KR20220127847A - 뇌암을 치료하기 위해 혈액-뇌 장벽을 통해 면역요법제를 전달하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

뇌암을 치료하기 위해 혈액-뇌 장벽을 통해 면역요법제를 전달하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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펑펑 베이
이. 안토니오 치오카
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더 브리검 앤드 우먼즈 하스피털, 인크.
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Abstract

본 출원은 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 통한 면역요법제의 투과를 증진시키는 서열, 상기 서열을 포함하는 조성물, 및 뇌암, 예컨대, 교모세포종 (GBM)을 치료하기 위한 그의 사용 방법에 관한 것이다. 추가로, 아데노-연관 바이러스 (AAV)의 캡시드 내로 삽입되었을 때, BBB를 통한 투과를 증진시키는 것으로 확인된 다수의 잠재적 표적화 펩티드 서열을 개시한다.

Description

뇌암을 치료하기 위해 혈액-뇌 장벽을 통해 면역요법제를 전달하기 위한 방법 및 조성물
우선권 주장
본 출원은 2020년 1월 10일 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/959,625의 이익을 주장한다. 상기 가출원의 전체 내용은 본원에서 참조로 포함된다.
기술 분야
본원에서는 혈액 뇌 장벽을 통한 면역요법제의 투과를 증진시키는 서열, 상기 서열을 포함하는 조성물, 및 뇌암, 예컨대, 교모세포종 (GBM)을 치료하기 위한 그의 사용 방법을 기술한다.
다형성 교모세포종 (GBM)은 전체 생존 중앙값이 15개월에 불과한, 성인에서 가장 흔하고, 치명적인 뇌종양이다1. 미국에서는 매년 대략 12,000건의 신규 GBM 사례를 진단받고 있으며, 발병률은 인구 100,000명당 3.2명이다2. GBM의 조직학, 분자 환경 및 종양 미세환경을 이해하는 데 상당한 진전이 있었음에도 불구하고3 -6, 2005년 이후 치료적 발전은 거의 없었다. GBM에 대한 본 발명자들의 풍부한 지식을 효과적인 요법으로 전환하는 데 있어 중요한 장애물 중 하나는 GBM 종양 부위로의 비효율적인 약물 전달이다. 정맥내 투여는 이론적으로 GBM 종양이 구조상 잘 혈관화되기 때문에 우수한 종양 커버리지를 달성할 수 있는, 편리하고, 널리 적용가능한 약물 투여 경로이다7. 그러나, 혈액-뇌 장벽 (BBB) 및/또는 혈액-종양 장벽을 통과하는 약물을 디자인하는 것이 여전히 도전 과제로 남아있다.
교모세포종은 종래 방법으로는 치료하기 어려운 극도로 치명적인 뇌암이다. 전신 투여되는 암 유전자 요법은 교모세포종을 치료하기(tackling) 위한 새로운 치료 패러다임이다. 본원에서는 예컨대, 교모세포종의 치료를 위한 PD-L1 항체를 전신으로 전달하기 위해, 교모세포종 유전자 요법을 위한 혈관내 유전자 전달 플랫폼을 확립하도록 조작된 뇌-침투성 AAV 바이러스 벡터를 기술한다.
따라서, 본원에서는 대상체의 암에 면역요법제를 전달하는 방법을 제공한다. 본 방법은 대상체에게 (i) 서열 TVSALFK (서열식별번호(SEQ ID NO:) 8); TVSALK (서열식별번호 4); KLASVT (서열식별번호 83); 또는 KFLASVT (서열식별번호 84)로부터의 적어도 4개의 인접한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; 및 (ii) 면역요법제를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 아데노-연관 바이러스 (AAV)를 투여하는 단계를 포함하고, 임의적으로, 여기서, 암 세포는 인간 대상체의 뇌에 존재한다.
일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 TVSALK (서열식별번호 4); TVSALFK (서열식별번호 8); KLASVT (서열식별번호 83); 또는 KFLASVT (서열식별번호 84)로부터의 적어도 5개의 인접한 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 TVSALK (서열식별번호 4); TVSALFK (서열식별번호 8); KLASVT (서열식별번호 83); 또는 KFLASVT (서열식별번호 84)로부터의 적어도 6개의 인접한 아미노산을 포함한다.
본원에서는 또한 대상체의 암에 면역요법제를 전달하는 방법도 제공한다. 본 방법은 대상체에게 (i) 서열 V[S/p][A/m/t/]L (서열식별번호 79), TV[S/p][A/m/t/]L (서열식별번호 80), TV[S/p][A/m/t/]LK (서열식별번호 81), 또는 TV[S/p][A/m/t/]LFK (서열식별번호 82)로부터의 적어도 4개의 인접한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; 및 (ii) 면역요법제를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 아데노-연관 바이러스 (AAV)를 투여하는 단계를 포함하고, 임의적으로, 여기서, 암 세포는 인간 대상체의 뇌에 존재한다.
일부 실시양태에서, 표적화 서열은 VPALR (서열식별번호 1); VSALK (서열식별번호 2); TVPALR (서열식별번호 3); TVSALK (서열식별번호 4); TVPMLK (서열식별번호 12); TVPTLK (서열식별번호 13); FTVSALK (서열식별번호 5); LTVSALK (서열식별번호 6); TVSALFK (서열식별번호 8); TVPALFR (서열식별번호 9); TVPMLFK (서열식별번호 10) 또는 TVPTLFK (서열식별번호 11)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역요법제를 코딩하는 트랜스진은 항체 표적화 PD-1 또는 PD-L1을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물 대상체이다.
일부 실시양태에서, AAV는 AAV9이다.
일부 실시양태에서, AAV9는 AAV9 VP1을 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적화 서열은 서열식별번호 85를 포함하는 AAV9 VP1의 아미노산 588 및 589에 상응하는 위치에 삽입된다.
일부 실시양태에서, 세포는 대상체의 뇌에 존재하고, AAV는 비경구 전달; 대뇌내; 또는 척추강내 전달에 의해 투여된다.
일부 실시양태에서, 비경구 전달은 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내, 또는 근육내 전달을 통해 이루어진다.
일부 실시양태에서, 척추강내 전달은 요추 주사, 대수조 주사, 또는 실질내 주사를 통해 이루어진다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 대상체에게 화학요법, 방사선 및/또는 외과적 절제술을 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 화학요법은 테모졸아미드, 로무스틴, 또는 그의 조합을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에 사용하기 위한 방법 및 물질은 본원에 기술되어 있으며; 관련 기술분야에 공지된 다른 적합한 방법 및 물질 또한 사용될 수 있다. 물질, 방법 및 예는 단지 예시일 뿐이며, 제한하고자 하는 것은 아니다. 본원에서 언급된 모든 공개문헌, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 엔트리 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 상충하는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 도면으로부터, 및 청구범위로부터 자명해질 것이다.
도 1a-1c는 세포-침투성 펩티드 (CPP)를 그의 캡시드에 삽입함으로써 AAV9를 조작하는 예시적인 전략법을 도시한 것이다. 도 1a는 AAV9 바이러스의 3D 모델이다. 아미노산 588 및 589 (VP1 넘버링) 사이의 캡시드 내에 삽입된 개별 CPP는 아마도 수용체 결합이 발생하는 3중 축에 표시된다. 도 1b는 개별 AAV 제조 방법을 예시한 것이다. (조작되거나, 또는 조작되지 않은) pRC, pHelper 및 pAAV를 포함한 3개의 플라스미드를 HEK 293T 세포에 공동 형질감염시키고, 아이오딕사놀 구배를 사용하여 AAV를 수확하고, 정제시킨다. 도 1c는 항-PDL1 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 예시적인 벡터의 벡터 다이어그램이다.
도 2a-2b는 저용량 후보 AAV의 정맥내 투여 후 마우스 뇌 절편 (도 2a) 및 그의 정량적 분석 (도 2b)의 대표적인 이미지를 도시한 것이다. 혼합 유전 배경을 가진 마우스가 사용된다. 후보 AAV는 그의 삽입된 CPP가 다르지만 (표 3 참조), 이들은 모두 리포터로서 핵 적색 형광 단백질 (RFP)을 발현한다. 생산 수율이 낮은 후보 AAV는 추가 스크리닝을 위해 배제된다. AAV의 용량은 동물당 1x1010 vg (바이러스 게놈)이다. 도 2a에서 각각의 흰색 도트는 RFP 표지된 세포를 나타낸다. 도 2b에서, * P< 0.05 (AAV9 대비), ANOVA.
도 2c-2d는 반복 실험에서 AAV.CPP.11 및 AAV.CPP.12의 정맥내 투여 후의 마우스 뇌 절편 (도 2c) 및 그의 정량적 분석 (도 2d)의 대표적인 이미지를 도시한 것이다. AAV.CPP.11 및 AAV.CPP.12는 각각 CPP BIP1 및 BIP2를 포함한다 (표 3 참조). AAV의 용량은 동물당 1x1011 vg로 증가된다. 후보 AAV는 리포터로서 핵 적색 형광 단백질 (RFP)을 발현한다. 도 2c에서 각각의 흰색 도트는 RFP 표지된 세포를 나타낸다. 도 2d에서, * P< 0.05, ** P< 0.01 (AAV9 대비), ANOVA.
도 3a는 더 우수한 뇌 형질도입을 위해 AAV9를 추가로 조작하기 위한 BIP 표적화 서열의 최적화를 도시한 것이다. AAV9가 (AAV.CPP.11에서와 같이) 뇌를 더욱 효율적으로 형질도입할 수 있게 하는 BIP1 (VPALR, 서열식별번호 1)은 래트의 단백질 Ku70으로부터 유래된 것이다. 인간, 마우스 및 래트 Ku70 단백질은 그의 정확한 아미노산 서열이 상이하다. AAV.CPP.12에서와 같은 BIP2 (VSALK, 서열식별번호 2)는 BIP1과 관련된 "합성" 펩티드이다. 추가 조작은 최종 조작된 AAV의 종 특이성을 최소화하기 위해 VSALK 서열에 대해 중점적으로 이루어진다. 새로운 표적화 서열을 생성하기 위해, 관심 아미노산을 VSALK 서열에 부가하고, 다른 경우에는 개별 아미노산의 위치를 교환한다. 새로운 BIP2 유래 서열을 모두 다시 AAV9 캡시드에 삽입하여 스크리닝을 위한 새로운 후보 AAV를 생성한다. 출현 순서대로 서열은 서열식별번호 69, 70, 71, 1-6, 72, 7, 및 8이다.
도 3b-3c는 더 많은 후보 AAV의 정맥내 투여 후의 마우스 뇌 절편 (도 3b) 및 그의 정량적 분석 (도 3c)의 대표적인 이미지를 도시한 것이다. 모든 후보 AAV는 리포터로서 핵 적색 형광 단백질 (RFP)을 발현한다. AAV의 용량은 동물당 1x1011 vg이다. 도 3b에서 각각의 흰색 도트는 RFP 표지된 세포를 나타낸다. AAV.CPP.16 및 AAV.CPP.21은 그의 강건하고 광범위한 뇌 형질도입을 보이는 상위 히트인 것으로 확인되었다. 도 3c에서, * P< 0.05, ** P< 0.01, *** P< 0.001 (AAV9 대비), ANOVA.
도 3d는 후보 AAV의 정맥내 투여 후의 간에서의 형질도입률의 정량적 분석을 도시한 것이다. 형질도입된 간 세포의 비율(%)이 제시되어 있다. AAV의 용량은 동물당 1x1011 vg이다. *** P< 0.001 (AAV9 대비), ANOVA.
도 4a-4e는 인간 혈액-뇌 장벽의 시험관내 스페로이드 모델에서의 선택된 후보 AAV의 스크리닝을 도시한 것이다. 도 4a는 표면에 장벽을 형성하는 인간 미세혈관 내피 세포, 및 스페로이드에 인간 혈관주위세포 및 성상세포를 포함하는 스페로이드를 도시한 것이다. 주변 배지로부터 스페로이드 내부로 침투할 수 있고, 세포 내부로 형질도입할 수 있는 그의 능력에 대해 후보 AAV를 평가하였다. 도 4b-4d는 AAV9 (도 4b), AAV.CPP.16 (도 4c) 및 AAV.CPP.21 (도 4d)로 처리된 스페로이드의 이미지를 보여주는 것이다. 도 4e는 상이한 AAV로 처리된 스페로이드의 상대적인 RFP 강도를 보여주는 것이다. *** P< 0.001 (AAV9 대비), ANOVA.
도 5a-5b는 C57BL/6J 근친교배 마우스에서의 AAV9, AAV.CPP.16 및 AAV.CPP.21의 정맥내 투여 후의 뇌 절편 (도 5a) 및 그의 정량적 분석 (도 5b)의 대표적인 이미지를 도시한 것이다. 모든 후보 AAV는 리포터로서 핵 적색 형광 단백질 (RFP)을 발현한다. AAV의 용량은 동물당 1x1012 vg이다. 도 5a에서 각각의 흰색 도트는 RFP 표지된 세포를 나타낸다. 도 5b에서, * P< 0.05, *** P< 0.001, ANOVA.
도 6a-6b는 BALB/cJ 근친교배 마우스에서의 AAV9, AAV.CPP.16 및 AAV.CPP.21의 정맥내 투여 후의 뇌 절편 (도 6a) 및 그의 정량적 분석 (도 6b)의 대표적인 이미지를 도시한 것이다. 모든 후보 AAV는 리포터로서 핵 적색 형광 단백질 (RFP)을 발현한다. AAV의 용량은 동물당 1x1012 vg이다. 도 6a에서 각각의 흰색 도트는 RFP 표지된 세포를 나타낸다. 도 6b에서, *** P< 0.001, ANOVA.
도 7a-7b는 C57BL/6J 근친교배 마우스에서의 고용량 AAV.CPP.16 및 AAV.CPP.21의 정맥내 투여 후의 뇌 절편 (도 7a) 및 그의 정량적 분석 (도 7b)의 대표적인 이미지를 도시한 것이다. 두 후보 AAV 모두 리포터로서 핵 적색 형광 단백질 (RFP)을 발현한다. AAV의 용량은 동물당 4x1012 vg이다. 도 7a에서 각각의 흰색 도트는 RFP 표지된 세포를 나타낸다. 도 7b에서, * P< 0.05, 스튜던트 검정.
도 8a는 AAV.CPP.16 및 AAV.CPP.21이 피질, 중뇌 및 해마를 포함하는 마우스의 다중 뇌 영역에 걸쳐 성체 뉴런 (NeuN 항체에 의해 표지)을 형질도입한다는 것을 보여주는 것이다. 형질도입된 뉴런은 NeuN 항체 및 RFP에 의해 공동 표지된 것이다. 4x1012 vg의 AAV를 성체 C57BL/6J 마우스 (6주령)에 정맥내로 투여하였다.
도 8b는 AAV.CPP.16 및 AAV.CPP.21이 마우스에서 척수 및 운동 뉴런을 표적화하는 데 있어서 AAV9에 비해 증진된 능력을 나타낸다는 것을 도시한 것이다. 4x1010 vg의 AAV를 신생아 마우스 (생후 1일)에 정맥내로 투여하였다. CHAT 항체 염색을 사용하여 척수의 전각에 있는 운동 뉴런을 시각화하였다. RFP 및 CHAT 신호의 공동 국재화는 운동 뉴런의 특이적인 형질도입을 시사하는 것이다.
도 9a는 AAV.CPP.16이 성체 마우스에서 심장을 표적화하는 데 있어서 AAV9 대비 증진된 능력을 나타낸다는 것을 도시한 것이다. 1x1011 vg의 AAV를 성체 C57BL/6J 마우스 (6주령)에 정맥내로 투여하였다. 모든 DAPI 염색된 세포 대비 RFP 표지된 세포의 비율(%)이 제시되어 있다. * P< 0.05, 스튜던트 검정.
도 9b는 AAV.CPP.16이 성체 마우스에서 골격근을 표적화하는 데 있어서 AAV9 대비 증진된 능력을 나타낸다는 것을 도시한 것이다. 1x1011 vg의 AAV를 성체 C57BL/6J 마우스 (6주령)에 정맥내로 투여하였다. 모든 DAPI 염색된 세포 대비 RFP 표지된 세포의 비율(%)이 제시되어 있다. * P< 0.05, 스튜던트 검정.
도 9c는 AAV.CPP.16이 성체 마우스에서 후근 신경절 (DRG)을 표적화하는 데 있어서 AAV9 대비 증진된 능력을 나타낸다는 것을 도시한 것이다. 1x1011 vg의 AAV를 성체 C57BL/6J 마우스 (6주령)에 정맥내로 투여하였다. 모든 DAPI 염색된 세포 대비 RFP 표지된 세포의 비율(%)이 제시되어 있다. * P< 0.05, 스튜던트 검정.
도 10a는 AAV.CPP.16 및 AAV.CPP.21이 비-인간 영장류에서의 정맥내 투여 후의 1차 시각 피질에서의 뇌 세포를 형질도입할 수 있는 능력에 있어서 AAV9 대비 증진된 능력을 나타낸다는 것을 도시한 것이다. (리포터 유전자로서) 2 x 1013 vg/kg AAVs-CAG-AADC를 기존 중화 항체가 낮은 3개월된 시노몰구스 원숭이에 정맥내로 주사하였다. AAV 형질도입된 세포 (검정색으로 표시)는 AADC에 대한 항체 염색을 사용하여 시각화하였다. 좌측 패널의 사각형으로 표시된 영역은 우측 패널에 확대하여 제시되어 있다. AAV.CPP.16은 AAV9 대비 유의적으로 더 많은 세포를 형질도입하였다. AAV.CPP.21 또한 AAV.CPP.16과 비교하여 그 효과가 덜 분명했지만, AAV9 대비 더 많은 세포를 형질도입하였다.
도 10b는 AAV.CPP.16 및 AAV.CPP.21이 비-인간 영장류에서의 정맥내 투여 후의 두정 피질에서의 뇌 세포를 형질도입할 수 있는 능력에 있어서 AAV9 대비 증진된 능력을 나타낸다는 것을 도시한 것이다. (리포터 유전자로서) 2 x 1013 vg/kg AAVs-CAG-AADC를 기존 중화 항체가 낮은 3개월된 시노몰구스 원숭이에 정맥내로 주사하였다. AAV 형질도입된 세포 (검정색으로 표시)는 AADC에 대한 항체 염색을 사용하여 시각화하였다. 좌측 패널의 사각형으로 표시된 영역은 우측 패널에 확대하여 제시되어 있다. AAV.CPP.16은 AAV9 대비 유의적으로 더 많은 세포를 형질도입하였다. AAV.CPP.21 또한 AAV.CPP.16과 비교하여 그 효과가 덜 분명했지만, AAV9 대비 더 많은 세포를 형질도입하였다.
도 10c는 AAV.CPP.16 및 AAV.CPP.21이 비-인간 영장류에서의 정맥내 투여 후의 시상에서의 뇌 세포를 형질도입할 수 있는 능력에 있어서 AAV9 대비 증진된 능력을 나타낸다는 것을 도시한 것이다. (리포터 유전자로서) 2 x 1013 vg/kg AAVs-CAG-AADC를 기존 중화 항체가 낮은 3개월된 시노몰구스 원숭이에 정맥내로 주사하였다. AAV 형질도입된 세포 (검정색으로 표시)는 AADC에 대한 항체 염색을 사용하여 시각화하였다. 좌측 패널의 사각형으로 표시된 영역은 우측 패널에 확대하여 제시되어 있다. AAV.CPP.16은 AAV9 대비 유의적으로 더 많은 세포를 형질도입하였다. AAV.CPP.21 또한 AAV.CPP.16과 비교하여 그 효과가 덜 분명했지만, AAV9 대비 더 많은 세포를 형질도입하였다.
도 10d는 AAV.CPP.16 및 AAV.CPP.21이 비-인간 영장류에서의 정맥내 투여 후의 소뇌에서의 뇌 세포를 형질도입할 수 있는 능력에 있어서 AAV9 대비 증진된 능력을 나타낸다는 것을 도시한 것이다. (리포터 유전자로서) 2 x 1013 vg/kg AAVs-CAG-AADC를 기존 중화 항체가 낮은 3개월된 시노몰구스 원숭이에 정맥내로 주사하였다. AAV 형질도입된 세포 (검정색으로 표시)는 AADC에 대한 항체 염색을 사용하여 시각화하였다. 좌측 패널의 사각형으로 표시된 영역은 우측 패널에 확대하여 제시되어 있다. AAV.CPP.16 및 AAV.CPP.21, 둘 모두 AAV9 대비 유의적으로 더 많은 세포를 형질도입하였다.
도 11a-11b는 AAV.CPP.16 및 AAV.CPP.21이 LY6A에 결합하지 않는다는 것을 도시한 것이다. LY6A는 (US9102949, US20170166926에서와 같이) AAV.PHP.B 및 AAV.PHP.eB를 포함한 그의 변이체에 대한 수용체로서 작용하고, 특정 마우스 계통에서 BBB를 통과하는 데 있어서 AAV.PHP.eB의 강건한 효과를 매개한다 (Hordeaux et al. Mol Ther 2019 27(5):912-921; Huang et al. 2019, dx.doi.org/10.1101/538421). 배양된 293 세포에서의 마우스 LY6A 과다발현은 AAV.PHP.eB의 세포 표면에의 결합을 유의적으로 증가시킨다 (도 11a). 반대로, LY6A 과다발현은 AAV9, AAV.CPP.16 또는 AAV.CPP.21에 대한 바이러스 결합은 증가시키지 않는다 (도 11b). 이는 AAV.CPP.16 또는 AAV.CPP.21이 수용체로서 AAV.PHP.eB와 LY6A를 공유하지 않는다는 것을 시사한다.
도 12a-12c는 AAV.CPP.21이 교모세포종 (GBM) 마우스 모델에서 뇌 종양 내로 치료 유전자를 전신적으로 전달하는 데 사용될 수 있다는 것을 도시한 것이다. 도 11a에서와 같이, 정맥내로 투여된 AAV.CPP.21-H2BmCherry는 종양 매스, 특히, 종양 확장 경계를 표적화하는 것으로 나타났다 (도 12a). 도 11b (이미지) 및 도 11c (정량적 분석)에서, AAV.CPP.21을 사용하여 "자살 유전자" HSV.TK1을 전신 전달할 때, 프로드럭 간시클로비르와 조합하는 경우, 그 결과로 뇌 종양 매스를 수축시킨다. HSV.TK1은 다르게는 "휴면" 간시클로비르를 종양 사멸 약물로 전환시킨다. * P< 0.05, 스튜던트 검정.
도 13은 AAV.CPP.21이 성체 마우스 뇌로 국부적으로 주사되었을 때, AAV9와 비교하여 뇌 조직에의 더욱 광범위하고, 강건한 형질도입을 초래하였다는 것을 도시한 것이다. 성체 마우스 (>6주령)에서 AAV (1x1011 vg)의 대뇌내 주사를 수행하고, AAV 주사 후 3주째에 뇌 조직을 수확하고, 검사하였다. ** P< 0.01, 스튜던트 검정.
도 14는 AAV9 (상단) 및 AAV.CPP16 (하단)을 사용한 마우스 모델에서의 GBM 종양 미세환경에의 전달 효율을 비교한 이미지 세트이다. 삽입도 (우측)에서 알 수 있는 바와 같이, AAV.CPP16이 더 큰 전달 효능을 제공하였다.
도 15a-c는 AAV.CPP.16-항PD-L1 매개 면역요법이 뮤린 GBM 모델에서 생존을 연장시켰다는 것을 보여주는 것이다. 도 15a, 실험 프로토콜의 개략도. 도 15b, 명시된 바와 같이 처리된 동물에서의 생존. 도 15c, AAV.CPP16-항-PDL1로 처리된 동물에서의 장기간 생존. LTS: 장기간 생존.
도 16a-c는 GBM 종양이 장기간 생존한 모든 마우스에서 근절되었다는 것을 보여주는 것이다. 도 16a, 종양 주사 부위의 후방 및 전방, 둘 모두의 뇌 절편의 H&E 염색. 어느 절편에도 잔여 GBM은 없음. 도 16b, 초기 종양 이식의 성공을 시사하는 종양 이식 후 7일째의 생물발광 이미징. 도 16c, 반흔-유사 조직이 있는 GBM 종양 이식 부위.
도 17a-17b는 웨스턴 블롯팅에 의해 측정된 GBM 종양 중 HA-태그부착된 항PD-L1 항체의 발현을 보여주는 것이다. 1e12 vg의 AAV 또는 PBS를 마우스에 종양 이식 후 5일째 정맥내로 주사하였다. IV 주사 후 14일째 종양 조직을 수확하였다. 항PD-L1 항체 발현 (도 17b)의 측정으로서 HA 태그 염색 강도 (도 17a)를 정량화하였다.
BBB를 통한 전달과 연관된 난관은 암을 비롯한 뇌 장애 치료를 위한 치료제 개발을 방해하였다. 아데노-연관 바이러스 (AAV)가 뇌, 척수 및 눈에 치료 유전자를 전달하기 위한 중요한 연구 및 임상 도구로 부상하였고; 예컨대, US9102949; US 9585971; 및 US20170166926을 참조한다. AAV에 의해 매개되는 유전자 요법은 최근 룩스투나(Luxturna) 및 졸겐스마(Zolgensma)의 승인으로 상당한 진전을 이루었다. 2세 미만 척수성 근위축증 환자의 혈관내 치료를 위한 졸겐스마의 승인은 중추 신경계 (CNS)의 전신 유전자 요법을 위한 BBB-통과 AAV 벡터의 사용 가능성을 보여주기 때문에 특히 고무적이다. 젊은 환자에서의 성공에도 불구하고, 졸겐스마에서 사용되는 AAV 혈청형인 AAV9는 특히 성인에서 BBB 통과 효율이 낮아 다른 CNS 질환에 대한 그의 적용을 제한한다8 , 9. 본원에서는 GBM 암 유전자 요법을 위한 새로운 BBB-통과 AAV 플랫폼에 사용될 수 있는, 설치류 및 비-인간 영장류, 둘 모두에서 현행 산업 표준 (즉, AAV9)에 비해 적어도 5-10배 증진을 달성하는 차세대 뇌-침투성 AAV 벡터 (즉, AAV.CPP16)를 기술한다.
공지된 세포-침투성 펩티드 (CPP) (예컨대, 문헌 [Gomez et al., Bax -inhibiting peptides derived from Ku70 and cell-penetrating pentapeptides . Biochem. Soc. Trans. 2007;35(Pt 4):797-801] 참조)를 기반으로 한 합리적인 디자인 및 표적화된 스크리닝을 통해, 표적 서열이 AAV의 캡시드로 조작될 때, 뇌로의 유전자 전달 효율을 최대 103배만큼 증진시킨 표적화 서열이 발견되었다. 이러한 방법을 사용하여 교모세포종 동물 모델에서 종양 크기를 극적으로 감소시키는 AAV 벡터를 조작하였다.
추가로, 뇌는 "면역 특권"이 있기 때문에, GBM의 면역요법은 도전과제로서 어려워질 수 있다. 면역 반응을 "프라이밍"하는 것은 면역학상 "냉담한" GBM 종양을 면역원성인 "핫한" 종양으로 전환시키는 데 바람직하다. 본 방법은 예컨대, 항-PD-L1 항체를 달성할 수 있는 면역요법제를 전달하기 위해 본원에 기술된 벡터를 사용한다. 이론에 얽매이지 않고, AAV 벡터 자체는 세포독성 T 세포의 종양 침윤을 증가시킴으로써 면역계를 "프라이밍"하는 반면, 종양 부위, 및 대체로 CNS에서 발현된 항PD-L1 항체는 다르게 "고갈된" T 세포를 활성화시키는 것으로 여겨진다.
표적화 서열
본 방법은 예컨대, AAV, 예컨대, AAV1, AAV2, AAV8, 또는 AAV9의 캡시드 내로 삽입되었을 때, 또는 화학적으로 또는 융합 단백질로서의 발현을 통해 생물학적 작용제, 예컨대, 항체 또는 다른 큰 생체분자에 접합되었을 때, BBB를 통한 투과를 증진시키는 다수의 잠재적 표적화 펩티드를 확인하였다.
일부 실시양태에서, 표적화 펩티드는 적어도 5개의 아미노산으로 이루어진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 VPALR (서열식별번호 1) 및 VSALK (서열식별번호 2)의 적어도 4개, 예컨대, 5개의 인접한 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적화 펩티드는 X1 X2 X3 X4 X5의 서열을 포함하고, 여기서,
(i) X1, X2, X3, X4는 V, A, L, I, G, P, S, T, 또는 M의 임의의 4개의 동일하지 않은 아미노산이고;
(ii) X5는 K, R, H, D, 또는 E (서열식별번호 73)이다.
일부 실시양태에서, 표적화 펩티드는 적어도 6개의 아미노산으로 이루어진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 TVPALR (서열식별번호 3), TVSALK (서열식별번호 4), TVPMLK (서열식별번호 12) 및 TVPTLK (서열식별번호 13)의 적어도 4개, 예컨대, 5 또는 6개의 인접한 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적화 펩티드는 X1 X2 X3 X4 X5 X6의 서열을 포함하고, 여기서,
(i) X1은 T이고;
(ii) X2, X3, X4, X5는 V, A, L, I, G, P, S, T, 또는 M의 임의의 4개의 동일하지 않은 아미노산이고;
(iii) X6은 K, R, H, D, 또는 E (서열식별번호 74)이다.
일부 실시양태에서, 표적화 펩티드는 X1 X2 X3 X4 X5 X6의 서열을 포함하고, 여기서,
(i) X1, X2, X3, X4는 V, A, L, I, G, P, S, T, 또는 M으로부터의 임의의 4개의 동일하지 않은 아미노산이고;
(ii) X5는 K, R, H, D, 또는 E이고;
(iii) X6은 E 또는 D (서열식별번호 75)이다.
일부 실시양태에서, 표적화 펩티드는 적어도 7개의 아미노산으로 이루어진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 FTVSALK (서열식별번호 5), LTVSALK (서열식별번호 6), TVSALFK (서열식별번호 8), TVPALFR (서열식별번호 9), TVPMLFK (서열식별번호 10) 및 TVPTLFK (서열식별번호 11)의 적어도 4개, 예컨대, 5, 6, 또는 7개의 인접한 아미노산을 포함한다. 일부 다른 실시양태에서, 표적화 펩티드는 X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7의 서열을 포함하고, 여기서,
(i) X1은 F, L, W, 또는 Y이고;
(ii) X2는 T이고;
(iii) X3, X4, X5, X6은 V, A, L, I, G, P, S, T, 또는 M의 임의의 4개의 동일하지 않은 아미노산이고;
(iv) X7은 K, R, H, D, 또는 E (서열식별번호 76)이다.
일부 실시양태에서, 표적화 펩티드는 X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7의 서열을 포함하고, 여기서,
(i) X1은 T이고;
(ii) X2, X3, X4, X5는 V, A, L, I, G, P, S, T, 또는 M의 임의의 4개의 동일하지 않은 아미노산이고;
(iii) X6은 K, R, H, D, 또는 E이고;
(iv) X7은 E 또는 D (서열식별번호 77)이다.
일부 실시양태에서, 표적화 펩티드는 X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7의 서열을 포함하고, 여기서,
(i) X1, X2, X3, X4는 V, A, L, I, G, P, S, T, 또는 M의 임의의 4개의 동일하지 않은 아미노산이고;
(ii) X5는 K, R, H, D, 또는 E이고;
(iii) X6은 E 또는 D이고;
(iv) X7은 A 또는 I (서열식별번호 78)이다.
일부 실시양태에서, 표적화 펩티드는 V[S/p][A/m/t/]L의 서열 (서열식별번호 79)을 포함하고, 여기서, 해당 위치에서는 대문자가 그 위치에서 바람직하다. 일부 실시양태에서, 표적화 펩티드는 TV[S/p][A/m/t/]L의 서열 (서열식별번호 80)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 펩티드는 TV[S/p][A/m/t/]LK의 서열 (서열식별번호 81)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 펩티드는 TV[S/p][A/m/t/]LFK의 서열 (서열식별번호 82)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적화 펩티드는 VPALR (서열식별번호 1) 또는 VSALK (서열식별번호 2)로 이루어지지 않는다.
상기 언급된 5, 6, 또는 7-아미노산 서열을 포함하는 구체적인 아미노산 서열의 예가 표 1에 열거되어 있다.
표 1 - 표적화 서열
Figure pct00001
Figure pct00002
역 서열을 포함하는 표적화 펩티드, 예컨대, KLASVT (서열식별번호 83) 및 KFLASVT (서열식별번호 84) 또한 사용될 수 있다.
본원에 개시된 표적화 펩티드는 관련 기술분야에 공지된 펩티드모방체 제조 방법에 따라 변형될 수 있다. 예컨대, 문헌 [Qvit et al., Drug Discov Today. 2017 Feb; 22(2): 454-462]; [Farhadi and Hashemian, Drug Des Devel Ther. 2018; 12: 1239-1254]; [Avan et al., Chem. Soc. Rev., 2014,43, 3575-3594]; [Pathak, et al., Indo American Journal of Pharmaceutical Research, 2015. 8; Kazmierski, W.M., ed., Peptidomimetics Protocols, Human Press (Totowa NJ 1998)]; [Goodman et al., eds., Houben-Weyl Methods of Organic Chemistry: Synthesis of Peptides and Peptidomimetics, Thiele Verlag (New York 2003)]; 및 [Mayo et al., J. Biol. Chem., 278:45746 (2003)]을 참조한다. 일부 경우에서, 본원에 개시된 펩티드 및 단편의 이러한 변형된 펩티드모방체 버전은 비-펩티드모방체 펩티드에 비해 생체내에서 증진된 안정성을 나타낸다.
펩티드모방체 생성 방법은 펩티드 서열 중의 하나 이상의 아미노산, 예컨대, 아미노산 모두를 D-아미노산 거울상이성질체로 치환하는 것을 포함한다. 상기 서열은 본원에서 "레트로" 서열로 지칭된다. 또 다른 방법에서, 원래 펩티드의 N-말단에서 C-말단으로의 아미노산 잔기 순서가 변형된 펩티드모방체에서는 C-말단에서 N-말단으로의 아미노산 잔기 순서가 되도록 N-말단에서 C-말단으로의 아미노산 잔기의 순서가 역전된다. 상기 서열은 "인버소" 서열로 지칭될 수 있다.
펩티드모방체는 레트로 및 인버소 버전, 둘 모두, 즉, 본원에 개시된 펩티드의 "레트로-인버소" 버전일 수 있다. 새로운 펩티드모방체는 펩티드모방체에서 N-말단에서 C-말단으로의 아미노산 잔기 순서가 원래 펩티드에서의 C-말단에서 N-말단으로의 아미노산 잔기 순서에 상응하도록 배열된 D-아미노산으로 구성될 수 있다.
펩티드모방체를 제조하는 다른 방법은 펩티드 중 하나 이상의 아미노산 잔기를 화학적으로 구별되지만, 기능상으로는 인정되는, 아미노산의 기능적 유사체, 즉, 인공 아미노산 유사체로 대체하는 것을 포함한다. 인공 아미노산 유사체로는 β-아미노산, β-치환된 β-아미노산 ("β3-아미노산"), 아미노산의 인 유사체, 예컨대, ∀-아미노 포스폰산 및 ∀-아미노 포스핀산, 및 비펩티드 결합을 갖는 아미노산을 포함한다. 인공 아미노산을 사용하여 펩티드모방체, 예컨대, 펩토이드 올리고머 (예컨대, 펩토이드 아미드 또는 에스테르 유사체), β-펩티드, 시클릭 펩티드, 올리고우레아 또는 올리고카르바메이트 펩티드; 또는 헤테로시클릭 고리 분자를 생성할 수 있다. 예시적인 레트로-인버소 표적화 펩티드모방체로는 KLASVT 및 KFLASVT를 포함하며, 여기서, 서열은 모든 D-아미노산을 포함한다. 상기 서열은 예컨대, 아미노 말단의 비오틴화 및 카르복시 말단의 아미드화에 의해 변형될 수 있다.
AAV
본 방법 및 조성물에서 사용하기 위한 바이러스 벡터는 본원에 기술된 표적화 펩티드 및 임의적으로, 표적 조직에서의 발현을 위한 트랜스진을 포함하는, 재조합 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 알파바이러스 및 렌티바이러스를 포함한다.
본 방법에서 핵산의 전달에 유용한 바람직한 바이러스 벡터 시스템은 아데노-연관 바이러스 (AAV)이다. AAV는 25 nm의 캡시드를 갖는 외피가 없는 작은 바이러스이다. 야생형 바이러스와 연관된 것으로 알려졌거나, 또는 그러한 것으로 밝혀진 질환은 없다. AAV는 단일 가닥 DNA (ssDNA) 게놈을 가지고 있다. AAV는 장기간 에피솜 트랜스진 발현을 나타내는 것으로 나타났으며, AAV는 뇌에서, 특히, 뉴런에서 탁월한 트랜스진 발현을 보였다. AAV의 최소 300개 염기쌍을 포함하는 벡터를 패키징될 수 있고,통합할 수 있다. 외인성 DNA를 위한 공간은 약 4.7 kb로 제한된다. 예컨대, 문헌 [Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985)]에 기술된 것과 같은 AAV 벡터는 DNA를 세포 내로 도입하는 데 사용될 수 있다. 다양한 핵산이 AAV 벡터를 사용하여 상이한 세포 유형 내로 도입되었다 (예를 들어, 문헌 [Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470 (1984)]; [Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1985)]; [Wondisford et al., Mol. Endocrinol. 2:32-39 (1988)]; [Tratschin et al., J. Virol. 51:611-619 (1984)]; 및 [Flotte et al., J. Biol. Chem. 268:3781-3790 (1993)] 참조). 대안적 AAV 변이체가 다수 존재하며 (100개가 넘는 변이체가 클로닝되었다), AAV 변이체는 바람직한 특성에 기초하여 확인되었다. 일부 실시양태에서, AAV는 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, rh.10, rh.39, rh.43 또는 CSp3이고; CNS 용도로는 일부 실시양태에서, AAV는 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, 또는 AAV9이다. 한 예로서, AAV9는 혈액-뇌 장벽을 다소 효율적으로 통과하는 것으로 나타났다. 본 방법을 사용하여, AAV 캡시드는 본원에 기술된 바와 같은 표적화 서열을 캡시드 단백질 내로, 예컨대, AAV9 캡시드 단백질 VP1 내 아미노산 588 및 589 사이로의 삽입에 의해 BBB 통과, 또는 특정 조직 내로의 투과를 증가시키도록 유전적으로 조작될 수 있다.
예시적인 야생형 AAV9 캡시드 단백질 VP1 (Q6JC40-1) 서열은 하기와 같다:
Figure pct00003
.
따라서, 본원에서는 본원에 기술된 표적화 펩티드 서열 중 하나 이상을 포함하는 AAV, 예컨대, 본원에 기술된 표적화 서열을 포함하는 캡시드 단백질, 예컨대, 서열식별번호 1을 포함하는 캡시드 단백질을 포함하는 AAV로서, 여기서, 표적화 펩티드 서열이 예컨대, 아미노산 588 및 589 사이의 서열에 삽입된 것인 AAV를 제공한다.
면역치료 트랜스진
일부 실시양태에서, AAV는 또한 예컨대, 본원에 기술되거나, 또는 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 면역요법제를 코딩하는 트랜스진 서열 (즉, 이종성 서열)을 포함한다. 트랜스진은 바람직하게는 표적 조직에서 트랜스진의 발현을 촉진/구동시키는 서열에 연결된다.
면역요법제로 사용하기 위한 예시적인 트랜스진은 면역 체크포인트 억제 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 예컨대, 체크포인트 억제제로서 작용하는 단일 쇄 가변 단편 (scFv) 항체를 코딩하는 것을 포함한다.
면역요법의 예로는 T 림프구가 암 세포를 인식하도록 유도하도록 디자인된 입양 T 세포 요법 또는 암 백신 제제 뿐만 아니라, 체크포인트 억제제, 예컨대, 항-CD137 항체 (예컨대, BMS-663513), 항-PD1 항체 (예컨대, 니볼루맙(Nivolumab), 펨브롤리주맙/MK-3475, 피딜리주맙(Pidilizumab) (CT-011)), 항-PDL1 항체 (예컨대, BMS-936559, MPDL3280A), 또는 항-CTLA-4 항체 (예컨대, 이필리무맙; 예컨대, 문헌 [Kruger et al. (2007) Histol Histopathol . 22(6): 687-96]; [Eggermont et al. (2010) Semin Oncol. 37(5): 455-9]; [Klinke (2010) Mol . Cancer. 9: 242]; [Alexandrescu et al. (2010) J. Immunother . 33(6): 570-90]; [Moschella et al. (2010) Ann N Y Acad Sci . 1194: 169-78]; [Ganesan and Bakhshi (2010) Natl . Med . J. India 23(1): 21-7]; 및 [Golovina and Vonderheide (2010) Cancer J. 16(4): 342-7] 참조)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 기술된 방법에서 사용될 수 있는 예시적인 항-PD-1 항체는 인간 PD-1에 결합하는 항체를 포함하고; 예시적인 PD-1 단백질 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_005009.2에서 제공된다. 예시적인 항체는 미국 특허 번호 8,008,449; 9,073,994; 및 미국 공개 번호 2011/0271358에 기술되어 있으며, 예컨대, PF-06801591, AMP-224, BGB-A317, BI 754091, JS001, MEDI0680, PDR001, REGN2810, SHR-1210, TSR-042, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 아벨루맙, 세미플리맙(Cemiplimab), 스파르탈리주맙(Spartalizumab), 캄렐리주맙(Camrelizumab), 신틸리맙(Sintilimab), 피딜리주맙, 티슬레리주맙(Tislelizumab), 토리팔리맙(Toripalimab), AMP-224, AMP-514, 및 아테졸리주맙을 포함한다.
본원에 기술된 방법에서 사용될 수 있는 예시적인 항-CD40 항체는 인간 CD40에 결합하는 항체를 포함하고; 예시적인 CD40 단백질 전구체 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_001241.1, NP_690593.1, NP_001309351.1, NP_001309350.1 및 NP_001289682.1에서 제공된다. 예시적인 항체는 국제 공개 번호 WO 2002/088186; WO 2007/124299; WO 2011/123489; WO 2012/149356; WO 2012/111762; WO 2014/070934; 국제 공개 번호 2013/0011405; 2007/0148163; 2004/0120948; 2003/0165499; 및 미국 특허 번호 8,591,900에 기술된 것을 포함하며; 예컨대, 다세투주맙, 루카투무맙, 블레셀루맙, 테네릭시맙, ADC-1013, CP-870,893, Chi Lob 7/4, HCD122, SGN-4, SEA-CD40, BMS-986004, 및 APX005M을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-CD40 항체는 CD40 효능제이지, CD40 길항제는 아니다.
본원에 기술된 방법에서 사용될 수 있는 예시적인 항-PD-L1 항체는 인간 PD-L1에 결합하는 항체를 포함하고; 예시적인 PD-L1 단백질 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_001254635.1, NP_001300958.1, 및 NP_054862.1에서 제공된다. 예시적인 항체는 미국 공개 번호 2017/0058033; 국제 공개 번호 WO 2017/118321A1; WO 2016/061142A1; WO 2016/007235A1; WO 2014/195852A1; 및 WO 2013/079174A1에 기술되어 있으며, 예컨대, BMS-936559 (MDX-1105), FAZ053, KN035, 아테졸리주맙 (티센트릭(Tecentriq), MPDL3280A), 아벨루맙 (바벤시오(Bavencio)), 더발루맙(Durvalumab) (임핀지(Imfinzi), MEDI-4736), 엔바폴리맙(Envafolimab) (KN035), CK-301, CS-1001, SHR-1316 (HTI-1088), CBT-502 (TQB-2450), BGB-A333, 및 BMS-986189를 포함한다. 예컨대, AUNP12, CA-170과 같은 비항체 펩티드 억제제 또한 사용될 수 있다. 문헌 [Akinleye & Rasool, Journal of Hematology & Oncology 12:92 (2019) doi:10.1186/s13045-019-0779-5] 또한 참조한다.
일부 실시양태에서, 면역요법제는 항-PD-L1 항체의 항원 결합부, 예컨대, 인간 PD-L1 단백질 (PD-L1.Hu)에 대한 단일 쇄 가변 단편 (scFv) 항체이거나, 또는 그를 포함하고; 항-PDL1 항체 scFv를 코딩하는 예시적인 서열은 서열식별번호 105, 또는 그의 일부, 예컨대, 서열식별번호 105의 아미노산 (aa) 31-513을 포함하고, 예컨대, 신호 펩티드, HA-태그, 및 Myc-태그 중 1, 2개 또는 그 초과의 것이 결여된 것에 제시되어 있다:
예시적인 항-PDL1 scFv 서열
Figure pct00004
하기는 예시적인 항PD-L1 핵산 서열이다
Figure pct00005
Figure pct00006
다른 항체 뿐만 아니라, 상기 항체를 코딩하는 핵산을 생성하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며; 예컨대, 문헌 [Li et al., Int J Mol Sci. 2016 Jul; 17(7): 1151]; [Engeland et al., Mol Ther. 2014 Nov; 22(11): 1949-1959] 및 상기 참고문헌을 참조한다.
바이러스는 또한 트랜스진의 발현을 촉진하는 하나 이상의 서열, 예컨대, 하나 이상의 프로모터 서열; 인핸서 서열, 예컨대, 5' 비번역 영역 (UTR) 또는 3' UTR; 폴리아데닐화 부위; 및/또는 절연체 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 뇌 조직 특이적 프로모터, 예컨대, 뉴런 특이적 또는 신경교세포 특이적 프로모터이다. 특정 실시양태에서, 프로모터는 뉴런 핵(NeuN), 신경교 섬유성 산성 단백질(GFAP), MeCP2, 선종성 결장 폴립증 (APC), 이온화된 칼슘-결합 어댑터 분자 1 (Iba-1), 시냅신 I (SYN), 칼슘/칼모듈린 의존성 단백질 키나제 II, 튜불린 알파 I, 뉴런 특이적 에놀라제 및 혈소판 유래 성장 인자 베타 쇄로부터 선택되는 유전자의 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 범세포 유형 프로모터, 예컨대, 거대세포바이러스 (CMV), 베타 글루쿠로니다제, (GUSB), 유비퀴틴 C (UBC), 또는 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터이다. 우드척 간염 바이러스 전사 후 반응 요소 (WPRE)도 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 신호 또는 리더 서열, 예컨대, IgK 리더 서열이 사용된다. 일부 실시양태에서, 하기 표 (novoprolabs.com/support/articles/commonly-used-leader-peptide-sequences-for-efficient-secretion-of-a-recombinant-protein-expressed-in-mammalian-cells-201804211337.html로부터 적합화된 표)에 제시된 바와 같이, 인간 신호 서열이 대신 사용된다:
Figure pct00007
*, 문헌 [Barash et al., Biochem Biophys Res Commun. 2002 Jun 21;294(4):835-42].
일부 실시양태에서, 예컨대, 문헌 [von Heijne, J Mol Biol. 1985 Jul 5;184(1):99-105]; [Kober et al., Biotechnol. Bioeng. 2013; 110: 1164-1173]; [Tsuchiya et al., Nucleic Acids Research Supplenzent No. 3 261-262 (2003)]에 기술된 바와 같이, 항체의 분비를 촉진시키는 분비 서열이 사용된다.
일부 실시양태에서, AAV는 또한 표적 조직, 예컨대, CNS로의 전달을 증가시키거나, 또는 조직외 표적화를 감소시키는 하나 이상의 추가 돌연변이, 예컨대, CNS, 심장 또는 근육 전달이 의도되는 경우, 간 전달을 감소시키는 감소시키는 돌연변이 (예컨대, 문헌 [Pulicherla et al. (2011) Mol Ther 19:1070-1078]에 기술); 또는 예컨대, 문헌 [Chen et al. (2008) Nat Med 15:1215-1218] 또는 [Xu et al., (2005) Virology 341:203-214] 또는 US9102949; US 9585971; 및 US20170166926에 기술된 바와 같은, 다른 표적화 펩티드의 부가를 갖는다. sfn.org/~/media/SfN/Documents/Short%20Courses/2011%20Short%20Course%20I/2011_SC1_Gray.ashx.에서 이용가능한 문헌 [Gray and Samulski (2011) "Vector design and considerations for CNS applications," in Gene Vector Design and Application to Treat Nervous System Disorders ed. Glorioso J., editor. (Washington, DC: Society for Neuroscience;) 1-9] 또한 참조한다.
사용 방법
본원에 기술된 방법 및 조성물을 사용하여 면역치료 조성물을 조직으로, 예컨대, 중추 신경계 (뇌), 심장, 근육, 또는 후근 신경절 또는 척수 (말초 신경계)에 전달할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 특정 뇌 영역, 예컨대, 피질, 소뇌, 해마, 흑색질, 또는 편도체로의 전달을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 뉴런, 성상세포 및/또는 신경교 세포로의 전달을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 방법 및 조성물, 예컨대, AAV를 사용하여 뇌암을 앓는 대상체에게 면역요법제를 코딩하는 핵산 서열을 전달한다. 뇌암은 신경교종 (예컨대, 다형성 교모세포종 (GBM)), 전이 (예컨대, 폐암, 유방암, 흑색종 또는 결장암으로부터의 전이), 수막종, 뇌하수체 선종 및 청각 신경종을 포함한다. 따라서, 본 방법은 본원에 기술된 바와 같은 표적화 펩티드 및 면역요법제를 코딩하는 것을 포함하는 AAV (예컨대, AAV9) (예컨대, 그 안에 CPP 16이 삽입된 AAV9, 이는 또한 본원에서 AAV.CPP16으로도 지칭)를 뇌암 진단을 받은 대상체에게 전신으로, 예컨대, 정맥내로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 또한 화학요법제를 공동 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학요법제는 테모졸아미드, 로무스틴, 또는 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 독소 또는 세포독성 약물이다. 예컨대, 문헌 [Herrlinger et al., Lancet. 2019 Feb 16;393(10172):678-688]을 참조한다. 본 방법은 또한 방사선, 외과적 절제술, 또는 둘 모두를 투여하는 것을 포함할 수 있다.
제약 조성물 및 투여 방법
본원에 기술된 방법은 (i) 표적화 펩티드 및 (ii) 활성 성분으로서 면역요법제를 코딩하는 서열을 포함하는 AAV를 포함하는 제약 조성물의 사용을 포함한다.
제약 조성물은 전형적으로 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "제약상 허용되는 담체"라는 표현은 제약적 투여와 양립가능한, 염수, 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
제약 조성물은 전형적으로 그의 의도된 투여 경로와 양립가능하도록 제제화된다. 투여 경로의 예로는 비경구, 예컨대, 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내, 근육내 또는 주사 또는 주입 투여를 포함한다. 따라서, 전달은 전신 또는 국소 전달일 수 있다.
적합한 제약 조성물을 제제화하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예컨대, 문헌 [Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., 2005; 및 the books in the series Drugs and the Pharmaceutical Sciences: a Series of Textbooks and Monographs (Dekker, NY)]를 참조한다. 예를 들어, 비경구 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분: 멸균 희석제, 예컨대, 주사용수, 염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제, 예컨대, 벤질알콜 또는 메틸파라벤; 항산화제, 예컨대, 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨; 킬레이팅제, 예컨대, 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 장성 조정제, 예컨대, 염화나트륨 또는 덱스트로스를 포함할 수 있다. pH는 예컨대, 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기로 조정될 수 있다. 비경구용 제제는 앰플, 1회용 시린지 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다회 용량 바이알에 봉입될수 있다.
주사용으로 적합한 제약 조성물은 멸균 수성 액제 (수용성인 경우) 또는 분산제, 및 멸균 주사용 액제 또는 분산제의 즉석 제조를 위한 멸균 산제를 포함할 수 있다. 정맥내 투여를 위해 적합한 담체로는 생리 식염수, 정균수, 크레모포어(Cremophor) EL™ (BASF:미국 뉴저지주 파시패니) 또는 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균성이어야 하고, 용이한 주사능이 존재하는 정도로 유동적이어야 한다. 제조 및 보관 조건하에서 안정적이어야 하고, 예컨대, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅제, 예컨대, 레시틴 사용에 의해, 분산제인 경우, 필요한 입자 크기 유지에 의해, 및 계면활성제 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에서, 등장제, 예를 들어, 당, 다가알콜, 예컨대, 만닛톨, 소르비톨, 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 조성물에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함함으로써 주사용 조성물의 흡수를 연장시킬 수 있다.
멸균 주사용 액제는 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 하나 또는 그의 조합과 함께 적절한 용매 중에 필요한 양의 활성 화합물을 도입한 후, 여과 멸균시킴응로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산제는 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 도입함으로써 제조된다. 멸균 주사용 액제의 제조를 위한 멸균 산제의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조이며, 이를 통해 사전에 멸균 여과된 그의 액제로부터 활성 성분과 임의의 추가의 바람직한 성분으로 이루어진 산제를 수득할 수 있다.
한 실시양태에서, 치료 화합물은 임플란트 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 비롯한, 방출 조절형 제제와 같이 신체로부터의 신속한 제거에 대해 치료 화합물을 보호할 담체와 함께 제조된다. 예컨대, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안히드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생체분해성, 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다. 상기 제제는 표준 기술을 사용하여 제조될 수 있거나, 또는 예컨대, 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티칼즈, 인크.(Nova Pharmaceuticals, Inc.)로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 리포솜 현탁액 (세포 항원에 대한 모노클로날 항체를 이용하여 선택된 세포로 표적화된 리포솜 포함) 또한 제약상 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이는 예를 들어, 미국 특허 번호 4,522,811에 기술된 바와 같이, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
제약 조성물은 투여 설명서와 함께 키트, 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 설명되며, 이 실시예는 본 청구범위에 기술된 본 발명의 범주를 제한하지 않는다.
물질 및 방법
하기 물질 및 방법이 하기 실시예에서 사용되었다.
1. 캡시드 변이체 생성
캡시드 변이체 플라스미드를 생성하기 위해, 세포-침투성 펩티드를 코딩하는 DNA 단편 (표 3)을 합성하고 (진스크립트(GenScript)), 클론EZ 심리스(CloneEZ seamless) 클로닝 기술 (진스크립트)을 이용하여 AAV9 Rep-cap 플라스미드 (pRC9) 백본 내로 아미노산 위치 588 및 589 (VP1 아미노산 넘버링) 사이에 삽입하였다. CPP BIP1 (VPALR, 서열식별번호 1) 및 BIP2 (VSALK, 서열식별번호 2) 뿐만 아니라, 그의 유도체, 예컨대, AAV.CPP.16 중의 TVSALK (서열식별번호 4) 및 AAV.CPP.21 중의 TVSALFK (서열식별번호 8)는 Ku70 단백질로부터 유래된 것이며, 그의 서열은 하기와 같이 제공된다:
Figure pct00008
추가로, AAV9, AAV.CPP.16 및 AAV.CPP.21에 대한 VP1 단백질 서열은 하기와 같이 제공된다:
Figure pct00009
Figure pct00010
2. 재조합 AAV 제조
표준 3-플라스미드 공동-형질감염 프로토콜 (pRC 플라스미드, pHelper 플라스미드 및 pAAV 플라스미드)을 사용하여 재조합 AAV를 패키징하였다. pRC9 (또는 그의 변이체), pHelper 및 트랜스진 (예컨대, 유비쿼터스 EF1a 프로모터에 의해 구동되는 핵 유도 RFP H2B-mCherry)를 보유하는 pAAV를 폴리에틸렌이민 (PEI, 폴리사이언시스(Polysciences))을 사용하여 HEK 293T 세포에 공동 형질감염시켰다. 형질감염 후 72h 및 120h째 무혈청 배지로부터 및 형질감염 후 120h째 세포로부터 rAAV 벡터를 수집하였다. 8% PEG-8000 (wt/vol)을 이용하는 PEG-침전 방법을 사용하여 배지 중 AAV 입자를 농축시켰다. 바이러스 입자를 함유하는 세포 펠릿을 재현탁시키고, 초음파 처리를 통해 용해시켰다. PEG-침전 및 세포 용해물로부터의 조합된 바이러스 벡터를 37℃에서 30min 동안 DNase 및 RNase로 처리한 후, 이어서, 초원심분리 (VTi 50 회전자, 40,000 r.p.m, 18℃, 1h)와 함께 아이오딕사놀 구배 (15%, 25%, 40% 및 60%)에 의해 정제하였다. 이어서, 밀리포어 아미콘(Millipore Amicon) 필터 유닛 (UFC910008, 100K MWCO)을 사용하여 rAAV를 농축시키고, 0.001% 플루로닉(Pluronic) F68 (기브코(Gibco))을 함유하는 둘베코스(Dulbecco's) 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS)에서 제제화하였다.
3. AAV 적정
정량적 PCR을 사용하여 DNase 내성 게놈 카피를 측정하여 바이러스 역가를 측정하였다. PVUII(NEB)로 pAAV-CAG-GFP를 분해하여 플라스미드 ITR에 대한 유리 말단을 생성하고, 표준 곡선을 생성하는 데 사용하였다. 바이러스 샘플을 DNase I와 함께 인큐베이션시켜 오염 DNA를 제거한 후, 수산화나트륨으로 처리하여 바이러스 캡시드를 용해시키고, 바이러스 게놈을 방출시켰다. ITR 정방향 프라이머 5'-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (서열식별번호 91) 및 ITR 역방향 프라이머 5'-CGGCCTCAGTGAGCGA (서열식별번호 92)를 사용하여 정량적 PCR을 수행하였다. 벡터 역가를 rAAV-2 참조 표준 물질 (RSM, ATCC, 카탈로그 번호: VR-1616, 미국 버지니아주 매나사스)에 대해 정규화하였다.
4. 마우스에서의 AAV 투여
정맥내 투여를 위해, 멸균 염수 (0.2 ml)에 희석된 AAV를 성체 마우스 (6주령 초과)에 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. 이후, 동물은 조직 수확을 위해 안락사시키기 전 3주 동안 생존하였다. 대뇌내 주사를 위해, PBS (10 ul) 중에 희석된 AAV를 브레그마 좌표로 해밀턴(Hamilton) 시린지를 사용하여 주사하였다: 오른쪽 1.0 mm, 뒤쪽 0.3 mm, 깊이 2.6 mm. 모든 동물 연구는 IACUC 승인을 받은 AAALAC 인증 시설에서 수행하였다.
5. 마우스 조직 프로세싱
마취된 동물을 냉 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS)에 이어 4% 파라포름알데히드 (PFA)로 경심 관류시켰다. 조직을 밤새도록 4% PFA에 사후 고정한 후, 이어서, 2일 동안 30% 수크로스 용액 중에 침지시킨 후, OCT 중 포매하고, 급냉시켰다. 전형적으로, 천연 형광의 이미징을 위해 80 um 두께의 뇌 절편을 절단하고, IHC를 위해서는 40 um 두께의 뇌 절편을 절단하였다.
6. 시험관내 인간 BBB 스페로이드 모델
뜨거운 1% 아가로스 (w/v, 50 ul)를 96-웰 플레이트 중에 첨가하여 냉각/응고시켰다. 이어서, 1차 인간 성상세포 (론자 바이오사이언스(Lonza Bioscience)), 인간 뇌 미세혈관혈관주위세포 (HBVP, 사이언셀 리서치 라보라토리즈(ScienCell Research Laboratories)) 및 인간 대뇌 미세혈관내피 세포 (hCMEC/D3; 씨더레인(Cedarlane))를 1:1:1 비로 (각 유형의 세포 1500개씩) 아가로스 겔 상에 시딩하였다. 세포를 5% CO2 인큐베이터에서 37℃하에 48-72시간 동안 배양하여 다세포 BBB 스페로이드를 자발적으로 어셈블리시켰다. 다세포 장벽이 스페로이드 주변에 형성되는 것으로 보고되었고, 이는 BBB를 모방하였다. AAVs-H2B-mCherry를 배양 배지에 첨가하고, 4일 후 모든 스페로이드를 4% PFA를 사용하여 고정하고, Nunc Lab-Tek II 얇은 유리 8-웰 챔버 커버글라스 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))로 옮기고, 자이스 LSM710 공초점 현미경을 사용하여 이미징하였다. 스페로이드 내부의 RFP 신호 강도를 검사하고 "판독값"으로 사용하였다.
7. 비-인간 영장류 ( NHP )에서의 AAV 투여
모든 NHP 연구는 IACUC 승인을 받은 AAALAC 인증 시설에서 CRO에 의해 수행하였다. AAV9에 대한 기존의 중화 항체가 거의 없거나, 또는 전혀 없는지에 대해 시노몰구스 원숭이를 미리 스크리닝하였다 (역가 < 1:5). PBS/0.001% F68 중에 희석된 AAV를 연동 펌프를 사용하여 (두부 정맥 또는 대퇴 정맥을 통해) 정맥내로 주사하였다. 3주 후, 동물을 PBS로, 이어서, 4% PFA로 경심 관류시켰다. 이어서, 조직을 수집하고, 파라핀 포매 및 절편화를 위해 프로세싱하였다.
8. 면역조직화학
10% 당나귀 혈청 및 2% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS에 희석된 1차 항체를 사용하여 마우스 조직 절편에 대해 부동 염색을 수행하였다. 사용된 1차 항체는 닭 항-GFP (1:1000); 토끼 항-RFP (1:1000); 마우스 항-NeuN (1:500); 래트 항-GFAP(1:500); 염소 항-GFAP(1:500); 마우스 항-CD31(1:500)을 포함한다. 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488, 알렉사 플루오르 555 또는 알렉사 플루오르 647의 형광단에 접합된 2차 항체를 1:200의 희석률로 1차 항체의 숙주 종에 적용시켰다.
NHP 조직의 파라핀 절편에 대해, DAB 염색을 수행하여 AAV-AADC에 의해 형질도입된 세포를 시각화하였다. 토끼 항-AADC 항체 (1:500, 밀리포어)를 1차 항체로 사용하였다.
9. AAV 결합 검정법
HEK293T 세포를 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 배양하였다. 24-웰 플레이트에 HEK293T 세포를 웰당 250,000개의 세포 밀도로 시딩한 후 다음날, LY6A의 cDNA 플라스미드를 200 ul DMEM (31053028; 기브코), 1 ug DNA 플라스미드 및 3 ug의 PEI의 형질감염 혼합물을 사용하여 세포에 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, 세포를 얼음 상에 놓고 10 min 동안 냉각시켰다. 이어서, 배지를 MOI 10000으로 rAAVs-mCherry를 포함하는 빙냉 무혈청 DMEM 배지 500 ul로 교체하였다. 얼음 상에서 1시간 동안 배양한 후, AAV가 그의 표면에 결합된 것으로 추정되는 세포를 냉 PBS로 3회 세척한 후, 이어서, 게놈 DNA를 단리시켰다. mCherry에 특이적인 프라이머를 사용하여 qPCR에 의해 세포 결합 바이러스 입자를 정량화하고, 참조로서 인간 GCG를 이용하여 HEK293T 게놈에 대해 정규화하였다.
10. 교모세포종 마우스 모델
모든 실험은 브리검 여성 병원(Brigham and Women's Hospital) 및 하버드 의과 대학(Harvard Medical School)의 동물 관리 및 사용 위원회(Animal Care and Use Committees: IACUC)에서 승인한 프로토콜에 따라 수행하였다. 체중이 20 +/- 1 g인 동계 면역-적격 C57BL/6 암컷 마우스 (엔비고(Envigo))를 사용하였다. 2 ㎕ 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS) 중에 재현탁된 GL261-Luc (100,000개의 마우스 교모세포종 세포)를 26 게이지 니들 (80075; 해밀턴)이 장착된 10 ㎕ 시린지를 사용하여 두개내로 주사하였다. 정위 프레임을 사용하여 이식 부위 (브레그마로부터의 좌표 (단위 mm): 오른쪽 2, 전방 0.5, 피질 깊이 3.5)를 위치시켰다. 7일 후, 200 ul AAV-HSV-TK1 (1E+12 바이러스 게놈, IV)을 1회 투여하고, 간시클로비르 (50 mg/kg)를 10일 동안 매일 투여하였다.
실시예 1. AAV9 캡시드 변형
혈액 뇌 장벽을 통한 생체분자 또는 바이러스의 투과를 증진시키는 펩티드 서열을 확인하기 위해, AAV 펩티드 디스플레이 기술을 사용하였고, 표 3에 열거된 바와 같은 개별 세포-침투성 펩티드를 도 1a에 도시된 바와 같이 AAV9 캡시드 내로 아미노산 588 및 589 (VP1 넘버링) 사이에 삽입하였다. 삽입은 AAV 패키징을 위해 공동 형질감염된 3개의 플라스미드 중 하나인 RC 플라스미드를 변형시켜 수행하였고; 도 1b는 실험의 예시적인 개략도를 보여주는 것이다. 개별 AAV 변이체를 별개로 제조하고, 스크리닝하였다. 더욱 상세한 사항에 대해서는 물질 및 방법 #1-3을 참조한다.
표 3
Figure pct00011
#, 서열식별번호
Syn, 합성
실시예 2. 제1 라운드의 생체내 스크리닝
혼합된 C57BL/6 및 BALB/c 유전적 배경을 갖는 성체 마우스에 핵 RFP (H2B-RFP)를 발현하는 AAV를 정맥내로 주사하였다. 3주 후, 뇌 조직을 수확하고, 절편화하여 RFP 표지된 세포 (도 2a 및 2c의 흰색 도트, 각각 도 2b 및 2d에서 정량화됨)를 나타내었다. CPP BIP1 및 BIP2는 각각 AAV.CPP.11 및 AAV.CPP.12의 캡시드 내로 삽입하였다. 더욱 상세한 사항에 대해서는 물질 및 방법 #4-5를 참조한다.
실시예 3. 변형된 AAV9 캡시드의 최적화
BIP 표적화 서열을 최적화하여 AAV.CPP.11 및 AAV.CPP.12를 추가로 조작하였다. BIP 인서트는 단백질 Ku70으로부터 유래된 것이었다 (전체 서열에 대해서는 도 3a 및 물질/방법 #1을 참조한다). "합성" 기원인 BIP 서열 VSALK는 조작된 AAV 벡터의 잠재적 종 특이성을 최소화하기 위한 연구 포커스로 선택하였다. AAV를 제조하고, AAV9와 비교하여 뇌 형질도입률에 대해 별개로 시험하였다 (도 3b-c 참조). 리포터 유전자 RFP를 전달하는 일부 AAV 변이체의 IV 주사 3주 후의 마우스 간 중 세포 형질도입률(%)이 도 3d에 제시되어 있다. 더욱 상세한 사항에 대해서는 물질 및 방법 #1-5를 참조한다.
실시예 4. 시험관내 모델 - BBB 투과 스크리닝
시험관내 스페로이드 BBB 모델을 이용하여 AAV 변이체 중 일부를 인간 BBB를 통과할 수 있는 능력에 대해 스크리닝하였다. 스페로이드는 표면에서 장벽을 형성하는 인간 미세혈관내피 세포, 및 인간 혈관주위세포 및 성상세포를 함유한다. 리포터로서 핵 RFP를 보유하는 AAV를 주변 배지로부터 스페로이드 내부로 침투할 수 있고, 세포 내부로 형질도입할 수 있는 그의 능력에 대해 평가하였다. 도 4a는 실험 개략도를 보여주는 것이다. 도 4b-d는 각각 wt AAV9, AAV.CPP.16, 및 AAV.CPP.21에 대한 결과를 보여주는 것이고, 도 4e에는 상기 및 다른 펩티드가 정량화되어 있다. 상기 모델에서, 펩티드 11, 15, 16, 및 21이 스페로이드 내로 가장 크게 투과시켰다. 더욱 상세한 사항에 대해서는 물질 및 방법 #6을 참조한다.
실시예 5. 생체내 BBB 투과 스크리닝
AAV.CPP.16 및 AAV.CPP.21은 상기 실시예 2에 대해 기술된 바와 같이 수행된 실험에서 생체내 모델에서의 추가 평가를 위해 선택되었다. 모든 AAV는 리포터로서 핵 RFP를 보유하였다. 둘 모두 C57BL/6J 성체 마우스 (도 5a에서 뇌 절편 중 흰색 도트, 도 5b에서 정량화됨) 및 BALB/c 성체 마우스 (도 6a에서 뇌 절편 중 흰색 도트, 도 6b에서 정량화됨)에서 정맥내 투여 후 뇌 세포를 형질도입할 수 있는 능력에 있어 AAV9에 비해 증진된 능력을 보였다.
고용량의 AAV.CPP.16 및 AAV.CPP.21 (4 x 1012 vg/마우스, IV 투여)은 마우스에서 광범위한 뇌 형질도입을 발생시켰다. 두 AAV 모두 리포터로서 핵 RFP를 보유하였다 (도 7a에서 뇌 절편 중 흰색 도트, 도 7b에서 정량화됨).
실시예 6. 변형된 AAV의 생체내 분포
도 8a에 제시된 바와 같이, AAV.CPP.16 및 AAV.CPP.21은 피질, 중뇌 및 해마를 포함하는 마우스의 다중 뇌 영역에 걸쳐 우선적으로 뉴런 (NeuN 항체로 표지)을 표적화하였다. 두 AAV 모두 리포터로서 핵 RFP를 보유하였다.
AAV.CPP.16 및 AAV.CPP.21은 또한 마우스에서 척수 및 운동 뉴런을 표적화하는 데 있어 AAV9에 비해 증진된 능력을 보였다. 모든 AAV는 리포터로서 핵 RFP를 보유하고, 이를 신생아 마우스 (4 x 1010 vg) 내로 정맥내로 투여하였다. CHAT 항체 염색을 사용하여 운동 뉴런을 시각화하였다. 도 8b의 RFP 및 CHAT 신호의 공동 국재화는 운동 뉴런의 특이적인 형질도입을 시사하였다.
마우스에서 다양한 조직을 형질도입시킬 수 있는 AAV-CAG-H2B-RFP 및 AAV.CPP.16-CAG-H2B-RFP의 상대적인 능력에 대해서도 또한 평가하였다. 1 x 1011 vg를 정맥내로 주사하였다. 형질도입된 세포 개수를 DAPI 핵 염색에 의해 표지된 세포 총 개수에 대해 정규화하였다. 그 결과, AAV.CPP.16이 마우스에서 심장 (도 9a); 골격근 (도 9b), 및 후근 신경절 (도 9c) 조직을 표적화하는 데 있어 AAV9보다 더욱 효율적인 것으로 나타났다.
실시예 7. 비-인간 영장류 모델에서의 BBB 투과
2 x 1013 vg/kg AAVs-CAG-AADC (리포터 유전자로서)를 3개월된 시노몰구스 원숭이에 정맥내로 주사하였다. AAV 형질도입된 세포 (검은색으로 제시)를 AADC에 대한 항체 염색을 사용하여 시각화하였다. 도 10a-d에 제시된 바와 같이, AAV.CPP.16 및 AAV.CPP.21이 비-인간 영장류에서의 정맥내 투여 후 뇌 세포를 형질도입시키는 데 있어 AAV9에 비해 증진된 능력을 보였다. AAV.CPP.16이 1차 시각 피질 (도 10a), 두정 피질 (도 10b), 시상 (도 10c), 및 소뇌 (도 10d)에서 wt AAV9보다 유의적으로 더 많은 세포를 형질도입시켰다. 더욱 상세한 사항에 대해서는 물질 및 방법 #7-8을 참조한다.
실시예 8. AAV . CPP .16 및 AAV . CPP .21은 LY6A에 결합하지 않는다.
LY6A는 AAV.PHP.eB에 대한 수용체로서 작용하고, 특정 마우스 계통에서 BBB를 통과하는 데 있어서 AAV.PHP.eB의 강건한 효과를 매개한다. 배양된 293 세포에서의 마우스 LY6A 과다발현은 AAV.PHP.eB의 세포 표면에의 결합을 유의적으로 증가시켰다 (도 11a 참조). 반대로, LY6A 과다발현은 AAV9, AAV.CPP.16 또는 AAV.CPP.21에 대한 바이러스 결합은 증가시키지 않는다 (도 11b 참조). 이는 AAV.CPP.16 또는 AAV.CPP.21이 수용체로서 AAV.PHP.eB와 LY6A를 공유하지 않는다는 것을 시사한다. 더욱 상세한 사항에 대해서는 물질 및 방법 #9를 참조한다.
실시예 9. AAV . CPP .21을 이용한 치료 단백질의 뇌로의 전달
AAV.CPP.21을 사용하여 뇌 종양 마우스 모델에서 "자살 유전자" HSV.TK1을 전신 전달하였다 (물질 및 방법 #10). HSV.TK1은 다르게는 "휴면" 간시클로비르를 종양 사멸 약물로 전환시킨다. 정맥내로 투여된 AAV.CPP.21-H2BmCherry (도 12a, 좌측 하단 및 우측 중간 패널)는 종양 매스, 특히, 종양 확장 경계를 표적화하는 것으로 나타났다. 도 12b-c에 제시된 바와 같이, AAV.CPP.21을 사용하여 "자살 유전자" HSV.TK1을 전신 전달하였을 때, 프로드럭 간시클로비르와 조합된 경우, 그 결과로 뇌 종양 매스가 수축되었다. 본 결과는 AAV.CPP.21을 사용하여 치료 유전자를 뇌 종양 내로 전신 전달할 수 있다는 것을 보여주는 것이다. 더욱 상세한 사항에 대해서는 물질 및 방법 #10을 참조한다.
실시예 10. AAV . CPP .21의 대뇌내 투여
(예컨대, 실시예 2에서의) 전신 투여 외에도, 본원에 기술된 바와 같은 AAV를 마우스 뇌 내로 국소적으로 투여하였다. AAV9-H2B-RFP 및 AAV.CPP.21-H2B-RFP의 대뇌내 주사 (도 13) 결과, AAV9로 처리된 뇌 절편에 비해 AAV.CPP.21로 처리된 뇌 절편에서 더욱 광범위하고, 더욱 높은 강도의 RFP 신호가 생성되었다. 더욱 상세한 사항에 대해서는 물질 및 방법 #4를 참조한다.
실시예 11. 교모세포종 종양 미세환경으로의 AAV . CPP .16의 전신 전달
(예컨대, 실시예 2에서의) 전신 투여를 사용하여, (물질 및 방법 #10에 기술된 바와 같이) 본원에 기술된 바와 같은 AAV를 동소, 면역적격 마우스 교모세포종 모델 (GL261 모델)의 뇌 내로 전달하였다. 도 14에 제시된 바와 같이, AAV.CPP16이 AAV9보다 훨씬 더 우수한 성능을 보였으며, 종양으로 및 주변 미세환경으로의 전달, 둘 모두에서 상당한 전달을 보였다.
상기 증가된 전달 효율이 개선된 치료 효능으로 해석되는지 여부를 결정하기 위해, 마우스 GBM 모델에 다양한 치료를 투여하였다; 도 15a는 실험 프로토콜의 개략도를 제공하는 것이다. 도 15b-c에 제시된 결과는 AAV.CPP.16-항PD-L1 매개 면역요법이 뮤린 GBM 모델에서 생존을 유의적으로 연장시켰다는 것을 입증하였다. 도 15b에 제시된 바와 같이, AAV9-항PD-L1로 처리된 마우스 8마리 중 1마리가 장기간 생존한 반면, AAV.CPP.16-항PD-L1로 처리된 마우스 8마리 중 6마리가 장기간 (100일 넘게) 생존하였다. 도 15c는 장기간 생존한 마우스 6마리 모두 (AAV.CPP.16-항PD-L1로 처리된 5마리 및 AAV9-항PD-L1로 처리된 1마리; AAV.CPP.16-항PD-L1로 처리된 장기간 생존한 마우스 중 1마리는 기술상의 이유로 리-챌린징 수술 동안 사망하였다) 종양 이식 후 200일 동안 여전히 생존하였다는 것을 보여주는 것이다. 따라서, 마우스 PD-L1을 표적화하는 항체를 발현하는 AAV.CPP.16의 정맥내 주사는 마우스의 75%에서 GBM 종양을 근절시킨 반면, 비처리된 마우스는 종양 이식 1개월 이내에 사망하였다.
장기간 생존한 마우스를 200일째에 희생시키고, 뇌를 검사하였다. 도 16a에 제시된 바와 같이, 종양의 증거는 남아 있지 않았다. 도 16b는 생존이 연장된 마우스 중 1마리에서 촬영된 생물발광 이미지를 보여주는 것으로서, 이는 이식 후 7일째에 종양 세포가 존재하였다는 것을 나타낸다. 도 16c는 초기 종양 이식에 잔류 종양이 없고, 신경교증 반흔 조직만이 남아 있다는 것을 보여주는 것이며, 이는 종양이 완전히 근절되었다는 것을 시사하는 것이다.
추가로, 면역조직화학은 CB8+ 세포독성 T 세포가 GBM 종양 부위에도 존재함을 보여주었으며, 이는 면역 반응에 대한 추가 증거가 된다.
실시예 12. GBM 종양 중 HA- 태그부착된 항PD -L1 항체의 발현
웨스턴 블롯팅에 의해 측정된 GBM 종양 중 HA-태그부착된 항PD-L1 항체의 발현이 도 17a-17b에 제시되어 있다. 1e12 vg의 AAV 또는 PBS를 마우스에 종양 이식 후 5일째 정맥내로 주사하였다. IV 주사 후 14일째 종양 조직을 수확하였다. 항PD-L1 항체 발현 (도 17b)의 측정으로서 HA 태그 염색 강도 (도 17a)를 정량화하였다.
참고문헌
Figure pct00012
Figure pct00013
다른 실시양태
본 발명이 그의 상세한 설명과 함께 설명되었지만, 전술한 설명은 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 범주를 제한하지 않고, 설명하기 위한 것임을 이해하여야 한다. 다른 측면, 이점 및 변형은 하기 청구범위의 범주 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> THE BRIGHAM AND WOMEN'S HOSPITAL, INC. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR DELIVERY OF IMMUNOTHERAPY AGENTS ACROSS THE BLOOD-BRAIN BARRIER TO TREAT BRAIN CANCER <130> 29618-0244WO1 <140> PCT/US2021/012746 <141> 2021-01-08 <150> 62/959,625 <151> 2020-01-10 <160> 117 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Val Pro Ala Leu Arg 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Val Ser Ala Leu Lys 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Thr Val Pro Ala Leu Arg 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Thr Val Ser Ala Leu Lys 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Val Pro Ala Leu Arg Asp 1 5 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 Val Ser Ala Leu Lys Glu 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Val Ser Ala Leu Lys Asp 1 5 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Thr Ala Val Ser Leu Lys 1 5 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 22 Thr Ala Leu Val Ser Lys 1 5 <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 23 Thr Val Leu Ser Ala Lys 1 5 <210> 24 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 24 Thr Leu Val Ser Ala Lys 1 5 <210> 25 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 25 Thr Met Val Pro Leu Lys 1 5 <210> 26 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 26 Thr Met Leu Val Pro Lys 1 5 <210> 27 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 27 Thr Val Leu Pro Met Lys 1 5 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 28 Thr Leu Val Pro Met Lys 1 5 <210> 29 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 29 Thr Thr Val Pro Leu Lys 1 5 <210> 30 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 30 Thr Thr Leu Val Pro Lys 1 5 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 37 Thr Ala Val Ser Leu Lys Glu 1 5 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 38 Thr Ala Leu Val Ser Lys Glu 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Thr Val Leu Ser Ala Lys Glu 1 5 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 Thr Leu Val Ser Ala Lys Glu 1 5 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Thr Met Val Pro Leu Lys Glu 1 5 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Thr Met Leu Val Pro Lys Glu 1 5 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Thr Val Leu Pro Met Lys Glu 1 5 <210> 44 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 44 Thr Leu Val Pro Met Lys Glu 1 5 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 45 Thr Thr Val Pro Leu Lys Asp 1 5 <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 46 Thr Thr Leu Val Pro Lys Asp 1 5 <210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 47 Thr Val Leu Pro Thr Lys Asp 1 5 <210> 48 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 48 Thr Leu Val Pro Thr Lys Asp 1 5 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 49 Thr Ala Val 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 62 Thr Thr Leu Val Pro Phe Lys 1 5 <210> 63 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 63 Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys 1 5 <210> 64 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 64 Thr Leu Val Pro Thr Phe Lys 1 5 <210> 65 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 65 Thr Ala Val Pro Leu Phe Arg 1 5 <210> 66 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 66 Thr Ala Leu Val Pro Phe Arg 1 5 <210> 67 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 67 Thr Val Leu Pro Ala Phe Arg 1 5 <210> 68 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 68 Thr Leu Val Pro Ala Phe Arg 1 5 <210> 69 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Lys Phe Thr Val Pro Met Leu Lys 1 5 <210> 70 <211> 8 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 70 Lys Leu Thr Val Pro Thr Leu Lys 1 5 <210> 71 <211> 8 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 71 Lys Phe Thr Val Pro Ala Leu Arg 1 5 <210> 72 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 72 Lys Phe Thr Val Ser Ala Leu Lys 1 5 <210> 73 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(4) <223> V, A, L, I, G, P, S, T, or M <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> K, R, H, D, or E <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 73 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 74 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(5) <223> V, A, L, I, G, P, S, T, or M <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> K, R, H, D, or E <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 74 Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 75 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(4) <223> V, A, L, I, G, P, S, T, or M <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> K, R, H, D, or E <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> E or D <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 75 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 76 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> F, L, W, or Y <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(6) <223> V, A, L, I, G, P, S, T, or M <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> K, R, H, D, or E <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 76 Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 77 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(5) <223> V, A, L, I, G, P, S, T, or M <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> K, R, H, D, or E <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> E or D <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 77 Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 78 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(4) <223> V, A, L, I, G, P, S, T, or M <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> K, R, H, D, or E <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> E or D <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> A or I <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 78 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 79 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> S or P <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> A, M, or T <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 79 Val Xaa Xaa Leu 1 <210> 80 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> S or P <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> A, M, or T <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 80 Thr Val Xaa Xaa Leu 1 5 <210> 81 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> S or P <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> A, M, or T <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 81 Thr Val Xaa Xaa Leu Lys 1 5 <210> 82 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> S or P <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> A, M, or T <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 82 Thr Val Xaa Xaa Leu Phe Lys 1 5 <210> 83 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 83 Lys Leu Ala Ser Val Thr 1 5 <210> 84 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 84 Lys Phe Leu Ala Ser Val Thr 1 5 <210> 85 <211> 736 <212> PRT <213> Adeno-associated virus 9 <400> 85 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 450 455 460 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 580 585 590 Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met 625 630 635 640 Lys His 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<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 103 Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg 1 5 10 15 <210> 104 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 104 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 105 <211> 524 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 105 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ala 20 25 30 Gln Pro Ala Asp Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 35 40 45 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 50 55 60 Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 65 70 75 80 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 85 90 95 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 100 105 110 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu 115 120 125 Tyr His Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 145 150 155 160 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 165 170 175 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp 180 185 190 Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 195 200 205 Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 210 215 220 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 225 230 235 240 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 245 250 255 Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 260 265 270 Val Thr Val Ser Ala Val Asp Glu Ala Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 275 280 285 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 290 295 300 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 305 310 315 320 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 325 330 335 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 340 345 350 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 355 360 365 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 370 375 380 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 385 390 395 400 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 405 410 415 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 420 425 430 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 435 440 445 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 450 455 460 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 465 470 475 480 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 485 490 495 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Val 500 505 510 Asp Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn 515 520 <210> 106 <211> 1575 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 106 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gactatccat atgatgttcc agattatgct ggggcccagc cggccgacga catccaaatg 120 acccagagtc catctagtct gtctgcttcg gtaggtgata gggtcactat tacttgcagg 180 gcctcccagg acgtgtcaac tgcagtggct tggtaccaac agaagcccgg gaaagctccc 240 aaactgctga tctactccgc cagctttctg tattccggag ttccgtctag attttccgga 300 tcaggaagcg gcacggattt cacactcaca ataagcagcc tacaaccaga ggacttcgca 360 acctactatt gtcaacagta cctgtaccat ccagccacct ttgggcaggg caccaaggtg 420 gaaatcaagc gcggtggtgg tggatcaggt ggaggcggaa gtggaggtgg cggatccgaa 480 gttcagcttg tcgagtccgg tggcggcctg gttcagcctg gtgggtcttt gcgtctgtca 540 tgcgccgcct ctggtttcac cttttcagac tcttggatcc actgggtgag acaggcccca 600 ggaaagggtc ttgagtgggt tgcatggatt agcccctacg gcggcagtac atattacgcg 660 gatagcgtga aagggaggtt taccatcagc gcagacacgt cgaagaacac cgcatacctc 720 cagatgaatt ccctccgagc cgaagatacc gccgtgtact attgtgctcg ccggcattgg 780 cctggcggct tcgattattg gggacaggga actctagtaa cagtgtcggc tgtcgacgag 840 gccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacccga actcctgggg 900 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 960 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 1020 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 1080 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1140 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1200 tccaaagcca aggggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1260 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1320 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1380 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1440 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1500 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaagtcgacg aacaaaaact catctcagaa 1560 gaagatctga attga 1575 <210> 107 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met 20 25 <210> 108 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 109 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 109 Met Trp Trp Arg Leu Trp Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Pro Met Val Trp Ala 20 <210> 110 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Arg Gly Ala Arg Cys 20 <210> 111 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala 1 5 10 15 <210> 112 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser 20 <210> 113 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 Met Ala Phe Leu Trp Leu Leu Ser Cys Trp Ala Leu Leu Gly Thr Thr 1 5 10 15 Phe Gly <210> 114 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Met Asn Leu Leu Leu Ile Leu Thr Phe Val Ala Ala Ala Val Ala 1 5 10 15 <210> 115 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser 20 <210> 116 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 116 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Ser Ser Ala Tyr Ser 1 5 10 15 <210> 117 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala 20

Claims (15)

  1. 대상체에게 (i) 서열 TVSALFK (서열식별번호(SEQ ID NO:) 8); TVSALK (서열식별번호 4); KLASVT (서열식별번호 83); 또는 KFLASVT (서열식별번호 84)로부터의 적어도 4개의 인접한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; 및 (ii) 면역요법제를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 아데노-연관 바이러스 (AAV)를 투여하는 단계를 포함하고, 임의적으로, 여기서, 암 세포는 인간 대상체의 뇌에 존재하는 것인, 대상체의 암에 면역요법제를 전달하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이 서열 TVSALK (서열식별번호 4); TVSALFK (서열식별번호 8); KLASVT (서열식별번호 83); 또는 KFLASVT (서열식별번호 84)로부터의 적어도 5개의 인접한 아미노산을 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이 서열 TVSALK (서열식별번호 4); TVSALFK (서열식별번호 8); KLASVT (서열식별번호 83); 또는 KFLASVT (서열식별번호 84)로부터의 적어도 6개의 인접한 아미노산을 포함하는 것인 방법.
  4. 대상체에게 (i) 서열 V[S/p][A/m/t/]L (서열식별번호 79), TV[S/p][A/m/t/]L (서열식별번호 80), TV[S/p][A/m/t/]LK (서열식별번호 81), 또는 TV[S/p][A/m/t/]LFK (서열식별번호 82)로부터의 적어도 4개의 인접한 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질; 및 (ii) 면역요법제를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 아데노-연관 바이러스 (AAV)를 투여하는 단계를 포함하고, 임의적으로, 여기서, 암 세포는 인간 대상체의 뇌에 존재하는 것인, 대상체의 암에 면역요법제를 전달하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 표적화 서열이 VPALR (서열식별번호 1); VSALK (서열식별번호 2); TVPALR (서열식별번호 3); TVSALK (서열식별번호 4); TVPMLK (서열식별번호 12); TVPTLK (서열식별번호 13); FTVSALK (서열식별번호 5); LTVSALK (서열식별번호 6); TVSALFK (서열식별번호 8); TVPALFR (서열식별번호 9); TVPMLFK (서열식별번호 10) 또는 TVPTLFK (서열식별번호 11)를 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 면역요법제를 코딩하는 트랜스진이 PD-1 또는 PD-L1을 표적화하는 항체를 코딩하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 대상체가 포유동물 대상체인 방법.
  8. 제7항에 있어서, AAV가 AAV9인 방법.
  9. 제8항에 있어서, AAV9가 AAV9 VP1을 포함하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 표적화 서열이 서열식별번호 85를 포함하는 AAV9 VP1의 아미노산 588 및 589에 상응하는 위치에 삽입되는 것인 방법.
  11. 제7항에 있어서, 세포가 대상체의 뇌에 존재하고, AAV가 비경구 전달; 대뇌내; 또는 척추강내 전달에 의해 투여되는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 비경구 전달이 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내, 또는 근육내 전달을 통해 이루어지는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 척추강내 전달이 요추 주사, 대수조 주사, 또는 실질내 주사를 통해 이루어지는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 화학요법, 방사선 및/또는 외과적 절제술을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 화학요법이 테모졸아미드, 로무스틴, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
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