ES2911714T3 - Proteína M013 expresada por AAV como un terapéutico antiinflamatorio para su uso en un método de tratamiento de enfermedad ocular inflamatoria - Google Patents

Abstract

Un vector de virus adeno-asociado (AAV) para su uso en el tratamiento de uno o más síntomas de inflamación en el ojo de un mamífero, en donde el mamífero ha sido diagnosticado con degeneración macular, degeneración macular senil (DMS), atrofia geográfica, DMS húmeda, DMS seca, formación de drusas, ojo seco, retinopatía diabética, vitreorretinopatía, inflamación de la córnea, uveítis, hipertensión ocular o glaucoma, y en donde el vector vírico comprende un polinucleótido que comprende un segmento de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido M013 modificado derivado de virus y un péptido señal de secreción, en donde el segmento de ácido nucleico aislado está operativamente unido a un promotor que expresa el polipéptido de fusión codificado en una o más células hospedadoras de mamífero seleccionadas en donde el vector comprende además un péptido de penetración celular seleccionado de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO:13 a SEQ ID NO:111.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteína M013 expresada por AAV como un terapéutico antiinflamatorio para su uso en un método de tratamiento de enfermedad ocular inflamatoria

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

La presente solicitud reivindica prioridad a la solicitud provisional de Estados Unidos N.° 61/951.294; presentada el 11 de marzo de 2014 (en trámite; expediente de agente N.° 36689.343).

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere, en general, a los campos de la biología molecular y la virología, y en particular, al desarrollo de vehículos de administración génica. En la presente solicitud, se describe el uso de una versión modificada permeable a las células de la proteína M013 específica de virus como un reactivo antiinflamatorio.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA

La degeneración macular senil (DMS) seca se ha asociado a un aumento en los procesos de estrés oxidativo e inflamatorios en la retina. Se han detectado moléculas oxidadas, como el 4-hidroxinonenal (4-HNE) y los componentes del complemento activado, en los ojos de pacientes con DMS seca, lo que demuestra además la función de estos procesos en esta enfermedad.

Lo que falta en el estado de la técnica son vectores víricos que pueden ser usados para suministrar construcciones terapéuticas a poblaciones seleccionadas de células in vitro o in vivo. El desarrollo de dichos vectores, y las composiciones que los comprenden, proporcionarían un avance importante en la genoterapia humana, y particularmente en el tratamiento de enfermedades mediadas por inflamación, tales como la artritis, la retinopatía diabética, la DMS seca, la vasculitis, la uveítis recurrente, la enfermedad de Bechet, el lupus eritematoso, la nefritis y similares.

BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención vence estas y otras limitaciones inevitables del estado de la técnica proporcionando construcciones de vector AAV que son capaces de, y están optimizadas para, la administración de péptidos antiinflamatorios, tales como los derivados de la proteína M013 vírica, a células y/o tejidos de mamífero seleccionados. En particular, la invención proporciona novedosas construcciones basadas en vector AAV y no obvias que suministran un producto génico M013 secretable de penetración celular y derivado de virus a células de mamífero seleccionadas. Estas construcciones genéticas codifican polipéptidos M013 que inhiben una o más citocinas proinflamatorias [que incluyen, por ejemplo, IL-1 beta (IL-1 p) e IL-18] en una variedad de afecciones anormales en mamíferos, que incluyen, por ejemplo, enfermedades oculares, tales como degeneración macular senil (DMS), retinopatía diabética y uveítis recurrente.

Más particularmente, en un primer aspecto de la presente invención se proporciona un vector de virus adeno-asociado (AAV) para su uso en el tratamiento de uno o más síntomas de inflamación en el ojo de un mamífero, en donde el mamífero ha sido diagnosticado con degeneración macular, degeneración macular senil (DMS), atrofia geográfica, DMS húmeda, DMS seca, formación de drusas, ojo seco, retinopatía diabética, vitreorretinopatía, inflamación de la córnea, uveítis, hipertensión ocular o glaucoma, y en donde el vector vírico comprende un polinucleótido que comprende un segmento de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido M013 modificado derivado de virus, y un péptido señal de secreción, en donde el segmento de ácido nucleico aislado está unido operativamente a un promotor que expresa el polipéptido de fusión codificado en una o más células hospedadoras de mamífero seleccionadas, en donde el vector comprende además un péptido de penetración celular seleccionado de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO:13 a SEQ ID NO:111.

En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una pluralidad de viriones o partículas víricas infecciosas que comprenden el vector AAV para su uso según la presente invención.

En aún un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una composición que comprende un vector AAV y un tampón, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, para su uso en el tratamiento de uno o más síntomas de inflamación en el ojo de un mamífero, en donde el mamífero ha sido diagnosticado con degeneración macular, degeneración macular senil (DMS), atrofia geográfica, DMS húmeda, DMS seca, formación de drusas, ojo seco, retinopatía diabética, vitreorretinopatía, inflamación de la córnea, uveítis, hipertensión ocular o glaucoma, y en donde el vector vírico comprende un polinucleótido que comprende un segmento de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido M013 modificado derivado de virus y un péptido señal de secreción, en donde el segmento de ácido nucleico aislado está unido operativamente con un promotor que expresa el polipéptido de fusión codificado en una o más células hospedadoras de mamífero seleccionadas, en donde el vector comprende además un péptido de penetración celular seleccionado de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en SeQ ID n O:13 a SEQ ID NO:111.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona un kit que comprende: a) un vector AAV o b) o una pluralidad de viriones o partículas víricas infecciosas que comprenden el vector AAV de a); y c) instrucciones para usar el vector o la pluralidad de viriones o partículas infecciosas para su uso en el tratamiento de uno o más síntomas de inflamación en el ojo de un mamífero, en donde el mamífero ha sido diagnosticado con degeneración macular, degeneración macular senil (DMS), atrofia geográfica, DMS húmeda, DMS seca, formación de drusas, ojo seco, retinopatía diabética, vitreorretinopatía, inflamación de la córnea, uveítis, hipertensión ocular o glaucoma, y en donde el vector vírico comprende un polinucleótido que comprende un segmento de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido M013 modificado derivado de virus y un péptido señal de secreción, en donde el segmento de ácido nucleico aislado está operativamente unido a un promotor que expresa el polipéptido de fusión codificado en una o más células hospedadoras de mamífero seleccionadas y en donde el vector comprende además un péptido de penetración celular seleccionado de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO:13 a SEQ ID NO:111.

En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un vector AAV para su uso en el tratamiento de síntomas de una enfermedad mediada por inflamación seleccionada de degeneración macular, degeneración macular senil (DMS), atrofia geográfica, DMS húmeda, DMS seca, formación de drusas, ojo seco, retinopatía diabética, vitreorretinopatía, inflamación de la córnea, uveítis, hipertensión ocular o glaucoma, transduciendo una población de células de mamífero introduciendo en una o más células de la población una composición que comprende un vector AAV que comprende un polinucleótido que comprende un segmento de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido M013 modificado derivado de virus y un péptido señal de secreción, en donde se transforma el segmento de ácido nucleico aislado unido operativamente a un promotor que expresa el polipéptido de fusión codificado en una o más células hospedadoras de mamífero seleccionadas, en donde el vector comprende además un péptido de penetración celular seleccionado de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO:13 a SEQ ID NO:111.

La presente invención vence las limitaciones en el estado de la técnica proporcionando nuevos vectores de genoterapia basados en AAV que suministran un péptido secretable de penetración celular, tal como el péptido o polipéptido M013 vírico, a una o más células hospedadoras diana o tejidos. Cuando se expresa en células hospedadoras de mamífero adecuadamente transformadas, el producto génico expresado inhibe una variedad de citocinas proinflamatorias endógenas (incluyendo, sin limitación, interleucinas, tales como IL-1 p e IL-18). En una realización a modo de ejemplo, las construcciones de genoterapia de la invención que comprende péptidos basados en M013 que fueron útiles en la inhibición del proceso de respuestas inflamatorias en un modelo de mamífero establecido de DMS seca.

Las construcciones descritas en el presente documento proporcionan estrategias de tratamiento nuevas y útiles para una variedad de enfermedades, afecciones o trastornos de mamífero que están asociados con, provocados por, o agravados debido a, una o más respuestas de estrés oxidativo celular o una o más etapas en el proceso de inflamación.

En realizaciones a modo de ejemplo, se explotó un péptido de fusión tatM013 vectorizado con virus para tratar trastornos inflamatorios basados en tejido, usando un método en el que la construcción de vector se suministró directamente a una o más poblaciones de células diana seleccionadas. Y, lo que es más importante, se ha mostrado que las construcciones de expresión basadas en virus de la presente invención (y en particular, las encapsidadas en viriones basados en AAV) reducen la inflamación en varios procesos de enfermedad para los que actualmente no existen terapias eficaces. Las composiciones y los métodos desvelados proporcionan nuevas modalidades terapéuticas para un hospedador de enfermedades de mamífero mediadas por inflamación, que incluyen, por ejemplo, las del ojo, el intestino y/o uno o más de los órganos internos o tejidos diana a los que se pueden suministran de forma segura, fiable y adecuadamente dichos vectores víricos, tales como casetes de expresión basados en rAAV.

Ventajosamente, los vectores víricos y las construcciones de expresión de la presente invención (así como los viriones infecciosos y las partículas víricas que los contienen) tienen una eficiencia mejorada en la transducción de uno o más de células de un mamífero, y en particular, una o más células de un ojo humano, y que facilita la expresión de la proteína M013 en células transformadas con el virus. En realizaciones particulares, el uso de partículas víricas modificadas por proteínas de la cápside para suministrar las construcciones de expresión de interés ha producido la transducción altamente eficiente de células seleccionadas de mamífero con poblaciones de las partículas víricas terapéuticas.

En un sentido global y general, la invención proporciona polinucleótidos aislados y purificados que codifican uno o más de los vectores rAAV desvelados descritos en el presente documento, así como pluralidades de viriones víricos adenoasociados infecciosos que contienen dicho polinucleótido. Preferentemente, las construcciones de vector de la presente invención incluyen al menos un segmento de ácido nucleico que codifica al menos un péptido o proteína derivado de M013 unido operativamente a un promotor que es capaz de expresar el segmento de ácido nucleico en células de mamífero adecuadas que han sido transformadas con la construcción de vector.

En la práctica de la invención, los vectores rAAV desvelados incluirán preferentemente al menos un polinucleótido que comprende uno o más promotores, uno o más potenciadores, una o más secuencias reguladoras posttranscripcionales, una o más señales de poliadenilación, o cualquier combinación de los mismos, unido operativamente al segmento de ácido nucleico que codifica la proteína o péptido terapéutico derivado de M013 seleccionado para permitir la expresión de la construcción en células hospedadoras de mamífero seleccionadas.

En ciertas realizaciones, dicho(s) promotor(es) puede(n) incluir un promotor homólogo, un promotor heterólogo, un promotor endógeno, un promotor exógeno, un promotor sintético, un promotor híbrido, un promotor vírico, un promotor específico de célula, un promotor específico de tejido, o cualquier combinación de los mismos que es/son capaces de expresar el segmento de ácido nucleico que codifica M013 en células y/o tejidos seleccionados de un sujeto mamífero.

Los vectores rAAV preparados según la presente invención también pueden incluir además opcionalmente una o más secuencias del ácido nucleico adicionales que se unen cada una operativamente al segmento de ácido nucleico que codifica el agente terapéutico. Las secuencias a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, una o más seleccionadas del grupo que consiste en una secuencia potenciadora derivada de virus, una secuencia potenciadora derivada de mamífero, un potenciador sintético, una secuencia potenciadora específica de célula o de tejido, una o más repeticiones terminales invertidas, uno o más sitios de clonación múltiple, sitios de escisión de la restricción, señales de poliadenilación, secuencias reguladoras post-transcripcionales, secuencias señal de la secreción, o cualquier combinación de los mismos.

Las secuencias reguladoras post-transcripcionales a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, elementos reguladores de la post-transcripción del virus de la hepatitis de la marmota, secuencias señal de poliadenilación, señales de unión/corte y empalme de intrón/exón, elementos sintéticos, o cualquier combinación de los mismos.

Los vectores víricos de la presente invención también pueden incluir opcionalmente además una región de secuencia del ácido nucleico adicional que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, uno o más policonectores, sitios de restricción y/o múltiples región (regiones) de clonación para facilitar la inserción (clonación) de uno o más elementos genéticos seleccionados, genes de interés, o construcciones terapéuticas o de diagnóstico en el vector en un sitio predeterminado.

En aspectos adicionales de la presente invención, el (los) polinucleótido(s) exógeno(s) que se puede(n) administrar en células hospedadoras adecuadas por los vectores víricos desvelados son preferentemente de origen de mamífero, con polinucleótidos que codifican uno o más polipéptidos o péptidos de origen humano, primate no humano, porcino, bovino, ovino, felino, canino, equino, epino, caprino o lupino, siendo también preferidos para ciertos usos de las composiciones de vector desveladas.

En ciertas realizaciones, los vectores víricos desvelados incluirán opcionalmente además un segundo segmento de ácido nucleico que expresa o codifica una o más moléculas de diagnóstico o terapéuticas, que incluyen, sin limitación, uno o más polipéptidos, péptidos, ribozimas, ácidos nucleicos peptídicos, ARNip, iARN, oligonucleótidos antisentido, polinucleótidos antisentido, anticuerpos, fragmentos de unión al antígeno, o cualquier combinación de los mismos. Dichos agentes terapéuticos adicionales pueden incluir, sin limitación, uno o más agonistas, antagonistas, factores antiapoptosis, inhibidores, receptores, citocinas, citotoxinas, agentes eritropoyéticos, glucoproteínas, factores de crecimiento, receptores de factor de crecimiento, hormonas, receptores de hormonas, interferones, inhibidores de interleucina, receptores de interleucina, factores de crecimiento nervioso, péptidos neuroactivos, receptores de péptidos neuroactivos, proteasas, inhibidores de la proteasa, proteínas descarboxilasas, proteínas cinasas, inhibidores de proteínas cinasas, enzimas, proteínas de unión al receptor, proteínas de transporte o uno o más inhibidores de las mismas, receptores de serotonina, o uno o más inhibidores de la captación de los mismos, serpinas, receptores de serpina, supresores de tumores, moléculas de diagnóstico, marcadores moleculares, agentes quimioterapéuticos, citotoxinas, o cualquier combinación de los mismos.

Cuando se desean terapias combinatorias de genes, se pueden producir dos o más moléculas diferentes a partir de un único sistema de expresión de rAAV, o alternativamente, se puede transfectar una célula hospedadora seleccionada con dos o más sistemas de expresión de rAAV únicos, cada uno de los cuales puede comprender uno o más polinucleótidos distintos que codifican uno o más agentes de diagnóstico y/o terapéuticos.

Los vectores víricos de la presente invención son preferentemente vectores rAAV, que incluyen, sin limitación, los derivados de, o comprendidos en un virión que tiene un serotipo que se selecciona del grupo que consiste en serotipo 1 de AAV (AAV1), serotipo 2 de AAV (AAV2), serotipo 3 de AAV (Aa V3), serotipo 4 de AAV (a Av 4), serotipo 5 de a Av (AAV5), serotipo 6 de a Av (AAV6), serotipo 7 de AAV (AAV7), serotipo 8 de AAV (AAV8), serotipo 9 de Aa V (AAV9), serotipo 10 de AAV (AAV10), serotipo 11 de AAV (AAV11), serotipo 12 de AAV (AAV12), o cualquier otro serotipo como conoce un experto en las artes víricas.

En realizaciones relacionadas, la invención proporciona además poblaciones y pluralidades de vectores víricos, viriones, partículas víricas infecciosas, o células hospedadoras que incluyen uno o más segmentos de ácidos nucleicos que codifican un CPP, tal como una proteína o péptido específico de M013, unida operativamente con un promotor seleccionado capaz de expresar el CPP codificado en al menos una célula de mamífero de interés.

La invención proporciona además composición y formulaciones que incluyen una o más de las proteínas, segmentos de ácidos nucleicos, vectores víricos, células hospedadoras o partículas víricas de la presente invención junto con uno o más tampones, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables. Dichas composiciones se pueden incluir en uno o más kits de diagnóstico o terapéuticos, para diagnosticar, prevenir, tratar o mejorar uno o más síntomas de una enfermedad, lesión, trastorno, traumatismo o disfunción de mamífero, y en particular, para el tratamiento de estrés oxidativo y/o inflamación en una o más células humanas.

La invención también muestra métodos de preparación, así como métodos de uso, de los vectores víricos desvelados en una variedad de formas, que incluyen, por ejemplo, aplicaciones, metodologías, procedimientos de diagnóstico y/o métodos de genoterapia ex situ, in vitro e in vivo como se expone en las reivindicaciones. Los vectores desvelados son particularmente aptos para regímenes de genoterapia humana basada en vectores víricos, y para administrar una o más construcciones genéticas, que incluyen, por ejemplo, un péptido M013, a una o más poblaciones de células seleccionadas de mamífero, ya sea in vivo o in vitro.

En un aspecto, la invención proporciona composiciones que comprenden vectores víricos adeno-asociados (AAV) recombinantes, viriones, partículas víricas y formulaciones farmacéuticas de los mismos, útiles en métodos para administrar material genético que codifica uno o más producto(s) beneficioso(s) o terapéutico(s) a células y tejidos de mamífero. En particular, las composiciones y los métodos de la invención proporcionan un avance significativo en la técnica mediante su uso en el tratamiento, la prevención y/o la mejoría de los síntomas de una o más enfermedades de mamífero asociadas a uno o más de estrés oxidativo o respuestas inflamatorias como se reivindica.

En particular, la invención proporciona construcciones de expresión basadas en rAAV que codifican uno o más de agente(s) terapéutico(s) de mamífero (que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, proteína(s) derivada(s) de M013, polipéptido(s), péptido(s), enzima(s), anticuerpos, fragmentos de unión al antígeno, así como variantes, y/o fragmentos activos de los mismos, para su uso en el tratamiento, la profilaxis y/o la mejoría de uno o más síntomas de una enfermedad, disfunción, lesión y/o trastorno de mamífero, como se expone en las reivindicaciones.

En otras realizaciones, la invención también proporciona vectores víricos que están comprendidos dentro de una partícula vírica infecciosa o un virión, así como pluralidades de dichos viriones o partículas infecciosas. Dichos vectores y viriones pueden estar comprendidos dentro de uno o más diluyentes, tampones, disoluciones fisiológicas o vehículos farmacéuticos, o formulados para administración a un mamífero en uno o más regímenes de diagnóstico, terapéuticos y/o profilácticos. Los vectores, virus partículas, viriones y pluralidades de los mismos de la presente invención también se pueden proporcionar en formulaciones de excipiente que son aceptables para administración veterinaria a ganado seleccionado, animales exóticos, animales domesticados y animales de compañía (incluyendo mascotas y similares), así como a primates no humanos, especímenes zoológicos o de otro tipo en cautividad, y similares.

Dichas composiciones farmacéuticas de la invención reivindicada pueden comprender opcionalmente además uno o más diluyentes, tampones, liposomas, un lípido, un complejo de lípido. Alternativamente, los vectores de la presente invención pueden estar comprendidos dentro de una pluralidad de microesferas, nanopartículas, liposomas, o una combinación de los mismos. Se prefieren particularmente las formulaciones farmacéuticas adecuadas para administración a una o más células, tejidos y/u órganos de un ser humano.

Los kits comprenden uno o más de los vectores víricos desvelados (así como uno o más viriones, partículas víricas, células hospedadoras transformadas o composiciones farmacéuticas que comprenden dichos vectores); e instrucciones para el uso de dichos kits en una o más realizaciones clínicas terapéuticas, de diagnóstico y/o profilácticas también se proporcionan por la presente invención, como se expone en las reivindicaciones. Dichos kits pueden comprender además uno o más reactivos, enzimas de restricción, péptidos, terapéuticos, compuestos farmacéuticos, o medios para la administración de la(s) composición (composiciones) a células hospedadoras, o a un animal (por ejemplo, jeringas, inyectables y similares). Los kits a modo de ejemplo incluyen aquellos para tratar, prevenir o mejorar los síntomas de una enfermedad, deficiencia, disfunción y/o lesión, o pueden incluir componentes para la producción a gran escala de los vectores víricos en sí, tales como para venta comercial, o para su uso por otros, que incluyen, por ejemplo, virólogos, profesionales médicos y similares.

Dichos kits también pueden incluir además uno o más componentes de encapsidación de rAAV, tales como a) una célula hospedadora que expresa al menos un gen rep y/o al menos un gen cap, b) un producto génico de virus auxiliar; c) un virus auxiliar, tal como adenovirus o virus del herpes, o d) cualquier combinación de los mismos para facilitar la encapsidación de los vectores de expresión en viriones o partículas víricas infecciosas adecuados.

Otro aspecto importante de la presente invención se refiere a métodos de uso de los vectores rAAV desvelados, viriones, sistemas de expresión, composiciones y células hospedadoras como se describe en el presente documento en la preparación de medicamentos para tratar o mejorar al menos un síntoma de una enfermedad, una disfunción, un trastorno, una afección anormal, una deficiencia, lesión o traumatismo en un animal, y en particular, en una o más células o tejidos de un mamífero vertebrado. Dichos métodos implican, en general, la administración directa al mamífero en necesidad del mismo de uno o más de los CPP desvelados (y preferentemente vectores rAAV que expresan péptido M013), viriones, partículas víricas, células hospedadoras, composiciones, o pluralidades de los mismos, en una cantidad y durante un tiempo suficiente para tratar o mejorar uno o más síntomas de dicha enfermedad, disfunción, trastorno, afección anormal, deficiencia, lesión o traumatismo en el animal afectado, como se expone en las reivindicaciones. Las composiciones de la invención también se pueden usar para la profilaxis de uno o más animales que se sospecha que tienen dicha afección expuesta en las reivindicaciones, así como para la administración a uno o más animales que se ha determinado que están en riesgo de desarrollar una o más de dichas afecciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Para promover un entendimiento de los principios de la invención, ahora se hará referencia a las realizaciones, o ejemplos, ilustrados en los dibujos y se usará lenguaje específico para describirlos. Sin embargo, se entenderá que así no se pretende ninguna limitación del alcance de la invención. Se contempla cualquier alteración y modificación adicional de las realizaciones descritas, y cualquier aplicación adicional de los principios de la invención como se describe en el presente documento, como se le ocurriría normalmente a un experto habitual en la técnica a la que se refiere la invención.

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para mostrar ciertos aspectos de la presente invención. La solicitud contiene al menos un dibujo que está hecho en color. Copias de esta patente o publicación de solicitud de patente con dibujo(s) en color serán proporcionadas por la Oficina de Patentes y Marcas tras su solicitud y pago de la tasa necesaria. La invención se puede entender mejor por referencia a la siguiente descripción tomada junto con los dibujos adjuntos, en los que números de referencia similares identifican elementos similares, y en los que:

Las FIG. 1A, FIG. 1B, FIG. 1C y FIG. 1D muestran una construcción de proteína de fusión de M013 del virus del mixoma que se puede usar para inhibir la secreción de la interleucina (IL)-1p. FIG. 1A: Se ha demostrado que la proteína M013 nativa del virus del mixoma inhibe tanto el factor nuclear (NF)- ^k B como las vías de señalización de los inflamasomas NLRP3 interactuando con componentes efectores clave. FIG. 1B: Mapa del vector lentivírico que suministra el gen de fusión TatM013. Se clonaron los genes de fusión M013 y TatM013 dentro del marco de lectura con el péptido 2A y la secuencia de resistencia a puromicina (puroR). FIG. 1C: Se transdujeron células THP-1 derivadas de monocito con un vector lentivírico que suministraba el gen de fusión M013-puroR, la fusión TatM013-puroR, o el gen puroR solo como control. Las células establemente transducidas se incubaron con IFN- ^y (4 h) y lipopolisacárido (LPS) (18 h). Se cuantificó por ELISA la IL-1 p secretada. La proteína M013 se midió en extractos de células por transferencia Western, y se comparó con control de tubulina (recuadro) (n = 3, promedio ± EEM). FIG. 1D:

Se transdujeron células ARPE-19 con cualquiera del vector lentivírico TatM013-puroR o puroR. Se incubaron las células establemente transducidas con 4-hidroxinonenal 30 pM (4-HNE, 18 h). Se cuantificó la IL-1 p secretada por ELISA (n = 3, promedio ± EEM). ASC, proteína de tipo punto asociada a la apoptosis que contiene un dominio de reclutamiento de caspasa; AmpR, gen de resistencia a ampicilina; cPPT, tramo de polipurina central; EF1, factor-1 de elongación; LTR VIH, repetición terminal larga del virus de la inmunodeficiencia humana; I ^k -B, inhibidor de NF- ^k B; IKKK, cinasa I ^k -B; n.s., no significativo; ORI/ori, origen de replicación; RRE, elemento de respuesta Rev; RSV, virus del sarcoma de Rous; SV40, virus 40 simio; TNF-a, factor de necrosis tumoral-a; WPRE, elemento regulador de la post-transcripción del virus de la hepatitis de la marmota. *p<0,05; ***p<0,0001;

las FIG. 2A, FIG. 2B y FIG. 2C muestran el desarrollo de una construcción de fusión TatM013 secretable y de penetración celular. FIG. 2A : Mapa del plásmido pCDH-EF1-sGFP-TatM013-T2A-Puro, una construcción a modo de ejemplo según un aspecto de la presente invención. En esta construcción a modo de ejemplo, el gen TatM013 se fusionó con el ADNc de la proteína verde fluorescente secretable (sGFP), separado por una secuencia de sitio de escisión por furina. El gen de fusión sGFP-TatM013 se clonó en el plásmido de vector lentivírico en la dirección 5’ y se fusionó con el péptido señal 2A y la secuencia de puroR. Todas estas secuencias se clonaron dentro del marco de lectura, que, tras la traducción, generó la proteína fusionada sGFP-TatM013 dirigida a la vía secretora. FIG. 2B : Expresión de sGFP-TatM013 en células transducidas con lentivirus. Se lisaron células HEK293T que expresan establemente GFP, un péptido de control fusionado con GFP o sGFP-TatM013, en tampón de lisis NP-40 (Lis). Las proteínas en el sobrenadante de cultivo (Sob) se concentraron como se describe. Se separó un total de 30 pg de proteína de cada muestra por SDS-PAGE, usando un gel al 12 %. La expresión de M013 se determinó por transferencia Western usando un anticuerpo anti-GFP. FIG. 2C: La proteína sGFP-TatM013 presentó un patrón de distribución perinuclear discreto en células. Las células HEK293T establemente transducidas se generaron por transfección con o GFP sin modificar o partículas de vector lentivírico sGFP-TatM013 y selección adicional con puromicina. La expresión de GFP se visualizó por microscopía de fluorescencia. DAPI, 4',6-diamidino-2-fenilindol; Lis, lisado; Sob, sobrenadante;

las FIG. 3A, FIG. 3B, FIG. 3C y FIG. 3D muestran la confirmación in vitro de la actividad del vector AAV que expresa sGFP-TatM013 a modo de ejemplo. FIG. 3A: Mapa del plásmido pTR-smCBA-sGFP-TatM013. Se clonó la secuencia sGFP-TatM013 en un plásmido AAV entre las repeticiones terminales invertidas AAV2 (TR). FIG. 3B: Distribución celular de sGFP-TatM013. Se transfectaron células HEK293T con el plásmido pTR-smCBA-sGFP-TatM013. Se validó la expresión de GFP a las 48 h, por microscopía de fluorescencia. Como control, se transfectaron células HEK293T con el plásmido pTR-smCBA-GFP, que suministra un gen GFP sin modificar. FIG. 3C: Secreción de la proteína de fusión sGFP-TatM013 en el medio de células transfectadas. Se concentró el medio acondicionado de las células de las que se obtuvieron imágenes en FIG. 3B . Se separaron por SDS-PAGE muestras de proteína de células lisadas (Lis) y medio acondicionado (Sob), y se detectó GFP con un anticuerpo anti-GFP. FIG. 3D: Se midió la actividad biológica de TatM013 secretado en células ARPE-19 humanas (izquierda). Se superpuso un total de 500 pl de medio de células transfectadas como en la FIG. 3B (acondicionado durante 48 h) sobre las células ARPE-19 durante 1 h. Las células se incubaron con o sin 4-HNE (40 gM) durante 18 h añadiendo este reactivo a los pocillos sin retirar el medio acondicionado, y se cuantificó por ELISA la IL-1 p secretada. La actividad biológica de TatM013 secretada se midió en células RAW 264.7 murinas (derecha). Se superpuso el medio acondicionado que contenía células transfectadas con GFP o sGFP-TatM013 sobre células RAW 264.7. Entonces se incubaron las células con o sin LPS (18 h), y se cuantificó por ELISA la IL-1 p secretada (n = 3, promedio ± EEM). *p < 0,05; **p < 0,001; ***p < 0,0001; y

las FIG. 4A, FIG. 4B, FIG. 4C y FIG. 4D muestran que la expresión de un producto génico TatM013 vectorizado con AAV a modo de ejemplo según un aspecto de la presente invención inhibió la respuesta inflamatoria observada en un modelo de uveítis inducida por endotoxina (EIU) murino a modo de ejemplo. FIG. 4A: Fondo de ratones inyectados por vía intravítrea con o AAV-GFP (ojo izquierdo) o AAV-sGFP-TatM013 (ojo derecho). Se muestran imágenes de campo brillante y de fluorescencia de un ojo no inyectado (Sin vector) para la comparación. FIG. 4B:

Una semana después, se inyectaron por vía intravítrea tres ratones con 175 ng de LPS (ambos ojos), y se recogió su humor vítreo 24 h después. La concentración secretada de IL-1 p se cuantificó por ELISA (promedio ± EEM).

FIG. 4C: Micrografías representativas de ojos inyectados con el vector AAV GFP o sGFP-TatM013 después de la inducción de uveítis (con 25 ng de LPS). Se cortaron ojos incorporados en parafina y se tiñeron (hematoxilinaeosina, H&E). Se tomaron imágenes de campo brillante con aumentos originales de 5x y 10x para observar células infiltrantes. FIG. 4D: La expresión del producto génico TatM013 de AAV disminuyó la inflamación en el modelo de EIU de ratón. Se inyectaron cinco ratones como se describe en la FIG. 4A. Veinticuatro horas después de la inyección de 25 ng de LPS, se recogieron los ojos de ratón y se procesaron para secciones de parafina. Las secciones de ojo se tiñeron con H&E y las células infiltrantes fueron contadas por un observador enmascarado (promedio ± EEM). vg, genomas de vector. *p < 0,05.

DESCRIPCIÓN DE REALIZACIONES ILUSTRATIVAS

A continuación, se describen realizaciones ilustrativas de la invención. En el interés de la claridad, no todas las características de una implementación real se describen en esta memoria descriptiva. Por supuesto, se apreciará que en el desarrollo de cualquier realización real se deberán tomar numerosas decisiones específicas de implementación para lograr los objetivos específicos de los desarrolladores, tales como el cumplimiento de las limitaciones relacionadas con el sistema y relacionadas con el negocio, que variarán de una implementación a otra. Además, se apreciará que dicho esfuerzo de desarrollo podría ser complejo y requerir tiempo, pero sería una tarea rutinaria para los expertos habituales en la técnica que tienen el beneficio de la presente divulgación.

La inflamación de la retina es un factor contribuyente en las enfermedades oculares, tales como la uveítis, la retinopatía diabética y la degeneración macular senil (DMS). Se ha mostrado que la proteína inmunomoduladora M013 del virus del mixoma interfiere con las vías de señalización proinflamatorias que implican tanto al inflamasoma de NLRP3 como a NF- ^k B. En la presente solicitud, los inventores han desarrollado y caracterizado un vector vírico adeno-asociado (AAV) que suministra una forma secretable y de penetración celular de la proteína M013 (TatM013). Se secretó la proteína TatM013 expresada y bloqueó la secreción inducida por la endotoxina de interleucina (IL)-1p en células derivadas de monocito y la secreción inducida por aldehído reactivo de IL-1 p en células del epitelio pigmentario de la retina. Se evaluaron los efectos antiinflamatorios locales de TatM013 suministrado por AAV en un modelo de ratón de uveítis inducida por endotoxina (EIU) después de la inyección intravítrea de ratones con un vector basado en AAV2 que lleva TatM013 fusionado con una marca de proteína verde fluorescente (GFP) secretada (sGFP-TatM013) o con la propia GFP. Se demostró la expresión del transgén sGFP-TatM013 por oftalmoscopia de fluorescencia en ratones vivos. En EIU, el número de células infiltrantes y la concentración de IL-1 p en el cuerpo vítreo fueron significativamente menores en los ojos inyectados con AAV-sGFP-TatM013 en comparación con los ojos inyectados con AAV-GFP de control. Estos resultados indicaron que un inhibidor de la respuesta inmunitaria innata derivado de virus, cuando se suministró por AAV, proporcionó una terapia eficaz y generalizada para el tratamiento de diversas enfermedades inflamatorias del ojo.

La degeneración macular senil seca (DMS) se ha asociado a un aumento en los procesos de estrés oxidativo e inflamatorios dentro de la retina. Se han detectado moléculas oxidadas, como 4-hidroxinonenal (4-HNE) y los componentes del complemento activado, en los ojos de pacientes con DMS seca, lo que soporta la función de estos procesos en las enfermedades.

Ciertas proteínas víricas codificadas por grandes virus de ADN poseen potentes propiedades antiinflamatorias. En la presente solicitud se desvela el desarrollo de una versión modificada permeable a las células de una proteína vírica específica llamada M013 como reactivo antiinflamatorio para tratar inflamación específica de tejido. Usando la enfermedad ocular inflamatoria como una diana de enfermedad a modo de ejemplo, se desarrollaron vectores de suministro de AAV que expresaron una proteína M013 modificada en células dentro del tejido inflamado del ojo.

Se han desarrollado muchos fármacos y reactivos para tratar enfermedades pro-inflamatorias y algunos de estos compuestos terapéuticos derivan de organismos biológicos naturales, tales como proteínas antiinflamatorias secretadas expresadas por virus de ADN grandes (revisado en Lucas y McFadden, 2004). A diferencia de los fármacos de molécula pequeña habituales y los reactivos biológicos típicos, tales como los anticuerpos monoclonales contra dianas inflamatorias únicas, que tienden a ser monofuncionales y actúan en una diana celular o vía específica, las proteínas víricas se han desarrollado durante millones de años para reconocer múltiples dianas y vías.

En la presente invención, la proteína M013 del virus del mixoma [que normalmente se expresa como una proteína citoplásmica pequeña que inhibe dos vías inflamatorias celulares distintas: las vías de señalización del inflamasoma y NFkB (Rahman, et al., 2013; Rahman et al., 2009)] ha sido explotada como un terapéutico para tratar afecciones mediadas por inflamación en mamíferos.

La proteína M013 es relativamente pequeña (188 aminoácidos), contiene un único dominio de pirina, e interactúa físicamente con dos proteínas hospedadoras separadas que regulan vías inflamatorias celulares: ASC-1 (un componente de armazón clave de inflamasomas celulares) y NFkB1/p105 (un precursor clave utilizado para la señalización de NFkB). Por lo tanto, la proteína M013 vírica expresada corta dos poderosas cascadas de señalización pro-inflamatoria celular: inflamasomas que controlan la secreción de citocinas inflamatorias como IL-1 p y IL-18, y la señalización de NFkB que controla la secreción de otra clase de citocinas pro-inflamatorias, tales como TNF, interferón e IL-6.

A diferencia de las proteínas víricas secretadas que se pueden expresar como proteínas recombinantes y luego usar directamente en pacientes como fármacos antiinflamatorios terapéuticos basados en proteína (Arsenault et al., 2012), las proteínas citoplásmicas, tales como M013, se debe suministrar genéticamente - es decir, se debe introducir un segmento de ácido nucleico que codifica M013 en las células usando un vector adecuado, y ese segmento de ácido nucleico se debe expresar en el interior de las células diana para producir la proteína citoplásmica codificada. Por lo tanto, para las proteínas, tales como M013 (o para derivados basados en el péptido M013), que van a ser útiles como agente terapéutico en un mamífero, se deben manipular vectores adecuados (tales como rAAV), y suministrar a células por un protocolo de genoterapia apropiado. Para su uso en el tratamiento de los seres humanos, dichos vectores deben también estar autorizados por la FDA. La presente invención proporciona permitir que la tecnología cumpla estos requisitos esenciales.

Aunque se ha utilizado un ácido nucleico que codifica la molécula indicadora, GFP, en los resultados experimentales a modo de ejemplo presentados en los siguientes ejemplos, la invención no se limita a construcciones que emplean GFP, o en ese caso, construcciones que emplean una o varias de otras moléculas "indicadoras" u otros productos génicos usados principalmente para la visualización de los resultados experimentales usando, por ejemplo, microscopía. En realidad, en muchas realizaciones dirigidas a usos terapéuticos de las construcciones desveladas, se puede emplear una variedad de segmentos de ácidos nucleicos en lugar de las moléculas indicadoras de GFP ejemplificadas en el presente documento. Dichos segmentos de ácidos nucleicos pueden incluir, sin limitación, los que codifican una o más proteínas, tales como albúmina de suero humano (incluyendo, sin limitación, PMID:6171778 o PMID:6275391); opticina (incluyendo, sin limitación, PMID: 10636917 o PMID:22669977); una dihidrofolato reductasa bacteriana (o un dominio de desestabilización de la misma) (tal como el dominio de desestabilización de DHFR de E. coli, PMID:20851347 o PMID:23029456, etc.), un dominio de desestabilización de proteína de unión a FK506 (FKBP) (tal como el dominio de la proteína de unión a FK506 que permite la estabilización de una proteína fusionada solo en presencia de su ligando Shield-1, por ejemplo, PMID:16959577, PMID:18836461); o una o más combinaciones de los mismos. Cada una de estas proteínas es conocida por los expertos habituales en la técnica, y las secuencias de aminoácidos para cada una están registradas en bases de datos convencionales de secuencias y archivos (por ejemplo, SwissProt ID's NP_000468, CAB53459, AIW05158 y AAD40379, respectivamente). Las construcciones también se pueden manipular para incluir además uno o más segmentos de ácidos nucleicos adicionales diagnósticos y/o que codifican terapéuticos donde se indique.

VECTORES rAAV

Se han usado satisfactoriamente vectores de virus adeno-asociado (AAV) recombinante para la transferencia génica in vivo en numerosos modelos animales preclínicos de enfermedad humana, y se han usado satisfactoriamente para la expresión a largo plazo de una amplia variedad de genes terapéuticos (Daya and Berns, 2008; Niemeyer et al., 2009; Owen et al., 2002; Keen-Rhinehart et al., 2005; Scallan et al., 2003; Song et al., 2004). Los vectores AAV también han generado un beneficio clínico a largo plazo en los seres humanos cuando se dirigieron a sitios inmunoprivilegiados, es decir, el suministro ocular para la amaurosis congénita de Leber (Bainbridge et al., 2008; Maguire et al., 2008; Cideciyan et al., 2008). Una ventaja importante de este vector es su perfil inmunitario comparativamente bajo, que solo provoca respuestas inflamatorias limitadas y, en algunos casos, incluso dirige la tolerancia inmunitaria a productos transgénicos (LoDuca et al., 2009).

DEFINICIONES A MODO DE EJEMPLO

Según la presente invención, polinucleótidos, segmentos de ácidos nucleicos, secuencias del ácido nucleico y similares, incluyen, pero no se limitan a, ADN (que incluyen y no se limitan a ADN genómicos o extragenómicos), genes, ARN de ácidos nucleicos peptídicos (PNA) (que incluyen, pero no se limitan a, ARNr, ARNm y ARNt), nucleósidos y segmentos de ácidos nucleicos adecuados, ya sea obtenidos de fuentes naturales, químicamente sintetizados, modificados, o preparados de otro modo o sintetizados en conjunto o en parte por la mano del hombre.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente es entendido por un experto habitual en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque cualquier método y composición similar o equivalente a los descritos en el presente documento se puede usar en la práctica o prueba de la presente invención, en el presente documento se describen los métodos preferidos, y las composiciones. Para los fines de la presente invención, los siguientes términos se definen a continuación en aras de claridad y facilidad de referencia:

Según el convenio de derecho de patentes de larga duración, las palabras "un" y "una", cuando se usan en la presente solicitud, que incluyen las reivindicaciones, indican "uno o más".

Los términos "alrededor de" y "aproximadamente", como se usan en el presente documento, son intercambiables, y se debe entender, en general, que se refieren a un intervalo de números alrededor de un número dado, así como a todos los números en un intervalo citado de números (por ejemplo, "aproximadamente 5 a 15" significa "aproximadamente 5 a aproximadamente 15", a menos que se establezca de otro modo). Además, se debe entender en el presente documento que todos los intervalos numéricos incluyen cada número entero dentro del intervalo.

Como se usa en el presente documento, el término "tampón" incluye una o más composiciones, o disoluciones acuosas de las mismas, que resisten a la fluctuación en el pH cuando se añade un ácido o un álcali a la disolución o composición que incluye el tampón. Esta resistencia al cambio de pH es debida a las propiedades de tamponamiento de dichas disoluciones, y puede ser una función de uno o más compuestos específicos incluidos en la composición. Por lo tanto, disoluciones u otras composiciones que presentan actividad tamponante se denominan tampones o disoluciones de tampón. Los tampones no tienen, en general, una capacidad ilimitada para mantener el pH de una disolución o composición; más bien, normalmente son capaces de mantener el pH dentro de ciertos intervalos, por ejemplo, desde un pH de aproximadamente 5 hasta 7.

Como se usa en el presente documento, el término "vehículo" pretende incluir cualquier disolvente, medio de dispersión, recubrimiento, diluyente, tampón, agente isotónico, disolución, suspensión, coloide, inerte, o similares, o una combinación de los mismos que es farmacéuticamente aceptable para administración al animal relevante o aceptable para un fin terapéutico o de diagnóstico, según proceda.

Como se usa en el presente documento, el término "segmento de ADN" se refiere a una molécula de ADN que ha sido aislado libre de ADN genómico total de una especie particular. Por lo tanto, un segmento de ADN obtenido de una muestra biológica usando una de las composiciones desveladas en el presente documento se refiere a uno o más segmentos de ADN que han sido aislados de, o purificados libres de, ADN genómico total de las especies particulares de las que se obtienen. Dentro del término "segmento de ADN" están incluidos segmentos de ADN y fragmentos más pequeños de dichos segmentos, así como vectores recombinantes, que incluyen, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fago, virus y similares.

El término "una cantidad eficaz" de un agente activo se refiere a la cantidad del agente activo suficiente para provocar una respuesta biológica deseada. Como será apreciado por aquellos expertos habituales en esta técnica, la cantidad absoluta de un agente particular que es eficaz puede variar dependiendo de dichos factores, como el criterio de valoración biológico deseado, el agente a administrar, el tejido diana, etc. Los expertos habituales en la técnica entenderán además que una "cantidad eficaz" se puede administrar en una dosis única, o se puede lograr por la administración de dosis múltiples. Por ejemplo, una cantidad eficaz puede ser una cantidad suficiente para lograr uno o más de los siguientes: (i) prevenir la formación de drusas; (ii) provocar una reducción en el número y/o el tamaño de drusas (regresión de drusas); (iii) provocar una reducción o prevención de los depósitos de lipofuscina; (iv) prevenir la pérdida visual o ralentizar la tasa de pérdida visual; (v) prevenir o ralentizar la tasa de neovascularización coroidea; (vi) provocar una reducción en el tamaño y/o el número de lesiones caracterizadas por neovascularización coroidea; (vii) mejorar la agudeza visual y/o la sensibilidad al contraste; (viii) prevenir o reducir la tasa de atrofia de fotorreceptores o células RPE o apoptosis; (ix) prevenir o ralentizar la progresión de la forma húmeda a la seca de DMS.

Como se usa en el presente documento, los términos células "manipuladas" y "recombinantes" pretenden referirse a una célula en la que se ha introducido un segmento de polinucleótido exógeno (tal como un segmento de ADN que conduce a la transcripción de una molécula biológicamente activa). Por lo tanto, las células manipuladas son distinguibles de las células que existen de forma natural, que no contienen un segmento de ADN exógeno recombinantemente introducido. Las células manipuladas son, por lo tanto, células que comprenden al menos uno o más segmentos de polinucleótido heterólogos introducidos mediante la mano del hombre.

Las expresiones "aislado" o "biológicamente puro" se refieren a material que está sustancialmente, o esencialmente, libre de componentes que normalmente acompañan al material que se encuentra en su estado nativo, Por lo tanto, los polinucleótidos aislados según la invención no contienen preferentemente materiales normalmente asociados a los polinucleótidos en su entorno natural, o in situ.

"Enlazar" o "unir" se refiere a cualquier método conocido en la técnica para conectar funcionalmente una o más proteínas, péptidos, ácidos nucleicos o polinucleótidos, que incluyen, sin limitación, fusión recombinante, enlace covalente, enlace disulfuro, enlace iónico, enlace de hidrógeno, enlace electrostático y similares.

Como se usa en el presente documento, el término "kit" se puede usar para describir variaciones del recinto portátil autocontenido que incluye al menos un conjunto de reactivos, componentes o composiciones farmacéuticamente formuladas para realizar uno o más de los métodos de ensayo de la presente invención. Opcionalmente, dicho kit puede incluir uno o más conjuntos de instrucciones para su uso en los reactivos encerrados, tales como, por ejemplo, en un laboratorio o aplicación clínica.

Los términos "administración local" o "suministro local", en referencia al suministro de una composición, formulación o dispositivo de la invención, se refieren al suministro que no se basa en el transporte del agente a su tejido diana previsto por el sistema vascular o linfático desde un sitio de administración que está remoto desde el tejido diana previsto. El agente se administra directamente a su tejido diana previsto o en la proximidad del mismo, por ejemplo, por inyección o implantación. Se apreciará que una pequeña cantidad del agente suministrado puede entrar en el sistema vascular y puede, por último, lugar, llegar al tejido diana por el sistema vascular.

"Afección relacionada con la degeneración macular" se refiere a cualquiera de varios trastornos y afecciones en las que la mácula degenera o pierde actividad funcional. La degeneración o pérdida de actividad funcional puede surgir debido a, por ejemplo, muerte celular, disminución de la proliferación celular, pérdida de función biológica normal, o una combinación de uno o más de los anteriores. La degeneración macular puede conducir a y/o manifestarse como alteraciones en la integridad estructural de las células y/o la matriz extracelular de la mácula, alteración en la arquitectura normal de la matriz celular y/o extracelular, y/o pérdida de función de las células maculares. Las células pueden ser cualquier tipo de célula normalmente presente en o cerca de la mácula que incluye células RPE, fotorreceptores y células endoteliales capilares. La DMS es la principal afección relacionada con la degeneración macular, pero se conocen varias otras que incluyen, pero no se limitan a, distrofia macular de Best, distrofia del fondo de Sorsby, malattia leventinese y distrofia retiniana en panal de Doyne, y trastornos relacionados del ojo de mamífero.

Como se usa en el presente documento, el término "ácido nucleico" incluye uno o más tipos de: polidesoxirribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), polirribonucleótidos (que contiene D-ribosa), y cualquier otro tipo de polinucleótido que sea un N-glucósido de una base de purina o pirimidina, o bases modificadas de purina o pirimidina (incluyendo sitios abásicos). El término "ácido nucleico", como se usa en el presente documento, también incluye polímeros de ribonucleósidos o desoxirribonucleósidos que se unen covalentemente, normalmente por enlaces fosfodiéster entre subunidades, pero en algunos casos por fosforotioatos, metilfosfonatos y similares. Los "ácidos nucleicos" incluyen ADN mono- y bicatenario, así como ARN mono- y bicatenario. Los ácidos nucleicos a modo de ejemplo incluyen, sin limitación, ADNg; ARNnh; ARNm; ARNr, ARNt, micro ARN (miARN), ARN interferente pequeño (ARNip), ARN nucleolar pequeño (ARNnop), ARN nuclear pequeño (ARNnp) y ARN temporal pequeño (ARNtp), y similares, y cualquier combinación de los mismos.

El término "que existe de forma natural", como se usa en el presente documento, como se aplica a un objeto, se refiere al hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos que está presente en un organismo (incluyendo virus) que se puede aislar de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionadamente por la mano del hombre en un laboratorio existe de forma natural. Como se usa en el presente documento, las cepas de laboratorio de roedores que pueden haber sido selectivamente criadas según la genética clásica se consideran animales que existen de forma natural.

"Dispositivo ocular" se refiere a un dispositivo de suministro de fármaco que tiene estructura, dimensiones, forma y/o configuración apropiada y está hecho de materiales apropiados de manera que se pueda disponer en o sobre la superficie del ojo sin causar una interferencia inaceptable con la fisiología o el funcionamiento del ojo. Preferentemente, la colocación de un dispositivo ocular no altera significativamente la visión. Un dispositivo ocular es normalmente un artículo de fabricación sólido o semi-sólido y normalmente es macroscópico, es decir, visible a simple vista.

"Neovascularización ocular" (ONV) se usa en el presente documento para referirse a neovascularización coroidea o neovascularización retiniana, o ambas.

El término "unido operativamente", como se usa en el presente documento, se refiere a que las secuencias del ácido nucleico que se unen son normalmente contiguas, o sustancialmente contiguas, y, donde sea necesario, para unir dos regiones codificantes de proteína, contiguas y en marco de lectura. Sin embargo, puesto que los potenciadores funcionan, en general, cuando se separan del promotor por varias kilobases y secuencias intrónicas, pueden ser de longitudes variables, algunos elementos de polinucleótido pueden estar unidos operativamente, pero no ser contiguos.

Como se usa en el presente documento, el término "paciente" (también denominado indistintamente "hospedador" o "sujeto"), se refiere a cualquier hospedador que pueda ser receptor de una o más de las formulaciones terapéuticas o de diagnóstico como se trata en el presente documento. En ciertos aspectos, el paciente es un animal vertebrado, que está previsto que indique cualquier especie de animal (y preferentemente, una especie de mamífero, tal como un ser humano). En ciertas realizaciones, un paciente puede ser cualquier animal hospedador, que incluye, pero no se limita a, primates humanos y no humanos, aviares, reptiles, anfibios, bovinos, caninos, caprinos, cavinos, corvinos, epinos, equinos, felinos, hircinos, lapinos, leporinos, lupinos, murinos, ovinos, porcinos, racinos, vulpinos y similares, que incluyen, sin limitación, ganado domesticado, animales o aves de manada o migratorios, especímenes exóticos o de zoológico, así como animales de compañía, mascotas, o cualquier animal bajo el cuidado de un médico de cuidado veterinario o médico animal.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen preferentemente una reacción alérgica o no deseada similar cuando se administran a un mamífero, y en particular, cuando se administran a un ser humano. Como se usa en el presente documento, "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que retiene preferentemente la actividad biológica deseada del compuesto parental y no confiere efectos toxicológicos no deseados. Los ejemplos de dichas sales incluyen, sin limitación, sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos (por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico y similares); y sales formadas con ácidos orgánicos que incluyen, sin limitación, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido cítrico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido tánico, ácido pamoico (embónico), ácido algínico, ácido naftoico, ácido poliglutámico, ácidos naftalenosulfónicos, ácidos naftalenodisulfónicos, ácido poligalacturónico; sales con cationes metálicos polivalentes, tales como cinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel, cadmio y similares; sales formadas con un catión orgánico formados a partir de N,N'-dibenciletilendiamina o etilendiamina; y combinaciones de los mismos.

El término "sal farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto de la presente divulgación derivado de bases, ácidos inorgánicos u orgánicos farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de ácidos adecuados incluyen, pero no se limitan a, ácidos clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, perclórico, fumárico, maleico, fosfórico, glicólico, láctico, salicílico, succínico, tolueno-p-sulfónico, tartárico, acético, cítrico, metanosulfónico, fórmico, benzoico, malónico, naftaleno-2-sulfónico, trifluoroacético y bencenosulfónico. Las sales derivadas de bases apropiadas incluyen, pero no se limitan a, álcali, tal como sodio y amoniaco.

Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido" pretende englobar un "polipéptido" en singular, así como "polipéptidos" en plural, e incluye cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos. Por lo tanto, como se usa en el presente documento, los términos que incluyen, pero no se limitan a, "péptido", "dipéptido", "tripéptido", "proteína", "enzima", "cadena de aminoácido" y "secuencia de aminoácidos contigua" están todos englobados dentro de la definición de un "polipéptido," y el término "polipéptido" se puede usar en lugar de, o indistintamente con, cualquiera de estos términos. El término incluye además polipéptidos que se han sometido a una o más modificaciones postraduccionales, que incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización, escisión proteolítica, procesamiento post-traducción, o modificación por inclusión de uno o más aminoácidos que no existen de forma natural. Existe una nomenclatura convencional en la técnica para las estructuras de polinucleótidos y polipéptidos. Por ejemplo, se emplean ampliamente las abreviaturas unilíteras y trilíteras para describir aminoácidos: Alanina (A; Ala), Arginina (R; Arg), Asparagina (N; Asn), Ácido aspártico (D; Asp), Cisteína (C; Cys), Glutamina (Q; Gin), Ácido glutámico (E; Glu), Glicina (G; Gly), Histidina (H; His), Isoleucina (I; Ile), Leucina (L; Leu), Metionina (M; Met), Fenilalanina (F; Phe), Prolina (P; Pro), Serina (S; Ser), Treonina (T; Thr), Triptófano (W; Trp), Tirosina (Y; Tyr), Valina (V; Val) y Lisina (K; Lys). Se prefiere que los restos de aminoácidos descritos en el presente documento estén en la forma isomérica "L". Sin embargo, los restos en la forma isomérica "D" se pueden sustituir por cualquier resto de aminoácido L, siempre que se retengan las propiedades deseadas del polipéptido.

"Proteína" se usa en el presente documento indistintamente con "péptido" y "polipéptido", e incluye tanto péptidos como polipéptidos producidos sintéticamente, recombinantemente, o in vitro, y péptidos y polipéptidos expresados in vivo después de que se administren secuencias del ácido nucleico a un animal o sujeto humano hospedador. El término "polipéptido" pretende referirse preferentemente a cualquier longitud de cadena de aminoácido, que incluye aquellos de péptidos cortos desde aproximadamente dos hasta aproximadamente 20 restos de aminoácidos de longitud, oligopéptidos desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100 restos de aminoácidos de longitud, y polipéptidos más largos que incluyen desde aproximadamente 100 restos de aminoácidos o más de longitud. Además, el término también pretende incluir enzimas, es decir, biomoléculas funcionales que incluyen al menos un polímero de aminoácido. Los polipéptidos y las proteínas de la presente invención también incluyen polipéptidos y proteínas que son o han sido post-traduccionalmente modificados, e incluyen cualquier azúcar u otro(s) derivado(s) o conjugado(s) añadido(s) a la cadena de aminoácidos del esqueleto.

El término "promotor", como se usa en el presente documento, se refiere a una región o regiones de una secuencia del ácido nucleico que regula la transcripción.

"Purificado", como se usa en el presente documento, significa separado de muchos otros compuestos o entidades. Un compuesto o entidad puede estar parcialmente purificado, sustancialmente purificado, o puro. Un compuesto o entidad se considera puro cuando se retira de sustancialmente todos los otros compuestos o entidades, es decir, preferentemente es al menos aproximadamente el 90 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o superior al 99 % de pureza. Un compuesto o entidad parcialmente o sustancialmente purificado se puede retirar de al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, o al menos el 80 % del material con el que se encuentra naturalmente, por ejemplo, material celular, tal como proteínas y/o ácidos nucleicos celulares.

El término "recombinante" indica que el material (por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido) se ha alterado artificialmente o sintéticamente (no naturalmente) por intervención humana. La alteración se puede realizar en el material dentro o fuera, de su entorno natural, o estado nativo. En concreto, por ejemplo, una secuencia promotora es "recombinante" cuando se produce por la expresión de un segmento de ácido nucleico manipulado por la mano del hombre. Por ejemplo, un "ácido nucleico recombinante" es uno que se prepara recombinando ácidos nucleicos, por ejemplo, durante la clonación, el barajado de ADN u otros procedimientos, o por mutagénesis química u otra; un "polipéptido recombinante" o "proteína recombinante" es un polipéptido o proteína que se produce por expresión de un ácido nucleico recombinante; y un "virus recombinante", por ejemplo, un virus AAV recombinante, se produce por la expresión de un ácido nucleico recombinante.

El término "elemento regulador", como se usa en el presente documento, se refiere a una región o regiones de una secuencia del ácido nucleico que regula la transcripción. Los elementos reguladores a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, potenciadores, elementos post-transcripcionales, secuencias de control de la transcripción y similares.

El término "segmento de ARN" se refiere a una molécula de ARN que ha sido aislada libre de ARN celular total de una especie particular. Por lo tanto, segmentos de ARN puede referirse a uno o más segmentos de ARN (ya sea de origen nativo o sintético) que han sido aislados de, o purificados libres de, otros ARN. Dentro del término "segmento de ARN" se incluyen segmentos de ARN y fragmentos más pequeños de dichos segmentos.

"Neovascularización retiniana" (RNV) se refiere al desarrollo anormal, la proliferación y/o el crecimiento de vasos sanguíneos retinianos, por ejemplo, sobre la superficie de la retina.

El término "elemento regulador", como se usa en el presente documento, se refiere a una región o regiones de una secuencia del ácido nucleico que regula la transcripción. Los elementos reguladores a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, potenciadores, elementos post-transcripcionales, secuencias de control de la transcripción y similares.

El término "corresponde sustancialmente a", "sustancialmente homólogo" o "identidad sustancial", como se usa en el presente documento, indica una característica de un ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos, en donde una secuencia del ácido nucleico o de aminoácidos seleccionada tiene al menos aproximadamente 70 o aproximadamente 75 por ciento de identidad de secuencia en comparación con una secuencia del ácido nucleico o de aminoácidos de referencia seleccionada. Más normalmente, la secuencia seleccionada y la secuencia de referencia tendrán al menos aproximadamente 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 o incluso 85 por ciento de identidad de secuencia, y más preferentemente, al menos aproximadamente 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 o 95 por ciento de identidad de secuencia. Más preferentemente todavía, las secuencias altamente homólogas comparten frecuentemente más de al menos aproximadamente 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad de secuencia entre la secuencia seleccionada y la secuencia de referencia con la que se comparó.

El porcentaje de identidad de secuencia se puede calcular a lo largo de la longitud entera de las secuencias con las que se compara, o se puede calcular excluyendo pequeñas deleciones o adiciones que ascienden a menos de aproximadamente el 25 por ciento más o menos de la secuencia de referencia elegida. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mayor, tal como una porción de un gen o secuencia flanqueante, o una porción repetitiva de un cromosoma. Sin embargo, en el caso de la homología de secuencias de dos o más secuencias de polinucleótidos, la secuencia de referencia comprenderá normalmente al menos aproximadamente 18-25 nucleótidos, más normalmente al menos aproximadamente 26 a 35 nucleótidos, e incluso más normalmente al menos aproximadamente 40, 50, 60, 70, 80, 90, o incluso 100 nucleótidos más o menos.

Cuando se desean fragmentos altamente homólogos, el grado de porcentaje de identidad entre las dos secuencias será al menos aproximadamente 80 %, preferentemente al menos aproximadamente 85 % y más preferentemente aproximadamente 90 % o 95 % o más alto, como se determina fácilmente por uno o más de los algoritmos de comparación de secuencias bien conocidos por los expertos en la técnica, tales como, por ejemplo, el análisis de programa FASTA descrito por Pearson y Lipman (1988).

El término "sujeto", como se usa en el presente documento, describe un organismo, que incluye mamíferos tales como primates, a los que se les puede proporcionar el tratamiento con las composiciones según la presente invención. Las especies de mamífero que pueden beneficiarse de los métodos de tratamiento desvelados incluyen, pero no se limitan a, simios superiores; chimpancés; orangutanes; seres humanos; monos; animales domesticados tales como perros y gatos; ganado, tal como caballos, ganado vacuno, cerdos, ovejas, cabras y pollos; y otros animales, tales como ratones, ratas, cobayas y hámsteres.

"Administración secuencial" de dos o más agentes se refiere a la administración de dos o más agentes a un sujeto de forma que los agentes no estén presentes juntos en el cuerpo del sujeto en concentraciones superiores a las mínimas. La administración de los agentes puede alternar, pero no es necesario. Cada agente se puede administrar múltiples veces.

"Homología de secuencias significativa", como se aplica a una secuencia de aminoácidos, significa que la secuencia muestra al menos aproximadamente 20 % de aminoácidos idénticos o conservativamente sustituidos, preferentemente al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 % de aminoácidos idénticos o conservativamente sustituidos, deseablemente al menos aproximadamente 70 % de aminoácidos idénticos o conservativamente sustituidos, más deseablemente al menos aproximadamente 80 % de aminoácidos idénticos o conservativamente sustituidos, y lo más deseablemente al menos aproximadamente 90 % de aminoácido idénticos o aminoácidos conservativamente sustituidos con respecto a una secuencia de referencia. Cuando se comparan dos o más secuencias, cualquiera de ellas se puede considerar la secuencia de referencia. El % de identidad se puede calcular usando un algoritmo FASTA o BLASTP, usando parámetros por defecto. Se puede usar una matriz PAM250 o BLOSUM62. Para los fines de cálculo del % de restos idénticos o conservativamente sustituidos, se considera un resto conservativamente sustituido idéntico al resto que sustituye. Las sustituciones conservativas se pueden definir según Stryer, L, Biochemistry, 3a ed., 1988, según el cual los aminoácidos en los siguientes grupos poseen características similares con respecto a las propiedades de la cadena lateral, tales como carga, hidrofobia, aromaticidad, etc. (1) Cadenas laterales alifáticas: G, A, V, L, I; (2) cadenas laterales aromáticas: F, Y, W; (3) cadenas laterales que contienen azufre: C, M; (4) cadenas laterales de hidroxilo alifáticas: S, T ; (5) cadenas laterales básicas: K, R, H; (6) aminoácidos ácidos: D, E, N, Q; y (7) cadena lateral alifática cíclica: P.

"Homología de secuencias sustancial", como se aplica a una secuencia, significa que la secuencia muestra al menos aproximadamente 60 % de identidad, deseablemente al menos aproximadamente 70 % de identidad, más deseablemente al menos aproximadamente 80 % de identidad, y lo más deseablemente al menos aproximadamente 90 % de identidad con respecto a una secuencia de referencia. Cuando se comparan dos o más secuencias, cualquiera de ellas se puede considerar la secuencia de referencia. El % de identidad se puede calcular usando un algoritmo FASTA, BLASTN o BLASTP, dependiendo de si las secuencias de aminoácidos o de nucleótidos están siendo comparadas. Se pueden usar parámetros por defecto, y en realizaciones a modo de ejemplo, en la práctica de la invención se puede emplear una matriz PAM250 y/o BLOSUM62 o similar.

Como se usa en el presente documento, el término "gen estructural" pretende describir, en general, un polinucleótido, tal como un gen, que se expresa para producir un péptido codificado, polipéptido, proteína, ribozima, molécula de ARN catalítico o molécula antisentido.

Una "formulación de liberación sostenida" es una composición de materia que comprende un agente terapéutico como uno de sus componentes y comprende además uno o más componentes, elementos o estructuras eficaces adicionales para proporcionar la liberación sostenida del agente terapéutico, opcionalmente en parte debido a la estructura física de la formulación. Liberación sostenida es la liberación o administración que ocurre ya sea continuamente o intermitentemente durante un periodo prolongado, por ejemplo, al menos varios días, al menos varias semanas, al menos varios meses, al menos varios años, o incluso más, dependiendo de la formulación particular empleada.

El término "sujeto", como se usa en el presente documento, describe un organismo, que incluye mamíferos tales como primates, a los que se puede proporcionar el tratamiento con las composiciones según la presente invención. Las especies de mamífero que pueden beneficiarse de los métodos de tratamiento desvelados incluyen, pero no se limitan a, seres humanos, primates no humanos, tales como simios superiores; chimpancés; monos y orangutanes, animales domesticados, que incluyen perros y gatos, así como ganado, tal como caballos, ganado vacuno, cerdos, ovejas y cabras, u otras especies de mamífero que incluyen, sin limitación, ratones, ratas, cobayas, conejos, hámsteres y similares.

"Elemento regulador de la transcripción" se refiere a una secuencia de polinucleótidos que activa la transcripción solo o en combinación con una o varias de otras secuencias del ácido nucleico. Un elemento regulador de la transcripción puede comprender, por ejemplo, uno o más promotores, uno o más elementos de respuesta, uno o más elementos reguladores negativos, y/o uno o más potenciadores.

Como se usa en el presente documento, un "sitio de reconocimiento de factor de transcripción" y un "sitio de unión al factor de transcripción" se refiere a secuencia(s) de polinucleótidos o motivo(s) de secuencia, que se identifican como que son sitios para la interacción específica de secuencia de uno o más factores de transcripción, que adoptan frecuentemente la forma de la unión directa proteína-ADN. Normalmente, se pueden identificar sitios de unión a factor de transcripción por huella de ADN, ensayos de desplazamiento por movilidad del gel y similares, y/o se pueden predecir basándose en motivos de secuencia consenso conocidos, o por otros métodos conocidos por los expertos habituales en la técnica.

"Unidad transcripcional" se refiere a una secuencia de polinucleótidos que comprende al menos un primer gen estructural unido operativamente a al menos una primera secuencia promotora que actúa en cis y opcionalmente unida operativamente con una o varias de otras secuencias del ácido nucleico que actúa en cis necesarias para la eficiente transcripción de las secuencias de genes estructurales, y al menos un primer elemento regulador distal como se puede requerir para la transcripción específica de tejido y conductual apropiada de la secuencia estructural de genes situados operativamente bajo el control de los elementos promotores y/o potenciadores, así como cualquier secuencia en cis adicional que es necesaria para la eficiente transcripción y traducción (por ejemplo, sitio(s) de poliadenilación, secuencia(s) de control de la estabilidad de ARNm, etc.

Como se usa en el presente documento, el término "célula transformada" pretende significar una célula hospedadora cuyo complemento de ácido nucleico ha sido alterado por la introducción de uno o más polinucleótidos exógenos en esa célula.

Como se usa en el presente documento, el término "transformación" pretende describir, en general, un proceso de introducción de una secuencia de polinucleótidos exógena (por ejemplo, un vector vírico, un plásmido, o un ADN recombinante o molécula de ARN) en una célula hospedadora o protoplasto en la que se incorpora el polinucleótido exógeno en al menos un primer cromosoma o es capaz de replicarse de forma autónoma dentro de la célula hospedadora transformada. La transfección, la electroporación y la captación de ácido nucleico "desnudo" representan todos ejemplos de técnicas usadas para transformar una célula hospedadora con uno o más polinucleótidos.

"Tratar" o "tratamiento de", como se usa en el presente documento, se refiere a proporcionar cualquier tipo de tratamiento médico o quirúrgico a un sujeto. Tratar puede incluir, pero no se limita a, administrar una composición que comprende un agente terapéutico a un sujeto. "Tratar" incluye cualquier administración o aplicación de un compuesto o composición de la invención a un sujeto para fines tales como curación, inversión, alivio, reducción de la intensidad de, inhibición de la progresión de, o reducción de la probabilidad de una enfermedad, trastorno o afección, o uno o más síntomas o manifestaciones de una enfermedad, trastorno o afección. Una composición de la presente invención se puede administrar a un sujeto que ha desarrollado una afección relacionada con degeneración macular riesgo de desarrollar una infección con respecto a un miembro de la población general. Una composición de la presente invención puede ser administrada a un sujeto que ha desarrollado un trastorno ocular, tal como DMS exudativa o no exudativa, retinopatía diabética, uveítis, enfermedad de Bechet, una inflamación localizada o generalizada, o similares, o un sujeto que está en riesgo elevado de desarrollar dicho trastorno (en comparación con un miembro de la población general). En ciertos aspectos, los inventores contemplan que las composiciones de la presente invención también se puedan administrar profilácticamente, es decir, antes del desarrollo de cualquier síntoma o manifestación de la afección, donde dicha profilaxis se garantiza. Normalmente, en tales casos, el sujeto será uno que ha sido diagnosticado que está "en riesgo" de desarrollar dicha enfermedad o trastorno, ya sea como resultado de antecedentes familiares, historia clínica, o la finalización de una o más pruebas de diagnóstico o pronóstico indicativas de una tendencia a desarrollar posteriormente dicha enfermedad o trastorno.

El término "una secuencia esencialmente como se expone en SEQ ID NO:X" significa que la secuencia corresponde sustancialmente a una porción de SEQ ID NO:X y tiene relativamente algunos nucleótidos (o aminoácidos en el caso de secuencias de polipéptidos) que no son idénticos en, o un equivalente biológicamente funcional de, los nucleótidos (o aminoácidos) de SEQ ID NO:X. El término "equivalente biológicamente funcional" es bien entendido en la técnica, y se define además con detalle en el presente documento. Por consiguiente, las secuencias que tienen aproximadamente 85 % a aproximadamente 90 %; o más preferentemente, aproximadamente 91 % a aproximadamente 95 %; o incluso más preferentemente, aproximadamente 96 % a aproximadamente 99 %; de nucleótidos que son idénticos o funcionalmente equivalentes a una o más de las secuencias de nucleótidos proporcionadas en el presente documento se contemplan particularmente por ser útiles en la práctica de la invención.

Las condiciones de hibridación habituales adecuadas para la presente invención incluyen, por ejemplo, hibridación en 50 % de formamida, 5x disolución de Denhardt, 5x SSC, fosfato de sodio 25 mM, 0,1 % de Sd S y 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado a 42 °C durante 16 h, seguido por 1 h de lavados secuenciales con 0,1 xSSC, 0,1% de disolución de SDS a 60 °C para retirar la cantidad deseada de señal de fondo. Las condiciones de hibridación de menor rigurosidad para la presente invención incluyen, por ejemplo, hibridación en 35 % de formamida, 5x disolución de Denhardt, 5x SSC, fosfato de sodio 25 mM, 0,1 % de SDS y 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado o ADN de E. coli a 42 °C durante 16 h, seguido por lavados secuenciales con 0,8x SSC, 0,1 % de SDS a 55 °C. Los expertos en la técnica reconocerán que las condiciones pueden ser fácilmente ajustadas para obtener el nivel de rigurosidad deseado.

Naturalmente, la presente invención también engloba segmentos de ácidos nucleicos que son complementarios, esencialmente complementarios y/o sustancialmente complementarios a al menos una o más de las secuencias de nucleótidos específicas expuestas específicamente en el presente documento. Las secuencias del ácido nucleico que son "complementarias" son las que son capaces de aparear bases según las reglas de complementariedad habituales de Watson-Crick. Como se usa en el presente documento, el término "secuencias complementarias" significa secuencias del ácido nucleico que son sustancialmente complementarias, como se puede evaluar por la misma comparación de nucleótidos expuesta anteriormente, o como se define por ser capaces de hibridarse con uno o más de los segmentos de ácidos nucleicos específicos desvelados en el presente documento en condiciones relativamente rigurosas, tales como las descritas inmediatamente antes.

Como se ha descrito anteriormente, las sondas y los cebadores de la presente invención pueden ser de cualquier longitud. Asignando valores numéricos a una secuencia, por ejemplo, el primer resto es 1, el segundo resto es 2, etc., se puede proponer un algoritmo que define todas las sondas o cebadores contenidos dentro de una secuencia dada:

n hasta n y,

donde n es un número entero desde 1 hasta el último número de la secuencia, e y es la longitud de la sonda o cebador menos uno, donde n y no supera el último número de la secuencia. Por lo tanto, para una sonda o cebador de 25 pares de bases (es decir, un "25-mero"), el conjunto de sondas o cebadores corresponde a las bases 1 a 25, bases 2 a 26, bases 3 a 27, bases 4 a 28, etc., a lo largo de la longitud entera de la secuencia. Similarmente, para una sonda o cebador de 35 pares de bases (es decir, un "35-mero), las secuencias de cebador o sonda a modo de ejemplo incluyen, sin limitación, secuencias correspondientes a las bases 1 a 35, bases 2 a 36, bases 3 a 37, bases 4 a 38, etc., a lo largo de la longitud entera de la secuencia. Asimismo, para los 40-meros, dichas sondas o cebadores pueden corresponder a los nucleótidos del primer par de bases hasta pb 40, desde el segundo pb de la secuencia hasta el pb 41, desde el tercer pb hasta el pb 42, etc., mientras que para los 50-meros, dichas sondas o cebadores pueden corresponder a una secuencia de nucleótidos que se extiende desde pb 1 hasta pb 50, desde pb 2 hasta pb 51, desde pb 3 hasta pb 52, desde pb 4 hasta pb 53, etc.

En ciertas realizaciones, será ventajoso emplear uno o más segmentos de ácidos nucleicos de la presente invención en combinación con un marcador detectable apropiado (es decir, una "marca,"), tal como en el caso de empleo de sondas de polinucleótidos marcadas en la determinación de la presencia de una secuencia diana dada en un ensayo de hibridación. Se conocen en la técnica una amplia variedad de compuestos y composiciones indicadores apropiados para marcar sondas de oligonucleótidos, que incluyen, sin limitación, ligandos fluorescentes, radiactivos, enzimáticos u otros ligandos, tales como avidina/biotina, etc., que son capaces de ser detectados en un ensayo adecuado. En realizaciones particulares, también se puede emplear una o más marcas fluorescentes o una marca enzimática, tal como ureasa, fosfatasa alcalina o peroxidasa, en lugar de reactivos radiactivos u otros medioambientalmente menos deseables. En el caso de las marcas de enzima, se conoce que se pueden emplear sustratos indicadores colorimétricos, cromogénicos o fluorigénicos para proporcionar un método de detección de la muestra que es visible para el ojo humano, o por métodos analíticos, tales como escintigrafía, fluorimetría, espectrofotometría y similares, para identificar hibridación específica con muestras que contienen una o más secuencias del ácido nucleico complementarias o sustancialmente complementarias. En el caso de los denominados ensayos de "multiplexado", donde dos o más sondas marcadas se detectan ya sea simultáneamente o una detrás de la otra, se puede desear marcar una primera sonda de oligonucleótidos con una primera marca que tiene una primera propiedad o parámetro de detección (por ejemplo, un máximo espectral de emisión y/o excitación), que también marcó una segunda sonda de oligonucleótidos con una segunda marca que tiene una segunda propiedad o parámetro de detección que es diferente (es decir, discreta o discernible de la primera marca). El uso de ensayos de multiplexado, particularmente en el contexto de los protocolos de amplificación/detección genética, son bien conocidos por los expertos habituales en las técnicas de genética molecular.

El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico (que normalmente comprende ADN) capaz de replicarse en una célula hospedadora y/o con la que se puede unir operativamente otro segmento de ácido nucleico de manera que se provoque la replicación del segmento unido. Un plásmido, cósmido o un virus es un vector a modo de ejemplo.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se incluyen para mostrar realizaciones preferidas de la invención. Se debe apreciar por los expertos en la técnica que las técnicas desveladas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por el inventor para funcionar bien en la práctica de la invención, y así se puede considerar que constituyen modos preferidos para su práctica.

EJEMPLO 1 - CONSTRUCCIONES DE VECTOR rAAV

El presente ejemplo describe la construcción de una novedosa variante recombinante de M013 que se manipula por fusión con una secuencia de péptidos del dominio de transducción de proteínas (en este caso se ha usado un dominio específico de proteína de la proteína tat del VIH). Esta proteína se expresa como una proteína tatM013 de unión secretada de un vector AAV recombinante que puede suministrar el gen tatM013 modificado en tejidos diana para inhibir la inflamación localmente dentro del tejido transducido. Por lo tanto, la proteína de fusión tatM013 terapéutica inhibe señales inflamatorias no solo de las células que han captado el vector del virus AAV-tatM013 (y así expresan la proteína tatM013 terapéutica directamente), sino también en células vecinas que captan la versión secretada de la proteína tatM013 expresada en sí. Esta "inhibición doble" inhibe entonces ampliamente múltiples vías pro-inflamatorias clave dentro de las diversas clases de células dentro del tejido transducido por el vector AAV, y esta supresión durará en tanto que el vector AAV-M013 sea activo y exprese la proteína de fusión tatM013 terapéutica. El tejido inflamado resaltado en la presente solicitud se diseña para imitar diversas enfermedades inflamatorias del ojo, pero se contempla que efectos antiinflamatorios similares puedan ser forzados en otros tejidos que son adecuados para pautas de tratamiento de administración génica similares basadas en AAV.

Una variedad de factores que incluyen estrés oxidativo, inflamación con un posible componente autoinmunitario, acervo genético (por ejemplo, mutaciones) y características medioambientales o conductuales, tales como ser fumador y la dieta, puede contribuir a la patogénesis de la DMS en modos que son hasta ahora poco entendidos (Zarbin, 2004). Independientemente de la etiología subyacente, el distintivo clínico de la DMS es la aparición de drusas, depósitos localizados de material lipoproteináceo que se acumula en el espacio entre el RPE y la membrana de Bruch, que separa el RPE de los vasos coroideos (coriocapilares). Las drusas son normalmente el primer signo clínico en la DMS. La existencia de drusas maculares es un factor de riesgo fuerte para el desarrollo de tanto formas húmedas como secas de DMS (Ambati et al., 2003).

La inflamación ocular puede afectar a un gran número de estructuras del ojo que incluyen la conjuntiva, la córnea, la epiesclerótica, la esclerótica, la úvea, la retina, la vasculatura, el nervio óptico y la órbita. La evidencia de inflamación ocular puede incluir la presencia de células asociadas a inflamación, tales como glóbulos blancos (por ejemplo, neutrófilos, macrófagos) en el ojo, la presencia de mediadores inflamatorios endógenos conocidos en la técnica, uno o más síntomas tales como dolor de ojos, rojez, sensibilidad a la luz, visión borrosa y moscas volantes, etc. La uveítis es un término general que se refiere a la inflamación de la úvea del ojo, por ejemplo, en cualquiera de las estructuras de la úvea, que incluyen el iris, el cuerpo ciliar o la coroides. Los tipos específicos de uveítis incluyen iritis, iridociclitis, ciclitis, pars planitis y coroiditis. La uveítis puede surgir de varias causas diferentes y está asociada con varias enfermedades diferentes, que incluyen, pero no se limitan a, enfermedades reumáticas, tales como enfermedades reumáticas (por ejemplo, espondilitis anquilosante y artritis reumatoide juvenil), ciertas enfermedades infecciosas, tales como tuberculosis y sífilis, otras afecciones, tales como sarcoidosis, lupus eritematoso sistémico, lesión química, traumatismo, cirugía, etc. Queratitis se refiere a la inflamación de la córnea. La queratitis tiene una diversa matriz de causas que incluyen infección bacteriana, vírica o fúngica, traumatismo, y reacción alérgica. La infección amebiana de la córnea, por ejemplo, causada por Acanthamoeba, es un problema particular para las personas que usan lentillas. La escleritis se refiere a la inflamación de la esclerótica. Se conocen bien en la técnica la uveítis, la queratitis y la escleritis, y los métodos para su diagnóstico. Los síntomas de las diversas afecciones inflamatorias que afectan al ojo pueden incluir, pero no se limitan a, dolor de ojos, rojez, sensibilidad a la luz, lagrimeo, visión borrosa, moscas volantes, hinchazón, molestia, o una combinación de dichos síntomas. Se sabe que la inflamación ocular de diversos tipos ocurre en asociación con una variedad de enfermedades locales o sistémicas, algunas de las cuales se indican anteriormente. En algunos casos, sin embargo, la causa de la inflamación puede seguir siendo desconocida.

MATERIALES Y MÉTODOS:

Se fusionó la secuencia codificante del virus del mixoma M013 con la secuencia de péptidos de penetración celular derivada de la proteína del VIH Tat usando PCR, y se denomina tatM013. El producto quimérico se fusionó entonces o con un gen de resistencia a puromicina en un plásmido de vector lentivírico, o con una forma secretable de GFP mediante un sitio de escisión de furina. La secuencia del inserto de TatM013 se verificó por secuenciación de ADN y se clonó en un plásmido de AAV. Se transdujeron la estirpe celular monocítica THP-1 y la estirpe celular de tipo epitelio pigmentario de la retina, ARPE-19, con vectores lentivíricos para generar estirpes celulares estables seleccionando células resistentes a puromicina. La expresión de la proteína TatM013 recombinante se verificó por transferencia Western, y los efectos biológicos de esta proteína expresada en secreción inducida por LPS o 4-HNE de IL-1 p se midieron por ELISA. La localización celular de la proteína TatM013 secretable se determinó por microscopía fluorescente. La detección de la proteína TatM013 secretada se infirió por transferencia Western usando medio acondicionado de células. La transferencia de actividad biológica se determinó usando las células ARPE-19 y Raw 264.7. Los efectos antiinflamatorios in vivo de la proteína TatM013 expresados a partir de un vector a Av se determinaron usando el modelo de ratón de uveítis inducida por endotoxina (EIU).

En estos experimentos in vitro, se analizó el medio acondicionado de tres cultivos independientes. Los estudios en animales se realizaron según las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Florida (Gainesville, FL). Estos estudios se realizaron con el número mínimo de ratones necesarios para investigar los criterios de valoración que no pudieron ser tratados con experimentos in vitro. Los animales se analizaron apropiadamente con ketamina y xilazina para su evaluación en vida por oftalmoscopia y se sacrificaron humanitariamente, usando inhalación de dióxido de carbono, para el análisis de tejido.

Cultivo celular. Se cultivaron estirpes celulares HEK293T humanas y RAW 264.7 de ratón en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con 10 % de suero bovino fetal (FBS) y 1 % de disolución de penicilinaestreptomicina (Pen-Strep). La estirpe celular ARPE-19 humana se cultivó en medio DMEM/F12 (50/50) complementado con 10 % de FBS y 1 % de Pen-Strep. La estirpe celular de THP-1 humana se cultivó en medio RPMI 1640 complementado con 10 % de FBS y 1 % de Pen-Strep. Todos los cultivos celulares se mantuvieron en una estufa de incubación a 37 °C con 5 % de CO². Todas las estirpes celulares estables generadas por transducción de vector lentivírico se cultivaron en el medio correspondiente complementado con puromicina en dosis de 1 pg/ml.

Concentración de medio acondicionado. Se recogió medio de baja proteína acondicionado M199 (Invitrogen Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.) y se dispuso en un tubo cónico de 15 ml y se centrifugó a 2500 x g durante 5 min para retirar cualquier residuo celular. Entonces se pasó el medio acondicionado a través de un filtro centrífugo Amicon-Ultra de 50 kDa de corte de peso molecular (MWCO) (EMD Millipore, Billerica, MA, EE. UU.) por centrifugación a 14.000 x g durante 15 min en una microcentrífuga de mesa. Entonces se recogió el flujo continuo y se pasó a través de un filtro centrífugo Amicon-Ultra de 3 kDa (EMD Millipore) por centrifugación a 14.000 x g durante 30 min en una microcentrífuga de mesa. El medio concentrado que contenía moléculas con pesos moleculares entre 50 y 3 kDa se recogió por inversión y centrifugación del filtro a 1000 x g durante 1 min.

Vectores víricos. Todos los vectores lentivíricos se crearon con el plásmido pCDH-EFI-MCS-T2A-Puro (Systems Biosciences, Mountain View, CA, EE. UU.). Los transgenes se clonaron, usando los sitios de restricción EcoRI y NotI en los sitios de clonación múltiple. Los plásmidos se propagaron en células DH5a y se secuenciaron por el método de terminación de cadena de didesoxi. Para generar partículas víricas, los plásmidos se transfectaron conjuntamente con el kit de encapsidación del vector lentivírico pPACKH1 (Systems Biosciences) en células HEK293T. Se recogió el medio que contenía el vector lentivírico 48 h después de la cotransfección y se centrifugó a 2500 x g durante 5 min a 4 °C. Se pasó el medio que contenía vector a través de un filtro de jeringa de 0,22 pm (tamaño de poro).

Se creó el plásmido de vector sGFP-TatM013 por subclonación de la construcción de fusión TatM013 en la dirección 3' de IgK-GFP (se fusionó la secuencia conductora de la cadena ligera kappa de IgG con la secuencia de GFP) mientras se mantenía el marco de lectura de estos elementos. Entonces se cortó esta construcción génica, usando los sitios XbaI (5') y XhoI (3'), y se clonó en el plásmido pTR-smCBA AAV. El plásmido pTR-smCBA-IgK-GFP- TatM013 final se cultivó en células SURE 2 (Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.) y se purificó por pase a través de un gradiente de CsCl. Se encapsidó el ADN, se purificó y se tituló por el Center for Vision Research Vector Core de la Universidad de Florida según métodos previamente publicados.

Aislamiento de vitreo. Se aisló vitreo de ratón usando el protocolo desarrollado por Skeie y colaboradores. Brevemente, los ratones se sacrificaron humanamente, usando CO². Se hizo una incisión transversal en la córnea con un bisturí quirúrgico para permitir que circulara el humor acuoso. El exceso de humor acuoso se absorbió con una toalla de papel. Se evisceraron la retina, el vítreo y el cristalino apretando el ojo desde la parte de atrás. Se recogieron los tejidos en un tubo estéril de 1,5 ml y después se transfirieron a un filtro de centrífuga de Amicon Ultra (corte, 50 kDa; EMD Millipore). Se añadió al tubo 100 pl adicionales de solución salina tamponada con fosfato (PBS) complementada con mezcla de inhibidor de la proteasa (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EE. UU.). Las muestras se centrifugaron a 14.000 x g durante 15 min, y se recogió el flujo continuo vitreo. La concentración de proteina del vitreo se determinó por el ensayo de proteínas DC (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.) según el protocolo del fabricante y se guardó a -20 °C hasta que se ensayó.

ELISA. Se compró el kit de ELISA para IL-1 p de ratón de Peprotech (Peprotech, Rocky Hill, NJ, EE. UU.). La concentración de IL-1 p se determinó según el protocolo del fabricante. La concentración de IL-1 p humana se determinó con un kit de ELISA de IL-1 p humana de RayBiotech (RayBiotech, Norcross, GA, EE. UU.) según el protocolo del fabricante. En ambos casos, se analizó un total de 100 pl de o tejido homogeneizado o medio de cultivo celular.

Transferencias Western . Las células correspondientes al medio acondicionado se lisaron en tampón de lisis NP-40 complementado con mezcla de inhibidores de la proteasa (Thermo Fisher Scientific) y EDTA 2 mM. La concentración de proteína de las muestras se midió con el ensayo de proteína DC (Bio-Rad) según el protocolo del fabricante. Se diluyeron los lisados de proteína en tampón Laemmli que contenía ditiotreitol (DTT) 100 pM y se llevó a ebullición durante 5 min. Se separaron cantidades iguales de proteína por electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio (SDS)-poliacrilamida y se transfirieron a una membrana de poli(difluoruro de vinilideno) (PVDF), usando un sistema iBlot (Invitrogen Life Technologies) como se recomendó por el fabricante. Esta membrana se bloqueó con un tampón de bloqueo patentado Li-Cor Biosciences (Lincoln, NE, EE. UU.) durante 1 h a temperatura ambiente y se incubó durante la noche con el anticuerpo primario diseñado a 4 °C. Entonces se lavó cuatro veces la membrana con PBS-0,1% de Tween 20 y se incubó con el anticuerpo secundario IRDye correspondiente (dilución 1:5000 en tampón de bloqueo; Li-Cor Biosciences). Finalmente, la membrana se lavó como se hizo previamente y se barrió con un sistema de obtención de imágenes de infrarrojos Odyssey (Li-Cor Biosciences).

Modelo de ratón de uveítis inducida por endotoxina. Se inyectó por vía intravítrea ratones de la raza C57BL/6J con 3x109 genomas de vector en cada ojo. Dos semanas después de la inyección, los ratones se inspeccionaron por tomografía de coherencia óptica de dominio espectral, usando un instrumento de alta resolución de Bioptigen, para excluir infiltrados inflamatorios resultantes de la inyección de vector. Un mes después de la inyección, se observó expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) por oftalmoscopia de fluorescencia. Al día siguiente, se inyectó por vía intravítrea a los ratones en cada ojo 25 ng de lipopolisacárido (LPS). Después de 24 h, estos ratones fueron sacrificados, y sus ojos fueron enucleados y colocados en 4 % de paraformaldehído a 4 °C durante la noche. Los ojos se pusieron en PBS después de la fijación y se guardaron a 4 °C hasta la incorporación. Se hidrató los ojos y se incorporaron en parafina en preparación para el corte. Los ojos incorporados se cortaron a través del eje córnea-nervio óptico, a un espesor de 12 pm. Se recogieron secciones de ocho etapas en portaobjetos independientes, teniendo las secciones en el mismo portaobjetos una diferencia de 80 pm. Los portaobjetos se tiñeron con hematoxilina y eosina para visualizar células infiltrantes. Estas células se cuantificaron en imágenes de las secciones por un individuo que no conocía el grupo de tratamiento.

Oftalmoscopia . Se usó un microscopio de obtención de imágenes retinianas del fondo digital Micron III (Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA, EE. UU.) para monitorizar la expresión de GFP en vida. Se dilató los ojos de ratones conscientes con 1 % de atropina y 2,5 % de fenilefrina. Entonces se anestesió a los ratones con una mezcla de ketamina y xilazina en solución salina normal (0,9 % de disolución de cloruro sódico USP, pH 5,0; Baxter, Deerfield, IL, EE. UU.). Para evitar la pérdida de humedad de la superficie ocular durante el procedimiento, los ratones recibieron una gota de 2,5 % de disolución emoliente oftálmica de hipromelosa (Gonak; AKORN, Lake Forest, IL, EE. UU.). Se adquirieron imágenes del fondo de campo brillante usando los mismos tiempos de exposición. Se midió la fluorescencia de GFP con el filtro de fluorescencia, usando los mismos tiempos de exposición para todos los ojos.

Análisis estadístico . Se informan los datos de experimentos in vitro como el promedio ± desviación estándar. Los valores se compararon por análisis de la varianza, seguido por una prueba de la t de Student de Newman-Keuls para determinar diferencias significativas entre grupos. Para estudios en animales, los valores se informan como el promedio ± error estándar de la media y la comparación estadística se hizo por la prueba de la U de Mann-Whitney para evitar posibles sesgos introducidos por valores atípicos. P < 0,05 se consideró significativo (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La expresión mediada por AA V del gen M013 del virus del mixoma puede inhibir la secreción de IL-10 in vitro.

Tras la activación del inflamasoma por ligandos estimulantes apropiados, se escinde el precursor de IL-1 p y se secreta, por lo que se proporciona una "lectura" de citocinas para la señalización de inflamasomas. Para validar el efecto inhibidor de las construcciones de fusión de M013 sobre la secreción de IL-1 p, se usó en primer lugar un vector lentivírico para generar células THP-1 mieloides humanas que expresan establemente lo siguiente:

(1) M013 fusionado en su extremo C con el gen de resistencia a puromicina (puroR);

(2) M013 con un péptido aminoterminal de penetración celular (TatM013) fusionado con puroR; o

(3) el gen puroR solo (FIG. 1B).

La activación del inflamasoma se indujo incubando las estirpes celulares THP-1 transducidas con interferón (IFN)- g en presencia o ausencia de lipopolisacárido (LPS). La concentración de IL-1 p secretada en el medio acondicionado aumentó en presencia de LPS solo en células que expresan el gen de resistencia a puromicina de control solo (FIG. 1C). En las células THP-1 que expresan o la proteína M013 sin modificar (~19 kDa) o la proteína TatM013 (~20 kDa) fusionada con puroR, la secreción de IL-1 p se inhibió significativamente. Es interesante señalar que el nivel de expresión detectable de la proteína TatM013 fue considerablemente inferior al de M013 sin modificar (FIG. 1C, recuadro) en extractos celulares totales preparados a partir de estos clones de células THP-1. Sin embargo, ambas proteínas previnieron la secreción inducida por IFN/LPS de IL-1 p.

En la retina, IL-1 p inducida se puede secretar de la microglía, células endoteliales (Kohno et al., 2013) y células del epitelio pigmentario de la retina (RPE) (Kauppinen et al., 2012). La estirpe celular ARPE-19 derivada de RPE se transfectó establemente con los mismos vectores lentivíricos que se describe previamente para estudiar el efecto de TatM013 sobre la secreción de IL-1 p por un tipo de célula ocular biológicamente relevante. Las células ARPE-19 modificadas expresaron la fusión TatM013-puroR o el gen de resistencia a puromicina de control solo. La activación del inflamasoma se indujo por incubación de estas células con 4-hidroxi-2-nonenal (4-HNE); un aldehído reactivo generado por estrés oxidativo en la retina y que se informó que activaba el inflamasoma en estas células (Kauppinen et al., 2012). En células ARPE-19, 4-HNE condujo a una inducción triple de la secreción de IL-1 p, pero esta inducción se bloqueó por la expresión del gen TatM013 en comparación con células que expresan GFP solo (FIG. 1D). Juntos, estos resultados muestran que la expresión ectópica de la proteína M013 o TatM013 inhibió in vitro la secreción de IL-1 p activada por el inflamasoma. Además, no pareció que esta fusión del gen M013 con el péptido Tat de penetración celular comprometiera la eficiencia de esta función inhibidora de M013.

Desarrollo de un vector AAV que expresa M013 secretable y de penetración celular. Las diversas fuentes celulares de IL-1 p en el ojo dificultan la prevención de su secreción por una estrategia de genoterapia que bloquea la secreción de IL-1 p solo de células transducidas con el vector AAV. Para permitir la visualización de la proteína TatM013, que tiene la posibilidad de afectar las células de alrededor que pueden no ser directamente transducidas por el vector de genoterapia, la secuencia codificante de TatM013 se fusionó con una secuencia que codificaba una versión secretable de GFP. Esta construcción de fusión se expresó como una única proteína recombinante que contenía la señal secretora aminoterminal del gen IgK fusionado con GFP y se unió en el extremo C con el gen TatM013 y se separó por una secuencia de sitio de escisión de furina (FIG. 2A). Se ha mostrado que este sistema de secreción suministra y secreta un péptido pequeño derivado de angiotensina (Verma et al., 2012). Para estudiar la expresión de la novedosa construcción de fusión sGFP-TatM013, se clonó en un plásmido lentivírico bajo el control del promotor del factor de elongación (EF)-1a y se fusionó con el gen de resistencia a puromicina (puroR) a través de un péptido 2A autoescindible (FIG. 2A). La expresión de la proteína sGFP-TatM013 fusionada se mostró por transferencia Western, que reveló una banda del tamaño predicho usando o un anticuerpo contra el péptido 2A (no mostrado) o contra la propia GFP (FIG. 2B). Usando microscopía de fluorescencia, se observó que la GFP de control tuvo una distribución citoplásmica, mientras que sGFP-TatM013 tuvo un patrón en puntos característico de las proteínas dentro de la vía secretora (Kakihana et al., 2013; Stow y Murray, 2013; Reinhardt et al., 2014) (FIG. 2C). Este resultado indicó que el producto génico sGFP-TatM013 se podría expresar, y elegir para la secreción.

Para la administración estable al ojo, se diseñó un vector AAV para expresar sGFP-TatM013. AAV ha mostrado ser seguro y eficaz en múltiples ensayos clínicos previstos para tratar la enfermedad retiniana (Hauswirth et al., 2008; Maguire et al., 2008; Simonelli et al., 2010; Testa et al., 2013; MacLaren et al., 2014). Esta construcción se subclonó en un plásmido que contenía repeticiones terminales invertidas (TR) de AAV2 y un promotor de p-actina (smCBA) del citomegalovirus (CMV) quimérico truncado, que se sabe que es ubicuamente activo en la retina (Beltran et al., 2010) (FIG. 3A). Se transfectaron células HEK293T con el plásmido AAV que suministró o GFP de control o sGFP-TatM013 para determinar el efecto de la señal de secreción sobre la distribución de la proteína fusionada. Usando microscopía de fluorescencia, se observó un patrón de distribución en puntos similar para GFP solo entre células transfectadas con sGFP-TatM013 (FIG. 3B). Para mostrar que la proteína sGFP-TatM013 era proteolisada por furina y se secretó, se recogió medio acondicionado de las células transfectadas con o GFP de control o sGFP-TatM013. Se concentró el medio y se fraccionó una porción sobre un gel de SDS-poliacrilamida. En una transferencia Western (FIG. 3C), se detectó GFP en el medio acondicionado de células que expresan sGFP-TatM013 y estuvo ausente en el medio acondicionado de células que expresan GFP, lo que indica que ocurrió la secreción y la proteólisis en el sitio de escisión de furina de la proteína de fusión. La actividad biológica de TatM013 proteolisada extracelular se demostró por su capacidad para inhibir la señalización del inflamasoma en células incubadas con este medio acondicionado. La incubación de células con medio acondicionado con TatM013 causó una disminución significativa en la cantidad de IL-1 p producida por células tratadas con un agente inflamatorio (LPS o 4-HNE) cuando se comparó con células que se incubaron con medio de control (FIG. 3D). Aunque se reprimió la liberación de IL-1 p por el medio acondicionado con TatM013, no se observó muerte celular después de la exposición a ninguno del medio acondicionado. Estos resultados mostraron que TatM013 secretable y de penetración celular se podría expresar por AAV y que esta proteína retuvo su actividad anti-inflamasoma cuando se exportó al medio acondicionado.

La expresión medida por el vector AAVde la proteína sGFP-TatM013 es biológicamente activa. Con el objetivo para tratar la enfermedad retiniana inflamatoria, el suministro de vector terapéutico al compartimento vitreo del ojo puede ser clínicamente ventajoso, debido a que las inyecciones intravítreas se realizan habitualmente en las visitas a las consultas externas. Por lo tanto, el plásmido sGFP-TatM013 se encapsidó en un vector basado en AAV que contenía cuatro mutaciones tirosina a fenilalanina (Y ^F ) y una treonina a valina (T ^V ) sobre la superficie de la cápside: AAV2(quadY^F+T^-V). Las mutaciones Y ^ F fueron en las posiciones de aminoácidos 272, 444, 500 y 730 y la mutación T->V fue en la posición de aminoácido 491 de la proteína de la cápside de AAV2. Esta variante mutante péntuple fue capaz de infectar múltiples tipos de células en la retina después de la inyección en el compartimento vítreo (Kay et al., 2013). El vector AAV se inyectó en el líquido vítreo de los ojos derechos (se suministraron 3 x 109 genomas de vector) de ratones C57B/6J. Como control, los ojos izquierdos se inyectaron con el mismo mutante de la cápside que llevaba solo la GFP. Este vector se eligió para controlar el impacto de la inyección ocular sobre la liberación de factores neurotróficos, tales como el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y el factor neurotrófico ciliar (CNTF), como se informó en la bibliografía (Wen et al., 1995; Qin y Rodrigues, 2010). Dos semanas después de la inyección, todos los ratones se inspeccionaron por tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) para descartar desprendimientos de retina e infiltrados inflamatorios en el vítreo. Y, lo que es más importante, ni los virus que expresan GFP ni los virus que expresan sGFP-TatM013 condujeron a inflamación ocular. Se evaluó a los ratones por oftalmoscopia de fluorescencia 4 semanas después de la inyección del vector. La obtención de imágenes de fluorescencia reveló que la expresión de GFP mediada por AAV2(quadY-F+T-V)-smCBA era robusta y panretiniana, rodeando el marcado más intenso los vasos sanguíneos de la retina. A diferencia, sGFP-TatM013 mediada por AAV2(quadY-F+T-V) presentó un patrón de fluorescencia difuso, lo que indica la secreción de la proteína fusionada. Esta fluorescencia difusa, sin embargo, no se observó en animales de control no inyectados, que indica que la señal fue causada por la expresión de sGFP (FIG. 4A).

Para probar la actividad biológica de este vector AAV en un modelo de inflamación ocular aguda, se usó el bien caracterizado modelo de ratón de uveítis inducida por endotoxina (EIU) (Rosenbaum et al., 1980). Se ha informado de aumentos en IL-1 p y otras citocinas de en este modelo (Shen et al., 2000), que lo hace un sistema in vivo adecuado para probar la eficacia de los vectores víricos de la presente invención. La actividad biológica de sGFP-TatM013 mediado por AAV se evaluó a continuación induciendo una respuesta inflamatoria en los ojos tratados por una inyección de LPS 5 semanas después de la inyección de AAV. Se cuantificaron los niveles de IL-1 p en el cuerpo vítreo sometiendo el vítreo recogido a un ELISA. La concentración de IL-1 p fue significativamente menor en las muestras de ojos tratados con sGFP-TatM013 que en los ojos tratados con control de GFP (FIG. 4B). Para cuantificar el efecto de este vector sobre el reclutamiento de células infiltrantes, se usó la dosis mínima de LPS (25 ng) que induciría la uveítis, lo que permite que estas células sean contadas por microscopía óptica. Para cuantificar la cantidad de leucocitos infiltrantes en respuesta a la exposición a LPS, se recogieron los ojos 24 h después de la inyección con LPS, cuando la respuesta de infiltración de células inflamatorias alcanza el punto máximo en la raza C57BL/6J (Shen et al., 2000), y se fijaron e incorporaron en parafina para el corte y la tinción con hematoxilina y eosina (FIG. 4C). El número promedio de células inmunitarias que infiltran la cámara vítrea en los ojos tratados con AAV-sGFP-TatM013 se redujo en casi el 50 % con respecto a los ojos tratados con AAV-GFP de control (FIG. 4D). Estos resultados indican que la expresión del gen de fusión sGFP-TatM013 redujo significativamente la respuesta de células inflamatorias infiltrantes en el modelo ampliamente usado de inflamación ocular. Además, estos resultados indicaron que el gen de fusión TatM013 tuvo actividades antiinflamatorias que se podrían medir tanto en células cultivadas como en los ojos de animales de prueba.

La inflamación contribuye a la patología de enfermedades crónicas que afectan a muchos sistemas de órganos y tejidos, que incluyen el SNC. En el cerebro, se cree que la activación de las células de la glía desempeña una función en la etiología de la enfermedad de Alzheimer36 y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) (Hall et al., 1998; Chiu et al., 2009). En la retina, la inflamación crónica participa en la degeneración macular senil (DMS), pero las fuentes de esa inflamación son una cuestión de conjetura e incluyen dichas moléculas dispares como lípidos oxidados,39 bisretinoides (Anderson et al., 2013), ARN bicatenario (Tarallo et al., 2012) y péptidos amiloides (Cao et al., 2013; Liu et al., 2013). Para suprimir la inflamación que puede surgir de más de un estímulo que afecta a una variedad de tipos de células dentro de tejidos complejos, tales como el ojo, se explotó una estrategia antiinflamatoria generalizada perfeccionada por poxvirus. El gen M013 del virus del mixoma se expresa como una proteína que contiene PYD citoplásmico pequeño (~19 kDa) que interactúa con dos componentes reguladores importantes de la inmunidad innata: NF-KB/p105 y el ASC de los inflamasomas. Por lo tanto, la expresión de la proteína M013 bloquea dos cascadas de señalización inmunitaria innata importantes y reduce la secreción de citocinas inflamatorias bajo su control: por ejemplo, IL-1 p y IL-18 bajo el control del inflamasoma y TNF e IL-6 bajo el control de NF-kB (Johnston et al., 2005; Rahman, y McFadden, 2011; Rahman et al., 2009). En infecciones de hospedadores susceptibles (conejos del género Oryctolagus), la supresión de la respuesta inmunitaria por mixoma es tan satisfactoria que un único virión infeccioso es suficiente para destruir a un conejo adulto (Shope, 1932). Sin embargo, los virus delecionados para el gen M013 son intensamente atenuados debido a la incapacidad del virus mutante para inhibir respuestas inmunitarias e inflamatorias innatas del hospedador (Johnston et al., 2005; Rahman, y McFadden, 2011). Algunos de los inmunomoduladores expresados por este virus actúan solo dentro de esta especie de conejo, pero otros, tales como M013, inhiben las dianas de células hospedadoras en una amplia variedad de especies (Liu et al., 2010; Lucas y McFadden, 2004). Por lo tanto, la proteína M013 inhibe tanto NF-kB como la señalización del inflamasoma en células humanas y murinas, así como en conejos (Rahman, y McFadden, 2011).

Aunque el epitelio pigmentario de la retina (RPE) desempeña una función importante en la secreción de citocinas inflamatorias en enfermedades tales como uveítis y DMS, otras fuentes importantes de moléculas proinflamatorias incluyen la glía de Müller, las principales células macrogliales residentes de la retina, la microglía retiniana y células endoteliales vasculares. Debido a que existen múltiples fuentes de vías inflamatorias inducidas, se construyó un mutante de la cápside basado en AAV2 que expresaba una versión fusionada secretable y de penetración celular de M013. La secuencia señal aminoterminal de inmunoglobulina k condujo a la eficiente sección de una proteína de fusión sGFP-TatM013, con la GFP escindida de TatM013 por furina durante la fase de secreción. La señal de penetración celular derivada de tat del VIH permitió la entrada de la proteína de fusión TatM013 en células no transducidas intactas en el tejido circundante. Los experimentos de cultivo celular indicaron que este gen TatM013 fusionado retuvo las propiedades supresoras inmunitarias de la proteína M013 parental. La proteína de fusión sGFP-TatM013 inhibió la secreción de la IL-1 p inducida por ligando en tipos de células relevantes, la línea de monocitos de ratón RAW 246.7, células THP-1 mieloides humanas y la línea ARPE-19 humana de tipo RPE, incluso después de la incubación en medios de diversas células que habían secretado M013. Cuando se inyectó en vítreo de ratón, este mutante de la cápside de AAV coexpresó la proteína M013 recombinante y GFP con un patrón de fluorescencia de acuerdo con una proteína secretada. Además, la transducción con este vector AAV también condujo a una disminución significativa en el reclutamiento de células inflamatorias en el vítreo, cuando los ojos se expusieron a LPS 1 mes después de la administración de vector en el modelo de ratón de EIU.

El ojo presenta un tejido particularmente útil para probar la terapia inmunomoduladora contra síndromes inflamatorios crónicos usando vectores de genoterapia AAV armados con la versión de fusión de tat secretada de M013. La inflamación en el ojo está localizada y, debido a que la proteína TatM013 es secretada de células que captan y expresan el vector AAV-TatM013, una baja dosis de vector suministrado al compartimento vítreo debe proteger a todas las capas de la retina de las señales inflamatorias que surgen localmente. De hecho, los anticuerpos monoclonales que se unen al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)-A se administran directamente al vítreo para bloquear la neovascularización de la coroides, en el otro lado de la retina neural (Abedi et al., 2014). Tseng y colaboradores demostraron que la activación del inflamasoma podría asociarse con la inflamación de bajo grado asociada a DMS seca (Tseng et al., 2013). También se ha informado de la activación del inflamasoma NLRP3 en muestras de donante y en modelos de ratón de DMS (Tarallo et al., 2012; Kerur et al., 2013). Además de la uveítis, los inventores contemplan que muchas otras enfermedades del ojo también pueden ser tributarias de terapia usando uno o más de los vectores basados en AAV-TatM013 y los sistemas de expresión desvelados en el presente documento. Por ejemplo, se ha desarrollado un modelo de ratón de atrofia geográfica, basado en estrés oxidativo en RPE (Seo et al., 2012). Un péptido M013 secretado de penetración celular, suministrado a células vecinas adecuadas, puede ser capaz de proteger la estructura y la función de fotorreceptores del aumento del estrés oxidativo.

La expresión de la proteína de fusión TatM013 inhibió significativamente la secreción inducida por lipopolisacáridos (LPS) de IL-1 p de células THP-1. Células ARPE-19 estables transducidas con o control de vector de lentivirus vacío o vector de lentivirus TatM013 se estimularon con 4-HNE a 30 pM durante 24 horas. Los niveles de IL-1 p secretada en el medio acondicionado fueron más bajos en células que expresan la construcción TatM013 que en las células de control de vector de lentivirus vacío. La distribución celular de sGFP-TatM013 en células transfectadas era punteada, a diferencia de la distribución citoplásmica difusa de GFP sola. La construcción sGFP-TatM013 fusionada se detectó en lisados de células transfectadas, mientras que la GFP escindida se detectó en el medio acondicionado de células correspondiente. La incubación de cualquiera de las células ARPE-19 o Raw 264.7 con este medio acondicionado disminuyó significativamente tanto la secreción inducida con LPS como con 4-HNE de IL-1 p. Los efectos in vivo se determinaron inyectando por vía intravítrea el vector de control sGFP-TatM013 o GFP en ratones C57B1/6 e induciendo la inflamación intraocular un mes después a través de una inyección de LPS. Los ojos inyectados con sGFP-TatM013 tuvieron un número significativamente menor de células inflamatorias infiltrantes cuando se comparó con los ojos inyectados con GFP de control.

La expresión de TatM013 inhibió la secreción inducida por LPS y 4-HNE de IL-1 p. Las construcciones víricas descritas en el presente documento ofrecen una forma secretable de la proteína TatM013 que es útil en el bloqueo de la inflamación retiniana y de RPE, como se demuestra por su efecto en el modelo de EIU de ratón.

Estos datos proporcionan la primera evidencia de un inhibidor de inmunidad innata derivado de virus expresado a partir de un vector de genoterapia que demuestra utilidad para proteger células no transducidas vecinas de los ataques inflamatorios, tales como los que emanan de un tejido diana específico.

EJEMPLO 2 - USO DE CONSTRUCCIONES DE VECTOR PARA INDICACIONES NO OCULARES

Además del uso de las construcciones en el tratamiento de trastornos oculares, los vectores rAAV-tatM013 desvelados también se pueden usar para prevenir, reducir, tratar y/o mejorar uno o más síntomas de inflamación en tejidos de mamífero distintos de los del ojo.

Dichas afecciones incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, inflamación de uno o más tejidos u órganos en el cuerpo del mamífero, tales como los intestinos, el hígado, el páncreas, así como uno o más sitios deslocalizados o difusos dentro del cuerpo (incluyendo, por ejemplo, la cavidad peritoneal) que son tributarios de transducción génica por una o más de las construcciones genéticas basadas en AAV desveladas.

EJEMPLO 3 - ADMINISTRACIÓN SISTÉMICA DE CONSTRUCCIONES DE VECTOR EN MODALIDADES DE TERAPIA INMUNOSUPRESORA

Se puede facilitar el tratamiento sistémico con construcciones terapéuticas TatM013 vectorizadas con rAAV, tales como las descritas en el presente documento, regulando la producción de la proteína de fusión con uno o más inductores exógenos.

Incluso sin regulación específica del gen TatM013, la expresión mediada por AAV localizado de M013 secretado también puede ser de valor significativo para tratar uno o más trastornos autoinmunitarios crónicos u otras enfermedades inflamatorias específicas de órgano.

EJEMPLO 4 - SEÑALES DE SECRECIÓN A MODO DE EJEMPLO PARA EXPRESIÓN RETINIANA*

En la práctica de la presente invención, los inventores contemplan el uso de vectores que comprenden un segmento de ácido nucleico que codifica una o más de varias señales de secreción para la preparación de sistemas de expresión terapéuticos. Además de la señal de secreción a modo de ejemplo utilizada en los ejemplos previos, se puede emplear una o más de las siguientes secuencias señal de secreción en aspectos particulares de la invención en donde se desea la expresión en la retina. Dichas señales de secreción incluyen, sin limitación:

TABLA 1

SECUENCIAS SEÑAL DE SECRECIÓN PARA LA EXPRESIÓN RETINIANA

PROTEÍNA UNIPROT NO. SECUENCIA SEÑAL SEQ ID NO

CNTF P26992 MAAPVPWACCAVLAAAAAWYA 1

PEDF P36955 MQALVLLLCIGALLGHSSC 2

FGF10 015520 MWKWILTHCASAFPHLPGCCCCCFLLLFLVSSVPVTC 3

PDGF-A P04085 MRTLACLLLLGCGYLAHVLA 4

Gas6 Q14393 MAPSLSPGPAALRRAPQLLLLLLAAECALA 5

TIMP3 P35625 MTPWLGLIVLLGSWSLGDWGAEA 6

VEGF-A P15692 MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQA 7

TGF-b1 P01137 MPPSGLRLLLLLLPLLWLLVLTPGRPAAG 8

CFH P08603 MRLLAKIICLMLWAICVA 9

IL-8 P10145 MTSKLAVALLAAFLISAALC 10

MCP-1 P13500 MKVSAALLCLLLIAATFIPQGLA 11

GDNF P39905 MKLWDWAVCLVLLHTASA 12

EJEMPLO 5 - PÉPTIDOS DE PENETRACIÓN CELULAR A MODO DE EJEMPLO

En la práctica de la presente invención, los inventores contemplan el uso de vectores que comprenden un segmento de ácido nucleico que codifica una o más de varios péptidos de penetración celular (CPP) para la preparación de sistemas de expresión terapéuticos particulares. Además del uso de péptidos M013 como se muestra en los ejemplos previos, una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos también puede encontrar utilidad particular en ciertos aspectos de la invención.

En las realizaciones, se puede preparar un vector en el que la secuencia de nucleótidos del péptido M013 mostrado anteriormente se sustituye por una secuencia del ácido nucleico que codifica una o más de las secuencias de aminoácidos de CPP que incluyen, sin limitación:

REFERENCIAS

Las siguientes referencias, hasta el punto que proporcionen detalles de procedimiento a modo de ejemplo u otros detalles suplementarios a los expuestas en el presente documento.

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Se debe entender que los ejemplos y las realizaciones en el presente documento se describen para fines ilustrativos solo y que diversas modificaciones o cambios en luz de los mismos serán sugeridos a los expertos en la técnica y se deben incluir dentro del espíritu y el alcance de la presente solicitud y el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Todas las referencias, que incluyen publicaciones, solicitudes de patente y patentes, citadas en el presente documento se incorporan por este documento como referencia al mismo grado que si se indicara individualmente y específicamente que cada referencia se incorpora como referencia y se expusiera en su totalidad en el presente documento. La recitación de intervalos de valores en el presente documento está simplemente prevista para servir de método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentra dentro del intervalo, a menos que se indique lo contrario en el presente documento, y cada valor separado se incorpora en la memoria descriptiva como si fuera individualmente citado en el presente documento.

La descripción en el presente documento de cualquier aspecto o realización de la invención usando términos tales como "que comprende", "que tiene", "que incluye" o "que contiene" con referencia a un elemento o elementos pretende proporcionar soporte para un aspecto o realización similar de la invención que "consiste en", "consiste esencialmente en" o "comprende sustancialmente" ese elemento o elementos particulares, a menos que se establezca de otro modo o se contradiga claramente por el contexto (por ejemplo, una composición descrita en el presente documento por comprender un elemento particular se debe entender que también describe una composición que consiste en ese elemento, a menos que se establezca de otro modo o se contradiga claramente por el contexto).

Todas las composiciones y métodos desvelados y reivindicados en el presente documento se pueden hacer y ejecutar sin excesiva experimentación en vista de la presente divulgación. Aunque las composiciones y los métodos de la presente invención se han descrito en términos de realizaciones preferidas, será evidente para los expertos en la técnica que se pueden aplicar variaciones a las composiciones y los métodos y en las etapas o en la secuencia de etapas del método descrito en el presente documento sin apartarse del concepto, el espíritu y el alcance de la invención. Más específicamente, será evidente que ciertos agentes que están relacionados químicamente y/o fisiológicamente se pueden sustituir por los agentes descritos en el presente documento mientras se logren los mismos resultados o similares. Se considera que todas aquellas sustituciones y modificaciones similares evidentes para los expertos en la técnica están dentro del alcance de la invención como se define por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un vector de virus adeno-asociado (AAV) para su uso en el tratamiento de uno o más síntomas de inflamación en el ojo de un mamífero, en donde el mamífero ha sido diagnosticado con degeneración macular, degeneración macular senil (DMS), atrofia geográfica, DMS húmeda, DMS seca, formación de drusas, ojo seco, retinopatía diabética, vitreorretinopatía, inflamación de la córnea, uveítis, hipertensión ocular o glaucoma, y en donde el vector vírico comprende un polinucleótido que comprende un segmento de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido M013 modificado derivado de virus y un péptido señal de secreción, en donde el segmento de ácido nucleico aislado está operativamente unido a un promotor que expresa el polipéptido de fusión codificado en una o más células hospedadoras de mamífero seleccionadas en donde el vector comprende además un péptido de penetración celular seleccionado de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO:13 a SEQ ID NO:111.

2. El vector AAV para el uso de la reivindicación 1, a) caracterizado como un vector AAV de serotipo 1 (AAV1), un vector AAV de serotipo 2 (AAV2) un vector AAV de serotipo 3 (AAV3), un vector AAV de serotipo 4 (Aa V4), un vector AAV de serotipo 5 (Aa V5), un vector AAV de serotipo 6 (AAV6), un vector AAV de serotipo 7 (AAV7), un vector AAV de serotipo 9 (AAV9), un vector AAV de serotipo 10 (AAV10), un vector AAV de serotipo 11 (AAV11), o un vector AAV de serotipo 12; o b) encapsidado dentro de una partícula de virión que comprende una proteína de la cápside AAV1, una proteína de la cápside AAV2, una proteína de la cápside AAV3, una proteína de la cápside AAV4, una proteína de la cápside AAV5, una proteína de la cápside AAV6, una proteína de la cápside AAV7, una proteína de la cápside AAV8, una proteína de la cápside AAV9, una proteína de la cápside AAV10, una proteína de la cápside AAV11 o una proteína de la cápside AAV12.

3. El vector AAV para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el polipéptido M013 modificado derivado de virus comprende un péptido TatM013.

4. Una pluralidad de viriones o partículas víricas infecciosas que comprenden el vector AAV para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

5. Una composición que comprende un vector AAV y un tampón, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, para su uso en el tratamiento de uno o más síntomas de inflamación en un ojo de un mamífero, en donde el mamífero ha sido diagnosticado con degeneración macular, degeneración macular senil (DMS), atrofia geográfica, DMS húmeda, DMS seca, formación de drusas, ojo seco, retinopatía diabética, vitreorretinopatía, inflamación de la córnea, uveítis, hipertensión ocular o glaucoma, y en donde el vector vírico comprende un polinucleótido que comprende un segmento de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido M013 modificado derivado de virus y un péptido señal de secreción, en donde el segmento de ácido nucleico aislado está unido operativamente a un promotor que expresa el polipéptido de fusión codificado en una o más células hospedadoras de mamífero seleccionadas, en donde el vector comprende además un péptido de penetración celular seleccionado de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO:13 a SEQ ID NO:111.

6. Un kit que comprende: a) un vector AAV o b) o una pluralidad de viriones o partículas víricas infecciosas que comprenden el vector AAV de a); y c) instrucciones para usar el vector o la pluralidad de viriones o partículas infecciosas para su uso en el tratamiento de uno o más síntomas de inflamación en el ojo de un mamífero, en donde el mamífero ha sido diagnosticado con degeneración macular, degeneración macular senil (DMS), atrofia geográfica, DMS húmeda, DMS seca, formación de drusas, ojo seco, retinopatía diabética, vitreorretinopatía, inflamación de la córnea, uveítis, hipertensión ocular o glaucoma, y en donde el vector vírico comprende un polinucleótido que comprende un segmento de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido M013 modificado derivado de virus y un péptido señal de secreción, en donde el segmento de ácido nucleico aislado está unido operativamente a un promotor que expresa el polipéptido de fusión codificado en una o más células hospedadoras de mamífero seleccionadas y en donde el vector comprende además un péptido de penetración celular seleccionado de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO:13 a SEQ ID NO:111.

7. Un vector AAV para el uso en el tratamiento de síntomas de una enfermedad mediada por inflamación seleccionada de degeneración macular, degeneración macular senil (DMS), atrofia geográfica, DMS húmeda, DMS seca, formación de drusas, ojo seco, retinopatía diabética, vitreorretinopatía, inflamación de la córnea, uveítis, hipertensión ocular o glaucoma transduciendo una población de células de mamífero introduciendo en una o más células de la población una composición que comprende un vector AAV que comprende un polinucleótido que comprende un segmento de ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido M013 modificado derivado de virus y un péptido señal de secreción, en donde se transformó el segmento de ácido nucleico aislado unido operativamente a un promotor que expresa el polipéptido de fusión codificado en una o más células hospedadoras de mamífero seleccionadas, en donde el vector comprende además un péptido de penetración celular seleccionado de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO:13 a SEQ ID NO:111.

8. El vector AAV para el uso de la reivindicación 7, a) caracterizado como un vector AAV de serotipo 1 (AAV1), un vector AAV de serotipo 2 (AAV2), un vector AAV de serotipo 3 (AAV3), un vector AAV de serotipo 4 (Aa V4), un vector AAV de serotipo 5 (Aa V5), un vector AAV de serotipo 6 (AAV6), un vector AAV de serotipo 7 (AAV7), un vector AAV de serotipo 9 (AAV9), un vector AAV de serotipo 10 (AAV10), un vector AAV de serotipo 11 (AAV11), o un vector AAV de serotipo 12; o b) encapsidado dentro de una partícula de virión que comprende una proteína de la cápside AAV1, una proteína de la cápside AAV2, una proteína de la cápside AAV3, una proteína de la cápside AAV4, una proteína de la cápside AAV5, una proteína de la cápside AAV6, una proteína de la cápside AAV7, una proteína de la cápside AAV8, una proteína de la cápside AAV9, una proteína de la cápside AAV 10, una proteína de la cápside AAV 11 o una proteína de la cápside AAV 12.

9. El vector AAV para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, en donde el polipéptido M013 modificado derivado de virus comprende un péptido TatM013.

10. El vector AAV para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3 o 7-9, en donde el promotor es un promotor endógeno, un promotor exógeno, un promotor derivado de virus, un promotor específico de mamífero, un promotor específico de tejido, un promotor específico de célula, un promotor constitutivo, un promotor inducible, o cualquier combinación de los mismos.

11. El vector AAV para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o 7-9, en donde el péptido señal de secreción se selecciona del grupo que consiste en un péptido IgK, un péptido de tipo glucagón, un péptido CNTF, un péptido PEDF, un péptido FGF10, un péptido PDGF-A, un péptido Gas6, un péptido CFH, un péptido GDNF, un péptido IL-8, un péptido Mc P-1 y un péptido T iMp .

12. El vector AAV para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o 7-9, en donde el péptido señal de secreción comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NOs: 1-12, y cualquier combinación de las mismas.