JP6293664B2 - 桿体由来錐体生存因子をコードするベクター - Google Patents

Description

助成金の情報
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ ＨｅａｌｔｈのＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａによって付与されたＳＢＩＲ助成金第ＥＹ０１６２６２号の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有し得る。

ＲｄＣＶＦは網膜中の桿体光受容器細胞により特異的に発現されるチオレドキシン様タンパク質である（Ｌｅｖｅｉｌｌａｒｄら（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３６：７５５−７５９、および補足情報）。ヒトにおいては２種類のＲｄＣＶＦ遺伝子が見出されており、これらはＲｄＣＶＦ１およびＲｄＣＶＦ２と命名されている。いずれのＲｄＣＶＦ遺伝子も、オルタナティブスプライシングによる２種類の生成物：それぞれ、ＲｄＣＶＦ−ｌｏｎｇおよびＲｄＣＶＦ−ｓｈｏｒｔとして知られている全長タンパク質およびＣ末端転写後短縮型タンパク質をコードする。

ＲｄＣＶＦ−ｓｈｏｒｔは、錐体の生存を促進するための分泌型栄養因子として記載されており、ＲｄＣＶＦ−Ｌｏｎｇは、細胞内タンパク質と相互作用する酸化還元活性酵素（ｒｅｄｏｘ−ａｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ）として記載されている（Ｌｅｖｅｉｌｌａｒｄら（２０１０）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２（２６）：２６ｐｓｌ６）。例えば、ｔａｕは、ＲｄＣＶＦ−Ｌの結合パートナーとして記載されており、ｔａｕは専ら細胞内に存在する（Ｆｒｉｄｌｉｃｈら（２００９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ８（６）：１２０６−１８）。

いくつかの網膜ジストロフィーに罹患している個体は、網膜ジストロフィーに罹患していない個体よりも、彼らの眼の中のＲｄＣＶＦタンパク質レベルが低いことが明らかにされている（ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ０２／０８１５１３）。

ＲｄＣＶＦタンパク質の異なる形態が、インビトロおよびインビボで錐体光受容器細胞の生存を促進できることが実証されている。例えば、短い形態のヒトＲｄＣＶＦ１（ＲｄＣＶＦ１Ｓ）タンパク質の眼内注射は錐体細胞を変性からレスキューしただけではなく、遺伝性網膜変性の動物モデルにおいてはそれらの機能も保存した（Ｙａｎｇら（２００９）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒａｐｙ １７：７８７−７９５）。しかし、このタンパク質のインビボでの錐体細胞保護作用の実証には、複数回の眼内注射を使用することが必要である。

大規模での、そして遺伝子治療ベクターからのＲｄＣＶＦの有意なレベルでの発現への挑戦が行われてきた。例えば、米国特許公開番号２０１１００３４５４６、段落［０００４］を参照のこと。

本明細書中での参考文献の引用または議論は、そのような参考文献が本発明の先行技術であることの承認と解釈されるべきではない。

国際公開第０２／０８１５１３号 米国特許出願公開第２０１１／００３４５４６号明細書

本発明は、一部、ＲｄＣＶＦをコードする核酸、ＲｄＣＶＦ発現構築物、ＲｄＣＶＦベクター、ＲｄＣＶＦの発現方法、光受容器細胞（例えば、錐体細胞および／または桿体細胞）の死を遅らせる、妨げる、または阻害する方法、網膜変性のような眼疾患の処置方法、およびアルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病のような神経変性疾患、もしくは嗅覚の疾患の処置方法に関する。

本発明は、細胞（単数または複数）からＲｄＣＶＦタンパク質を発現させるための組成物、方法、ならびに処置方法を提供する。

本発明のいくつかの実施形態は、ＲｄＣＶＦタンパク質のコード配列をコードするヌクレオチド配列を含有している核酸を提供する。ここでは、ＲｄＣＶＦコード配列は再コード化されたヌクレオチド配列を含有している。

本発明はまた、核酸を含有しているウイルスベクターを含み、ここでは、核酸がＲｄＣＶＦタンパク質のコード配列をコードするヌクレオチド配列を含有しており、ＲｄＣＶＦコード配列が再コード化されたヌクレオチド配列を含有している。

本発明のいくつかの実施形態は本発明の核酸を含有している単離された細胞に関する。

本発明の他の実施形態は、本発明の細胞により、または本発明の核酸から産生されたＲｄＣＶＦタンパク質に関する。いくつかの実施形態では、ＲｄＣＶＦタンパク質は自然界に存在するＲｄＣＶＦアミノ酸配列ではない。

（ｉ）薬学的に受容可能な担体と（ｉｉ）本発明の核酸、本発明のウイルスベクター、本発明のＲｄＣＶＦタンパク質、またはそれらの組み合わせを含有している薬学的調製物もまた本発明に含まれる。

ＲｄＣＶＦタンパク質の発現および分泌を可能にする条件下で本発明の細胞を培養する工程、ならびに細胞培養物からＲｄＣＶＦタンパク質を単離する工程を含む、ＲｄＣＶＦタンパク質の産生方法もまた提供される。

本発明のいくつかの実施形態は、哺乳動物の眼に、本発明の核酸、本発明のウイルスベクター、本発明のＲｄＣＶＦタンパク質、またはそれらの組み合わせを投与する工程を含む、眼の桿体細胞の保存方法に関する。

本発明はまた、網膜ジストロフィー、シュタルガルト病、網膜色素変性、ドライ型加齢性黄斑変性（ドライ型ＡＭＤ）、地図状萎縮（ドライ型ＡＭＤの進行期）、滲出型加齢性黄斑変性（滲出型ＡＭＤ）、高眼圧症を伴う緑内障もしくは高眼圧症を伴わない緑内障、糖尿病網膜症、バルデ・ビードル症候群、バッセン−コーンツバイク症候群、ベスト病、全脈絡膜萎縮（ｃｈｏｒｏｉｄｅｍａ）、脳回転状萎縮症、先天黒内障、レフサム病（ｒｅｆｓｕｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、アッシャー症候群、甲状腺関連眼疾患、グレーヴス病、網膜色素上皮細胞と関係がある疾患、前上葉区の疾患（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｓｅｇｍｅｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ）、水晶体疾患／白内障、眼杯（ｅｙｅ ｃｕｐ）の障害、ぶどう膜炎、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、または嗅覚の疾患のような疾患の処置方法を提供する。

本発明のいくつかの実施形態は、哺乳動物の眼に本発明の核酸および／またはウイルスベクターを投与する工程を含む眼の桿体細胞の保存方法に関する。ここでは、核酸および／またはウイルスベクターは網膜下注射により投与され、桿体細胞は網膜下注射の部位とは異なる部位で保存される。

本発明のいくつかの実施形態は、哺乳動物の眼に本発明の核酸および／またはウイルスベクターを投与する工程を含む眼の錐体細胞の保存方法に関する。ここでは、核酸および／またはウイルスベクターは網膜下注射により投与され、錐体細胞は網膜下注射の部位とは異なる部位で保存される。

本発明はまた、細胞に本発明の核酸またはウイルスベクターを投与する工程を含む、細胞からＲｄＣＶＦタンパク質を分泌させる方法も提供する。

ＲｄＣＶＦタンパク質は、ＲｄＣＶＦ１タンパク質であってもＲｄＣＶＦ２タンパク質であってもよく、また長いバージョンであっても短いバージョンであってもよい。

本明細書中に記載される任意の方法または組成物は、本明細書中に記載される任意の他の方法または組成物に関しても実行され得ると考えられる。語句「ａ」または「ａｎ」の使用は、特許請求の範囲および／または明細書中において語句「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と組み合わせて使用される場合は「１」を意味し得るが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは２つ以上」の意味とも合致する。語句／表現「および／または」の使用は、リストとともに使用される場合は、列挙された項目の１つ以上が利用され得る、例えば、要素のうちの１つまたは全てに限定されないことを意味する。

本発明のこの要旨は、本発明の全ての特徴または必須の特徴を必ずしも記載しているわけではない。本発明はまた、記載される特徴の部分的組み合わせにも属し得る。

本発明を説明する目的のために、本発明の特定の実施形態が図面で示される。しかし、本発明は、図面に示される実施形態の正確な取り合わせおよび手段に限定されない。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
ＲｄＣＶＦタンパク質のコード配列をコードするヌクレオチド配列を含有している核酸であって、ここでは、前記ＲｄＣＶＦコード配列が再コード化されたヌクレオチド配列を含有している、核酸。
（項目２）
前記ＲｄＣＶＦタンパク質がＲｄＣＶＦ１タンパク質である、項目１に記載の核酸。
（項目３）
前記ＲｄＣＶＦタンパク質がＲｄＣＶＦ２タンパク質である、項目１に記載の核酸。
（項目４）
前記ＲｄＣＶＦタンパク質が短いバージョンのＲｄＣＶＦタンパク質である、前述の項目のいずれか１項に記載の核酸。
（項目５）
前記ＲｄＣＶＦタンパク質が長いバージョンのＲｄＣＶＦタンパク質である、項目１〜３のいずれか１項に記載の核酸。
（項目６）
前記ＲｄＣＶＦタンパク質がヒトＲｄＣＶＦタンパク質である、前述の項目のいずれか１項に記載の核酸。
（項目７）
前記再コード化されたヌクレオチド配列が開始メチオニンコドンを欠いている、前述の項目のいずれか１項に記載の核酸。
（項目８）
前記ＲｄＣＶＦタンパク質の前記コード配列が、配列番号１のヌクレオチド１０６〜７４１、配列番号１のヌクレオチド１０６〜４２９、配列番号３のヌクレオチド１０６〜４３２、または配列番号３のヌクレオチド１０６〜７４４を含有している、項目１に記載の核酸。
（項目９）
前記ＲｄＣＶＦタンパク質の前記コード配列に作動可能に連結されたＮ末端シグナル配列の第２のコード領域をさらに含有している、前述の項目のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１０）
前記シグナル配列が、Ｉｇｋシグナル配列、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インシュリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）およびβ−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ）（ＧＵＳＢ）からなる群より選択される、項目９に記載の核酸。
（項目１１）
前記シグナル配列が配列番号１のヌクレオチド１〜１０５を含有している、項目９に記載の核酸。
（項目１２）
前記シグナル配列が、配列番号１５、配列番号２のアミノ酸２〜３４、または配列番号２のアミノ酸７〜２１を含有しているアミノ酸配列をコードする、項目９に記載の核酸。
（項目１３）
前記ヌクレオチド配列が配列番号１または３を含有している、項目１に記載の核酸。
（項目１４）
前記再コード化されたヌクレオチド配列が、少なくとも４０％の再コード化されたコドンを有している、項目１に記載の核酸。
（項目１５）
前記再コード化されたヌクレオチド配列が、対応するネイティブなヌクレオチド配列と比べると異なる、少なくとも１５％のヌクレオチドを有している、項目１に記載の核酸。
（項目１６）
前記再コード化されたヌクレオチド配列が、対応するネイティブなヌクレオチド配列に対して９０％未満同一である、項目１に記載の核酸。
（項目１７）
前記再コード化されたヌクレオチド配列が、原核生物の阻害性モチーフを持たないこと、コンセンサススプライスドナー部位を持たないこと、潜在的なスプライスドナー部位を持たないこと、およびＧＣ含量が６０〜６５％の間であることからなる群より選択される特徴のうちの１つ以上を有している、項目１〜７および９〜１６のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１８）
プロモーター配列が、前記ＲｄＣＶＦタンパク質の前記コード配列に作動可能に連結されている、前述の項目のいずれか１項に記載の核酸。
（項目１９）
前記プロモーターがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである、項目１８に記載の核酸。
（項目２０）
前記ＣＭＶプロモーターが配列番号１１の１５０〜８１２を含有している、項目１９に記載の核酸。
（項目２１）
イントロン配列が前記ＲｄＣＶＦタンパク質の前記コード配列に作動可能に連結されている、前述の項目のいずれか１項に記載の核酸。
（項目２２）
前記イントロン配列がβ−グロビンイントロン配列である、項目２１に記載の核酸。
（項目２３）
前記イントロン配列が配列番号１１のヌクレオチド８２０〜１３１２を含有している、項目２１に記載の核酸。
（項目２４）
前記核酸が、配列番号１１、配列番号１１の１５０〜２０８０のヌクレオチド配列、または配列番号１１の１５０〜８１２、８２０〜１３１２および１３４０〜２０８０のヌクレオチド配列を含有している、項目１に記載の核酸。
（項目２５）
前述の項目のいずれか１項に記載の核酸を含有しているウイルスベクター。
（項目２６）
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、項目２５に記載のウイルスベクター。
（項目２７）
前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ血清型２をベースとしている、項目２６に記載のウイルスベクター。
（項目２８）
前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ血清型８をベースとしている、項目２６に記載のウイルスベクター。
（項目２９）
前記ウイルスベクターがウシ免疫不全ウイルスベクターではない、項目２５に記載のウイルスベクター。
（項目３０）
前記ウイルスベクターが１種類のウイルスベクターではない、項目２５に記載のウイルスベクター。
（項目３１）
前記ウイルスベクターが、ＤＮＡウイルスベクター、非エンベロープ型ウイルスベクター、およびアデノウイルスベクターからなる群より選択される、項目２５に記載のウイルスベクター。
（項目３２）
ＲｄＣＶＦタンパク質を分泌する、項目１〜４のいずれか１項に記載の核酸を含有している単離された細胞。
（項目３３）
天然に存在するタンパク質ではない、項目３２に記載の細胞により産生されたＲｄＣＶＦタンパク質。
（項目３４）
（ｉ）薬学的に受容可能な担体、および（ｉｉ）項目１〜２４のいずれか１項に記載の核酸、項目２５〜３１のいずれか１項に記載のウイルスベクター、項目３３に記載のＲｄＣＶＦタンパク質、またはこれらの組み合わせを含有している、薬学的調製物。
（項目３５）
ＲｄＣＶＦタンパク質を産生するための方法であって、前記方法は、項目３２に記載の細胞を、前記ＲｄＣＶＦタンパク質の発現と分泌を可能にする条件下で培養する工程、および前記細胞の培養物から前記ＲｄＣＶＦタンパク質を単離する工程を含む、方法。
（項目３６）
前記細胞の培養物の上清からの前記ＲｄＣＶＦタンパク質の精製をさらに含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
天然に存在するタンパク質ではない、項目３５または３６に記載の方法により産生されたＲｄＣＶＦタンパク質。
（項目３８）
哺乳動物の眼において眼の桿体細胞を保存する方法であって、前記方法は、前記哺乳動物の前記眼に、前記眼の桿体細胞を保存するために有効な量の、項目１〜２４のいずれか１項に記載の核酸、項目２５〜３１のいずれか１項に記載のウイルスベクター、項目３３または３７に記載のＲｄＣＶＦタンパク質、項目３３に記載の薬学的組成物、あるいはそれらの組み合わせを投与する工程を含む、方法。
（項目３９）
前記ウイルスベクターまたは前記核酸が、網膜下注射により投与される、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記ウイルスベクターまたは前記核酸が、硝子体内注射、前房への注射、結膜下注射、またはテノン嚢下注射により投与される、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記哺乳動物がヒトである、項目３８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
（項目４２）
前記哺乳動物が、網膜ジストロフィー、シュタルガルト病、網膜色素変性、ドライ型加齢性黄斑変性（ドライ型ＡＭＤ）、地図状萎縮（進行期のドライ型ＡＭＤ）、滲出型加齢性黄斑変性（滲出型ＡＭＤ）、緑内障／高眼圧症、糖尿病網膜症、バルデ・ビードル症候群、バッセン−コーンツバイク症候群、ベスト病、全脈絡膜萎縮（ｃｈｏｒｏｉｄｅｍａ）、脳回転状萎縮症、先天黒内障、レフサム病（ｒｅｆｓｕｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、アッシャー症候群、甲状腺関連眼疾患、グレーヴス病、網膜色素上皮細胞と関係がある疾患、前上葉区の疾患、水晶体疾患／白内障、眼杯の障害、またはぶどう膜炎からなる群より選択される眼疾患に罹患している、項目３８〜４１のいずれか１項に記載の方法。
（項目４３）
前記投与の前には、保存される前記眼の桿体細胞が項目１〜２４のいずれか１項に記載の核酸を含まず、また前記ウイルスベクターが形質導入されていない、項目３８〜４２のいずれか１項に記載の方法。
（項目４４）
哺乳動物の眼において眼の桿体細胞を保存する方法であって、前記哺乳動物の前記眼に、項目１〜２４のいずれか１項に記載の核酸、または項目２５〜３０のいずれか１項に記載のウイルスベクターを投与する工程を含み、前記核酸または前記ウイルスベクターが、網膜下注射により投与され、前記桿体細胞が、前記網膜下注射の前記部位から少なくとも１ｍｍの部位で保存される、方法。
（項目４５）
前記桿体細胞が、前記網膜下注射の前記部位から少なくとも２ｍｍの部位で保存される、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
細胞からＲｄＣＶＦタンパク質を分泌させる方法であって、前記方法は、前記細胞に、項目９〜１３および２４のいずれか１項に記載の核酸、または項目２５〜３１のいずれか１項に記載のウイルスベクターを、前記核酸または前記ウイルスベクターによりコードされるＲｄＣＶＦの発現および分泌を可能にする条件下で投与する工程を含む、方法。
（項目４７）
前記細胞が哺乳動物細胞である、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記細胞がヒト細胞である、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記細胞が眼細胞である、項目４６〜４８のいずれか１項に記載の方法。
（項目５０）
前記細胞が、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、桿体細胞、錐体細胞、双極細胞、水平細胞、無軸索細胞、神経節細胞、およびＡＲＰＥ−１９細胞からなる群より選択される、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記細胞がインビトロにある、項目４６〜５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目５２）
前記細胞がインビボにある、項目４６〜５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目５３）
前記細胞がエクスビボにある、項目４６〜５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目５４）
前記細胞が、２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＰｅｒＣ６細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＤＣＫ細胞、３Ｔ３細胞、およびＷＩ３８からなる群より選択される、項目４７および５１〜５２のいずれか１項に記載の方法。
（項目５５）
前記細胞が被包されている、項目４６〜５４のいずれか１項に記載の方法。
（項目５６）
疾患を処置する方法であって、前記方法は、哺乳動物に、項目１〜２４のいずれか１項に記載の核酸、項目２５〜３１のいずれか１項に記載のウイルスベクター、項目３３に記載のＲｄＣＶＦタンパク質、項目３４に記載の薬学的調製物、またはそれらの組み合わせを投与する工程を含み、ここで、前記疾患が、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、および嗅覚の疾患からなる群より選択される、方法。
（項目５７）
前記哺乳動物がヒトである、項目５６に記載の方法。

図１は、精製された組み換えＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１ＬおよびＡＡＶ−ＧＦＰベクター粒子のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ｒＡＡＶ−ＧＦＰ調製物（レーン１）および２つのｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌ調製物（レーン２および３）のタンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、銀染色分析により視覚化された。 図２は、ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌベクターが形質導入されたＡＲＰＥ−１９細胞中でのＲｄＣＶＦ１Ｌの発現のウェスタンブロット分析を示す。ｒＡＡＶが形質導入されたＡＲＰＥ−１９細胞の細胞溶解物（図２Ａ）および上清（図２Ｂ）がＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、ＲｄＣＶＦ１Ｌタンパク質に対するウェスタンブロットが行われた。レーン１は、対照のための形質導入されていないＡＲＰＥ−１９の細胞溶解物（図２Ａ）および上清（図２Ｂ）を示し、レーン２およびレーン３は、それぞれ、ｒＡＡＶ−ＧＦＰおよびｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌが形質導入されたＡＲＰＥ−１９細胞の細胞溶解物（図２Ａ）および上清（図２Ｂ）を示す。 図３は、ベクターの注入後６週間でのウェスタンブロットによる、正常なＢａｌｂ／ＣマウスのｒＡＡＶ−ＧＦＰが注射された眼および未処置の眼に対するｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌが注射された眼の中でのＲｄＣＶＦ発現の増大の確認を示す。ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌが形質導入されたＡＲＰＥ−１９細胞由来のタンパク質抽出物が陽性対照として使用され（レーン１４および１７）、一方、形質導入されていない細胞の抽出物が陰性対照として使用された（レーン１５）。ＲｄＣＶＦタンパク質は、ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌが注射された眼において検出され（レーン６、８、１０、および１２）、一方、同じ動物の未処置の反対側の眼においてはＲｄＣＶＦに相当するバンドが観察されなかったか、またはかすかにしか観察されず（レーン７、９、１１、および１３）、さらに、ｒＡＡＶ−ＧＦＰが注射された眼においても同様であった（レーン２〜５）。レーン１は、タンパク質標準マーカーである。レーン１６は、野生型の正常なマウスの眼由来のタンパク質抽出物である。 図４は、ＲＰＥ−脈絡膜−強膜フラットマウント（ｆｌａｔｍｏｕｎｔ）のＲＰＥ細胞中のＲｄＣＶＦの免疫組織化学染色を示す。ベクターの注射後６週間で、強いＲｄＣＶＦ発現が、正常なＢａｌｂ／ＣマウスのｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌが注射された眼の中で観察されたが（図４Ａ）、注射されなかった反対側の眼の中では観察されなかった（図４Ｂ）。一次抗体なしで処理された試料中では免疫反応性は見られなかった（図４Ｃ）。フラットマウントが、細胞核を示すためにＤＡＰＩにより青色に対比染色された。 図５は、神経網膜のフラットマウントのＲｄＣＶＦ１Ｌの免疫組織化学染色を示す。ベクターの注射後６週間で、強いＲｄＣＶＦ１Ｌ発現が正常なＢａｌｂ／ＣマウスのｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌが注射された眼の中の光受容器細胞において観察された（図５Ａ）。染色の大部分は、光受容器細胞の外節の中に存在していた。対照的に、注射されなかった反対側の眼の光受容器細胞においては、バックグラウンドの染色しか見られなかった（図５Ｂ）。一次抗体なしで処理された試料中では免疫反応性は観察されなかった（図５Ｃ）。 図６は、ｒｄ１０マウスへのＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌの網膜下注射後５週間での、ＲＰＥおよび光受容器細胞中でのＲｄＣＶＦ１Ｌの発現を明らかにした研究の結果を示す。ＲｄＣＶＦを発現するＲＰＥ細胞が、ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌベクターが注射された眼のＲＰＥ−脈絡膜−強膜フラットマウントのおよそ半分において見られたが（Ａ）、注射されなかった反対側の眼においては見られなかった（Ｂ）。ＲｄＣＶＦを発現する節が同じ眼のフラットマウントされた網膜において観察されたので、光受容器細胞（Ｃ）もまた形質導入された。対照的に、注射されなかった反対側の眼においては、ＲｄＣＶＦ発現は見られなかった（Ｄ）。（Ｄ）の暗緑色の細胞はおそらく、網膜に付着した自己蛍光マクロファージである。典型的な六角形の形態を維持している形質導入されたＲＰＥ細胞（Ｅ）とＲｄＣＶＦを発現する光受容器節（Ｆ）の高倍率の写真。 図７は、ｒｄ１０マウスのＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌの網膜下注射による光受容器のレスキューを示す。生後３日目に右眼にｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌが投与され（ＡおよびＣ）、左眼は未処置の対照とされた（ＢおよびＤ）２匹のマウス由来の代表的な網膜の切片の光学顕微鏡写真。ｒｄ１０マウスは５週齢で屠殺された。処置された眼（先を二重にした矢印）と未処置の眼（先が一重の矢印）との間での外核層（ＯＮＬ）の厚みの差に留意されたい。未処置の眼には１列存在する（ＢおよびＤ）のに対しＡＡＶ−ＲｄＣＶＦで処置された眼には２〜４列存在する（ＡおよびＣ）。光受容器の内節および外節が、保護された網膜のいくつかの領域に残っていた（Ｅ）。ＩＳ，内節；ＯＳ，外節；ＯＮＬ，外核層。 図８は、一方の眼にｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌの網膜下注射を受け（パネルＡ，図８）、そして反対側の眼には処置が行われなかった（パネルＢ、図８）代表的な５週齢のｒｄ１０マウス由来の眼杯の光学顕微鏡写真を示す。示されるように、処置された眼の中ではより多くの光受容器細胞が保存されていた。 図９は、注釈付きのｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌのヌクレオチド配列を示す。 図９は、注釈付きのｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌのヌクレオチド配列を示す。 図１０Ａ：ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌの送達により、ｒｄ１０マウスにおいて網膜の機能が改善する。ＥＲＧは、ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌの注射後およそ５週間で行われた。本発明者らが試験した全８匹のマウスによるＥＲＧ応答の測定は、処置された眼による平均のｂ波の振幅が、未処置のもう一方の眼による増幅よりも約３倍大きく、これが統計学的に有意であった（ｐ＝０．０２５）ことを示している。

図１０Ｂ：ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌの送達によりｒｄ１０マウスの網膜の機能が改善する。ＥＲＧは、ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌの注射後およそ５週間で行われた。右のパネル：これらは、処置された眼（黒色の線、ｎ＝８）と未処置のもう一方の眼（赤色の線、ｎ＝８）による８つの波形の平均である。これらは、暗い背景のもとで２５ｃｄ．ｓ／ｍ^２の強度の１回の閃光で記録された。明らかに、処置された眼はもう一方の眼よりもはるかに高い応答を有していた。左のパネル：本発明者らが試験した全８匹のマウスによるＥＲＧ応答の測定は、処置された眼による平均のｂ波の振幅が、未処置のもう一方の眼による振幅よりも約３倍大きく、これが統計学的に有意であった（ｐ＝０．０２５）ことを示している。
図１１Ａおよび１１Ｂ：ｒｄ１０マウスにおけるｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌの網膜下注射による光受容器の保存。生後３日目に右眼にｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌが投与され（Ａ）、左眼は未処置の対照とされた（Ｂ）マウス由来の代表的な網膜の切片の光学顕微鏡写真。処置された眼と未処置の眼との間でのＯＮＬの厚みの差に留意されたい。未処置の眼（Ｂ）には１段存在するのに対し、処置された眼（Ａ）には約４段存在する。光受容器の外節は、保護された網膜；ｏｎｌ、外核層のうちのいくつかの領域に残っている。 図１２：ｒｄ１０マウスの未処置の眼に対するｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌで処置された眼の中の外核層（ＯＮＬ）の厚みの比較。処置された眼（赤色のバー）の中のＯＮＬの平均の厚みは、未処置の眼（黒色のバー）の中のＯＮＬの平均の厚みよりも有意に大きい（Ｐ＝０．００６）。数値は平均＋ＳＤを意味する。

（発明の詳細な説明）
本明細書中で使用される場合は、移行句「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は開かれている。この語句を利用している特許請求の範囲には、そのような特許請求の範囲に記述されたものに加えて複数の要素が含まれ得る。したがって例えば、方法については、そのような特許請求の範囲は、記述された要素またはそれらの等価物が存在する限りは、その中に具体的には記述されていない他の工程もまた含むと読み取ることができる。

語句「同一性」および「同一」は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列のような２つの配列を比較する状況において使用される場合は、２つの配列の間でアラインする配列の百分率をいう。パーセント同一性は当業者に一般的に利用されているアルゴリズムにより決定され得る。例えば、パーセント同一性は、ウェブサイト上で入手できる国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ））から入手可能なツールおよびプログラムを使用して決定され得る。２つのヌクレオチド配列のパーセント同一性は、例えば、ＮＣＢＩ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔｎ ｓｕｉｔｅを使用して決定され得る。Ｂｌａｓｔｎは以下のように設定されたパラメーターとともに使用され得る：予想される閾値＝１０；語長＝２８；範囲クエリー中の最大マッチ＝０；マッチ／ミスマッチスコア＝１、−２；ギャップコスト＝あり：５、伸長：２。

ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２００２／０８１５１３、ＷＯ２００８／１４８８６０、およびＷＯ２００９／１４６１８３には、ＲｄＣＶＦに関連するさまざまな組成物および方法が記載されている。いくつかの場合には、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２００２／０８１５１３、ＷＯ２００８／１４８８６０、およびＷＯ２００９／１４６１８３に記載されているＲｄＣＶＦに関連する組成物および方法が、例えば、ＲｄＣＶＦをコードする核酸、ベクター、またはタンパク質を、本発明のもの、例えば、野生型ＲｄＣＶＦコード配列を含有している核酸およびベクター）で置き換えることにより利用され得る。

本発明のいくつかの実施形態は、配列番号２および４のようなＲｄＣＶＦプロタンパク質のアミノ酸配列を提供する。本発明はまた、配列番号１、３、および１１のような、ＲｄＣＶＦプロタンパク質をコードするヌクレオチド配列も提供する。

本発明はまた、被検体の疾患（ここでは、疾患は、ＲｄＣＶＦ１またはＲｄＣＶＦ２遺伝子の発現の変化（例えば、眼の中のＲＤＣＶＦ１またはＲＤＣＶＦ２ポリペプチドの存在の減少）により媒介されるか、あるいはそのような変化と関係があるもの）の、ＲＤＣＶＦ１もしくはＲＤＣＶＦ２タンパク質、または関連するタンパク質、あるいはそれらの断片または一部分をコードする治療有効量の核酸あるいはベクターの被検体への投与による処置方法を提供する。

別の態様では、本発明のＲｄＣＶＦタンパク質、核酸、ベクター、または組成物は例えば、本明細書中に列挙される疾患を処置するための医薬品の製造に使用され得る。

本発明の製品、組成物、プロセス、および方法は、とりわけ、研究上の、生物学的、臨床的、または治療目的のために使用され得る。

（ＲｄＣＶＦ）
ＲｄＣＶＦタンパク質がインビトロおよびインビボにおいて錐体光受容器細胞の生存を促進し得ることが実証されている。例えば、短い形態のヒトＲｄＣＶＦ１（ＲｄＣＶＦ１Ｓ）タンパク質の眼内注射は錐体細胞を分解からレスキューしただけではなく、遺伝性網膜変性の動物モデルにおいてはそれらの機能もまた維持した（Ｙａｎｇら（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００９）１７：７８７−７９５および補足材料）。ＲｄＣＶＦは、網膜の中で桿体光受容器細胞を含むいくつかの細胞型により発現される（Ｌｅｖｅｉｌｌａｒｄら（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３６：７５５−７５９）。

２種類の異なるＲｄＣＶＦ遺伝子がヒトおよび他の哺乳動物において見出されており、これらはＲｄＣＶＦ１およびＲｄＣＶＦ２と命名されている。いずれのＲｄＣＶＦ遺伝子も、オルタナティブスプライシングによる２種類の生成物：それぞれ、ＲｄＣＶＦ−ｌｏｎｇおよびＲｄＣＶＦ−ｓｈｏｒｔとして知られている全長タンパク質およびＣ末端短縮型タンパク質をコードする。

いくつかの実施形態では、本発明は再コード化されたＲｄＣＶＦコード配列を含む。再コード化されたＲｄＣＶＦコード配列は、本明細書中で開示されるもののうちのいずれかを含む任意のＲｄＣＶＦタンパク質をコードし得る。様々なＲｄＣＶＦタンパク質の配列は、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２００２０８１５１３およびＷＯ２０１００２９１３０；Ｃｈａｌｍｅｌら（ＢＭＣ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００７）８：７４ ｐｐ１−１２および補足情報）；Ｌｅｖｅｉｌｌａｒｄら（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００４）３６：７５５−７５９および補足情報）；Ｙａｎｇら（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００９）１７：７８７−７９５および補足材料）、ならびにＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６１２４６３、ＡＡＨ１４１２７、Ｑ９６ＣＭ４、ＥＡＷ８４６０８、ＣＡＤ６７５２８、Ｑ５ＶＺ０３、ＮＰ＿００１１５５０９７、ＮＰ＿６６０３２６、ＣＡＭ２４７４８、ＣＡＭ１４２４７、ＡＡＨ２２５２１、およびＣＡＤ６７５３１の中に見ることができる（明確にするために、これらのＧｅｎＢａｎｋ配列の全て、さらには本明細書中で議論される全ての他の特許公開および非特許刊行物は、それらの全体が引用により組み込まれるものとされる）。

いくつかの実施形態では、ＲｄＣＶＦタンパク質は、錐体細胞および／または桿体細胞生存活性または保護作用を保持しているＲｄＣＶＦタンパク質の断片あるいはアナログである。これらの活性または作用を測定する方法は当前記分野で公知である。例えば、Ｌｅｖｅｉｌｌａｒｄら（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００４）３６：７５５−７５９および補足情報）には、ＲｄＣＶＦ活性を検出するための関連するマウスモデルとインビトロでの方法が記載されている。核酸によりコードされるＲｄＣＶＦタンパク質またはＲｄＣＶＦは、自然界に存在するアミノ酸配列ではないアミノ酸配列を有し得る。例えば、自然界には存在しないＲｄＣＶＦタンパク質は、自然界に存在するＲｄＣＶＦタンパク質において見られるものに加えて、（例えば、アミノ末端またはカルボキシ末端に）アミノ酸を含み得る、および／または自然界に存在するＲｄＣＶＦアミノ酸配列と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換）を含み得る。保存的アミノ酸置換は、一般に、親配列の構造的特長を実質的に変化させないものとされる（例えば、代替アミノ酸は親配列中に存在するへリックスを破断するか、または親配列を特徴づける他のタイプの二次構造を破壊する傾向のないものであるべきである）。当前記分野で認識されているポリペプチドの二次構造および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ ａｎｄ Ｊ．Ｔｏｏｚｅ編，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５（１９９１）に記載されている。保存的置換として、以下のグループによる置換が挙げられるが、これらに限定されるわけではない：酸性残基Ａｓｐ（Ｄ）およびＧｌｕ（Ｅ）；塩基性残基Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、およびＨｉｓ（Ｈ）；親水性非荷電残基Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ａｓｎ（Ｎ）、およびＧｌｎ（Ｑ）；脂肪族非荷電残基Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、およびＩｌｅ（Ｉ）；非極性非荷電残基Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、およびＰｒｏ（Ｐ）；芳香族残基Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、およびＴｒｐ（Ｗ）；アルコール基を含有している残基ＳおよびＴ；脂肪族残基Ｉ、Ｌ、Ｖ、およびＭ；シクロアルケニルが会合している残基Ｆ、Ｈ、Ｗ、およびＹ；疎水性残基Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹ；負電荷を持つ残基ＤおよびＥ；極性残基Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、およびＴ；正電荷を持つ残基Ｈ、Ｋ、およびＲ；小さい残基Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、およびＶ；非常に小さい残基Ａ、Ｇ、およびＳ；ターンの形成に関与する残基Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｐ、およびＴ；ならびに、可撓性残基Ｑ、Ｔ、Ｋ、Ｓ、Ｇ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、およびＲ。本発明のいくつかの実施形態では、自然界には存在しないＲｄＣＶＦタンパク質は、アミノ末端にさらなるアミノ酸、例えば、異種シグナルペプチド由来のさらなるアミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、本発明のＲｄＣＶＦタンパク質は、シグナルペプチドを用いてヌクレオチドコード配列から最初に翻訳され、いくつかの場合は、シグナルペプチドの全てのアミノ酸またはその一部が、本発明の発現された、および／または分泌されたＲｄＣＶＦタンパク質上に維持される。

（再コード化されたＲｄＣＶＦコード配列）
語句「再コード化された」または「再コード化されたヌクレオチド配列」は、少なくとも１つのネイティブなコドンが、そのネイティブなコドンと同じアミノ酸をコードする異なるコドンに変更されていることを意味する。いくつかの実施形態では、再コード化されたＲｄＣＶＦコード領域は、少なくとも２．５％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の再コード化されたコドンを有する。いくつかの実施形態では、約２０〜５０％、３５〜４５％、３８〜４２％、または３９〜４１％のコドンが再コード化されている。いくつかの実施形態では、再コード化されたコドンは、ヒトにおいてより一般的に使用されているコドンに置き換えられる。いくつかの実施形態では、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、または少なくとも５５％のコドンが、ヒトにおいてより一般的に使用されているコドンに置き換えられている。

いくつかの実施形態では、再コード化された配列は、対応するネイティブなコード配列と約７０〜９０％、約７５〜８５％、約８０〜８５％、または約８２〜８５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、再コード化されたヌクレオチド配列は、対応するネイティブなヌクレオチド配列と比較して少なくとも１５％のヌクレオチドの相違を有する。いくつかの実施形態では、再コード化されたヌクレオチド配列は、対応するネイティブなヌクレオチド配列に対して９０％未満の同一性である。

再コード化はまた、グアニン／シトシン（ＧＣ）百分率のような、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡコード配列の化学組成を変化させるためにも使用され得る。いくつかの実施形態では、ＲｄＣＶＦコード領域の再コード化は、ＧＣ含量を少なくとも６０％にまで上昇させる。いくつかの実施形態では、再コード化されたＲｄＣＶＦコード領域は、６０〜６４％または６０．４％〜６３．５％の間のＧＣ百分率を有する。

再コード化は、ｍＲＮＡの二次構造を変化させるために使用され得る。再コード化はまた、原核生物阻害性モチーフ、コンセンサススプライスドナー部位、潜在的なスプライスドナー部位、またはそれらの組み合わせのような特定のモチーフあるいは部位をコード配列または核酸分子から除去する、あるいはそれらに加えるためにも使用され得る。いくつかの実施形態では、再コード化されたＲｄＣＶＦコード配列は、ネイティブな配列よりも小さい原核生物阻害性モチーフ、コンセンサススプライスドナー部位、潜在的なスプライスドナー部位、またはそれらの組み合わせを有する。いくつかの実施形態では、再コード化されたＲｄＣＶＦコード配列は、原核生物阻害性モチーフを含まない、コンセンサススプライスドナー部位を含まない、および／または潜在的なスプライスドナー部位を含まない。

Ｈｏｏｖｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００２）３０：ｅ４３，ｐｐ１−７）；Ｆａｔｈら（ＰＬｏＳ ＯＮＥ（２０１１）６：ｅ１７５９６ ｐｐ１−１４）；Ｇｒａｆら（Ｊ Ｖｉｒｏｌ（２０００）７４：１０８２２−１０８２６；Ｒａａｂら、Ｓｙｓｔ Ｓｙｎｔｈ Ｂｉｏｌ（２０１０）４：２１５−２２５；および米国特許出願番号２００７０１４１５５７に、コード領域の再コード化が記載されている。

本発明のいくつかの実施形態では、再コード化されたＲｄＣＶＦコード配列は、最初のＲｄＣＶＦ ＡＴＧコドンおよび／またはＲｄＣＶＦ停止コドン（例えば、ＴＡＧ）を含まない。例えば、ＲｄＣＶＦの再コード化されたコード配列は別のコード配列に対して５’または３’で作動可能に連結され得て、それぞれ、ＲｄＣＶＦアミノ酸配列に対してＮ末端および／またはＣ末端に異種アミノ酸配列を含有しているタンパク質を生じ得る。これらの実施形態のうちのいくつかにおいては、最初のＲｄＣＶＦ ＡＴＧコドンおよび／またはＲｄＣＶＦ停止コドンが欠失している場合があり、またＲｄＣＶＦ ＡＴＧコドンおよび／またはＲｄＣＶＦ停止コドンがＲｄＣＶＦコード領域中に存在している場合もある。例えば、配列番号１および配列番号３を参照のこと。別のコード配列がＲｄＣＶＦコード領域の３’末端にインフレームで融合される場合は、ネイティブなＲｄＣＶＦ停止コドンはＲｄＣＶＦコード配列の末端には通常存在しないであろう。

いくつかの実施形態では、再コード化されたＲｄＣＶＦコード領域は、配列番号１のヌクレオチド１０６〜７４１、配列番号１のヌクレオチド１０６〜４２９、配列番号３のヌクレオチド１０６〜４３２、または配列番号３のヌクレオチド１０６〜７４４を含有する。

いくつかの実施形態では、再コード化されたＲｄＣＶＦコード配列は、配列番号２のアミノ酸３６〜２４６をコードする再コード化された配列である。

いくつかの実施形態では、本発明のコード配列はシグナル配列を含むタンパク質をコードする。

（シグナルペプチド／分泌シグナル）
シグナル配列は、典型的には、選択されたポリペプチドのアミノ末端に対して付着したペプチドとしてインフレームで翻訳される。分泌シグナル配列は、宿主細胞の機構と相互作用することにより細胞からポリペプチドの分泌を引き起こす。分泌プロセスの一部として、この分泌シグナル配列は、典型的には、切り離されるか、または少なくとも部分的に切り離される。語句「シグナル配列」はまたシグナルペプチドをコードする核酸配列も意味する。いくつかの実施形態では、シグナル配列は特定のＲｄＣＶＦと比較して異種である。

典型的なシグナルペプチドの構造には３つの異なる領域が含まれ得る：（ｉ）多数の正電荷を持つアミノ酸（例えば、リジンおよびアルギニン）を含むＮ末端領域；（ｉｉ）中央の疎水性コア領域（ｈ領域）；（ｉｉｉ）シグナルぺプチダーゼにより認識される配列モチーフを含む親水性切断領域（ｃ領域）（例えば、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．（１９８３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３３：１７−２１；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．（１９８５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１８４：９９−１０５；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１０）：１−６）を参照のこと）。本発明において使用され得るシグナルペプチドを持つタンパク質の例として、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ７）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インシュリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、神経膠細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、免疫グロブリンタンパク質、ウシ成長ホルモン、ウシプロアルブミン、ヒトプロインスリン、ヒトインターフェロン−γ、ヒトα−フィブリノゲン、ヒトＩｇＧ重鎖、ラットアミラーゼ、マウスα−フェトプロテイン、ニワトリリゾチーム、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ、およびトウモロコシレインタンパク質（ｒｅｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）２２．１を挙げることができるがこれらに限定されるわけではない。これらのシグナルペプチドは本発明にしたがって使用され得る。いくつかの実施形態では、本発明にしたがって使用されるシグナルペプチドは、ＨＧＨ、ＢＤＮＦ、ＩＧＦ−１、およびＧＵＳＢからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドはＩｇＫのような免疫グロブリン由来である。

シグナル配列は、哺乳動物、マウス、またはヒトのシグナル配列であり得る。いくつかの実施形態では、本発明の核酸またはベクターは配列番号１のヌクレオチド１〜１０５または配列番号１の４〜１０５を含有する。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、配列番号２のアミノ酸２〜３４を含有しているアミノ酸配列をコードするか、または配列番号１５を含有する。シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は野生型配列であってよく、また、これは再コード化された配列であってもよい。

本発明のいくつかの実施形態では、シグナルペプチド配列がＲｄＣＶＦのＮ末端またはＣ末端をコードする。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、分泌経路に対する、例えば、小胞体（ＥＲ）に対するタンパク質の移動を命令する。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは細胞質から細胞の外側の目的の部位へのタンパク質の輸送を促進する。シグナルペプチド配列は、自然界に存在するシグナルペプチド配列、それらの誘導体、または合成の設計された配列から選択され得る。いくつかの実施形態では、設計されたシグナルペプチド配列の非限定的なパラメーターは、いくつかの相対的に親水性である残基が隣接している３〜２０残基の疎水性コアを含有する、３〜４０残基の配列を含む。

いくつかの実施形態では、シグナルペプチド配列は疎水性コアを欠いている。本発明において使用され得る、典型的な疎水性シグナル配列を欠いている哺乳動物分泌タンパク質の非限定的な例として、ヒトＩＬ−１α、ＩＬ１β、ｂＦＧＦ、ａＦＧＦ、ＰＤＥＧＦ、抗凝固薬タンパク質、レクチンＬ−１４、ＡＴＬ由来因子、ＸＩＩＩａ因子、Ａｎｃｈｏｒｉｎ ＣＩＩ、リポコルチンＩ、パラサイモシン、α−プロサイモシン、ならびにげっ歯類のトランスグルタミナーゼ、パラサイモシン、およびＭＤＧＩが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。

（核酸）
本発明は、ＲｄＣＶＦをコードするヌクレオチド配列を含有している核酸を含み、そしてこれらの核酸を含有しているベクターを含む。

目的の核酸の局所的、および／または長期の発現を確実にするために、本発明のいくつかの実施形態は、ＲｄＣＶＦをコードする核酸またはベクターの細胞への形質導入を目論む。本発明は、任意の１つの特定の核酸送達方法には限定されると解釈されるべきではなく、インビボもしくはインビトロのいずれかの核酸送達ストラテジーを用いる任意の利用可能な核酸送達媒体、あるいは遺伝子操作された細胞（例えば、Ｎｅｕｒｏｔｅｃｈ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＲＩの技術、例えば、米国特許第６，２３１，８７９号；同第６，２６２，０３４号；同第６，２６４，９４１号；同第６，３０３，１３６号；同第６，３２２，８０４号；同第６，４３６，４２７号；同第６，８７８，５４４号を参照のこと）およびＲｄＣＶＦ自体をコードする本発明の核酸（例えば、「裸のＤＮＡ」）の使用が、本発明の実施において使用され得る。ベクターのような様々な送達媒体が本発明とともに使用され得る。例えば、ウイルスベクター、両親媒性脂質、陽イオン性ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）およびポリリジン）、デンドリマー（例えば、コンバースト（ｃｏｍｂｂｕｒｓｔ）分子およびスターバースト分子、非イオン性脂質、陰イオン性脂質、ベシクル、リポソーム、および他の合成核酸送達手段（例えば、米国特許第６，９５８，３２５号および同第７，０９８，０３０号；Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；「Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ」中の「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ」中のＴｒｅａｔら；ならびにＬｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ＆ Ｆｉｄｌｅｒ（編）、Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３１７−３２７および３５３−３６５（１９８９）を参照のこと）；「裸の」核酸などが、本発明の実施において使用され得る。

いくつかの実施形態では、ＲｄＣＶＦコード配列と任意の他の所望される配列に、ゲノム中の所望される部位での相同組み換えを促進する領域が隣接している核酸分子が使用され、これにより、ＲｄＣＶＦ核酸の染色体内での発現が提供される（Ｋｏｌｌｅｒら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５；Ｚｉｊｌｓｔｒａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８）。患者への核酸の送達は、核酸または核酸を保有しているベクターに対して患者が暴露される場合には直接的であり得、また、細胞が最初にインビトロで核酸により形質転換され、その後、患者に移植される場合には、間接的であり得る。

ベクターは、目的の核酸（例えば、治療用タンパク質をコードし得る治療用核酸）を目的の標的細胞に導入する１つの手段である。目的のベクターを得るまたは構築するための方法として、当前記分野で公知であるような、標準的な遺伝子操作技術、配列決定反応、制限酵素消化、ポリメラーゼ反応、ＰＣＲ、ＰＣＲ ＳＯＥｉｎｇ、ライゲーション、組み換え反応（例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）技術）、核酸に対する他の酵素活性、細菌およびウイルスの増殖の材料および方法、化学薬品および試薬、部位特異的突然変異誘発プロトコールなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓらのテキスト「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」を参照のこと。

本発明の核酸は、典型的には、ＲｄＣＶＦコード配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含有するであろう。プロモーターは、例えば、組織特異的プロモーター、細胞特異的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、構成性プロモーター、合成プロモーターまたはハイブリッドプロモーターであり得る。本発明の構築物において有用なプロモーターの例として、ファージλ（ＰＬ）プロモーター；ＳＶ４０初期プロモーター；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（例えば、ヒトＣＭＶ前初期プロモーター；ＣＭＶエンハンサーとニワトリβ−アクチンプロモーターを持つハイブリッドプロモーター）；テトラサイクリンにより制御されるトランス活性化因子反応性プロモーター（ｔｅｔ）システム；長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター（例えば、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ＢＩＶ ＬＴＲ、またはＨＩＶ ＬＴＲ）；モロニーマウス肉腫ウイルスのＵ３領域プロモーター；Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ａプロモーター；メタロチオネイン遺伝子の調節配列（単数または複数）；ＣＤ３４プロモーター；ＣＤ８プロモーター；チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター；Ｂ１９パルボウイルスプロモーター；ＰＧＫプロモーター；グルココルチコイドプロモーター；熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）プロモーター（例えば、ＨＳＰ６５およびＨＳＰ７０プロモーター）；免疫グロブリンプロモーター；ＭＭＴＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；ｌａｃプロモーター；ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター；およびノパリン合成酵素プロモーターが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの実施形態では、プロモーターはＭＮＤプロモーター（Ｒｏｂｂｉｎｓら、１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９４６６−９４７４）またはＭＮＣプロモーター（これは、ＬＴＲエンハンサーが最小ＣＭＶプロモーターと組み合わせられている、ＭＮＤプロモーターの誘導体である（Ｈａｂｅｒｍａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（１８）：８７３２−８７３９，２０００））である。いくつかの実施形態では、ＲｄＣＶＦコード配列が、配列番号１１のヌクレオチド配列１５０〜８１２を含有しているプロモーター配列に作動可能に連結される。

いくつかの実施形態では、本発明のベクターまたは核酸は、ＲｄＣＶＦタンパク質のコード配列に作動可能に連結されたイントロンを含有する。イントロンはＲｄＣＶＦ遺伝子であり得、また異種イントロンであってもよい。異種イントロンは公知であり、非限定的な例として、ヒトβ−グロビン遺伝子のイントロンおよびβ―アクチンのイントロンが挙げられる。いくつかの実施形態では、イントロン配列はヒトβ−グロビン遺伝子のイントロン配列である。いくつかの実施形態では、イントロン配列は配列番号１１のヌクレオチド８２０〜１３１２または配列番号１１の９０８〜１３０７を含有する。

いくつかの実施形態では、本発明の核酸はＲｄＣＶＦタンパク質のコード配列をコードするヌクレオチド配列を含有し、ここでは、ＲｄＣＶＦコード配列は再コード化されたヌクレオチド配列を含有する。核酸は、ＲＤＣＶＦ１タンパク質および／またはＲｄＣＶＦ２タンパク質をコードし得る。いくつかの実施形態では、ＲｄＣＶＦタンパク質は短いバージョンのＲｄＣＶＦタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＲｄＣＶＦタンパク質は長いバージョンのＲｄＣＶＦタンパク質である。明確にするために、ＲｄＣＶＦタンパク質は、ＲＤＣＶＦ１−ｓｈｏｒｔ、ＲＤＣＶＦ１−ｌｏｎｇ、ＲｄＣＶＦ２−ｓｈｏｒｔ、またはＲｄＣＶＦ２−ｌｏｎｇタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、ＲｄＣＶＦタンパク質はヒトＲｄＣＶＦタンパク質である。

典型的には、哺乳動物のヌクレオチドコード領域は、ヒトＲｄＣＶＦコード領域において見られるように、ヌクレオチド配列ＡＴＧ（開始メチオニンコドン）で始まる。本明細書中で議論されるように、本発明のいくつかの実施形態は、再コード化されたＲｄＣＶＦコード領域を提供し、いくつかのさらなる実施形態では、コード領域がインフレームで第２のコード領域、例えば、シグナル配列のコード配列と融合される。これらの場合のいくつかにおいては、ＡＴＧヌクレオチド配列は必ずしもＲｄＣＶＦコード領域の開始部位に存在する必要はなく、例えば、ＲｄＣＶＦコード領域は特定のＲｄＣＶＦタンパク質の２番目のアミノ酸をコードすることにより開始する。しかし、ＲｄＣＶＦコード領域が、ＲｄＣＶＦコード領域に対して５’にある別のコード領域に作動可能に連結されている場合でさえ、ＡＴＧヌクレオチド配列はＲｄＣＶＦコード領域の開始部位に存在し得る。

いくつかの実施形態では、本発明の核酸は配列番号１、３、または１１を含有する。いくつかの実施形態では、本発明の核酸は、配列番号１１のヌクレオチド１５０〜８１２，８２０〜１３１２、および１３４０〜２０８０を含有する。いくつかの実施形態では、本発明の核酸は、配列番号１１のヌクレオチド１５０〜８１２、９０８〜１３０７、および１３４０〜２０８０を含有する。いくつかの実施形態では、核酸はさらに、配列番号１１のヌクレオチド２１３０〜２６０８を含有する。

いくつかの実施形態では、本発明の核酸はＲｄＣＶＦのコード領域を含有し、ここでは、ＲｄＣＶＦコード配列は再コード化されている。

本発明のいくつかの実施形態では、本発明の核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）は、ウイルスベクターのようなベクター中に存在する。

（ウイルスベクター）
本発明は、本発明のＲｄＣＶＦコード領域を含有しているウイルスベクターを含む。本発明において有用なウイルスベクターの例は、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ０８／１０６６４４および米国特許公開番号ＵＳ２０１００１２０６６５に記載されている。いくつかの実施形態では、本発明は特定のウイルスベクターに限定されない。ウイルスベクターとして、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター（例えば、米国特許第７，０４５，３４４号を参照のこと）、ＡＡＶベクター（例えば、米国特許第７，１０５，３４５号を参照のこと）、ヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第５，８３０，７２７号および同第６，０４０，１７２号を参照のこと）、肝炎（例えば、Ｄ型肝炎）ウイルスベクター（例えば、米国特許第５，２２５，３４７号を参照のこと）、ＳＶ４０ベクター、ＥＢＶベクター（例えば、米国特許第６，５２１，４４９号を参照のこと）、およびニューカッスル病ウイルスベクター（例えば、米国特許第６，１４６，６４２号、同第７，４４２，３７９号、同第７，３３２，１６９号、および同第６，７１９，９７９号を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ、ＥＩＡＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、またはＢＩＶベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＡＡＶベクターまたはアデノウイルスベクターから選択される。本発明はまた、本発明のウイルスベクターを産生する細胞を提供する。

本発明のベクタービリオンは、インビボまたはインビトロで細胞（例えば、哺乳動物細胞）に投与され得る。ベクター（ウイルス性または非ウイルス性）が、未分化細胞、分化細胞、体細胞、単細胞、および／または幹細胞を含むがこれらに限定されない細胞に形質導入、あるいはこれらを形質転換するために使用され得る。いくつかの実施形態では、幹細胞は、ヒトへの投与が意図され、胎児への分化および発生のために適切な偽妊娠の女性への移植のために意図されるものではない。

いくつかの実施形態では、本発明のウイルスベクターは崩壊促進因子（ＤＡＦ）を含有する。例えば、エンベロープ型ウイルスベクターはウイルス膜上にＤＡＦを含む。いくつかの実施形態では、ＤＡＦは野生型ＤＡＦである。いくつかの実施形態では、ＤＡＦはエンベロープタンパク質を持つ融合タンパク質の一部分である。例えば、Ｇｕｉｂｉｎｇａら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００５ １１（４）：６４５−５１を参照のこと。

アデノウイルスは、典型的には約３６ｋｂのゲノムを持つ非エンベロープ型の核ＤＮＡウイルスである。ヒトアデノウイルスは多数の血清型（およそ４７、その都度番号付けされ、６つのグループ：Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦに分類されている）に分けられる。

組み換えアデノウイルスベクターは、***細胞および非***細胞の両方の向性、最小の潜在的病原性、ベクターストックの調製のために高力価に複製する能力、および比較的大きいヌクレオチド配列インサートを保有できる能力を有する（Ｂｅｒｋｎｅｒ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３９−６６；Ｊｏｌｌｙ，（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５１−６４）。様々なアデノウイルス遺伝子配列が欠失しているアデノウイルスベクターが、細胞への核酸の送達に適している媒体として設計されている。いくつかの実施形態では、本発明のアデノウイルスベクターはヘルパー依存性であるか、または「弱い（ｇｕｔｌｅｓｓ）」アデノウイルスベクターである。以下の遺伝子のうちの１つ以上が欠失しているアデノウイルスベクターが使用され得る：Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、およびＥ３。アデノウイルスをベースとする核酸送達を行うための方法は、例えば、米国特許第５，８２４，５４４号；同第５，８６８，０４０号；同第５，８７１，７２２号；同第５，８８０，１０２号；同第５，８８２，８７７号；同第５，８８５，８０８号；同第５，９３２，２１０号；同第５，９８１，２２５号；同第５，９９４，１０６号；同第５，９９４，１３２号；同第５，９９４，１３４号；および同第６，００１，５５７号に記載されている。

ＡＡＶベクターは１本鎖（ｓｓ）ＤＮＡパルボウイルスから誘導される。１本鎖のＡＡＶ粒子は５ｋｂまでのｓｓＤＮＡに適応することができ、トランスジーンと調節エレメントのための約４．５ｋｂを残している。例えば、米国特許第６，５４４，７８５号に記載されているようなトランススプライシングシステムはこの限界のほぼ２倍であり得、これらのタイプのベクターもまた本発明とともに使用され得る。本発明に関しては、基本的には任意の血清型のＡＡＶが使用され得る。本発明のいくつかの実施形態では、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９血清型が使用され得るが（例えば、米国特許第５，１７３，４１４号、同第５，２５２，４７９号、同第５，５５２，３１１号、同第５，６５８，７７６号、同第５，６５８，７８５号、同第５，７６３，４１６号、同第５，７７３，２８９号、同第５，８４３，７４２号、同第５，８６９，０４０号、同第５，９４２，４９６号、同第５，９４８，６７５号、同第６，００１，６５０号、および同第７，７９０，４４９号；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２００９１３４６８１；Ｋａｓｓｉｍら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ（２０１０）５（１０）ｅ１３４２４：１−１０；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ（２０１１）２０（Ｒ１）：Ｒ２−６を参照のこと）、本発明はこれらの血清型に限定されるわけではない（例えば、Ｇａｏら（２００２）ＰＮＡＳ ９９：１１８５４−１１８５９；およびＶｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍａｃｈｉｄａ編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００３を参照のこと）。

本発明のＡＡＶベクターは偽型でもあり得る。偽型ＡＡＶベクターは第２のＡＡＶ血清型のキャプシドの中に１つのＡＡＶ血清型のゲノムを含む（例えば、Ａｕｒｉｃｃｈｉｏら（２００１）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１０（２６）：３０７５−８１を参照のこと）。本発明のＡＡＶベクターは、突然変異したキャプシドを含み得る、および／またはリターゲットされ得る。例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒら（Ａｄｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｅｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００５）９９：１１９−４５）；Ｇｏｎｃａｌｖｅｓら（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．（２００６）１３（５）：９７６−８６）；およびＷａｒｒｉｎｇｔｏｎら（Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（２００４）７８（１２）：６５９５−６０９）を参照のこと。

本発明のいくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターが、ＡＡＶベクターの自然な向性または自然な結合を小さくするため；ＡＡＶベクターをリターゲットするため、および／または中和抗血清に対する耐性を提供するために、ポリマー、例えば、反応性ポリマーでコーティングされる。例えば、Ｃａｒｌｉｓｌｅら（Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．（２００８）１０（４）：４００−１１）を参照のこと。

レトロウイルスはウイルスゲノムがＲＮＡであるＲＮＡウイルスである。宿主細胞がレトロウイルスに感染すると、ゲノムＲＮＡがＤＮＡ中間体に逆転写され、これが感染した細胞の染色体ＤＮＡ中に効率よく組み込まれる。レンチウイルスは調節機能または構造的機能を持つ他の遺伝子を含む。遺伝子送達のためのレトロウイルスベクターの使用は、例えば、米国特許第６，０１３，５１６号；および米国特許第５，９９４，１３６号に記載されている。ＢＩＶシステムの例は、例えば、Ｍａｔｕｋｏｎｉｓら、２００２ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３，１２９３−１３０３；Ｍｏｌｉｎａら、２００２ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．３０４，１０−２３；Ｍｏｌｉｎａら、２００４ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１５，６５−８７７；米国特許第６，８６４，０８５号、同第７，１２５，７１２号、同第７，１５３，５１２号；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ０８／１０６６４４および米国特許公開番号ＵＳ２０１００１２０６６５に記載されている。

ＤＮＡウイルスベクターは、ＤＮＡをベースとするゲノムを有しているウイルスをベースとするか、またはそれらから誘導されたウイルスベクターである。非エンベロープ型ウイルスのウイルスベクターは、脂質二重膜を欠いているウイルスをベースとするか、またはそれらから誘導されたウイルスベクターである。

いくつかの実施形態では、本発明のウイルスベクターはＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態では、本発明のウイルスベクターはウシ免疫不全ウイルスベクターではないか、またはこれはレンチウイルスベクターではない。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＤＮＡウイルスベクター、非エンベロープ型ウイルスベクター、およびアデノウイルスベクターからなる群より選択される。

（被包された細胞を含む、ＲｄＣＶＦの細胞送達）
遺伝子治療またはタンパク質送達のための別のアプローチは、インビトロまたはエクスビボでの細胞への遺伝子の導入、およびその後の哺乳動物または患者への細胞の投与を含む。核酸の細胞への導入は、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、細胞融合、染色体に媒介される遺伝子導入、マイクロセルに媒介される遺伝子導入、スフェロプラスト融合、リポフェクション、マイクロパーティクルボンバードメント、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ウイルスベクターまたはバクテリオファージ形質導入などのような任意の方法により行われ得る。任意に、選択マーカーもまた細胞に導入され得る。選択マーカーが利用される場合は、次に細胞が、例えば、発現を増強するため、および／または導入されたコード領域を発現する細胞を単離／選択するための選択下に置かれ得る（例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ ＆ Ｂｅｈｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８（１９９３）；Ｃｏｈｅｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９９３）；およびＣｌｉｎｅ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２（１９８５）を参照のこと）。その後、これらの細胞が直接、または被包後に患者に送達され得る。

いくつかの実施形態では、核酸が、得られる組み換え細胞のインビボでの投与前に細胞に導入される。いくつかの実施形態では、核酸が細胞により発現可能となり、いくつかの場合においてはその細胞の子孫に遺伝し、発現され得るように、細胞への核酸の安定した導入のための技術が提供され得る。組み換え細胞は様々な方法により患者に送達され得る。いくつかの実施形態では、ＲｄＣＶＦタンパク質が、調節可能、誘導性、および／または抑制性プロモーターを介して細胞から発現される。

いくつかの実施形態では、使用される細胞は患者にとって自己、同種異系、または異種である。いくつかの実施形態では、細胞がＲｄＣＶＦタンパク質を産生または分泌することを可能にする本発明の核酸を含むように、自己細胞がエクスビボで操作され、細胞が患者に戻される。

いくつかの実施形態では、細胞は局所に（例えば、関節内、硝子体内、網膜内、頭蓋内など）、または全身に（例えば、ｉ．ｖ．）投与される。

いくつかの実施形態では、組み換え血液細胞（例えば、造血幹細胞および／または始原細胞）が静脈内に投与される。いくつかの実施形態では、眼細胞および／または多能性細胞が眼に直接注射され得る。

単離され得、インビトロで維持され得る幹細胞および／または始原細胞が、本発明のいくつかの実施形態にしたがって使用され得る可能性がある。このような幹細胞として、造血幹細胞（ＨＳＣ）、皮膚および消化管の裏層のような上皮組織の幹細胞、胎児の心筋細胞、肝臓幹細胞（例えば、ＷＯ９４／０８５９８を参照のこと）、ならびに神経幹細胞（例えば、Ｓｔｅｍｐｌｅ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９２）Ｃｅｌｌ ７１：９７３−９８５）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの実施形態では、投与される細胞は、本発明の核酸を含有しており、ＲｄＣＶＦを発現し、分泌することができる幹細胞である。

被包された細胞は、インビボにおいて、ＲｄＣＶＦのようなタンパク質の制御された、および／または持続的な送達を可能にし得る。いくつかの実施形態では、本発明の核酸を含有しており、ＲｄＣＶＦを発現および／または分泌する細胞が被包される。いくつかの実施形態では、細胞は膜を通過して起こるＲｄＣＶＦの拡散を可能にする半透膜内に被包される。被包された細胞および被包された細胞のインプラントに関連するさらなる情報は、Ｓｉｅｖｉｎｇら（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，（２００６）１０３（１０）：３８９６−９０１）；米国特許第７，１１５，２５７号および同第７，８２０，１９５号；ならびにＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２０１１０４４２１６の中に見られる。本発明のいくつかの実施形態では、ＲｄＣＶＦタンパク質を発現する被包された細胞が動物に送達される。

いくつかの実施形態では、被包された細胞が哺乳動物に移植され、例えば、眼、脳、または嗅部に移植される。いくつかの実施形態では、被包された細胞は網膜色素上皮細胞、例えば、ＡＲＰＥ−１９（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手可能）である。いくつかの実施形態では、被包された細胞が、眼に、例えば、眼の裏側にＲｄＣＶＦを送達するために使用される。

いくつかの実施形態では、本発明の被包された細胞のインプラントは、半透過性の中空繊維膜の部分に被包されている細胞からなり、細胞は、ＲｄＣＶＦを産生するように遺伝的に改変されている。いくつかの実施形態では、被包された細胞のインプラントは、眼の内側の硝子体−網膜体中の強膜にインプラントをつなぎとめるために、一方の末端に縫合糸ループを有している。いくつかの実施形態では、被包された細胞のインプラントは、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｍｍの長さである。

（ＲｄＣＶＦタンパク質の分泌および産生）
本発明の核酸およびウイルスベクターは、細胞からＲｄＣＶＦを発現、産生、および／または分泌するために使用され得る。この発現、産生、および／または分泌は、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで起こり得る。

本発明のいくつかの実施形態は、細胞に本発明の核酸、および／またはウイルスベクターを投与する工程を含む、細胞からＲｄＣＶＦタンパク質を分泌させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、ヒト細胞、眼細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、桿体細胞、または錐体細胞であり得る。

本発明のいくつかの実施形態は、脊椎動物または哺乳動物の細胞を利用する。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶＩ細胞株（例えば、ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓細胞株（例えば、２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））または２９３ＦＴのような、懸濁培養液中での増殖のためにサブクローニングされたいずれかの細胞株を含む２９３または２９３Ｔ細胞（Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）））；ベビーハムスター腎臓細胞（例えば、ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（例えば、ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（例えば、ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（例えば、ＣＶＩ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚部癌細胞（例えば、ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（例えば、ＭＯＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；ＣＦ２ＴＨ細胞；バッファローラット（ｂｕｆｆａｌｏ ｒａｔ）肝臓細胞（例えば、ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（例えば、Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍細胞（例えば、ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８３））；ＭＲＣ５細胞；ＡＲＰＥ−１９細胞（ＡＴＣＣ）、ならびにＦＳ４細胞である。

いくつかの実施形態では、細胞は、２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＰｅｒＣ６細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＤＣＫ細胞、３Ｔ３細胞、またはＷＩ３８からなる群より選択される。

本発明のいくつかの実施形態は、本発明の核酸を含有している単離された細胞を提供する。いくつかの実施形態では、核酸は細胞ゲノム／ＤＮＡ中に組み込まれる。

本発明はまた、ＲｄＣＶＦタンパク質の発現および分泌を可能にする条件下で細胞を培養する工程、ならびに上記細胞培養物からＲｄＣＶＦタンパク質を単離する工程を含む、ＲｄＣＶＦタンパク質の産生方法も含む。ここでは、上記細胞は、ＲｄＣＶＦタンパク質をコードし、そしてＲｄＣＶＦタンパク質の発現、例えば、ＲｄＣＶＦタンパク質の分泌を可能にする本発明の核酸を含有する。いくつかの実施形態では、核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）は、ＲｄＣＶＦタンパク質のコード配列を含有するヌクレオチド配列を含有し、ここでは、上記ＲｄＣＶＦコード配列は再コード化された配列を含有する。ＲｄＣＶＦタンパク質は、ＲｄＣＶＦ１タンパク質であってもＲｄＣＶＦ２タンパク質であってもよく、また、長い形態であっても短い形態であってもよい。いくつかの実施形態では、これらの方法はさらに、細胞および／または培養上清からのＲｄＣＶＦタンパク質の精製を含む。

本発明はまた、本発明の核酸から細胞により発現されたＲｄＣＶＦタンパク質を含む。本発明はまた、分泌型の本発明のＲｄＣＶＦタンパク質、および分泌型の本発明のＲｄＣＶＦタンパク質を含有している組成物も提供する。

いくつかの実施形態では、細胞により発現されたＲｄＣＶＦタンパク質が、全タンパク質に対して少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９．５％、または少なくとも９９．９％純粋にまで精製される。

（組成物、処方物、および調製物）
本発明のいくつかの実施形態は、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明のＲｄＣＶＦタンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含有している組成物、処方物、あるいは調製物、例えば、薬学的組成物を提供する。

処方物（例えば、注射用）は一般に、例えば、ハンクス溶液、リンガー溶液、またはリン酸緩衝生理食塩水を含有している有効成分の生体適合性溶液であるが、必ずしもそうである必要はない。いくつかの実施形態では、処方物または薬学的組成物は以下の１つ以上を含有する：クエン酸塩、ＮａＣｌ、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ）、塩化マグネシウム六水和物（ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ）、酢酸ナトリウム三水和物（ＣＨ_３ＣＯ_２Ｎａ・３Ｈ_２Ｏ）、クエン酸ナトリウム二水和物（Ｃ_６Ｈ_５Ｏ_７Ｎａ_３・２Ｈ_２Ｏ）、スクロース、水酸化ナトリウムおよび／または塩酸（ｐＨを調整するため）、ならびに水。前記リストは、特定の水和物、例えば、二水和物、三水和物、六水和物などとして列挙されるいくつかの分子を含む。これらの化合物の様々な水和物が本発明において使用され得、本発明がこれらの列挙された分子の特定の水和物形態に限定されないことが理解される。いくつかの実施形態では、処方物または薬学的組成物は、ヒスチジン、ＭｇＣｌ_２、トレハロース、ポリソルベート、ポリソルベート２０、ＮａＣｌ、スクロース、アルギニン、およびプロリンからなる群より選択される１種類以上の成分を含有する。いくつかの実施形態では、処方物は以下の１種類以上を含有する：ヒスチジン；α，α−トレハロース脱水物；ＭｇＣｌ_２；ポリソルベート２０のようなポリソルベート；およびＮａＣｌ。いくつかの実施形態では、処方物または薬学的組成物は以下の１種類以上を含有する：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）およびｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８。いくつかの実施形態では、ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８濃度は０．０００１％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、または０．１％であり得る。

所望される投与様式に適切な処方物および処方方法の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，最新版，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡおよび米国特許第７，２０８，５７７号の中に見ることができる。

いくつかの実施形態では、インビボでの使用のための組成物は「担体」または「薬学的に受容可能な担体」を含む。語句「担体」は、本発明の核酸、ベクター、またはタンパク質がそれとともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または媒体をいう。語句「担体」は、固体材料または液体材料のいずれをも含むがこれらに限定されるわけではなく、これは、無機物であっても有機物であっても、また、合成のものであっても天然起源のものであってもよく、被検体への投与を容易にするために、これとともに組成物の有効成分（単数または複数）が混合または処方される。医薬品の処方において習慣的に利用されている任意の他の材料が適している。薬学的担体は、組成物が投与される宿主に対して有害であり得る物質を排除する（例えば、細菌毒素の除去）ためのインビボでの使用のために特別に調製される点で、典型的な溶液および懸濁液とは異なり得る。

適切な液体担体の例として、水、およびエタノールのような酸素を含む有機化合物を含有している水溶液が挙げられる。着香料および懸濁化剤のような、薬学的調製物中に通常存在する緩衝液および他の材料もまた存在し得る。一般に、適切な油（１種類または複数種）、生理食塩水、デキストロース（グルコース）水溶液、および関連する糖溶液、ならびにプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコールが、非経口用の溶液についての典型的に適切な担体である。いくつかの実施形態では、非経口投与のための溶液は、有効成分の水溶性の塩、適切な安定化剤、そして所望または必要に応じて、緩衝物質を含む。重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、またはアスコルビン酸のような酸化防止剤が、単独または組み合わせのいずれかにおいて、安定化剤として使用され得る。クエン酸およびその塩、ならびにＥＤＴＡナトリウムも使用される。加えて、非経口用の溶液は、塩化ベンズアルコニウム、メチルパラベンまたはプロピルパラベン、およびクロロブタノールのような防腐剤を含み得る。

担体として、トレハロース、マンニトール、グルタチオン、キシリトール、スクロース、ラクトース、およびソルビトールのような炭水化物を挙げることができる。薬学的調製物中で使用される他の成分として、例えば、ＤＰＰＣ（１，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、およびＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）を挙げることができる。天然または合成の界面活性剤が使用され得る。ポリエチレングリコールが使用され得る（タンパク質の誘導におけるその使用とは別の場合にもなお）。シクロデキストランのようなデキストランが使用され得る。いくつかの実施形態では、シクロデキストリン、第三級アミン、および／またはβ−シクロデキストリンが使用され得る。胆汁酸塩および他の関連するエンハンサーが使用され得る。セルロースおよびセルロース誘導体が使用され得る。緩衝液処方物中での使用のように、アミノ酸が使用され得る。また、リポソーム、マイクロカプセル、またはマイクロスフェア、包接体、または他のタイプの担体の使用も想定される。

組成物は、所望される場合は、湿潤剤および／または乳化剤および／またはｐＨ緩衝剤もまた含み得る。必要に応じて、組成物はまた、可溶化剤、および／または注射部位の疼痛をやわらげるためのリグノカインのような局所麻酔薬を含み得る。

いくつかの実施形態では、本発明の薬学的調製物または組成物は、（ｉ）薬学的に受容可能な担体、および（ｉｉ）本発明の核酸、本発明のウイルスベクター、本発明のＲｄＣＶＦタンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含有する。

（投与、送達、および処置）
ＲｄＣＶＦタンパク質をコードする核酸またはベクターの導入あるいは投与が議論される場合には、本発明が、ＲｄＣＶＦタンパク質自体の導入または投与も意図することが理解される。ＲｄＣＶＦタンパク質の導入が議論される場合は、本発明がまた、ＲｄＣＶＦタンパク質をコードする核酸またはベクターの導入も意図することが理解される。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物は局所投与または全身投与され得る。有用な投与経路は本明細書中で議論され、当前記分野で公知である。導入または投与方法として、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、気管内、局所、吸入、経皮、直腸、非経口経路、硬膜外、頭蓋内、脳内に、心室内、硬膜下、関節内、髄腔内、心臓内、冠内、硝子体内、網膜下、眼の前房（ｉｎｔｒａａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｈａｍｂｅｒ）、角膜上に局所に、結膜下、テノン嚢下注射、点眼薬を塗布することにより、経口経路、バルーンカテーテルを介して、ステントを介して、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。全身投与は、静脈内もしくは動脈内注射により、または経粘膜的、皮下、経皮、および／または腹腔内送達により行われ得るが、これらに限定されるわけではない。

例えば、眼への投与を含むいくつかの実施形態では、ＲｄＣＶＦをコードする本発明のベクターまたは核酸が、およそ１週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、６ヶ月に１回、９ヶ月に１回、１年に１回、１８ヶ月に１回、２年に１回、３０ヶ月に１回、３年に１回、５年に１回、１０年に１回、または必要に応じて投与される。例えば、眼への投与を含むいくつかの実施形態では、ＲｄＣＶＦをコードする本発明のベクターまたは核酸が、およそ１〜４週間ごとに、およそ４〜８週間ごとに、およそ１〜４ヶ月ごとに、およそ３〜６ヶ月ごとに、およそ４〜８ヶ月ごとに、およそ６〜１２ヶ月ごとに、およそ９〜１５ヶ月ごとに、およそ１２〜１８ヶ月ごとに、およそ１５〜２１ヶ月ごとに、およそ１８〜２４ヶ月ごとに、およそ１〜２年ごとに、およそ１．５〜３年ごとに、およそ２〜４年ごとに、およそ３〜５年ごとに、およそ５〜７年ごとに、およそ７〜１０年ごとに、またはおよそ１０〜２０年ごとに投与される。ＲｄＣＶＦタンパク質をコードするベクターの投与は、ＲｄＣＶＦタンパク質自体の投与よりも少ない頻度で行われるであろうと予想される。本発明のいくつかの実施形態では、薬学的調製物は本発明のＲｄＣＶＦタンパク質をコードするベクターを含有し、上記薬学的調製物は患者に一度だけ投与される。

いくつかの実施形態では、本発明のＲｄＣＶＦタンパク質は、硝子体内または網膜下注射によりヒトの眼に投与される。いくつかの実施形態では、約１５μｇ〜約５ｍｇ；約１５μｇ〜約５００μｇ；約１００μｇ〜約９００μｇ；約３００μｇ〜約７００μｇ；約５００μｇ〜約１ｍｇ；約１ｍｇ〜約５ｍｇ；約１ｍｇ；または約５００μｇのＲｄＣＶＦタンパク質が、硝子体内または網膜下注射によりヒトの眼に投与される。

いくつかの実施形態では、ＲｄＣＶＦタンパク質が、ＲｄＣＶＦをコードするＡＡＶベクターの網膜下注射または硝子体内注射により投与される。いくつかの実施形態では、約５×１０^８〜約１×１０^９；約５×１０^８〜約７．５×１０^８；約７．５×１０^８〜約１×１０^９；約６×１０^８〜約９×１０^８；約７×１０^８〜約８×１０^８；約５×１０^８；約６×１０^８；約７×１０^８；約８×１０^８；約９×１０^８；または約１×１０^９のベクターゲノムコピー（ＧＣ）数のＡＡＶベクターが網膜下注射により投与される。いくつかの実施形態では、約５×１０^８〜約１×１０^１０；約５×１０^８〜約５×１０^９；約５×１０^８〜約２×１０^９；約２×１０^９〜約５×１０^９；約５×１０^９〜約１×１０^１０；約５×１０^８〜約１×１０^９；約１×１０^９〜約３×１０^９；約３×１０^９〜約６×１０^９；約６×１０^９〜約１×１０^１０；約１×１０^９〜約１×１０^１０；約１×１０^１０〜約１×１０^１１；または１×１０^１１〜約１×１０^１２ＧＣのＡＡＶベクターが硝子体内注射により投与される。ＡＡＶベクターの量が、時として、形質導入単位で、またはＧＣ数で測定されることが理解される。ＧＣ数は典型的には、同じＡＡＶベクター試料が形質導入単位について測定される場合よりも２５〜３００倍高い。

いくつかの実施形態では、抗炎症薬が本発明のＲｄＣＶＦタンパク質、ベクター、または核酸と組み合わせて送達され得る。抗炎症薬は、本発明の分子もしくはベクターの投与前に、投与と同時に、および／または投与後に送達され得る。いくつかの実施形態では、抗炎症薬は、本発明のＲｄＣＶＦタンパク質、核酸、もしくはベクターと同じ溶液および／または同じ注射器中で投与される。いくつかの実施形態では、本発明のＲｄＣＶＦタンパク質、核酸、またはベクターと抗炎症薬が眼に同時投与される。

多くの抗炎症剤が当前記分野で公知であり、抗炎症剤として、デキサメタゾン、メタスルホ安息香酸デキサメタゾンナトリウム、リン酸デキサメタゾンナトリウム、フルオロメトロン、ブロムフェナク、プラノプロフェン、シクロスポリンの眼科用エマルジョン（例えば、ＲＥＳＴＡＳＩＳ（商標））、ナプロキセン、グルココルチコイド、ケトロラック、イブプロフェン、トルメチン、非ステロイド系抗炎症剤、ステロイド系抗炎症剤、ジクロフェナク、フルルビプロフェン、インドメタシン、およびスプロフェンが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。

本発明のいくつかの実施形態は、ＲｄＣＶＦタンパク質およびそれをコードするベクターの両方の投与を含む。ＲｄＣＶＦタンパク質は、本発明のベクターの投与前、投与と同時に、および／または投与後に送達され得る。いくつかの実施形態では、ＲｄＣＶＦタンパク質が、本発明のベクターと同じ溶液および／または同じ注射器中で投与される。いくつかの実施形態では、本発明のベクターとＲｄＣＶＦタンパク質が眼に同時投与される。

本発明のいくつかの実施形態では、遺伝子送達システムが、ＲｄＣＶＦタンパク質の遺伝子もしくはコード領域の、標的細胞への形質導入および／または安定な組み込みを生じ得る。いくつかの実施形態では、標的細胞は、霊長類細胞またはヒト細胞のような哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、網膜色素上皮細胞、桿体光受容器細胞、錐体光受容器細胞、双極細胞、水平細胞、無軸索細胞、神経節細胞、網膜細胞、または多能性細胞のような眼の細胞である。標的細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボであり得る。いくつかの実施形態では、標的細胞は幹細胞である。幹細胞として、多能性幹細胞、全能性幹細胞、造血幹細胞、癌幹細胞、および胚幹細胞が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの実施形態では、本明細書中で意図される多能性細胞は、接合子または割球から生存している実態に増殖させるためのものではない。本発明はまた、例えば、眼の細胞を再生させるための、処置を必要とする患者の眼への移植のための部分的に未分化の細胞の使用も意図する。

本発明はまた処置方法も提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、哺乳動物の眼に、本発明の核酸、本発明のウイルスベクター、本発明のＲｄＣＶＦタンパク質、本発明の薬学的組成物、またはそれらの組み合わせを投与する工程を含む、眼の桿体細胞を保存する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明のウイルスベクターおよび／または核酸は、網膜下注射、硝子体内注射、眼の前房への注射、結膜下注射、テノン嚢下注射、またはこれらの任意の組み合わせにより投与される。いくつかの実施形態では、ヒトが処置される。いくつかの実施形態では、処置される哺乳動物は、網膜ジストロフィー、シュタルガルト病、網膜色素変性、ドライ型加齢性黄斑変性（ドライ型ＡＭＤ）、地図状萎縮（ドライ型ＡＭＤの進行期）、滲出型加齢性黄斑変性（滲出型ＡＭＤ）、緑内障／高眼圧症、糖尿病網膜症、バルデ・ビードル症候群、バッセン−コーンツバイク症候群、ベスト病、全脈絡膜萎縮、脳回転状萎縮症、先天黒内障、レフサム病、アッシャー症候群、甲状腺関連眼疾患、グレーヴス病、網膜色素上皮細胞と関係がある疾患、前上葉区の疾患、水晶体疾患／白内障、眼杯の障害、またはぶどう膜炎からなる群より選択される眼疾患に罹患している。いくつかの実施形態では、保存された眼の桿体細胞は本発明の核酸および／またはウイルスベクターを含まない。例えば、保存された眼細胞は、保存された眼細胞自体の形質導入によっては保存されない。

本発明のいくつかの実施形態は、哺乳動物の眼に本発明の核酸および／またはウイルスベクターを投与する工程を含む、眼の桿体細胞の保存方法を提供する。ここでは、核酸および／またはウイルスベクターが網膜下注射により投与され、桿体細胞および／または錐体細胞が、網膜下注射の部位から少なくとも１ｍｍ、少なくとも２ｍｍ、少なくとも３ｍｍ、少なくとも５ｍｍ、少なくとも７ｍｍ、少なくとも１０ｍｍ、少なくとも１５ｍｍ、少なくとも２０ｍｍ、または少なくとも２５ｍｍの部位で保存される。例えば、そして理論に束縛されることは望ましくないが、網膜下注射部位に核酸またはウイルスベクターが形質導入された細胞は、形質導入された細胞または注射部位に対して遠位の部位に眼の桿体および／または錐体保存作用を提供することができるＲｄＣＶＦ−ｌｏｎｇおよび／またはＲｄＣＶＦ−ｓｈｏｒｔタンパク質を発現ならびに／あるいは分泌する。

眼の中でのその発現に加えて、ＲｄＣＶＦタンパク質は他の組織の中でも天然において発現される。プロテオミクスアプローチを使用することにより、マイクロチューブリン結合タンパク質ｔａｕを含む９０種類のタンパク質がＲｄＣＶＦＬと相互作用することが明らかにされた（Ｆｒｉｄｌｉｃｈら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（２００９）８（６）：１２０６−１２１８）。Ｆｒｉｄｌｉｃｈらは、いくつかの場合には、おそらくは酸化ストレスにより、アルツハイマー病に罹患している患者の脳の中で過剰リン酸化されているとの理由により、ＴＡＵのリン酸化レベルが、Ｎｘｎｌ１^−／−（ＲｄＣＶＦ１−／−）マウスの網膜において上昇していることを明らかにした。Ｆｒｉｄｌｉｃｈらはまた、ＲｄＣＶＦＬがＴＡＵリン酸化を阻害することも示した。Ｃｒｏｎｉｎら（Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（２０１０）１７：１１９９−１２１０）は、アルツハイマー病に罹患している患者の脳の中で見られるものと同様に、Ｎｘｎｌ１−／−（ＲｄＣＶＦｌ−／−）の網膜が凝集したＴＡＵタンパク質を含むことを明らかにした。

ＲｄＣＶＦ２を欠失しているマウスは視力と嗅覚が低下している。正常なマウスは嗅上皮中でＲｄＣＶＦ２を発現する。Ｊａｉｌｌａｒｄら（ＡＲＶＯ会議（２００９）、プログラム番号／ポスター番号 ４９１／Ｄ６３６）は、嗅覚神経細胞がＲｄＣＶＦ２の存在下で培養された場合に高い割合で生存することを見出したことを報告した。Ｊａｉｌｌａｒｄらはまた、嗅覚弁別試験を行うことにより、ＲｄＣＶＦ２−／−を対照マウスと比較した。１２ヶ月齢までは、ＲｄＣＶＦ２−／−マウスは刺激に対して正確に応答できなかった。

ＲｄＣＶＦタンパク質は神経保護活性を有しており、錐体および／または桿体の生存のための因子であるのみならず、これは、一般的な神経生存因子でもある。

したがって、上記に基づいて、本発明のＲｄＣＶＦをコードする核酸、ウイルスベクター、またはＲｄＣＶＦタンパク質が、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、および嗅覚の疾患を処置するまたは寛解させるために使用され得る。

本発明は、哺乳動物に本発明の核酸、本発明のウイルスベクター、本発明のＲｄＣＶＦタンパク質、本発明の薬学的組成物、またはこれらの組み合わせを投与する工程を含む患者の処置方法を含む。ここでは、疾患は、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、および嗅覚の疾患からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、本発明のウイルスベクターはＡＡＶベクターである。

本発明は、以下の実施例を参照してここに記載される。これらの実施例は、説明の目的だけのために提供され、本発明はこれらの実施例に限定されるとは決して解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書中に提供される技術の結果として明らかになる任意および全てのバリエーションを含むと解釈されるべきである。

本発明の特定の実施形態が解説の目的のために本明細書中に記載されているが、詳細についての多数のバリエーションが、添付の特許請求の範囲に記載される本発明から逸脱することなく作られ得ることは当業者に明らかであろう。

本明細書中で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が、引用により本明細書中に組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、同じ程度にそれらの全体が引用により本明細書中に組み込まれる。上記刊行物、特許、および特許出願のいずれかに伴い公開された全ての補足情報もまた、引用により組み込まれる。例えば、一部の雑誌論文は、典型的にはオンラインで入手可能である補足情報を伴って公開されている。

（実施例１ ＲｄＣＶＦ１の長い形態および短い形態の再コード化されたコード配列）
再コード化されたヒトＲｄＣＶＦ１ＳおよびＲｄＣＶＦ１Ｌヌクレオチドのコード領域を設計した（例えば、配列番号１のヌクレオチド１０６〜７４１、配列番号３のヌクレオチド１０６〜７４４、配列番号１２または１４）。ＧＥＮＥＡＲＴ（登録商標）（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により、特に、ＲｄＣＶＦ１ＳおよびＲｄＣＶＦ１Ｌのコドン最適化されたヌクレオチドのコード配列を含む核酸配列が合成された。これらのコード配列もまた、原核生物の阻害性モチーフ、コンセンサススプライスドナー部位、および潜在的なスプライスドナー部位のようなモチーフを最小化するために再コード化した。

ヒトＲｄＣＶＦ１Ｌコード配列の再コード化はまた、再コード化されたＲｄＣＶＦ１Ｓコード領域（３’末端に停止コドンを持つ配列番号１２のヌクレオチド１〜３２７）も提供した。

再コード化されたコード領域に対するネイティブなＲｄＣＶＦ１Ｌコード領域のアラインメント
ＲｄＣＶＦ１Ｌ（１〜６３９）：同一性＝５２９／６３９（８２．８％） ８９／２１３のコドンが異なる（４１．７％）
ＲｄＣＶＦ１Ｓ（１〜３２７）：同一性＝２７４／３２７（８３．８％） ４４／１０９のコドンが異なる（４０．４％）
ＲｄＣＶＦ１Ｓ（１〜３２７およびＴＧＡ）同一性＝２７７／３３０（８３．９％） ４４／１１０のコドンが異なる（４０．０％）

ネイティブなＲｄＣＶＦ１Ｌコード配列の配列番号１２への再コード化により、２つの原核生物阻害性モチーフ、１つのコンセンサススプライスドナー部位、および３つの潜在的なスプライスドナー部位が取り除かれ、これらの要素はいずれも再コード化された配列（配列番号１２）の中には残っていなかった。再コード化によってはまた、平均ＧＣ含量も６５％から６３％に変化した。

配列番号１２のヌクレオチド１〜３２７はまた、ＲｄＣＶＦ１Ｓの再コード化されたコード配列を提供するが、これはＴＧＡのような停止コドンを持たない。

再コード化されたコード領域に対するネイティブなＲｄＣＶＦ１Ｓコード領域のアラインメント
同一性＝２７８／３３０（８４．２％） ４３／１１０のコドンが異なる（３９．１％）

ネイティブなＲｄＣＶＦ１Ｓコード配列の配列番号１４への再コード化により、１つの原核生物阻害性モチーフ、１つのコンセンサススプライスドナー部位、および２つの潜在的なスプライスドナー部位が取り除かれ、これらの要素はいずれも再コード化された配列（配列番号１４）の中には残っていなかった。再コード化によっては、平均ＧＣ含量もまた５８％から６１％に変化した。

（実施例２ アデノ随伴ウイルスベクターにより媒介された長い形態の桿体由来錐体生存因子のインビトロでの発現）
（プラスミドクローニング）
短い形態のＲｄＣＶＦタンパク質のｃＤＮＡをＧＥＮＥＡＲＴ（登録商標）により合成された核酸からＰＣＲにより増幅し、ＩｇｋシグナルペプチドＤＮＡ配列がＲｄＣＶＦＳコード配列に対して５’向きに位置するようにマウスＩｇｋシグナルペプチド配列が組み込まれているｐＳｅｃＴａｇ２Ａプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号Ｖ９００−２０）にクローニングした。得られたプラスミドをｐＡＶＴｒＲｄ０３４と命名した。ｐＡＶＴｒＲｄ０３４の大きさと方向を、制限酵素消化を使用して確認した。Ｉｇｋ−ＲｄＣＶＦＳ配列をｐＡＶＴｒＲｄ０３４からＰＣＲにより増幅し、アデノ随伴ウイルスベクタープラスミドｐＡＡＶ−ＭＣＳ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に挿入して、プラスミドｐＡＡＶ−ＳＲｄ２６９（配列番号８）を作製した。コドン最適化した長い形態のＲｄＣＶＦをＰＣＲにより増幅し、インハウスクローニングプラスミドｐＡＶＴ００１に挿入して、プラスミドｐＡＶＴＬｒＲｄ０５５（配列番号９）を作製した。プラスミドｐＡＶＴＬｒＲｄ０５５およびｐＡＡＶ−ＳＲｄ２６９をＢｇｌＩＩとＳｔｕＩで二重消化した。ｐＡＡＶ−ＳＲｄ２６９由来の４．８ｋｂのバンドとｐＡＶＴＬｒＲｄ０５５由来の５４０ｂｐのバンドとをライゲーションして、長いＲｄＣＶＦの再コード化されたコード配列を含むｐＡＡＶ−ＬＲｄ２６８（配列番号１０）を作製した。ｐＡＡＶ−ＬＲｄ２６８の大きさと方向を、制限酵素消化を使用して確認した。

短い形態および長い形態のＲｄＣＶＦタンパク質のＮ末端配列が同定されているので、ｐＡＶＴｒＲｄ０３４の短いＲｄＣＶＦ ＤＮＡ配列の末端をプラスミドｐＡＶＴＬｒＲｄＣＶＦ０５５由来のコドン最適化した長いＲｄＣＶＦ ＤＮＡ配列の末端に交換し、それにより、ＡＡＶ−ＩＴＲ間に以下の特徴を含むｒＡＡＶプラスミドｐＡＡＶ−ＬＲｄ２６８を作製した：
ＣＭＶプロモーター − β−グロビンイントロン − Ｉｇｋ−ＲｄＣＶＦ１Ｌ − ポリＡ
（組み換えＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１ＬベクターおよびＡＡＶ−ＧＦＰベクターの産生ならびに精製）
プラスミドｐＡＡＶ−ＬＲｄ２６８、ｐＨＥＬＰＥＲ（Ｃｅｌｌ ＢｉｏＬａｂｓ，カタログ番号３４０２０２）、およびｐＲＣ２（Ｃｅｌｌ ＢｉｏＬａｂｓ，カタログ番号３４０２０１）をＤＨ１０Ｂコンピテント細菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号１８２９７−０１０）に形質転換し、製造業者の説明書にしたがってＱｉａｇｅｎ ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ ＫｉｔまたはＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａ Ｋｉｔを使用してスケールアップした。プラスミド濃度をＢｅｃｋｍａｎ ＤＵ−６００分光光度計を使用して決定した。各プラスミドの実態を制限消化および分析により確認した。

ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌベクターを産生するために、２９３ＡＡＶ細胞（Ｃｅｌｌ ＢｉｏＬａｂｓ，カタログ番号ＡＡＶ−１００）を、１５ｃｍの皿あたり４００万個の細胞で、ｃＤＭＥＭ（１０％のＦＢＳ、１％のグルタミン、１％の非必須アミノ酸、および１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ）中に播種した。翌日、培地を２５ｍＬの新鮮なｃＤＭＥＭに置き換えた。２時間後、トランスフェクションを行った。水（５７．４ｍＬ）を、１．３ｍｇのｐＨＥＬＰＥＲ、６５０μｇのｐＲＣ２、６５０μｇのｐＡＡＶ−ＬＲｄ２６８、および８．１ｍＬの２Ｍ ＣａＣｌ_２と混合した（水／プラスミド／ＣａＣｌ_２混合物）。１２．５ｍＬの容量の２×ＨＢＳ（Ｌｏｎｚａ，Ｓｋｕ：ＲＲ０７００５）を５個の５０ｍＬの円錐管のそれぞれに移した。ボルテックスしながら、１２．５ｍＬの水／プラスミド／ＣａＣｌ_２混合物を２×ＨＢＳを含有している円錐管のそれぞれにゆっくりと添加した。５分間のインキュベーションの後、２．５ｍＬの懸濁液を、２９３ＡＡＶ細胞を含有している各細胞培養皿に添加した。

翌日、培地を、皿あたり２５ｍＬの新しいｃＤＭＥＭ培地で置き換えた。２日後、細胞をセルリフター（ｃｅｌｌ ｌｉｆｔｅｒ）を使用して回収し、細胞／培地混合物を２５０ｍＬの円錐管に移した。試料を４℃で１５分間、３，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を廃棄し、そして細胞ペレットを１１０ｍＬのＤＭＥＭ中に再懸濁した。再懸濁した細胞試料を５０ｍＬの円錐管にアリコートし（３０ｍＬ）、凍結／解凍／凍結工程を、エタノール／ドライアイス浴と３７℃の水浴を使用して行った。これらの管を材料のさらなる処理まで−８０℃で保管した。同じプロセスを利用し、プラスミドｐＡＡＶ−ＬＲｄ２６８をプラスミドｐＡＡＶ−ＧＦＰ（Ｃｅｌｌ ＢｉｏＬａｂｓ カタログ番号ＡＡＶ−４００）に置き換えてｒＡＡＶ−ＧＦＰを得た。

ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌベクターを精製するために、凍結／解凍／凍結工程によるベクターを含有している４個の５０ｍＬの円錐管を水浴中にて３７℃で解凍した。４０μｌのＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｅ８２６３−２５ｋＵ）を各管に添加し、次にこれを３７℃で３０分間インキュベートした。これらの管を３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を５００ｍＬの瓶に移した。６ｍｌの１０％デオキシコール酸ナトリウム溶液（８２ｍＬの水の中に８．２ｇ）を添加した。試料を軽く混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。この懸濁液を５μｍの濾紙を使用して濾過した。続いて、０．８μｍの濾紙を使用して別の濾過工程を行った。ヘパリンアガロースカラム（８ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｈ６５０８−２５ｍＬ）を準備し、このカラムを４８ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号１００１０−０４９）で平衡化した。濾過した細胞溶解物をこのカラム上にロードし、カラムを４０ｍＬの洗浄緩衝液（２０ｍＬの５Ｍ ＮａＣｌ、９８０ｍＬのＰＢＳ）で洗浄した。ベクターを１５ｍＬの溶離緩衝液（８０ｍＬの５Ｍ ＮａＣｌ、９２０ｍＬのＰＢＳ）を使用して溶離させ、新しい５０ｍＬの円錐管に集めた。

ベクターを遠心濾過により濃縮した。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５遠心分離用フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，カタログ番号ＵＦＣ９１００２４）をＰＢＳで１回リンスし、溶離した試料をデバイスに添加した。試料が１〜２ｍＬの容量に濃縮されるまで、Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｌｌｅｇｒｏ ６ＫＲ遠心分離機で２，２００ｒｐｍ、２２℃で遠心分離を行った。１５ｍＬの容量のＰＢＳを添加し、試料の容量が≦１ｍＬになるまで遠心分離を繰り返した。精製したベクターを集め、フィルターの壁を１００μＬのＰＢＳでリンスした。試料を混合し、ベクターの３０μＬのアリコートを、使用するまで６００μＬの円錐管の中で−８０℃で保管した。

このプロセスを繰り返してｒＡＡＶ−ＧＦＰベクターを精製した。

図９および配列番号１１はｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌベクターの核酸配列を示す。

（精製した組み換えＡＡＶベクターのゲノム力価アッセイ）
精製したｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１ＬベクターおよびｒＡＡＶ−ＧＦＰベクターのゲノム力価を測定するために、５μＬの適切なベクターを、５μＬの１０×ＤＮａｓｅ緩衝液、１μＬのＤＮａｓｅＩ酵素（Ｒｏｃｈｅ，カタログ番号０４７１６７２８００１）、および全量を５０μＬにするために水と混合した。３７℃で３０分間のインキュベーション後、６５℃で１０分間のインキュベーションにより酵素を不活化させた。プロテイナーゼＫ（０．５μＬ）（Ｒｏｃｈｅ，カタログ番号０３１１５８８７００１）を添加した。試料を軽く混合し、５０℃で６０分間インキュベートした。プロテイナーゼＫを２０分間の９５℃により不活化した。同時に、スパイク制御を使用した。ここでは、５μＬのスパイク標準（ｐＡＡＶ−ＧＦＰ由来の２×１０^９の一本鎖ＤＮＡ）を反応に添加した。これらの反応は、蓋を持たない０．２ｍＬの８個のチューブストリップ（ｔｕｂｅ ｓｔｒｉｐ）（Ｂｉｏｒａｄ，カタログ番号ＴＢＳ−０２０１）において、８個のフラットキャップストリップ（ｆｌａｔ ｃａｐ ｓｔｒｉｐ）（ＢｉｏＲａｄ，カタログ番号ＴＣＳ−０８０３）を使用して、ＢｉｏＲａｄ ＰＣＲサーモサイクラー中で行った。

８２５μＬの水、１．８７５μＬのｉＱ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ，カタログ番号１７０−８８８２）、および３３７．５μＬの各プライマー（ＱＰＣＲ ＣＭＶ１（配列番号５）およびＱＰＣＲ ＣＭＶ２（配列番号６））を含有しているｑＰＣＲ用のマスター混合物を準備した。４５μＬの容量のこの混合物を９６ウェルＰＣＲプレートのウェルあたりに添加し、５μＬの消化したベクター、スパイクした消化したベクター、未消化のベクター（４０μＬの水と５μＬのＤＮａｓｅ緩衝液を含む５μＬの精製したベクター）、未消化のスパイクしたベクター（３５μＬの水、５μＬのＤＮａｓｅ緩衝液、および５μＬのスパイクした標準物を含む５μＬの精製したベクター）のいずれかを添加し、混合した。ＰＣＲプロセスを実施し、サイクル３による試料を融解曲線の分析に使用した。

これらの１本鎖ＤＮＡゲノムの濃度を、上記のような定量的ＰＣＲにより分析した。ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌベクター粒子の濃度をミリリットルあたり２×１０^１１ベクターゲノムコピー（ＧＣ／ｍＬ）であると決定し、ｒＡＡＶ−ＧＦＰベクター粒子の濃度を２×１０^１１ＧＣ／ｍＬであると決定した。

（精製した組み換えＡＡＶベクターの銀染色）
精製したｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１ＬおよびｒＡＡＶ−ＧＦＰベクターの純度を試験するために、ベクター溶解物について銀染色分析を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。具体的には、２０μＬの溶解緩衝液（８．４ｍＬの水、５００μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＬのグリセロール、３００μＬの５Μ ＮａＣｌ、５０μＬのＮＰ−４０、４０μＬのＥＤＴＡ、１００μＬのＰＭＳＦ、１錠のプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ，カタログ番号１１８３６１７０００１））を２０μＬのそれぞれの精製した組み換えＡＡＶベクターに添加し、氷上で２０分間保った。この反応物を、卓上型遠心分離機において１３，０００ｒｐｍおよび４℃で２分間遠心分離した。上清を新しい管に移し、１０μＬの５×還元試料緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ，カタログ番号３９０００）を添加し、試料を９５℃で１０分間インキュベートした。

電気泳動を製造業者の説明書にしたがって行った。４〜１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを水でリンスし、ゲルチャンバーの中に入れた。ランニング緩衝液（１０×Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳランニング緩衝液（ＢｉｏＲａｄ，カタログ番号１６１−０７３２）を水で希釈することにより作製した１×Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳ）を上部および下部緩衝液チャンバーに添加した。ウェルを２００μＬのランニング緩衝液で２回リンスし、試料をロードした。対照として、１μＬの容量のＢＥＮＣＨＭＡＲＫ（商標）タンパク質のラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号１０７４７−０１２）を外側のウェルに添加した。ゲノム力価分析により決定したものと等濃度のベクターをロードした。ゲルを、色素がゲルの底に達するまで２００Ｖで泳動した。ゲルを固定し、製造業者の使用方法（Ｂｉｏｒａｄ Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎ Ｐｌｕｓ，カタログ番号１６１−０４４９）にしたがって銀染色した。

３種類のＡＡＶウイルスタンパク質ＶＰ１（９０ｋＤａ）、ＶＰ２（７２ｋＤａ）、およびＶＰ３（６０ｋＤａ）だけを見ることができた（図１）。他のタンパク質バンドは銀染色分析において見ることができなかったので、これにより、ベクター調製物が高い純度のベクター粒子の産生を生じたことを確認することができた。

（ＡＲＰＥ−１９細胞のＡＡＶベクター形質導入により媒介されたＲｄＣＶＦ１Ｌのインビトロ発現）
ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌベクターにより媒介されたＲｄＣＶＦ１Ｌの発現および分泌を試験するために、ＡＲＰＥ−１９ヒト網膜色素上皮細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、６ウェルプレート中のウェルあたり３ｍＬのｃＤＭＥＭ中に２００，０００個の細胞を播種した。ＡＡＶ感染後のトランスジーンの発現について律速となる工程は１本鎖ＤＮＡゲノムの２本鎖合成であり、これは数週間を要し得る。例えば、Ｆｅｒｒａｒｉら（１９９６）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７０：３２２７−３２３４を参照のこと。しかし、細胞培養物中でのｒＡＡＶベクターの形質導入後のタンパク質の発現を促進するために、形質導入の前に放射線照射を使用することができる。例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６８：８２８２−８２８７を参照のこと。

２４時間後、細胞にＳｈｅｐｈｅｒｄ ＆ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，モデル：Ｍａｒｋ Ｉ−６８ Ｓｅｌｆ−ｓｈｉｅｌｄｅｄ ｉｒｒａｄｉａｔｏｒを用いて１７５Ｇｙの^１３７Ｃｓを照射した。２時間後、培地を１．５ｍＬの新鮮なｃＤＭＥＭで置き換え、３μＬの精製した組み換えＡＡＶベクターを添加した。１つのプレートは対照として形質導入せず（ＡＡＶなし）、１つのプレートをｒＡＡＶ−ＧＦＰベクターで形質導入し、そして１つのプレートをｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１ベクターで形質導入した。

形質導入の２日後、形質導入した細胞および形質導入されていない細胞由来の上清を回収し、０．４５μｍの濾紙を通して濾過した。等容量の溶解緩衝液（９．４ｍＬの水、２００μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、４０μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、３００μＬの５Μ ＮａＣｌ、１００μＬのＮＰ−４０、１００μＬのＰＭＳＦ、１錠のプロテアーゼ阻害剤）を添加し、使用するまで−８０℃で保管した。各プレート由来の細胞をＰＢＳで洗浄し、セルリフターを使用して削り取り、プールし、１５ｍＬの円錐管に移した。細胞をＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ ６ＫＲ遠心分離機において、１，２００ｒｐｍおよび４℃で４分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞ペレットを１ｍＬの溶解緩衝液（上記を参照のこと）中に再懸濁し、１．５ｍＬの管に移し、氷上で１０分間インキュベートした。細胞溶解物を、卓上型遠心分離機において１３，０００ｒｐｍおよび４℃で２分間遠心分離した。明澄化した細胞溶解物を１．５ｍＬの管の中に２００μＬの容量にアリコートし、使用するまで−８０℃で保管した。

（形質導入した細胞の上清および細胞溶解物のＲｄＣＶＦ１Ｌ発現についてのウェスタンブロット分析）
４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用したウェスタンブロット分析を、標準的な技術を使用してＲｄＣＶＦ１Ｌ発現を検出するために使用した。対照として、５μＬの容量のＭＡＧＩＣＭＡＲＫ（商標）ＸＰ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号ＬＣ５６０２）を外側のウェルに添加した。このゲルを色素がゲルの底に達するまで２００Ｖで泳動した。ウェスタンブロット分析を、製造業者の説明書の改変バージョンにしたがってＶｅｃｔｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによるＶｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ−Ａｍｐウェスタンブロット分析キットを用いて行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥをトランスファー緩衝液中で２０分間かけて平衡化させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離したタンパク質をＴｒａｎｓ Ｂｌｏｔ Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃｅｌｌを使用して２０Ｖで４０分間、ニトロセルロースメンブレン上に移動させた。移動が完了したら、メンブレンを、２００ｍＬの１×カゼイン溶液中で、ロッキングプラットフォーム上で穏やかに攪拌しながら、上清については室温（ＲＴ）で少なくとも２時間、そして細胞溶解物については４℃で一晩とＲＴで１時間ブロックした。メンブレンを、５０ｍＬで、１×カゼイン溶液中に１：２，０００（上清）または１：１０，０００（細胞溶解物）に希釈したウサギ抗ＲｄＣＶＦタンパク質特異的モノクローナル抗体（大腸菌中で産生された精製されたＨｉｓ−Ｔａｇ ＲｄＣＶＦ１Ｌタンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｏｎｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用してＣｏｖａｎｃｅ（Ｄｅｎｖｅｒ，ＰＡ）により作製された一次抗体）とともに、穏やかに攪拌しながらそれぞれ４℃で一晩、または室温で２時間インキュベートした。メンブレンを、３０ｍＬの１×カゼイン溶液で５分間を４回、それぞれＲＴで穏やかに攪拌しながら洗浄した。メンブレンを、１×カゼイン溶液中に１：２４，０００に希釈した３０ｍＬのビオチニル化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（二次抗体）とともにＲＴで１時間、穏やかに攪拌しながらインキュベートした。メンブレンを、３０ｍＬの１×カゼイン溶液中で５分間を３回、それぞれＲＴで穏やかに攪拌しながら洗浄した。メンブレンを、１００μＬのＲｅａｇｅｎｔ Ａと１００μＬのＲｅａｇｅｎｔ Ｂを含有している５０ｍＬの１×カゼイン中のＶｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ−ＡｍＰの中で４５分間インキュベートした。メンブレンを３０ｍＬの１×カゼイン溶液中で５分間を３回、それぞれＲＴで穏やかに攪拌しながら洗浄した。

メンブレンをＴｒｉｓ（ｐＨ９．５）中でインキュベートした。化学発光シグナルを、６ｍＬのＤｕｏｌｏｘ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，カタログ番号ＳＫ ６６０５）を使用し、メンブレンをＫｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘ ＭＳ Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ Ｈｅａｌｔｈ，カタログ番号８５７２７８６）に対してフィルムカセットの中で１０秒〜５分間露光させ、続いてＫｏｄａｋ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｋｏｄａｋ ＧＢＸ，カタログ番号１９００９８４）およびＫｏｄａｋ Ｆｉｘｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎを使用してフィルムを現像することにより獲得した。

細胞溶解物中の発現されたＲｄＣＶＦ１Ｌタンパク質のレベル（図２Ａ）は、ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１ＬベクターがＡＲＰＥ細胞に効率よく形質導入したことを示していた。さらに重要なのは、ＲｄＣＶＦ１Ｌタンパク質が、ベクターを形質導入した細胞の細胞培養培地中に効率よく分泌されたことである（図２Ｂ）。しかし、予想した分子量を持つ２つのＲｄＣＶＦ１Ｌタンパク質陽性バンドがｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌベクターを形質導入した細胞溶解物試料中で観察され（図２Ａ、レーン３）、細胞上清試料中では３個のそのようなバンドが検出された（図２Ｂ、レーン３）。理論に束縛されることは望ましくないが、細胞溶解物中のものと同じ分子量を持つ、細胞上清中の２つのより小さい分子量のバンド（図２Ｂ、レーン３）は、培養物中のいくつかの死滅した細胞から放出された可能性がある。上清中よりもわずかに大きい分子量を持つ第３のバンドはおそらく、細胞溶解物には存在しない分泌型のＲｄＣＶＦ１Ｌを示していた。データはまた、分泌型のＲｄＣＶＦ１Ｌを含む３つの形態のＲｄＣＶＦ１Ｌが、おそらく、翻訳後に修飾されたことを示唆していた。

（まとめ）
ＲｄＣＶＦ１Ｌ ＡＡＶベクターはヒト網膜色素上皮（ＡＲＰＥ−１９）細胞に効率よく形質導入することができ、ウェスタンブロットにより検出されたように、長いＲｄＣＶＦタンパク質の発現および分泌を導くことができた。より大きなバンドに加えて２つの異なるＲｄＣＶＦＬタンパク質バンドが、ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌベクターを形質導入した細胞溶解物試料中で観察された。３つのＲｄＣＶＦＬタンパク質のバンドが、ベクターを形質導入した細胞の上清中で検出された。細胞溶解物中で見られたものと同じ分子量を有しているこれらのうちの２つは細胞培養物中の死滅した細胞に由来した可能性があった。わずかに大きな分子量を持つ第３のバンドは、おそらく分泌型のＲｄＣＶＦ１Ｌを示していた。これらのデータはまた、分泌型のＲｄＣＶＦ１Ｌを含むＲｄＣＶＦ１Ｌがおそらく翻訳後に修飾されたことを示唆していた。

（実施例３ マウスの眼の中でのＡＡＶベクターによるＲｄＣＶＦ１およびＧＦＰのインビボ発現）
本研究の目的は、ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌの網膜下投与によりマウスの眼の網膜中のＲｄＣＶＦレベルを増大させることができるかどうかを決定することであった。組み換えＡＡＶ血清型２ベクターｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌおよび対照ベクターｒＡＡＶ−ＧＦＰを実施例２に記載したように調製した。

雌ＢＡＬＢ／Ｃマウス（５〜６週齢）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入し、本研究において使用した。動物に、研究に使用する前に最も短くても１週間の馴化期間を与えた。これらを１２時間の明暗サイクルで、ケージの中で＜５０ルクスの光度で飼育した。飼料と水は自由に利用できるようにした。実験計画については表１に概要を述べる。

網膜下注射を麻酔下で行った。動物を５〜６μｇ／グラムのキシラジンと組み合わせた２５〜３０μｇ／グラムのケタミンの腹腔内注射により麻酔した。麻酔の用量は深い麻酔状態に達するように調整した。眼を局所麻酔のための０．５％の塩酸プロパラカイン（Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂ Ｉｎｃ．Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）と、手術の直前の消毒のための０．３％のＡＫ−Ｔｏｂ（Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂ Ｉｎｃ．）の局所塗布で処置した。瞳孔を１％のトロピカミド（Ａｋｏｒｎ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）で膨張させた。

簡単に説明すると、麻酔したマウスを、視野（およそ１０倍の倍率）に注射を行う眼を含むようにＺｅｉｓｓ手術用顕微鏡下に置いた。ジュウェラー鑷子を用いて眼瞼に穏やかな圧力をかけて、眼球を完全に前に脱出させた。上側頭回を注意深く切開して強膜を露出させた。３０ゲージの針を使用して、強膜、脈絡膜、および網膜の穿刺（ｓｈｅｌｖｉｎｇ ｐｕｎｃｔｕｒｅ）を、角膜輪部から０．５ｍｍ後方、およそ１１時（右眼）および１時（左眼）の位置に行った。１滴のＧｏｎａｋ（２．５％、Ａｋｏｒｎ，Ｉｎｃ）を角膜に滴下し、眼底が見やすくなるように、角膜表面上にカバースライドをゆっくりと置いた。５μＬのハミルトン注射器に取り付けた３３ゲージの鈍針を、水晶体と網膜の内表面上に置いた針の先端とを触れさせることなく、後極に対して接線方向に強膜切開を通じて挿入した。網膜に穿孔を生じさせ、１μＬのベクターを網膜下腔に注射した。注射後、針を注意深く引き抜き、結膜を整復した。それぞれの注射の成功は、網膜剥離の兆候について眼底を評価することにより確認した。網膜下または硝子体内で出血を示した全ての眼を除外し、同様に、網膜剥離（または水疱）を示さなかった眼も除外した。ネオマイシンおよび硫酸ポリミキシンＢ（ｐｏｌｙｍｙｃｉｎ Ｂ ｓｕｌｆａｔｅ）および亜鉛バシトラシン（Ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ Ｚｉｎｃ）眼軟膏（Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂ Ｉｎｃ．）を角膜に塗布して、動物を暖めた毛布の上で麻酔から回復させる間のこの組織の乾燥を最小限にした。

（ウェスタンブロット分析）
ウェスタンブロットを、ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌベクターの投与後６週間で得た、ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌベクターを注射した眼および反対側の注射しなかった対照の眼由来のタンパク質抽出物を用いて作製した。簡単に説明すると、眼球を摘出し、眼球外の組織と前上葉区を取り除いた。残っている後上葉区を液体窒素で迅速に凍結させた。これらの試料を、タンパク質の抽出に使用するまで−８０℃で保管した。それぞれの眼杯について、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，カタログ番号１１８３６１７０００１）を含む２００μＬの氷冷したＴ−ＰＥＲ組織タンパク質抽出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，カタログ番号７８５１０）を添加した。これらの試料をＳｏｎｉｃ ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｏｄｅｌ １００，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を用いて氷上で５秒間、超音波処理した。超音波処理した試料を氷上に１５分間置いておき、１０，０００ｇ、４℃で５分間遠心分離して細胞の破片を取り除いた。上清を集め、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを使用してタンパク質濃度を決定した。ＲｄＣＶＦＬ対照については、ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌを形質導入したＡＲＰＥ−１９細胞の溶解物を陽性対照とし、形質導入されていない細胞の溶解物を陰性対照とした。タンパク質をゲル電気泳動により分離した。各レーンにつき、３６μｇの総タンパク質を４〜２０％のＣｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）ＴＧＸ（商標）Ｐｒｅｃａｓｔゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，カタログ番号５６７−１０９４）上にロードし、２００ボルトで７０分間電気泳動した。Ｔｒａｎｓ Ｂｌｏｔ Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃｅｌｌを使用して、タンパク質を０．２μｍのニトロセルロースブロッティングメンブレン上にエレクトロブロットした。ブロットを１×カゼイン溶液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，カタログ番号ＳＰ−５０２０）を使用してＲＴで２時間ブロックし、１：２，０００に希釈したウサギ抗ＲｄＣＶＦＬ一次抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＰＡ）または１：５００に希釈したウサギ抗オプシン、赤／緑ポリクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｔｅｍｅｃｕｒａ，ＣＡ）とともにインキュベートした。１×カゼイン溶液での３回の洗浄の後、各ブロットを１：３，０００に希釈したアルカリホスファターゼヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，カタログ番号ＡＰ−１０００）とともにインキュベートした。タンパク質のバンドを、化学発光物質検出キットを使用して視覚化した。β−チューブリン（５０ｋＤ）を、等タンパク質ローディング対照に使用した。ブロットをＲｅｓｔｏｒｅ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号４６４３０）を用いて剥がし、１：５００に希釈した抗β−チューブリンモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号Ｔ４０２６）、続いて、１×カゼイン溶液中に１：３，０００に希釈したアルカリホスファターゼ結合ウマ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，カタログ番号ＡＰ−２０００）で再度プローブした。

Ｋｏｄａｋ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｔａｔｉｏｎを用いて行った放射能写真のタンパク質デンシトメトリーを、スキャンしたタンパク質バンドを定量化するために使用した。これは、同じブロットの中のβ−チューブリンレベルに関して基準化した。

ＲｄＣＶＦ１Ｌタンパク質の存在は、およそ３０ｋＤａの分子サイズを持つ顕著な二重免疫反応性のバンドとして、ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌの注射を投与した眼において明白に検出された（図３）。陽性対照とした、ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌが形質導入されたＡＲＰＥ−１９細胞由来の細胞溶解物のウェスタンブロットもまた、同じ大きさの２つの個別のタンパク質バンドを生じた。網膜下注射を投与しなかった反対側の眼に由来のタンパク質抽出物も、ｒＡＡＶ−ＧＦＰを注射した眼も、抗ＲｄＣＶＦＬ抗体により検出された類似するタンパク質バンドを生じた（図３）。二重免疫反応性のバンドは、ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌが形質導入されたＡＲＰＥ−１９細胞中でインビトロにおいて観察された二重のバンドと類似していた。第３のバンド（おそらくは分泌型のＲｄＣＶＦ１Ｌ）が存在しない理由は、これらのインビボ試料が網膜細胞由来のタンパク質抽出物であることであった。

（免疫組織化学分析）
ＲｄＣＶＦ１Ｌ免疫染色を、神経網膜およびＲＰＥ−脈絡膜−強膜の全載標本中で行った。動物を最後に麻酔し、眼を摘出し、すぐにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）７．４（１×）、液体（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号１００１０−０３１）中の４％パラホルムアルデヒド中に、４℃で一晩固定した。各マウスの眼に、摘出術の前に墨汁で角膜の下部四分円に印をつけた。眼杯は、Ｌｅｉｃａ解剖顕微鏡下で前上葉区を取り除くことにより準備した。方向決めのために、下部四分円に小さい切り込みを入れた。神経網膜をＲＰＥから注意深く切り開いて離し、視神経で分断した。全載標本を１×ＰＢＳで３回リンスし、ＰＢＳ中の２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中において５％のロバ血清でＲＴで２時間ブロックした。ブロッキング溶液を除去した後、全載標本を一次抗体（ブロッキング溶液中の１：１，０００のウサギ抗ＲｄＣＶＦ）とともに４℃で一晩、および二次抗体（ＰＢＳ中の２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中の１：１，０００のＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８ロバ抗ウサギとともにＲＴで２時間、連続してインキュベートした。ＰＢＳでの最後のリンスの後、各全載標本を、神経網膜については光受容器が上を向き、ＲＰＥ−脈絡膜−強膜についてはＲＰＥが上を向くようにガラススライド上にフラットマウントした。次に、フラットマウントを、デジタルカメラ（Ｓｐｏｔ ＲＴ Ｃｏｌｏｒ ２．２．１，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ）を取り付けたＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１顕微鏡とエピ蛍光法を用いて試験した。

免疫組織化学により、ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１ベクターを注射した眼の中でのＲｄＣＶＦ１Ｌタンパク質の発現の増大を確認した。強いＲｄＣＶＦ１Ｌ免疫染色が、ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦを注射した眼においてＲＰＥ細胞中で観察されたが（図４Ａ）、注射しなかった反対側の眼からは観察されなかった（図４）。ＲｄＣＶＦ１Ｌの発現の増大は、各眼のおよそ１つの四分円に及ぶ限局性の領域においてのみ見られ、発現が網膜下注射による水疱の領域のみにとどまることを示していた。一次抗体なしで染色した試料は免疫反応性を全く示さなかった（図４Ｃ）。このタンパク質の発現の顕著な増大はまた、ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌを注射した眼の中の光受容器細胞中でも観察された（図５Ａ）。強いＲｄＣＶＦ１Ｌ染色が、フラットマウントした神経網膜の中の光受容器外節においてみられた。ここでもまた、陽性染色は、網膜の１０〜３０％に及ぶ網膜の限局性の領域だけに局在していた。注射しなかった反対側の眼においてはバックグラウンドの染色しか存在しなかった（図５Ｂ）。免疫反応性は、一次抗体なしで処理した試料においては見られなかった（図５Ｃ）。

（マウスの眼の中でのＧＦＰの発現）
試験したＡＡＶベクターがマウスの眼にＲＰＥおよび光受容器細胞を効率よく形質導入できるかどうかを決定するために、１つのグループのマウス（ｎ＝７）にｒＡＡＶ−ＧＦＰを網膜下注射し、６週間後に屠殺した。ＲＰＥ−脈絡膜−強膜と神経網膜を分離させ、ガラススライド上にフラットマウントした。蛍光顕微鏡は、ＲＰＥおよび光受容器層の中での強いＧＦＰ発現を明らかにした（未公開データ）。ＧＦＰを発現するＲＰＥ細胞は、フラットマウントの１〜２の四分円に拡がっており、注射部位に最大数の、最も強くＧＦＰを発現する細胞が存在していた。形質導入したＲＰＥ細胞は、それらの六角形の形態を維持していたとの理由から健全であるように見えた。フラットマウントした神経網膜においては、ＧＦＰ発現が光受容器外節中で確認された。時折、神経節細胞のような網膜の内部の細胞が、おそらく網膜下注射後のベクターの硝子体への漏出が原因で、ＧＦＰ陽性であった。

（まとめ）
本研究は、網膜下注射の成功後のｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１ＬベクターによるＲＰＥおよび光受容器細胞の効率的な形質導入を明らかにした。このベクターにより送達されたＲｄＣＶＦ１Ｌ発現構築物は、マウスの眼の中のＲｄＣＶＦ１Ｌタンパク質のレベルの有意な増大を導いた。

（実施例４ ｒｄ１０マウスの眼の中での光受容器の生存に対するアデノ随伴ウイルスベクターにより媒介された長い形態のＲｄＣＶＦ発現の効果）
本研究の目的は、ＲｄＣＶＦ１ＬをコードするＡＡＶをベースとする遺伝子治療ベクターの網膜下投与がｒｄ１０マウス（ヒト遺伝性網膜変性についての自然界に存在する動物モデル）における光受容器の生存を促進できるかどうかを決定することであった。Ｒｄ１０マウスは、常染色体劣性網膜色素変性（ＲＰ）についての自然界に存在する動物モデルである。Ｒｄ１０マウスは桿体ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子中にミッセンス点変異を有し、これにより光受容器細胞のアポトーシスを生じる（Ｃｈａｎｇら（２００７）Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓ ４７：６２４−６３３）。桿体光受容器細胞は１８日齢で変性を開始し、光受容器の死滅のピークはＰ２５にある（Ｇａｒｇｉｎｉら（２００７）Ｊ Ｃｏｍｐ Ｎｅｕｒｏｌ ５００：２２２−２３８）。５週間までにほとんどの光受容器細胞が変性していた（Ｃｈａｎｇら（２００２）Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓ ４２：５１７−５２５；Ｃｈａｎｇら（２００７）Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓ ４７：６２４−６３３；Ｇａｒｇｉｎｉら（２００７）Ｊ Ｃｏｍｐ Ｎｅｕｒｏｌ ５００：２２２−２３８）。興味深いことは、暗所で飼育中のｒｄ１０マウスが光受容器の変性を４週間も遅らせたことが明らかにされたことであり（Ｃｈａｎｇら（２００７）Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓ ４７：６２４−６３３）、これは、光への暴露が光受容器の死滅を加速させ得ることを示唆している。一方、これらのマウスを暗所に囲い続けることによる光受容器の変性の遅れは、治療用トランスジーンの発現に時間が必要であるベクターについて治療の猶予時間を延長することができる。例えば、ＡＡＶからの十分なトランスジーンの発現には通常約３週間を要するであろう。

ｒｄ１０マウスの類遺伝子性近交系株の飼育対（４〜５週齢）をＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入し、動物施設の中で繁殖させた。これらを１２時間の明暗サイクルで、ケージの中で＜５０ルクスの光度で飼育した。飼料と水は自由に利用できるようにした。以下に記載するように、外科手術後、仔を彼らの雌親とともに、彼らを３週齢で離乳させるまで暗所に囲い続けた。その後、全ての動物を、１２時間の明暗サイクルの以前の部屋に戻した。実験計画は表２のとおりである。

動物（生後３日の日齢）を低体温症により麻酔した。この麻酔方法は５日齢までの新生仔マウスおよびラットについて十分に確立されており、これらの動物における短時間の小手術手順（５〜１５分）に適している（Ｇａｅｒｔｎｅｒら、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ ａｎｄ Ａｎａｌｇｅｓｉａ 第２版、２７７−２７８頁）。仔を砕いた氷の上に３〜４分間置いた。この時間の間に、仔の色はピンクから紫に変化した。このタイプの麻酔下で網膜下注射を行った。

麻酔したマウスを、視野（およそ１０倍の倍率）に注射を行う眼を含むようにＺｅｉｓｓ手術用顕微鏡下に置いた。眼瞼と隣接する領域を５％のポビドンヨードで消毒した。虹彩はさみを使用した眼瞼裂の分離により眼を露出させた。ジュウェラー鑷子を用いて眼瞼に穏やかな圧力をかけて、眼球を完全に前に脱出させた。消毒のために１滴の０．３％のトブラマイシン（Ｔｏｂｒｏｍｙｃｉｎ）（Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂ Ｉｎｃ．）を投与した。３０ゲージの角針を使用して、強膜、脈絡膜、および網膜の穿刺を、角膜輪部に対して約０．５ｍｍ後方、およそ１１時（右眼）の位置に行った。５μＬのハミルトン注射器に取り付けた３３ゲージの鈍針を、後極に向かう接線方向の強膜切開を通じて挿入した。針の先端を網膜下腔に置き、１μＬのＡＡＶベクターを網膜下腔に注射した。注射後、針をゆっくりと引き抜いた。網膜下または硝子体内で出血を示した全ての眼を研究から除外した。感染を防ぎ、この組織の乾燥を最小限にするために、ネオマイシンおよび硫酸ポリミキシンＢ（ｐｏｌｙｍｙｃｉｎ Ｂ ｓｕｌｆａｔｅ）および亜鉛バシトラシン眼軟膏（Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂ Ｉｎｃ．）を角膜に塗布した。暖かい電気座布団の上で動物を回復させた。

（網膜の組織診断）
マウスを深い麻酔状態とし、彼らの眼を方向決めのために赤い組織色素で上の四分円に印をつけた。その後、彼らを屠殺し、すぐに摘出術を行い、Ｄａｖｉｄｓｏｎ’ｓ定着液中にＲＴで約２４時間固定した。エタノールおよびＣｌｅａｒ−ｒｉｔｅ中での連続する脱水の後、眼をパラフィン（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）中に包埋した。５μｍ厚の網膜の切片を垂直軸に沿って切り、上位および下位網膜の試験ができるようにした。これらの切片をヘマトキシリンとエオシンで染色し、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１）下で試験した。外核層（ＯＮＬ）の厚みを、中心および周辺部網膜の中の核の段数を数えることにより評価した。光受容器の形態もまた試験した。

処置したｒｄ１０マウスの眼を５週齢での構造レスキューの程度について評価した。光学顕微鏡検査は、未処置の反対側の眼と比較して、ＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌで処置した眼の外核層（ＯＮＬ）の明らかな保存を示した。典型的には、同じ位置において、未処置の反対側の眼における１〜２段に対して、ＲｄＣＶＦ１Ｌベクターで処置した網膜は、上位および／または下位領域においては、２〜５段の光受容器の核を有していた（図７）。保護が下部四分円においても観察されたとの理由から、レスキューは、注射した領域である上部四分円に限定されなかった。形態計測分析は、未処置の眼における３４％と比較して、ベクターで処置した眼においてはおよそ７５％の網膜が保護されたことを示した。一部の保存された光受容器は、内節と外節をなおも保有していた（図７Ｅ）。注目すべきは、レスキューされた光受容器が桿体細胞と錐体細胞の両方を含んでいたことである。

（錐体の光受容器の染色および計数）
錐体細胞特異的マーカーであるピーナッツアグルチニン（ＰＮＡ）を使用して、網膜の全載標本を染色した。マウスの眼に、摘出術の前に、角膜の上部四分円には墨で、耳側の四分円には赤色色素で印をつけた。これらを直ちに４％パラホルムアルデヒド中に、４℃で少なくとも一晩固定した。眼杯は、Ｌｅｉｃａ解剖顕微鏡下で前上葉区を取り除くことにより準備した。方向決めのために、上部四分円に小さい切り込みを入れた。円周の付近を４つに放射状に切った後、神経網膜全体を眼杯から注意深く切り開いた。網膜を１×ＰＢＳで３回リンスし、０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳ中の６％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号１００１０−０３１）でＲＴで３０分間ブロックした。ブロッキング溶液を除去した後、網膜を、Ｌｅｃｔｉｎ ＰＮＡ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４（ＰＢＳ中１：２５０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）とともに４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳでの最後のリンスの後、各網膜を、光受容器を上に向けてガラススライド上にフラットマウントした。次に、網膜の全載標本を、デジタルカメラ（Ｓｐｏｔ ＲＴ Ｃｏｌｏｒ ２．２．１，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ）を取り付けたＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１顕微鏡とエピ蛍光法を用いて試験した。

網膜の全載標本中の錐体細胞の密度を評価するために、２つの画像を、それぞれ、視神経頭の端から１ｍｍおよび２ｍｍで、各網膜の四分円から６０倍の対物レンズを用いて撮影した。示した各画像（３９０×２９３μｍ）の錐体の数を、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）で計数した。

一部の眼については、網膜のクリオスタット切片（１２μｍの厚み）をＬｅｉｃａクリオスタットミクロトーム（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｏｄｅｌ ＣＭ １８５０，Ｌｅｉｃａ，Ｂａｎｎｏｃｋｂｕｒｎ，ＩＬ）で切断し、ＰＮＡで染色し、上記のように蛍光顕微鏡で試験した。

錐体光受容器細胞を、フラットマウントした神経網膜中の錐体内節および外節を選択的に染色するＰＮＡ標識により同定した。蛍光顕微鏡は、特に、後部中心網膜で、例えば、視神経頭周囲において、未処置の眼の中の錐体細胞の激しい変性を示した。錐体細胞は外節を失い、その内節は短く、欠けており、でこぼこである。対照的に、ベクターで処置した眼はより高い錐体密度を有しており、乱れた錐体節ははるかに少なく、錐体の染色はより均一であった（未公開データ）。より高倍率で、ＰＮＡ陽性錐体細胞を視神経頭から１ｍｍおよび２ｍｍの位置で４つの四分円の全てにおいて計数した。錐体密度の定量は、未処置の反対側の眼と比較してベクターで処置した眼において有意に多い数の錐体受容器を示した：５０＋／−２５．２に対して１８１＋／−４６．４の錐体／０．１１４ｍｍ^２、ｐ＝０．００１。

（ＲｄＣＶＦの免疫組織化学）
ＲｄＣＶＦ免疫染色を、神経網膜およびＲＰＥ−脈絡膜−強膜の全載標本中で行った。全載標本を１×ＰＢＳで３回リンスし、ＰＢＳ中の５％のロバ血清および２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００でＲＴで２時間ブロックした。ブロッキング溶液を除去した後、全載標本を、一次抗体（ブロッキング溶液中の１：１，０００のウサギ抗ＲｄＣＶＦ）とともに４℃で一晩、および二次抗体（ＰＢＳ中の１：１，０００のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ロバ抗ウサギおよび２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）とともにＲＴで２時間、連続してインキュベートした。ＰＢＳでの最後のリンスの後、各全載標本を、神経網膜については光受容器が上を向き、ＲＰＥ−脈絡膜−強膜についてはＲＰＥが上を向くようにガラススライド上にフラットマウントした。次に、フラットマウントを、デジタルカメラ（Ｓｐｏｔ ＲＴ Ｃｏｌｏｒ ２．２．１，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ）を取り付けたＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１顕微鏡とエピ蛍光法を用いて試験した。

強いＲｄＣＶＦ免疫反応性が、６個のｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌを注射した眼のうちの５個においてＲＰＥ細胞中で観察された（１つの眼による代表的な例を（図６Ａ）に示す）が、注射しなかった反対側の眼からは観察されなかった（図６Ｂ）。ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌ注射を投与した１つの眼は、小眼球症（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｍｉａ）の理由により分析から除外した。ＲｄＣＶＦ１Ｌの効率的な発現が、各眼のおよそ１．５〜３個の四分円に拡がる限局性の領域において見られた。ＲｄＣＶＦ１Ｌを発現するＲＰＥ細胞は典型的な六角形の形態を維持しており（図６Ｅ）、ベクターの投与またはＲｄＣＶＦ１Ｌの発現によっては、ＲＰＥに対して明らかにネガティブな影響はないことを示唆していた。ＲｄＣＶＦ１ＬのＲＰＥ発現と同様に、このタンパク質の免疫反応性における効率的な発現も、ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌを注射した眼において神経網膜中で観察された（図６Ｃ）。注射しなかった反対側の眼には染色は存在しなかった（図６Ｄ）。強いＲｄＣＶＦ１Ｌ染色が、５個の眼のうちの３個において、特に、内節／外節において、光受容器細胞中に明らかに見られた（図６Ｆ）。他の２つの眼にＲｄＣＶＦ免疫反応性がないことは、光受容器の変性に原因があり得る。ここでもまた、陽性染色は網膜の限局性の領域のみに局在していた。注射しなかった反対側の眼においてはＲｄＣＶＦ１Ｌの観察出来る程の発現が存在しなかったという観察は、内因性のＲｄＣＶＦ１Ｌのレベルが免疫組織化学染色による検出の限界を下回り得ることを示唆している。

（まとめ）
本研究は、ｒｄ１０マウスの眼において、ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌベクターの網膜下注射がＲＰＥおよび光受容器細胞の効率的な形質導入と強いＲｄＣＶＦ１Ｌタンパク質発現を導いたことを示していた。より重要なことは、このベクターが桿体および錐体の両方の光受容器の生存を延長し、この臨床的に関連する網膜色素変性（ＲＰ）の動物モデルにおいて錐体の形態を改善したことである。

（実施例５ ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌの網膜下注射はｒｄ１０マウスにおいて注射部位から遠位にある光受容器細胞を保存した）
ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌによる光受容器細胞のレスキューが注射部位から遠位にある領域にまで拡がり得るかどうかを試験するために、ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌ（１μＬ、２×１０^８ＧＣ）を、生後３日のｒｄ１０マウスの右眼の上部四分円に網膜下注射し、注射しなかった反対側の眼を対照とした。マウスを５週齢で屠殺した。眼杯全体による網膜の組織診断を行った。図８は、一方の眼にｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌの網膜下注射を投与し（パネルＡ、図８）、反対側の眼は未処置とした（パネルＢ、図８）代表的な５週齢のｒｄ１０マウス由来の眼杯の光学顕微鏡写真を示す。処置した眼と未処置の眼との間でのＯＮＬの厚みに差に留意されたい。光受容器の保存は、ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌで処置した眼の網膜全体に明らかに見られた（パネルＡ、図８）。上部網膜中の注射部位が標識された。対照的に、未処置の反対側の眼においては、下部周辺部網膜中を除き、ほとんどの光受容器細胞が失われた（パネルＢ、図８）。

（実施例６ ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌの網膜下注射が桿体光受容器細胞を保存した）
桿体光受容器細胞が（錐体の光受容器細胞に加えて）ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌによりレスキューされ得るかどうかを試験するために、生後３日のｒｄ１０マウスの右眼にｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌ（１μＬ、２×１０^８ＧＣ）を網膜下注射し、注射しなかった反対側の眼を対照とした。マウスを５週齢で屠殺した。網膜の組織をロドプシン免疫組織化学染色した。網膜の層の同定を手助けするために、切片をＤＡＰＩ（ジアミジノ−２−フェニルインドール、青色）で対比染色した。

ロドプシンの強い発現が、ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌで処置した眼において光受容器細胞の節層および核層の両方の中で観察された（未公開データ）。しかし、未処置の眼においてはごく一部の細胞しかロドプシン染色を示さなかった（未公開データ）。

（実施例７ Ｒｄ１０マウスにおいてアデノ随伴ウイルスベクターにより媒介されたＲｄＣＶＦＬによる光受容器の機能的レスキュー）
本研究の目的は、ｒｄ１０マウスにおいて、網膜の機能と構造に対するＡＡＶベクターにより送達されるＲｄＣＶＦの保護効果を評価することであった。新生仔ｒｄ１０マウス（３または４日齢）に、一方の眼にはｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦＬベクターを網膜下注射し、一方、反対側の眼は未処置のままとした。網膜下注射後５週間で、網膜の機能を評価するために、マウスを網膜電位図（ＥＲＧ）で試験した。ＥＲＧ後、マウスを屠殺し、彼らの眼を網膜の組織学的評価のために処理した。

組み換えＡＡＶ血清型２ベクターｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌおよび対照ベクターｒＡＡＶ−ＧＦＰを実施例２に記載したように調製した。

ｒｄ１０マウスの類遺伝子性近交系株の飼育対（４〜５週齢）をＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入し、動物施設の中で繁殖させた。これらを１２時間の明暗サイクルで、ケージの中で＜５０ルクスの光度で飼育した。飼料と水は自由に利用できるようにした。外科手術後、仔を彼らの雌親とともに、彼らを３週齢で離乳させるまで暗所に囲い続けた。その後、全ての動物を、１２時間の明暗サイクルの以前の部屋に戻した。実験計画については表３に概要を述べる。

動物を麻酔し、実施例４の中で上記に記載したように網膜下注射を行った。

マウスを実験前に一晩（少なくとも１４時間）暗所に適応させ、彼らの瞳孔を０．５％のトロピカミド（Ａｌｋｏｒｎ）点眼薬で膨張させた。ケタミンとキシラジンの腹腔内注射により麻酔状態を誘導した。銀の針電極を対照（額）と地面（尾）とし、ＤＴＬリング電極を活性電極とした。ゴネゾール（Ｇｏｎｅｓｏｌ）を、良好な電極の接触状態を確実にし、全手順の間、眼を水和された状態に保つために塗布した。記録のセットアップは、Ｇａｎｚｆｅｌｄボウル、ＤＣ増幅器、およびコンピューターによる制御、ならびにＥｓｐｉｏｎ Ｅ３網膜電位写真システム（Ｄｉａｇｎｏｓｙｓ ＬＬＣ．Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）の記録単位を特徴とした。ＥＲＧは、Ｇａｎｚｆｅｌｄボウルの中にマウスを入れた後、両眼から同時に記録した。シングルフラッシュ記録およびフリッカー記録を、暗順応（ｄａｒｋ−ａｄａｐｔｅｄ）（暗順応（ｓｃｏｔｏｐｉｃ））状態および明順応（ｌｉｇｈｔ−ａｄａｐｔｅｄ）（明順応（ｐｈｏｔｏｐｉｃ））状態の両方で得た。１回の閃光刺激は、強度の増大を示し、１０^−２から２５ｃｄｓ／ｍ^２に達した。５〜１７秒の刺激間間隔での５回の応答を平均した。２、５、１０、１５、および３０Ｈｚの周波数でのフリッカー刺激は３ｃｄｓ／ｍ^２の強度を有していた。明順応を、明順応応答を安定なレベルに到達させるために１０分間、示した３０ｃｄｓ／ｍ^２のバックグラウンドの照射を用いて行った。平均の振幅の比較のために、対応のあるＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ ｐａｉｒ−ｔ−ｔｅｓｔ）を使用した。

マウスを深い麻酔状態とし、彼らの眼を方向決めのために赤い組織色素で上部四分円に印をつけた。その後、彼らを屠殺し、すぐに摘出術を行い、Ｄａｖｉｄｓｏｎ’ｓ定着液中に室温で約２４時間固定した。エタノールおよびＣｌｅａｒ−ｒｉｔｅ中での連続する脱水の後、眼をパラフィン（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）中に包埋した。５μｍ厚の網膜の切片を垂直軸に沿って切り、上位および下位網膜の試験ができるようにした。これらの切片をヘマトキシリンとエオシンで染色し、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１）下で試験した。外核層（ＯＮＬ）の厚みを、中心および周辺部網膜の核の段数を数えることにより評価した。光受容器の形態もまた試験した。

（結果）
（ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌで処置した眼における網膜機能のレスキュー）
予想したとおり、５週齢で、ｒｄ１０マウスは週齢が一致する野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスと比較して、ＥＲＧ記録において暗順応応答および明順応応答の有意な減少を示した（未公開データ）。しかし、ｒｄ１０マウス（ｎ＝８）においては、暗順応のバックグラウンドでの２５ｃｄのフラッシュ強度下で、未処置のもう一方の眼（１１．５±８．４μＶ）と比較して、ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌで処置した眼は、ｂ波の振幅においておよそ３倍の増大（３３．６±１４μＶ）を示した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。この条件下では、桿体および錐体の両方の応答が記録された。統計分析は、ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌで処置した眼と対照の眼との間でのＥＲＧ振幅の有意な差を示している（ｐ＝０．０２５）。いくつかの動物（ｎ＝５）は、新生仔期での眼内外科手術によりおそらく生じた角膜の混濁、白内障、または小眼球症の理由から、ＥＲＧ試験から除外した（ＥＲＧ試験前に除外した）。

（ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌで処置した眼における光受容器の構造の保存：）
ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌで処置した眼におけるＥＲＧ応答の増大がｒｄ１０マウスにおける光受容器細胞の構造の保存と相関しているかどうかを決定するために、動物をＥＲＧの直後に屠殺した。彼らの眼を組織学的評価のために処理した。光学顕微鏡検査は、未処置の反対側の眼と比較して、ＡＡＶ−ＲｄＣＶＦＬで処置した眼において外核層（ＯＮＬ）の明らかな保存を示した。典型的には、ベクターで処置した網膜は、未処置の反対側の眼の中での１〜２段に対して、上位および／または下位領域においては、２〜４段の光受容器の核を有していた（図１１Ａおよび１１Ｂ）。保護が下部四分円においても観察されたとの理由から、光受容器の保存は、注射した領域である上部四分円に限定されなかった。一部の保存された光受容器は、内節と外節をなおも保有していた。形態計測分析は、対照の眼（１．２＋０．２）と比較して、処置した眼（２．５＋１．０）におけるＯＮＬの段数の有意な増加を示している（ｐ＝０．００６）（図１２）。

（まとめ）
ＥＲＧは、未処置のもう一方の眼（１１．５±８．４μＶ）と比較して、ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌで処置した眼（３３．６±１４μＶ）においてｂ−波の振幅の有意な増大を示した。ＥＲＧ振幅の増大は、網膜の構造の改善と相関していた。本研究は、ｒＡＡＶ−ＲｄＣＶＦ１Ｌベクターの網膜下注射が、Ｒｄ１０マウスにおいて網膜の機能を有意に改善し、光受容器の変性を遅らせることを明らかにした。

Claims (49)

1. Ｎ末端シグナル配列をコードする第２のヌクレオチド配列に作動可能に連結されたＲｄＣＶＦタンパク質のコード配列をコードするヌクレオチド配列を含有している核酸であって、ここでは、前記ＲｄＣＶＦコード配列が、配列番号１のヌクレオチド１０６〜７４１、配列番号１のヌクレオチド１０６〜４２９、配列番号３のヌクレオチド１０６〜４３２または配列番号３のヌクレオチド１０６〜７４４を含有しており、前記シグナル配列が、Ｉｇｋシグナル配列、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インシュリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）およびβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）からなる群より選択される、核酸。
2. 前記ＲｄＣＶＦタンパク質がＲｄＣＶＦ１タンパク質である、請求項１に記載の核酸。
3. 前記ＲｄＣＶＦタンパク質がＲｄＣＶＦ２タンパク質である、請求項１に記載の核酸。
4. 前記ＲｄＣＶＦタンパク質が短いバージョンのＲｄＣＶＦタンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸。
5. 前記ＲｄＣＶＦタンパク質が長いバージョンのＲｄＣＶＦタンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸。
6. 前記ＲｄＣＶＦタンパク質がヒトＲｄＣＶＦタンパク質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸。
7. 前記再コード化されたヌクレオチド配列が開始メチオニンコドンを欠いている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸。
8. 前記シグナル配列が配列番号１のヌクレオチド１〜１０５を含有している、請求項１に記載の核酸。
9. 前記シグナル配列が、配列番号１５、配列番号２のアミノ酸２〜３４、または配列番号２のアミノ酸７〜２１を含有しているアミノ酸配列をコードする、請求項１に記載の核酸。
10. 前記ヌクレオチド配列が配列番号１または３を含有している、請求項１に記載の核酸。
11. プロモーター配列が、前記ＲｄＣＶＦタンパク質の前記コード配列に作動可能に連結されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸。
12. 前記プロモーターがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである、請求項１１に記載の核酸。
13. 前記ＣＭＶプロモーターが配列番号１１の１５０〜８１２を含有している、請求項１２に記載の核酸。
14. イントロン配列が前記ＲｄＣＶＦタンパク質の前記コード配列に作動可能に連結されている、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の核酸。
15. 前記イントロン配列がβ−グロビンイントロン配列である、請求項１４に記載の核酸。
16. 前記イントロン配列が配列番号１１のヌクレオチド８２０〜１３１２を含有している、請求項１４に記載の核酸。
17. 前記核酸が、配列番号１１、配列番号１１の１５０〜２０８０のヌクレオチド配列、または配列番号１１の１５０〜８１２、８２０〜１３１２および１３４０〜２０８０のヌクレオチド配列を含有している、請求項１に記載の核酸。
18. 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の核酸を含有しているウイルスベクター。
19. 前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１８に記載のウイルスベクター。
20. 前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ血清型２をベースとしている、請求項１９に記載のウイルスベクター。
21. 前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ血清型８をベースとしている、請求項１９に記載のウイルスベクター。
22. 前記ウイルスベクターがウシ免疫不全ウイルスベクターではない、請求項１８に記載のウイルスベクター。
23. 前記ウイルスベクターが、ＤＮＡウイルスベクター、非エンベロープ型ウイルスベクター、およびアデノウイルスベクターからなる群より選択される、請求項１８に記載のウイルスベクター。
24. ＲｄＣＶＦタンパク質を分泌する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸を含有している単離された細胞。
25. 天然に存在するタンパク質ではない、請求項２４に記載の細胞により産生されたＲｄＣＶＦタンパク質。
26. （ｉ）薬学的に受容可能な担体、および（ｉｉ）請求項１〜１７のいずれか１項に記載の核酸、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載のウイルスベクター、請求項２５に記載のＲｄＣＶＦタンパク質、またはこれらの組み合わせを含有している、薬学的調製物。
27. ＲｄＣＶＦタンパク質を産生するための方法であって、前記方法は、請求項２４に記載の細胞を、前記ＲｄＣＶＦタンパク質の発現と分泌を可能にする条件下で培養する工程、および前記細胞の培養物から前記ＲｄＣＶＦタンパク質を単離する工程を含む、方法。
28. 前記細胞の培養物の上清からの前記ＲｄＣＶＦタンパク質の精製をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
29. 天然に存在するタンパク質ではない、請求項２７または２８に記載の方法により産生されたＲｄＣＶＦタンパク質。
30. 哺乳動物の眼において眼の桿体細胞を保存するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の核酸、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載のウイルスベクター、請求項２５または２９に記載のＲｄＣＶＦタンパク質、請求項２６に記載の薬学的調製物、あるいはそれらの組み合わせを含む組成物であって、前記組成物は、前記哺乳動物の前記眼に投与されることを特徴とする、組成物。
31. 前記組成物が、網膜下注射により投与されることを特徴とする、請求項３０に記載の組成物。
32. 前記組成物が、硝子体内注射、前房への注射、結膜下注射、またはテノン嚢下注射により投与されることを特徴とする、請求項３１に記載の組成物。
33. 前記哺乳動物がヒトである、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の組成物。
34. 前記哺乳動物が、網膜ジストロフィー、シュタルガルト病、網膜色素変性、ドライ型加齢性黄斑変性（ドライ型ＡＭＤ）、地図状萎縮（進行期のドライ型ＡＭＤ）、滲出型加齢性黄斑変性（滲出型ＡＭＤ）、緑内障／高眼圧症、糖尿病網膜症、バルデ・ビードル症候群、バッセン−コーンツバイク症候群、ベスト病、全脈絡膜萎縮（ｃｈｏｒｏｉｄｅｍａ）、脳回転状萎縮症、先天黒内障、レフサム病（ｒｅｆｓｕｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、アッシャー症候群、甲状腺関連眼疾患、グレーヴス病、網膜色素上皮細胞と関係がある疾患、前上葉区の疾患、水晶体疾患／白内障、眼杯の障害、またはぶどう膜炎からなる群より選択される眼疾患に罹患している、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
35. 前記投与の前には、保存される前記眼の桿体細胞が請求項１〜１７のいずれか１項に記載の核酸を含まず、また前記ウイルスベクターが形質導入されていない、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の組成物。
36. 哺乳動物の眼において眼の桿体細胞を保存するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の核酸、または請求項１８〜２３のいずれか１項に記載のウイルスベクターを含む組成物であって、前記組成物は、網膜下注射により投与され、前記桿体細胞が、前記網膜下注射の前記部位から少なくとも１ｍｍの部位で保存されることを特徴とする、組成物。
37. 前記桿体細胞が、前記網膜下注射の前記部位から少なくとも２ｍｍの部位で保存される、請求項３６に記載の組成物。
38. 細胞からＲｄＣＶＦタンパク質を分泌させるための、請求項８〜１０および１７のいずれか１項に記載の核酸、または請求項１８〜２３のいずれか１項に記載のウイルスベクターを含む組成物であって、前記組成物は、前記核酸または前記ウイルスベクターによりコードされるＲｄＣＶＦの発現および分泌を可能にする条件下で前記細胞に投与されることを特徴とする、組成物。
39. 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項３８に記載の組成物。
40. 前記細胞がヒト細胞である、請求項３８に記載の組成物。
41. 前記細胞が眼細胞である、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
42. 前記細胞が、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、桿体細胞、錐体細胞、双極細胞、水平細胞、無軸索細胞、神経節細胞、およびＡＲＰＥ−１９細胞からなる群より選択される、請求項４１に記載の組成物。
43. 前記細胞がインビトロにある、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の組成物。
44. 前記細胞がインビボにある、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の組成物。
45. 前記細胞がエクスビボにある、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の組成物。
46. 前記細胞が、２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＰｅｒＣ６細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＤＣＫ細胞、３Ｔ３細胞、およびＷＩ３８からなる群より選択される、請求項３９および４３〜４４のいずれか１項に記載の組成物。
47. 前記細胞が被包されている、請求項３８〜４６のいずれか１項に記載の組成物。
48. 疾患を処置するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の核酸、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載のウイルスベクター、請求項２５に記載のＲｄＣＶＦタンパク質、請求項２６に記載の薬学的調製物、またはそれらの組み合わせを含む組成物であって、前記組成物は、哺乳動物に投与され、ここで、前記疾患が、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、および嗅覚の疾患からなる群より選択されることを特徴とする、組成物。
49. 前記哺乳動物がヒトである、請求項４８に記載の組成物。