CN111094583A - 与生物靶相关的定量中利用靶相关分子的测序输出确定和分析 - Google Patents

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Abstract

方法和/或***的实施方案可以包括生成与一种或更多种生物靶相关的靶相关分子(例如，加标(spike‑in)分子)的集合；基于与包含一种或更多种生物靶的一种或更多种样品一起处理靶相关分子的集合来生成一种或更多种加标混合物；对一种或更多种加标混合物进行一个或更多个Sanger测序操作；基于来自一个或更多个Sanger测序操作的色谱相关输出来确定一种或更多种丰度度量；和/或基于一种或更多种丰度度量来促进一种或更多种医学状况的表征。

Description

与生物靶相关的定量中利用靶相关分子的测序输出确定和 分析
对相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年8月4日提交的美国临时申请序列号62/541,565的权益，该临时申请通过该引用以其整体并入本文。
技术领域
本公开内容总体上涉及基因组学的领域。
附图简述
图1A-1C包括方法的实施方案的变化形式的流程图；
图2包括方法的实施方案的变化形式的示意图；
图3包括靶序列、靶相关序列和相关引物的具体实例；
图4包括包含发夹序列的PCR引物的具体实例；
图5A-5E包括在方法的实施方案的变化形式中用包含发夹序列的PCR引物进行扩增的产物的具体实例；
图6A-6B包括色谱相关输出和丰度度量的具体实例；
图7A-7B包括色谱相关输出和丰度度量的具体实例；
图8包括方法的实施方案的变化形式的示意图；
图9包括方法的实施方案的变化形式的示意图；
图10包括方法的实施方案的变化形式的部分的图示；以及
图11包括靶序列和靶相关序列的具体实例；
图12A-12B包括来自对方法的实施方案的变化形式的部分进行验证的结果的图示；
图13A-13B包括方法的实施方案的变化形式的部分的示意图。
实施方案的描述
以下实施方案(例如，包括实施方案的变化形式、实施方案的实例、实施方案的具体实例、其他合适的变化形式等等)的描述不意图限制于这些实施方案，而是使本领域技术人员能够制造和使用。
1.概要.
如图1A-1C和图2中所示出的，方法100(例如，用于确定生物靶丰度；用于促进一种或更多种状况的表征等等)的实施方案可以包括：生成与一种或更多种生物靶相关的靶相关分子(例如，加标(spike-in)分子等等)的集合S110；生成一种或更多种加标混合物S120(例如，基于与包含一种或更多种生物靶的一种或更多种样品诸如生物样品和/或合成样品一起处理靶相关分子的集合等等)，诸如其中一种或更多种加标混合物可以被配置为促进准确度的增加(例如，通过使扩增偏差最小化，诸如基于靶相关分子与一种或更多种生物靶的共扩增；等等)和/或可部署性的增加(例如，通过与测序技术诸如Sanger测序的兼容性等等)；进行一个或更多个测序操作S130(例如，Sanger测序等等)，诸如基于一种或更多种加标混合物；和/或确定一种或更多种丰度度量S140(例如，靶分子相对于靶相关分子的丰度比率；等等)，诸如基于对一种或更多种加标混合物的一个或更多个测序操作(例如，基于内源性碱基和加标碱基之间的相对色谱峰强度等等)。
另外地或可选择地，方法100的实施方案可以包括以下中的一个或更多个：处理参考相关分子的集合S115(其例如，与样品中的参考分子相关，其中可以将相对于参考相关分子的集合确定的丰度度量与靶相关丰度度量进行比较以用于促进一种或更多种状况的表征和/或治疗；等等)；促进一种或更多种状况的表征S150，诸如基于一种或更多种丰度度量；促进治疗S160(例如，基于一种或更多种丰度度量对一种或更多种状况的治疗等等)；和/或验证S105，诸如对方法100的实施方案的一个或更多个部分进行验证；和/或任何其他合适的方法。
在具体的实例中，方法100(例如，用于促进由与妊娠女性相关的母体样品进行遗传紊乱诸如一种或更多种染色体紊乱和/或单基因紊乱的产前诊断等等)可以包括：生成包含靶相关序列的靶相关分子的集合，该靶相关序列包含：与生物靶的靶序列的靶序列区域具有序列相似性的靶相关区域，其中生物靶与遗传紊乱相关；以及与靶序列的序列区域具有序列相异性(dissimilarity)的靶变异区域；基于对靶相关分子的集合和来自母体样品的核酸分子进行共扩增来生成共扩增的加标混合物，其中核酸分子包含靶序列区域；对共扩增的加标混合物进行Sanger测序，以确定至少一个色谱相关输出(例如，色谱、对应于碱基的峰、峰的强度等等)，该色谱相关输出包括与靶相关区域、生物靶的靶序列区域、靶变异区域和生物靶的序列区域相关的峰；确定靶相关丰度比率(和/或其他合适的丰度度量；等等)的集合，其中靶相关丰度比率的集合中的每一个靶相关丰度比率对应于靶相关序列的碱基和靶序列的碱基的不同对(例如，其中所述对的碱基共享相同的碱基类型；其中所述对的碱基共享不同的碱基类型；等等)，其中对于不同对中的每一对，确定靶相关丰度比率的集合包括：基于至少一个色谱相关输出(例如，基于根据Sanger测序确定的峰的强度值；等等)来确定所述对的靶相关序列的碱基的峰强度度量(例如，峰的最大强度；峰的总体强度；等等)；基于至少一个色谱相关输出来确定所述对的靶序列的碱基的峰强度度量；以及基于靶相关序列的碱基的峰强度度量和靶序列的碱基的峰强度度量来确定靶相关丰度比率的集合中的靶相关丰度比率(例如，靶序列的碱基的峰强度度量与靶相关分子序列的碱基的峰强度度量的比率；等等)；基于靶相关丰度比率的集合来确定总体靶相关丰度比率；和/或基于总体靶相关丰度比率和描述生物参考相对于参考相关分子的丰度的参考相关总体丰度比率(和/或其他合适的参考相关丰度度量；等等)之间的比较来促进遗传紊乱的产前诊断。
在具体实例中，方法100(例如，用于促进由包含靶分子的样品进行医学状况诸如一种或更多种遗传紊乱和/或癌症状况的表征等等)可以包括：生成包含靶相关序列的靶相关分子的集合，所述靶相关序列包含：与生物靶的靶序列的靶序列区域具有序列相似性的靶相关区域，其中生物靶与遗传紊乱相关；以及与靶序列的序列区域具有序列相异性的靶变异区域；基于靶相关分子的集合和包含靶序列的靶分子进行Sanger测序，以确定至少一个色谱相关输出，该色谱相关输出包括与靶相关区域、生物靶的靶序列区域、靶变异区域和生物靶的序列区域相关的峰的集合；基于至少一个色谱相关输出的峰的集合来确定不同碱基对的集合的靶相关丰度比率(和/或其他合适的丰度度量；等等)的集合，其中来自不同碱基对的集合的每一个不同碱基对对应于靶相关序列的碱基和靶序列的碱基的对；和/或基于靶相关丰度比率的集合和描述生物参考相对于参考相关分子的丰度的参考相关丰度比率(和/或其他合适的参考相关丰度度量；等等)的集合来促进医学状况的表征(例如，检测、诊断等等)(例如，基于总体靶相关丰度比率和总体参考相关丰度比率之间的比较来促进表征；其中总体靶相关丰度比率可以基于靶相关丰度比率的集合的组合来确定；其中总体参考相关丰度比率可以基于参考相关丰度比率的集合的组合来确定；等等)。
在具体实例中，方法100(例如，用于由包含靶分子的样品进行生物靶定量等等)可以包括：基于与靶相关分子的集合和靶分子的集合相关的Sanger测序(例如，通过第三方、通过任何合适的实体；等等)来确定与靶相关分子的集合和靶分子的集合相关的至少一个色谱相关输出，其中靶相关分子的集合包括靶相关序列，该靶相关序列包含：与生物靶的靶序列的靶序列区域具有序列相似性的靶相关区域，其中靶分子的集合包括靶序列区域；以及与靶序列的序列区域具有序列相异性的靶变异区域；基于至少一个色谱相关输出来确定碱基的不同集合的靶相关丰度比率(和/或其他合适的丰度度量；等等)的集合，其中来自碱基的不同集合的碱基的每一个不同集合包括靶相关序列中的至少一个碱基和靶序列中的至少一个碱基；和/或基于靶相关丰度比率的集合来确定描述样品的生物靶的丰度的总体丰度度量。
在具体实例中，方法100可以包括：生成靶相关核酸(例如，加标核酸；等等)的集合，其中核酸包含与靶染色体(例如，染色体21；其中可以生成靶相关核酸的不同集合，其中不同集合可以对应于染色体21的不同基因座并且可以包括与靶序列的不同靶序列区域具有序列相似性的不同靶相关区域，其中不同靶序列区域或靶序列可以对应于不同基因座；等等)相关的一个或更多个靶相关区域(例如，靶相关核酸的集合，所述靶相关核酸包含含有靶相关区域的靶相关核酸序列；序列区域，其包含与样品中靶分子的靶序列的靶序列区域匹配的核苷酸序列，其中靶分子对应于生物靶；等等)，并且包含一个或更多个变异区域(例如，序列***；序列缺失；相对于靶序列(诸如鉴定染色体21的靶序列)具有多个改组(shuffle)碱基的变异序列等等)；将靶相关核酸的集合与来自样品(例如，来自妊娠女性的母体血液样品；等等)的靶核酸(例如，鉴定染色体21的内源性DNA分子)的集合组合；基于靶相关引物(例如，靶向由靶相关核酸和靶核酸共享的序列的引物)的集合来对靶相关核酸的集合和靶核酸的集合进行共扩增(例如，对于对应于不同基因座的靶相关核酸的每一个不同的集合，将靶相关核酸的集合与对应于基因座的靶核酸的集合共扩增；等等)，从而生成一种或更多种加标混合物；对一种或更多种加标混合物(和/或单独的靶相关核酸、单独的靶核酸和/或其他合适的分子的集合)进行Sanger测序，以确定一个或更多个色谱相关输出；对靶序列碱基和靶相关序列碱基的对(例如，对应于靶序列的原始序列位置和靶相关序列的移位序列位置的相同碱基类型的对，诸如其中靶相关序列的变异区域包含一个或更多个***和/或缺失；在对应于变异区域的位置处，诸如其中变异区域包含相对于靶序列的改组碱基类型的集合；等等)的一个或更多个色谱相关输出(例如，来自Sanger测序的色谱；来自Sanger测序的峰数据诸如包括峰强度度量的峰强度数据；等等)进行统计估计分析(例如，一般线性回归、非负最小二乘法、压缩感知、随机样本一致性；等等)；对于每一对，基于将靶序列碱基的峰强度度量(例如，峰的最大强度；峰的总体强度；等等)(和/或其他合适的测序输出)与靶相关序列碱基的峰强度度量(和/或其他合适的测序输出)进行比较来提取内源性与加标的个体丰度比率；基于个体丰度比率来生成总体丰度比率(例如，对与染色体21的多个靶基因座相关的靶序列碱基和靶相关序列碱基的不同对的个体丰度比率进行平均；对跨基因座的丰度比率进行平均；等等)；以及基于丰度比率(例如，基于将染色体21的总体丰度比率与参考总体丰度比率进行比较，所述参考总体丰度比率基于根据方法100的实施方案的部分与来自样品的参考分子一起处理参考相关分子针对参考染色体诸如染色体18所计算出；其中所述比较可以促进唐氏综合征和爱德华兹综合征的表征；等等)来促进一种或更多种状况的一种或更多种表征(例如，唐氏综合征诊断、其他状况表征、测序输出的分析等等)。
方法100和/或***200的实施方案可以用于提高与确定一种或更多种生物靶的丰度度量(例如，分子计数)有关的成本效益(例如，通过利用Sanger测序技术等等)、可部署性(例如，在对基因组测序***具有有限的访问的国家等中的可部署性)以及准确度(例如，与小于1％的变异系数相关的准确度和/或任何合适的准确度等等)。方法100和/或***200的实施方案可以另外地或可选择地用于利用丰度度量来表征(例如，诊断)和/或治疗(例如，通过治疗确定、治疗评估和随时间的修改等等)一种或更多种状况。方法100和/或***200的实施方案可以另外地或可选择地用于克服传统方法的问题，诸如通过增加应用(例如，数字PCR)的多重化(multiplexing)能力、提高应用(例如，qPCR)的准确度和/或任何其他合适的改进来克服传统方法的问题。然而，实施方案可以包括任何合适的功能性。
方法100和/或***200的实施方案可以与一种或更多种状况联合(例如，与一种或更多种状况的表征、诊断、治疗和/或进行与一种或更多种状况有关的方法等等联合)使用，其中所述状况可以包括以下中的一种或更多种和/或以其他方式与其相关：非侵入性产前检测(NIPT)(例如，涉及针对染色体异常的存在的基因筛查，该染色体异常包括非整倍性，诸如21三体或唐氏综合征、18三体或爱德华兹综合征、13三体或帕陶综合征、性染色体非整倍性诸如特纳综合征、其他合适的非整倍体；包括迪格奥尔格综合症(DiGeorge syndrome)的染色体异常；涉及针对单基因紊乱的基因筛查；罕见的变体相关状况；等等)；其他产前检测；非整倍性分析和/或产前环境之外的其他合适的分析；遗传紊乱(例如，单基因紊乱，其包括镰状细胞疾病和/或罕见变体相关状况；染色体异常；与基因扩增相关的紊乱；基因缺失；部分染色体异常；22q11.2缺失综合征或迪格奥尔格综合症；Charcot-Marie-Tooth综合征、囊性纤维化、亨廷顿氏病；杜氏肌营养不良；血友病、地中海贫血；罕见的变体相关状况等等)、与染色体异常(例如，额外的、缺失的、不规则的染色体DNA等等)相关的其他状况、罕见的变体相关状况、癌症(例如，通过分析肿瘤活检物中致癌基因的基因扩增；通过与HER2、MET、MYC-N、MYC-C、EGFR、FGFR1、ER/PR、KRAS、UGT1A1、c-KIT、CD20、CD30、FIP1L1-PDGFRα、PDGFR、VCR/ABL、PML/RAR-α、TPMT、UGT1A1、EML4/ALK、BRAF和/或任何其他合适的致癌基因、癌症生物标志物和/或其他癌症相关靶中的一种或更多种相关的分析；在确定和/或评估治疗诸如赫赛汀中，分析活检样品以评估循环肿瘤DNA随时间的盛行率(prevalence)；等等)和/或任何其他合适的状况。状况可以另外地或可选择地包括：精神和行为状况(例如，心理障碍；抑郁；精神病；等等)；交流相关状况(例如，表达性语言障碍；口吃；语音障碍；自闭症障碍；声音状况；听力状况；眼睛状况；等等)；睡眠相关状况(例如，失眠、睡眠呼吸暂停；等等)；心血管相关状况(例如，冠状动脉疾病；高血压；等等)；代谢相关状况(例如，糖尿病等等)、类风湿相关状况(例如，关节炎等等)；体重相关状况(例如，肥胖等等)；疼痛相关状况；内分泌相关状况；遗传相关状况；慢性疾病；和/或任何其他合适类型的状况。
方法100和/或***200的实施方案可以另外地或可选择地将实体(例如，样品、靶、参考、合成分子、用户、样品处理***、测序***、计算***等等)转化成不同的状态或事物。例如，方法100可以包括合成加标分子(例如，靶相关分子等等)，该加标分子包含相对于生物靶的共享区域(例如，共享核苷酸序列)和变异区域(例如，改组的核苷酸序列)，其中此类加标分子可以与靶分子一起处理(例如，使用相同的引物与靶分子一起共扩增等等)，以转化成适合于准确的丰度确定的形式，同时使扩增偏差最小化(例如，其中对于靶相关分子和靶分子两者，共扩增以相同的效率发生；等等)，诸如通过进行Sanger测序和基于来自对加标混合物进行Sanger测序的结果的相关计算分析进行。此类方法能够实现先前不可执行的丰度定量(例如，对于靶分子、对于参考分子等等的丰度定量)、状况表征(例如，对一种或更多种状况的诊断的改进；等等)，和/或治疗(例如，通过促进对于加标分子和靶分子(诸如与不同基因座相关的靶分子)的有意义的定量和比较的准确度的提高；通过促进治疗提供随时间的丰度确定和随时间的评估；等等)。然而，方法100和/或***200的实施方案可以提供任何其他合适的一种或更多种益处，诸如在使用***200的实施方案的部分的非通用组分以用于进行方法100的实施方案的非常规部分的背景下提供任何其他合适的一种或更多种益处。
另外地或可选择地，本文所描述的数据(例如，丰度度量；表征；测序输出；比率；标识符；分子设计诸如靶相关分子设计、参考相关分子设计、引物设计、实验设计；序列设计；序列区域设计；实验结果；验证结果；状况相关数据；治疗相关数据；等等)可以与任何合适的时间指示符(例如，秒、分、小时、天、周、时间段、时间点、时间戳等等)联合，该时间指示符包括以下中的一个或更多个：指示何时收集、确定、发送、接收和/或以其他方式处理数据的时间指示符；为通过数据描述的内容提供背景的时间指示符，诸如指示加标混合物生成和/或合适的测序文库制备和/或测序的不同阶段的时间指示符；时间指示符的变化(例如，随时间的数据诸如随时间的丰度度量，其可以用于促进一种或更多种状况的表征和/或促进治疗，诸如与癌症状况监测相关的治疗；数据的变化；数据模式；数据趋势；数据外推和/或其他预测；等等)；和/或与时间有关的任何其他合适的指示符。
另外地或可选择地，本文所描述的参数、度量、输入、输出和/或其他合适的数据可以与值类型相联合，该值类型包括以下中的任何一个或更多个：分数(score)、二进制值、分类、置信水平、标识符(例如，本文所描述的任何合适的分子的样品标识符、分子标识符等等)、沿谱的值和/或任何其他合适类型的值。本文所描述的任何合适类型的数据可以作为输入使用，作为输出生成和/或以对与方法100和/或***200的实施方案相关的任何合适的组分的任何合适的方式操作。
本文所描述的方法100和/或过程的实施方案的一个或更多个实例和/或部分可以通过和/或使用本文所描述的***200、组分和/或实体的一个或更多个实例，相对于触发事件在时间上异步地(例如，顺序地)、同时地(例如，平行地；以多重化的、自动化的方式同时处理样品；在计算上同时处理Sanger测序产生的输出诸如峰数据和/或色谱，以提高***处理能力；任何合适数目的样品、混合物、测序输出和/或其他组分的任何合适的同时计算处理；多重化样品制备和/或测序操作；等等)和/或在任何合适的时间和频率上以任何其他合适的顺序进行。
***200的实施方案可以包括一个或更多个样品处理网络，该样品处理网络被配置为生成分子(例如，靶相关分子；参考相关分子；等等)、处理样品(例如，生物样品；合成样品；来自用户的样品；等等)和/或进行其他合适的方法；一个或更多个测序***(例如，Sanger测序***；等等)，该测序***被配置为对来自加标混合物、其他混合物和合适的样品和/或任何合适的组分的经处理的遗传物质进行测序；一个或更多个计算***(例如，远程计算***、本地计算***等等)，该计算***被配置为分析一个或更多个测序***的测序输出(例如，在确定一种或更多种丰度度量方面、在促进一种或更多种状况的表征方面、在促进治疗方面等等分析一个或更多个测序***的测序输出)；和/或任何其他合适的组件。方法100和/或***200的实施方案的部分优选地由第一方进行，但是可以另外地或可选择地由一个或更多个第三方、用户和/或任何合适的实体(例如，护理提供者、实验室技术人员等等)进行。
然而，方法100和***200可以以任何合适的方式配置。
2.1生成靶相关分子.
方法100的实施方案可以包括生成一种或更多种靶相关分子S110(例如，与一种或更多种生物靶等等相关的一种或更多种靶相关分子)，其可以用于合成与一种或更多种靶(例如，生物靶；等等)共享一个或更多个特征(例如，序列特征、功能特征、结构特征、演化特征等等)的一种或更多种分子，这可以促进相似的样品处理参数(例如，Sanger测序条件，其用于对包括靶相关分子和靶分子的加标混合物进行测序，用于对单独的靶相关分子或单独的靶分子进行测序；在基于PCR的扩增诸如通过对靶相关分子和靶分子、参考相关分子和参考分子进行共扩增期间的相似的扩增参数；等等)以减少偏差(例如，扩增偏差等等)和/或提高下游处理期间的准确度(所述下游处理例如，用于统计评估诸如线性回归；峰值分析；用于促进丰度比率确定的不同序列的碱基的对和/或集合的关联和/或鉴定；解卷积；方法100的实施方案的多个实例随时间的性能；等等)。
靶相关分子优选地包含一个或更多个靶相关序列(例如，核苷酸序列；靶相关分子的集合中的每一个靶相关分子对应于相同或相似的靶相关分子序列；等等)，其中靶相关序列可以包含一个或更多个靶相关区域。例如，靶相关序列可以包含与一种或更多种生物靶的一种或更多种靶序列(例如，对应于生物靶的靶序列；等等)的一个或更多个靶序列区域具有序列相似性(例如，全序列相似性；大于阈值百分比和/或量的序列相似性；等等)的靶相关区域，其中一种或更多种生物靶可以与一种或更多种医学状况相关。
靶相关区域(和/或靶相关分子和/或靶相关序列)优选地与一种或更多种生物靶和/或靶分子(例如，对应于生物靶的靶分子；包含生物靶的靶序列区域的靶分子；等等)相关(例如，与其共享核苷酸序列；与靶序列在相应位置处共享碱基的集合；能够与其一起进行处理；能够与其一起进行Sanger测序；能够与其一起进行扩增，诸如通过共扩增进行扩增；能够被相同的引物靶向；与其互补；靶向其；在计算***中与其在数字上相关；等等)。生物靶(例如，靶标志物；对应于一种或更多种医学状况、引起一种或更多种医学状况、促成一种或更多种医学状况、涉及一种或更多种医学状况的治疗、与一种或更多种医学状况相关联和/或以其他方式相关的治疗；感兴趣的靶；已知的或鉴定出的靶；未知的或先前未鉴定出的靶；等等)可以包括以下中的任何一个或更多个：靶序列区域(例如，鉴定染色体的序列；指示状况的序列；跨群体和/或任何合适的受试者的集合不变的序列；保守序列；包括突变、多态性的序列；核苷酸序列；氨基酸序列；等等)、基因(例如，与一种或更多种单基因紊乱等等相关的基因)、基因座、染色体(例如，与一种或更多种染色体异常相关等等的染色体)、蛋白质(例如，血清蛋白质、抗体等等)、肽、碳水化合物、脂质、核酸(例如，细胞外RNA、微RNA、信使RNA，其中对RNA靶的丰度确定可以包括合适的逆转录酶操作等等)、细胞(例如，全细胞等等)、代谢物、天然产物、癌症生物标志物(例如，由肿瘤分泌的分子；响应于癌症的存在而分泌的分子；等等)、遗传倾向(genetic predisposition)生物标志物、诊断生物标志物、预后生物标志物、预测生物标志物、其他分子生物标志物、基因表达标志物、成像生物标志物和/或其他合适的靶。靶优选地与本文所描述的状况相关，并且可以另外地或可选择地与一种或更多种状况相关，所述状况包括：症状、原因(cause)、疾病、紊乱和/或与状况相关的任何其他合适的方面。在实例中，靶相关分子可以包括与靶分子的靶序列的一个或更多个区域相同的核苷酸序列(例如，鉴定染色体21)，其中引物可以通过靶向相同的区域同时靶向靶相关分子和靶分子两者(例如，用于促进共扩增，诸如以减少扩增偏差等等)。在实例中，如图3中所示出的，靶相关序列(例如，“spk”序列)可以包含与靶序列(例如，“hg19”序列)的靶序列区域具有序列相似性的靶相关区域，诸如其中引物(例如，进行第一PCR方法的引物，进行第二PCR方法的引物；“chr21:14439004_PCR2_FP”、“chr21:14439076_PCR2_RP_hp”、“chr21:14439004_PCR1_FP”、“chr21:14439076_PCR1_RP”；包含一个或更多个发夹序列的PCR引物；等等)的集合可以靶向靶相关序列和靶序列两者(例如，用于促进共扩增并且相应地减少扩增偏差；等等)。在实例中，靶相关分子可以包含与靶序列具有任何合适的序列同一性的序列，其中任何数目和/或类型的引物可以用于同时或单独靶向靶相关分子和靶分子。在具体实例中，生物靶可以包含鉴定对应于非整倍性相关状况的染色体的靶序列(例如，涉及染色体21、18、13中非整倍性的NIPT等等的靶序列)。在具体实例中，生物靶可以包括鉴定致癌基因的靶序列(例如，涉及确定癌症状况度量、评估癌症治疗等等的靶序列)。然而，靶(例如，生物靶等等)可以以任何合适的方式配置。另外地或可选择地，靶相关分子(例如，靶相关分子的靶相关区域；等等)可以与生物靶(例如，与对应于生物靶的靶分子；等等)共享任何合适的特征(例如，组分等等)，诸如以促进相似的样品处理参数，从而能够随后在靶相关分子和靶分子的丰度度量之间生成有意义的比较。然而，靶相关分子可以以任何合适的方式配置。
如图11中所示出的，靶相关分子优选地包含靶变异区域(例如，靶相关分子的靶相关序列的变异区域；每一个靶相关分子包含一个或更多个变异区域；等等)，其中变异区域可以包括与靶分子的特征不同的特征。变异区域优选地包括一个或更多个变异(例如，***、缺失、取代等等)，诸如这样的变异，所述变异可以使相应的靶相关分子(例如，包含含有变异区域的靶相关序列的靶相关分子；等等)能够以与相应的靶分子(例如，包含生物靶的靶序列区域的核酸；等等)相似的方式进行样品处理操作，同时促进靶相关分子与靶分子的区分(例如，在测序输出的确定期间；在丰度度量的确定诸如进行统计估计分析期间；促进一种或更多种医学状况的表征和/或治疗；在来自对加标混合物和/或合适的样品进行Sanger测序的色谱相关输出的后处理期间；诸如在对靶相关碱基和靶碱基的对(诸如对应于变异区域和/或其他合适的区域的位置的对)的重叠峰的解卷积期间；在统计估计分析以拟合靶相关序列和靶序列的丰度期间；等等)。这样的区分可以促进可以进行有意义的比较(例如，碱基的对和/或集合的峰强度之间的定量比较；个体丰度度量的比较和/或组合，诸如以确定总体丰度度量；诸如用于促进表征和/或治疗；等等)的不同的相应丰度度量的确定。在实例中，变异区域可以包括包含与靶分子的靶序列的序列区域不同的核苷酸序列的序列变异区域。在具体实例中，如图3中所示出的，靶相关序列(例如，“spk”序列；等等)可以包括相对于靶序列的序列区域(例如，相对于“hg19”靶序列的“att”序列区域；等等)的缺失(例如，三核苷酸缺失；等等)。另外地或可选择地，变异区域可以包括与任何合适的碱基和/或碱基类型有关的任何合适数目的取代、***、缺失和/或任何合适大小的其他修饰(例如，任何合适数目的核苷酸的***和/或缺失；任何合适数目的点突变诸如10个点突变；等等)。
在具体实例中，变异区域可以促进任何靶相关碱基(例如，靶相关序列的碱基；等等)和/或靶碱基(例如，靶序列的碱基；等等)的测序输出(例如，峰强度、峰面积、峰数据、色谱等等)的确定，诸如其中可以将一个或更多个区域(例如，靶相关区域、变异区域等等)处的靶相关碱基的测序输出(例如，峰强度度量)与在不同的位置(例如，在相应碱基的位置可以由于变异区域的一个或更多个***和/或缺失而被移位的情况；等等)或相同位置(例如，对于变异区域的点取代；等等)处的相应靶碱基的测序输出(例如，峰强度度量等等)进行比较，诸如用于确定一种或更多种丰度度量。在具体实例中，如图11中所示出的，靶相关分子可以包含与相应的靶核苷酸序列相差10个碱基的核苷酸序列变异区域(例如，其中靶序列包括“TCTTGGATAG”区域，并且其中变异区域包括在相应位置处的“CTGGTTTAGA”区域，等等)，其中10个碱基差异中的每一个能够实现内源性与加标的不同的个体丰度比率度量，该个体丰度比率度量可以用于生成准确度提高的总体丰度比率。另外地或可选择地，变异区域可以包括任何合适数目的碱基的差异(例如，相对于靶序列等等的差异)。
变异区域可以与靶相关区域协调设计，以分别促进适当的序列相异性和序列相似性(例如，考虑到与测序技术诸如Sanger测序相关的测序参数，确定变异区域和/或靶相关区域的特征以促进测序输出的改进；等等)。
序列变异区域可以在任何合适的染色体和/或其他靶的跨任何合适的基因座的任何合适的位置(例如，连续的位置、非连续的位置；等等)处与靶序列相差任何合适数目和类型的碱基，和/或可以以任何合适的方式与靶序列不同。序列变异区域可以(例如，相对于靶序列和/或生物靶的一个或更多个序列区域；等等)包括取代、***、缺失、任何合适的突变类型和/或任何合适的修饰中的任何一个或更多个。
在变化形式中，序列变异区域可以(例如，以等比例的碱基类型、以预定部分的碱基类型等等)包括随机改组的碱基。在变化形式中，方法100可以包括选择待修饰的靶序列的碱基(例如，基于对Sanger测序输出结果进行优化，诸如通过选择碱基类型的特定序列来解释Sanger输出质量对序列中碱基的顺序和碱基类型的依赖性；基于促进计算后处理期间的统计估计、解混(unmixing)、解卷积；基于在使扩增偏差最小化的同时实现阈值丰度度量准确度所需的碱基差异的数目；等等)。
另外地或可选择地，变异区域可以包含非序列变异区域，其具有与一种或更多种靶分子(例如，任何合适类型的靶分子等等)的特征不同的功能特征、结构特征、演化特征和/或其他合适的特征。然而，变异区域可以以任何合适的方式配置，并且靶相关分子可以包含任何合适的核苷酸序列区域。
在变化形式中，靶相关分子可以包含一个或更多个测序区域(例如，测序分子的测序区域；等等)，该测序区域被配置为有助于测序操作(例如，测序***的操作；测序输出的确定诸如准确度的增加的确定和/或能够定量比较和/或定量的形式的确定；等等)S130、确定丰度度量S140和/或方法100的任何合适的部分(例如，促进表征S150和/或促进治疗S160；等等)。在变化形式中，靶相关分子(例如，靶相关分子的靶相关序列；等等)可以(例如，通过添加等等)包含一个或更多个Sanger相关序列区域(其例如，被配置为提高Sanger测序输出等等)和/或任何合适的测序区域，其可以包含任何一个或更多个另外的靶相关区域(例如，与一种或更多种生物靶诸如相同或不同的生物靶的一个或更多个靶序列诸如相同或不同的靶序列的另外的靶序列区域具有序列相似性；等等)；序列重复(sequencerepeat)(例如，靶相关分子、靶分子、参考相关分子、参考分子的任何合适的区域的序列重复，本文所描述的任何合适的序列、区域和/或分子的序列重复；等等)；和/或任何合适的测序区域(例如，本文所描述涉及被添加至一种或更多种分子的测序区域；等等)。
在变化形式中，Sanger相关序列区域可以包括在靶相关分子的序列变异区域和/或其他合适的区域之前(和/或与其具有任何合适的位置关系)的特定核苷酸序列(例如，预定长度的、具有特定选择的核苷酸的核苷酸序列；等等)，这可以促进序列变异区域重新定位到对应于提高的Sanger测序色谱相关输出的位置处(例如，在Sanger测序期间在碱基100-500处、在碱基200-500处，和/或在任何合适的位置处)。在具体实例中，Sanger BigDye1.1化学可以被应用以用于相对于序列的开始区域的准确度的提高(例如，其中诸如图13A-13B中所示出的LCR和/或RCA可以被省略；等等)。在具体实例中，Sanger BigDye 3.1化学可以被应用以实现较长的测序读段，其中起始序列区域(例如，约200bp和/或其他合适的大小)可以被用于(例如，***在靶序列区域和/或靶相关序列区域之前)准确度的提高(例如，诸如通过诸如图13A-13B中所示出的LCR和/或RCA进行，其可以实现多重化)。然而，Sanger相关序列区域可以以任何合适的方式配置。
另外地或可选择地，测序分子可以包含测序引物，该测序引物被配置为促进通过测序***的过程；衔接子序列和/或与任何合适的测序***相关的其他合适的组分。然而，测序分子可以以任何合适的方式配置。
靶相关分子(和/或本文所描述的其他合适的组分诸如参考相关分子、加标混合物的组分等等)可以具有任何合适的大小(例如，长度为100-500个碱基对、200-500个碱基对，并且包含序列区域诸如靶相关区域和/或变异区域的重复；长度与靶分子相似或不同；长度为80-150个碱基对，包含改组碱基类型的10个碱基对的变异区域；等等)。靶相关分子的集合可以包括与任何合适数目的靶(例如，与任何数目的基因座、染色体、癌症生物标志物、靶生物标志物相关的任何数目的靶序列等等)、样品(例如，同时合成一批分子，其用于与跨多个用户的样品一起使用，用于与单个用户的多个样品一起使用，以提高样品处理***的效率；等等)、状况(例如，与生物靶相关的靶相关分子的集合，所述生物靶与不同状况相关；等等)和/或其他合适的方面相关的任何数目的靶相关分子。
在变化形式中，生成靶相关分子可以包括生成不同类型的靶相关分子(例如，包括不同的靶相关区域、不同的变异区域、不同的序列分子等等)，诸如靶相关分子的集合(例如，每一个集合对应于不同类型的靶相关分子；等等)。靶相关分子可以包括靶相关分子的集合(例如，多个不同集合，等等)，每一个集合包括与不同的靶序列区域(例如，相同靶序列和/或生物靶诸如染色体的不同靶序列区域；不同靶序列和/或生物靶诸如不同基因的不同靶序列区域；等等)相关(例如，与其具有序列相似性；等等)的不同靶相关区域，这可以促进靶相关区域类型(例如，对应于特定的靶相关区域序列；等等)和靶序列区域类型(例如，对应于生物靶的特定靶序列；等等)的不同对和/或集合和/或碱基的不同的对和/或集合(例如，其中对和/或集合的碱基可以来自靶相关序列和靶序列；等等)，诸如以确定相应的丰度度量诸如个体丰度比率(例如，对应于不同对的丰度度量诸如个体丰度比率；诸如对应于碱基的不同集合的个体丰度比率，其中碱基的不同集合可以对应于染色体生物靶的不同基因座；等等)，其可以用于通过例如对个体丰度度量进行平均和/或进行任何合适的组合操作以增加的准确度确定总体丰度度量。
在具体实例中，靶相关分子的不同集合可以与跨不同基因座的不同靶序列(和/或靶序列区域等等)相关。在具体实例中，每一个集合可以与相同染色体的不同基因座(例如，染色体的第一基因座、第二基因座、第三基因座和第四基因座，诸如图9中所示出的；等等)相关，其中给定集合中的靶相关分子的序列可以包含由对应于所述集合的基因座共享的序列区域，并且可以(例如，通过***、缺失、碱基取代等等)包含与基因座的序列不同的序列变异区域。
任何数目的靶相关分子集和/或任何数目的靶相关分子类型可以被生成和/或与任何合适数目的生物靶相关。在实例中，选择不同的靶相关分子集可以基于测序参数、给定的条件和/或应用的准确度要求(例如，选择一定数目的集合，其导致待在实现诊断唐氏综合征的靶准确度中使用的相应合适数目的个体丰度度量)，和/或可以基于任何合适的标准(例如，待优化的参数)来选择。然而，生成靶相关分子的不同集合可以以任何合适的方式进行。
生成靶相关分子可以包括确定靶序列(例如，靶序列的靶序列区域；靶序列的任何合适区域；等等)，其可以用于选择靶相关分子基于其生成的靶序列。确定靶序列可以基于以下中的任何一个或更多个：状况(例如，选择鉴定染色体21的靶序列以用于促进唐氏综合征诊断；选择鉴定致癌基因的靶序列；等等)、测序参数(例如，选择具有特定长度、核苷酸序列和/或用于优化来自Sanger测序的色谱相关输出质量的其他参数的靶序列；用于生成适合于统计估计分析和/或其他合适的色谱相关输出；用于降低成本、提高准确度、提高再现性和/或用于与测序***和/或操作有关的其他合适的优化等等)；扩增参数(例如，选择具有特定长度、核苷酸序列和/或用于优化扩增特异性的其他参数(诸如涉及与聚合酶链式反应扩增相关的引物对靶序列的特异性)的靶序列；等等)、其他样品处理参数和/或其他合适的标准。在实例中，确定靶序列可以包括通过计算机搜索数据库(例如，DNA数据库、基因组数据库、基因表达数据库、表型数据库、RNA数据库、蛋白质数据库等等)以生成靶序列候选物列表；和/或基于本文描述的标准和/或任何合适的标准来过滤靶序列候选物列表。在具体实例中，确定靶序列可以包括提取靶序列候选物列表(例如，基于外显子组下拉；合并成合适数目的碱基对的组块(chunk)；等等)；过滤掉包含定义的类型的突变和/或多态性的候选物(例如，过滤掉与常见的单核苷酸多态性相关的候选物，以获得跨群体的受试者具有相对不变性的候选物，等等)；鉴定用于剩余候选物的引物(例如，用Primer-BLAST针对80-150bp的扩增子进行)；以及确定适合于在生成靶相关分子的变异区域中变异的候选区域(例如，通过在相对于序列的正向引物和/或其他区域的位置处置乱碱基等等来进行)。然而，确定靶序列可以以任何合适的方式进行。
生成靶相关分子可以包括通过进行以下中的任何一个或更多个来合成分子：扩增(例如，PCR扩增，诸如用包含一个或更多个发夹序列的PCR引物的PCR扩增；等等)、基于质粒的核酸合成(例如，包括分别对应于靶染色体和参考染色体的不同基因座的靶相关分子和参考相关分子二者；使用包含任何合适的切割位点、复制位点的起点、多个克隆位点、可选择的标志物、报告标志物、骨架和/或其他组分的质粒；等等)、其他人工基因合成技术、扩增技术(例如，聚合酶链式反应、滚环扩增等等)、连接技术(例如，连接酶循环反应等等)、亚磷酰胺方法、合成后处理、纯化(例如，使用高效液相色谱方法或其他色谱方法、脱盐、洗涤、离心等等)、加标签技术(例如，分子加标签技术、荧光加标签技术、粒子标记技术等等)、分子克隆技术和/或任何合适的样品处理技术。
在变化形式中，合成靶相关分子可以包括生成靶相关序列，该靶相关序列包含与不同靶(例如，跨同一染色体的不同基因座、不同染色体的不同基因座、不同致癌基因等等)相关的多个序列区域。在具体实例中，靶相关分子的类型可以被配置为减少所需测序操作的数目(例如，促进生成色谱相关输出的靶相关分子类型，所述色谱相关输出提供多个靶的信息并使用单一Sanger测序运行生成；等等)；然而，靶相关分子类型可以被合成以优化任何合适的参数。另外地或可选择地，任何合适数目的分子和/或与任何数目的靶相关的分子类型可以以任何合适的时间和频率生成。
然而，生成靶相关分子S110可以以任何合适的方式进行。
2.2生成加标混合物.
方法100的实施方案可以包括生成(例如，促进生成等等)一种或更多种加标混合物S120(例如，基于与来自用户的一种或更多种样品的靶分子一起处理靶相关分子的集合等等进行)，其可以用于对靶相关分子、靶分子和/或其他合适的分子(例如，参考相关分子、参考分子等等)进行扩增(例如，在相似的扩增参数下进行扩增)、进行预处理(例如，样品制备、裂解、基于珠的方法、其他纯化和/或核酸提取技术等等)、修饰(例如，生成序列重复、将与不同靶相关的序列进行组合等等)和/或以其他方式处理成适合于后续分析(例如，Sanger测序等等)和丰度度量确定(例如，基于来自Sanger测序的输出等等进行丰度度量确定)的形式。收集的样品(例如，生物样品；其使用样品收集试剂盒中提供给用户的样品容器收集)可以包括以下中的任何一种或更多种：血液、血浆、血清、组织、活检(例如，肿瘤活检物等等)、汗液、尿液、粪便、***、***分泌物、泪液、间质液(interstitial fluid)、其他体液和/或任何其他合适的样品(例如，与人类用户、动物、物体诸如食物、微生物等等相关的样品)。在实例中，诸如对于NIPT，生物样品可以包括一种或更多种母体样品。样品优选地包含靶分子(例如，包含一个或更多个靶序列和/或靶序列区域的核酸分子；等等)和/或参考分子(例如，包含一个或更多个参考序列和/或参考序列区域的核酸分子；等等)，诸如其中靶分子可以在相似的参数下与靶相关分子一起被扩增；其中参考分子可以在相似的参数下与参考相关分子一起被扩增；等等)。另外地或可选择地，样品可以包含来自多个用户的组分(例如，靶分子)(例如，血液样品包含来自母亲的核酸和来自母亲未出生婴儿的核酸，其中核酸混合物可以指示染色体21的异常丰度等等)、跨多个时间段收集的组分和/或跨任何合适的条件变化的组分，使得生成一种或更多种加标混合物(spike-in mixture(s))可以对任何合适数目和类型的实体进行。
生成一种或更多种加标混合物优选地包括将靶相关分子与来自样品的靶分子(例如，包含靶序列区域和/或靶序列的核酸等等)组合；和/或将参考相关分子与参考分子组合；和/或将任何合适的分子组合。组合可以包括以下中的一种或更多种：将每个分子组合为单一混合物(例如，包含靶相关分子的不同子集和靶分子的相应子集；等等)；将样品(例如，预处理的样品)子取样成多个混合物，所述混合物各自被指定用于靶相关分子的不同子集(例如，对应于靶染色体的不同靶基因座等等)；将样品子取样成不同的混合物，以用于靶相关分子和参考相关分子；和/或组合分子的任何其他合适的方法。在实例中，靶分子和靶相关分子(例如，靶分子和靶相关分子的类型的不同对；对应于靶相关区域和靶序列区域的不同对；与多个不同的靶相关；等等)可以在相同隔室(例如，管；等等)(和/或任何合适数目的隔室)中，诸如通过多重PCR和/或合适的扩增方法来扩增，其可以有助于保存珍贵的样品；并且所得到的扩增产物可以随后被子取样成单独的混合物，以用于随后的靶向不同靶类型的个体Sanger测序(例如，使用与不变区域诸如由靶相关区域和靶序列区域共享的序列相似性的区域相关的Sanger测序引物；等等)。在实例中，子取样和/或其他样品修饰操作可以以任何合适的顺序进行。
另外地或可选择地，可以针对不同类型的分子生成单独的样品(例如，混合物、溶液等等)(例如，未对不同类型的分子进行组合)。例如，可以生成包含靶相关分子(例如，没有靶分子)的第一样品，并且可以生成包含靶分子(例如，没有靶相关分子)的样品混合物，其中第一混合物和第二混合物可以单独用于下游处理(例如，进行单独的Sanger测序运行以生成单独的色谱相关输出，诸如可以在统计估计、解卷积和/或其他计算处理操作期间使用的单独的色谱，诸如用于确定丰度度量等等)。然而，可以生成和/或处理包含任何合适的单独或组合的分子类型的任何合适数目的样品。
对分子进行组合优选地包括使用已知丰度的靶相关分子，但是可以可选择地使用未知丰度的靶分子(例如，其中来自先前测序运行的具有未知丰度的结果可以用于报告(inform)来自后续测序运行的结果等等)。此外，对分子进行组合优选地包括跨靶相关分子的不同子集(例如，与不同基因座相关)使用相同或基本上相似的丰度，和/或相对于参考相关分子使用相同或相似的丰度。另外地或可选择地，对于不同分子类型可以使用任何合适的丰度。
在变化形式中，对分子进行组合可以包括修饰(例如，在预处理期间)靶相关分子、参考相关分子和/或其他合适的组分的丰度。例如，修饰分子的丰度可以包括测量分子的初始丰度(例如，靶相关分子的丰度)；以及基于靶分子的预期丰度(例如，样品中内源性靶分子的预期计数等等)来修饰丰度(例如，通过稀释、扩增等等)。在变化形式中，生成加标混合物可以省略丰度的修饰(例如，在预处理期间的丰度的修饰)(例如，其中方法100的实施方案的第一实例的丰度结果可以用于确定待在方法100的实施方案的后续实例中使用的校正因子；等等)。然而，对分子进行组合可以以任何合适的方式进行。
生成加标混合物优选地包括将靶相关分子与靶分子一起扩增。扩增可以包括进行以下中的任何一个或更多个：基于聚合酶链式反应的技术(例如，固相PCR、RT-PCR、qPCR、多重PCR、降落PCR(touchdown PCR)、纳米PCR(nanoPCR)、巢式PCR、热启动PCR等等)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、环介导的等温扩增(LAMP)、自持续序列复制(self-sustained sequencereplication；3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)、连接酶链式反应、连接酶循环反应(LCR)和/或任何其他合适的扩增技术和/或相关的方案(例如，用于最小化扩增瓶颈的方案)。在实例中，如图3中所示出的，生成加标混合物可以包括进行多个PCR轮次(例如，任何数目的PCR轮次)，以将靶相关分子与靶分子共扩增(例如，使用靶向由靶相关分子和靶分子两者共享的序列的引物集合；使用对应于不同引物类型和序列的引物的不同集合，如图3中所示出的，其中引物的一个或更多个集合可以包含一个或更多个发夹序列，诸如用于促进序列重复的添加；等等)。
在变化形式中，生成加标混合物和/或方法100的实施方案的合适部分(例如，在其中包含靶相关分子的样品与包含靶分子的样品独立制备和测序的变化形式中；在其中包含参考相关分子的样品与包含参考分子的样品独立制备和测序的变化形式中；等等)可以包括将一个或更多个序列区域添加至一个或更多个分子(例如，一个或更多个分子的一个或更多个区域和/或序列；添加至靶相关分子、添加至靶分子、添加至参考相关分子、添加至参考分子等等)。
添加序列区域可以包括以下中的一个或更多个：生成序列重复(例如，生成包含靶相关序列和/或靶序列的重复的修饰的序列；等等)；添加鉴定不同靶(例如，通过原始靶鉴定的染色体的不同基因座；不同染色体的基因座；与不同状况相关的序列区域；等等)的序列区域；和/或添加任何合适的核苷酸序列。例如，方法100可以包括将至少一个序列区域添加至靶相关分子和靶分子的集合中的至少一个，其中至少一个序列区域包括以下中的至少一种：(a)与第二靶序列区域具有序列相似性的第二靶相关区域(例如，其中靶分子的集合包括与生物靶的靶序列的第一靶序列区域具有序列相似性的第一靶相关区域；等等)，和(b)靶相关序列的区域和靶序列的区域中的至少一种的至少一个序列重复。
添加序列区域可以用于：促进来自测序***的输出质量(例如，色谱结果的质量)的提高，诸如通过添加定位在变异区域之前的序列区域来进行，丰度度量提取将基于所述变异区域(例如，其中添加的序列区域可以使变异区域能够重新定位在对应于提高的测序输出的位置处；等等)；促进添加的序列区域的另外的个体丰度度量的确定(例如，通过分析变异区域相对于相应的靶碱基的序列重复来进行；等等)，其可以用于计算准确度提高的总体丰度度量；促进分析多个靶(例如，跨不同的基因座、染色体等等)所需的测序操作的数目和/或成本的减少(例如，较少的Sanger测序运行；等等)，诸如通过连接与不同靶相关的不同序列。
在实例中，方法100可以包括将至少一个序列重复(例如，用于促进多通(multiple-pass)测序，诸如对序列进行多于一次测序，诸如在相同或不同的测序运行中进行所述测序，诸如用于增加测序输出数据，使得测序输出数据和/或相关的丰度度量可以被平均和/或以其他方式组合，诸如以降低噪声；等等)添加至一个或更多个靶相关分子(例如，靶相关分子的靶相关序列的一个或更多个区域；等等)和/或一个或更多个靶分子(例如，靶分子的靶序列的一个或更多个区域；等等)，诸如其中至少一个色谱相关输出(例如，色谱、峰强度、其他峰数据等等)的峰的第一集合对应于靶相关区域、生物靶的靶序列区域、靶变异区域和生物靶的序列区域的第一测序(例如，来自Sanger测序操作；等等)，其中至少一个色谱相关输出包括对应于靶相关区域、生物靶的靶序列区域、靶变异区域和生物靶的序列区域的第二测序(例如，来自相同Sanger测序操作等等)的峰的第二集合，并且其中确定靶相关丰度比率的集合可以基于峰的第一集合和峰的第二集合(例如，基于靶序列和靶相关序列的碱基对的来自峰的第一集合和峰的第二集合的峰强度的个体丰度比率；等等)。
在变化形式中，添加一个或更多个序列区域(例如，序列重复；等等)可以基于一个或更多个发夹序列(例如，引物的发夹序列，诸如用于PCR扩增的引物的发夹序列；等等)进行，诸如其中用包含一个或更多个发夹序列的PCR引物进行扩增可以使多个核苷酸延伸实例(例如，通过自引发)能够用于添加可以被Sanger测序的序列重复。在实例中，如图3中所示出的，添加一个或更多个序列重复(例如，添加至任何合适的分子；等等)可以包括用包含一个或更多个发夹序列的一个或更多个引物集合(例如，“chr21:14439076_PCR2_RP_hp”，诸如图3和图4中所示出的)共扩增(和/或单独扩增)靶相关分子的集合和来自样品(例如，母体样品；生物样品；等等)的核酸分子，其中核酸分子包含靶序列区域。在实例中，包含发夹序列的引物(例如，PCR引物)可以包括如图3和图4中所示出的序列(“chr21:14439076_PCR2_RP_hp”)的一个或更多个部分(例如，序列部分、结构部分；等等)。在实例中，从基于一个或更多个发夹序列添加一个或更多个序列区域(例如，序列重复；等等)所得到的产物(例如，所得到的分子等等)可以包括图5A-5E中示出的序列(例如，其中图5A-5E示出了全序列，其中图5A中的序列与图5B中的序列连接、图5B中的序列与图5C中的序列连接、图5C中的序列与图5D中的序列连接并且图5D中的序列与图5E中的序列连接；等等)的一个或更多个部分(例如，序列部分、结构部分；等等)。
在实例中，如果发夹仅在序列的一端(例如，PCR引物序列的一端)使用，则获得双通Sanger序列(例如，包括序列的两次通过的峰结果的色谱相关输出)。在实例中，双通Sanger序列的重要贡献在于，因为引物-二聚体在该增加的长度上的降低的影响并且因为Big Dye 3.1化学在更长的长度上质量提高，第二序列(例如，峰数据的第二集合和/或序列的合适的色谱相关输出等等)可以比首通序列(例如，峰数据的第一集合和/或序列的合适的色谱相关输出等等)在色谱内容上更具信息性和更清晰。在实例中，如果发夹在两端使用，则对同一序列将获得多个(a plurality of)(例如，许多(many)，多个(multiple)；等等)而不是两个(例如，多个大于两个)Sanger色谱；虽然这可以显著降低由于平均而导致的与丰度测量相关的任何噪声，但它可能并没有类似地降低引物-二聚体的影响。
在变化形式中，发夹序列(例如，引物的发夹序列等等)可以被配置用于靶相关分子和参考相关分子、被生成用于靶相关分子和参考相关分子、被用于靶相关分子和参考相关分子和/或在没有靶相关分子和参考相关分子的情况下以其他方式处理。例如，可以将一个或更多个序列重复(例如，通过用包含一个或更多个发夹序列的PCR引物扩增而生成)添加至靶分子、参考分子和/或合适的分子，以用于使得能够针对多个实例(例如，多通测序，以使得能够在单次测序运行中针对同一序列生成数据的多个集合；等等)对特定序列进行Sanger测序(和/或合适的测序技术)。在实例中，主要等位基因峰(例如，峰强度度量)(和/或合适的色谱相关输出；等等)与次要等位基因峰(例如，峰强度度量)(和/或合适的色谱相关输出；等等)的比率可以基于来自对序列重复(例如，由使用发夹序列生成的序列重复；等等)进行Sanger测序的输出多次确定以确定总体丰度比率。另外地或可选择地，添加一个或更多个序列区域可以在不处理靶相关分子和/或参考相关分子的情况下进行，诸如其中添加一个或更多个序列区域可以独立地改进色谱相关输出、丰度度量、特征和/或处理(例如，改进其准确度；减少关于其的偏差；降低关于其的噪声；等等)。
然而，发夹序列可以以任何合适的方式配置，并且基于发夹序列添加一个或更多个序列区域可以以任何合适的方式进行。
在具体实例中，如图13A-13B中所示出的(例如，示出生成约150个碱基对长度的扩增子的串联重复，以将加标碱基定位到预定的Sanger质量窗口诸如促进测序输出的改进的窗口中；其中内源性等位基因和加标等位基因的扩增子混合物可以被LCR环化，并且其中串联重复可以然后通过环化的扩增子的RCA生成，并且其中加标碱基的位置可以由阴影区域指示，并且其中色谱可以由多个加标基因座的多重Sanger测序生成，并且其中源自四个基因座的扩增子通过LCR被组装成环状DNA，并且产物通过RCA扩增并进行Sanger测序；等等)，添加序列区域可以包括：对由共扩增靶相关核酸和靶核酸而生成的扩增子混合物进行连接操作(例如，用Taq连接酶和/或其他合适的连接酶的连接酶循环反应；等等)，从而生成环化的扩增子；对环化的扩增子进行扩增操作(例如，滚环扩增)，从而生成包含序列重复(例如，串联重复)和/或鉴定不同靶的另外的序列区域的一个或更多个修饰的序列，其中所得到的加标混合物(例如，包含含有修饰的序列的线性核酸的加标混合物)可以用于后续测序操作(例如，Sanger测序等等)。添加序列区域优选地包括将序列区域添加至扩增子混合物，该扩增子混合物包括基于靶分子的扩增子(例如，从内源性靶分子生成的扩增子)和基于靶相关分子的扩增子(例如，从加标靶相关分子生成的扩增子)。可选择地，添加序列区域可以与靶分子分开地对靶相关分子进行。另外地或可选择地，可以(例如，在生成靶相关分子、参考相关分子期间等等)初始地生成序列区域，诸如成为初始靶相关序列和/或参考相关序列的一部分。添加序列区域和/或方法100的实施方案的任何合适的部分可以包括进行本文描述的任何样品处理操作和/或其他合适的操作。然而，序列区域可以以任何合适的方式配置，并且添加序列区域可以以任何合适的方式进行。
然而，靶相关序列、靶序列和/或其他合适的序列可以使用任何合适的样品处理操作以任何合适的方式修饰(例如，使区域缺失、修饰特定位置处的核苷酸等等)。然而，生成加标混合物S120可以以任何合适的方式进行。
2.3进行测序操作.
方法100的实施方案可以包括进行一个或更多个测序操作S130(例如，对一种或更多种加标混合物等等进行一个或更多个测序操作)，其可以用于对一个或更多个组分(例如，一种或更多种加标混合物；等等)进行测序和/或生成一个或更多个测序输出。进行测序操作优选地包括进行Sanger测序(例如，对加标混合物、单独地对靶分子、单独地对靶相关分子等等进行Sanger测序)。Sanger测序优选地包括链终止方法和/或与Sanger测序相关的任何合适的操作(例如，诸如在体外DNA复制期间使用标记的双脱氧核苷酸和DNA聚合酶；生成覆盖靶相关序列、靶序列、参考相关分子序列、参考序列、任何合适序列的碱基的碱基位置的核酸片段的集合；诸如通过毛细管凝胶电泳、标记碱基的激光检测进行核酸片段的分析；进行任何合适的Sanger测序相关操作诸如染料终止子测序、自动化和/或与Sanger测序相关的样品制备、微流体Sanger测序、确定测序输出的计算过程；等等)。然而，Sanger测序可以以任何合适的方式进行。
进行测序操作优选地包括对一种或更多种共扩增的加标混合物(例如，包括共扩增的靶相关分子和包含相关靶序列区域的核酸的加标混合物；等等)进行测序，但是可以另外地或可选择地通过任何数目的测序操作(例如，任何数目的Sanger测序运行等等)对任何合适的组分进行测序(例如，分别对来自第一样品的靶相关分子和来自第二样品的靶分子进行测序；对加标混合物进行测序；对来自用户的样品进行测序；对包含参考相关分子和/或参考分子的样品进行测序；等等)。
优选地，可以进行测序操作以确定一个或更多个测序输出(例如，定量测序输出，根据该定量测序输出可以确定丰度度量；等等)。测序输出可以包括以下中的任何一个或更多个：色谱相关输出、序列读段、高通量测序输出、文本数据、比对和/或来自任何合适的测序技术的任何其他合适的输出。色谱相关输出可以包括以下中的任何一个或更多个：色谱(例如，包括本文所描述的任何合适分子的任何合适的相关区域的靶相关分子序列、靶序列、参考相关分子序列、参考序列的经测序的碱基的峰；等等)、对准位置(alignmentposition)(例如，对应于通过Sanger测序所测序的峰和/或碱基；每个对准位置对应于一个或更多个峰和/或一个或更多个碱基；对应于多个经比对的序列的碱基诸如靶相关序列和靶序列的碱基；如图6A和图7A中所示出的；等等)、任何合适的测序相关位置、峰强度、峰面积、峰相似性、峰差异、相对于相同或不同碱基类型的峰的峰度量；平均强度；中值强度；高度；宽度；重叠和/或在相同位置处或在不同位置处的靶相关碱基和靶碱基的峰之间的其他比较、文本数据(例如，来自Sanger测序的文本结果等等)，和/或任何其他合适的输出(例如，与Sanger测序相关的输出等等)。例如，如图8中所示出的，色谱相关输出可以包括不同混合物的色谱(例如，加标混合物的第一色谱，单独的靶相关分子的第二色谱，单独的靶分子的第三色谱；等等)，诸如其中不同碱基的色谱峰可以通过计算机被处理以提取测序输出。
一个或更多个特定碱基的测序输出(例如，涉及Sanger测序的峰)可以包括对在特定碱基之前(和/或以其他方式与特定碱基相关)的碱基的数目和/或类型的依赖性，其中在生成加标混合物中添加序列区域(例如，序列重复)可以解释此类依赖性。另外地或可选择地，确定靶相关序列和/或参考相关分子序列的变异区域序列可以基于所述依赖性(例如，基于序列中前面碱基的数目和/或类型等等)和/或其他合适的测序参数(例如，测序技术的特征，诸如Sanger测序的特征等等)，诸如其中变异区域的预定***和/或缺失可以实现校准(例如，自动校准)，以用于能够在促进丰度度量确定方面准确地比较峰强度和/或其他合适的色谱相关输出。例如，靶变异区域包括一个或更多个***和一个或更多个缺失中的至少一种，其中至少一个色谱相关输出包括对应于峰的对准位置(例如，与第一靶相关区域、生物靶的靶序列区域、靶变异区域和生物靶的序列区域的碱基相关等等)，其中，对于不同对中的每一对(例如，靶相关序列的碱基和靶序列的碱基等等)，第一靶相关序列的碱基对应于第一对准位置，该第一对准位置与对应于第一靶序列的碱基的第二对准位置不同(例如，如图6A和图7A中所示出的)，并且其中至少一个色谱相关输出的对准位置包括第一对准位置和第二对准位置。
在实例中，变异区域可以包含预定的改组碱基(例如，碱基取代等等)，该改组碱基能够实现校准和/或合适的处理操作(例如，解卷积、校正因子确定和应用等等)以用于丰度度量确定的准确度提高。然而，任何合适的区域和/或序列的确定可以以任何合适的方式基于任何合适的测序参数。另外地或可选择地，特定碱基和/或其他序列区域的测序输出和/或任何合适区域和/或序列的确定可以独立于其他序列区域和/或合适的测序参数。
在变化形式中，进行一个或更多个测序操作可以针对具有添加的序列区域(例如，序列重复；等等)的一种或更多种产物(例如，加标混合物的组分；靶相关分子、靶分子和/或其他合适的分子；等等)，诸如基于发夹序列生成的一种或更多种产物(例如，基于使用包含一个或更多个发夹序列的PCR引物的扩增生成的一种或更多种产物；等等)。对具有序列重复的产物进行测序操作可以用于对一个或更多个序列和/或序列区域进行多次测序，以用于生成另外的测序输出，该另外的测序输出可以降低噪声、被用于确定另外的丰度度量(例如，用于确定准确度提高的总体丰度度量；等等)和/或用于任何合适的目的(例如，促进表征和/或治疗；等等)。
另外地或可选择地，进行测序操作(和/或方法100和/或***200的实施方案的任何合适的部分)可以包括确定、应用、进行和/或以其他方式使用任何合适的测序和/或测序相关的技术诸如高通量测序，其可以包括以下中的任何一个或更多个和/或与其相关：NGS、NGS相关技术、大规模平行签名测序(massively parallel signature sequencing)、Polony测序(Polonysequencing)、454焦磷酸测序、Illumina测序、SOLiD测序、Ion Torrent半导体测序、DNA纳米球测序、Heliscope单分子测序、单分子实时(SMRT)测序、纳米孔DNA测序、任意代数的测序技术(例如，第二代测序技术、第三代测序技术、***测序技术等等)、扩增子相关测序(例如，靶向扩增子测序)、宏基因组相关测序、合成测序、隧道电流测序、杂交测序、质谱测序、基于显微术的技术和/或与高通量测序相关的任何合适的技术。另外地或可选择地，测序和/或测序相关技术可以包括任何合适的技术(例如，毛细管测序等等)。
然而，进行测序操作S130可以以任何合适的方式进行。
2.4确定丰度度量.
方法100的实施方案可以包括确定一种或更多种丰度度量S140(例如，一种或更多种样品的一种或更多种丰度度量；其基于一种或更多种加标混合物的一个或更多个测序操作的输出等等进行)，其可以用于准确地确定丰度度量，诸如可被有意义地分析和比较(例如，比较靶分子和靶相关分子的个体丰度以生成丰度比率，比较靶与参考的丰度比率；等等)的丰度度量，诸如可以用于促进表征和/或治疗的丰度度量。丰度度量可以包括以下中的任何一个或更多个：丰度比率(例如，第一峰的第一峰强度度量与第二峰的第二峰强度度量的比率，诸如其中第一峰和第二峰对应于相同或不同的对准位置；任何合适的测序输出的比率；内源性靶分子计数与靶相关分子计数的计数比率；内源与加标的测序输出比率，诸如靶序列碱基和相应的靶相关序列碱基的峰强度度量比率；具有任何合适分子和分母的比率；个体丰度比率，诸如可用于确定总体丰度比率和/或丰度度量；等等)，但是可以另外地或可选择地包括个体丰度(例如，个体峰强度；计数；等等)、相对丰度、绝对丰度和/或其他合适的丰度度量。在具体实例中，内源性分子与加标分子的比率(例如，内源性DNA和加标DNA之间的比率，等等)可以基于测序输出比率(例如，内源性相关峰与加标相关峰的峰强度的比率)和加标分子的已知丰度(所述加标分子例如，用于生成加标混合物)来计算。
确定丰度度量优选地基于一个或更多个测序输出，但是可以另外地或可选择地基于任何合适的数据(例如，包括已知丰度的补充数据、生物统计数据、病史数据、人口统计学数据、遗传史、调查数据、饮食数据、行为数据、环境数据、样品类型和/或其他合适的上下文数据(contextual data))。例如，确定丰度比率(例如，靶相关丰度比率；等等)(和/或任何合适的丰度度量)可以基于一个或更多个色谱相关输出，该色谱相关输出包括一个或更多个峰强度、峰面积、共享碱基类型的碱基的峰度量、具有不同碱基类型的碱基的峰度量和/或任何其他合适的色谱相关输出和/或测序输出。确定丰度度量可以包括计算处理(例如，用诸如云计算***的远程计算***，用本地计算***等等进行)，诸如对一个或更多个测序输出(例如，色谱、峰数据等等)和/或其他合适的数据进行计算处理，但是可以另外地或可选择地包括任何合适的处理(例如，手动处理；等等)。处理(例如，用于确定丰度度量等等的处理)和/或方法100的实施方案的合适部分(例如，促进表征和/或治疗等等)可以包括以下中的任何一个或更多个：对数据进行统计估计(例如，普通最小二乘回归、非负最小二乘回归、主成分分析、岭回归等等)、解卷积(例如，来自色谱图的重叠峰的解卷积、分辨率不足的峰的解卷积、任何合适的峰的解卷积；傅立叶解卷积；基于高斯函数的解卷积；Lucy-Richardson解卷积等等)、提取特征(例如，提取色谱中任何合适数目的峰等等的特征)、对数据进行模式识别、融合来自多个源的数据、值的组合(例如，平均值等等的组合)、压缩、转换(例如，数模转换、模数转换)、波调制、归一化、更新、排名、验证、过滤(例如，用于基线校正、数据裁剪(data cropping)等等)、噪声降低、平滑化、填充(例如，间隙填充)、比对、模型拟合、开窗口(windowing)、剪辑(clipping)、变换、数学运算(例如，导数、移动平均值、求和、减法、乘法、除法等等)、多重化、解多重化、插值、外推、聚类、其他信号处理操作、其他图像处理操作、可视化和/或任何其他合适的处理操作。
在变化形式中，确定丰度度量可以基于一个或更多个测序输出和/或以其他方式与其相关，该一个或更多个测序输出与包含具有一个或更多个***(例如，核苷酸***；等等)和/或一个或更多个缺失(例如，核苷酸缺失；等等)和/或任何合适的修饰的变异区域的靶相关序列(和/或参考相关序列)相关。例如，确定靶相关丰度比率的集合可以基于峰的集合(例如，对应于靶序列和靶相关序列的经测序的碱基的峰的峰强度数据；等等)以及取代、***和缺失中的至少一种(例如，一个或更多个取代、***和/或缺失的特征；修饰的大小，诸如涉及核苷酸数目的修饰的大小；修饰的类型，诸如涉及碱基类型变化的修饰的类型；其中应用修饰的位置；等等)。如图6A和图7A中所示出的，包含一个或更多个***和/或缺失的变异区域可以导致移位的对准位置(例如，靶相关序列的碱基相对于靶序列的碱基的移位的对准位置；诸如其中靶相关区域和靶序列区域的碱基之间的序列相似性可以相对于由于一个或更多个***和/或缺失的位置移位；等等)。在实例中，靶变异区域(例如，靶相关序列的变异区域；等等)可以包含***和缺失中的至少一种，其中一个或更多个色谱相关输出可以包括对应于峰的集合(例如，靶相关分子的靶相关区域、生物靶的靶序列区域、靶相关分子的靶变异区域和生物靶的序列区域的峰数据和/或与靶相关分子的靶相关区域、生物靶的靶序列区域、靶相关分子的靶变异区域和生物靶的序列区域相关的峰数据等等)的对准位置，并且其中确定靶相关丰度比率(和/或合适的丰度度量)的集合包括对于不同对中的每一对(例如，靶相关序列的碱基和靶序列的碱基的不同对中的每一对；等等)：基于至少一个色谱相关输出(例如，基于经测序的碱基的峰强度数据；基于色谱；等等)确定在对准位置中的第一对准位置处的所述对的靶相关序列的碱基的峰强度度量(例如，峰的最大强度；峰的总体强度；等等)；基于至少一个色谱相关输出(例如，基于经测序的碱基的峰强度数据；基于色谱；等等)确定在对准位置中的第二对准位置处的所述对的靶序列的碱基的峰强度度量，其中第一对准位置与第二对准位置不同，并且其中对准位置包括第一对准位置和第二对准位置；和/或基于靶相关序列的碱基的峰强度度量和第一靶序列的碱基的峰强度度量来确定靶相关丰度比率的集合(和/或合适的丰度度量的集合；等等)的靶相关丰度比率(和/或合适的丰度度量；等等)。在实例中，如图6A和图7A中所示出的，第一对准位置可以对应于峰的第一集合中的第一峰和第二峰(例如，重叠峰，其对应于相同的对准位置；对应于相同或不同的碱基类型；等等)，其中第一峰对应于靶相关序列的重叠碱基(例如，其中靶相关序列碱基通过“*”标记，如图6A和图7A中所示出的)，其中第一峰对应于靶相关丰度比率的集合中的第一靶相关丰度比率(例如，针对靶相关序列的重叠碱基和靶序列的在对准位置上移位的对应碱基的对，其中在对准位置上的移位量基于一个或更多个***和/或缺失的特征，诸如一个或更多个***和/或缺失的大小；等等)，其中第二峰对应于靶序列的重叠碱基(例如，其中靶序列碱基通过“O”标记，如图6A和图7A中所示出的)，和/或其中第二峰对应于靶相关丰度比率的集合中的第二靶相关丰度比率(例如，不同于第一靶相关丰度比率；针对靶序列的重叠碱基和靶相关序列的在对准位置上移位的相应碱基的对；等等)。
在具体实例中，如图6A-6B中所示出的，样品DNA的区域chr21:15811326-15811417的初始丰度可以通过估计hg19“参考”DNA强度与加标“Spk”强度的比率来确定(例如，在对由靶相关分子和包含靶序列的靶分子的共扩增生成的加标混合物进行Sanger测序之后进行所述确定；等等)；其中靶相关序列(例如，加标序列；靶相关分子的靶相关序列；等等)包含三个核苷酸缺失，导致形成靶相关序列和靶序列的相应(例如，序列相似；等等)碱基对的对准位置上的三位置移位；其中个体靶相关丰度比率可以基于相应对的峰强度(例如，由色谱的峰处的“*”和“O”的位置指示)来确定(例如，其中对应于靶相关序列的“C”碱基和由“*”指示的对准位置161的个体丰度比率可以基于靶相关序列的“C”碱基的峰强度度量(例如，峰的最大强度)和由“O”指示并且在位置164处的靶序列的“C”碱基的峰强度度量(例如，峰的最大强度)的比率来确定，这是由于从在靶相关序列的变异区域中的三个核苷酸缺失的对准位置移位；等等)，诸如其中可以绘制靶相关比率(例如，如图6B中所示出的；诸如其中分别在位置161和位置164处的“C”碱基对的个体丰度比率由绘图中的对准位置编号“161”指示；等等)，和/或诸如其中数据点的斜率(例如，0.185；靶相关丰度比率数据点的线性回归；绘图的数据点的斜率；等等)可以是描述样品中靶分子的丰度相对于靶相关分子的丰度的丰度度量(例如，内源性DNA相对于加标DNA的丰度；样品DNA的丰度为加标DNA水平的0.185倍；等等)。
在具体实例中，如图7A-7B中所示出的，样品DNA的区域chr21:22231528+22231612的初始丰度可以通过估计hg19“参考”DNA强度与加标“Spk”强度的比率来确定(例如，在对由靶相关分子和包含靶序列的靶分子的共扩增生成的加标混合物进行Sanger测序之后进行所述确定；等等)；其中靶相关序列(例如，加标序列；靶相关分子的靶相关序列；等等)包括三个核苷酸缺失，导致形成靶相关序列和靶序列的相应(例如，序列相似；等等)碱基对的对准位置上的三位置移位；其中个体靶相关丰度比率可以基于相应对的峰强度(例如，由色谱的峰处的“*”和“O”的位置指示)来确定(例如，其中对应于靶相关序列的“G”碱基和由“*”指示的对准位置15的个体丰度比率可以基于靶相关序列的“G”碱基的峰强度度量(例如，峰的最大强度)和由“O”指示并且在位置18处的靶序列的“G”碱基的峰强度度量(例如，峰的最大强度)的比率来确定，这是由于从在靶相关序列的变异区域中的三个核苷酸缺失的对准位置移位；等等)，诸如其中可以绘制靶相关比率(例如，如图7B中所示出的；诸如其中分别在位置15和位置18处的“G”碱基对的个体丰度比率由绘图中的对准位置编号“15”指示；等等)，和/或诸如其中数据点的斜率(例如，0.34；靶相关丰度比率数据点的线性回归；绘图的数据点的斜率；等等)可以是描述样品中靶分子的丰度相对于靶相关分子的丰度的丰度度量(例如，内源性DNA相对于加标DNA的丰度；样品DNA的丰度为加标DNA水平的0.34倍；等等)。
然而，基于与包含一个或更多个***、缺失和/或合适的修饰的变异区域相关的测序输出确定丰度度量和/或确定以其他方式与所述测序输出相关的丰度度量可以以任何合适的方式进行。
在变化形式中，提取丰度度量可以包括对重叠峰(例如，色谱峰等等)解卷积，该重叠峰包括对应于变异区域位置处的靶相关序列碱基(例如，“A”碱基)的第一峰和对应于该位置处的靶序列碱基(例如，“T”碱基)的第二峰；以及计算解卷积的峰的测序输出和/或丰度度量(例如，“T”碱基相对于“A”碱基的峰强度的比率)。在变化形式中，解卷积可以用于第一基因座(例如，染色体18的第一基因座)的碱基和第二基因座(例如，同一染色体的第二基因座、不同染色体诸如染色体21的第二基因座等等)的碱基之间的重叠峰。
在变化形式中，如图8中所示出的，从加标混合物色谱对靶序列和靶相关序列的相对丰度进行统计估计可以基于单独的靶分子的第一色谱(和/或任何合适的测序输出诸如峰数据；等等)和/或单独的靶相关分子的第二色谱(和/或任何合适的测序输出；等等)(例如，其中跨色谱和/或测序输出的集合的特定碱基的峰可以被处理以进行多重线性回归等等)。在变化形式中，解卷积(例如，Lucy-Richardson解卷积)可以被应用以解析色谱的峰(例如，实现相同颜色的峰之间的改进的分离)和/或以解析其他合适的输出。在具体实例中，方法100可以包括：生成色谱(和/或色谱相关数据；等等)的集合(例如，针对加标混合物、针对单独的靶相关分子、针对单独的靶分子等等生成所述集合)；通过解卷积解析色谱集合的峰(例如，其中可以省略该操作和/或其他合适的操作；等等)；以及对经处理的色谱进行回归分析。另外地或可选择地，可以对任何合适数目的色谱峰和/或测序***输出的其他组分以及色谱峰和/或测序***输出的其他组分的组合进行解卷积、回归分析或其他计算操作。
在变化形式中，确定丰度度量可以包括从多个个体丰度度量确定总体丰度度量，这可以增加丰度度量的准确度。在实例中，方法100可以包括基于与靶相关分子(例如，包含第一靶相关序列，所述第一靶相关序列包含与第一靶序列的第一靶序列区域具有序列相似性的第一靶相关区域；等等)的第一集合、靶分子的集合和靶相关分子的第二集合相关的Sanger测序来确定至少一个色谱相关输出，其中靶相关分子的第二集合包含第二靶相关序列，所述第二靶相关序列包含与第二靶序列的第二靶序列区域具有序列相似性的第二靶相关区域；基于至少一个色谱相关输出确定第一靶相关序列和第一靶序列的碱基的不同集合(例如，其中来自碱基的不同集合的碱基的每一个不同集合包括第一靶相关序列的至少一个碱基和第一靶序列的至少一个碱基；等等)的靶相关丰度比率的第一集合；基于至少一个色谱相关输出确定第二靶相关序列和第二靶序列的碱基的不同集合(例如，其中来自碱基的不同集合的碱基的每一个不同集合包括第二靶相关序列的至少一个碱基和第二靶序列的至少一个碱基，等等)的靶相关丰度比率的第二集合；和/或基于靶相关丰度比率的第一集合和靶相关丰度比率的第二集合来确定一个或更多个总体丰度度量(例如，描述样品的生物靶的丰度等等)。在实例中，第一靶序列可以对应于染色体的第一基因座，其中第二靶序列可以对应于染色体的第二基因座，并且其中促进一种或更多种状况的表征可以包括基于一个或更多个总体丰度度量来促进染色体异常的表征。
例如，如图9中所示出的，确定总体丰度比率度量可以基于以下进行：基于变异区域的每个位置处碱基的内源相关峰和相应的加标相关峰的对的测序输出(例如，峰强度等等)来确定变异区域的每个位置的个体测序输出比率，其中个体测序输出比率可以跨越任何数目的碱基位置，跨过任何数目的基因座(例如，其中不同基因座的个体测序输出比率从不同基因座的不同色谱提取；其中比率从包括多个基因座的数据的同一色谱提取；等等)、染色体、靶和/或其他合适的方面；以及对个体测序输出比率进行组合(例如，取平均值(averaging))。另外地或可选择地，从个体丰度度量确定总体丰度度量可以利用任何合适的统计方法(例如，取平均值、中值等等)，和/或可以以任何合适的方式进行。在变化形式中，可以确定单独制备和/或测序的样品(例如，包含靶相关分子的第一样品和包含靶分子的第二样品，其中第一样品和第二样品可以被单独制备和/或测序诸如Sanger测序；等等)的丰度度量的不同集合。例如，方法100可以包括Sanger测序(例如，由第一方、第三方、用户和/或任何合适的实体进行；等等)，该Sanger测序包括：对包含靶相关分子的集合的第一样品进行Sanger测序；以及对包含靶分子的集合的第二样品进行Sanger测序，其中确定至少一个色谱相关输出(例如，峰强度的集合；色谱；等等)可以包括：基于第一样品的Sanger测序来确定与靶相关分子的集合相关的第一色谱相关输出(例如，色谱、峰强度的集合；等等)(例如，靶相关分子的集合的靶相关序列的碱基的峰强度数据；等等)；以及基于第二样品的Sanger测序来确定与靶分子的集合相关的第二色谱相关输出(例如，色谱、峰强度的集合；等等)(例如，靶相关分子的集合的靶相关序列的碱基的峰强度数据；等等)，并且其中确定靶相关丰度比率(和/或任何合适的丰度度量)的集合可以包括基于第一色谱相关输出和第二色谱相关输出来确定靶相关丰度比率的集合(例如，基于第一色谱相关输出来确定靶相关分子的集合的个体丰度比率的第一集合；基于第二色谱相关输出来确定靶分子的集合的个体丰度比率的第二集合；其中总体丰度比率可以基于个体丰度比率来确定；等等)。
在变化形式中，丰度度量可以随时间确定(例如，针对随时间收集的不同样品进行；通过随时间进行方法100的实施方案的多个实例来进行；等等)，其中可以在促进一种或更多种状况的一种或更多种表征(例如，随时间监测癌症相关分子计数；等等)、治疗(例如，随时间评估癌症治疗效果；等等)和/或其他合适的信息方面来分析一系列丰度度量。例如，方法100可以包括，其中一种或更多种状况(例如，医学状况等等)可以包括单基因紊乱和癌症状况(和/或任何合适的状况；等等)中的至少一种：确定与第一时间段相关(例如，与进行方法100的实施方案的一个或更多个部分的第一实例相关；等等)的第一总体丰度度量(和/或任何合适的第一丰度度量；等等)(例如，描述生物靶的第一丰度；等等)；确定第二总体丰度度量(例如，描述生物靶的第二丰度；等等)，其中第二总体丰度度量与第二时间段相关(例如，与进行方法100的实施方案的一个或更多个部分的第二实例相关；等等)；和/或基于第一总体丰度度量(例如，基于第一总体丰度度量和第一参考相关丰度度量诸如第一总体参考相关丰度度量之间的第一比较；等等)和第二总体丰度度量(例如，第二总体丰度度量和描述相同生物参考或不同生物参考的第二丰度的第二总体参考相关丰度度量之间的第二比较，其中第二总体参考相关丰度度量可以与第二时间段和/或任何合适的时间段相关；第二总体丰度度量和第一总体参考相关丰度度量之间的第二比较等等)来促进一种或更多种状况的表征。
在变化形式中，确定丰度度量可以包括应用丰度确定模型，该丰度确定模型包括以下中的任何一个或更多个：概率性属性、启发式属性、确定性属性和/或任何其他合适的属性。
然而，确定丰度度量S140可以以任何合适的方式进行。
2.5处理参考相关分子.
另外地或可选择地，方法100的实施方案可以包括处理参考相关分子(例如，包含含有参考相关区域和参考变异区域的参考序列，诸如其中序列和/或区域类似于靶相关分子的序列和/或区域，诸如其中此类分子、序列和/或区域可以以类似的方式诸如以类似于关于S110、S120和/或本文所描述的方式配置、生成、应用、处理和/或使用；等等)的集合；S115，其可以用于生成和/或处理(例如，通过应用方法100的实施方案的一个或更多个合适的部分等等)与参考分子(例如，包含鉴定参考染色体诸如染色体21的参考序列的参考核酸；包含与单基因紊乱的野生型形式相关的参考序列的参考核酸；等等)，诸如存在于样品(例如，从其提取靶分子的生物样品；等等)中的参考分子相关的分子，诸如以确定参考丰度度量(例如，参考相关丰度度量；等等)，该参考丰度度量可以与靶的丰度度量进行比较(例如，在确定相对丰度方面；与靶相关丰度度量进行比较；等等)和/或以其他方式被处理(例如，用于促进表征和/或治疗；等等)，诸如通过将靶染色体21的丰度比率和参考染色体18的丰度比率进行比较来筛选21三体和/或18三体。处理参考相关分子(例如，生成分子；处理分子以生成参考加标混合物；测序；计算处理等等)和/或参考分子可以以类似于处理靶相关分子、靶分子和/或其他合适的组分的任何方式进行。然而，处理参考相关分子S115可以以任何合适的方式进行。
2.6促进状况的表征.
另外地或可选择地，方法100的实施方案可以包括促进一种或更多种状况的表征S150(所述状况例如医学状况，诸如遗传紊乱；其基于一种或更多种丰度度量等等进行)，其可以用于对一种或更多种状况进行检测、诊断、分析、确定其特征，在一种或更多种状况的表征方面帮助一个或更多个护理提供者，提供有关一种或更多种状况的数据(例如，参数；等等)；和/或以其他方式促进一种或更多种状况的表征。
表征可以包括以下中的任何一个或更多个：诊断、风险评估、原因(例如，用户行为的鉴定、人口统计、病史、遗传因素和/或促成状况的其他合适的方面)和/或提供关于一种或更多种状况的信息的其他合适的信息。在变化形式中，一种或更多种表征可以在以下的任何一个或更多个方面中使用：确定治疗、告知用户、告知护理提供者(例如，在诊断中指导护理提供者；等等)，和/或进行任何合适的操作。促进一种或更多种表征优选地基于丰度比率的比较(例如，总体靶相关丰度比率针对总体参考相关丰度比率的比较)，但是可以另外地或可选择地基于任何数目和/或类型的丰度度量(例如，应用于和/或用于生成丰度度量的任何合适的分析技术诸如统计估计分析；等等)，但是可以另外地或可选择地基于任何合适的丰度度量。在实例中，生物靶可以与一种或更多种医学状况相关，并且促进一种或更多种医学状况的表征可以基于第一总体丰度度量(例如，总体靶相关丰度度量；等等)和第二总体丰度度量(例如，描述生物参考的丰度的总体参考相关丰度度量；等等)之间的比较。
在实例中，状况(例如，医学状况；等等)可以包括包含染色体异常和单基因紊乱中的至少一种的遗传紊乱；其中第一靶序列区域(例如，靶相关分子的第一集合的第一靶序列的第一靶序列区域；等等)可以与第一染色体和突变中的至少一种相关；其中生物参考的参考序列区域与第二染色体和突变的缺乏中的至少一种相关；和/或其中促进遗传紊乱的产前诊断(和/或合适的表征；等等)包括基于总体靶相关丰度比率(例如，基于对应于第一靶相关序列的碱基和第一靶序列的碱基的不同对的峰强度的靶相关丰度比率的第一集合确定的；等等)和参考相关总体丰度比率(例如，基于对应于参考相关序列的碱基和参考序列的碱基的不同对的峰强度的参考相关丰度比率的集合确定的；等等)之间的比较，促进染色体异常和单基因紊乱中的至少一种的产前诊断。在实例中，所述状况可以包括包含染色体异常的遗传紊乱，其中第一靶序列对应于第一染色体的第一基因座，并且其中方法100可以包括生成靶相关分子的第二集合，该靶相关分子包含第二靶相关序列，所述第二靶相关序列包含与对应于第一染色体的第二基因座的第二靶序列的第二靶序列区域具有序列相似性的第二靶相关区域；以及基于至少一个色谱相关输出确定靶相关丰度比率的第二集合，其中靶相关丰度比率的第二集合中的每一个靶相关丰度比率对应于第二靶相关序列的碱基和第二靶序列的碱基的不同对，其中确定总体靶相关丰度比率包括基于靶相关丰度比率的第一集合和靶相关丰度比率的第二集合确定总体靶相关丰度比率，并且其中生物参考的参考序列区域与第二染色体相关。
在实例中，状况(例如，医学状况；等等)可以包括一种或更多种染色体异常、一种或更多种单基因紊乱和/或一种或更多种癌症状况中的至少一种，其中靶序列区域与第一染色体(例如，与染色体异常相关；与癌症状况相关；等等)和突变(例如，与染色体异常相关；与癌症状况相关；等等)中的至少一种相关，其中生物参考的参考序列区域与第二染色体和突变的缺乏中的至少一种相关，和/或其中促进医学状况的表征包括基于一种或更多种丰度度量(例如，靶相关丰度比率的集合和参考相关丰度比率的集合，诸如从靶相关丰度比率的集合确定的总体靶相关丰度比率以及从参考相关丰度的集合确定的总体参考相关丰度比率；等等)促进一种或更多种染色体异常、一种或更多种单基因紊乱和/或一种或更多种癌症状况中的至少一种的表征。
在变化形式中，促进一种或更多种表征可以基于一个或更多个胎儿分数(fraction)测量(和/或任何其他合适的数据，诸如一种或更多种丰度度量；等等)。例如，促进产前诊断可以包括基于胎儿分数测量和/或一种或更多种丰度度量(例如，总体靶相关丰度比率、参考相关总体丰度比率、比率之间的比较等等)促进一种或更多种遗传紊乱的产前诊断。然而，基于胎儿分数测量促进表征可以以任何合适的方式进行。
促进一种或更多种状况的表征和/或方法100的实施方案的任何其他合适的部分(例如，确定丰度度量；促进治疗；等等)可以包括应用一种或更多种人工智能方法(例如，机器学***均聚类)、半监督式学***滑估计(locallyEstimated Scatterplot Smoothing)等等)、基于实例的方法(例如，k最近邻域、学***均单依赖估计(averaged one-dependence estimator)、贝叶斯置信网络(Bayesian belief network)等等)、核方法(例如，支持向量机、径向基函数、线性判别分析等等)、聚类方法(例如，k-均值聚类、期望最大化等等)、关联规则学习算法(associated rule learning algorithm)(例如，Apriori算法、Eclat算法等等)、人工神经网络模型(例如，感知方法(Perceptron method)、反向传播方法(back-propagation method)、Hopfield网络方法、自组织映射方法、学习向量量化方法等等)、降维方法(例如，主成分分析、偏最小二乘回归、Sammon映射、多维标度(multidimensional scaling)、投影寻踪等等)、集成方法(例如，推进(boosting)、靴襻式聚集(boostrapped aggregation)、AdaBoost、堆叠泛化(stacked generalization)、梯度推进机方法(gradient boosting machine method)、随机森林法等等)和/或任何合适的人工智能方法。
然而，促进一种或更多种状况的表征S150可以以任何合适的方式进行。
2.7促进治疗.
另外地或可选择地，方法100的实施方案可以包括促进治疗S160(例如，基于一种或更多种丰度度量；基于一种或更多种状况的一种或更多种表征；等等)，其可以用于利用丰度数据以确定、提供、管理、推动、推荐一种或更多种状况的治疗提供和/或以其他方式促进治疗提供(例如个性化治疗提供等等)。促进治疗可以包括应用与分析丰度度量相关的任何合适的技术(例如，用于促进一种或更多种表征；使用相似或不同的统计操作或算法；使用相同或不同的丰度度量、补充数据、其他合适的数据；等等)。治疗可以包括以下中的任何一种或更多种：治疗性组合物(例如，妊娠相关组合物、基于药物的治疗、基于益生菌的治疗、基于局部的治疗等等)、外科手术治疗、基于医疗设备的治疗、包括基于丰度度量导出的状况相关信息和/或治疗相关信息的健康相关通知(例如，传送至受试者、至护理提供者等等)；饮食相关治疗；认知/行为治疗；物理疗法；临床相关治疗(例如，远程医疗、安排护理人员预约等等)；基于替代医学的治疗；基于环境的治疗；和/或任何其他合适类型的治疗。然而，促进治疗S160可以以任何合适的方式进行。
2.8验证.
另外地或可选择地，方法100的实施方案可以包括验证S105(例如，诸如验证方法100和/或***200的实施方案的一个或更多个部分，等等)，其可以用于评估与方法100和/或***200的实施方案相关的任何合适的参数(例如，准确度、成本、功效、可部署性等等)。在具体实例中，图10可以包括向未知质量的样品添加加标DNA的湿实验室协议的表示；其中加标DNA序列与内源性DNA相同，除了10bp可变区域之外；其中加标DNA和内源性DNA然后通过PCR扩增，并且纯化所得到的扩增子并且诸如使用BigDye v3.3化学进行Sanger测序；其中图10包括加标DNA和内源性DNA(单独测序的内源性DNA和加标DNA的纯的制品)的色谱；其中内源性/加标混合物的色谱是纯的加标色谱和内源性色谱的线性组合；其中图10包括用于计算内源性DNA质量的色谱数据的计算分析的结果；其中加标DNA和内源性DNA的比例由线性回归分析确定；其中对应于荧光标记的双脱氧核苷酸的Sanger色谱的每一个通道单独进行分析；其中描绘了对“A”通道的分析；并且其中测量了色谱的预期在内源或加标中显示“A”峰的碱基位置处的峰强度。在具体实例中，如图10中所示出的，验证可以包括进行样品处理和计算处理(例如，使用本文所描述的任何合适的技术等等)，以便评估方法100的实施方案在确定加标混合物和/或其他合适的组分的丰度度量方面的准确度；其中验证度量(例如，包含已知丰度的组分的加标混合物的内源性与加标的比例等等)可以以可用作校准因子用于调整对于具有未知的靶分子丰度的样品计算的丰度比率度量和/或可用于任何合适的目的的方式计算。
在变化形式中，如图12A-12B中所示出的，靶相关分子(例如，加标分子)的任何合适的丰度(例如，来自连续稀释等等)可以用于评估与方法100的实施方案的部分相关的准确度、精确度和/或其他合适的参数。在具体实例中，如图12A-12B中所示出的(例如，指示应用方法100的实施方案的部分的准确度和/或精确度)，将42ng的NA12878人基因组DNA与不同量的加标DNA混合并通过PCR进行30轮扩增，并且每一个样品中加标DNA的比例通过应用方法100的实施方案的部分来确定；并且其中将回归线拟合于产生的加标比例>0的4个样品，并且基于回归拟合，0.0226amol或44.9ng被预测产生1/2的加标比例；其中1fmol的参考DNA以指定的比例与加标DNA混合；并且其中混合物被扩增20x PCR、纯化，并且可以进行方法100的实施方案的部分。
然而，验证S105可以以任何合适的方式进行。
然而，方法100的实施方案可以以任何合适的方式进行。
方法100和/或***200的实施方案可以包括多种***组件和多种方法过程的每个组合和排列，包括任何变型(例如，实施方案、变化形式、实例、具体实例、附图等等)，其中本文所描述的方法100和/或过程的实施方案的部分可以通过和/或使用本文所描述的***200和/或其他实体的一个或更多个实例、元件、组分和/或其他方面异步地(例如，顺序地)、同时地(例如，平行地)或以任何其他合适的顺序来进行。
本文描述的任何变型(例如，实施方案、变化形式、实例、具体实例、附图等等)和/或本文所描述的变型的任何部分可以被另外地或可选择地组合、聚集、排除、使用、串行进行、平行进行和/或以其他方式应用。
方法100和/或***200的实施方案的部分可以至少部分地被实施和/或实现为被配置为接收存储计算机可读指令的计算机可读介质的机器。指令可以由可以与***200的实施方案集成的计算机可执行组件来执行。计算机可读介质可以储存在任何适当的计算机可读介质上，诸如RAM、ROM、闪速存储器、EEPROM、光学装置(CD或DVD)、硬盘、软盘或任何合适的装置。计算机可执行的组件可以是一般的或应用特异性的处理器，但任何合适的专用硬件或硬件/固件组合装置可以可选择地或另外地执行指令。
如本领域技术人员将从先前详细的描述和从附图和权利要求认识到的，可以对方法100、***200和/或变型的实施方案进行修改和改变而不脱离权利要求中定义的范围。

Claims (20)

1.一种用于促进由与妊娠女性相关的母体样品进行遗传紊乱的产前诊断的方法，所述方法包括：
·生成包含第一靶相关序列的靶相关分子的第一集合，所述第一靶相关序列包含：
·与生物靶的第一靶序列的第一靶序列区域具有序列相似性的第一靶相关区域，其中所述生物靶与所述遗传紊乱相关；以及
·与靶序列的序列区域具有序列相异性的靶变异区域；
·基于对所述靶相关分子的第一集合和来自所述母体样品的第一核酸分子进行共扩增来生成共扩增的加标混合物，其中所述第一核酸分子包含所述靶序列区域；
·对所述共扩增的加标混合物进行Sanger测序以确定至少一个色谱相关输出，所述色谱相关输出包括与所述第一靶相关区域、所述生物靶的靶序列区域、所述靶变异区域和所述生物靶的序列区域相关的第一峰；
·确定靶相关丰度度量的第一集合，其中所述靶相关丰度度量的第一集合中的每一个靶相关丰度度量对应于所述第一靶相关序列的碱基和所述第一靶序列的碱基的不同对，其中对于所述不同对中的每一对，确定所述靶相关丰度度量的第一集合包括：
·基于所述至少一个色谱相关输出来确定所述对的所述第一靶相关序列的碱基的峰强度度量；
·基于所述至少一个色谱相关输出来确定所述对的所述第一靶序列的碱基的峰强度度量；以及
·基于所述第一靶相关序列的碱基的所述峰强度度量和所述第一靶序列的碱基的所述峰强度度量来确定所述靶相关丰度度量的第一集合的靶相关丰度度量；
·基于所述靶相关丰度度量的第一集合来确定总体靶相关丰度度量；以及
·基于所述总体靶相关丰度度量和描述生物参考相对于参考相关分子的丰度的参考相关总体丰度度量之间的比较来促进所述遗传紊乱的产前诊断。
2.如权利要求1所述的方法，
·其中所述遗传紊乱包括染色体异常和单基因紊乱中的至少一种，
·其中所述第一靶序列区域与第一染色体和突变中的至少一种相关，
·其中所述生物参考的参考序列区域与第二染色体和所述突变的缺乏中的至少一种相关，并且
·其中促进所述遗传紊乱的产前诊断包括基于所述总体靶相关丰度度量和所述参考相关总体丰度度量之间的所述比较来促进所述染色体异常和所述单基因紊乱中的至少一种的产前诊断。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述遗传紊乱包括所述染色体异常，其中所述第一靶序列对应于所述第一染色体的第一基因座，其中所述方法还包括：
·生成包含第二靶相关序列的靶相关分子的第二集合，其中所述第二靶相关序列包含：
·与第二靶序列的第二靶序列区域具有序列相似性的第二靶相关区域，
·其中所述第二靶序列对应于所述第一染色体的第二基因座；以及
·基于所述至少一个色谱相关输出来确定靶相关丰度度量的第二集合，其中所述靶相关丰度度量的第二集合中的每一个靶相关丰度度量对应于所述第二靶相关序列的碱基和所述第二靶序列的碱基的不同对，
·其中确定所述总体靶相关丰度度量包括基于所述靶相关丰度度量的第一集合和所述靶相关丰度度量的第二集合来确定所述总体靶相关丰度度量，并且
·其中所述生物参考的参考序列区域与所述第二染色体相关。
4.如权利要求1所述的方法，其中促进产前诊断包括基于胎儿分数测量、所述总体靶相关丰度度量和所述参考相关总体丰度度量来促进所述遗传紊乱的产前诊断。
5.如权利要求1所述的方法，其中与所述靶序列相比，所述靶变异区域包括***和缺失中的至少一种，其中所述至少一个色谱相关输出包括对应于所述第一峰的对准位置，其中对于所述不同对中的每一对，所述第一靶相关序列的碱基对应于第一对准位置，所述第一对准位置不同于对应于所述第一靶序列的碱基的第二对准位置，并且其中所述至少一个色谱相关输出的所述对准位置包括所述第一对准位置和所述第二对准位置。
6.一种用于促进由包含靶分子的样品进行医学状况的表征的方法，所述方法包括：
·生成包含靶相关序列的靶相关分子的集合，所述靶相关序列包含：
·与生物靶的靶序列的第一靶序列区域具有序列相似性的第一靶相关区域，其中所述生物靶与遗传紊乱相关；以及
·与所述靶序列的序列区域具有序列相异性的靶变异区域；
·基于所述靶相关分子的集合和包含所述靶序列的靶分子进行Sanger测序，以确定至少一个色谱相关输出，所述色谱相关输出包括与所述第一靶相关区域、所述生物靶的第一靶序列区域、所述靶变异区域和所述生物靶的序列区域相关的峰的第一集合；
·基于所述至少一个色谱相关输出的所述峰的第一集合来确定不同碱基对的集合的靶相关丰度度量的集合，其中来自所述不同碱基对的集合的每一个不同碱基对对应于所述靶相关序列的碱基和所述靶序列的碱基的对；以及
·基于所述靶相关丰度度量的集合和描述生物参考相对于参考相关分子的丰度的参考相关丰度度量的集合来促进所述医学状况的表征。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述靶变异区域包含相对于所述靶序列的序列区域的取代、***和缺失中的至少一种，并且其中确定所述靶相关丰度度量的集合包括基于所述峰的第一集合以及所述取代、所述***和所述缺失中的至少一种来确定所述靶相关丰度度量的集合。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述靶变异区域包含所述***和所述缺失中的至少一种，其中所述至少一个色谱相关输出包括对应于所述峰的第一集合的对准位置，并且其中对于所述不同对中的每一对，确定所述靶相关丰度度量的集合包括：
·基于所述至少一个色谱相关输出，确定所述对的第一靶相关序列的碱基在所述对准位置的第一对准位置处的峰强度度量；
·基于所述至少一个色谱相关输出，确定所述对的第一靶序列的碱基在所述对准位置的第二对准位置处的峰强度度量，其中所述第一对准位置不同于所述第二对准位置，并且其中所述对准位置包括所述第一对准位置和所述第二对准位置；以及
·基于所述靶相关序列的碱基的所述峰强度度量和所述第一靶序列的碱基的所述峰强度度量来确定所述靶相关丰度度量的集合的靶相关丰度度量。
9.如权利要求8所述的方法，
·其中所述第一对准位置对应于所述峰的第一集合中的第一峰和第二峰，
·其中所述第一峰对应于所述靶相关序列的重叠碱基，
·其中所述第一峰对应于所述靶相关丰度度量的集合的第一靶相关丰度度量，
·其中所述第二峰对应于所述靶序列的重叠碱基，并且
·其中所述第二峰对应于所述靶相关丰度度量的集合的第二靶相关丰度度量。
10.如权利要求6所述的方法，
·其中所述医学状况包括染色体异常、单基因紊乱和癌症状况中的至少一种，
·其中所述第一靶序列区域与第一染色体和突变中的至少一种相关，
·其中所述生物参考的参考序列区域与第二染色体和所述突变的缺乏中的至少一种相关，并且
·其中促进所述医学状况的表征包括基于所述靶相关丰度度量的集合和所述参考相关丰度度量的集合来促进所述染色体异常、所述单基因紊乱和所述癌症状况中的至少一种的表征。
11.如权利要求6所述的方法，所述方法还包括将至少一个序列区域添加至所述靶相关分子和所述靶分子的集合中的至少一个，其中所述至少一个序列区域包括以下中的至少一种：(a)与第二靶序列区域具有序列相似性的第二靶相关区域，和(b)所述靶相关序列的区域和所述靶序列的区域中的至少一种的至少一个序列重复。
12.如权利要求11所述的方法，
·其中添加所述至少一个序列区域包括添加所述靶相关序列的区域和所述靶序列的区域中的至少一种的至少一个序列重复，
·其中所述至少一个色谱相关输出的所述峰的第一集合对应于所述第一靶相关区域、所述生物靶的第一靶序列区域、所述靶变异区域和所述生物靶的序列区域的第一测序，
·其中所述至少一个色谱相关输出包括对应于所述第一靶相关区域、所述生物靶的第一靶序列区域、所述靶变异区域和所述生物靶的序列区域的第二测序的峰的第二集合，并且
·其中确定所述靶相关丰度度量的集合包括基于所述峰的第一集合和所述峰的第二集合来确定所述靶相关丰度度量的集合。
13.如权利要求6所述的方法，所述方法还包括将至少一个序列重复添加至所述靶相关分子的集合和所述靶分子中的至少一种，其中添加所述至少一个序列重复包括用包含发夹序列的引物的集合对所述靶相关分子的集合和所述靶分子进行共扩增。
14.一种用于由包含靶分子的样品进行生物靶定量的方法，所述方法包括：
·基于与靶相关分子的第一集合和靶分子的集合相关的Sanger测序来确定与所述靶相关分子的第一集合和所述靶分子的集合相关的至少一个色谱相关输出，其中所述靶相关分子的第一集合包括第一靶相关序列，所述第一靶相关序列包含：
·与生物靶的第一靶序列的第一靶序列区域具有序列相似性的第一靶相关区域，其中所述靶分子的集合包括所述第一靶序列区域；以及
·与所述第一靶序列的序列区域具有序列相异性的靶变异区域；
·基于所述至少一个色谱相关输出来确定碱基的不同集合的靶相关丰度度量的第一集合，其中来自所述碱基的不同集合的碱基的每一个不同集合包括所述第一靶相关序列中的至少一个碱基和所述第一靶序列中的至少一个碱基；以及
·基于所述靶相关丰度度量的第一集合来确定描述所述样品的所述生物靶的第一丰度的第一总体丰度度量。
15.如权利要求14所述的方法，
·其中确定所述至少一个色谱相关输出包括基于与所述靶相关分子的第一集合、所述靶分子的集合和靶相关分子的第二集合相关的Sanger测序来确定所述至少一个色谱相关输出，
·其中所述靶相关分子的第二集合包括第二靶相关序列，所述第二靶相关序列包含与第二靶序列的第二靶序列区域具有序列相似性的第二靶相关区域，并且
·其中所述方法还包括基于所述至少一个色谱相关输出来确定所述第二靶相关序列和所述第二靶序列的碱基的不同集合的靶相关丰度度量的第二集合。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述第一靶序列对应于染色体的第一基因座，其中所述第二靶序列对应于所述染色体的第二基因座，并且其中所述方法还包括基于所述第一总体丰度度量来促进染色体异常的表征。
17.如权利要求14所述的方法，其中所述生物靶与医学状况相关，并且其中所述方法还包括基于所述第一总体丰度度量和描述生物参考的丰度的总体参考相关丰度度量之间的第一比较来促进所述医学状况的表征。
18.如权利要求17所述的方法，
·其中所述医学状况包括单基因紊乱和癌症状况中的至少一种，
·其中所述第一总体丰度度量与第一时间段相关，
·其中所述方法还包括确定描述所述生物靶的第二丰度的第二总体丰度度量，其中所述第二总体丰度度量与第二时间段相关，并且
·其中促进所述医学状况的表征包括基于所述第一比较和所述第二总体丰度度量来促进所述医学状况的表征。
19.如权利要求14所述的方法，
·其中所述Sanger测序包括：
·对包含所述靶相关分子的第一集合的第一样品进行Sanger测序；以及
·对包含所述靶分子的集合的第二样品进行Sanger测序，
·其中确定所述至少一个色谱相关输出包括：
·基于对所述第一样品的Sanger测序来确定与所述靶相关分子的第一集合相关的第一色谱相关输出；以及
·基于对所述第二样品的Sanger测序来确定与所述靶分子的集合相关的第二色谱相关输出，并且
·其中确定所述靶相关丰度度量的第一集合包括基于所述第一色谱相关输出和所述第二色谱相关输出来确定所述靶相关丰度度量的第一集合。
20.如权利要求14所述的方法，其中基于所述至少一个色谱相关输出来确定所述靶相关丰度度量的第一集合包括基于峰强度、峰面积、共享碱基类型的碱基的峰度量和具有不同碱基类型的碱基的峰度量中的至少一种来确定所述碱基的不同集合的所述靶相关丰度度量的第一集合。
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