ES2912099T3 - Composiciones para prevenir y/o tratar una infección por un virus VIH-1 - Google Patents

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Abstract

Una composición inmunogénica que comprende un péptido antigénico de fórmula (I), el cual, cuando dicha composición inmunogénica se administra a un individuo, aumenta la producción de anticuerpos dirigidos contra dicho péptido de fórmula (I) que están dotados de propiedades neutralizantes frente a una pluralidad de aislados clínicos de VIH-1, en donde el péptido antigénico de fórmula (I) se selecciona del grupo que consiste en: - PWNASASNKSLDDIW (SEQ ID N° 12), - PWNASWANKSLDDIW (SEQ ID N° 13), - PWNASWSAKSLDDIW (SEQ ID N° 14), y - PWNASWSNKALDDIW (SEQ ID N° 15).

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones para prevenir y/o tratar una infección por un virus VIH-1
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a la prevención y al tratamiento de una infección de individuos con un virus VIH-1.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Aproximadamente el 90% de las infecciones humanas por el VIH son provocadas por un virus VIH-1. El virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) se caracteriza por una notable variabilidad genética provocada por la acumulación de mutaciones que surgen durante la replicación viral y también provocadas por los eventos de recombinación. El fracaso a largo plazo de los métodos quimioterapéuticos del tratamiento del VIH se explica, en particular, por la alta actividad mutagénica de cepas virales del VIH-1. Anteriormente se demostró que variantes virales resistentes han surgido rápidamente en pacientes después de diferentes cursos de terapia antirretroviral e incluso después de la terapia multifarmacológica (HAART, siglas inglesas de terapia antirretroviral muy activa). Estos virus resistentes portan alteraciones específicas en la conformación y estructura de sus proteínas. Habitualmente, mutaciones de este tipo responsables de que el VIH-1 escape de los tratamientos actuales se mantienen a lo largo de las sucesivas generaciones de virus y se acumulan, como resultado de la selección bajo las condiciones del tratamiento.
El tratamiento con medicamentos anti-VIH-1 no bloquea totalmente la replicación del virus, lo que permite una selección y acumulación de mutaciones de resistencia pre-existentes, así como de mutaciones nuevas, brindando así nuevas oportunidades para que el virus siga propagándose. Los medicamentos antirretrovirales existentes (NRTI, NNRTI, inhibidores de proteasa, inhibidores de fusión y mezclas de los mismos, tales como HAART) solo pueden ralentizar la replicación del VIH-1 durante un período de tiempo más o menos prolongado, hasta la aparición y propagación de cepas virales resistentes. La amplia difusión de variantes resistentes al VIH-1 plantea serias preocupaciones y requiere la disponibilidad de herramientas terapéuticas contra el VIH-1 adicionales.
Se han considerado diversas estrategias terapéuticas anti-VIH, distintas de las que hacen uso de sustancias químicas antirretrovirales, que incluyen (i) el uso de anticuerpos anti-VIH, (ii) vacunas basadas en la ruptura de partículas de VIH, (iii) vacunas basadas en péptidos del VIH y (iv) vacunas basadas en vectores de plásmidos de ADN o virales, teniendo cada una sus inconvenientes específicos.
A medida que la pandemia del VIH continúa infectando a millones de personas cada año, aumenta la necesidad de una vacuna eficaz. El desarrollo de vacunas anti-VIH se ha visto profundamente afectado debido a la dificultad de desarrollar un producto inmunogénico capaz de provocar anticuerpos anti-VIH ampliamente neutralizantes.
La inducción de anticuerpos ampliamente neutralizantes (bNAb, por sus siglas en inglés) contra aislados primarios del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) sigue siendo un objetivo importante e incumplido para la investigación de vacunas contra el SIDA. Los primeros intentos de utilizar vacunas basadas en envolturas han provocado anticuerpos que son efectivos solo contra aislados adaptados en laboratorio. En estos casos, la protección se ha correlacionado con títulos altos de bNAb dirigidos a la región hipervariable V3 de gp120. Sin embargo, las actividades neutralizantes generadas son en gran medida específicas para el aislado y son mínimamente efectivas contra la mayoría de los aislados primarios del VIH-1. El fracaso de las vacunas de la subunidad gp120 para proteger contra la adquisición del VIH-1 en ensayos clínicos de Fase III subraya la dificultad de la tarea.
No obstante, bNAb se pueden encontrar a menudo en individuos infectados por el VIH. Las respuestas generadas en la fase temprana de la infección son habitualmente de una especificidad estrecha, neutralizando los virus transmitidos en el huésped, pero no los contemporáneos. Respuestas de este tipo se amplían durante el curso de la infección en algunos sobrevivientes a largo plazo que son capaces de controlar su infección en ausencia de tratamiento antiviral. Sin embargo, la naturaleza de la respuesta de anticuerpos de neutralización cruzada y los mecanismos que conducen a su génesis no se conocen.
Naturalmente, los NAbs contra Env se generan semanas después de la infección, pero esta respuesta temprana solo es eficaz contra un subtipo viral específico; sin embargo, los bNAbs (Abs neutralizantes de reacción cruzada) pueden desarrollarse durante el curso del VIH. Recientemente, varios estudios importantes han demostrado que aproximadamente el 25 % de los sujetos infectados por el VIH (infectados durante al menos 1 año) tienen una respuesta de bNAb, y el 1 % de los "neutralizadores de élite" tienen una actividad muy sólida contra una gran mayoría de los clados. Es importante destacar que estos resultados demuestran la capacidad del sistema inmunitario de las personas infectadas para generar NAbs in vivo contra el VIH-1 durante el curso de la enfermedad. También sugieren que las actividades de Nab ampliamente reactivas parecen desarrollarse con el tiempo y son fomentadas por la exposición crónica al antígeno, en ausencia de conocimiento sobre el título de bNAbs que sería protector.
La replicación viral persistente, con poco ruido, conduce a una evolución continua de Env para evadir los Nabs. Una evolución antigénica de este tipo puede enfocar la nueva estrategia de vacunas en la región más conservada de la proteína Env y sugerir que los inmunógenos de vacunas podrían diseñarse para imitar epítopos clave altamente conservados.
Uno de los principales obstáculos para el diseño de vacunas anti-VIH eficientes ha sido que el objetivo de los bNAbs es la proteína de la envoltura viral (Env), que es muy variable, mientras que los elementos conservados parecen ser poco inmunogénicos. Esto significa que las restricciones cinéticas y especiales impiden que los bNAbs accedan a sitios potencialmente vulnerables durante los procesos de unión y fusión al receptor. En realidad, se han descrito pocas cantidades de Nabs. Por ejemplo, el primer bNAb identificado fue b12, que ocluye el sitio de unión de CD4 en gp120 e impide la fijación de CD4. La subunidad gp41 está mucho más conservada que la gp120, lo que implica reordenamientos conformacionales comunes a todas las cepas. Se provocan muy pocas actividades de bNAb contra elementos estructurales conservados de la gp41 que están protegidos, son de difícil acceso o son transitorios; esos bNAbs, incluidos 2F5 y 4E10, fijan como objetivo la región del ectodominio proximal a la membrana (MPER, por sus siglas en inglés) de gp41. Sin embargo, la inmunización con estos epítopos clave no dio como resultado la generación de actividad bNAb. Esta dicotomía entre las características antigénicas e inmunológicas aún no se comprende.
Vieillard et al. (AIDS 2008, 22:185-192)informaron que los anticuerpos dirigidos contra el motivo 'SWSNKS' de gp41 pueden generarse en macacos.
Sigue existiendo la necesidad en la técnica de herramientas terapéuticas destinadas a prevenir o tratar una infección provocada por un virus VIH-1.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una composición inmunogénica que comprende un péptido antigénico de fórmula (I), el cual, cuando dicha composición inmunogénica se administra a un individuo, aumenta la producción de anticuerpos dirigidos contra dicho péptido de fórmula (I) que están dotados de propiedades neutralizantes frente a una pluralidad de aislados clínicos de VIH-1,
en donde el péptido antigénico de fórmula (I) se selecciona del grupo que consiste en:
• PWNASASNKSLDDIW (SEQ ID N° 12),
• PWNASWANKSLDDIW (SEQ ID N° 13),
• PWNASWSAKSLDDIW (SEQ ID N° 14), y
• PWNASWSNKALDDIW (SEQ ID N° 15).
En determinadas realizaciones de la invención, el péptido antigénico de fórmula (I) está enlazado de forma covalente a una molécula portadora.
En determinadas realizaciones de dicha composición inmunogénica de la invención, el péptido antigénico de fórmula (I), opcionalmente enlazado a una molécula portadora, se combina con uno o más agentes inmuno-adyuvantes.
En determinadas realizaciones de la invención, la composición inmunogénica de la invención consiste en una composición de vacuna en la que el péptido antigénico se combina con al menos un adyuvante de inmunidad.
La presente invención también se refiere a un péptido antigénico de fórmula (I) como se describe en la presente memoria descriptiva.
En determinadas realizaciones de la invención, el péptido antigénico de fórmula (I) de la invención está enlazado de forma covalente a una molécula portadora.
La presente invención también se refiere a un método para detectar y/o cuantificar anticuerpos dirigidos contra un péptido en una muestra, que comprende las siguientes etapas:
a) poner en contacto una muestra a testar con uno o más péptidos antigénicos de la invención, y
b) detectar y/o cuantificar la formación de complejos entre dichos péptidos antigénicos y anticuerpos presentes en dicha muestra.
La presente invención también se refiere a un kit para detectar y/o cuantificar anticuerpos dirigidos contra un péptido en una muestra, que comprende:
a) uno o más péptidos antigénicos de la invención, y
b) uno o más reactivos para detectar complejos formados entre dichos péptidos antigénicos y anticuerpos presentes en dicha muestra.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de varios péptidos de fórmula (I).
Tipo salvaje: secuencia de aminoácidos contenida en la proteína gp41 de la cepa HXB2 del VIH-1, que también puede denominarse "3S".
S613A (M1) y K617A (M5): secuencias de aminoácidos que tienen una fuerte identidad de aminoácidos con el "tipo salvaje" anterior.
W614A, S615A, N616A y S618A: realizaciones específicas de un péptido de fórmula (I).
Figura 2. Infectividad del virus VIH-1 NL4.3 que contiene sustitución de alanina en el motivo 3S/gp41.
Células MT-2 se infectaron con 100 ng/mL de antígeno equivalente a p24 de virus NL4.3 de tipo salvaje (WT, barras en blanco) o mutado con alanina 3S/gp41 (barras negras).
(A) El antígeno p24 se cuantificó el día 6 post-infección. Los resultados, expresados en unidades relativas al tipo salvaje, representan la media ± DE de tres a siete preparaciones de clones de plásmidos independientes, dependiendo de los mutantes.
(B ) La formación de sincitios se cuantificó el día 4 post-infección mediante microscopía de contraste de fase estándar. Los resultados, expresados en unidades relativas al tipo salvaje, representan la media ± DE de dos a cuatro preparaciones de clones de plásmidos separadas, dependiendo de los mutantes.
(C) Estudio cinético de la producción del antígeno p24 en el sobrenadante celular de células T CD4+ primarias infectadas por el virus 3S/gp41 NL4.3 de tipo salvaje (WT, * ) o mutado en alanina, incluyendo S613A (■), W614A (A), S615A (A), N616A (o), K617A (•) y S618A (□). Este experimento es representativo de 2 experimentos independientes realizados con preparaciones de clones de plásmidos separados en células T CD4+ purificadas de dos donantes sanos independientes.
(D) Infectividad de células Hela P4C5 por virus NL4.3 de tipo salvaje (WT, barras en blanco) o 3S/gp41 mutado con alanina (barras negras). Las células se infectaron por triplicado con 4 ng/15.000 células de antígeno equivalente a p24 durante 48 h y se determinó la actividad de p-galactosidasa en los extractos celulares. Los resultados, expresados en unidades relativas al tipo salvaje, representan la media ± DE de tres a cuatro preparaciones de clones de plásmidos independientes. A los virus NL4.3 mutados en alanina se les alude como: S613A, W614A, S615A, N616A, K617A y S618A.
Figura 3. Expresión de NKp44L en células T CD4+ y desgranulación de células NK mediada por mutantes de alanina 3S/gp41.
(A) Células T CD4+ purificadas no estaban infectadas (líneas de puntos), se infectaron durante la noche (líneas negras) con virus de tipo salvaje (WT, por sus siglas en inglés) o diversos virus NL4.3 mutados con alanina. Las células se tiñeron con ligandos para las NCRs (proteínas de fusión NKp30-Ig, NKp44-Ig o NKp46-Ig). Los histogramas se seleccionaron en las células T CD4+. Superposición que muestra la expresión de ligandos de NCR en células infectadas por VIH en comparación con células no infectadas. Los números corresponden a la proporción de células T CD4+ que expresan positivamente ligandos NCR.
(B) La expresión de NKp44L en células T CD4+ purificadas no se trató (UT, por sus siglas en inglés) o se trató con péptidos de los péptidos de tipo salvaje (WT) o sintéticos 3S/gp41 mutados con alanina del motivo 3S/gp41. Las células se tiñeron con mAb anti-NKp44L o control de isotipo IgM (líneas de puntos). Los histogramas se seleccionaron en las células T CD4+. La superposición muestra la expresión de NKp44L, en comparación con el control de isotipo. Los números corresponden a la proporción de células T CD4+ que expresan NKp44L.
(C) La actividad de desgranulación se evaluó en células NK activadas por IL2 frente a células T CD4+ autólogas, en una relación E/T: 1/1, en presencia de mAb anti-CD107a. Células T CD4+ purificadas no estaban infectadas (NI), se infectaron durante la noche con virus de tipo salvaje (WT) o 3S/gp41 NL4.3 mutados con alanina. Los gráficos de puntos se seleccionan en células NK CD3-CD56+ en función de la expresión de NKp44 y CD107a. El número en cada uno de los paneles corresponde a la proporción de células NK positivas
(D) Eficacia de desgranulación de células NK frente a células T CD4+ autólogas purificadas en una relación E/T: 1/1, en presencia de mAb anti-CD 107a. Células T CD4+ no se trataron (UT) o se trataron con péptidos de los péptidos de tipo salvaje (WT) o sintéticos mutados con alanina del motivo 3S/gp41. Células T CD4+ se incubaron con células NK activadas con IL2 autólogas. Los histogramas se seleccionaron en las células NK CD3-CD56+ que expresaban NKp44. La superposición muestra la expresión de CD107a en células NK testadas en presencia de células T CD4+ autólogas tratadas con péptidos de tipo salvaje (WT) o sintéticos 3S/gp41 mutados con Alanina, en comparación con las células no tratadas. Los números corresponden a la proporción de células NK que expresan CD107a. A los virus NL4.3 mutados con alanina o los péptidos 3S/gp41 se les alude como S613A, W614A, S615A, N616A, K617A y S618A.
Figura 4. Neutralización de la infección viral e inhibición de NKp44L en células T CD4+ y desgranulación de células NK por Ig murina generada a partir de mutantes de alanina 3S/gp41 específicos.
Células T CD4+ purificados se infectaron con virus competentes NL4.3 (panel izquierdo) o NDK (panel derecho) preincubados durante 30 min con Ig purificada procedente de ratones inmunizados solo con adyuvante (Ig-Adj,+), con virus de tipo salvaje (WT, * ) o 3S/gp41 NL4.3 mutados con alanina, incluyendo S613A (■), W614A (△ ), S615A (O), N616A (o), K617A (•) y S618A (□).
(A) Los virus competentes (200TCID50) se incubaron con diversas concentraciones que variaban entre 0 y 20 pg/ml de Ig purificada durante 30 min, seguido de la adición de células T CD4+ purificadas activadas con PHA. El día 6 después de la infección se cuantificó el antígeno p24 en el sobrenadante celular.
(B) Efecto dependiente del tiempo. Virus competentes (200TCID50) se incubaron con 10 pg/ml de Ig durante 30 min, seguido de la adición de células T CD4+ purificadas activadas con PHA. Se testó el nivel de p24 en el sobrenadante celular cada 2 días durante 10 días post-infección.
(C) La expresión de NKp44L en células T CD4+ se determinó 17 h post-infección. Los histogramas se seleccionaron en el subconjunto de células CD4+ . La superposición muestra la expresión de NKp44L, en comparación con el control de isotipo IgM. Los números corresponden a la proporción de células positivas.
(D) Desgranulación de células NK autólogas. Células T CD4+ se incubaron con células NK autólogas a una relación E/T: 1/1, en presencia de mAb anti-CD107a. Los gráficos de puntos se seleccionan en células NK CD3-CD56+ en función de la expresión de NKp44 y CD107a. El número en cada uno de los paneles corresponde a la proporción de células positivas. A los virus NL4.3 mutados con alanina o los péptidos 3S/gp41 se les alude como S613A, W614A, S615A, N616A, K617A y S618A.
Figura 5. Neutralización de la infección viral e Inhibición de NKp44L en células CD4+ y desgranulación de células NK mediante Ab anti-W614A inmuno-precipitados purificados de pacientes infectados con VIH.
Células T CD4+ activadas con PHA se infectaron con virus competentes NL4.3 (panel izquierdo) o NDK (panel derecho) pre-incubados durante 30 min con el mAb anti-3S-WT (Anti-3S, o), Ab anti-3s inmuno-purificado con WT proporcionado por 1 paciente infectado con VIH (n° 117, □), o Ab inmuno-purificado con anti-3S-W614A proporcionado por 5 pacientes infectados con VIH: n° 24 (•), n° 44 (■), n° 65 (▲), n° 71 (▼) y n° 109 (♦).
(A) Virus competentes (200TCID50) se incubaron con diversas concentraciones que variaban entre 0 y 2 pg/ml de Ab inmuno-purificado durante 30 min, seguido de la adición de células T CD4+ . El día 6 después de la infección se cuantificó el antígeno p24 en el sobrenadante celular.
(B) Efecto dependiente del tiempo. Virus competentes (200TCID50) se incubaron con 1 pg/ml de Ab inmunopurificado durante 30 min, seguido de la adición de células T CD4+ purificadas activadas con PHA. Se testó el nivel de p24 en el sobrenadante celular cada 2 días durante 10 días post-infección.
(C) La expresión de NKp44L en células T CD4+ se determinó 17 h post-infección. Los histogramas se seleccionaron en el subconjunto de células T CD4+ . La superposición muestra la expresión de NKp44L, en comparación con el control de isotipo IgM. Los números corresponden a la proporción de células positivas.
(D) Desgranulación de células NK autólogas. Células T CD4+ se incubaron con células NK autólogas a una relación E/T: 1/1, en presencia de mAb anti-CD107a. Los gráficos de puntos se seleccionan en células NK CD3-CD56+ en función de la expresión de NKp44 y CD107a. El número en cada uno de los paneles corresponde a la proporción de células NK positivas. A los virus NL4.3 mutados con alanina o los péptidos 3S/gp41 se les alude como S613A, W614A, S615A, N616A, K617A y S618A.
Figura 6. Expresión de NKp44L y desgranulación de células NK autólogas, mediada por mutantes de alanina activados por calor de 3S/gp41 en células T CD4+.
Células T CD4+ purificadas no se trataron o se trataron durante la noche con 100 ng de antígeno p24 equivalente por mL de virus NL4.3 de tipo salvaje (WT) inactivado por calor o con los diversos mutantes de alanina de virus 3S/gp41.
(A) La expresión de NKp44L en células T CD4+ se determinó 17 h post-infección. Los histogramas se seleccionaron en el subconjunto de células T CD4+. La superposición muestra la expresión de NKp44L, en comparación con el control de isotipo IgM. Los números corresponden a la proporción de células positivas.
(B) Desgranulación de células NK autólogas. Células T CD4+ se incubaron con células NK autólogas a una relación E/T: 1/1, en presencia de mAb anti-CD107a. Los gráficos de puntos se seleccionan en células NK CD3-CD56+ en función de la expresión de NKp44 y CD107a. El número en cada uno de los paneles corresponde a la proporción de células NK positivas. A los virus NL4.3 mutados con alanina o los péptidos 3S/gp41 se les alude como S613A, W614A, S615A, N616A, K617A y S618A.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona principalmente composiciones inmunogénicas anti-VIH-1 o de vacuna, cuyas composiciones inmunogénicas o de vacuna comprenden péptidos antigénicos específicos que permiten, en particular, la inducción de anticuerpos anti-VIH-1 ampliamente neutralizantes.
De manera ideal, una vacuna eficaz contra el VIH-1 bloquearía completamente la infección. En realidad, puede ser más realista desarrollar una vacuna segura y eficiente sub-óptima que reduzca significativamente la infección y prevenga el agotamiento de células T CD4+. El objetivo principal de esta estrategia está ligado a la capacidad de generar anticuerpos ampliamente neutralizantes (bNAb, por sus siglas en inglés) que tengan también la capacidad de actuar sobre el agotamiento de células T CD4+, que parecían insuperables en la técnica anterior.
La presente invención proporciona, por lo tanto, nuevas sustancias y composiciones para prevenir y/o tratar la infección de un organismo mamífero, preferiblemente de un organismo humano, por un virus VIH-1.
Se ha encontrado de acuerdo con la invención que una familia de péptidos específicos que comparten una fuerte identidad de secuencia con un péptido conocido derivado de gp41, denominado "3S", inducen in vivo la producción de bNAb anti-VIH-1.
En esta memoria se muestra que estos péptidos específicos generan una actividad neutralizante robusta y amplia contra diversos aislados clínicos del virus VIH-1, en contraste con los péptidos conocidos derivados de la proteína gp41 VIH-1, incluido el conocido péptido "3S" arriba citado.
De manera muy importante, también se ha encontrado de acuerdo con la invención que estos péptidos específicos no desencadenan la sensibilidad de células T CD4+ a la lisis por parte de células NK, aunque todas las funcionalidades de las células NK, incluida la desgranulación, permanecen intactas.
Adicionalmente, los autores de la invención han demostrado que los anticuerpos dirigidos contra estos péptidos específicos bloquean la sensibilidad de las células T CD4+ a la lisis de las células NK que se estimula en el curso de una infección con un virus VIH-1.
La presente invención se refiere a una composición inmunogénica que comprende un péptido antigénico de fórmula (I), el cual, cuando dicha composición inmunogénica se administra a un individuo, aumenta la producción de anticuerpos dirigidos contra dicho péptido de fórmula (I) que están dotados de propiedades neutralizantes frente a una pluralidad de aislados clínicos de VIH-1,
en donde el péptido antigénico de fórmula (I) se selecciona del grupo que consiste en:
• PWNASASNKSLDDIW (SEQ ID N° 12),
• PWNASWANKSLDDIW (SEQ ID N° 13),
• PWNASWSAKSLDDIW (SEQ ID N° 14), y
• PWNASWSNKALDDIW (SEQ ID N° 15).
La presente divulgación también se refiere a un aspecto que no está de acuerdo con la invención y se presenta solo con fines ilustrativos, que es una composición inmunogénica que comprende un péptido antigénico de fórmula (I) que figura a continuación:
Nt-S-X1-X2-X3-K-X4-Ct (I) [Nt-SEQ ID N° 1 -Ct], en donde
• Nt consiste en un péptido que tiene de 0 a 100 aminoácidos de longitud,
• Ct consiste en un péptido que tiene de 0 a 100 aminoácidos de longitud,
• cada uno de los X1 a X4 consiste en un residuo de aminoácido, en donde:
o (i) X1 significa el aminoácido específico W o (ii) X1 significa cualquier residuo de aminoácido, excepto W,
o (i) X2 significa el aminoácido específico S o (ii) X2 significa cualquier residuo de aminoácido, excepto S,
o (i) X3 significa el aminoácido específico N o (ii) X3 significa cualquier residuo de aminoácido, excepto N,
o (i) X4 significa el aminoácido específico S o (ii) X4 significa cualquier residuo de aminoácido, excepto S,
con la condición de que
■ tres de los cuatro residuos de aminoácidos X1, X2, X3 y X4 signifiquen el aminoácido específico definido en su respectivo significado (i) anterior, y
■ el residuo de aminoácido restante entre X1 a X4 signifique cualquier residuo de aminoácido excepto el residuo de aminoácido específico definido en su significado (i),
Con la condición de que que el péptido de fórmula (I) no signifique el péptido de SEQ ID N° 18 divulgado en la solicitud PCT publicada como WO 2011/005289.
El péptido de SEQ ID N° 18 descrito en la solicitud PCT publicada como WO 2011/005289 tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: "Ac-NHNHRIRTNPAIVK(Ac)TENSWSNKAKSICQQQ-NH2" (SEQ ID N° 16 de la presente solicitud de patente).
Un péptido Nt que tiene de 0 a 100 residuos de aminoácidos de longitud abarca péptidos que tienen 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57,58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 y 100 residuos de aminoácidos de longitud/
Un péptido Ct que tiene de 0 a 100 residuos de aminoácidos de longitud abarca péptidos que tienen 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57,58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 y 100 residuos de aminoácidos de longitud/
Como ya se mencionó arriba, un péptido de fórmula (I), cuando se utiliza en una composición inmunogénica, preferiblemente en combinación con uno o más agentes inmuno-adyuvantes, induce la producción de anticuerpos que bloquean la infección de células T CD4+ con virus VIH-1 y/o bloquea la propagación del virus VIH-1 a las células T CD4+ no infectadas, como lo demuestra la producción casi indetectable de p24 por parte de las células T CD4+ que entran en contacto con los virus VIH-1 y los anticuerpos dirigidos contra un péptido de fórmula (I).
Además, a diferencia de otros péptidos derivados del VIH que se han utilizado en la técnica como antígenos del VIH, incluyendo el péptido "3S" (mostrado en la figura 1), un péptido de fórmula (I) no desencadena la expresión de NKp44L en la superficie. de las células T CD4+ y, por lo tanto, no desencadena la destrucción de las células T CD4+ por parte de las células NK.
Aún más, los anticuerpos producidos en un individuo inmunizado con un péptido de fórmula (I) son capaces de bloquear la lisis mediada por NKp44L de células T CD4+ por las células NK, sin afectar a cualquier otra función de las células NK, que incluye la desgranulación.
Por lo tanto, la presente invención proporciona una herramienta terapéutica altamente eficaz que puede utilizarse para la profilaxis y el tratamiento de una infección por un virus VIH-1.
Una composición inmunogénica que se utiliza de acuerdo con la invención comprende un péptido antigénico de fórmula (I), el cual, cuando dicha composición inmunogénica se administra a un individuo, aumenta la producción de anticuerpos dirigidos contra dicho péptido de fórmula (I) que están dotados de propiedades neutralizantes frente a una pluralidad de aislados clínicos de VIH-1, como se muestra en los ejemplos en esta memoria. Como se ilustra adicionalmente en la presente memoria descriptiva, un péptido antigénico de fórmula (I) puede volverse inmunogénico por conjugación con una molécula portadora y/o por combinación con uno o más agentes inmuno-adyuvantes. Una composición inmunogénica que comprende un polipéptido de fórmula (I) puede utilizarse profilácticamente contra una infección por un virus VIH-1 al inducir anticuerpos que reducen drásticamente o incluso bloquean la infección de células CD4 con dicho virus VIH-1.
Una composición inmunogénica que comprende un polipéptido de fórmula (I) puede utilizarse con fines de tratamiento, en un individuo infectado con VIH-1, mediante la inducción de anticuerpos que reducen drásticamente o incluso bloquean la infección de células T CD4+ por virus VIH-1 que ya han sido replicados en el individuo infectado.
Como se muestra en los ejemplos de esta memoria, anticuerpos anti-VIH-1 que se obtienen después de la inmunización de un mamífero con una composición inmunogénica que comprende un péptido antigénico de fórmula (I) consisten en anticuerpos neutralizantes que pueden poseer una CI50 de menos de 20 pg/ml, en un ensayo de células T CD4+-p24.
Típicamente, un ensayo de células T CD4+-p24 comprende las etapas de:
a) preparar una mezcla de ensayo poniendo en contacto un virus VIH-1 capaz de replicarse con una cantidad conocida de los anticuerpos a testar,
b) incubar células T CD4+ activadas por PHA con la mezcla de ensayo obtenida al final de la etapa a), en presencia de IL-2, y
c) determinar la actividad de p24 en los cultivos de células T CD4+ obtenidos al final de la etapa b), y d) determinar el valor CI50 de los anticuerpos testados comparando la actividad de p24 determinada en la etapa c) para la cantidad conocida de anticuerpos añadidos en la etapa a) con la actividad de p24 encontrada en el mismo ensayo en que la etapa a) se realiza en ausencia de anticuerpos anti-VIH.
Generalmente, para realizar el ensayo de neutralización arriba descrito, se realiza una serie de ensayos en los que se utilizan cantidades crecientes conocidas de los anticuerpos testados en la etapa a). En los ejemplos de esta memoria se proporciona una descripción completamente detallada del ensayo de neutralización.
Los resultados obtenidos por los autores de la invención demuestran que una composición inmunogénica que comprende un péptido antigénico de fórmula (I) se puede utilizar con un alto grado de seguridad para el individuo que lo necesite, ya que dicha composición inmunogénica no provoca efectos secundarios indeseables, y en particular no afecta a la funcionalidad de las células T CD4+, a diferencia de los péptidos antigénicos anti-VIH conocidos (p. ej., el péptido "3S" mostrado en la figura 1).
Además, una composición inmunogénica que comprende un péptido antigénico de fórmula (I) es una herramienta terapéutica anti-VIH muy potente, debido a sus actividades pleiotrópicas contra una infección por VIH-1, incluyendo (i) la generación de anticuerpos dotados de una amplia actividad neutralizante contra un cierto número de aislados clínicos de VIH-1 y (ii) el bloqueo de la lisis de las células T CD4+ por parte de las células NK.
Aún más, una composición inmunogénica que comprende un péptido antigénico de fórmula (I) está dotada de una alta selectividad de acción, ya que, ilustrativamente, perjudica exclusivamente a la actividad anti-CD4 de las células NK, sin afectar simultáneamente a una importante función de resistencia inmune antimicrobiana de las células NK tal como la desgranulación.
Entonces, una composición inmunogénica que comprende un polipéptido antigénico de fórmula (I) (i) tiene una actividad anti-VIH-1 al inducir anticuerpos anti-VIH-1 ampliamente neutralizantes y (ii) protege la funcionalidad del sistema inmunológico de un individuo infectado por VIH-1.(a) protegiendo las células T CD4+ de la destrucción y (b) asegurando que las funciones antimicrobianas no específicas del sistema inmunitario permanezcan completamente funcionales.
Péptidos de fórmula (I) se describen en la figura 1, que incluyen (i) "W614A" o "M2" (SEQ ID N° 12 en esta memoria), (ii) "S615A" o "M3" (SEQ ID N° 13 en esta memoria), (iii) "N616A" o "M4" (SEQ ID N° 14 en esta memoria) y (iv) "S618A" o "M6" (SeQ ID N° 15 en esta memoria).
Es importante destacar que, como se muestra en los ejemplos en esta memoria, otros péptidos específicos que tienen una fuerte identidad de aminoácidos con los péptidos de fórmula (I), tales como los denominados S613A (o "M1") y K617A (o "M5") representados en la figura 1 no están dotados de cualquiera de las propiedades anti-VIH de los péptidos de fórmula (I). De manera ilustrativa, los péptidos S613A y K617A (i) no inducen anticuerpos neutralizantes anti-VIH, (ii) desencadenan la expresión de NKp44L por parte de las células CD4 y, por lo tanto, tampoco la sensibilidad de las células T CD4+ a la lisis de las células NK y (iii) no inducen la producción de anticuerpos capaces de reducir o bloquear la sensibilidad de las células T CD4+ a la lisis por parte de las células NK.
De manera altamente sorprendente, los autores de la invención han demostrado que los péptidos S613A y K617A arriba comentados inducen anticuerpos que reconocen bien las secuencias de tipo salvaje expresadas por los virus VIH-1, aunque estos péptidos son incapaces de inducir anticuerpos neutralizantes contra virus VIH-1.
También de manera altamente sorprendente, en los ejemplos de esta memoria se demuestra que los péptidos de fórmula (I) inducen anticuerpos que no reaccionan con las secuencias de tipo salvaje expresadas por virus VIH-1, como se muestra en la Tabla 4. Estos resultados sorprendentes sugieren que los péptidos de fórmula (I) son estructuralmente distintas de las correspondientes secuencias de VIH-1 de tipo salvaje, aunque inducen anticuerpos anti-VIH-1 ampliamente neutralizantes. Estos resultados contrastan claramente con lo que habría esperado el experto en la técnica al buscar compuestos antigénicos para inducir una respuesta inmune eficaz contra una infección por virus VIH-1.
Por otra parte, péptidos que tienen secuencias cercanas a un péptido de fórmula (I), tales como los péptidos S613A y K617A arriba citados, parecen estar estrechamente relacionados estructuralmente con las secuencias del VIH-1 de tipo salvaje y son capaces de inducir anticuerpos que reconocen esas secuencias de tipo salvaje, aunque estos anticuerpos no poseen propiedad anti-HIV-1 alguna.
Los resultados reseñados en esta memoria demuestran que ni (i) la seguridad de un péptido de fórmula (I) ni (ii) las diversas propiedades anti-VIH de los anticuerpos dirigidos contra un péptido de fórmula (I) podrían ser anticipadas por un experto en la técnica.
Además, se espera que un péptido de fórmula (I) posea una estructura espacial lineal.
Los autores de la invención también han demostrado que se pueden encontrar anticuerpos dirigidos contra un péptido de fórmula (I) en un pequeño número de individuos infectados con un virus VIH-1. Se ha encontrado una fuerte correlación entre (i) la presencia de anticuerpos dirigidos contra un péptido de fórmula (I) en estos individuos infectados por el VIH-1 y (ii) una baja carga viral del VIH-1, así como un alto número de células T CD4+. Estos resultados indican claramente la alta eficacia in vivo de los anticuerpos dirigidos contra un péptido de fórmula (I) para prevenir y/o tratar la infección de un individuo por un virus VIH-1.
Los ejemplos de esta memoria también ilustran que virus VIH-1 mutados que codifican una proteína gp41 mutada que porta una de las mutaciones W614A y S618A, que están presentes en realizaciones de péptidos de fórmula (I), tienen una capacidad muy reducida para infectar una línea celular linfoblastoide humana y no desencadenan la expresión de NKp44L por parte de células T CD4+. Estos resultados sugieren que la incapacidad de un péptido de fórmula (I) de inducir la expresión de NKp44L por parte de células T CD4+ también se encuentra en virus completos de VIH-1 que expresan proteínas gp41 variantes específicas.
Tal como se utiliza en esta memoria, la prevención o el tratamiento de una infección de un individuo con un virus VIH-1 abarca (i) prevenir o tratar una enfermedad relacionada con una infección de dicho individuo con un virus VIH-1, incluyendo el SIDA y (ii) prevenir la progresión de la enfermedad del VIH-1.
Tal como se utiliza en esta memoria, "infección por VIH" abarca generalmente la infección de un animal huésped, particularmente un huésped humano, por el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1). "VIH-1" puede utilizarse en esta memoria para referirse a cualquier cepa, forma, subtipo, clado y variación en la familia del VIH-1. Por lo tanto, el tratamiento de la infección por el VIH-1 abarcará el tratamiento de una persona que sea portadora de cualquiera de los retrovirus de la familia del VIH-1 o una persona a la que se le haya diagnosticado SIDA activo, así como el tratamiento o la profilaxis de las afecciones relacionadas con el SIDA en personas de este tipo. Un portador de VIH-1 puede identificarse mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, una persona puede ser identificada como portadora de VIH-1 sobre la base de que la persona es positiva para anticuerpos anti-VIH-1, o es VIH-1 positiva, o tiene síntomas de SIDA. Es decir, "tratar la infección por VIH-1" debe entenderse como tratar a un paciente que se encuentra en cualquiera de las varias etapas de progresión de la infección por VIH-1, las cuales, por ejemplo, incluyen el síndrome de infección primaria aguda (que puede ser asintomático o estar asociado con una enfermedad similar a la gripe con fiebre, malestar general, diarrea y síntomas neurológicos tales como dolor de cabeza), infección asintomática (que es el largo período de latencia con una disminución gradual en el número de células T CD4+ circulantes) y SIDA (que se define por enfermedades más graves que definen el SIDA y/o una disminución en el recuento de células CD4 circulantes por debajo de un nivel compatible con una función inmunológica efectiva). Además, "tratar o prevenir la infección por el VIH-1" también abarcará el tratamiento de la sospecha de infección por el VIH-1 después de una supuesta exposición pasada al VIH-1, p. ej., contacto con sangre contaminada con el VIH-1, transfusión de sangre, intercambio de fluidos corporales, sexo "no seguro" con una persona infectada, pinchazo accidental con una aguja, tatuaje o acupuntura con instrumentos contaminados, o transmisión del virus de una madre a un bebé durante el embarazo, el parto o poco tiempo después.
La expresión "tratamiento de la infección por VIH-1" también debe entenderse en el contexto de las terapias antirretrovirales, ya sea que los pacientes respondan total o parcialmente a dichas terapias en términos de carga viral y/o recuento de células T CD4.
La expresión "prevención de la infección por VIH-1" puede abarcar el tratamiento de una persona que está libre de infección por VIH-1 pero que se cree que,, tarde o temprano, está en riesgo de infección por VIH-1.
La expresión "tratar el SIDA" significa tratar a un paciente que exhibe enfermedades definitorias de SIDA más graves y/o una disminución en el recuento de células T CD4+ circulantes por debajo de un nivel compatible con una función inmunitaria eficaz. El término "tratar el SIDA" también incluye el tratamiento de afecciones relacionadas con el SIDA, lo que significa trastornos y enfermedades incidentales o asociados con el SIDA o la infección por VIH-1, tal como el complejo relacionado con el SIDA (ARC, por sus siglas en inglés), la linfadenopatía progresiva generalizada (PGL), condiciones positivas para anticuerpos anti-VIH y condiciones positivas para el VIH, condiciones neurológicas relacionadas con el SIDA (tales como demencia o paraparesia tropical), sarcoma de Kaposi, trombocitopenia purpúrea e infecciones oportunistas asociadas tales como neumonía por Pneumocystis carinii, tuberculosis micobacteriana, candidiasis esofágica, toxoplasmosis del cerebro, retinitis por CMV, encefalopatía relacionada con el VIH, síndrome de emaciación relacionado con el VIH-1, etc.
Por lo tanto, la expresión "prevención del SIDA", tal como se utiliza en esta memoria, significa prevenir que un paciente que tiene una infección por el VIH-1 o se sospecha que tiene una infección por el VIH-1 o que está en riesgo de una infección por el VIH-1 desarrolle SIDA (que se caracteriza por enfermedades que definen el SIDA más graves y/o por una disminución en el recuento de células T CD4+ circulantes por debajo de un nivel que sea compatible con una función inmunológica eficaz) y/o afecciones relacionadas con el SIDA.
Por lo tanto, la expresión "prevenir la progresión del VIH-1" tal como se utiliza en esta memoria, significa prevenir en un paciente que tiene una infección por VIH-1, la disminución de su recuento de células T CD4+ y/o prevenir el aumento de su carga viral, los dos principales marcadores vinculados a la complicación de la enfermedad y a un incremento de la gravedad de la enfermedad.
Tal como se utiliza en esta memoria, residuos de aminoácidos abarcan Alanina (también denominada "A" o "Ala"), Arginina (también denominada ("R" o "Arg"), Asparagina (también denominada "N" o "Asn"), Ácido Aspártico (también denominado "D" o "Asp"), Cisteína (también denominada "C" o "Cys"), Glutamina (también denominada "Q" o "Gln"), Ácido Glutámico (también denominado ("E" o "Glu"), Glicina (también denominada "G" o "Gly"), Histidina (también denominada "H" o "His"), Isoleucina (también denominada "I" o "Ile"), Leucina (también denominada "L" o "Leu"), Lisina (también denominada "K" o "Lys"), Metionina (también denominada "M" o "Met"), Fenilalanina (también denominada ("F" o "Phe"), Prolina (también denominada "P" o "Pro"), Serina (también denominada "S" o "Ser"), Treonina (también denominada "T" o "Thr"), Triptófano (también denominado "W" o "Trp"), Tirosina (también denominada "Y" o "Tyr") y Valina (también denominada "V" o "Val").
Todos los aminoácidos en los péptidos de la invención pueden estar tanto en forma D como L, aunque se prefiere la forma L que se produce de forma natural.
Por lo tanto, los siguientes aspectos no están de acuerdo con la invención y están presentes solo con fines ilustrativos, cuando el residuo de aminoácido X1 significa (ii) cualquier resto de aminoácido excepto W, entonces el residuo de aminoácido X1 puede significar uno cualquiera de los residuos de aminoácidos A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, T, S, Y o V. El mismo razonamiento se utiliza para los significados de cualquiera de los residuos de aminoácidos X1, X2, X3 y X4 del péptido antigénico de fórmula (I).
Sin desear estar ligados por teoría particular alguna, los autores de la invención creen que un péptido de fórmula (I) es espacialmente lineal cuando se suspende en una solución salina fisiológicamente compatible (p. ej., una solución de NaCl 0,15 M).
Por lo tanto, en algunas realizaciones de un péptido de fórmula (I) fuera de la invención, el significado (ii) de cada uno de los residuos de aminoácidos X1, X2, X3 y X4 consiste en un residuo de aminoácido que no genera un cambio de conformación espacial, en comparación con el residuo de aminoácido de significado (i) de X1, X2, X3 y X4, respectivamente.
En algunas realizaciones de un péptido de fórmula (I) fuera de la invención, el significado (ii) de cada uno de los residuos de aminoácido X1, X2, X3 y X4 consiste en un residuo de aminoácido sin carga, de tamaño pequeño.
En algunas realizaciones de un péptido de fórmula (I) fuera de la invención, el significado (ii) de cada uno de los residuos de aminoácidos X1, X2, X3 y X4 se selecciona del grupo que consiste en Alanina (Ala o A), Cisteína (Cys o C), Glicina (Gly o G) y Valina (Val o V).
En algunas realizaciones de un péptido de fórmula (I) fuera de la invención, el significado (ii) de cada uno de los residuos de aminoácidos X1, X2, X3 y X4 se selecciona del grupo que consiste en Alanina (Ala o A), Cisteína (Cys o C), Glicina (Gly o G), Valina (Val o V) y Prolina (Pro o P).
En algunas realizaciones de un péptido de fórmula (I) fuera de la invención, el significado (ii) de cada uno de los residuos de aminoácido X1, X2, X3 y X4 consiste en un residuo de aminoácido sin carga, de tamaño pequeño que tiene una cadena lateral no polar. Algunos residuos de aminoácidos sin carga, de tamaño pequeño, fuera de la invención se seleccionan del grupo que consiste en Glicina (Gly o G), Alanina (Ala o A), Valina (Val o V), Leucina (Leu o L), Isoleucina (Ile o I), Metionina (Met o M), Fenilalanina (Phe o F), Prolina (Pro o P) y Triptófano (Trp o W). Más preferiblemente, los residuos de aminoácidos sin carga, de tamaño pequeño, que tienen una cadena lateral no polar se seleccionan del grupo que consiste en Glicina (Gly o G), Alanina (Ala o A), Valina (Val o V), Leucina (Leu o L), Isoleucina (Ile o I), Prolina (Pro o P) y Metionina (Met o M). En otras realizaciones fuera de la invención, los residuos de aminoácidos sin carga, de tamaño pequeño, que tienen una cadena lateral no polar se seleccionan del grupo que consiste en Glicina (Gly o G), Alanina (Ala o A), Valina (Val o V), Leucina (Leu o L), Isoleucina (Ile o I) y Metionina (Met o M).
En algunas de estas realizaciones fuera de la invención, el significado (ii) de cada uno de los residuos de aminoácidos X1, X2, X3 y X4 se selecciona del grupo que consiste en Alanina (Ala), Glicina (Gly o G) y Valina (Val o V).
En algunas realizaciones de un péptido de fórmula (I) fuera de la invención, el significado (ii) de cada uno de los residuos de aminoácido X1, X2, X3 y X4 consiste en un residuo de Alanina (Ala o A).
En algunas realizaciones de un péptido de fórmula (I) fuera de la invención, cada uno de los cuatro residuos de aminoácido X1, X2, X3 y X4 designan su significado (ii).
En algunas realizaciones de un péptido de fórmula (I) fuera de la invención, tres residuos de aminoácidos entre X1, X2, X3 y X4 designan, uno independientemente de los otros dos, su significado (ii) y el cuarto residuo de aminoácido entre X1, X2, X3 y X4 designa su significado (i).
En algunas realizaciones de un péptido de fórmula (I) fuera de la invención, dos residuos de aminoácidos entre X1, X2, X3 y X4 designan, uno independientemente del otro, su significado (ii) y los otros dos residuos de aminoácidos entre X1, X2, X3 y X4 designa, uno independientemente del otro, su significado (i).
En realizaciones de un péptido de fórmula (I) fuera de la invención, solo un residuo de aminoácido entre X1, X2, X3 y X4 designa el significado (ii) y cada uno de los otros residuos de aminoácido entre X1, X2, X3 y X4 designa su significado (i).
Por lo tanto, en algunas realizaciones de un péptido de fórmula (I) fuera de la invención,
• X1 designa el significado (ii) anterior y cada uno de X2, X3 y X4 designa su respectivo significado (i) anterior, o
• X2 designa el significado (ii) anterior y cada uno de X1, X3 y X4 designa su respectivo significado (i) anterior, o
• X3 designa el significado (ii) anterior y cada uno de X1, X2 y X4 designa su respectivo significado (i) anterior, o
• X4 designa el significado (ii) anterior y cada uno de X1, X2 y X3 designa su respectivo significado (i) anterior.
Las realizaciones anteriores fuera de la invención son las más preferidas, ya que se cree que un solo cambio de aminoácido (es decir, un solo residuo de aminoácido que designa el significado (ii)) entre X1, X2, X3 y X4 minimizará el riesgo de un cambio de conformación espacial. en comparación con un péptido en el que todos los residuos X1, X2, X3 y X4 indican su significado respectivo (i) y, por lo tanto, aumentarán las posibilidades de inducir buenas propiedades anti-VIH, es decir, inducir la producción de anticuerpos anti-VIH neutralizantes.
En aún realizaciones adicionales de un péptido antigénico de fórmula (I) fuera de la invención, dicho péptido antigénico tiene una longitud de aminoácidos no superior a 200 residuos de aminoácidos. Estas realizaciones abarcan péptidos de fórmula (I) que tienen 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57,58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106,107, 108, 109, 110,111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157,158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199 y 200 residuos de aminoácidos de longitud. En algunas de estas realizaciones preferidas, un péptido de fórmula (I) tiene una longitud de 10 a 26 residuos de aminoácidos, que incluye una longitud de 15 a 20 residuos de aminoácidos.
Un péptido de fórmula (I) de la invención como se describe en esta memoria se puede producir mediante una tecnología de clonación conocida o mediante síntesis química.
Por ejemplo, el ADN que codifica un péptido de fórmula (I) se prepara mediante el uso de una tecnología de clonación y se inserta en un vector replicable de forma autónoma para preparar un ADN recombinante. El ADN recombinante se introduce en un huésped apropiado, tal como Escherichia coli, Bacillus subtilis, Actinomyces, levadura, hongo filamentoso, una célula vegetal, una célula de insecto y una célula animal, para obtener un transformante. A partir del producto cultivado del transformante, se puede obtener un péptido que contiene un péptido de fórmula (I). Alternativamente, el ADN que codifica un péptido de fórmula (I) se prepara y se somete a un sistema de síntesis de proteínas acelular utilizando germen de trigo y un extracto celular de Escherichia coli, para sintetizar el péptido de la invención. En algunas realizaciones en las que el péptido de fórmula (I) está enlazado a una proteína portadora, entonces se puede sintetizar mediante una técnica de ADN recombinante un producto inmunogénico que consiste en una proteína de fusión que contiene tanto un péptido de fórmula (I) como la proteína portadora deseada.
Además, utilizando un método de síntesis química habitual para un péptido de fórmula (I), tal como un "método de fase sólida" o "un método de fase líquida", los aminoácidos se conectan y extienden sucesivamente por deshidratación/condensación.
Además, cuando un péptido de fórmula (I) se enlaza a un péptido o polipéptido deseado, p. ej., una molécula portadora de proteína, se puede sintetizar un producto inmunogénico que comprende el péptido antigénico de fórmula (I).
En la siguiente realización, que no está de acuerdo con la invención y que se presenta únicamente con fines ilustrativos, un péptido de fórmula (I) puede abarcar los siguientes péptidos antigénicos:
• Nt-S-X-S-N-K-S- Ct (Ia) -(Nt-SEQ ID N°2-Ct),
• Nt-S-W-X-N-K-S- Ct (Ib) -(Nt-SEQ ID N° 3-Ct),
• Nt-S-W-S-X-K-S- Ct (Ic) -(Nt-SEQ ID N° 4-Ct), y
• Nt-S-W-S-N-K-X- Ct (Id) -(Nt-SEQ ID N° 5-Ct),
en donde:
• Nt y Ct tienen el mismo significado que para el péptido de fórmula (I) arriba definido, y
• X es cualquier residuo de aminoácido excepto: W para (Ia), S para (Ib), N para (Ic) y S para (Id).
En determinadas realizaciones de un péptido de fórmula (I), dicho "cualquier residuo de aminoácido" es un residuo de alanina (también denominado "A"). En esas realizaciones, el resto de aminoácido "X" de cada uno de los péptidos de fórmulas (Ia) a (Id) significa "A".
En la siguiente realización, que no está de acuerdo con la invención y que se presenta únicamente con fines ilustrativos, el péptido de fórmula (I) fuera de la invención se selecciona del grupo que consiste en:
• Nt-SASNKS-Ct (Nt-SEQ ID N° 6-Ct),
• Nt-SWANKS-Ct (Nt-SEQ ID N° 7-Ct),
• Nt-SWSAKS-Ct (Nt-SEQ ID N° 8-Ct), y
• Nt-SWSNKA-Ct (Nt-SEQ ID N° 9-Ct).
En determinadas realizaciones de un péptido antigénico de fórmula (I) fuera de la invención, Nt (para región "N-terminal") consiste en un péptido que tiene de 1 a 10 residuos de aminoácidos de longitud, que incluye de 1 a 5 aminoácidos residuos de longitud. Por lo tanto, de acuerdo con estas realizaciones, Nt es un péptido que tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 residuos de aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, Nt tiene 5 o 6 residuos de aminoácidos de longitud.
En determinadas realizaciones de un péptido de fórmula (I) fuera de la invención, Nt comprende, o alternativamente consiste en la secuencia de aminoácidos NH2-PWNA-COOH [SEQ ID N° 10].
En determinadas realizaciones de un péptido antigénico de fórmula (I) fuera de la invención, Ct (para región "C-terminal") consiste en un péptido que tiene de 1 a 10 residuos de aminoácidos de longitud, que incluye de 1 a 5 aminoácidos residuos de longitud. Por lo tanto, de acuerdo con estas realizaciones, Ct es un péptido que tiene 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 residuos de aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, Ct tiene 5 o 6 residuos de aminoácidos de longitud.
En determinadas realizaciones de un péptido de fórmula (I) fuera de la invención, Ct comprende, o alternativamente consiste en la secuencia de aminoácidos NH2-LDDIW-COOH [SEQ ID N° 11].
Cada uno de los péptidos Nt y Ct está directamente enlazado por un enlace covalente al extremo correspondiente del péptido S-X1-X2-X3-K-X4, preferiblemente por un enlace peptídico convencional.
En una composición inmunogénica fuera de la invención, uno de los péptidos Nt o Ct, o ambos, puede comprender, o consistir en un polímero de un solo monómero de aminoácido. Ilustrativamente, dicho polímero de aminoácido puede consistir en un polímero de poli-alanina, un polímero de poli-glutamina o un polímero de poli-lisina.
Los extremos C- y/o N-terminales de un péptido de fórmula (I) fuera de la invención podrían desviarse de las secuencias naturales expresamente especificadas en esta memoria mediante la modificación del grupo NH2 terminal y/o el grupo COOH y/o por modificación de un grupo NH2 y/o un grupo COOH de una cadena lateral de un residuo de aminoácido contenido en la misma. Estos grupos pueden, por ejemplo, acilarse, acetilarse, amidarse o modificarse para proporcionar un sitio de unión para una molécula portadora.
En realizaciones, el péptido antigénico de la invención se selecciona del grupo que consiste en:
• PWNASASNKSLDDIW (SEQ ID N° 12),
• PWNASWANKSLDDIW (SEQ ID N° 13),
• PWNASWSAKSLDDIW (SEQ ID N° 14), y
• PWNASWSNKALDDIW (SEQ ID N° 15),
En determinadas realizaciones de una composición inmunogénica de acuerdo con la invención, el péptido antigénico de fórmula (I) está enlazado de forma covalente a una molécula portadora.
Los tipos de moléculas portadoras utilizadas para generar un producto inmunogénico que comprende un polipéptido de fórmula (I) enlazado a una molécula portadora son bien conocidos por los expertos en la técnica. La función de la molécula portadora es proporcionar ayuda a citoquinas (o ayuda a células T) con el fin de potenciar la respuesta inmune contra el VIH-1.
La molécula portadora a la que se une opcionalmente el péptido se puede seleccionar de una amplia variedad de portadores conocidos. Ejemplos de moléculas portadoras para fines de vacunas abarcan proteínas tales como albúmina sérica humana o bovina y hemocianina de lapa bocallave (KLH) y ácidos grasos. Otras realizaciones de moléculas portadoras a las que se puede enlazar covalentemente un péptido antigénico de fórmula (I) incluyen toxinas o toxoides bacterianos, tales como toxoides de difteria, cólera, E. co litermolábiles o toxoides tetánicos, la proteína de membrana externa de N. meninigitidis (solicitud de patente europea n° EP0372501), péptidos sintéticos (solicitudes de patente europea n°EP0378881 y n° EP0427347), proteínas de choque térmico (solicitud PCT n° WO93/17712), proteínas de Pertussis (solicitud PCT n° WO98/58668), proteína D de H. influenzae (solicitud PCT n° WO00/56360) y la toxina A o B de C. difficile (solicitud de patente internacional WO00/61761).
Puede utilizarse cualquier reacción de conjugación adecuada, con cualquier enlazador adecuado cuando sea necesario. Ejemplos de esta memoria ilustran realizaciones de una composición inmunogénica en la que los péptidos de fórmula (I) están enlazados covalentemente a una molécula portadora de KLH.
La presente divulgación también se refiere a un aspecto que no está de acuerdo con la invención, que es un péptido antigénico de fórmula (I) como se describe en esta memoria, opcionalmente unido de forma covalente a una molécula portadora, para uso como un medicamento, incluyendo para uso como un ingrediente inmunogénico activo de un medicamento.
Esta divulgación también se refiere a un aspecto que no está de acuerdo con la invención, que es un péptido antigénico de fórmula (I) como se describe en esta memoria, opcionalmente unido de forma covalente a una molécula portadora, para uso en un método para prevenir y/o tratar una infección de un individuo con un virus VIH-1.
La presente divulgación también se refiere a un aspecto que no está de acuerdo con la invención, que es el uso de un polipéptido antigénico de fórmula (I), opcionalmente unido covalentemente a una molécula portadora, para fabricar un fármaco para prevenir y/o tratar a un individuo infectado por el VIH-1, es decir, para prevenir y/o tratar una infección de un individuo con un virus VIH-1.
La presente divulgación también se ocupa de un aspecto que no está de acuerdo con la invención que es para uso en un método para prevenir y/o tratar a un individuo infectado con un virus VIH-1, es decir, para prevenir y/o tratar una infección de un individuo con un virus VIH-1, que comprende una etapa de administrar una composición inmunogénica que comprende un péptido antigénico de fórmula (I), preferiblemente enlazado a una molécula portadora, a dicho individuo.
En determinadas realizaciones que no están de acuerdo con la invención y que se presentan únicamente con fines ilustrativos, una composición inmunogénica utilizada de acuerdo con la invención comprende un péptido antigénico de fórmula (I) en una cantidad que se adapta a la administración de 10 ng a 1 mg de un péptido de fórmula (I) a un individuo que lo necesite, con fines profilácticos o terapéuticos.
Una cantidad de un péptido antigénico de fórmula (I) de 10 ng a 10 mg abarca una cantidad de péptido de fórmula (I) de aproximadamente 20 ng, 30 ng, 40 ng, 50 ng, 60 ng, 70 ng, 80 ng, 90 ng, 100 ng, 150 ng, 200 ng, 250 ng, 300 ng, 350 ng, 400 ng, 450 ng, 500 ng, 550 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, 1 gg, 2 gg, 3 gg, 4 gg, 5 gg, 6 gg, 7 gg, 8 gg, 9 gg, 10 gg, 20 gg, 30 gg, 40 gg, 50 gg, 60 gg, 70 gg, 80 gg, 90 gg, 100 gg, 110 gg, 120 gg, 130 gg, 140 gg, 150 gg, 160 gg, 170 gg, 180 gg, 190 gg, 200 gg, 250 gg, 300 gg, 350 gg, 400 gg,
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450 gg, 500 gg, 550 gg, 600 gg, 650 gg, 700 gg, 750 gg, 800 gg, 850 gg, 900 gg, 950 gg y 1 mg.
La cantidad de un péptido de fórmula (I) seleccionado del grupo de péptidos de SEQ ID N° 12, 13, 14 o 15 puede ser particularmente de aproximadamente 200 gg, 500 gg o 1 mg.
El experto en la técnica puede adaptar fácilmente la cantidad de un péptido de fórmula (I) realizando ensayos de rutina y determinando el intervalo de cantidades de péptido que, cuando se administra in vivo, induce una respuesta de anticuerpos que bloquea la infección de células T CD4+ con un virus VIH-1 y/o bloquea la propagación de un virus VIH-1 a células T CD4+ no infectadas, utilizando ensayos conocidos, que incluyen uno o más de los ensayos descritos en los ejemplos de esta memoria.
Particularmente, la cantidad de péptido de fórmula (I) puede variar en función de su longitud de aminoácidos y, por lo tanto, en función de su masa molecular, teniendo en cuenta que la relación del número de secuencias "S-X1-X2-X3-K -X4" por peso de un péptido de fórmula (I) varía con la longitud de los péptidos Ct y Nt contenidos en dicho péptido de fórmula (I) y, por lo tanto, varía con la masa molecular de dicho péptido.
También, en realizaciones preferidas en las que el péptido antigénico de fórmula (I) está unido a una molécula portadora, y en las que al paciente se le administra un compuesto inmunogénico que comprende, o consiste en dicho péptido de fórmula (I) unido a dicha molécula portadora, la cantidad de péptido inmunogénico a administrar puede variar tanto con (i) la masa molecular del péptido de fórmula (I) como (ii) la masa molecular de la molécula portadora que se utiliza.
La cantidad de un compuesto inmunogénico que se ha de administrar a un individuo la determina o adapta fácilmente el experto en la técnica, que se guía principalmente por el intervalo de cantidades efectivas de un péptido de fórmula (I), que incluye el intervalo de cantidades efectivas de un péptido de fórmula (I) seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID N° 12-15), y luego por la masa molecular del compuesto inmunogénico que pretende administrar.
En algunas realizaciones, la cantidad de péptido inmunogénico a administrar puede ser de aproximadamente 0,1 gg, 0,5 gg, 1 gg, 5 gg, 10 gg o 20 gg de dicho compuesto inmunogénico.
La cantidad de un péptido de fórmula (I) puede ser a lo sumo de 10.000 mg de un péptido de fórmula (I).
La cantidad de un péptido de fórmula (I) arriba especificada también se aplica cuando dicho péptido de fórmula (I) está conjugado con una molécula portadora, en una composición inmunogénica de acuerdo con la invención.
Ilustrativamente, cuando se utiliza en individuos humanos, una composición inmunogénica que comprende un péptido de fórmula (I) conjugado con la molécula portadora de KLH puede contener de 0,1 gg a 50 gg del producto inmunogénico conjugado KLH-péptido de fórmula (I).
En determinadas realizaciones, una composición inmunogénica se administra al menos dos veces a un individuo que la necesita. En estas realizaciones, la segundo etapa de administración de una composición inmunogénica de acuerdo con la invención se realiza en un período de tiempo de 2 semanas a 6 meses después de la primera etapa de administración.
En determinadas realizaciones, una composición inmunogénica se administra al menos tres veces a un individuo que la necesita. En estas realizaciones, la segunda etapa de administración de dicha composición inmunogénica de acuerdo con la invención se realiza en un período de tiempo de 2 semanas a 6 meses después de la primera etapa de administración. En estas realizaciones, la tercera etapa de administración de una composición inmunogénica de acuerdo con la invención se realiza en un período de tiempo de más de 6 meses a aproximadamente un año después de la primera etapa de administración.
En algunas realizaciones, dicha composición inmunogénica se administra entonces de nuevo a un individuo inmunizado, por ejemplo, un período de tiempo de cada 5 años o un período de tiempo de cada 10 años.
La presente invención también se refiere a composiciones inmunogénicas que comprenden un polipéptido antigénico de fórmula (I) como se describe en esta memoria.
En determinadas realizaciones, el péptido antigénico de fórmula (I) está enlazado de forma covalente a una molécula portadora.
En determinadas realizaciones, una composición inmunogénica de acuerdo con la invención comprende, además, uno o más agentes inmuno-adyuvantes.
Una composición inmunogénica como se define en esta memoria que comprende un producto inmunogénico que comprende un péptido de fórmula (I), preferiblemente un producto inmunogénico que consiste en un conjugado entre dicho péptido de fórmula (I) y una molécula portadora y que, además, comprende uno o más compuestos inmunoadyuvantes, también pueden denominarse una "composición de vacuna" en la presente memoria descriptiva.
En algunas realizaciones, no se debe hacer una distinción específica entre una composición inmunogénica de acuerdo con la divulgación y una composición de vacuna de acuerdo con la divulgación, más allá de los términos y expresiones empleados para designar composiciones de este tipo.
Más precisamente, una composición inmunogénica está destinada a generar anticuerpos dirigidos contra un péptido de fórmula (I) cuando se administra a un organismo mamífero, p. ej., un organismo de ratón, conejo, oveja, caballo o cabra, en situaciones en las que el no se espera que los anticuerpos generados ejerzan un efecto preventivo o terapéutico en el organismo mamífero inmunizado. Composiciones inmunogénicas de acuerdo con la invención se pueden utilizar para producir anticuerpos dirigidos contra un péptido de fórmula (I), para un uso no terapéutico adicional de estos anticuerpos, p. ej., como un reactivo de detección del virus VIH-1 o un reactivo de detección del péptido derivado de VIH-1.
Por otra parte, una composición de vacuna de acuerdo con la invención está dirigida a generar anticuerpos dirigidos contra un péptido de fórmula (I) en el organismo mamífero al que se le administra dicha composición de vacuna, en situaciones en las que no se espera que los anticuerpos generados ejerzan un efecto un efecto preventivo o terapéutico en el organismo mamífero inmunizado.
Agentes inmuno-adyuvantes abarcan, pero no se limitan a, Stimulon™, QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, Mass.); MPL™ (monofosforil lípido A 3-O-desacilado; Corixa, Hamilton, Mont.), 529 (un compuesto de fosfato de amino alquil glucosamina, Corixa, Hamilton, Mont.), IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, Mont.); GM-CSF (Immunex Corp., Seattle, Washington); N-acetil-muramil-L-teronil- D-isoglutamina (thr-MDP); N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637, a la que se alude como nor-MDP); N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1 ’-2’-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi-etilamina) (CGP 19835A, a la que se alude como MTP-PE); y toxina del cólera. Otros agentes o compuestos inmuno-adyuvantes que pueden utilizarse abarcan derivados no tóxicos de la toxina del cólera, incluida su subunidad A, y/o conjugados o fusiones modificadas genéticamente del polipéptido de N. meningitidis con la toxina del cólera o su subunidad B ("CTB"), procoleragenoide, polisacáridos fúngicos, incluyendo esquizofilano, dipéptido de muramilo, derivados de dipéptido de muramilo ("MDP"), ésteres de forbol, la toxina termolábil de E. coli, polímeros de bloques o saponinas.
Los ejemplos en esta memoria ilustran una composición de vacuna que comprende (i) un conjugado entre KLH y un péptido de fórmula (I) como producto inmunogénico y (ii) el adyuvante incompleto de Freund como el agente inmunoadyuvante.
La formulación de composiciones inmunogénicas de este tipo es bien conocida por las personas expertas en la técnica. Las composiciones inmunogénicas de la invención incluyen preferiblemente un portador farmacéuticamente aceptable. Portadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, cargas, portadores sólidos, soluciones acuosas, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, isotónicos y agentes retardadores de la absorción, y similares. Portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, por ejemplo, uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. Portadores farmacéuticamente aceptables pueden comprender, además, cantidades menores de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian la vida útil o la eficacia del anticuerpo. La preparación y el uso de portadores farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones inmunogénicas de la presente invención.
Composiciones inmunogénicas de este tipo pueden administrarse por vía parenteral, p. ej., mediante inyección, por vía subcutánea o intramuscular, así como por vía oral o intranasal. Otros modos de administración emplean formulaciones orales, formulaciones pulmonares, supositorios y aplicaciones transdérmicas, por ejemplo, sin limitación. Las formulaciones orales, por ejemplo, incluyen excipientes empleados normalmente, tales como, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares, sin limitación.
La presente invención también pertenece a una composición de vacuna que comprende un polipéptido antigénico de fórmula (I) descrito en esta memoria en combinación con uno o más compuestos inmuno-adyuvantes.
La presente invención también se refiere a una composición de vacuna que comprende (i) un producto inmunogénico que comprende un péptido de fórmula (I) que se combina con (ii) uno o más compuestos inmuno-adyuvantes.
Generalmente, una composición inmunogénica o de vacuna de acuerdo con la invención comprende 1, 2, 3, 4 o a lo sumo 5 compuestos inmuno-adyuvantes distintos.
En realizaciones preferidas, una composición inmunogénica o de vacuna de acuerdo con la invención comprende 1 o 2 compuestos inmuno-adyuvantes distintos.
En algunas realizaciones de una composición inmunogénica o de vacuna, que no están de acuerdo con la invención y que se presentan únicamente con fines ilustrativos, el péptido de fórmula (I) puede seleccionarse del grupo que consiste en:
• Nt-SASNKS-Ct (Nt-SEQ ID N° 6-Ct),
• Nt-SWANKS-Ct (Nt-SEQ ID N° 7-Ct),
• Nt-SWSAKS-Ct (Nt-SEQ ID N° 8-Ct), y
• Nt-SWSNKA-Ct (Nt-SEQ ID N° 9-Ct),
En realizaciones de una composición inmunogénica o de vacuna de la invención, el péptido antigénico de fórmula (I) se selecciona del grupo que consiste en:
• PWNASASNKSLDDIW (SEQ ID N° 12),
• PWNASWANKSLDDIW (SEQ ID N° 13),
• PWNASWSAKSLDDIW (SEQ ID N° 14), y
• PWNASWSNKALDDIW (SEQ ID N° 15).
En algunas realizaciones preferidas, el péptido antigénico de fórmula (I) está enlazado de forma covalente a una molécula portadora.
La presente divulgación también se refiere a un aspecto que no está de acuerdo con la invención y que se presenta únicamente con fines ilustrativos, es decir, un péptido antigénico de fórmula (I) como se describe ampliamente en la presente memoria descriptiva, como agente activo de una composición de vacuna destinada a prevenir y/o tratar a un individuo infectado por el VIH-1.
Más generalmente, la presente invención también se refiere a un péptido antigénico de fórmula (I) per se, como se describe en la presente memoria descriptiva.
Anticuerpos dirigidos contra un péptido de fórmula (I)
Como se ha comentado ampliamente e ilustrado experimentalmente en esta memoria, la inmunización de un individuo con una composición inmunogénica que comprende un péptido de fórmula (I) induce la producción de anticuerpos anti-VIH-1 ampliamente neutralizantes. Estos anticuerpos anti-HIV-1 ampliamente neutralizantes se pueden utilizar como agentes anti-HIV-1 activos.
Los anticuerpos dirigidos contra un péptido de fórmula (I) pueden utilizarse con fines de prevención del VIH-1 o terapéuticos del VIH-1, así como con fines de diagnóstico del VIH-1.
En algunas realizaciones, los anticuerpos dirigidos contra un péptido de fórmula (I) consisten en anticuerpos producidos después de la inmunización de un mamífero, incluyendo un ser humano, con una composición inmunogénica que comprende un péptido de fórmula (I) como se describe en esta memoria.
En algunas realizaciones, los anticuerpos dirigidos contra un péptido de fórmula (I) se obtienen de individuos infectados con VIH-1 que han generado una respuesta inmune contra el VIH-1.
En las dos realizaciones anteriores, dichos anticuerpos pueden obtenerse mediante la purificación de una muestra, especialmente una muestra de sangre, recogida de dicho mamífero, incluyendo dicho ser humano.
En las dos realizaciones anteriores, dichos anticuerpos también se pueden obtener mediante la clonación del material de ADN relevante que los codifica, partiendo, por ejemplo, de células B obtenidas de dicho mamífero, incluyendo dicho ser humano.
En las dos realizaciones anteriores, dichos anticuerpos también se pueden obtener secuenciando las secuencias de aminoácidos de dichos anticuerpos recogidos de dicho mamífero, incluyendo dicho ser humano, y luego sintetizando una molécula de ADN que codifica dicho anticuerpo o una porción del mismo que comprende la CDR del mismo, para producir anticuerpos recombinantes relevantes dirigidos contra un péptido de fórmula (I).
La presente invención también trata de anticuerpos dirigidos contra un péptido de fórmula (I) como se describe en esta memoria.
En algunas realizaciones que no están de acuerdo con la invención, los anticuerpos descritos pueden estar dirigidos contra un péptido de fórmula (I) fuera de la invención, seleccionado del grupo que consiste en:
• Nt-SASNKS-Ct (Nt-SEQ ID N° 6-Ct),
• Nt-SWANKS-Ct (Nt-SEQ ID N° 7-Ct),
• Nt-SWSAKS-Ct (Nt-SEQ ID N° 8-Ct), y
• Nt-SWSNKA-Ct (Nt-SEQ ID N° 9-Ct.
Dichos anticuerpos están dirigidos contra un péptido de fórmula (I) seleccionado del grupo que consiste en:
• PWNASASNKSLDDIW (SEQ ID N° 12),
• PWNASWANKSLDDIW (SEQ ID N° 13),
• PWNASWSAKSLDDIW (SEQ ID N° 14), y
• PWNASWSNKALDDIW (SEQ ID N° 15).
La preparación de anticuerpos dirigidos contra un péptido de fórmula (I) mediante inmunización con una composición inmunogénica que comprende un péptido de fórmula (I) se describe en particular en los Ejemplos de esta memoria. Alternativamente, los anticuerpos dirigidos contra un péptido de fórmula (I) pueden recogerse de pacientes infectados con VIH-1 que ya albergan de forma natural anticuerpos de este tipo; también pueden obtenerse tras la inmortalización de los linfocitos B humanos que los producen; su ADNc también se puede clonar y utilizar adicionalmente para producirlos o sus derivados a través de la tecnología de ADN recombinante.
La presente divulgación también trata de un aspecto que no está de acuerdo con la invención y que se presenta únicamente con fines ilustrativos, que es el uso de anticuerpos anti-VIH-1 obtenidos de un individuo inmunizado con una composición inmunogénica descrita en esta memoria, para fabricar un medicamento para prevenir y/o tratar a un individuo infectado por el VIH-1.
El término "anticuerpo" en esta memoria se utiliza para referirse a una molécula que tiene una especificidad de unión a antígeno útil. Los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que este término también puede abarcar polipéptidos que son fragmentos o derivados de anticuerpos que aún pueden mostrar la misma funcionalidad o una muy similar. Fragmentos o derivados de anticuerpos de este tipo pretenden ser abarcados por el término anticuerpo tal como se utiliza en esta memoria. Por "anticuerpo" o "molécula de anticuerpo" a los efectos de la inmunoterapia pasiva, se entiende en esta memoria no solo moléculas de inmunoglobulina enteras, sino también fragmentos de las mismas, tales como Fab, F(ab’)2, Fv y otros fragmentos de las mismas que conservan la actividad neutralizante contra los virus VIH-1. De manera similar, el término anticuerpo incluye derivados de anticuerpos modificados genéticamente tales como moléculas Fv de cadena sencilla (scFv) y anticuerpos de dominio (dAbs).
La fabricación de composiciones que comprenden anticuerpos purificados dirigidos contra un péptido de fórmula (I) se describe en los Ejemplos de esta memoria.
En algunas realizaciones, un anticuerpo dirigido contra un péptido de fórmula (I) consiste en un anticuerpo policlonal. La producción de una composición que comprende anticuerpos policlonales purificados dirigidos contra un péptido de fórmula (I) se describe en los Ejemplos de esta memoria.
La expresión "anticuerpo monoclonal" se utiliza en esta memoria para abarcar cualquier Ab aislado, tal como los hibridomas de anticuerpos monoclonales convencionales, pero también para abarcar anticuerpos monoespecíficos aislados producidos por cualquier célula, tal como, por ejemplo, una muestra de inmunoglobulinas humanas idénticas expresadas en una línea celular de mamífero.
Los dominios variable pesado (Vh) y variable ligero (Vl) del anticuerpo están implicados en el reconocimiento del antígeno, un hecho reconocido por primera vez por los primeros experimentos de digestión con proteasa. Se encontró una confirmación adicional mediante la "humanización" de anticuerpos de roedores. Los dominios variables de origen de roedores pueden fusionarse con dominios constantes de origen humano de modo que el anticuerpo resultante conserve la especificidad antigénica del anticuerpo parental de roedor (Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,6851 -6855). Esa especificidad antigénica que es conferida por dominios variables y que es independiente de los dominios constantes se conoce de experimentos que implican la expresión bacteriana de fragmentos de anticuerpos, que contienen todos uno o más dominios variables. Estas moléculas incluyen moléculas tipo Fab (Better et al (1988) Science 240, 1041); moléculas Fv (Skerra et al (1988) Science 240, 1038); moléculas Fv de cadena sencilla (scFv) en las que los dominios asociados V sub H y V sub L están enlazados a través de un oligopéptido flexible (Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879) y anticuerpos de un solo dominio (dAbs) que comprenden dominios V aislados (Ward et al (1989) Nature 341,544). Una revisión general de las técnicas implicadas en la síntesis de fragmentos de anticuerpos que conservan sus sitios de unión específicos se encuentra en Winter & Milstein (1991, Nature 349, 293-299).
Por “moléculas ScFv” los autores de la invención quieren decir moléculas en las que los dominios asociados Vh y Vl están enlazados a través de un oligopéptido flexible. Anticuerpos modificados, tales como los anticuerpos ScFv, pueden fabricarse utilizando las técnicas y los enfoques descritos en J. Huston et al, (1988) "Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single chain Fv analogue produced in E. coli", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 5879-5883 y en A. Pluckthun, (1991) "Antibody engineering; Advances from use of E. coli expression systems", Bio/technology 9 (6): 545-51.
Anticuerpos monoclonales adecuados que son reactivos como se describe en esta memoria pueden prepararse mediante técnicas conocidas, por ejemplo, las descritas en "Monoclonal Antibodies; A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) y en "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Application", S G R Hurrell (CRC Press, 1982).
Una realización adicional abarca anticuerpos humanizados en los que las regiones del anticuerpo murino que entraron en contacto con el antígeno, las Regiones Determinantes de la Complementariedad (CDRs), se transfirieron a un marco de anticuerpo humano. Anticuerpos de este tipo son casi completamente humanos y rara vez provocan respuestas de anticuerpos dañinas cuando se administran a los pacientes. Se han registrado varios anticuerpos quiméricos o humanizados como fármacos terapéuticos y ahora se utilizan ampliamente en diversas indicaciones (Borrebaeck & Carlsson, 2001, Curr. Opin. Pharmacol. 1: 404-408).
Se prefiere que el anticuerpo sea un anticuerpo humanizado. Anticuerpos no humanos adecuadamente preparados pueden "humanizarse" de formas conocidas, por ejemplo, insertando las regiones CDR de anticuerpos de ratón en el marco de anticuerpos humanos. Los anticuerpos humanizados pueden fabricarse utilizando las técnicas y los enfoques descritos en Verhoeyen et al (1988) Science, 239, 1534-1536 y en Kettleborough et al, (1991) Protein Engineering, 14 (7), 773-783.
Otras realizaciones de anticuerpos abarcan anticuerpos completamente humanos, que pueden producirse utilizando tecnologías recombinantes. Típicamente, se utilizan colecciones grandes que comprenden billones de anticuerpos diferentes. A diferencia de las tecnologías anteriores que emplean la quimerización o humanización de, p. ej., anticuerpos murinos, esta tecnología no se basa en la inmunización de animales para generar el anticuerpo específico. En cambio, las colecciones recombinantes comprenden un gran número de variantes de anticuerpos pre-fabricadas, en las que es probable que la colección tenga al menos un anticuerpo específico para cualquier antígeno.
En los tratamientos pasivos de una infección por VIH-1 como se proporciona en esta memoria, los anticuerpos de la presente invención se administrarán, preferiblemente por vía intravenosa, a los pacientes que los necesiten. La frecuencia de administración puede determinarse clínicamente siguiendo la disminución de los títulos de anticuerpos en el suero de los pacientes a lo largo del tiempo, pero en cualquier caso puede ser a una frecuencia de 1 a 52 veces al año, y más preferiblemente entre 1 y 12 veces al año. Las cantidades de anticuerpo pueden variar de acuerdo con la gravedad de la enfermedad o la semivida del anticuerpo en el suero, pero preferiblemente estarán en el intervalo de 1 a 10 mg/kg de paciente, y preferiblemente en el intervalo de 1 a 5 mg/kg de paciente, y lo más preferiblemente de 1 a 2 mg/kg de paciente.
Diagnóstico, pronóstico, métodos y kits de seguimiento del VIH-1
Como se describe en los ejemplos de esta memoria, se pueden encontrar anticuerpos dirigidos contra un péptido de fórmula (I) en pacientes infectados con el VIH-1.
Por consiguiente, un péptido de fórmula (I) puede utilizarse como reactivo de detección para determinar la presencia y, opcionalmente, la cantidad de anticuerpos dirigidos contra dicho péptido en un individuo testado.
La presente invención se refiere a un método para detectar y/o cuantificar anticuerpos dirigidos contra un péptido de fórmula (I) en una muestra, que comprende las siguientes etapas:
a) poner en contacto una muestra a testar con uno o más péptidos de fórmula (I), y
b) detectar y/o cuantificar la formación de complejos entre dichos péptidos de fórmula (I) y anticuerpos presentes en dicha muestra.
La presente invención también se refiere a un kit para detectar y/o cuantificar anticuerpos dirigidos contra un péptido de fórmula (I) en una muestra, que comprende:
a) uno o más péptidos de fórmula (I) sobre el mismo, y
b) uno o más reactivos para detectar complejos formados entre dichos péptidos y anticuerpos presentes en dicha muestra.
En algunas realizaciones, la muestra a testar consiste en una muestra previamente recogida de un individuo, que incluye (i) un individuo del que se sospecha que está infectado por un virus VIH-1 y (ii) un individuo que ha sido infectado por un virus VIH-1.
En algunas realizaciones, dicha muestra consiste en una preparación que se espera que contenga anticuerpos dirigidos contra un péptido de fórmula (I), tal como (i) una preparación de anticuerpos purificados a partir de muestras recogidas de un mamífero inmunizado con una composición inmunogénica que comprende un péptido de fórmula (I) y (ii) una preparación de anticuerpos monoclonales o de anticuerpos recombinantes dirigidos contra un péptido de fórmula (I).
En algunas realizaciones del método de detección de arriba, el o los péptidos de fórmula (I) están inmovilizados sobre un sustrato.
En algunas realizaciones, se puede utilizar un péptido de fórmula (I) como reactivo para diagnosticar la infección de un individuo con un virus VIH-1.
Por lo tanto, la presente divulgación también se refiere a un aspecto que no está de acuerdo con la invención y que se presenta únicamente con fines ilustrativos, que es un método para el diagnóstico de una infección con un virus VIH-1 en un individuo, que comprende las siguientes etapas:
a) poner en contacto una muestra de dicho individuo con uno o más péptidos de fórmula (I), y
b) detectar la formación de complejos entre dichos péptidos de fórmula (I) y anticuerpos presentes en dicha muestra.
En algunas realizaciones de la etapa b) del método, se cuantifican los complejos entre dichos péptidos de fórmula (I) y los anticuerpos, cuando están presentes.
La divulgación también se refiere a un aspecto que no está de acuerdo con la invención y que se presenta únicamente con fines ilustrativos, que es un kit para el diagnóstico de una infección con un virus VIH-1 en un individuo, que comprende:
a) uno o más péptidos de fórmula (I), y
b) uno o más reactivos para detectar complejos formados entre dichos péptidos de fórmula (I) y anticuerpos presentes en dicha muestra recogida de dicho individuo.
En algunas realizaciones del método de diagnóstico o del kit de diagnóstico anterior, dicho o dichos péptidos de fórmula (I) están inmovilizados sobre un sustrato, como se describe más adelante en la presente memoria descriptiva.
De acuerdo con el método anterior, se determina una infección por VIH-1 si se detecta la formación de complejos entre el o los péptidos de fórmula (I) y los anticuerpos contenidos en la muestra previamente recogida del individuo testado.
De acuerdo con el método de diagnóstico anterior, el nivel de la respuesta inmune de un individuo infectado por el VIH-1 frente a un virus del VIH-1 se determina cuantificando los complejos formados entre el o los péptidos de fórmula (I) y los anticuerpos contenidos en la muestra previamente recogida del individuo testado.
En algunas realizaciones, se puede utilizar un péptido de fórmula (I) como reactivo para realizar un pronóstico de la progresión de la infección de un individuo con un virus VIH-1.
Por lo tanto, la presente divulgación también se refiere a un aspecto que no está de acuerdo con la invención y que se presenta únicamente con fines ilustrativos, que es un método para el pronóstico de la progresión de una infección con un virus VIH-1 en un individuo, que comprende las siguientes etapas:
a) poner en contacto una muestra de dicho individuo con uno o más péptidos de fórmula (I), y
b) detectar y cuantificar la formación de complejos entre dichos péptidos de fórmula (I) y anticuerpos presentes en dicha muestra.
Esta divulgación también se refiere un aspecto que no está de acuerdo con la invención y que se presenta únicamente con fines ilustrativos, que es un kit para el pronóstico de la progresión de una infección con un virus VIH-1 en un individuo, que comprende:
a) uno o más péptidos de fórmula (I), y
b) uno o más reactivos para detectar complejos formados entre dichos péptidos de fórmula (I) y anticuerpos presentes en dicha muestra recogida de dicho individuo.
De acuerdo con el método anterior, se determina una infección por VIH-1 si se detecta la formación de complejos entre el o los péptidos de fórmula (I) y los anticuerpos contenidos en la muestra previamente recogida del individuo testado.
De acuerdo con el método de pronóstico anterior, el nivel de la respuesta inmune de un individuo infectado con el VIH-1 contra un virus VIH-1 se determina en la etapa b).
Cuando se realiza el método de pronóstico anterior, se espera un resultado favorable cuando se mide un alto nivel de anticuerpos dirigidos a un polipéptido de fórmula (I) en la etapa b). Por el contrario, se espera un mal resultado cuando se mide un bajo nivel de anticuerpos dirigidos a un polipéptido de fórmula (I) en la etapa b).
Como se utiliza en esta memoria, un nivel "alto" de anticuerpos dirigidos contra un péptido de fórmula (I) se determina por comparación con uno o más valores de referencia.
En algunas realizaciones del método de pronóstico de arriba, se puede determinar un resultado favorable si se detecta la presencia de anticuerpos dirigidos contra un péptido de fórmula (I) en una muestra previamente recogida de dicho individuo infectado por VIH-1, ya que, como se muestra en los Ejemplos de esta memoria, se ha encontrado que los individuos que tienen anticuerpos séricos dirigidos contra un péptido de fórmula (I) tienen buenos parámetros clínicos, tales como una carga viral baja y un recuento alto de células T CD4+.
El método de diagnóstico de arriba, el método de pronóstico de arriba, así como los kits para realizar dichos métodos, pueden utilizarse para controlar la eficacia de un tratamiento médico anti-VIH-1 en un individuo infectado por el VIH-1.
Esta divulgación también se refiere a un aspecto que no está de acuerdo con la invención y que se presenta únicamente con fines ilustrativos, que es un método para controlar un tratamiento médico anti-VIH-1 en un individuo infectado con el VIH-1, que comprende las etapas de:
a) administrar un tratamiento anti-VIH-1 a dicho individuo infectado por el VIH-1, y
b) determinar el nivel de anticuerpos dirigidos contra un péptido de fórmula (I) en una muestra recogida de dicho paciente.
En algunas realizaciones del método de control, el nivel de anticuerpos dirigidos contra un péptido de fórmula (I) se determina antes de administrar un tratamiento anti-VIH-1 a dicho individuo, por lo tanto, antes de la etapa a) del método.
En algunas realizaciones del método de control, especialmente cuando el tratamiento anti-VIH-1 comprende una pluralidad de etapas de administración de una composición farmacéutica anti-VIH-1 a dicho individuo, el método de control anterior se realiza en cada una de las etapas de administración, o solo en una o más etapas de administración o después de la último etapa de administración.
En esta memoria se especifica que las realizaciones del tratamiento médico anti-VIH-1 que pueden controlarse de acuerdo con el método anterior abarcan la inmunización del individuo infectado por el VIH-1 con una composición de vacuna que comprende un péptido de fórmula (I) como se describe en esta memoria.
Expresiones tales como "muestra que contiene un anticuerpo" o "detectar un anticuerpo en una muestra" no pretenden excluir muestras o determinaciones (intentos de detección) en las que no esté contenido ni se detecte anticuerpo alguno. En un sentido general, esta invención implica ensayos para determinar si un anticuerpo producido en respuesta a la infección y durante el curso de la enfermedad con un virus VIH-1 está presente en una muestra, independientemente de si se detecta o no.
Condiciones para hacer reaccionar péptidos y anticuerpos de modo que reaccionen específicamente son bien conocidas por los expertos en la técnica. Véase, p. ej., Current Protocols in Immunology (Coligan et al., editores, John Wiley & Sons, Inc) o los Ejemplos en esta memoria.
El método de diagnóstico comprende tomar una muestra de fluido corporal o tejido que pueda contener anticuerpos. Los anticuerpos pueden ser, p. ej., de tipo IgG, IgE, IgD, IgM o IgA. Generalmente, se detectan anticuerpos IgM y/o IgA, p. ej., para la detección de una infección temprana. Los anticuerpos IgG pueden detectarse cuando algunos de los péptidos adicionales comentados anteriormente se utilizan en el método (p. ej., péptidos para la detección de proteínas de flagelos). La muestra es preferiblemente fácil de obtener y puede ser suero o plasma derivado de una muestra de sangre venosa o incluso de un pinchazo en el dedo. Se sabe que el tejido de otras partes del cuerpo u otros fluidos corporales, tales como el líquido cefalorraquídeo (CSF, por sus siglas en inglés), la saliva, las secreciones gástricas, la mucosidad, etc., contienen anticuerpos y pueden utilizarse como una fuente de la muestra.
Una vez que se permite que el antígeno peptídico y el anticuerpo de muestra reaccionen en un medio adecuado, se realiza un ensayo para determinar la presencia o ausencia de una reacción anticuerpo-péptido. Entre los muchos tipos de ensayos adecuados, que serán evidentes para un trabajador experto, están los ensayos de inmunoprecipitación y aglutinación.
En realizaciones de la invención, el ensayo puede comprender (1) inmovilizar el o los anticuerpos en la muestra, añadir un péptido de la invención y luego detectar el grado de unión del anticuerpo al péptido, p. ej., al marcar el péptido o al añadir una sustancia marcada (conjugado, participante en la unión) tal como un anticuerpo marcado que reconoce específicamente el péptido; (2) inmovilizar un péptido de la invención, añadir la muestra que contiene uno o más anticuerpos y luego detectar la cantidad de anticuerpo unido al péptido, p. ej., añadiendo una sustancia marcada (conjugado, participante en la unión) tal como un anticuerpo marcado que reconoce específicamente el anticuerpo; o (3) hacer reaccionar el péptido y la muestra que contiene anticuerpo o anticuerpos sin inmovilizar ninguno de los reaccionantes, y luego detectar la cantidad de complejos de anticuerpo y péptido, p. ej., marcando el péptido o añadiendo una sustancia marcada (conjugado, participante en la unión), como un anticuerpo marcado, que reconoce específicamente el péptido.
La inmovilización de un péptido de la invención puede ser covalente o no covalente, y la inmovilización no covalente puede ser no específica (p. ej., unión no específica a una superficie de poliestireno en, p. ej., un pocillo de microtitulación). La unión específica o semi-específica a un portador, soporte o superficie sólido o semi-sólido se puede lograr si el péptido tiene, asociado a él, un resto que permita su unión covalente o no covalente al portador, soporte o superficie sólido o semi-sólido. Por ejemplo, el resto puede tener afinidad a un componente fijado al portador, soporte o superficie. En este caso, el resto puede ser, p. ej., un grupo biotina o biotinilo o un análogo del mismo unido a un grupo aminoácido del péptido tal como ácido 6-aminohexanoico, y el componente es entonces avidina, estreptavidina o un análogo de las mismas. Una alternativa es una situación en la que el resto tiene la secuencia de aminoácidos His-His-His-His-His-His (SEQ ID NO: 17) y el portador comprende un derivado del Ácido Nitrilotriacético (NTA, por sus siglas en inglés) cargado con iones Ni++. Entre los portadores, soportes o superficies adecuados se encuentran, p. ej., perlas magnéticas o látex de copolímeros, tales como estireno-divinilbenceno, estirenodivinilbenceno hidroxilado, poliestireno, poliestireno carboxilado, perlas de negro de humo, no activado o poliestireno o poli(cloruro de vinilo). vidrio activado, vidrio magnético poroso activado con epoxi, partículas de gelatina o polisacáridos u otras partículas de proteínas, glóbulos rojos, anticuerpos monoclonales o policlonales o fragmentos Fab de anticuerpos de este tipo.
Los protocolos para inmunoensayos que utilizan antígenos para la detección de anticuerpos específicos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo sándwich convencional o se puede utilizar un formato de ensayo competitivo convencional. Para una discusión de algunos tipos adecuados de ensayos, véase Current Protocols in Immunology (supra). En un ensayo preferido, un péptido de la invención se inmoviliza en la superficie o portador sólido o semi-sólido por medio de unión covalente o no covalente, ya sea antes o después de la adición de la muestra que contiene el anticuerpo.
Se conocen dispositivos para realizar ensayos de unión específica, especialmente inmunoensayos, y se pueden adaptar fácilmente para su uso en los presentes métodos. Los ensayos en fase sólida, en general, son más fáciles de realizar que los métodos de ensayo heterogéneos que requieren una etapa de separación, tal como precipitación, centrifugación, filtración, cromatografía o magnetismo, porque la separación de los reactivos es más rápida y sencilla. Los dispositivos de ensayo en fase sólida incluyen placas de microtitulación, dispositivos de ensayo de flujo continuo, tiras reactivas y dispositivos de inmunoensayo inmunocapilar o inmunocromatográfico.
En realizaciones de la invención, la superficie sólida o semi-sólida o el portador es el suelo o la pared de un pocillo de microtitulación; una superficie o membrana de filtro (p. ej., una membrana de nitrocelulosa o una membrana de PVDF (poli(fluoruro de vinilideno)), tal como una membrana Immobilon); una fibra hueca; un medio cromatográfico de perlas (p. ej., un gel de agarosa o de poliacrilamida); una perla magnética; una matriz de celulosa fibrosa; una matriz de HPLC; una matriz de FPLC; una sustancia que tiene moléculas de un tamaño tal que las moléculas con el péptido unido a ellas, cuando se disuelven o dispersan en una fase líquida, pueden ser retenidas por medio de un filtro; una sustancia capaz de formar micelas o de participar en la formación de micelas, permitiendo cambiar o intercambiar una fase líquida sin arrastrar las micelas; un polímero hidrosoluble; o cualquier otro portador, soporte o superficie adecuado.
En algunas realizaciones de la invención, el péptido se proporciona con un marcador adecuado que permite la detección. Pueden utilizarse marcadores convencionales que sean capaces, solos o junto con otras composiciones o compuestos, de proporcionar una señal detectable. Métodos de detección adecuados incluyen, p. ej., la detección de un agente que está marcado, directa o indirectamente, con un marcador fluorescente mediante microscopía de inmunofluorescencia, incluyendo la microscopía confocal, o mediante citometría de flujo (FACscan); detección de un agente marcado radiactivamente por autorradiografía; microscopio de electrones; inmunotinción; fraccionamiento subcelular, o similares. En una realización, un elemento radiactivo (p. ej., un aminoácido radiactivo) se incorpora directamente en una cadena peptídica; en otra realización, un marcador fluorescente se asocia con un péptido a través de la interacción biotina/avidina, asociación con un anticuerpo conjugado con fluoresceína o similar. En una realización, se añade a la mezcla un participante en la unión específico detectable para el anticuerpo. Por ejemplo, el participante en la unión puede ser un anticuerpo secundario detectable que se une al primer anticuerpo. Este anticuerpo secundario se puede marcar, p. ej., con un marcador radiactivo, enzimático, fluorescente, luminiscente u otro marcador detectable, tal como un sistema de avidina/biotina.
En realizaciones de la invención, el procedimiento de detección comprende inspeccionar visiblemente el complejo anticuerpo-péptido en cuanto a un cambio de color, o inspeccionar el complejo anticuerpo-péptido en cuanto a un cambio físico-químico. Los cambios físico-químicos se pueden producir con reacciones de oxidación u otras reacciones químicas. Pueden detectarse a simple vista, utilizando un espectrofotómetro o similar.
En una realización del método, el péptido, o una mezcla de péptidos, se somete a electrotransferencia o transferencia puntual sobre papel de nitrocelulosa. Posteriormente, el fluido biológico (p. ej., suero o plasma) se incuba con el antígeno transferido y se permite que el anticuerpo en el fluido biológico se una al antígeno o antígenos. A continuación, el anticuerpo unido puede detectarse, p. ej., mediante métodos inmunoenzimáticos estándar.
En otra realización del método, las perlas de látex se conjugan con el o los antígenos de la invención. Posteriormente, el fluido biológico se incuba con el conjugado de perla/péptido, formando con ello una mezcla de reacción. Luego se analiza la mezcla de reacción para determinar la presencia de los anticuerpos.
Un ensayo preferido para la selección de productos de la sangre u otros fluidos fisiológicos o biológicos es un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas, es decir, un ELISA. Típicamente, en un ELISA, el o los antígenos aislados de la invención se adsorben a la superficie de un pocillo de microtitulación directamente o a través de una matriz de captura (es decir, un anticuerpo). Sitios de unión a proteínas residuales no específicos en la superficie se bloquean luego con un agente apropiado, tal como albúmina de suero bovino (BSA), suero de cabra normal inactivado por calor (NGS) o BLOTTO (una solución tamponada de leche descremada en polvo que también contiene un conservante, sales y un agente antiespumante). Luego, el pocillo se incuba con una muestra biológica sospechosa de contener anticuerpos anti-VIH-1. La muestra se puede aplicar pura o, más a menudo, se puede diluir, habitualmente en una solución tamponada que contiene una pequeña cantidad (0,1-5,0 % en peso) de proteína, tal como BSA, NGS o BLOTTO. Después de incubar durante un período de tiempo suficiente para permitir que se produzca la unión específica, el pocillo se lava para eliminar la proteína no unida y luego se incuba con una concentración óptima de un anticuerpo anti-inmunoglobulina apropiado (p. ej., para sujetos humanos, una inmunoglobulina anti-humana de otro animal, tal como un perro, un ratón, una vaca, etc.) que se conjuga con una enzima u otro marcador mediante procedimientos estándar y se disuelve en un tampón de bloqueo. El marcador se puede elegir entre una diversidad de enzimas, incluyendo peroxidasa de rábano picante (HRP, por sus siglas en inglés), beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa, etc. Se deja que pase un tiempo suficiente para que se produzca de nuevo la unión, después el pocillo se lava de nuevo para eliminar conjugado no unido, y se añade un sustrato adecuado para la enzima. Se deja que se desarrolle el color y se determina visual o instrumentalmente la densidad óptica del contenido del pocillo (medida a una longitud de onda apropiada). El valor de OD de corte puede definirse como las desviaciones estándar (SDs, por sus siglas en inglés) medias de OD de al menos 50 muestras de suero recogidas de individuos que no están infectados por un virus VIH-1, o por otras definiciones convencionales de este tipo. En el caso de un ensayo muy específico, OD+2 SD se puede utilizar como valor de corte.
En una realización de un ELISA, un péptido de la invención se inmoviliza sobre una superficie, tal como una placa ELISA de noventa y seis pocillos o una fase sólida equivalente que se recubre con estreptavidina o un compuesto de unión a biotina equivalente a una concentración óptima en un tampón de revestimiento alcalino y se incuba a 4 °C durante la noche. Después de un número adecuado de lavados con tampones de lavado estándar, se aplica a cada uno de los pocillos una concentración óptima de una forma biotinilada de una composición/antígeno de esta invención disuelta en un tampón de bloqueo convencional; se añade una muestra; y el ensayo procede como arriba.
Otro formato de ensayo útil es un formato de flujo lateral. El anticuerpo contra el anticuerpo humano o animal o los anticuerpos contra la proteína estafilococo A o G se marca con un generador o indicador de la señal (es decir, oro coloidal) que se seca y se coloca en una almohadilla de fibra de vidrio (almohadilla de aplicación de muestra). El péptido de diagnóstico se inmoviliza en una membrana, tal como una membrana de PVDF (poli(fluoruro de vinilideno)) (p. ej., una membrana Immobilon (Millipore)) o una membrana de nitrocelulosa. Cuando se aplica una solución de muestra (sangre, suero, etc.) a la almohadilla de aplicación de muestra, ésta disuelve el indicador marcado con oro coloidal y esto se une a todos los anticuerpos en la muestra. Esta mezcla se transporta a la siguiente membrana (PVDF o nitrocelulosa que contiene el péptido de diagnóstico) por acción capilar. Si están presentes anticuerpos contra el péptido de diagnóstico, estos se unen al péptido de diagnóstico rayado en la membrana generando una señal. Se utiliza un anticuerpo adicional específico para el anticuerpo marcado con oro coloidal (tal como IgG anti-ratón de cabra) para producir una señal de control.
El experto en la técnica debe entender que se puede diseñar cualquier número de formatos de ensayo de proteínas convencionales, en particular formatos de inmunoensayo, para utilizar los péptidos aislados de esta invención para la detección de una infección por VIH-1 en un sujeto. Por lo tanto, esta invención no está limitada por la selección del formato de ensayo particular, y se cree que abarca formatos de ensayo que son conocidos por los expertos en la técnica.
Reactivos para ELISA u otros ensayos de acuerdo con esta invención se pueden proporcionar en forma de kits. Kits de este tipo son útiles para diagnosticar la infección con un virus VIH-1, utilizando una muestra de un sujeto (p. ej., un ser humano u otro animal). Un kit de diagnóstico de este tipo puede contener un péptido de la invención (y, si se desea, péptidos adicionales como se comentó arriba) y, opcionalmente, un sistema para (medios que permiten) la detección de un péptido de la invención unido a un anticuerpo dirigido contra un péptido de fórmula (I), y/o una superficie a la que se puede unir el péptido. En una realización, un kit contiene una mezcla de péptidos adecuados o medios para preparar mezclas de este tipo y/o reactivos para detectar complejos de péptido-anticuerpo.
El kit puede incluir placas de microtitulación en las que se han pre-adsorbido los péptidos de la invención, otro dispositivo de ensayo apropiado, diversos diluyentes y tampones, conjugados marcados u otros agentes para la detección de antígenos o anticuerpos unidos específicamente, y otros reactivos generadores de señales, tales como sustratos enzimáticos, cofactores y cromógenos. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente otros componentes de un kit. Componentes de este tipo pueden incluir reactivos de recubrimiento, anticuerpos de captura policlonales o monoclonales específicos para un péptido de la invención, o un cóctel de dos o más de los anticuerpos, extractos purificados o semi-purificados de estos antígenos como patrones, anticuerpos detectores de MAb, un anticuerpo anti-ratón o anti-humano con molécula indicadora conjugada al mismo, una placa ELISA preparada para absorción, gráficos indicadores para comparaciones colorimétricas, guantes desechables, instrucciones de descontaminación, varillas aplicadoras o recipientes, un vaso de preparación de muestras, etc. En una realización, un kit comprende tampones u otros reactivos apropiados para constituir un medio de reacción que permita la formación de un complejo péptido-anticuerpo. Kits de este tipo proporcionan una forma conveniente y eficiente para que un laboratorio clínico diagnostique la infección por un virus VIH-1.
En algunas realizaciones, los métodos y kits de diagnóstico descritos en esta memoria pueden utilizarse para detectar en general la presencia de anticuerpos anti-VIH en una muestra previamente recogida de un individuo. En algunas otras realizaciones, los métodos y kits de diagnóstico descritos en esta memoria se pueden utilizar para determinar la identidad de la subfamilia del virus VIH-1 que ha infectado al individuo que actualmente se testa.
En algunas realizaciones, los métodos y kits de diagnóstico descritos en esta memoria utilizan solo un péptido seleccionado de los péptidos que pertenecen a la familia de péptidos de fórmula (I).
En otras realizaciones, los métodos y kits de diagnóstico descritos en esta memoria utilizan una pluralidad de péptidos seleccionados de los péptidos que pertenecen a la familia de péptidos de fórmula (I).
En realizaciones de los métodos y kits de diagnóstico descritos en esta memoria, se hace uso de una pluralidad de péptidos de fórmula (I) seleccionados del grupo que consiste en:
• PWNASASNKSLDDIW (SEQ ID N° 12),
• PWNASWANKSLDDIW (SEQ ID N° 13),
• PWNASWSAKSLDDIW (SEQ ID N° 14), y
• PWNASWSNKALDDIW (SEQ ID N° 15).
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los Ejemplos siguientes.
EJEMPLOS
Material y Métodos de los ejemplos
1. Preparación de virus
Se prepararon mutantes a partir del plásmido pNL4.3 utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange II XL (Stratagene) con verificación posterior mediante secuenciación de ADN. Se transfectaron plásmidos pNL4.3 3S/gp41 de tipo salvaje y mutados con Alanina mediante lipofectamina (Invitrogen) en células 293T en medio Optima. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se recogió el sobrenadante libre de células y se midió la concentración de la principal proteína p24 del núcleo del VIH utilizando el kit Vidas Ag p24 II (Biomerieux). Los sobrenadantes de virus se conservan a -80 °C.
2. Péptidos y anticuerpos.
Los péptidos sintéticos 3S/gp41 purificados no conjugados y conjugados con KLH y mutados con Alanina (Figura 1) se adquirieron de Covalabs (Villeurbanne, Francia). A ratones se inyectaron IV dos veces con un intervalo de aproximadamente 2 semanas entre cada una de las inyecciones 20 mg de péptido enlazado a KLH, en presencia de adyuvante de Freund incompleto. Los sueros se titularon mediante ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) utilizando placas Maxisorp (Nunc) recubiertas durante la noche a 4 °C con 100 ng de péptidos 3S/gp41 de tipo salvaje o mutados con alanina, como se describe (Vieillard et al AIDS 2006).
3. Purificación de células T CD4+ sanas primarias
Se obtuvieron leucocitos de muestras de sangre entera de donantes sanos mediante centrifugación de capa leucocitaria del "Etablissement Frangais du sang" (Hospital Pitié-Salpétriére, París, Francia). Células T CD4+ se purificaron con microperlas magnéticas CD4 (Miltenyi). El análisis de citometría de flujo demostró una pureza de más del 95 % de células CD4. Las células se activaron durante 3 días con 1 pg/ml de PHA-L (Murex) en medio RPMI-1640 Glutamax (Invitrogen) complementado con suero de ternera fetal (FCS, por sus siglas en inglés) al 10 %, y luego se cultivaron con 100 UI/ml de Proleukin-2 (Chiron), añadido cada 3 días.
4. Ensayo de infección
Células T CD4+, MT2 y Jurkat activadas purificadas (107 células) se incubaron con 100 ng de equivalentes de antígeno p24, durante 17 h y 2 h a 37 °C, respectivamente. A continuación, las células se lavaron dos veces en PBS/EDTA y se resuspendieron a razón de 106/mL. La producción de virus se controló cada 2 días post-infección mediante ELISA para medir la concentración de p24 con el kit Vidas Ag p24 II (Biomerieux). La formación de sincitios en células MT2 infectadas se evaluó después de 96 h mediante microscopía de contraste en fase estándar.
5. Ensayo de infectividad de VIH-1 de ronda única
Hela P4C5, gentilmente donada por A. Morris y O. Schwartz (Instituto Pasteur de París, Francia) fueron cotransfectadas por CD4+ y CCR5+, y contenían una copia integrada de la repetición terminal larga (LTR, por sus siglas en inglés) del VIH-1 enlazada a una luciferasa y el gen de la p-galactosidasa (Amara et al J. Exp. Med. 1997). Las células se sembraron un día antes y se infectaron con 4 ng de p24/ml de virus NL4.33S/gp41de tipo salvaje o mutados con alanina. A las 48 h post-infección, se midió la actividad de p-galactosidasa en lisados de células Hela-P4C5 utilizando el kit CPRG Beta-Galactosidasa
6. Ensayos de neutralización
La fracción de IgG policlonal de anti-sueros de ratones se aisló utilizando el kit Nab Protein A/G Spin y, a continuación, se desaló con las columnas de desalinización Zeba spin, ambas de Thermo Scientific, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las fracciones de inmunoglobulina se concentraron con unidades de filtro centrífugo Centricon (Millipore) y luego se cuantificaron utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Scientific). Los Abs purificados se analizaron a concentraciones iniciales de 20 pg/ml, seguido de cinco diluciones dobles.
Abs 3S/gp41 anti-WT o anti-W614A humanos se purificaron mediante inmuno-precipitación a partir de plasma inactivado por calor de un paciente infectado por el VIH utilizando el kit Pierce Direct IP mediante inmunobilización directa de péptido sintético en un soporte de agarosa reactiva con amina. Los Abs purificados se sometieron luego a diálisis frente a PBS (casete de diálisis Silde-A-Lyser, Pierce) y se cuantificaron. Los Abs purificados se testaron a concentraciones iniciales de 2 pg/ml, seguido de cinco diluciones dobles.
Se realizaron dos ensayos utilizando virus infecciosos para testar la neutralización de los Abs purificados (Fenyo et la PLoS one 2009):
(1) Para comparar la potencia (concentraciones requeridas para lograr una inhibición del 50 % [CI50] y del 90 % [CI90]) de Abs, los autores de la invención utilizaron primero un ensayo de células T Cd4++-p24. Los virus infecciosos competentes para la replicación (200TCID50) se incubaron con diversas concentraciones de Ig durante 30 min, seguido de la adición de células T CD4+ purificadas activadas con PHA, en presencia de IL2. Siete días después del inicio de la infección, se recogieron muestras por duplicado para la medición de p24 (kit Vidas Ag p24 II, Biomerieux).
(2) Para evaluar la posibilidad de una actividad de neutralización diferencial de los diversos Ab purificados, los autores de la invención midieron su capacidad para inhibir la entrada del VIH-1 desde diferentes cepas X4 (NL4.3, BRU, NDK) y R5 (JR-CSF, YU-2) o ROD HIV-2, utilizando células Hela-P4C5 y/o TZM-bl (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program), proporcionado amablemente por Clarisse Berlioz-Torrent (Institut Cochin, París, Francia). Se incubaron virus infecciosos competentes para la replicación (200TCID50) con diversas concentraciones de Ig durante 30 min, seguido de la adición de células Hela P4C5. A las 48 h post-infección, la actividad de p-galactosidasa se mide en lisados de Hela-P4C5 utilizando el kit CPRG Beta-Galactosidase (OZ biosciences), y la actividad de Luciferasa se mide en lisados de TZM-bl utilizando el reactivo Britelite Plus (Perkin Elmer). Se aplicó un valor de corte de 2,5 veces el fondo para determinar los valores positivos en los ensayos de TCID. Los datos se expresaron en TCID50 y TCID95.
7. Citometría de flujo
El análisis FACS se realizó en células T CD4+ purificadas en presencia de virus viable o inactivado por calor durante 17 h, o se trataron con péptidos 3S/gp41 durante 4 h a 37 °C. Las muestras se incubaron con 1 pg de cada uno de los anticuerpo: anti-NKp44L, o con proteínas de fusión (NKp30-Ig, NKp44-Ig o NKp46-Ig) durante 2 h a 4 °C en presencia de PBS/BSA al 1 %. A continuación, las células se lavaron en PBS/BSA al 1 % y se incubaron durante 30 min a 4 °C con anticuerpos secundarios específicos (diluidos 1:100 en PBS/BSA al 1 %), y finalmente se tiñeron directamente con mAb anti-CD4 y se fijaron utilizando la solución BD CellFix (BD Bioscience), como se describe (Vieillard et al PNAS 2005). Se detectaron al menos 10.000 eventos de células CD4+ en un FACSCanto (BD Biosciences) o Navios (Coulter).
8. Ensayo de desgranulación
Células T CD4+ no infectadas o infectadas con virus 3S/gp41 NL4.3 de tipo salvaje o mutados con alanina se resuspendieron en una relación de 1:1 en presencia de PBMC autólogas activadas con IL2 y mAb anti-CD107a (H4A3; Becton Dickinson). Después de 1 h de incubación, se añadió monensina 3 mM durante 3 h adicionales de incubación tal como se describió previamente (Béziat et al PLoS One 2010). Las células NK se tiñeron con mAb anti-CD3, anti-CD56 y anti-NKp44 y se analizaron en un FACSCanto (BD Biosciences) o Navios (Coulter). Se analizaron al menos 5.000 eventos CD3-CD56+ .
Ejemplo 1 : Integridad del 3S/gp41 de CD4 para la infección de células T CD4+ .
Para delinear el papel del motivo 3S/gp41 en el ciclo de vida del virus, se introdujeron individualmente sustituciones de un solo punto en los residuos comprendidos entre las posiciones S613 y S618 dentro del motivo 3S de la proteína gp41 de la cepa NL4.3 HIV-1. Para examinar si estas sustituciones individuales ejercen un efecto sobre la infectividad del virus, las células MT-2 se expusieron a 100 ng de antígeno equivalente a p24 de cada una de las preparaciones de virus. La Figura 2A demuestra que los efectos de las sustituciones del motivo 3S/gp41 varían desde la abolición casi completa de la producción viral hasta ningún efecto con respecto al virus que expresa el motivo de tipo salvaje. De hecho, el virus mutado S613A conservó su capacidad completa para infectar MT-2, mientras que K617A todavía estaba en un 66 ± 10 % del nivel observado para el tipo salvaje, y los otros mutantes en menos de un 22 %. Parece que los mutantes W614A y S618A son incapaces de establecer una infección en células MT-2 (Figura 2A). Estos datos se confirmaron con la capacidad de estos mutantes de realizar la formación de sincitios, con la ausencia completa de estas estructuras de células gigantes en células MT-2 infectadas con virus mutados W614A y S618A, en comparación con el tipo salvaje (Figura 2B). Estos datos sugieren que ambas posiciones, W614 y S618, del motivo 3S/gp41 pueden desempeñar un papel crítico durante la infección viral.
Estudios cinéticos de infección en células T CD4+ purificadas revelaron que los mutantes de tipo salvaje y S613A y K617A mostraron una replicación viral muy productiva (hasta 187 pg /ml de p24) con un pico de producción de p248 días después de la infección (Figura 2C). Por el contrario, sea cual sea el período de tiempo, el nivel infeccioso de los virus mutantes S615A y N616A sigue siendo muy bajo, con 13,5 y 17,3 pg/ml, en el pico de la carga viral, respectivamente, y sigue siendo indetectable con W614A y S618A (Figura 2C). Se observaron resultados similares en presencia de células Jurkat infectadas (datos no mostrados).
A continuación, los autores de la invención buscaron determinar qué etapa del ciclo viral se vio afectada por la mutación en el motivo 3S/gp41. Con el fin de evaluar la infectividad de los mutantes 3S/gp41, los sobrenadantes virales de las células 293T transfectadas se analizaron en células indicadoras Hela P4C5, una línea celular derivada de Hela que porta un casete HIV-LTR Lac-Zactivado por Tat tras la infección por VIH-1 (Amara et al J Exp Med 1997). Como muestra la Figura 2D, tanto los mutantes S613A como los K617A conservan la capacidad de infectar células, de manera similar al tipo salvaje. Por el contrario, en presencia de los mutantes S615A, N616A y S618A, el nivel de infectividad es al menos 10 veces menor que con el tipo salvaje y completamente indetectable con el mutante W614A. Esto sugiere que sustituciones peculiares en posiciones específicas en el motivo 3S/gp41 inhiben la entrada del virus en las células T CD4+.
Ejemplo 2 : Las mutaciones puntuales en el motivo 3S/gp41 anulan la expresión de NKp44L
Como ya lo demostraron otros y los autores de la invención, la infección por VIH-1 induce la expresión de determinados ligandos de NKR, incluyendo NKp44L (Vieillard et al 2005; Ward et al 2007). Los autores de la invención querían determinar si los virus que contienen sustituciones 3S/gp41 también son capaces de inducir la expresión de NKp44L en células T CD4+ purificadas. Después de la infección con el virus de tipo salvaje, una alta frecuencia de células expresó NKp44L (56,2 %). Se obtuvieron resultados similares con células T CD4+ infectadas con los mutantes S613A o K617A, con 61,0 y 67,6 % de células que expresan NKp44L, respectivamente. Lo que es más intrigante, no se detectó expresión con los otros mutantes; W614A, S615A, N616A y S618A. En consonancia con los datos previos ( Vieillard et a l2005; Ward et a l2007), la expresión de ligandos NKp30 y NKp46 no se indujo en células infectadas por virus 3S/gp41 de tipo salvaje o mutados con alanina, independientemente de la posición de la sustitución (Figura 3A).
A continuación, los autores de la invención investigaron la posibilidad de que la expresión de NKp44L estuviera regulada de manera diferencial en ausencia de partículas infecciosas. Por lo tanto, en presencia de virus inactivado por calor (Figura 6A), o después de la estimulación con péptidos 3S sintéticos que incluyen las diversas sustituciones de alanina en el motivo 3S/gp41 (Figure 3B), resultados similares a los obtenidos con virus competentes a la vez que respetando su sustitución específica de residuos. De hecho, la expresión de NKp44L solo se induce en presencia de elementos mutados S613A y K617A, a un nivel cercano al observado con el tipo salvaje, mientras que las otras partículas no infecciosas o péptidos mutantes no son capaces de inducir NKp44L.
Ejemplo 3 : Modulación de la desgranulación de células NK en presencia de células T CD4+ autólogas infectadas por mutantes virales 3S/gp41.
Debido a que los autores de la invención encontraron NKp44L en células T CD4+ infectadas con el virus NL4.3 que contenía determinadas mutaciones 3S/gp41 (Figura 2A), los autores de la invención investigaron la posibilidad de que células diana que expresan este ligando sean más sensibles a la citotoxicidad de NK. Células T CD4+ purificadas infectadas con virus de tipo salvaje o los diversos virus mutados se incubaron con células NK activadas con IL2 autólogas para determinar sus capacidades de desgranulación. La Figura 3C muestra que se detectó una alta expresión de CD107a en células NK NKp44+ en presencia de virus de tipo salvaje (28,8 %), o los mutantes S613A (29,5 %) y K617A (29,9 %), en comparación con células no infectadas (4,2 %), en línea con los datos que demuestran una alta expresión de NKp44L en las células T CD4+ diana (Figura 3A). En contraste con los otros mutantes, para los cuales no observaron la inducción de NKp44L en células T CD4+, el nivel de desgranulación permanece casi cercano al obtenido con células no infectadas (Figura 3C). Se obtuvieron resultados similares en presencia de partículas virales inactivadas por calor (Figura 6B) y péptidos sintéticos (Figure 4D).
En conjunto, estos resultados sugieren fuertemente que las sustituciones de residuos peculiares dentro del motivo 3S/gp41 altamente conservado inducen consecuencias importantes relacionadas con la modulación de la sensibilidad a células NK de las células diana CD4+.
Ejemplo 4 : Obtención de anticuerpos ampliamente neutralizantes de tipo 3S en ratones
Por lo tanto, los autores de la invención realizaron la inmunización de ratones con péptidos 3S/gp41 de tipo salvaje y mutados con alanina para generar anticuerpos específicos. Para todos ellos, se observaron respuestas inmunes sólidas contra su secuencia específica de 3S/gp41 en ELISA capturado con péptido libre (datos no mostrados). Curiosamente, la magnitud de la reactividad sero-cruzada depende del componente peptídico; interactuando el anti­ suero con cada uno de los péptidos sintéticos de manera directamente proporcional a sus capacidades para inducir la expresión de NKp44L. Por lo tanto, se observó una fuerte reactividad sero-cruzada entre el tipo salvaje y los mutantes S613A y K617A, mientras que este efecto está profundamente disminuido con otros mutantes, consistentemente con supuestas modificaciones conformacionales inducidas por sustituciones peculiares.
Más importante aún, las inmunoglobulinas (Ig) completas se separaron por elución de cada uno de los sueros para evaluar su potencia y amplitud de neutralización en un clado cruzado de cepas R5 y X4 de VIH-1. Utilizando diferentes ensayos de neutralización clásicos utilizando células TZM-bl y Hela-P4C5, los autores de la invención confirmaron la ausencia de actividad neutralizante significativa de los anticuerpos anti-3S de tipo salvaje contra el VIH-1 (Tablas 2 y 3), como se describió previamente (Vieillard AIDS 2006). Se observaron resultados similares en presencia de Ig purificada de ratones mutantes inmunizados con S613A y K617A. Sorprendentemente, se detectó una actividad neutralizante sólida y amplia para los mutantes W614A, S615A, N616A y S618A. De hecho, cada uno de estos mutantes provocó respuestas significativas frente a diversas cepas de VIH-1 X4 (NL4.3, BRU y NDK) y R5 (JR-CSF y YU-2) con un valor de CI50 de entre 3,3 y 17,7 mg de Ig/ml (Tabla 2). Más importante aún, las Ig de W614A son capaces de neutralizar todas las cepas de VIH-1 X4 y R5 testadas con una CI95 que variaba entre 6,7 y 19,5 pg/mL en células Hela-P4C5 (Tabla 2), y entre 3,9 y 10,3 pg/mL en células TZM -bl (Tabla 3), dependiendo de los virus. Como era de esperar, en presencia de una cepa de VIH-2 (ROD), no se detectó actividad neutralizante alguna, independientemente de la condición (Tabla 3), en línea con la deleción específica del motivo 3S/gp41 en las secuencias de la cepa de VIH-2 (Vieillard PNAS 2005).
Para confirmar definitivamente estos datos, los autores de la invención determinaron a continuación la eficacia de la neutralización viral mediante la detección de la producción de p24 de células T CD4+ purificadas infectadas con cepas NL4.3 o NDK HIV-1. La Figura 4A confirma la ausencia de actividad neutralizante frente a NL4.3 por parte de Ig de WT, o mutantes S613A y K617A, cualquiera que sea su concentración. Por el contrario, se observó una disminución significativa de la producción de p24 en presencia de Ig de los mutantes W614A, S615A, N616A y S618A. Curiosamente, a una concentración superior a 10 pg/ml de Ig de W614A, el antígeno p24 permanece indetectable. Se observaron resultados similares después de la infección con NDK (Figura 4A). Además, el estudio cinético reveló que la producción de p24 se anula por completo con 10 pg/ml de Ig procedente del mutante W614A independientemente del tiempo post-infección, y se retrasa significativamente con Ig de los mutantes S615A, N616A y S618A, en comparación con el tipo salvaje y los mutantes S613A y K617A (Figura 4B). En conjunto, estos datos respaldan firmemente que la sustitución en posiciones específicas en el motivo 3S/gp41 altamente conservado provocó la producción de actividad ampliamente neutralizante en ratones.
Para evaluar adicionalmente la eficacia de la inhibición de NKp44L por parte de Ig purificada de mutantes de alanina-3S/gp41, se incubaron células T CD4+ purificadas de donantes sanos con péptido de tipo salvaje 3S/gp41 pre-tratado con la Ig purificada de los ratones inmunizados. La Figura 4C demuestra que la expresión de NKp44L inducida por 3S se reduce significativamente en presencia de Ig de 3S-WT (9,4 %), en comparación con células de control (35,5 %), en consonancia con los datos anteriores con mAb de tipo salvaje anti-3S (Vieillard et al PNAS 2005). Más importante aún, también se observó una fuerte inhibición de la expresión de NKp44L en presencia de mutantes de alanina-3S/gp41, pero ligeramente más pronunciada con Ig de S613A y K617A que con mutantes W614A, S615A, N616A y S618A (Figura 4C). Estos resultados coinciden con datos de desgranulación de células NK activadas con IL-2 contra células T CD4+ autólogas tratadas con péptido 3S en presencia de Ab de WT o mutantes de alanina-3S/gp41. Por lo tanto, la desgranulación se inhibió a 91,4 % en WT y a 78,3 ± 4,8 % en mutantes de alanina 3S/gp41, cualquiera que sea la posición de la sustitución (Figura 4D). Esto indicó que las Ig generadas a partir del péptido 3S/gp41 con sustituciones específicas adquieren una amplia capacidad neutralizante al tiempo que protegen, permitiendo la inhibición de la expresión de NKp44L en las células T CD4+ .
Ejemplo 5 : Mutante 3S anti-W614A ampliamente NAbs en plasma de pacientes con VIH-1
Recientemente se demostró que las actividades de Nab ampliamente reactivas parecen desarrollarse con el tiempo en pacientes infectados por VIH. Para obtener información sobre la frecuencia con la que se obtienen bNAb para el motivo 3S/gp41 sustituido en la infección por VIH, los autores de la invención han analizado la actividad de neutralización en 106 muestras de plasma derivadas de pacientes infectados por VIH-1 con una diversidad de características clínicas. De las 106 muestras evaluadas, 55/106 (52%) tenían un nivel detectable de Ab anti-3S-WT, con valores que varíaban entre 15 y 325 AU/ml. Una prueba de Spearman revela una relación altamente significativa entre la cantidad de Ab anti-3S y el recuento de CD4 (p < 0,0001) (datos no mostrados), como se describe (Vieillard et al AIDS 2006). Inesperadamente, se detectaron anticuerpos dirigidos específicamente contra el motivo 3S/gp41 mutado con W614A en 5 a 106 plasmas (4,7 %) mediante ELISA. Para cada uno de ellos, se detectó un alto nivel de Ab (varió entre 120 y 250 AU/ml). Estos anticuerpos específicos eran isotipos IgG (datos no mostrados) y se detectaron exclusivamente en pacientes con recuento elevado de CD4 (822 ± 89 CD4/mm3) y carga viral indetectable (inferior a 20 copias/ml) (Tabla 3). Es de señalar que estos Ab dirigidos específicamente contra el motivo 3S/gp41 mutado con W614A no son detectables en el plasma de donantes sanos (datos no mostrados), así como los Ab para el motivo de tipo salvaje (Vieillard et al AIDS 2006).
Se investigaron muestras de plasma de estos 5 pacientes peculiares y los niveles de neutralización, expresados como la dilución recíproca del plasma, revelaron una actividad neutralizante anti-VIH de clados cruzados para todos estos plasmas, con una CI50 > 100 para todos ellos, en presencia de los virus X4 NL4.3 y R5 YU-2. Curiosamente, el plasma de 1 de estos pacientes (n° 109) neutralizó al menos el 95 % de las partículas de VIH (Tabla 3). Para confirmar que la actividad neutralizante está asociada con Ab específicamente dirigido contra el motivo mutado W614A 3S/gp41, Abs de los sueros de los 5 pacientes infectados con VIH se inmuno-purificaron con el péptido sintético correspondiente. Estos Abs eluidos muestran una actividad neutralizante significativa con valores de CI50 entre < 0,2 y 1,9 pg/ml, o < 0,2 y 1,9 pg/ml, en células Hela-P4C5 y TZM-bl, respectivamente, para al menos dos cepas de VIH-1 diferentes (Tabla 3). Sorprendentemente, los anticuerpos purificados de 1 de estos 5 pacientes (n° 109) muestran una amplitud similar de actividad neutralizante contra todas las cepas X4 y R5 de VIH-1 con una CI95 que variaba entre 0,6 y 1,9 pg/ml, independientemente del ensayo de neutralización (Tabla 3). Estos datos fueron confirmados por la producción de p24 en células T CD4+ purificadas que mostraron una sólida actividad neutralizante que varió entre 0,2 y 1,0 pg/ml y 0,11 y 1,8 pg/ml después de la infección con NL4.3 y NDK, respectivamente (Figura 5A). Además, un estudio cinético demuestra que la producción de p24 en el sobrenadante libre de células disminuye de manera muy significativa con 1 pg/ml de Abs inmuno-purificados de pacientes infectados por el VIH-1, independientemente del tiempo post-infección, en comparación con los controles (Figura 5B).
A continuación, los autores de la invención quisieron determinar el efecto de la inhibición de NKp44L por estos bNAb neutralizantes, que reconocían específicamente el motivo mutado W614A 3S/gp41, purificado de pacientes infectados con VIH-1. La Figura 5C demuestra que todos los NAbs anti-W614A conservaron sus capacidades para inhibir NKp44L, en comparación con las células de control sensibilizadas con 3S; sin embargo, en comparación con el Ab anti-3S/gp41 de tipo salvaje, de ratones o purificado de un paciente con VIH-1 (n° 117), la eficacia está ligeramente modulada a la baja. De hecho, el 21,9% de las células expresaron NKp44L en presencia de anti-3S-WT Ab purificado, mientras que del 21,9 al 34,6% de las células siguen siendo NKp44L+ después del tratamiento con bNAbs 3S/gp41 mutados anti-W614A de pacientes con VIH-1. De manera importante, el cultivo conjunto de células T CD4+ autólogas, tratadas con Ab de tipo salvaje o purificado 3S/gp41 anti-W614A, con células NK activadas por IL2 autólogas reveló que la expresión de CD107a se reduce o abolió de forma muy significativa, con valores que varíaban entre 1,8 y 7,8 % de células NK CD107a+NKp44+ , en comparación con 28,6 % en células NK cultivadas conjuntamente con células T diana CD4+ sensibilizadas con 3S en ausencia de Ab (Figura 5D). Juntos, estos datos revelan que la provocación de bNAb natural contra una forma mutada específica del motivo 3S/gp41 está presente en algunos infectados por VIH-1, que poseen efectos dicotómicos, acoplando tanto la neutralización viral como la inhibición del agotamiento de CD4.
Tabla 1: Ensayo de neutralización en células Hela P4C5
Virus mutante 3S/gp41 Especificidad del co-receptor CI50 (pg/ml) CI95 (pg/ml)
NL4.3 X4 >20 >20
S613A >20 >20
W614A 3,4 17,4
S615A 7,1 >20
N616A 5,8 19,5
K617A >20 >20
S618A 8,0 >20
BRU X4 >20 >20
S613A >20 >20
W614A 3,8 6,7
S615A 8,1 >20
N616A 3,3 6,0
K617A >20 >20
S618A 8,6 >20
NDK X4 >20 >20
S613A >20 >20
W614A 3,3 12,9
S615A 5,9 >20
N616A 4,2 >20
K617A >20 >20
S618A 8,9 >20
JR-CSF R5 18,1 >20
S613A >20 >20
Virus mutante 3S/gp41 Especificidad del co-receptor CI50 (pg/ml) CI95 (pg/ml)
W614A 6,1 19,5
S615A 15,7 >20
N616A 5,6 >20
K617A >20 >20
S618A 11,0 >20
YU-2 R5 >20 >20
S613A >20 >20
W614A 10,3 19,5
S615A 17,7 >20
N616A 8,3 >20
K617A >20 >20
S618A 16,8 >20
Tabla 2: Ensayo de neutralización en células TZM-bl
Virus mutante 3S/gp41 Especificidad del co-receptor CI50 (pg/ml) CI95 (pg/ml)
NL4.3 X4 >20 >20
S613A >20 >20
W614A 5,4 17,4
BRU X4 >20 >20
S613A >20 >20
W614A 3,9 11,9
NDK X4 >20 >20
S613A >20 >20
W614A 6,3 18,9
JR-CSF R5 >20 >20
S613A >20 >20
W614A 8,1 19,5
YU-2 R5 >20 >20
S613A >20 >20
W614A 10,3 20
ROD HIV-2
S613A >20 >20
W614A >20 >20
Tabla 3. Características y actividad neutralizante de pacientes infectados por VIH que producen Ab anti-W614A-3S/gp41 específicos para el mutante W614A 3S/gp41.
Pacientes infectados por el VIH
#105a #24 #44 #65 #71 #109 Recuento de CD4/mm3 752 825 816 650 856 1040 Relación CD4/CD8 0,7 1,0 1,1 0,8 0,7 1,2
Carga viral <20 <20 <20 <20 <20 <20
Ab anti-W614A (Au/mL) < 10 220 220 140 150 250
Actividad de NAb en
plasmab (CI50/CI95)
NL4.3 <40/<40 1280/75 1115/56 827/<40 452/<40 >2000/875
YU-2 <40/<40 480/<40 360<40 220/<40 128/<40 1120/65
Pacientes infectados por el VIH
#105a #24 #44 #65 #71 #109
Actividad de NAb en
Abc purificado (CI50/CI95)
NL4.3 >2/>2 0,3/1,5 0,3/1,6 1,5/>2 1,8/>2 <0,2/0,6 NDK >2/>2 0,4/1,9 0,6/>2 1,8/>2 1,9/>2 <0,2/0,9 JRCSF >2/>2 0,8/>2 0,9/>2 >2/>2 >2/>2 0,2/1,6 YU-2 >2/>2 1,4/>2 1,3/>2 1,8/>2 1,9/>2 0,3/1,9 ROD >2/>2 >2/>2 >2/>2 >2/>2 >2/>2 >2/>2
Actividad de NAb con
Abd purificado (CI50/CI95)
NL4.3 >2/>2 0,4/1,6 0,4/1,9 1,6/>2 1,9/>2 <0,2/1,1 BRU >2/>2 0,5/>2 0,9/>2 1,9/>2 >2/>2 0,3/2,6 JRCSF >2/>2 0,9/>2 1,4/>2 >2/>2 >2/>2 0,9/1,9 YU-2 >2/>2 1,7/>2 1,6/>2 >2/>2 >2/>2 0,6/1,7 ROD >2/>2 >2/>2 >2/>2 >2/>2 >2/>2 >2/>2 a n° 107: muestra infectada con VIH, que no produjo Ab anti-W614A-3S/gp, pero 125 AU/mL de Ab anti-3S WT. Se inmuno-purificaron Abs específicos de los sueros con el péptido 3S-WT, como control.
b La actividad de NAb en suero se expresa como la dilución recíproca de plasma inactivado por calor que estableció una inhibición del 50 % (CI50) o del 95 % (CI95), respectivamente, de la infección viral en células Hela P4C5.
c La actividad de NAb en Ab purificado se expresa en microgramos de Ab que estableció una inhibición del 50 % (CI50) o del 95 % (CI95), respectivamente, de la infección viral en células Hela P4C5.
d La actividad de NAb en Ab purificado suero se expresa en microgramos de Ab que estableció una inhibición del 50 % (CI50) o del 95 % (CI95), respectivamente, de la infección viral en células TZM-bl.
Tabla 4
polipéptidos
WT S613A W614A S615A N616A K617A S618A
Ady. <1 :20 <1 :20 <1 :20 <1 :20 <1 :20 <1 :20 <1 :20 WT >1 :1280 1 1280 <1 :20 1 :320 1 160 1 :640 1 320 M1 1 1280 >1 :1280 1 :20 1 :640 1 320 1 :640 1 640 M2 1 40 1 40 >1 :1280 1 :20 1 80 <1 :20 1 20 M3 1 320 1 320 <1 :20 >1 :1280 1 320 1 :160 1 320 M4 1 640 1 640 <1 :20 1 :640 >1 :1280 1 160 M5 1 1280 1 1280 <1 :20 1/80 1/40 >1 :1280 1 80 M6 1 640 1 640 1 :20 1 160 1 160 1 :40 >1 :1280

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Una composición inmunogénica que comprende un péptido antigénico de fórmula (I), el cual, cuando dicha composición inmunogénica se administra a un individuo, aumenta la producción de anticuerpos dirigidos contra dicho péptido de fórmula (I) que están dotados de propiedades neutralizantes frente a una pluralidad de aislados clínicos de VIH-1,
en donde el péptido antigénico de fórmula (I) se selecciona del grupo que consiste en:
- PWNASASNKSLDDIW (SEQ ID N° 12),
- PWNASWANKSLDDIW (SEQ ID N° 13),
- PWNASWSAKSLDDIW (SEQ ID N° 14), y
- PWNASWSNKALDDIW (SEQ ID N° 15).
2. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el péptido antigénico está enlazado covalentemente a una molécula portadora.
3. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el péptido antigénico se combina con al menos un adyuvante de inmunidad.
4. La composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que consiste en una composición de vacuna en la que el péptido antigénico se combina con al menos un adyuvante de la inmunidad.
5. Un péptido antigénico como se define en la reivindicación 1 o 2.
6. El péptido antigénico de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicho péptido antigénico está enlazado covalentemente a una molécula portadora.
7. Un método para detectar y/o cuantificar anticuerpos dirigidos contra un péptido en una muestra, que comprende las siguientes etapas:
a) poner en contacto una muestra a testar con uno o más péptidos antigénicos según se define en la reivindicación 1 o 2, y
b) detectar y/o cuantificar la formación de complejos entre dichos péptidos antigénicos y anticuerpos presentes en dicha muestra.
8. Un kit para detectar y/o cuantificar anticuerpos dirigidos contra un péptido en una muestra, que comprende: a) uno o más péptidos antigénicos como se define en la reivindicación 1 o 2, y
b) uno o más reactivos para detectar complejos formados entre dichos péptidos antigénicos y anticuerpos presentes en dicha muestra.
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