ES2909573T3 - Factor de von Willebrand truncado mutado - Google Patents

Abstract

Un polipéptido que comprende el Factor de von Willebrand (VWF) truncado que comprende una secuencia como la mostrada en la SEC. ID Núm.: 3 o un fragmento de la misma, en la que el VWF truncado comprende la SEC. ID Núm.: 5 (S764P/S766W/V1083A), la SEC. ID Núm.: 6 (S764G/S766Y/V1083A), la SEC. ID Núm.: 7 (S764E/S766Y/V1083A), la SEC. ID Núm.: 8 (N1011S/V1083A/K1181E), la SEC. ID Núm.: 17 (S766Y/V1083A), la SEC. ID Núm.: 9 (V1083A), la SEC. ID Núm.: 10 (S1042T), la SEC. ID Núm.: 11 (V805A/Q1158L), la SEC. ID Núm.: 12 (K912E/T1088S) o SEC. ID Núm.: 13 (L781P); y en el que el VWF truncado se une al Factor VIII (FVIII) y el VWF truncado se une al Factor VIII con una tasa de desactivación inferior a la de un polipéptido de referencia que comprende una SEC. ID Núm.: 3 no modificada.

Description

DESCRIPCIÓN

Factor de von Willebrand truncado mutado

Campo de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos que comprenden el Factor de von Willebrand truncado modificado, que presenta una afinidad de unión mejorada con el Factor VIII. La invención se refiere además a un complejo que comprende el polipéptido y el FVIII, a polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la invención y a procedimientos de producción de los polipéptidos. Además, la invención se refiere al uso terapéutico o profiláctico del polipéptido o complejo de la invención para tratar los trastornos de la coagulación sanguínea.

Antecedentes de la invención

[0002 ] Existen diversos trastornos hemorrágicos causados por deficiencias de los factores de coagulación de la sangre. Los trastornos más comunes son la hemofilia A y B, que resultan de las deficiencias del Factor VIII (FVIII) y IX de la coagulación sanguínea, respectivamente. Otro trastorno hemorrágico conocido es la enfermedad de von Willebrand (VWD).

En el plasma, el FVIII existe predominantemente en un complejo no covalente con el VWF y actúa como cofactor del factor IX activado en el complejo generador del factor X activado unido a la membrana.

Se han hecho varios intentos para prolongar la vida media del FVIII no activado, ya sea por medio de la reducción de su interacción con los receptores celulares (documentos WO 03/093313 A2, WO 02/060951 A2), por medio de la unión covalente de polímeros al FVIII (documentos WO 94/15625 A1,WO 97/11957 A1 y US 4970300), por encapsulación del FVIII (documento WO 99/55306 A1), por medio de la introducción de novedosos sitios de unión de metales (documento WO 97/03193 A1), por medio de la unión covalente del dominio A2 al dominio A3, ya sea por vía peptídica (documentos WO 97/40145 A1 y WO 03/087355 A1) o por enlace disulfuro (documento WO 02/103024 A2) o por medio de la unión covalente del dominio A1 al dominio A2 (documento WO 2006/108590 A1).

Otro enfoque para mejorar la vida media funcional del FVIII o del VWF es la PEGilación del FVIII (documentos WO 2007/126808 A1, WO 2006/053299 A2, WO 2004/075923 A2) o por PEGilación del VWF (documento WO 2006/071801 A2). La PEGilación del VWF (documento WO 2006/071801) también se ha intentado en un esfuerzo por aumentar indirectamente la vida media del FVIII presente en el plasma. También se han descrito proteínas de fusión del FVIII (documentos WO 2004/101740 A2, WO2008/077616 A1 y WO 2009/156137 A1).

El VWF, que falta, está funcionalmente defectuoso o sólo está disponible en cantidad reducida en diferentes formas de la enfermedad de von Willebrand (VWD), es una glicoproteína adhesiva multimérica presente en el plasma de los mamíferos, que tiene múltiples funciones fisiológicas. Durante la hemostasia primaria, el VWF actúa como mediador entre los receptores específicos de la superficie de las plaquetas y los componentes de la matriz extracelular, como el colágeno. Además, el VWF sirve como proteína portadora y estabilizadora del FVIII procoagulante. El VWF se sintetiza en las células endoteliales y los megacariocitos como una molécula precursora de 2813 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADNc del VWF de tipo salvaje se divulgan en Collins et al. 1987, Proc. Acad. Sci. EE.UU. 84:4393-4397. El polipéptido precursor, pre-pro-VWF, consiste en un péptido señal de 22 residuos en su extremo N, un propéptido de 741 residuos y el polipéptido de 2050 residuos que se encuentra en el plasma (Fischer et al., FEBS Lett. 351: 345-348, 1994). Tras la escisión del péptido señal en el retículo endoplasmático, se forma un puente disulfuro C-terminal entre dos monómeros del VWF. Durante el transporte posterior a través de la vía secretora se añaden 12 cadenas laterales de carbohidratos ligadas a la N y 10 ligadas a la O. Más importante aún, los dímeros del VWF se multimerizan a través de puentes disulfuro N-terminales y el propéptido de 741 aminoácidos de longitud es escindido por la enzima PACE/furina en el aparato de Golgi tardío. El propéptido y los multímeros de alto peso molecular del VWF (VWF-HMWM) se almacenan en los cuerpos de Weibel-Pallade de las células endoteliales o en los a-Gránulos de las plaquetas.

Una vez secretada en el plasma, la proteasa ADAMTS13 escinde el VWF dentro del dominio A1 del VWF. El VWF plasmático consiste en una gama de multímeros que oscilan desde dímeros simples de 500 kDa hasta multímeros que consisten en más de 20 dímeros de un peso molecular superior a 10.000 kDa. Típicamente, los multímeros de alto peso molecular de VWF tienen la mayor actividad hemostática, que se puede medir en la actividad del cofactor de ristocetina (VWF:RCo). Cuanto mayor sea la relación VWF:RCo/VWF antígeno, mayor será la cantidad relativa de multímeros de alto peso molecular.

Los defectos en el VWF son la causa de la enfermedad de von Willebrand (VWD), que se caracteriza por un fenotipo hemorrágico más o menos pronunciado. La VWD de tipo 3 es la forma más grave en la que el VWF falta por completo, la VWD de tipo 1 se refiere a una pérdida cuantitativa del VWF y su fenotipo puede ser muy leve. La vWd de tipo 2 está relacionada con defectos cualitativos del VWF y puede ser tan grave como la VWD de tipo 3. La VWD de tipo 2 tiene numerosas subformas, algunas de las cuales están asociadas a la pérdida o a la disminución de los multímeros de alto peso molecular. La VWD de tipo 2a se caracteriza por una pérdida de multímeros intermedios y grandes. La VWD de tipo 2B se caracteriza por una pérdida de los multímeros de mayor peso molecular.

La VWD es el trastorno hemorrágico heredado más frecuente en los seres humanos y se puede tratar por medio de una terapia de sustitución con concentrados que contengan VWF de origen plasmático o recombinante. El VWF se puede preparar a partir de plasma humano como se describe, por ejemplo, en EP 05503991. El documento EP 0784632 describe un procedimiento para producir y aislar VWF recombinante.

En el plasma, el FVIII se une con alta afinidad al VWF, lo que lo protege del catabolismo prematuro y, por lo tanto, desempeña, además de su función en la hemostasia primaria, un papel crucial en la regulación de los niveles plasmáticos del FVIII y, como consecuencia, también es un factor central para controlar la hemostasia secundaria. La semivida del FVIII no activado unido al VWF es de aproximadamente 12 a 14 horas en el plasma. En la enfermedad de von Willebrand de tipo 3, en la que no existe o casi no existe el FVIII, la vida media del FVIII es sólo de aproximadamente 2 a 6 horas, lo que da lugar a síntomas de hemofilia A de leve a moderada en dichos pacientes debido a la disminución de las concentraciones de FVIII. El efecto estabilizador del VWF sobre el FVIII también se ha utilizado para ayudar a la expresión recombinante del FVIII en células CHO (Kaufman et al. 1989, Mol. Cell. Biol.). La divulgación de YEE et al., 2014, Blood. Vol. 124 (3) págs. 445 a 451 ("A von Willebrand factor fragment containing the D'D3 domains is sufficient to stabilize coagulation factor VIII in mice") se refiere al hallazgo de que un fragmento truncado del factor de von Willebrand (VWF) que contiene la región D'D3 de unión al factor VIII (FVIII) del VWF es suficiente para estabilizar los niveles endógenos de FVIII en ratones deficientes en VWF. Los fragmentos de VWF fueron expresados o infundidos en ratones con deficiencia de VWF. Sin embargo, la coinfusión de un VWF D'D3-Fc con FVIII dio lugar a un rápido aclaramiento del FVIII administrado exógenamente en ratones deficientes en FVIII. Los constructos D'D3 descritos en Yee et al. (2014) son monómeros, dímeros o multímeros. Los constructos D'D3 mostrados en Yee et al. (2014) no fueron capaces de estabilizar un FVIII coadministrado en ratones con hemofilia A. En el documento WO2013/120939 A1 se han sugerido ciertas sustituciones de aminoácidos dentro del dominio D' de un VWF de longitud completa para aumentar la afinidad de unión al FVIII. El dominio D' puede tener una, dos, tres, cuatro, cinco o más mutaciones. De acuerdo con esta divulgación, la afinidad de unión al FVIII de las variantes del VWF aumenta en al menos un 10%.

La divulgación de Castro-Nunez et al., 2013, The Journal of Biological Chemistry. Vol. 288. Núm. 1, págs. 393 a 400, se relaciona con el papel del N-terminal del VWF en la unión del FVIII. Se demostró que una sustitución S764A resulta en un aumento y una sustitución K773A resulta en una disminución de la unión del FVIII, respectivamente. Para ambas posiciones de aminoácidos en el VWF, se proponen funciones opuestas en la interacción con el FVIII.

Sumario de la invención

En la solicitud internacional de patente en tramitación del actual solicitante Núm.PCT/AU2015/050369 se desvela que un número de modificaciones en el dominio D' del VWF pueden aumentar la unión al Factor VIII. Los presentes inventores han descubierto ahora que la unión del VWF al Factor VIII se puede aumentar por medio de otras modificaciones en D' y, en particular, por medio de modificaciones en el dominio D3.

La presente invención se refiere, por lo tanto, a un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, un complejo de acuerdo con la reivindicación 12, un polipéptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 13 o la reivindicación 17, una composición farmacéutica como se define en la reivindicación 14 o en la reivindicación 15, un kit farmacéutico de acuerdo con la reivindicación 16, un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 18, un plásmido de acuerdo con la reivindicación 19, una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 20, y un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21. Otras realizaciones preferidas se describen en las reivindicaciones dependientes.

Breve descripción de las figuras

[0016]

Figura 1: Muestra de sensorgramas de la pantalla a pH neutro. Los dos candidatos con mayor afinidad y menor tasa de desactivación están marcados con un círculo.

Figura 2: Muestras de sensorgramas que muestran la cinética detallada de CSL627 para dos candidatos mutantes de D'D3-HSA a pH 7. a) Factor VIII que se une a D'D3-HSA con mutaciones: V1083A, S764G, S766Y; b) D'D3-HSA de unión del factor VIII con mutaciones: S764G, S766Y; c) D'D3-HSA de unión del factor VIII con mutaciones: V1083A, S764P, S766W; d) Factor VIII vinculante D'D3-HSA S764P, S766W.

Figura 3: Muestras de sensorgramas que muestran la cinética detallada del Factor VIII para dos candidatos mutantes de D'D3-HSA a pH 5,5 a) Factor VIII de unión a D'D3-HSA con mutaciones: V1083A, S764G, S766Y; b) D'D3-HSA de unión del factor VIII con mutaciones: S764G, S766Y. c) Factor VIII vinculante D'D3-HSA con mutaciones: V1083A, S764P, S766W d) Unión del factor VIII D'D3-HSA S764P, S766W.

Figura 4: a) Dímero D'D3-HSA de unión a CSL627 con mutaciones: V1083A, S764E, S766Y a pH neutro; b) Dímero D'D3-HSA de tipo salvaje de unión a CSL627 a pH neutro.

Figura 5: a) Dímero D'D3-HSA de unión a CSL627 con mutaciones: V1083A, S764E, S766Y b) CSL627 de unión al dímero D'D3-HSA de tipo salvaje a pH 5,5.

Descripción detallada

A lo largo de esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprende", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros indicados, pero no la exclusión de ningún otro elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros.

Cabe señalar que, como se utiliza en la memoria descriptiva del tema, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen aspectos plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. De este modo, por ejemplo, la referencia a "un agente" incluye un único agente, así como dos o más agentes; la referencia a "una molécula" incluye una única molécula, así como dos o más moléculas; y así sucesivamente.

VWF truncado

El término "Factor de von Willebrand" o "VWF", como se utiliza en la presente memoria, se refiere a cualquier polipéptido que tenga una actividad biológica de VWF de tipo salvaje, en particular la capacidad de unirse al Factor VIII. El gen que codifica el VWF nativo humano se transcribe en un ARNm de 9 kb que se traduce en un prepropolipéptido de 2813 aminoácidos con un peso molecular estimado de 310.000 Da. El prepolipéptido contiene un péptido señal de 22 aminoácidos, un propolipéptido de 741 aminoácidos y la subunidad madura. La escisión del propolipéptido de 741 aminoácidos del N-terminal da lugar a un VWF maduro que consiste en 2050 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos del prepropolíptido del VWF humano nativo se muestra en la SEC. ID Núm.: 2. A menos que se indique lo contrario, la numeración de aminoácidos de los residuos del VWF en esta solicitud se refiere a la SEC. ID Núm.: 2, incluso si la molécula de VWF, en particular un VWF truncado, no comprende todos los residuos de la SEC. ID Núm.: 2. La secuencia de aminoácidos del D'D3-His maduro se muestra como SEC. ID Núm.: El término "VWF", como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la forma madura del VWF, a menos que se indique lo contrario.

El propolipéptido del VWF de tipo salvaje comprende múltiples dominios que están dispuestos en el siguiente orden:

D1 -D2-D'-D3-A1 -A2-A3-D4-B1-B2-B3-C1-C2-CK

Los dominios D1 y D2 representan el propéptido que se escinde para producir el VWF maduro. Los dominios D'-D3 abarcan los aminoácidos responsables de la unión al Factor VIII. La secuencia de aminoácidos de al menos una parte de los dominios D'-D3 del VWF de tipo salvaje se muestra en la SEC. ID Núm.: 3. Los 90 residuos carboxiterminales comprenden el dominio "CK" que es homólogo a la superfamilia de proteínas "nudo de cisterna". Estos miembros de la familia tienen tendencia a dimerizarse por medio de enlaces disulfuro.

Preferentemente, el VWF de tipo salvaje comprende la secuencia de aminoácidos del VWF maduro como se muestra en la SEC. ID Núm.: 4. También se incluyen adiciones, inserciones, supresiones N-terminales, C-terminales o internas del VWF a condición de que se conserve una actividad biológica del VWF, en particular la capacidad de unirse al FVIII. La actividad biológica se conserva en el sentido de la invención si el VWF con supresiones conserva al menos el 10%, preferentemente al menos el 25%, más preferentemente al menos el 50%, más preferentemente al menos el 75% de la actividad biológica del VWF de tipo salvaje. La actividad biológica del vWf de tipo salvaje puede ser determinada por los expertos mediante el uso de procedimientos para la actividad del cofactor ristocetina (Federici AB et al. 2004. Haematologica 89:77 a 85), la unión del VWF a la GP b del complejo glicoproteico plaquetario Ib-V-IX (Sucker et al. 2006. Clin Appl Thromb Hemost. 12:305 a 310), o un ensayo de unión al colágeno (Kallas & Talpsep. 2001. Annals of Hematology 80:466 a 471). Cuando la actividad biológica del VWF es la capacidad de unirse al FVIII, esto se puede medir de un número de maneras, sin embargo, se mide preferentemente como se describe en el Ejemplo 1 de la presente memoria.

Factor VIII

Los términos "Factor VIII de coagulación sanguínea", "Factor VIII" y "FVIII" se utilizan indistintamente en la presente memoria. El "Factor VIII de coagulación sanguínea" incluye el FVIII de coagulación sanguínea de tipo natural, así como los derivados del FVIII de coagulación sanguínea de tipo natural que tienen la actividad procoagulante del FVIII de coagulación sanguínea de tipo natural. Los derivados pueden tener supresiones, inserciones y/o adiciones en comparación con la secuencia de aminoácidos del FVIII de tipo salvaje. El término FVIII incluye formas de FVIII procesadas proteolíticamente, por ejemplo, la forma antes de la activación, que comprende la cadena pesada y la cadena ligera. Se incluye el FVIII derivado del plasma y el recombinante, incluido el FVIII eliminado del dominio B. Algunos ejemplos de productos comerciales son Advate®, Kogenate®, Xyntha®, Loctate® y Novoeight®.

El término "FVIII" incluye cualquier variante o mutante del FVIII que tenga al menos el 25%, más preferentemente al menos el 50%, más preferentemente al menos el 75% de la actividad biológica del factor VIII de tipo salvaje.

Como ejemplos no limitantes, las moléculas de FVIII incluyen mutantes de FVIII que impiden o reducen la escisión de APC (Amano 1998. Tromb. Hemost. 79:557 a 563), mutantes del FVIII que estabilizan aún más el dominio A2 (el documento WO 97/40145), mutantes del FVIII que tienen una mayor expresión (Swaroop et al. 1997. JBC 272:24121 a 24124), mutantes del F^v III con inmunogenicidad reducida (Lollar 1999. Tromb. Hemost. 82:505 a 508), FVIII reconstituido a partir de cadenas pesadas y ligeras expresadas de forma diferente (Oh et al. 1999. Exp. Mol. Med.

31:95 a 100), mutantes del FVIII que tienen una unión reducida a los receptores que conducen al catabolismo del FVIII como HSPG (proteoglicanos de heparán sulfato) y/o LRP (proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad) (Ananyeva et al. 2001. TCM, 11:251 a 257), variantes del FVIII estabilizadas por enlaces disulfuro (Gale et al., 2006. J. Thromb. Hemost. 4:1315 a 1322), mutantes del FVIII con propiedades de secreción mejoradas (Miao et al., 2004. Blood 103:3412 a 3419), mutantes del FVIII con mayor actividad específica del cofactor (Wakabayashi et al., 2005. Biochemistry 44:10298 a 10304), mutantes del FVIII con biosíntesis y secreción mejoradas, interacción reducida de la chaperona del RE, transporte mejorado del RE-Golgi, activación aumentada o resistencia a la inactivación y vida media mejorada (resumido por Pipe 2004. Sem. Tromb. Hemost. 30:227 a 237). Otro ejemplo particularmente preferido es una forma recombinante de FVIII como se describe en Zollner et al. 2013, Thrombosis Research, 132:280 a 287.

Preferentemente, el FVIII comprende la secuencia de longitud completa del FVIII como se muestra en la SEC. ID Núm.: 14. También se incluyen adiciones, inserciones, sustituciones, supresiones N-terminales, C-terminales o internas del FVIII, a condición de que se conserve la actividad biológica del FVIII. La actividad biológica se conserva en el sentido de la invención si el FVIII con modificaciones conserva al menos el 10%, preferentemente al menos el 25%, más preferentemente al menos el 50%, más preferentemente al menos el 75% de la actividad biológica del FVIII de tipo salvaje. La actividad biológica del FVIII puede ser determinada por los expertos como se describe a continuación.

Una prueba adecuada para determinar la actividad biológica del FVIII es, por ejemplo, el ensayo de coagulación de una o dos etapas (Rizza et al. 1982. Ensayo de coagulación de FVIII:C y FIXa en Bloom ed. The Hemophilias. NY Churchchill Livingston 1992) o el ensayo de sustrato cromogénico FVIII:C (S. Rosen, 1984. Scand J Haematol 33: 139 a 145).

La secuencia de aminoácidos de la forma madura de tipo salvaje del FVIII de la coagulación sanguínea humana se muestra en la SEC. ID Núm.: 14. La referencia a la posición de un aminoácido de una secuencia específica significa la posición de dicho aminoácido en la proteína FVIII de tipo salvaje y no excluye la presencia de mutaciones, por ejemplo, supresiones, inserciones y/o sustituciones en otras posiciones de la secuencia referida. Por ejemplo, una mutación en "Glu2004" referida a la SEC. ID Núm.: 14 no excluye que en el homólogo modificado falten uno o más aminoácidos en las posiciones 1 a 2332 de la SEC. ID Núm.: 14.

El "FVIII" y/o el "VWF" dentro de la definición anterior también incluyen las variaciones alélicas naturales que pueden existir y ocurrir de un individuo a otro. "FVIII" y/o "VWF" dentro de la definición anterior incluye además variantes de FVIII y/o VWF. Estas variantes difieren en uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia de tipo salvaje. Los ejemplos de tales diferencias pueden incluir sustituciones conservadoras de aminoácidos, es decir, sustituciones dentro de grupos de aminoácidos con características similares, por ejemplo (1) aminoácidos pequeños, (2) aminoácidos ácidos, (3) aminoácidos polares, (4) aminoácidos básicos, (5) aminoácidos hidrofóbicos y (6) aminoácidos aromáticos. En la Tabla 1 se muestran ejemplos de estas sustituciones conservadoras.

Tabla 1

La característica "truncado" en términos de la presente invención significa que el polipéptido no comprende la secuencia completa de aminoácidos del VWF maduro (aminoácidos 764 a 2813 de la SEC. ID Núm.: 2). Típicamente, el VWF truncado no comprende todos los aminoácidos 764-2813 de la SEQ ID NO:2, sino sólo un fragmento del mismo. Un VWF truncado también puede denominarse fragmento de VWF o, en plural, fragmentos de VWF.

Típicamente, el VWF truncado es capaz de unirse a un Factor VIII. Preferentemente, el VWF truncado es capaz de unirse a la forma madura del Factor VIII nativo humano. En otra realización, el VWF truncado es capaz de unirse al Factor VIII de cadena única que consiste en la secuencia de aminoácidos SEC. ID Núm.: 15.

El VWF truncado de la presente invención comprende o consiste preferentemente en (a) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con los aminoácidos 764 a 1242 de la SEC. ID Núm.: 2, o (b) un fragmento de la misma, a condición de que el VWF truncado siga siendo capaz de unirse al FVIII. Más preferentemente, el VWF truncado consiste en (a) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, o al menos el 99%, con los aminoácidos 764 a 1242 de la SEC. ID Núm.: 2. o (b) un fragmento de la misma, a condición de que el VWF truncado siga siendo capaz de unirse al FVIIII. Más preferentemente, el VWF truncado consiste en (a) los aminoácidos 764 a 1242 de la SEC. ID Núm.: 2, o (b) un fragmento de los mismos, a condición de que el VWF truncado siga siendo capaz de unirse al FVIII.

Como se describe con más detalle a continuación, el polipéptido de la invención se puede preparar por medio de un procedimiento que utiliza células que comprenden un ácido nucleico que codifica el polipéptido que comprende el VWF truncado. El ácido nucleico se introduce en las células huésped adecuadas por medio de técnicas que son muy conocidas para los expertos en la técnica.

En una realización preferida, el ácido nucleico de la célula huésped codifica (a) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con los aminoácidos 1 a 1242 de la SEC. ID Núm.: 2, o (b) un fragmento de la misma, a condición de que el VWF maduro truncado siga siendo capaz de unirse al FVIII. Más preferentemente, el ácido nucleico codifica (a) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, o al menos el 99%, con los aminoácidos 1 a 1242 de la SEC. ID Núm.: 2, o (b) un fragmento de la misma, a condición de que el VWF truncado siga siendo capaz de unirse al FVIII.. Aún más preferentemente, el ácido nucleico codifica (a) los aminoácidos 1 a 1242 de la SEC. ID Núm.: 2, o (b) un fragmento del mismo, a condición de que el VWF truncado siga siendo capaz de unirse al FVIII. Especialmente si el polipéptido de acuerdo con esta invención es un dímero, el ácido nucleico comprenderá una secuencia que codifica los aminoácidos 1 a 763 del VWF (por ejemplo, la SEC. ID Núm.: 2), incluso si el VWF truncado en el polipéptido no comprende los aminoácidos 1 a 763 del VWF (por ejemplo, la SEC. ID Núm.: 2).

En otras realizaciones, el VWF truncado comprende o consiste en una de las siguientes secuencias de aminoácidos cada una de ellas referida a la SEC. ID Núm.: 2: 776-805; 766-805; 764-805; 776-810; 766-810; 764-810; 776-815 766-815 764-815; 776-820; 766-820 764-820; 776-825; 766-825; 764-825; 776-830; 766-830; 764-830; 776-835 766-835 764-835; 776-840; 766-840 764-840; 776-845; 766-845; 764-845; 76-850; 766-850; 764-850; 776-855 766-855 764-855; 776-860 ; 766-860; 764-860 ; 776-864; 766-864; 764-864; 776-865 ; 766-865; 764-865; 776-870 766-870 764-870; 776-875 ; 766-875; 764-875 ; 776-880; 766-880; 764-880; 776-885 ; 766-885; 764-885; 776-890 766-890 764-890; 776-895 ; 766-895; 764-895 ; 776-900; 766-900; 764-900; 776-905 ; 766-905; 764-905; 776-910 766-910 764-910; 776-915 766-915; 764-915 ; 776-920; 766-920; 764-920; 776-925 ; 766-925; 764-925; 776-930 766-930 764-930; 776-935 ; 766-935; 764-935 ; 776-940; 766-940; 764-940; 776-945 ; 766-945; 764-945; 776-950 766-950 764-950; 776-955 ; 766-955; 764-955 ; 776-960; 766-960; 764-960; 776-965 ; 766-965; 764-965; 776-970 766-970 764-970; 776-975 ; 766-975; 764-975 ; 776-980; 766-980; 764-980; 776-985 ; 766-985; 764-985; 776-990 766-990 764-990; 776-995; 766-995; 764-995; 776-1000; 766-1000; 764-1000; 776-1005; 766-1005; 764-1005; 776­ 1010; 766-1010; 764-1010; 776-1015; 766-1015; 764-1015; 776-1020; 766-1020; 764-1020; 776-1025; 766-1025; 764-1025; 776-1030; 766-1030; 764-1030; 776-1035; 766-1035; 764-1035; 776-1040; 766-1040; 764-1040; 776­ 1045; 766-1045; 764-1045; 776-1050; 766-1050; 764-1050; 776-1055; 766-1055; 764-1055; 776-1060; 766-1060; 764-1060; 776-1065; 766-1065; 764-1065; 776-1070; 766-1070; 764-1070; 776-1075; 766-1075; 764-1075; 776­ 1080; 766-1080; 764-1080; 776-1085; 766-1085; 764-1085; 776-1090; 766-1090; 764-1090; 776-1095; 766-1095; 764-1095; 776-1100; 766-1100; 764-1100; 776-1105; 766-1105; 764-1105; 776-1110; 766-1110; 764-1110; 776­ 1115; 766-1115; 764-1115; 776-1120; 766-1120; 764-1120; 776-1125; 766-1125; 764-1125; 776-1130; 766-1130; 764-1130; 776-1135; 766-1135; 764-1135; 776-1140; 766-1140; 764-1140; 776-1145; 766-1145; 764-1145; 776­ 1150; 766-1150; 764-1150; 776-1155; 766-1155; 764-1155; 776-1160; 766-1160; 764-1160; 776-1165; 766-1165; 764-1165; 776-1170; 766-1170; 764-1170; 776-1175; 766-1175; 764-1175; 776-1180; 766-1180; 764-1180; 776­ 1185; 766-1185; 764-1185; 776-1190; 766-1190; 764-1190; 776-1195; 766-1195; 764-1195; 776-1200; 766-1200; 764-1200; 776-1205; 766-1205; 764-1205; 776-1210; 766-1210; 764-1210; 776-1215; 766-1215; 764-1215; 776­ 1220; 766-1220; 764-1220; 776-1225; 766-1225; 764-1225; 776-1230; 766-1230; 764-1230; 776-1235; 766-1235; 764-1235; 776-1240; 766-1240; 764-1240; 776-1242; 766-1242; 764-1242; 764-1247; 764-1464; 764-1250; 764­ 1041; 764-828; 764-865; 764-1045; 764-1035; 764-1128; 764-1198; 764-1268; 764-1270; 764-1261; 764-1264; 764­ 1459; 764-1463; 764-1464; 764-1683; 764-1873; 764-1482; 764-1479; 764-1672; y 764-1874.

[0036] En ciertas realizaciones, el VWF truncado tiene una deleción interna en relación con el VWF maduro de tipo salvaje. Por ejemplo, los dominios A1, A2, A3, D4, C1, C2, C3, C4, C5, C6, CK o combinaciones de los mismos se pueden suprimir, y se mantiene el dominio D', el dominio D3 y el dominio CK. En otras realizaciones, el VWF truncado no comprende los sitios de unión para la glicoproteína plaquetaria Iba (GPIba), el colágeno y/o la integrina aIIbpIII (secuencia RGDS dentro del dominio C1). En otras realizaciones, el VWF truncado no comprende el sitio de escisión (Tyr1605-Met1606) para ADAMTS13 que se encuentra en el dominio central A2 del VWF. Aún en otra realización, el VWF truncado no comprende los sitios de unión para GPIba, y/o no comprende el sitio de unión para el colágeno, y/o no comprende el sitio de unión para la integrina aIIbpIII, y/o no comprende el sitio de escisión (Tyr1605-Met1606) para ADAMTS13 que se encuentra en el dominio central A2 del VWF.

En otras realizaciones, el VWF truncado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, o al menos el 91%, o al menos el 92%, o al menos el 93%, o al menos el 94%, o al menos el 95%, o al menos el 96%, o al menos el 97%, o al menos el 98%, o al menos el 99%, con una de las secuencias de aminoácidos mencionadas en el párrafo anterior, a condición de que el VWF truncado sea capaz de unirse al FVIII.

Un polipéptido de la invención se denomina "dímero" en la presente invención si dos monómeros del polipéptido de la invención están unidos covalentemente. Preferentemente, las dos subunidades monoméricas están unidas covalentemente a través de al menos un puente disulfuro, por ejemplo, por medio de uno, dos, tres o cuatro puentes disulfuro. Los residuos de cisteína que forman el al menos un puente disulfuro se encuentran preferentemente dentro de la porción truncada del VWF del polipéptido de la invención. En una realización, estos residuos de cisteína son Cys-1099, Cys-1142, Cys-1222, Cys-1225, o Cys-1227 o combinaciones de ellos.

Si el polipéptido de la invención es un dímero, el VWF truncado preferentemente comprende o consiste en dos polipéptidos cada uno con una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90% con los aminoácidos 764 a 1099, los aminoácidos 764 a 1142, los aminoácidos 764 a 1222, los aminoácidos 764 a 1225, los aminoácidos 764 a 1227, los aminoácidos 764 a 1242, los aminoácidos 764 a 1247, o los aminoácidos 764 a 1270 de la SEC. ID Núm.: 2 y es capaz de unirse al FVIII. En realizaciones preferidas, el VWF truncado comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, o al menos el 99%, con los aminoácidos 764 a 1099, los aminoácidos 764 a 1142, los aminoácidos 764 a 1222, los aminoácidos 764 a 1225, o los aminoácidos 764 a 1227 de la SEC. ID Núm.: 2 y es capaz de unirse al FVIII. Aún más preferentemente, el VWF truncado comprende o consiste en los aminoácidos 764 a 1099, los aminoácidos 764 a 1142, los aminoácidos 764 a 1222, los aminoácidos 764 a 1225, los aminoácidos 764 a 1227, los aminoácidos 764 a 1242, o los aminoácidos 764 a 1270 de la SEC. ID Núm.: 2.

El VWF truncado puede ser cualquiera de los fragmentos de VWF desvelados en los documentos WO 2013/106787, WO 2014/198699, WO 2011/060242, WO 2014/011819, WO 2013/083858, WO 2015/185758 o WO 2013/093760.

Fracción de extensión de la vida media

Además del VWF truncado, el polipéptido de la invención comprende una fracción de extensión de la vida media. La fracción de extensión de la semivida puede ser una secuencia de aminoácidos heteróloga fusionada con el VWF truncado. Alternativamente, la fracción de extensión de semivida puede conjugarse químicamente con el polipéptido que comprende el VWF truncado mediante un enlace covalente diferente a un enlace peptídico.

[0042] En ciertas realizaciones de la invención, la semivida del polipéptido de la invención se prolonga mediante una modificación química, por ejemplo, la unión de una fracción que prolonga la semivida, como el polietilenglicol (PEGilación), el PEG glicosilado, el hidroxietilalmidón (HESilación), los ácidos polisiálicos, los polipéptidos similares a la elastina, los polímeros de heparosán o el ácido hialurónico. En otra realización, el polipéptido de la invención se conjuga con una HLEP como la albúmina a través de un enlazador químico. El principio de esta tecnología de conjugación ha sido descrito de forma ejemplar por Conjuchem LLC (véase, por ejemplo La patente estadounidense n° 7.256.253).

Polipéptidos potenciadores de la semivida (HLEP)

Preferentemente, la fracción que prolonga la vida media es un polipéptido que prolonga la vida media (HLEP), más preferentemente el HLEP se selecciona de la albúmina o fragmentos de la misma, la región constante de la inmunoglobulina y porciones de la misma, por ejemplo el fragmento Fc, cadenas aleatorias solvatadas con gran volumen hidrodinámico (por ejemplo XT^e N (Schellenberger et al. 2009; Nature Biotechnol. 27:1186 a 1190), repeticiones de homo-aminoácidos (HAP) o repeticiones de prolina-alanina-serina (PAS), afamina, alfa-fetoproteína, proteína de unión a la vitamina D, transferrina o variantes de la misma, péptido carboxilo-terminal (CTP) de la subunidad beta de la gonadotropina coriónica humana, polipéptidos o lípidos capaces de unirse en condiciones fisiológicas a la albúmina o a la región constante de la inmunoglobulina.

Un "polipéptido potenciador de la vida media", como se utiliza en la presente memoria, se selecciona preferentemente del grupo formado por la albúmina, un miembro de la familia de la albúmina, la región constante de la inmunoglobulina G y fragmentos de la misma, la región y los polipéptidos capaces de unirse en condiciones fisiológicas a la albúmina, a los miembros de la familia de la albúmina, así como a porciones de una región constante de la inmunoglobulina. Puede ser una proteína de media vida de longitud completa descrita en la presente memoria (por ejemplo, la albúmina, un miembro de la familia de la albúmina o la región constante de la inmunoglobulina G) o uno o más fragmentos de la misma que sean capaces de estabilizar o prolongar la actividad terapéutica o la actividad biológica del factor de coagulación. Dichos fragmentos pueden tener una longitud de 10 o más aminoácidos o pueden incluir al menos unos 15, al menos unos 20, al menos unos 25, al menos unos 30, al menos unos 50, al menos unos 100, o más aminoácidos contiguos de la secuencia HLEP o pueden incluir parte o todos los dominios específicos del HLEP respectivo, siempre que el fragmento HLEP proporcione una extensión de la semivida funcional de al menos un 25% en comparación con el polipéptido respectivo sin la HLEP.

[0045 ] La porción HLEP del polipéptido de la invención puede ser una variante de una HLEP de tipo salvaje. El término "variantes" incluye inserciones, supresiones y sustituciones, ya sean conservadoras o no conservadoras, cuando dichos cambios no alteren sustancialmente la actividad de unión al FVIII del VWF truncado.

En particular, los constructos de fusión VWF-HLEP truncados propuestos de la invención pueden incluir variantes polimórficas naturales de HLEP y fragmentos de HLEP. El HLEP puede derivarse de cualquier vertebrado, especialmente de cualquier mamífero, por ejemplo, humano, mono, vaca, oveja o cerdo. Las HLEP no mamíferas incluyen, entre otras, la gallina y el salmón.

[0047] En una realización el polipéptido tiene la siguiente estructura:

tVWF - L1 - H, [fórmula 1]

en la que tVWF es el VWF truncado, L1 es un enlace químico o una secuencia de enlace, y H es una HLEM, en particular una HLEP.

[0048 ] L1 puede ser un enlace químico o una secuencia de enlace que consiste en uno o más aminoácidos, por ejemplo de 1 a 50, 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5 o 1 a 3 (por ejemplo 1 , 2 o 3) aminoácidos y que pueden ser iguales o diferentes entre sí. Normalmente, las secuencias enlazadoras no están presentes en la posición correspondiente en el VWF de tipo salvaje. Ejemplos de aminoácidos adecuados presentes en L1 incluyen Gly y Ser. El enlazador debe ser no inmunogénico y puede ser un enlazador no escindible o escindible. Los enlazadores no escindibles pueden estar compuestos por residuos de glicina y serina alternados, como se ejemplifica en el documento WO 2007/090584 A1. En otra realización de la invención, el enlazador peptídico entre la parte truncada del VWF y la parte de la albúmina consiste en secuencias peptídicas que sirven como enlazadores naturales entre dominios en las proteínas humanas. Preferentemente, estas secuencias peptídicas en su entorno natural se encuentran cerca de la superficie de la proteína y son accesibles al sistema inmunitario, de modo que se puede asumir una tolerancia natural contra esta secuencia. Se dan ejemplos en WO2007/090584. Las secuencias de enlace escindibles se describen, por ejemplo, enWO 2013/120939 A1.

[0049 ] Las secuencias HLEP preferidas se describen infra. También se incluyen en la invención las fusiones al "aminoácido N-terminal" exacto o al "aminoácido C-terminal" exacto de la HLEP respectiva, o las fusiones a la "parte N-terminal" o a la "parte C-terminal" de la HLEP respectiva, que incluyen deleciones N-terminales de uno o más aminoácidos de la HLEP. El polipéptido puede comprender más de una secuencia HLEP, por ejemplo, dos o tres secuencias HLEP. Estas múltiples secuencias HLEP pueden fusionarse con la parte C-terminal del ^v W^f en tándem, por ejemplo, como repeticiones sucesivas.

Albúmina como HLEP

[0050 ] Los términos "albúmina de suero humano" (HSA) y "albúmina humana" (HA) y "albúmina" (ALB) se utilizan indistintamente en esta solicitud. Los términos "albúmina" y "albúmina sérica" son más amplios y abarcan la albúmina sérica humana (y sus fragmentos y variantes), así como la albúmina de otras especies (y sus fragmentos y variantes).

[0051 ] Tal y como se utiliza aquí, "albúmina" se refiere colectivamente al polipéptido de albúmina o a la secuencia de aminoácidos, o a un fragmento o variante de albúmina, que tiene una o más actividades funcionales (por ejemplo, actividades biológicas) de la albúmina. En particular, la "albúmina" se refiere a la albúmina humana o a sus fragmentos, especialmente la forma madura de la albúmina humana tal como se muestra en la SEQ ID NO:16 o la albúmina de otros vertebrados o sus fragmentos, o análogos o variantes de estas moléculas o sus fragmentos. En particular, los polipéptidos propuestos de la invención pueden incluir variantes polimórficas naturales de la albúmina humana y fragmentos de albúmina humana. En general, un fragmento o variante de albúmina tendrá una longitud de al menos 10, preferentemente de al menos 40, y más preferentemente de más de 70 aminoácidos.

[0053 ] Las realizaciones preferidas de la invención incluyen variantes de albúmina utilizadas como HLEP del polipéptido de la invención con una unión mejorada al receptor FcRn. Dichas variantes de albúmina pueden dar lugar a una semivida plasmática más larga de una proteína de fusión de la variante de albúmina del vWf truncada en comparación con una fusión del VWF truncado con una albúmina de tipo salvaje. Las variantes incluyen las descritas en los documentos WO 2014072481, WO 2012150319, WO 2013135896, WO 2011124718, WO 2011051489 y WO 2012059486.

[0054 ] La porción de albúmina de los polipéptidos de la invención puede comprender al menos un subdominio o dominio de HA o modificaciones conservativas del mismo.

Inmunoglobulinas como HLEP

[0055 ] Las regiones constantes (Fc) de la inmunoglobulina G (IgG) son conocidas en el arte para aumentar la semivida de las proteínas terapéuticas (Dumont J A et al. 2006. BioDrugs 20:151-160). La región constante de la cadena pesada de la IgG consiste en 3 dominios (CH1-CH3) y una región bisagra. La secuencia de inmunoglobulina puede proceder de cualquier mamífero o de las subclases IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, respectivamente. Las IgG y los fragmentos de IgG sin un dominio de unión al antígeno también pueden utilizarse como HLEP. La porción de polipéptido terapéutico está conectada a la IgG o a los fragmentos de IgG preferentemente a través de la región bisagra del anticuerpo o de un enlazador peptídico, que incluso puede ser escindible. Diversas patentes y solicitudes de patentes describen la fusión de proteínas terapéuticas con regiones constantes de inmunoglobulina para aumentar la vida media in vivo de las proteínas terapéuticas. US 2004/0087778 y WO 2005/001025 describen proteínas de fusión de dominios Fc o al menos porciones de regiones constantes de inmunoglobulina con péptidos biológicamente activos que aumentan la semivida del péptido, que de otro modo se eliminaría rápidamente in vivo. Se describieron proteínas de fusión Fc-IFN-p que conseguían una mayor actividad biológica, una vida media circulante prolongada y una mayor solubilidad (el documento WO 2006/000448 A2). Se desvelaron proteínas Fc-EPO con una vida media sérica prolongada y una mayor potencia in vivo (WO 2005/063808 A1), así como fusiones de Fc con G-CSF (el documento WO 2003/076567 A2), péptido similar al glucagón-1 (el documento WO 2005/000892 A2), factores de coagulación (el documento WO 2004/101740 A2) y la interleucina-10 (la Patente de los Estados Unidos N° 6.403.077), todos ellos con propiedades de mejora de la semivida.

[0056 ] Varios HLEP que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención se describen en detalle en WO 2013/120939 A1.

Secuencias de enlace

De acuerdo con la presente invención, la fracción de polipéptido terapéutico se puede acoplar a la fracción de HLEP por medio de un enlazador peptídico. El enlazador debe ser no inmunogénico y puede ser un enlazador no escindible o escindible.

Los enlazadores no escindibles pueden estar compuestos por residuos de glicina y serina alternados, como se ejemplifica en el documento WO 2007/090584 A1.

En otra realización de la invención, el enlazador peptídico entre la fracción del VWF y la fracción de la albúmina consiste en secuencias peptídicas que sirven como enlazadores naturales entre dominios en las proteínas humanas. Preferentemente, estas secuencias peptídicas en su entorno natural se encuentran cerca de la superficie de la proteína y son accesibles al sistema inmunitario, de modo que se puede asumir una tolerancia natural contra esta secuencia. Se dan ejemplos en WO2007/090584.

Los enlazadores escindibles deben ser lo suficientemente flexibles como para permitir la escisión por proteasas. En una realización preferida, la escisión del enlazador procede con una rapidez comparable a la de la activación del FVIII dentro de la proteína de fusión, si ésta es un FVIII modificado.

El enlazador escindible comprende preferentemente una secuencia derivada de

(a) el propio polipéptido terapéutico que se va a administrar si contiene sitios de escisión proteolítica que se escinden proteolíticamente durante la activación del polipéptido terapéutico,

(b) un polipéptido sustrato escindido por una proteasa que se activa o se forma por la participación del polipéptido terapéutico, o

(c) un polipéptido que interviene en la coagulación o la fibrinólisis.

La región enlazadora, en una realización más preferida, comprende una secuencia de VWF, lo que debería dar lugar a un menor riesgo de propiedades neoantigénicas de la proteína de fusión expresada.

Los péptidos enlazadores son preferentemente escindibles por las proteasas del sistema de coagulación, por ejemplo FIIa, FlXa, FXa, FXIa y FVIIa.

Las combinaciones ejemplares de polipéptido terapéutico, enlazador escindible y HLEP incluyen las construcciones enumeradas en el documento WO2007/090584 (por ejemplo en la tabla 2 y la figura 4) y el documento WO2007/144173 (por ejemplo en la tabla 3a y 3b), pero no se limitan a ellas.

En otra realización, la vida media funcional del polipéptido de la invención o del FVIII complejado con el polipéptido de la invención se prolonga en comparación con la del VWF de tipo salvaje o con la del FVIII complejado con el VWF de tipo salvaje, o con el polipéptido de referencia como se define supra. El aumento puede ser superior al 15%, por ejemplo al menos 20% o al menos 50%. De nuevo, dichos valores de vida media funcional se pueden medir in vitro en muestras de sangre tomadas a diferentes intervalos de tiempo de dicho mamífero después de que se haya administrado el FVW modificado o el complejo de FVIII con FVW modificado.

En otra realización de la invención, el polipéptido de la invención o el FVIII complejado con el polipéptido de la invención exhibe una recuperación in vivo mejorada en comparación con el VWF de tipo salvaje o con el FVIII complejado con el VWF de tipo salvaje, o con el polipéptido de referencia definido supra. La recuperación in vivo se puede determinar, por ejemplo, en animales normales o en modelos animales de hemofilia A, como los ratones con FVIII knockout, en los que cabría esperar que se encontrara un mayor porcentaje de FVIII por medio de ensayos de antígenos o de actividad en la circulación poco después (de 5 a 10 minutos) de la administración i.v. en comparación con el correspondiente VWF de tipo salvaje, o con el polipéptido de referencia definido anteriormente.

La recuperación in vivo aumenta preferentemente en al menos un 10%, más preferentemente en al menos un 20%, e incluso más preferentemente en al menos un 40% en comparación con el FVIII complejado con el VWF de tipo salvaje, o con el polipéptido de referencia definido supra.

Ratios

Como se describe con más detalle a continuación, el polipéptido de la invención es un dímero o una mezcla de un dímero y un monómero. Cualquier relación molar según la invención se refiere a una relación de la concentración molar de la subunidad monomérica del polipéptido de la invención, ya sea que esté presente como monómero o dímero. Las relaciones se forman sobre la concentración molar del FVIII coadministrado o sobre la concentración molar de las subunidades endógenas del VWF. Cualquier relación del polipéptido de la invención sobre el FVIII en esta solicitud se refiere a la cantidad de polipéptidos de la invención, que se van a administrar (en moles) dividida por la cantidad de FVIII que se va a administrar (en moles), a menos que se indique lo contrario. El VWF endógeno es el VWF que está naturalmente presente en el plasma del animal o del ser humano que se va a dosificar con el polipéptido de la invención y con el FVIII coadministrado. Suele consistir en una gama de diferentes oligómeros de aproximadamente 2 a 40 subunidades monoméricas de VWF. A menos que se indique lo contrario, cualquier proporción del polipéptido de la invención sobre el VWF endógeno en esta solicitud se refiere a la concentración plasmática molar del polipéptido de la invención por kg de peso corporal del sujeto tratado inmediatamente después de la administración del polipéptido de la invención, dividida por la concentración plasmática molar del VWF endógeno por kg de peso corporal del sujeto tratado. La concentración plasmática molar del polipéptido de la invención por kg de peso corporal del sujeto tratado inmediatamente después de la administración del polipéptido de la invención se calcula suponiendo una dilución del polipéptido de la invención administrado directamente después de la administración en un volumen de plasma de 40 ml/kg. La cantidad del polipéptido de la invención inmediatamente después de la administración cuando se administra por vía intravenosa se supone, a efectos de la invención, idéntica a la cantidad administrada.

Aunque el polipéptido de la presente invención se puede administrar a cualquier nivel, se puede conseguir una ventaja si se administra a un nivel en el que la relación molar del polipéptido de la invención con el VWF endógeno sea superior a 0,5. La concentración de VWF endógeno en el plasma del sujeto a tratar se puede determinar por medio de un ELISA o un ensayo de actividad, por ejemplo, como se describe en los Ejemplos. Normalmente, la concentración medida se indica en U/mL. Este valor se puede convertir en una molaridad como se describe a continuación.

[0070 ] El plasma humano normal (NHP) contiene VWF en una concentración de 1 U/ml o 100% por definición. Esto corresponde a una concentración de proteína de aproximadamente 10 pg/ml (Haberichter S.L. y Montgomery R.R., Structure and function of von Willebrand factor; en Hemostasis and Thrombosis, eds. Marder, Aird, Bennett, Schulman y White, Lippincott Williams & Wilkins 2013, pp 197-207). Basándose en esta concentración de VWF en el NHP y en un peso molecular del monómero maduro del VWF de aproximadamente 267.500 Da, que incluye de 18 a 19% de glicosilación, se puede calcular una concentración plasmática molar de la unidad monomérica del VWF de aproximadamente 37 * 10-9 Mol/L para el NHP.

Para el cálculo de las concentraciones molares de las subunidades del VWF de rata o de conejo en el plasma normal de rata o de conejo, respectivamente, se utilizó un peso molecular de la subunidad monomérica comparable al del VWF humano (267.500 Da) junto con una supuesta actividad específica comparable (100 U/mg) y las actividades endógenas del VWF medidas en el plasma de rata o de conejo (véanse también los ejemplos).

La concentración de VWF en la población humana varía entre aproximadamente el 60% y el 200% de la concentración de VWF en NHP. En ciertas realizaciones de la invención, la concentración de VWF endógeno se define como la concentración en NHP. En otras realizaciones, la concentración de VWF endógeno se determina en el sujeto a tratar, y la dosis del polipéptido se basa en este valor individual.

La relación molar del polipéptido de la invención administrado con respecto al VWF endógeno es, preferentemente, de al menos 2, o de al menos 3, o de al menos 4, o de al menos 5, o de al menos 6, o de al menos 7, o de al menos 8, o de al menos 9, o de al menos 10, más preferentemente de al menos 15, o de al menos 20, o de al menos 25, o de al menos 30, aún más preferentemente de al menos 40, o de al menos 50, o de al menos 75.

La relación molar del polipéptido de la invención que se va a administrar con respecto al VWF endógeno puede oscilar entre 0,5 y 1.000, o entre 1 y5400, o entre 2 y 400, o entre 3 y 300, o entre 4 y 250, o entre 5 y 200, o entre 6 y 150, o entre 7 y 140, o entre 8 y 130, o entre 9 y 1200 o entre 10 y 110. Preferentemente, la relación molar del polipéptido de la invención que se va a administrar con respecto al ^vW^f endógeno oscila entre 3 y 100, o entre 4 y 90, o entre 5 y 80, o entre 6 y 75, o entre 10 y 60.

La relación molar del polipéptido de la invención que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar es preferentemente de al menos 2, o de al menos 5, o de al menos 10, o de al menos 20, o de al menos 30, o de al menos 40, o de al menos 50, más preferentemente la relación es mayor de 50, o de al menos 75, o de al menos 100, o mayor que 100, o de al menos 200, aún más preferentemente de al menos 300, o de al menos 400, o de al menos 500.

La relación molar del polipéptido de la invención que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar puede oscilar entre 2 y 10.000, o entre 5 y 5.000, o entre 10 y 4.000, o entre 20 y 3.000, o entre 30 y 2.000, o entre 40 y 1.000. Preferentemente, la relación molar del polipéptido de la invención que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar oscila entre 60 y 2.500, o entre 110 y 2.000, o entre 150 y 1.500, o entre 200 y 1.000.

La Tabla 1 resume varias realizaciones del tratamiento de acuerdo con esta invención. En una realización determinada, se deben cumplir los dos requisitos de las columnas 2 y 3, respectivamente.

Tabla 2:

Las realizaciones 1 a 72 mostradas en la Tabla 2 se pueden combinar con cualquier otra realización y aspecto de la invención descrita en la presente memoria. Más adelante se describen otros detalles del tratamiento de acuerdo con la invención.

N-Glicanos y Sialilación del polipéptido de la invención

[0079 ] El polipéptido de la invención comprende preferentemente N-glicanos, y al menos el 75%, preferentemente al menos el 85%, más preferentemente al menos el 90% de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, al menos una fracción de ácido siálico. En realizaciones preferidas, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, o al menos el 99%, de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, al menos una fracción de ácido siálico. Los inventores descubrieron que los polipéptidos que comprenden fragmentos de FVW altamente sialilados no sólo pueden tener una vida media más prolongada por sí mismos, sino que también pueden ser capaces de prolongar aún más la vida media del FVIII coadministrado. En otras palabras, la administración del polipéptido de la invención conduce a una semivida prolongada y/o a una eliminación reducida del FVIII coadministrado.

[0080 ] El polipéptido de la invención comprende preferentemente N-glicanos, y al menos el 50% de los grupos sialilo de los N-glicanos de las glicoproteínas son grupos sialilo ligados a a-2,6. En general, los grupos sialilo terminales pueden estar unidos a los grupos galactosa a través de un enlace a-2,3- o a través de un enlace a-2,6. Típicamente, los N-glicanos del polipéptido de la invención comprenden más grupos sialilo ligados a a-2,6 que a a-2,3. Preferentemente, al menos el 60%, o al menos el 70%, o al menos el 80%, o al menos el 90% de los grupos sialilo de los N-glicanos son grupos sialilo ligados a a-2,6. Estas realizaciones pueden obtenerse, por ejemplo, coexpresando la a-2,6-sialiltransferasa humana en células de mamífero.

[0081 ] En una realización, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, o al menos el 99%, de los N-glicanos del polipéptido de la invención comprenden al menos un grupo de ácido siálico. En otra realización, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% de los N-glicanos del polipéptido de la invención comprenden al menos un grupo de ácido siálico.

[0082 ] En otra realización, menos del 15%, menos del 12%, menos del 10%, o menos del 8%, o menos del 6%, o menos del 5%, o menos del 4%, o menos del 3%, o menos del 2% o incluso menos del 1% de los N-glicanos del polipéptido de la invención son asialo-N-glicanos, es decir, son N-glicanos que carecen de un grupo ácido siálico. En otra realización, menos del 15%, menos del 12%, menos del 10%, o menos del 8%, o menos del 6%, o menos del 5%, o menos del 4%, o menos del 3%, o menos del 2% o incluso menos del 1% de los N-glicanos del polipéptido de la invención son asialo-N-glicanos, es decir, no tienen un grupo ácido siálico.

[0083 ] Las realizaciones descritas anteriormente pueden combinarse entre sí. Todos los porcentajes de N-glicanos mencionados anteriormente, o cualquier indicación del grado de sialilación, deben entenderse como porcentajes o grados medios, es decir, se refieren a una población de moléculas, no a una única molécula. Está claro que la glicosilación o sialilación de las moléculas individuales de glicoproteínas dentro de una población de glicoproteínas mostrará cierta heterogeneidad.

Dímeros

Se ha encontrado además que los polipéptidos de esta invención pueden tener una alta proporción de dímeros. El polipéptido de la invención preferentemente está presente por lo tanto como dímero. En una realización, al menos el 50%, o al menos el 60%, o al menos el 70% de los polipéptidos están presentes como dímeros. En otra realización, la relación dímero : monómero del polipéptido de la invención es al menos 1,5, preferentemente al menos 2, más preferentemente al menos 2,5 o al menos 3. Lo más preferible es que todos los polipéptidos de la invención estén presentes como dímeros. El uso de dímeros es favorable, ya que el dímero tiene una mejor afinidad con el Factor VIII en comparación con el monómero.

[0085] En una realización, la afinidad del polipéptido de la invención al Factor VIII es mayor que la del VWF nativo humano a la misma molécula de Factor VIII. La afinidad del factor VIII se puede referir al Factor VIII nativo humano, o a la molécula de Factor VIII caracterizada por la SEC. ID Núm.: 15.

[0086] Se ha encontrado que las preparaciones del polipéptido de esta invención con una alta proporción de dímeros tienen una mayor afinidad al Factor VIII. Esta mayor afinidad al Factor VIII conduce a una mayor estabilización del Factor VIII por los polipéptidos de la presente invención. Alternativamente o en combinación con una proporción aumentada de dímeros también los polipéptidos de acuerdo con la invención con mutaciones dentro del dominio de unión al Factor VIII que aumentan la afinidad al Factor VIII son realizaciones preferidas de la invención. Se divulgan mutaciones adecuadas, por ejemplo, en WO 2013/120939 A1.

Preparación del polipéptido

[0087] El ácido nucleico que codifica el polipéptido de la invención puede prepararse según procedimientos conocidos en la técnica. Basándose en la secuencia de ADNc del VWF (SEC. ID Núm.: 3), se puede diseñar y generar ADN recombinante que codifique los constructos o polipéptidos de VWF truncado antes mencionados de la invención.

Incluso si el polipéptido que es secretado por las células huésped no comprende los aminoácidos 1 a 763 del VWF, se prefiere que el ácido nucleico (por ejemplo el ADN) que codifica el precursor intracelular del polipéptido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, o al menos el 99%, con los aminoácidos 23 a 763 o, preferentemente, con los aminoácidos 1 a 763 de la SEC. ID Núm.: 2. Más preferentemente, el ácido nucleico (por ejemplo, el ADN) que codifica el precursor intracelular del polipéptido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 23 a 763 de la SEQ ID NO:2, o los aminoácidos 1 a 763 de la SEQ ID NO:2.

[0089 ] Los constructos en los que el ADN contiene el marco de lectura abierto completo insertado en la orientación correcta en un plásmido de expresión pueden utilizarse para la expresión de proteínas. Los vectores de expresión típicos contienen promotores que dirigen la síntesis de grandes cantidades de ARNm correspondientes al ácido nucleico insertado en las células portadoras del plásmido. También pueden incluir una secuencia de origen de replicación que permite su replicación autónoma dentro del organismo anfitrión, y secuencias que aumentan la eficiencia con la que se traduce el ARNm sintetizado. Los vectores estables a largo plazo pueden mantenerse como entidades de libre replicación utilizando elementos reguladores de, por ejemplo, virus (por ejemplo, las secuencias OriP del genoma del virus de Epstein Barr). También se pueden producir líneas celulares que hayan integrado el vector en el ADN genómico, y de esta manera el producto génico se produce de forma continua.

[0090 ] Típicamente, las células a proporcionar se obtienen introduciendo el ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención en células huésped de mamífero.

[0091 ] Cualquier célula huésped susceptible de cultivo celular, y de expresión de glicoproteínas, puede ser utilizada de acuerdo con la presente invención. En ciertas realizaciones, una célula huésped es de mamífero. Ejemplos no limitantes de células de mamífero que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención incluyen la línea de mieloma de ratón BALB/c (NSO/ 1, ECACC No: 85110503); retinoblastos humanos (PER.C6 (CruCell, Leiden, Países Bajos)); línea de riñón de mono CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para su crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59, 1977); células de riñón de hámster bebé (BHK, ATCC CCL10); células de ovario de hámster chino /-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243251, 1980); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1 587); células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34) células de hígado de rata de búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (HepG2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals NY. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); células MRC 5; células PS4; células de amniocitos humanos (CAP); y una línea de hepatoma humano (Hep G2). Preferentemente, la línea celular es una línea celular de roedores, especialmente una línea celular de hámster como CHO o BHK.

[0092 ] Los procedimientos adecuados para introducir ácidos nucleicos suficientes para lograr la expresión de una glicoproteína de interés en células huésped de mamíferos son conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, Gething et al., Nature, 293:620-625, 1981 Mantei et al., Nature, 281:40-46, 1979 Levinson et al. EP 117.060 y EP 117,058. En el caso de las células de mamíferos, los procedimientos habituales para introducir material genético en ellas incluyen el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Erb (Virology, 52:456 a 457, 1978) o el procedimiento de lipofectamina™ (Gibco BRL) de Hawley-Nelson (Focus 15:73, 1993). Los aspectos generales de las transformaciones del sistema de células de mamíferos han sido descritos por Axel en US. Pat. N° 4.399.216. Para diversas técnicas de introducción de material genético en células de mamíferos, véase Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527 a 537, 1990 y Mansour et al., Nature, 336:348 a 352, 1988.

[0093] Las células se cultivan en condiciones que permiten la expresión del polipéptido. El polipéptido puede recuperarse y purificarse utilizando procedimientos conocidos por el artesano experto.

Vida media terminal, MRT y Aclaramiento

Otro aspecto de la invención es el uso de un polipéptido como el definido anteriormente para aumentar la vida media terminal o el tiempo de residencia medio (^t R^m ) o reducir el aclaramiento del Factor VIII. Para la evaluación de los datos farmacocinéticos se aplicó un modelo farmacocinético lineal (eliminación del compuesto a través del compartimento central). Por consiguiente, todos los parámetros farmacocinéticos utilizados en la presente memoria se basan en un modelo farmacocinético lineal (eliminación del compuesto a través del compartimento central), a menos que se indique lo contrario.

La "vida media" T1/2(t) en un determinado tiempo t es el tiempo que tarda en reducirse a la mitad la concentración plasmática C(t) presente en el tiempo t. La "vida media terminal" (en este último texto abreviada como t1/2) es el límite de T1/2(t) cuando t tiende a infinito. La "vida media terminal" es el límite de T1/2(t) cuando t tiende a infinito. La vida media terminal del FVIII administrado se incrementa en al menos un 25%, preferentemente en al menos un 50%, más preferentemente en al menos un 75%, más preferentemente en al menos un 100%, más preferentemente en al menos un 150%, si se coadministra una cantidad efectiva del polipéptido de la presente invención, en relación con la administración del FVIII solo. Otro aspecto de la invención es el uso de un polipéptido como el definido anteriormente para aumentar la vida media terminal del Factor VIII.

[0097 ] El término "MRT", tal como se utiliza aquí, significa el tiempo medio que una molécula de fármaco (por ejemplo, el polipéptido de la invención o un FVIII) reside en el cuerpo. En un sistema farmacocinético con aclaramiento constante, el MRT se puede calcular como el área bajo la curva del primer momento (AUMC) dividida por el área bajo la curva de la concentración de plasma a lo largo del tiempo (AUC). La curva del primer momento es el tiempo multiplicado por la concentración de plasma en ese momento.

La TRM del FVIII administrado aumenta al menos un 25%, preferentemente al menos un 50%, más preferentemente al menos un 75%, más preferentemente al menos un 100%, más preferentemente al menos un 150%, si se coadministra una cantidad eficaz del polipéptido de la presente invención, en relación con la administración del FVIII solo. Otro aspecto de la invención es el uso de un polipéptido como el definido anteriormente para aumentar la vida media terminal o el tiempo de residencia medio (TRM) o reducir el aclaramiento del Factor VIII.

[0099 ] El término "aclaramiento", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la tasa de eliminación del fármaco en el plasma. En concreto, es la tasa de eliminación actual de un fármaco dividida por su concentración plasmática actual. En un sistema farmacocinético tras una única administración intravenosa, el aclaramiento se puede calcular como la relación entre la dosis y el área bajo la curva de la concentración de plasma a lo largo del tiempo (AUC), a condición de que el aclaramiento sea constante. Cuanto menor sea el aclaramiento, más tiempo tardará el plasma en ser eliminado del fármaco.

El aclaramiento del FVIII administrado se reduce en al menos un 10%, preferentemente en al menos un 25%, más preferentemente en al menos un 50%, más preferentemente en al menos un 60%, más preferentemente en al menos un 70%, si se coadministra una cantidad efectiva del polipéptido de la presente invención, en relación con la administración del FVIII solo.

La invención se refiere además a un procedimiento para aumentar la TRM o la vida media, o a un procedimiento para reducir el aclaramiento del Factor VIII in vivo, que comprende la administración a un sujeto de una cantidad eficaz de un polipéptido como el definido anteriormente.

Otro aspecto de la presente invención es el polipéptido de la invención para el tratamiento de un trastorno de la coagulación sanguínea, que comprende la administración a un paciente que lo necesita de una cantidad eficaz de un polipéptido como el definido anteriormente.

Otro aspecto es el uso de un polipéptido como se define anteriormente para reducir la frecuencia de administración del FVIII en el tratamiento de la hemofilia A. La frecuencia de administración subcutánea del FVIII se puede reducir a dos veces por semana. Alternativamente, la frecuencia de la administración subcutánea del FVIII se puede reducir a una vez por semana, o incluso a una frecuencia menor, por ejemplo, una vez cada 10 días o una vez cada 14 días. El FVIII se puede administrar dos veces por semana, cada 5 días, una vez por semana, cada 10 días, cada dos semanas, cada tres semanas, cada cuatro semanas o una vez al mes, o en cualquier intervalo entre dos de los valores anteriores, por ejemplo, desde cada cuatro días hasta cada mes, desde cada 10 días hasta cada dos semanas, etc.

Otro aspecto es el uso de un polipéptido como el definido anteriormente para reducir la dosis de FVIII que se debe administrar en el tratamiento de la hemofilia A.

Tratamiento de los trastornos de la coagulación

Los polipéptidos de la invención son útiles para tratar los trastornos de la coagulación, incluida la hemofilia A. El término "hemofilia A" se refiere a una deficiencia en la coagulación funcional del FVIII, que suele ser hereditaria.

[0106 ] El tratamiento de una enfermedad abarca el tratamiento de pacientes a los que ya se les ha diagnosticado cualquier forma de la enfermedad en cualquier fase o manifestación clínica; el retraso del inicio o la evolución o el agravamiento o el deterioro de los síntomas o signos de la enfermedad; y/o la prevención y/o la reducción de la gravedad de la enfermedad.

[0107 ] Un "sujeto" o "paciente" al que se administra un polipéptido de la invención es preferentemente un ser humano. En ciertos aspectos, el humano es un paciente pediátrico. En otros aspectos, el humano es un paciente adulto.

En la presente memoria se describen composiciones que comprenden el polipéptido de la invención y, opcionalmente, el FVIII. Las composiciones suelen suministrarse como parte de una composición farmacéutica estéril que incluye un portador farmacéuticamente aceptable. Esta composición puede estar en cualquier forma adecuada (dependiendo del procedimiento deseado para administrarla a un paciente).

Los términos "Factor VIII" y "FVIII" se utilizan indistintamente en la presente memoria y abarcan tanto el FVIII derivado del plasma como el FVIII recombinante. El FVIII recombinante abarca, sin limitación, el FVIII de longitud completa, así como las variantes de dos cadenas del dominio B suprimidas o truncadas, así como las variantes de una sola cadena del dominio B suprimidas o truncadas, por ejemplo las descritas en el documento WO 2004/067566 A1 y otras variantes del FVIII con mutaciones fuera del dominio B pero que tienen la actividad biológica del FVIII. El polipéptido de la invención se puede administrar a un paciente por una variedad de vías tales como oral, transdérmica, subcutánea, intranasal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, tópica o local. La vía de administración más adecuada en cada caso dependerá del polipéptido concreto, del sujeto y de la naturaleza y gravedad de la enfermedad y del estado físico del sujeto. Típicamente, un polipéptido de la invención se administrará por vía intravenosa.

El polipéptido y el FVIII se administran preferentemente por vía intravenosa o subcutánea.

En una primera realización, tanto el polipéptido como el FVIII se administran por vía intravenosa. En una segunda realización, tanto el polipéptido como el FVIII se administran por vía subcutánea.

En otra realización, el FVIII se administra por vía intravenosa, y el polipéptido se administra por una vía diferente. En otras realizaciones, el polipéptido se administra por vía subcutánea, y el FVIII se administra por una vía diferente. Por ejemplo, el polipéptido se puede administrar por vía subcutánea, y el FVIII se puede administrar por vía intravenosa.

En otras realizaciones, el FVIII se administra por vía subcutánea, y el polipéptido se administra por una vía diferente. En otras realizaciones, el polipéptido se administra por vía intravenosa, y el FVIII se administra por una vía diferente. Por ejemplo, el polipéptido se puede administrar por vía intravenosa, y el FVIII se puede administrar por vía subcutánea.

La determinación del número total de dosis y la duración del tratamiento con un polipéptido de la invención y FVIII está bien dentro de las capacidades de los expertos en la técnica. La dosificación del polipéptido de la invención así como del FVIII a administrar depende de las concentraciones del FVIII a administrar, de la concentración del VWF endógeno en el paciente a tratar, o de ambas. Una dosificación eficaz basada en las proporciones definidas por los inventores de esta solicitud puede ser determinada por los expertos, teniendo en cuenta el peso molecular del polipéptido de la invención. Las dosis típicas de FVIII pueden oscilar entre aproximadamente 20 U/kg de peso corporal y aproximadamente 100 U/kg de peso corporal.

[0116] De acuerdo con esta invención, el paciente que está siendo tratado con el polipéptido de la invención también es tratado con el Factor VIII de coagulación sanguínea. El polipéptido de la invención y el Factor VIII se pueden administrar de forma simultánea, o de una forma secuencial, ambos modos de administración están englobados por el término "terapia combinada" y "coadministración". El polipéptido de la invención y el Factor VIII pueden administrarse como una mezcla, es decir, dentro de la misma composición, o por separado, es decir, como composiciones independientes.

[0117 ] La concentración de Factor VIII en la composición utilizada está típicamente en el intervalo de 10-10,000 IU/ml. En diferentes realizaciones, la concentración de FVIII en las composiciones de la invención está en el intervalo de 10-8.000 IU/ml, o 10-5.000 IU/ml, o 20-3.000 IU/ml, o 50-1.500 IU/ml, o 3.000 IU/ml, o 2.500 IU/ml, o 2,000 IU/ml, o 1.500 IU/ml, o 1.200 IU/ml, o 1.000 IU/ml, o 800 IU/ml, o 750 IU/ml, o 600 IU/ml, o 500 IU/ml, o 400 IU/ml, o 300 IU/ml, o 250 IU/ml, o 200 IU/ml, o 150 IU/ml, o 125 IU/ml, o 100 IU/ml, o 625 IU/ml, o 50 IU/ml, siempre que se cumplan los requisitos relativos a la relación con respecto al polipéptido VWF de la invención tal como se define en el presente documento.

La "unidad internacional", o "IU", es una unidad de medida de la actividad de coagulación de la sangre (potencia) del FVIII, medida por un ensayo de actividad del FVIII, tal como un ensayo de coagulación de una etapa o un ensayo de actividad del FVIII con sustrato cromogénico, mediante el uso de un estándar calibrado en "IU" con respecto a una preparación estándar internacional. Los ensayos de coagulación de una etapa son conocidos en la técnica, como el descrito en N Lee, Martin L, et al., An Effect of Predilution on Potency Assays of FVIII Concentrates, Thrombosis Research (Pergamon Press Ltd.) 30, 511519 (1983). Principio del ensayo de una etapa: La prueba se ejecuta como una versión modificada del ensayo del tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa): La incubación del plasma con fosfolípidos y un activador de superficie conduce a la activación de los factores del sistema intrínseco de coagulación. La adición de iones de calcio desencadena la cascada de coagulación. Se determina el tiempo hasta la formación de un coágulo de fibrina medible. El ensayo se realiza en presencia de plasma deficiente de Factor VIII. La capacidad de coagulación del plasma deficiente se restablece mediante el Factor de Coagulación VIII incluido en la muestra a analizar. El acortamiento del tiempo de coagulación es proporcional a la cantidad de Factor VIII presente en la muestra. La actividad del Factor VIII de la coagulación se cuantifica por comparación directa con una preparación estándar con una actividad conocida del Factor VIII en Unidades Internacionales.

[0119] Otro ensayo estándar es un ensayo de sustrato cromogénico. Los ensayos de sustrato cromogénico se pueden adquirir comercialmente, tales como el kit de ensayo Coamatic® FVIII (Chromogenix-Instrumentation Laboratory SpA V. le Monza 338 - 20128 Milano, Italia). Principio del ensayo cromogénico: En presencia de calcio y fosfolípidos, el Factor X es activado por el Factor IXa a Factor Xa. Esta reacción es estimulada por el Factor VIIIa como cofactor. El FVIIIa se forma por bajas cantidades de trombina en la mezcla de reacción a partir del FVIII en la muestra a medir. Cuando se utilizan las concentraciones óptimas de Ca2+, fosfolípido y Factor IXa y una cantidad excesiva de Factor X, la activación del Factor X es proporcional a la potencia del Factor VIII. El Factor X activado libera el cromóforo pNA del sustrato cromogénico S-2765. La liberación de pNA, medida a 405 nm, es por lo tanto proporcional a la cantidad de FXa formado y, por lo tanto, también a la actividad del Factor VIII de la muestra.

Composiciones farmacéuticas

[0120 ] Las formulaciones terapéuticas del polipéptido de la invención adecuadas en los procedimientos descritos en el presente documento pueden prepararse para su almacenamiento como formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas mezclando el polipéptido que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizadores opcionales farmacéuticamente aceptables que se emplean típicamente en la técnica (todos los cuales se denominan aquí "portadores"), es decir, agentes tamponadores, agentes estabilizadores, conservantes, isotonificadores, detergentes no iónicos, antioxidantes y otros aditivos diversos. Véase, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ta edición (Osol, ed. 1980). Estos aditivos deben ser no tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas.

[0121] Los agentes tamponadores ayudan a mantener el pH en el intervalo que se aproxima a las condiciones fisiológicas. Pueden presentarse en concentraciones que van desde unos 2 mM hasta unos 50 mM. Los agentes tamponadores adecuados incluyen tanto ácidos orgánicos como inorgánicos y sales de los mismos, tales como tamponadores de citrato (por ejemplo, mezcla de citrato monosódico y citrato disódico, mezcla de ácido cítrico y citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico y citrato monosódico, etc.), tamponadores de succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínico-succinato monosódico, mezcla de ácido succínico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido succínicosuccinato disódico, etc.), tampones de tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartárico-tartrato de sodio, mezcla de ácido tartárico-tartrato de potasio, mezcla de ácido tartárico-hidróxido de sodio, etc.), tampones de fumarato (por ejemplo mezcla de ácido fumárico-fumarato monosódico, mezcla de ácido fumárico-fumarato disódico, mezcla de fumarato monosódico-fumarato disódico, etc.), tampones de gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido glucónicogliconato de sodio, mezcla de ácido glucónico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido glucónico-gluconato de potasio, etc.), tampones de oxalato (por ejemplo mezcla de oxalato de sodio, mezcla de ácido oxálico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido oxálico-oxalato de potasio, etc.), tampones de lactato (por ejemplo, mezcla de ácido láctico-lactato de sodio, mezcla de ácido láctico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido láctico-lactato de potasio, etc.) y tampones de acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético-acetato de sodio, mezcla de ácido acético-hidróxido de sodio, etc.). Además, se pueden utilizar tampones de fosfato, tampones de histidina y sales de trimetilamina como Tris.

[0122 ] Pueden añadirse conservantes para retardar el crecimiento microbiano, y pueden añadirse en cantidades que oscilan entre el 0,2% y el 1% (p/v). Entre los conservantes adecuados se encuentran el fenol, el alcohol bencílico, el meta-cresol, el metilparabeno, el propilparabeno, el cloruro de octadecildimetilbencilamonio, los haluros de benzalconio (por ejemplo, cloruro, bromuro y yoduro), el cloruro de hexametonio y los alquilparabenos como el metilparabeno o el propilparabeno, el catecol, el resorcinol, el ciclohexanol y el 3-pentanol. Para garantizar la isotonicidad de las composiciones líquidas pueden añadirse isotonificadores, a veces conocidos como "estabilizadores", que incluyen alcoholes de azúcares polihídricos, preferentemente trihídricos o superiores, como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. Los estabilizadores se refieren a una amplia categoría de excipientes cuya función puede variar desde un agente de volumen hasta un aditivo que solubiliza el agente terapéutico o ayuda a evitar la desnaturalización o la adherencia a la pared del envase. Los estabilizadores típicos pueden ser alcoholes polihídricos de azúcar (enumerados anteriormente); aminoácidos como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc, azúcares orgánicos o alcoholes de azúcar, como la lactosa, la trehalosa, la estaquiosa, el manitol, el sorbitol, el xilitol, el ribitol, el mioinisitol, el galactitol, el glicerol y similares, incluidos los ciclitoles como el inositol; el polietilenglicol; polímeros de aminoácidos; agentes reductores que contienen azufre, como la urea, el glutatión, el ácido tióctico, el tioglicolato de sodio, el tioglicerol, el a-monotioglicerol y el tiosulfato de sodio; polipéptidos de bajo peso molecular (por ejemplo, péptidos de 10 residuos o menos); proteínas como la albúmina de suero humano, la albúmina de suero bovino, la gelatina o las inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, como los monosacáridos de polivinilpirrolidona, como la xilosa, la manosa, la fructosa y la glucosa; disacáridos como la lactosa, la maltosa, la sacarosa y los trisacáridos como la rafinosa; y polisacáridos como el dextrano. Los estabilizadores pueden estar presentes en el intervalo de 0,1 a 10.000 pesos por parte de peso de proteína activa.

[0123 ] Pueden añadirse tensioactivos o detergentes no iónicos (también conocidos como "agentes humectantes") para ayudar a solubilizar el agente terapéutico, así como para proteger la proteína terapéutica contra la agregación inducida por la agitación, lo que también permite exponer la formulación a la tensión superficial de cizallamiento sin causar la desnaturalización de la proteína. Entre los tensioactivos no iónicos adecuados se encuentran los polisorbatos (20, 80, etc.), los polioxámeros (184, 188, etc.), los polioles plurónicos, los monoéteres de sorbitán polioxilados (TWEEN®-20, TWEEN®-80, etc.). Los tensioactivos no iónicos pueden estar presentes en un intervalo de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, o en un intervalo de aproximadamente 0,07 mg/ml a aproximadamente 0,2 mg/ml.

[0124 ] Otros excipientes diversos incluyen agentes de carga (por ejemplo, almidón), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metionina, vitamina E) y cosolventes.

[0125 ] La formulación del presente documento también puede contener un segundo agente terapéutico además de un polipéptido de la invención. A continuación se ofrecen ejemplos de segundos agentes terapéuticos adecuados.

[0126] El programa de dosificación puede variar desde una vez al mes hasta diariamente, dependiendo de una serie de factores clínicos, incluyendo el tipo de enfermedad, la gravedad de la misma y la sensibilidad del paciente al polipéptido de la invención. En realizaciones específicas, un polipéptido de la invención se administra, dos veces por semana, cada 5 días, una vez por semana, cada 10 días, cada dos semanas, cada tres semanas, cada cuatro semanas o una vez al mes, o en cualquier intervalo entre dos de los valores anteriores, por ejemplo desde cada cuatro semanas hasta cada mes, desde cada 10 días hasta cada dos semanas, o de dos a tres veces por semana, etc.

[0127] La dosificación de un polipéptido de la invención que se va a administrar variará según el polipéptido particular, el sujeto y la naturaleza y gravedad de la enfermedad, la condición física del sujeto, el régimen terapéutico (por ejemplo, si se utiliza un segundo agente terapéutico) y la vía de administración seleccionada; la dosificación adecuada puede determinarse fácilmente por un experto en la técnica.

[0128 ] Un experto en la técnica reconocerá que la cantidad óptima y el espaciamiento de las dosificaciones individuales de un polipéptido de la invención se determinarán por la naturaleza y el alcance de la condición que se está tratando, la forma, la ruta y el sitio de administración, y la edad y la condición del sujeto particular que se está tratando, y que un médico determinará en última instancia las dosificaciones apropiadas que se utilizarán. Esta dosificaciones puede repetirse tantas veces como sea necesario. Si se producen efectos secundarios, se puede modificar o reducir la cantidad y/o la frecuencia de la dosificación, de acuerdo con la práctica clínica habitual.

La afinidad de unión del polipéptido de la presente invención al FVIII es mayor que la de un polipéptido de referencia que tiene la misma secuencia de aminoácidos excepto por las modificaciones en SEC. ID Núm.: 3.

La afinidad de unión de una molécula de VWF a una molécula de Factor VIII se puede determinar por medio de un ensayo de unión utilizado en la técnica. Por ejemplo, la molécula de VWF se puede inmovilizar en un soporte sólido, se aplican concentraciones crecientes de Factor VIII, se incuba durante un cierto período de tiempo y, tras el lavado, se determina el Factor VIII unido con un ensayo cromogénico. La constante de afinidad o de disociación se puede determinar entonces por medio del análisis de Scatchard u otro procedimiento adecuado. Un procedimiento para determinar la afinidad de unión del Factor VIII humano al Factor von Willebrand se describe en Vlot et al. (1995), Blood, Volumen 85, Número 11, 3150 a 3157.

Cualquier indicación en la presente memoria de afinidad, que incluye las constantes de disociación, se refiere preferentemente a la unión del VWF modificado de la invención, o del polipéptido de la invención al FVIII. La secuencia de aminoácidos del prepropolíptido del FVIII humano nativo se muestra en la SEC. ID Núm.: 15.

Como la interacción del VWF con el FVIII tiene típicamente una alta tasa de activación, los cambios en la constante de disociación dependen en gran medida de los cambios en la tasa de desactivación. En consecuencia, el principal objetivo para aumentar la asociación del VWF con el FVIII implica esfuerzos para disminuir la tasa de desactivación entre el FVIII y el VWF. Preferentemente, la tasa de desactivación del VWF y el FVIII modificados en comparación con el VWF y el FVIII de tipo salvaje es al menos dos veces menor, más preferentemente al menos 5 veces menor, preferentemente al menos 10 veces menor y más preferentemente al menos 20 veces menor.

La constante de disociación del complejo formado por el VWF y el FVIII es preferentemente 0,2 nmol/L o menos, más preferentemente 0,175 nmol/L o menos, más preferentemente 0,15 nmol/L o menos, más preferentemente 0,125 nmol/L o menos, más preferentemente 0,1 nmol/L o menos, más preferentemente 0,05 nmol/L o menos, más preferentemente 0,01 nmol/L o menos.

La constante de disociación KD de un complejo del polipéptido de la invención y el Factor VIII de la SEC. ID Núm.: 15 es típicamente inferior al 90% de la constante de disociación KD de un complejo del polipéptido de referencia (por ejemplo, el polipéptido de la SEC. ID Núm.: 4) y el Factor VIII de la SEC. ID Núm.: 15. La constante de disociación KD de un complejo del polipéptido de la invención y el Factor VIII de la SEC. ID Núm.: 14 es preferentemente inferior al 75%, más preferentemente inferior al 50%, más preferentemente inferior al 25%, más preferentemente inferior al 10%, más preferentemente inferior al 5%, de la constante de disociación KD de un complejo del polipéptido de referencia (por ejemplo, el polipéptido de la SEC. ID Núm.: 3) y el Factor VIII de la SEC. ID Núm.: 15.

El polipéptido de referencia es un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la del polipéptido de la presente invención, excepto por la mutación dentro de los dominios D'-D3 del VWF. Es decir, el polipéptido de referencia tiene preferentemente una secuencia de aminoácidos idéntica a la del polipéptido de la presente invención, con la salvedad de que los dominios D'-D3 en el polipéptido de referencia consisten en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC. ID Núm.: 3. En otras palabras, la única diferencia de secuencia entre el polipéptido de la invención y el polipéptido de referencia reside en la secuencia de aminoácidos de los dominios D'-D3. El polipéptido de referencia se ha preparado preferentemente en las mismas condiciones que el polipéptido de la invención.

Polinucleótidos

La invención se refiere además a un polinucleótido que codifica un VWF modificado o un polipéptido que comprende dicho VWF modificado, como se describe en esta solicitud. El término "polinucleótido" se refiere generalmente a cualquier polirribonucleótido o polideoxirribonucleótido que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. El polinucleótido puede ser ADN de una o dos hebras, ARN de una o dos hebras. Como se utiliza en la presente memoria, el término "polinucleótido" también incluye ADN o ARN que comprenden una o más bases modificadas y/o bases inusuales, tales como la inosina. Se apreciará que se pueden hacer una variedad de modificaciones al ADN y al ARN que sirven para numerosos propósitos útiles conocidos por los expertos en la técnica. El término "polinucleótido", como se emplea en la presente memoria, abarca dichas formas de polinucleótidos modificadas química, enzimática o metabólicamente, así como las formas químicas de ADN y ARN características de los virus y las células, que incluyen, por ejemplo, las células simples y complejas.

Los expertos entenderán que, debido a la degeneración del código genético, un polipéptido dado puede ser codificado por diferentes polinucleótidos. Estas "variantes" están incluidas en esta invención.

Preferentemente, el polinucleótido de la invención es un polinucleótido aislado. El término polinucleótido "aislado" se refiere a un polinucleótido que está sustancialmente libre de otras secuencias de ácido nucleico, tales como y no limitadas a otro ADN y ARN cromosómico y extracromosómico. Los polinucleótidos aislados pueden ser purificados a partir de una célula huésped. Para la obtención de polinucleótidos aislados se pueden utilizar los procedimientos convencionales de purificación de ácidos nucleicos conocidos por los artesanos. El término también incluye los polinucleótidos recombinantes y los polinucleótidos sintetizados químicamente.

La invención se refiere además a un grupo de polinucleótidos que juntos codifican el VWF modificado de la invención, o el polipéptido de la invención que comprende el VWF modificado. Un primer polinucleótido del grupo puede codificar la parte N-terminal del VWF modificado, y un segundo polinucleótido puede codificar la parte C-terminal del VWF modificado.

Otro aspecto de la invención es un plásmido o vector que comprende un polinucleótido de acuerdo con la invención. Preferentemente, el plásmido o vector es un vector de expresión. En una realización particular, el vector es un vector de transferencia para su uso en terapia génica humana.

La invención también se refiere a un grupo de plásmidos o vectores que comprenden el grupo de polinucleótidos anterior. Un primer plásmido o vector puede contener dicho primer polinucleótido, y un segundo plásmido o vector puede contener dicho segundo polinucleótido. Alternativamente, ambas secuencias codificadoras se clonan en un vector de expresión, ya sea mediante el uso de dos secuencias promotoras separadas o un promotor y un elemento del sitio de entrada del ribosoma interno (IRES), que se puede utilizar, por ejemplo, para dirigir la expresión de la furina con el fin de mejorar la generación del FVW maduro.

Todavía otro aspecto de la invención es una célula huésped que comprende un polinucleótido, un plásmido o vector de la invención, o un grupo de polinucleótidos o un grupo de plásmidos o vectores como se describe en la presente memoria.

Las células huésped de la invención se pueden emplear en un procedimiento de producción de un VWF modificado o de un polipéptido que comprenda dicho VWF modificado, que forma parte de esta invención. El procedimiento comprende:

(a) cultivar las células huésped de la invención en condiciones tales que se exprese la proteína modificada deseada; y

(b) opcionalmente, recuperar la proteína modificada deseada de las células huésped o del medio de cultivo. Se prefiere purificar el VWF modificado de la presente invención, o el polipéptido que comprende el VWF modificado hasta > 80% de pureza, más preferentemente > 95% de pureza, y particularmente se prefiere un estado farmacéuticamente puro que sea superior al 99,9% de pureza con respecto a macromoléculas contaminantes, particularmente otras proteínas y ácidos nucleicos, y libre de agentes infecciosos y pirogénicos. Preferentemente, un VWF modificado aislado o purificado de la invención o un polipéptido de la invención está sustancialmente libre de otros polipéptidos no relacionados.

Los diversos productos de la invención son útiles como medicamentos. Por consiguiente, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un VWF modificado o un polipéptido que comprende dicho VWF modificado como se describe en la presente memoria, un polinucleótido de la invención, o un plásmido o vector de la invención.

La invención también se refiere a un procedimiento para tratar a un individuo que padece un trastorno de la coagulación de la sangre, tal como la hemofilia A o B o la VWD. Las referencias a los procedimientos de tratamiento de esta descripción se deben interpretar como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano (o animal) por medio de terapia (o para el diagnóstico).

El procedimiento comprende administrar a dicho individuo una cantidad eficaz de (i) FVIII y del VWF modificado o del polipéptido que comprende el VWF modificado o (ii) del complejo de FVIII con VWF modificado o (iii) del complejo de FVIII con el polipéptido que comprende el VWF modificado como se describe en la presente memoria. En otra realización, el procedimiento comprende la administración al individuo de una cantidad eficaz de un polinucleótido de la invención o de un plásmido o vector de la invención. Alternativamente, el procedimiento puede comprender la administración al individuo de una cantidad eficaz de las células huésped de la invención descritas en la presente memoria.

Expresión de los polipéptidos modificados

La producción de proteínas mutantes recombinantes a altos niveles en células huésped adecuadas requiere el ensamblaje de los polinucleótidos modificados antes mencionados, típicamente ADNc, en unidades transcripcionales eficientes junto con elementos reguladores adecuados en un vector de expresión recombinante que se puede propagar en varios sistemas de expresión de acuerdo con procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Los elementos reguladores transcripcionales eficientes se podrían derivar de los virus que tienen a las células animales como huéspedes naturales o del ADN cromosómico de las células animales. Preferentemente, se pueden utilizar combinaciones promotoras-reforzadoras derivadas del virus Simian 40, adenovirus, virus del polioma BK, citomegalovirus humano o la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous, o combinaciones promotorasreforzadoras que incluyan genes fuertemente transcritos de forma constitutiva en células animales como la betaactina o el GRP78. Para conseguir niveles elevados y estables de ARNm transcrito a partir de los ADNc, la unidad transcripcional debe contener en su parte 3'-proximal una región de ADN que codifique una secuencia de terminación-poliadenilación transcripcional. Preferentemente, esta secuencia se deriva de la región transcripcional temprana del virus Simian 40, del gen de la beta-globina de conejo o del gen del activador tisular del plasminógeno humano.

Los ADNc se integran entonces en el genoma de una línea celular huésped adecuada para la expresión de las proteínas FVIII y/o VWF modificadas. Preferentemente, esta línea celular debe ser una línea celular animal de origen vertebrado para garantizar el correcto plegamiento, la formación de enlaces disulfuro, la glicosilación ligada a la asparagina y otras modificaciones postraduccionales, así como la secreción en el medio de cultivo. Los ejemplos de otras modificaciones postraduccionales son la O-sulfatación de la tirosina y el procesamiento proteolítico de la cadena polipeptídica naciente. Los ejemplos de líneas celulares que se pueden utilizar son las células COS de mono, las células L de ratón, las células C127 de ratón, las células BHK-21 de hámster, las células 293 de riñón embrionario humano y las células de CHO de hámster.

El vector de expresión recombinante que codifica los ADNc correspondientes se puede introducir en una línea celular animal de diversas maneras. Por ejemplo, se pueden crear vectores de expresión recombinantes a partir de vectores basados en diferentes virus animales. Algunos ejemplos son los vectores basados en baculovirus, virus vaccinia, adenovirus y, preferentemente, el virus del papiloma bovino.

Las unidades de transcripción que codifican los ADN correspondientes también se pueden introducir en células animales junto con otro gen recombinante que puede funcionar como un marcador selectivo dominante en estas células para facilitar el aislamiento de clones celulares específicos que hayan integrado el ADN recombinante en su genoma. Los ejemplos de este tipo de genes marcadores dominantes seleccionables son la fosfotransferasa de aminoglicósidos Tn5, que confiere resistencia a la gentamicina (G418), la fosfotransferasa de higromicina, que confiere resistencia a la higromicina, y la acetiltransferasa de puromicina, que confiere resistencia a la puromicina. El vector de expresión recombinante que codifica dicho marcador seleccionable puede residir en el mismo vector que el que codifica el ADNc de la proteína deseada, o bien se puede codificar en un vector separado que se introduce e integra simultáneamente en el genoma de la célula huésped, lo que a menudo da lugar a un estrecho vínculo físico entre las diferentes unidades de transcripción.

Otros tipos de genes marcadores seleccionables que se pueden utilizar junto con el ADNc de la proteína deseada se basan en varias unidades de transcripción que codifican la dihidrofolato reductasa (dhfr). La introducción de este tipo de genes en células que carecen de la actividad dhfr endógena, preferentemente células de CHO (DUKX-B11, DG-44), permitirá a éstas crecer en medios carentes de nucleósidos. Un ejemplo de este medio es el F12 de Ham sin hipoxantina, timidina y glicina. Estos genes dhfr se pueden introducir junto con las unidades transcripcionales de ADNc del FVIII en células de CHO del tipo mencionado, ya sea enlazadas en el mismo vector o en vectores diferentes, para de ese modo crear líneas celulares dhfr-positivas que producen la proteína recombinante.

Si las líneas celulares anteriores se cultivan en presencia del inhibidor citotóxico de dhfr, metotrexato, surgirán nuevas líneas celulares resistentes al metotrexato. Estas líneas celulares pueden producir la proteína recombinante a una tasa mayor debido al número amplificado de dhfr vinculado y las unidades transcripcionales de la proteína deseada. Al propagar estas líneas celulares en concentraciones crecientes de metotrexato (1 a 10000 nM), se pueden obtener nuevas líneas celulares que producen la proteína deseada a un ritmo muy elevado.

Las líneas celulares anteriores que producen la proteína deseada se pueden cultivar a gran escala, ya sea en cultivo en suspensión o en diversos soportes sólidos. Los ejemplos de estos soportes son los microportadores basados en matrices de dextrano o colágeno, o los soportes sólidos en forma de fibras huecas o diversos materiales cerámicos. Cuando se cultivan en cultivo de suspensión celular o en microportadores, el cultivo de las líneas celulares mencionadas se puede llevar a cabo como cultivo en baño o como cultivo en perfusión con producción continua de medio condicionado durante largos períodos de tiempo. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, las líneas celulares anteriores son muy adecuadas para el desarrollo de un proceso industrial para la producción de las proteínas mutantes recombinantes deseadas

Purificación y formulación

La proteína VWF recombinante modificada, que se acumula en el medio de las células secretoras de los tipos anteriores, se puede concentrar y purificar por medio de una variedad de procedimientos bioquímicos y cromatográficos, incluidos los procedimientos que utilizan las diferencias de tamaño, carga, hidrofobicidad, solubilidad, afinidad específica, etc. entre la proteína deseada y otras sustancias en el medio de cultivo celular. Un ejemplo de tal purificación es la adsorción de la proteína mutante recombinante a un anticuerpo monoclonal, dirigido a, por ejemplo, una HLEP, preferentemente albúmina humana, o dirigido al respectivo factor de coagulación, que se inmoviliza sobre un soporte sólido. Tras la adsorción del VWF modificado al soporte, el lavado y la desorción, la proteína se puede purificar aún más por medio de diversas técnicas cromatográficas basadas en las propiedades mencionadas.

El orden de las etapas de purificación se elige, por ejemplo, en función de la capacidad y la selectividad de las etapas, la estabilidad del soporte u otros aspectos. Las etapas de purificación preferidas incluyen, entre otras, etapas de cromatografía de intercambio iónico, etapas de cromatografía de afinidad inmune, etapas de cromatografía de afinidad, etapas de cromatografía de interacción hidrofóbica, etapas de cromatografía de colorantes, etapas de cromatografía de hidroxiapatita, etapas de cromatografía multimodal y etapas de cromatografía de exclusión por tamaño.

Para minimizar el riesgo teórico de contaminaciones por virus, se pueden incluir etapas adicionales en el proceso que proporcionen una inactivación o eliminación efectiva de los virus. Estas etapas son, por ejemplo, el tratamiento térmico en estado líquido o sólido, el tratamiento con disolventes y/o detergentes, la radiación en el espectro visible o UV, la radiación gamma o la nanofiltración.

Los polinucleótidos modificados (por ejemplo, ADN) de esta invención también se pueden integrar en un vector de transferencia para su uso en la terapia génica humana.

Las diversas realizaciones descritas en la presente memoria se pueden combinar entre sí. La presente invención se describirá con más detalle en los siguientes ejemplos de la misma. Esta descripción de realizaciones específicas de la invención se hará en conjunto con las figuras anexas.

El VWF modificado, como se describe en esta invención, se puede formular en preparados farmacéuticos para uso terapéutico. La proteína purificada se puede disolver en soluciones tampón acuosas convencionales fisiológicamente compatibles a las que se pueden añadir, opcionalmente, excipientes farmacéuticos para proporcionar preparados farmacéuticos.

Tales portadores y excipientes farmacéuticos, así como las formulaciones farmacéuticas adecuadas, son muy conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", Frokjaer et al., Taylor & Francis (2000) o "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3ra edición, Kibbe et al., Pharmaceutical Press (2000)). Las técnicas estándar de formulación farmacéutica son muy conocidas por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo 2005 Physicians' Desk Reference®, Thomson Healthcare: Montvale, NJ, 2004 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20ma ed., Gennaro et al., Eds. Lippincott Williams & Wilkins: Filadelfia, PA, 2000). En particular, la composición farmacéutica que comprende la variante polipeptídica de la invención se puede formular en forma liofilizada o líquida estable. La variante polipeptídica puede ser liofilizada por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Las formulaciones liofilizadas se reconstituyen antes de su uso por medio de la adición de uno o más diluyentes aceptables para uso farmacéutico, tales como agua estéril para inyección o solución salina fisiológica estéril.

Las formulaciones de la composición se entregan al individuo por cualquier medio de administración adecuado para uso farmacéutico. Se conocen varios sistemas de administración que se pueden utilizar para administrar la composición por cualquier vía conveniente. Preferentemente, las composiciones de la invención se administran por vía sistémica. Para el uso sistémico, las proteínas de la invención se formulan para la administración parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intracerebral, intrapulmonar, intranasal o transdérmica) o enteral (por ejemplo, oral, vaginal o rectal) de acuerdo con los procedimientos convencionales. Las vías de administración más preferentes son la intravenosa y la subcutánea. Las formulaciones se pueden administrar de forma continua por infusión o por inyección en bolo. Algunas formulaciones abarcan sistemas de liberación lenta.

Las proteínas de la presente invención se administran a los pacientes en una dosis terapéuticamente eficaz, es decir, una dosis que es suficiente para producir los efectos deseados, para prevenir o disminuir la gravedad o la propagación de la condición o indicación que se está tratando sin alcanzar una dosis que produzca efectos secundarios adversos intolerables. La dosis exacta depende de numerosos factores como, por ejemplo, la indicación, la formulación y el modo de administración, y se debe determinar en ensayos preclínicos y clínicos para cada indicación respectiva.

La composición farmacéutica de la invención se puede administrar sola o junto con otros agentes terapéuticos. Estos agentes se pueden incorporar como parte del mismo producto farmacéutico. Un ejemplo de tal agente es la combinación de VWF modificado con FVlII.

Los "glicanos ligados al N" son oligosacáridos que están unidos covalentemente a los residuos de asparagina de un polipéptido. Las galactosas terminales de dichos glicanos ligados a la N se pueden modificar por medio de la unión de un ácido siálico ligado a la a-2,3 o a la a-2,6.

El término "ácido siálico" se refiere a los derivados sustituidos en N u O del ácido neuramínico que se suelen encontrar como monosacáridos terminales de los oligosacáridos animales (para una revisión, véase Varkis (1992) Glycobiology vol. 2 Núm. 1 págs. 25 a 40). El ácido siálico más común es el ácido N-acetil neuramínico. Una "sialilación aumentada" significa que al menos el 85% de los N-glicanos de la glicoproteína comprenden, en promedio, al menos una fracción de ácido siálico. A modo de ejemplo no limitativo, un "aumento de la sialilación de al menos el 85%" se determina como en el Ejemplo 6 de la presente invención, es decir, por medio de la escisión enzimática de todos los N-glicanos de una glicoproteína de interés dada y la determinación posterior de la cantidad de N-glicanos escindidos sin ácidos siálicos ("N-glicanos asialo") y la cantidad total de todos los N-glicanos escindidos. Una "sialilación de al menos el 85%" corresponde entonces a una cantidad del 15% de N-glicanos asialo o menos de la cantidad total de todos los N-glicanos escindidos.

En una primera etapa, los procedimientos de la invención comprenden la etapa de proporcionar células que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende un Factor de von Willebrand (VWF) truncado.

Como se describe con más detalle a continuación, el polipéptido de la invención se puede preparar por medio de un procedimiento que utiliza células que comprenden un ácido nucleico que codifica el polipéptido que comprende el VWF truncado. El ácido nucleico se introduce en las células huésped adecuadas por medio de técnicas conocidas per se.

Cultivo de las células

En una realización, la invención comprende cultivar las células a una temperatura inferior a 36,0 °C. Este procedimiento comprende cultivar las células en condiciones que permitan la expresión del polipéptido.

El medio basal seleccionado para cultivar la línea celular huésped no es crítico para la presente invención y puede ser cualquiera de, o una combinación de, los conocidos en la técnica que son adecuados para cultivar células de mamífero. Los medios tales como el Medio Eagle Modificado de Dulbecco, el Medio F-12 de Ham, el Medio Esencial Mínimo de Eagle y el Medio RPMI-1640 y similares están disponibles comercialmente. La adición de factores de crecimiento, tales como la insulina recombinante, es opcional. En una realización, el medio está "libre de proteínas" en el sentido de que está completamente libre de cualquier proteína o al menos está libre de cualquier proteína que no sea producida recombinantemente. La albúmina de suero humano se puede utilizar como suplemento de cultivo sin suero para la producción del polipéptido. Preferentemente, el medio contiene un inhibidor de la proteasa, tal como un inhibidor de la serina proteasa, que es adecuado para el cultivo de tejidos y que es de origen sintético o vegetal.

En general, la presente invención se puede utilizar con cualquier procedimiento de cultivo celular que sea susceptible de expresar polipéptidos. Por ejemplo, las células pueden crecer en cultivos por partidas o alimentados por partidas, donde el cultivo se termina después de una expresión suficiente del polipéptido, tras lo cual se cosecha el polipéptido expresado. Alternativamente, las células pueden crecer en cultivos continuos (por ejemplo, cultivos de perfusión), en los que el cultivo no se termina y se añaden nuevos nutrientes y otros componentes de forma periódica o continua al cultivo, durante el cual el polipéptido expresado se cosecha de forma periódica o continua. Esta última forma de realización es preferente si el procedimiento comprende un cambio de temperatura como se describe a continuación. El cultivo puede ser de cualquier tipo convencional, tal como, por ejemplo, por partidas, por partidas alimentados o continuo, pero es preferentemente continuo. Los cultivos continuos adecuados incluyen el cultivo por perfusión.

Las células se pueden cultivar en cualquier volumen conveniente seleccionado por el profesional. Por ejemplo, las células se pueden cultivar en recipientes de reacción a pequeña escala cuyo volumen oscila entre unos pocos mililitros y varios litros. Alternativamente, las células se pueden cultivar en biorreactores comerciales a gran escala cuyo volumen oscila entre aproximadamente 1 litro y 10, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 8.000, 10.000, 12.000 litros o más, o cualquier volumen intermedio. El cultivo se lleva a cabo normalmente en un biorreactor, que suele ser un recipiente de acero inoxidable, vidrio o plástico de 1 (uno) a 10.000 (diez mil) litros de capacidad, por ejemplo, 5, 10, 50, 100, 1.000, 2.500, 5.000 u 8.000 litros. El recipiente suele ser rígido, pero se pueden utilizar bolsas de plástico flexibles, sobre todo para volúmenes pequeños. Por lo general, son del tipo "de un solo uso".

Las células de mamífero, tales como las células de CHO y BHK, se cultivan generalmente como cultivos en suspensión. Es decir, las células están suspendidas en el medio, en lugar de adherirse a un soporte sólido. Las células se pueden inmovilizar alternativamente en un portador, en particular en un microportador. Los portadores porosos, tales como Cytoline®, Cytopore® o Cytodex®, pueden ser especialmente adecuados.

Para obtener una alta sialilación, las células (por ejemplo, las células de CHO) se cultivan preferentemente a una temperatura disminuida, por ejemplo, a menos de 36,0 °C. "Temperatura disminuida" se refiere a una temperatura que es inferior a la temperatura óptima o a la temperatura normal para el crecimiento de la línea celular respectiva. Para la mayoría de las células de mamíferos la temperatura normal es de 37 °C. Por lo tanto, se prefiere de acuerdo con la invención que las células (por ejemplo, las células de CHO) se cultiven a una temperatura reducida de 30,0 a 36,0 °C, de 30,5 a 35,5 °C, de 31,0 a 35,0 °C, de 31,5 a 34,5 °C, de 32,0 a 34,0 °C, o de32,5 a 33,5 °C.

Preferentemente, las células se cultivan a una temperatura reducida de 30,0 °C ± 1,0 °C, 31,0 °C ± 1,0 °C, 32,0 °C ± 1.0 °C, 33,0 °C ± 1,0 °C, 34,0 °C ± 1,0 °C, o 35,0 °C ± 1,0 °C.

La disminución de la temperatura se mantiene durante un período de tiempo suficiente para aumentar la sialilación del polipéptido a expresar. Preferentemente, la temperatura reducida se mantiene durante al menos 1 hora, al menos 6 horas, al menos 12 horas, al menos 18 horas, al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 72 horas, al menos 96 horas, al menos 120 horas o al menos 144 horas. En otras realizaciones, la temperatura reducida se mantiene de 1 hora a 8 semanas, de 6 horas a 6 semanas, de 12 horas a 5 semanas, de 18 horas a 4 semanas, de 24 horas a 3 semanas, de 48 horas a 14 días, de 72 horas a 10 días, o de 3 a 7 días.

Para lograr esto, un cultivo puede ser sometido a uno o más cambios de temperatura durante el curso del cultivo. Al cambiar la temperatura de un cultivo, el cambio de temperatura puede ser relativamente gradual. Por ejemplo, puede tardar varias horas o días en completar el cambio de temperatura. Alternativamente, el cambio de temperatura puede ser relativamente abrupto. La temperatura se puede aumentar o reducir constantemente durante el proceso de cultivo. Alternativamente, la temperatura se puede aumentar o disminuir en cantidades discretas en varios momentos durante el proceso de cultivo. Las temperaturas posteriores o intervalos de temperatura pueden ser inferiores o superiores a las temperaturas iniciales o anteriores. Los expertos en la técnica entenderán que en esta realización se incluyen múltiples cambios de temperatura discretos. Por ejemplo, la temperatura se puede cambiar una vez (ya sea a una temperatura o intervalo de temperatura más alto o más bajo), las células se mantienen a esta temperatura o intervalo de temperatura durante un cierto período de tiempo, después de lo cual la temperatura puede cambiarse de nuevo a una nueva temperatura o intervalo de temperatura, que puede ser más alta o más baja que la temperatura o el intervalo de temperatura de la temperatura o el intervalo de temperatura anterior. La temperatura del cultivo después de cada turno discreto puede ser constante o se puede mantener dentro de un determinado intervalo de temperaturas.

Típicamente, las células (por ejemplo, células de CHO) se cultivarán inicialmente a una temperatura "normal" de 37.0 °C±1,0 °C hasta que se alcance la densidad celular objetivo. A continuación, el período de cultivo inicial va seguido por un cambio de temperatura a la temperatura reducida. Después de un período de cultivo a la temperatura reducida, puede seguir o no un cambio de temperatura a la temperatura normal. Preferentemente, las células (por ejemplo, las células de CHO) se cultivarán inicialmente a 37,0 °C±1,0 °C durante varios días, y a continuación se fabricarán a una temperatura reducida de 31,0 - 35,0 °C.

Basándose en la presente divulgación, aquellos con conocimientos ordinarios en la técnica podrán seleccionar las temperaturas en las que cultivar las células, dependiendo de las necesidades particulares de la respectiva línea celular y de los requisitos particulares de producción del profesional.

En ciertas realizaciones, los biorreactores por partidas y alimentados por partidas se terminan una vez que el polipéptido expresado alcanza un título suficientemente alto. Adicional o alternativamente, los biorreactores por partidas y alimentados por partidas se pueden terminar una vez que las células alcanzan una densidad suficientemente alta, de acuerdo con las necesidades del profesional. Por ejemplo, el cultivo se puede terminar una vez que las células alcancen el 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 por ciento de la densidad celular máxima viable. Adicionalmente o alternativamente, los biorreactores por partidas y alimentados por partidas pueden ser terminados antes de la acumulación excesiva de productos metabólicos de desecho como el lactato y el amonio.

En ciertos casos, puede ser beneficioso complementar un cultivo celular durante la fase de producción posterior con nutrientes u otros componentes del medio que han sido agotados o metabolizados por las células. Como ejemplos no limitativos, puede ser beneficioso complementar un cultivo celular con hormonas y/u otros factores de crecimiento, iones inorgánicos (tales como, por ejemplo, sodio, cloruro, calcio, magnesio y fosfato), tampones, vitaminas, nucleósidos o nucleótidos, oligoelementos (compuestos inorgánicos normalmente presentes en concentraciones finales muy bajas), aminoácidos, lípidos o glucosa u otra fuente de energía. Dichos componentes suplementarios pueden ser añadidos al cultivo celular de una sola vez, o pueden ser proporcionados al cultivo celular en una serie de adiciones o pueden ser proporcionados junto con el medio fresco durante un cultivo de perfusión.

Como alternativa a los biorreactores por partidas y alimentados por partidas, la invención también se puede practicar cuando las células que expresan un polipéptido de la invención se cultivan en biorreactores de perfusión continua. Los expertos en la técnica podrán adaptar condiciones específicas de cultivo celular para optimizar ciertas características del cultivo celular, que incluye, pero sin limitarse a ello, la tasa de crecimiento, la viabilidad celular, la densidad celular final del cultivo celular, la concentración final de subproductos metabólicos perjudiciales tales como el lactato y el amonio, el título del polipéptido expresado, la extensión y la composición de las cadenas laterales de oligosacáridos o cualquier combinación de estas u otras condiciones que el profesional considere importantes. Aislamiento del polipéptido expresado

En general, será típicamente deseable aislar y/o purificar polipéptidos expresados de acuerdo con la presente invención. En ciertas realizaciones, el polipéptido expresado se secreta en el medio y, por lo tanto, las células y otros sólidos se pueden remover, como por ejemplo, por medio de centrifugación o filtrado, como primera etapa en el proceso de purificación.

El polipéptido expresado se puede aislar y purificar por procedimientos estándar que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, exclusión por tamaño y cromatografía de hidroxiapatita), filtración en gel, centrifugación o solubilidad diferencial, precipitación con etanol y/o por cualquier otra técnica disponible para la purificación de proteínas (Véase, por ejemplo, Scopes, Protein Purification Principies and Practice 2da Edición, Springer-Verlag, Nueva York, 1987 Higgins, S. J. y Hames, B. D. (eds.), Protein Expression: A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999y Deutscher, M. P., Simon, M. I., Abelson, J. N. (eds.), Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, Vol. 182), Academic Press, 1997). Para la cromatografía de inmunoafinidad en particular, el polipéptido se puede aislar por medio de la unión a una columna de afinidad que comprende anticuerpos que fueron criados contra ese polipéptido y fueron fijados a un soporte estacionario. Alternativamente, se pueden unir al polipéptido etiquetas de afinidad, tales como una secuencia de la capa de la gripe, poli-histidina o glutatión-S-transferasa, por medio de técnicas recombinantes estándar, para permitir una fácil purificación por medio del paso por la columna de afinidad apropiada. Los inhibidores de la proteasa, tales como el fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), la leupeptina, la pepstatina o la aprotinina, se pueden añadir en cualquiera o en todas las etapas a fin de reducir o eliminar la degradación del polipéptido durante el proceso de purificación. Los inhibidores de la proteasa son particularmente ventajosos cuando las células deben ser lisadas para aislar y purificar el polipéptido expresado. Adicional o alternativamente, se pueden añadir inhibidores de glicosidasa en cualquiera o en todas las etapas a fin de reducir o eliminar el recorte enzimático de las cadenas de oligosacáridos unidas covalentemente.

Los polipéptidos expresados de acuerdo con la presente invención tienen una sialilación más extensa que la que tendrían si se cultivaran en condiciones tradicionales de cultivo celular. Por lo tanto, un beneficio práctico de la presente invención que se puede explotar en la etapa de purificación es que los residuos de ácido siálico adicionales y/o alterados en un polipéptido cultivado de acuerdo con algunos de los presentes procedimientos inventivos pueden conferirle propiedades bioquímicas diferentes que pueden ser utilizadas por el profesional para purificar ese polipéptido más fácilmente, o con una mayor pureza, de lo que sería posible para un polipéptido cultivado de acuerdo con procedimientos más tradicionales. Por ejemplo, el polipéptido se puede purificar o enriquecer en gran medida por medio de cromatografía de intercambio aniónico, aprovechando la carga negativa de los residuos de ácido siálico. De este modo, se puede lograr un mayor enriquecimiento del polipéptido con alta sialilación.

En otra realización, la sialilación del polipéptido obtenido por un procedimiento de la invención se puede aumentar aún más poniendo en contacto el polipéptido con una sialiltransferasa in vitro. La sialiltransferasa es típicamente una sialiltransferasa de mamífero, preferentemente una sialiltransferasa humana. La sialiltransferasa puede ser una a-2,3-sialiltransferasa y/o una a-2,6-sialiltransferasa. Preferentemente, la sialiltransferasa es una a-2,3-sialiltransferasa humana (Genbank NP_775479-ST3GAL 1) y/o una a-2,6-sialiltransferasa humana. Más preferentemente, la sialiltransferasa es la a-2,6-sialiltransferasa humana identificada por el Genbank NP_003023-ST6GAL 1). También está presente en la reacción in vitro un donante de grupo sialilo, o donante de ácido siálico. Entre los donantes adecuados se encuentran, por ejemplo, el ácido citidina-5-monofosfórico-N-acetilneuramínico (CMP-NANA), catálogo de Roche núm. 05974003103. Un kit adecuado para la sialilación in vitro está disponible a partir de Roche (Número de Catálogo 07012250103).

Los expertos en la técnica apreciarán que la técnica de purificación exacta variará dependiendo del carácter del polipéptido a purificar, el carácter de las células de las que se expresa el polipéptido, y/o la composición del medio en el que se cultivaron las células.

Como se ha mencionado anteriormente, la invención, en un segundo aspecto, se refiere a un procedimiento de producción de un polipéptido que comprende N-glicanos con sialilación aumentada, que comprende (i) proporcionar células que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende un Factor de von Willebrand (VWF) truncado y un ácido nucleico recombinante que codifica una a-2,3-sialiltransferasa y/o una a-2,6-sialiltransferasa, preferentemente una a-2,6-sialiltransferasa, y (ii) cultivar las células en condiciones que permitan la expresión del polipéptido.

La a-2,3-sialiltransferasa es preferentemente una a-2,3-sialiltransferasa humana. La secuencia de ADNc que codifica la a-2,3-sialiltransferasa humana se muestra en la SEC. ID Núm.: 12, y basándose en ella los expertos pueden diseñar vectores de expresión adecuados que contengan una secuencia codificadora de la a-2,3-sialiltransferasa. La a-2,6-sialiltransferasa es preferentemente una a-2,6-sialiltransferasa humana. La secuencia de ADNc que codifica la a-2,6-sialiltransferasa humana se muestra en la SEC. ID Núm.: 31, y basándose en ella los expertos pueden diseñar vectores de expresión adecuados que contengan una secuencia codificadora de la a-2,6-sialiltransferasa. Las células transfectadas se pueden cultivar en condiciones que permitan la expresión del polipéptido de acuerdo con procedimientos de cultivo conocidos.

El polipéptido se puede recuperar y/o aislar mediante el uso de técnicas de purificación establecidas.

Polipéptido de la invención

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, dicho polipéptido es una glicoproteína que comprende N-glicanos, y en la que preferentemente al menos el 85%, preferentemente al menos el 90% de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, al menos una fracción de ácido siálico. En realizaciones preferidas, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, o al menos el 99%, de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, al menos una fracción de ácido siálico. Los inventores descubrieron que los polipéptidos que comprenden fragmentos de FVW altamente sialilados no sólo pueden tener una vida media más prolongada por sí mismos, sino que también pueden ser capaces de prolongar aún más la vida media del FVIII coadministrado. En otras palabras, la administración del polipéptido de la invención conduce a una semivida prolongada y/o a una eliminación reducida del FVIII coadministrado.

De acuerdo con otra realización preferida, el polipéptido de la invención comprende N-glicanos, en los que al menos el 50% de los grupos sialilo de los N-glicanos de los polipéptidos son grupos sialilo ligados a a-2,6. En general, los grupos sialilo terminales pueden estar unidos a los grupos galactosa a través de un enlace a-2,3- o a través de un enlace a-2,6. Típicamente, los N-glicanos del polipéptido de la invención comprenden más grupos sialilo ligados a a-2,6 que a a-2,3. Preferentemente, al menos el 60%, o al menos el 70%, o al menos el 80%, o al menos el 90% de los grupos sialilo de los N-glicanos son grupos sialilo ligados a a-2,6. Estas realizaciones pueden obtenerse, por ejemplo, coexpresando la a-2,6-sialiltransferasa humana en células de mamífero.

En una realización, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, o al menos el 99%, de los N-glicanos del polipéptido de la invención comprenden al menos un grupo de ácido siálico. En otra realización, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% de los N-glicanos del polipéptido de la invención comprenden al menos un grupo de ácido siálico.

[0197 ] En otra realización, menos del 15%, menos del 12%, menos del 10%, o menos del 8%, o menos del 6%, o menos del 5%, o menos del 4%, o menos del 3%, o menos del 2% o incluso menos del 1% de los N-glicanos del polipéptido de la invención son asialo-N-glicanos, es decir, son N-glicanos que carecen de un grupo ácido siálico. En otra realización, menos del 15%, menos del 12%, menos del 10%, o menos del 8%, o menos del 6%, o menos del 5%, o menos del 4%, o menos del 3%, o menos del 2% o incluso menos del 1% de los N-glicanos del polipéptido de la invención son asialo-N-glicanos, es decir, no tienen un grupo ácido siálico.

En otra realización, menos del 25%, menos del 12%, menos del 10%, o menos del 20%, o menos del 15%, o menos del 10%, o menos del 4%, o menos del 3%, o menos del 2% o incluso menos del 1% de los N-glicanos del polipéptido de la invención son asialo-N-glicanos, es decir, son N-glicanos que carecen de un grupo ácido siálico. En otra realización, menos del 25%, menos del 20%, menos del 15% o menos del 10% de los N-glicanos del VWF truncado dentro del polipéptido de la invención son monosialo-N-glicanos, es decir, son N-glicanos con un grupo de ácido siálico. A modo de ejemplo no limitativo, la cantidad de N-glicanos monosialilados se puede determinar como se detalla en el Ejemplo 6.

En otra realización, al menos el 20%, o al menos el 25%, de los N-glicanos del polipéptido de la invención son disialo-N-glicanos, es decir, son N-glicanos con 2 grupos de ácido siálico. En otra realización, al menos el 20%, o al menos el 25%, de los N-glicanos del VWF truncado dentro del polipéptido de la invención son disialo-N-glicanos. En otra realización, al menos el 10%, o al menos el 15%, o al menos el 20%, o al menos el 25%, de los N-glicanos del polipéptido de la invención son trisialo-N-glicanos, es decir, son N-glicanos con 3 grupos de ácido siálico. En otra realización, al menos el 10%, o al menos el 15%, o al menos el 20%, o al menos el 25%, de los N-glicanos del VWF truncado dentro del polipéptido de la invención son trisialo-N-glicanos.

En otra realización, al menos el 5%, o al menos el 10%, de los N-glicanos del polipéptido de la invención son tetrasialo-N-glicanos, es decir, son N-glicanos con 4 grupos de ácido siálico. En otra realización, al menos el 10%, o al menos el 15%, de los N-glicanos del VWF truncado dentro del polipéptido de la invención son tetrasialo-N-glicanos.

En otra realización, al menos el 50%, o al menos el 60%, o al menos el 70%, o al menos el 80% de los N-glicanos del polipéptido de la invención comprenden dos o más grupos de ácido siálico. En otra realización, al menos el 50%, ,o al menos el 60%, o al menos el 70%, o al menos el 80% de los N-glicanos del VWF truncado dentro del polipéptido de la invención comprenden dos o más grupos de ácido siálico.

[0203 ] Las realizaciones descritas anteriormente pueden combinarse entre sí. Todos los porcentajes de N-glicanos mencionados anteriormente, o cualquier indicación del grado de sialilación, deben entenderse como porcentajes o grados medios, es decir, se refieren a una población de moléculas, no a una única molécula. Está claro que la glicosilación o sialilación de las moléculas individuales de glicoproteínas dentro de una población de glicoproteínas mostrará cierta heterogeneidad.

Otro aspecto de la presente invención es un kit farmacéutico que comprende (i) un polipéptido como se define anteriormente y (ii) un Factor VIII. Preferentemente, el polipéptido y el FVIII están contenidos en composiciones separadas.

Otro aspecto de la presente invención es un kit farmacéutico que comprende (i) un polipéptido como se define anteriormente y (ii) un Factor VIII, para su uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de un trastorno de la coagulación sanguínea.

En la Tabla 3 se presenta un sumario de las secuencias mencionadas en la presente memoria.

Tabla 3:

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Mutantes del FvW con mejor unión al FVIII

Antecedentes

Como se ha comentado anteriormente y en la Solicitud Internacional de Patente en tramitación Núm. PCT/AU2015/050369 la mayor parte del FVIII circulante está en complejo con el VWF. En los seres humanos, el FVIII se elimina de la sangre con un t-i^/2 de aproximadamente 2 horas y 16 horas en ausencia y presencia de VWF, respectivamente. Aunque el VWF imparte un aumento en la vida media del FVIII, también pone un límite superior a la t-i^/2 que está dictada por su propia vida media. El documento US 8.575.104 desvela una proteína de fusión VWF-albúmina. Esta proteína de fusión tiene una vida media cinco veces más larga que el FVW de tipo salvaje en un modelo de roedores. Un complejo estable entre esta proteína de fusión y el FVIII puede conferir beneficios adicionales a la vida media del FVIII. Aunque la constante de unión de equilibrio para la interacción FVIII/vWF es alta, la cinética de unión es rápida y cualquier FVIII en complejo con la proteína de fusión VWF-albúmina se intercambiará rápidamente con el vWF endógeno durante la infusión. Por consiguiente, si la tasa de desactivación del FVIII con la fusión VWF-albúmina es sustancialmente equivalente a la tasa de desactivación del FVIII con el VWF nativo, el uso de la fusión VWF-albúmina no proporcionará ningún aumento sustancial de la vida media del FVIII.

En consecuencia, a fin de aprovechar la mayor vida media de la fusión VWF-albúmina para extender la vida media del FVIII es necesario disminuir la tasa de desactivación del FVIII con la fusión de VWF-albúmina. A partir de estudios de modelización que aprovechan las mediciones llevadas a cabo en pacientes con la enfermedad de von Willebrand de tipo 2N, en los que el nivel de VWF es normal pero la capacidad del VWF para asociarse con el FVIII está gravemente disminuida, se ha estimado que se requiere una disminución de al menos cinco veces la tasa de desactivación para proporcionar una mejora clínicamente relevante en la vida media del FVIII. La relación postulada entre la disminución de la tasa de desactivación de la fusión FVIII-VWF-albúmina y el aumento de la vida media del FVIII se establece en la Tabla 4.

Tabla 4:

En un esfuerzo por disminuir la tasa de desactivación de la fusión VWF-albúmina del FVIII, se llevaron a cabo experimentos para evaluar si la proteína de fusión VWF-albúmina mutante podría proporcionar una tasa de desactivación del FVIII significativamente más lenta, para de ese modo proporcionar una opción viable para extender la vida media del FVIII a través de la asociación estable con la proteína de fusión VWF-albúmina.

Se construyeron una serie de mutantes alrededor de las posiciones de aminoácidos 764, 765, 766, 768, 769, 773, 806 y 809 del FvW con la intención de disminuir la velocidad de disociación del FVIII unido. En estos experimentos se utilizó una forma recombinante de FVIII. Este FVIII se describe en Zollner et al. 2013, Thrombosis Research, 132:280 a 287. Inicialmente, la unión del FVIII se midió para las construcciones del FvW que tenían uno de los residuos mencionados mutados a todos los aminoácidos codificados genéticamente, excluyendo la cisteína. Tras la identificación de ligantes mejorados, se produjeron conjuntos adicionales de variantes que incluían combinaciones de mutaciones. Además, como la prolongación de la vida media proporcionada por la fusión de albúmina depende del reciclaje mediado por el FcRn, también se probó un número de los mutantes a un pH de 5,5. Los resultados de las diversas mutaciones se muestran en las Tablas 5 a 20.

Procedimientos

Se obtuvo un ADNc sintético, optimizado por codones, que codifica los dominios D' y D3 del Factor von Willebrand humano (vWF; aminoácidos (aa) 764-1270 (SEC. ID Núm.: 2); basado en el número de acceso del GenBank. NP_000543 se obtuvo de GeneART AG (Regensberg, Alemania). Este fue modificado en el extremo 5' para codificar su propio péptido señal (aa1 a 22) y en el extremo 3' para codificar una etiqueta C-terminal 8xHis. El constructo (HuvWF[764-1270]-8His) se clonó direccionalmente en el vector de expresión para mamíferos pcDNA3.1 (Invitrogen, EE.UU.) con una secuencia consenso de Kozak (GCCACC) antes de la metionina inicial y un doble codón de parada (TGA) en el extremo 3' del marco de lectura abierto, y la secuencia del plásmido se confirmó por medio de secuenciación automática. Este plásmido de expresión se utilizó entonces como plantilla para realizar cambios de uno, dos o tres residuos en Ser764, Leu765, Ser766 o Lys773 mediante el uso de técnicas estándar de PCR y las construcciones se clonaron en pcDNA3.1 y se secuenciaron como se ha descrito anteriormente. También se sintetizó un segundo ADNc optimizado en codones que codifica los dominios D1 y D2 (aa1-762) de Hu-vWF con una etiqueta FLAG C-terminal (DYKDDDDK), que se obtuvo de GeneArt; se clonó como se ha indicado anteriormente en pcDNA3.1 y se secuenció.

Para la expresión transitoria en mamíferos, se cultivaron células en suspensión FreestyleTM 293 (Invitrogen) hasta 1,1 x 106 células/ml en 5ml de medio de expresión Freestyle (Invitrogen). Se preincubaron 7 pl de reactivo de transfección 293Fectin (Invitrogen) durante 5 minutos con 167 pl de medio Opti-MEM I (Invitrogen), y a continuación se añadieron 2,5 □g de ADN de plásmido que codifica el Hu-vWF[764-1270]-8His de tipo salvaje y 2,5 □g de ADN de plásmido que codifica el Hu-vWF[1-762]-FLAG, y la mezcla se incubó durante otros 20 minutos. El complejo ADN-293Fectina se añadió a las células, que se cultivaron durante 6 días a 37 °C, 8% de CO² en una incubadora con agitación a 250 rpm. Los sobrenadantes de los cultivos se recolectaron por medio de centrifugación a 2.000 rpm durante 5 minutos y se almacenaron a 4 °C para su análisis.

La cinética de unión se investigó por medio de resonancia de plasmón superficial mediante el uso de un biosensor Biacore 4000 a 37 °C. Cada mutante se capturó del medio de cultivo celular a una densidad de 40-150RU en un chip sensor CM-5 preinmovilizado con anticuerpo anti-His (14.000 RU). En un estudio inicial de cribado, se inyectó FVIII sobre los mutantes capturados durante 5 minutos a 1nM y se monitorizó la disociación durante 5 minutos. Los mutantes que mostraron una disminución de la kd en relación con los de tipo salvaje se volvieron a examinar con la inyección de FVIII durante 5 minutos a 1, 0,5 y 0,25nM, y se monitorizó la disociación durante 30 minutos.

Todos los sensorgramas fueron doblemente referenciados por sustracción de las señales de un punto de referencia (que contenía sólo anticuerpos inmovilizados contra His) y de una inyección en blanco. La cinética de unión se determinó por medio del ajuste de los sensorgramas de doble referencia a un modelo cinético 1:1.

Resultados

La mutagénesis de la serina 764 a prolina generó una variante del FvW con una disminución de aproximadamente 3,5 veces en la tasa de desactivación y un aumento de 4,4 veces en la afinidad. Las mutaciones en la posición 765 no produjeron mejores aglutinantes con respecto al vWF de tipo salvaje. Numerosas mutaciones en la posición 766 generaron moléculas de FvW variantes con características mejoradas de la tasa de desactivación y mayor afinidad que el FvW de tipo salvaje (His, Arg, Val, Tyr, Trp, Thr, Phe, Ile, Gln, Gly y Asn). Dado que la prolina en la posición 764 confería una mejora significativa a la tasa de desactivación mientras que numerosas mutaciones en la posición 766 impactaban positivamente en la unión, se generó una serie de mutantes que consistían en S764P y todos los demás aminoácidos codificados genéticamente, excluyendo la cisteína, en la posición 766. Se produjeron mutaciones similares que contenían S764P y todos los demás aminoácidos codificados genéticamente, excluyendo la cisteína, en la posición 765. Un número de estos dobles mutantes tienen una tasa de desactivación significativamente más lenta y una mayor afinidad con respecto al FvW de tipo salvaje. En particular, S764P en combinación con S766I genera una variante de vWF con una disminución de 22 veces en la tasa de desactivación y un aumento de 30 veces en la afinidad.

Ejemplo 2

Fusiones de vWF de albúmina de suero humano con mutantes puntuales y unión al FVIII

Se llevaron a cabo experimentos posteriores mediante el uso de vWF fusionado con albúmina de suero humano. Se obtuvo de GeneART Ag (Regensberg, Alemania) un ADNc sintético, optimizado en cuanto a codones, que codifica los dominios D' y D3 del factor von Willebrand humano (vWF; aminoácidos (aa) 764-1242; basado en el número de acceso del GenBank. NP_000543) se obtuvo de GeneART AG (Regensberg, Alemania). Este se modificó en el extremo 5' para codificar su propio péptido señal (aa1-22) y en el extremo 3' para codificar la albúmina de suero humano (HSA) por medio de un enlazador de glicina-serina y se clonó como se describe en el Ejemplo 1. Se utilizó el mismo proceso descrito en el Ejemplo 1 para generar las diversas mutaciones del FVW y las construcciones resultantes se transfectaron transitoriamente en células en suspensión Freestyle™ 293. Las proteínas vWF-HSA se purificaron a partir de las cosechas mediante el uso de resina de afinidad Capture Select™ Human Albumin y el dímero vWF-HSA se purificó aún más por medio de cromatografía de exclusión por tamaño preparativa. Se estableció un análisis cinético detallado a pH 7 para los principales candidatos, incluidos los controles.

El anticuerpo anti-HSA de ratón se inmovilizó en un chip CM5 mediante el uso de la química estándar de acoplamiento NHS/EDC. Normalmente, el nivel de inmovilización estaba entre 10.000 y 12.000 UI. Cada partida de vWF-HSA (monómeros y dímeros) se capturó en un único punto en cada celda de flujo durante 2 minutos a varias concentraciones que oscilaban entre 0,1 y 1|jg/ml. Los niveles de captura oscilaron entre 40 y 150RU. Se utilizó como referencia una mancha adyacente en la que se inmovilizó el anti-vWF, pero no se capturó el vWF-HSA. La captura se llevó a cabo en cada ciclo, antes del análisis de la unión del FVIII.

El FVIII se inyectó al azar y por duplicado sobre todos los puntos en todas las celdas de flujo a concentraciones variables dependiendo de la afinidad de la interacción y del pH del análisis. La asociación y la disociación del FVIII se controlaron durante varios intervalos de tiempo que se adaptaban mejor a la interacción que tenía lugar.

Después del período de disociación, la superficie fue regenerada con una inyección de 30 segundos de Glicina 25mM pH2,6. El tampón de funcionamiento fue 10mM de HEPES, 150mM de NaCl, 10mM de Citrato de Na, 2,5mM de CaCl² , 0,1% de BSA, pH 7,3 y pH 5, mientras que el caudal fue de 30 jl/min. Cada interacción se midió 4 veces (n=4) a 37 °C.

Las respuestas para la unión a la mancha de referencia se restaron de las de las manchas capturadas de vWF-HSA. Las respuestas de las inyecciones en blanco se restaron de las de todas las demás muestras para producir sensorgramas de doble referencia. Los sensorgramas de doble referencia se ajustaron a un modelo cinético 1:1, que incluye un término para la limitación del transporte de masa. Las tasas de asociación y disociación se ajustaron globalmente y la Rmáx se ajustó localmente. Los resultados obtenidos se exponen en las Tablas 21 y 22.

Tabla 5:

Tabla 6:

Tabla 7:

Tabla 8:

Tabla 9:

Tabla 10:

Tabla 11:

Tabla 12:

Tabla 13:

Tabla 14:

Tabla 15:

Tabla 16:

Tabla 17:

Tabla 18:

Tabla 19:

Tabla 20:

Tabla 21:

Tabla 22:

Ejemplo 3

En una extensión del trabajo descrito en el documento PCT/AU2015/050369 se investigaron otras mutaciones y combinaciones de mutaciones con énfasis en las modificaciones en el dominio D3. En estos experimentos se utilizó una forma recombinante de FVIII. Este FVIII se describe en Zollner et al. 2013, Thrombosis Research, 132:280 a 287.

Procedimientos

Las construcciones plasmídicas que codifican vWF(763-1242) -HSA y que contienen las mutaciones simples, dobles o triples enumeradas en la Tabla 23 se utilizaron para generar proteínas dímeras de vWF-HSA purificadas mediante el uso de los procedimientos descritos en el Ejemplo 2. Se estableció un análisis cinético detallado a pH 7 para los principales candidatos, incluidos los controles.

El anticuerpo anti-HSA de ratón se inmovilizó en un chip CM5 mediante el uso de la química estándar de acoplamiento NHS/EDC. Normalmente, el nivel de inmovilización era de aproximadamente 14.000 UI. Cada mutante dímero de vWF-HSA se capturó en un solo punto en cada celda de flujo durante 2 minutos a varias concentraciones que iban de 0,1 a 1|jg/ml. Los niveles de captura oscilaron entre 100 y 200RU. Se utilizó como referencia una mancha adyacente en la que se inmovilizó el anti-HSA, pero no se capturó el vWF-HSA. La captura se llevó a cabo en cada ciclo, antes del análisis de la unión del FVIII. En los experimentos iniciales, el Factor VIII se inyectó al azar y por duplicado en todos los puntos y en todas las celdas de flujo en uso a 5, 1 y 1,25nM. Los resultados de este análisis se exponen en la Tabla 23.

Tabla 23: Pantalla a pH 7: afinidades y tasas cinéticas del Factor VIII para varias proteínas mutantes del dímero D'D3-HSA clasificadas de mayor a menor afinidad.

Ejemplo 4

Análisis cinético detallado

Se llevaron a cabo experimentos posteriores en los que se estableció un análisis cinético detallado a pH 7 para los dos mejores candidatos, que incluyen los controles. El factor VIII se inyectó a 1, 0,5, 0,25, 0,125 y 0,06nM. De manera similar, se estableció un análisis cinético detallado sobre los dos primeros candidatos, que incluyen los controles, a pH 5,5, donde se inyectó el Factor VIII a varias concentraciones que se adaptaban mejor a la interacción.

A lo largo de todos los experimentos también se inyectaron blancos de tampón sobre todas las proteínas capturadas. La asociación y la disociación del Factor VIII se controlaron durante 3 minutos respectivamente durante el experimento de "cribado". La asociación de CSL627 se monitorizó durante 5 minutos y la disociación se monitorizó durante 20 y 60 minutos durante los experimentos de "análisis cinético detallado" a pH neutro. A un pH de 5,5, la asociación y la disociación del Factor VIII se controlaron durante varios períodos de tiempo que se adaptaban mejor a la interacción.

Después del período de disociación, la superficie fue regenerada con una inyección de 45 segundos de Glicina 25mM pH2,6. El tampón de funcionamiento fue 10mM de HEPES, 150mM de NaCl, 10mM de Citrato de Na, 2,5mM de CaCl² , 0,1% de BSA, pH 7,3 y pH 5, mientras que el caudal fue de 30 pl/min. Cada interacción se midió al menos 2 veces (n=2) a 37 °C.

Las respuestas para la unión a la mancha de referencia se restaron de las de las manchas capturadas de vWF-HSA. Las respuestas de las inyecciones en blanco se restaron de las de todas las demás muestras para producir sensorgramas de doble referencia. Los sensorgramas de doble referencia se ajustaron a un modelo cinético 1:1, que incluye un término para la limitación del transporte de masa. Las tasas de asociación y disociación se ajustaron globalmente y la Rmáx se ajustó localmente. Los resultados se exponen en las Tablas 24 y 25 y se muestran en las Figuras 1 a 3.

Tabla 24: Cinética detallada a pH 7: afinidades y tasas cinéticas del Factor VIII para los dímeros mutantes D'D3-HSA.

Tabla 25: Cinética detallada a pH 5,5: afinidades y tasas cinéticas del Factor VIII para los dímeros mutantes D'D3-

HSA

Ejemplo 5

Análisis cinético adicional

Procedimiento en pocas palabras:

A continuación se generaron combinaciones de mutaciones adicionales mediante el uso de los mismos enfoques experimentales y se llevó a cabo un análisis cinético detallado.

El anticuerpo anti-HSA de ratón se inmovilizó en un chip CM5 mediante el uso de la química estándar de acoplamiento NHS/EDC. Normalmente, el nivel de inmovilización era de aproximadamente 14.000 UI. Cada mutante dímero de D'D3-HSA se capturó en un solo punto en cada celda de flujo durante 2 minutos a varias concentraciones que iban de 0,2 a 0,7|jg/ml. Los niveles de captura oscilaron entre 50 y 250RU. Se utilizó como referencia una mancha adyacente en la que se inmovilizó el anti-HSA, pero no se capturó el D'D3-HSA. La captura se llevó a cabo cada ciclo, antes del análisis de la unión del FVIII (CSL627).

CSL627 fue inyectado al azar y por duplicado sobre todos los puntos en todas las celdas de flujo. A pH neutro se inyectó CSL627 a 1, 0,5, 0,25, 0,125 y 0,06nM. La asociación se controló durante 5 minutos, mientras que la disociación se controló durante 20 minutos, así como durante 1 hora a la concentración de 1nM. También se inyectaron blancos de tampón. A pH 5,5 se inyectó CSL627 a varias concentraciones y tiempos que se adaptaban mejor a la interacción que tenía lugar.

Después del período de disociación, la superficie se regeneró con una inyección de 45 segundos de 25mM de Glicina pH2,6. El tampón de funcionamiento fue 10mM de HEPES, 150mM de NaCl, 10mM de Citrato de Na, 2,5mM de CaCl² , 0,1% de ^b S^a , pH 7,3 y pH 5,5, mientras que el caudal fue de 30 jl/min. Cada interacción se midió 4 veces (n=4) a 37 °C.

Las respuestas para la unión a la mancha de referencia se restaron de las de las manchas capturadas de vWF-HSA. Las respuestas de las inyecciones en blanco se restaron de las de todas las demás muestras para producir sensorgramas de doble referencia. Los sensorgramas de doble referencia se ajustaron a un modelo cinético 1:1, que incluye un término para la limitación del transporte de masa. Las tasas de asociación y disociación se ajustaron globalmente y la Rmáx se ajustó localmente.

Los resultados se exponen en las Tablas 26 y 27 y en las Figuras 4 y 5.

Tabla 26: Cinética detallada a pH 7: afinidades y tasas cinéticas de unión de CSL627 (Factor VIII) a dímeros mutantes de D'D3-HSA.

Dímero vWF D'D3-HSA ka [1/Ms] kd [1/s] KD [M] Tamaño de la Muestra (n) S764G, S766Y, V1083A 1,33E+07 ± 1,58E+06 6,44E-05 ± 3,39E-06 4,96E-12 ± 3,31E-13 n=4

S764E, S766Y, V1083A 4,77E-05 ± 3,59E-06 5,65E-12 ± 5,82E-13 n=5 S766Y,V1083A 1,47E+07 ± 1,2E+06 8,88E-05 ± 7,15E-06 6,05E-12 ± 2,53E-13 n=4 S764E,V1083A 1,77E+07 ± 1,74E+06 2,07E-04 ± 3,04E-05 1,16E-11 ± 1,03E-12 n=4 S764G,V1083A 1,89E+07 ± 7,01E+05 3,59E-04 ± 8,59E-06 1,90E-11 ± 3,74E-13 n=4

Tipo salvaje 2,31E+07 ± 3,03E-06 2,22E-03 ± 1,02E-04 9,88E-11 ± 9,8E-12 n=4

Tabla 27: Cinética detallada a pH 5,5: afinidades y tasas cinéticas de unión de CSL627 a dímeros mutantes de D'D3-

HSA.

Dímero vWF D'D3-HSA ka [1/Ms] kd [1/s] KD [M] Tamaño de la Muestra (n) S764E, S766Y, V1083A 3,61E+06 ± 2,12E+05 1,89E-03 ± 6,42E-05 5,35E-10 ± 2,64E-11 n=4

S766Y,V1083A 9,55E-03 ± 7,47E-04 2,38E-09 ± 8,42E-11 n=4

Dímero vWF D'D3-HSA ka [1/Ms] kd [1/s] KD [M] Tamaño de la Muestra (n) S764G, S766Y, V1083A 6,81E+06 ± 3,77E+06 1,56E-02 ± 6,27E-03 2,93E-09 ± 4,70E-10 n=4 S764E,V1083A 2,50E+06 ± 1,67E+05 2,07E-02 ± 7,8E-04 8,32E-09 ± 3,12E-10 n=4 S764G,V1083A 8,24E-08 ± 4,18E-09 n=4

Tipo salvaje

1,22E-07 ± 1,36E-08 n=4

Ejemplo 6

Análisis PK e impacto en la vida media del FVIII

Procedimientos

Se generó una línea celular estable derivada de CHO que expresaba la variante Hu vWF D'D3-FP S764E; S766Y mediante el uso de procedimientos experimentales estándar. El material se produjo a partir de la línea celular estable en un biorreactor de 10L y el dímero vWF D'D3-FP S764E; S766Y se purificó como se ha descrito previamente.

Para evaluar el impacto relativo del tipo salvaje y de la variante vWF D'D3-FP S764E; S766Y en los niveles de FVIII, se administró a ratas CD (3 animales/grupo) una combinación de FVIII recombinante (CSL627 a 200IU/kg) y proteínas vWF-FP a las dosis mostradas en la Tabla 9. Se tomaron muestras de plasma a las 0, 3, 8, 24, 48, 56 y 72 horas después de la administración intravenosa y se determinaron los niveles de FVIII por medio de un ELISA Asserachrom FVIII:Ag. Estos datos se utilizaron para determinar la vida media del FVIII y los tiempos medios de residencia que figuran en la Tabla 28.

Tabla 28: Análisis PK: Vida media del FVIII y tiempo medio de residencia tras la administración conjunta de FVIII recombinante y dímeros de D'D3-HSA

Conclusión:

A partir de la pantalla inicial D'D3-HSA con mutaciones: Los mutantes S764P, S766W, V1083A (denominados mutantes PWA) y S764G, S766Y, V1083A (denominados mutantes GYA) parecían tener la mayor afinidad y la menor tasa de desactivación del Factor VIII.

A pH neutro, los dímeros mutantes de vWF D'D3-HSA con la mayor afinidad y tasa de desactivación para CSL627 (Factor VIII) son S764G/S766Y/V1083A (GYA), S764E/S766Y/V1083A (EYA) y S766Y/V1083A (YA) con una KD de 5pM y una tasa de desactivación de 10-51/s. Esto supone una mejora de aproximadamente 20 veces en la afinidad y 40 veces en la tasa de desactivación en comparación con el dímero de tipo salvaje.

A pH ácido, el dímero mutante de vWF D'D3-HSA con la mayor afinidad y tasa de desactivación para CSL627 fue EYA con una KD de 500pM y una tasa de desactivación de 10-31/s. En base a esto, la mejora en la afinidad y la tasa de desactivación de EYA es de alrededor de 100 veces y al menos 10 veces respectivamente en comparación con el dímero de tipo salvaje.

El dímero EYA pareció tener tasas cinéticas y afinidad similares por el CSL627 que el S764P/S766I tanto a pH neutro como ácido.

Tabla 14:

Tabla 15:

Tabla 16:

Tabla 17:

Tabla 18:

T a b la 19:

Tabla 20:

Tabla 21:

Tabla 22:

Ejemplo 3

En una extensión del trabajo descrito en el documento PCT/AU2015/050369 se investigaron otras mutaciones y combinaciones de mutaciones con énfasis en las modificaciones en el dominio D3. En estos experimentos se utilizó una forma recombinante de FVIII. Este FVIII se describe en Zollner et al. 2013, Thrombosis Research, 132:280 a 287.

Procedimientos

Las construcciones plasmídicas que codifican vWF(763-1242) -HSA y que contienen las mutaciones simples, dobles o triples enumeradas en la Tabla 23 se utilizaron para generar proteínas dímeras de vWF-HSA purificadas mediante el uso de los procedimientos descritos en el Ejemplo 2. Se estableció un análisis cinético detallado a pH 7 para los principales candidatos, incluidos los controles.

El anticuerpo anti-HSA de ratón se inmovilizó en un chip CM5 mediante el uso de la química estándar de acoplamiento NHS/EDC. Normalmente, el nivel de inmovilización era de aproximadamente 14.000 UI. Cada mutante dímero de vWF-HSA se capturó en un solo punto en cada celda de flujo durante 2 minutos a varias concentraciones que iban de 0,1 a 1|jg/ml. Los niveles de captura oscilaron entre 100 y 200RU. Se utilizó como referencia una mancha adyacente en la que se inmovilizó el anti-HSA, pero no se capturó el vWF-HSA. La captura se llevó a cabo en cada ciclo, antes del análisis de la unión del FVIII. En los primeros experimentos, el Factor VIII se inyectó al azar y por duplicado en todos los puntos y en todas las celdas de flujo en uso a 5, 1 y 1,25nM. Los resultados de este análisis se exponen en la Tabla 23.

Tabla 23: Pantalla a pH 7: afinidades y tasas cinéticas del Factor VIII para varias proteínas mutantes del dímero D'D3-HSA clasificadas de mayor a menor afinidad.

Ejemplo 4

Análisis cinético detallado

Se llevaron a cabo experimentos posteriores en los que se estableció un análisis cinético detallado a pH 7 para los dos mejores candidatos, que incluyen los controles. El factor VIII se inyectó a 1, 0,5, 0,25, 0,125 y 0,06nM. De manera similar, se estableció un análisis cinético detallado sobre los dos primeros candidatos, que incluyen los controles, a pH 5,5, donde se inyectó el Factor VIII a varias concentraciones que se adaptaban mejor a la interacción.

A lo largo de todos los experimentos también se inyectaron blancos de tampón sobre todas las proteínas capturadas. La asociación y la disociación del Factor VIII se controlaron durante 3 minutos respectivamente durante el experimento de "cribado". La asociación de CSL627 se monitorizó durante 5 minutos y la disociación se monitorizó durante 20 y 60 minutos durante los experimentos de "análisis cinético detallado" a pH neutro. A un pH de 5,5, la asociación y la disociación del Factor VIIi se controlaron durante varios períodos de tiempo que se adaptaban mejor a la interacción.

Después del período de disociación, la superficie fue regenerada con una inyección de 45 segundos de Glicina 25mM pH2,6. El tampón de funcionamiento fue 10mM de HEPES, 150mM de NaCl, 10mM de Citrato de Na, 2,5mM de CaCl² , 0,1% de BSA, pH 7,3 y pH 5,5, mientras que el flujo fue de 30 pL/min. Cada interacción se midió al menos 2 veces (n=2) a 37 °C.

Las respuestas para la unión a la mancha de referencia se restaron de las de las manchas capturadas de vWF-HSA. Las respuestas de las inyecciones en blanco se restaron de las de todas las demás muestras para producir sensorgramas de doble referencia. Los sensorgramas de doble referencia se ajustaron a un modelo cinético 1:1, que incluye un término para la limitación del transporte de masa. Las tasas de asociación y disociación se ajustaron globalmente y la Rmáx se ajustó localmente. Los resultados se exponen en las Tablas 24 y 25 y se muestran en las Figuras 1 a 3.

Tabla 24: Cinética detallada a pH 7: afinidades y tasas cinéticas del Factor VIII para los dímeros mutantes D'D3-

HSA.

Tabla 25: Cinética detallada a pH 5,5: afinidades y tasas cinéticas del Factor VIII para los dímeros mutantes D'D3-

HSA

Ejemplo 5

Análisis cinético adicional

Procedimiento en pocas palabras:

A continuación se generaron combinaciones de mutaciones adicionales mediante el uso de los mismos enfoques experimentales y se llevó a cabo un análisis cinético detallado.

El anticuerpo anti-HSA de ratón se inmovilizó en un chip CM5 mediante el uso de la química estándar de acoplamiento NHS/EDC. Normalmente, el nivel de inmovilización era de aproximadamente 14.000 UI. Cada mutante dímero de D'D3-HSA se capturó en un solo punto en cada celda de flujo durante 2 minutos a varias concentraciones que iban de 0,2 a 0,7|jg/ml. Los niveles de captura oscilaron entre 50 y 250RU. Se utilizó como referencia una mancha adyacente en la que se inmovilizó el anti-HSA, pero no se capturó el D'D3-HSA. La captura se llevó a cabo cada ciclo, antes del análisis de la unión del FVIII (CSL627).

CSL627 fue inyectado al azar y por duplicado sobre todos los puntos en todas las celdas de flujo. A pH neutro se inyectó CSL627 a 1, 0,5, 0,25, 0,125 y 0,06nM. La asociación se controló durante 5 minutos, mientras que la disociación se controló durante 20 minutos, así como durante 1 hora a la concentración de 1nM. También se inyectaron blancos de tampón. A pH 5,5 se inyectó CSL627 a varias concentraciones y tiempos que se adaptaban mejor a la interacción que tenía lugar.

Después del período de disociación, la superficie se regeneró con una inyección de 45 segundos de 25mM de Glicina pH2,6. El tampón de funcionamiento fue 10mM de HEPES, 150mM de NaCl, 10mM de Citrato de Na, 2,5mM de CaCl² , 0,1% de ^b S^a , pH 7,3 y pH 5,5, mientras que el caudal fue de 30 jl/min. Cada interacción se midió 4 veces (n=4) a 37 °C.

Las respuestas para la unión a la mancha de referencia se restaron de las de las manchas capturadas de vWF-HSA. Las respuestas de las inyecciones en blanco se restaron de las de todas las demás muestras para producir sensorgramas de doble referencia. Los sensorgramas de doble referencia se ajustaron a un modelo cinético 1:1, que incluye un término para la limitación del transporte de masa. Las tasas de asociación y disociación se ajustaron globalmente y la Rmáx se ajustó localmente.

Los resultados se exponen en las Tablas 26 y 27 y en las Figuras 4 y 5.

Tabla 26: Cinética detallada a pH 7: afinidades y tasas cinéticas de unión de CSL627 (Factor VIII) a dímeros mutantes de D'D3-HSA.

Tabla 28: Cinética detallada a pH 5,5: afinidades y tasas cinéticas de unión de CSL627 a dímeros mutantes de D'D3-

HSA.

Ejemplo 6

Análisis PK e impacto en la vida media del FVIII

Procedimientos

Se generó una línea celular estable derivada de CHO que expresaba la variante Hu vWF D'D3-FP S764E; S766Y mediante el uso de procedimientos experimentales estándar. El material se produjo a partir de la línea celular estable en un biorreactor de 10L y el dímero vWF D'D3-FP S764E; S766Y se purificó como se ha descrito previamente.

Para evaluar el impacto relativo del tipo salvaje y la variante vWF D'D3-FP S764E; S766Y en los niveles de FVIII, se administró a ratas CD (3 animales/grupo) una combinación de FVIII recombinante (CSL627 a 200IU/kg) y proteínas vWF-FP a las dosis mostradas en la Tabla 9. Se tomaron muestras de plasma a las 0, 3, 8, 24, 48, 56 y 72 horas después de la administración intravenosa y se determinaron los niveles de FVIII por medio de un ELISA Asserachrom FVIII:Ag. Estos datos se utilizaron para determinar la vida media del FVIII y los tiempos medios de residencia que figuran en la Tabla 29.

Tabla 29: Análisis PK: Vida Media del FVIII y tiempo Medio de Residencia tras la administración conjunta de dímeros de FVIII recombinante y D'D3-HSA

Conclusión:

A partir de la pantalla inicial D'D3-HSA con mutaciones: Los mutantes S764P, S766W, V1083A (denominados mutantes PWA) y S764G, S766Y, V1083A (denominados mutantes GYA) parecían tener la mayor afinidad y la menor tasa de desactivación del Factor VIII.

A pH neutro, los dímeros mutantes de vWF D'D3-HSA con la mayor afinidad y tasa de desactivación para CSL627 (Factor VIII) son S764G/S766Y/V1083A (GYA), S764E/S766Y/V1083A (EYA) y S766Y/V1083A (YA) con una KD de 5pM y una tasa de desactivación de 10-51/s. Esto supone una mejora de aproximadamente 20 veces en la afinidad y 40 veces en la tasa de desactivación en comparación con el dímero de tipo salvaje.

A pH ácido, el dímero mutante de vWF D'D3-HSA con la mayor afinidad y tasa de desactivación para CSL627 fue EYA con una KD de 500pM y una tasa de desactivación de 10-31/s. En base a esto, la mejora en la afinidad y la tasa de desactivación de EYA es de alrededor de 100 veces y al menos 10 veces respectivamente en comparación con el dímero de tipo salvaje.

El dímero EYA pareció tener tasas cinéticas y afinidad similares por el CSL627 que el S764P/S766I tanto a pH neutro como ácido.

Claims (21)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que comprende el Factor de von Willebrand (VWF) truncado que comprende una secuencia como la mostrada en la SEC. ID Núm.: 3 o un fragmento de la misma, en la que el VWF truncado comprende la SEC. ID Núm.: 5 (S764P/S766W/V1083A), la SEC. ID Núm.: 6 (S764G/S766Y/V1083A), la SEC. ID Núm.: 7 (S764E/S766Y/V1083A), la SEC. ID Núm.: 8 (N1011S/V1083A/K1181E), la SEC. ID Núm.: 17 (S766Y/V1083A), la SEC. ID Núm.: 9 (V1083A), la SEC. ID Núm.: 10 (S1042T), la SEC. ID Núm.: 11 (V805A/Q1158L), la SEC. ID Núm.: 12 (K912E/T1088S) o SEC. ID Núm.: 13 (L781P); y en el que el VWF truncado se une al Factor VIII (FVIII) y el VWF truncado se une al Factor VIII con una tasa de desactivación inferior a la de un polipéptido de referencia que comprende una SEC. ID Núm.: 3 no modificada.

2. El polipéptido como se reivindica en la reivindicación 1, en el que el VWF truncado se une al Factor VIII con una tasa de desactivación al menos 5 veces inferior a la del polipéptido de referencia; por lo que el VWF truncado se une al Factor VIII preferentemente con una tasa de desactivación al menos 10 veces inferior a la del polipéptido de referencia.

3. El polipéptido como se reivindica en la reivindicación 1, en el que el VWF truncado se une al Factor VIII con un KD al menos 5 veces menor que el polipéptido de referencia; por lo que el VWF truncado se une al Factor VIII preferentemente con un KD al menos 10 veces menor que el polipéptido de referencia.

4. El polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el VWF truncado además comprende los residuos 1243 a 1247 de la SEC. ID Núm.: 2 o además comprende los residuos 1243 a 1270 de la SEC. ID Núm.: 2.

5. El polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el VWF truncado carece de los residuos 1243 a 1247 de la SEC. ID Núm.: 2 o carece de los residuos 1243 a 2813 de la SEC. ID Núm.: 2.

6. El polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el polipéptido además comprende una fracción de extensión de la vida media.

7. El polipéptido como se reivindica en la reivindicación 6, en el que la fracción que prolonga la vida media es una secuencia de aminoácidos heteróloga fusionada al FVW truncado, en la que dicha secuencia de aminoácidos heteróloga comprende o consiste preferentemente en un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en regiones constantes de inmunoglobulina y porciones de las mismas, por ejemplo el fragmento Fc, la transferrina y sus fragmentos, el péptido C-terminal de la gonadotropina coriónica humana, las cadenas aleatorias solvatadas con gran volumen hidrodinámico conocidas como x Te N, las repeticiones de homo-aminoácidos (HAP), las repeticiones de prolina-alanina-serina (PAS), la albúmina, la afamina, la alfa-fetoproteína, la proteína de unión a la vitamina D, los polipéptidos capaces de unirse en condiciones fisiológicas a la albúmina o a las regiones constantes de las inmunoglobulinas, y combinaciones de las mismas.

8. El polipéptido como se reivindica en la reivindicación 6, en el que la fracción de extensión de la vida media se conjuga con el polipéptido, en el que dicha fracción de extensión de la vida media se selecciona preferentemente del grupo que consiste en hidroxietil almidón (HES), polietilenglicol (PEG), ácidos polisiálicos (PSA), polipéptidos similares a la elastina, polímeros de heparosán, ácido hialurónico y ligandos de unión a la albúmina, por ejemplo, cadenas de ácidos grasos, y combinaciones de los mismos.

9. El polipéptido como se reivindica en la reivindicación 7, en el que la secuencia de aminoácidos heteróloga comprende albúmina, preferentemente, en la que el N-terminal de la albúmina se fusiona con el C-terminal de la secuencia del VWF truncado, ya sea directamente o a través de un espaciador.

10. El polipéptido como se reivindica en una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el polipéptido es una glicoproteína que comprende N-glicanos, y en el que al menos el 75%, preferentemente al menos el 85%, preferentemente al menos el 90%, y más preferentemente al menos el 95% de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, al menos una fracción de ácido siálico, preferentemente, en el que al menos el 60% de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, al menos una fracción de ácido a-2,6-siálico.

11. El polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el polipéptido es un dímero.

12. Un complejo que comprende una molécula de Factor VIII y el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o el complejo de la reivindicación 12 para su uso en el tratamiento o la profilaxis de un trastorno de la coagulación sanguínea, en el que el trastorno de la coagulación sanguínea es preferentemente la enfermedad de von Willebrand (VWD) o la hemofilia A.

14. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o el complejo de la reivindicación 12.

15. Una composición farmacéutica que comprende (i) un FVIII y (ii) un polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que la relación molar entre el polipéptido y el FVIII en la composición es superior a 50.

16. Un kit farmacéutico que comprende (i) un FVIII y (ii) un polipéptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de un trastorno de la coagulación de la sangre, dicho tratamiento comprende administrar a un sujeto que tiene VWF endógeno el polipéptido y el FVIII, en el que la relación molar del polipéptido que se administra al VWF endógeno es superior a 0,5, y/o en el que la relación molar del polipéptido que se va a administrar con respecto al FVIII que se va a administrar es superior a 50.

17. Un polipéptido para uso como se define en la reivindicación 13 para mejorar la vida media plasmática del FVIII, y/o para reducir la frecuencia de administración del FVIII.

18. Un polinucleótido que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

19. Un plásmido o vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 18, en el que dicho plásmido o vector es preferentemente un vector de expresión.

20. Una célula huésped que comprende el polinucleótido de la reivindicación 18 o el plásmido de la reivindicación 19.

21. Un procedimiento para producir un polipéptido que comprende un VWF truncado, que comprende:

(i) cultivar las células huésped de la reivindicación 20 en condiciones tales que se exprese el polipéptido que comprende un VWF truncado; y

(ii) opcionalmente, recuperar el polipéptido que comprende el VWF truncado de las células huésped o del medio de cultivo.