléculas asociadas a una diana con las moléculas diana (p. ej., usando conjuntos de cebadores dirigidos a una secuencia compartida tanto por las moléculas asociadas a una diana como por las moléculas diana; usando diferentes conjuntos de cebadores correspondientes a diferentes tipos y secuencias de cebadores, como se muestra en la FIGURA 3, en donde uno o más de los conjuntos de cebadores pueden incluir una o más secuencias de horquilla, como para facilitar la adición de repeticiones de secuencia, etc.).

En una variación, generar una mezcla adicional y/o porciones adecuadas de realizaciones del método 100 (p. ej., en variaciones en donde las muestras que incluyen moléculas asociadas a una diana se preparan y se secuencian de forma independiente a partir de muestras que incluyen moléculas diana; en variaciones en donde las muestras que incluyen moléculas asociadas a una referencia se preparan y se secuencian de forma independiente a partir de mues­ tras que incluyen moléculas de una referencia, etc.) puede incluir añadir una o más regiones de una secuencia a una o más moléculas (p. ej., una o más regiones y/o secuencias de una o más moléculas; para moléculas asociadas a una diana, para moléculas diana, para moléculas asociadas a una referencia, para moléculas de una referencia, etc.).

Añadir regiones de una secuencia puede incluir uno o más entre: generar repeticiones de secuencias (p. ej., generar una secuencia modificada que incluye repeticiones de una secuencia asociada a una diana y/o una secuencia diana; etc.); añadir regiones de secuencias que identifiquen diferentes dianas (por ejemplo, diferentes loci de un cromosoma identificado por la diana original; loci de diferentes cromosomas; regiones de secuencias asociadas con diferentes afecciones, etc.); y/o añadir cualquier secuencia de nucleótidos adecuada. Por ejemplo, el método 100 puede incluir añadir al menos una región de una secuencia a al menos uno del conjunto de moléculas asociadas a una diana y las moléculas diana, en donde al menos una región de una secuencia incluye al menos uno entre (a) una segunda región asociada a una diana con similitud de secuencia con una segunda región de una secuencia diana (p. ej., en donde el conjunto de moléculas diana incluye una primera región asociada a una diana con similitud de secuencia con una primera región de una secuencia diana de una secuencia diana de una diana biológica, etc.), y (b) al menos una repetición de secuencias de al menos una entre una región de la secuencia asociada a una diana y una región de la secuencia diana.

La adición de regiones de una secuencia puede servir para: facilitar una mejor calidad de los resultados de los sistemas de una secuenciación (p. ej., calidad de los resultados del cromatograma), por ejemplo, mediante la adición de regio­ nes de una secuencia que preceden posicionalmente a las regiones de variación en las que se basará la extracción de la medición de la abundancia (p. ej., en donde las regiones de una secuencia añadida pueden permitir el reposicionamiento de las regiones de variación para que estén en posiciones correspondientes a resultados de secuenciación mejorados, etc.); facilitar la determinación de las mediciones de la abundancia individuales adicionales para las regio­ nes de secuencias añadidas (p. ej., mediante el análisis de repeticiones de secuencias de la región de variación en relación con las bases diana correspondientes, etc.), que se pueden usar para calcular una medición de la abundancia global con una precisión mejorada; facilitar la reducción de la cantidad y/o el coste de las operaciones de secuenciación requeridas (p. ej., menos ejecuciones de secuenciaciones de tipo Sanger, etc.) para analizar una pluralidad de dianas (p. ej., a lo largo de diferentes loci, cromosomas, etc.), tal como mediante la ligación de diferentes secuencias asocia­ das con diferentes dianas.

En un ejemplo, el método 100 puede incluir la adición de al menos una repetición de secuencias (por ejemplo, para facilitar la secuenciación de pases múltiples, tal como secuenciar secuencias una pluralidad de veces, tal como en la misma ejecución de una secuenciación o en diferentes ejecuciones, tal como para aumentar los datos de resultados de una secuenciación, de modo que los datos de los resultados de una secuenciación y/o las mediciones de la abun­ dancia asociada se puedan promediar y/o combinar de otro modo, tal como para reducir el ruido, etc.) a una o más moléculas asociadas a una diana (p. ej., una o más regiones de un secuencia asociada a una diana de las moléculas asociadas a una diana, etc.) y/o una o más moléculas diana (p. ej., una o más regiones de una secuencia diana de las moléculas diana, etc.), como cuando el primer conjunto de picos de al menos un resultado relacionado con el croma­ tograma (p. ej., cromatograma, intensidades de picos, otros datos de picos, etc.) corresponde a una primera secuen­ ciación (p. ej., a partir de una operación de secuenciación de tipo Sanger, etc.) para la región asociada a una diana, la región de una secuencia diana de la diana biológica, la región de variación de una diana y la región de una secuencia de la diana biológica, en donde al menos un resultado relacionado con el cromatograma incluye un segundo conjunto de picos correspondiente a una segunda secuenciación (por ejemplo, a partir de la misma operación de secuenciación de tipo Sanger, etc.) para la región asociada a una diana, la región de una secuencia diana de la diana biológica, la región de variación de la diana y la región de una secuencia de la diana biológica, y en donde la determinación de un conjunto de relaciones de abundancias asociadas a una diana puede basarse en el primer conjunto de picos y el segundo conjunto de picos (p. ej., basándose en las relaciones de abundancias individuales de las intensidades de los picos, a partir del primer y segundo conjunto de picos, para pares de bases de la secuencia diana y la secuencia asociada a una diana; etc.).

En una variación, añadir una o más regiones de una secuencia (p. ej., repeticiones de secuencias, etc.) puede basarse en una o más secuencias de horquilla (p. ej., de cebadores, como los que se usan en la amplificación con PCR, etc.), como cuando la amplificación con cebadores de PCR que incluyen una o más secuencias de horquilla pueden hacer posible una pluralidad de ejemplos de extensión de nucleótidos (p. ej., mediante autocebado) para añadir repeticiones de secuencias que pueden ser secuenciadas por el método Sanger. En un ejemplo, tal y como se muestra en la FIGURA 3, añadir una o más repeticiones de secuencias (por ejemplo, a cualquier molécula adecuada, etc.) puede incluir una coamplificación (y/o una amplificación por separado), con uno o más conjuntos de cebadores que incluyen uno o más secuencias de horquilla (por ejemplo, "chr21:14439076_PCR2_RP_hp", como se muestra en las FIGURAS 3 y 4), el conjunto de moléculas asociadas a una diana y moléculas de ácido nucleico de la muestra (por ejemplo, muestra materna, muestra biológica, etc.), en donde las moléculas de ácido nucleico incluyen la región de la secuencia diana. En un ejemplo, los cebadores (por ejemplo, cebadores de PCR) que incluyen una secuencia de horquilla pueden incluir una o más porciones (por ejemplo, porciones de una secuencia, porciones estructurales, etc.) de una secuencia que se muestra en las FIGURAS 3 y 4 ("chr21:14439076_PCR2_RP _hp"). En un ejemplo, los productos resultantes (p. ej., moléculas resultantes, etc.) de añadir una o más regiones de secuencias (p. ej., repeticiones de secuencias, etc.) basándose en una o más secuencias de horquilla, pueden incluir una o más porciones (p. ej., porciones de secuencias, porciones estructurales, etc.) de las secuencias que se muestran en las FIGURAS 5A-5E (p. ej., en donde las FIGURAS 5A-5E ilustran una secuencia completa, con la secuencia de la FIGURA 5A conectada a la secuencia de la FIGURA 5B, conectada a la secuencia de la FIGURA 5C, conectada a la secuencia de la FIGURA 5D y conectada a la secuencia de la FIGURA 5E, etc.).

En los ejemplos, si se usa una horquilla solo en un extremo de la secuencia (p. ej., de una secuencia de cebador de PCR), se obtiene una secuencia de tipo Sanger de dos pases (p. ej., resultados relacionados con un cromatograma que incluyen resultados de picos para dos pases de la secuencia). En un ejemplo, una contribución significativa de la secuencia de tipo Sanger de dos pases es que la segunda secuencia (por ejemplo, el segundo conjunto de datos de picos y/o resultados adecuados relacionados con un cromatograma para la secuencia, etc.) puede ser más informativa y más limpia en el contenido del cromatograma que la secuencia del primer pase (p. ej., primer conjunto de datos de picos y/o resultados adecuados relacionados con el cromatograma para la secuencia, etc.) debido a una disminución del efecto de los dímeros del cebador en esa longitud incrementada y debido a la calidad mejorada con longitudes más largas con la química Big Dye 3.1. En los ejemplos, si se usa una horquilla en ambos extremos, se obtendrá una pluralidad (p. ej., muchos, múltiples; etc.) en lugar de dos (p. ej., una pluralidad mayor de dos), de cromatogramas de tipo Sanger para la misma secuencia; si bien esto puede disminuir significativamente cualquier ruido asociado con la medición de la abundancia debido al promedio, es posible que no disminuya de manera similar los efectos de los dímeros de cebadores.

En una variación, las secuencias de horquilla (p. ej., de cebadores, etc.) pueden configurarse, generarse, usarse y/o procesarse de otro modo sin moléculas asociadas a una diana y moléculas asociadas a una referencia. Por ejemplo, se pueden añadir una o más repeticiones de secuencias (p. ej., generadas a través de la amplificación con cebadores de PCR que incluyen una o más secuencias de horquilla) a moléculas diana, moléculas de una referencia y/o molécu­ las adecuadas para permitir una secuenciación de tipo Sanger (y/o tecnologías de secuenciación adecuadas) de una secuencia particular para una pluralidad de ejemplos (por ejemplo, secuenciación de múltiples pases para permitir que se generen múltiples conjuntos de datos para la misma secuencia en una sola ejecución de secuenciación, etc.). En un ejemplo, la relación de un pico de alelo principal (p. ej., una medición de la intensidad de un pico) (y/o un resultado adecuado relacionado con el cromatograma, etc.) con un pico un de alelo menor (p. ej., una medición de la intensidad de un pico) (y/o un resultado adecuado relacionado con el cromatograma, etc.) se puede determinar una pluralidad de veces, basándose en los resultados de la secuenciación de tipo Sanger de repeticiones de secuencias (por ejemplo, generadas a partir del uso de secuencias de horquilla, etc.) para determinar una relación de la abundancia global. Adicional o alternativamente, la adición de una o más regiones de secuencias se puede realizar sin el procesamiento de las moléculas asociadas a una diana y/o las moléculas asociadas a una referencia, como cuando la adición de una o más regiones de secuencias puede mejorar de forma independiente (p. ej., precisión; reducción de sesgo con res­ pecto a, reducción del ruido con respecto a, etc.) los resultados relacionadas con el cromatograma, mediciones de la abundancia, caracterizaciones y/o tratamientos.

Sin embargo, las secuencias de horquilla se pueden configurar de cualquier manera adecuada, y la adición de una o más regiones de secuencias, basándose en secuencias de horquilla, se puede realizar de cualquier manera adecuada.

En un ejemplo específico, tal y como se muestra en las FIGURAS 13A-13B (p. ej., que ilustran la generación de repeticiones en tándem de un amplicón de alrededor de 150 pares de bases de longitud, para colocar las bases adicionales en una ventana de calidad de tipo Sanger predeterminada, tal como una ventana que facilita resultados mejorados de una secuenciación; en donde la mezcla del amplicón de alelos endógenos y adicionales puede circularizarse mediante LCR, y en donde las repeticiones en tándem pueden generarse luego mediante RCA de los amplicones circularizados, y en donde las ubicaciones de las bases adicionales pueden indicarse mediante las áreas sombreadas, y en donde los cromatogramas se pueden generar a partir de una secuenciación múltiple de tipo Sanger para múltiples loci adicionales, y en donde los amplicones que se originan en cuatro loci se ensamblaron en un ADN circular mediante LCR, y el producto se amplificó mediante RCA y secuenciación de tipo Sanger, etc.), la adición de regiones de secuencias puede incluir: realizar operaciones de ligación (p. ej., reacción de ciclación con ligasa con una ligasa Taq y/u otras ligasas adecuadas, etc.) en una mezcla de amplicones generada a partir de la coamplificación de los ácidos nucleicos asociados a una diana y los ácidos nucleicos diana, generando así amplicones circularizados; realizando operaciones de amplificación (p. ej., amplificación de círculo rodante) sobre los amplicones circularizados, generando así una o más secuencias modificadas que incluyen repeticiones de secuencias (p. ej., repeticiones en tándem) y/o regiones de secuencias adicionales que identifican diferentes dianas, en donde la mezcla adicional resul­ tante (por ejemplo, que incluye ácidos nucleicos lineales que incluyen las secuencias modificadas) se puede usar en operaciones de secuenciación posteriores (por ejemplo, secuenciación de tipo Sanger, etc.). La adición de regiones de secuencias incluye preferiblemente la adición de regiones de secuencias a una mezcla de amplicones que incluye amplicones basados en moléculas diana (p. ej., amplicones generados a partir de moléculas diana endógenas) y amplicones basados en moléculas asociadas a una diana (p. ej., amplicones generados a partir de moléculas asocia­ das a una diana insertadas). Alternativamente, la adición de regiones de secuencias se puede realizar sobre las mo­ léculas asociadas a una diana separadamente de las moléculas diana. Adicional o alternativamente, las regiones de secuencias pueden generarse inicialmente (p. ej., durante la generación de moléculas asociadas a una diana, molé­ culas asociadas a una referencia, etc.), para que formen parte de la secuencia asociada a una diana inicial y/o la secuencia asociada a una referencia. La adición de regiones de secuencias y/o cualquier porción adecuada de las realizaciones del método 100, puede incluir la realización de cualquiera de las operaciones de procesamiento de muestras descritas en el presente documento y/u otras operaciones adecuadas. Sin embargo, las regiones de secuen­ cias se pueden configurar de cualquier manera adecuada, y la adición de regiones de secuencias se puede realizar de cualquier manera adecuada.

Sin embargo, las secuencias asociadas a una diana, las secuencias diana y/u otras secuencias adecuadas pueden modificarse de cualquier manera adecuada (p. ej., delecionando regiones, modificando nucleótidos en posiciones es­ pecíficas, etc.) utilizando cualquier operación de procesamiento de muestras adecuada. Sin embargo, la generación de mezclas adicionales S120 se puede realizar de cualquier manera adecuada.

2.3 Realización de una operación de secuenciación

Las realizaciones del método 100 pueden incluir la realización de una o más operaciones de secuenciación S130 (p. ej., en una o más mezclas adicionales, etc.), que pueden servir para secuenciar uno o más componentes (p. ej., una o más mezclas adicionales; etc.) y/o generar uno o más resultados de secuenciación. La realización de operaciones de secuenciación incluye preferiblemente la realización de una secuenciación de tipo Sanger (p. ej., sobre una mezcla adicional, sobre moléculas diana por separado, sobre moléculas asociadas a una diana por separado, etc.). La se­ cuenciación de tipo Sanger incluye preferiblemente enfoques de terminación de cadena y/o cualquier operación ade­ cuada relacionada con la secuenciación de tipo Sanger (p. ej., usando didesoxinucleótidos marcados y ADN polimerasa, como durante una replicación de ADN in vitro; generando un conjunto de fragmentos de ácido nucleico que cubren posiciones de bases de las bases de secuencias asociadas a una diana, secuencias diana, secuencias de moléculas asociadas a una referencia, secuencias de una referencia, cualquier secuencia adecuada; realizando aná­ lisis de los fragmentos de ácido nucleico, como a través de una electroforesis capilar en gel, detección con láser de bases marcadas; realizando cualquier operación adecuada relacionada con la secuenciación de tipo Sanger, como la secuenciación con terminador de colorante, la automatización y/o la preparación de muestras asociadas con la se­ cuenciación de tipo Sanger, la secuenciación microfluídica de tipo Sanger, procesos informáticos para determinar los resultados de una secuenciación; etc.). Sin embargo, la secuenciación de tipo Sanger se puede realizar de cualquier manera adecuada.

La realización de operaciones de secuenciación incluye preferentemente la secuenciación de una o más mezclas adicionales coamplificadas (p. ej., una mezcla adicional que incluye moléculas asociadas a una diana coamplificadas y ácidos nucleicos que incluyen una región de una secuencia diana asociada, etc.), pero además o como alternativa, se puede secuenciar cualquier componente adecuado (p. ej., secuenciar por separado moléculas asociadas a una diana de una primera muestra y moléculas diana de una segunda muestra; mezclas adicionales; muestras de usuarios; muestras que incluyen moléculas asociadas a una referencia y/o moléculas de una referencia; etc.) con cualquier cantidad de operaciones de secuenciación (por ejemplo, cualquier cantidad de ejecuciones de una secuenciación de tipo Sanger, etc.).

Las operaciones de secuenciación preferiblemente se pueden realizar para determinar uno o más resultados de una secuenciación (por ejemplo, resultados de una secuenciación cuantitativa sobre los que se pueden determinar medi­ ciones de la abundancia, etc.). Los resultados de una secuenciación pueden incluir uno cualquiera o más entre: resul­ tados relacionados con cromatogramas, lecturas de secuencias, resultados de una secuenciación de alto rendimiento, datos de textos, alineamientos y/o cualquier otro resultado adecuado procedente de cualquier tecnología de secuen­ ciación adecuada. Los resultados relacionados con cromatogramas pueden incluir uno o más cromatogramas (p. ej., incluidos picos para bases secuenciadas de secuencias de moléculas asociadas a una diana, secuencias diana, se­ cuencias de moléculas asociadas a una referencia, secuencias de una referencia, de cualquier región asociada ade­ cuada, de cualquier molécula adecuada descrita en este documento; etc.), posiciones de alineamientos (p. ej., corres­ pondientes a picos y/o bases secuenciadas con una secuenciación de tipo Sanger; cada posición de un alineamiento corresponde a uno o más picos y/o a una o más bases; correspondientes a bases de una pluralidad de secuencias alineadas, como las bases de una secuencia asociada a una diana y una secuencia diana, como se muestra en las FIGURAS 6A y 7A, etc.), cualquier posición adecuada relacionada con la secuenciación, intensidades de los picos, áreas de los picos, similitudes de los picos, diferencias de los picos, mediciones de picos relacionadas con picos para el mismo tipo o un tipo diferente de base; intensidad media; intensidad mediana; alturas; anchos; superposición y/u otras comparaciones entre los picos de una base asociada a una diana y una base diana en la misma posición o en una posición diferente, datos de texto (p. ej., resultados de textos de la secuenciación de tipo Sanger, etc.) y/o cualquier otro resultado adecuado (por ejemplo, relacionado con la secuenciación de tipo Sanger, etc.). Por ejemplo, como se muestra en la FIGURA 8, los resultados relacionados con los cromatogramas pueden incluir cromatogramas para las diferentes mezclas (p. ej., un primer cromatograma para la mezcla adicional, un segundo cromatograma solo para las moléculas asociadas a una diana, un tercer cromatograma solo para las moléculas diana; etc.), como cuando los picos de los cromatogramas para diferentes bases pueden procesarse informáticamente para extraer resultados de una secuenciación.

Los resultados de una secuenciación (p. ej., en relación con los picos de una secuenciación de tipo Sanger) para una o más bases particulares, pueden incluir una dependencia de la cantidad y/o el tipo de bases que preceden (y/o están relacionados con) a la base particular, en donde una adición de las regiones de secuencias (p. ej., repeticiones de secuencias) al generar la mezcla adicional, pueden explicar tales dependencias. Adicional o alternativamente, la de­ terminación de una secuencia de la región de variación para una secuencia asociada a una diana y/o una secuencia de una molécula asociada a una referencia puede basarse en las dependencias (p. ej., en la cantidad y/o el tipo de bases precedentes en la secuencia, etc.) y/u otros parámetros de una secuenciación adecuada (p. ej., características de las tecnologías de secuenciación, como las características de la secuenciación de tipo Sanger, etc.), como cuando una inserción y/o una deleción predeterminadas para regiones de variación pueden permitir la calibración (p. ej., la autocalibración) para poder comparar con precisión las intensidades de los picos y/u otros resultados adecuados, relacionados con el cromatograma, para facilitar una determinación de la medición de la abundancia. Por ejemplo, la región de variación de la diana incluye al menos una entre una o más inserciones y una o más deleciones, en donde al menos un resultado relacionado con el cromatograma incluye posiciones del alineamiento correspondientes a los picos (p. ej., asociados con bases de la primera región asociada a una diana, la región de la secuencia diana de la diana biológica, la región de variación de la diana y la región de la secuencia de la diana biológica, etc.), en donde, para cada uno de las diferentes parejas (por ejemplo, una base de la secuencia asociada a una diana y una base de la secuencia diana, etc.), la base de la primera secuencia asociada a una diana corresponde a una primera posición del alineamiento que es diferente de una segunda posición del alineamiento correspondiente a la base de la primera secuencia diana (por ejemplo, como se muestra en las FIGURAS 6A y 7A), y en donde las posiciones del alineamiento de al menos un resultado relacionado con el cromatograma incluyen las posiciones de alineamiento primera y segunda.

En un ejemplo, la región de variación puede incluir bases mezcladas predeterminadas (p. ej., sustituciones de bases, etc.) que pueden permitir la calibración y/u operaciones de procesamiento adecuadas (p. ej., desconvolución, deter­ minación y aplicación del factor de corrección, etc.) para mejorar la precisión en la determinación de la medición de la abundancia. Sin embargo, la determinación de cualquier región y/o secuencia adecuada puede basarse en cualquier parámetro de secuenciación adecuado de cualquier manera adecuada. Adicional o alternativamente, los resultados de una secuenciación para una base particular y/u otra región de una secuencia y/o la determinación de cualquier región y/o secuencia adecuada, pueden ser independientes de otras regiones de una secuencia y/o parámetros de secuenciación adecuados.

En las variaciones, la realización de una o más operaciones de secuenciación puede ser para uno o más productos (p. ej., componentes de mezclas adicionales; moléculas asociadas a una diana, moléculas diana y/u otras moléculas adecuadas, etc.) con regiones de secuencias añadidas (p. ej., repeticiones de secuencias, etc.), como uno o más productos generados basándose en secuencias de horquilla (por ejemplo, basándose en la amplificación con cebado­ res de PCR que incluyen una o más secuencias de horquilla, etc.). La realización de operaciones de secuenciación sobre productos con repeticiones de secuencias puede servir para secuenciar una o más secuencias y/o regiones de secuencias varias veces, para generar resultados de secuenciaciones adicionales, que pueden reducir el ruido, utili­ zarse para determinar mediciones de la abundancia adicionales (p. ej., para determinar una medición de la abundancia global con una precisión mejorada, etc.) y/o para cualquier fin adecuado (p. ej., facilitar caracterizaciones y/o trata­ mientos, etc.).

Adicional o alternativamente, realizar operaciones de secuenciación (y/o cualquier porción adecuada de las realiza­ ciones del método 100 y/o el sistema 200) puede incluir determinar, aplicar, realizar y/o usar cualquier secuenciación adecuada y/o tecnologías relacionadas con la secuenciación, tales como como una secuenciación de alto rendimiento, que puede incluir y/o estar asociada con una cualquiera o más entre: NGS, tecnologías asociadas a NGS, secuenciación de firmas paralelas de forma masiva, secuenciación Polony, pirosecuenciación 454, secuenciación Illumina, secuenciación SOLiD, secuenciación de semiconductores Ion Torrent, secuenciación de nanoesferas de ADN, secuen­ ciación de molécula única Heliscope, secuenciación de molécula única en tiempo real (SMRT), secuenciación de nanoporos de ADN, cualquier generación de tecnologías de secuenciación (por ejemplo, tecnologías de secuenciación de segunda generación, tecnologías de secuenciación de tercera generación, tecnologías de secuenciación de cuarta generación, etc.), secuenciación asociada a amplicones (p. ej., secuenciación dirigida de amplicones), secuenciación asociada al metagenoma, secuenciación por síntesis, secuenciación de corrientes de efecto túnel, secuenciación me­ diante hibridación, secuenciación mediante espectrometría de masas, técnicas basadas en microscopía y/o cualquier tecnología adecuada, relacionada con una secuenciación de alto rendimiento. Adicional o alternativamente, las tecno­ logías de secuenciación y/o relacionadas con la secuenciación pueden incluir cualquier tecnología adecuada (por ejemplo, secuenciación capilar, etc.).

Sin embargo, la realización de operaciones de secuenciación S130 puede realizarse de cualquier manera adecuada.

2.4 Determinación de una medición de la abundancia

Las realizaciones del método 100 pueden incluir la determinación de una o más mediciones de la abundancia S140 (p. ej., para una o más muestras; basándose en los resultados de una o más operaciones de secuenciación para una o más mezclas adicionales, etc.), que pueden servir para determinar con precisión las mediciones de la abundancia, como las mediciones de la abundancia que pueden analizarse y compararse significativamente (p. ej., comparar las abundancias individuales de una molécula diana y una molécula asociada a una diana para generar una relación de la abundancia, comparar las relaciones de la abundancia de las dianas frente a las referencias, etc.), como las medi­ ciones de la abundancia que se pueden utilizar para facilitar caracterizaciones y/o tratamientos. Las mediciones de la abundancia pueden incluir uno cualquiera o más entre: relaciones de la abundancia (p. ej., una relación de la medición de la intensidad del primer pico para un primer pico y una medición de la intensidad del segundo pico para un segundo pico, como cuando el primer pico y el segundo pico corresponden a la misma posición o a diferentes posiciones de un alineamiento; relaciones de cualquier resultado de una secuenciación adecuada; una relación del recuento de un recuento de moléculas diana endógenas con respecto a un recuento de moléculas asociadas a una diana; una relación de resultados de una secuenciación entre endógeno a adicional, como la relación de una medición de la intensidad del pico para una base de la secuencia diana y una base de la secuencia asociada a una diana correspondiente, relaciones entre cualquier numerador y denominador adecuados, relaciones entre abundancias individuales, como las que se pueden utilizar para determinar una relación de la abundancia global y/o una medición de la abundancia, etc.), pero adicional o alternativamente pueden incluir abundancias individuales (p. ej., intensidades máximas individuales, recuentos, etc.), abundancias relativas, abundancias absolutas y/u otra medición de la abundancia adecuada. En un ejemplo específico, se puede calcular una relación entre moléculas endógenas y moléculas adicionales (p. ej., una relación entre el ADN endógeno y el ADN adicional, etc.) basándose en una relación del resultado de una secuencia­ ción (p. ej., relación de las intensidades entre un pico asociado a endógeno y un pico asociado a adicional) y una abundancia conocida de las moléculas adicionales (p. ej., utilizadas para generar la mezcla adicional).

La determinación de las mediciones de la abundancia se basa preferentemente en uno o más resultados de secuenciaciones, pero puede basarse adicional o alternativamente en cualquier dato adecuado (por ejemplo, datos comple­ mentarios que incluyen abundancias conocidas, datos biométricos, datos de un historial médico, datos demográficos, historial genético, datos de un seguimiento, datos de comportamiento, datos ambientales, tipo de muestra y/u otros datos contextuales adecuados). Por ejemplo, la determinación de las relaciones de la abundancia (p. ej., relaciones de la abundancia asociada a una diana, etc.) (y/o cualquier medición de la abundancia adecuada) se puede basar en el uno o más resultados relacionados con el cromatograma, incluyendo una o más intensidades de picos, áreas de picos, mediciones de picos para bases que comparten un tipo de base, mediciones de picos para bases con diferentes tipos de bases y/o cualquier otro resultado adecuado relacionado con cromatogramas y/o resultados de secuenciación. La determinación de las mediciones de la abundancia puede incluir un procesamiento informático (p. ej., con un sis­ tema informático remoto, tal como un sistema informático en la nube, con un sistema informático local, etc.), tal como el procesamiento informático de uno o más resultados de una secuenciación (p. ej., cromatogramas, datos de picos, etc.) y/u otros datos adecuados, pero adicional o alternativamente puede incluir cualquier procesamiento adecuado (por ejemplo, procesamiento manual, etc.). El procesamiento (p. ej., para determinar mediciones de la abundancia, etc.) y/o porciones adecuadas de realizaciones del método 100 (p. ej., que facilitan caracterizaciones y/o tratamientos, etc.) puede incluir uno cualquiera o más entre: realizar estimaciones estadísticas de datos (p. ej., regresión de mínimos cuadrados ordinarios, regresión de mínimos cuadrados no negativos, análisis de componentes principales, regresión de crestas, etc.), desconvolución (p. ej., de picos superpuestos de un cromatograma, de picos con resolución inade­ cuada, de cualquier pico adecuado; desconvolución de Fourier; desconvolución basada en funciones gaussianas; desconvolución de Lucy-Richardson, etc.), extracción de características (p. ej., para cualquier cantidad adecuada de picos de un cromatograma, etc.), realización de reconocimiento de patrones sobre datos, fusión de datos procedentes de múltiples fuentes, combinación de valores (por ejemplo, valores promedio, etc.), compresión, conversión (por ejem­ plo, conversión de digital a analógico, conversión de analógico a digital), modulación de ondas, normalización, actua­ lización, clasificación, validación, filtrado (p. ej., para una corrección de la línea de base, recorte de datos, etc.), reduc­ ción del ruido, suavizado, relleno (p. ej., relleno de huecos), alineamiento, ajuste de modelos, formación de ventanas, recortes, transformaciones, operaciones matemáticas (p. ej., derivadas, medias móviles, suma, resta, multiplicación, división, etc.), multiplexación, desmultiplexación, interpolación, extrapolación, agrupación, otras operaciones de pro­ cesamiento de señales, otras operaciones de procesamiento de imágenes, visualización y/o cualquier otra operación de procesamiento adecuada.

En las variaciones, la determinación de las mediciones de la abundancia pueden basarse y/o asociarse de otro modo con uno o más resultados de la secuenciación asociados con secuencias asociadas a una diana (y/o secuencias asociadas a una referencia), incluidas las regiones de variación con una o más inserciones (p. ej., inserciones de nucleótidos; etc.) y/o una o más deleciones (por ejemplo, deleciones de nucleótidos, etc.) y/o cualquier modificación adecuada. Por ejemplo, la determinación de un conjunto de relaciones de la abundancia asociada con una diana puede basarse en un conjunto de picos (p. ej., datos de intensidad de un pico para picos correspondientes a bases secuenciadas de una secuencia diana y una secuencia asociada a una diana, etc.) y al menos una entre la sustitución, la inserción y la deleción (p. ej., características de una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones; como el tamaño de la modificación, en relación con la cantidad de nucleótidos; tipos de modificación, como en relación con cambios del tipo de base; posiciones de dónde se aplican las modificaciones; etc.). Como se muestra en las FIGURAS 6A y 7A, las regiones de variación que incluyen una o más inserciones y/o deleciones pueden dar como resultado posicio­ nes de alineamiento desplazadas (p. ej., las bases de una región asociada a una diana y una región de la secuencia diana pueden desplazarse en relación con la posición debido a una o más inserciones y/o deleciones, etc.). En un ejemplo, la región de variación de la diana (p. ej., de una secuencia asociada a una diana, etc.) puede incluir al menos una inserción y una deleción, en donde el uno o más resultados relacionados con el cromatograma pueden incluir posiciones de alineamiento correspondientes a un conjunto de picos (p. ej., datos de picos para y/o asociados con la región asociada a una diana de las moléculas asociadas a una diana, la región de la secuencia diana de la diana biológica, la región de variación de la diana de las moléculas asociadas a una diana y la región de la secuencia de la diana biológica, etc.), y en donde la determinación del conjunto de relaciones de la abundancia asociada a una diana (y/o mediciones de la abundancia adecuadas) incluye, para cada una de las diferentes parejas (por ejemplo, de una base de la secuencia asociada a una diana y una base de la secuencia diana, etc.): determinar una medición de la intensidad de los picos (p. ej., una intensidad máxima del pico, una intensidad global del pico, etc.), en una primera posición de alineamiento de las posiciones de alineamiento, para la base de la secuencia asociada a una diana de la pareja, basándose en al menos un resultado relacionado con el cromatograma (p. ej., basándose en datos de la inten­ sidad del pico para las bases secuenciadas; basándose en un cromatograma; etc.); determinar una medición de la intensidad del pico, en una segunda posición de alineamiento de las posiciones del alineamiento, para la base de la secuencia diana de la pareja, basándose en al menos un resultado relacionado con el cromatograma (p. ej., basándose en los datos de la intensidad del pico para las bases secuenciadas; basándose en un cromatograma, etc.), en donde la primera posición del alineamiento es diferente de la segunda posición del alineamiento, y en donde las posiciones del alineamiento incluyen la primera y la segunda posición del alineamiento; y/o determinar una relación de la abun­ dancia asociada a una diana (y/o una medición de la abundancia adecuada, etc.) del conjunto de relaciones de la abundancia asociada con una diana (y/o un conjunto de mediciones adecuadas de la abundancia, etc.), basándose en la medición de la intensidad del pico para la base de la secuencia asociada a una diana y la medición de la inten­ sidad del pico para la base de la primera secuencia diana. En un ejemplo, como se muestra en las FIGURAS 6A y 7A, la primera posición del alineamiento puede corresponder a un primer pico y un segundo pico (por ejemplo, picos superpuestos correspondientes a la misma posición del alineamiento, correspondientes a tipos de bases iguales o diferentes, etc.) del primer conjunto de picos, en donde el primer pico corresponde a una base superpuesta de la secuencia asociada a una diana (p. ej., en donde las bases de la secuencia asociada a una diana están marcadas con un "*" como se muestra en las FIGURAS 6A y 7A), en donde el primer pico corresponde a una primera relación de la abundancia asociada a una diana (p. ej., para una pareja de bases superpuestas de la secuencia asociada a una diana y una base correspondiente, desplazada en la posición del alineamiento, de la secuencia diana, en donde la cantidad de desplazamiento en la posición del alineamiento se basa sobre las características de una o más inserciones y/o deleciones, como los tamaños de una o más inserciones y/o deleciones, etc.) del conjunto de relaciones de la abundancia asociada con una diana, en donde el segundo pico corresponde a una base que se superpone de la secuencia diana (p. ej., en donde las bases de la secuencia diana están marcadas con una "O" como se muestra en las FIGURAS 6A y 7A), y/o en donde el segundo pico corresponde a una segunda relación de la abundancia asociada a una diana (p. ej., distinta de la primera relación de la abundancia asociada a una diana; para una pareja de bases superpuestas de la secuencia diana y una base correspondiente, desplazada en la poción del alineamiento, de la secuencia asociada a una diana; etc.) del conjunto de relaciones de la abundancia asociada a una diana.

En un ejemplo específico, como se muestra en las FIGURAS 6A-6B, la abundancia inicial del ADN de una muestra para la región chr21:15811326-15811417 se puede determinar estimando la relación entre la intensidad del ADN de la "referencia" hg 19 y la intensidad de "Spk" adicional (por ejemplo, después de una secuenciación de tipo Sanger de una mezcla adicional generada a partir de la coamplificación de moléculas asociadas a una diana y moléculas diana que incluyen la secuencia diana, etc.); en donde la secuencia asociada a una diana (p. ej., la secuencia adicional; de las moléculas asociadas a una diana, etc.) incluye una deleción de tres nucleótidos, lo que da como resultado un cambio de tres posiciones en la posición del alineamiento para parejas correspondientes (p. ej., una secuencia similar, etc.) de una base que forman la secuencia asociada a una diana y la secuencia diana; en donde las relaciones de la abundancia asociada con una diana individual pueden determinarse basándose en las intensidades de los picos (p. ej., indicadas por las posiciones de "*"'s y "O"s en los picos del cromatograma) de las parejas correspondientes (p. ej., en donde una relación de la abundancia individual para la posición 161 del alineamiento, correspondiente a una base "C" de una secuencia asociada a una diana e indicada por "*", se puede determinar basándose en una relación de una medición de la intensidad del pico (p. ej., intensidad máxima para el pico) para la base "C" de la secuencia asociada a una diana y una medición de la intensidad del pico (p. ej., intensidad máxima para el pico) para la base "C" de la secuencia diana, indicada por "O" y en la posición 164, debido a un desplazamiento de la posición del alineamiento por la deleción de tres nucleótidos en la región de variación de la secuencia asociada a una diana, etc.), como cuando se puede trazar un gráfico con las relaciones asociadas a una diana (p. ej., como se muestra en la FIGURA 6B; como cuando la relación de la abundancia individual para el par de bases "C" en las posiciones 161 y 164, respectivamente, se indica por el número de la posición en el alineamiento "161" en el gráfico; etc.) y/o como cuando la pendiente de los puntos de datos (p. ej., 0,185; la regresión lineal para los puntos de datos de la relación de la abundancia asociada a una diana; del gráfico; etc.) puede ser una medición de la abundancia que describe la abundancia de las moléculas diana en la muestra, en relación con la abundancia de las moléculas asociadas a una diana (p. ej., abundancia del ADN endógeno frente al ADN adicional; el ADN de la muestra era abundante en 0,185, el nivel del ADN adicional, etc.).

En un ejemplo específico, como se muestra en las FIGURAS 7A-7B, la abundancia inicial del ADN de una muestra para la región chr21:22231528+22231612 se puede determinar estimando la relación entre la intensidad del ADN de "referencia" hg19 y la intensidad de "Spk" adicional (por ejemplo, después de una secuenciación de tipo Sanger de una mezcla adicional generada a partir de la coamplificación de moléculas asociadas a una diana y moléculas diana que incluyen la secuencia diana, etc.); en donde la secuencia asociada a una diana (p. ej., la secuencia adicional; de las moléculas asociadas a una diana, etc.) incluye una deleción de tres nucleótidos, lo que da como resultado un desplazamiento de tres posiciones en la posición del alineamiento para las parejas correspondientes (p. ej., una se­ cuencia similar, etc.) de una base que forman la secuencia asociada a una diana y la secuencia diana; en donde las relaciones de la abundancia asociada a una diana individual pueden determinarse basándose en las intensidades de los picos (p. ej., indicadas por las posiciones de "*''s y "O"s en los picos del cromatograma) de las parejas correspon­ dientes (p. ej., en donde una relación de la abundancia individual para la posición 15 del alineamiento, correspondiente a una base "G" de una secuencia asociada a una diana y que se indica por "*", se puede determinar basándose en una relación de la medición de la intensidad de los picos (p. ej., intensidad máxima para el pico) para la base "G" de la secuencia asociada a una diana y una medición de la intensidad de los picos (p. ej., intensidad máxima para el pico) para la base "G" de la secuencia diana, indicada por "O" y en la posición 18 debido a un desplazamiento de la posición del alineamiento por la deleción de tres nucleótidos en la región de variación de la secuencia asociada a una diana, etc.), como cuando se puede trazar un gráfico de las relaciones asociadas a una diana (p. ej., como se muestra en la FIGURA 7B; como cuando la relación de la abundancia individual para la pareja de bases "G" en las posiciones 15 y 18, respectivamente, se indica por el número "15" de la posición del alineamiento en el gráfico; etc.), y/o cuando la pendiente de los puntos de datos (p. ej., 0,34; la regresión lineal para los puntos de datos de la relación de la abun­ dancia asociada a una diana; del gráfico; etc.) puede ser una medición de la abundancia que describe la abundancia de los moléculas diana en la muestra en relación con la abundancia de las moléculas asociadas a una diana (p. ej., abundancia del ADN endógeno frente al ADN adicional; el ADN de la muestra era abundante en 0,34 el nivel del ADN adicional, etc.).

Sin embargo, la determinación de las mediciones de la abundancia basadas en y/o asociadas de otro modo con re­ sultados de una secuenciación asociada con regiones de variación que incluyen una o más inserciones, deleciones y/o modificaciones adecuadas, se puede realizar de cualquier manera adecuada.

En una variación, la extracción de mediciones de la abundancia puede incluir la desconvolución de picos superpuestos (p. ej., picos de cromatograma, etc.), incluido un primer pico correspondiente a una base de una secuencia asociada a una diana (p. ej., una base "A") en una posición de la región de variación, y un segundo pico correspondiente a una base de la secuencia diana (p. ej., una base "T") en la posición; y calcular los resultados de la secuenciación y/o las mediciones de la abundancia para los picos desconvolucionados (p. ej., una relación de las intensidades del pico para la base "T" con respecto a la base "A"). En una variación, la desconvolución puede ser para picos superpuestos entre una base de un primer locus (p. ej., el cromosoma 18) y una base de un segundo locus (p. ej., del mismo cromosoma, de un cromosoma diferente como el cromosoma 21, etc.).

En una variación, tal y como se muestra en la FIGURA 8, una estimación estadística de las abundancias relativas de las secuencias diana y las asociadas a una diana de un cromatograma de una mezcla adicional puede basarse en un primer cromatograma (y/o cualquier resultado de una secuenciación adecuada, como datos de picos; etc.) solo para moléculas diana y/o un segundo cromatograma (y/o cualquier resultado de una secuenciación adecuada; etc.) solo para moléculas asociadas a una diana (p. ej., cuando los picos para una base particular entre los cromatogramas y/o los conjuntos de resultados de una secuenciación se pueden procesar para una regresión lineal múltiple, etc.). En una variación, la desconvolución (p. ej., desconvolución de Lucy-Richardson) se puede aplicar para resolver los picos de un cromatograma (p. ej., logrando una separación mejorada entre los picos del mismo color) y/o para resolver otros resultados adecuados. En un ejemplo específico, el método 100 puede incluir: generar un conjunto de cromatogramas (y/o datos relacionados con cromatogramas, etc.) (p. ej., para la mezcla adicional, solo para las moléculas asociadas a una diana, solo para las moléculas diana, etc.); resolver los picos del conjunto de cromatogramas mediante descon­ volución (por ejemplo, cuando esa y/u otras operaciones adecuadas pueden omitirse, etc.); y realizar un análisis de regresión en los cromatogramas procesados. Adicional o alternativamente, se puede realizar un análisis de descon­ volución, regresión u otras operaciones informáticas para cualquier cantidad y combinación adecuada de picos cromatográficos y/u otros componentes de los resultados de un sistema de secuenciación.

En una variación, la determinación de una medición de la abundancia puede incluir la determinación de una medición de la abundancia global a partir de una pluralidad de mediciones de abundancias individuales, lo que puede aumentar la precisión de la medición de la abundancia. En un ejemplo, el método 100 puede incluir la determinación de al menos un resultado relacionado con el cromatograma basándose en la secuenciación de tipo Sanger asociada con el primer conjunto de moléculas asociadas a una diana (por ejemplo, que incluye una primera secuencia asociada a una diana que incluye una primera región asociada a una diana con similitud de secuencia con una primera región de una se­ cuencia diana de una primera secuencia diana, etc.), el conjunto de moléculas diana y un segundo conjunto de molé­ culas asociadas a una diana, en donde el segundo conjunto de moléculas asociadas a una diana incluye una segunda secuencia asociada a una diana que incluye una segunda región asociada a una diana con similitud de secuencia con una segunda región de la secuencia diana de una segunda secuencia diana; determinar un primer conjunto de relaciones de la abundancia asociada a una diana para diferentes conjuntos de bases de la primera secuencia aso­ ciada a una diana y la primera secuencia diana (por ejemplo, en donde cada conjunto diferente de bases, procedente de los diferentes conjuntos de bases, incluye al menos una base de la primera secuencia asociada a una diana y al menos una base de la primera secuencia diana, etc.), basándose en al menos un resultado relacionado con el cromatograma; determinar un segundo conjunto de relaciones de la abundancia asociada a una diana para diferentes con­ juntos de bases de la segunda secuencia asociada a una diana y la segunda secuencia diana (por ejemplo, en donde cada conjunto diferente de bases, procedente de los diferentes conjuntos de bases, incluye al menos una base de la segunda secuencia asociada a una diana y al menos una base de la segunda secuencia diana, etc.) basándose en al menos un resultado relacionado con el cromatograma; y/o determinar una o más mediciones de la abundancia global (p. ej., una la abundancia de la diana biológica para la muestra, etc.) basándose en el primer y el segundo conjunto de relaciones de la abundancia asociada a una diana. En un ejemplo, la primera secuencia diana puede corresponder a un primer locus de un cromosoma, en donde la segunda secuencia diana puede corresponder a un segundo locus del cromosoma, y en donde facilitar la caracterización de una o más afecciones puede incluir facilitar la caracterización de una anomalía cromosómica basándose en una o más mediciones de la abundancia global.

Por ejemplo, tal y como se muestra en la FIGURA 9, la determinación de una medición de la relación de la abundancia global se puede basar en: determinar las relaciones de resultados de secuenciaciones individuales para cada posición de una región de variación basándose en los resultados de la secuenciación (p. ej., intensidades de los picos, etc.) para parejas de un pico asociado endógeno y un pico asociado adicional correspondiente para las bases en la posición, en donde las relaciones de los resultados de secuenciaciones individuales pueden abarcar cualquier cantidad de po­ siciones de bases, a través de cualquier cantidad de loci (por ejemplo, cuando se extraen las relaciones de resultados de secuenciaciones individuales para diferentes loci a partir de diferentes cromatogramas para los diferentes loci, cuando las relaciones se extraen a partir del mismo cromatograma incluyendo datos para una pluralidad de loci, etc.), cromosomas, dianas y/u otros aspectos adecuados; y combinar las relaciones de resultados de secuenciaciones indi­ viduales (p. ej., realizar un promedio). De manera adicional o alternativa, la determinación de las mediciones de la abundancia global a partir de las mediciones de la abundancia individual puede valerse de cualquier enfoque estadís­ tico adecuado (p. ej., promedio, mediana, etc.) y/o puede realizarse de cualquier manera adecuada. En una variación, se pueden determinar diferentes conjuntos de mediciones de la abundancia para muestras preparadas y/o secuenciadas por separado (p. ej., para una primera muestra que incluye moléculas asociadas a una diana y una segunda muestra que incluye moléculas diana, en donde la primera y la segunda muestras se pueden analizar por separado y/o secuenciar como con una secuenciación de tipo Sanger, etc.). Por ejemplo, el método 100 puede incluir una se­ cuenciación de tipo Sanger (por ejemplo, realizada por una primera parte, una tercera parte, un usuario y/o cualquier entidad adecuada, etc.) que incluye: la secuenciación de tipo Sanger de una primera muestra que incluye un conjunto de moléculas asociadas a una diana; y la secuenciación de tipo Sanger de una segunda muestra que incluye el con­ junto de moléculas diana, en donde la determinación del al menos un resultado relacionado con el cromatograma (p. ej., un conjunto de intensidades de picos; cromatogramas, etc.) puede incluir: determinar un primer resultado relacio­ nado con el cromatograma (p. ej., un cromatograma, un conjunto de intensidades de picos, etc.) asociado con el conjunto de moléculas asociadas a una diana (p. ej., datos de la intensidad de los picos para bases de una secuencia asociada a una diana del conjunto de moléculas asociadas a una diana, etc.), basándose en la secuenciación de tipo Sanger de la primera muestra; y determinar un segundo resultado relacionado con un cromatograma (p. ej., un cro­ matograma, un conjunto de intensidades de picos, etc.) asociado con el conjunto de moléculas diana (p. ej., datos de la intensidad de picos para las bases de una secuencia asociada a una diana del conjunto de moléculas asociadas a una diana, etc.), basándose en la secuenciación de tipo Sanger de la segunda muestra, y en donde la determinación de un conjunto de relaciones de la abundancia asociada a una diana (y/o cualquier medición adecuada de la abun­ dancia) puede incluir la determinación del conjunto de relaciones de la abundancia asociada a una diana basándose en el primer resultado relacionado con un cromatograma y el segundo resultado relacionado con un cromatograma (p. ej., determinar un primer conjunto de relaciones de la abundancia individuales para el conjunto de moléculas asociadas a una diana basándose en el primer resultado relacionado con un cromatograma; determinar un segundo conjunto de relaciones de la abundancia individuales para el conjunto de moléculas diana basándose en el segundo resultado relacionado con un cromatograma, en donde se pueden determinar relaciones de la abundancia global basándose en relaciones de la abundancia individual, etc.).

En una variación, las mediciones de la abundancia se pueden determinar a lo largo del tiempo (p. ej., para diferentes muestras recogidas a lo largo del tiempo; realizando múltiples ejemplos de realizaciones del método 100 a lo largo del tiempo, etc.), en donde la serie de mediciones de la abundancia se puede analizar para facilitar una o más caracteri­ zaciones de una o más afecciones (p. ej., seguimiento del recuento de moléculas asociadas con el cáncer a lo largo del tiempo, etc.), tratamientos (p. ej., evaluación de la eficacia del tratamiento del cáncer a lo largo del tiempo, etc.) y/u otra información adecuada. Por ejemplo, el método 100 puede incluir, con una o más afecciones (por ejemplo, afecciones médicas, etc.) al menos un trastorno de un solo gen y una afección cancerígena (y/o cualquier afección adecuada, etc.); determinar una primera medición de la abundancia global (y/o cualquier primera medición de la abun­ dancia adecuada, etc.) (p. ej., describir una primera abundancia de la diana biológica, etc.) asociada con un primer período de tiempo (p. ej., asociada con un primer ejemplo para realizar una o más porciones de realizaciones del método 100, etc.); determinar una segunda medición de la abundancia global (p. ej., describir una segunda abundancia de la diana biológica, etc.) en donde la segunda medición de la abundancia global está asociada con un segundo período de tiempo (p. ej., asociada con un segundo ejemplo para realizar una o más porciones de realizaciones del método 100, etc.); y/o facilitar la caracterización de la una o más afecciones basándose en la primera medición de la abundancia global (p. ej., basándose en una primera comparación entre la primera medición de la abundancia global y una primera medición de la abundancia asociada a una referencia, como una primera medición de la abundancia global asociada a una referencia etc.) y la segunda medición de la abundancia global (por ejemplo, una segunda comparación entre la segunda medición de la abundancia global y una segunda medición de la abundancia global asociada a una referencia que describe una segunda abundancia de la misma referencia biológica o una referencia biológica diferente, en donde la segunda medición de la abundancia global asociada a una referencia se puede asociar con el segundo período de tiempo y/o cualquier período de tiempo adecuado; una segunda comparación entre la segunda medición de la abundancia global y la primera medición de la abundancia global asociada a una referencia, etc.).

En una variación, la determinación de una medición de la abundancia puede incluir la aplicación de un modelo de determinación de la abundancia que incluya una cualquiera o más entre: propiedades probabilísticas, propiedades heurísticas, propiedades deterministas y/o cualquier otra propiedad adecuada.

Sin embargo, la determinación de la medición de la abundancia S140 se puede realizar de cualquier manera adecuada.

2.5 Procesamiento de moléculas asociadas a una referencia

Adicional o alternativamente, las realizaciones del método 100 pueden incluir el procesamiento de un conjunto de moléculas asociadas a una referencia (p. ej., que incluyen una secuencia de una referencia que incluye una región asociada a una referencia y una región de variación de una referencia, como cuando las secuencias y/o regiones son análogas a la secuencia y/o las regiones de moléculas asociadas a una diana, como cuando dichas moléculas, se­ cuencias y/o regiones pueden configurarse, generarse, aplicarse, procesarse y/o usarse de manera análoga, tal como una manera análoga a la descrita en relación con S110, S120 y/o en este documento, etc.); S115, que puede servir para generar y/o procesar (p. ej., mediante la aplicación de una o más porciones adecuadas de realizaciones del método 100, etc.) moléculas asociadas con moléculas de una referencia (p. ej., ácidos nucleicos de una referencia que incluyen una secuencia de una referencia que identifica un cromosoma de referencia, como el cromosoma 21; ácidos nucleicos de una referencia que incluyen una secuencia de una referencia asociada con versiones de tipo silvestre para trastornos de un solo gen; etc.), como moléculas de una referencia presentes en una muestra (p. ej., la muestra biológica de la que se extraen las moléculas diana; etc.), como para determinar mediciones de la abundancia de la referencia (p. ej., mediciones de la abundancia asociada a una referencia, etc.) que se pueden comparar con mediciones de la abundancia para dianas (p. ej., para determinar la abundancia relativa; en comparación con las mediciones de la abundancia asociada a una diana, etc.) y/o procesar de otro modo (p. ej., para facilitar la caracteri­ zación y/o los tratamientos, etc.), por ejemplo, comparando una relación de la abundancia para el cromosoma 21 diana con una relación de la abundancia para el cromosoma 18 de referencia para detectar una trisomía 21 y/o una trisomía 18. Procesamiento de moléculas asociadas a una referencia (p. ej., generación de moléculas; procesamiento de mo­ léculas para generar mezclas adicionales de una referencia; secuenciación; procesamiento informático, etc.) y/o las moléculas de una referencia se pueden realizar de cualquier manera análoga al procesamiento de las moléculas aso­ ciadas a una diana, las moléculas diana y/u otros componentes adecuados. Sin embargo, el procesamiento de las moléculas asociadas a una referencia S115 se puede realizar de cualquier manera adecuada.

2.6 Facilitar la caracterización de una afección

Adicional o alternativamente, las realizaciones del método 100 pueden incluir facilitar la caracterización de una o más afecciones S150 (por ejemplo, afecciones médicas tales como trastornos genéticos; basándose en una o más medi­ ciones de la abundancia, etc.), que pueden servir para detectar, diagnosticar, analizar, determinar caracterizaciones, ayudar a uno o más profesionales sanitarios en relación con, proporcionar datos (por ejemplo, parámetros, etc.) con respecto a; y/o facilitar de otro modo la caracterización de una o más afecciones.

Las caracterizaciones pueden incluir uno cualquiera o más entre: diagnósticos, evaluaciones de riesgos, causas (p. ej., identificación de comportamientos de usuarios, datos demográficos, historial médico, genética y/u otros aspectos adecuados que contribuyan a la afección) y/u otra información adecuada para la una o más afecciones. En variaciones, se puede usar una o más caracterizaciones en uno cualquiera o más entre: determinar un tratamiento, informar a los usuarios, informar a los profesionales sanitarios (por ejemplo, guiar al profesional sanitario en los diagnósticos, etc.) y/o realizar cualquier operación adecuada. Facilitar una o más caracterizaciones se basa preferiblemente en compa­ raciones de relaciones de la abundancia (p. ej., una comparación de una relación de la abundancia global asociada a una diana frente a una relación de la abundancia global asociada a una referencia), pero adicional o alternativamente puede basarse en cualquier cantidad y/o tipo de mediciones de la abundancia (p. ej., cualquier técnica analítica ade­ cuada, como análisis de estimación estadística, aplicada a y/o utilizada para generar las mediciones de la abundancia, etc.), pero puede basarse adicional o alternativamente en cualquier medición de la abundancia adecuada. En un ejem­ plo, la diana biológica se puede asociar con una o más afecciones médicas, y facilitar la caracterización de una o más afecciones médicas se puede basar en una comparación entre una primera medición de la abundancia global (p. ej., una medición de la abundancia global asociada con una diana; etc.) y una segunda medición de la abundancia global (por ejemplo, una medición de la abundancia global asociada a una referencia que describe la abundancia de una referencia biológica, etc.).

En un ejemplo, la afección (p. ej., una afección médica, etc.) puede incluir un trastorno genético que incluye al menos una anomalía cromosómica y el trastorno de un solo gen; en donde una primera región de la secuencia diana (p. ej., de una primera secuencia diana de un primer conjunto de moléculas asociadas a una diana, etc.) puede asociarse con al menos uno entre un primer cromosoma y una mutación; en donde una región de la secuencia de una referencia de la referencia biológica está asociada con al menos uno entre un segundo cromosoma y la ausencia de la mutación; y/o en donde facilitar el diagnóstico prenatal (y/o caracterizaciones adecuadas, etc.) del trastorno genético incluye facilitar el diagnóstico prenatal de la al menos una de las anomalías cromosómicas y el trastorno de un solo gen, basándose en la comparación entre la relación de la abundancia global asociada a una diana (p. ej., determinada basándose en un primer conjunto de relaciones de la abundancia asociada a una diana correspondiente a las intensi­ dades de los picos de una pareja diferente de una base de la primera secuencia asociada a una diana y una base de la primera secuencia diana, etc.) y una relación de la abundancia global asociada a una referencia (p. ej., determinada basándose en un conjunto de relaciones de la abundancia asociada a una referencia correspondiente a las intensida­ des de los picos de una pareja diferente de una base de la secuencia asociada a una referencia y una base de la secuencia de una referencia, etc.). En un ejemplo, la afección puede incluir un trastorno genético que incluye la ano­ malía cromosómica, en donde la primera secuencia diana corresponde a un primer locus del primer cromosoma, y en donde el método 100 puede incluir la generación de un segundo conjunto de moléculas asociadas a una diana que incluye una segunda secuencia asociada a una diana que incluye una segunda región asociada a una diana con similitud de secuencia con una segunda región de una secuencia diana de una segunda secuencia diana correspon­ diente a un segundo locus del primer cromosoma; y determinar un segundo conjunto de relaciones de la abundancia asociada a una diana basándose en al menos un resultado relacionado con el cromatograma, en donde cada relación de la abundancia asociada a una diana, del segundo conjunto de relaciones de la abundancia asociada a una diana, corresponde a una pareja diferente de una base de la segunda secuencia asociada a una diana y una base de la segunda secuencia diana, en donde la determinación de la relación de la abundancia asociada a una diana incluye la determinación de la relación de la abundancia global asociada a una diana basándose en el primer conjunto de rela­ ciones de la abundancia asociada a una diana y el segundo conjunto de relaciones de la abundancia asociada a una diana, y en donde la región de la secuencia de una referencia de la referencia biológica está asociada con el segundo cromosoma.

En un ejemplo, la afección (p. ej., una afección médica, etc.) puede incluir al menos una entre una o más anomalías cromosómicas, uno o más trastornos de un solo gen y/o una o más afecciones cancerosas, en donde una región de la secuencia diana está asociada con al menos uno entre un primer cromosoma (p. ej., asociado con la anomalía cromosómica; asociado con la afección cancerosa; etc.) y una mutación (p. ej., asociada con la anomalía cromosó­ mica; asociada con la afección cancerosa; etc.), en donde una región de la secuencia de una referencia de la referencia biológica está asociada con al menos uno entre un segundo cromosoma y una ausencia de la mutación, y/o en donde facilitar la caracterización de la afección médica incluye facilitar la caracterización de la al menos una entre una o más anomalías cromosómicas, uno o más trastornos de un solo gen y/o una o más afecciones cancerosas, basándose en una o más mediciones de la abundancia (p. ej., un conjunto de relaciones de la abundancia asociada a una diana y un conjunto de relaciones de la abundancia asociada con una referencia, tales como relaciones de la abundancia global asociada a una diana, determinadas a partir del conjunto de relaciones de la abundancia asociada a una diana, y una relación de la abundancia global asociada a una referencia, determinada a partir del conjunto de la abundancia asociada a una referencia; etc.).

En variaciones, facilitar una o más caracterizaciones puede basarse en una o más mediciones de la fracción fetal (y/o cualquier otro dato adecuado, como una o más mediciones de la abundancia, etc.). Por ejemplo, facilitar el diagnóstico prenatal puede incluir facilitar el diagnóstico prenatal de uno o más trastornos genéticos basándose en una medición de la fracción fetal y/o una o más mediciones de la abundancia (p. ej., una relación de la abundancia global asociada a una diana, una relación de la abundancia global asociada a una referencia, una comparación entre las relaciones, etc.). Sin embargo, facilitar las caracterizaciones basándose en las mediciones de la fracción fetal se puede realizar de cualquier manera adecuada.

Facilitar la caracterización de una o más afecciones y/o cualquier otra porción adecuada de las realizaciones del método 100 (por ejemplo, determinar mediciones de la abundancia, facilitar el tratamiento, etc.) puede incluir aplicar uno o más enfoques de inteligencia artificial (por ejemplo, enfoques de aprendizaje automatizado, etc.) que incluyen uno cualquiera o más entre: aprendizaje supervisado (por ejemplo, usando regresión logística, usando redes neuronales de retropropagación, usando bosques aleatorios, árboles de decisión, etc.), aprendizaje no supervisado (por ejemplo, usando un algoritmo Apriori, usando agrupamiento de K-means), aprendizaje semisupervisado, un algoritmo de aprendizaje profundo (por ejemplo, redes neuronales, una máquina de Boltzmann restringida, un método de red de creencias profundas, un método de red neuronal convolucional, un método de red neuronal recurrente, un método de codificador automático apilado, etc.), aprendizaje por refuerzo (p. ej., utilizando un algoritmo Q-learning, utilizando aprendizaje de diferencia temporal), un algoritmo de regresión (p. ej., mínimos cuadrados ordinarios, regresión logís­ tica, regresión paso a paso, líneas de regresión adaptativa multivariante, suavización del diagrama de dispersión es­ timado localmente, etc.), un método basado en ejemplos (p. ej., k-vecino más cercano, cuantificación del vector de aprendizaje, mapa de autoorganización, etc.), un método de regularización (p. ej., regresión de cresta, mínima con­ tracción absoluta y operador de selección, red elástica, etc.), un método de aprendizaje de árbol de decisión (p. ej., árbol de clasificación y regresión, dicotomizador iterativo 3, C4.5, detección de interacción automática chi-cuadrado, muñón de decisión, bosque aleatorio, líneas de regresión adaptativa multivariante, máquinas potenciadoras de gra­ dientes, etc.), un método bayesiano (p. ej., bayesiano ingenuo, estimadores promediados de una dependencia, red de creencias bayesianas, etc.), un método kernel (p. ej., una máquina de vectores de soporte, una función de base radial, un análisis de discriminación lineal, etc.), un método de agrupamiento (p. ej., agrupamiento de k-medias, maximización de expectativas, etc.), un algoritmo de aprendizaje de reglas asociado (p. ej., un algoritmo Apriori, un algoritmo Eclat, etc.), un modelo de red neuronal artificial (p. ej., un método Perceptron, un método de retropropagación, un método de red de Hopfield, un método de mapa autoorganizado, un método de cuantificación de vector de aprendizaje, etc.), un método de reducción de dimensionalidad (p. ej., análisis de componentes principales, regresión de mínimos cua­ drados parciales, cartografiado de Sammon, escala de conversión multidimensional, búsqueda de proyección, etc.), un método de conjunto (por ejemplo, impulso, agregación de tipo bootstrapped, AdaBoost, generalización apilada, método de máquina de aumento de gradiente, método de bosque aleatorio, etc.), y/o cualquier enfoque de inteligencia artificial adecuado.

Sin embargo, facilitar la caracterización de una o más afecciones S150 se puede realizar de cualquier manera ade­ cuada.

2.7 Facilitar el tratamiento

Adicional o alternativamente, las realizaciones del método 100 pueden incluir facilitar el tratamiento S160 (por ejemplo, basándose en una o más mediciones de la abundancia; basándose en una o más caracterizaciones de una o más afecciones, etc.), lo que puede servir para aprovechar los datos de la abundancia para determinar, proporcionar, ad­ ministrar, promover, recomendar y/o facilitar de otro modo la prestación de un tratamiento (por ejemplo, prestación de un tratamiento personalizado, etc.) para una o más afecciones. Facilitar el tratamiento puede incluir la aplicación de cualquier técnica adecuada asociada con un análisis de las mediciones de la abundancia (p. ej., para facilitar una o más caracterizaciones; usando operaciones estadísticas o algoritmos similares o diferentes; usando las mismas me­ diciones o diferentes mediciones de la abundancia, datos complementarios, otros datos adecuados, etc.). Los trata­ mientos pueden incluir uno cualquiera o más entre: composiciones terapéuticas (por ejemplo, composiciones relacio­ nadas con el embarazo, tratamientos basados en medicamentos, tratamientos basados en probióticos, tratamientos basados en agentes tópicos, etc.), tratamientos quirúrgicos, tratamientos basados en dispositivos médicos, tratamien­ tos relacionados con notificaciones de la salud (por ejemplo, transmitidas al sujeto, a un profesional sanitario, etc.) que incluyen una información relacionada con la afección y/o relacionada con el tratamiento, obtenida basándose en me­ diciones de la abundancia; tratamientos relacionados con la dieta; tratamientos cognitivos/conductuales; terapias físi­ cas; tratamientos relacionados con la clínica (p. ej., telemedicina, programación de una cita con un profesional sanita­ rio, etc.); tratamientos basados en la medicina alternativa; tratamientos basados en el medio ambiente; y/o cualquier otro tipo de tratamiento adecuado. Sin embargo, facilitar el tratamiento S160 se puede realizar de cualquier manera adecuada.

2.8 Validación

Adicional o alternativamente, las realizaciones del método 100 pueden incluir la validación S105 (p. ej., tal como la validación de una o más porciones de las realizaciones del método 100 y/o el sistema 200, etc.), lo que puede servir para evaluar cualquier parámetro adecuado (p. ej., precisión, coste, eficacia, capacidad de despliegue, etc.) asociado con realizaciones del método 100 y/o el sistema 200. En un ejemplo específico, la FIGURA 10 puede incluir una representación de un protocolo de laboratorio de prácticas para añadir ADN adicional a una muestra de masa desco­ nocida; en donde la secuencia del ADN adicional es idéntica al ADN endógeno, excepto por una región variable de 10 pb; en donde el ADN endógeno y el adicional se amplifican después mediante PCR, y el amplicón resultante se purifica y se secuencia según Sanger, usando por ejemplo la química BigDye v33; en donde la FIGURA 10 incluye cromatogramas del ADN adicional y endógeno, preparaciones puras del ^a Dⁿ endógeno y adicional secuenciadas individual­ mente; en donde el cromatograma de una mezcla de endógeno/adicional es una combinación lineal de los cromatogramas de adicional y endógeno puros; en donde la FIGURA 10 incluye los resultados de un análisis informático de los datos del cromatograma para calcular la masa de ADN endógeno; en donde la relación entre ADN adicional y endógeno se determina a partir de un análisis de regresión lineal; en donde se analiza individualmente cada canal del cromatograma de tipo Sanger, correspondiente a didesoxinucleótidos marcados con fluorescencia; en donde se re­ presenta el análisis en el canal "A"; y en donde se miden las intensidades de los picos en las posiciones de las bases que se espera que muestren un pico "A" en el ADN endógeno o en el adicional para los cromatogramas. En un ejemplo específico, tal y como se muestra en la FIGURA 10, la validación puede incluir realizar un procesamiento de las mues­ tras y un procesamiento informático (por ejemplo, usando cualquier técnica adecuada descrita en este documento, etc.), para evaluar la precisión de las realizaciones del método 100 en la determinación de mediciones de la abundan­ cia para mezclas adicionales y/u otros componentes adecuados; en donde las mediciones de la validación (p. ej., la relación entre endógeno y adicional para una mezcla adicional que incluye componentes con abundancias conocidas, etc.) se pueden calcular de una manera que se puede usar como factor de calibración para ajustar las mediciones de la relación de la abundancia, calculadas para muestras con abundancias de moléculas diana desconocidas, y/o se pueden usar para cualquier fin adecuado.

En una variación, tal y como se muestra en las FIGURAS 12A-12B, cualquier abundancia adecuada (p. ej., a partir de una dilución en serie, etc.) de moléculas asociadas a una diana (p. ej., moléculas adicionales) puede usarse para evaluar la exactitud, la precisión y/o u otros parámetros adecuados asociados con porciones de realizaciones del método 100. En un ejemplo específico, tal y como se muestra en las FIGURAS 12A-12B (por ejemplo, que indican la exactitud y/o la precisión de aplicar porciones de realizaciones del método 100), 42 ng de ADn genómico humano NA12878 se mezclaron con cantidades variables de ADN adicional y se amplificaron con 30 rondas de PCR, y la relación de ADN adicional en cada muestra se determinó aplicando porciones de realizaciones del método 100; y en donde la línea de regresión se ajustó a las 4 muestras que proporcionaban una relación de adicional >0, y basándose en el ajuste de la regresión, 0,0226 amol o 44,9 ng, se predice que se obtendrá una relación de adicional de 1/ 2 ; en donde se mezcló 1 fmol de ADN de referencia con ADN adicional con las relaciones indicadas; y en donde las mezclas se amplificaron con 20x PCR, se purificaron y se pueden realizar porciones de realizaciones del método 100.

Las porciones de las realizaciones del método 100 y/o el sistema 200 pueden incorporarse y/o implementarse al menos en parte como una máquina configurada para recibir un medio legible por ordenador que almacena instrucciones legibles por ordenador. Las instrucciones pueden ser ejecutadas por componentes ejecutables por un ordenador que pueden integrarse con realizaciones del sistema 200. El medio legible por ordenador puede almacenarse en cualquier medio legible por ordenador adecuado, como RAM, ROM, memoria flash, EEPROM, dispositivos ópticos (CD o DVD), discos duros, unidades de disquete o cualquier dispositivo adecuado. El componente ejecutable por ordenador puede ser un procesador general o específico de la aplicación, pero cualquier dispositivo de combinación de un sistema informático/microprograma o un sistema informático especializado adecuado, puede alternativa o adicionalmente ejecutar las instrucciones.

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Un método para facilitar un diagnóstico prenatal de un trastorno genético a partir de una muestra materna obtenida a partir de una mujer embarazada, comprendiendo el método:

• generar un primer conjunto de moléculas asociadas a una diana que comprenden una primera secuencia asociada a una diana que comprende:

• una primera región asociada a una diana con similitud de secuencia con una primera región de una secuen­ cia diana de una primera secuencia diana de una diana biológica, en donde la diana biológica está asociada con el trastorno genético; y

• una región de variación de la diana con disimilitud de secuencia con una región de la secuencia de una secuencia diana;

• generar una mezcla adicional coamplificada basándose en la coamplificación del primer conjunto de moléculas aso­ ciadas a una diana y primeras moléculas de ácido nucleico procedentes de la muestra materna, en donde las primeras moléculas de ácido nucleico comprenden la región de la secuencia diana;

• secuenciar con el modo Sanger la mezcla adicional coamplificada para determinar al menos un resultado relacionad con un cromatograma que comprende los primeros picos asociados con la primera región asociada a una diana, la región de la secuencia diana de la diana biológica, la región de variación de la diana y la región de la secuencia de la diana biológica;

• determinar un primer conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana, en donde cada medición de la abundancia asociada a una diana, del primer conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana, corres­ ponde a una pareja diferente de una base de la primera secuencia asociada a una diana y una base de la primera secuencia diana, en donde determinar el primer conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana com­ prende, para cada una de las parejas diferentes:

• determinar una medición de la intensidad del pico para la base de la primera secuencia asociada a una diana de la pareja, basándose en el al menos un resultado relacionado con un cromatograma;

• determinar una medición de la intensidad del pico para la base de la primera secuencia diana de la pareja, basándose en al menos un resultado relacionado con un cromatograma; y

• determinar una medición de la abundancia asociada a una diana del primer conjunto de mediciones de la abun­ dancia asociada a una diana, basándose en la medición de la intensidad del pico para la base de la primera secuencia asociada a una diana y la medición de la intensidad del pico para la base de la primera secuencia diana;

• determinar una medición de la abundancia global asociada a una diana basándose en el primer conjunto de medi­ ciones de la abundancia asociada a una diana; y

• facilitar el diagnóstico prenatal del trastorno genético basándose en una comparación entre la medición de la abun­ dancia global asociada a una diana y una medición de la abundancia global asociada a una referencia que describe la abundancia de una referencia biológica en relación con moléculas asociadas a una referencia.

2. El método según la reivindicación 1,

• en donde el trastorno genético comprende al menos uno entre una anomalía cromosómica y un trastorno de un solo gen,

• en donde la primera región de la secuencia diana está asociada con al menos uno entre un primer cromosoma y una mutación,

• en donde una región de la secuencia de una referencia de la referencia biológica está asociada con al menos uno entre un segundo cromosoma y la falta de mutación, y

• en donde facilitar el diagnóstico prenatal del trastorno genético comprende facilitar el diagnóstico prenatal de al menos uno entre la anomalía cromosómica y el trastorno de un solo gen basándose en la comparación entre la medi­ ción de la abundancia global asociada a una diana y la medición de la abundancia global asociada a una referencia.

3. El método según la reivindicación 2, en donde el trastorno genético comprende la anomalía cromosómica, en donde la primera secuencia diana corresponde a un primer locus del primer cromosoma, en donde el método comprende además:

• generar un segundo conjunto de moléculas asociadas a una diana que comprenden una segunda secuencia asociada a una diana, en donde la segunda secuencia asociada a una diana comprende:

• una segunda región asociada a una diana con similitud de secuencia con una segunda región de la secuencia diana de una segunda secuencia diana,

• en donde la segunda secuencia diana corresponde a un segundo locus del primer cromosoma; y

• determinar un segundo conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana basándose en al menos un resultado relacionado con un cromatograma, en donde cada medición de la abundancia asociada a una diana, del segundo conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana, corresponde a una pareja diferente de una base de la segunda secuencia asociada a una diana y una base de la segunda secuencia diana,

• en donde determinar la medición de la abundancia global asociada a una diana comprende determinar la medición de la abundancia global asociada a una diana basándose en el primer conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana y el segundo conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana, y

• en donde la región de la secuencia de una referencia de la referencia biológica está asociada con el segundo cro­ mosoma.

4. El método según la reivindicación 1, en donde facilitar el diagnóstico prenatal comprende facilitar el diagnóstico prenatal del trastorno genético basándose en una medición de una fracción fetal, la medición de la abundancia global asociada a una diana y la medición de la abundancia global asociada a una referencia.

5. El método según la reivindicación 1, en donde la región de variación de la diana comprende al menos una inserción y una deleción en comparación con la secuencia diana, en donde el al menos un resultado relacionado con el croma­ tograma comprende posiciones del alineamiento correspondientes a los primeros picos, en donde, para cada una de las diferentes parejas, la base de la primera secuencia asociada a una diana corresponde a una primera posición del alineamiento que es diferente de una segunda posición del alineamiento correspondiente a la base de la primera secuencia diana, y en donde las posiciones del alineamiento del al menos un resultado relacionado con el cromatograma comprenden la primera y la segunda posición del alineamiento.

6. Un método in vitro para facilitar la caracterización de una afección médica a partir de una muestra que comprende moléculas diana, en donde el método comprende:

• generar un conjunto de moléculas asociadas a una diana que comprenden una secuencia asociada a una diana que comprende:

• una primera región asociada a una diana con similitud de secuencia con una primera región de la secuencia diana de una secuencia diana de una diana biológica, en donde la diana biológica está asociada con el trastorno genético; y

• una región de variación de la diana con disimilitud de secuencia con una región de una secuencia de la secuen­ cia diana;

• realizar una secuenciación de tipo Sanger basándose en el conjunto de moléculas asociadas a una diana y las moléculas diana que comprenden la secuencia diana, para determinar al menos un resultado relacionado con el cro­ matograma que comprende un primer conjunto de picos asociados con la primera región asociada a una diana, la primera región de la secuencia diana de la diana biológica, la región de variación de la diana y la región de la secuencia de la diana biológica;

• determinar un conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana para un conjunto de diferentes parejas de bases basándose en el primer conjunto de picos de al menos un resultado relacionado con el cromatograma, en donde cada pareja de bases diferente, procedente del conjunto de diferentes parejas de bases, corresponde a una pareja de una base de la secuencia asociada a una diana y una base de la secuencia diana; y

• facilitar la caracterización de la afección médica basándose en el conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana y un conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una referencia que describen la abundancia de una referencia biológica en relación con moléculas asociadas a una referencia.

7. El método según la reivindicación 6, en donde la región de variación de la diana comprende al menos una entre una sustitución, una inserción y una deleción, en relación con la región de una secuencia de la secuencia diana, y en donde determinar el conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana comprende determinar el conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana basándose en el primer conjunto de picos y la al menos una entre la sustitución, la inserción y la deleción.

8. El método según la reivindicación 7, en donde la región de variación de la diana comprende al menos una entre la inserción y la deleción, en donde el al menos un resultado relacionado con el cromatograma comprende posiciones del alineamiento correspondientes al primer conjunto de picos, y en donde determinar el conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana comprende, para cada una de las diferentes parejas:

• determinar una medición de la intensidad del pico, en una primera posición del alineamiento de las posiciones del alineamiento, para la base de la primera secuencia asociada a una diana de la pareja, basándose en el al menos un resultado relacionado con el cromatograma;

• determinar una medición de la intensidad del pico, en una segunda posición del alineamiento de las posiciones del alineamiento, para la base de la primera secuencia diana de la pareja, basándose en el al menos un resultado rela­ cionado con el cromatograma, en donde la primera posición del alineamiento es diferente de la segunda posición del alineamiento, y en donde las posiciones del alineamiento comprenden la primera y la segunda posición del alinea­ miento; y

• determinar una medición de la abundancia asociada a una diana del conjunto de mediciones de la abundancia aso­ ciada a una diana, basándose en la medición de la intensidad del pico para la base de la secuencia asociada a una diana y la medición de intensidad del pico para la base de la primera secuencia diana.

9. El método según la reivindicación 8,

• en donde la primera posición del alineamiento corresponde a un primer pico y a un segundo pico del primer conjunto de picos,

• en donde el primer pico corresponde a una base solapante de la secuencia asociada a una diana,

• en donde el primer pico corresponde a una primera medición de la abundancia asociada a una diana del conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana,

• en donde el segundo pico corresponde a una base solapante de la secuencia diana, y

• en donde el segundo pico corresponde a una segunda medición de la abundancia asociada a una diana del conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana.

10. El método según la reivindicación 6,

• en donde la afección médica comprende al menos una anomalía cromosómica, un trastorno de un solo gen y una afección cancerosa,

• en donde la primera región de la secuencia diana está asociada con al menos uno entre un primer cromosoma y una mutación,

• en donde una región de la secuencia de una referencia de la referencia biológica está asociada con al menos uno entre un segundo cromosoma y una falta de mutación, y

• en donde facilitar la caracterización de la afección médica comprende facilitar la caracterización de al menos uno entre la anomalía cromosómica, el trastorno de un solo gen y la afección cancerosa, basándose en el conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana y el conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una referencia.

11. El método según la reivindicación 6, que comprende además añadir al menos una región de una secuencia a al menos uno entre el conjunto de moléculas asociadas a una diana y las moléculas diana, en donde la al menos una región de una secuencia comprende al menos una entre (a) una segunda región asociada a una diana con similitud de secuencia con una segunda región de una secuencia diana y (b) al menos una repetición de la secuencia de al menos una entre una región de la secuencia asociada a una diana y una región de la secuencia diana.

12. El método según la reivindicación 11,

• en donde añadir la al menos una región de una secuencia comprende añadir la al menos una repetición de la se­ cuencia de la al menos una entre la región de la secuencia asociada a una diana y la región de la secuencia diana, • en donde el primer conjunto de picos del al menos un resultado relacionado con el cromatograma corresponde a una primera secuenciación de la primera región asociada a una diana, la primera región de la secuencia diana de la diana biológica, la región de variación de la diana y la región de la secuencia de la diana biológica,

• en donde el al menos un resultado relacionado con el cromatograma comprende un segundo conjunto de picos correspondientes a una segunda secuenciación de la primera región asociada a una diana, la primera región de la secuencia diana de la diana biológica, la región de variación de la diana y la región de la secuencia de la diana biológica, y

• en donde determinar el conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana comprende determinar el conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana basándose en el primer conjunto de picos y el segundo conjunto de picos.

13. El método según la reivindicación 6, que comprende además añadir al menos una repetición de la secuencia a al menos uno entre conjunto de moléculas asociadas a una diana y las moléculas diana, en donde añadir la al menos una repetición de la secuencia comprende coamplificar, con un conjunto de cebadores que comprenden una secuencia de horquilla, el conjunto de moléculas asociadas a una diana y las moléculas diana.

14. Un método in vitro para la cuantificación de dianas biológicas a partir de una muestra que comprende moléculas diana, comprendiendo el método:

• realizar una secuenciación de tipo Sanger de una mezcla adicional coamplificada para generar al menos un resultado relacionado con el cromatograma, asociado con un primer conjunto de moléculas asociadas a una diana y un conjunto de moléculas diana, en donde:

• el primer conjunto de moléculas asociadas a una diana comprende una primera secuencia asociada a una diana que comprende:

• una primera región asociada a una diana con similitud de secuencia con una primera región de la secuencia diana de una primera secuencia diana de las moléculas diana, en donde el conjunto de moléculas diana comprende la primera región de la secuencia diana; y

• una región de variación de la diana con disimilitud de secuencia con una región de una secuencia de la primera secuencia diana; y

• la mezcla adicional coamplificada se había generado basándose en la coamplificación del primer conjunto de moléculas asociadas a una diana y las primeras moléculas de ácido nucleico de una muestra, en donde las primeras moléculas de ácido nucleico comprenden la región de la secuencia diana;

• determinar un primer conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana para diferentes conjuntos de bases basándose en al menos un resultado relacionado con el cromatograma, en donde cada conjunto diferente de bases, procedente de los diferentes conjuntos de bases, comprende al menos una base de la primera secuencia asociada a una diana y al menos una base de la primera secuencia diana;

• determinar una primera medición de la abundancia global que describe una primera abundancia de la diana biológica para la muestra, basándose en el primer conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana; y

• cuantificar una cantidad de la diana biológica basándose en una comparación entre la medición de la abundancia global asociada a una diana y una medición de la abundancia global asociada a una referencia que describe la abun­ dancia de una referencia biológica en relación con moléculas asociadas a una referencia.

15. El método según la reivindicación 14,

• en donde determinar el al menos un resultado relacionado con el cromatograma comprende determinar el al menos un resultado relacionado con el cromatograma basándose en la secuenciación de tipo Sanger asociada con el primer conjunto de moléculas asociadas a una diana, el conjunto de moléculas diana y un segundo conjunto de moléculas asociadas a una diana,

• en donde el segundo conjunto de moléculas asociadas a una diana comprende una segunda secuencia asociada a una diana que comprende una segunda región asociada a una diana con similitud de secuencia con una segunda región de la secuencia diana de una segunda secuencia diana, y

• en donde el método comprende además determinar un segundo conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana para diferentes conjuntos de bases de la segunda secuencia asociada a una diana y la segunda secuencia diana, basándose en el al menos un resultado relacionado con el cromatograma.

16. El método según la reivindicación 15, en donde la primera secuencia diana corresponde a un primer locus de un cromosoma, en donde la segunda secuencia diana corresponde a un segundo locus del cromosoma, y en donde el método comprende además facilitar la caracterización de una anomalía cromosómica basándose en la primera medi­ ción de la abundancia global.

17. El método según la reivindicación 14, en donde la diana biológica está asociada con una afección médica, y en donde el método comprende además facilitar una caracterización de la afección médica basándose en una primera comparación entre la primera medición de la abundancia global y una medición de la abundancia global asociada a una referencia que describe la abundancia de [[a] la referencia biológica.

18. El método según la reivindicación 17,

• en donde la afección médica comprende al menos uno entre un trastorno de un solo gen y una afección cancerosa,

• en donde la primera medición de la abundancia global está asociada con un primer período de tiempo,

• en donde el método comprende además determinar una segunda medición de la abundancia global que describe una segunda abundancia de la diana biológica, en donde la segunda medición de la abundancia global está asociada con un segundo período de tiempo, y

• en donde facilitar la caracterización de la afección médica comprende facilitar la caracterización de la afección médica basándose en la primera comparación y la segunda medición de la abundancia global.

19. El método según la reivindicación 14,

• en donde la secuenciación de tipo Sanger comprende:

• una secuenciación de tipo Sanger de una primera muestra que comprende el primer conjunto de moléculas asociadas a una diana; y

• una secuenciación de tipo Sanger de una segunda muestra que comprende el conjunto de moléculas diana, • en donde la determinación del al menos un resultado relacionado con el cromatograma comprende:

• determinar un primer resultado relacionado con el cromatograma asociado con el primer conjunto de moléculas asociadas a una diana, basándose en la secuenciación de tipo Sanger de la primera muestra; y

• determinar un segundo resultado relacionado con el cromatograma asociado con el conjunto de moléculas diana, basándose en la secuenciación de tipo Sanger de la segunda muestra, y

• en donde determinar el primer conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana comprende determinar el primer conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana basándose en el primer resultado relacionado con el cromatograma y el segundo resultado relacionado con el cromatograma.

20. El método según la reivindicación 14, en donde determinar el primer conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana basándose en el al menos un resultado relacionado con el cromatograma comprende determinar el primer conjunto de mediciones de la abundancia asociada a una diana para los diferentes conjuntos de bases basándose en al menos uno entre intensidades de picos, áreas de picos, mediciones de picos para bases que com­ parten un tipo de base y mediciones de picos para bases con diferentes tipos de base.