ES2909180T3 - Vacunas de ácido nucleico - Google Patents

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Axel Bouchon
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Abstract

Una vacuna de ácido nucleico, que comprende: uno o más polinucleótidos de ARNm que tienen un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido antigénico, donde uno o más polinucleótidos de ARNm comprenden al menos una modificación química y se formulan en una nanopartícula lipídica que tiene una relación molar de 20-60% de lípido catiónico: 5-25 % de lípidos no catiónicos: 25- 55% de esterol; y 0,5-15% de lípidos modificados con PEG, donde la al menos una modificación química se selecciona de entre el grupo que consiste en pseudouridina, Nl- metilpseudouridina, 2-tiouridina, 4-tiouridina, 5-metilcitosina, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio- 1-metil- pseudouridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-2-tio- pseudouridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 4-tio-pseudouridina, 5-aza-uridina, dihidropseudouridina, 5-metoxiuridina, 2'-O-metil uridina, 1-carboximetil-pseudouridina, 1-propinil-pseudouridina, 1- taurinometil-pseudouridina, 1-taurinometil-4-tio-pseudouridina, 3-metil-pseudouridina (m3Ψ), 1-metil-1-deaza- pseudouridina, 2-metoxiuridina, 2-metoxi-4-tio-uridina, 1-metil-3-(3-amino-3-carboxipropil) pseudouridina (acp3Ψ), y 2'- O-metil-pseudouridina (Ψm), donde el polipéptido antigénico se deriva de un agente infeccioso, donde el agente infeccioso es una cepa de Influenza A o Influenza B o combinaciones de las mismas y donde el polipéptido antigénico es una proteína hemaglutinina o un fragmento de la misma.

Description

DESCRIPCIÓN
Vacunas de ácido nucleico
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a vacunas, específicamente vacunas de ácido nucleico (VAN). En particular, la invención se refiere a vacunas de ácido ribonucleico (ARN), es decir, vacunas de ARNm.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La vacunación es una forma efectiva de brindar protección profiláctica contra enfermedades infecciosas, incluidas, entre otras, las virales, bacterianas, y/o enfermedades parasitarias, como la influenza, el SIDA, la infección por virus de la hepatotisis, el cólera, la malaria y la tuberculosis, y muchas otras enfermedades. Por ejemplo, las infecciones por influenza son la séptima causa principal de muerte en los EE. UU. con 200.000 hospitalizaciones y 40.000 muertes al año y causan aproximadamente 3-5 millones de hospitalizaciones y aproximadamente 300.000 a 500.000 muertes por año en todo el mundo. Millones de personas reciben cada año las vacunas contra la influenza para protegerlas de la influenza estacional. La vacunación también puede impedir rápidamente la propagación de una pandemia emergente de influenza.
Una vacuna típica contiene un agente que se asemeja a una forma debilitada o muerta del agente causante de la enfermedad, que podría ser un microorganismo, como bacterias, virus, hongos, parásitos o una o más toxinas y/o una o más proteínas, por ejemplo, proteínas de superficie (es decir, antígenos) de dicho microorganismo. El antígeno o agente de la vacuna puede estimular el sistema inmunológico del cuerpo para que reconozca al agente como un invasor extraño, genere anticuerpos contra él, lo destruya y desarrolle un recuerdo del mismo. La memoria inducida por la vacuna permite que el sistema inmunológico actúe rápidamente para proteger al cuerpo de cualquiera de estos agentes que encuentre más tarde.
La producción de vacunas utilizada en la técnica, p.ej., la producción de vacunas antigénicas, tiene varias etapas, que incluyen la generación de antígenos, purificación e inactivación de antígenos y formulación de vacunas. Primero, el antígeno se genera cultivando virus en líneas celulares, cultivando bacterias en biorreactores o produciendo proteínas recombinantes derivadas de virus y bacterias en cultivos celulares, levaduras o bacterias. A continuación, se purifican las proteínas recombinantes y se inactivan los virus y las bacterias antes de que se formulen con adyuvantes en las vacunas. Ha sido un desafío reducir drásticamente el tiempo y los gastos asociados con las tecnologías actuales en el desarrollo de vacunas.
Otro obstáculo para el desarrollo de nuevas vacunas es la evolución constante de la mayoría de los agentes infecciosos, como virus y bacterias. Los virus a menudo mutan sus proteínas de superficie para generar nuevos antígenos que pueden ayudarlos a saltarse el sistema inmunológico activo que ha sido inmunizado por las vacunas que contienen los virus. Por el contrario, las bacterias adquieren y mutan proteínas clave para evadir la defensa del huésped y las aplicaciones de antibióticos efectivos.
Por ejemplo, los virus de la influenza A, B y C son los agentes etiológicos de la influenza. La hemaglutinina (HA), la principal glicoproteína envolvente de los virus de la influenza A y B, o su homóloga, la hemaglutinina-esterasa (HE) en el virus de la influenza C, es el reservorio natural de los virus. La rápida evolución de la proteína hemaglutinina (HA) del virus de la influenza da como resultado la aparición constante de nuevas cepas, lo que hace que la respuesta inmune adaptativa del huésped sea sólo parcialmente protectora frente a nuevas infecciones. El mayor desafío para la terapia y la profilaxis contra la influenza y otras infecciones que utilizan vacunas tradicionales es la limitación de la amplitud de las vacunas, que brindan protección solo contra subtipos estrechamente relacionados. Además, la duración actual del procedimiento de producción inhibe cualquier reacción rápida para desarrollar y producir una vacuna adaptada en una situación de pandemia.
Es de gran interés desarrollar nuevas vacunas, así como nuevas estrategias para combatir las enfermedades infecciosas y los agentes infecciosos.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
Basándose en la divulgación que se incluye en esta invención, la presente invención proporciona una vacuna de ácido nucleico, que comprende:
uno o más polinucleótidos de ARNm que tienen un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido antigénico, donde uno o más polinucleótidos de ARNm comprenden al menos una modificación química y se formulan en una nanopartícula lipídica que tiene una relación molar de 20-60 % de lípido catiónico: 5-25 % de lípidos no catiónicos: 25­ 55 % de esterol; y 0,5-15 % de lípidos modificados con PEG,
donde la al menos una modificación química se selecciona de entre el grupo que consiste en pseudouridina, N1-metilpseudouridina, 2-tiouridina, 4-tiouridina, 5-metilcitosina, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio-1 -metilpseudouridina, 2-tio-5-aza-uridina , 2-tio-dihidropseudouridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-2-tiopseudouridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 4-tio-pseudouridina, 5-aza-uridina, dihidropseudouridina, 5-metoxiuridina, 2'-O-metil uridina, 1-carboximetil-pseudouridina, 1-propinil-pseudouridina, 1-taurinometil-pseudouridina, 1-taurinometil-4-tio-pseudouridina, 3-metil-pseudouridina (m3^ ), 1-metil-l-deazapseudouridina, 2-metoxiuridina, 2-metoxi-4- tio-uridina, 1-metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina (acp3^ ), y 2'-O-metil-pseudouridina (^m),
donde el polipéptido antigénico se deriva de un agente infeccioso, donde el agente infeccioso es una cepa de Influenza A o Influenza B o combinaciones de las mismas, y donde el polipéptido antigénico es una proteína hemaglutinina o un fragmento de la misma.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona dicha vacuna para su uso en un procedimiento para inducir una respuesta inmune específica de antígeno en un sujeto, comprendiendo el procedimiento administrar la vacuna al sujeto en una cantidad efectiva para producir una respuesta inmune específica de antígeno.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona dicha vacuna para su uso en un procedimiento para impedir o tratar la infección viral de la influenza, comprendiendo el procedimiento administrar la vacuna a un sujeto.
La presente invención y algunas realizaciones preferidas de la invención de la misma se exponen en las reivindicaciones adjuntas.
En algunas realizaciones, la nanopartícula de lípido catiónico comprende una relación molar de aproximadamente 50 % de lípido catiónico, aproximadamente 1,5 % de lípido modificado con PEG, aproximadamente 38,5 % de colesterol y aproximadamente 10 % de lípido no catiónico. En algunas realizaciones, la nanopartícula de lípidos catiónicos comprende una relación molar de aproximadamente 55 % de lípidos catiónicos, aproximadamente 2,5 % de lípidos PEG, aproximadamente 32,5 % de colesterol y aproximadamente 10 % de lípidos no catiónicos. En algunas realizaciones, el lípido catiónico en un lípido catiónico ionizable y el lípido no catiónico es un lípido neutro y el esterol es un colesterol. En algunas realizaciones, la nanopartícula de lípidos catiónicos tiene una relación molar de 50:38,5:10:1,5 de lípidos catiónicos: colesterol: PEG2000-DMG:DSPC.
En algunas realizaciones, la nanopartícula de lípidos catiónicos tiene un diámetro medio de 50-150 nm. En algunas realizaciones, la nanopartícula de lípidos catiónicos tiene un un diámetro medio de 80-100 nm. En algunas realizaciones, la vacuna incluye 1,5mg/mL de polinucleótido de ARN y 35-45 mg/mL de lípidos. En algunas realizaciones, la VAN incluye aproximadamente 2 mg/mL de polinucleótido de ARN y aproximadamente 40 mg/mL de lípidos.
En algunas realizaciones, un marco de lectura abierto se optimiza por codones.
En algunas realizaciones, el uno o más polinucleótidos de ARN codifican un polipéptido antigénico adicional. En algunas realizaciones, el polinucleótido de ARN adicional comprende al menos una modificación química y un marco de lectura abierto con codón optimizado, codificando dicho marco de lectura abierto un polipéptido antigénico.
En la invención, el virus es una cepa de Influenza A o Influenza B o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, la cepa de Influenza A o Influenza B está asociada con aves, cerdos, caballos, perros, humanos o primates no humanos. En la invención, el polipéptido antigénico codifica una proteína hemaglutinina o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, la proteína hemaglutinina es H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17, H18 o un fragmento de los mismos. En algunas realizaciones, la proteína hemaglutinina no comprende un dominio de cabeza (HA1). En algunas realizaciones, la proteína hemaglutinina comprende una porción del dominio de cabeza (HA1). En algunas realizaciones, la proteína hemaglutinina no comprende un dominio citoplasmático. En algunas realizaciones, la proteína hemaglutinina comprende una porción del dominio citoplásmico. En algunas realizaciones, la proteína hemaglutinina está truncada. En algunas realizaciones, la proteína hemaglutinina truncada comprende una porción del dominio transmembrana. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la proteína hemaglutinina o fragmento de la misma comprende al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, o 99 % se identifica con cualquiera de las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la Tabla 6-14. En algunas realizaciones, el virus se selecciona de entre el grupo que consiste en H1N1, H3N2, H7N9 y H10N8. En algunas realizaciones, el polipéptido antigénico se selecciona de entre las proteínas enumeradas en las Tablas 6-14, o fragmentos de las mismas.
En algunas realizaciones, la VAN es multivalente. En algunas realizaciones, el marco de lectura abierto de uno o más polinucleótidos de ARN codifica al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 polipéptidos antigénicos. En algunas realizaciones, el marco de lectura abierto de uno o más polinucleótidos de ARN codifica al menos 10, 15, 20 o 50 polipéptidos antigénicos. En algunas realizaciones, el marco de lectura abierto de uno o más polinucleótidos de ARN codifica 2-10, 10-15, 15-20, 20-50, 50-100 o 100- 200 polipéptidos antigénicos.
En algunas realizaciones, la modificación química se selecciona de entre el grupo que consiste en pseudouridina, N1-metilpseudouridina, 2-tiouridina, 4'-tiouridina, 5-metilcitosina, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio-1 -metilpseudouridina, 2-tio-5-aza-uridina , 2-tio-dihidropseudouridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-2-tiopseudouridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 4-tio-pseudouridina, 5-aza-uridina, dihidropseudouridina, 5-metoxiuridina o 2'-O-metil uridina. En algunas realizaciones, el polinucleótido de ARN incluye una segunda modificación química donde dicha segunda modificación química se selecciona de entre cualquiera de las enumeradas en las Tablas 22 y 23.
En algunas realizaciones, el polinucleótido de ARN comprende las SEQ ID NO 2459-2621. En algunas realizaciones, el polinucleótido de ARN comprende un polinucleótido que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO 2459-2621. En algunas realizaciones, el polinucleótido de ARN comprende un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 2254. En algunas realizaciones, el polinucleótido de ARN comprende un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 2254. En algunas realizaciones, el polinucleótido de ARN comprende un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 2259. En algunas realizaciones, el polinucleótido de ARN comprende un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 2259. En algunas realizaciones, el polinucleótido de ARN comprende un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 2192. En algunas realizaciones, el polinucleótido de ARN comprende un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 2192. En algunas realizaciones, el polinucleótido de ARN comprende un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 2200. En algunas realizaciones, el polinucleótido de ARN comprende un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 2200. En algunas realizaciones, el polinucleótido de ARN comprende la SEQ ID NO 2046. En algunas realizaciones, el polinucleótido de ARN comprende un polinucleótido que tiene 80-98 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 2046. En algunas realizaciones, el polinucleótido de ARN comprende la SEQ ID NO 2119. En algunas realizaciones, el polinucleótido de ARN comprende un polinucleótido que tiene 80-98% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 2119. En algunas realizaciones, el polinucleótido de a Rn comprende la SEQ ID NO 2054. En algunas realizaciones, el polinucleótido de ARN comprende un polinucleótido que tiene 80-98% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 2054. En algunas realizaciones, el polinucleótido de a Rn comprende la SEQ ID NO 2127. En algunas realizaciones, el polinucleótido de ARN comprende un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia del 80-98 % con la SEQ ID NO 2127. La invención también proporciona la vacuna de la invención para su uso en un procedimiento para inducir una respuesta inmune específica de antígeno en un sujeto que comprende administrar las vacunas de la invención al sujeto en una cantidad efectiva para producir una respuesta inmune específica de antígeno.
En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria específica de antígeno comprende una respuesta de células T. En algunas realizaciones, una respuesta inmunitaria específica de antígeno comprende una respuesta de células B. En algunas realizaciones, el procedimiento para producir una respuesta inmunitaria específica de antígeno involucra una sola administración de la vacuna. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además administrar una dosis de refuerzo de la vacuna. En algunas realizaciones, la vacuna se administra al sujeto por inyección intradérmica o intramuscular.
En algunas realizaciones, la dosis de refuerzo de la vacuna se administra al sujeto el día veintiuno. En algunas realizaciones, se administra al sujeto una dosis de entre 10 ug/kg y 400 ug/kg de la vacuna. En algunas realizaciones, se incluye una dosis de 25 microgramos del polinucleótido de ARN en la vacuna administrada al sujeto. En algunas realizaciones, se incluye una dosis de 100 microgramos del polinucleótido de ARN en la vacuna administrada al sujeto. En algunas realizaciones, se incluye una dosis de 400 microgramos del polinucleótido de ARN en la vacuna administrada al sujeto. En algunas realizaciones, el polinucleótido de ARN se acumula a un nivel 100 veces mayor en el ganglio linfático local en comparación con el ganglio linfático distal. La invención también proporciona la vacuna de la invención para su uso en un procedimiento de prevención o tratamiento de la infección viral de la influenza que comprende administrar a un sujeto las vacunas de la invención. En algunas realizaciones, la respuesta inmune específica de antígeno comprende una respuesta de células T. En algunas realizaciones, una respuesta inmunitaria específica de antígeno comprende una respuesta de células B. En algunas realizaciones, el procedimiento para producir una respuesta inmunitaria específica de antígeno involucra una sola administración de la vacuna. En algunas realizaciones, la vacuna se administra al sujeto por inyección intradérmica o intramuscular.
En la invención, los polinucleótidos de la VAN codifican uno o más polipéptidos de una cepa de influenza como antígeno. Dichos antígenos incluyen, pero no se limitan a, aquellos antígenos codificados por los polinucleótidos enumerados en las Tablas presentadas en esta invención. En la tabla, el Número de Acceso GenBank o el Número de Acceso GI representa el CDS completo o parcial del antígeno codificado. Los polinucleótidos VAN pueden comprender una región de cualquiera de las secuencias enumeradas en las tablas o la región codificante completa del ARNm enumerado. Los mismos pueden comprender regiones híbridas o quiméricas, o imitaciones o variantes.
Los detalles de varias realizaciones de la invención se establecen en la descripción a continuación. Otras características, objetivos y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y a partir de las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Los objetivos, características y ventajas anteriores y otros serán evidentes a partir de la siguiente descripción de realizaciones particulares de la invención, como se ilustra en los dibujos adjuntos en los que los mismos caracteres de referencia se refieren a las mismas partes en las diferentes vistas. Los dibujos no están necesariamente a escala y, en cambio, se coloca un énfasis en la ilustración de los principios de diversas realizaciones de la invención.
FIG. 1 es un esquema de una construcción polinucleotídica. FIG. 1A es un esquema de una construcción polinucleotídica enseñada en la solicitud de patente de EE. UU. de propiedad común y en tramitación 13/791.922 depositada el 9 de marzo de 2013. FIG. 1B es un esquema de una construcción polinucleotídica lineal.
FIG. 2 es un esquema de una serie de polinucleótidos quiméricos de la presente invención.
FIG. 3 es un esquema de una serie de polinucleótidos quiméricos que ilustran varios patrones de modificaciones posicionales y muestran regiones análogas a aquellas regiones de un polinucleótido de ARNm.
FIG. 4 es un esquema de una serie de polinucleótidos quiméricos que ilustra varios patrones de modificaciones posicionales basadas en la Fórmula I.
FIG. 5 es un esquema de una serie de polinucleótidos quiméricos que ilustran varios patrones de modificaciones posicionales basadas en la Fórmula I e ilustran además un extremo 3' bloqueado o estructurado.
FIG. 6A y 6B son esquemas de construcciones circulares de la presente invención.
FIG. 7A-7B son esquemas de construcciones circulares de la presente invención. FIG. 8A-8B son esquemas de construcciones circulares de la presente invención. FIG. 8A muestra una construcción circular que comprende al menos una región de sensor y una región espaciadora. FIG. 8B muestra una construcción circular no codificante. FIG. 9 es un esquema de una construcción circular no codificante de la presente invención.
FIG. 10 muestra los títulos de neutralización de HA de una vacuna contra la influenza de ARNm modificada químicamente en comparación con vacunas de ARNm sin modificar y de proteína.
FIG. 11 muestra los títulos de inhibición de la hemaglutinina en ratones después de la vacunación con diferentes dosis y formulaciones de ARNm que codifica la proteína hemaglutinina del virus H1N1.
FIG. 12A-AD muestra el porcentaje de supervivencia de los ratones después de la vacunación y la exposición con el virus A/PR/8/34 de la influenza. FIG. 12A muestra el porcentaje de supervivencia 1 semana después de la exposición. FIG. 12B muestra el porcentaje de supervivencia 2 semanas después de la exposición. FIG. 12C muestra el porcentaje de supervivencia 3 semanas después de la exposición. FIG. 12D muestra el porcentaje de supervivencia 4 semanas después de la exposición.
FIG. 13 muestra los títulos medios de inhibición de la hemaglutinación de ratones después de la vacunación y la exposición con virus A/PR/8/34 de la influenza.
FIG. 14A-14C muestra respuestas de atocinas de IFNy de células T CD4. FIG. 14A muestra la producción de IFNy con estimulación H1 proteína/péptido. FIG. 14B muestra la producción de IFNy con estimulación H7 proteína/péptido. FIG. 14C muestra la producción de IFNy con estimulación pMA+ionomicina.
FIG. 15A-15D muestra la producción de IgG después de estimulación H1 y H7 proteína/péptido.
FIG. 16 es un gráfico que muestra los títulos de inhibición de hemaglutinina (HAI) contra H10 después de la administración de vacuna H10N8/ N1-metil pseudouridina /C0 formulación MC3 en las dosis indicadas.
FIG. 17 es un gráfico que muestra los títulos de inhibición de hemaglutinina (HAI) contra H10 después de la administración de vacuna H10N8/ N1-metil pseudouridina /C1 formulación MC3 en las dosis indicadas.
FIG. 18 es un gráfico que compara los títulos de inhibición de hemaglutinina (HAI) contra H7 después de la administración de 10 pg/dosis de la formulación H7N9/C0 en comparación con la formulación H7N9/C1.
FIG. 19 es un gráfico de los títulos medios de inhibición de hemaglutinina (HAI) en muestras de suero de mono cynomolgus en varios puntos de tiempo antes y después de la administración de las formulaciones y dosis indicadas. FIG. 20 es un gráfico que muestra la carga viral de H7N9 en hurones expuestos el día 21 después de recibir una única inmunización.
FIG. 21A-21D presenta la supervivencia de ratón y los títulos de HAI en ratones expuestos a una dosis letal tras la administración de una dosis única de VAN de ARNm que codifica H7N9. FIG. 21A muestra la supervivencia en el día 7 después de la exposición. FIG. 21B muestra la supervivencia en el día 21 después de la exposición. FIG. 21C muestra la supervivencia el día 84 después de la exposición. FIG. 21D muestra títulos de HAI.
FIG. 22 muestra un alineamiento de secuencias de aminoácidos de proteínas de hemaglutinina de cepas A H7N9 de influenza en relación con una secuencia de consenso.
FIG. 23 muestra un alineamiento de secuencias de aminoácidos de proteínas de hemaglutinina de cepas A H10N8 de influenza en relación con una secuencia de consenso.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Es de gran interés en los campos de la terapéutica, el diagnóstico, los reactivos y los ensayos biológicos poder diseñar, sintetizar y administrar un ácido nucleico, por ejemplo, un ácido ribonucleico (ARN), por ejemplo, un ARN mensajero (ARNm) que codifica un péptido. o polipéptido de interés dentro de una célula, ya sea in vitro, in vivo, in situ o ex vivo, para producir resultados fisiológicos que sean beneficiosos para la célula, tejido u órgano y, en última instancia, para un organismo. Un resultado beneficioso es provocar la traducción intracelular del ácido nucleico y la producción de al menos un péptido o polipéptido codificado de interés.
Es de particular interés la capacidad de diseñar, sintetizar y administrar un ácido nucleico, p.ej., un ácido ribonucleico (ARN), por ejemplo, un ARN mensajero (ARNm), que codifica un antígeno, p.ej., un antígeno derivado de un microorganismo infeccioso, con fines de vacunación.
La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
Según la presente invención, los polinucleótidos se modifican de manera que se eviten las deficiencias de otras moléculas de polinucleótidos de la técnica o se proporcionen mejoras sobre ellas.
Aunque se han hecho intentos para producir vacunas de ARN funcionales, incluidas vacunas de ARNm y vacunas de ARN autorreplicante, la eficacia terapéutica de estas vacunas de ARN aún no se ha establecido completamente. Sorprendentemente, los inventores han descubierto una clase de formulaciones para administrar vacunas de ARNm in vivo que da como resultado respuestas inmunes significativamente mejoradas y, en muchos aspectos, sinérgicas, incluida la generación mejorada de antígenos y la producción de anticuerpos funcionales con capacidad de neutralización. Estos resultados se logran incluso cuando se administran dosis significativamente más bajas de ARNm en comparación con las dosis de ARNm utilizadas en otras clases de formulaciones basadas en lípidos. Las formulaciones de la invención han demostrado respuestas inmunes in vivo significativas e inesperadas suficientes para establecer la eficacia de las vacunas de ARNm funcional como agentes profilácticos y terapéuticos.
La invención implica, en algunos aspectos, el sorprendente hallazgo de que las formulaciones de nanopartículas lipídicas (NPL) mejoran significativamente la eficacia de las vacunas de ARNm, incluidas las vacunas de ARNm químicamente modificado. La eficacia de las vacunas de ARNm formuladas en NPL se examinó in vivo utilizando varios antígenos virales distintos y en una variedad de modelos animales diferentes. Los resultados presentados en esta invención demuestran la eficacia superior inesperada de las vacunas de ARNm formuladas en NPL sobre otras vacunas de ARNm formuladas en otros vehículos basados en lípidos así como sobre antígenos proteicos.
Además de proporcionar una respuesta inmune mejorada, las formulaciones de la invención generan una respuesta inmune más rápida después de una sola dosis de antígeno que otras vacunas a base de ARNm o proteínas probadas. Un estudio que se describe en esta invención implicó la vacunación de ratones por vía intravenosa (IV), intramuscular (IM) o intradérmica (ID), seguida de una exposición con una dosis letal de virus. Además de todos los animales vacunados que sobrevivieron a la dosis letal, se observaron respuestas inmunes tempranas significativamente más fuertes (actividad antiviral mediante ensayo de neutralización de virus e inhibición de Ha (HAI)) en comparación con el antígeno proteico y otras formulaciones a base de lípidos (lipoplex). Los datos demuestran que tan pronto como 1 semana después de la vacunación, dos grupos de animales que recibieron una formulación de ARNm-NPL (ID o IM) mostraron títulos de HAI superiores a 40, a 60 y 114, respectivamente. Un título de HAI superior a 40 se considera suficiente para proteger de una exposición letal de influenza. La respuesta rápida fue inesperada, particularmente cuando se comparó con la respuesta observada con las vacunas de antígeno proteico y ARNm formuladas en otros vehículos de lípidos (lipoplex), que una semana e incluso tres semanas después de la vacunación continuaron mostrando títulos de HAI ineficaces de menos de 40.
En cada uno de los puntos de tiempo posteriores (3 semanas y 5 semanas), las formulaciones de la invención continuaron proporcionando respuestas terapéuticas significativamente más fuertes que las del antígeno proteico. De hecho, tanto la formulación de ARNm-NPL modificada como químicamente no modificada administrada por vía IV tenían títulos de HAI mejorados con respecto al antígeno proteico. En la semana 3, todos los animales que recibieron una formulación de ARNm-NPL por administración IM o ID mostraron una actividad de HAI superior a 40, en comparación con el antígeno proteico, que a la semana y a las tres semanas continuaron mostrando títulos de HAI de menos de 40. En la semana 5, una formulación de ARNm-NPL administrada por vía ID tenía una actividad HAI sorprendente de más de 10.000, en contraste con el título de HAI de aproximadamente 400 para el antígeno proteico en ese momento. Los ratones que recibieron una formulación de ARNm-NPL también mostraron una actividad neutralizante de 79-250 (IM) y 250 (ID) mediante el ensayo de microneutralización, en comparación con el antígeno proteico, que tenía una actividad de neutralización indetectable en ese momento. En la semana 5 después de la vacunación, cinco de los seis grupos formulados con NPL mostraron una alta actividad neutralizante entre 789 y 24.892. Por el contrario, los ratones vacunados con antígeno proteico mostraron actividad neutralizante en solo 3 de 5 ratones y variaron solo entre 79 y 250.
Las formulaciones de ARNm-NPL de la invención también produjeron respuestas inmunes cuantitativa y cualitativamente mejores que las de las vacunas de ARNm formuladas en un vehículo lipídico diferente (lipoplex). En la semana 5, la vacuna ARNm-lipoplex produjo títulos HAI de 197, en comparación con los logrados por las formulaciones de ARNm-LNP de la invención (títulos HAI de 635-10.152). En todos los demás puntos de tiempo y para todas las vacunas de ARNm-lipoplex, ninguno de los títulos de HAI alcanzó el nivel crítico de más de 40. Además, las vacunas de ARNm-lipoplex no dieron como resultado ninguna actividad neutralizante detectable en la actividad de microneutralización, incluso hasta cinco semanas después de la vacunación.
Los datos descritos en esta invención demuestran que las formulaciones de la invención produjeron mejoras inesperadas significativas sobre las vacunas de antígenos proteicos existentes y las formulaciones de vacunas de ARNm, que incluyen: rescate del 100 % de la exposición letal a la influenza con inicio rápido de títulos de anticuerpos protectores después de 1 semana y títulos de anticuerpos altos, es decir, 50 veces más que el ARNm sin modificar y 20 veces más que la vacuna proteica.
Además, las formulaciones de ARNm-NPL de la invención fueron superiores a otras formulaciones de lípidos incluso cuando la dosis de ARNm era significativamente menor que en las otras formulaciones de lípidos. Por ejemplo, los datos descritos anteriormente se generaron usando 10 |jg de ARNm en las formulaciones de ARNm-NPL en contraste con 80 jg de ARNm en la formulación de ARNm-lipoplex.
Las formulaciones de la invención también mostraron una gran eficacia en varios modelos animales no roedores, incluidos primates no humanos. Se observó una vacunación muy efectiva en monos cynomoglus y hurones. Se vacunaron monos Cynomoglus con varias dosis de formulaciones de ARNm-NPL (50 jg/dosis, 200 jg/dosis, 400 jg/dosis). Sorprendentemente, las formulaciones de vacuna de la invención en todas las dosis midieron títulos virales significativamente reducidos en los pulmones de hurones cuando se expusieron al virus solo 7 días después de una única vacunación. Se detectaron aumentos estadísticamente significativos en el título de anticuerpos medidos por HAI y microneutralización tan pronto como 7 días después de la vacunación y durante toda la duración del estudio (84 días). Una sola vacuna pudo eliminar todos los virus en la mayoría de los animales.
Las NPL usadas en los estudios descritos en esta invención se han utilizado anteriormente para administrar siRNA en varios modelos animales, así como en seres humanos. En vista de las observaciones realizadas en asociación con la administración de RNA de formulaciones de NPL, el hecho de que NPL sean útiles en vacunas es bastante sorprendente. Se ha observado que la administración terapéutica de siRNA formulado en NPL causa una respuesta inflamatoria indeseable asociada con una respuesta IgM transitoria, que típicamente conduce a una reducción en la producción de antígeno y una respuesta inmune comprometida. En contraste con los hallazgos observados con siRNA, se demuestra en esta invención que las formulaciones de ARNm de NPL de la invención generan niveles mejorados de IgG, suficientes para procedimientos profilácticos y terapéuticos en lugar de respuestas de IgM transitorias.
I. Vacunas de ácidos nucleicos (VAN)
Las vacunas de ácido nucleico (VAN) de la presente divulgación comprenden uno o más polinucleótidos, p.ej., construcciones de polinucleótidos, que codifican uno o más antígenos de tipo salvaje o manipulados. Polinucleótidos ejemplares, por ejemplo, construcciones de polinucleótidos, incluyen polinucleótidos de ARN que codifican antígenos, por ejemplo, ARNm. En la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación, por ejemplo, polinucleótidos de ARN que codifican antígenos, pueden incluir al menos una modificación química. Las referencias en esta invención a las "VAN de la invención" se refieren a las establecidos en las reivindicaciones adjuntas.
Las composiciones de VAN de la invención pueden comprender otros componentes que incluyen, pero no se limitan a, agentes de tolerancia o adyuvantes.
Agente o composición de tolerancia.
Cuando se producen efectos secundarios mediados por la autoinmunidad, la tolerancia al ARNm y/o como cualquiera de los enseñados por ejemplo en USSN 61/892,556 depositada el 18 de octubre de 2013, y PCT/US2014/61104 depositada el 17 de octubre de 2014) se coadministran con VAN para inducir tolerancia específica al antígeno.
Adyuvantes
Los adyuvantes o potenciadores inmunitarios también se pueden administrar con o en combinación con una o más VAN.
En una realización, un adyuvante actúa como co-señal para cebar las células T y/o Células B y/o Células NK en cuanto a la existencia de una infección.
Las ventajas de los adyuvantes incluyen la mejora de la inmunogenicidad de los antígenos, la modificación de la naturaleza de la respuesta inmune, la reducción de la cantidad de antígeno necesaria para una inmunización exitosa, la reducción de la frecuencia de las inmunizaciones de refuerzo necesarias y una respuesta inmune mejorada en ancianos e inmunodeprimidos vacunados. Estos pueden coadministrarse por cualquier vía, por ejemplo, inyecciones intramusculares, subcutáneas, intravenosas o intradérmicas.
Adyuvantes útiles en la presente invención pueden incluir, entre otros, naturales o sintéticos. Pueden ser orgánicos o inorgánicos.
Los adyuvantes pueden seleccionarse de entre cualquiera de las clases (1) sales minerales, por ejemplo, hidróxido de aluminio y geles de fosfato de aluminio o calcio; (2) emulsiones que incluyen: emulsiones oleosas y formulaciones basadas en tensioactivos, por ejemplo, emulsión de aceite en agua estabilizada con detergente microfluidizado, saponina purificada, emulsión de aceite en agua, emulsión de agua en aceite estabilizada; (3) adyuvantes en partículas, por ejemplo, virosomas (vehículos liposomales unilaminares que incorporan hemaglutinina de influenza), complejo estructurado de saponinas y lípidos, polilactida co-glicólido (PLG); (4) derivados microbianos; (5) inmunomoduladores humanos endógenos; y/o (6) vehículos inertes, como partículas de oro; (7) adyuvantes derivados de microorganismos; (8) compuestos tensoactivos; (9) carbohidratos; o combinaciones de los mismos.
Se han descrito adyuvantes para vacunas de ácido nucleico (ADN) de ADN, por ejemplo, en Kobiyama, y col Vaccines, 2013, 1(3), 278-292. Cualquiera de los adyuvantes descritos por Kobiyama puede usarse en las RVAN de la presente invención.
Otros adyuvantes que pueden utilizarse en las RVAN de la presente invención incluyen cualquiera de los enumerados en la base de datos de adyuvantes de vacunas basada en la web, Vaxjo; http://www.violinet.org/vaxjo/ y se describe, por ejemplo, en Sayers, y col., J. Biomedicine ans Biotechnology, volumen 2012 (2012), Artículo ID 831486, 13 págs
La selección de adyuvantes apropiados será evidente para un experto en la técnica. Los adyuvantes específicos pueden incluir, sin limitación, complejo catiónico de liposoma-ADN JVRS-100, adyuvante de vacuna de hidróxido de aluminio, adyuvante de vacuna de fosfato de aluminio, adyuvante de sulfato de aluminio y potasio, alhidrogel, ISCOM(s)™, adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, ADN de CpG Adyuvante de vacuna, toxina del cólera, subconjunto de la toxina del cólera B, liposomas, adyuvante de la vacuna de saponina, adyuvante de DDA, adyuvantes a base de escualeno, adyuvante de la subconjunto B de Etx, adyuvante de la vacuna IL-12, adyuvante de la vacuna LTK63 mutante, adyuvante de oro TiterMax, adyuvante Ribvanti Adyuvante ISA 720, adyuvante de vacuna de P40 derivado de Corynebacterium, Adyuvante de MPL™ , AS04, AS02, adyuvante de vacuna de Lipopolisacárido, Adyuvante Muramil Dipéptido, CRL1005, Adyuvante de vacuna de Corynebacterium parvum muerto, Montanide ISA 51, Adyuvante de vacuna de componente Bordetellapertussis , Adyuvante de vacuna liposomal catiónica, Adyuvante de vacuna de Adamantilamida Dipéptido, Arlacel A, Adyuvante de VSA-3, adyuvante de vacuna de Aluminum, Adyuvante de vacuna de Poligen, Adjumer™, Algal Glucan, Bay R1005, Theramide®, Stearyl Tyrosine, Specol, Algammulin, Avridine®, Gel de Fosfato de Calcio, proteína de fusión de gen CTA1-DD, Complejo DOC/Alum, Gamma Inulina, Adyuvante Gerbu , GM-CSF, GMDP, hlFN-gamma/Interferón-g recombinante, lnterleuc¡na-1p, Interleucina-2, Interleucina-7, Sclavo péptido, Rehydragel LV, Rehydragel HPA, Loxoribine, MF59, MTP-PE Liposomas, Murametide, Murapalmitine, D-Murapalmitine, NAGO, Vesículas Tensioactivas No Iónicas, PMMA, Proteína Cochleates, QS-21, SPT (Formulación de antígeno), adyuvante de vacuna de nanoemulsión, AS03, Adyuvante de vacuna Quil-A, Adyuvante de vacuna RC529, Adyuvante de vacuna LTR192G, toxina termolábil de E. coli , LT, adyuvante de sulfato de hidroxifosfato de aluminio amorfo, Adyuvante de vacuna de fosfato de calcio, Adyuvante séptico incompleto de montanida, imiquimod, resiquimod, a F03, flagelina, Poly(I:C), ISCOMATRIX®, adyuvante de vacuna Abisco-100, adyuvante de vacuna de micropartículas de albúmina-heparina, adyuvante de vacuna AS-2, adyuvante de vacuna B7-2, adyuvante de vacuna DHEa , inmunoliposomas que contienen anticuerpos contra moléculas coestimuladoras, SAF-1, proteoliposomas de Sendai, lípido que contiene Sendai Matrices, treonil muramil dipéptido (TMDP), adyuvante de vacuna de partículas Ty, adyuvante de la vacuna de bupivacaína, adyuvante de la vacuna DL-PGL (poliéster poli (DL-lactida-co-glicólido)), adyuvante de la vacuna IL-15, adyuvante de la vacuna LTK72, MPL-SE adyuvante de vacuna, mutante no tóxico E112K de la toxina del cólera mCT-E112K, y/o Matrix-S.
Otros adyuvantes que pueden coadministrarse con las VAN de la invención incluyen, entre otros, interferones, TNF-alfa, TNF-beta, quimiocinas como CCL21, eotaxina, HMGB1, SA100-8alpha, GCs F, GMCSF, granulisina, lactoferrina, ovoalbúmina, c D-40L, agonistas de CD28, PD-1, PD1 soluble, L1 o L2, o interleucinas como IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL- 10, IL-12, IL-13, IL-21, IL-23, IL-15, IL-17 e IL-18. Estos pueden administrarse con VAN en el mismo polinucleótido codificado, por ejemplo, policistrónico, o como ARNm separado que codifica el adyuvante y el antígeno.
Valencia
Las VAN de la presente invención pueden variar en su valencia. La valencia se refiere al número de componentes antigénicos en el polinucleótido de la VAN o la VAN (por ejemplo, polinucleótido de ARN) o polipéptido. En algunas realizaciones, las VAN son monovalentes. En algunas realizaciones, las VAN son bivalentes. En algunas realizaciones, las VAN son trivalentes. En algunas realizaciones las VAN son multi-valentes. Las vacunas multivalentes pueden comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más antígenos o restos antigénicos (p. ej., péptidos antigénicos, etc.). Los componentes antigénicos de las VAN pueden estar en un solo polinucleótido o en polinucleótidos separados.
Terapéutica
Las VAN de la presente invención pueden usarse como agentes terapéuticos o profilácticos. Se proporcionan para su uso en medicina y/o para el cebado de células efectoras inmunes, p. ej., estimular/transfectar PBMC ex vivo y reinfundir las células activadas. Por ejemplo, una VAN descrita en esta invención puede administrarse a un sujeto, donde los polinucleótidos se traducen in vivo para producir un antígeno. Se proporcionan composiciones, procedimientos, kits y reactivos para prevenir, tratar o diagnosticar una enfermedad o afección en seres humanos y otros mamíferos. Los agentes terapéuticos activos de la divulgación incluyen VAN, células que contienen VAN o polipéptidos traducidos de los polinucleótidos contenidos en dichas VAN.
En esta invención se proporcionan procedimientos para inducir la traducción de un polipéptido (p.ej., antígeno o inmunógeno) en una célula, tejido u organismo utilizando los polinucleótidos de las VAN descritas en esta invención. Esta traducción puede ser in vivo, ex vivo, en cultivo, o in vitro.La célula, tejido u organismo se pone en contacto con una cantidad efectiva de una composición que contiene una VAN que contiene un polinucleótido que tiene al menos una región traducible que codifica el polipéptido de interés (p.ej., antígeno o inmunógeno).
Se proporciona una "cantidad efectiva" de la composición de VAN, al menos en parte, en el tejido diana, el tipo celular diana, los medios de administración, las características físicas del polinucleótido (por ejemplo, el tamaño y la extensión de los nucleósidos modificados) y otros componentes de la VAN, y otros determinantes. En general, una cantidad efectiva de la composición de v An proporciona una respuesta inmunitaria inducida o reforzada en función de una producción de antígenos en la célula, preferentemente más efectiva que una composición que contiene un polinucleótido no modificado correspondiente que codifica el mismo antígeno. El aumento de la producción de antígenos puede demostrarse mediante el aumento de la transfección celular (es decir, el porcentaje de células transfectadas con loa VAN), el aumento de la traducción de proteínas del polinucleótido, la disminución de la degradación del ácido nucleico (como se demuestra, por ejemplo, mediante el aumento de la duración de la traducción de proteínas de un polinucleótido modificado), o respuesta inmunitaria innata alterada de la célula huésped.
Aspectos de la divulgación están dirigidos a procedimientos para inducir la traducción in vivo de un antígeno de polipéptido en un sujeto mamífero que lo necesite. Allí, se administra al sujeto una cantidad efectiva de una composición de VAN que contiene un polinucleótido que tiene al menos una modificación estructural o química y una región traducible que codifica el polipéptido (p. ej., antígeno o inmunógeno) usando los procedimientos de administración descritos en esta invención. El polinucleótido se proporciona en una cantidad y en otras condiciones tales que el polinucleótido se traduce en la célula. La célula donde se localiza un ácido nucleico de la divulgación, o el tejido donde está presente la célula, puede ser alcanzada con una o más rondas de administración de VAN.
En ciertos aspectos, las VAN administradas que comprenden polinucleótidos dirigen la producción de uno o más polipéptidos que proporcionan una actividad funcional relacionada con el sistema inmunológico que está sustancialmente ausente en la célula, tejido u organismo donde se traduce el polipéptido. Por ejemplo, la actividad funcional faltante puede ser de naturaleza enzimática, estructural o reguladora de genes. En aspectos relacionados, los polinucleótidos administrados dirigen la producción de uno o más polipéptidos que aumentan (p. ej., sinérgicamente) una actividad funcional relacionada con el sistema inmunitario que está presente pero es sustancialmente deficiente en la célula en la que se traduce el polipéptido.
Además, el polipéptido antagoniza, directa o indirectamente, la actividad de un resto biológico presente en, sobre la superficie o secretado de la célula. Ejemplos de restos biológicos antagonizados incluyen lípidos (p. ej., colesterol), una lipoproteína (p. ej., lipoproteína de baja densidad), un ácido nucleico, un carbohidrato, una toxina proteica como las toxinas shiga y toxinas del tétanos, o una pequeña toxina molecular como las toxinas botulínica, del cólera y diftérica. Además, la molécula biológica antagonizada puede ser una proteína endógena que exhibe una actividad indeseable, tal como una actividad citotóxica o citostática.
Las proteínas descritaqs en esta invención pueden diseñarse para la localización dentro de la célula, potencialmente dentro de un compartimento específico como citoplasma o núcleo, o se proyectan para la secreción de la célula o la translocación a la membrana plasmática de la célula.
En algunos aspectos, los polinucleótidos de las VAN y sus polipéptidos codificados según la presente divulgación pueden usarse para el tratamiento de cualquiera de una variedad de enfermedades, trastornos, y/o afecciones, que incluyen, entre otras, infecciones virales (p.ej., influenza, VIH, VHC, RSV), infecciones parasitarias o infecciones bacterianas.
El sujeto al que se le puede administrar el agente terapéutico padece o puede tener riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección deletérea. Se proporcionan procedimientos para identificar, diagnosticar y clasificar sujetos sobre estas bases, que pueden incluir diagnóstico clínico, niveles de biomarcadores, estudios de asociación de todo el genoma (GWAS) y otros procedimientos conocidos en la técnica.
Los agentes se pueden administrar simultáneamente, por ejemplo, en una dosis unitaria combinada (p.ej., proporcionando la administración simultánea de ambos agentes). Los agentes también se pueden administrar en un intervalo de tiempo especificado, como, pero sin limitarse a, un intervalo de minutos, horas, días o semanas. Generalmente, los agentes pueden estar simultáneamente biodisponibles, por ejemplo, detectables, en el sujeto. En algunos aspectos, los agentes pueden administrarse esencialmente de forma simultánea, por ejemplo, dos dosis unitarias administradas al mismo tiempo, o una dosis unitaria combinada de los dos agentes. En otros aspectos, los agentes pueden administrarse en dosis unitarias separadas. Los agentes pueden administrarse en cualquier orden o como una o más preparaciones que incluyen dos o más agentes. En un aspecto preferido, al menos una administración de uno de los agentes, p. ej., el primer agente, puede realizarse en minutos, una, dos, tres o cuatro horas, o incluso dentro de uno o dos días del otro agente, p. ej., el segundo agente. En algunos aspectos, las combinaciones pueden lograr resultados sinérgicos, por ejemplo, mayores que los resultados aditivos, por ejemplo, al menos un 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400 o 500 % mayores que los resultados aditivos.
Modulación de la respuesta inmune
Activación de la respuesta inmune
Según la presente divulgación, las VAN que comprenden los polinucleótidos descritos en esta invención, por ejemplo, que comprenden polinucleótidos de ARN, pueden actuar como una composición única como vacuna. Como se usa en esta invención, una "vacuna" se refiere a una composición, por ejemplo, una sustancia o preparación que estimula, induce, causa o mejora la inmunidad en un organismo, por ejemplo, un organismo animal, por ejemplo, un organismo de mamífero (por ejemplo, un humano.) Preferiblemente, una vacuna proporciona inmunidad contra una o más enfermedades o trastornos en el organismo, incluida la profiláctica y/o inmunidad terapéutica. Vacunas ejemplares incluyen uno o más agentes que se asemejan a un agente infeccioso, por ejemplo, un microorganismo causante de enfermedades, y pueden prepararse, por ejemplo, a partir de formas vivas, atenuadas, modificadas, debilitadas o muertas de microorganismos causantes de enfermedades, o antígenos derivados de ellos, incluidas combinaciones de componentes antigénicos. En aspectos ejemplares, una vacuna estimula, induce, causa o mejora la inmunidad en un organismo o causa o imita una infección en el organismo sin inducir ninguna enfermedad o trastorno. Una vacuna introduce un antígeno en los tejidos, el espacio extracelular o las células de un sujeto y provoca una respuesta inmune, protegiendo así al sujeto de una enfermedad o infección patógena particular. Los polinucleótidos de la presente divulgación pueden codificar un antígeno y cuando los polinucleótidos se expresan en células, se logra una respuesta inmune deseada.
Se pueden administrar VAN en forma profiláctica o terapéutica como parte de un esquema de inmunización activa a individuos sanos o que se encuentran en etapas tempranas de infección durante la fase de incubación o durante la infección activa, luego de la aparición de síntomas.
Las VAN de la presente divulgación también pueden administrarse como un tratamiento de segunda línea después de que los tratamientos estándar de primera línea, como los antibióticos y antivirales, no hayan logrado inducir la inmunidad pasiva. A este respecto, las VAN de la presente divulgación son útiles en entornos donde se ha desarrollado resistencia a los tratamientos de primera línea y la enfermedad persiste e induce una enfermedad crónica.
El uso de ARN en o como vacuna supera las desventajas de la vacunación genética convencional que implica incorporar ADN en las células en términos de seguridad, factibilidad, aplicabilidad y efectividad para generar respuestas inmunes. Se considera que las moléculas de ARN son significativamente más seguras que las vacunas de ADN, ya que los ARN se degradan más fácilmente. Se eliminan rápidamente del organismo y no pueden integrarse en el genoma e influir en la expresión genética de la célula de manera incontrolable. También es menos probable que las vacunas de ARN causen efectos secundarios graves como la generación de enfermedades autoinmunes o anticuerpos anti-ADN (Bringmann A. y col., Journal of Biomedicine and Biotechnology (2010), vol. 2010, artículo ID623687). La transfección con ARN solo requiere la inserción en el citoplasma de la célula, que es más fácil de lograr que en el núcleo. Sin embargo, el ARN es susceptible a la degradación de la ARNasa y a otra descomposición natural en el citoplasma de las células.
Varios intentos de aumentar la estabilidad y la vida útil de las vacunas de ARN.EE. UU. 2005/0032730 a Von Der Mulbe y col. describe la mejora de la estabilidad de las composiciones de vacunas de ARNm aumentando el contenido de G(guanosina)/C(citosina) de las moléculas de ARNm.US 5580859 a Felgner y col. enseña la incorporación de secuencias de polinucleótidos que codifican proteínas reguladoras que se unen y regulan las estabilidades del ARNm. Aunque no se desea ceñirse a la teoría, se cree que las vacunas de polinucleótidos (VAN) de la invención darán como resultado una estabilidad y eficacia terapéuticas mejoradas debido al menos en parte a la especificidad, pureza y selectividad de los diseños de construcciones.
Además, ciertos nucleósidos modificados, o combinaciones de los mismos, cuando se introducen en los polinucleótidos de las VAN de la invención activarán la respuesta inmune innata. Tales moléculas activantes son útiles como adyuvantes cuando se combinan con polipéptidos y/u otras vacunas. En ciertos aspectos, las moléculas de activación contienen una región traducible que codifica una secuencia polipeptídica útil como vacuna, proporcionando así la capacidad de ser autoadyuvante.
En un aspecto, los polinucleótidos de las VAN de la presente divulgación pueden usarse en la prevención, el tratamiento y el diagnóstico de enfermedades y alteraciones físicas causadas por agentes infecciosos. El polinucleótido de la presente divulgación puede codificar al menos un polipéptido de interés (antígeno) y puede proporcionarse a un individuo para estimular el sistema inmunológico para protegerlo contra los agentes causantes de enfermedades. Como ejemplo no limitativo, la actividad biológica y/o el efecto de un antígeno o agente infeccioso puede inhibirse y/o abolirse proporcionando uno o más polinucleótidos que tienen la capacidad de unirse y neutralizar el antígeno y/o agente infeccioso.
Como ejemplo no limitante, los polinucleótidos que codifican un inmunógeno se pueden administrar a las células para desencadenar múltiples vías de respuesta innatas (ver Publicación Internacional No. WO2012006377 y Publicación de Patente de EE. Uu . No. US20130177639 ). Como otro ejemplo no limitante, los polinucleótidos de las VAN de la presente divulgación que codifican un inmunógeno pueden administrarse a un vertebrado en una cantidad de dosis lo suficientemente grande como para ser inmunogénica para el vertebrado (ver Publicación Internacional No. WO2012006372 y WO2012006369 y publicación de EE. UU. N.° US20130149375 y US20130177640
Las VAN de la presente invención se pueden utilizar en varios entornos dependiendo de la prevalencia de la infección o el grado o nivel de necesidad médica no satisfecha. Las VAN de la presente invención se pueden utilizar para tratar y/o impedir la infección por influenza, es decir, enfermedades y afecciones relacionadas con la infección por el virus de la influenza (estacional y pandémica).
Los síntomas de la infección por influenza incluyen tos seca, fiebre, escalofríos, mialgias que progresan a insuficiencia respiratoria y el riesgo de infecciones bacterianas secundarias (p. ej., MRSA). La influenza estacional es ubicua y consiste en tres cepas principales (A [H1N1], A [H3N2], y B), que son cubiertas por la vacuna anual. La influenza pandémica se produce porque la capacidad única de reordenamiento de los virus permite el cambio antigénico y la transferencia entre las cepas de influenza aviar y porcina. Una preocupación emergente en el sudeste asiático es el potencial pandémico de varias cepas nuevas. Estos brotes pandémicos tienen una alta tasa de mortalidad con pocos tratamientos disponibles. Los antivirales solo brindan alivio sintomático y deben administrarse en las primeras 48 horas.
Las VAN de la presente invención tienen propiedades superiores en el sentido de que producen títulos de anticuerpos mucho mayores, producen respuestas más tempranas que los antivirales disponibles comercialmente y pueden administrarse después del período crítico de 48 horas manteniendo la eficacia.
Aunque no desean limitarse a la teoría, los inventores plantean la hipótesis de que las VAN de la invención, como polinucleótidos de ARNm, están mejor diseñados para producir la conformación proteica adecuada en la traducción, ya que las VAN cooptan la maquinaria celular natural. A diferencia de las vacunas tradicionales que se producen ex vivo y que pueden desencadenar respuestas celulares no deseadas, las vacunas de ARN se presentan al sistema celular en una forma más natural. Además de los efectos superiores, también pueden implicar las formulaciones utilizadas que no pueden ni servir para blindar ni transitar las v An .
Según la presente invención, las VAN representan una vacuna activa adaptada que no solo puede impedir la infección, sino que también puede limitar la transmisión de la influenza.
Las VAN pueden usarse para impedir la influenza pandémica al reaccionar a las nuevas cepas emergentes con el muy rápido procedimiento de producción de vacunas basado en VAN. Una nueva VAN para el tratamiento o prevención profiláctica de brotes de influenza, incluso para cepas emergentes (p. ej., H10N8), puede producirse en menos de seis semanas, desde el momento de la identificación del antígeno hasta la vacuna disponible.
En algunos aspectos, una sola inyección de un único antígeno que codifica el polinucleótido de la VAN puede brindar protección durante toda una temporada de influenza.
Los polinucleótidos de las VAN de la invención no son ARN autorreplicantes. Se han descrito ARN autorreplicantes, por ejemplo, en la publicación de EE. UU. No. US20110300205 y Pub. Internacional. N° WO201l005799 y WO2013055905.
En un aspecto, los polinucleótidos de las VAN de la invención pueden codificar péptidos anfipáticos y/o péptidos anfipáticos inmunogénicos.
En una realización, una formulación de los polinucleótidos de las VAN de la invención puede comprender además un péptido anfipático y/o péptido anfipático inmunogénico. Como ejemplo no limitativo, los polinucleótidos que comprenden un péptido anfipático y/o un péptido anfipático inmunogénico se puede formular como se describe en la Pub. de EE.UU. No. US20110250237 y Pub. Internacional. Nos. WO2010009277 y W02010009065.
En una realización, los polinucleótidos de las VAN de la invención pueden ser inmunoestimuladores. Como ejemplo no limitativo, los polinucleótidos pueden codificar todo o una parte de un genoma de virus de ARN de cadena de sentido positivo o negativo (ver Publicación internacional No. WO2012092569 y Publicación de EE. UU. No. US20120177701). En otro ejemplo no limitante, los polinucleótidos inmunoestimuladores de la presente invención pueden formularse con un excipiente para su administración como se describe en esta invención y/o conocidos en la técnica (ver Publicación Internacional No. W02012068295 y Publicación de EE.UU. No. US20120213812). Los polinucleótidos pueden comprender además una región de secuencia que codifica una citoquina que promueve la respuesta inmune, como una monoquina, linfoquina, interleucina o quimioquina, como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, I N F - c í , I N F - y , GM-CFS, LT-a o factores de crecimiento como hGH.
En una realización, la respuesta de la vacuna formulada mediante los procedimientos descritos en esta invención puede mejorarse mediante la adición de varios compuestos para inducir el efecto terapéutico. Como ejemplo no limitante, la formulación de la vacuna puede incluir un péptido de unión a MHC II o un péptido que tenga una secuencia similar a un péptido de unión a MHC II (ver Publicaciones Internacionales Nos. W02012027365, W02011031298 y Publicaciones de EE. UU. N° US20120070493, US20110110965). Como otro ejemplo, las formulaciones de vacunas pueden comprender compuestos nicotínicos modificados que pueden generar una respuesta de anticuerpos al residuo de nicotina en un sujeto (ver Publicación Internacional No. W02012061717 y Publicación de EE.UU. No. US20120114677).
En una realización, la cantidad efectiva de polinucleótidos de las VAN de la invención proporcionados a una célula, un tejido o un sujeto puede ser suficiente para la profilaxis inmunitaria.
En un aspecto, los polinucleótidos de las VAN de la invención pueden administrarse con otros compuestos profilácticos o terapéuticos. Como ejemplo no limitante, el compuesto profiláctico o terapéutico puede ser un adyuvante o un refuerzo. Tal como se usa en esta invención, cuando se hace referencia a una composición profiláctica, tal como una vacuna, el término “refuerzo” se refiere a una administración extra de la composición profiláctica (vacuna). Puede administrarse un refuerzo (o vacuna de refuerzo) después de una administración anterior de la composición profiláctica. El plazo de administración entre la administración inicial de la composición profiláctica y el refuerzo puede ser, de modo no taxativo, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 6 minutos, 7 minutos, 8 minutos, 9 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 35 minutos, 40 minutos, 45 minutos, 50 minutos, 55 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 1 día, 36 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 10 días, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 año, 18 meses, 2 años, 3 años, 4 años, 5 años, 6 años, 7 años, 8 años, 9 años, 10 años, 11 años, 12 años, 13 años, 14 años, 15 años, 16 años, 17 años, 18 años, 19 años, 20 años, 25 años, 30 años, 35 años, 40 años, 45 años, 50 años, 55 años, 60 años, 65 años, 70 años, 75 años, 80 años, 85 años, 90 años, 95 años o más de 99 años.
En un aspecto, los polinucleótidos de las VAN de la invención pueden administrarse por vía intranasal de forma similar a la administración de vacunas vivas. En otro aspecto, el polinucleótido puede administrarse por vía intramuscular o intradérmica de forma similar a la administración de vacunas inactivadas conocidas en la técnica.
En un aspecto, las VAN de la invención pueden usarse para proteger contra y/o impedir la transmisión de una amenaza emergente o diseñada que pueda ser conocida o desconocida.
En otra realización, las VAN pueden formularse mediante los procedimientos descritos en esta invención. En un aspecto, la formulación puede comprender una VAN o polinucleótido que puede tener un efecto terapéutico y/o efecto profiláctico en más de una enfermedad, trastorno o afección.
Además, los anticuerpos de la VAN de la presente invención pueden usarse para investigación en muchas aplicaciones, tales como, pero sin limitarse a, identificar y localizar proteínas intracelulares y extracelulares, interacción de proteínas, rutas de señales y biología celular.
En otro aspecto, la VAN puede usarse para reducir el riesgo o inhibir la infección de virus de la influenza como, entre otros, el virus de la influenza aviar altamente patógena (como, entre otros, el subtipo H5N1) y la infección e infección por virus de la influenza humana (como, entre otros, subtipo H1N1 y subtipo H3N2). El polinucleótido descrito en esta invención que puede codificar cualquiera de las secuencias de proteínas descritas en la Patente de EE. UU. N° 8470771, puede usarse en el tratamiento o para reducir el riesgo de una infección por influenza.
En un aspecto, la VAN puede usarse como vacuna y puede comprender además un adyuvante que puede permitir que la vacuna provoque una respuesta inmune más alta. Como ejemplo no limitante, el adyuvante podría ser una emulsión de aceite en agua submicrométrica que puede provocar una respuesta inmune más alta en poblaciones pediátricas humanas (ver, por ejemplo, las vacunas con adyuvante descritas en la publicación de patente de EE.UU. N° US20120027813 y Patente de EE. UU. N° US8506966).
II. Agentes infecciosos y antíaenos
Las VAN de la presente divulgación pueden usarse para proteger, tratar o curar infecciones que surgen del contacto con un agente infeccioso. En la invención, el agente infeccioso es una cepa de Influenza A o Influenza B o combinaciones de las mismas y el polipéptido antigénico es una proteína hemaglutinina o fragmento de la misma.
A. Manejo de la infección
Combinaciones de antibióticos
En un aspecto, las VAN de la presente divulgación, por ejemplo, las VAN que comprenden uno o más polinucleótidos que codifican antígenos de la presente divulgación pueden administrarse junto con uno o más antibióticos.
Agentes antibacterianos
Agentes antibacterianos incluyen, sin limitación, aminoglicósidos (p.ej., amikacina (AMIKIN®), gentamicina (GARAMYCIN®), kanamicina (KANTREX®), neomicina (MYCIFRADIN®), netilmicina (NETROMYCIN®), tobramicina (NEBCIN®), Paromomicina (HUMATIN®)), ansamicinas (p.ej., geldanamicina, herbimicina), carbacefem (p.ej., loracarbef (LORABID®), Carbapenems (p.ej., ertapenem (INVANZ®), doripenem (DORIBAX®), imipenem/cilastatin (PRIMAXIN®), meropenem (MERREM®), cefalosporinas (primera generación) (p.ej., cefadroxil (Du RiCe F®), cefazolin (ANCEF®), cefalotin o cefalotin (KEFLIN®), cefalexina (KEFLEX®), cefalosporinas (segunda generación) (p.ej., cefaclor (CECLOR®), cefamandole (MANDOL®), cefoxitin (MEFOXIN®), cefprozil (CEFZIL®), cefuroxime (CEFTIN®, ZINNAT®)), cefalosporinas (tercera generación) (p . e j cefixime (SUPRAX®), cefdinir (o Mn ICEF®, CEFDIEL®), cefditoren (SPECTRACEF®), cefoperazona (CEFOBID®), cefotaxime (CLAFORAN®), cefpodoxime (VANTIN®), ceftazidime (FORTAZ®), ceftibuten (CEDAX®), ceftizoxime (CEFIZOX®), ceftriaxone (ROCEPHIN®)), cefalosporinas (cuarta generación) (p.ej., cefepime (MAXIPIME®)), cefalosporinas (quinta generación) (p.ej., ceftobiprole (ZEFTERA®)), glicopéptidos (p.ej., teicoplanin (TARGOCiD®), vancomicina (VANCOCIN®), telavancin (VIBa T iV®)), lincosamidas (p.ej., clindamicina (CLe Oc IN®), lincomicina (LlNCOCIN®)), lipopéptido (p.ej., daptomicina (CUBIClN®)), macrólidos (p.ej., azitromicina (ZITHROMAX®, SUMAMED®, ZITROCIN®), claritromicina (BIAXIN®), diritromicina (DYNABAC®), eritromicina (ERYTHOCIN®, ERYTHROPED®), roxitromicina, troleandomicina (TAO®), telitromicina (KETEK®), spectinomicina (TROBICIN®)), monobactams (p.ej., aztreonam (AZACTAM®)), nitrofuranos (p.ej., furazolidona (FUROXONE®), nitrofurantoin (MACRODANTIN®, MACROBID®)), penicilinas (p.ej., amoxicilina (NOVAMOX®, AMOXIL®), ampicilina (PRINCIPEN®), azlocilina, carbenicilina (GEOCILLIN®), cloxacilina (TEGOPEN®), dicloxacilina (DYNAPEN®), flucloxacilina (FLOXAPEN®), mezlocilina (MEZLIN®), methicilina (STAPHCILLIN®), nafcilina (UNIPEN®), oxacilina (PROSTAPHLIN®), penicilina G (PENTIDS®), penicilina V (PEN-VEE-K®), piperacilina (PIPRACIL®), temocilina (NEGABAN®), ticarcilina (TICAR®)), combinaciones de penicilina (p.ej., amoxicilina/clavulanato (AUGMENTIN®), ampicilina/sulbactam (UNASYN®), piperacilina/tazobactam (ZOSYN®), ticarcilina/clavulanato (TIMENTIN®)), polipéptidos (p.ej., bacitracina, colistina (COLY-MYCIN-S®), polimixina B, quinolonas (p.ej., ciprofloxacin (CIPRO®, CIPROXIN®, CIPROBAY®), enoxacin (PENETREX®), gatifloxacin (TEQUIN®), levofloxacin (LEVAQUIN®), lomefloxacin (MAXAQUIN®), moxifloxacin (AVELOX®), ácido nalidíxico (NEGGRAM®), norfloxacin (NOROXIN®), ofloxacin (FLOXIN®, OCUFLOX®), trovafloxacin (TROVAN®), grepafloxacin (RAXAR®), sparfloxacin (ZAGAM®), temafloxacin (OMNIFLOX®)), sulfonamidas (p.ej., mafenida (Su LfAm YLON®), sulfonamidocrisoidinaq (PRONTOSIL®), sulfacetamida (SULAMYD®, BLEPH-10®), sulfadiazina (MICRO-SULFON®), sulfadiazina de plata (SILVADENE®), sulfametizol (THIOSULFIL FORTE®), sulfametoxazol (GANTANOL®), sulfanilimida, sulfasalazina (AZULFIDINE®), sulfisoxazol (GANTRISIN®), trimetoprim (PROLOPRIM®), TRIMPEX®), trimetoprim-sulfametoxazol (co-trimoxazol) (TMP-SMX) (BACTRIM®, Se Pt RA®)), tetraciclinas (p.ej., demeclociclina (DECLo My CIN®), doxiciclina (VIBRAMYCIN®), minociclina (MINOCIN®), oxitetraciclina (TERRAMYCIN®), tetraciclina (SUMYCIN®, ACHROMYCIN® V, STECLIN®)), fármacos contra micobacterias (p.ej., clofazimina (lAm PRENE®), dapsona (AVLOSULFON®), capreomicina (CAPASTAT®), cicloserina (SEROMYCIN®), etambutol (MYAMBUTOL®), etionamida (TRECATOR®), isoniazid (I.N.H.®), pirazinamida (ALDINAMIDE®), rifampin (RIFADIN®, RIMACTANE®), rifabutin (MYCOBUTIN®), rifapentin (PRIFTIN®), streptomicina), y otros (p.ej., arsfenamina (SALVARSAN®), cloramfenicol (CHLOROMYCETIN®), fosfomicina (MONUROL®), ácido fusídico (FUCIDIN®), linezolid (ZYVOX®), metronidazol (FLAGYL®), mupirocin (BACTROBAN®), platensimicina, quinupristin/dalfopristin (SYNERCID®), rifaximin (XIFAXAN®), tiamfenicol, tigeciclina (TIGACYL®), tinidazol (TINDAMAX®, FASIGYN®)).
B. Ámbitos y/o situaciones terapéuticas
Las VAN de la presente invención se pueden utilizar en varios entornos dependiendo de la prevalencia de la infección o el grado o nivel de necesidad médica no satisfecha. Algunas aplicaciones de las VAN de la divulgación se describen en la Tabla 1.
Tabla 1. A entes infecciosos por prevalencia necesidad médica
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Influenza (estacional y pandémica)
Los síntomas de la influenza incluyen tos seca, fiebre, escalofríos, mialgias que progresan a insuficiencia respiratoria y el riesgo de infecciones bacterianas secundarias (p. ej., MRSA). La influenza estacional es ubicua y consiste en tres cepas principales (A [H1N1], A [H3N2], y B), que son cubiertas por la vacuna anual. La influenza pandémica se produce porque la capacidad única de reordenamiento de los virus permite el cambio antigénico y la transferencia entre las cepas de influenza aviar y porcina. Una preocupación emergente en el sudeste asiático es el potencial pandémico de varias cepas nuevas. Estos brotes pandémicos tienen una alta tasa de mortalidad con pocos tratamientos disponibles. Los antivirales solo brindan alivio sintomático y deben administrarse en las primeras 48 horas.
Las VAN de la presente invención tienen propiedades superiores en el sentido de que producen títulos de anticuerpos mucho mayores, producen respuestas más tempranas que los antivirales disponibles comercialmente y pueden administrarse después del período crítico de 48 horas manteniendo la eficacia.
Aunque no desean limitarse a la teoría, los inventores plantean la hipótesis de que las VAN de la invención, como polinucleótidos de ARNm, están mejor diseñadas para producir la conformación proteica adecuada en la traducción, ya que los VAN cooptan la maquinaria celular natural. A diferencia de las vacunas tradicionales que se producen ex vivo y que pueden desencadenar respuestas celulares no deseadas, las VAN se presentan al sistema celular en una forma más natural. Además de los efectos superiores, también pueden implicar las formulaciones utilizadas que no pueden ni servir para blindar ni transitar las VAN.
Según la presente invención, las VAN representan una vacuna activa adaptada que no solo puede impedir la infección, sino que también puede limitar la transmisión de la influenza.
Las VAN de la invención pueden usarse para impedir la influenza pandémica al reaccionar a las nuevas cepas emergentes con el muy rápido procedimiento de producción de vacunas basado en VAN. En algunas realizaciones, una nueva VAN para el tratamiento o prevención profiláctica de brotes de influenza, incluso para cepas emergentes (p. ej., H7N9 H10N8), puede producirse en menos de seis semanas, desde el momento de la identificación del antígeno hasta la vacuna disponible.
En algunos aspectos, una sola inyección de un único antígeno que codifica el polinucleótido de la VAN puede brindar protección durante toda una temporada de influenza.
Influenza: mantenimiento de la memoria antigénica
Las composiciones de VAN de la presente invención también pueden usarse para mantener o restaurar la memoria antigénica en un sujeto o población como parte de un plan de vacunación.
Con la velocidad y versatilidad de la tecnología VAN de la presente invención, ahora es posible crear un plan de vacunación que abarque el espacio de cepas tanto temporal como viral.
En una realización, se pueden crear composiciones de VAN que incluyen polinucleótidos que codifican uno o más antígenos del año de influenza. Como se usa en esta invención, un antígeno de año de influenza es un antígeno que se selecciona de entre una cepa de influenza usada como componente de una vacuna de influenza de un año particular. Por ejemplo, la cepa de influenza A, virus similar a A/Port Chalmers/1/1973(H3N2), representa un componente de la cepa de la vacuna del hemisferio norte de 1974 a 1975.
Según la presente divulgación, se desarrolla un esquema o plan de vacunación que permite no solo la vacunación continua en el año en curso, sino también vacunas de refuerzo de la memoria antigénica a lo largo de años, cepas o grupos de las mismas para establecer y mantener la memoria antigénica en una población. De esta manera, es menos probable que una población sucumba a cualquier pandemia o brote que implique la recurrencia de cepas más antiguas o la aparición de antígenos de cepas más antiguas.
Cualquier combinación de cepas de componentes de vacunas anteriores utilizadas para crear o diseñar una vacuna de refuerzo de memoria antigénica se denomina en esta invención conjunto de referencia.
En un aspecto, las VAN que son vacunas de refuerzo de la memoria antigénica se administran para estimular la memoria antigénica durante un período de tiempo de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 o más años.
En un aspecto, las VAN que son vacunas de refuerzo de la memoria antigénica se administran para estimular la memoria antigénica durante años históricos alternos, incluidos años alternos de las cepas componentes de la vacuna anteriores en relación con un año en curso. En algunos aspectos la selección de los componentes de la vacuna puede ser de cada 3°, 4°, 5°, 6°, 7° , 8°, 9°, 10° o más años.
En un aspecto, las VAN, que son vacunas de refuerzo de la memoria antigénica, se administran para estimular la memoria antigénica durante períodos de diez años.
En algunos aspectos, las VAN, que son vacunas de refuerzo de la memoria antigénica, se administran para estimular la memoria antigénica y se seleccionan de entre varias cepas de influenza tipo A como primera selección combinada con una selección de entre varias cepas de influenza tipo B u otras cepas enumeradas en esta invención. El número de selecciones de tipo A o tipo B puede ser independientemente, 1,2, 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más.
En todos los casos, las cepas de la vacuna de refuerzo de la memoria antigénica para el antígeno que codifica en las VAN pueden seleccionarse de entre los componentes de la vacuna del hemisferio norte o sur de forma independiente.
En algunos aspectos, la vacuna de refuerzo de VAN puede usarse en una población una vez o periódicamente para crear inmunidad colectiva. Esta inmunidad está presente cuando más del 30 % de la población está protegida.
Los componentes o cepas de influenza que pueden utilizarse en las vacunas de refuerzo de la memoria antigénica incluyen, pero no se limitan a, los de las Tablas 2-5.
Tabla 2. Com onentes de la vacuna contra la influenza or año
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Tabla 3. Componentes de la vacuna contra la influenza por año-Hemisferio Sur
Hemisferio H1N1 H3N2 Cepa B cepa B sur adicional
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para QIV 1975 N/A Virus similar a A/Port Virus similar a N/A Chalmers/1/1973(H 3N2) B/HongKong/05/1 972
1976 H1N1 virus similar a Virus similar a A/Port Virus similar a N/A A/Scotland/840/74 Chalmers/1/1973(H 3N2) B/HongKong/05/1 972 1977 N/A Virus similar a A/Victoria/3/75(H3 Virus similar a N/A N2) B/HongKong/05/1 972
1978 N/A Virus similar a A/Victoria/3/75(H3 Virus similar a N/A N2) B/HongKong/05/1 972
1979 Virus similar a Virus similar a A/Texas/1/77(H3N2 ) Virus similar a N/A A/USSR/90/77(H1N 1) B/HongKong/05/1 972 1980 Virus similar a Virus similar a A/Texas/1/77(H3N2 ) N/A N/A A/USSR/90/77(H1N 1)
1981 Virus similar a Virus similar a A/Bangkok/01/1979 Virus similar a N/A A/Brazil/11/78(H1N 1) (H3N2) B/Singapore/222/79 1982 Virus similar a Virus similar a A/Bangkok/01/1979 Virus similar a N/A A/Brazil/11/78(H1N 1) (H3N2) B/Singapore/222/79 1983 Virus similar a Virus similar a A/Bangkok/01/1979 Virus similar a N/A A/Brazil/11/78(H1N 1) (H3N2) B/Singapore/222/79 1984 Virus similar a Virus similar a A/Philippines/2/82( Virus similar a N/A A/Brazil/11/78(H1N 1) H3N2) B/Singapore/222/79 1985 Virus similar a Virus similar a A/Philippines/2/82( Virus similar a N/A
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A/Chile/1/83 (H1N1) H3N2) B/USSR/100/ 83
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Tabla 4. Com onentes de la vacuna contra la influenza or año-Hemisferio Norte
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Tabla 5. Componentes de la vacuna contra la influenza por año-Hemisferio Norte
Hemisferio H1N1 H3N2 Cepa B cepa B sur adicional para
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QIV
1999 Virus similar a Virus similar a Virus similar a N/A
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A/Beijing/262/95(H 1N1) A/Syd ney/5/97(H3N 2) B/Beijing/184/93
Mayo- Virus similar a A/New Virus similar a Virus similar a N/A
octubre de Caledonia/20/99 (H1N1) A/Moscow/10/99 (H3N2) B/Beijing/184/93 o Virus
2000 similar a B/Shangdong/7/97
Mayo- Virus similar a A/New Virus similar a Virus similar a N/A
octubre de Caledonia/20/99 (H1N1) A/Moscow/10/99 (H3N2) B/Sichuan/379/99
2001
Virus similar a A/New Virus similar a Virus similar a N/A Caledonia/20/99 (H1 NI) A/Moscow/10/99(H 3N2) B/Sichuan/379/99
Virus similar a A/New Virus similar a Virus similar a B/Hong N/A Caledonia/20/99 (H1 NI) A/Moscow/10/99(H 3N2) Kong/330/2001
Virus similar a A/New Virus similar a Virus similar a B/Hong N/A Caledonia/20/99 (H1 NI) A/Fujian/411/2002( Kong/330/2001
H3N2)
Virus similar a A/New Virus similar a Virus similar a N/A Caledonia/20/99 (H1 NI) A/Wellington/1/200 B/Shanghai/361/2002
4(H3N2)
Virus similar a A/New Virus similar a Virus similar a N/A Caledonia/20/99(H1 N1) A/California/7/2004 B/Malaysia/2506/2 004
(H3N2)
Virus similar a A/New Virus similar a Virus similar a N/A Caledonia/20/99(H1 Nl) A/Wisconsin/67/200 5 B/Malaysia/2506/2 004
(H3N2)
Virus similar a A/Solomon Virus similar a Virus similar a N/A Islands/3/2006 (H1N1) A/Brisbane/10/2007 B/Florida/4/2006
(H3N2)
Virus similar a Virus similar a Virus similar a N/A A/Brisbane/59/2007 A/Brisbane/10/2007 B/Florida/4/2006
(H1N1) (H3N2)
Virus similar a Virus similar a Virus similar a N/A A/California/7/2009 A/Perth/16/2009 (H3N2) B/Brisbane/60/200 8
(H1N1)
Virus similar a Virus similar a Virus similar a N/A A/California/7/2009 A/Perth/16/2009 (H3N2) B/Brisbane/60/200 8
(H1N1)
Virus similar a Virus similar a Virus similar a N/A A/California/7/2009 A/Perth/16/2009 (H3N2) B/Brisbane/60/200 8
(H1N1)pdm09
Virus similar a Virus similar a Virus similar a Virus similar a A/California/7/2009 A/Victoria/361/2011 B/Wisconsin/1/201 0 B/Brisbane/6 (H1N1)pdm09 (H3N2) 0/2008
Virus similar a Virus similar a Virus similar a Virus similar a A/California/7/2009 A/Texas/50/2012 B/Massachusetts/2/ 2012 B/Brisbane/6
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(H1N1)pdm09 (H3N2) 0/2008
Antígenos de influenza
En algunas realizaciones, los polinucleótidos VAN pueden codificar uno o más polipéptidos de una cepa de influenza como antígeno. Dichos antígenos incluyen, pero no se limitan a, aquellos antígenos codificados por los polinucleótidos enumerados en las Tablas 6-18. En la tabla, el Número de Acceso GenBank representa el CDS completo o parcial del antígeno codificado. Los polinucleótidos VAN pueden comprender una región de cualquiera de las secuencias enumeradas en las tablas o la región codificante completa del ARNm enumerado. Los mismos pueden comprender regiones híbridas o quiméricas, o imitaciones o variantes. En la invención, el polipéptido antigénico ES una proteína hemaglutinina o un fragmento de la misma.
Cualquiera de las cepas a las que se hace referencia en las Tablas 6 a 14 también se puede usar en una vacuna de refuerzo de la memoria antigénica como se describe en esta invención.
T l . An í n l infl nz H1N1
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Ta
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Tabla 8. Antí enos de la influenza H5N1
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A/duck/Kurgan/08/2005(H5N1) nucleoproteína (NP)
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DQ449643.1 Tabla 9. Otros antíaenos de la influenza A H1N'. H2N'. H3N
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Tabla 10. Otros antíaenos de la influenza A H4N-H13N
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Tabla 11. Antíaenos de influenza B
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Tabla 12. Antí enos de influenza C
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Tabla 13: Secuencias de aminoácidos de hema lutinina H7
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Tabla 14: Secuencias de aminoácidos de Hema lutinina H10
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Tab
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Tabla 17: Secuencias o timizadas de codones ue codifican Hema lutinina H7
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En la Figura 22 se muestra una alineación de secuencias de aminoácidos de proteínas de hemaglutinina de cepas de influenza A H7N9 en relación con una secuencia de consenso. En la Figura 23 se muestra una alineación de secuencias de aminoácidos de proteínas de hemaglutinina de cepas de influenza A H10N8 con respecto a una secuencia de consenso.
Los aspectos de la presente divulgación proporcionan polinucleótidos de ARN que codifican una proteína hemaglutinina de la influenza o un fragmento de la misma. Los términos "hemaglutinina", "proteína de hemaglutinina" y "HA" pueden usarse indistintamente en todas partes y se refieren a una proteína de hemaglutinina que puede estar presente en la superficie de un virus de la influenza. En la superficie viral, la proteína hemaglutinina está presente en homotrímeros, cada monómero de los cuales se compone de dos subconjuntos, HA1 y HA2, unidos por un enlace disulfuro. Estructuralmente, las proteínas de hemaglutinina se componen de varios dominios: un dominio de cabeza globular, un dominio de tallo (también denominado dominio tronco), un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático. Sin embargo, en general, durante la infección de una célula huésped (p. ej., una célula eucariota como una célula humana) con un virus de la influenza, la proteína hemaglutinina reconoce y se une al ácido siálico de un receptor en la superficie de una célula huésped, lo que facilita la unión del virus a la célula huésped (Gamblin y col., 2004; Ha y col., 2000). Después de la endocitosis del virus y la acidificación del endosoma, la proteína hemaglutinina sufre un cambio conformacional dependiente del pH que permite que la proteína hemaglutinina facilite la fusión de la envoltura viral con la membrana del endosoma de la célula huésped y la entrada del ácido nucleico viral en la célula huésped.
En general, los virus de la influenza se clasifican según la secuencia de aminoácidos de proteína hemaglutinina viral y/o la secuencia de aminoácidos de la neuraminidasa viral (NA). En algunas realizaciones, la hemaglutinina es del subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17 o H18. Las diferencias en las secuencias de aminoácidos entre las proteínas de hemaglutinina de diferentes subtipos se encuentran en gran parte dentro de la secuencia del dominio principal de la proteína. Se considera que la secuencia de aminoácidos del dominio del tallo está más conservada entre los subtipos de hemaglutinina en comparación con la secuencia del dominio de la cabeza. Los dominios de proteína hemaglutinina pueden predecirse usando procedimientos convencionales conocidos en la técnica.
Se cree que muchos anticuerpos de origen natural y experimental que se unen y neutralizan la proteína hemaglutinina se unen a los epítopos dentro del dominio principal de la hemaglutinina e impiden o reducen la interacción de la hemaglutinina con el ácido siálico en los receptores de las células huésped, previniendo o reduciendo la infección de la célula. Alternativamente o además, los anticuerpos neutralizantes pueden impedir o reducir la fusión de la membrana del virus con la membrana del endosoma. Dichos anticuerpos pueden unirse a epítopos dentro del dominio del tallo, inhibiendo así el cambio de conformación de la proteína.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos de ARN descritos en esta invención codifican un fragmento de una proteína hemaglutinina, tal como una proteína hemaglutinina truncada. En algunas realizaciones, el fragmento es una hemaglutinina sin cabeza, lo que significa que el fragmento no comprende el dominio principal. En algunas realizaciones, el fragmento comprende una parte del dominio principal. En algunas realizaciones, el fragmento es un fragmento de tallo (ver, por ejemplo, Mallajosyula y col. PNAS (2014) E2514-E2523). En algunas realizaciones, el fragmento no comprende el dominio citoplásmico. En algunas realizaciones, el fragmento no comprende el dominio transmembrana. En tales realizaciones, el fragmento puede denominarse proteína o fragmento de hemaglutinina soluble o secretada.
En algunas realizaciones, el polipéptido de ARN codifica una proteína hemaglutinina o un fragmento de la misma que es al menos el 90 % (p.ej., 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 %) idéntica a una proteína hemaglutinina proporcionada por una secuencia de aminoácidos en la Tabla 14-16. Los términos "idéntico" o "identidad" porcentual, en el contexto de dos o más secuencias de polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias que son iguales. El porcentaje de identidad entre secuencias de polipéptidos se puede realizar usando algoritmos conocidos en la técnica, tales como BLAST y CLUSTAL.
La secuencia de proteína hemaglutinina o un fragmento de la misma puede obtenerse de cualquier fuente. En algunas realizaciones, la secuencia de proteína hemaglutinina o fragmento de la misma es de una cepa de influenza aviar. En algunas realizaciones, la secuencia de proteína hemaglutinina o fragmento de la misma es de una cepa de influenza aviar que es capaz de infectar a seres humanos o está en riesgo de infectarla. En algunas realizaciones, la secuencia de proteína hemaglutinina o fragmento de la misma es de una cepa de influenza porcina. En algunas realizaciones, la secuencia de proteína hemaglutinina o fragmento de la misma es de una cepa de influenza porcina que es capaz de infectar a seres humanos o está en riesgo de infectarla.
En cualquiera de las realizaciones descritas en esta invención, la secuencia de la hemaglutinina o fragmento de la misma puede modificarse u optimizarse (tal como un codón optimizado) para la expresión en una célula u organismo huésped particular.
Antígenos
Los antígenos codificados por las VAN de la invención incluyen polipéptidos, péptidos y/o polipéptidos de interés y están codificados por los polinucleótidos de la invención. Los polinucleótidos que codifican dichos antígenos se describen con más detalle a continuación en "Diseño, síntesis y cuantificación de polinucleótidos VAN". Las referencias en esta invención a las "VAN de la invención" se refieren a las establecidos en las reivindicaciones adjuntas. Las referencias a polinucleótidos, polipéptidos o antígenos "de la invención" se refieren a aquellos en el contexto de las VAN de la invención.
III. Diseño, síntesis y cuantificación de polinucleótidos VAN
Según la presente divulgación, los polinucleótidos codifican al menos un polipéptido de interés, por ejemplo, un antígeno. Los antígenos de la presente divulgación pueden ser de tipo salvaje (es decir, derivados del agente infeccioso) o modificados (p. ej., manipulados, diseñados o artificiales). Pueden tener cualquier combinación de las características descritas en esta invención. Las VAN de la presente invención comprenden moléculas de ácido nucleico, específicamente polinucleótidos de ARNm que codifican uno o más péptidos o polipéptidos de interés. Dichos péptidos o polipéptidos, según la invención, sirven como antígeno o molécula antigénica. El término "ácido nucleico", en su sentido más amplio, incluye cualquier compuesto y/o sustancia que comprenda un polímero de nucleótidos. A menudo se hace referencia a estos polímeros como polinucleótidos.
En una realización, los polinucleótidos lineales que codifican uno o más antígenos de las VAN de la presente invención que se preparan utilizando únicamente procedimientos de síntesis enzimática de transcripción in vitro in vitro (IVT) se denominan "polinucleótidos IVT".
En otra realización, los polinucleótidos de la presente invención que tienen porciones o regiones que difieren en tamaño y/o patrón de modificación química, posición de modificación química, porcentaje de modificación química o población de modificación química y combinaciones de los anteriores se conocen como "polinucleótidos quiméricos". Una "quimera" según la presente invención es una entidad que tiene dos o más partes o regiones incongruentes o heterogéneas. Como se usa en esta invención, una "parte" o "región" de un polinucleótido se define como cualquier porción del polinucleótido que sea menor que la longitud total del polinucleótido.
En otra realización más, los polinucleótidos de la presente invención que son circulares se conocen como "polinucleótidos circulares" o "circP". Como se usa en esta invención, "polinucleótidos circulares" o "circP" significa un polinucleótido circular monocatenario que actúa sustancialmente como, y tiene las propiedades de, un ARN. El término "circular" también pretende abarcar cualquier configuración secundaria o terciaria del circP.
En algunos aspectos, el polinucleótido incluye de aproximadamente 30 a aproximadamente 100.000 nucleótidos (p. ej., de 30 a 50, de 30 a 100, de 30 a 250, de 30 a 500, de 30 a 1000, de 30 a 1.500, de 30 a 3.000, de 30 a 5.000, de 30 a 7.000, de 30 a 10.000, de 30 a 25.000, de 30 a 50.000, de 30 a 70.000, de 100 a 250, de 100 a 500, de 100 a 1.000, de 100 a 1.500, de 100 a 3.000, de 100 a 5.000, de 100 a 7.000, de 100 a 10.000, de 100 a 25.000, de 100 a 50.000, de 100 a 70.000, de 100 a 100.000, de 500 a 1.000, de 500 a 1.500, de 500 a 2.000, de 500 a 3.000, de 500 a 5.000, de 500 a 7.000, de 500 a 10.000, de 500 a 25.000, de 500 a 50.000, de 500 a 70.000, de 500 a 100.000, de 1.000 a 1.500, de 1.000 a 2.000, de 1.000 a 3.000, de 1.000 a 5.000, de 1.000 a 7.000, de 1.000 a 10.000, de 1.000 a 25.000, de 1.000 a 50.000, de 1.000 a 70.000, f de 1.000 a 100.000, de 1,500 a 3.000, de 1,500 a 5.000, de 1,500 a 7.000, de 1,500 a 10.000, de 1,500 a 25.000, de 1,500 a 50.000, de 1,500 a 70.000, de 1,500 a 100.000, de 2.000 a 3.000, de 2.000 a 5.000, de 2.000 a 7.000, de 2.000 a 10.000, de 2.000 a 25.000, de 2.000 a 50.000, de 2.000 a 70.000 y de 2.000 a 100.000).
En una realización, la longitud de una región que codifica al menos un polipéptido peptídico de interés de los polinucleótidos de la presente invención es mayor que aproximadamente 30 nucleótidos de longitud (p. ej., al menos o mayor que aproximadamente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.500 y 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000 o hasta e incluyendo 100.000 nucleótidos). Como se usa en esta invención, tal región puede denominarse "región codificante" o "región de codificación".
Los polinucleótidos de la presente invención son o funcionan como ARN mensajero (ARNm). Tal como se usa en esta invención, el término "ARN mensajero" (ARNm) se refiere a cualquier polinucleótido que codifica al menos un péptido o polipéptido de interés y que es capaz de traducirse para producir el péptido polipéptido de interés codificado in vitro, in vivo, in situ o ex vivo.
Los polinucleótidos de la presente invención están químicamente modificados. Como se usa en esta invención, una modificación "estructural" es aquella en la que se insertan, eliminan, duplican, invierten o aleatorizan dos o más nucleósidos enlazados en un polinucleótido sin una modificación química significativa de los propios nucleótidos. Debido a que los enlaces químicos necesariamente se romperán y reformarán para efectuar una modificación estructural, las modificaciones estructurales son de naturaleza química y, por lo tanto, son modificaciones químicas. Sin embargo, las modificaciones estructurales darán como resultado una secuencia diferente de nucleótidos. Por ejemplo, el polinucleótido "ATCG" puede modificarse químicamente a "AT-5meC-G". El mismo polinucleótido se puede modificar estructuralmente de "ATCG" a "ATCCCG". Aquí, se ha insertado el dinucleótido "CC", dando como resultado una modificación estructural del polinucleótido.
En una realización, los polinucleótidos de la presente invención, como polinucleótidos IVT o polinucleótidos circulares, pueden tener una modificación química uniforme de todos o cualquiera del mismo tipo de nucleósido o una población de modificaciones producidas por mera titulación descendente de la misma modificación inicial en todos o cualquiera del mismo tipo de nucleósido, o un porcentaje medido de una modificación química de todos los del mismo tipo de nucleósido pero con incorporación aleatoria, como cuando todas las uridinas se reemplazan por un análogo de uridina, por ejemplo, pseudouridina. En otra realización, los polinucleótidos pueden tener una modificación química uniforme de dos, tres o cuatro del mismo tipo de nucleósido en todo el polinucleótido (tal como todas las uridinas y todas las citosinas, etc. se modifican de la misma manera).
Cuando los polinucleótidos de la presente invención son químicamentey/o estructuralmente modificados los polinucleótidos pueden denominarse "polinucleótidos modificados".
En una realización, los polinucleótidos de la presente invención pueden incluir una secuencia que codifica un péptido de auto escisión. El péptido de auto escisión puede ser, entre otros, un péptido 2A. Como un ejemplo no limitante, el péptido 2A puede tener la secuencia de proteína: GSGATNFSLLKQAg Dv EENPGP (SEQ ID NO: 2005), fragmentos o variantes de la misma. En una realización, el péptido 2A se escinde entre la última glicina y la última prolina. Como otro ejemplo no limitante, los polinucleótidos de la presente invención pueden incluir una secuencia de polinucleótidos que codifica el péptido 2A que tiene la secuencia de proteína GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 2005), fragmentos o variantes de la misma.
Una secuencia de polinucleótidos que codifica el péptido 2A es GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGA GGAGAACCCTGGACCT (SEQ ID NO: 2006). La secuencia polinucleotídica del péptido 2A puede modificarse o optimizarse en el codón mediante los procedimientos descritos en esta invención y/o procedimientos conocidos en la técnica.
En una realización, esta secuencia puede usarse para separar las regiones codificantes de dos o más polipéptidos de interés. Como ejemplo no limitante,, la secuencia que codifica el péptido 2A puede estar entre una primera región codificante A y una segunda región codificante B (A-2Apep-B). La presencia del péptido 2A daría como resultado la escisión de una proteína larga en proteína A, proteína B y el péptido 2A. La proteína A y la proteína B pueden ser los mismos o diferentes péptidos o polipéptidos de interés. En otra realización, el péptido 2A puede usarse en los polinucleótidos de la presente invención para producir dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más proteínas.
Arquitectura de polinucleótidos
Tradicionalmente, los componentes básicos de una molécula de ARNm incluyen al menos una región de codificación, una 5' UTR, una 3' UTR, una capa 5' y una cola poli-A. Los polinucleótidos IVT de la presente invención pueden funcionar como ARNm, pero se pueden distinguir del ARNm de tipo salvaje en sus características de diseño estructural y/o funcional que son útiles para sobreponerse a problemas existentes de expresión de polipéptidos efectivos con terapia con base en ácidos nucleicos. Debe entenderse que los antígenos de las VAN de la presente invención pueden estar codificados por polinucleótidos IVT, como se describe en esta invención.
La Figura 1 muestra una construcción primaria 100 de un polinucleótido IVT de la presente invención. Dichos polinucleótidos son útiles en composiciones de VAN, composiciones de RVAN o vacunas de ARNm. Como se usa en esta invención, "construcción primaria" se refiere a un polinucleótido de la presente invención que codifica uno o más polipéptidos de interés y que retiene suficientes características estructurales y/o químicas para permitir que el polipéptido de interés codificado en él se traduzca.
Según las FIG. 1A y 1B, el polinucleótido 100 en esta invención contiene una primera región de nucleótidos enlazados 102 que está flanqueada por una primera región flanqueante 104 una segunda región flanqueante 106. El polipéptido de interés puede comprender en su extremo 5' una o más secuencias señal codificadas por una región de secuencia señal 103. La primera región flanqueante 104 puede comprender una región de nucleótidos enlazados que comprenden una o más secuencias UTR 5' completas o incompletas que puede estar completamente optimizadas por codones o parcialmente optimizadas por codones.. La región flanqueante 104 puede incluir al menos una secuencia de ácido nucleico que incluye, pero no se limita a, secuencias miR, secuencias TERZAK™ y secuencias de control de la traducción. La región flanqueante 104 puede también comprender una capa de extremo 5' 108.La región de protección de extremo 5' 108 puede incluir una capa de origen natural, una capa sintética o una capa optimizada. Ejemplos no limitantes de capas optimizadas incluyen las capas enseñadas por Rhoads en la patente EE. UU. N° US7074596 y publicación de patente internacional N° WO2008157668, WO2009149253 y WO2013103659. La segunda región flanqueante 106 puede comprender una región de nucleótidos enlazados que comprenden una o más UTR 3' completas o incompletas. La segunda región flanqueante 106 puede estar completamente optimizada para codones o parcialmente optimizada para codones. La región flanqueante 106 puede incluir al menos una secuencia de ácido nucleico que incluye, pero no se limita a, secuencias miR y secuencias de control de traducción. La región flanqueante 106 puede también comprender una secuencia de cola 3' 110. La secuencia de cola 3' 110 puede incluir una región de cola sintética 112 y/o un nucleósido de terminación de cadena 114. Ejemplos no limitantes de una región de cola sintética incluyen una secuencia poliA, una secuencia poliC, y/o un cuarteto poliA-G. Ejemplos no limitantes de nucleósidos de terminación de cadena incluyen 2'-O metilo, F y ácidos nucleicos bloqueados (LNA).
Uniendo el extremo 5' de la primera región 102 y la primera región flanqueante 104 hay una primera región operativa 105. Tradicionalmente, esta región operativa comprende un codón de inicio. La región operativa puede comprender alternativamente cualquier secuencia o señal de inicio de la traducción que incluya un codón de inicio.
Uniendo el extremo 3' de la primera región 102 y la segunda región flanqueante 106 es una segunda región operativa 107. Tradicionalmente, esta región operativa comprende un codón de parada. La región operativa puede comprender alternativamente cualquier secuencia o señal de inicio de traducción que incluya un codón de parada. También se pueden usar múltiples codones de parada en serie en el polinucleótido IVT. En una realización, la región operativa de la presente invención puede comprender dos codones de parada. El primer codón de parada puede ser "TGA" o "UGA" y el segundo codón de parada puede seleccionarse de entre el grupo que consiste en "TAA", "TGA", "TAG", "UAA", "UGA" o "UAG".
La longitud más corta de la primera región de la construcción primaria del polinucleótido IVT de la presente invención puede ser la longitud de una secuencia de ácido nucleico que sea suficiente para codificar un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido, un pentapéptido, un hexapéptido , un heptapéptido, un octapéptido, un nonapéptido o un decapéptido. En otra realización, la longitud puede ser suficiente para codificar un péptido de 2 a 30 aminoácidos, por ejemplo, 5 a 30, 10 a 30, 2 a 25, 5 a 25, 10 a 25 o 10 a 20 aminoácidos. La longitud puede ser suficiente para codificar un péptido de al menos 11, 12, 13, 14, 15, 17, 20, 25 o 30 aminoácidos, o un péptido que no tenga más de 40 aminoácidos, por ejemplo, no más de 35,30, 25, 20, 17, 15, 14, 13, 12, 11 o 10 aminoácidos. Ejemplos de dipéptidos que las secuencias de polinucleótidos pueden codificar o incluyen, pero no se limitan a, carnosina y anserina. Se entiende que las vacunas VAN, RVAN o ARNm de la invención pueden ser traducibles e incluir dicha primera región de una construcción primaria.
La longitud de la primera región de la construcción primaria del polinucleótido IVT que codifica el polipéptido de interés de la presente invención es mayor que aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. (p. ej., al menos o mayor que aproximadamente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.500 y 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000 o hasta e incluyendo 100.000 nucleótidos).
En algunas realizaciones, el polinucleótido IVT incluye de aproximadamente 30 a aproximadamente 100.000 nucleótidos (p. ej., de 30 a 50, de 30 a 100, de 30 a 250, de 30 a 500, de 30 a 1000, de 30 a 1.500, de 30 a 3.000, de 30 a 5.000, de 30 a 7.000, de 30 a 10.000, de 30 a 25.000, de 30 a 50.000, de 30 a 70.000, de 100 a 250, de 100 a 500, de 100 a 1.000, de 100 a 1,500, de 100 a 3.000, de 100 a 5.000, de 100 a 7.000, de 100 a 10.000, de 100 a 25.000, de 100 a 50.000, de 100 a 70.000, de 100 a 100.000, de 500 a 1.000, de 500 a 1,500, de 500 a 2.000, de 500 a 3.000, de 500 a 5.000, de 500 a 7.000, de 500 a 10.000, de 500 a 25.000, de 500 a 50.000, de 500 a 70.000, de 500 a 100.000, de 1.000 a 1,500, de 1.000 a 2.000, de 1.000 a 3.000, de 1.000 a 5.000, de 1.000 a 7.000, de 1.000 a 10.000, de 1.000 a 25.000, de 1.000 a 50.000, de 1.000 a 70.000, f de 1.000 a 100.000, de 1,500 a 3.000, de 1,500 a 5.000, de 1,500 a 7.000, de 1,500 a 10.000, de 1,500 a 25.000, de 1,500 a 50.000, de 1,500 a 70.000, de 1,500 a 100.000, de 2.000 a 3.000, de 2.000 a 5.000, de 2.000 a 7.000, de 2.000 a 10.000, de 2.000 a 25.000, de 2.000 a 50.000, de 2.000 a 70.000 y de 2.000 a 100.000).
Según la presente invención, la primera y segunda regiones flanqueantes del polinucleótido mIVT pueden variar independientemente de 15 a 1000 nucleótidos de longitud (por ejemplo, más de 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140), 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800 y 900 nucleótidos o al menos 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 y 1000 nucleótidos).
Según la presente invención, la secuencia de cola del polinucleótido IVT puede variar desde ausente hasta 500 nucleótidos de longitud (por ejemplo, al menos 60, 70, 80, 90, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 nucleótidos). Cuando la secuencia de cola es una cola poliA, la longitud puede determinarse en conjuntos de o en función de la unión de la proteína de unión de poliA. En esta realización, la cola de poliA es lo suficientemente larga para unir al menos 4 monómeros de proteína de unión de poliA. Los monómeros de la proteína de unión a poliA se unen a tramos de aproximadamente 38 nucleótidos. Como tal, se ha observado que las colas de poliA de aproximadamente 80 nucleótidos (SEQ ID NO: 2276) y 160 nucleótidos (SEQ ID NO: 2277) son funcionales.
Según la presente invención, la región de protección del polinucleótido IVT puede comprender una sola capa o una serie de nucleótidos que forman la capa. En esta realización la región de protección puede tener una longitud de 1 a 10, por ejemplo, 2--9, 3--8, 4--7, 1-5, 5-10, o al menos 2, o 10 o menos nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la capa está ausente.
Según la presente invención, la primera y segunda regiones operativas pueden variar de 3 a 40, por ejemplo, 5-30, 10--20, 15, o al menos 4, o 30 o menos nucleótidos de longitud y pueden comprender, además de un codón de inicio y/o parada, una o más señales y/o secuencias de restricción.
Los polinucleótidos IVT de la presente invención están químicamente modificados. Cuando los polinucleótidos IVT de la presente invención son químicamente y/o estructuralmente modificados los polinucleótidos pueden denominarse "polinucleótidos IVT modificados".
En una realización, los polinucleótidos IVT de la presente invención pueden tener una modificación química uniforme de todos o cualquiera del mismo tipo de nucleósido o una población de modificaciones producidas por mera titulación descendente de la misma modificación inicial en todos o cualquiera del mismo tipo de nucleósido, o un porcentaje medido de una modificación química de todos los del mismo tipo de nucleósido pero con incorporación aleatoria, como cuando todas las uridinas se reemplazan por un análogo de uridina, por ejemplo, pseudouridina. En otra realización, los polinucleótidos IVT pueden tener una modificación química uniforme de dos, tres o cuatro del mismo tipo de nucleósido en todo el polinucleótido (tal como todas las uridinas y todas las citosinas, etc. se modifican de la misma manera).
En una realización, los polinucleótidos IVT de la presente invención pueden incluir una secuencia que codifica un péptido autoescindible, descrito en esta invención, tal como, pero no limitado a, el péptido 2A. La secuencia polinucleotídica del péptido 2A puede modificarse o optimizarse en el codón mediante los procedimientos descritos en esta invención y/o procedimientos conocidos en la técnica.
En una realización, esta secuencia puede usarse para separar las regiones codificantes de dos o más polipéptidos de interés nen los polinucleótidos IVT.
Los polinucleótidos IVT de la presente invención están químicamente modificados. Cuando se modifica químicamente y/o estructuralmente, el polinucleótido IVT modificado estructuralmente puede denominarse "polinucleótido IVT modificado".
El polinucleótido IVT codifica al menos un péptido o polipéptido de interés. En otra realización, el polinucleótido IVT puede codificar dos o más péptidos o polipéptidos de interés. Ejemplos no limitantes de péptidos o polipéptidos de interés incluyen cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos, una enzima y su sustrato, un marcador y su molécula de unión, un segundo mensajero y su enzima o los componentes de proteínas o complejos multiméricos.
Arquitectura de polinucleótidos quiméricos
Los polinucleótidos quiméricos o construcciones de ARN de la presente invención mantienen una organización modular similar a los polinucleótidos IVT, pero los polinucleótidos quiméricos comprenden uno o más y/o modificaciones o alteraciones químicas que imparten propiedades útiles al polinucleótido. Como tales, los polinucleótidos quiméricos que son moléculas de ARNm modificadas de la presente invención se denominan "ARNm quimérico modificado" o "ARNm quimérico".
Debe entenderse que los antígenos de las VAN de la presente invención pueden estar codificados por ARNm quimérico modificado o ARNm quimérico.
Los polinucleótidos quiméricos tienen porciones o regiones que difieren en tamaño y/o patrón de modificación química, posición de modificación química, porcentaje de modificación química o población de modificación química y combinaciones de los anteriores.
Ejemplos de partes o regiones, donde el polinucleótido quimérico funciona como un ARNm y codifica un polipéptido de interés incluyen, pero no se limitan a, regiones no traducidas (UTR, tales como UTR 5' o UTR 3'), regiones codificantes, regiones de capa, regiones de cola de poliA, regiones de inicio, regiones de parada, regiones de secuencia de señal y combinaciones de las mismas. La Figura 2 ilustra ciertas realizaciones de los polinucleótidos quiméricos de la invención que pueden usarse como ARNm. La FIG. 3 ilustra un esquema de una serie de polinucleótidos quiméricos que identifican varios patrones de modificaciones posicionales y muestran regiones análogas a aquellas regiones de un polinucleótido de ARNm. Las regiones o partes que se unen o se encuentran entre otras regiones también pueden diseñarse para tener subregiones. Estas se muestran en la figura.
En algunos aspectos, los polinucleótidos quiméricos de la divulgación tienen una estructura que comprende la Fórmula I.
5' [An]x-L1-[Bo]y-L2-[Cp]z-L33' Fórmula I
donde:
cada uno de A y B comprende independientemente una región de nucleósidos enlazados;
C es una región opcional de nucleósidos enlazados;
al menos una de las regiones A, B o C está modificada posicionalmente, donde dicha región modificada posicionalmente comprende al menos dos nucleósidos modificados químicamente de uno o más del mismo tipo de nucleósido de adenosina, timidina, guanosina, citidina o uridina, y donde al menos dos de las modificaciones químicas de nucleósidos del mismo tipo son modificaciones químicas diferentes;
n, o y p son independientemente un número entero entre 15-1000;
x e y son independientemente 1-20;
z es 0-5;
L1 y L2 son restos enlazadores opcionales independientemente, estando dichos restos enlazadores basados en ácido nucleico o no basados en ácido nucleico; y
L3 es un conjugado opcional o un resto enlazador opcional, estando dicho resto enlazador basado en ácido nucleico o no basado en ácido nucleico.
En algunos aspectos, el polinucleótido quimérico de Fórmula I codifica uno o más péptidos o polipéptidos de interés. Dichas moléculas codificadas se pueden codificar en dos o más regiones.
En otro aspecto, la divulgación presenta un polinucleótido quimérico que codifica un polipéptido, donde el polinucleótido tiene una secuencia que incluye la Fórmula II:
[An]-L1-[Bo] Fórmula II
donde cada A y B es independientemente cualquier nucleósido;
n y o son, independientemente de 15 a 1000; y
L1 tiene la estructura de la Fórmula III:
Figure imgf000497_0001
Fórmula III
donde a, b, c, d, e y f son cada uno, independientemente, 0 o 1;
cada uno de R1, R3, R5, y R7, se selecciona, independientemente, de entre alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquileno C1-C6 opcionalmente sustitutuido, O, S, y NR8;
R2 y R6 son cada uno, independientemente, seleccionados de entre carbonilo, tiocarbonilo, sulfonilo, fosforilo o; R4 es alquileno C1—C10 opcionalmente sustituido, alquenileno C2—C10 opcionalmente sustituido, alquinileno C2—C10 opcionalmente sustituido, heterociclileno C2—C9 opcionalmente sustituido, arileno C6—C12 opcionalmente sustituido, polietileno glicoleno C2—C100 opcionalmente sustituido, o heteroalquileno C1—C10 opcionalmente sustituido, o un enlace que une (R1)a-(R2)b-(R3)c a (R5)d-(R6)e-(R7)f, donde si c, d, e, f, g, y h son 0, R4 no es un enlace; y
R8 es hidrógeno, alquilo C1—C4 opcionalmente sustituido, alquenilo C2—C4 opcionalmente sustituido, alquinilo C2—C4 opcionalmente sustituido, heterociclilo C2—C6 opcionalmente sustituido, arilo C6—C12 opcionalmente sustituido, o heteroalquilo C1—C7 opcionalmente sustituido;
donde L1 está unido a [An] y [Bo] en el azúcar de uno de los nucleósidos (por ejemplo, en la posición 3' de un anillo de azúcar de cinco miembros o en la posición 4' de un anillo de azúcar de seis miembros de un nucleósido de [An] y la posición 5' de un anillo de azúcar de cinco miembros o la posición 6' de un anillo de azúcar de seis miembros de un nucleósido de [Bo] o en la posición 5' de un anillo de azúcar de cinco miembros o en la posición 6' de un anillo de azúcar de seis miembros de un nucleósido de [An] y la posición 3' de un anillo de azúcar de cinco miembros o la posición 4' de un anillo de azúcar de seis miembros de un nucleósido de [Bo]).
En algunos aspectos, al menos uno de [An] y [Bo] incluye la estructura de Fórmula IV:
Figure imgf000498_0001
donde cada uno de N1 y N2 es independientemente una nucleobase;
cada uno de R9, R1°, R11, R12, R13, R14, R15, y R16 es, independientemente, H, halo, hidroxi, tiol, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, amino, azido opcionalmente sustituido, o arilo C6-C10 opcionalmente sustituido;
cada uno de g y h es independientemente 0 o 1;
cada X1 y X4 es, independientemente, O, NH, o S;
cada X2 es independientemente O o S; y
cada X3 es OH o SH, o una sal del mismo.
En otro aspecto, la descripción presenta un polinucleótido quimérico que codifica un polipéptido, donde el polinucleótido tiene una secuencia que incluye la Fórmula II:
[An]-L1-[Bo] Fórmula II
donde cada A y B es independientemente cualquier nucleósido;
n y o son, independientemente de 15 a 1000; y
L1 es un enlace o tiene la estructura de la Fórmula III: (R1)a-(R2)b-(R3)c-R4-(R5)d-(R6)e-( R7)f- ^ Fórmula III donde a, b, c, d, e y f son cada uno, independientemente, 0 o 1;
cada uno de R1, R3, R5, y R7, se selecciona, independientemente, alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, O, S, y NR8;
R2 y R6 son cada uno, independientemente, seleccionados de entre carbonilo, tiocarbonilo, sulfonilo, fosforilo o; R4 es alquileno C1—C10 opcionalmente sustituido, alquenileno C2—C10 opcionalmente sustituido, alquinileno C2—C10 opcionalmente sustituido, heterociclileno C2—C9 opcionalmente sustituido, arileno C6—C12 opcionalmente sustituido, polietileno glicoleno C2—C100 opcionalmente sustituido, o heteroalquileno C1—C10 opcionalmente sustituido, o un enlace que une (R1)a-(R2)b-(R3)c a (R5)d-(R6)e-(R7)f; y
R8 es hidrógeno, alquilo C1—C4 opcionalmente sustituido, alquenilo C2—C4 opcionalmente sustituido, alquinilo C2—C4 opcionalmente sustituido, heterociclilo C2—C6 opcionalmente sustituido, arilo C6—C12 opcionalmente sustituido, o heteroalquilo C1—C7 opcionalmente sustituido;
donde L1 está unido a [An] y [Bo] en el azúcar de uno de los nucleósidos (por ejemplo, en la posición 3' de un anillo de azúcar de cinco miembros o en la posición 4' de un anillo de azúcar de seis miembros de un nucleósido de [An] y la posición 5' de un anillo de azúcar de cinco miembros o la posición 6' de un anillo de azúcar de seis miembros de un nucleósido de [Bo] o en la posición 5' de un anillo de azúcar de cinco miembros o en la posición 6' de un anillo de azúcar de seis miembros de un nucleósido de [An] y la posición 3' de un anillo de azúcar de cinco miembros o la posición 4' de un anillo de azúcar de seis miembros de un nucleósido de [Bo]).
donde al menos uno de [An] o [Bo] incluye la estructura de la Fórmula IV:
Figure imgf000499_0001
donde cada uno de N1 y N2 es independientemente una nucleobase;
cada uno de R9, R1°, R11, R12, R13, R14, R15, y R16 es, independientemente, H, halo, hidroxi, tiol, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, amino, azido opcionalmente sustituido, o arilo C6-C10 opcionalmente sustituido;
cada uno de g y h es independientemente 0 o 1;
cada X1 y X4 es, independientemente, O, NH, o S; y cada X2 es independientemente O o S; y
cada X3 es OH o SH, o una sal del mismo;
donde al menos uno de X1, X2, o X4 es NH o S.
En algunos aspectos, X1 es NH. En otros aspectos, X4 es NH. En ciertos aspectos, X2 es S.
En algunos aspectos, el polinucleótido incluye: (a) una región codificante; (b) una UTR 5' que incluye al menos una secuencia de Kozak; (c) una UTR 3'; y (d) al menos una estructura de capa 5'. En otros casos, el polinucleótido incluye además (e) una cola poli-A.
En algunos aspectos, una de las regiones codificantes, la UTR 5' que incluye al menos una secuencia Kozak, la UTR 3', la estructura de la capa 5' o la cola poli-A incluye [An]-L1-[Bo].
En otros aspectos, una de las regiones codificantes, la UTR 5' que incluye al menos una secuencia de Kozak, la UTR 3', la estructura de la capa 5' o la cola poli-A incluye [An] y otra de la región codificante, la UTR 5' que incluye al menos una secuencia de Kozak, la UTR 3', la estructura de la capa 5' o la cola poli-A incluye [Bo].
En ciertos aspectos, el polinucleótido incluye al menos un nucleósido modificado (por ejemplo, un nucleósido de la Tabla 2).
En algunos aspectos, R4 es heterociclileno C2-9 opcionalmente sustituido, por ejemplo, el heterociclo puede tener la estructura:
Figure imgf000499_0002
En ciertos aspectos, L1 se une a [An] en la posición 3’ de un anillo de azúcar de cinco miembros o en la posición 4' de un anillo de azúcar de seis miembros de uno de los nucleósidos y a [B0] en la posición 5' de un anillo de azúcar de cinco miembros o en la posición 6' de un anillo de azúcar de seis miembros de uno de los nucleósidos.
En algunos aspectos, el polinucleótido es circular.
En otro aspecto, la divulgación presenta un procedimiento para producir una composición que incluye un polinucleótido quimérico que codifica un polipéptido, donde el polinucleótido incluye la estructura de Fórmula V:
Figure imgf000500_0001
Este procedimiento incluye hacer reaccionar un compuesto que tiene la estructura de Fórmula VI:
Figure imgf000500_0002
Fórmula VI
con un compuesto que tiene la estructura de Fórmula Vil:
Figure imgf000500_0003
Fórmula Vil
donde cada uno de N1 y N2 es, independientemente, una nucleobase;;
cada uno de R9, R1°, R11, R12, R13, R14, R15, y R16 es, independientemente, H, halo, hidroxi, tiol, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, amino, azido opcionalmente sustituido, o arilo C6-C10 opcionalmente sustituido;
cada uno de g y h es independientemente 0 o 1;
cada X1 y X4 es, independientemente, O, NH, o S; y cada X3 es independientemente OH o SH, o una sal del mismo; cada uno de R17 y R19 es, independientemente, una región de nucleósidos enlazados; y R18 es un halógeno.
En otro aspecto, la divulgación presenta un procedimiento para producir una composición que incluye un polinucleótido
Figure imgf000500_0004
Este procedimiento incluye hacer reaccionar un compuesto que tiene la estructura de Fórmula IX:
Figure imgf000501_0001
Fórmula IX
con un compuesto que tiene la estructura de Fórmula X:
Fórm
Figure imgf000501_0002
donde cada uno de N1 y N2 es, independientemente, una nucleobase;
cada uno de R9, R1°, R11, R12, R13, R14, R15, y R16 es, independientemente, H, halo, hidroxi, tiol, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, amino, azido opcionalmente sustituido, o arilo C6-C10 opcionalmente sustituido;
cada uno de g y h es independientemente 0 o 1;
cada X4 es independientemente, O, NH, o S; y
cada X2 es independientemente O o S;
cada X3 es independientemente OH, SH, o una sal del mismo;
cada uno de R2° y R23 es, independientemente, una región de nucleósidos enlazados; y
cada uno de R21 y R22 es, independientemente, alcoxi C1-C6 opcionalmente sustituido.
En otro aspecto, la divulgación presenta un procedimiento para producir una composición que incluye un polinucleótido quimérico que codifica un polipéptido, donde el polinucleótido incluye la estructura de Fórmula XI:
Figure imgf000501_0003
Este procedimiento incluye hacer reaccionar un compuesto que tiene la estructura de Fórmula XII:
Figure imgf000501_0004
con un compuesto que tiene la estructura de Fórmula XIII:
Figure imgf000502_0001
donde cada uno de N1 y N2 es, independientemente, una nucleobase;
cada uno de R9, R1°, R11, R12, R13, R14, R15, y R16 es, independientemente, H, halo, hidroxi, tiol, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, amino, azido opcionalmente sustituido, o arilo C6-C10 opcionalmente sustituido;
cada uno de g y h es independientemente 0 o 1;
cada X4 es independientemente, O, NH, o S; y
cada X2 es independientemente O o S;
cada X3 es independientemente OH, SH, o una sal del mismo;
cada uno de R24 y R26 es, independientemente, una región de nucleósidos enlazados; y
R25 es alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido o heteroalquileno C1-C6 opcionalmente sustituido o R25 y el grupo alquinilo juntos forman cicloalquinilo opcionalmente sustituido.
En otro aspecto, la divulgación presenta un procedimiento para producir una composición que incluye un polinucleótido quimérico que codifica un polipéptido, donde el polinucleótido tiene una secuencia que incluye la Fórmula II:
[An]-L1-[Bo], Fórmula II
Este procedimiento incluye hacer reaccionar un compuesto que tiene la estructura de Fórmula XIV
[An]-(R1)a-(R2)b-(R3)c-N3 Fórmula XIV
con un compuesto que tiene la estructura de la Fórmula XV:
R27-(R5)d-(R6)e-(R7)f-[Bo] Fórmula XV
donde cada A y B es independientemente cualquier nucleósido;
n y o son, independientemente de 15 a 1000; y
L1 tiene la estructura de la Fórmula III:
Fórmula III
donde a, b, c, d, e y f son cada uno, independientemente, 0 o 1;
donde cada A y B es independientemente cualquier nucleósido;
n y o son, independientemente de 15 a 1000;
R1, R3, R5, y R7 se selecciona, independientemente, de entre alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, O, S, y NR8;
R2 y R6 son cada uno, independientemente, seleccionados de entre carbonilo, tiocarbonilo, sulfonilo, fosforilo o; R4 es un triazoleno opcionalmente sustituido; y
R8 es hidrógeno, alquilo C1—C4 opcionalmente sustituido, alquenilo C3—C4 opcionalmente sustituido, alquinilo C2—C4 opcionalmente sustituido, heterociclilo C2—C6 opcionalmente sustituido, arilo C6—C12 opcionalmente sustituido, o heteroalquilo C1—C7 opcionalmente sustituido; y
R27 es un alquinilo C2-C3 opcionalmente sustituido o un cicloalquinilo C8-C12 opcionalmente sustituido,
donde L1 está unido a [An] y [Bo] en el azúcar de uno de los nucleósidos.
En algunos aspectos, el triazoleno opcionalmente sustituido tiene la estructura:
Figure imgf000503_0001
En un aspecto, al menos una de las regiones de nucleósidos enlazados de A puede comprender una secuencia de nucleósidos enlazados que pueden funcionar como una región 5' no traducida (UTR). La secuencia de nucleósidos enlazados puede ser una UTR 5' natural o sintética. Como ejemplo no limitante, el polinucleótido quimérico puede codificar un polipéptido de interés y la secuencia de nucleósidos enlazados de A puede codificar la UTR 5' nativa de un polipéptido codificado por el polinucleótido quimérico o la secuencia de nucleósidos enlazados puede ser una UTR 5' heteróloga tal como, pero sin limitarse a, una UTR sintética.
En otro aspecto, al menos una de las regiones de nucleósidos enlazados de A puede ser una región de capa. La región de la capa puede estar ubicada en 5' con respecto a una región de nucleósidos unidos de A que funcionan como una UTR 5'. La región de capa puede comprender al menos una capa tal como, pero no limitada a, Cap0, C ap í, ARCA, inosina, Ní-metil-guanosina, 2'fluoro-guanosina, 7-deaza-guanosina, 8-oxo-guanosina, 2 -amino-guanosina, LNA-guanosina, 2-azido-guanosina, Cap2 y Cap4.
En un aspecto, al menos una de las regiones de nucleósidos enlazados de B puede comprender al menos un marco de lectura abierto de una secuencia de ácido nucleico. La secuencia de ácido nucleico puede tener codones optimizados y/o comprenden al menos una modificación.
En un aspecto, al menos una de las regiones de nucleósidos enlazados de C puede comprender una secuencia de nucleósidos enlazados que pueden funcionar como una 3' UTR. La secuencia de nucleósidos enlazados puede ser una 3' UTR natural o sintética. Como ejemplo no limitante, el polinucleótido quimérico puede codificar un polipéptido de interés y la secuencia de nucleósidos enlazados de C puede codificar la u Tr 3' nativa de un polipéptido codificado por el polinucleótido quimérico o la secuencia de nucleósidos enlazados puede ser una UTR 3' no heteróloga tal como, pero sin limitarse a, una UTR sintética.
En un aspecto, al menos una de las regiones de nucleósidos enlazados de A comprende una secuencia de nucleósidos enlazados que funciona como una UTR 5' y al menos una de las regiones de nucleósidos enlazados de C comprende una secuencia de nucleósidos enlazados que funciona como una UTR 3'. En un aspecto, la UTR 5' y la UTR 3' pueden ser de la misma especie o de especies diferentes. En otro aspecto, la UTR 5' y la UTR 3' pueden codificar las regiones nativas no traducidas de diferentes proteínas de la misma o diferentes especies.
Las Figuras 4 y 5 proporcionan esquemas de una serie de polinucleótidos quiméricos que ilustran varios patrones de modificaciones posicionales basadas en la Fórmula I así como aquellos que tienen un extremo 3' bloqueado o estructurado.
Los polinucleótidos quiméricos, incluidas las partes o regiones de los mismos, de la presente invención pueden clasificarse como hemímeros, gápmeros, wíngmeros o blóckmeros.
Como se usa en esta invención, un "hemímero" es un polinucleótido quimérico que comprende una región o parte que comprende la mitad de un patrón, porcentaje, posición o población de una modificación química y la mitad de un segundo patrón, porcentaje, posición o población de una modificación química. Los polinucleótidos quiméricos de la presente invención también pueden comprender subregiones de hemímeros. En una realización, una parte o región es 50 % de una y 50 % de otra.
En una realización, el polinucleótido quimérico completo puede ser el 50 % de uno y el 50 % del otro. Cualquier región o parte de cualquier polinucleótido quimérico de la invención puede ser un hemímero. Los tipos de hemímeros incluyen hemímeros de patrón, hemímeros de población o hemímeros de posición. Por definición, los hemímeros son 50:50 por cento hemímeros.
Como se usa en esta invención, un "gápmero" es un polinucleótido quimérico que tiene al menos tres partes o regiones con un espacio (gap) entre las partes o regiones. El "gap" puede comprender una región de nucleósidos enlazados o un solo nucleósido que difiere de la naturaleza quimérica de las dos partes o regiones que lo flanquean. Las dos partes o regiones de un gápmero pueden ser iguales o diferentes entre sí.
Como se usa en esta invención, un "wíngmero" es un polinucleótido quimérico que tiene al menos tres partes o regiones con un espacio (gap) entre las partes o regiones. A diferencia de un gápmero, las dos partes o regiones flanqueantes que rodean el espacio en un wíngmero son iguales en grado o tipo. Tal similitud puede estar en la longitud del número de conjuntos de diferentes modificaciones o en el número de modificaciones. Las alas (wings) de un wíngmero pueden ser más largas o más cortas que el espacio (gap). Las partes o regiones del ala (wing) pueden ser un 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 95 % más largas o más cortas que la región que comprende el espacio (gap).
Como se usa en esta invención, un "blóckmero" es un polinucleótido con patrón donde las partes o regiones tienen un tamaño o número y tipo de modificaciones equivalentes. Las regiones o subregiones en un blóckmero pueden ser 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96,97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 , 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146 , 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196 , 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221 , 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246,247, 248, 249, 250, 251 , 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276,277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 310 , 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490 o 500, nucleidos largos.
Los polinucleótidos quiméricos, incluidas las partes o regiones de los mismos, de la presente invención que tienen un patrón de modificación química se denominan "quimeras de patrón". Las quimeras de patrón también pueden denominarse blóckmeros. Quimeras de patrón son aquellos polinucleótidos que tienen un patrón de modificaciones dentro, a través o entre regiones o partes.
Los patrones de modificaciones dentro de una parte o región son aquellos que comienzan y terminan dentro de una región definida. Los patrones de modifcaciones en una parte o región son aquellos patrones que comienzan en una parte o región y terminan en otra parte o región adyacente. Los patrones de modificaciones entre partes o regiones son aquellos que comienzan y terminan en una parte o región y se repiten en una parte o región diferente, que no es necesariamente adyacente a la primera región o parte.
Las regiones o subregiones de patrones de quimeras o blóckmeros pueden tener patrones alternos simples como ABAB[AB]n donde cada "A" y cada "B" representan diferentes modificaciones químicas (al menos una de la base, el azúcar o el conector de la estructura principal), diferentes tipos de modificaciones químicas (por ejemplo, de origen natural y no natural), diferentes porcentajes de modificaciones o diferentes poblaciones de modificaciones. El patrón puede repetirse n número de veces donde n=3-300. Además, cada A o B puede representar de 1 a 2500 conjuntos (por ejemplo, nucleósidos) en el patrón. Los patrones también pueden ser múltiplos alternos como patrón AABBAABB[AABB]n (un múltiplo doble alterno) o AAABBBAAABBB[AAABBB]n (un triple múltiple alterno). El patrón puede repetirse n número de veces donde n=3-300.
También se pueden mezclar diferentes patrones para formar un patrón de segundo orden. Por ejemplo, un único patrón alterno se puede combinar con un patrón alterno triple para formar un patrón alterno A'B' de segundo orden. Un ejemplo sería [ABABAB][AAABBBAAABBB] [ABABAB][AAABBBAAABBB] [ABABAB][AAABBBAAABBB], donde [ABABAB] es A' y [AAABBBAAABBB] es B'. De manera similar, estos patrones pueden repetirse n número de veces, donde n=3-300.
Los patrones pueden incluir tres o más modificaciones diferentes para formar un patrón ABCABC[ABC]n. Estos tres patrones de componentes también pueden ser múltiplos, como AABBCCAABBCC[AABBCC]n y pueden diseñarse como combinaciones con otros patrones tales como ABCABCAABBCCABCABCAABBCC, y pueden ser patrones de orden superior.
Las regiones o subregiones de modificaciones de posición, porcentaje y población no necesitan reflejar una contribución igual de cada tipo de modificación. Pueden formar series como "1-2-3-4", "1-2-4-8", donde cada número entero representa el número de conjuntos de un tipo de modificación particular. Alternativamente, pueden ser solo impares, como ' 1 -3-3-1 -3-1 -5» o solo pares "2-4-2-4-6-4-8» o una combinación de impares y número par de conjuntos como "1-3-4-2-5-7-3-3-4".
Las quimeras de patrón pueden variar en su modificación química por grado (como las descritas anteriormente) o por tipo (por ejemplo, diferentes modificaciones).
Polinucleótidos quiméricos, incluidas las partes o regiones de los mismos, de la presente divulgación que tienen al menos una región con dos o más modificaciones químicas diferentes de dos o más miembros nucleósidos del mismo tipo de nucleósidos (A, C, G, T o U ) se denominan quimeras "posicionalmente modificadas". Las quimeras posicionalmente modificadas también se denominan en esta invención quimeras de "colocación selectiva" o "polinucleótidos de colocación selectiva". Como su nombre lo indica, la colocación selectiva se refiere al diseño de polinucleótidos que, a diferencia de los polinucleótidos en la técnica, donde la modificación de cualquier A, C, G, T o U es la misma en virtud del procedimiento de síntesis, pueden tener diferentes modificaciones para el individuo As, Cs, Gs, Ts o Us en un polinucleótido o región del mismo. Por ejemplo, en un polinucleótido quimérico posicionalmente modificado, puede haber dos o más modificaciones químicas diferentes en cualquiera de los tipos de nucleósidos de As, Cs, Gs, Ts o Us. También puede haber combinaciones de dos o más a cualesquiera dos o más del mismo tipo de nucleósido. Por ejemplo, un polinucleótido quimérico de colocación selectiva o posicionalmente modificado puede comprender 3 modificaciones diferentes de la población de adeninas en el núcleo molecular y también tener 3 modificaciones diferentes de la población de citosinas en la construcción, todas las cuales pueden tener una única colocación, no aleatoria.
Los polinucleótidos quiméricos, incluidas las partes o regiones de los mismos, de la presente invención que tienen un porcentual de modificación química se denominan "quimeras porcentuales". Las quimeras porcentuales puede tener regiones o partes que comprenden al menos 1 %, por lo menos 2 %, por lo menos 5 %, por lo menos 8 %, por lo menos 10 %, por lo menos 20 %, por lo menos 30 %, por lo menos 40 %, por lo menos 50 %, por lo menos 60 %, por lo menos 70 %, por lo menos 80 %, por lo menos 90 %, por lo menos 95 %, o al menos 99 % de modificaciones posicionales, de patrón o de población. Alternativamente, la quimera porcentual puede modificarse completamente en cuanto a la posición, el patrón o la población de modificación. El porcentaje de modificación de una quimera porcentual puede dividirse entre modificaciones naturales y no naturales.
Los polinucleótidos quiméricos, incluidas las partes o regiones de los mismos, de la presente invención que tienen una población de modificación química se denominan "quimeras de población". Una quimera de población puede comprender una región o parte donde los nucleósidos (su enlace de base, azúcar o estructura principal, o una combinación de los mismos) tienen una población seleccionada de modificaciones. Tales modificaciones pueden seleccionarse de entre poblaciones funcionales tales como modificaciones que inducen, alteran o modulan un resultado fenotípico. Por ejemplo, una población funcional puede ser una población o una selección de modificaciones químicas que aumentan el nivel de una citocina. Otras poblaciones funcionales pueden funcionar individual o colectivamente para disminuir el nivel de una o más citocinas. El uso de una selección de estas modificaciones de función similar en un polinucleótido quimérico constituiría por tanto una "quimera de población funcional". Como se usa en esta invención, una "quimera de población funcional" puede ser una cuya característica funcional única está definida por la población de modificaciones como se describe anteriormente o el término puede aplicarse a la función general del polinucleótido quimérico en sí. Por ejemplo, en su conjunto, el polinucleótido quimérico puede funcionar de una manera diferente o superior en comparación con un polinucleótido no modificado o no quimérico.
Cabe señalar que los polinucleótidos que tienen una modificación química uniforme de todos los del mismo tipo de nucleósido o una población de modificaciones producidas por mera titulación a la baja de la misma modificación inicial en todos los del mismo tipo de nucleósido, o un porcentaje medido de una modificación química de todos los del mismo tipo de nucleósido pero con incorporación aleatoria, como cuando todas las uridinas se reemplazan por un análogo de uridina, por ejemplo, pseudouridina, no se consideran quiméricos. Asimismo, los polinucleótidos que tienen una modificación química uniforme de dos, tres o cuatro del mismo tipo de nucleósido en todo el polinucleótido (como todas las uridinas y todas las citosinas, etc. se modifican de la misma manera) no se consideran polinucleótidos quiméricos. Un ejemplo de un polinucleótido que no es quimérico es el canónico pseudouridina/5-metil polinucleótido modificado con citosina de la técnica anterior. Estos polinucleótidos uniformes se obtienen por completo a través de la síntesis enzimática de transcripción in vitro (IVT); y debido a las limitaciones de las enzimas sintetizadoras, contienen solo un tipo de modificación cuando ocurre cada uno del mismo tipo de nucleósido, es decir, adenosina (A), timidina (T), guanosina (G), citidina (C) o uradina (U), que se encuentra en el polinucleótido. Dichos polinucleótidos se pueden caracterizar como polinucleótidos IVT.
Los polinucleótidos quiméricos de la presente invención están químicamente modificados. Cuando los polinucleótidos quiméricos de la presente invención son químicamente y/o estructuralmente modificados, los polinucleótidos pueden denominarse "polinucleótidos quiméricos modificados".
En algunas realizaciones de la invención, los polinucleótidos quiméricos pueden codificar dos o más péptidos o polipéptidos de interés. Dichos péptidos o polipéptidos de interés incluyen las cadenas pesada y ligera de anticuerpos, una enzima y su sustrato, una etiqueta y su molécula de unión, un segundo mensajero y su enzima o los componentes de proteínas o complejos multiméricos.
Las regiones o partes de los polinucleótidos quiméricos de la presente invención pueden estar separadas por un resto enlazador o espaciador. Dichos enlazadores o espacios pueden estar basados en ácidos nucleicos o no nucleosídicos.
En una realización, los polinucleótidos quiméricos de la presente invención pueden incluir una secuencia que codifica un péptido autoescindible, descrito en esta invención, tal como, pero no limitado a, el péptido 2A. La secuencia polinucleotídica del péptido 2A puede modificarse u optimizarse en el codón mediante los procedimientos descritos en esta invención y/o procedimientos conocidos en la técnica.
No obstante lo anterior, los polinucleótidos quiméricos de la presente invención pueden comprender una región o parte que no está modificada posicionalmente o no es quimérica como se define en esta invención.
Por ejemplo, una región o parte de un polinucleótido quimérico puede modificarse uniformemente en uno o más A, T, C, G o U pero según la divulgación, los polinucleótidos no se modificarán uniformemente en toda la región o parte.
Las regiones o partes de polinucleótidos quiméricos pueden tener una longitud de 15 a 1000 nucleósidos y un polinucleótido puede tener de 2 a 100 regiones o patrones de regiones diferentes como se describe en esta invención.
En otra realización, los polinucleótidos quiméricos tienen regiones y partes tanto codificantes como no codificantes.
La Figura 2 ilustra el diseño de ciertos polinucleótidos quiméricos de la presente invención cuando se basan en el andamio del polinucleótido de la Figura 1. En la figura se muestran las regiones o partes de los polinucleótidos quiméricos donde las regiones con patrón representan aquellas regiones que están modificadas posicionalmente. y las regiones abiertas ilustran regiones que pueden modificarse o no pero que, cuando se modifican, se modifican uniformemente. Los polinucleótidos quiméricos de la presente invención pueden estar completamente modificados en posición o parcialmente modificados en posición. También pueden tener subregiones que pueden tener cualquier patrón o diseño. En la Figura 2 se muestran una subregión quimérica y una subregión de hemímero.
En una realización, la longitud más corta de una región del polinucleótido quimérico de la presente invención que codifica un péptido puede ser la longitud suficiente para codificar un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido, un pentapéptido, un hexapéptido, un heptapéptido , un octapéptido, un nonapéptido o un decapéptido. En otra realización, la longitud puede ser suficiente para codificar un péptido de 2 a 30 aminoácidos, por ejemplo, 5 a 30, 10 a 30, 2 a 25, 5 a 25, 10 a 25 o 10 a 20 aminoácidos. La longitud puede ser suficiente para codificar un péptido de al menos 11, 12, 13, 14, 15, 17, 20, 25 o 30 aminoácidos, o un péptido que no tenga más de 40 aminoácidos, por ejemplo, no más de 35,30, 25, 20, 17, 15, 14, 13, 12, 11 o 10 aminoácidos. Ejemplos de dipéptidos que las secuencias de polinucleótidos pueden codificar o incluyen, pero no se limitan a, carnosina y anserina.
En una realización, la longitud de una región del polinucleótido quimérico de la presente invención que codifica el péptido o polipéptido de interéses es mayor que aproximadamente 30 nucleótidos de longitud (p. ej., al menos o mayor que aproximadamente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.500 y 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000 o hasta e incluyendo 100.000 nucleótidos). Tal como se usa en esta invención, tal región puede denominarse "región de codificación" o "región que codifica".
En algunas realizaciones, el polinucleótido quimérico incluye de aproximadamente 30 a aproximadamente 100.000 nucleótidos (p. ej., de 30 a 50, de 30 a 100, de 30 a 250, de 30 a 500, de 30 a 1000, de 30 a 1.500, de 30 a 3.000, de 30 a 5.000, de 30 a 7.000, de 30 a 10.000, de 30 a 25.000, de 30 a 50.000, de 30 a 70.000, de 100 a 250, de 100 a 500, de 100 a 1.000, de 100 a 1,500, de 100 a 3.000, de 100 a 5.000, de 100 a 7.000, de 100 a 10.000, de 100 a 25.000, de 100 a 50.000, de 100 a 70.000, de 100 a 100.000, de 500 a 1.000, de 500 a 1,500, de 500 a 2.000, de 500 a 3.000, de 500 a 5.000, de 500 a 7.000, de 500 a 10.000, de 500 a 25.000, de 500 a 50.000, de 500 a 70.000, de 500 a 100.000, de 1.000 a 1,500, de 1.000 a 2.000, de 1.000 a 3.000, de 1.000 a 5.000, de 1.000 a 7.000, de 1.000 a 10.000, de 1.000 a 25.000, de 1.000 a 50.000, de 1.000 a 70.000, de 1.000 a 100.000, de 1,500 a 3.000, de 1,500 a 5.000, de 1,500 a 7.000, de 1,500 a 10.000, de 1,500 a 25.000, de 1,500 a 50.000, de 1,500 a 70.000, de 1,500 a 100.000, de 2.000 a 3.000, de 2.000 a 5.000, de 2.000 a 7.000, de 2.000 a 10.000, de 2.000 a 25.000, de 2.000 a 50.000, de 2.000 a 70.000 y de 2.000 a 100.000).
Según la presente invención, las regiones o subregiones de los polinucleótidos quiméricos también pueden variar independientemente de 15 a 1000 nucleótidos de longitud (p. ej., más de 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110 , 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700,750, 800, 850, 900 y 950 nucleótidos o al menos 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 y 1.000 nucleótidos).
Según la presente invención, las regiones o subregiones de los polinucleótidos quiméricos pueden variar desde ausentes hasta 500 nucleótidos de longitud (por ejemplo, al menos 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 nucleótidos). Cuando la región es una cola de poliA, la longitud puede determinarse en unidades o en función de la unión de la proteína de unión a poliA. En esta realización, la cola de poliA es lo suficientemente larga para unir al menos 4 monómeros de proteína de unión de poliA. Los monómeros de la proteína de unión a poliA se unen a tramos de aproximadamente 38 nucleótidos. Como tal, se ha observado que las colas de poliA de aproximadamente 80 nucleótidos a aproximadamente 160 nucleótidos (SEQ ID NO: 2278) son funcionales. Los polinucleótidos quiméricos de la presente invención que funcionan como un ARNm no necesitan comprender una cola de poliA.
Según la presente invención, los polinucleótidos quiméricos que funcionan como un ARNm pueden tener una región de protección. La región de protección puede comprender una sola capa o una serie de nucleótidos que forman la capa. En esta realización la región de protección puede tener una longitud de 1 a 10, por ejemplo, 2--9, 3--8, 4--7, 1­ 5, 5-10, o al menos 2, o 10 o menos nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la capa está ausente.
La presente invención contempla polinucleótidos quiméricos que son circulares o cíclicos. Como su nombre lo indica, los polinucleótidos circulares son de naturaleza circular, lo que significa que los extremos están unidos de alguna manera, ya sea por ligación, enlace covalente, asociación común con la misma proteína u otra molécula o complejo o por hibridación. Cualquiera de los polinucleótidos cíclicos como se enseña, por ejemplo, en Número de solicitud provisional de EE. UU. 61/873.010 depositada el 3 de septiembre de 2013, se puede convertir en quimérico según la presente invención.
Los polinucleótidos quiméricos, las formulaciones y las composiciones que comprenden polinucleótidos quiméricos y los procedimientos para fabricar, usar y administrar polinucleótidos quiméricos también se describen en la Solicitud Provisional de EE. UU. pendiente de tramitación N° 61/873,034, depositada el 3 de septiembre de 2013, titulada Chimeric Polynucleotides, y la Solicitud provisional de EE. UU. No. 61/877.582, presentada el 13 de septiembre de 2013, titulada Chimeric Polynucleotides
Arquitectura de polinculeótidos circulares
La presente invención contempla polinucleótidos que son circulares o cíclicos. Como su nombre lo indica, los polinucleótidos circulares son de naturaleza circular, lo que significa que los extremos están unidos de alguna manera, ya sea por ligación, enlace covalente, asociación común con la misma proteína u otra molécula o complejo o por hibridación. Cualquiera de los polinucleótidos cíclicos como se enseña, por ejemplo, en Número de solicitud provisional de EE. UU. 61/873.010 depositada el 3 de septiembre de 2013, (expediente de abogado número M51.60)
Los polinucleótidos circulares de la presente invención pueden diseñarse según los andamios de construcción de ARN circular que se muestran en las Figuras 6-12. Dichos polinucleótidos son polinucleótidos ciculares o construcciones circulares.
Los polinucleótidos circulares o circP de la presente invención que codifican al menos un péptido o polipéptido de interés se conocen como ARN circulares o ARNcirc. Los antígenos de las VAN de la presente invención pueden estar codificados por uno o más ARN circulares o ARNcirc.
Como se usa en esta invención, "ARN circular" o "ARNcirc" significa un polinucleótido circular que puede codificar al menos un péptido o polipéptido de interés.
Como se usa en esta invención, "secuencia sensora" significa un receptor o pseudorreceptor para moléculas de unión de ácido nucleico endógenas. Los ejemplos no limitantes de secuencias sensoras incluyen sitios de unión de microARN, secuencias de semillas de microARN, sitios de unión de microARN sin la secuencia de semillas, sitios de unión de factores de transcripción y sitios de unión artificiales diseñados para actuar como pseudoreceptores y porciones y fragmentos de los mismos.
Los circP de la presente invención que comprenden al menos una secuencia sensora y codifican al menos un péptido o polipéptido de interés se conocen como esponjas circulares de ARN o ARNcirc-SP. Como se usa en esta invención, "esponjas circulares de ARN" o "ARNcirc-SP" significa un polinucleótido circular que comprende al menos una secuencia sensora y al menos una región que codifica al menos un péptido o polipéptido de interés.
La Figura 6A muestra una construcción circular representativa 200 de los polinucleótidos circulares de la presente invención. Como se usa en esta invención, el término "construcción circular" se refiere a una transcripción de polinucleótidos circular que puede actuar sustancialmente similar y tener propiedades de una molécula de ARN. En una realización, la construcción circular actúa como un ARNm. Tal como se usa en esta invención, el término "construcción primaria" o "construcción de ARNm primario" se refiere a una transcripción de polinucleótidos que codifica uno o más polipéptidos de interés y que retiene suficientes características estructurales y/o químicas para permitir la traducción del polipéptido de interés codificado en el mismo. Las construcciones circulares pueden ser polinucleótidos de la invención. Cuando se modifica estructural o químicamente, la construcción puede denominarse circP modificado, circSP modificado, ARNcirc modificado o ARNcirc-SP modificado.
Volviendo a la FIG. 6A, la construcción circular 200 aquí contiene una primera región de nucleótidos enlazados 202 que está flanqueada por una primera región flanqueante 204 y una segunda región flanqueante 206. Tal como se usa en esta invención, la "primera región" puede denominarse "región de codificación" o "región que codifica" o simplemente la "primera región". En una realización, esta primera región puede comprender nucleótidos tales como, entre otros, que codifican al menos un péptido o polipéptido de interés y/o nucleótidos que codifican una región sensora. El éptido o polipéptido de interés puede comprender en su extremo 5' una o más secuencias de péptidos de señal codificadas por una región de secuencia de péptido de señal 203. La primera región flanqueante 204 puede comprender una región de nucleósidos enlazados o una porción de los mismos que pueden actuar de manera similar a una región no traducida (UTR) en un ARNm y/o secuencia de ADN. La primera región flanqueante también puede comprender una región de polaridad 208. La región de polaridad 208 puede incluir una secuencia IRES o una porción de la misma. Como ejemplo no limitativo, cuando se linealiza esta región puede dividirse para que una primera porción esté en el extremo 5' de la primera región 202 y la segunda porción esté en el extremo 3' de la primera región 202. La segunda región flanqueante 206 puede comprender una región de secuencia de cola 210 y puede comprender una región de nucleótidos enlazados o una porción de los mismos 212 que pueden actuar de manera similar a una UTR en un ARNm y/o ADN.
Uniendo el extremo 5' de la primera región 202 y la primera región flanqueante 104 hay una primera región operativa 205. En una realización, esta región operativa puede comprender un codón de inicio. La región operativa puede comprender alternativamente cualquier secuencia o señal de inicio de traducción que incluya un codón de inicio.
Uniendo el extremo 3' de la primera región 202 y la segunda región flanqueante 106 hay una segunda región operativa 207. Tradicionalmente, esta región operativa comprende un codón de parada. La segunda región operativa puede comprender alternativamente cualquier secuencia o señal de inicio de traducción que incluya un codón de parada. Según la presente invención, también se pueden usar múltiples codones de parada en serie. En una realización, la región de operación de la presente invención puede comprender dos codones de parada. El primer codón de parada puede ser "TGA" o "UGA" y el segundo codón de parada puede seleccionarse de entre el grupo que consiste en "TAA", "TGA", "TAG", "UAA", "UGA" o "UAG".
Volviendo a la Figura 6B, se puede usar al menos un resto 201 que no es de ácido nucleico para preparar una construcción circular 200 donde se usa el resto 201 que no es de ácido nucleico para llevar la primera región flanqueante 204 cerca de la segunda región flanqueante 206. En esta invención se describen ejemplos no limitantes de restos de ácido no nucleico que pueden usarse en la presente invención. La construcción circular 200 puede comprender más de un resto no ácido nucleico donde los restos no nucleicos adicionales pueden ser heterólogos u homólogos al primer resto de ácido no nucleico.
Volviendo a la Figura 7A, la primera región de nucleósidos 202 enlazados puede comprender una región espaciadora 214 espaciadora. Esta región espaciadora 214 puede usarse para separar la primera región de nucleósidos 202 enlazados de modo que la construcción circular pueda incluir más de un marco de lectura abierto, región no codificante o un marco de lectura abierto y una región no codificante.
Volviendo a la Figura 7B, la segunda región flanqueante 206 puede comprender una o más regiones sensoras 216 en la 3' UTR 212. Estas secuencias sensoras, como se discute en esta invención, operan como pseudo-receptores (o sitios de unión) para ligandos del microambiente local de la construcción circular. Por ejemplo, los sitios de unión de microARN o semillas de miARN pueden usarse como sensores de modo que funcionen como pseudorreceptores para cualquier microARN presente en el entorno del polinucleótido circular. Como se muestra en la Figura 9 , la una o más regiones sensoras 216 pueden estar separadas por una región espaciadora 214.
Como se muestra en la Figura 8A, una construcción circular 200, que incluye una o más regiones detectoras 216, también puede incluir una región espaciadora 214 en la primera región de nucleósidos enlazados 202. Como se discutió anteriormente para la Figura 7, esta región espaciadora 214 puede usarse para separar la primera región de nucleósidos 202 enlazados de modo que la construcción circular pueda incluir más de un marco de lectura abierto y/o más de una región no codificante.
Volviendo a la Figura 8B, una construcción circular 200 puede ser una construcción no codificante conocida como circSP que comprende al menos una región no codificante tal como, pero sin limitarse a, una región sensora 216. Cada una de las regiones sensoras 216 puede incluir, entre otras, una secuencia miR, una semilla miR, un sitio de unión miR y/o una secuencia de miR sin la semilla.
Volviendo a la Figura 9 , se puede usar al menos un resto 201 que no es de ácido nucleico para preparar una construcción circular 200 que es una construcción no codificante. La construcción circular 200 que es una construcción no codificante puede comprender más de un resto de ácido no nucleico donde los restos de ácido no nucleico adicionales pueden ser heterólogos u homólogos al primer resto de ácido no nucleico.
Los polinucleótidos circulares, las formulaciones y las composiciones que comprenden polinucleótidos circulares y los procedimientos para fabricar, usar y administrar polinucleótidos circulares también se describen en la Solicitud Provisional de EE. UU. pendiente de tramitación N° 61/873,010, depositada el 3 de septiembre de 2013, titulada Circular Polynucleotides, y Solicitud provisional de EE. UU. No. 61/877.527, presentada el 13 de septiembre de 2013, titulada Circular Polynucleotides;
Multímeros de polinucleótidos
Según la presente invención, múltiples polinucleótidos quiméricos distintos y/o polinucleótidos IVT pueden unirse entre sí a través del extremo 3' usando nucleótidos que están modificados en el extremo 3'. Puede usarse conjugación química para controlar la estequiometría del suministro a las células. Por ejemplo, las enzimas del ciclo del glioxilato, isocitrato liasa y malato sintasa, se pueden suministrar a las células a una relación 1:1 para alterar el metabolismo celular de los ácidos grasos. Esta relación puede controlarse mediante la unión química de polinucleótidos quiméricos y/o polinucleótidos IVT usando un nucleótido terminado en 3'-azido en una especie de polinucleótido y un nucleótido que contiene C5-etinilo o alquinilo en la especie de polinucleótido opuesta. El nucleótido modificado se añade postranscripcionalmente usando transferasa terminal (New England Biolabs, Ipswich, MA) según el protocolo del fabricante. Después de la adición del nucleótido modificado en 3', las dos especies de polinucleótidos pueden combinarse en una solución acuosa, en presencia o ausencia de cobre, para formar un nuevo enlace covalente a través de un mecanismo de química clic como se describe en la bibliografía.
En otro ejemplo, más de dos polinucleótidos quiméricos y/o polinucleótidos IVT pueden unirse entre sí usando una molécula enlazadora funcionalizada. Por ejemplo, una molécula de sacárido funcionalizada puede modificarse químicamente para contener múltiples grupos reactivos químicos (SH-, NH2-, N3, etc.) para reaccionar con el resto afín en una molécula de ARNm funcionalizada en 3' (es decir, un éster 3'-maleimida, éster 3'-NHS, alquinilo). El número de grupos reactivos en el sacárido modificado se puede controlar de forma estequiométrica para controlar directamente la proporción estequiométrica de polinucleótidos quiméricos conjugados y/o polinucleótidos IVT.
En una realización, los polinucleótidos quiméricos y/o los polinucleótidos IVT pueden unirse juntos en un patrón. El patrón puede ser un patrón alterno simple como CD[CD]x donde cada "C" y cada "D" representan un polinucleótido quimérico, polinucleótido IVT, diferentes polinucleótidos quiméricos o diferentes polinucleótidos IVT. El patrón puede repetirse x número de veces, donde x= 1-300. Debe entenderse que los antígenos de las VAN de la presente invención pueden estar codificados por dichos polinucleótidos enlazados, como se describe en esta invención. Los patrones también pueden ser múltiplos alternos como patrón CCDD[CCDD] x (un múltiplo doble alterno) o CCCDDD[CCCDDD] x (un patrón triple múltiple alterno). El múltiplo doble alterno o el múltiplo triple alterno pueden repetirse x número de veces, donde x= 1-300.
Combinaciones y conjugados de polinucleótidos
Para mejorar aún más la producción de proteínas, los polinucleótidos de la presente invención se pueden diseñar para conjugarlos con otros polinucleótidos, tintes, agentes intercalantes (p.ej. acridinas), reticulantes (p.ej. psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, zafirina), hidrocarburos aromáticos policíclicos (p.ej., fenazina, dihidrofenazina), endonucleasas artificiales (p.ej. EDTA), agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (p.ej., PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alquilo, alquilo sustituido, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (p.ej. biotina), facilitadores de transporte/absorción (p.ej., aspirina, vitamina E, ácido fólico), ribonucleasas sintéticas, proteínas, p. ej., glicoproteínas o péptidos, p. ej., moléculas que tienen una afinidad específica por un coligando, o anticuerpos p.ej., un anticuerpo, que se une a un tipo celular, como una célula cancerosa, una célula endotelial o una célula ósea, hormonas y receptores de hormonas, especies no peptídicas, como lípidos, lectinas, carbohidratos, vitaminas, cofactores o un fármaco.
En una realización preferida, los polinucleótidos de la presente invención que codifican un antígeno se conjugan con uno o más marcadores de células dendríticas.
La conjugación puede resultar en una mayor estabilidad y/o semivida y puede ser particularmente útil para dirigir los polinucleótidos a sitios específicos en la célula, tejido u organismo.
Según la presente invención, los polinucleótidos pueden administrarse, conjugarse o codificar adicionalmente uno o más agentes de ARNi, siRNA, shARN, miARN, sitios de unión de miARN, a Rn antisentido, ribozimas, ADN catalítico, ARNt, ARN que inducen la triple hélice. formación, aptámeros o vectores, y similares.
Polinucleótidos bifuncionales
En una realización de la invención, las VAN pueden comprender polinucleótidos bifuncionales (por ejemplo, polinucleótidos IVT bifuncionales, polinucleótidos quiméricos bifuncionales o polinucleótidos circulares bifuncionales). Como su nombre lo indica, los polinucleótidos bifuncionales son aquellos que tienen o son capaces de al menos dos funciones. Estas moléculas también pueden denominarse por convención multifuncionales. Debe entenderse que los polinucleótidos VAN de la presente invención pueden conjugarse con otras moléculas o agentes, como se describió anteriormente.
Las múltiples funcionalidades de los polinucleótidos bifuncionales pueden estar codificadas por el ARN (la función puede no manifestarse hasta que se traduzca el producto codificado) o puede ser una propiedad del propio polinucleótido. Puede ser estructural o química. Los polinucleótidos modificados bifuncionales pueden comprender una función que está asociada covalente o electrostáticamente con los polinucleótidos. Además, las dos funciones pueden proporcionarse en el contexto de un complejo de un polinucleótido quimérico y otra molécula.
Polinucleótidos no codificantes
Como se describe en esta invención, se proporcionan polinucleótidos que tienen secuencias que son parcial o sustancialmente no traducibles, por ejemplo, que tienen una región no codificante. Como ejemplo no limitante, la región no codificante puede ser la primera región del polinucleótido IVT o el polinucleótido circular. Alternativamente, la región no codificante puede ser una región distinta de la primera región. Como otro ejemplo no limitante, la región no codificante puede ser A, B y/o región C del polinucleótido quimérico.
Por lo general, estas moléculas no se traducen, pero pueden ejercer un efecto sobre la respuesta inmunitaria o la producción de proteínas al unirse y secuestrar uno o más componentes de la maquinaria de traducción, como una proteína ribosómica o un ARN de transferencia (ARNt), reduciendo así de manera efectiva la expresión de proteínas en la célula o la modulación de una o más vías o cascadas en una célula que a su vez altera los niveles de proteínas. El polinucleótido puede contener o codificar uno o más ARN largos no codificantes (IncARN o lincARN) o una parte del mismo, un ARN nucleolar pequeño (sno-ARN), micro ARN (miARN), ARN pequeño de interferencia (siRNA) o ARN que interactúa con Piwi (piARN). Ejemplos de tales moléculas de IncARN y construcciones de ARNi diseñadas para dirigirse a dicho IncARN, cualquiera de los cuales puede estar codificado en los polinucleótidos, se muestran en la Publicación Internacional. WO2012/018881 A2,
Según la presente invención, el polinucleótido codifica uno o más polipéptidos de interés o fragmentos de los mismos. Tal polipéptido de interés puede incluir, entre otros, polipéptidos completos, una pluralidad de polipéptidos o fragmentos de polipéptidos, que independientemente pueden estar codificados por una o más regiones o partes de todo un polinucleótido. Tal como se usa en esta invención, el término "polipéptidos de interés" se refiere a cualquier polipéptido que se selecciona para ser codificado en, o cuya función es afectada por los polinucleótidos de la presente invención. Los péptidos o polipéptidos de la invención son antigénicos.
Tal como se usa en esta invención, "polipéptido" significa un polímero de residuos de aminoácidos (naturales o no naturales) unidos entre sí con mayor frecuencia mediante enlaces peptídicos. El término, como se usa en esta invención, se refiere a proteínas, polipéptidos y péptidos de cualquier tamaño, estructura o función. Los polipéptidos de interés son antígenos codificados por los polinucleótidos como se describe en esta invención.
En algunos aspectos, el polipéptido codificado tiene menos de aproximadamente 50 aminoácidos y, a continuación, se denomina un péptido. Si el polipéptido es un péptido, tendrá una longitud de al menos aproximadamente 2, 3, 4 o al menos 5 residuos de aminoácidos. Por lo tanto, los polipéptidos incluyen productos génicos, polipéptidos de origen natural, polipéptidos sintéticos, homólogos, ortólogos, parálogos, fragmentos y otros equivalentes, variantes y análogos de los que anteceden. Un polipéptido puede ser una única molécula o puede ser un complejo de múltiples moléculas, tal como un dímero, trímero o tetrámero. Estos también pueden comprender polipéptidos de cadena simple o de cadena múltiple, tales como anticuerpos o insulina, y pueden estar asociados o unidos. Los enlaces disulfuro más comunes se encuentran en los polipéptidos de cadena múltiple. El término polipéptido también puede aplicarse a polímeros de aminoácidos, en los cuales uno o más residuos de aminoácidos son un análogo químico artificial de un aminoácido correspondiente de origen natural.
La expresión "variante de polipéptido" se refiere a moléculas que difieren en su secuencia de aminoácidos de una secuencia de referencia o natural. Las variantes de la secuencia de aminoácidos pueden poseer sustituciones, deleciones e/o inserciones en determinadas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos, en comparación con una secuencia nativa o de referencia. Normalmente, las variantes tendrán al menos aproximadamente 50 % de identidad (homología) con una secuencia de referencia o natural y, preferentemente, serán idénticas (homólogas) en al menos aproximadamente 80 %, más preferentemente al menos aproximadamente 90 % a una secuencia de referencia o natural.
En algunas realizaciones, se proporcionan “miméticos variantes”. Tal como se usa en esta invención, la expresión "imitador de variante" es uno que contiene uno o más aminoácidos que imitarían una secuencia activada. Por ejemplo, el glutamato puede servir como un imitador de fosforo-treonina y/o fosforo-serina. De manera alternativa, los imitadores de variantes pueden producir la desactivación o un producto inactivado que contiene el imitador, por ejemplo, la fenilalanina puede actuar como una sustitución inactivante de la tirosina, o la alanina puede actuar como una sustitución inactivante para serina.
"Homología", tal como se aplica a las secuencias de aminoácidos, se define como el porcentaje de residuos en la secuencia de aminoácidos candidata que sean idénticos a los residuos en la secuencia de aminoácidos de una segunda secuencia a continuación de alinear las secuencias e introducir huecos, de ser necesario, para lograr el mayor porcentaje de homología. Procedimientos y programas informáticos para la alineación son bien conocidos en la técnica. Se entiende que la homología depende de un cálculo del porcentaje de identidad, pero puede diferir en valor debido a los huecos y las penalizaciones introducidas en el cálculo.
Por "homólogos", tal como se aplica a secuencias de polipéptidos, se entiende la secuencia correspondiente de otra especie que tiene una identidad sustancial con una segunda secuencia de una segunda especie.
Se pretende que "análogos" incluya variantes polipeptídicas que difieran en una o más alteraciones de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones, adiciones o deleciones de residuos aminoácidos que aún conservan una o más de las propiedades del polipéptido original o inicial.
La presente invención contempla varios tipos de composiciones que están basados en polipéptidos, inclusive variantes y derivados. Estos incluyen variantes y derivados de sustitución, inserción, deleción y covalentes. El término "derivado" se usa como sinónimo del término "variante", pero generalmente se refiere a una molécula que ha sido modificada y/o cambiada de cualquier manera en comparación con una molécula de referencia o molécula inicial.
Como tales, los polinucleótidos que codifican péptidos o polipéptidos que contienen sustituciones, inserciones y/o adiciones, deleciones y modificaciones covalentes con respecto a las secuencias de referencia, en particular las secuencias polipeptídicas descritas en esta invención, están incluidos dentro del alcance de esta invención. Por ejemplo, marcadores de secuencia o aminoácidos, tales como una o más lisinas, pueden agregarse a las secuencias de péptidos de la descripción (por ejemplo, en los extremos N o C). Pueden usarse marcadores de secuencia para la purificación o localización de péptidos. Pueden usarse lisinas para aumentar la solubilidad de péptidos o para permitir la biotinilación. De manera alternativa, los residuos de aminoácidos ubicados en las regiones de los extremos amino y carboxi de la secuencia de aminoácidos de un péptido o proteína pueden eliminarse de manera opcional para proporcionar secuencias truncadas. Determinados aminoácidos (por ejemplo, residuos del extremo C o extremo N) pueden eliminarse de manera alternativa, dependiendo del uso de la secuencia, como, por ejemplo, expresión de la secuencia como parte de una secuencia mayor que sea soluble, o que esté unida a un soporte sólido.
"Variantes de sustitución", cuando se refieren a polipéptidos, son las que han eliminado al menos un residuo de aminoácidos en una secuencia natural o inicial y un aminoácido diferente insertado en su lugar en la misma posición. Las sustituciones pueden ser simples, donde solo se sustituyó una molécula de aminoácido, o pueden ser múltiples, cuando se sustituyeron dos o más aminoácidos en la misma molécula.
Tal como se usa en esta invención, la expresión “sustitución de aminoácido conservadora” se refiere a la sustitución de un aminoácido que está presente normalmente en la secuencia con un aminoácido diferente de tamaño, carga o polaridad similar. Ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo no polar (hidrofóbico), tal como isoleucina, valina y leucina, por otro residuo no polar. De manera similar, ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo polar (hidrofílico) por otro, tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, y entre glicina y serina. De manera adicional, la sustitución de un residuo básico, tal como lisina, arginina o histidina, por otro, o la sustitución de un residuo ácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico por otro residuo ácido, son ejemplos adicionales de sustituciones conservadoras. Ejemplos de sustituciones no conservadoras incluyen la sustitución de un residuo de aminoácido no polar (hidrofóbico), tal como isoleucina, valina, leucina, alanina, metionina, por un residuo polar (hidrofílico), tal como, cisteína, glutamina, ácido glutámico o lisina, y/o un residuo polar por un residuo no polar.
"Variantes de inserción", cuando se refiere a polipéptidos, son las que tienen uno o más aminoácidos insertados de manera inmediatamente adyacente a un aminoácido en una posición particular en una secuencia natural o inicial. "Inmediatamente adyacente" a un aminoácido significa conectado al grupo funcional alfa-carboxi o alfa-amino del aminoácido.
"Variaciones de deleción", cuando se refiere a polipéptidos, son las que tienen uno o más aminoácidos eliminados en la secuencia de aminoácidos natural o inicial. De manera común, las variantes de deleción tendrán uno o más aminoácidos eliminados en una región particular de la molécula.
"Derivados covalentes", cuando se refiere a polipéptidos, incluyen modificaciones de una proteína natural o inicial con un agente de derivación proteináceo o no proteináceo orgánico, y/o modificaciones postraduccionales. Las modificaciones covalentes se introducen tradicionalmente mediante la reacción de residuos de aminoácidos dirigidos de la proteína con un agente de derivación orgánico que es capaz de reaccionar con residuos extremos o cadenas laterales seleccionadas, o mediante mecanismos de aprovechamiento de modificaciones postraduccionales que funcionan en células hospedadoras recombinantes seleccionadas. Los derivados covalentes resultantes son útiles en programas dirigidos a identificar residuos importantes para verificar la actividad biológica, para inmunoensayos, o para la preparación de anticuerpos contra proteínas para la purificación por inmunoafinidad de la glicoproteína recombinante. Dichas modificaciones se encuentran dentro del conocimiento de la técnica y se llevan a cabo sin experimentación innecesaria.
Determinadas modificaciones postraduccionales son el resultado de la acción células hospedadoras recombinantes sobre el polipéptido expresado. Los residuos de glutaminilo y asparaginilo a menudo se desamidan de forma postraduccional y se convierten en los residuos aspartilo y glutamilo correspondientes. Alternativamente, estos residuos se desamidan en condiciones moderadamente ácidas. Cualquier forma de estos residuos puede estar presente en los polipéptidos producidos según la presente invención.
Otras modificaciones postraduccionales incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo y treonilo, metilación de los grupos alfa-amino de cadenas laterales de histidina, lisina y arginina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79--86 (1983)).
Las "características", cuando se hace referencia a polipéptidos, son definidas como componentes distintos basados en secuencias de aminoácidos de una molécula. Las características de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos de la presente invención incluyen manifestaciones en la superficie, forma conformacional local, pliegues, bucles, semibucles, dominios, semidominios, sitios, extremos o cualquier combinación de los mismos.
Tal como se usa en esta invención al hacer referencia a polipéptidos, la expresión "manifestación en la superficie" se refiere a un componente basado en polipéptidos de una proteína que aparece en la última superficie externa.
Tal como se usa en esta invención al hacer referencia a polipéptidos, la expresión "forma conformacional local" significa una manifestación estructural basada en polipéptidos de una proteína que está ubicada dentro de un espacio definible de la proteína.
Tal como se usa en esta invención al hacer referencia a polipéptidos, el término "pliegue" se refiere a la conformación resultante de una secuencia de aminoácidos al minimizar la energía. Puede producirse un pliegue en el nivel secundario o terciario del procedimiento de plegado. Ejemplos de pliegues secundarios incluyen láminas beta y hélices alfa. Ejemplos de pliegues terciarios incluyen dominios y regiones formadas debido a la agregación o separación de fuerzas energéticas. Regiones formadas de este modo incluyen cavidades hidrofóbicas e hidrofílicas, y similares.
Tal como se usa en esta invención, el término "giro" en relación con la conformación de una proteína significa una rotación que altera la dirección de la estructura principal de un péptido o polipéptido y puede implicar uno, dos, tres o más residuos de aminoácidos.
Tal como se usa en esta invención en referencia a polipéptidos, el término "bucle" se refiere a una característica estructural de un polipéptido que puede servir para revertir la dirección de la estructura principal de un péptido o polipéptido. Cuando el bucle se encuentra en un polipéptido y solo altera la dirección de la estructura principal, puede comprender cuatro o más residuos de aminoácidos. Oliva y col. identificaron al menos 5 clases de bucles de proteínas (J. Mol Biol 266 (4): 814-830; 1997). Los bucles pueden ser abiertos o cerrados. Los bucles cerrados o "cíclicos" pueden comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos entre los restos de puenteo. Dichos restos de puenteo pueden comprender un puente cisteína-cisteína (Cys-Cys) típico en polipéptidos que tienen puentes disulfuro o, de manera alternativa, los restos de puenteo pueden no estar basados en proteínas, tal como el agente dibromocililo, tal como se usan en esta invención.
Tal como se usa en esta invención al hacer referencia a polipéptidos, el término "semibucle" se refiere a una parte de un bucle identificado que tiene al menos la mitad de la cantidad de aminoácidos que forman el bucle del cual se derivan. Se entiende que los bucles no siempre contienen una cantidad par de residuos de aminoácidos. Por lo tanto, en aquellos casos en los que un bucle contiene o se identifica que comprende un número impar de aminoácidos, un semibucle del bucle impar comprenderá la porción de número entero o la siguiente porción de número entero del bucle (número de aminoácidos del bucle/2+/- 0,5 aminoácidos). Por ejemplo, un bucle identificado como un bucle de 7 aminoácidos puede producir semibucles de 3 aminoácidos o de 4 aminoácidos (7/2=3,5+/-0,5 puede ser 3 o 4).
Tal como se usa en esta invención al hacer referencia a polipéptidos, el término "dominio" se refiere a un motivo de un polipéptido que tenga una o más características o propiedades funcionales o estructurales identificables (por ejemplo, capacidad de unión, servir como sitio para interacciones entre proteínas).
Tal como se usa en esta invención al hacer referencia a polipéptidos, el término "semidominio" se refiere a una parte de un dominio identificado que tiene al menos la mitad de la cantidad de aminoácidos que forman el dominio del cual se derivan. Se entiende que los dominios no siempre contienen una cantidad par de residuos de aminoácidos. Por lo tanto, en los casos donde un dominio contiene o se identifica que comprende una cantidad impar de aminoácidos, un semidominio de un dominio con una cantidad impar de aminoácidos comprenderá la porción de número entero, o la porción del próximo número entero del dominio (cantidad de aminoácidos en el dominio/2+/0,5 aminoácidos). Por ejemplo, un dominio identificado como un dominio de 7 aminoácidos puede producir semidominios de 3 aminoácidos o de 4 aminoácidos (7/2=3,5+/-0,5 puede ser 3 o 4). También se entenderá que pueden identificarse subdominios dentro de dominios o semidominios, estos subdominios poseen menos que la totalidad de propiedades funcionales o estructurales identificadas en los dominios o semidominios de los cuales se derivan. También se entenderá que los aminoácidos que comprenden cualquier tipo de dominio en esta invención no necesitan ser contiguos a lo largo de la estructura principal del polipéptido (es decir, los aminoácidos no adyacentes pueden plegarse estructuralmente para producir un dominio, semidominio o subdominio).
Tal como se usa en esta invención en referencia a polipéptidos, el término “sitio”, en lo referente a aspectos basados en aminoácidos, se usa como sinónimo de “residuo de aminoácidos” y “cadena lateral de aminoácidos”. Un sitio representa una posición dentro de un péptido o polipéptido que puede modificarse, manipularse, alterarse, derivarse o variarse dentro de las moléculas basadas en polipéptidos de la presente invención.
Tal como se usa en esta invención los términos "extremos" o "extremo", en referencia a polipéptidos, se refieren a una extremidad de un péptido o polipéptido. Dicha extremidad no se limita únicamente al sitio inicial o final del péptido o polipéptido, sino que puede incluir aminoácidos adicionales en las regiones de los extremos. Las moléculas basadas en polipéptidos de la presente invención pueden caracterizarse como moléculas que tienen tanto un extremo N (terminado en un aminoácido con un grupo amino libre (NH2)) como un extremo C (terminado en un aminoácido con un grupo carboxilo libre (COOH)). En algunos aspectos, las proteínas de la invención están compuestas de cadenas de polipéptidos que están unidas mediante enlaces disulfuro o mediante fuerzas no covalentes (multímeros, oligómeros). Estos tipos de proteínas tendrán múltiples extremos N y C. De manera alternativa, los extremos de los polipéptidos pueden modificarse de manera que comiencen o terminen, según sea el caso, con un resto no basado en polipéptidos, tal como un conjugado orgánico.
Una vez que cualquiera de las características ha sido identificada o definida como un componente deseado de un polipéptido para ser codificado por un polinucleótido de la invención, cualquiera de las diversas manipulaciones y/o modificaciones de estas características puede realizarse moviendo, intercambiando, invirtiendo, eliminando, aleatorizando o duplicando. Además, se entenderá que la manipulación de características puede producir el mismo resultado que una modificación de las moléculas de la invención. Por ejemplo, una manipulación que implica la deleción de un dominio daría como resultado la alteración de la longitud de una molécula solamente como la modificación de un aminoácido para codificar menos de lo que lo haría una molécula de longitud completa.
Las modificaciones y manipulaciones se pueden lograr mediante métodos conocidos en la técnica tales como, entre otros, mutagénesis dirigida al sitio o incorporación a priori durante la síntesis química. Las moléculas modificadas resultantes pueden a continuación evaluarse para verificar su actividad mediante el uso de ensayos in vitro o in vivo, tales como los descritos en esta invención o cualquier otro ensayo de selección adecuado conocido en la técnica.
Según la presente invención, los polipéptidos pueden comprender una secuencia de consenso que se descubre a través de ciclos de experimentación. Tal como se usa en esta invención, una secuencia "de consenso" es una secuencia individual que representa una población colectiva de secuencias que permite la variabilidad en uno o más sitios.
Como reconocerán los expertos en la técnica, los fragmentos de proteína, dominios de proteína funcional y proteínas homólogas, también se consideran dentro del alcance de los polipéptidos de interés de la presente invención. Por ejemplo, se proporciona en esta invención cualquier fragmento de proteína (que significa una secuencia de polipéptidos que en su longitud tiene un residuo de aminoácidos menos que una secuencia de polipéptidos de referencia, pero idéntica en los demás aspectos) de una proteína de referencia con una longitud de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o mayor que 100 aminoácidos. En otro ejemplo, puede utilizarse según la invención cualquier proteína que incluya una extensión de 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, o aproximadamente 100 aminoácidos que sea 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % o aproximadamente 100 % idéntica a las secuencias descritas en esta invención. En algunas realizaciones, un polipéptido incluye 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más mutaciones, según se muestra en cualquiera de las secuencias que se proporcionan o a las que se hace referencia en esta invención.
Las moléculas de referencia (polipéptidos o polinucleótidos) pueden compartir una cierta identidad con las moléculas diseñadas (polipéptidos o polinucleótidos). Tal como se conoce en la técnica, el término "identidad" hace referencia a una relación entre las secuencias de dos o más péptidos, polipéptidos o polinucleótidos determinada mediante la comparación de las secuencias. En la técnica, la identidad también hace referencia al grado de relación entre secuencias según se determina por la cantidad de coincidencias entre cadenas de dos o más residuos de aminoácidos o nucleósidos. La identidad mide el porcentaje de coincidencias idénticas entre la menor de dos o más secuencias con alineaciones de huecos (si los hubiera) conforme a un modelo matemático o programa informático particular (es decir, "algoritmos"). Es posible calcular la identidad de péptidos relacionados mediante procedimientos conocidos. Dichos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; y Carillo y col., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988).
En algunas realizaciones, la variante de polipéptido codificado puede tener la misma actividad o similar que el polipéptido de referencia. Alternativamente, la variante puede tener una actividad alterada (por ejemplo, aumentada o disminuida) con respecto a un polipéptido de referencia. Generalmente, las variantes de un polinucleótido o polipéptido particular de la invención tendrán al menos aproximadamente 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % pero menos del 100 % de identidad de secuencia con ese polinucleótido o polipéptido de referencia particular según se determina mediante programas y parámetros de alineación de secuencia descritos en esta invención y conocidos por los expertos en la técnica. Tales herramientas para la alineación incluyen las de la suite BLAST (Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller y David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BlAST: a new generación of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389—3402.) En esta invención se describen otras herramientas, específicamente en la definición de "Identidad".
Los parámetros predeterminados en el algoritmo BLAST incluyen, por ejemplo, un umbral esperado de 10, tamaño de palabra de 28, Puntuaciones Match/Mismatch 1, -2, Costos de Gap lineales. Se puede aplicar cualquier filtro, así como una selección de repeticiones específicas de especies, por ejemplo, Homo sapiens.
Polipéptidos penetrantes de células
Los polinucleótidos descritos en esta invención (por ejemplo, polinucleótidos que codifican antígenos incluidos en las VAN de la invención) también pueden codificar uno o más polipéptidos que penetran en las células. Como se usa en esta invención, "polipéptido que penetra en las células" o CPP se refiere a un polipéptido que puede facilitar la captación celular de moléculas. Un polipéptido de penetración celular de la presente invención puede contener uno o más marcadores detectables. Los polipéptidos pueden estar parcialmente marcados o completamente marcados en su totalidad. Los polinucleótidos pueden codificar el marcador detectable de forma completa, parcial o nula. El péptido que penetra en las células también puede incluir una secuencia señal. Como se usa en esta invención, una "secuencia señal" se refiere a una secuencia de residuos de aminoácidos unidos al extremo amino de una proteína naciente durante la traducción de la proteína. La secuencia señal puede usarse para señalar la secreción del polipéptido que penetra en las células.
En una realización, los polinucleótidos también pueden codificar una proteína de fusión. La proteína de fusión puede crearse uniendo operativamente una proteína cargada a una proteína terapéutica. Como se usa en esta invención, "operativamente unido" se refiere a la proteína terapéutica y la proteína cargada que están conectadas de tal manera que permiten la expresión del complejo cuando se introducen en la célula. Como se usa en esta invención, "proteína cargada" se refiere a una proteína que lleva una carga eléctrica positiva, negativa o neutra en general. Preferiblemente, la proteína terapéutica puede unirse covalentemente a la proteína cargada en la formación de la proteína de fusión. La relación entre la carga superficial y los aminoácidos totales o superficiales puede ser de aproximadamente 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 o 0,9.
El polipéptido que penetra en las células codificado por los polinucleótidos puede formar un complejo después de ser traducido. El complejo puede comprender una proteína cargada unida, por ejemplo, unida covalentemente, al polipéptido que penetra en las células. "Proteína terapéutica" se refiere a una proteína que, cuando se administra a una célula, tiene un efecto terapéutico, de diagnóstico y/o profiláctico y/o provoca un efecto biológico y/o farmacológico deseado.
En una realización, el polipéptido de penetración celular puede comprender un primer dominio y un segundo dominio. El primer dominio puede comprender un polipéptido sobrecargado. El segundo dominio puede comprender una pareja de unión a proteínas. Tal como se usa en esta invención, "pareja de unión a proteínas" incluye, pero no se limita a, anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos, proteínas de andamio o péptidos. El polipéptido que penetra en las células puede comprender además una pareja de unión intracelular para la pareja de unión a proteínas. El polipéptido que penetra en las células puede ser capaz de secretarse a partir de una célula donde se pueden introducir los polinucleótidos. El polipéptido que penetra en las células también puede ser capaz de penetrar en la primera célula.
En una realización adicional, el polipéptido que penetra en las células es capaz de penetrar en una segunda célula. La segunda célula puede ser de la misma área que la primera célula o puede ser de un área diferente. El área puede incluir, entre otros, tejidos y órganos. La segunda célula también puede estar próxima o distal a la primera célula.
En una realización, los polinucleótidos pueden codificar un polipéptido que penetra en las células que puede comprender una pareja de unión a proteínas. La pareja de unión a proteínas puede incluir, pero no se limita a, un anticuerpo, un anticuerpo sobrecargado o un fragmento funcional. Los polinucleótidos pueden introducirse en la célula donde se introduce un polipéptido que penetra en la célula que comprende la pareja de unión a proteínas.
Polipéptidos antimicrobianos y antivirales
Los polinucleótidos de la presente invención (i.e polinucleótidos que codifican antígenos incluidos en las VAN de la invención) pueden diseñarse para ser coadministrados con un polinucleótido que codifica uno o más péptidos antimicrobianos (AMP) o péptidos antivirales (AVP). Se han aislado y descrito AMP y AVP de una amplia gama de animales como, entre otros, microorganismos, invertebrados, plantas, anfibios, aves, peces y mamíferos (Wang y col., Nucleic Acids Res. 2009; 37 (Database issue):D933-7). Por ejemplo, los polipéptidos antimicrobianos se describen en la base de datos de péptidos antimicrobianos (http://aps.unmc.edu/AP/main.php; Wang y col., Nucleic Acids Res. 2009; 37 (Database issue):D933-7), CAMP: Collection of Anti-Microbial Peptides (http://www.bicnirrh.res.in/antimicrobial/); Thomas y col. , Nucleic Acids Res. 2010 ; 38 (Database issue):D774-80), US 5221732, US 5447914 , US 5519115, US 5607914, US 5714577, US 5734015, US 5798336, US 5821224, US 5849490, US 5856127, US 5905187, US 5994308, US 5998374, US 6107460, US 6191254, US 6211148, US 6300489, US 6329504, US 6399370, US 6476189, US 6478825, US 6492328, US 6514701, US 6573361, US 6573361, US 6576755, US 6605698, US 6624140, US 6638531, US 6642203, US 6653280, US 6696238, US 6727066, US 6730659, US 6743598, US 6743769, US 6747007, US 6790833, US 6794490, US 6818407, US 6835536, US 6835713, US 6838435, US 6872705, US 6875907, US 6884776, US 6887847, US 6906035, US 6911524, US 6936432, US 7001924, US 7071293, US 7078380, US 7091185, US 7094759, US 7166769, US 7244710, US 7314858, y US 7582301.
Los polipéptidos antimicrobianos descritos en esta invención pueden bloquear la fusión celular y/o entrada viral por uno o más virus envueltos (p.ej., HIV, HCV). Por ejemplo, el polipéptido antimicrobiano puede comprender o consistir en un péptido sintético correspondiente a una región, por ejemplo, una secuencia consecutiva de al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 aminoácidos del subconjunto transmembrana de una proteína de la envoltura viral, por ejemplo, gp120 o gp41 del VIH-1. Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de gp120 o gp41 de VIH-1 se describen en, por ejemplo, Kuiken y col., (2008). "HIV Sequence Compendium, " Los Alamos National Laboratory.
En algunas realizaciones, el polipéptido antimicrobiano puede tener al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 % de homología de secuencia con la secuencia de proteína viral correspondiente. En algunas realizaciones, el polipéptido antimicrobiano puede tener al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 % de homología de secuencia con la secuencia de proteína viral correspondiente.
En otras realizaciones, el polipéptido antimicrobiano puede comprender o consistir en un péptido sintético correspondiente a una región, p.ej., una secuencia consecutiva de al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ó 60 aminoácidos del dominio de unión de una proteína de unión a la cápside. En algunas realizaciones, el polipéptido antimicrobiano puede tener al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 % de homología de secuencia con la secuencia correspondiente de la proteína de unión a cápside.
Los polipéptidos antimicrobianos descritos en esta invención pueden bloquear la dimerización de proteasas e inhibir la escisión de proproteínas virales (p.ej., procesamiento de VIH Gag-pol) en proteínas funcionales impidiendo así la liberación de uno o más virus envueltos (p.ej., HIV, HCV). En algunas realizaciones, el polipéptido antimicrobiano puede tener al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 % de homología de secuencia con la secuencia de proteína viral correspondiente.
En otras realizaciones, el polipéptido antimicrobiano puede comprender o consistir en un péptido sintético correspondiente a una región, p.ej., una secuencia consecutiva de al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ó 60 aminoácidos del dominio de unión de una proteína de unión a proteasa. En algunas realizaciones, el polipéptido antimicrobiano puede tener al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 % de homología de secuencia con la secuencia correspondiente de la proteína de unión a proteasa.
Los polipéptidos antimicrobianos descritos en esta invención pueden incluir un polipéptido desarrollado in vitro-, dirigido contra un patógeno viral.
Polipéptidos antimicrobianos
Los polipéptidos antimicrobianos (AMP) son péptidos pequeños de longitud, secuencia y estructura variables con actividad de amplio espectro contra una amplia gama de microorganismos que incluyen, entre otros, bacterias, virus, hongos, protozoos, parásitos, priones y células de tumor/cáncer. (Véase, por ejemplo, Zaiou, J Mol Med, 2007; 85:317; Se ha demostrado que los a Mp tienen un amplio espectro de inicio rápido de actividades destructoras, con niveles potencialmente bajos de resistencia inducida y amplios efectos antiinflamatorios concomitantes.
En algunas realizaciones, el polipéptido antimicrobiano (p.ej., un polipéptido antibacteriano) puede tener menos de 10kDa, p.ej., menos de 8kDa, 6kDa, 4kDa, 2kDa, o 1kDa. En algunas realizaciones, el polipéptido antimicrobiano (p. ej., un polipéptido antibacteriano) consiste en aproximadamente 6 a aproximadamente 100 aminoácidos, p. ej., de aproximadamente 6 a aproximadamente 75 aminoácidos, aproximadamente 6 a aproximadamente 50 aminoácidos, aproximadamente 6 a aproximadamente 25 aminoácidos, aproximadamente 25 a aproximadamente 100 aminoácidos, aproximadamente 50 a aproximadamente 100 aminoácidos o aproximadamente 75 a aproximadamente 100 aminoácidos. En determinadas realizaciones, el polipéptido antimicrobiano (por ejemplo, un polipéptido antibacteriano) puede consistir en aproximadamente 15 a aproximadamente 45 aminoácidos. En algunas realizaciones, el polipéptido antimicrobiano (por ejemplo, un polipéptido antibacteriano) es sustancialmente catiónico.
En algunas realizaciones, el polipéptido antimicrobiano (p.ej., un polipéptido antibacteriano) puede ser sustancialmente anfipático. En determinadas realizaciones, el polipéptido antimicrobiano (por ejemplo, un polipéptido antibacteriano) puede ser sustancialmente catiónico y anfipático. En algunas realizaciones, el polipéptido antimicrobiano (por ejemplo, un polipéptido antibacteriano) puede ser citostático para una bacteria Gram-positiva. En algunas realizaciones, el polipéptido antimicrobiano (por ejemplo, un polipéptido antibacteriano) puede ser citotóxico para una bacteria Grampositiva. En algunas realizaciones, el polipéptido antimicrobiano (porejemplo, un polipéptido antibacteriano) puede ser citostático y citotóxico para una bacteria Gram-positiva. En algunas realizaciones, el polipéptido antimicrobiano (por ejemplo, un polipéptido antibacteriano) puede ser citostático para una bacteria Gram-negativa. En algunas realizaciones, el polipéptido antimicrobiano (por ejemplo, un polipéptido antibacteriano) puede ser citotóxico para una bacteria Gram-negativa. En algunas realizaciones, el polipéptido antimicrobiano (por ejemplo, un polipéptido antibacteriano) puede ser citostático y citotóxico para una bacteria Gram-positiva. En algunas realizaciones, el polipéptido antimicrobiano puede ser citostático para un virus, hongo, protozoo, parásito, prión o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el polipéptido antimicrobiano puede ser citotóxico para un virus, hongo, protozoo, parásito, prión o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el polipéptido antimicrobiano puede ser citostático y citotóxico para un virus, hongo, protozoo, parásito, prión o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el polipéptido antimicrobiano puede ser citotóxico para un tumor o una célula cancerosa (p. ej., un tumor humano y/o célula cancerosa). En algunas realizaciones, el polipéptido antimicrobiano puede ser citostático para un tumor o una célula cancerosa (p. ej., un tumor humano y/o célula cancerosa). En algunas realizaciones, el polipéptido antimicrobiano puede ser citotóxico y citostático para un tumor o una célula cancerosa (p. ej., un tumor humano yo célula cancerosa). En algunas realizaciones, el polipéptido antimicrobiano (por ejemplo, un polipéptido antibacteriano) puede ser un polipéptido secretado.
En algunas realizaciones, el polipéptido antimicrobiano comprende o consiste en una defensina. Ejemplos de defensinas Incluyen, pero no se limitan a, a-defensinas (por ejemplo, defensina de neutrófilos 1, defensina alfa 1, defensina de neutrófilos 3, defensina de neutrófilos 4, defensina 5, defensina 6), p-defensinas (por ejemplo, betadefensina 1, beta-defensina 2, beta-defensina 103, beta-defensina 107, beta-defensina 110, beta-defensina 136) y 0-defensinas. En otras realizaciones, el polipéptido antimicrobiano comprende o consiste en una catelicidina (por ejemplo, hCAP18).
Polipéptidos anti-virales
Los polipéptidos antivirales (AVP) son pequeños péptidos de longitud, secuencia y estructura variables con actividad de amplio espectro contra una amplia gama de virus. Véase, por ejemplo, Zaiou, J Mol Med, 2007; 85:317. Se ha demostrado que los AVP tienen un amplio espectro de inicio rápido de actividades destructoras, con niveles potencialmente bajos de resistencia inducida y amplios efectos antiinflamatorios concomitantes. En algunas realizaciones, el polipéptido antiviral está por debajo de 10 kDa, por ejemplo, por debajo de 8 kDa, 6 kDa, 4 kDa, 2 kDa o 1 kDa. En algunas realizaciones, el polipéptido antiviral comprende o consiste en aproximadamente 6 a aproximadamente 100 aminoácidos, p. ej., de aproximadamente 6 a aproximadamente 75 aminoácidos, aproximadamente 6 a aproximadamente 50 aminoácidos, aproximadamente 6 a aproximadamente 25 aminoácidos, aproximadamente 25 a aproximadamente 100 aminoácidos, aproximadamente 50 a aproximadamente 100 aminoácidos o aproximadamente 75 a aproximadamente 100 aminoácidos. En determinadas realizaciones, el polipéptido antiviral comprende o consiste en aproximadamente 15 a aproximadamente 45 aminoácidos. En algunas realizaciones, el polipéptido antiviral es sustancialmente catiónico. En algunas realizaciones, el polipéptido antiviral es sustancialmente anfipático. En determinadas realizaciones, el polipéptido antiviral es sustancialmente catiónico y anfipático. En algunas realizaciones, el polipéptido antiviral es citostático para un virus. En algunas realizaciones, el polipéptido antiviral es citotóxico a un virus. En algunas realizaciones, el polipéptido antiviral es citostático y ncitotóxico para un virus. En algunas realizaciones, el polipéptido antiviral es citostático para una bacteria, hongo, protozoo, parásito, prión o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el polipéptido antiviral es citotóxico para una bacteria, hongo, protozoo, parásito, prión o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el polipéptido antiviral es citostático y citotóxico para una bacteria, hongo, protozoo, parásito, prión o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el polipéptido antiviral es citotóxico para un tumor o una célula cancerosa (por ejemplo, una célula cancerosa humana). En algunas realizaciones, el polipéptido antiviral es citostático para un tumor o una célula cancerosa (p. ej., una célula cancerosa humana). En algunas realizaciones, el polipéptido antiviral es citotóxico y citostático para un tumor o una célula cancerosa (p. ej., una célula cancerosa humana). En algunas realizaciones, el polipéptido antiviral es un polipéptido secretado.
Nucleósidos citotóxicos
En una realización, los polinucleótidos de la presente invención (i.e, polinucleótidos que codifican antígenos incluidos en las VAN de la invención) pueden incorporar uno o más nucleósidos citotóxicos. Por ejemplo, se pueden incorporar nucleósidos citotóxicos en polinucleótidos tales como ARN o ARNm modificados bifuncionales. Agentes anti-cáncer de nucleósidos citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, arabinósido de adenosina, citarabina, arabinósido de citosina, 5-fluorouracilo, fludarabina, floxuridina, ftorafur® (una combinación de tegafur y uracilo), tegafur ((RS) -5-fluoro -1-(tetrahidrofuran-2-il) pirimidin-2,4 (1H, 3H) -diona) y 6-mercaptopurina.
Varios análogos de nucleósidos citotóxicos están en uso clínico, o han sido objeto de ensayos clínicos, como agentes contra el cáncer. Ejemplos de tales análogos incluyen, pero no se limitan a, citarabina, gemcitabina, troxacitabina, decitabina, tezacitabina, 2'-desoxi-2'-metilidencitidina (DMDC), cladribina, clofarabina, 5-azacitidina, 4'-tio-aracitidina, ciclopentenilcitosina y 1-(2-C-ciano-2-desoxi-beta-D-arabino-pentofuranosil) -citosina. Otro ejemplo de tal compuesto es el fosfato de fludarabina. Estos compuestos pueden administrarse sistémicamente y pueden tener efectos secundarios que son típicos de los agentes citotóxicos tales como, pero sin limitarse a, poca o ninguna especificidad para las células tumorales sobre las células normales en proliferación.
También se describen en la técnica varios profármacos de análogos de nucleósidos citotóxicos. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, N4-behenoil-1-beta-D-arabinofuranosilcitosina, N4-octadecil-1-beta-D-arabinofuranosilcitosina, N4-palmitoil-1- (2-C-ciano-2-desoxi- beta-D-arabino-pentofuranosil) citosina y P-4055 (éster de ácido 5'-elaídico de citarabina). En general, estos profármacos pueden convertirse en fármacos activos principalmente en el hígado y la circulación sistémica y mostrar poca o ninguna liberación selectiva del fármaco activo en el tejido tumoral. Por ejemplo, la capecitabina, un profármaco de 5'-desoxi-5-fluorocitidina (y eventualmente de 5-fluorouracilo), se metaboliza tanto en el hígado como en el tejido tumoral. Una serie de análogos de capecitabina que contienen "un radical fácilmente hidrolizable en condiciones fisiológicas» han sido reivindicados por Fujiu y col. (Pat. EE. UU. No. 4.966.891)
La serie descrita por Fujiu incluye N4 alquil y aralquil carbamatos de 5'-desoxi-5-fluorocitidina y la implicación de que estos compuestos se activarán por hidrólisis en condiciones fisiológicas normales para proporcionar 5'-desoxi-5-fluorocitidina.
Una serie de N4-carbamatos de citarabina ha sido informada por Fadl y col (Pharmazie. 1995, 50, 382- 7,) en los que se diseñaron compuestos para convertirse en citarabina en el hígado y el plasma.WO 2004/041203, describe profármacos de gemcitabina, donde algunos de los profármacos son carbamatos N4. Estos compuestos se diseñaron para superar la toxicidad gastrointestinal de la gemcitabina y estaban destinados a proporcionar gemcitabina mediante liberación hidrolítica en el hígado y el plasma después de la absorción del profármaco intacto del tracto gastrointestinal.Nomura y col (Bioorg Med. Chem. 2003, 11, 2453-61,) han descrito derivados acetales de 1- (3-C-etinil-p-D-ribo-pentofaranosil) citosina que, en biorreducción, produjo un intermedio que requirió hidrólisis adicional en condiciones ácidas para producir un compuesto nucleósido citotóxico.
Los nucleótidos citotóxicos que pueden ser quimioterapéuticos también incluyen, pero no se limitan a, pirazolo [3,4-D]-pirimidinas, alopurinol, azatioprina, capecitabina, arabinósido de citosina, fluorouracilo, mercaptopurina, 6-tioguanina, aciclovir, ara-adenosina, ribavirina, 7-deaza-adenosina, 7-deaza-guanosina, 6-aza-uracilo, 6-aza-citidina, timidina ribonucleótido, 5-bromodesoxiuridina, 2-cloropurina e inosina, o combinaciones de los mismos.
Polinucleótidos que tienen regiones no traducidas (UTR)
Los polinucleótidos de la presente invención (i.e. polinucleótidos que codifican antígenos presentados en las VAN de la invención) pueden comprender una o más regiones o partes que actúan o funcionan como una región no traducida. Cuando los polinucleótidos se diseñan para codificar al menos un polipéptido de interés, los polinucleótidos pueden comprender una o más de estas regiones no traducidas.
Las regiones no traducidas (UTR) de un gen se transcriben pero no se traducen. En ARNm, a UTR 5' comienza en el sitio de inicio de la transcripción y continúa hasta el codón de inicio, pero no incluye el codón de inicio; mientras que la UTR 3’ comienza inmediatamente después del codón de parada y continúa hasta la señal de terminación de la transcripción. Existe un cuerpo creciente de evidencia sobre las funciones reguladoras que desempeñan las UTR en términos de estabilidad de la molécula de ácido nucleico y traducción. Las características reguladoras de una UTR se pueden incorporar en los polinucleótidos de la presente invención para, entre otras cosas, mejorar la estabilidad de la molécula. Las características específicas también se pueden incorporar para asegurar una regulación hacia abajo controlada de la transcripción en caso de que estén mal dirigidas a sitios de órganos no deseados.
Las tablas 19 y 20 proporcionan una lista de UTR ejemplares que pueden utilizarse en los polinucleótidos de la presente invención. En la Tabla 19 se muestra una lista de una región 5' sin traducir de la invención. Pueden utilizarse variantes de UTR 5' donde se añaden o eliminan uno o más nucleótidos en los extremos, incluidos A, T, C o G. Tabla 19. 5'-Re iones no traducidas
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En la Tabla 20 se muestra una lista de regiones 3’ sin traducir de la invención. Pueden utilizarse variantes de UTR 3' donde se añaden o eliminan uno o más nucleótidos en los extremos, incluidos A, T, C o G.
Tabla 20. 3'-Re iones no traducidas
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UTR 5' e inicio de traducción
Las UTR 5’ naturales tienen características que desempeñan un papel en el inicio e la traducción. Albergan firmas como las secuencias de Kozak, que comúnmente se sabe que están involucradas en el procedimiento por el cual el ribosoma inicia la traducción de muchos genes. Las secuencias de Kozak tienen el consenso CCR(A/G)CCAUGG, donde R es una purina (adenina o guanina) tres bases corriente arriba del codón de inicio (AUG), que va seguido de otra "G". También se sabe que la UTR 5’ forma estructuras secundarias que están implicadas en la unión del factor de alargamiento.
Mediante la ingeniería de las características que se encuentran típicamente en genes abundantemente expresados de órganos diana específicos, se puede mejorar la estabilidad y la producción de proteínas de los polinucleótidos de la invención. Por ejemplo, introducción de UTR 5' de ARNm expresado en hígado, como albúmina, amiloide A sérico, Apolipoproteína A/B/E, transferrina, alfafetoproteína, eritropoyetina o Factor VIII podrían usarse para mejorar la expresión de una molécula de ácido nucleico, como polinucleótidos en líneas de células hepáticas o en el hígado. Asimismo, es posible el uso de UTR 5' de otro ARNm específico de tejido para mejorar la expresión en ese tejido: para músculo (MyoD, miosina, mioglobina, miogenina, herculina), para células endoteliales (Tie-1, CD36), para células mieloides (C/EBP, AML1, G-CSF, GM-CSF, CD11b, MSR, Fr-1, i-NOS), para leucocitos (CD45, CD18), para tejido adiposo (CD36, GLUT4, ACRP30, adiponectina) y para células epiteliales pulmonares (SP-A/B/c /d ).
Las regiones no traducidas útiles en el diseño y fabricación de polinucleótidos (i.e. polinucleótidos que codifican antígenos incluidos en las VAN de la invención) incluyen, entre otras, las descritas en la Solicitud Provisional de EE. UU. co-pendiente y copropiedad (USSN) 61/829.372 Solicitud provisional de EE. UU. 61/829.372 (USSN) y Solicitud internacional, PCT/US 14/21522 depositada el 7 de marzo de 2014,
También pueden usarse otras secuencias que no sean UTR como regiones o subregiones dentro de los polinucleótidos. Por ejemplo, se pueden incorporar intrones o porciones de secuencias de intrones en regiones de los polinucleótidos de la invención. La incorporación de secuencias intrónicas puede incrementar la producción de proteínas así como los niveles de polinucleótidos.
Las combinaciones de características pueden incluirse en regiones flanqueantes y pueden estar contenidas dentro de otras características. Por ejemplo, el ORF puede estar flanqueado por una UTR 5' que puede contener una fuerte señal de inicio de la traducción de Kozak y/o una UTR 3’ que puede incluir una secuencia de oligo(dT) para la adición de plantilla de una cola poli-A. 5'UTR puede comprender un primer fragmento de polinucleótido y un segundo fragmento de polinucleótido del mismo y/o diferentes genes, como los 5'UTR descritos en la Publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. 20100293625,
Solicitud provisional de EE. UU. (USSN) en tramitación conjunta y en copropiedad 61/829.372 y Solicitud provisional de EE. UU. 61/829.372 (USSN) proporciona una lista de UTR ejemplares que pueden utilizarse en el polinucleótido de la presente invención como regiones flanqueantes. Pueden utilizarse variantes de UTR 5' o 3' donde se añaden o eliminan uno o más nucleótidos en los extremos, incluidos A, T, C o G.
Debe entenderse que cualquier UTR de cualquier gen puede incorporarse en las regiones del polinucleótido. Además, se pueden utilizar múltiples UTR de tipo silvestre de cualquier gen conocido. También está dentro del alcance de la presente invención proporcionar UTR artificiales que no sean variantes de regiones de tipo salvaje. Estas UTR o partes de las mismas pueden colocarse en la misma orientación que en la transcripción de la que fueron seleccionados o pueden estar alteradas en orientación o ubicación. Por tanto, una UTR 5' o 3' puede invertirse, acortarse, alargarse, hacerse quimérica con una o más de otras UTR 5' o UTR 3'. Tal como se usa en esta invención, el término "alterado" en lo que se refiere a una secuencia UTR, significa que la UTR se ha cambiado de alguna manera en relación con una secuencia de referencia. Por ejemplo, una UTR 3' o 5' puede alterarse con respecto a una UTR de tipo natural o nativa por el cambio en la orientación o ubicación como se enseñó anteriormente o puede ser alterada por la inclusión de nucleótidos adicionales, deleción de nucleótidos, intercambio o transposición de nucleótidos. Cualquiera de estos cambios que produzcan una UTR "alterada" (ya sea 3' o 5') comprende una UTR variante.
En una realización, se puede utilizar una UTR doble, triple o cuádruple, como una UTR 5' o 3'. Tal como se usa en esta invención, una UTR "doble" es aquella donde dos copias de la misma UTR están codificadas en serie o sustancialmente en serie. Por ejemplo, se puede usar una UTR 3' doble beta-globina como se describe en la Publicación de patente de EE.UU. 20100129877.
También está dentro del alcance de la presente invención tener UTR con patrones. Tal como se usa en esta invención, "UTR con patrón" son aquellas UTR que reflejan un patrón repetido o alterno, como ABABAB o AABBAABBAABB o ABCABCABC o variantes de los mismos repetidos una, dos o más de 3 veces. En estos patrones, cada letra, A, B o C representa una UTR diferente a nivel de nucleótidos.
En otra realización, las regiones flanqueantes pueden seleccionarse de entre una familia de transcripciones cuyas proteínas comparten una función, estructura y característica de propiedad comunes. Por ejemplo, polipéptidos de interés pueden pertenecer a una familia de proteínas que se expresan en una célula, tejido particular o en algún momento durante el desarrollo. Las UTR de cualquiera de estos genes pueden intercambiarse por cualquier otra UTR de la misma familia de proteínas o de una diferente para crear un nuevo polinucleótido. Tal como se usa en esta invención, una "familia de proteínas" se usa en el sentido más amplio para referirse a un grupo de dos o más polipéptidos de interés que comparten al menos una función, estructura, característica, localización, origen o patrón de expresión.
La región no traducida también puede incluir elementos potenciadores de la traducción (TEE). Como ejemplo no limitativo, el TEE puede incluir los descritos en la Solicitud de EE.UU. N° 2009022647, y los conocidos en la técnica.
UTR 3’ y los elementos ricos en A U
Se sabe que las UTR 3' naturales o de tipo salvaje tienen tramos de adenosinas y uridinas incrustadas en ellas. Estas firmas ricas en AU son particularmente frecuentes en genes con altas tasas de rotación. Según sus características de secuencia y propiedades funcionales, los elementos ricos en AU (ARE - AU Rich Elements) se pueden separar en tres clases (Chen y col, 1995): Los ARE de clase I contienen varias copias dispersas de un motivo AUUUA dentro de regiones ricas en U. C-Myc y MyoD contienen ARE de clase I. Los ARE de Clase II poseen dos o más nonámeros UUAUUUA(U/A)(U/A) que se solapan. Las moléculas que contienen este tipo de ARE incluyen GM-CSF y TNF-a. Los ARES de clase III están menos definidos. Estas regiones ricas en U no contienen un motivo AUUUA. c-Jun y Myogenin son dos ejemplos bien estudiados de esta clase. Se sabe que la mayoría de las proteínas que se unen a los ARE desestabilizan al mensajero, mientras que se ha documentado que los miembros de la familia ELAV, sobre todo HuR, aumentan la estabilidad del ARNm. HuR se une a los ARE de las tres clases. La ingeniería de los sitios de unión específicos de HuR en la UTR 3' de las moléculas de ácido nucleico conducirá a la unión de HuR y, por lo tanto, a la estabilización del mensaje in vivo.
La introducción, eliminación o modificación de elementos ricos en 3'UTR AU (ARE) se puede usar para modular la estabilidad de polinucleótidos de la invención (i.e., polinucleótidos que codifican antígenos incluidos en las VAN de la invención). Cuando se manipulan polinucleótidos específicos, se pueden introducir una o más copias de un ARE para hacer que los polinucleótidos de la invención sean menos estables y de ese modo acortar la traducción y disminuir la producción de la proteína resultante. Asimismo, los ARE se pueden identificar y eliminar o mutar para aumentar la estabilidad intracelular y así aumentar la traducción y producción de la proteína resultante. Experimentos de transfección se pueden realizar en líneas celulares relevantes, usando polinucleótidos de la invención y la producción de proteínas se puede ensayar en varios puntos de tiempo después de la transfección. Por ejemplo, las células se pueden transfectar con diferentes moléculas de ingeniería de ARE y usando un kit ELISA para proteína relevante y la proteína de ensayo producida a las 6 h, 12 h, 24 h, 48 h y 7 días después de la transfección.Sitios de unión a microARN
Un microARN (o miARN) es un ARN no codificante de 19--25 nucleótidos de longitud que se une a la UTR 3' de las moléculas de ácido nucleico y regula negativamente la expresión génica, ya sea reduciendo la estabilidad de la molécula de ácido nucleico o inhibiendo la traducción. Los polinucleótidos de la invención (esdecir, polinucleótidos que codifican antígenos presentados en las VAN de la invención) pueden comprender una o más secuencias diana de microARN, secuencias de microARN o semillas de microARN. Dichas secuencias pueden corresponder a cualquier microARN conocido, como los que se enseñan en la Publicación de los EE.UU. US2005/0261218 y la Publicación de los EE.UU. US2005/0059005.
Una secuencia de microARN comprende una región "semilla", es decir, una secuencia en la región de posiciones 2-­ 8 del microARN maduro, cuya secuencia tiene una complementariedad de Watson-Crick perfecta con la secuencia diana de miARN. Una semilla de microARN puede comprender las posiciones 2--8 o 2--7 de un microARN maduro. En algunas realizaciones, una semilla de microARN puede comprender 7 nucleótidos (p. ej., los nucleótidos 2-8 del microARN maduro), donde el sitio complementario de la semilla en la diana de miARN correspondiente está flanqueado por una adenina (A) opuesta a la posición 1 del microARN. En algunas realizaciones, una semilla de microARN puede comprender 6 nucleótidos (p. ej., los nucleótidos 2-7 del microARN maduro), donde el sitio complementario de la semilla en la diana de miARN correspondiente está flanqueado por una adenina (A) opuesta a la posición 1 del microARN. Véase, por ejemplo, Grimson A, Farh KK, Johnston WK, Garrett-Engele P, Lim LP, Bartel d P; Mol Cell. 2007 Jul 6;27(1):91-105; Las bases de la semilla de microARN tienen una completa complementariedad con la secuencia diana. Mediante la ingeniería de secuencias diana de microARN en los polinucleótidos (p. ej., en una región similar a 3'UTR u otra región) de la invención, se puede dirigir la molécula para degradación o traducción reducida, siempre que el microARN en cuestión esté disponible. Este procedimiento reducirá el riesgo de efectos fuera de diana sobre el suministro de moléculas de ácido nucleico. Se ha informado sobre la identificación de microARN, regiones diana de microARN y sus patrones de expresión y función en biología (Bonauer y col., Curr Drug Targets 2010 11:943--949; Anand y Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176; Contreras y Rao Leukemia 201226:404--413 (20 de diciembre de 2011 doi: 10.1038/leu.2011.356); Bartel Cell 2009 136:215--233; Landgraf y col., Cell, 2007 129:1401 —1414).
Por ejemplo, si la molécula de ácido nucleico es un ARNm y no está destinada a ser entregada al hígado pero termina allí, a continuación miR-122, un microARN abundante en el hígado, puede inhibir la expresión del gen de interés si se diseñan uno o múltiples sitios diana de miR-122 en la región UTR 3' de los polinucleótidos. La introducción de uno o múltiples sitios de unión para diferentes microARN se puede diseñar para disminuir aún más la longevidad, estabilidad y traducción de proteínas de polinucleótidos.
Tal como se usa en esta invención, el término "sitio de microARN" se refiere a un sitio diana de microARN o un sitio de reconocimiento de microARN, o cualquier secuencia de nucleótidos a la que un microARN se une o se asocia. Debe entenderse que la "unión" puede seguir las reglas tradicionales de hibridación de Watson-Crick o puede reflejar cualquier asociación estable del microARN con la secuencia diana en o de manera adyacente al sitio de microARN.
A la inversa, para los propósitos de los polinucleótidos de la presente invención, los sitios de unión de microARN pueden diseñarse a partir de (es decir, eliminarse de) secuencias donde se producen naturalmente para aumentar la expresión de proteínas en tejidos específicos. Por ejemplo, los sitios de unión de miR-122 pueden eliminarse para mejorar la expresión de proteínas en el hígado. La regulación de la expresión en múltiples tejidos se puede lograr mediante la introducción o eliminación o uno o varios sitios de unión de microARN.
Ejemplos de tejidos en los que se sabe que los microARN regulan el ARNm y, por lo tanto, la expresión de proteínas incluyen, entre otros, hígado (miR-122), músculo (miR-133, miR-206, miR-208), células endoteliales (miR -17-92, miR-126), células mieloides (miR-142-3p, miR-142-5p, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27), tejido adiposo (deje -7, miR-30c), corazón (miR-1d, miR-149), riñón (miR-192, miR-194, miR-204) y células epiteliales de pulmón (let-7, miR-133, miR-126 ). El microARN también puede regular procedimientos biológicos complejos como la angiogénesis (miR-132) (Anand y Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176).
Los perfiles de expresión, microARN y líneas celulares útiles en la presente invención incluyen aquellos enseñados en, por ejemplo,Solicitudes Provisionales de EE. UU. 61/857.436 y 61/857.304 cada una depositada el 23 de julio de 2013,
En los polinucleótidos de la presente invención, los sitios de unión para los microARN que están implicados en dichos procedimientos pueden eliminarse o introducirse para adaptar la expresión de los polinucleótidos a tipos celulares biológicamente relevantes o al contexto de procedimientos biológicos relevantes. Una lista de secuencias de microARN, miR y sitios de unión a miR es mostrada en la Tabla 9 de la Solicitud provisional de EE. UU. n.° 61/753.661 depositada el 17 de enero de 2013, en la Tabla 9 de la Solicitud provisional de Ee . UU. N.° 61/754.159 depositada el 18 de enero de 2013, y en la Tabla 7 de la Solicitud Provisional de EE. UU. No. 61/758,921 depositada el 31 de enero de 2013,
Se enumeran ejemplos del uso de microARN para impulsar la expresión de genes específicos de enfermedades o tejidos (Getner y Naldini, Tissue Antigens. 2012, 80:393-403; Además, los sitios de semillas de microARN se pueden incorporar al ARNm para disminuir la expresión en ciertas células, lo que da como resultado una mejora biológica. Un ejemplo de esto es la incorporación de sitios miR-142 en un vector lentiviral que expresa UGT1A1. La presencia de sitios de semillas de miR-142 redujo la expresión en las células hematopoyéticas y, como consecuencia, redujo la expresión en las células presentadoras de antígenos, lo que provocó la ausencia de una respuesta inmune contra la UGT1A1 expresada viralmente (Schmitt y col., Gastroenterology 2010; 139:999-1007; González-Asequinolaza y col. Gastroenterology 2010, 139:726-729; La incorporación de sitios miR-142 en ARNm modificado no solo podría reducir la expresión de la proteína codificada en células hematopoyéticas, sino que también podría reducir o abolir las respuestas inmunes a la proteína codificada por ARNm. La incorporación de sitios semilla de miR-142 (uno o múltiples) en el ARNm sería importante en el caso del tratamiento de pacientes con deficiencias proteicas completas (UGT1A1 tipo I, pacientes con deficiencia de LDLR, pacientes con Pompe negativos a CRIM, etc.).
Por último, a través de la comprensión de los patrones de expresión de microARN en diferentes tipos de células, los polinucleótidos (i.e los polinucleótidos que codifican antígenos que aparecen en las VAN de la invención) pueden diseñarse para una expresión más específica en tipos celulares específicos o solo bajo condiciones biológicas específicas. Mediante la introducción de sitios de unión de microARN específicos de tejido, podrían diseñarse polinucleótidos que serían óptimos para la expresión de proteínas en un tejido o en el contexto de una condición biológica.
Experimentos de transfección se pueden realizar en líneas celulares relevantes, utilizando polinucleótidos modificados y la producción de proteínas se puede analizar en varios puntos de tiempo después de la transfección. Por ejemplo, las células se pueden transfectar con diferentes polinucleótidos de ingeniería del sitio de unión de microARN, construcciones primarias y mediante el uso de un kit ELISA para proteína relevante y la proteína de ensayo producida a las 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 hr y 7 días después de la transfección.También se pueden realizar experimentos in vivo utilizando moléculas diseñadas en el sitio de unión de microARN para examinar cambios en la expresión específica de tejido de polinucleótidos formulados.
Regiones que tienen una capa 5‘
La estructura de capa 5' de un ARNm está involucrada en la exportación nuclear, aumentando la estabilidad del ARNm y se une a la proteína de unión a la capa de ARNm (CBP), que es responsable de la estabilidad del ARNm en la célula y la capacidad de traducción a través de la asociación de c Bp con la proteína de unión a poli(A) para formar la especie de ARNm cíclico maduro. La capa ayuda además a la eliminación de los intrones proximales 5' durante el empalme del ARNm.
Las moléculas de ARNm endógeno pueden estar protegidas en el extremo 5' generando un enlace 5'-ppp-5'-trifosfato entre un residuo terminal de la capa de guanosina y el nucleótido sentido transcrito en el extremo 5' de la molécula de ARNm. Esta capa de 5'-guanilato puede a continuación metilarse para generar un residuo de N7-metil-guanilato. Los azúcares ribosa de los nucleótidos transcritos de extremo y/o unteextremos del extremo 5' del ARNm pueden opcionalmente estar también 2'-O-metilados. El decapado 5' mediante hidrólisis y escisión de la estructura de capa de guanilato puede alcanzar a una molécula de ácido nucleico, como una molécula de ARNm, para su degradación.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos (i.e. los polinucleótidos que codifican antígenos incluidos en las VAN de la invención) pueden diseñarse para incorporar un resto de capa. Las modificaciones de los polinucleótidos de la presente invención pueden generar una estructura de capa no hidrolizable que impide el decapado y, por lo tanto, aumenta la vida media del ARNm. Debido a que la hidrólisis de la estructura de la capa requiere la escisión de los enlaces fosforodiéster 5'-ppp-5', se pueden usar nucleótidos modificados durante la reacción de protección. Por ejemplo, se puede usar una enzima de protección contra Vaccinia de New England Biolabs (Ipswich, MA) con nucleótidos de a-tioguanosina según las instrucciones del fabricante para crear un enlace fosforotioato en la capa 5'-ppp-5'. Pueden usarse nucleótidos de guanosina modificados adicionales tales como nucleótidos de a-metil-fosfonato y selenofosfato.
Las modificaciones adicionales incluyen, pero no se limitan a, 2'-O-metilación de los azúcares ribosa del extremo 5' y/o 5'-nucleótidos ante-extremos del ARNm (como se mencionó anteriormente) en el grupo 2'-hidroxilo del anillo de azúcar. Se pueden usar múltiples estructuras de capa 5' distintas para generar la capa 5' de una molécula de ácido nucleico, tal como una molécula de ARNm.
Análogos de capa, que en esta invención también se denominan análogos de capa sintética, capas químicas, análogos de capa química o análogos de capas estructurales o funcionales, difieren de las capas 5' naturales (es decir, endógenas, de tipo salvaje o fisiológicas) en su estructura química, manteniendo la función de capa. Análogos de capa pueden sintetizarse químicamente (es decir, no enzimáticamente) o enzimáticamente y/enlazados a un polinucleótido de la invención.
Por ejemplo, la capa Anti-Reverse Cap Analog (ARCA) (Análogo de Capa Anti-Inversa) contiene dos guaninas unidas por un grupo 5'-5'-trifosfato, donde una guanina contiene un grupo metilo N7 así como un grupo 3'-O-metilo (es decir, N7,3'-O-dimetil-guanosina-5'-trifosfato-5'-guanosina (m7G-3'mppp-G; que puede denominarse equivalentemente 3' O-m7G(5')ppp(5')G). El átomo 3'-O de la otra guanina, no modificada, se une al nucleótido extremo 5' del polinucleótido protegido. La guanina N7- y 3'-O-metilizada proporciona el resto extremo del polinucleótido protegido.
Otra capa ejemplar es mCAP, que es similar a ARCA pero tiene un grupo 2'-O-metilo en la guanosina (es decir, N7,2'-O-dimetil-guanosina-5'-trifosfato-5'-guanosina, m7Gm-ppp-G).
En una realización, la capa es un análogo de capa de dinucleótido. Como ejemplo no limitativo, el análogo de la capa de dinucleótidos puede modificarse en diferentes posiciones de fosfato con un grupo boranofosfato o un grupo fosforoselenoato, como los análogos de la capa de dinucleótidos descritos en la patente de EE.UU. N° US 8.519.110,
En otra realización, el capa es un análogo del capa que es una forma de dicucleótido N7-(4-clorofenoxietil) sustituido de un análogo del capa conocido en la técnica y/o descrito en esta invención. Ejemplos no limitantes de una forma de dicucleótido sustituido con N7-(4-clorofenoxietilo) de un análogo de capa incluyen un N7-(4-clorofenoxietil) -G (5') ppp (5') G y un N7- (4-clorofenoxietilo) -m3'-°G (5') ppp (5') G análogo de capa (Véase, por ejemplo, los diversos análogos de capa y los procedimientos de síntesis de análogos de capa descritos en Kore y col. Bioorganic & Medicinal Chemistry 2013 21:4570-4574 ). En otra realización, un análogo de capa de la presente invención es un análogo de 4-cloro/bromofenoxietil.
Mientras los análogos de capa permiten la protección concomitante de una molécula de ácido nucleico en una reacción de transcripción in vitro, hasta el 20 % de las transcripciones permanecen sin protección. Esto, así como las diferencias estructurales de un análogo de capa de las estructuras endógenas de la capa 5' de los ácidos nucleicos producidas por la maquinaria de transcripción celular endógena, pueden conducir a una competencia de traducción reducida y una estabilidad celular reducida.
Los polinucleótidos de la invención también se pueden bloquear después de la fabricación (ya sea IVT o síntesis química), usando enzimas, para generar estructuras de capa 5' más auténticas. Tal como se usa en esta invención, la frase "más auténtico" se refiere a una característica que refleja o imita, estructural o funcionalmente, una característica endógena o de tipo silvestre. Es decir, una característica "más auténtica" es mejor representativa de una función y/o estructura celular endógena, de tipo silvestre, natural o fisiológica en comparación con características sintéticas o análogas, etc., de la técnica anterior, o que supera a la característica endógena, de tipo silvestre, natural, o fisiológica correspondiente en uno o más aspectos. Ejemplos no limitantes de estructuras de capa 5' más auténticas de la presente invención son aquellas que, entre otras cosas, tienen una unión mejorada de las proteínas de unión a la capa, una vida media aumentada, una susceptibilidad reducida a las endonucleasas 5' y/o decapado 5' reducido, en comparación con las estructuras de capa 5' sintéticas conocidas en la técnica (o con una estructura de capa 5' de tipo salvaje, natural, o fisiológica). Por ejemplo, la enzima recombinante de protección contra el virus Vaccinia y la enzima 2'-O-metiltransferasa recombinante pueden crear un enlace 5'-5'-trifosfato canónico entre el nucleótido 5'-extremo de un ARNm y un nucleótido de capa de guanina donde la capa de guanina contiene una metilación de N7 y el nucleótido 5'-terminal del ARNm contiene un 2'-O-metilo. Esta estructura se denomina estructura Cap1. Esta capa da como resultado una mayor competencia de traducción y estabilidad celular y una activación reducida de citocinas proinflamatorias celulares, en comparación, por ejemplo, con otras estructuras análogas de capa 5' conocidas en la técnica. Las estructuras de capa incluyen 7mG(5')ppp(5')N, pN2p (capa 0), 7mG(5')ppp(5')NlmpNp (capa 1) y 7mG(5')-ppp(5')NlmpN2mp (capa 2).
Puede ser más efectiva ya que casi el 100 % de los polinucleótidos quiméricos pueden estar protegidos. Esto contrasta con ~80 % cuando un análogo de capa se une a un en el curso de una reacción de transcripción in vitro.
Según la presente invención, las capas de extremo 5' pueden incluir capas endógenas o análogos de capas. Según la presente invención, una capa de extremo 5' puede comprender un análogo de guanina. Análogos de guanina útiles incluyen, sin nlimitación, inosina, N1-metil-guanosina, 2'fluoro-guanosina, 7-deaza-guanosina, 8-oxo-guanosina, 2-amino-guanosina, LNA-guanosina y 2-azido-guanosina.
Secuencias virales
Secuencias virales adicionales como, entre otras, la secuencia potenciadora de la traducción del virus del enanismo amarillo de la cebada (BYDV-PAV), el retrovirus de la oveja Jaagsiekte (JSRV) y/o el virus del tumor nasal enzoótico (ver, por ejemplo, la Pub. Internacional No. WO2012129648;) pueden modificarse e insertarse en los polinucleótidos de la invención y pueden estimular la traducción de la construcción in vitro e in vivo.Experimentos de transfección se pueden realizar en líneas celulares relevantes y la producción de proteínas se puede ensayar mediante ELISA a las 12 h, 24 h, 48 h, 72 h y el día 7 después de la transfección.
Secuencias de IRES:
Además, se proporcionan polinucleótidos (i.e. polinucleótidos que codifican antígenos incluidos en las VAN de la invención) que pueden contener un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES). Identificado por primera vez como una característica del ARN del virus Picorna, el IRES desempeña un papel importante en el inicio de la síntesis de proteínas en ausencia de la estructura de la capa 5'. Un IRES puede actuar como el único sitio de unión al ribosoma, o puede servir como uno de los múltiples sitios de unión al ribosoma de un ARNm. Los polinucleótidos que contienen más de un sitio de unión al ribosoma funcional pueden codificar varios péptidos o polipéptidos que los ribosomas traducen de forma independiente ("moléculas de ácido nucleico multicistrónico"). Cuando los polinucleótidos se proporcionan con un IRES, además se proporciona opcionalmente una segunda región traducible. Ejemplos de secuencias de IRES que se pueden usar según la invención incluyen, sin limitación, las de picornavirus (p. ej., FMDV), virus de plagas (CFFV), virus de la polio (PV), virus de encefalomiocarditis (ECMV), virus de la fiebre aftosa (FMDV), virus de la hepatitis C (HCV), virus de la peste porcina clásica (CSFV), virus de la leucemia murina (MLV), virus de la inmunodeficiencia de los simios (VIS) o virus de la parálisis del grillo (CrPV).
Colas Poli-A
Durante el procesamiento del ARN, se puede agregar una cadena larga de nucleótidos de adenina (cola poli-A) a un polinucleótido, como moléculas de ARNm, para aumentar la estabilidad. Inmediatamente después de la transcripción, el extremo 3' del transcrito se puede escindir para liberar un hidroxilo 3'. A continuación, la polimerasa poli-A agrega una cadena de nucleótidos de adenina al ARN. El procedimiento, llamado poliadenilación, agrega una cola poli-A que puede tener entre, por ejemplo, aproximadamente 80 a aproximadamente 250 residuos de largo (SEQ ID NO: 2279), incluyendo aproximadamente 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 , 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 o 250 residuos de largo.
También se pueden agregar colas de PoliA después de que la construcción se exporta desde el núcleo.
Según la presente invención, los grupos extremos en la cola poli A pueden incorporarse para estabilización en polinucleótidos de la invención (i.e. polinucleótidos que codifican antígenos presentados en las RVAN de la invención). Los polinucleótidos de la presente invención pueden incluir colas hidroxilo des-3'. También pueden incluir restos estructurales o modificaciones de 2'-ometilo como enseñan Junjie Li, y col. (Current Biology, Vol. 15, 1501-1507, 23 de agosto de 2005,.
Los polinucleótidos de la presente invención (i.e. polinucleótidos que codifican antígenos presentados en las VAN de la invención) pueden diseñarse para codificar transcripciones con estructuras de cola de poliA alternativas que incluyen ARNm de histona. Según Norbury, “la uridilación de extremo también se ha detectado en ARNm de histonas dependientes de la replicación humana. Se cree que la rotación de estos ARNm es importante para la prevención de la acumulación de histonas potencialmente tóxicas tras la finalización o inhibición de la replicación del ADN cromosómico. Estos ARNm se distinguen por la falta de una cola poli(A) 3', cuya función es asumida por una estructura estable de tronco-bucle y su proteína de unión de tronco-bucle (SLBP) afín; este último realiza las mismas funciones que las de PABP en ARNm poliadenilados "(Norbury," Cytoplasmic RNA: a case of the tail wagging the dog", Nature Reviews Molecular Cell Biology; AOP, publicado en línea el 29 de agosto de 2013; doi:10.1038/nrm3645)
Las longitudes de cola de poli-A únicas proporcionan ciertas ventajas a los polinucleótidos de la presente invención (i.e. polinucleótidos que codifican antígenos incluidos en las VAN de la invención).
Generalmente, la longitud de una cola poli-A, cuando está presente, es mayor de 30 nucleótidos (SEQ ID NO: 2280) de longitud. En otra realización, la cola poli-A tiene más de 35 nucleótidos (SEQ ID NO: 2281) de longitud (por ejemplo, al menos o más de aproximadamente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.500 y 3.000 nucleótidos). En algunas realizaciones, el polinucleótido o región del mismo incluye de aproximadamente 30 a aproximadamente 3000 nucleótidos (p. ej., De 30 a 50, de 30 a 100, de 30 a 250, de 30 a 500, de 30 a 750, de 30 a 1000, de 30 a 1500, de 30 a 2000, de 30 a 2500, de 50 a 100, de 50 a 250, de 50 a 500, de 50 a 750, de 50 a 1000, de 50 a 1500, de 50 a 2000, de 50 a 2500, de 50 a 3000, de 100 a 500, de 100 a 750, de 100 a 1000, de 100 a 1500, de 100 a 2000, de 100 a 2500, de 100 a 3000, de 500 a 750, de 500 a 1000, de 500 a 1500, de 500 a 2000, de 500 a 2500, de 500 a 3000, de 1000 a 1500, de 1000 a 2000, de 1000 a 2500, de 1000 a 3000, de 1500 a 2.000, de 1.500 a 2.500, de 1.500 a 3.000, de 2.000 a 3.000, de 2.000 a 2.500 y de 2.500 a 3.000).
En una realización, la cola de poli-A se diseña en relación con la longitud del polinucleótido total o la longitud de una región particular del polinucleótido. Este diseño puede basarse en la longitud de una región codificante, la longitud de una característica o región particular o en la longitud del producto final expresado a partir de los polinucleótidos.
En este contexto, la cola poli-A puede ser 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 % mayor en longitud que el polinucleótido o característica del mismo. La cola poli-A también puede diseñarse como una fracción de los polinucleótidos a los que pertenece. En este contexto, la cola poli-A puede ser 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 % o más de la longitud total de la construcción, una región de construcción o la longitud total de la construcción menos la cola poli-A. Además, los sitios de unión diseñados y la conjugación de polinucleótidos para proteína de unión a Poli-A pueden mejorar la expresión.
Además, múltiples polinucleótidos distintos se pueden unir a la PABP (proteína de unión a Poli-A) a través del extremo 3' usando nucleótidos modificados en el extremo 3' de la cola poli-A. Experimentos de transfección se pueden realizar en líneas celulares relevantes y la producción de proteínas se puede ensayar mediante ELISA a las 12 h, 24 h, 48 h, 72 h y el día 7 después de la transfección.
En una rea lizac ión , los p o lin u c le ó tid o s de la p re sen te in ven c ión (i.e . p o lin u c le ó tid o s que cod ifica n a n tíg e n o s inc lu idos en las VAN de la invención) se diseñan para incluir una región de cuarteto poliA-G. El cuarteto G es una matriz cíclica con enlaces de hidrógeno de cuatro nucleótidos de guanina que pueden formarse mediante secuencias ricas en G tanto en el ADN como en el ARN. En esta realización, el cuarteto G se incorpora al final de la cola poli-A. El polinucleótido resultante se analiza en cuanto a estabilidad, producción de proteínas y otros parámetros, incluida la vida media en varios puntos de tiempo. Se ha descubierto que el cuarteto poliA-G da como resultado una producción de proteínas equivalente a al menos el 75 % de la observada usando una cola poli-A de 120 nucleótidos (SEQ ID NO: 2282) sola.
Región de codón de inicio
En algunas realizaciones, los polinucleótidos de la presente invención (i.e. polinucleótidos que codifican antígenos incluidos en las VAN de la invención) pueden tener regiones que son análogas o funcionan como una región de codón de inicio.
En una realización, la traducción de un polinucleótido puede iniciarse en un codón que no es el codón de inicio AUG. La traducción del polinucleótido puede iniciarse en un codón de inicio alternativo como, entre otros, ACG, AGG, AAG, CTG/CUG, GTG/GUG, ATA/AUA, ATT/AUU, TTG/UUG (ver Touriol y col. Biology of the Cell 95 (2003) 169-178 y Matsuda y Mauro PLoS ONE, 2010 5:11; ). Como ejemplo no limitante, la traducción de un polinucleótido comienza en el codón de inicio alternativo ACG. Como otro ejemplo no limitante, la traducción de polinucleótidos comienza en el codón de inicio alternativo CTG o CUG. Como otro ejemplo no limitante más, la traducción de un polinucleótido comienza en el codón de inicio alternativo GTG o GUG.
Se sabe que los nucleótidos que flanquean un codón que inicia la traducción, como, entre otros, un codón de inicio o un codón de inicio alternativo, afectan la eficiencia de la traducción, la longitud y/o la estructura del polinucleótido. (Véase, por ejemplo, Matsuda y Mauro PLoS ONE, 2010 5:11; ). Enmascarar cualquiera de los nucleótidos que flanquean un codón que inicia la traducción puede usarse para alterar la posición del inicio de la traducción, la eficiencia de la traducción, la longitud y/o estructura de un polinucleótido.
En una realización, se puede usar un agente de enmascaramiento cerca del codón de inicio o codón de inicio alternativo para enmascarar u ocultar el codón para reducir la probabilidad de iniciación de la traducción en el codón de inicio enmascarado o codón de inicio alternativo. Ejemplos no limitantes de agentes enmascaradores incluyen polinucleótidos de ácidos nucleicos bloqueados antisentido (LNA) y complejos de unión de exón (EJC) (véase, por ejemplo, Matsuda y Mauro que describen agentes enmascaradores, polinucleótidos LNA y EJC (PLoS ONE, 2010) 5:11);
En otra realización, se puede usar un agente de enmascaramiento para enmascarar un codón de inicio de un polinucleótido con el fin de aumentar la probabilidad de que la traducción se inicie en un codón de inicio alternativo.
En una realización, se puede usar un agente de enmascaramiento para enmascarar un primer codón de inicio o un codón de inicio alternativo con el fin de aumentar la posibilidad de que la traducción se inicie en un codón de inicio o un codón de inicio alternativo cadena abajo del codón de inicio enmascarado o codón de inicio alternativo.
En una realización, un codón de inicio o un codón de inicio alternativo puede estar ubicado dentro de un complemento perfecto para un sitio de unión de miR. El complemento perfecto de un sitio de unión miR puede ayudar a controlar la traducción, la longitud y/o estructura del polinucleótido similar a un agente de enmascaramiento. Como ejemplo no limitante, el codón de inicio o el codón de inicio alternativo puede estar ubicado en el medio de un complemento perfecto para un sitio de unión de miR-122. El codón de inicio o codón de inicio alternativo puede estar ubicado después del primer nucleótido, segundo nucleótido, tercer nucleótido, cuarto nucleótido, quinto nucleótido, sexto nucleótido, séptimo nucleótido, octavo nucleótido, noveno nucleótido, décimo nucleótido, undécimo nucleótido, duodécimo nucleótido, decimotercer nucleótido , decimocuarto nucleótido, decimoquinto nucleótido, decimosexto nucleótido, decimoséptimo nucleótido, decimoctavo nucleótido, decimonoveno nucleótido, vigésimo nucleótido o vigésimo primer nucleótido.
En otra realización, el codón de inicio de un polinucleótido puede eliminarse de la secuencia de polinucleótidos para que la traducción del polinucleótido comience en un codón que no es el codón de inicio. La traducción del polinucleótido puede comenzar en el codón que sigue al codón de inicio eliminado o en un codón de inicio corriente abajo o un codón de inicio alternativo. En un ejemplo no limitante, el codón de inicio ATG o AUG se elimina como los primeros 3 nucleótidos de la secuencia de polinucleótidos para que se inicie la traducción en un codón de inicio corriente abajo o un codón de inicio alternativo. La secuencia de polinucleótidos donde se eliminó el codón de inicio puede comprender además al menos un agente de enmascaramiento para el codón de inicio cadena abajo y/o codones de inicio alternativos para controlar o intentar controlar el inicio de la traducción, la longitud del polinucleótido y/o la estructura del polinucleótido.
Región de Codón de parada
En una rea lizac ión , los p o lin u c le ó tid o s de la p re sen te inven c ión (i.e. p o lin u c le ó tid o s que cod ifica n an tíg eno s inc lu idos en las VAN de la invención) pueden incluir al menos dos codones de parada antes de la región no traducida 3' (UTR). El codón de parada puede ser seleccionado de entre TGA, TAA y t Ag . En una realización, los polinucleótidos de la presente invención incluyen el codón de parada TGA y un codón de parada adicional. En una realización adicional, el codón de terminación de la adición puede ser TAA. En otra realización, los polinucleótidos de la presente invención incluyen tres codones de parada.
Secuencias señal
Los polinucleótidos de la invención (i.e. polinucleótidos que codifican antígenos incluidos en las VAN de la invención) también pueden codificar características adicionales que facilitan el tráfico de los polipéptidos a sitios terapéuticamente relevantes. Una de esas características que ayuda en el tráfico de proteínas es la secuencia señal. Tal como se usa en esta invención, una "secuencia señal" o "péptido señal" es un polinucleótido o polipéptido, respectivamente, que tiene una longitud de aproximadamente 9 a 200 nucleótidos (3-60 aminoácidos) que se incorpora en el extremo 5' (o extremo N) de la región codificante o polipéptido codificado, respectivamente. La adición de estas secuencias da como resultado el tráfico del polipéptido codificado al retículo endoplásmico a través de una o más vías secretoras. Algunos péptidos señal son escindidos de la proteína por la peptidasa señal después de que se transporten las proteínas.
Secuencias de señal adicionales que pueden utilizarse en esta invención incluyen las enseñadas, por ejemplo, en bases de datos como las que se encuentran en http://www.signalpeptide.de/ o http://proline.bic.nus.edu.sg/spdb/ o aquellas descritas en Patentes EE. UU. 8.124.379; 7.413.875 y 7.385.034.
Señales y sitios de escisión de proteínas
En realizaciones ejemplares, polipéptidos de la invención (i.e. polipéptidos antigénicos) pueden incluir varias señales y/o sitios de escisión de proteínas.
En una realización, los polipéptidos de la presente invención pueden incluir al menos una señal de escisión de proteína que contiene al menos un sitio de escisión de proteína. El sitio de escisión de la proteína puede estar ubicado en el extremo N, el extremo C, en cualquier espacio entre los extremos N y C tales como, pero no limitado a, a mitad de camino entre los extremos N y C, entre el extremo N y el punto medio, entre el punto medio y el extremo C, y combinaciones de los mismos.
En una realización, los polinucleótidos de la presente invención pueden diseñarse de manera que el polinucleótido contenga al menos una señal de escisión de proteína codificada. La señal de escisión de la proteína codificada puede ubicarse en cualquier región que incluye, entre otros, antes del codón de inicio, después del codón de inicio, antes de la región de codificación, dentro de la región de codificación, como, entre otros, a mitad de camino en la región de codificación, entre el codón de inicio y el punto medio, entre el punto medio y el codón de parada, después de la región codificante, antes del codón de parada, entre dos codones de parada, después del codón de parada y combinaciones de los mismos.
En una realización, los polinucleótidos de la presente invención pueden incluir al menos una señal de escisión de proteína codificada que contiene al menos un sitio de escisión de proteína. La señal de escisión de proteína codificada puede incluir, pero no se limita a, una proproteína convertasa (o prohormona convertasa), trombina y/o señal de escisión de proteína del factor Xa.
Como ejemplo no limigtativo, Pat. EE. UU. N° 7.374.930 y Pub. EE. UU. N° 20090227660, usan un sitio de escisión de furina para escindir la metionina del extremo N de GLP-1 en el producto de expresión del aparato de Golgi de las células. En una realización, los polipéptidos de la presente invención incluyen al menos una señal y/o sitio de escisión de proteína con la condición de que el polipéptido no sea GLP-1.
Inserciones y sustituciones
En realizaciones ejemplares, los polinucleótidos de la invención (i.e. los polinucleótidos que codifican antígenos incluidos en las VAN de la invención) pueden incluir varias sustituciones e/o inserciones.
En una realización, la 5'UTR del polinucleótido puede reemplazarse por la inserción de al menos una región y/o cadena de nucleósidos de la misma base. La región y/o la cadena de nucleótidos puede incluir, pero no se limita a, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7 o al menos 8 nucleótidos y los nucleótidos pueden ser naturales y/o antinatural. Como ejemplo no limitante, el grupo de nucleótidos puede incluir 5-8 adenina, citosina, timina, una cadena de cualquiera de los otros nucleótidos descritos en esta invención y/o combinaciones de los mismos.
En una realización, la 5'UTR del polinucleótido puede reemplazarse por la inserción de al menos dos regiones y/o cadenas de nucleótidos de dos bases diferentes tales como, entre otras, adenina, citosina, timina, cualquiera de las otras nucleótidos descritos en el presente documento y/o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, la 5'UTR puede reemplazarse insertando de 5 a 8 bases de adenina seguidas de la inserción de 5 a 8 bases de citosina. En otro ejemplo, la 5'UTR puede reemplazarse insertando de 5 a 8 bases de citosina seguidas de la inserción de 5 a 8 bases de adenina.
En una realización, el polinucleótido puede incluir al menos una sustitución y/o inserción cadena abajo del sitio de inicio de la transcripción que puede ser reconocido por una ARN polimerasa. Como ejemplo no limitativo, al menos una sustitución y/o la inserción puede producirse corriente abajo del sitio de inicio de la transcripción mediante la sustitución de al menos un ácido nucleico en la región justo debajo del sitio de inicio de la transcripción (tales como, pero no limitado a, 1 a 6). Los cambios en la región de nucleótidos justo debajo del sitio de inicio de la transcripción pueden afectar las tasas de inicio, aumentar los valores constantes de reacción de nucleótido trifosfato (NTP) aparente y aumentar la disociación de transcripciones cortas del complejo de transcripción que cura la transcripción inicial (Brieba y col, Biochemistry (2002) 41: 5144--5149). La modificación, sustitución y/o inserción de al menos un nucleósido puede provocar una mutación silenciosa de la secuencia o puede provocar una mutación en la secuencia de aminoácidos.
En una realización, el polinucleótido puede incluir la sustitución de al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10 , al menos 11, al menos 12 o al menos 13 bases de guanina corriente abajo del sitio de inicio de la transcripción.
En una realización, el polinucleótido puede incluir la sustitución de al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 6 bases de guanina en la región inmediatamente corriente abajo del sitio de inicio de la transcripción. Como ejemplo no limitativo, si los nucleótidos de la región son GGGAGA, las bases de guanina pueden estar sustituidas por al menos 1, al menos 2, al menos 3 o al menos 4 nucleótidos de adenina. En otro ejemplo no limitante, si los nucleótidos en la región son GGGAGA, las bases de guanina pueden estar sustituidas por al menos 1, al menos 2, al menos 3 o al menos 4 bases de citosina. En otro ejemplo no limitante, si los nucleótidos en la región son GGGAGA, las bases de guanina pueden estar sustituidas por al menos 1, al menos 2, al menos 3 o al menos 4 timina y/o cualquiera de los nucleótidos descritos en esta invención.
En una realización, el polinucleótido puede incluir al menos una sustitución y/o inserción corriente arriba del codón de inicio. En aras de la claridad, un experto en la técnica apreciaría que el codón de inicio es el primer codón de la región codificante de la proteína, mientras que el sitio de inicio de la transcripción es el sitio donde comienza la transcripción. El polinucleótido puede incluir, pero no se limita a, al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7 o al menos 8 sustituciones y/o inserciones de bases de nucleótidos. . Las bases de nucleótidos pueden insertarse o sustituirse en 1, al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 ubicaciones corriente arriba del codón de inicio. Los nucleótidos insertados y/o sustituido puede ser la misma base (por ejemplo, todo A o todo C o todo T o todo G), dos bases diferentes (por ejemplo, A y C, A y T, o C y T), tres bases diferentes (por ejemplo, A, C y T o A, C y T) o al menos cuatro bases diferentes. Como ejemplo no limitativo, la base de guanina corriente arriba de la región codificante en el polinucleótido puede sustituirse con adenina, citosina, timina o cualquiera de los nucleótidos descritos en esta invención. En otro ejemplo no limitativo, la sustitución de bases de guanina en el polinucleótido puede diseñarse para dejar una base de guanina en la región corriente abajo del sitio de inicio de la transcripción y antes del codón de inicio (ver Esvelt y col. Nature (2011) 472(7344):499-503;).
Como ejemplo no limitativo, se pueden insertar al menos 5 nucleótidos en 1 ubicación corriente abajo del sitio de inicio de la transcripción pero corriente arriba del codón de inicio y los al menos 5 nucleótidos pueden ser del mismo tipo de base.
Incorporación de moduladores de control postranscripcional
En una realización, los polinucleótidos de la presente invención (i.e. polinucleótidos que codifican antígenos incluidos en las VAN de la invención) pueden incluir al menos un modulador de control postranscripcional. Estos moduladores de control postranscripcional pueden ser, pero no se limitan a, moléculas pequeñas, compuestos y secuencias reguladoras. Como ejemplo no limitante, el control postranscripcional se puede lograr usando pequeñas moléculas identificadas por PTC Therapeutics Inc. (South Plainfield, NJ) usando su tecnología de cribado GEMS™ (Modulación de la expresión génica por medio de moléculas pequeñas).
El modulador de control postranscripcional puede ser un modulador de expresión génica que se selecciona mediante el procedimiento detallado en o un modulador de expresión génica descrito en la Publicación Internacional No. WO2006022712,.
Los procedimientos que identifican secuencias reguladoras de ARN involucradas en el control de la traducción se describen en la Publicación Internacional No. WO2004067728, procedimientos que identifican compuestos que modulan la expresión dependiente de la región no traducida de un gen se describen en la Publicación Internacional No. WO2004065561,.
En una realización, los polinucleótidos de la presente invención pueden incluir al menos un modulador de control postranscripcional ubicado en la 5' región y/o la región 3' no traducida de los polinucleótidos de la presente invención.
En o tra rea lizac ión , los p o lin u c le ó tid o s de la p re sen te inven c ión pueden in c lu ir al m enos un m o d u la d o r de con tro l posterior a la transcripción para modular la terminación prematura de la traducción Los moduladores de control de postranscripción pueden ser compuestos descritos en o un compuesto encontrado mediante procedimientos descritos en la Publicación Internacional No. WO2004010106, WO2006044456, WO2006044682, WO2006044503 y WO2006044505,. Como ejemplo no limitante, el compuesto puede unirse a una región del ARN ribosómico 28S para modular la terminación prematura de la traducción (véase, por ejemplo, WO2004010106,).
En una realización, los polinucleótidos de la presente invención pueden incluir al menos un modulador de control post­ transcripción para alterar la expresión de proteínas. Como ejemplo no limitativo, la expresión de VEGF puede regularse usando los compuestos descritos en o un compuesto encontrado por los procedimientos descritos en las Publicaciones internacionales No. WO2005118857, WO2006065480, WO2006065479 y WO2006058088,.
Los polinucleótidos de la presente invención pueden incluir al menos un modulador de control posterior a la transcripción para controlar la traducción. En una realización, el modulador de control posterior a la transcripción puede ser una secuencia reguladora de ARN. Como ejemplo no limitante, la secuencia reguladora de ARN puede identificarse mediante los procedimientos descritos en la Publicación Internacional No. WO2006071903,.
OPtimización de codones
Los polinucleótidos contenidos en las VAN de la invención, sus regiones o partes o subregiones pueden tener codones optimizados. Los procedimientos de optimización de codones se conocen en la técnica y pueden ser útiles en los esfuerzos por lograr uno o más de varios objetivos. Estos objetivos incluyen hacer coincidir las frecuencias de los codones en los organismos diana y huésped para garantizar el plegamiento adecuado, sesgar el contenido de GC para aumentar la estabilidad del ARNm o reducir las estructuras secundarias, minimizar los codones repetidos en tándem o las corridas de bases que pueden afectar la construcción o expresión de genes, personalizar las regiones de control transcripcional y traduccional, insertar o eliminar secuencias de tráfico de proteínas, eliminar/agregar sitios de modificación posterior a la traducción en la proteína codificada (por ejemplo, sitios de glicosilación), agregar, eliminar o barajar dominios de proteínas, insertar o eliminar sitios de restricción, modificar sitios de unión a ribosomas y sitios de degradación de ARNm, para ajustar las tasas de traducción para permitir que los diversos dominios de la proteína se plieguen correctamente, o para reducir o eliminar estructuras secundarias problemáticas dentro del polinucleótido. Las herramientas, algoritmos y servicios de optimización de codones son conocidos en la técnica; los ejemplos no taxativos incluyen los servicios de GeneArt (Life Technologies), DNA2.0 (Menlo Park, CA) y/o procedimientos de marca registrada. En algunas realizaciones, se optimiza la secuencia de ORF con algoritmos de optimización. Las opciones de codones para cada aminoácido se dan en la Tabla 21.
Tabla 21. Opciones de codones
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Las características, que pueden considerarse beneficiosas en algunas realizaciones de la presente invención, pueden estar codificadas por regiones del polinucleótido y dichas regiones pueden estar corriente arriba (5') o corriente abajo (3') de una región que codifica un polipéptido. Estas regiones pueden incorporarse al polinucleótido antes y/o después de la optimización del codón de la región que codifica la proteína o del marco de lectura abierto (ORF). No es necesario que un polinucleótido contenga una región flanqueante tanto en 5' como en 3'. Ejemplos de tales características incluyen, pero no se limitan a, regiones no traducidas (UTR), secuencias de Kozak, una secuencia oligo(dT) y etiquetas detectables y pueden incluir múltiples sitios de clonación que pueden tener reconocimiento Xbal.
En algunas realizaciones, una región UTR 5' y/o UTR 3' puede proporcionarse como regiones flanqueantes. Pueden incluirse múltiples UTR 5' o 3' en las regiones flanqueantes y pueden ser las mismas o de secuencias diferentes. Cualquier porción de las regiones flanqueantes, incluida ninguna, puede tener codones optimizados y cualquiera puede contener independientemente una o más modificaciones estructurales o químicas diferentes, antes y/o después de la optimización de codones.
Después de la optimización (si se desea), los componentes de polinucleótidos se reconstituyen y transforman en un vector tal como, entre otros, plásmidos, virus, cósmidos y cromosomas artificiales. Por ejemplo, el polinculeótido optimizado puede reconstituirse y transformarse en E. coli, levadura, neurospora, maíz, drosófila, etc. químicamente competentes donde se producen estructuras similares a plásmidos o cromosómicas con muchas copias mediante los procedimientos descritos en esta invención.
Los polinucleótidos sintéticos y sus análogos de ácidos nucleicos desempeñan un papel importante en la investigación y los estudios de los procedimientos bioquímicos. Se han desarrollado varios procedimientos asistidos por enzimas y basados en sustancias químicas para sintetizar polinucleótidos y ácidos nucleicos, en particular, polinucleótidos y ácidos nucleicos incluidos en las VAN de la invención, como se describe más adelante.
Síntesis: procedimientos enzimáticos
Síntesis transcripción enzimática in vitro
El ADNc que codifica los polinucleótidos descritos en esta invención se puede transcribir utilizando un sistema de transcripción in vitro (IVT). El sistema típicamente comprende un tampón de transcripción, nucleótidos trifosfatos (NTP), un inhibidor de RNasa y una polimerasa. Los NTP se pueden fabricar internamente, se pueden seleccionar de un proveedor o se pueden sintetizar como se describe en esta invención. Los NTP pueden seleccionarse, pero no se limitan a, los descritos en esta invención, incluidos los NTP naturales y no naturales (modificados). La polimerasa se puede seleccionar de, entre otras, ARN polimerasa T7, ARN polimerasa T3 y polimerasas mutantes tales como, entre otras, polimerasas capaces de incorporar polinucleótidos (p. ej., ácidos nucleicos modificados).
Polimerasas de ARN útiles para síntesis
Puede usarse cualquier número de ARN polimerasas o variantes en la síntesis de los polinucleótidos de la presente invención.
Las ARN polimerasas se pueden modificar por inserción o deleción de aminoácidos de la secuencia de ARN polimerasa. Como ejemplo no limitante, la ARN polimerasa puede modificarse para mostrar una mayor capacidad para incorporar un nucleótido trifosfato modificado en 2' en comparación con una ARN polimerasa no modificada (véase la publicación internacional WO2008078180 y la patente de Ee . UU. 8.101.385;).
Las variantes pueden obtenerse desarrollando una ARN polimerasa, optimizando la secuencia de aminoácidos y/o de ácido nucleico de la ARN polimerasa y/o usando otros procedimientos conocidos en la técnica. Como ejemplo no limitativo, las variantes de la ARN polimerasa T7 pueden evolucionar utilizando el sistema de evolución dirigida continua establecido por Esvelt y col. (Nature (2011) 472(7344):499-503;) donde los clones de la polimerasa de ARN T7 pueden codificar al menos una mutación como, entre otras, lisina en la posición 93 sustituida por treonina (K93T), I4M, A7T, E63V, V64D, A65E, D66Y, T76N, C125R, S128R, A136T, N165S, G175R, H176L, Y178H, F182L, L196F, G198V, D208Y, E222K, S228A, Q239R, T243N, G259D, M267I, G280C, H300R, D351A, A354S, E356D, L360P, A383V, Y385C, D388Y, S397R, M401T, N410S, K450R, P451T, G452V, E484A, H523L, H524N, G542V, E565K, K577E, K577M, N601S, S684Y, L699I, K713E, N748D, Q754R, E775K, A827V, D851N o L864F. Como otro ejemplo no limitante, las variantes de la ARN polimerasa T7 pueden codificar al menos una mutación como se describe en las Pub. EE. UU. No. 20100120024 y 20070117112; Las variantes de la ARN polimerasa también pueden incluir, entre otras, variantes de sustitución, sustitución conservativa de aminoácidos, variantes de inserción, variantes de deleción y/o derivados covalentes.
En una realización, el polinucleótido puede diseñarse para ser reconocido por las ARN polimerasas de tipo salvaje o variantes. Al hacerlo, el polinucleótido puede modificarse para que contenga sitios o regiones de cambios de secuencia del polinucleótido de tipo salvaje u original.
Las reacciones de síntesis de polinucleótidos o ácidos nucleicos pueden llevarse a cabo mediante procedimientos enzimáticos que utilizan polimerasas. Las polimerasas catalizan la creación de enlaces fosfodiéster entre nucleótidos en un polinucleótido o cadena de ácido nucleico. Las ADN polimerasas conocidas actualmente se pueden dividir en diferentes familias basándose en la comparación de la secuencia de aminoácidos y el análisis de la estructura cristalina. La ADN polimerasa I (pol I) o la familia de polimerasas A, incluidos los fragmentos Klenow de E. Coli, Bacillus ADN polimerasa I, Thermus aquaticus (Taq) ADN polimerasas y ARN T7, se encuentran entre las mejor estudiadas de estas familias. Otra gran familia es la ADN polimerasa a (pol a) o la familia de la polimerasa B, que incluye todas las ADN polimerasas y polimerasas de replicación eucariotas de los fagos T4 y RB69. Aunque emplean un mecanismo catalítico similar, estas familias de polimerasas difieren en la especificidad de sustrato, la eficacia de incorporación de análogos de sustrato, el grado y la velocidad de extensión del cebador, el modo de síntesis de ADN, la actividad exonucleasa y la sensibilidad frente a los inhibidores.
Las ADN polimerasas también se seleccionan en función de las condiciones de reacción óptimas que requieren, como la temperatura de reacción, el pH y las concentraciones de plantilla y cebador. A veces se emplea una combinación de más de una ADN polimerasa para lograr el tamaño de fragmento de ADN y la eficacia de síntesis deseados. Por ejemplo, Cheng y col. Aumentar el pH, agregar glicerol y dimetilsulfóxido, disminuir los tiempos de desnaturalización, aumentar los tiempos de extensión y usar una ADN polimerasa termoestable secundaria que posee una actividad exonucleasa de 3' a 5' para amplificar eficazmente las dianas largas de los insertos clonados y el ADN genómico humano (Cheng y col., PNAS, Vol. 91, 5695-5699 (1994), las ARN polimerasas del bacteriófago T3, T7 y SP6 se han utilizado ampliamente para preparar ARN para estudios bioquímicos y biofísicos. Las ARN polimerasas, las enzimas protectoras y las poli-A polimerasas se describen en la solicitud en tramitación N° PCT/US2013/054635 (M032),
En un aspecto, la ARN polimerasa que se puede usar en la síntesis de los polinucleótidos quiméricos descritos en esta invención es una a Rn polimerasa Syn5. (véase Zhu y col. Nucleic Acids Research 2013,).
La ARN polimerasa Syn5 se caracterizó recientemente a partir del cianófago marino Syn5 por Zhu y col. donde también identificaron la secuencia promotora (véase Zhu y col. Nucleic Acids Research 2013, ). Zhu y col. encontraron que la ARN polimerasa Syn5 catalizaba la síntesis de ARN en un intervalo más amplio de temperaturas y salinidad en comparación con la ARN polimerasa T7. Además, se encontró que el requisito del nucleótido iniciador en el promotor era menos estricto para la ARN polimerasa Syn5 en comparación con la ARN polimerasa T7, lo que hace que la ARN polimerasa Syn5 sea prometedora para la síntesis de ARN.
En un aspecto, se puede usar una ARN polimerasa Syn5 en la síntesis de los polinucleótidos quiméricos descritos en esta invención. Como ejemplo no limitante, se puede usar una ARN polimerasa Syn5 en la síntesis del polinucleótido quimérico que requiere un extremo 3' preciso.
En un aspecto, se puede usar un promotor Syn5 en la síntesis de polinucleótidos quiméricos. Como ejemplo no limitante, el promotor Syn5 puede ser 5-ATTGGGCACCCGTAAGGG-3' (SEQ ID NO: 2041) como describen Zhu y col. (Nucleic Acids Research 2013,.
En un aspecto, se puede usar una ARN polimerasa Syn5 en la síntesis de polinucleótidos quiméricos que comprenden al menos una modificación química descrita en esta invención y/o conocida en la técnica. (ver, por ejemplo, la incorporación de pseudo-UTP y 5Me-CTP descrita en Zhu y col. Nucleic Acids Research 2013,
En un aspecto, los polinucleótidos quiméricos descritos en esta invención pueden sintetizarse usando una ARN polimerasa Syn5 que se ha purificado usando el procedimiento de purificación mejorado y modificado descrito por Zhu y col. (Nucleic Acids Research 2013,).
Varias herramientas en ingeniería genética se basan en la amplificación enzimática de un gen diana que actúa como plantilla. Para el estudio de secuencias de genes individuales o regiones específicas de interés y otras necesidades de investigación, es necesario generar múltiples copias de un gen diana a partir de una pequeña muestra de polinucleótidos o ácidos nucleicos. Dichos procedimientos se pueden aplicar en la fabricación de los polinucleótidos de la divulgación.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) tiene amplias aplicaciones en la amplificación rápida de un gen diana, así como en el mapeo y secuenciación del genoma. Los componentes clave para la síntesis de ADN comprenden moléculas de ADN diana como plantilla, cebadores complementarios a los extremos de las cadenas de ADN diana, desoxinucleósidos trifosfatos (dNTP) como bloques de construcción y una ADN polimerasa. A medida que la PCR avanza a través de las etapas de desnaturalización, hibridación y extensión, las moléculas de ADN recién producidas pueden actuar como plantilla para el siguiente círculo de replicación, logrando una amplificación exponencial del ADN diana. La PCR requiere un ciclo de calentamiento y enfriamiento para la desnaturalización e hibridación. Las variaciones de la p Cr básica incluyen, pero no se limitan a, PCR asimétrica (ver, por ejemplo, Innis y col., PNAS, vol.
85, 9436-9440 (1988), PCR inversa (ver, por ejemplo, Ochman y col., Genetics, vol. 120 (3), 621-623, (1988), y PCR de transcripción inversa (RT-PCR) (véase, por ejemplo, Freeman y col., BioTechniques, vol. 26 ( 1), 112 - 22, 124 - 5 (1999), ). En RT-PCR, un ARN monocatenario es la diana deseada y se convierte primero en un ADN bicatenario mediante transcriptasa inversa.
Se han desarrollado una variedad de técnicas isotérmicas de amplificación de ácidos nucleicos in vitro como alternativas o complementos de la PCR. Por ejemplo, la amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) se basa en la capacidad de una enzima de restricción para formar una muesca (Walker y col., PNAS, vol. 89, 392-396 (1992),]. Se inserta una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción en una secuencia de cebador hibridada. Los cebadores se extienden mediante una ADN polimerasa y dNTP para formar un dúplex. La enzima de restricción escinde solo una cadenas del dúplex. Cada cadena de una sola ramificación está a continuación disponible como plantilla para la síntesis posterior. SDA no requiere el complicado ciclo de control de temperatura de la PCR.
La amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), también llamada amplificación mediada por transcripción (TMA), es también un procedimiento de amplificación isotérmica que utiliza una combinación de ADN polimerasa, transcriptasa inversa, ARNasa H y ARN polimerasa T7 (Compton, Nature, vol. 350, 91-92 (1991), ). Se utiliza un ARN diana como plantilla y una transcriptasa inversa sintetiza su cadena de ADN complementaria. La ARNasa H hidroliza la plantilla de ARN, dejando espacio para que una ADN polimerasa sintetice una cadena de ADN complementaria a la primera cadena de a Dn que es complementaria a la diana de ARN, formando un dúplex de ADN. La ARN polimerasa de T7 genera continuamente cadenas de ARN complementarias de este dúplex de ADN. Estas cadenas de ARN actúan como plantillas para nuevos ciclos de síntesis de ADN, lo que resulta en la amplificación del gen diana.
La amplificación de círculo rodante (RCA) amplifica un polinucleótido circular monocatenario e involucra numerosas rondas de síntesis enzimática isotérmica donde la ADN polimerasa 029 extiende un cebador al progresar continuamente alrededor del círculo de polinucleótidos para replicar su secuencia una y otra vez. Por tanto, se consigue una copia lineal de la plantilla circular. A continuación, se puede hibridar un cebador con esta copia lineal y se puede sintetizar su cadena complementaria (Lizardi y col., Nature Genetics, vol. 19, 225-232 (1998),
Un ADN circular monocatenario también puede servir como plantilla para la síntesis de ARN en presencia de una ARN polimerasa (Daubendiek y col., JACS, vol. 117, 7818-7819 (1995),
Una amplificación rápida inversa de extremos de cADN (RACE) RCA es descrita por Polidoros y col. (BioTechniques, vol. 41, 35-42 (2006), ). Un ARN mensajero (ARNm) se transcribe de forma inversa en ADNc, seguido de un tratamiento con ARNasa H para separar el ADNc. A continuación, CircLigasa circulariza el ADNc en un ADN circular. La amplificación del ADN circular resultante se logra con RCA.
Cualquiera de los procedimientos anteriores se puede utilizar en la fabricación de una o más regiones de los polinucleótidos de la presente invención (i.e. polinucleótidos que codifican antígenos incluidos en las VAN de la invención).
También se usa ampliamente el ensamblaje de polinucleótidos o ácidos nucleicos (p.ej., polinucleótidos o ácidos nucleicos que codifican antígenos) mediante una ligasa. Las ligasas de ADN o a Rn promueven la ligadura intermolecular de los extremos 5' y 3' de las cadenas polinucleotídicas mediante la formación de un enlace fosfodiéster. La reacción en cadena de la ligasa (LCR) es una técnica de diagnóstico prometedora basada en el principio de que dos sondas polinucleotídicas adyacentes se hibridan con una cadena de un gen diana y se acoplan entre sí mediante una ligasa. Si un gen diana no está presente, o si hay un desajuste en el gen diana, como un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), las sondas no pueden acoplarse por ligasa (Wiedmann y col., PCR Methods and Application, vol.3 (4), s51-s64 (1994), ). La LCR se puede combinar con diversas técnicas de amplificación para aumentar la sensibilidad de detección o para aumentar la cantidad de productos si se usa en la síntesis de polinucleótidos y ácidos nucleicos.
Actualmente se encuentran disponibles comercialmente varios kits de preparación de bibliotecas para ácidos nucleicos. Incluyen enzimas y tampones para convertir una pequeña cantidad de muestras de ácido nucleico en una biblioteca indexada para aplicaciones posteriores. Por ejemplo, los fragmentos de ADN pueden ser colocados en un NEBNEXT® ULTRA™ DNA Library Prep Kit por NEWEn GlAND BIOLABS® para preparación final, ligadura, selección de tamaño, limpieza, amplificación por PCR y limpieza final.
Se está realizando un desarrollo continuo para mejorar las técnicas de amplificación. Por ejemplo, Patente de EE.UU.
8.367.328 de Asada y col. , enseña la utilización de un potenciador de reacción para aumentar la eficiencia de las reacciones de síntesis de ADN por las ADN polimerasas. El potenciador de la reacción comprende una sustancia ácida o complejos catiónicos de una sustancia ácida.La Patente de EE.UU. 7.384.739 de Kitabayashi y col. enseña una sustancia suministradora de iones carboxilato que promueve la síntesis enzimática de ADN, donde la sustancia suministradora de iones carboxilato se selecciona de entre ácido oxálico, ácido malónico, ésteres de ácido oxálico, ésteres de ácido malónico, sales de ácido malónico y ésteres de ácido maleico.La Patente de EE.UU. 7.378.262 de Sobek y col. , describe una composición enzimática para aumentar la fidelidad de las amplificaciones de ADN. La composición comprende una enzima con actividad exonucleasa 3' pero sin actividad polimerasa y otra enzima que es una polimerasa. Ambas enzimas son termoestables y se modifican reversiblemente para permanecer inactivas a temperaturas más bajas.
La Patente de EE.UU. 7.550.264 de Getts y col. enseña que se realizan múltiples rondas de síntesis de moléculas de ARN con sentido uniendo colas de oligodesoxinucleótidos en el extremo 3' de moléculas de ADNc e iniciando la transcripción de ARN usando ARN polimerasa.La Publicación de Patente de EE.UU. No. 2013/0183718 a Rohayem enseña síntesis de ARN mediante ARN polimerasas dependientes de ARN (RdRp) que muestran una actividad ARN polimerasa en plantillas de ADN monocatenario. Los oligonucleótidos con nucleótidos no estándar se pueden sintetizar con la polimerización enzimática poniéndose en contacto con una plantilla que comprende nucleótidos no estándar con una mezcla de nucleótidos que son complementarias a los nucleótidos de la plantilla como se describe en la Patente de EE. UU. N° 6.617.106 a Benner,.
Síntesis: Síntesis química en fase sólida
Los polinucleótidos quiméricos o polinucleótidos circulares de la presente invención (i.e. los polinucleótidos que codifican antígenos incluidos en las VAN de la invención) se pueden fabricar en su totalidad o en parte usando técnicas en fase sólida.
La síntesis química en fase sólida de polinucleótidos o ácidos nucleicos es un procedimiento automatizado donde las moléculas se inmovilizan sobre un soporte sólido y se sintetizan etapa a etapa en una solución reactiva. Las impurezas y el exceso de reactivos se eliminan por lavado y no se requiere purificación después de cada etapa. La automatización del procedimiento es posible en un sintetizador de fase sólida controlado por ordenador. La síntesis en fase sólida permite la producción rápida de polinucleótidos o ácidos nucleicos a una escala relativamente grande que conduce a la disponibilidad comercial de algunos polinucleótidos o ácidos nucleicos. Además, es útil en la introducción específica de un sitio de modificaciones químicas en las secuencias de polinucleótidos o ácidos nucleicos. Es una herramienta indispensable en el diseño de derivados modificados de ácidos nucleicos naturales.
En la síntesis automatizada en fase sólida, la cadena se sintetiza en la dirección 3' a 5'. El grupo hidroxilo en el extremo 3' de un nucleósido está unido a un soporte sólido mediante un enlazador químicamente escindible o escindible por luz. Los monómeros de nucleósidos activados, tales como 2'-desoxinucleósidos (dA, dC, dG y T), ribonucleósidos (A, C, G y U) o nucleósidos modificados químicamente, se añaden secuencialmente al nucleósido unido al soporte. Los monómeros más utilizados en la actualidad son los derivados 3' de la fosformidita de los componentes básicos de los nucleósidos. El átomo de fósforo 3' del monómero activado se acopla con el átomo de oxígeno 5' del nucleósido unido al soporte para formar un triéster de fosfito. Para evitar reacciones secundarias, todos los grupos funcionales que no participan en la reacción de acoplamiento, como el grupo hidroxilo 5', el grupo hidroxilo en el átomo de fósforo 3', el grupo hidroxilo 2' en los monómeros de ribonucleósidos y los grupos amino en la purina o bases de pirimidina, todos están bloqueados con grupos de protección. La siguiente etapa consiste en la oxidación del triéster de fosfito para formar un triéster de fosfato o fosfotriéster, donde el átomo de fósforo es pentavalente. A continuación, se elimina el grupo de protección del grupo hidroxilo 5' al final de la cadena de crecimiento, listo para acoplarse con un bloque de construcción de monómero activado entrante. Al final de la síntesis, se agrega un agente de escisión como amoníaco o hidróxido de amonio para eliminar todos los grupos protectores y liberar las cadenas polinucleotídicas del soporte sólido. También se puede aplicar luz para escindir la cadena de polinucleótidos. A continuación, el producto puede purificarse adicionalmente mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC) o electroforesis.
En la síntesis en fase sólida, la cadena de polinucleótidos se une covalentemente al soporte sólido a través de su grupo hidroxilo 3'. Los soportes sólidos son partículas insolubles también llamadas resinas, típicamente de 50 a 200 pm de diámetro. Actualmente se encuentran disponibles muchos tipos diferentes de resinas, como se revisó en "Soportes en fase sólida para la síntesis de polinucleótidos" de Guzaev (Guzaev, Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, 3.1.1-3.1.60 (2013), ). Los materiales más comunes para las resinas incluyen perlas de poliestireno altamente reticuladas y perlas de vidrio de poro controlado (CPG). La superficie de las perlas puede tratarse para que tenga grupos funcionales, tales como grupos amino o aminometilo, que pueden usarse como puntos de anclaje para enlazadores a nucleósidos de unión. Se pueden implementar en columnas, placas de pocillos múltiples, micromatrices o microchips. El formato basado en columnas permite la síntesis a escala relativamente grande de los polinucleótidos o ácidos nucleicos. Las resinas se mantienen entre filtros en columnas que permiten que todos los reactivos y disolventes pasen libremente. Las placas de pozos múltiples, micromatrices o microchips están diseñados específicamente para síntesis rentable a pequeña escala. Se pueden producir hasta un millón de polinucleótidos en un solo chip de micromatrices. Sin embargo, las tasas de error de la síntesis basada en microchip son más altas que los procedimientos tradicionales basados en columnas (Borovkov y col., Nucleic Acids Research, vol. 38 (19), e180 (2010),]. Las placas de pocillos múltiples permiten la síntesis paralela de polinucleótidos o ácidos nucleicos con diferentes secuencias simultáneamente (Sindelar, y col., Nucleic Acids Research, vol. 23, 982-987 (1995), ). La carga sobre los soportes sólidos es limitada. Además, a medida que avanza la extensión, la morfología y el volumen de las cadenas en crecimiento en los soportes sólidos podrían impedir que los monómeros entrantes reaccionen con el grupo extremo de las cadenas en crecimiento. Por tanto, el número de monómeros que se pueden añadir a la cadena de crecimiento también es limitado.
Los enlazadores están unidos al soporte sólido para una mayor extensión de la cadena. Son estables a todos los reactivos utilizados en el procedimiento de síntesis, excepto al final de la síntesis cuando la cadena se desprende del soporte sólido. Pueden usarse soportes sólidos con un enlazador de nucleósido específico, es decir, A, C, dT, G o U, para preparar polinucleótidos con A, C, T, G o U como el primer nucleótido en la secuencia, respectivamente. Soportes sólidos universales con enlazadores no nucleósidos se pueden utilizar para todas las secuencias de polinucleótidos (Patente de EE. UU. 6.653.468 a Guzaev y col., Varios enlazadores no nucleósidos se han desarrollado para soportes universales, muchos de ellos con dos grupos hidroxilo vecinales. Por ejemplo, un grupo succinilo es un enlazador de uso frecuente.
Tal como se usa en esta invención, un enlazador se refiere a un grupo de átomos, por ejemplo, 10--1.000 átomos, y puede estar comprendido por átomos o grupos tales como, pero no limitado a, carbono, amino, alquilamino, oxígeno, azufre, sulfóxido, sulfonilo, carbonilo e imina. El enlazador se puede unir a un nucleósido o nucleótido modificado en la nucleobase o resto de azúcar. Un enlazador puede estar basado en ácido nucleico o no nucleosídico. El enlazador puede tener una longitud suficiente para no interferir con la incorporación en una secuencia de ácido nucleico. El enlazador puede usarse para cualquier propósito útil, como formar multímeros (p. ej., mediante el enlace de dos o más moléculas de polinucleótidos quiméricos) o conjugados, así como para administrar una molécula terapéutica o incorporar una etiqueta, como se describe en esta invención. Los ejemplos de grupos químicos que se pueden incorporar en el enlazador incluyen, pero no se limitan a, alquilo, alquenilo, alquinilo, amido, amino, éter, tioéter, éster, alquileno, heteroalquileno, arilo o heterociclilo, cada uno de los cuales puede ser opcionalmente sustituido, como se describe en esta invención. Ejemplos de enlazadores incluyen, entre otros, alcanos insaturados, polietilenglicoles (por ejemplo, conjuntos monoméricos de etilenglicol o propilenglicol, por ejemplo, dietilenglicol, dipropilenglicol, trietilenglicol, tripropilenglicol, tetraetilenglicol o tetraetilenglicol) y dextrano. polímeros y derivados de los mismos. Otros ejemplos incluyen, entre otros, restos escindibles dentro del enlazador, como, por ejemplo, un enlace disulfuro (-SS-) o un enlace azo (-N=N-), que pueden ser escindido usando un agente reductor o fotólisis. Ejemplos no limitantes de un enlace escindible selectivamente incluyen un enlace amido que puede escindirse, por ejemplo, mediante el uso de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP), u otros agentes reductores, y/o fotólisis, así como un enlace éster puede ser escindido, por ejemplo, por hidrólisis ácida o básica.)
Además de los grupos funcionales en el monómero activado y la cadena de crecimiento necesarios para que la reacción de acoplamiento extienda la cadena, todos los demás grupos funcionales deben protegerse para evitar reacciones secundarias. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente las condiciones de protección y desprotección y la selección de los grupos protectores apropiados. La química de los grupos protectores se puede encontrar y/o está descrita, por ejemplo, en Greene, y col. (Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed., Wiley & Sons, 1991, .) Por ejemplo, el grupo hidroxilo 5' de los monómeros de fosforamidita de nucleósidos activados puede protegerse con 4,4-dimetoxitritilo (DMT) y el grupo hidroxilo del átomo de fósforo puede protegerse con 2-cianoetilo . Los grupos amino exocíclicos de las bases A, C, G pueden protegerse con grupos acilo.
En un sistema de síntesis en fase sólida, la reactividad de los monómeros activados es importante debido a la heterogeneidad de los medios. La mayoría de la síntesis en fase sólida utiliza nucleósidos de fosforamidita, cuyo mecanismo se discutió anteriormente. Otro ejemplo de monómero activado son los nucleósidos H-fosfonatos (Abramova, Molecules, vol. 18, 1063-1075 (2013), ). Se requiere un gran exceso de reactivos, como monómeros, agentes oxidantes y agentes desprotectores, para asegurar altos rendimientos en el sistema de síntesis en fase sólida.
Se están realizando estudios e investigaciones científicas para mejorar aún más el procedimiento de síntesis en fase sólida. Por ejemplo, en lugar de la síntesis bien establecida-3' a 5', Patente de EE. UU. N° 8.309.707 y Patente de EE.UU. Publicación No. 2013/0072670 a Srivastava y col. describió una síntesis 5' a 3' de ARN utilizando una nueva fosforamidita y un nuevo derivado de nucleósido, permitiendo así modificaciones fáciles del ARN sintético en el extremo 3'.La Solicitud PCT WO2013123125 de Church y col. describe el ensamblaje de una secuencia de ácido nucleico diana a partir de una pluralidad de subsecuencias, donde las resinas con las subsecuencias se colocan en una gota de emulsión. Las subsecuencias se escinden de las resinas y se ensamblan dentro de la gota de emulsión. Para reducir el costo de los soportes sólidos, se ha desarrollado un soporte sólido de CPG reutilizable con un enlazador de hidroquinona-O, O'-ácido diacético (Q-enlazador) (Pon y col., Nucleic Acid Research, vol. 27, 1531-1538 (1999), ).
También se han desarrollado nuevos grupos protectores para la síntesis en fase sólida Nagat y col. ha sintetizado con éxito ARN de 110 nt de longitud con la secuencia de un microARN precursor candidato utilizando 2-cianoetoximetilo (CEM) como grupo protector 2'-hidroxi (Shiba y col., Nucleic Acids Research, vol. 35, 3287 -3296 (2007),
También con CEM como grupo protector 2'-O, se ha sintetizado un ARNm de 130 nt que codifica un péptido de 33 aminoácidos que incluye la secuencia del péptido 1 similar al glucagón (GLP-1). La actividad biológica del ARNm artificial de 130 nt se muestra produciendo GLP-1 en un sistema de síntesis de proteínas libre de células y en células de ovario de hámster chino (CHO) (Nagata y col., Nucleic Acids Research, vol. 38 ( 21), 7845-7857 (2010), Los nuevos grupos protectores para los monómeros de síntesis en fase sólida incluyen, pero no se limitan a, el grupo protector de carbonato descrito en Patente de EE. UU. N° 8.309.706 de Dellinger y col., grupo protector de hidroxilo de tipo ortoéster 2' y un grupo protector de hidroxilo de tipo acil carbonato descritos en Patente Ee . UU. No. 8.242.258 de Dellinger y col., grupo protector 2'-hidroxil tiocarburo descrito en Patente EE. UU. No. 8,202,983 de Dellinger y col., Grupo protector de tiocarbonato que contiene 2'-sililo descrito en Patente de EE. UU. No. 7,999,087 de Dellinger y col., Derivados de 9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMOS) como un grupo protector de amino descrito en Patente de EE. UU. N° 7.667.033 de Alvarado, grupo protector de 5'sililo lábil al fluoruro descrito en Patente de EE. UU. N° 5.889.136 de Scaringe y col., y grupos protectores de pixilo descritos en Patente de EE.UU. Publicación No. 2008/0119645 a Griffey y col., Patente de EE.UU. Publicación No. 2011/0275793 a Debart y col. enseña la síntesis de ARN usando un grupo protector de los hioxilos en la posición 2' de la ribosa que puede ser eliminado por una base. Los nuevos soportes sólidos incluyen polímeros hechos de monómeros que comprenden una cadena de hidroxipolico alquilenoxi C2-4 protegida unida a un conjunto polimerizable enseñado en Patente de EE.UU. N° 7.476.709 de Moody y col.,
Síntesis: Síntesis química en fase líquida
La síntesis de polinucleótidos quiméricos o polinucleótidos circulares de la presente invención (i.e. polinucleótidos que codifican antígenos incluidos en las VAN de la invención) mediante la adición secuencial de bloques de construcción de monómeros se puede llevar a cabo en una fase líquida. Se forma un enlace covalente entre los monómeros o entre un grupo funcional extremo de la cadena en crecimiento y un monómero entrante. Los grupos funcionales que no participan en la reacción deben protegerse temporalmente. Después de la adición de cada bloque de construcción de monómero, la mezcla de reacción debe purificarse antes de agregar el siguiente bloque de construcción de monómero. El grupo funcional en un extremo de la cadena debe desprotegerse para poder reaccionar con los siguientes bloques de construcción de monómeros. Una síntesis en fase líquida requiere mucho tiempo y trabajo y no puede no ser automatizada. A pesar de las limitaciones, la síntesis en fase líquida sigue siendo útil para preparar polinucleótidos cortos a gran escala. Debido a que el sistema es homogéneo, no requiere un gran exceso de reactivos y es rentable a este respecto.
Síntesis: combinación de procedimientos sintéticos
Cada uno de los procedimientos sintéticos discutidos anteriormente tiene sus propias ventajas y limitaciones. Se han realizado intentos para combinar estos procedimientos para superar las limitaciones. Dichas combinaciones de procedimientos están dentro del alcance de la presente divulgación.
Se pueden preparar cadenas polinucleotídicas cortas con 2-4 nucleótidos en fase líquida seguido de unión a un soporte sólido para reacciones de extensión mediante síntesis en fase sólida. Se desarrolla una síntesis de fase líquida de alta eficiencia (HELP) que utiliza éter monometílico de perlas de polietilenglicol (MPEG) como soporte para los componentes básicos del monómero. El MPEG es soluble en disolventes de cloruro de metileno y piridina, pero precipita en un disolvente de éter dietílico. Al elegir un disolvente apropiado, la reacción de acoplamiento entre los monómeros o entre una cadena en crecimiento y un monómero entrante unido a MPEG se puede llevar a cabo en un sistema de fase líquida homogénea. A continuación, la mezcla se puede lavar con un disolvente de éter dietílico para precipitar y purificar fácilmente el producto (Bonora y col., Nucleic Acids Research, vol. 18, 3155-3159 (1990),
Pat. EE. UU. No. 8.304.532 a Adamo y col., cuyo contenido se incorpora en esta invención en su totalidad, enseña una síntesis de oligonucleótidos en fase de solución donde al menos algunos de los reactivos tienen un soporte sólido.
El uso de síntesis química en fase sólida o en fase líquida en combinación con la ligadura enzimática proporciona una forma efectiva de generar polinucleótidos de cadena larga que no se pueden obtener mediante síntesis química solamente. Moore y Sharp describen la preparación de fragmentos de a Rn de 10 a 20 nt de largo mediante síntesis química, en los que se pueden introducir modificaciones específicas del sitio, hibridar los fragmentos con un puente de ADNc y a continuación ensamblar los fragmentos con la ligasa de ADN T4 (Moore y col., Science, vol. 256, 992­ 997 (1992),
Un sintetizador en fase sólida puede producir suficientes polinucleótidos o ácidos nucleicos con buena pureza para preformar la PCR y otras técnicas de amplificación. Agilent Technologies ha desarrollado micromatrices que están disponibles comercialmente. Los polinucleótidos se pueden sintetizar en un sustrato de micromatrices, escindido por una base fuerte o luz, seguido de amplificación por PCR para generar una biblioteca de polinucleótidos (Cleary y col., Nature Methods, vol. 1 (3), 241-247 (2004),).
Síntesis: Síntesis en región pequeña
Las regiones o subregiones de los polinucleótidos de la presente invención (i.e. polinucleótidos que codifican antígenos incluidos en las VAN de la invención) pueden comprender pequeñas moléculas de ARN como siRNA y, por lo tanto, pueden sintetizarse de la misma manera. Existen varios procedimientos para preparar siRNA, como la síntesis química utilizando fosforamiditas de ribonucleósidos debidamente protegidas, transcripción in vitro, vectores de expresión de siRNA y casetes de expresión de PCR. Sigma-Aldrich® es uno de los proveedores de siRNA y sintetiza su siRNA usando monómeros de fosforamidita de ribonucleósido protegidas en la posición 2' con un grupo t-butilmetilsililo (TBDMS). La síntesis química en fase sólida se lleva a cabo con Síntesis Paralela Ultra Rápida (UFPS) y Desprotección Paralela Ultra Rápida (UFPD) de SIGMA-ALDRICH®, para lograr una alta eficiencia de acoplamiento y desprotección rápida. Los productos de siRNA finales se pueden purificar con HPLC o PAGE. Tales procedimientos pueden usarse para sintetizar regiones o subregiones de polinucleótidos quiméricos.
La transcripción y expresión In vitro de un vector o un casete de siRNA generado por PCR requieren plantillas apropiadas para producir siRNA. El kit de construcción de siRNA comercialmente disponible AMBIOn® SILEn CER® produce siRNA por transcripción in vitro de plantillas de ADN y contiene las enzimas, tampones, cebadores necesarios. Tales procedimientos pueden usarse para sintetizar regiones o subregiones de polinucleótidos quiméricos.
Síntesis: Ligadura de regiones o subregiones de polinucleótidos
Polinucleótidos de la invención (i.e. polinucleótidos que codifican antígenos incluidos en las VAN de la invención) tales como polinucleótidos quiméricos y/o se pueden preparar polinucleótidos circulares mediante ligación de una o más regiones o subregiones.
La ligadura es una herramienta indispensable para ensamblar fragmentos de polinucleótidos o ácidos nucleicos en construcciones más grandes. Los fragmentos de ADN se pueden unir mediante una reacción catalizada por ligasa para crear ADN recombinante con diferentes funciones. Dos oligodesoxinucleótidos, uno con un grupo fosforilo 5' y otro con un grupo hidroxilo 3' libre, sirven como sustratos para una ADN ligasa. Los oligodexoinucleótidos con marcadores fluorescentes o quimioluminiscentes también pueden servir como sustratos de ADN ligasa (Martinelli y col., Clinical Chemistry, vol. 42, 14-18 (1996),]. Las ligasas de ARN como la ligasa de ARN T4 catalizan la formación de un enlace fosfodiéster entre dos oligoribonucleótidos monocatenarios o fragmentos de ARN. Se han sintetizado copias de grandes construcciones de ADN con una combinación de fragmentos de polinucleótidos, ADN polimerasas termoestables y ADN ligasas.La Patente de EE.UU. Publicación No. 2009/0170090 a Ignatov y col., describe la mejora de la PCT, especialmente la mejora del rendimiento de una PCR de larga distancia y/o una amplificación por PCR de plantilla de a Dn de baja copia, utilizando una ADN ligasa además de una ADN polimerasa.
Las ligasas se pueden usar con otras enzimas para preparar el polinucleótido quimérico o las moléculas de ácido nucleico deseadas y para realizar el análisis del genoma. Por ejemplo, la amplificación por PCR selectiva mediada por ligación se describe en EP Pat. Pub. N° 0735144 a Kato. Los ADN complementarios (ADNc) transcritos de forma inversa a partir de ARN o ADN derivados de tejidos o células se digieren en fragmentos con enzimas de restricción de tipo IIS
Las secuencias adaptadoras biotiniladas se unen a los fragmentos mediante ADN ligasas de E. coli . Los fragmentos de ADN marcados con biotina se inmovilizan a continuación en perlas recubiertas de estreptavidina para el análisis posterior.
Una férula de ligadura o una férula de ligadura oligo es un oligonucleótido que se usa para proporcionar un sitio de hibridación o una plantilla de ligadura para unir dos extremos de un ácido nucleico, es decir, unión intramolecular, o dos extremos de dos ácidos nucleicos, es decir, unión intermolecular, usando una ligasa u otra enzima con actividad de ligasa. La férula de ligadura mantiene los extremos adyacentes entre sí y crea una unión de ligadura entre los extremos 5'-fosforilado y 3'-hidroxilado que se van a ligar.
En un aspecto, se puede usar un procedimiento de ligadura mediada por férula o ligadura con férula para sintetizar los polinucleótidos quiméricos descritos en esta invención. El polinucleótido quimérico puede ensamblarse usando un procedimiento que no se base en la presencia de sitios de escisión de endonucleasas de restricción como el procedimiento descrito en la Publicación de Patente Internacional No. WO2012138453,.
La ligadura mediada por férula permite la síntesis rápida de la construcción mediante la concatenación controlada y sin la necesidad o con una necesidad limitada de la introducción de sitios de restricción en las regiones de unión. Como ejemplo no limitante, se puede usar la ligadura en férula para añadir al menos una región no traducida a una región codificante del polinucleótido quimérico. En un aspecto, la ligadura en férula puede usarse en combinación con otros procedimientos de síntesis en la síntesis de los polinucleótidos quiméricos descritos en esta invención.
Si el fosforilado 5' y los extremos 3' hidroxilo de los ácidos nucleicos se ligan cuando los extremos se hibridan a una férula de ligadura de modo que los extremos son adyacentes, enzimas tales como, pero no limitadas a, ADN ligasa T4, AMPLIGASE® ADN Ligasa (EPICENTRE® Technologies), Tth ADN ligasa, Tfl ADN ligasa, o Tsc ADN Ligasa (Prokaria) pueden ser usadas. Farugui en la Patente de EE.UU. 6.368.801 describe que la ARN ligasa T4 puede ligar de manera eficiente los extremos de moléculas de ADN que están adyacentes entre sí cuando se hibridan con una férula de ARN. Por tanto, la ARN ligasa T4 es una ligasa adecuada para unir extremos de ADN con un oligo de férula de ligadura que comprende ARN o ARN modificado. Ejemplos de férulas de ARN incluyen ARN modificado que contiene 2'-flúor-CTP (2'-F-dCTP) y 2'-flúor-UTP (2'-F-dUTP) elaborado con el kit de transcripción DURASCRIBE® T7 (EPICENTER® Technologies) divulgados en la Patente de Ee .UU. N° 8.137.911 y la Patente de EE.UU. Publicación 2012/0156679 a Dahl y col,
El ARN modificado producido a partir del kit de transcripción DURASCRIBE® T7 es completamente resistente a la digestión con ARNasa A. La férula de ADN y la ligasa de ADN pueden usarse para generar fusiones de ARN-proteína descritas en la Patente de EE.UU. 6.258.558 a Szostak y col.,.
Para la ligadura intramolecular de ssADN lineal, la Pat. de EE. UU. No. 7.906.490 a Kool y col. enseña la construcción de un círculo de 83 nucleótidos haciendo fragmentos de oligodesoxinucleótidos lineales en un sintetizador de ADN seguido de ligación con ADN ligasa T4 y dos oligonucleótidos de férula de 30 nucleótidos. La circulación de sentido lineal que contiene el promotor de ADNc se describe en la Patente de EE. UU. Publicación No. 2012/0156679 a Dahl y col.,
THERMOPHAGE™ ssADN ligasa (Prokazyme), que se deriva del fago TS2126 que infecta Thermus scotoductus, cataliza la ligadura intra e intermolecular de ADN y ARN dependiente de ATP.
El procedimiento de síntesis química en fase sólida que utiliza monómeros de fosforamidita se limita a producir moléculas de ADN con cadenas cortas La pureza de los productos de ADN y el rendimiento de las reacciones se vuelven pobres cuando la longitud excede las 150 bases. Para la síntesis de polinucleótidos largos con altos rendimientos, es más conveniente utilizar el procedimiento de ligación enzimática junto con la síntesis química. Por ejemplo, Moore y Sharp describen la preparación de fragmentos de ARN de 10 a 20 nt de largo mediante síntesis química, en los que se pueden introducir modificaciones específicas del sitio, hibridar los fragmentos con una división de ADNc y a continuación ensamblar los fragmentos con la ADN ligasa T4 (Moore y col., Science, vol. 256, 992-997 (1992), Las reacciones de ligación de oligoribonucleótidos con ARN ligasa T4 y una férula de ADN o un polirribonucleótido para generar ARN sintéticos grandes se describen en Bain y col., Nucleic Acids Research, vol. 20 (16), 4372 (1992), Stark y col., RNA, vol. 12, 2014-2019 (2006), y Solicitud de Patente de EE. UU. No. 2005/0130201 a Deras y col., las colas 5'-capa y 3'-poliA se añaden a menudo mediante adición enzimática a un oligonucleótido sintetizado con procedimientos en fase sólida. Como ejemplo no limitante, se ha sintetizado un ARNm de 42-meros con recubrimiento sintético en tres fragmentos ligados enzimáticamente como se describe por Iwase y col. (Nucleic Acids Research, vol. 20, 1643-1648 (1992), como otro ejemplo, se ha producido un genoma mitocondrial de ratón de 16,3 kilobase a partir de 600 polinucleótidos de 60 meros superpuestos. Los ciclos del procedimiento entre la recombinación in vitro y la amplificación pueden repetirse hasta alcanzar la longitud deseada (Gibson y col., Nature Methods, vol. 7, 901-903 (2010),
También se ha informado del ensamblaje de un genoma de Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0 de 1,08 megabase. Como ejemplo no limitativo, los casetes de 1080 pb se producen ensamblando fragmentos de polinucleótidos generados químicamente a partir de un sintetizador de polinucleótidos. A continuación, el genoma se ensambla en tres etapas mediante transformación y recombinación homóloga en levadura (Gibson, y col., Science, vol. 329, 52-56 (2010),).
Se han realizado estudios para unir fragmentos cortos de ADN con enlazadores químicos. La química 'clic' o ligadura 'clic', la reacción de cicloadición entre azida y alquino, ha ganado mucho interés debido a sus ventajas, tales como condiciones de reacción suaves, altos rendimientos y subproductos inofensivos. La química «clic» ha sido revisada por Nwe y col. in Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals, vol. 24(3), 289-302 (2009),. Se han producido construcciones de ADN de hasta 300 bases de longitud con ligadura clic y son factibles secuencias más largas. Demostrado con datos de PCR, varias ADN polimerasas son capaces de amplificar las construcciones de ADN sintetizadas hechas por ligadura clic a pesar de los enlazadores de triazol entre los fragmentos resultantes de la reacción de cicloadición.La transcripción in vitro y la amplificación por círculo rodante también se pueden realizar en las construcciones de ADN sintetizadas. También se han preparado ribozimas en horquilla de hasta 100 nucleótidos de longitud y dúplex de mini-ADN cíclicos con ligadura clic (El-Sagheer y col., Accounts of Chemical Research, vol. 45 (8), 1258-1267 (2012),).
La ligadura secuencial se puede realizar sobre un sustrato sólido. Por ejemplo, las moléculas de ADN del enlazador inicial modificadas con biotina en el extremo se unen a perlas recubiertas de estreptavidina. Los extremos 3' de las moléculas de ADN del enlazador son complementarios con los extremos 5' de los fragmentos de ADN entrantes. Las perlas se lavan y recogen después de cada etapa de ligación y las construcciones lineales finales se liberan mediante una meganucleasa. Este procedimiento permite el ensamblaje rápido y eficiente de genes en un orden y orientación optimizados. (Takita, DNA Research, vol. 20 (4), 1-10 (2013), Los polinucleótidos marcados sintetizados en soportes sólidos se describen en la Publicación de patente de EE.UU. 2001/0014753 a Soloveichik y col. y en la Patente de EE.UU. Pub. No. 2003/0191303 a Vinayak y col.,
Cuantificación
En un aspecto, los polinucleótidos de la presente invención (i.e. polinucleótidos que codifican antígenos incluidos en las VAN de la invención) pueden cuantificarse en exosomas o cuando se derivan de uno o más fluidos corporales. Tal como se usa en esta invención, "fluidos corporales" incluye sangre periférica, suero, plasma, ascitis, orina, fluido cefalorraquídeo (LCR), esputo, saliva, médula ósea, fluido sinovial, humor acuoso, fluido amniótico, cerumen, leche materna, fluido de lavado bronqueoalveolar, semen, fluido prostático, fluido de Cowper o fluido preeyaculatorio, sudor, materia fecal, cabello, lágrimas, fluido quístico, fluido pleural y peritoneal, fluido pericárdico, linfa, quimo, quilo, bilis, fluido intersticial, menstruación, pus, sebo, vómitos, secreciones vaginales, secreciones mucosas, agua de heces, jugo pancreático, fluidos de lavado de las cavidades sinusales, aspirados broncopulmonares, fluido de la cavidad blastocilo y sangre del cordón umbilical. Alternativamente, los exosomas se pueden recuperar de un órgano seleccionado de entre el grupo que consiste en pulmón, corazón, páncreas, estómago, intestino, vejiga, riñón, ovario, testículos, piel, colon, mama, próstata, cerebro, esófago, hígado y placenta.
En el procedimiento de cuantificación, se obtiene una muestra de no más de 2 mL del sujeto y se aíslan los exosomas mediante cromatografía de exclusión por tamaño, centrifugación en gradiente de densidad, centrifugación diferencial, ultrafiltración de nanomembranas, captura inmunoabsorbente, purificación por afinidad, separación de microfluidos o combinaciones de los mismos. En el análisis, el nivel o concentración de un polinucleótido puede ser un nivel de expresión, presencia, ausencia, truncamiento o alteración de la construcción administrada. Es ventajoso correlacionar el nivel con uno o más fenotipos clínicos o con un ensayo para un biomarcador de enfermedad humana. El ensayo se puede realizar usando sondas específicas de construcción, citometría, qRT-PCR, PCR en tiempo real, PCR, citometría de flujo, electroforesis, espectrometría de masas o combinaciones de los mismos, mientras que los exosomas pueden aislarse usando procedimientos inmunohistoquímicos como procedimientos de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas ( ELISA). Los exosomas también pueden aislarse mediante cromatografía de exclusión por tamaño, centrifugación en gradiente de densidad, centrifugación diferencial, ultrafiltración de nanomembranas, captura inmunoabsorbente, purificación por afinidad, separación de microfluidos o combinaciones de los mismos.
Estos procedimientos brindan al investigador la capacidad de monitorear, en tiempo real, el nivel de polinucleótidos restantes o entregados. Esto es posible porque los polinucleótidos de la presente invención difieren de las formas endógenas debido a las modificaciones estructurales o químicas.
En un aspecto, el polinucleótido puede cuantificarse usando procedimientos tales como, pero sin limitarse a, espectroscopía ultravioleta visible (UV/Vis). Un ejemplo no limitativo de espectrómetro UV/Vis es un espectrómetro NANODROP® (ThermoFisher, Waltham, MA). El polinucleótido cuantificado puede analizarse para determinar si el polinucleótido puede tener el tamaño adecuado, comprobar que no se ha producido degradación del polinucleótido. La degradación del polinuclótido se puede comprobar mediante procedimientos como, entre otros, electroforesis en gel de agarosa, procedimientos de purificación basados en HPLC como, entre otros, HPLC de intercambio aniónico fuerte, HPLC de intercambio aniónico débil, HPLC de fase inversa (RP-HPLC) y HPLC de interacción hidrofóbica (HIC-HPLC), cromatografía líquida-espectrometría de masas (LCMS), electroforesis capilar (CE) y electroforesis capilar en gel (CGE).
Purificación
La purificación de los polinucleótidos de la invención (i.e. polinucleótidos que codifican antígenos incluidos en las VAN de la invención) descrita en esta invención puede incluir, entre otros, limpieza de polinucleótidos, garantía de calidad y control de calidad. La limpieza se puede realizar mediante procedimientos conocidos en la técnica como, entre otros, perlas AGENCOURT® (Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA), perlas poli-T, sondas de captura oligo-T LNA™ (EXIQON® Inc, Vedbaek, Dinamarca) o procedimientos de purificación basados en HPLC como, entre otros, HPLC de intercambio aniónico fuerte, HPLC de intercambio aniónico débil, HPLC de fase inversa (RP-HPLC) y HPLC de interacción hidrofóbica (HIC-HPLC). El término "purificado" cuando se usa en relación con un polinucleótido tal como un "polinucleótido purificado" se refiere a uno que está separado de al menos un contaminante. Tal como se usa en esta invención, un "contaminante" es cualquier sustancia que hace que otra sea inadecuada, impura o inferior. Por lo tanto, un polinucleótido purificado (p. ej., ADN y ARN) está presente en una forma o entorno diferente de aquel donde se encuentra en la naturaleza, o en una forma o entorno diferente del que existía antes de someterlo a un tratamiento o procedimiento de purificación. .
Una garantía de calidad y/o verificación del control de calidad se puede realizar utilizando procedimientos como, entre otros, electroforesis en gel, absorbancia UV o HPLC analítica.
En otro aspecto, los polinucleótidos pueden secuenciarse mediante procedimientos que incluyen, entre otros, PCR con transcriptasa inversa.
IV.Modificaciones
En realizaciones ejemplares, los polinucleótidos de la invención (i.e. los polinucleótidos que codifican antígenos incluidos en las VAN de la invención) pueden incluir varias sustituciones e/o inserciones.
Los datos presentados en los Ejemplos demuestran respuestas inmunes mejoradas significativas usando las formulaciones de la invención. Los datos demostraron la eficacia de las vacunas de ARN modificadas químicamente de la invención. Sorprendentemente, en contraste con los informes de la técnica anterior de que era preferible usar ARNm químicamente no modificado formulado en un vehículo para la producción de vacunas, se descubrió en esta invención que las vacunas de ARNm-NPL químicamente modificadas requerían una dosis de ARNm efectiva mucho más baja que el ARNm sin modificar, es decir , diez veces menos que el ARNm sin modificar.
Adicionalmente, un estudio que se describe en esta invención implicó la vacunación de ratones por vía intravenosa (IV), intramuscular (IM) o intradérmica (ID), seguida de una exposición con una dosis letal de virus. Además de todos los animales vacunados que sobrevivieron a la dosis letal, se observaron respuestas inmunes tempranas significativamente más fuertes (actividad antiviral mediante ensayo de neutralización de virus e inhibición de HA (HAI)) en comparación con el antígeno proteico y otras formulaciones a base de lípidos (lipoplex). Los datos demuestran que tan pronto como 1 semana después de la vacunación, ambos grupos de animales que recibieron una formulación de ARNm-NPL (ID o IM) químicamente modificada mostraron títulos de HAI superiores a 40, a 60 y 114, respectivamente. Un título de HAI superior a 40 se considera suficiente para proteger de una exposición letal de influenza. La respuesta rápida fue inesperada, particularmente cuando se comparó con la respuesta observada con las vacunas de antígeno proteico y ARNm formuladas en otros vehículos de lípidos (lipoplex), que una semana e incluso tres semanas después de la vacunación continuaron mostrando títulos de HAI ineficaces de menos de 40.
En cada uno de los puntos de tiempo posteriores (3 semanas y 5 semanas), las formulaciones de la invención continuaron proporcionando respuestas terapéuticas significativamente más fuertes que las del antígeno proteico. De hecho, incluso la formulación de ARNm-NPL no modificada químicamente administrada por vía IV tenía títulos de HAI mejorados con respecto al antígeno proteico. En la semana 3, todos los animales que recibieron una formulación de ARNm-NPL por administración IM o ID mostraron una actividad de HAI superior a 40, en comparación con el antígeno proteico, que a la semana y a las tres semanas continuaron mostrando títulos de HAI de menos de 40. En la semana 5, la formulación de ARNm-NPL químicamente modificada administrada por vía ID tenía una actividad HAI sorprendente de más de 10.000, en contraste con el título de HAI de aproximadamente 400 para el antígeno proteico en ese punto de tiempo.
Tanto las vacunas de ARN químicamente modificadas como las no modificadas produjeron mejores respuestas inmunitarias que las vacunas de ARNm formuladas en un vehículo de lípidos diferente (lipoplex). En la semana 5, la vacuna lipoplex de ARNm no modificada químicamente produjo títulos HAI de 197, en comparación con los logrados por las formulaciones de ARNm-LNP de la invención (títulos HAI de 635-10,152). En todos los demás puntos de tiempo y para todas las vacunas de ARNm-lipoplex químicamente modificadas, ninguno de los títulos de HAI alcanzó el nivel crítico de más de 40. Además, las vacunas de ARNm-lipoplex no dieron como resultado ninguna actividad neutralizante detectable en la actividad de microneutralización, incluso hasta cinco semanas después de la vacunación.
Como se usa en esta invención en un polinucleótido (como un polinucleótido quimérico, un polinucleótido IVT o un polinucleótido circular), los términos "modificación química" o, según corresponda, "modificado químicamente" se refieren a la modificación con respecto a la adenosina (A), guanosina (G), uridina (U), timidina (T) o citidina (C) ribo- o desoxirribonucleósidos en una o más de sus posiciones, patrón, porcentaje o población. En general, en esta invención, estas expresiones no hacen referencia a las modificaciones de ribonucleótidos en restos de capa de ARNm de extremo 5' de origen natural.
Respecto a un polipéptido, el término “modificación” se refiere a una modificación respecto al conjunto canónico de 20 aminoácidos.
Las modificaciones pueden ser varias modificaciones distintas. En algunas realizaciones, las regiones pueden contener una, dos o más modificaciones (opcionalmente diferentes) de nucleósidos o nucleótidos. En algunas realizaciones, un polinucleótido modificado, introducido en una célula, puede presentar una degradación reducida en la célula, en comparación con un polinucleótido no modificado.
La al menos una modificación química de la presente invención se establece en las reivindicaciones adjuntas. Las modificaciones de los polinucleótidos de las VAN que son útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, las de la Tabla 22. En la tabla se indican el símbolo de la modificación, el tipo de nucleobase y si la modificación se produce de forma natural o no.
Tabla 22. Modificaciones
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Otras modificaciones que pueden ser útiles en los polinucleótidos de las VAN de la presente invención se enumeran en la Tabla 23. La al menos una modificación química de la presente invención se establece en las reivindicaciones adjuntas.
Tabla 23. Tipos de modificaciones adicionales
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Los polinucleótidos de las VAN pueden incluir cualquier enlazador útil entre los nucleósidos. Dichos enlazadores, incluidas las modificaciones de la estructura principal, se dan en la Tabla 24.
Tabla 24. Modificaciones de enlazadores
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Los polinucleótidos de las VAN de la invención pueden incluir cualquier modificación útil, como el azúcar, la nucleobase o el enlace internucleósido (p.ej. a un enlace fosfato/a un enlace fosfodiéster/a la estructura principal fosfodiéster). Uno o más átomos de una nucleobase de pirimidina pueden reemplazarse o sustituirse con amino opcionalmente sustituido, tiol opcionalmente sustituido, alquilo opcionalmente sustituido (por ejemplo, metilo o etilo) o halo (por ejemplo, cloro o flúor). En ciertas realizaciones, están presentes modificaciones (por ejemplo, una o más modificaciones) en cada uno de los enlaces de azúcar y entre nucleósidos. Las modificaciones según la presente invención pueden ser modificaciones de ácidos ribonucleicos (ARN) a ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos treósicos (TNA), ácidos nucleicos de glicol (GNA), ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos bloqueados (LNA) o híbridos de los mismos). En esta invención se describen modificaciones adicionales. La al menos una modificación química de la presente invención se establece en las reivindicaciones adjuntas.
Se pueden introducir nucleótidos modificados no naturales en polinucleótidos, i.e., de las VAN de la invención, o ácidos nucleicos durante la síntesis o possíntesis de las cadenas para lograr las funciones o propiedades deseadas. Las modificaciones pueden estar en un enlace internucleótido, bases de purina o pirimidina, o azúcares. La modificación puede introducirse en el extremo de una cadena o en cualquier otro lugar de la cadena; con síntesis química o con una enzima polimerasa. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de hexitol (HNA) son resistentes a las nucleasas y proporcionan una fuerte hibridación con el ARN. Se han construido ARN mensajeros cortos (ARNm) con residuos de hexitol en dos codones (Lavrik y col., Biochemistry, 40, 11777-11784 (2001), Los efectos antisentido de un oligonucleótido gápmero de HNA quimérico que comprende una secuencia central de fosforotioato flanqueadas por secuencias de HNA 5' y 3' también se han estudiado (véase, por ejemplo, Kang y col., Nucleic Acids Research, vol.
32 (4), 4411-4419 (2004), La preparación y usos de los nucleótidos que comprenden anillos de 6 miembros en la interferencia de ARN, la terapia antisentido u otras aplicaciones se describen en la Solicitud de Patente de EE. UU. No. 2008/0261905, Solicitud de Patente de EE.UU. No. 2010/0009865, y Solicitud PCT No. WO97/30064 a Herdewijn y col.; ). Ejemplos de ácidos nucleicos modificados y su síntesis se describen en la solicitud PCT en tramitación No. PCT/US2012/058519. La síntesis y estrategia de polinucleótidos modificados se revisa en Verma y Eckstein, Annual Review of Biochemistry, vol. 76, 99—134 (1998).
Se pueden usar procedimientos de ligación enzimáticos o químicos para conjugar polinucleótidos o sus regiones con diferentes bloques funcionales, como etiquetas fluorescentes, líquidos, nanopartículas, agentes de administración, etc. Los conjugados de polinucleótidos y polinucleótidos modificados son revisados por Goodchild en Bioconjugate Chemistry, vol. 1(3), 165-187 (1990),.Los documentos Patente de EE.UU. N° 6.835.827 y Patente de EE.UU. N° 6.525.183 a Vinayak y col. enseñan la síntesis de oligonucleótidos marcados usando un soporte sólido marcado.
En ciertas realizaciones, puede ser deseable degradar intracelularmente un polinulcleótido introducido en la célula. Por ejemplo, la degradación de un polinucleótido puede ser preferible si se desea una sincronización precisa de la producción de proteína. Por tanto, en algunas realizaciones, la invención proporciona un polinucleótido que contiene un dominio de degradación, sobre el que se puede actuar de manera dirigida dentro de una célula.
Cualquiera de las regiones de los polinucleótidos puede modificarse químicamente como se enseña en esta invención o como se enseña en el número de solicitud internacional PCT/2012/058519 depositada el 3 de octubre de 2012 y solicitud provisional de EE. UU. 61/837297 depositada el 20 de junio de 2013.
Moléculas de polinucleótidos modificados
La presente invención también incluye bloques de construcción, por ejemplo, ribonucleósidos modificados y ribonucleótidos modificados, de moléculas polinucleotídicas, por ejemplo, de las VAN de la invención. Por ejemplo, estos bloques de construcción pueden ser útiles para preparar los polinucleótidos de la invención. Estos componentes básicos se enseñan en la solicitud internacional No. PCT/2012/058519 depositada el 3 de octubre de 2012 y Solicitud provisional de EE. UU. No. 61/837297 depositada el 20 de junio de 2013.
Modificaciones en el azúcar
Los nucleósidos y nucleótidos modificados (por ejemplo, moléculas de bloques de construcción), que pueden incorporarse en un polinucleótido (por ejemplo, ARN o ARNm, como se describe en esta invención), pueden modificarse en el azúcar del ácido ribonucleico. Por ejemplo, el grupo hidroxilo 2' (OH) se puede modificar o reemplazar con varios sustituyentes diferentes. Sustituciones ejemplares en la posición 2' incluyen, pero no se limitan a, H, halo, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido; alcoxi C1-6 opcionalmente sustituido; ariloxi C6-10 opcionalmente sustituido; cicloalquilo C3-8 opcionalmente sustituido; cicloalcoxi C3-8 opcionalmente sustituido; ariloxi C6-10 opcionalmente sustituido; aril-C6-10 opcionalmente sustituido, alcoxi C1-6 opcionalmente sustituido, (heterociclil) oxi C1-12 opcionalmente sustituido; un azúcar (por ejemplo, ribosa, pentosa o cualquiera de los descritos en esta invención); un polietilenglicol (PEG), - O (CH2CH2O)nCH2CH2OR, donde R es H o alquilo opcionalmente sustituido, y n es un número entero de 0 a 20 (por ejemplo, de 0 a 4, de 0 al 8, de 0 a 10, de 0 a 16, de 1 a 4, de 1 a 8, de 1 a 10, de 1 a 16, de 1 a 20, de 2 a 4, de 2 a 8, de 2 a 10, de 2 a 16, de 2 a 20, de 4 a 8, de 4 a 10, de 4 a 16, y de 4 a 20); ácidos nucleicos "bloqueados" (LNA) donde el hidroxilo 2' está conectado por un alquileno C1-6 o puente heteroalquileno C1-6 al carbono 4' del mismo azúcar ribosa, donde los puentes ejemplares incluyen metileno, propileno , puentes de éter o amino; aminoalquilo, como se define en esta invención; aminoalcoxi, como se define en esta invención; amino como se define en esta invención; y aminoácido, como se define en esta invención
Generalmente, el ARN incluye el grupo de azúcar ribosa, que es un anillo de 5 miembros que tiene oxígeno. Nucleótidos modificados no limitantes ejemplares incluyen la sustitución del oxígeno en la ribosa (por ejemplo, con S, Se o alquileno, como metileno o etileno); adición de un doble enlace (por ejemplo, para reemplazar la ribosa con ciclopentenilo o ciclohexenilo); contracción del anillo de la ribosa (por ejemplo, para formar un anillo de 4 miembros de ciclobutano u oxetano); expansión de anillo de ribosa (por ejemplo, para formar un anillo de 6 o 7 miembros que tiene un carbono o heteroátomo adicional, tal como anhidrohexitol, altritol, manitol, ciclohexanilo, ciclohexenilo y morfolino que también tiene una estructura principal de fosforamidato); formas multicíclicas (p. ej., triciclo; y formas "desbloqueadas", como ácido nucleico de glicol (GNA) (p. ej., R-GNA o S-GNA, donde la ribosa se reemplaza por conjuntos de glicol unidas a enlaces fosfodiéster), treosa ácido nucleico (TNA , donde la ribosa se reemplaza con a-L-treofuranosil- (3 ^ 2')) y ácido nucleico peptídico (PNA, donde los enlaces 2-amino-etil-glicina reemplazan la estructura principal de ribosa y fosfodiéster). El grupo de azúcar también puede contener uno o más carbonos que posean la configuración estereoquímica opuesta a la del carbono correspondiente en la ribosa. Por tanto, una molécula de polinucleótido puede incluir nucleótidos que contienen, por ejemplo, arabinosa, como azúcar. Estas modificaciones de azúcares se enseñan en la solicitud internacional No. PCT/2012/058519 depositada el 3 de octubre de 2012 y en la Solicitud provisional de EE. UU. No. 61/837297 depositada el 20 de junio de 2013.
Modificaciones en la Nucleobase
La presente descripción proporciona nucleótidos y nucleósidos modificados. Tal como se describe en esta invención, "nucleósido" se define como un compuesto que contiene una molécula de azúcar (por ejemplo, una pentosa o ribosa) o un derivado de la misma, en combinación con una base orgánica (por ejemplo, una purina o pirimidina) o un derivado de la misma (que también se denomina "nucleobase" en esta invención). Tal como se describe en esta invención, "nucleótido" se define como un nucleósido que incluye un grupo fosfato. Los nucleótidos modificados pueden sintetizarse mediante cualquier procedimiento útil, tal como se describe en esta invención (por ejemplo, de forma química, enzimática o recombinante, para incluir uno o más nucleósidos no naturales o modificados). Los polinucleótidos pueden comprender una región o regiones de nucleósidos enlazados. Estas regiones pueden tener enlaces de estructura principal variable. Los enlaces pueden ser enlaces fosfodiéster estándares, en cuyo caso los polinucleótidos comprenderían regiones de nucleótidos.
La formación de pares de bases del nucleótido modificados abarca no sólo los pares de bases estándar adenosinatimina, adenosina-uracilo o guanosina-citosina, sino también a los pares de bases formados entre nucleótidos y/o nucleótidos modificados que comprenden bases modificadas o no estándares, donde la disposición de donantes de enlaces de hidrógeno y los aceptores de enlaces de hidrógeno permiten la unión de hidrógenos entre una base no estándar y una base estándar, o entre dos estructuras complementarias de bases no estándar. Un ejemplo de dicha formación de pares de bases no estándar es la formación de pares de bases entre la inosina y adenina, citosina o uracilo del nucleótido modificado.
Los nucleótidos y nucleósidos modificados pueden incluir una nucleobase modificada. Ejemplos de nucleobases que se encuentran en el ARN incluyen, de modo no taxativo, adenina, guanina, citosina y uracilo. Ejemplos de nucleobases que se encuentran en el ADN incluyen, de modo no taxativo, adenina, guanina, citosina y timina. Estas nucleobases modificadas (incluidas las distinciones entre naturales y no naturales) se enseñan en la solicitud internacional No. PCT/2012/058519 depositada el 3 de octubre de 2012 y en la solicitud provisional de EE. UU. No. 61/837297 depositada el 20 de junio de 2013.
Combinaciones de azúcares modificados, nucleobases y enlaces internucleosídicos
Los polinucleótidos de la invención, i.e. las VAN de la invención, pueden incluir una combinación de modificaciones en el azúcar, la nucleobase, y/o el enlace internucleosídico. Estas combinaciones pueden incluir una o más modificaciones descritas en esta invención. La al menos una modificación química de la presente invención se establece en las reivindicaciones adjuntas. La al menos una modificación química de la presente invención se establece en las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos de nucleótidos modificados y combinaciones de nucleótidos modificados se proporcionan a continuación en la Tabla 25. Estas combinaciones de nucleótidos modificados pueden usarse para formar los polinucleótidos de la invención. A menos que se indique lo contrario, los nucleótidos modificados pueden sustituirse completamente por los nucleótidos naturales de los polinucleótidos de la invención. Como ejemplo no limitante, el nucleótido natural uridina puede sustituirse con un nucleósido modificado descrito en esta invención. En otro ejemplo no limitante, el nucleótido uridina natural puede estar parcialmente sustituido (p. ej., aproximadamente 0,1 %, 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99,9 %) con al menos uno de los nucleósidos modificados descritos en esta invención. Cualquier combinación de base/azúcar o enlazador se puede incorporar en los polinucleótidos de la invención y tales modificaciones se enseñan en la solicitud internacional No. PCT/2012/058519 depositada el 3 de octubre de 2012 y en la Solicitud provisional de EE. UU. No.
61/837297 depositada el 20 de junio de 2013.
Tabla 25. Combinaciones
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V. Composiciones farmacéuticas de vacunas
Formulaciones, Administración, Entrega y Dosificación
En la presente descripción se proporcionan composiciones farmacéuticas que incluyen vacunas de ARN de VSR y complejos y/o composiciones de vacunas de ARN opcionalmente en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
Los presentes inventores han descubierto que las VAN son superiores a las vacunas actuales de varias formas. Primero, la inyección subcutánea y/o intradérmica es mejor que la administración intramuscular como vía de administración. En segundo lugar, el suministro de nanopartículas lipídicas es superior a otras formulaciones, incluido el enfoque de protamina en la bibliografía, en un factor de entre 10 y 100 veces y no se encontró que fueran necesarios adyuvantes adicionales. En tercer lugar, las VAN modificadas y formuladas fueron superiores a las VAN formuladas sin modificar en un factor de 50 veces.
La presente divulgación proporciona VAN y composiciones y complejos farmacéuticos de VAN opcionalmente en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir opcionalmente una o más sustancias activas adicionales, por ejemplo, sustancias terapéuticamente y/o profilácticamente activas. Las composiciones farmacéuticas de la presente descripción pueden ser estériles y/o estar libre de pirógenos. Es posible encontrar consideraciones generales de la formulación y/o fabricación de agentes farmacéuticos, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición, Lippincott Williams & Wilkins, 2005.
En algunas realizaciones, las composiciones se administran a seres humanos, pacientes o sujetos humanos. A los efectos de la presente descripción, la expresión «ingrediente activo» hace referencia en general a las vacunas de ARN o los polinucleótidos contenidos en esta invención, por ejemplo, polinucleótidos de ARN que codifican polipéptidos antigénicos.
Si bien las descripciones de las composiciones farmacéuticas proporcionadas en esta invención se orientan principalmente a las composiciones farmacéuticas que son adecuadas para la administración a seres humanos, el experto en la técnica comprenderá que tales composiciones son adecuadas, en términos generales, para la administración a cualquier otro animal, por ejemplo, a animales no humanos, por ejemplo, mamíferos no humanos. Es conocida la modificación de las composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración a seres humanos para hacerlas adecuadas para la administración a diversos animales y el experto farmacéutico veterinario puede diseñar y/o llevar a cabo dicha modificación con experimentación meramente de rutina, si hubiese. Los sujetos para los cuales se contempla la administración de las composiciones farmacéuticas incluyen, entre otros, seres humanos y/o primates; mamíferos, incluyendo mamíferos pertinentes en términos comerciales, tales como ganado, cerdos, caballos, ovejas, gatos, perros, ratones y/o ratas; y/o aves, incluyendo aves pertinentes en términos comerciales, tales como aves de corral, pollos, patos, gansos y/o pavos.
Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas descritas en esta invención se pueden preparar mediante cualquier procedimiento conocido o que se desarrolle posteriormente en la técnica de la farmacología. En general, tales procedimientos de preparación incluyen la etapa de asociar el ingrediente activo con un excipiente y/o uno o más ingredientes accesorios y, a continuación, si fuera necesario y/o deseable, dividir, formar y/o envasar del producto en un conjunto de dosis única o de dosis múltiples deseado.
Las cantidades relativas del ingrediente activo, el excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica según la invención variarán conforme a la identidad, el tamaño y/o la condición del sujeto tratado y adicionalmente según la vía de administración de la composición. A modo de ejemplo, la composición puede comprender entre el 0,1 y el 100 %, por ejemplo, entre el 0,5 y el 50 %, entre el 1 - 30 %, entre el 5 - 80 % o al menos el 80 % (p/p) de ingrediente activo.
Formulaciones
Las VAN de la divulgación se pueden formular utilizando uno o más excipientes para: (1) aumentar la estabilidad; (2) aumentar la transfección celular; (3) permitir la liberación sostenida o retardada (p. ej., a partir de una formulación de depósito); (4) alterar la biodistribución (p. ej., dirigirse a tejidos o tipos de células específicos); (5) aumentar la traducción de la proteína codificada in vivo; y/o (6) alterar el perfil de liberación de la proteína codificada (antígeno) in vivo. Además de los excipientes tradicionales tales como cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes superficialmente activos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, los excipientes de la presente divulgación pueden incluir, sin limitación, lipidoides, liposomas, nanopartículas lipídicas, polímeros, lipoplejos, nanopartículas de núcleoenvoltura, péptidos, proteínas, células transfectadas con VAN (p. ej., para trasplante en un sujeto), hialuronidasa, imitadores de nanopartículas y combinaciones de los mismos.
En consecuencia, las formulaciones de la divulgación pueden incluir uno o más excipientes, cada uno en una cantidad que puede aumentar la estabilidad de la VAN, aumentar la transfección celular por la VAN, aumentar la expresión de proteína codificada por polinucleótidos y/o alterar el perfil de liberación de VAN, proteínas codificadas por polinucleótidos. Además, los polinucleótidos de la presente descripción pueden formularse utilizando nanopartículas de ácido nucleico autoensambladas.
Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas descritas en esta invención se pueden preparar mediante cualquier procedimiento conocido o que se desarrolle posteriormente en la técnica de la farmacología. En general, tales procedimientos preparatorios incluyen el etapa de asociar el ingrediente activo con un excipiente y/o uno o más de otros ingredientes accesorios.
Una composición farmacéutica según la invención puede prepararse, empaquetarse y/o venderse a granel, como una dosis unitaria individual y/o como una pluralidad dosis unitarias individuales. Tal como se usa en esta invención, una «dosis unitaria» es la cantidad discreta de composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del ingrediente activo. La cantidad del ingrediente activo es, por lo general, equivalente a la dosificación del ingrediente activo que se administraría a un sujeto y/o una fracción conveniente de tal dosificación tal como, por ejemplo, la mitad o un tercio de tal dosificación.
Cantidades relativas del ingrediente activo, el excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica según la presente divulgación puede variar, conforme a la identidad, el tamaño y/o la condición del sujeto tratado y adicionalmente según la vía de administración de la composición. Por ejemplo, la composición puede comprender entre 0,1 % y 99 % (p/p) del ingrediente activo. A modo de ejemplo, la composición puede comprender entre el 0,1 y el 100 %, por ejemplo, entre el ,5 y el 50 %, entre el 1 - 30 %, entre el 5 - 80 % o al menos el 80 % (p/p) del ingrediente activo.
En algunos aspectos, las formulaciones descritas en esta invención pueden contener al menos un polinucleótido, por ejemplo, un polinucleótido que codifica un antígeno. Como un ejemplo no limitante, las formulaciones pueden contener 1, 2, 3, 4 o 5 polinucleótidos.
En un aspecto, las formulaciones descritas en esta invención pueden comprender más de un tipo de polinucleótido, por ejemplo, polinucleótido que codifica antígenos. En un aspecto, la formulación puede comprender un polinucleótido quimérico en forma lineal y circular. En otro aspecto, la formulación puede comprender un polinucleótido circular y un polinucleótido IVT. En otro aspecto más, la formulación puede comprender un polinucleótido IVT, un polinucleótido quimérico y un polinucleótido circular.
En un aspecto, la formulación puede contener proteínas que codifican polinucleótidos seleccionadas de entre categorías tales como, entre otras, proteínas humanas, proteínas veterinarias, proteínas bacterianas, proteínas biológicas, anticuerpos, proteínas inmunogénicas, péptidos y proteínas terapéuticos, proteínas secretadas, proteínas de membrana plasmática. , proteínas citoplasmáticas y del citoesqueleto, proteínas unidas a la membrana intracelular, proteínas nucleares, proteínas asociadas con enfermedades humanas y/o proteínas asociadas con enfermedades no humanas. En un aspecto, la formulación contiene al menos tres proteínas que codifican polinucleótidos. En un aspecto, la formulación contiene al menos cinco proteínas que codifican polinucleótidos.
Las formulaciones farmacéuticas pueden comprender adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable, que, tal como se utiliza en esta invención, incluye todos los solventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes activos de superficie, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes y similares, según corresponda a la forma de dosificación particular deseada. Se conocen en la técnica varios excipientes para formular composiciones farmacéuticas y técnicas para preparar la composición (véase Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edición, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006;).
El uso de un medio excipiente convencional puede contemplarse dentro del alcance de la presente descripción, excepto en la medida en que cualquier medio excipiente convencional pueda ser incompatible con una sustancia o sus derivados, por ejemplo, al producir algún efecto biológico indeseable o al interactuar de otra manera de una manera perjudicial con cualquier otro componente de la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, el tamaño de partícula de la nanopartícula lipídica puede aumentarse y/o disminuirse. El cambio en el tamaño de partícula puede ayudar a contrarrestar una reacción biológica tal como, entre otras, la inflamación, o puede aumentar el efecto biológico del ARNm modificado administrado a mamíferos.
Excipientes farmacéuticamente aceptables utilizados en la elaboración de composiciones farmacéuticas incluyen, de modo no taxativo, diluyentes inertes, agentes activos de superficie y/o emulsionantes, conservantes, agentes tampones, agentes lubricantes y/o aceites. Tales excipientes pueden incluirse opcionalmente en composiciones farmacéuticas de la divulgación.
Nanopartículas lipídicas
Las VAN de la invención se formulan utilizando una o más nanopartículas lipídicas.
En algunas realizaciones, la proporción de PEG en las formulaciones de nanopartículas lipídicas (NPL) se puede aumentar o disminuir y/o la longitud de la cadena de carbono del lípido PEG se puede modificar de C14 a C18 para alterar la farmacocinética y/o la biodistribución de las formulaciones de NPL. Como ejemplo no taxativo, las formulaciones de NPL pueden contener de aproximadamente 0,5 % a aproximadamente 3,0 %, de aproximadamente 1,0 % a aproximadamente 3,5 %, de aproximadamente 1,5 % a aproximadamente 4,0 %, de aproximadamente 2,0 % a aproximadamente 4,5 %, de aproximadamente 2,5 % a aproximadamente 5,0 % y/o de aproximadamente 3,0 % a aproximadamente 6,0 % de la relación molar lipídica de PEG-c-DOMG (R-3-[(w-metoxipoli(etilenglicol)2000)carbamoil)]-1,2-dimiristiloxipropil-3-amina) (la que también se denomina en esta invención PEG-DOMG) en comparación con el lípido catiónico, DSPC y colesterol. En otra realización, el PEG-c-DOMG se puede reemplazar con un lípido PEG como, entre otros, PEG-DSG (1,2-Distearoil-sn-glicerol, metoxipolietilenglicol), PEG-DMG (1,2- dimiristoil-sn-glicerol) y/o PEG-DPG (1,2-dipalmitoil-sn-glicerol, metoxipolietilenglicol). El lípido catiónico se puede seleccionar de entre cualquier lípido conocido en la técnica tal como, de modo no taxativo, DLin-MC3-DMA, DLin-DMA, C12-200 y DLin-KC2-DMA.
En una realización, las VAN se pueden formular en una nanopartícula lipídica como las descritas en la Publicación Internacional No. WO2012170930,.
En un aspecto, la formulación de VAN que comprende el polinucleótido es una nanopartícula que puede comprender al menos un lípido. El lípido se puede seleccionar, de modo no taxativo, de entre DLin-DMA, Dlin-K-DMA, 98N12-5, C12-200, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA, DODMA, PLGA, PEG, PEG-DMG, lípidos pegilados y lípidos de aminoalcoholes. En otros aspectos, el lípido puede ser un lípido catiónico tal como, de modo no taxativo, DLin-DMA, DLin-D-DMA, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA, DODMA y lípidos de aminoalcoholes. El lípido catiónico de aminoalcohol puede ser cualquiera de los lípidos descritos y/o producidos mediante los procedimientos descritos en la publicación de patente de EE. UU. N° US20130150625. Como ejemplo no taxativo, el lípido catiónico puede ser 2-amino-3-[(9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1 -iloxi]-2-{[(9Z,2Z)-octadeca-9,12-dien-1 -iloxi]metil}propan-1 -ol (Compuesto 1 en US20130150625); 2-amino-3-[(9Z)-octadeca-9-en-1-iloxi]-2-{[(9Z)-octadeca-9-en-1-iloxi]metil}propan-1-ol (Compuesto 2 en US20130150625); 2-amino-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-2-[(octiloxi)metil]propan-1-ol (Compuesto 3 en US20130150625); y 2-(dimetilamino)-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-2-{[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]metil}propan-1-ol (Compuesto 4 en US20130150625); o cualquier sal o estereoisómero farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Usualmente, las formulaciones de nanopartículas lipídicas comprenden un lípido, en particular, un lípido catiónico ionizable, por ejemplo, 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) o di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato (L319), y además comprende un lípido neutro, un esterol y una molécula capaz de reducir la agregación de partículas, por ejemplo, un lípido PEG o modificado por PEG.
En una realización, la formulación de nanopartículas lipídicas consiste esencialmente en (i) al menos un lípido seleccionado de entre el grupo que consiste en 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil -4-dimetilaminobutirato de metilo (DLin-MC3-DMA), y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-il) (L319); (ii) un lípido neutro seleccionado de entre DSPC, DPPC, p Op C, Do PE y SM; (iii) un esterol, por ejemplo, colesterol; y (iv) un PEG-lípido, por ejemplo, PEG-DMG o PEG-cDMA, en una relación molar de aproximadamente 20-60 % de lípido catiónico: 5-25 % de lípido neutro: 25-55 % de esterol; 0,5-15% PEG-lípido.
En un aspecto, la formulación incluye de aproximadamente 25 % a aproximadamente 75 % en base molar de un lípido catiónico seleccionado de entre 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA), y di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato (L319), p.ej, desde alrededor del 35 hasta alrededor del 65 %, desde alrededor del 45 hasta alrededor del 65 %, alrededor del 60 %, alrededor del 57,5 %, alrededor del 50 % o alrededor del 40 % en base molar. En la invención, la relación molar de la nanopartícula lipídica es la que se establece en las reivindicaciones adjuntas.
En un aspecto, la formulación incluye desde alrededor del 0,5 % hasta alrededor del 15 % en base molar del lípido neutro, p.ej., desde alrededor del 3 hasta alrededor del 12 %, desde alrededor del 5 hasta alrededor del 10 % o alrededor del 15 %, alrededor del 10 %, o alrededor del 7,5% en base molar. Lípidos neutros ejemplares incluyen, de modo no taxativo, DSPC, POPC, DPPC, DOPE y SM. En un aspecto, la formulación incluye de aproximadamente 5 % a aproximadamente 50 % en una base molar del esterol (por ejemplo, aproximadamente 15 a aproximadamente 45 %, aproximadamente 20 a aproximadamente 40 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 38,5 %, aproximadamente 35 % o aproximadamente 31 % en una base molar. Un esterol ejemplar es el colesterol. En un aspecto, la formulación incluye de aproximadamente 0,5 % a aproximadamente 20 % en una base molar del PEG o lípido modificado por PEG (por ejemplo, aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 %, aproximadamente 0.5 y aproximadamente 5 %, aproximadamente 1,5 %, aproximadamente 0,5 %, aproximadamente 1,5 %, aproximadamente 3,5 %, o aproximadamente 5 % en una base molar. En algunas realizaciones, el PEG o lípido modificado por PEG comprende una molécula de PEG de peso molecular promedio de 2.000 Da. En otras realizaciones, el PEG o lípido modificado por PEG comprende una molécula de PEG de peso molecular promedio menor que 2.000 Da, por ejemplo, aproximadamente 1.500 Da, aproximadamente 1.000 Da o aproximadamente 500 Da. Lípidos modificados por PEG ejemplares incluyen, de modo no taxativo, PEG-diestearoil glicerol (PEG-DMG) (al que también se denomina PEG-C14 o C14-PEG), PEG-cDMA (se menciona adicionalmente en Reyes y col. J. Controlled Release, 107, 276-287 (2005)
En la invención, la relación molar de la nanopartícula lipídica es la establecida en las reivindicaciones adjuntas. En un aspecto, las formulaciones de la presente descripción incluyen 25-75 % de un lípido catiónico seleccionado de entre 2.2- dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) y di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato (L319), 0,5-15 % del lípido neutro, 5­ 50 % del esterol y 0,5-20 % del PEG o lípido modificado por PEG en una base molar.
En un aspecto, las formulaciones de las invenciones incluyen 35-65 % de un lípido catiónico seleccionado de entre 2.2- dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) y di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato (L319), 3-12 % del lípido neutro, 15­ 45 % del esterol y 0,5-10 % del PEG o lípido modificado por PEG en una base molar.
En una realización, las formulaciones de las invenciones incluyen 45-65 % de un lípido catiónico seleccionado de entre 2.2- dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) y di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato (L319), 5-10 % del lípido neutro, 25­ 40 % del esterol y 0,5-10 % del PEG o lípido modificado por PEG en una base molar.
En una realización, las formulaciones de las invenciones incluyen aproximadamente 60 % de un lípido catiónico seleccionado de entre 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) y di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato (L319), aproximadamente 7,5 % del lípido neutro, aproximadamente 31 % del esterol y aproximadamente 1,5 % del PEG o lípido modificado por PEG en una base molar.
En una realización, las formulaciones de las invenciones incluyen aproximadamente 50 % de un lípido catiónico seleccionado de entre 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) y di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato (L319), aproximadamente 10 % del lípido neutro, aproximadamente 38,5 % del esterol y aproximadamente 1,5 % del PEG o lípido modificado por PEG en una base molar.
En una realización, las formulaciones de las invenciones incluyen aproximadamente 50 % de un lípido catiónico seleccionado de entre 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) y di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato (L319), aproximadamente 10 % del lípido neutro, aproximadamente 35 % del esterol, aproximadamente 4,5 % o aproximadamente 5 % del PEG o lípido modificado por PEG, y aproximadamente 0,5 % del lípido diana en una base molar.
En una realización, las formulaciones de las invenciones incluyen aproximadamente 40 % de un lípido catiónico seleccionado de entre 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) y di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato (L319), aproximadamente 15 % del lípido neutro, aproximadamente 40 % del esterol y aproximadamente 5 % del PEG o lípido modificado por PEG en una base molar.
En una realización, las formulaciones de las invenciones incluyen aproximadamente 57,2 % de un lípido catiónico seleccionado de entre 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) y di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato (L319), aproximadamente 7,1 % del lípido neutro, aproximadamente 34,3 % del esterol y aproximadamente 1,4 % del PEG o lípido modificado por PEG en una base molar.
En una realización, las formulaciones de las invenciones incluyen aproximadamente 57,5 % de un lípido catiónico seleccionado de entre el lípido PEG que es PEG-cDMA (PEG-cDMA se discute con más detalle en Reyes Y COl. (J. Controlled Release, 107, 276-287 (2005), aproximadamente el 7,5 % del lípido neutro, aproximadamente el 31,5 % del esterol, y aproximadamente el 3,5 % del PEG o lípido modificado con PEG sobre una base molar.
En realizaciones particulares, la relación lipídica molar es aproximadamente 50/10/38,5/1,5 (% molar de lípido catiónico/lípido neutro, por ejemplo, DSPC/Col/lípido modificado por PEG, por ejemplo, PEG-DMG, PEG-DSG o PEG-DPG), 57,2/7,1134,3/1,4 (% molar de lípido catiónico/lípido neutro, p.ej., DPPC/Col/ lípido modificado por PEG, p.ej., PEG-cDMA), 40/15/40/5 (% molar de lípido catiónico/ lípido neutro, p.ej., DSPC/Col/ lípido modificado por PEG, p.ej., PEG-DMG), 50/10/35/4.5/0.5 (% molar de lípido catiónico/ lípido neutro, p.ej., DSPC/Col/ lípido modificado por Pe G, p.ej., PEG-DSG), 50/10/35/5 (lípido catiónico/ lípido neutro, p.ej., DSPC/Col/ lípido modificado por PEG, p.ej., PEG-DMG), 40/10/40/10 (% molar de lípido catiónico/ lípido neutro, p.ej., DSPC/Col/ lípido modificado por PEG, p.ej., PEG-DMG o PEG-cDMA), 35/15/40/10 (% molar de lípido catiónico/ lípido neutro, p.ej., DSPC/Col/ lípido modificado por PEG, p.ej., PEG-DMG o PEG-cDMA) o 52/13/30/5 (% molar de lípido catiónico/ lípido neutro, p.ej., DSPC/Col/ lípido modificado por PEG, p.ej., PEG-Dm G o PEG-cDMA).
Se describen ejemplos de composiciones de nanopartículas de lípidos y procedimientos para prepararlas, por ejemplo, en Semple y col. (2010) Nat. Biotechnol. 28:172-176; Jayarama y col. (2012), Angew. Chem. Int. Ed., 51: 8529-8533; y Maier y col. (2013) Molecular Therapy 21, 1570-1578.
La nanopartícula lipídica puede comprender un lípido catiónico, un lípido no catiónico, un lípido con PEG y un lípido estructural. Como ejemplo no taxativo, la nanopartícula lipídica comprende aproximadamente 50 % del lípido catiónico Dlin-KC2-DMA, aproximadamente 10 % del lípido no catiónico DSPC, aproximadamente 1,5 % del lípido con PEG PEG-DOMG y aproximadamente 38,5 % del lípido estructural colesterol. Como ejemplo no taxativo, la nanopartícula lipídica comprende aproximadamente 50 % del lípido catiónico Dlin-MC3-DMA, aproximadamente 10 % del lípido no catiónico DSPC, aproximadamente 1,5 % del lípido con PEG PEG-DOMG y aproximadamente 38,5 % del lípido estructural colesterol. Como ejemplo no taxativo, la nanopartícula lipídica comprende aproximadamente 50 % del lípido catiónico Dlin-MC3-DMA, aproximadamente 10 % del lípido no catiónico DSPC, aproximadamente 1,5 % del lípido con PEG PEG-DMG y aproximadamente 38,5 % del lípido estructural colesterol. Incluso como otro ejemplo no taxativo, la nanopartícula lipídica comprende aproximadamente 55 % del lípido catiónico L319, aproximadamente 10 % del lípido no catiónico DSPC, aproximadamente 2,5 % del lípido con PEG PEG-DMG y aproximadamente 32,5 % del lípido estructural colesterol.
En una realización, el lípido catiónico puede seleccionarse, de modo no taxativo, de entre un lípido catiónico descrito en las Publicaciones Internacionales No. WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365, WO2012044638, WO2010080724, WO201021865, WO2008103276, WO2013086373 y WO2013086354, Patentes de EE. UU. No. 7.893.302, 7.404.969, 8.283.333, y 8.466.122 y Publicaciones de Patente de EE. UU. No. US20100036115, US20120202871, US20130064894, US20130129785, US20130150625, US20130178541 y US20130225836; . En otra realización, el lípido catiónico puede seleccionarse de entre, pero sin limitarse a, la fórmula A descrita en las Publicaciones Internacionales No. WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965,WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365,WO2012044638 y WO2013116126 o Publicación de Patente de EE. UU. No. US20130178541 y US20130225836; . En otra realización más, el lípido catiónico puede seleccionarse de entre, pero sin limitarse a, la fórmula CLI-CLXXIX de la Publicación Internacional No. WO2008103276,fórmula CLI-CLXXIX de Patente de EE. UU. No. 7,893,302, fórmula CLI-CLXXXXII de Patente de EE. UU. No. 7.404.969 y formula I-VI de Publicación de Patente de EE. UU. No. US20100036115, fórmula I de Publicación de Patente de EE. UU. No US20130123338; . Como ejemplo no limitante, el lípido catiónico se puede seleccionar de entre (20Z,23Z)-N,N-dimetilnonacosa-20,23-dien-10-amina, (17Z,20Z)-N,N-dimemilhexacosa-17,20-dien-9-amina, (1 Z, 19Z)-N5N~dimetilpentacosa~16, 19-dien-8-amina, (13Z,16Z)-N,N-dimetildocosa-13,16-dien-5-amina, (12Z,15Z)-NJN-dimetilhenicosa-12,15-dien-4-amina, (14Z,17Z)-N,N-dimetiltricosa-14,17-dien-6-amina, (15Z,18Z)-N,N-dimetiltetracosa-15,18-dien-7-amina, (18Z,21Z)-N,N-dimetilheptacosa-18,21-dien-10-amina, (15Z, 18z )-N,N-dimetiltetracosa-15,18-dien-5-amina, (14Z,17Z)-N,N-dimetiltricosa-14,17-dien-4-amina, (19Z,22Z)-N,N-dimeihiloctacosa-19,22-dien-9-amina, (18Z,21 Z)-N,N-dimetilheptacosa- 18 ,21 -dien-8 -amina, (17Z,20Z)-N,N-dimetilhexacosa- 17,20-dien-7-amina, (16Z;19Z)-N,N-dimetilpentacosa-16,19-dien-6-amina, (22Z,25Z)-N,N-dimetilhentriaconta-22,25-dien- 10-amina, (21 Z ,24Z)-N;N-dimetiltriaconta-21 ,24-dien-9-amina, (18z )-N,N-dimetilheptacos-18-en-10-amina, (17Z)-N,N-dimetilhexacos-17-en-9-amina, (19Z,22Z)-NJN-dimetiloctacosa-19,22-dien-7-amina, N,N-dimetilheptacosan-10-amina, (20Z,23Z)-N-etil-N-metilnonacosa-20J23-dien-10-amina, 1 -[(11Z,14Z)-1-nonilicosa-1 1,14-dien-1-il] pirrolidina, (20Z)-N,N-dimetilheptacos-20-en-1 0-amina, (15Z)-N,N-dimetil eptacos-15-en-l 0-amina, (14Z)-N,N-dimetilnonacos-14-en-l 0-amina, (17Z)-N,N-dimetilnonacos-17-en-l 0-amina, (24Z)-N,N-dimetiltritriacont-24-en-l 0-amina, (20Z)-N,N-dimetilnonacos-20-en-l 0-amina, (22Z)-N,N-dimetilhentriacont-22-en-l 0-amina, (16Z)-N,N-dimetilpentacos-16-en-8-amina, (12Z, 15Z)-N,N-dimetil-2-nonilhenico sa- 12 , 15 -dien- 1 -amina, (13Z, 16Z)-N,N-dimetil-3-nonildocosa-l 3, 16-dien-l —amina, N,N-dimetil-l-[(l S,2R)-2-octilciclopropil] eptadecan-8-amina, 1 -[(1 S,2R)-2-hexilciclopropil]-N,N-dimetilnonadecan- 10-amina, N,N-dimetil- 1 - [(1 S ,2r )-2-octilciclopropil]nonadecan- 10-amina, N,N-dimetil-21~[(lS,2R)-2-octilciclopropil]henicosan-l 0-amina, N,N-dimetil- 1 -[(1 S ,2S)-2- { [(lR,2R)-2-pentilciclopropil]metil} ciclopropil]nonadecan- 10-amina, N,N-dimetil- 1 -[(1 S,2R)-2-octilciclopropil]hexadecan-8-amina, N,N-dimetiH -[(1R,2S)-2-undecilciclopropil]tetradecan-5-amina, N,N-dimetil-3- {7-[(1 S,2R)-2-octilciclopropil]heptil} dodecan- 1 -amina, 1 - [(1R,2 S)-2-hepti lciclopropi 1] -N,N-dimetiloctadecan-9 -amina, 1-[(1 S,2R)-2-decilciclopropil]-N,N-dimetilpentadecan-6-amina, N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]pentadecan-8-amina, RN,N-dimetil-1-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1- iloxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina, SN,N-dimetil-1-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-3-(octiloxi)propan-2 -amina, 1-{2-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-1-[(octiloxi)metil]etil)pirrolidina, (2S)-N,N-dimetil- 1-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-3-[(5Z)-oct-5-en-1-iloxi]propan-2-amina, 1-{2- [(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-1-[(octiloxi)metil]etil}azetidina, (2S)-1-(hexiloxi)-N,N-dimetil-3- [(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, (2S)-1-(heptiloxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)- octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, N,N-dimetil-1-(noniloxi)-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi ]propan-2-amina, N,N-dimetil-1-[(9Z)-octadec-9-en-1-iloxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina; (2S)-N,N-dimetil-1-[(6Z,9Z,12Z)-octadeca-6,9,12-trien-1-iloxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina, (2S) -1-[(11Z,14Z)-icosa-11,14-dien-1-iloxi]-N,N-dimetil-3-(pentiloxi)propan-2-amina, (2S)-1-(hexiloxi)-3-[(11Z,14Z)-icosa-11,14-dien-1-iloxi]-N,N-dimetilpropan-2-amina, 1-[(11Z,14Z)-icosa-11,14-dien-1-iloxi]-N,N-dimetil-3-(octiloxi)propan-2-amina, 1-[(13Z,16Z)-docosa-13,16-dien-1-iloxi]-N,N-dimetil-3-(octiloxi)propan-2-amina, (2S)-1-[(13Z,16Z)-docosa-13,16-dien-1-iloxi]-3 -(hexiloxi)-N,N-dimetilpropan-2-amina, (2S)-1-[(13Z)-docos-13-en-1-iloxi]-3-(hexiloxi)-N,N-dimetilpropan-2-amina, 1-[(13Z)-docos-13-en-1-iloxi]-N,N-dimetil-3-(octiloxi)propan-2-amina, 1-[(9Z)-hexadec-9-en-1-iloxi]-N,N-dimetil-3-(octiloxi)propan-2-amina, (2R)-N,N-dimetil-H(1-metoilo ctil)oxi]-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, (2R)-1 -[(3,7-dimetiloctil)oxi]-N, N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1 -iloxi]propan-2-amina, N,N-dimetil-1-(octiloxi)-3-({8-[(1S,2S)-2-{(1R,2R)-2-pentilciclopropil]metil}ciclopropil]octil}oxi)propan-2-amina, N,N-dimetil-1-{[8-(2-oclilciclopropil)octil]oxi}-3-(octiloxi)propan-2-amina y (1lE,20Z,23Z)-N;N-dimetilnonacosa-l1,20,2-trien-10-amina o una sal o estereoisómero farmacéuticamente aceptable de los mismos.
En una realización, el lípido puede ser un lípido escindible como aquellos que se describen en la Publicación internacional No. WO2012170889,
En otra realización, el lípido puede ser un lípido catiónico tal como, pero no limitado a, la Fórmula (I) de la Solicitud de Patente de EE. UU. No. US20130064894,.
En una realización, el lípido catiónico se puede sintetizar mediante procedimientos conocidos en la técnica y/o como se describe en las Publicaciones Internacionales Nos. WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365, WO2012044638, WO2010080724, WO201021865, WO2013086373 y WO2013086354;
En otra realización, el lípido catiónico puede ser un lípido catiónico trialquilo. Ejemplos no taxativos de los lípidos catiónicos de trialquilo y procedimientos para realizar y usar los lípidos catiónicos de trialquilo se describen en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013126803,.
En una realización, las formulaciones de LNP de las VAN pueden contener PEG-c-DOMG en una proporción molar de lípidos del 3 %. En otra realización, las RVAN de las formulaciones de LNP pueden contener PEG-c-DOMG en una proporción molar de lípidos del 1,5 %.
En una realización, las composiciones farmacéuticas de las VAN pueden incluir al menos uno de los lípidos PEGilados descritos en la Publicación Internacional No. WO2012099755,.
En una realización, la formulación de LNP puede contener PEG-DMG 2000 (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000). En una realización, la formulación de NPL puede contener PEG-DMG 2000, un lípido catiónico conocido en la técnica y al menos otro componente adicional. En otra realización, la formulación de NPL puede contener PEG-DMG 2000, un lípido catiónico conocido en la técnica, DSPC y colesterol. Como ejemplo no limitante, la formulación de NPL puede contener PEG-DMG 2000, DLin-DMA, DSPC y colesterol. Como ejemplo no limitante adicional, la formulación de NPL puede contener PEG-DMG 2000, DLin-DMA, DSPC y colesterol en una relación molar de 2:40:10:48 (véase Geall y col., Nonviral delivery of self-amplifying RNA vaccines, PNAS 2012; PMID: 22908294).
En una retalización, la formulación de NPL se puede formular mediante los procedimientos descritos en Publicaciones internacionales N° WO2011127255 o WO2008103276. Como ejemplo no limitante, las VAN en esta invención puede encapsularse en formulaciones de NPL como se describe en WO2011127255 y/o WO2008103276.
En una realización, las VAN descritas en esta invención pueden formularse en una nanopartícula para ser administradas por vía parenteral como se describe en la Pub. de EE.UU. No. US20120207845;
En una realización, las VAN pueden formularse en una nanopartícula lipídica fabricada mediante los procedimientos descritos en la publicación de patente de EE. UU. N° US20130156845 o Publicación internacional No WO2013093648 o WO2012024526,
Las nanopartículas lipídicas descritas en esta invención pueden fabricarse en un entorno estéril mediante el sistema y/o procedimientos descritos en la Publicación de patente de EE.UU. No. US20130164400, .
En una realización, la formulación de LNP se puede formular en una nanopartícula tal como una partícula de ácido nucleico-lípido descrita en la Patente de EE. u U. No. 8,492,359, .
En una realización, la formulación de NPL se puede formular mediante los procedimientos descritos en Publicaciones internacionales N° WO2011127255 o WO2008103276. Como ejemplo no limitante, el ARN modificado descrito en esta invención puede encapsularse en formulaciones de NPL como se describe en WO2011127255 y/o WO2008103276.
En una realización, las formulaciones de NPL descritas en esta invención pueden comprender una composición policatiónica. A modo de ejemplo no taxativo, la composición policatiónica puede seleccionarse de entre la fórmula 1­ -60 de la Publicación de patente de EE. UU. N° US20050222064. En otra realización, las formulaciones de NPL que comprenden una composición policatiónica puede usarse para la administración del ARN modificado descrito en esta invención in vivo y/o in vitro.
En una realización, las formulaciones de NPL descritas en esta invención pueden comprender adicionalmente una molécula que mejore la permeabilidad. Moléculas que mejoran la permeabilidad no taxativas son descritas en la Publicación de patente de EE. UU. N° US20050222064.
Las formulaciones de nanopartículas pueden comprender un conjugado de fosfato. El conjugado de fosfato puede aumentar los tiempos de circulación in vivo y/o aumentar la administración dirigida de la nanopartícula. Los conjugados de fosfato para uso con la presente invención pueden elaborarse mediante los procedimientos descritos en la Solicitud Internacional No. WO2013033438 o Publicación de Patente de EE. UU. No. US20130196948, . A modo de ejemplo no taxativo, los conjugados de fosfato pueden incluir un compuesto de cualquiera de las fórmulas descritas en la Solicitud Internacional No. WO2013033438,
La formulación de nanopartícula puede comprender un conjugado de polímero. El conjugado de polímero puede ser un conjugado soluble en agua. El conjugado de polímero puede tener una estructura descrita en la Solicitud de Patente de EE. UU. No. 20130059360, . En un aspecto, los conjugados de polímeros con los polinucleótidos de la presente invención se pueden realizar utilizando los procedimientos y/o reactivos poliméricos segmentados descritos en la Solicitud de Patente de EE. UU. No. 20130072709, . En otro aspecto, el conjugado de polímero puede tener grupos laterales pendientes que comprenden restos de anillo, tales como, de modo no taxativo, los conjugados de polímero descritos en la Publicación de patente de EE. UU. No. US20130196948,
Las formulaciones de nanopartículas pueden comprender un conjugado para mejorar la administración de las nanopartículas de la presente invención en un sujeto. Además, el conjugado puede inhibir la eliminación fagocítica de las nanopartículas en el sujeto. En un aspecto, el conjugado puede ser un “autopéptido” diseñado a partir de la proteína de membrana humana CD47 (por ejemplo, las “autopartículas” descritas por Rodriguez y col (Science 2013339, 971­ 975), ). Tal como se muestra en Rodriguez y col., los autopéptidos retrasaron la eliminación mediada por macrófagos de las nanopartículas, lo cual mejoró la administración de las nanopartículas. En otro aspecto, el conjugado puede ser la proteína de membrana CD47 (por ejemplo, véase Rodriguez y col. Science 2013 339, 971-975, ). En Rodriguez y col. se muestra que, de manera similar a los autopéptidos, la CD47 puede aumentar la relación de partículas circulantes en un sujeto en comparación con los péptidos mezclados y las nanopartículas cubiertas con PEG.
En una realización, las vacunas de ARN se la presente invención se formulan en nanopartículas que comprenden un conjugado para mejorar la administración de las nanopartículas de la presente invención en un sujeto. El conjugado puede ser la membrana CD47 o el conjugado puede derivarse de la proteína de membrana CD47, tal como el "autopéptido" descrito previamente. En otro aspecto, la nanopartícula puede comprender PEG y un conjugado de CD47 o un derivado de estos. En incluso otro aspecto, la nanopartícula puede comprender tanto el "auto" péptido descrito anteriormente como la proteína de membrana CD47.
En otro aspecto, un "auto" péptido y/o proteína CD47 puede conjugarse a una partícula similar al virus o seudovirión, como se describe en esta invención, para la administración de las vacunas de ARN de la presente invención.
En otra realización, las composiciones farmacéuticas de las VAN que comprenden los polinucleótidos de la presente invención y un conjugado que puede tener un enlace degradable. Los ejemplos no taxativos de conjugados incluyen un resto aromático que comprende un átomo de hidrógeno ionizable, un resto espaciador y un polímero soluble en agua. A modo de ejemplo no taxativo, se describen composiciones farmacéuticas que comprenden un conjugado con un enlace degradable y procedimientos para administrar dichas composiciones en la Publicación de patente de EE. UU. No. US20130184443,
Las formulaciones de nanopartículas pueden ser una nanopartícula de carbohidrato que comprende un vehículo de carbohidrato y una VAN. A modo de ejemplo no taxativo, el vehículo nde carbohidrato puede incluir, de modo no taxativo, un material similar a glicógeno o fitoglicógeno modificado con anhídrido, succinato de fitoglicógeno de octenilo, fitoglicógeno de beta-dextrina, fitoglicógeno de beta-dextrina modificado con anhídrido. (Ver, por ejemplo, Publicación internacional No. WO2012109121;).
Las formulaciones de nanopartículas de la presente invención pueden recubrirse con un tensioactivo o polímero para mejorar la administración de la partícula. En una realización, las nanopartículas pueden estar recubiertas con un recubrimiento hidrofílico, tales como, de modo no taxativo, recubrimientos de PEG y/o recubrimientos que tengan una carga superficial neutra. Los recubrimientos hidrofílicos pueden ayudar a administrar nanopartículas con cargas mayores, tales como, de modo no taxativo, las VAN dentro del sistema nervioso central. A modo de ejemplo no taxativo, se describen nanopartículas que comprenden un recubrimiento hidrofílico y procedimientos para elaborar dichas nanopartículas en la Publicación de patente de EE. UU. No. US20130183244,
Las formulaciones de nanopartículas lipídicas pueden mejorarse al reemplazar el lípido catiónico con un lípido catiónico biodegradable que se sepa que es una nanopartícula lipídica de eliminación rápida (reLNP - rapidly eliminated lipid nanoparticle). Se ha demostrado que los lípidos catiónicos ionizables, tales como, de modo no taxativo, DLinDMA, DLin-KC2-DMA y DLin-MC3-DMA, se acumulan en plasma y los tejidos con el tiempo y pueden ser una fuente potencial de toxicidad. El metabolismo rápido de los lípidos de eliminación rápida puede mejorar la tolerabilidad e índice terapéutico de las nanopartículas lipídicas en un orden de magnitud de una dosis de 1 mg/kg a una dosis de 10 mg/kg en ratas. La inclusión de un enlace de éster degradado de forma enzimática puede mejorar el perfil de degradación y metabolismo del componente catiónico, mientras que igual se mantiene la actividad de la formulación de reLNP. El enlace de éster puede ubicarse internamente dentro de la cadena lipídica o puede encontrarse de forma terminal en un extremo de la cadena lipídica. El enlace de éster interno puede reemplazar cualquier carbono de la cadena lipídica.
En una realización, el enlace éster interno puede estar ubicado en cualquier lado del carbono saturado.
En una realización, se puede provocar una respuesta inmune administrando una nanopartícula lipídica que puede incluir una nanoespecie, un polímero y un inmunógeno. (Publicación de EE. UU. N° 20120189700 y Publicación internacional N° WO2012099805). El polímero puede encapsular la nanoespecie o encapsular parcialmente la nanoespecie. El inmunógeno puede ser una proteína recombinante, un ARN modificado y/o un polinucleótido descrito en esta invención. En una realización, la nanopartícula lipídica se puede formular para su uso en una vacuna tal como, entre otros, contra un patógeno.
Las nanopartículas lipídicas pueden diseñarse para alterar las propiedades superficiales de las partículas, de manera que las nanopartículas lipídicas puedan penetrar la barrera de mucosa. La mucosa está ubicada en el tejido mucoso, tales como, por ejemplo, oral (por ejemplo, las membranas bucales y esofágicas y el tejido de las amígdalas), oftálmico, gastrointestinal (por ejemplo, estómago, intestino delgado, intestino grueso, colon, recto), nasal, respiratorio (por ejemplo, membrana nasal, faríngea, traqueal y bronquial), genital (por ejemplo, membrana vaginal, del cuello del útero y uretral). Se creía que las nanopartículas mayores que 10--200 nm que se prefieren por su mayor eficacia de encapsulación del fármaco y la capacidad de proporcionar administración sostenida para un conjunto amplio de fármacos, eran muy grandes como para difundirse rápidamente a través de las barreras de mucosa. La mucosa se secreta, dispersa, descarta o digiere y recicla continuamente, de manera que la mayoría de las partículas atrapadas puedan eliminarse del tejido mucoso en segundos o en unas pocas horas. Las nanopartículas poliméricas mayores (con un diámetro entre 200 nm y 500 nm) que se han recubierto de forma densa con un polietilenglicol (PEG) de peso molecular bajo se difunden a través de la mucosa solamente de 4 a 6 veces más lentamente que la difusión de las mismas partículas en agua (Lai y col. PNAS 2007 104(5):1482--487; Lai y col. Adv Drug Deliv Rev. 200961(2): 158— 171; cada una de los cuales se incorpora en esta invención como referencia en su totalidad).). El transporte de nanopartículas puede determinarse mediante el uso de velocidades de permeación y/o técnicas de microscopía fluorescente, inclusive, de modo no taxativo, recuperación de fluorescencia a continuación de fotoblanqueo (FRAP) y rastreo de partículas múltiples (MPT) de alta resolución. A modo de ejemplo no taxativo, las composiciones que pueden penetrar una barrera de mucosa pueden elaborarse de la forma descrita en la Patente de EE. UU. No. 8,241,670 o Publicación de Patente Internacional No. WO2013110028,
Las nanopartículas lipídicas diseñadas para penetrar la mucosa pueden comprender un material polimérico (es decir, un núcleo polimérico) y/o un conjugado de polímero y vitamina y/o un copolímero de tribloque. El material polimérico puede incluir, de modo no taxativo, poliaminas, poliéteres, poliamidas, poliésteres, policarbamatos, poliureas, policarbonatos, poli(estirenos), poliimidas, polisulfonas, poliuretanos, poliacetilenos, polietilenos, polietileniminas, poliisocianatos, poliacrilatos, polimeacrilatos, poliacrilonitrilos y poliarilatos. El material polimérico puede ser biodegradable y/o biocompatible. Se describen ejemplos no taxativos de polímeros biocompatibles en la Publicación de patente internacional No. WO2013116804, . El material polimérico puede estar adicionalmente irradiado. A modo de ejemplo no taxativo, el material polimérico puede someterse a radiación gamma (ver, por ejemplo, la Solicitud Internacional No. WO201282165, ). Ejemplos no taxativos de polímeros específicos incluyen poli(caprolactona) (PCL), polímero de acetato de etilenvinilo (EVA), ácido (poli)láctico (PLA), ácido (poli)(L-láctico (PLA), ácido (poli)glicólico (PGA), ácido (poli)láctico-co-glicólico (PlGa ), ácido (poli)L-láctico-co-glicólico (p Lg A), poli(D,L-láctido) (PDLA), poli(L-láctido) (PLA), poli(D,L-láctido-co-caprolactona), poli(D,L-láctido-co-caprolactona-co-glicólido), poli(D,L-láctido-co-PEO-co-D,L-láctido), poli(D,L-láctido-co-PPO-co-D,L-láctido), cianoacrilato de polialquilo, poliuretane, poli-L-lisina (PL), hidroxipropil metacrilato (HPMA), polietileneglicol, ácido poli-L-glutámico, ácidos (poli)hidroxi, polianhídridos, poliortoésteres, amidas de (poli)éster, poliamidas, éteres de (poli)éster, policarbonatos, polialquilenos, tales como polietileno y polipropileno, polialquilenglicoles, tales como poli(etilenglicol) (PEG), óxidos de polialquileno (PEO), tereftalatos de polialquileno, tales como tereftalato de (poli)etileno, alcoholes polivinílicos (PVA), éteres de polivinilo, ésteres de polivinilo, tales como acetato de (poli)vinilo, haluros de polivinilo, tales como cloruro de (poli)vinilo (PVC), polivinilpirrolidona, polisiloxanos, poliestireno (PS), poliuretanos, celuloses derivadas, tales como alquil celulosas, hidroxialquil celulosas, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, nitro celulosas, hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa, polímeros de ácidos acrílicos, tales como poli(metil(met)acrilato) (PMMA), poli(etil(met)acrilato), poli(butil(met)acrilato), poli(isobutil(met)acrilato), poli(hexil(met)acrilato), poli(isodecil(met)acrilato), poli(lauril(met)acrilato), poli(fenil(met)acrilato), poli(metil acrilato), poli(isopropil acrilato), poli(isobutil acrilato), poli(octadecil acrilato) y copolímeros y mezclas de los mismos, polidioxanona y sus copolímeros, polihidroxialcanoatos, fumarato de polipropileno, polioximetileno, poloxámeros, poli(orto)ésteres, ácido (poli)butírico, ácido (poli)valérico, poli(láctido-co-caprolactona, PEG-PLGA-PEG y carbonato de trimetileno, polivinilpirrolidona.La nanopartícula lipídica se puede recubrir o asociar con un copolímero como, entre otros, un copolímero de bloque (como un copolímero de bloque de poliéter-poliamida ramificado descrito en la Publicación Internacional No. WO2013012476,), y (poli(etilenglicol ))-(poli(óxido de propileno))-(poli(etilenglicol)) copolímero tribloque (ver, por ejemplo, la Publicación de EE. UU. 20120121718 y la Publicación de EE. UU. 20100003337 y la Pat. de EE. UU.. No. 8.263.665;). El copolímero puede ser un polímero que se considera en general seguro (GRAS) y la formación de la nanopartícula lipídica puede ser de una manera tal que no se creen entidades químicas nuevas. Por ejemplo, la nanopartícula lipídica puede comprender poloxámeros que recubren nanopartículas de PLGA sin formar entidades químicas nuevas que todavía son capaces de penetrar rápidamente en la mucosa humana (Yang y col. Chem. Int. Ed. 2011 50:2597-2600;). Un procedimiento escalable no taxativo para producir nanopartículas que pueden penetrar la mucosa humana se describe en Xu y col. (Véase, por ejemplo, J Control Release 2013, 170(2):279-86;
La vitamina del conjugado de polímero-vitamina puede ser vitamina E. La porción de vitamina del conjugado se puede sustituir con otros componentes adecuados como, por ejemplo, vitamina A, vitamina E, otras vitaminas, colesterol, un resto hidrofóbico o un componente hidrofóbico de otros surfactantes (por ejemplo, cadenas de esterol, ácidos grasos, cadenas de hidrocarburos y cadenas de óxido de alquileno).
La nanopartícula lipídica modificada para penetrar la mucosa puede incluir agentes que modifican la superficie como, entre otros, polinucleótidos, proteínas aniónicas (por ejemplo, albúmina de suero bovino), surfactantes (por ejemplo, surfactantes catiónicos como, por ejemplo, bromuro de dimetildioctadecil-amonio), azúcares o derivados de azúcares (por ejemplo, ciclodextrina), ácidos nucleicos, polímeros (por ejemplo, heparina, polietilenglicol y poloxámero), agentes mucolíticos (por ejemplo, N-acetilcisteína, artemisa, bromelaina, papaína, clerodendrum, acetilcisteína, bromhexina, carbocisteína, eprazinona, mesna, ambroxol, sobrerol, domyodol, letosteína, estepronina, tiopronina, gelsolina, timosina p4 dornasa alfa, neltenexina, erdosteína) y diversas DNasas incluido rhDNasa. El agente que altera la superficie puede incrustarse o incorporarse en la superficie de la partícula, o disponerse (por ejemplo, mediante recubrimiento, adsorción, enlace covalente u otro procedimiento) en la superficie de la nanopartícula lipídica (véase, por ejemplo, Publicación EE. UU. 20100215580 y Publicación EE. UU. 20080166414 y US20130164343;).
En una realización, las nanopartículas lipídicas que penetran la mucosa pueden comprender al menos un polinucleótido descrito en esta invención. El polinucleótido puede encapsularse en la nanopartícula lipídica y/o disponerse en la superficie de la partícula. El polinucleótido puede acoplarse de forma covalente a la nanopartícula lipídica. Las formulaciones de nanopartículas lipídicas que penetran la mucosa pueden comprender una pluralidad de nanopartículas. Además, las formulaciones pueden contener partículas que pueden interactuar con la mucosa y alterar las propiedades estructurales y/o adhesivas de la mucosa circundante para disminuir la mucoadhesión, lo cual puede aumentar la administración de las nanopartículas lipídicas que penetran la mucosa en el tejido mucoso.
En otra realización, las nanopartículas lipídicas que penetran la mucosa pueden ser una formulación hipotónica que comprende un recubrimiento que mejora la penetración de la mucosa. La formulación puede ser hipotónica para el epitelio en el cual se administra. Ejemplos no taxativos de formulaciones hipotónicas se pueden encontrar en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013110028,
En una realización, para mejorar la administración a través de la barrera de la mucosa, la formulación de la VAN puede comprender o ser una solución hipotónica. Se halló que las soluciones hipotónicas aumentaron la velocidad a la cual las partículas mucoinertes tales como, de modo no taxativo, partículas que penetran la mucosa, fueron capaces de alcanzar la superficie epitelial vaginal (véase, por ejemplo, Ensign y col. Biomaterials 201334(28):6922-9;
En una realización, dichas formulaciones también pueden construirse o modificarse las composiciones de manera que se dirijan pasiva o activamente a diferentes tipos celulares in vivo, incluidos, entre otros, hepatocitos, células inmunes, células tumorales, células endoteliales, células presentadoras de antígenos y leucocitos (Akinc y col. Mol Ther. 2010 18:1357--1364; Song y col., Nat Biotechnol. 2005 23:709--717; Judge y col., J Clin Invest. 2009 119:661-673; Kaufmann y col., Microvasc Res 201080:286--293; Santel y col., Gene Ther 2006 13:1222--1234; Santel y col., Gene Ther 2006 13:1360--1370; Gutbier y col., Pulm Pharmacol. Ther. 2010 23:334--344; Basha y col., Mol. Ther. 2011 19:2186--2200; Fenske y Cullis, Expert Opin Drug Deliv. 20085:25-44; Peer y col., Science. 2008319:627--630; Peer y Lieberman, Gene Ther. 2011 18:1127—1133). Un ejemplo de direccionamiento pasivo de formulaciones a células hepáticas incluye las formulaciones de nanopartículas lipídicas a base de DLin-DMA, DLin-KC2-DMA y DLin-MC3-DMA, que han demostrado unirse a la apoliproteína E y promover la unión y absorción de estas formulaciones en hepatocitos in vivo (Akinc y col. Mol Ther. 2010 18:1357—1364). Las formulaciones también pueden dirigirse selectivamente a través de la expresión de diferentes ligandos en su superficie, como se ejemplifica, pero no se limita a, folato, transferrina, N-acetilgalactosamina (GalNAc) y estrategias dirigidas a anticuerpos (Kolhatkar y col., Curr Drug Discov Technol. 2011 8:197--206; Musacchio y Torchilin, Front Biosci. 2011 16:1388--1412; Yu y col., Mol Membr Biol.
201027:286--298; Patil y col., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 200825:1 —61; Benoit y col., Biomacromolecules. 2011 12:2708--2714; Zhao y col., Expert Opin Drug Deliv. 2008 5:309-319; Akinc y col., Mol Ther. 2010 18:1357--1364; Srinivasan y col., Metods Mol Biol. 2012 820:105--116; Ben-Arie y col., Methods Mol Biol. 2012 757:497--507; Peer 2010 J Control Release. 20:63--68; Peer y col., Proc Natl Acad Sci USA. 2007 104:4095--4100; Kim y col., Methods Mol Biol. 2011 721:339--353; Subramanya y col., Mol Ther. 2010 18:2028--2037; Song y col., Nat Biotechnol. 2005 23:709--717; Peer y col., Science. 2008319:627--630; Peer y Lieberman, Gene Ther. 2011 18:1127--1133) ..
En una realización, las VAN de la presente invención se puede formular para liberación controlada y/o entrega dirigida. Tal como se usa en esta invención, “liberación controlada” se refiere a un perfil de liberación de un compuesto o composición farmacéutica que se conforma a un patrón particular de liberación para efectuar un resultado terapéutico. En una realización, la VAN pueden encapsularse en un agente de administración descrito en esta invención y/o conocido en la técnica para liberación controlada y/o administración dirigida. Tal como se usa en esta invención, el término "encapsular" significa envolver, encerrar o rodear. En lo que se refiere a la formulación de los compuestos de la invención, la encapsulación puede ser sustancial, completa o parcial. El término "sustancialmente encapsulado" significa que al menos más del 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,9 o más del 99,999 % de la composición farmacéutica o compuesto de la la invención puede estar envuelta, rodeada o encerrada dentro del agente de administración. “Encapsulación parcial” significa que menos que 10, 10, 20, 30, 40, 50 % o menos de la composición farmacéutica o compuesto de la invención puede encontrarse envuelto, encerrado o rodeado dentro del agente de administración. Ventajosamente, la encapsulación puede estar determinada mediante la medición del escape o la actividad de la composición farmacéutica o compuesto de la invención mediante el uso de fluorescencia y/o micrografía electrónica. Por ejemplo, al menos 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,99 o más que 99,99 % de la composición farmacéutica o compuesto de la invención se encuentra encapsulado en el agente de administración.
En una realización, la formulación de liberación controlada puede incluir, de modo no taxativo, copolímeros de tribloque. Como ejemplo no taxativo, la formulación puede incluir dos tipos distintos de copolímeros de tribloque (Pub. Internacional No. WO2012131104 y WO2012131106;).
En otra realización, los VAN se pueden encapsular en una nanopartícula lipídica o una nanopartícula lipídica eliminada rápidamente y las nanopartículas lipídicas o una nanopartícula lipídica eliminada rápidamente se pueden encapsular a continuación en un polímero, hidrogel y/o sellador quirúrgico descrito en esta invención y/o conocido en el arte. Como ejemplo no limitativo, el polímero, hidrogel o sellador quirúrgico puede ser PLGA, etileno acetato de vinilo (EVAc), poloxámero, GELSITE® (Nanotherapeutics, Inc. Alachua, FL), HYLENEX® (Halozyme Therapeutics, San Diego Ca ), selladores quirúrgicos como polímeros de fibrinógeno (Ethicon Inc. Cornelia, GA), TISSELL® (Baxter International, Inc Deerfield, IL), selladores a base de PEG y COSEAL® (Baxter International, Inc Deerfield, IL).
En otra realización, la nanopartícula lipídica se puede encapsular en cualquier polímero conocido en la técnica que pueda formar un gel cuando se inyecta en un sujeto. Como otro ejemplo no taxativo, la nanopartícula lipídica puede encapsularse en una matriz de polímero que puede ser biodegradable.
En una realización, la formulación de VAN para liberación controlada y/o administración dirigida también puede incluir al menos un recubrimiento de liberación controlada. Los recubrimientos de liberación controlada incluyen, entre otros, OPADRY®, copolímero de polivinilpirrolidona/acetato de vinilo, polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxietilcelulosa, EUDRAGIT RL®, EUDRAGIT RS® y derivados de celulosa como las dispersiones acuosas de etilcelulosa (AQUACOAT® y SURELEASE®).
En una realización, la formulación de liberación controlada y/o liberación dirigida de VAN puede comprender al menos un poliéster degradable que puede contener cadenas laterales policatiónicas. Los poliésteres degradables incluyen, de modo no taxativo, éster de poli(serina), poli(L-láctido-co-L-lisina), éster de poli(4-hidroxi-L-prolina) y combinaciones de los mismos. En otra realización, los poliésteres degradables pueden incluir una conjugación de PEG para formar un polímero PEGilado.
En una realización, la formulación de liberación controlada y/o administración dirigida de VAN que comprende al menos un polinucleótido puede comprender al menos un PEG y/o derivados de polímeros relacionados con PEG como se describe en loa Patente de EE. UU. No. 8.404.222,.
En otra realización, la formulación de liberación controlada de VAN que comprende al menos un polinucleótido puede ser el sistema polimérico de liberación controlada descrito en la US20130130348, .
En algunas realizaciones, las VAN de la presente invención pueden estar encapsuladas en una nanopartícula terapéutica, que se denomina en esta invención "vacunas de ARNr de nanopartícula terapéutica". Las nanopartículas terapéuticas pueden formularse mediante procedimientos descritos en esta invención y conocidos en la técnica tales como, de forma no taxativa, Pub. Internacionales No. WO2010005740, WO2010030763, WO2010005721, WO2010005723, WO2012054923, Pub. de EE. UU. No. US20110262491, US20100104645, US20100087337, US20100068285, US20110274759, US20100068286, US20120288541, US20130123351 y US20130230567 y Pat de EE. UU. No. 8.206.747, 8.293.276, 8.318.208 y 8.318.211; . En otro aspecto, las nanopartículas poliméricas terapéuticas pueden identificarse mediante los procedimientos descritos en la Publicación de EE.UU. N° US20120140790,
En una realización, la VAN de nanopartícula terapéutica de puede formularse para liberación sostenida. Tal como se usa en esta invención, "liberación sostenida" hace referencia a una composición farmacéutica o compuesto que se conforma a una velocidad de liberación en un período específico de tiempo. El período de tiempo puede incluir, de modo no taxativo, horas, días, semanas, meses y años. Como un ejemplo no limitativo, la nanopartícula de liberación sostenida puede comprender un polímero y un agente terapéutico como, entre otros, los polinucleótidos de la presente invención (consulte la Publicación internacional No. 2010075072 y Pub de EE. UU. No. US20100216804, US20110217377 y US20120201859, ). En otro ejemplo no limitativo, la formulación de liberación sostenida puede comprender agentes que permitan una biodisponibilidad persistente, como, entre otros, cristales, geles macromoleculares y/o suspensiones de partículas (véase la Publicación de patente de EE. UU.No US20130150295,
En una realización, las VAN de nanopartículas terapéuticas se pueden formular para que sean específicos de la diana. A modo de ejemplo no taxativo, las nanopartículas terapéuticas pueden incluir un corticoesteroide (ver Pub. International N° WO2011084518). A modo de ejemplo no taxativo, las nanopartículas terapéuticas pueden formularse en las nanopartículas descritas en las Pub Internacionales N° WO2008121949, WO2010005726, WO2010005725, WO2011084521 y Pub de EE. UU. N° US20100069426, US20120004293 y US20100104655.
En una realización, las nanopartículas de la presente invención pueden comprender una matriz polimérica. A modo de ejemplo no taxativo, la nanopartícula puede comprender dos o más polímeros tales como, de modo no taxativo, polietilenos, policarbonatos, polianhídridos, polihidroxiácidos, polipropilfumeratos, policaprolactonas, poliamidas, poliacetales, poliéteres, poliésteres, poli(ortoésteres), policianoacrilatos, alcoholes polivinílicos, poliuretanos, polifosfacenos, poliacrilatos, polimetacrilatos, policianoacrilatos, poliureas, poliestirenos, poliaminas, polilisina, poli(etilenimina), éster de poli(serina), poli(L-láctido-co-L-lisina), éster de poli(4-hidroxi-L-prolina) o combinaciones de los mismos.
En una realización, la nanopartícula terapéutica comprende un copolímero dibloque. En una realización, el copolímero dibloque puede incluir PEG en combinación con un polímero tal como, pero sin limitarse a, polietilenos, policarbonatos, polianhídridos, polihidroxiácidos, polipropilfumeratos, policaprolactonas, poliamidas, poliacetales, poliéteres, poliésteres, poli (ortoésteres), policianlatos, polivinilalcoholes, poliuretanos, polifosfacenos, poliacrilatos, polimetacrilatos, policianoacrilatos, poliureas, poliestirenos, poliaminas, polilisina, poli (etilen imina), poli (éster de serina), poli (L-lactida-co-L-lisina), poli (4-hidroxi-L-éster de prolina) o combinaciones de los mismos. En otra realización, el copolímero dibloque puede comprende los copolímeros en dibloque descritos en la Publicación de patente europea No. En aun otra realización, el copolímero dibloque puede ser un copolímero dibloque high-X, tal como los descritos en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013120052,
A modo de ejemplo no taxativo, la nanopartícula terapéutica comprende un copolímero en bloque PLGA-PEG (ver la Pub. EE. UU. No. US20120004293 y Pat de EE. UU. No. 8.236.330, ). En otro ejemplo no limitativo, la nanopartícula terapéutica es una nanopartícula no detectable que comprende un copolímero dibloque de PEG y PLA o PEG y PLGA (ver Pat de EE. UU. No 8.246.968 y Publicación Internacional No. WO2012166923, ). En aun otro ejemplo no taxativo, la nanopartícula terapéutica es una nanopartícula no detectable o una nanopartícula no detectable específica de la diana tal como se describe en la Publicación de Patente de EE. UU. No. US20130172406,
En una realización, la nanopartícula terapéutica puede comprender un copolímero de multibloque (ver, por ejemplo, Pat. ee EE. UU. No. 8.263.665 y 8.287.910 y Pub. De Patente de EE. UU. No. US20130195987;
En aun otro ejemplo no taxativo, la nanopartícula lipídica comprende el copolímero de bloque PEG-PLGA-PEG (ver, por ejemplo, el hidrogel termosensible (PEG-PLGA-PEG) se utilizó como un vehículo de administración del gen TGF-betal en Lee y coI. Thermosensitive Hydrogel as a Tgf-pl Gene Delivery Vehicle Enhances Diabetic Wound Healing. Pharmaceutical Research, 2003 20(12): 1995-2000; como un sistema de suministro de genes controlado en Li y col. Controlled Gene Delivery System Based on Thermosensitive Biodegradable Hydrogel. Pharmaceutical Research 2003 20(6):884-888; y Chang y col., Non-ionic amphiphilic biodegradable PEG-PLGA-PEG copolymer enhances gene delivery efficiency in rat skeletal muscle. J Controlled Release. 2007 118:245-253; ). Las VAN de la presente invención pueden formularse en nanopartículas lipídicas que comprenden el copolímero en bloque PEG-PLGA-PEG.
En una realización, la nanopartícula terapéutica puede comprender un copolímero multibloque (ver, por ejemplo, Pat. de EE. UU. No. 8.263.665 y 8.287.910 y Pub.de Patente de EE. UU. No. US20130195987;).
En una realización, los copolímeros de bloque descritos en esta invención pueden incluirse en un complejo de poliión que comprende una micela no polimérica y el copolímero de bloque. (Ver, por ejemplo, Pub. de EE. u U. No.
20120076836;).
EN nuna realización, la nanopartícula terapéutica puede comprender al menos un polímero acrílico. Los polímeros acrílicos incluyen, de modo no taxativo, ácido acrílico, ácido metacrílico, copolímeros de ácido metacrílico y ácido acrílico, copolímeros de metacrilato de metilo, metacrilatos de etoxietilo, metacrilato de cianoetilo, copolímero de amino alquil metacrilato, ácido (poli)acrílico, ácido (poli)metacrílico, policianoacrilatos y combinaciones de los mismos.
En una realización, las nanopartículas terapéuticas pueden comprender al menos un polímero de éster de poli(vinilo). El polímero de éster (poli)vinílico puede ser un copolímero tal como un copolímero aleatorio. A modo de ejemplo no taxativo, el copolímero aleatorio puede tener una estructura tal como las descritas en la Solicitud Internacional No. WO2013032829 o Publicación de Patente de EE. UU. No US20130121954, . En un aspecto, los polímeros de éster de poli(vinilo) pueden conjugarse con los polinucleótidos descritos en esta invención. En otros aspectos, el polímero de éster (poli)vinílico que puede usarse en la presente invención puede ser el descrito en, .
En una realización, la nanopartícula terapéutica puede comprender al menos un copolímero dibloque. El copolímero dibloque puede ser, entre otros, un copolímero de ácido poli(láctico)-poli(etilen)glicol (véase, por ejemplo, la Publicación de Patente Internacional No. WO2013044219; ). Como ejemplo no limitante, la nanopartícula terapéutica puede usarse para tratar el cáncer (ver Publicación Internacional No. WO2013044219;).
En una realización, las nanopartículas terapéuticas pueden comprender al menos un polímero catiónico descrito en esta invención y/o conocido en la técnica.
En una realización, las nanopartículas terapéuticas pueden comprender al menos un polímero que contiene amina como, entre otros, polilisina, polietilenimina, poli(amidoamina) dendrímeros, poli(beta-amino ésteres) (ver, por ejemplo, Pat. de EE. UU. No. 8.287,849; ) y combinaciones de los mismos.
En otra realización, las nanopartículas descritas en esta invención pueden comprender un lípido catiónico de amina tal como los descritos en la Solicitud de Patente Internacional No. WO2013059496, . En un aspecto, los lípidos catiónicos pueden tener un resto amino-amina o amino-amida.
En una realización, las nanopartículas terapéuticas pueden comprender al menos un poliéster degradable que puede contener cadenas laterales policatiónicas. Los poliésteres degradables incluyen, de modo no taxativo, éster de poli(serina), poli(L-láctido-co-L-lisina), éster de poli(4-hidroxi-L-prolina) y combinaciones de los mismos. En otra realización, los poliésteres degradables pueden incluir una conjugación de PEG para formar un polímero PEGilado.
En otra realización, la nanopartícula terapéutica puede incluir una conjugación de al menos un ligando de direccionamiento. El ligando de direccionamiento puede ser cualquier ligando conocido, tal como, de modo no taxativo, un anticuerpo monoclonal. (Kirpotin y col, Cancer Res. 200666:6732-6740; ).
En una realización, la nanopartícula terapéutica se puede formular en una solución acuosa que se puede utilizar para alcanzar el cáncer (ver Pub Internacional N° WO2011084513 y Pub de EE. UU. N° US20110294717).
En una realización, las VAN de nanopartículas terapéuticas, por ejemplo, las nanopartículas terapéuticas que comprenden al menos una VAN se pueden formular utilizando los procedimientos descritos por Podobinski y col en la Patente de EE. UU. No. 8.404.799,
En una realización, la nanopartícula puede optimizarse para administración por vía oral. La nanopartícula puede comprender al menos un biopolímero catiónico tal como, de modo no taxativo, quitosano o un derivado del mismo. A modo de ejemplo no taxativo, la nanopartícula puede formularse mediante los procedimientos descritos en la Pub. de
EE. UU. No. 20120282343; .
En algunas realizaciones, las NPL comprenden el lípido KL52 (un amino-lípido descrito en la Publicación de Solicitud de EE. UU. No. 2012/0295832 ). La actividad y/o seguridad (tal como se mide al examinar uno o más de ALT/AST, conteo de linfocitos e inducción de citocinas) de la administración de las NPL puede mejorarse mediante la incorporación de dichos lípidos. Las NPL que comprenden KL52 puede administrarse por vía intravenosa y/o en una o más dosis. En algunas realizaciones, la administración de NPL que comprenden KL52 produce una expresión igual o mejorada de ARNm y/o proteínas en comparación con las NPL que comprenden MC3.
En algunas realizaciones, las VAN puede administrarse mediante el uso de NPL más pequeñas. Dichas partículas pueden comprender un diámetro desde menor que 0,1 um hasta 100 nm tal como, de modo no taxativo, menor que
0,1 um, menor que 1,0 um, menor que 5 um, menor que 10 um, menor que 15 um, menor que 20 um, menor que 25 um, menor que 30 um, menor que 35 um, menor que 40 um, menor que 50 um, menor que 55 um, menor que 60 um, menor que 65 um, menor que 70 um, menor que 75 um, menor que 80 um, menor que 85 um, menor que 90 um, menor que 95 um, menor que 100 um, menor que 125 um, menor que 150 um, menor que 175 um, menor que 200 um, menor que 225 um, menor que 250 um, menor que 275 um, menor que 300 um, menor que 325 um, menor que
350 um, menor que 375 um, menor que 400 um, menor que 425 um, menor que 450 um, menor que 475 um, meno que 500 um, menor que 525 um, menor que 550 um, menor que 575 um, menor que 600 um, menor que 625 um, menor que 650 um, menor que 675 um, menor que 700 um, menor que 725 um, menor que 750 um, menor que 775 um, menor que 800 um, menor que 825 um, menor que 850 um, menor que 875 um, menor que 900 um, menor que
925 um, menor que 950 um, menor que 975 um,
En otra realización, las VAN pueden administrarse utilizando NPL más pequeñas que pueden comprender un diámetro de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 10 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 20 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 30 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 40 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 10 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 20 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 30 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 40 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 30 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 40 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 60 a aproximadamente 90 nm y/o de aproximadamente 70 a aproximadamente 90 nm.
En algunas realizaciones, dichas NPL se sintetizan mediante el uso de procedimientos que comprenden mezcladoras de microfluidos. Mezcladoras de microfluidos ejemplares pueden incluir, entre otros, un micromezclador interdigital de hendidura que incluye, entre otros, los fabricados por Microinnova (Allerheiligen bei Wildon, Austria) y/o un micromezclador en espiga escalonado (SHM) (Zhigaltsev, I.V. y col., se ha publicado el diseño ascendente y la síntesis de sistemas de nanopartículas de lípidos de tamaño límite con núcleos acuosos y de triglicéridos usando mezcla microfluídica de milisegundos (Langmuir. 2012. 28:3633-40; Belliveau, N.M. Y col., Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 2012. 1:e37; Chen,
D. y col., Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation.
J Am Chem Soc. 2012. 134(16):6948-51; ). En algunos aspectos, los procedimientos de generación de NPL que comprenden SHM comprenden además la mezcla de al menos dos corrientes de entrada donde la mezcla se produce por advección caótica inducida por microestructura (MICA). Según este procedimiento, las corrientes de fluido fluyen a través de canales presentes en un patrón de espiga, lo que provoca un flujo rotacional y pliega los fluidos entre sí.
Este procedimiento también puede comprender una superficie para mezclar fluidos, donde la superficie cambia de orientación durante el ciclado de fluido. Los procedimientos para generar NPL mediante el uso de SHM incluyen aquellos descritos en la Publicación de Solicitud de EE. UU. No. 2004/0262223 y 2012/0276209,
En una realización, las VAN de la presente invención se pueden formular en nanopartículas lipídicas creadas utilizando un micromezclador como, entre otros, un mezclador microestructurado interdigital de hendidura (SIMM-V2) o un micromezclador interdigital de hendidura estándar (SSIMM) o Caterpillar (CPMM) o Impacting-jet (IJMM) del Institut für Mikrotechnik Mainz GmbH, Mainz Alemania).
En una realización, las VAN de la presente invención pueden formularse en nanopartículas lipídicas creadas mediante el uso de tecnología de microfluidos (véase Whitesides, George M. The Origins and the Future of Microfluidics. Nature, 2006 442: 368-373; y Abraham y col. Chaotic Mixer for Microchannels. Science, 2002 295: 647-651; ). A modo de ejemplo no taxativo, la formulación de microfluidos controlada incluye un procedimiento pasivo para mezclar corrientes de flujos constantes impulsados por presión en microcanales con un número bajo de Reynolds (véase, por ejemplo, Abraham y col. Chaotic Mixer for Microchannels. Science, 2002295: 647-651; ).
En una realización, las VAN de la presente invención se pueden formular en las nanopartículas lipídicas creadas utilizando un chip de micromezclador como, entre otros, los de Harvard Apparatus (Holliston, Ma ) o Dolomite Microfluidics (Royston, RU). Un chip de micromezcladora puede utilizarse para mezclar rápidamente dos o más corrientes de fluido con un mecanismo de división y recombinación.
En una realización, las VAN de la invención se pueden formular para la administración utilizando las microesferas de encapsulamiento de fármaco descritas en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013063468 o Patente de EE. UU. No. 8.440.614, . Las microesferas pueden comprender un compuesto de la fórmula (I), (II), (III), (IV), (V) o (VI) tal como se describe en la Publicación de Patente Internacional No. WO2013063468, . En otro aspecto, el aminoácido, péptido, polipéptido, lípidos (APPL) son útiles para administrar las VAN de la invención a células (véase la Publicación de Patente Internacional No. WO2013063468,
En una realización, las VAN de la invención puede formularse en nanopartículas lipídicas con un diámetro de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nm, tales como, sin limitación, aproximadamente 10 a aproximadamente 20 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 40 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 30 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 40 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 70 nm aproximadamente 50 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 70 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 70 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 70 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 80 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 80 a aproximadamente 100 nm y/o aproximadamente 90 a aproximadamente 100 nm.
En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas pueden tener un diámetro de aproximadamente 10 a 500 nm.
En una realización, la nanopartícula lipídica puede tener un diámetro mayor que 100 nm, mayor que 150 nm, mayor que 200 nm, mayor que 250 nm, mayor que 300 nm, mayor que 350 nm, mayor que 400 nm, mayor que 450 nm, mayor que 500 nm, mayor que 550 nm, mayor que 600 nm, mayor que 650 nm, mayor que 700 nm, mayor que 750 nm, mayor que 800 nm, mayor que 850 nm, mayor que 900 nm, mayor que 950 nm o mayor que 1000 nm.
Las nanopartículas de la presente invención además pueden incluir nutrientes como, entre otros, aquellos cuyas deficiencias pueden provocar peligros de salud desde anemia hasta defectos del tubo neural (véase, por ejemplo, las nanopartículas descritas en la Publicación de Patente Internacional No WO2013072929, ). A modo de ejemplo no taxativo, el nutriente puede ser hierro en forma de sales ferrosas, férricas o hierro elemental, yodo, ácido fólico, vitaminas o micronutrientes.
Introducción a las células
Se conocen en la técnica una variedad de métodos y son adecuados para la introducción de ácido nucleico en una célula, incluidas técnicas mediadas por virus y no virus, y cualquiera de estas puede usarse para introducir los VAN de la presente descripción. Ejemplos de técnicas típicas no mediadas por virus incluyen, entre otras, electroporación, transferencia mediada por fosfato de calcio, nucleofección, sonoporación, choque térmico, magnetofección, transferencia mediada por liposomas, microinyección, transferencia mediada por microproyectiles (nanopartículas), transferencia mediada por polímeros catiónicos ( DEAE-dextrano, polietilenimina, polietilenglicol (PEG) y similares) o fusión celular.
La técnica de sonoporación, o sonicación celular, es el uso de sonido (por ejemplo, frecuencias ultrasónicas) para modificar la permeabilidad de la membrana plasmática celular. Los procedimientos de sonoporación son conocidos por los expertos en la técnica y se utilizan para administrar ácidos nucleicos in vivo (Yoon y Park, Expert Opin Drug Deliv. 2010 7:321-330; Postema y Gilja, Curr Pharm Biotechnol. 2007 8:355-361; Newman y Bettinger, Gene Ther.
2007 14:465-475; ). Los procedimientos de sonoporación son conocidos en la técnica y también se enseñan, por ejemplo, en lo que se refiere a bacterias en la Publicación de patente de EE. UU. 20100196983 y en lo que se refiere a otros tipos celulares en, por ejemplo, la Publicación de patente de EE. UU. 20100009424.
Las técnicas de electroporación también son bien conocidas en la técnica y se utilizan para administrar ácidos nucleicos in vivo y clinicamente (Andre y col., Curr Gene Ther. 2010 10:267--280; Chiarella y col., Curr Gene Ther.
2010 10:281--286; Hojman, Curr Gene Ther. 2010 10:128—138; ). Los dispositivos de electroporación son vendidos por muchas empresas en todo el mundo, incluidos, entre otros, BTX® Instruments (Holliston, MA) (p. ej., el sistema AgilePulse In Vivo) e Inovio (Blue Bell, PA) (p. ej., Dispositivo de administración intramuscular Inovio SP-5P o el dispositivo de administración intradérmica CELLECTRA® 3000). En un aspecto, las VAN pueden administrarse mediante electroporación como se describe en el Ejemplo 9.
Excipientes
Las formulaciones farmacéuticas de VAN pueden comprender adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable que, como se usa en esta invención, incluye, entre otros, todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes activos de superficie, isotónicos. agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes, agentes aromatizantes, estabilizantes, antioxidantes, agentes de ajuste de la osmolalidad, agentes de ajuste del pH y similares, según sea adecuado para la forma de dosificación particular deseada. En la técnica, se conocen varios excipientes para la formulación de composiciones farmacéuticas y técnicas para preparar la composición (véase Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006). El uso de un medio excipiente convencional puede contemplarse dentro del alcance de la presente divulgación, excepto en la medida en que cualquier medio excipiente convencional sea incompatible con una sustancia o sus derivados, por ejemplo, al producir algún efecto biológico indeseable o al interactuar de otra manera de forma nociva con cualquier otro componente(s) de la composición farmacéutica, se contempla que su uso esté dentro del alcance de esta divulgación.
En algunos aspectos, un excipiente farmacéuticamente aceptable es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % puro. En algunos aspectos, un excipiente se aprueba para su uso para humanos o para uso veterinario. En algunos aspectos, un excipiente puede ser aprobado por la administración de alimentos y fármacos de los EE. UU. En algunos aspectos, un excipiente puede ser de calidad farmacéutica. En algunos aspectos, un excipiente cumple con los estándares de la Farmacopea de los EE. UU. (USP), la Farmacopea europea (EP), la Farmacopea británica y/o la Farmacopea internacional.
Excipientes farmacéuticamente aceptables usados en la fabricación de composiciones farmacéuticas incluyen, entre otros, diluyentes inertes, agentes dispersantes y/o granulantes, agentes tensioactivos y/o emulsionantes, agentes desintegrantes, agentes aglutinantes, conservantes, agentes tamponadores, agentes lubricantes, y/o aceites. Tales excipientes pueden incluirse opcionalmente en composiciones farmacéuticas. La composición también puede incluir excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorios, agentes colorantes, agentes de recubrimiento, edulcorantes, aromatizantes y/o agentes perfumantes.
Diluyentes ejemplares incluyen, de modo no taxativo, carbonato de calcio, carbonato de sodio, fosfato de calcio, fosfato de dicalcio, sulfato de calcio, hidrogenofosfato de calcio, lactosa fosfato de sodio, sacarosa, celulosa, celulosa microcristalina, caolín, manitol, sorbitol, inositol, cloruro de sodio, almidón seco, almidón de maíz, azúcar en polvo, etc., y/o combinaciones de los mismos.
Agentes de granulación y/o dispersión ejemplares incluyen, de modo no taxativo, almidón de papa, almidón de maíz, almidón de tapioca, glicolato de almidón de sodio, arcillas, ácido algínico, goma guar, pulpa de cítricos, agar, bentonita, celulosa y productos de madera, esponja natural, resinas de intercambio de cationes, carbonato de calcio, silicatos, carbonato de sodio, poli(vinilpirrolidona) reticulada (crospovidona), almidón de carboximetilo de sodio (glicolato de almidón de sodio), carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio reticulada (croscarmelosa), metilcelulosa, almidón pregelatinizado (almidón 1500), almidón microcristalino, almidón no soluble en agua, carboximetilcelulosa de calcio, aluminosilicato de magnesio (VEEGUM®), laurilsulfato de sodio, compuestos de amonio cuaternario, etc., y/o combinaciones de los mismos.
Ejemplos de agentes activos de superficie y/o emulsionantes incluyen, de modo no taxativo, emulsionantes naturales (por ejemplo, acacia, agar, ácido algínico, alginato de sodio, tragacanto, chondrux, colesterol, xantana, pectina, gelatina, yema de huevo, caseína, lanolina, colesterol, cera y lecitina), arcillas coloidales (por ejemplo, bentonita [silicato de aluminio] y VEEGUM® [aluminosilicato de magnesio]), derivados de aminoácidos de cadena larga, alcoholes de peso molecular alto (por ejemplo, alcohol estearílico, alcohol cetílico, alcohol oleílico, monoestearato de triacetina, diestearato de etilenglicol, monoestearato de glicerilo y monoestearato de propilenglicol, alcohol polivinílico), carbómeros (por ejemplo, carboxi polimetileno, ácido poliacrílico, polímero de ácido acrílico y polímero de carboxivinilo), carragenano, derivados de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, celulosa en polvo, hidroximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa), ésteres de ácidos grasos de sorbitán (por ejemplo, monolaurato de sorbitán polioxietileno [TWEEN®20], polioxietileno de sorbitán [TWEENn®60], monooleato de sorbitán polioxietileno [TWEEN®80], monopalmitato de sorbitán [SPAN®40], monoestearato de sorbitá [Span®60], tri estearato de sorbitá [Span®65], monooleato de glicerilo, monooleato de sorbitán [SPAN®80]), ésteres de polioxietileno (por ejemplo, monoestearato de polioxietileno [MYRJ®45], aceite de ricino hidrogenado de polioxietileno, aceite de ricino polietoxilado, estearato de polioximetileno y SOLUTOL®), ésteres de ácido graso de sacarosa, ésteres de ácido graso de polietilenglicol (por ejemplo, CREMOPHOR®), éteres de polioxietileno (por ejemplo, lauril éter de polioxietileno [BRIJ®30]), poli(vinilpirrolidona), monolaurato de dietilenglicol, oleato de trietanolamina, oleato de sodio, oleato de potasio, oleato de etilo, ácido oleico, laurato de etilo, lauril sulfato de sodio, PLUORINC®F 68, POLOXAMEr®188, bromuro de cetrimonio, cloruro de cetilpiridinio, cloruro de benzalconio, docusato sódico, etc y/o combinaciones de los mismos.
Agentes aglutinantes ejemplares incluyen, de modo no taxativo, almidón (e.g, almidón de maíz y pasta de almidón), gelatina; azúcares (e.g, sacarosa, glucosa, dextrosa, dextrina, melaza, lactosa, lactitol, manitol,), gomas naturales y sintéticas (por ejemplo, acacia, alginato de sodio, extracto de musgo irlandés, goma panwar, goma ghatti, mucílago de cáscara de isapol, carboximetilcelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa microcristalina, acetato de celulosa, poli(vinilpirrolidona), aluminosilicato de magnesio (Veegum®), y arabogalactano de lárice); alginatos; óxido de polietileno; polietilenglicol; sales inorgánicas de calcio; ácidos silícicos; polimetacrilatos; ceras; agua; alcohol; etc.; y combinaciones de los mismos.
Los conservantes ejemplares pueden incluir, entre otros, antioxidantes, agentes quelantes, conservantes antimicrobianos, conservantes antifúngicos, conservantes de alcohol, conservantes ácidos y/u otros conservantes. La oxidación es una vía de degradación potencial del ARNm, especialmente para las formulaciones líquidas de ARNm. Para prevenir la oxidación, se pueden agregar antioxidantes a la formulación. Antioxidantes ejemplares incluyen, entre otros, alfa tocoferol, ácido ascórbico, palmitato de acorbil, alcohol bencílico, hidroxianisol butilado, EDTA, m-cresol, metionina, hidroxitolueno butilado, monotioglicerol, metabisulfito de potasio, ácido propiónico, galato de propilo, ascorbato de sodio, bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio, tioglicerol y/o sulfito de sodio. Los agentes quelantes ejemplares incluyen ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido cítrico monohidrato, edetato disódico, edetato dipotásico, ácido edético, ácido fumárico, ácido málico, ácido fosfórico, edetato sódico, ácido tartárico y/o edetato trisódico. Los conservantes antimicrobianos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, bronopol, cetrimida, cloruro de cetilpiridinio, clorhexidina, clorobutanol, clorocresol, cloroxilenol, cresol, alcohol etílico, glicerina, fenetidina, fenetidina, imidureaxidinio, alcohol feniletílico, nitrato fenilmercúrico, propilenglicol y/o timerosal. Conservantes antifúngicos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, butil paraben, metil paraben, etil paraben, propil paraben, ácido benzoico, ácido hidroxibenzoico, benzoato de potasio, sorbato de potasio, benzoato de sodio, propionato de sodio y/o ácido sórbico. Los conservantes de alcohol ejemplares incluyen, pero no se limitan a, etanol, polietilenglicol, fenol, compuestos fenólicos, bisfenol, clorobutanol, hidroxibenzoato y/o alcohol feniletílico. Los conservantes ácidos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, vitamina A, vitamina C, vitamina E, betacaroteno, ácido cítrico, ácido acético, ácido deshidroacético, ácido ascórbico, ácido sórbico y/o ácido fítico. Otros conservantes incluyen, entre otros, tocoferol, acetato de tocoferol, mesilato de deteroxima, cetrimida, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitoluenado butilado (BHT), etilendiamina, lauril sulfato de sodio (SLS), lauril éter sulfato de sodio (SLES), bisulfito, metabisulfito de sodio, sulfito de potasio, metabisulfito de potasio, GLYDANT PLUS®, PHENONIP®, metilparabeno, GERMALL®115, GERMABEN®II, NEOLONE™, KATHON™, y/o EUXYL®.
En algunas realizaciones, el pH de las soluciones de VAN se mantiene entre pH 5 y pH 8 para mejorar la estabilidad. Tampones ejemplares para controlar el pH pueden incluir, pero no se limitan a, fosfato de sodio, citrato de sodio, succinato de sodio, histidina (o histidina-HCl), carbonato de sodio, y/o malato de sodio. En otra realización, los tampones ejemplares enumerados anteriormente pueden usarse con contraiones monovalentes adicionales (que incluyen, pero no se limitan a, potasio). También pueden usarse cationes divalentes como contraiones tampón; Sin embargo, estos no son los preferidos debido a la formación de complejos y/o degradación del ARNm.
Los ejemplos de agentes tamponadores incluyen, pero no se limitan a, soluciones tampón de citrato, soluciones tampón de acetato, soluciones tampón de fosfato, cloruro de amonio, carbonato de calcio, cloruro de calcio, citrato de calcio, glubionato de calcio, gluceptato de calcio, gluconato de calcio, ácido D-glucónico, calcio. glicerofosfato, lactato cálcico, ácido propanoico, levulinato cálcico, ácido pentanoico, fosfato cálcico dibásico, ácido fosfórico, fosfato cálcico tribásico, hidróxido fosfato cálcico, acetato potásico, cloruro de potasio, gluconato de potasio, mezclas de potasio, fosfato de potasio dibásico, fosfato de potasio monobásico, mezclas de fosfato de potasio, acetato de sodio, bicarbonato de sodio, cloruro de sodio, citrato de sodio, lactato de sodio, fosfato de sodio dibásico, fosfato de sodio monobásico, mezclas de fosfato de sodio, trometamina, hidróxido de magnesio, hidróxido de aluminio, ácido algínico, agua sin pirógenos, solución salina isotónica, solución de Ringer, alcohol etílico, etc., y/o combinaciones de los mismos.
Agentes lubricantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, estearato de magnesio, estearato de calcio, ácido esteárico, sílice, talco, malta, betanato de glicerilo, aceites vegetales hidrogenados, polietilenglicol, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, leucina, lauril sulfato de magnesio, lauril sulfato de sodio, etc., y combinaciones de los mismos.
Los aceites ejemplares incluyen, pero no se limitan a, almendra, semilla de albaricoque, aguacate, babasú, bergamota, semilla de corriente negra, borraja, cade, manzanilla, canola, alcaravea, carnauba, ricino, canela, manteca de cacao, coco, hígado de bacalao, café., maíz, semilla de algodón, emú, eucalipto, onagra, pescado, linaza, geraniol, calabaza, semilla de uva, avellana, hisopo, miristato de isopropilo, jojoba, nuez kukui, lavandina, lavanda, limón, litsea cubeba, nuez de macademia, malva, semilla de mango, semilla de espuma de prado, visón, nuez moscada, aceituna, naranja, reloj anaranjado, palma, almendra de palma, almendra de melocotón, maní, semilla de amapola, semilla de calabaza, colza, salvado de arroz, romero, cártamo, sándalo, sasquana, sabroso, espino amarillo, sésamo, manteca de karité, silicona, soja, girasol, árbol de té, cardo, tsubaki, vetiver, nuez y aceites de germen de trigo. Los ejemplos de aceites incluyen, pero no se limitan a, estearato de butilo, triglicérido caprílico, triglicérido cáprico, ciclometicona, sebacato de dietilo, dimeticona 360, miristato de isopropilo, aceite mineral, octildodecanol, alcohol oleílico, aceite de silicona y/o combinaciones de los mismos..
Excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorios, agentes colorantes, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, aromatizantes y/o perfumantes pueden estar presentes en la composición, según el criterio del formulador.
Aditivos ejemplares incluyen tampones fisiológicamente biocompatibles (por ejemplo, clorhidrato de trimetilamina), adición de quelantes (como, por ejemplo, DTPA o DTPA-bisamida) o complejos de quelato de calcio (como por ejemplo calcio DTPA, CaNaDTPA-bisamida) u, opcionalmente , adiciones de sales de calcio o sodio (por ejemplo, cloruro de calcio, ascorbato de calcio, gluconato de calcio o lactato de calcio). Además, se pueden utilizar antioxidantes y agentes de suspensión.
Crioprotectores
En algunas realizaciones, las formulaciones de VAN pueden comprender ciroprotectores. Como se usa en esta invención, el término "crioprotector" se refiere a uno o más agentes que, cuando se combinan con una sustancia dada, ayudan a reducir o eliminar el daño a esa sustancia que se produce al congelarse. En algunas realizaciones, los crioprotectores se combinan con VAN para estabilizarlos durante la congelación. El almacenamiento congelado de VAN entre -20 ° C y -80 ° C puede ser ventajoso para la estabilidad a largo plazo (por ejemplo, 36 meses) del polinucleótido. En algunas realizaciones, se incluyen crioprotectores en las formulaciones de VAN para estabilizar el polinucleótido a través de freeze/thaw ciclos y en condiciones de almacenamiento congelado. Los crioprotectores de la presente invención pueden incluir, entre otros, sacarosa, trehalosa, lactosa, glicerol, dextrosa, rafinosa y/o manitol. La trehalosa figura en la lista de la Administración de Fármacos y Alimentos como generalmente considerada segura (GRAS) y se usa comúnmente en formulaciones farmacéuticas comerciales.
Agentes de carga
En algunas realizaciones, las formulaciones de VAN pueden comprender agentes de carga. Como se usa en esta invención, el término "agente de carga" se refiere a uno o más agentes incluidos en las formulaciones para impartir una consistencia deseada a la formulación y/o estabilización de los componentes de la formulación. En algunas realizaciones, se incluyen agentes de carga en formulaciones de v A n liofilizadas para producir una torta "farmacéuticamente elegante", que estabiliza las VAN liofilizados durante el almacenamiento a largo plazo (por ejemplo, 36 meses). Los agentes de carga de la presente invención pueden incluir, entre otros, sacarosa, trehalosa, manitol, glicina, lactosa y/o rafinosa. En algunas realizaciones, las combinaciones de crioprotectores y agentes de carga (por ejemplo, sucrose/glicinae o trehalose/mannitol) puede incluirse tanto para estabilizar las v An durante la congelación como para proporcionar un agente de carga para la liofilización.
También se proporcionan ejemplos no limitantes de formulaciones y procedimientos para formular las VAN de la presente invención en la Publicación Internacional No WO2013090648 depositada el 14 de diciembre de 2012,.
Ingredientes Inactivos
En algunas realizaciones, las formulaciones de VAN pueden comprender al menos un excipiente que un ingrediente inactivo. Como se usa en esta invención, el término "ingrediente inactivo" se refiere a uno o más agentes inactivos incluidos en las formulaciones. En algunas realizaciones, todos, ninguno o algunos de los ingredientes inactivos que pueden usarse en las formulaciones de la presente invención pueden ser aprobados por la Administración de Fármacos y Alimentos de los EE. UU. (FDA). En la Tabla 26 se describe una lista no exhaustiva de ingredientes inactivos y las vías de administración en las que se pueden formular los ingredientes inactivos. En la Tabla 26, "AN" significa anestésico, "CNBLK" significa bloqueo nervioso cervical, "NBLK" significa bloqueo de nervio, "IV" significa intravenoso, "IM" significa intramuscular y "SC" significa subcutáneo
Tabla 26. In redientes Inactivos
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Administración
La presente descripción abarca la administración de VAN para cualquier tratamiento, farmacéutico, de diagnóstico o de imagenología por cualquier ruta apropiada teniendo en cuenta los posibles avances en las ciencias de la administración de fármacos. La administración puede ser desnuda o formulada.
Administración formulada
Las VAN de la presente invención pueden formularse usando los procedimientos descritos en esta invención. Las formulaciones pueden contener polinucleótidos modificados. Las formulaciones pueden incluir además, pero no se limitan a, agentes de penetración celular, un vehículo farmacéuticamente aceptable, un agente de administración, un polímero bioerosionable o biocompatible, un disolvente y un depósito de liberación sostenida. Las VAN formuladas pueden administrarse a la célula utilizando vías de administración conocidas en la técnica y descritas en esta invención.
Las composiciones también se pueden formular para la administración directa a un órgano o tejido de varias formas en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, remojo o baño directo, a través de un catéter, mediante geles, polvos, ungüentos, cremas, geles, lociones y/o gotas, utilizando sustratos tales como tejidos o materiales biodegradables revestidos o impregnados con las composiciones y similares.
Administración
Las VAN de la presente invención pueden administrarse por cualquier vía que dé como resultado un resultado terapéuticamente efectivo. Estos incluyen, entre otros, enteral (en el intestino), gastroenteral, epidural (en la materia dura), oral (a través de la boca), transdérmica, peridural, intracerebral (en el cerebro), intracerebroventricular (en el cerebro). ventrículos), epicutánea (aplicación sobre la piel), intradérmica, (en la piel misma), subcutánea (debajo de la piel), administración nasal (a través de la nariz), intravenosa (en una vena), bolo intravenoso, goteo intravenoso, intraarterial ( en una arteria), intramuscular (en un músculo), intracardíaca (en el corazón), infusión intraósea (en la médula ósea), intratecal (en el canal espinal), intraperitoneal (infusión o inyección en el peritoneo), infusión intravesical, intravítrea, (a través del ojo), inyección intracavernosa (en una cavidad patológica) intracavitaria (en la base del pene), administración intravaginal, intrauterina, administración extraamniótica, transdérmica (difusión a través de la piel intacta para d distribución), transmucoso (difusión a través de una membrana mucosa), transvaginal, insuflación (esnifar), sublingual, sublabial, enema, colirio (sobre la conjuntiva), colirio en los oídos, auricular (en o a través del oído), bucal ( dirigida hacia la mejilla), conjuntival, cutánea, dental (a un diente o dientes), electro-ósmosis, endocervical, endosinusial, endotraqueal, extracorpórea, hemodiálisis, infiltración, intersticial, intraabdominal, intraamniótico, intraarticular, intrabiliar intrabronquial, intrabursal, intracartilaginoso (dentro de un cartílago), intracaudal (dentro de la cauda equina), intracisternal (dentro de la cisterna magna cerebellomedularis), intracorneal (dentro de la córnea), dental intracornal, intracoronaria (dentro de las arterias coronarias), intracorporus cavernosum ( dentro de los espacios dilatables del cuerpo cavernoso del pene), intradiscal (dentro de un disco), intraductal (dentro de un conducto de una glándula), intraduodenal (dentro del duodeno), intradural (dentro o debajo de la d ura), intraepidérmico (a la epidermis), intraesofágico (al esófago), intragástrico (dentro del estómago), intragingival (dentro de las encías), intraileal (dentro de la porción distal del intestino delgado), intralesional (dentro o introducido directamente en una lesión localizada), intraluminal (dentro de la luz de un tubo), intralinfática (dentro de la linfa), intramedular (dentro de la cavidad de la médula ósea), intrameníngea (dentro de las meninges), intraocular (dentro del ojo), intraovárica (dentro de la ovario), intrapericárdico (dentro del pericardio), intrapleural (dentro de la pleura), intraprostático (dentro de la glándula prostática), intrapulmonar (dentro de los pulmones o sus bronquios), intrasinal (dentro de los senos nasales o periorbitarios), intraespinal (dentro del columna vertebral), intrasinovial (dentro de la cavidad sinovial de una articulación), intratendinosa (dentro de un tendón), intratesticular (dentro del testículo), intratecal (dentro del líquido cefalorraquídeo en cualquier nivel del eje cerebroespinal), intratho racic (dentro del tórax), intratubular (dentro de los túbulos de un órgano), intratumor (dentro de un tumor), intratimpánico (dentro del aurus media), intravascular (dentro de un vaso o vasos), intraventricular (dentro de un ventrículo), iontoforesis ( por medio de corriente eléctrica donde los iones de sales solubles migran a los tejidos del cuerpo), irrigación (para bañar o enjuagar heridas abiertas o cavidades corporales), laríngea (directamente sobre la laringe), nasogástrica (a través de la nariz y hacia el estómago) , técnica de vendaje oclusivo, oftálmico (al ojo externo), orofaríngeo (directamente a la boca y faringe), parenteral, percutáneo, periarticular, peridural, perineural, periodontal, rectal, respiratorio (dentro del tracto respiratorio mediante inhalación oral o nasal para o efecto sistémico), retrobulbar (detrás de la protuberancia o detrás del globo ocular), intramiocárdico (que ingresa al miocardio), tejido blando, subaracnoideo, subconjuntival, submucoso, transplacentario (a través o por medio de la placenta), transtr dolor (a través de la pared de la tráquea), transtimpánico (a través oa través de la cavidad timpánica), ureteral (al uréter), uretral (a la uretra), vaginal, bloqueo caudal, diagnóstico, bloqueo nervioso, perfusión biliar, perfusión cardíaca, fotoféresis o espinal. En casos específicos, las composiciones se pueden administrar de una manera que les permita cruzar la barrera hematoencefálica, la barrera vascular u otra barrera epitelial. En un aspecto, una formulación para una vía de administración puede incluir al menos un ingrediente inactivo. En la Tabla 20 se muestran ejemplos no limitantes de vías de administración e ingredientes inactivos que pueden incluirse en formulaciones para la vía de administración específica. En la Tabla 27, "AN" significa anestésico, "CNBLK" significa bloqueo nervioso cervical, "NBLK" significa bloqueo nervioso, "IV" significa intravenoso, "IM" significa intramuscular y "SC" significa subcutáneo.
Tabla 27. Vías de administración e in redientes inactivos
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Las vías de administración no limitantes para las VAN de la presente invención se describen a continuación.
Administración parenteral e inyectable
Las formas de dosificación líquida para administración parenteral incluyen, pero no se limitan a, emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y/o elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los ingredientes activos, las formas de dosificación líquida pueden comprender diluyentes inertes que se usan comúnmente en la técnica, tales como, por ejemplo, agua u otros solventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceite de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol de tetrahidrofurfurilo, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán y mezclas de los mismos. Además de los diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes, tales como agentes humectantes, emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, saborizantes, y/o perfumantes. En determinados casos para administración parenteral, las composiciones se mezclan con agentes solubilizantes tales como CREMOPHOr®, alcoholes, aceites, aceites modificados, glicoles, polisorbatos, ciclodextrinas, polímeros y/o combinaciones de los mismos.
Una composición farmacéutica para administración parenteral puede comprender al menos un ingrediente inactivo. Cualquiera o ninguno de los ingredientes inactivos utilizados pueden haber sido aprobados por la Administración de Fármacos y Alimentos de los EE. UU. (FDA). Una lista no exhaustiva de ingredientes inactivos para uso en composiciones farmacéuticas para administración parenteral incluye ácido clorhídrico, manitol, nitrógeno, acetato de sodio, cloruro de sodio e hidróxido de sodio.
Es posible formular preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones estériles inyectables acuosas o suspensiones oleaginosas, según la técnica conocida, usando agentes de dispersión, agentes humectantes y/o agentes de suspensión adecuados. Las preparaciones inyectables estériles pueden ser soluciones, suspensiones y/o emulsiones inyectables estériles en diluyentes y/o solventes parenteralmente aceptables no tóxicos, por ejemplo, una solución en 1,3-butanodiol. Entre los solventes y vehículos aceptables que pueden ser empleados se encuentran agua, solución de Ringer, U.S.P. y solución isotónica de cloruro de sodio. Se emplean convencionalmente aceites no volátiles estériles como un solvente o medio de suspensión. A tales efectos, se puede emplear cualquier aceite no volátil insípido, inclusive mono o diglicéridos sintéticos. En la preparación de inyectables también se pueden usar ácidos grasos como el ácido oleico. La formulación estéril también puede comprender adyuvantes tales como anestésicos locales, conservantes y agentes tamponadores.
Las formulaciones inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias y/o mediante la incorporación de agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse o dispersarse en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de su uso.
Las formulaciones inyectables pueden ser para inyección directa en una región de tejido, órgano y/o sujeto. Como ejemplo no limitativo, un tejido, órgano y/o al sujeto se le puede inyectar directamente una formulación mediante inyección intramiocárdica en la región isquémica. (Véase, por ejemplo, Zangi y col. Nature Biotechnology 2013;).
Para prolongar el efecto de un ingrediente activo, a menudo es deseable ralentizar la absorción del ingrediente activo por inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo que tenga baja solubilidad en agua. Entonces, la velocidad de absorción del fármaco depende de su velocidad de disolución, la que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y de la forma cristalina. De manera alternativa, la absorción retardada de una forma de fármaco administrado parenteralmente se logra al disolver o suspender el fármaco en un vehículo oleoso. Las formas de depósito inyectables se preparan formando matrices de microcápsulas de los fármacos en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicólido. En función de la relación del fármaco respecto al polímero y de la naturaleza del polímero particular utilizado se puede controlar la velocidad de liberación del fármaco. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones de depósito inyectables también se preparan atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales
Administración rectal y vaginal
Las composiciones para administración rectal o vaginal son típicamente supositorios que pueden prepararse mezclando composiciones con excipientes adecuados no irritantes como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera para supositorios que son sólidos a temperatura ambiente pero líquidos a temperatura corporal y por lo tanto se funden en el recto o cavidad vaginal y liberan el ingrediente activo.
Como ejemplo no limitante, las formulaciones para administración rectal y/o vaginal se pueden preparar mezclando el fármaco con un excipiente no irritante adecuado que sea sólido a temperaturas normales pero líquido a la temperatura rectal y, por lo tanto, se derrita en el recto y/o vagina para liberar el fármaco. Entre dichos materiales se incluyen la manteca de cacao y polietilenglicoles.
Una composición farmacéutica para administración rectal puede comprender al menos un ingrediente inactivo. Cualquiera o ninguno de los ingredientes inactivos utilizados pueden haber sido aprobados por la Administración de Fármacos y Alimentos de los EE. UU. (FDA). Una lista no exhaustiva de ingredientes inactivos para uso en composiciones farmacéuticas para administración rectal incluye alcohol, alcohol deshidratado, subacetato de aluminio, ácido cítrico anhidro, aceite de anís, ácido ascórbico, palmitato de ascorbilo, bálsamo de Perú, ácido benzoico, alcohol bencílico, subgalato de bismuto. , hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, butilparabeno, caramelo, carbómero 934, carbómero 934p, carboxipolimetileno, cerasynt-se, alcohol cetílico, manteca de cacao, aceite de coco, hidrogenado, aceite de coco/glicéridos de aceite de almendra de palma, hidrogenado, extracto de semilla de cola nitida, d&c amarillo no. 10, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetano, bentonita de dimetildioctadecilamonio, edetato cálcico disódico, edetato disódico, ácido edético, epilactosa, etilendiamina, grasa, comestible, grasa, dura, fd&c blue no. 1, fd & c verde no. 3, fd & c amarillo no. 6, sabor a higo 827118, sabor a frambuesa pfc-8407, fructosa, galactosa, glicerina, palmitato de glicerilo, estearato de glicerilo, estearato de glicerilo/estearato de clavija, estearato de glicerilo/estearato de clavija-40, glicina, hidrocarburo, ácido clorhídrico, aceite de palma hidrogenado, hipromelosas, lactosa, lanolina, lecitina, aceite mineral ligero, silicato de aluminio y magnesio, silicato de aluminio y magnesio hidratado, metilparabeno, nitrógeno, aceite de almendra de palma, parafina, vaselina, blanco, polietilenglicol 1000, polietilenglicol 1540, polietilenglicol 3350, polietilenglicol 400, polietilenglicol 4000, polietilenglicol 6000, polietilenglicol 8000, polisorbato 60, polisorbato 80, acetato de potasio, metabisulfito de potasio, propilenglicol, propilparabeno, sacarina sódica, sacarina sódica anhidra, dióxido de silicio, coloidal, simeticona , benzoato de sodio, carbonato de sodio, cloruro de sodio, citrato de sodio, hidróxido de sodio, metabisulfito de sodio, monooleato de sorbitán, sesquioleato de sorbitán, sorbitol, solución de sorbitol, almidón, steareth-10, steareth-40, sacarosa, tagatosa, d-, ácido tartárico, dl-, trolamina, trometamina, glicérido de aceite vegetal, hidrogenado, aceite vegetal, hidrogenado, cera, emulsionante, cera blanca, xa goma de nthan y óxido de zinc.
Una composición farmacéutica para administración vaginal puede comprender al menos un ingrediente inactivo. Cualquiera o ninguno de los ingredientes inactivos utilizados pueden haber sido aprobados por la Administración de Fármacos y Alimentos de los EE. UU. (FDA). Una lista no exhaustiva de ingredientes inactivos para uso en composiciones farmacéuticas para administración vaginal incluye ácido adípico, alcohol desnaturalizado, alantoína, lactosa anhidra, ésteres peg-6 de aceite de hueso de albaricoque, sulfato de bario, cera de abejas, bentonita, ácido benzoico, alcohol bencílico, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, lactato de calcio, carbómero 934, carbómero 934p, celulosa microcristalina, ceteth-20, alcohol cetoestearílico, alcohol cetílico, cera de ésteres de cetilo, palmitato de cetilo, colesterol, coleth, ácido cítrico, monohidrato de ácido cítrico, aceite de coco/ glicéridos de aceite de palmiste, hidrogenados, crospovidona, edetato disódico, etilcelulosas, copolímero de etileno-acetato de vinilo (28% acetato de vinilo), copolímero de etileno-acetato de vinilo (9% acetato de vinilo), alcoholes grasos, fd&c amarillo no. 5, gelatina, ácido glutámico, dl-, glicerina, isoestearato de glicerilo, monoestearato de glicerilo, estearato de glicerilo, goma guar, polietileno de alta densidad, polímero de hidrogel, aceite de palma hidrogenado, hipromelosa 2208 (15000 mpa.s), hipromelosas, miristato de isopropilo, láctico ácido, ácido láctico, dl-, lactosa, lactosa monohidrato, lactosa, hidratada, lanolina, lanolina anhidra, lecitina, lecitina, soja, aceite mineral ligero, silicato de aluminio y magnesio, silicato de aluminio y magnesio hidratado, estearato de magnesio, estearato de metilo, metilparabeno, microcristalino cera, aceite mineral, ácido nítrico, octildodecanol, aceite de maní, estearato de peg 6-32/estearato de glicol, estearato de peg-100, estearato de glicerilo peg-120, estearato de peg-2, oleato de peg-5, estearato de pegoxol 7, vaselina, blanco , acetato de fenilmercurio, fosfolipón 90 g, ácido fosfórico, piperazina hexahidratada, poli(dimetilsiloxano/metilvinilsiloxano/metilhidrogensiloxano) dimetilvinilo o dimetilhidroxi o trimetilo bloqueado en los extremos, policarbófilo, poliéster, polietilenglicol 1000, polietilenglicol 3350, polietilenglicol 400, polietilenglicol 4000, polietilenglicol 6000, polietilenglicol 8000, oleato de poliglicerilo-3, oleato de poliglicerilo-4, palmitato de polioxilo, polisorbato 20, polisorbato 60, polisorbato 80, poliuretano, alumbre de potasio, hidróxido de potasio, povidona k29/32, povidonas, promulgen d, propilenglicol, monopalmitostearato de propilenglicol, propilparabeno , forma quaternium-15 cis, dióxido de silicio, dióxido de silicio, coloidal, silicona, bicarbonato de sodio, citrato de sodio, hidróxido de sodio, laurilsulfato de sodio, metabisulfito de sodio, fosfato de sodio, dibásico, anhidro, fosfato de sodio, monobásico, anhidro, ácido sórbico , monoestearato de sorbitán, sorbitol, solución de sorbitol, espermaceti, 2-etilhexanoato estannoso, almidón, almidón 1500, pregelatinizado, almidón, maíz, estearamidoetil dietilamina, ácido esteárico, alcohol estearílico, ácido tartárico, dl-, terc-butilhidroquinona, ortosilicato de tetrapropilo, trolamina, urea, aceite vegetal hidrogenado, wecobee fs, cera de ceresina blanca y blanca cera.
Administración por vía oral
Las formas de dosificación líquida para administración parenteral incluyen, pero no se limitan a, emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y/o elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los ingredientes activos, las formas de dosificación líquida pueden comprender diluyentes inertes que se usan comúnmente en la técnica, tales como, por ejemplo, agua u otros solventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceite de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol de tetrahidrofurfurilo, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán y mezclas de los mismos. Además de los diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes, tales como agentes humectantes, emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, saborizantes, y/o perfumantes. En determinados casos para administración parenteral, las composiciones se mezclan con agentes solubilizantes tales como CREMOPHOR®, alcoholes, aceites, aceites modificados, glicoles, polisorbatos, ciclodextrinas, polímeros y/o combinaciones de los mismos.
Los jarabes y elixires se pueden formular con agentes edulcorantes, por ejemplo, glicerol, propilenglicol, sorbitol o sacarosa. Dichas formulaciones también pueden contener un demulcente, un conservante y agentes saborizantes y colorantes. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión se puede formular según la técnica conocida con agentes de suspensión y agentes humectantes o dispersantes adecuados, que se mencionaron anteriormente. La preparación inyectable estéril también puede ser una suspensión o solución inyectable estéril en un solvente o diluyente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear están el agua, la solución de Ringer y la solución de cloruro sódico isotónica. Además, los aceites estériles fijos se emplean convencionalmente como un disolvente o medio de suspensión. Para este propósito, se puede emplear cualquier aceite fijo suave, incluidos mono o diglicéridos sintéticos. Además, se pueden utilizar ácidos grasos, tales como ácido oleico, en la preparación de inyectables.
Las suspensiones acuosas contienen los materiales activos mezclados con excipientes adecuados para la elaboración de suspensiones acuosas. Dichos excipientes pueden ser agentes de suspensión, como un ejemplo no limitante, los agentes de suspensión pueden ser carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma arábiga; los agentes dispersantes o humectantes pueden ser un fosfátido natural, por ejemplo, lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo, estearato de polioxietileno; o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo heptadecaetilenoxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol como monooleato de polioxietilensorbitol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos ácidos y anhídridos de hexitol, por ejemplo monooleato de polietilensorbitán. Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservantes, por ejemplo p-hidroxibenzoato de etilo o n-propilo, uno o más colorantes, uno o más aromatizantes y uno o más edulcorantes, como sacarosa o sacarina.
Las suspensiones oleosas para dosificación oral pueden formularse suspendiendo los ingredientes activos en un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco, o en un aceite mineral como parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo, cera de abejas, parafina dura o alcohol cetílico. Se pueden agregar agentes edulcorantes para proporcionar preparaciones orales palatables. Estas composiciones se pueden conservar mediante la adición de un antioxidante tal como ácido ascórbico.
La dosificación oral también puede estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase aceitosa puede ser un aceite vegetal o un aceite mineral o mezclas de los.mismos Agentes emulsionantes adecuados pueden ser gomas de origen natural, por ejemplo, goma arábiga o goma tragacanto; fosfátidos de origen natural, por ejemplo, semillas de soja, lecitina y ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo, monooleato de sorbitano, y productos de la condensación de dichos ésteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo, monooleato de polioxietilensorbitano. Las emulsiones también pueden contener agentes edulcorantes y aromatizantes.
Las formas de dosificación sólidas para administración por vía oral incluyen cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos y gránulos. En tales formas de dosificación sólidas, un ingrediente activo se mezcla con al menos un excipiente inerte farmacéuticamente aceptable, como citrato de sodio o fosfato dicálcico y/o rellenos o diluyentes (p.ej. almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico), aglutinantes (p.ej. carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidinona, sacarosa y acacia), humectantes (p.ej. glicerol), agentes desintegrantes (p.ej. agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato de sodio), retardantes de la solución (p.ej. parafina), aceleradores de absorción (p.ej. compuestos de amonio cuaternario), agentes humectantes (p.ej. alcohol cetílico y monoestearato de glicerol), absorbentes (p.ej. caolín y arcilla de bentonita) y lubricantes (p.ej. talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos , laurilsulfato de sodio), y mezclas de los mismos. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, la forma de dosificación puede comprender agentes tamponadores. Las formas de dosificación sólidas también pueden disolverse una vez que entran en contacto con líquidos como, entre otros, saliva y bilis.
Las composiciones destinadas al uso oral se pueden preparar de acuerdo con cualquier procedimiento conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas y dichas composiciones pueden contener uno o más agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes o agentes conservantes para proporcionar preparaciones farmacéuticamente elegantes y palatables.
Las formas de dosificación sólidas pueden no estar revestidas o pueden revestirse mediante técnicas conocidas. En algunos casos, dichos recubrimientos se pueden preparar mediante técnicas conocidas para retrasar la desintegración y la absorción en el tracto gastrointestinal y, por lo tanto, proporcionar una acción sostenida durante un período más prolongado. Por ejemplo, puede emplearse un material de retardo de tiempo tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.
Las formulaciones para uso oral también pueden presentarse como cápsulas de gelatina dura en las que el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín, o como cápsulas de gelatina blanda donde el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio oleoso, por ejemplo aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva.
Las formas de dosificación para administración oral también pueden ser masticables o chupables (p. ej., forma de pastilla). Las formas de dosificación masticables pueden ser formulaciones de liberación sostenida tales como, pero sin limitarse a, las composiciones de liberación sostenida descritas en la Publicación internacional N° WO2013082470 y Publicación de EE.UU. N° US20130142876,. Las formas de dosificación masticables pueden comprender lípidos anfipáticos tales como, pero sin limitarse a, los descritos en la Publicación internacional N° WO2013082470 y Publicación de EE.UU. N° US20130142876,.
Administración tópica o transdérmica
Como se describe en esta invención, las composiciones que contienen las VAN de la invención pueden formularse para su administración por vía transdérmica. La piel puede ser un lugar diana ideal para la administración, ya que es fácilmente accesible. La expresión génica puede estar restringida no solo a la piel, evitando potencialmente la toxicidad inespecífica, sino también a capas específicas y tipos celulares dentro de la piel.
El sitio de expresión cutánea de las composiciones administradas dependerá de la ruta de administración del ácido nucleico. Se consideran comúnmente dos vías para administrar v A n a la piel: (ii) inyección intradérmica; y (iii) administración sistémica (por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades dermatológicas que afectan tanto a las regiones cutáneas como extracutáneas). Las VAN pueden administrarse a la piel mediante varias estrategias diferentes conocidas en la técnica. Después de la administración del ácido nucleico, se han detectado productos génicos en varios tipos celulares diferentes de la piel, incluidos, entre otros, queratinocitos basales, células de las glándulas sebáceas, fibroblastos dérmicos y macrófagos dérmicos.
En un aspecto, la divulgación prevé que las composiciones de VAN se administren en más de una inyección.
En un aspecto, antes de la administración transdérmica, al menos un área de tejido, como la piel, puede someterse a un dispositivo y/o solución que puede aumentar la permeabilidad. En un aspecto, el tejido puede someterse a un dispositivo de abrasión para aumentar la permeabilidad de la piel (ver Publicación de Patente de EE. UU. N° 20080275468). En otro aspecto, el tejido puede someterse a un dispositivo de mejora por ultrasonidos. Un dispositivo de mejora por ultrasonido puede incluir, entre otros, los dispositivos descritos en la Publicación de EE. Uu . N.° 20040236268 y Patentes de EE. UU. N.° 6.491.657 y 6.234.990; los procedimientos para mejorar la permeabilidad del tejido se describen en las Publicaciones de EE.UU. Nos. 20040l7l980 y 20040236268 y Patente de EE.UU. N° 6.190.315;
En un aspecto, puede usarse un dispositivo para aumentar la permeabilidad del tejido antes de administrar las formulaciones de los polinucleótidos, las construcciones primarias y el ARNm descritos en esta invención. La permebilidad de la piel se puede medir usando procedimientos conocidos en la técnica y/o como se describe en la Patente de EE.UU. N° 6.190.315. Como ejemplo no limitativo, se puede administrar una formulación de ARNm modificado mediante los procedimientos de administración de fármacos descritos en la Patente EE. UU. N° 6.190.315.
En otro ejemplo no limitativo, el tejido puede tratarse con una crema de mezcla eutéctica de anestésicos locales (EMLA) antes, durante y/o después de que el tejido pueda someterse a un dispositivo que puede aumentar la permeabilidad.Katz y col. (Anesth Analg (2004); 98:371--76) demostraron que utilizando la crema EMLA en combinación con una energía baja, se observó un inicio de la analgesia cutánea superficial tan rápido como 5 minutos después de un pretratamiento con un ultrasonido de baja energía.
En un aspecto, pueden aplicarse potenciadores al tejido antes, durante y/o después de que el tejido haya sido tratado para aumentar la permeabilidad. Los potenciadores incluyen, pero no se limitan a, potenciadores de transporte, potenciadores físicos y potenciadores de cavitación. Se describen ejemplos no limitantes de potenciadores en la Patente EE. UU. N° 6.190.315.
En un aspecto, se puede usar un dispositivo para aumentar la permeabilidad del tejido antes de administrar formulaciones de VAN descritas en esta invención, que además pueden contener una sustancia que invoque una respuesta inmune. En otro ejemplo no limitante, una formulación que contiene una sustancia para invocar una respuesta inmune puede administrarse mediante los procedimientos descritos en las Publicaciones EE. UU. N° 20040171980 y 20040236268.
Las formas de dosificación para la administración transdérmica de una composición pueden incluir pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, aerosoles, inhalantes y/o parches. Generalmente, un ingrediente activo se mezcla en condiciones estériles con un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier conservante y/o tampón necesarios según se requiera.
Además, la presente divulgación contempla el uso de parches transdérmicos, que a menudo tienen la ventaja añadida de proporcionar una administración controlada de un compuesto al cuerpo. Tales formas de dosificación se pueden elaborar, por ejemplo, al disolver y/o dispersar el compuesto en el medio apropiado. Alternativa o adicionalmente, la velocidad puede controlarse proporcionando una membrana de control de la velocidad y/o dispersando el compuesto en una matriz de polímero y/o gel.
Una composición de VAN farmacéutica para administración transdérmica puede comprender al menos un ingrediente inactivo. Cualquiera o ninguno de los ingredientes inactivos utilizados pueden haber sido aprobados por la Administración de Fármacos y Alimentos de los EE. UU. (FDA). Una lista no exhaustiva de ingredientes inactivos para uso en composiciones farmacéuticas para administración transdérmica incluye copolímero de acrilatos, copolímero de ácido acrílico-isooctilacrilato, adhesivo acrílico 788, adcote 72a103, resina aerotex 3730, alcohol, alcohol deshidratado, poliéster de aluminio, bentonita, butilado hidroxitolueno, butilenglicol, ácido butírico, triglicérido caprílico/cáprico, carbómero 1342, carbómero 940, carbómero 980, carragenina, cloruro de cetilpiridinio, ácido cítrico, crospovidona, daubert 1-5 pestr (mate) 164z, éter monoetílico de dietilenglicol, ftalato de dietilhexilo, copoliol de dimeticona, dimeticona mdx4-4210, fluido médico de dimeticona 360, metacrilato de dimetilaminoetilo - metacrilato de butilo -copolímero de metacrilato de metilo, dipropilenglicol, duro-tak 280-2516, duro-tak 387-2516, duro-tak 80-1196, durotak 87-2070 , duro-tak 87-2194, duro-tak 87-2287, duro-tak 87-2296, duro-tak 87-2888, duro-tak 87-2979, edetato disódico, acetato de etilo, oleato de etilo, etilcelulosa, acetato de etilenvinilo copolímero, copolímero de etilenopropileno, ésteres de ácidos grasos, gelva 737, glicerina, laurato de glicerilo, oleato de glicerilo, heptano, polietileno de alta densidad, ácido clorhídrico, polibuteno hidrogenado 635-690, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, miristato de isopropilo, palmitato de isopropilo, lactosa, lanolina anhidra, lauril lactato, lecitina, ácido levulínico, aceite mineral ligero, adhesivo médico modificado s-15, alcohol metílico, laurato de metilo, aceite mineral, nitrógeno, octisalato, octildodecanol, ácido oleico, alcohol oleico, oleato de oleilo, pentadecalactona, vaselina, blanco, polacrilina, ácido poliacrílico (250000 mw), polibuteno (1400 mw), poliéster, copolímero de poliamina de poliéster, rayón de poliéster, tereftalatos de polietileno, poliisobutileno, poliisobutileno (1100000 mw), poliisobutileno (35000 mw), poliisobutileno 178-236, poliisobutileno 241-294, poliisobutileno 35-39, poliisobutileno de bajo peso molecular, poliisobutileno de peso molecular medio, adhesivo de poliisobutileno/polibuteno, polipropileno, acetato de polivinilo, alcohol polivinílico, cloruro de polivinilo, copolímero de cloruro de polivinilo-acetato de polivinilo, polivinilpiridina, povidona k29/32, povidonas, propilenglicol, monolaurato de propilenglicol, ra-2397, ra-3011, silicio, silicio dióxido, coloidal, silicona, adhesivo de silicona 4102, adhesivo de silicona 4502, adhesivo de silicona bio-psa q7-4201, adhesivo de silicona bio-psa q7-4301, tira de película de silicona/poliéster, cloruro de sodio, citrato de sodio, hidróxido de sodio, monooleato de sorbitán, hectorita de estearalconio/carbonato de propileno, dióxido de titanio, triacetina, trolamina, trometamina, union 76 amsco-res 6038 y viscosa/algodón.
Una composición de VAN farmacéutica para administración transdérmica puede comprender al menos un ingrediente inactivo. Cualquiera o ninguno de los ingredientes inactivos utilizados pueden haber sido aprobados por la Administración de Fármacos y Alimentos de los EE. UU. (FDA). Una lista no exhaustiva de ingredientes inactivos para uso en composiciones farmacéuticas para administración intradérmica incluye cloruro de benzalconio, alcohol bencílico, carboximetilcelulosa sódica, creatinina, edetato disódico, glicerina, ácido clorhídrico, metacresol, metilparabeno, fenol, polisorbato 80, sulfato de protamina, acetato de sodio. , bisulfito de sodio, cloruro de sodio, hidróxido de sodio, fosfato de sodio, fosfato de sodio, dibásico, fosfato de sodio, dibásico, heptahidrato, fosfato de sodio, monobásico, anhidro y cloruro de zinc.
Administración por depósito
Como se describe en esta invención, en algunos aspectos, la composición se puede formular en depósitos para liberación prolongada. Generalmente, un órgano o tejido específico (un "tejido diana") es alcanzado para administración..
En algunos aspectos de la divulgación, las VAN se retienen espacialmente dentro o cerca de un tejido diana. Se proporciona un procedimiento para proporcionar una composición a un tejido diana de un sujeto mamífero poniendo en contacto el tejido diana (que contiene una o más células diana) con la composición en condiciones tales que la composición, en particular el o los componentes de ácido nucleico de la composición, se retiene sustancialmente en el tejido diana, lo que significa que al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,99 o más del 99,99 % de la composición se retiene en el tejido diana. Ventajosamente, la retención se determina midiendo la cantidad de ácido nucleico presente en la composición que entra en una o más células diana. Por ejemplo, al menos 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,99 o más del 99,99 % del los ácidos nucleicos administrados al sujeto están presentes intracelularmente en un período de tiempo después de la administración. Por ejemplo, la inyección intramuscular a un sujeto mamífero se realiza usando una composición acuosa que contiene un ácido ribonucleico y un reactivo de transfección, y la retención de la composición se determina midiendo la cantidad de ácido ribonucleico presente en las células musculares.
Los aspectos de la invención están dirigidos a procedimientos para proporcionar una composición a un tejido diana de un sujeto mamífero, poniendo en contacto el tejido diana (que contiene una o más células diana) con la composición en condiciones tales que la composición se retenga sustancialmente en el tejido diana. La composición contiene una cantidad efectiva de un polinucleótido de manera que el polipéptido de interés se produzca en al menos una célula diana. Las composiciones contienen generalmente un agente de penetración celular, aunque también se contempla una VAN "desnuda" (tal como ácidos nucleicos sin un agente de penetración celular u otro agente) y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En algunas circunstancias, la cantidad de proteína producida por las células en un tejido aumenta de forma deseable. Preferiblemente, este aumento en la producción de proteínas se restringe espacialmente a las células dentro del tejido diana. Por tanto, se proporcionan procedimientos para aumentar la producción de una proteína de interés en un tejido de un sujeto mamífero. Se proporciona una composición que contiene polinucleótidos caracterizada porque se ha determinado una cantidad unitaria de composición para producir el polipéptido de interés en un porcentaje sustancial de células contenidas dentro de un volumen predeterminado del tejido diana..
En algunas realizaciones, la composición de VAN incluye una pluralidad de polinucleótidos diferentes, donde uno o más de uno de los polinucleótidos codifica un polipéptido de interés. Opcionalmente, la composición también contiene un agente de penetración celular para ayudar en el suministro intracelular de la composición. Se hace una determinación de la dosis de la composición requerida para producir el polipéptido de interés en un porcentaje sustancial de células contenidas dentro del volumen predeterminado del tejido diana (generalmente, sin inducir una producción significativa del polipéptido de interés en el tejido adyacente al volumen predeterminado, o distalmente al tejido diana). Posteriormente a esta determinación, la dosis determinada se introduce directamente en el tejido del sujeto mamífero.
En un aspecto, la descripción prevé que las VAN se suministren en más de una inyección o mediante inyecciones de dosis fraccionadas.
En un aspecto, la descripción se puede retener cerca del tejido diana usando un pequeño depósito de medicamento desechable, una bomba de parche o una bomba osmótica. Ejemplos no limitantes de bombas de parche incluyen las fabricadas y/o vendidas por BD® (Franklin Lakes, NJ), Insulet Corporation (Bedford, MA), SteadyMed Therapeutics (San Francisco, CA), Medtronic (Minneapolis, MN), UniLife (York, PA), Valeritas (Bridgewater, New Jersey) y SpringLeaf Therapeutics (Boston, MA). Un ejemplo no limitante de una bomba osmótica incluye las fabricadas por DURECT® (Cupertino, CA) (por ejemplo, DUROS® y ALZET ®).
Administración pulmonar
Se puede preparar, empaquetar y/o vender una composición farmacéutica en una formulación adecuada para administración pulmonar a través de la cavidad bucal. Tal formulación puede comprender partículas secas que comprenden el ingrediente activo y que tienen un diámetro en el intervalo de aproximadamente 0,5 nm a aproximadamente 7 nm o de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 6 nm. Dichas composiciones están convenientemente en forma de polvos secos para la administración usando un dispositivo que comprende un depósito de polvo seco al cual se puede dirigir una corriente de propulsor para dispersar el polvo y/o usando un recipiente dispensador de polvo/disolvente autopropulsado, tal como un dispositivo que comprende el ingrediente activo disuelto y/o suspendido en un propulsor de bajo punto de ebullición en un recipiente sellado. Dichos polvos comprenden partículas donde al menos el 98 % de las partículas en peso tienen un diámetro superior a 0,5 nm y al menos el 95 % de las partículas en número tienen un diámetro inferior a 7 nm. Alternativamente, al menos el 95 % de las partículas en peso tienen un diámetro mayor de 1 nm y al menos el 90 % de las partículas en número tienen un diámetro menor de 6 nm. Las composiciones de polvo seco pueden incluir un diluyente de polvo fino sólido tal como azúcar y se proporcionan convenientemente en forma de dosis unitaria.
Los propulsores de bajo punto de ebullición generalmente incluyen propulsores líquidos que tienen un punto de ebullición por debajo de los 65 °F a presión atmosférica. Generalmente, el propulsor puede constituir del 50 % al 99,9 % (p/p) de la composición, y el ingrediente activo puede constituir del 0,1 % al 20 % (p/p) de la composición. Un propulsor puede comprender además ingredientes adicionales tales como un tensioactivo líquido no iónico y/o aniónico sólido y/o un diluyente sólido (que puede tener un tamaño de partícula del mismo orden que las partículas que comprenden el ingrediente activo).
Como ejemplo no limitativo, las VAN descritos en esta invención pueden formularse para administración pulmonar mediante los procedimientos descritos en la Pat. de EE. UU. No. 8,257,685.
Las composiciones farmacéuticas formuladas para administración pulmonar pueden proporcionar un ingrediente activo en forma de gotitas de una solución y/o suspensión. Dichas formulaciones pueden prepararse, empaquetarse y/o venderse como soluciones y/o suspensiones acuosas y/o alcohólicas diluidas, opcionalmente estériles, que comprenden ingrediente activo, y pueden administrarse convenientemente usando cualquier dispositivo de nebulización y/o atomización. Dichas formulaciones pueden comprender además uno o más ingredientes adicionales que incluyen, pero no se limitan a, un agente aromatizante como sacarina sódica, un aceite volátil, un agente tamponador, un agente tensioactivo y/o un conservante como metilhidroxibenzoato. Las gotitas proporcionadas por esta vía de administración pueden tener un diámetro medio en el intervalo de aproximadamente 0,1 nm a aproximadamente 200 nm.
Las composiciones y formulaciones proporcionadas en esta invención que se pueden usar para la administración pulmonar pueden comprender además uno o más tensioactivos. Los tensioactivos o componentes tensioactivos adecuados para mejorar la absorción de las composiciones de la invención incluyen formas sintéticas y naturales, así como formas completas y truncadas de proteína A tensioactiva, proteína B tensioactiva, proteína C tensioactiva, proteína D tensioactiva y proteína E tensioactiva, disaturada. fosfatidilcolina (que no sea dipalmitoil), dipalmitoilfosfatidilcolina, fosfatidilcolina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina; ácido fosfatídico, ubiquinonas, lisofosfatidiletanolamina, lisofosfatidilcolina, palmitoil-lisofosfatidilcolina, dehidroepiandrosterona, dolicoles, ácido sulfatídico, glicerol-3-fosfato, fosfato de dihidroxiacetona, glicerol, glicero-3-fosfocolina, dihidroxiacetona, palmitato, difosfato de citidina (CDP) diacilglicerol, colina CDP , colina, fosfato de colina; así como cuerpos lamelares naturales y artificiales que son los vehículos portadores naturales de los componentes del surfactante, ácidos grasos omega-3, ácido poliénico, ácido polienoico, lecitina, ácido palmitínico, copolímeros en bloque no iónicos de óxidos de etileno o propileno, polioxipropileno, monoméricos y poliméricos, polioxietileno, monoméricos y poliméricos, poli(vinilamina) con cadenas laterales de dextrano y/o alcanoilo, Brij 35, Triton X-100 y surfactantes sintéticos ALEC, Exosurf, Survan y Atovacuona, entre otros. Estos tensioactivos se pueden utilizar como tensioactivos de un solo componente o como parte de múltiples componentes en una formulación, o como adiciones unidas covalentemente al extremo 5' y/o 3' del componente de ácido nucleico de una composición farmacéutica de esta invención.
Administración intranasal, nasal y bucal
Las formulaciones descritas en esta invención como útiles para la administración pulmonar son útiles para la administración intranasal de una composición farmacéutica de VAN. Otra formulación adecuada para la administración intranasal es un polvo grueso que comprende el ingrediente activo y que tiene una partícula promedio de aproximadamente 0,2 pm a 500 pm. Dicha formulación se administra de la manera en que se toma el rapé, es decir, mediante inhalación rápida a través del conducto nasal desde un recipiente del polvo que se mantiene cerca de la nariz.
Las formulaciones adecuadas para la administración nasal pueden, por ejemplo, comprender desde aproximadamente un 0,1 % (p/p) hasta un 100 % (p/p) de ingrediente activo, y pueden comprender uno o más de los ingredientes adicionales descritos en esta invención. . Se puede preparar, empaquetar y/o vender una composición farmacéutica en una formulación adecuada para administración bucal. Tales formulaciones pueden, por ejemplo, estar en forma de comprimidos y/o pastillas preparadas usando procedimientos convencionales, y pueden, por ejemplo, de 0,1 % a 20 % (p/p) de ingrediente activo, comprendiendo el resto un ingrediente activo que se disuelve por vía oral y/o composición degradable y, opcionalmente, uno o más de los ingredientes adicionales descritos en esta invención. Alternativamente, las formulaciones adecuadas para la administración bucal pueden comprender un polvo y/o una solución y/o suspensión aerosolizada y/o atomizada que comprende un ingrediente activo. Tales formulaciones en polvo, aerosolizadas y/o en aerosol, cuando se dispersan, pueden tener un tamaño medio de partículas y/o gotas en el intervalo de aproximadamente 0,1 nm a aproximadamente 200 nm, y pueden comprender además uno o más de los ingredientes adicionales descritos en esta invención.
Una composición de VAN farmacéutica para administración por inhalación (respiratoria) puede comprender al menos un ingrediente inactivo. Cualquiera o ninguno de los ingredientes inactivos utilizados pueden haber sido aprobados por la Administración de Fármacos y Alimentos de los EE. UU. (FDA). Una lista no exhaustiva de ingredientes inactivos para uso en composiciones farmacéuticas para administración por inhalación (respiratoria) incluye acetona bisulfito sódico, acetilcisteína, alcohol, alcohol deshidratado, amoníaco, apaflurano, ácido ascórbico, cloruro de benzalconio, carbonato de calcio, dióxido de carbono, cloruro de cetilpiridinio. , clorobutanol, ácido cítrico, d & c amarillo no. 10, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetano, edetato disódico, edetato sódico, fd & c amarillo no. 6, fluoroclorohidrocarburos, gelatina, glicerina, glicina, ácido clorhídrico, ácido clorhídrico, diluido, lactosa, lactosa monohidrato, lecitina, lecitina, soja hidrogenada, lecitina, soja, lisina monohidrato, manitol, mentol, metilparabeno, ácido nítrico, nitrógeno, norflurano ácido oleico, polietilenglicol 1000, povidona k25, propilenglicol, propilparabeno, sacarina, sacarina sódica, dióxido de silicio, coloidal, bisulfato de sodio, bisulfito de sodio, cloruro de sodio, citrato de sodio, hidróxido de sodio, lauril sulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfato de sodio anhidro , sulfito de sodio, trioleato de sorbitán, ácido sulfúrico, timol, dióxido de titanio, tricloromonofluorometano, trometamina y óxido de zinc.
Una composición de VAN farmacéutica para administración nasal puede comprender al menos un ingrediente inactivo. Cualquiera o ninguno de los ingredientes inactivos utilizados pueden haber sido aprobados por la Administración de Fármacos y Alimentos de los EE. UU. (FDA). Una lista no exhaustiva de ingredientes inactivos para uso en composiciones farmacéuticas para administración nasal incluye ácido acético, alcohol, allí a-ionona deshidratada, dextrosa anhidra, citrato trisódico anhidro, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, cafeína, dióxido de carbono, carboximetilcelulosa sódica, celulosa microcristalina, clorobutanol, ácido cítrico, monohidrato de ácido cítrico, dextrosa, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetano, edetato disódico, glicerina, éster de glicerol de colofonia hidrogenada, ácido clorhídrico, hipromelosa 2910 (15000 mpa. s), metilcelulosa, metilparabeno, nitrógeno, norflurano, ácido oleico, vaselina, blanco, alcohol feniletílico, polietilenglicol 3350, polietilenglicol 400, estearato de polioxilo 400, polisorbato 20, polisorbato 80, fosfato de potasio, monobásico, sorbato de potasio, propilenglicol, propilparabeno, acetato de sodio, cloruro de sodio, citrato de sodio, hidróxido de sodio, fosfato de sodio, fosfato de sodio, dibásico , fosfato de sodio, dibásico, anhidro, fosfato de sodio, dibásico, dihidrato, fosfato de sodio, dibásico, dodecahidrato, fosfato de sodio, dibásico, heptahidrato, fosfato de sodio, monobásico, anhidro, fosfato de sodio, monobásico, dihidrato, trioleato de sorbitán, sorbitol, solución de sorbitol , sucralosa, ácido sulfúrico, tricloromonofluorometano y citrato trisódico dihidrato.
Administración oftálmica y auricular (ótica)
Una composición farmacéutica de VAN puede prepararse, envasarse y/o venderse en una formulación adecuada para administrarse en y/o alrededor del ojo y/o administrarse en el oído (p. ej., administración auricular (ótica)). Ejemplos no limitantes de vía de administración para la entrega a y/o aproximadamentel ojo incluyen retrobulbar, conjuctival, intracorneal, intraocular, intravítreo, oftálmica y subconjuctiva. Tales formulaciones pueden estar, por ejemplo, en forma de gotas para los ojos que incluyen, por ejemplo, una solución y/o suspensión al 0,1/1,0 % (p/p) del ingrediente activo en un excipiente líquido acuoso o aceitoso. Dichas gotas pueden comprender además agentes tamponantes, sales y/o uno o más de cualquier ingrediente adicional descrito en esta invención. Otras formulaciones de administración oftálmica que son útiles incluyen aquellas que comprenden el ingrediente activo en forma microcristalina y/o en una preparación liposomal. Se contempla que las gotas para los oídos y/o las gotas oftálmicas quedan comprendidas en el alcance de la presente invención. Puede prepararse un dispositivo de película fina multicapa para que contenga una composición farmacéutica para su administración al ojo y/o tejido circundante.
Una composición de VAN farmacéutica para administración oftálmica puede comprender al menos un ingrediente inactivo. Cualquiera o ninguno de los ingredientes inactivos utilizados pueden haber sido aprobados por la Administración de Fármacos y Alimentos de los EE. UU. (FDA). Una lista no exhaustiva de ingredientes inactivos para uso en composiciones farmacéuticas para administración oftálmica incluye ácido acético, alcohol, alcohol deshidratado, ácido algínico, amerchol-cab, hidróxido de amonio, citrato trisódico anhidro, antipirina, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, bromuro de benzododecinio , ácido bórico, cafeína, cloruro de calcio, carbómero 1342, carbómero 934p, carbómero 940, homopolímero de carbómero tipo b (alil pentaeritritol reticulado), carboximetilcelulosa sódica, aceite de ricino, alcohol cetílico, clorobutanol, clorobutanol anhidro, colesterol, ácido cítrico, ácido cítrico monohidrato, creatinina, dietanolamina, ftalato de dietilhexilo, copolímero de divinilbenceno estireno, edetato disódico, edetato disódico anhidro, edetato sódico, copolímero de etileno acetato de vinilo, goma gellan (baja acilo), glicerina, estearato de glicerilo, polietileno de alta densidad, gel hidrocarbonado, plastificado, ácido clorhídrico, ácido clorhídrico, diluido, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa 2906, hipromelosa 2910 (15000 mpa.s), hipromelosas, jelene, lanolina, alcoholes de lanolina, lanolina anhidra, derivados no iónicos de lanolina, cloruro de lauralconio, lauroil sarcosina, aceite mineral ligero, cloruro de magnesio, manitol, metilcelulosa (4000 mpa.s), metilcelulosa, metilparabeno, aceite mineral, ácido nítrico, nitrógeno , nonoxinol-9, octoxinol-40, octilfenol polimetileno, vaselina, vaselina blanca, alcohol feniletílico, acetato fenilmercúrico, nitrato fenilmercúrico, ácido fosfórico, cloruro de polidronio, poloxámero 188, poloxámero 407, policarbófilo, polietilenglicol 300, polietilenglicol 400, polietilenglicol 8000, polioxietileno - polioxipropileno 1800, polioxil 35 aceite de ricino, polioxil 40 aceite de ricino hidrogenado, polioxil 40 estearato, polipropilenglicol, polisorbato 20, polisorbato 60, polisorbato 80, alcohol polivinílico, acetato de potasio, cloruro de potasio, fosfato de potasio, monobásico, sorbato de potasio, povidona k29/32, povidona k30, povidona k90, povidonas, propilenglicol, propilparabeno, carbonato de sodio, acetato de sodio, bisulfato de sodio, bisulfito de sodio, sodio borato, borato de sodio decahidratado, carbonato de sodio, carbonato de sodio monohidratado, cloruro de sodio, citrato de sodio, hidróxido de sodio, metabisulfito de sodio, nitrato de sodio, fosfato de sodio, fosfato de sodio dihidratado, fosfato de sodio, dibásico, fosfato de sodio, dibásico, anhidro, fosfato de sodio, dibásico, dihidrato, fosfato de sodio, dibásico, heptahidrato, fosfato de sodio, monobásico, fosfato de sodio, monobásico, anhidro, fosfato de sodio, monobásico, dihidrato, fosfato de sodio, monobásico, monohidrato, sodio sulfato, sulfato de sodio anhidro, sulfato de sodio decahidratado, sulfito de sodio, tiosulfato de sodio, ácido sórbico, monolaurato de sorbitán, sorbitol, solución de sorbitol, complejo de oxicloro estabilizado, ácido sulfúrico, timerosal, dióxido de titanio, tocofersolán, citrato trisódico dihidrato, tritón 720, trometamina, tiloxapol y cloruro de zinc.
Una composición de VAN farmacéutica para administración retrobulbar puede comprender al menos un ingrediente inactivo. Cualquiera o ninguno de los ingredientes inactivos utilizados pueden haber sido aprobados por la Administración de Fármacos y Alimentos de los EE. UU. (FDA). Una lista no exhaustiva de ingredientes inactivos para uso en composiciones farmacéuticas para administración retrobulbar incluye ácido clorhídrico e hidróxido de sodio.
Una composición de VAN farmacéutica para administración Intraocular puede comprender al menos un ingrediente inactivo. Cualquiera o ninguno de los ingredientes inactivos utilizados pueden haber sido aprobados por la Administración de Fármacos y Alimentos de los EE. UU. (FDA). Una lista no exhaustiva de ingredientes inactivos para uso en composiciones farmacéuticas para administración intraocular incluye cloruro de benzalconio, cloruro de calcio, ácido cítrico monohidrato, ácido clorhídrico, cloruro de magnesio, alcohol polivinílico, cloruro de potasio, acetato de sodio, cloruro de sodio, citrato de sodio e hidróxido de sodio. .
Una composición de VAN farmacéutica para administración intravítrea puede comprender al menos un ingrediente inactivo. Cualquiera o ninguno de los ingredientes inactivos utilizados pueden haber sido aprobados por la Administración de Fármacos y Alimentos de los EE. UU. (FDA). Una lista no exhaustiva de ingredientes inactivos para uso en composiciones farmacéuticas para administración intravítrea incluye cloruro de calcio, carboximetilcelulosa de sodio, celulosa, microcristalina, hialuronato de sodio, ácido clorhídrico, cloruro de magnesio, estearato de magnesio, polisorbato 80, alcohol polivinílico, cloruro de potasio, acetato de sodio. , bicarbonato de sodio, carbonato de sodio, cloruro de sodio, hidróxido de sodio, fosfato de sodio dibásico heptahidratado, fosfato de sodio monobásico monohidrato y citrato trisódico deshidratado.
Una composición de VAN farmacéutica para administración subconjuntival puede comprender al menos un ingrediente inactivo. Cualquiera o ninguno de los ingredientes inactivos utilizados pueden haber sido aprobados por la Administración de Fármacos y Alimentos de los EE. UU. (FDA). Una lista no exhaustiva de ingredientes inactivos para uso en composiciones farmacéuticas para administración subconjuntival incluye alcohol bencílico, ácido clorhídrico e hidróxido de sodio.
Una composición de VAN farmacéutica para administración auricular puede comprender al menos un ingrediente inactivo. Cualquiera o ninguno de los ingredientes inactivos utilizados pueden haber sido aprobados por la Administración de Fármacos y Alimentos de los EE. UU. (FDA). Una lista no exhaustiva de ingredientes inactivos para uso en composiciones farmacéuticas para administración auricular incluye ácido acético, acetato de aluminio, sulfato de aluminio anhidro, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, ácido bórico, carbonato de calcio, alcohol cetílico, clorobutanol, cloroxilenol, ácido cítrico ácido, creatinina, sulfato cúprico, sulfato cúprico anhidro, edetato disódico, ácido edético, glicerina, estearato de glicerilo, ácido clorhídrico, hidrocortisona, hidroxietilcelulosa, miristato de isopropilo, ácido láctico, lecitina hidrogenada, metilparabeno, aceite mineral, vaselina, vaselina, blanco, alcohol feniletílico, estearato de polioxilo 40, estearato de polioxilo, polisorbato 20, polisorbato 80, alcohol polivinílico, metabisulfito de potasio, fosfato de potasio, monobásico, povidona k90f, povidonas, propilenglicol, diacetato de propilenglicol, propilparabeno, acetato de sodio, bisulfito de sodio, borato de sodio, cloruro de sodio, citrato de sodio, hidróxido de sodio, fosfato de sodio, dibásico, anhidro, fosfato de sodio, dibásico, heptahidratado, fosfato de sodio, monobásico, anhidro, sulfito de sodio, ácido sulfúrico y timerosal.
Combinaciones
Las VAN se pueden usar en combinación con uno o más agentes terapéuticos, profilácticos, de diagnóstico o de formación de imágenes. Por "en combinación con", no se pretende implicar que los agentes deben administrarse al mismo tiempo y/o que deben formularse para su administración conjunta, aunque estos procedimientos de administración están dentro del alcance de la presente descripción. Las composiciones se pueden administrar simultáneamente con, antes o después de, uno o más de otros procedimientos terapéuticos o médicos deseados. En general, cada agente se administrará a una dosis y/o en un horario determinado para ese agente. En algunos aspectos, la presente divulgación abarca la administración de composiciones farmacéuticas, profilácticas, de diagnóstico o de formación de imágenes en combinación con agentes que pueden mejorar su biodisponibilidad, reducir y/o modificar su metabolismo, inhibir su excreción y/o modificar su distribución dentro del cuerpo.
Las combinaciones pueden presentarse convenientemente para su uso en forma de una formulación farmacéutica y, por lo tanto, las composiciones farmacéuticas que comprenden una combinación como se define anteriormente junto con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable representan otro aspecto de la divulgación.
Los compuestos individuales de dichas combinaciones pueden administrarse secuencial o simultáneamente en formulaciones farmacéuticas separadas o combinadas. En un aspecto, los compuestos individuales se administrarán simultáneamente en una formulación farmacéutica combinada.
Se apreciará además que los agentes activos terapéuticos, profilácticos, diagnósticos o de imagenología nutilizados en combinación pueden administrarse juntos en una sola composición o administrarse por separado en diferentes composiciones. En general, se espera que los agentes utilizados en combinación se utilicen a niveles que no superen los niveles a los que se utilizan individualmente. En algunos aspectos, los niveles utilizados en combinación serán más bajos que los utilizados individualmente. En un aspecto, las combinaciones, cada una o juntas, pueden administrarse según los regímenes de dosificación divididos descritos en esta invención.
Dosificación
La presente divulgación proporciona procedimientos que comprenden la administración de VAN y de acuerdo con la divulgación a un sujeto que lo necesite. La cantidad exacta requerida variará de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, la edad y el estado general del sujeto, la gravedad de la enfermedad, la composición particular, su modo de administración, su modo de actividad y similares. Las composiciones según la invención se formulan típicamente en forma de conjunto de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. Sin embargo, se entenderá que el uso diario total de las composiciones de la presente descripción puede ser decidido por el médico tratante dentro del alcance del buen juicio médico. El nivel de dosis de formación de imágenes específico terapéuticamente efectivo, profilácticamente efectivo o apropiado para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se está tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el momento de administración, la vía de administración y la velocidad de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; fármacos usados en combinación o coincidentemente con el compuesto específico empleado; y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.
En ciertos aspectos, las composiciones de acuerdo con la presente descripción pueden administrarse a niveles de dosificación suficientes para administrar desde alrededor de 0,0001 mg/kg hasta alrededor de 100 mg/kg, desde alrededor de 0,001 mg/kg hasta alrededor de 0,05 mg/kg, desde alrededor de 0,005 mg /kg a aproximadamente 0,05 mg/kg, de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 0,005 mg/kg, de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 0,5 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, o de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, del peso corporal del sujeto por día, una o más veces al día, para obtener el efecto terapéutico, de diagnóstico, profiláctico o de formación de imágenes deseado (ver, por ejemplo, el intervalo de dosis unitarias descrito en la Publicación Internacional No WO2013078199,). La dosis deseada se puede administrar tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, cada dos días, cada tercer día, cada semana, cada dos semanas, cada tres semanas o cada cuatro semanas. En ciertos aspectos, la dosificación deseada puede administrarse utilizando múltiples administraciones (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o más administraciones). Cuando se emplean múltiples administraciones, se pueden utilizar pautas de dosificación dividida, tales como las descritas en esta invención.
Según la presente divulgación, las VAN pueden administrarse en regímenes de dosis divididas. Tal como se usa en esta invención, una "dosis dividida" es la división de la dosis unitaria única o la dosis diaria total en dos o más dosis, por ejemplo, dos o más administraciones de la dosis unitaria única. Tal como se usa en esta invención, una "dosis unitaria única" es una dosis de cualquier terapéutico administrado en una dosis/en un momento/vía única/punto único de contacto, es decir, un evento de administración única. Tal como se usa en esta invención, una "dosis diaria total" es una cantidad administrada o prescrita en un período de 24 horas. Puede administrarse como una dosis unitaria única. En un aspecto, las VAN de la presente descripción se administran a un sujeto en dosis fraccionadas. Las VAN se puede formular en tampón solamente o en una formulación descrita en esta invención.
Formas de dosificación
Una composición farmacéutica de VAN descrita en esta invención se puede formular en una forma de dosificación descrita en esta invención, como intranasal, intratraqueal o inyectable (por ejemplo, intravenosa, intraocular, intravítrea, intramuscular, intracardíaca, intraperitoneal, subcutánea).
Formas de dosificación líquidas
Las formas de dosificación líquida para administración parenteral incluyen, pero no se limitan a, emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y/o elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los ingredientes activos, las formas de dosificación líquida pueden comprender diluyentes inertes que se usan comúnmente en la técnica, tales como, por ejemplo, agua u otros solventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceite de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol de tetrahidrofurfurilo, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán y mezclas de los mismos. En determinados aspectos para la administración parenteral, las composiciones se pueden mezclar con agentes solubilizantes tales como CREMOPHOR®, alcoholes, aceites, aceites modificados, glicoles, polisorbatos, ciclodextrinas, polímeros y/o combinaciones de los mismos.
Inyectables
Las preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles se pueden formular de acuerdo con la técnica conocida y pueden incluir agentes dispersantes, agentes humectantes y/o agentes de suspensión adecuados. Las preparaciones inyectables estériles pueden ser soluciones, suspensiones y/o emulsiones inyectables estériles en diluyentes y/o solventes parenteralmente aceptables no tóxicos, por ejemplo, una solución en 1,3-butanodiol. Entre los solventes y vehículos aceptables que pueden ser empleados se encuentran, sin limitación, agua, solución de Ringer, U.S.P. y solución isotónica de cloruro de sodio. Se emplean convencionalmente aceites no volátiles estériles como un solvente o medio de suspensión. A tales efectos, se puede emplear cualquier aceite no volátil insípido, inclusive mono o diglicéridos sintéticos. En la preparación de inyectables también se pueden usar ácidos grasos como el ácido oleico.
Las formulaciones inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias y/o mediante la incorporación de agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse o dispersarse en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de su uso.
Para prolongar el efecto de un ingrediente activo, a menudo es deseable ralentizar la absorción del ingrediente activo por inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo que tenga baja solubilidad en agua. La tasa de absorción de las VAN depende a continuación de su tasa de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de un VAN administrado por vía parenteral puede lograrse disolviendo o suspendiendo las VAN en un vehículo oleoso. Las formas de depósito inyectables se preparan formando matrices de microcápsulas de las VAN en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicólido. En función de la relación de la VAN respecto al polímero y de la naturaleza del polímero particular utilizado se puede controlar la velocidad de liberación de los polinucleótidos. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen, sin lkimitación, poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones inyectables de depósito se pueden preparar atrapando los VAN en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales.
Pulmonar
Las formulaciones descritas en esta invención como útiles para la administración pulmonar también pueden usarse para la administración intranasal de una composición farmacéutica. Otra formulación adecuada para la administración intranasal es un polvo grueso que comprende el ingrediente activo y que tiene una partícula promedio de aproximadamente 0,2 pm a 500 pm. Dicha formulación se administra de la manera en que se toma el rapé, es decir, mediante inhalación rápida a través del conducto nasal desde un recipiente del polvo que se mantiene cerca de la nariz.
Las formulaciones adecuadas para la administración nasal pueden, por ejemplo, comprender desde aproximadamente un 0,1 % (p/p) hasta un 100 % (p/p) de ingrediente activo, y pueden comprender uno o más de los ingredientes adicionales descritos en esta invención. . Se puede preparar, empaquetar y/o vender una composición farmacéutica en una formulación adecuada para administración bucal. Tales formulaciones pueden, por ejemplo, estar en forma de comprimidos y/o pastillas preparadas usando procedimientos convencionales, y pueden contener, por ejemplo, alrededor de 0,1 % a 20 % (p/p) de ingrediente activo, donde el resto puede comprender un ingrediente activo por vía oral. composición soluble y/o degradable y, opcionalmente, uno o más de los ingredientes adicionales descritos en esta invención. Alternativamente, las formulaciones adecuadas para la administración bucal pueden comprender un polvo y/o una solución y/o suspensión aerosolizada y/o atomizada que comprende un ingrediente activo. Tales formulaciones en polvo, aerosolizadas y/o en aerosol, cuando se dispersan, pueden tener un tamaño medio de partículas y/o gotas en el intervalo de aproximadamente 0,1 nm a aproximadamente 200 nm, y pueden comprender además uno o más de los ingredientes adicionales descritos en esta invención.
Es posible encontrar consideraciones generales de la formulación y/o fabricación de agentes farmacéuticos, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21a ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005.
Recubrimientos o cubiertas
Las formas de dosificación sólidas de comprimidos, grageas, cápsulas, píldoras y gránulos se pueden preparar con recubrimientos y cubiertas tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. Opcionalmente pueden comprender agentes opacificantes y pueden ser de una composición que liberen el ingrediente o los principios activos solo, o preferentemente, en una determinada parte del tracto intestinal, opcionalmente, de manera retardada. Los ejemplos de composiciones de inclusión que se pueden emplear incluyen ceras y sustancias poliméricas. Las composiciones sólidas de un tipo similar también se pueden emplear como rellenos en cápsulas de gelatina rellenas duras y blandas usando excipientes tales como lactosa o glúcidos de la leche así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
Administración de dosis múltiples y dosis repetidas
En algunos aspectos, los compuestos de VAN y/o las composiciones de la presente divulgación se pueden administrar en dos o más dosis (a las que se hace referencia en esta invención como "administración multidosis"). Dichas dosis pueden comprender los mismos componentes o pueden comprender componentes no incluidos en una dosis anterior. Dichas dosis pueden comprender la misma masa y/o volumen de componentes o una masa alterada y/o volumen de componentes en comparación con una dosis anterior. En algunos aspectos, la administración de dosis múltiples puede comprender la administración de dosis repetidas. Como se usa en esta invención, el término "administración de dosis repetidas" se refiere a dos o más dosis administradas consecutivamente o dentro de un régimen de dosis repetidas que comprenden sustancialmente los mismos componentes proporcionados sustancialmente en la misma masa y/o volumen. En algunos aspectos, los sujetos pueden mostrar una respuesta a dosis repetidas. Como se usa en esta invención, el término "respuesta a dosis repetidas" se refiere a una respuesta en un sujeto a una dosis repetida que difiere de la de otra dosis administrada dentro de un régimen de administración de dosis repetidas. En algunos aspectos, tal respuesta puede ser la expresión de una proteína en respuesta a una dosis repetida que comprende v An . En tales aspectos, la expresión de proteínas puede elevarse en comparación con otra dosis administrada dentro de un régimen de administración de dosis repetidas o la expresión de proteínas puede reducirse en comparación con otra dosis administrada dentro de un régimen de administración de dosis repetidas. La alteración de la expresión de proteínas puede ser de aproximadamente 1 % a alrededor 20 %, desde aproximadamente 5 % hasta aproximadamente el 50 % desde aproximadamente el 10 % hasta aproximadamente 60 %, desde aproximadamente el 25 % hasta aproximadamente 75 %, desde aproximadamente el 40 % hasta aproximadamente el 100 % y/o por lo menos 100 %. Una reducción en la expresión de ARNm administrado como parte de un régimen de dosis repetidas, donde el nivel de proteína traducida del ARN administrado se reduce en más del 40 % en comparación con otra dosis dentro del régimen de dosis repetidas, se denomina en esta invención "resistencia a dosis repetidas ".
Propiedades de las composiciones farmacéuticas
Las composiciones farmacéuticas VAN descritas en esta invención se pueden caracterizar por una o más de las siguientes propiedades:
Biodisponibilidad
Las VAN, cuando se formulan en una composición con un agente de liberación como se describe en esta invención, pueden exhibir un aumento en la biodisponibilidad en comparación con una composición que carece de un agente de liberación como se describe en esta invención. Tal como se usa en esta invención, el término "biodisponibilidad" se refiere a la disponibilidad sistémica de una cantidad dada de VAN administrada a un mamífero. La biodisponibilidad se puede evaluar midiendo el área bajo la curva (AUC) o la concentración máxima en suero o plasma (Cmax) de la forma inalterada de un compuesto después de la administración del compuesto a un mamífero. El AUC es una determinación del área bajo la curva que representa la concentración sérica o plasmática de un compuesto a lo largo de la ordenada (eje Y) frente al tiempo a lo largo de la abscisa (eje X). Generalmente, el AUC para un compuesto particular se puede calcular usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica y como se describe en
G. S. Banker, Modern Pharmaceutics, Drugs and the Pharmaceutical Sciences, v. 72, Marcel Dekker, New York, Inc.,
1996.
El valor Cmax es la concentración máxima del compuesto alcanzada en el suero o plasma de un mamífero después de la administración del compuesto al mamífero. El valor Cmax de un compuesto particular se puede medir usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Las frases "aumentar la biodisponibilidad" o "mejorar la farmacocinética", como se usan en esta invención, significan que la disponibilidad sistémica de un primer polinucleótido, construcción primaria o ARNm, medido como AUC,Cmax, o Cmin en un mamífero es mayor, cuando se coadministra con un agente de administración como se describe en esta invención, que cuando dicha coadministración no tiene lugar. En algunas realizaciones, la biodisponibilidad de las VAN puede aumentar en al menos aproximadamente un 2 %, al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al me aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 55 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 % o aproximadamente el 100 %.
En algunas realizaciones, las formulaciones líquidas de VAN pueden tener una vida media in vivo variable, lo que requiere la modulación de las dosis para producir un efecto terapéutico. Para abordar esto, en algunas realizaciones de la presente invención, las formulaciones de VAN pueden diseñarse para mejorar la biodisponibilidad y/o efecto terapéutico durante administraciones repetidas. Tales formulaciones pueden permitir la liberación sostenida de VAN y/o reducir las tasas de degradación de la VAN por nucleasas. En algunas realizaciones, se proporcionan formulaciones en suspensión que comprenden VAN, depósitos de aceite inmiscibles en agua, tensioactivos y/o cotensioactivos y/o codisolventes. Las combinaciones de aceites y tensioactivos pueden permitir la formulación en suspensión con VAN. La administración de VAN en un depósito inmiscible en agua se puede utilizar para mejorar la biodisponibilidad mediante la liberación sostenida de polinucleótidos desde el depósito al entorno fisiológico circundante y/o impedir la degradación de polinucleótidos por nucleasas.
En algunas realizaciones, las nanopartículas catiónicas que comprenden combinaciones de cationes divalentes y monovalentes pueden formularse con VAN. Estas nanopartículas pueden formarse espontáneamente en solución durante un período determinado (por ejemplo, horas, días, etc.). Tales nanopartículas no se forman en presencia de cationes divalentes solos o en presencia de cationes monovalentes solos. El suministro de VAN en nanopartículas catiónicas o en uno o más depósitos que comprenden nanopartículas catiónicas puede mejorar la biodisponibilidad de la VAN al actuar como depósito de acción prolongada y/o reduciendo la tasa de degradación por nucleasas.
Ventana terapéutica
Las VAN, cuando se formulan en una composición con un agente de liberación como se describe en esta invención, pueden exhibir un aumento en la ventana terapéutica de la composición de VAN administrada en comparación con la ventana terapéutica de la composición de VAN administrada que carece de un agente de liberación como se describe en esta invención. Tal como se usa en esta invención, "ventana terapéutica" se refiere al intervalo de concentraciones plasmáticas, o al intervalo de niveles de sustancia terapéuticamente activa en el sitio de acción, con una alta probabilidad de provocar un efecto terapéutico. En algunos aspectos, la ventana terapéutica de las VAN cuando coadministradas con un agente de administración como se describe en esta invención puede aumentar en al menos aproximadamente un 2 %, al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al me aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 55 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 % o aproximadamente el 100 %.
Volumen de distribución
Las VAN cuando se formulan en una composición con un agente de administración como se describe en esta invención, pueden exhibir un volumen de distribución mejorado (Vdist), por ejemplo, reducido o diana, en relación con una composición que carece de un agente de suministro como se describe en esta invención. El volumen de distribución (Vdist) relaciona la cantidad del fármaco en el cuerpo con la concentración del fármaco en la sangre o el plasma. Tal como se usa en esta invención, el término "volumen de distribución" se refiere al volumen de líquido que se requeriría para contener la cantidad total de fármaco en el cuerpo a la misma concentración que en la sangre o el plasma: Vdist es igual a la cantidad de fármaco en el cuerpo/concentración de fármaco en sangre o plasma.: Por ejemplo, para una dosis de 10 mg y una concentración plasmática de 10 mg/L, el volumen de distribución sería de 1
litro. El volumen de distribución refleja la medida en que el fármaco está presente en el tejido extravascular. Un gran volumen de distribución refleja la tendencia de un compuesto a unirse a los componentes tisulares en comparación con la unión a proteínas plasmáticas. En un entorno clínico, Vdist se puede utilizar para determinar una dosis de carga para lograr una concentración en estado estable. En algunos aspectos, el volumen de distribución de las VAN cuando coadministradas con un agente de administración como se describe en esta invención puede disminuir en al menos aproximadamente un 2 %, al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 55 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente el 70 %.
Efecto biológico
En un aspecto, el efecto biológico de la VAN administrada a los animales se puede clasificar analizando la expresión de proteínas en los animales. La expresión de la proteína se puede determinar analizando una muestra biológica recogida de un mamífero al que se le ha administrado la VAN de la presente invención.
Detección de polinucleótidos por espectrometría de masas
La espectrometría de masas (MS) es una técnica analítica que puede proporcionar información estructural y de masa molecular/concentración de moléculas después de su conversión en iones. Las moléculas se ionizan primero para adquirir cargas positivas o negativas y a continuación viajan a través del analizador de masas para llegar a diferentes áreas del detector según su relación masa/carga (m/z).
La espectrometría de masas se realiza utilizando un espectrómetro de masas que incluye una fuente de iones para ionizar la muestra fraccionada y crear moléculas cargadas para su posterior análisis. Por ejemplo, la ionización de la muestra puede realizarse mediante ionización por electropulverización (ESI), ionización química a presión atmosférica (APCI), fotoionización, ionización electrónica, bombardeo por átomos rápidos (FAB)/ionización secundaria líquida (LSIMS), desorción/ionización láser asistida por matriz ( MALDI), ionización de campo, desorción de campo, ionización por termopulverización/plasma e ionización por haz de partículas. El experto en la materia comprenderá que la elección del procedimiento de ionización se puede determinar en función del analito que se va a medir, el tipo de muestra, el tipo de detector, la elección del modo positivo frente al negativo, etc.
Una vez que la muestra ha sido ionizada, los iones cargados positivamente o cargados negativamente así creados pueden analizarse para determinar una relación de masa a carga (es decir, m/z). Los analizadores adecuados para determinar las relaciones de masa a carga incluyen analizadores de cuatro polos, analizadores de trampas de iones y analizadores de tiempo de vuelo. Los iones pueden detectarse utilizando varios modos de detección. Por ejemplo, se pueden detectar iones seleccionados (es decir, utilizando un modo de monitorización selectiva de iones (SIM)) o, alternativamente, los iones pueden detectarse utilizando un modo de exploración, por ejemplo, monitorización de reacciones múltiples (MRM) o monitorización de reacciones seleccionadas (SRM).
Se ha demostrado que la monitorización de reacciones múltiples de cromatografía líquida (LC-MS/MRM) junto con la dilución marcada con isótopos estables de estándares de péptidos es un procedimiento efectivo para la verificación de proteínas (p. ej., Keshishian y col., Mol Cell Proteomics 20098: 2339--2349; Kuhn y col., Clin Chem 200955:1108--1117; Lopez y col., Clin Chem 201056:281--290).
A diferencia de la espectrometría de masas no dirigida que se usa con frecuencia en los estudios de descubrimiento de biomarcadores, los procedimientos de EM dirigidos son modos de EM basados en secuencias peptídicas que concentran toda la capacidad analítica del instrumento en decenas a cientos de péptidos seleccionados en una mezcla compleja. Al restringir la detección y la fragmentación a solo aquellos péptidos derivados de proteínas de interés, la sensibilidad y la reproducibilidad mejoran drásticamente en comparación con los procedimientos de MS en modo de descubrimiento. Este procedimiento de cuantificación de proteínas de monitoreo de reacciones múltiples (MRM) basado en espectrometría de masas puede impactar dramáticamente el descubrimiento y la cuantificación de biomarcadores a través del perfil de expresión de proteínas multiplexado, rápido y dirigido de muestras clínicas.
En un aspecto, una muestra biológica que puede contener al menos una proteína codificada por al menos un ARNm modificado de la presente divulgación puede analizarse mediante el procedimiento de MRM-Ms . La cuantificación de la muestra biológica puede incluir además, pero no se limita a, péptidos o proteínas marcados isotópicamente como patrones internos.
Según la presente divulgación, la muestra biológica, una vez obtenida del sujeto, puede someterse a digestión enzimática. Tal como se usa en esta invención, el término "digerir" significa romper en péptidos más cortos. Tal como se usa en esta invención, la frase "tratar una muestra para digerir proteínas" significa manipular una muestra de tal manera que se descompongan las proteínas en una muestra. Estas enzimas incluyen, pero no se limitan a, tripsina, endoproteinasa Glu-C y quimotripsina. En un aspecto, una muestra biológica que puede contener al menos una proteína codificada por al menos un ARNm modificado de la presente divulgación puede digerirse usando enzimas.
En un aspecto, una muestra biológica que puede contener proteína codificada por el ARNm modificado de la presente descripción puede analizarse en busca de proteína usando ionización por electropulverización. La espectrometría de masas de ionización por electropulverización (ESI) (ESIMS) utiliza energía eléctrica para ayudar en la transferencia de iones de la solución a la fase gaseosa antes de analizarlos mediante espectrometría de masas. Las muestras se pueden analizar usando procedimientos conocidos en la técnica. (p.ej., Ho y col., Clin Biochem Rev. 2003 24(1):3--12). Las especies iónicas contenidas en la solución se pueden transferir a la fase gaseosa dispersando una fina pulverización de gotitas de carga, evaporando el disolvente y expulsando los iones de las gotitas cargadas para generar una niebla de gotitas muy cargadas. La neblina de gotitas muy cargadas puede analizarse usando al menos 1, al menos 2, al menos 3 o al menos 4 analizadores de masas tales como, pero sin limitarse a, un analizador de masas de cuatro polos. Además, el procedimiento de espectrometría de masas puede incluir una etapa de purificación. Como ejemplo no limitativo, el primer cuadripolo puede configurarse para seleccionar una sola relación m/z para que pueda filtrar otros iones moleculares que tengan una relación m/z diferente, lo que puede eliminar los complicados y laboriosos procedimientos de purificación de muestras previos al análisis MS.
En un aspecto, una muestra biológica que puede contener proteína codificada por el ARNm modificado de la presente descripción puede analizarse en busca de proteína en un sistema ESIMS en tándem (por ejemplo, MS/MS). Como ejemplos no limitantes, las gotitas pueden analizarse usando un escaneo de producto (o escaneo secundario), un escaneo de precursores (escaneo principal), una pérdida neutra o una monitorización de reacciones múltiples.
En un aspecto, una muestra biológica que puede contener proteína codificada por el ARNm modificado de la presente descripción puede analizarse usando espectrometría de masas (MALDIMS) de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI). MALDI proporciona la vaporización e ionización no destructivas de moléculas grandes y pequeñas, como las proteínas. En el análisis MALDI, el analito se co-cristaliza primero con un gran exceso molar de un compuesto matriz, que también puede incluir, pero no se limita a, un ácido orgánico débil que absorbe ultravioleta. Ejemplos no limitantes de matrices utilizadas en MALDI son ácido a-dano-4-hidroxidnámico, ácido 3,5-dimetox¡-4-h¡drox¡dnámico y ácido 2,5-dihidroxibenzoico. La radiación láser de la mezcla analito-matriz puede resultar en la vaporización de la matriz y el analito. La desorción inducida por láser proporciona altos rendimientos de iones del analito intacto y permite la medición de compuestos con alta precisión. Las muestras se pueden analizar usando procedimientos conocidos en la técnica.(p.ej., Lewis, Wei y Siuzdak, Encyclopedia of Analytical Chemistry 2000:5880--5894). Como ejemplos no limitantes, los analizadores de masas utilizados en el análisis MALDI pueden incluir un tiempo de vuelo lineal (TOF), un reflectrón TOF o un analizador de masas por transformada de Fourier.
En un aspecto, la mezcla analito-matriz se puede formar utilizando el procedimiento de gotas secas. Una muestra biológica se mezcla con una matriz para crear una solución de matriz saturada donde la proporción de matriz a muestra es de aproximadamente 5000:1. A continuación, se deja secar una alícuota (aproximadamente 0,5--2,0 uL) de la solución de matriz saturada para formar la mezcla de analito y matriz..
En un aspecto, la mezcla de analito-matriz se puede formar usando el procedimiento de capa fina. Primero se forma una película homogénea de matriz y a continuación se aplica la muestra y puede ser absorbida por la matriz para formar la mezcla analito-matriz.
En un aspecto, la mezcla de analito-matriz se puede formar usando el procedimiento de capa gruesa. Se forma una película de matriz homogénea con un aditivo de matriz de nitrocelulosa. Una vez que se obtiene la capa uniforme de matriz de nitrocelulosa, la muestra se aplica y se absorbe en la matriz para formar la mezcla analito-matriz.
En un aspecto, la mezcla de analito-matriz se puede formar usando el procedimiento de sándwich. Se prepara una capa fina de cristales de matriz como en el procedimiento de capa fina seguido de la adición de gotitas de ácido trifluoroacético acuoso, la muestra y la matriz. Luego, la muestra se absorbe en la matriz para formar la mezcla analitomatriz..
VI.Kits y dispositivos
Kits
La divulgación proporciona una variedad de kits para llevar a cabo de manera conveniente y/o efectiva los procedimientos de la presente divulgación. Normalmente, los kits comprenderán números y/o cantidades suficientes de componentes para permitir que un usuario realice múltiples tratamientos de un sujeto o sujetos y/o realice múltiples experimentos.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona kits que comprenden las moléculas de VAN (incluyendo cualquier proteína o polinucleótido) de la divulgación. En un caso, el kit comprende uno o más antígenos funcionales o fragmentos de función de los mismos.
Los kits pueden ser para la producción de proteínas, que comprenden un primer polinucleótido que comprende una región traducible de un antígeno. El kit puede comprender además el envase e instrucciones y/o un agente de administración para formar una composición de formulación. El agente de administración puede comprender una solución salina, una solución tamponada, un lípido o cualquier agente de administración descrito en esta invención.
En una realización, la solución tampón puede incluir cloruro de sodio, cloruro de calcio, fosfato y/o EDTA. En otra realización, la solución tampón puede incluir, de modo no taxativo, solución salina, solución salina con calcio 2 mM, sacarosa al 5 %, sacarosa al 5 % con calcio 2 mM, manitol al 5 %, manitol al 5 % con calcio 2 mM, lactato de Ringer, cloruro de sodio, cloruro de sodio con manosa y calcio 2 mM (ver, por ejemplo, Pub. de EE. UU. No. 20120258046;). En un aspecto adicional, las soluciones de amortiguación pueden precipitarse o pueden liofilizarse. La cantidad de cada componente puede variarse para permitir formulaciones tampón congruentes y reproducibles, simples o salinas, con mayor concentración.
Los componentes también pueden variarse para aumentar la estabilidad de los conjugados y/o partículas en la solución tampón en un período de tiempo y/o en una variedad de condiciones.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona kits para la producción de proteínas, que comprenden: un polinucleótido que comprende una región traducible, proporcionado en una cantidad efectiva para producir una cantidad deseada de una proteína codificada por la región traducible cuando se introduce en una célula diana; un segundo polinucleótido que comprende un ácido nucleico inhibidor, proporcionado en una cantidad efectiva para inhibir sustancialmente la respuesta inmune innata de la célula; y embalaje e instrucciones.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona kits para la producción de proteínas, que comprenden un polinucleótido que comprende una región traducible, donde el polinucleótido exhibe una degradación reducida por una nucleasa celular y empaquetamiento e instrucciones.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona kits para la producción de proteínas, que comprenden un polinucleótido que comprende una región traducible, donde el polinucleótido presenta una degradación reducida por una nucleasa celular, y una célula de mamífero adecuada para la traducción de la región traducible del primer ácido nucleico.
Dispositivos.
La presente divulgación proporciona dispositivos que pueden incorporar RVAN que comprenden polinucleótidos que codifican polipéptidos de interés, por ejemplo, codifican polipéptidos antigénicos. Estos dispositivos contienen dentro una formulación estable disponible para administrarse inmediatamente a un sujeto que la necesite, tal como un paciente humano.
Pueden emplearse dispositivos de administración para administrar las VAN de la presente divulgación según los regímenes de dosificación única, múltiple o dividida enseñados en esta invención. Estos dispositivos se enseñan, por ejemplo, en la Solicitud internacional PCT/US2013/30062 depositada el 9 de marzo de 2013.
Se contempla el uso de procedimientos y dispositivos conocidos en la técnica para la administración múltiple a células, órganos y tejidos junto con los procedimientos y composiciones descritos en esta invención como aspectos de la presente divulgación. Estos incluyen, por ejemplo, aquellos procedimientos y dispositivos que tienen múltiples agujas, dispositivos híbridos que emplean, por ejemplo, lúmenes o catéteres, así como dispositivos que utilizan calor, corriente eléctrica o mecanismos impulsados por radiación.
Según la presente divulgación, estos dispositivos de administración múltiple pueden utilizarse para administrar las dosis únicas, múltiples o divididas contempladas en esta invención. Estos dispositivos se enseñan, por ejemplo, en la Solicitud internacional PCT/US2013/30062 depositada el 9 de marzo de 2013.
En un aspecto, la VAN se administra por vía subcutánea o intramuscular a través de al menos 3 agujas en tres sitios diferentes, opcionalmente adyacentes, simultáneamente, o dentro de un período de 60 minutos (p. ej., administración a 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sitios simultáneamente o en un período de 60 minutos).
Procedimientos y dispositivos que utilizan catéteres y/o lúmenes
Pueden emplearse procedimientos y dispositivos que usan catéteres y lúmenes para administrar las VAN de la presente divulgación en un programa de dosificación único, múltiple o dividido. Estos procedimientos y dispositivos se describen en la Solicitud internacional PCT/US2013/30062 depositada el 9 de marzo de 2013.
Procedimientos y dispositivos que utilizan corriente eléctrica.
Pueden emplearse procedimientos y dispositivos que utilizan corriente eléctrica para administrar las VAN de la presente divulgación según los regímenes de dosificación única, múltiple o dividida enseñados en esta invención. Estos procedimientos y dispositivos se describen en la Solicitud internacional PCT/US2013/30062 depositada el 9 de marzo de 2013.
VII. DEFINICIONES
En varios lugares de la presente memoria descriptiva, los sustituyentes de los compuestos de la presente divulgación se describen en grupos o en intervalos. Se pretende específicamente que la presente divulgación incluya todas y cada una de las subcombinaciones individuales de los miembros de dichos grupos e intervalos. Por ejemplo, el término "alquilo C1-6 " está destinado específicamente a describir individualmente metilo, etilo, alquilo C3 , alquilo C4 , alquilo C5 , y alquilo C6. En esta invención, una frase de la forma "X opcionalmente sustituido" (p.ej., alquilo opcionalmente sustituido) pretende ser equivalente a "X, donde X está opcionalmente sustituido" (por ejemplo, "alquilo, donde dicho alquilo está opcionalmente sustituido"). No se pretende que signifique que la característica "X" (p.ej. alquilo) per se sea opcional.
Aproximadamente: Tal como se emplea en esta invención, el término “aproximadamente” significa ± 10 % del valor mencionado.
Administrado en combinación: Tal como se usa en esta invención, el término "administrado en combinación" o "administración combinada" significa que dos o más agentes se administran a un sujeto al mismo tiempo o dentro de un intervalo tal que puede haber una superposición de un efecto de cada agente en el paciente. En algunos aspectos, se administran con aproximadamente 60, 30, 15, 10, 5 o 1 minuto entre sí. En algunos aspectos, las administraciones de los agentes se espacian lo suficientemente cerca unas de otras para que se logre un efecto combinatorio (por ejemplo, sinérgico).
Adyuvante: Como se usa en esta invención, el término "adyuvante" significa una sustancia que mejora la respuesta inmune de un sujeto a un antígeno. Las VAN de la presente invención pueden comprender opcionalmente uno o más adyuvantes.
Animal: Tal como se usa en esta invención, el término "animal" se refiere a cualquier miembro del reino animal. En algunas realizaciones, "animal" se refiere a seres humanos en cualquier etapa de desarrollo. En algunas realizaciones, "animal" se refiere a animales no-humanos en cualquier etapa de desarrollo. En ciertas realizaciones, el animal no humano es un mamífero (porejemplo, un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, una oveja, un ganado vacuno, un primate o un cerdo). En algunas realizaciones, los animales incluyen, entre otros, mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces y gusanos. En algunas realizaciones, el animal es un animal transgénico, un animal modificado genéticamente o un clon.
Antígeno: Como se define en esta invención, el término "antígeno" o "generador de anticuerpos" ("Ag") se refiere a una composición, por ejemplo, una sustancia o agente que causa una respuesta inmune en un organismo, por ejemplo, causa la respuesta inmune del organismo para producir anticuerpos contra la sustancia o agente en particular, lo que provoca una respuesta inmune adaptativa en un organismo. Los antígenos pueden ser cualquier sustancia inmunogénica que incluye, en particular, proteínas, polipéptidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, lípidos y similares. Antígenos ejemplares se derivan de agentes infecciosos. Dichos agentes pueden incluir partes o subconjuntos de agentes infecciosos, por ejemplo, revestimientos, componentes del revestimiento, por ejemplo, proteína de revestimiento o polipéptidos, componentes de la superficie, por ejemplo, proteínas o polipéptidos de la superficie, componentes de la cápsula, componentes de la pared celular, flagelos, fimbras, y/o toxinas o toxoides) de agentes infecciosos, por ejemplo, bacterias, virus y otros microorganismos. Ciertos antígenos, por ejemplo, lípidos y/o los ácidos nucleicos son antigénicos, preferiblemente, cuando se combinan con proteínas y/o polisacáridos.
Antígenos de interés o antígenos deseados: Como se usa en esta invención, los términos "antígenos de interés" o "antígenos deseados" incluyen aquellas proteínas y otras biomoléculas proporcionadas en esta invención que son componentes de o codificadas por polinucleótidos que son componentes de una o más VAN.
Aproximadamente: Tal como se usa en esta invención, la expresión “aproximadamente” o “alrededor de”, según se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia indicado. En determinadas realizaciones, la expresión “aproximadamente” o “alrededor” se refiere a un intervalo de valores que se encuentra dentro del 25, el 20, el 19, el 18, el 17, el 16, el 15, el 14, el 13, el 12, el 11, el 10, el 9, el 8, el 7, el 6, el 5, el 4, el 3, el 2, el 1 % o menos en cualquier dirección (mayor o menor) del valor de referencia indicado, a menos que se indique lo contrario, o resulte evidente lo contrario a partir del contexto (salvo que dicho número supere el 100 % de un valor posible).
Asociado con: Tal como se usa en esta invención, los términos "asociado con", "conjugado", "enlazado", "unido" y "anclado", cuando se usan con respecto a dos o más restos, significa que los restos están físicamente asociados o conectados entre sí, ya sea directamente o mediante uno o más restos adicionales que sirven como agente de enlace, para formar una estructura que sea suficientemente estable de modo que los restos permanezcan físicamente asociados en las condiciones en las que se usa la estructura, por ejemplo, condiciones fisiológicas. Una "asociación" no tiene por qué ser estrictamente mediante un enlace químico covalente directo. También puede sugerir enlaces iónicos o de hidrógeno o una conectividad basada en hibridación suficientemente estable de modo que las entidades "asociadas" permanezcan físicamente asociadas.
Bifuncional: Tal como se usa en esta invención, el término "bifuncional" se refiere a cualquier sustancia, molécula o resto que sea capaz de o mantenga al menos dos funciones. Las funciones pueden afectar el mismo resultado o un resultado diferente. La estructura que produce la función puede ser la misma o diferente. Por ejemplo, los ARN modificados bifuncionales de la presente divulgación pueden codificar un péptido citotóxico (una primera función) mientras que los nucleósidos que comprenden el ARN codificante son, en y por sí mismos, citotóxicos (segunda función). En este ejemplo, la entrega del ARN modificado bifuncional a una célula cancerosa produciría no solo un péptido o molécula de proteína que podría mejorar o tratar el cáncer, sino que también entregaría una carga citotóxica de nucleósidos a la célula en caso de degradación, en lugar de traducción del ARN modificado.
Biocompatible: Tal como se usa en esta invención, el término "biocompatible" significa compatible con células, tejidos, órganos o sistemas vivos que presentan poco o ningún riesgo de lesión, toxicidad o rechazo por parte del sistema inmunológico.
Biodegradable: Tal como se usa en esta invención, el término "biodegradable" significa que puede descomponerse en productos inocuos por la acción de seres vivos.
Biológicamente activo: Tal como se usa en esta invención, la frase "biológicamente activo" se refiere a una característica de cualquier sustancia que tenga actividad en un sistema y/u organismo biológico. Por ejemplo, una sustancia que, cuando se administra a un organismo, tiene un efecto biológico sobre ese organismo, se considera biológicamente activa. En realizaciones particulares, un polinucleótido de la presente invención puede considerarse biológicamente activo si incluso una parte de los polinucleótidos es biológicamente activa o imita una actividad considerada biológicamente relevante.
Células madre cancerosas: Tal como se usa en esta invención, las "células madre cancerosas" son células que pueden experimentar autorrenovación y/o proliferación y diferenciación anormales para formar un tumor.
Términos químicos: A continuación se proporciona la definición de varios términos químicos desde "acilo" hasta "tiol".
El término "acilo", tal como se usa en esta invención, representa un grupo hidrógeno o alquilo (por ejemplo, un grupo haloalquilo), tal como se definen en esta invención, que está acoplado al grupo molecular original a través de un grupo carbonilo, tal como se define en esta invención, y un ejemplo de este es formilo (es decir, un grupo carboxialdehído), acetilo, propionilo, butanoilo y similares. Los ejemplos de grupos acilo no sustituidos incluyen de 1 a 7, de 1 a 11, o de 1 a 21 carbonos. En algunas realizaciones, el grupo alquilo está sustituido adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes, tal como se describen en esta invención.
Ejemplos no limitantes de grupos acilo opcionalmente sustituidos incluyen, alcoxicarbonilo, alcoxicarbonilacilo, arilalcoxicarbonilo, ariloílo, carbamoílo, carboxialdehído, (heterociclil) imino y (heterociclil) oilo:
El grupo "alcoxicarbonilo" representa un alcoxicarbonilo, que como se usa en esta invención, como se define en esta invención, unido al grupo molecular parental a través de un átomo de carbonilo (por ejemplo, -C (O) -OR, donde R es H o un C1-6, C1-10, o un grupo alquilo C1-20 opcionalmente sustituido). alcoxicarbonilos no sustituidos ejemplares incluyen de 1 a 21 carbonos (por ejemplo, de 1 a 11 o de 1 a 7 carbonos). En algunas realizaciones, el grupo alcoxi está sustituido adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes, tal como se describen en esta invención.
El grupo "alcoxicarbonilacilo", que como se usa en esta invención, representa un grupo acilo, como se define en esta invención, que está sustituido con un grupo alcoxicarbonilo, como se define en esta invención (por ejemplo, -C (O) -alquil-C (O) -OR, donde R es un grupo alquilo C1-6, C1-10, o C1-20 opcionalmente sustituido). Ejemplos de alcoxicarbonilacilo no sustituido incluyen de 3 a 41 carbonos (por ejemplo, de 3 a 10, de 3 a 13, de 3 a 17, de 3 a 21 o de 3 a 31 carbonos, tales como C1-6 alcoxicarbonil-C1-6 acilo, C1-10 alcoxicarbonil-C1-10 acilo, o C1-20 alcoxicarbonil-C1-20 acilo). En algunas realizaciones, cada grupo alcoxi y alquilo está además sustituido independientemente con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes, como se describe en el presente documento (p. ej., un grupo hidroxi) para cada grupo.
El grupo "arilalcoxicarbonilo", que como se usa en esta invención, representa un grupo arilalcoxi, como se define en esta invención, unido al grupo molecular principal a través de un carbonilo (p. ej., -C(O)-O-alquil-arilo). Grupos arilalcoxi no sustituidos ejemplares incluyen de 8 a 31 carbonos (por ejemplo, de 8 a 17 o de 8 a 21 carbonos, tales como C6-10 aril-C1-6 alcoxi-carbonilo, C6-10 aril-C1-10 alcoxi-carbonilo, o C6-10 aril-C1-20 alcoxi-carbonilo). En algunas realizaciones, el grupo arilalcoxicarbonilo puede estar sustituido con 1,2, 3 o 4 sustituyentes como se define en esta invención.
El grupo "ariloílo", que como se usa en esta invención, representa un grupo arilo, como se define en esta invención, que está unido al grupo molecular de origen a través de un grupo carbonilo. Grupos ariloílo no sustituidos ejemplares son de 7 a 11 carbonos. En algunas realizaciones, el grupo arilo está sustituido adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes, tal como se describen en esta invención.
El grupo "carbamoílo", que como se usa en esta invención, representa —C(O)-N(RN1)2, donde el significado de cada RN1 se encuentra en la definición de "amino" proporcionada en esta invención.
El grupo "carboxialdehído", que como se usa en esta invención, representa un grupo acilo que tiene la estructura -CHO.
El grupo "(heterociclil) imino", que como se usa en esta invención, representa un grupo heterociclilo, como se define
en esta invención, unido al grupo molecular de origen a través de un grupo imino. En algunas realizaciones, el grupo heterociclilo puede estar sustituido con 1,2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se define en esta invención.
El grupo "(heterociclil)oílo", que como se usa en esta invención, representa un grupo heterociclilo, como se define en esta invención, unido al grupo molecular original a través de un grupo carbonilo. En algunas realizaciones, el grupo heterociclilo puede estar sustituido adicionalmente con 1,2, 3 o 4 grupos sustituyentes, tal como se describen en esta invención.
El término "alquilo", como se usa en esta invención, incluye grupos saturados tanto de cadena lineal como de cadena ramificada de 1 a 20 carbonos (por ejemplo, de 1 a 10 o de 1 a 6), a menos que se especifique lo contrario. Los grupos alquilo son ejemplos de metilo, etilo, n- e isopropilo, n-, sec-, iso- y terc-butilo, neopentilo y similares, y pueden estar opcionalmente sustituidos con uno, dos, tres o, en el caso de grupos alquilo de dos carbonos o más, cuatro sustituyentes seleccionados independientemente de entre el grupo que consiste en: (1) C1-6 alcoxi; (2) C1-6 alquilsulfinil;
(3) amino, como se define en esta invención (p.ej., amino no sustituido (i.e., -NH2) o un amino sustituido (i.e., -N(RN1)2, donde RN1 es como definido para amino); (4) C6-10 aril-C1-6 alcoxi; (5) azido; (6) halo; (7) (C2-9 heterociclil)oxi; (8) hidroxi, opcionalmente sustituido con un O-grupo protector; (9) nitro; (10) oxo (p.ej., carboxialdehido o acil); (11) C1-7 spirociclil;
(12) tioalcoxi; (13) tiol; (14) - CO2RA', opcionalmente sustituido con un O-grupo protector y donde RA' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a) C1-20 alquilo (p.ej., C1-6 alquilo), (b) C2-20 alquenilo (p.ej., C2-6 alquenilo), (c) C6-10 aril,
(d) hidrógeno, (e) C1-6 alc-C6-10 aril, (f) amino-C1-20 alquilo, (g) polietileno glicol de -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', donde s1 es un entero de 1 a 10 (p.ej., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un entero
de 0 a 10 (p.ej., de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y R' es H o C1-20 alquilo, y (h) amino-polietileno
glicol de - NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, donde s1 es un entero de 1 a 10 (p.ej., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada
uno de s2 y s3, independientemente, es un entero de 0 a 10 (p.ej., de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y cada RN1 es, independientemente, hidrógeno o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido; (15) -C(O)NRB'RC', donde cada
uno de RB' y RC' es, independientemente, seleccionado de entre el grupo que consiste en (a) hidrógeno, (b) C1-6 alquilo,
(c) C6-10 aril, y (d) C1-6 alc-C6-10 aril; (16) -SO2RD', donde RD' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a) C1-6 alquilo, (b) C6-10 aril, (c) C1-6 alc-C6-10 aril, y (d) hidroxi; (17) -SO2NRE'RF', donde cada uno de RE' y RF' es, independientemente, seleccionado de entre el grupo que consiste en (a) hidrógeno, (b) C1-6 alquilo, (c) C6-10 aril y (d)
C1-6 alc-C6-10 aril; (18) -C(O)RG', donde RG' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a) C1-20 alquilo (p.ej., C1-6 alquilo), (b) C2-20 alquenilo (p.ej., C2-6 alquenilo), (c) C6-10 aril, (d) hidrógeno, (e) C1-6 alc-C6-10 aril, (f) amino-C1-20 alquilo, (g) polietileno glicol de -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', donde s1 es un entero de 1 a 10 (p.ej., de 1 a 6 o de
1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un entero de 0 a 10 (p.ej., de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y R' es H o C1-20 alquilo, y (h) amino-polietileno glicol de -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, donde
s1 es un entero de 1 a 10 (p.ej., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un entero de 0 a
10 (p.ej., de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y cada RN1 es, independientemente, hidrógeno o alquilo
C1-6 opcionalmente sustituido; (19) - NRH'C(O)RI', donde RH' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a1) hidrógeno y (b1) C1-6 alquilo, y RI' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a2) C1-20 alquilo (p.ej., C1-6 alquilo),
(b2) C2-20 alquenilo (p.ej., C2-6 alquenilo), (c2) C6-10 aril, (d2) hidrógeno, (e2) C1-6 alc-C6-10 aril, (f2) amino-C1-20 alquilo,
(g2) polietileno glicol de -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', donde s1 es un entero de 1 a 10 (p.ej., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un entero de 0 a 10 (p.ej., de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y R' es H o C1-20 alquilo, y (h2) amino-polietileno glicol de -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, donde s1 es un entero de 1 a 10 (p.ej., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un entero de 0 a 10 (p.ej., de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y cada RN1 es, independientemente, hidrógeno o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido; (20) -NRJ'C(O)ORK', donde RJ' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a1) hidrógeno y (b1) C1-6 alquilo, y RK' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a2) C1-20 alquilo (p.ej., C1-6 alquilo),
(b2) C2-20 alquenilo (p.ej., C2-6 alquenilo), (c2) C6-10 aril, (d2) hidrógeno, (e2) C1-6 alc-C6-10 aril, (f2) amino-C1-20 alquilo,
(g2) polietileno glicol de -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', donde s1 es un entero de 1 a 10 (p.ej., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un entero de 0 a 10 (p.ej., de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y R' es H o C1-20 alquilo, y (h2) amino-polietileno glicol de - NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, donde s1 es un entero de 1 a 10 (p.ej., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un entero de 0 a 10 (p.ej., de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y cada RN1 es, independientemente, hidrógeno o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido; y (21) amidina. En algunas realizaciones, cada uno de estos grupos se puede sustituir adicionalmente como se describe en esta invención. Por ejemplo, el grupo alquileno de un C1-alcarilo puede sustituirse adicionalmente con un grupo oxo para proporcionar el sustituyente ariloílo respectivo.
El término "alquileno", como se usa en esta invención, representa un grupo hidrocarburo divalente saturado derivado
de un hidrocarburo saturado de cadena lineal o ramificada mediante la eliminación de dos átomos de hidrógeno, y está ejemplificado por metileno, etileno, isopropileno y similares. El término "Cx-y alquileno" y el prefijo "Cx-y alq-" representan grupos alquileno que tienen entre x & y carbonos. Valores ejemplares para x son 1, 2, 3, 4, 5 y 6, y los valores ejemplares para y son 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, o 20 (por ejemplo, C1-6, C1-10, C2-20, C2-6, C2-10, o
C2-20 alquileno). En algunas realizaciones, el grupo alquileno puede estar sustituido adicionalmente con 1, 2, 3 o 4
grupos sustituyentes, tal como se define en esta invención para grupos alquilo. De manera similar, el sufijo "-eno" adjunto a cualquier grupo indica que el grupo es un grupo divalente.
Ejemplos no limitantes de grupos alquilo y alquileno opcionalmente sustituidos incluyen acilaminoalquilo, aciloxialquilo, alcoxialquilo, alcoxicarbonilalquilo, alquilsulfinilo, alquilsulfinilalquilo, aminoalquilo, carbamoilalquilo, carboxialquilo, carboxiaminoalquilo, haloalquilo, hidroxialquilo, perfluoroalquilo y sulfoalquilo
El grupo "acilaminoalquilo", que como se usa aquí, representa un grupo acilo, como se define aquí, unido a un grupo amino que a su vez está unido al grupo molecular principal a través de un grupo alquileno, como se define aquí (es decir, -alquil-N(RN1)-C(O)-R, donde R es H o un grupo alquilo C1-6, C1-10, o C1-20 opcionalmente sustituido (p.ej., haloalquilo) y RN1 es como definido en esta invención). Grupos acilaminoalquilo no sustituidos ejemplares incluyen de 1 a 41 carbonos (por ejemplo, de 1 a 7, de 1 a 13, de 1 a 21, de 2 a 7, de 2 a 13, de 2 a 21 o de 2 a 41 carbonos) . En algunas realizaciones, el grupo alquileno está además sustituido con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes como se describe en esta invención y/o el grupo amino es —NH2 o —NHRN1, donde RN1 es, independientemente, OH, NO2, NH2, NRN22, SO2ORN2, SO2RN2, SORN2, alquilo, arilo, acilo ( por ejemplo, acetilo, trifluoroacetilo u otros descritos en esta invención) o alcoxicarbonilalquilo, y cada RN2 puede ser H, alquilo o arilo.
El grupo "aciloxialquilo", que como se usa en esta invención, representa un grupo acilo, como se define en esta invención, unido a un átomo de oxígeno que a su vez está unido al grupo molecular de origen a través de un grupo alquileno (es decir, -alquil-OC (O) - R, donde R es H o un grupo alquilo C1-6, C1-10, o C1-20 opcionalmente sustituido). Grupos aciloxialquilo no sustituidos ejemplares incluyen de 1 a 21 carbonos (por ejemplo, de 1 a 7 o de 1 a 11 carbonos). En algunas realizaciones, el grupo alquileno está, independientemente, sustituido adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes como se describe en esta invención.
El grupo "alcoxialquilo", que como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo que está sustituido con un grupo alcoxi. Grupos alcoxialquilo no sustituidos ejemplares incluyen entre 2 a 40 carbonos (por ejemplo, de 2 a 12 o de 2 a 20 carbonos, tal como C1-6 alkoxi-C1-6 alquilo, C1-10 alkoxi-C1-10 alquilo, o C1-20 alkoxi-C1-20 alquilo). En algunas realizaciones, el alquilo y el alcoxi pueden estar sustituidos cada uno con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se define en esta invención para el grupo respectivo.
El grupo "alcoxicarbonilalquilo", que como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo, como se define en esta invención, que está sustituido con un grupo alcoxicarbonilo, como se define en esta invención (por ejemplo, -alquilo-C(O)-OR, donde R es un grupo nalquilo C1-20, C1-10, o C1-6 opcionalmente sustituidos). Alcoxicarbonilalquilos no sustituidos ejemplares incluyen de 3 a 41 carbonos (p. ej., de 3 a 10, de 3 a 13, de 3 a 17, de 3 a 21 o de 3 a 31 carbonos, como C1-6 alcoxicarbonilo-C1-6 alquilo, C1-10 alcoxicarbonilo-C1-10 alquilo, o C1-20 alcoxicarbonilo-C1-20 alquilo). En algunas realizaciones, cada grupo alquilo y alcoxi está además sustituido independientemente con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes como se describe en esta invención (p. ej., un grupo hidroxi).
El grupo "alquilsulfinilalquilo", que como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo, como se define en esta invención, sustituido con un grupo alquilsulfinilo. Grupos alquilsulfinilalquilo no sustituidos ejemplares son de 2 a 12, de 2 a 20 o de 2 a 40 carbonos. En algunas realizaciones, cada grupo alquilo puede estar además sustituido con 1,2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se define en esta invención.
El grupo "aminoalquilo", que como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo, como se define en esta invención, sustituido con un grupo amino, como se define en esta invención. El alquilo y el amino pueden estar sustituidos cada uno adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención para el grupo respectivo (por ejemplo, CO2RA ', donde RA' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a) alquilo C1-6, (b) arilo C6-10, (c) hidrógeno, y (d) arilo C1-6 alc-C6-10, por ejemplo, carboxi, y/o un grupo protector N.
El grupo "carbamoilalquilo", que como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo, como se define en esta invención, sustituido con un grupo carbamoílo, como se define en esta invención. El grupo alquilo puede estar además sustituido con 1, 2, 3 ó 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención.
El grupo "carboxialquilo", que como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo, como se define en esta invención, sustituido con un grupo carboxi, como se define en esta invención. El grupo alquilo puede estar sustituido adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención, y el grupo carboxi puede estar opcionalmente sustituido con uno o más grupos protectores O-
El grupo "carboxiaminoalquilo", que como se usa en esta invención, representa un grupo aminoalquilo, como se define en esta invención, sustituido con un carboxi, como se define en esta invención. El carboxi, alquilo, y amino cada uno se puede sustituir adicionalmente por 1, 2, 3, o 4 grupos sustituyentes conforme descrito en esta invención para el grupo respectivo (p.ej., CO2RA', donde RA' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a) C1-6 alquilo, (b) C6-10 aril, (c) hidrógeno, y (d) C1-6 alc-C6-10 aril, p.ej., carboxi, y/o un N-grupo protector, y/o un O-grupo protector).
El término "haloalquilo", tal como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo, tal como se define en esta invención, sustituido con un grupo halógeno (es decir, F, Cl, Br o I). Un haloalquilo puede estar sustituido con uno, dos o tres, o en el caso de grupos alquilo de dos carbonos o más, cuatro halógenos. Los grupos haloalquilo incluyen perfluoroalquilos (por ejemplo, -CF3), -CHF2, -CH2F, -CCb, -CH2CH2Br, -CH2CH(CH2CH2Br)CH3, y -CHICH3. En algunas realizaciones, el grupo haloalquilo puede estar sustituido adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes, tal como se describen en esta invención para grupos alquilo.
El grupo "hidroxialquilo", que como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo, como se define en esta invención, sustituido con uno a tres grupos hidroxi, con la condición de que no más de un grupo hidroxi puede estar unido a un solo átomo de carbono del grupo alquilo, y se ejemplifica por hidroximetilo, dihidroxipropilo y similares. En algunas realizaciones, el grupo hidroxialquilo puede estar sustituido adicionalmente con 1,2, 3 o 4 grupos sustituyentes (por ejemplo, grupos O-protectores), tal como se describen en esta invención para un alquilo.
El grupo "perfluoroalquilo", que como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo, como se define en esta invención, donde cada radical hidrógeno unido al grupo alquilo ha sido reemplazado por un radical fluoruro. Los grupos perfluoroalquilo se ejemplifican mediante trifluorometilo, pentafluoroetilo y similares.
El grupo "sulfoalquilo", que como se usa aquí, representa un grupo alquilo, como se define en esta invención, sustituido con un grupo sulfo de —SO3H. En algunas realizaciones, el grupo alquilo puede sustituirse adicionalmente con 1,2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención, y el grupo sulfo puede sustituirse adicionalmente con uno o más grupos protectores de O (p. ej., como se describe en esta invención).
El término "alquenilo", como se usa en esta invención, representa grupos monovalentes de cadena lineal o ramificada de, a menos que se especifique lo contrario, de 2 a 20 carbonos (por ejemplo, de 2 a 6 o de 2 a 10 carbonos) que contienen uno o más carbonos dobles enlaces de carbono y se ejemplifica por etenilo, 1-propenilo, 2-propenilo, 2-metil-1-propenilo, 1 -butenilo, 2-butenilo y similares. Los alquenilos incluyen isómeros tanto cis como trans. Los grupos alquenilo pueden estar opcionalmente sustituidos con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes que se seleccionan, independientemente, de entre amino, arilo, cicloalquilo o heterociclilo (por ejemplo, heteroarilo), como se define en esta invención, o cualquiera de los grupos sustituyentes alquilo ejemplares descritos en esta invención.
Ejemplos no limitantes de grupos alquenilo opcionalmente sustituidos incluyen alcoxicarbonilalquenilo, aminoalquenilo e hidroxialquenilo:
El grupo "alcoxicarbonilalquenilo", que como se usa en esta invención, representa un grupo alquenilo, como se define en esta invención, que está sustituido con un grupo alcoxicarbonilo, como se define en esta invención (p.ej., -alquenilo-C(O)-OR, donde R es un grupo alquilo C1-20, C1-10, o C1-6 opcionalmente sustituido ). Alcoxicarbonilalquenilos no sustituidos ejemplares incluyen de 4 a 41 carbonos (p. ej., de 4 a 10, de 4 a 13, de 4 a 17, de 4 a 21, o de 4 a 31 carbonos, tales como C1-6 alcoxicarbonil-C2-6 alquenilo, C1-10 alcoxicarbonil-C2-10 alquenilo, o C1-20 alcoxicarbonil-C2-20 alquenilo). En algunas realizaciones, cada grupo alquilo, alquenilo y alcoxi está además sustituido independientemente con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes como se describe en esta invención (p. ej., un grupo hidroxi).
El grupo "aminoalquenilo", que como se usa en esta invención, representa un grupo alquenilo, como se define en esta invención, sustituido con un grupo amino, como se define en esta invención. El alquenilo y amino cada se puede sustituir adicionalmente por 1, 2, 3, o 4 grupos sustituyentes conforme descrito en esta invención para el grupo respectivo (p.ej., CO2RA', donde RA' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a) C1-6 alquilo, (b) C6-10 aril, (c) hidrógeno, y (d) C1-6 alc-C6-10 aril, p.ej., carboxi, y/o un W-grupo protector).
El grupo "hidroxialquenilo", que como se usa en esta invención, representa un grupo alquenilo, como se define en esta invención, sustituido con uno a tres grupos hidroxi, con la condición de que no más de un grupo hidroxi pueda estar unido a un solo átomo de carbono del grupo alquilo, y está ejemplificado por dihidroxipropenilo, hidroxiisopentenilo y similares. En algunas realizaciones, el grupo hidroxialquenilo se puede sustituir con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes (por ejemplo, O-grupos protectores) como se define en esta invención para un alquilo.
El término "alquinilo", como se usa en esta invención, representa grupos monovalentes de cadena lineal o ramificada de 2 a 20 átomos de carbono (por ejemplo, de 2 a 4, de 2 a 6 o de 2 a 10 carbonos) que contienen un carbono-carbono triple enlace y está ejemplificado por etinilo, 1 -propinilo y similares. Los grupos alquinilo pueden estar opcionalmente sustituidos con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes que se seleccionan, independientemente, de entre arilo, cicloalquilo o heterociclilo (p. ej., heteroarilo), como se define en esta invención, o cualquiera de los ejemplos de grupos sustituyentes alquilo descritos en esta invención. .
Ejemplos no limitantes de grupos alquinilo opcionalmente sustituidos incluyen alcoxicarbonilalquinilo, aminoalquinilo e hidroxialquinilo:
El grupo "alcoxicarbonilalquinilo", que como se usa en esta invención, representa un grupo alquinilo, como se define en esta invención, que está sustituido con un grupo alcoxicarbonilo, como se define en esta invención (por ejemplo, -alquinil-C(O)-OR, donde R es un grupo alquilo C1-20, C1-10, o C1-6 opcionalmente sustituidos). Alcoxicarbonilalquinilos no sustituidos ejemplares incluyen de 4 a 41 carbonos (p.ej., de 4 a 10, de 4 a 13, de 4 a 17, de 4 a 21, o de 4 a 31 carbonos, tales como C1-6 alcoxicarbonil-C2-6 alquinil, C1-10 alcoxicarbonil-C2-10 alquinil, o C1-20 alcoxicarbonil-C2-20 alquinil). En algunas realizaciones, cada grupo alquilo, alquinilo y alcoxi está además sustituido independientemente con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes como se describe en esta invención (por ejemplo, un grupo hidroxi).
El grupo "aminoalquinilo", que como se usa en esta invención, representa un grupo alquinilo, como se define en esta invención, sustituido con un grupo amino, como se define en esta invención. El alquinil y amino cada uno se puede sustituir adicionalmente por 1, 2, 3, o 4 grupos sustituyentes conforme descrito en esta invención para el grupo respectivo (p.ej., CO2RA', donde RA' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a) C1-6 alquilo, (b) C6-10 aril, (c) hidrógeno, y (d) C1-6 alc-C6-10 aril, p.ej., carboxi, y/o un W-grupo protector).
El grupo "hidroxialquinilo", que como se usa en en esta invención, representa un grupo alquinilo, como se define en esta invención, sustituido con uno a tres grupos hidroxi, con la condición de que no se pueda unir más de un grupo hidroxi a un solo átomo de carbono del grupo alquilo. . En algunas realizaciones, el grupo hidroxialquinilo se puede sustituir con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes (por ejemplo, O-grupos protectores) como se define en esta invención para un alquilo.,
El término "amino", como se usa en esta invención —N(RN1)2, donde cada RN1 es, independientemente, H, OH, NO2, N(RN2)2, SO2ORN2, SO2RN2, SORN2, un W-grupo protector, alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, arilo, alcarilo, cicloalquilo, alccicloalquilo, carboxialquilo (p.ej., opcionalmente sustituido con un O-grupo protector, tal como grupos arilalcoxicarbonilo opcionalmente sustituidos o cualquiera descrito en esta invención), sulfoalquilo, acilo (p.ej., acetil, trifluoroacetil, u otros descritos en esta invención), alcoxicarbonilalquilo (p.ej., opcionalmente sustituido con un O-grupo protector, tal como grupos arilalcoxicarbonilo opcionalmente sustituidos o cualquiera descrito en esta invención), heterociclilo (p.ej., heteroarilo), o alc-heterociclilo (p.ej., alc-heteroarilo), donde cada uno de estos grupos RN1 citados puede ser opcionalmente sustituido, como definido en esta invención para cada grupo; o dos RN1 combinan para formar un heterociclilo o un W-grupo protector, y donde cada RN2 es, independientemente, H, alquilo, o arilo. Los grupos amino de la invención pueden ser un grupo amino no sustituido (es decir, -NH2) o un amino sustituido (es decir, -N(RN1)2). En una realización preferida de la invención, amino es -NH2 o -NHRN1, donde RN1 es, independientemente, OH, NO2, NH2, NRN22, SO2ORN2, SO2RN2, SORN2, alquilo, carboxialquilo , sulfoalquilo, acilo (p. ej., acetilo, trifluoroacetilo u otros descritos en esta invención), alcoxicarbonilalquilo (p. ej., t-butoxicarbonilalquilo) o arilo, y cada RN2 puede ser H, C1-20 alquilo (p. ej., C1-6) alquilo o C6-10 arilo.
Los ejemplos no limitantes de grupos amino opcionalmente sustituidos incluyen acilamino y carbamilo:
El grupo "acilamino", que como se usa en esta invención, representa un grupo acilo, como se define en esta invención, unido al grupo molecular parental a través de un grupo amino, como se define en esta invención. (es decir, —N(RN1)-C(O)-R, donde R es H o un grupo alquilo C1-6, C1-10, o C1-20 opcionalmente sustituido (p. ej., haloalquilo) y RN1 es conforme definido en esta invención). Grupos acilamino no sustituidos ejemplares incluyen de 1 a 41 carbonos (por ejemplo, de 1 a 7, de 1 a 13, de 1 a 21, de 2 a 7, de 2 a 13, de 2 a 21 o de 2 a 41 carbonos) . En algunas realizaciones, el grupo alquilo es adicionalmente sustituido por 1, 2, 3, o 4 sustituyentes conforme descrito en esta invención, y/o el grupo amino es —NH2 o —NHRN1, donde RN1 es, independientemente, OH, NO2, NH2, NRN22, SO2ORN2, SO2RN2, SORN2, alquilo, arilo, acilo (p.ej., acetilo, trifluoroacetilo, u otros descritos en esta invención), o alcoxicarbonilalquilo, y cada RN2 puede ser H, alquilo, o arilo.
El grupo "carbamilo", que como se usa en esta invención, se refiere a un grupo carbamato que tiene la estructura -NRN1C(=O)OR u -OC(=O)N(RN1)2, donde el significado de cada RN1 se encuentra en la definición de "amino" proporcionada en esta invención, y R es alquilo, cicloalquilo, alcicloalquilo, arilo, alcarilo, heterociclilo (por ejemplo, heteroarilo) o alc-heterociclilo (por ejemplo, alqueteroarilo), como se define en esta invención.
El término "aminoácido", como se describe en esta invención, se refiere a una molécula que tiene una cadena lateral, un grupo amino y un grupo ácido (por ejemplo, un grupo carboxi de —CO2H o un grupo sulfo de —SO3H), donde el aminoácido está unido al grupo molecular de origen por la cadena lateral, el grupo amino o el grupo ácido (por ejemplo, la cadena lateral). En algunas realizaciones, el aminoácido está unido al grupo molecular de origen mediante un grupo carbonilo, donde la cadena lateral o el grupo amino está unido al grupo carbonilo. Las cadenas laterales ejemplares incluyen un alquilo, arilo, heterociclilo, alcarilo, alqueterociclilo, aminoalquilo, carbamoilalquilo y carboxialquilo opcionalmente sustituidos. Los aminoácidos proteinogénicos, también conocidos como aminoácidos naturales, incluyen alanina, cisteína, selenocisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, metionina, asparagina, prolina, pirrolisina, glutamina, arginina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina. Los grupos de aminoácidos pueden estar opcionalmente sustituidos con uno, dos, tres o, en el caso de grupos de aminoácidos de dos carbonos o más, cuatro sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en: (1) C1-6 alcoxi; (2) C1-6 alquilsulfinil; (3) amino, como se define en esta invención (p.ej., amino no sustituido (i.e., -NH2) o un amino sustituido (i.e., -N(RN1)2, donde RN1 es como definido para amino); (4) C6-10 aril-C1-6 alcoxi; (5) azido; (6) halo; (7) (C2-9 heterociclil)oxi; (8) hidroxi; (9) nitro; (10) oxo (p.ej., carboxialdehido o acil); (11) C1-7 spirociclil; (12) tioalcoxi; (13) tiol; (14) -CO2RA', donde RA' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a) C1-20 alquilo (p.ej., C1-6 alquilo), (b) C2-20 alquenilo (p.ej., C2-6 alquenilo), (c) C6-10 aril, (d) hidrógeno, (e) C1-6 alc-C6-10 aril, (f) amino-C1-20 alquilo, (g) polietileno glicol de -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', donde s1 es un entero de 1 a 10 (p.ej., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un entero de 0 a 10 (p.ej., de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y R' es H o C1-20 alquilo, y (h) amino-polietileno glicol de - NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, donde s i es un entero de 1 a 10 (p.ej., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un entero de 0 a
10 (p.ej., de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y cada RN1 es, independientemente, hidrógeno o
opcionalmente sustituido C1-6 alquilo; (15) -C(O)NRB'RC', donde cada uno de RB' y RC' es, independientemente,
seleccionado de entre el grupo que consiste en (a) hidrógeno, (b) C1-6 alquilo, (c) C6-10 aril, y (d) C1-6 alc-C6-10 aril; (16)
-SO2Rd', donde RD' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a) C1-6 alquilo, (b) C6-10 aril, (c) C1-6 alc-Ca-10 aril,
y (d) hidroxi; (17) -SO2NRE'RF', donde cada uno de RE' y RF' es, independientemente, seleccionado de entre el grupo
que consiste en (a) hidrógeno, (b) C1-6 alquilo, (c) C6-10 aril y (d) C1-6 alc-C6-10 aril; (18) -C(O)RG', donde RG' se
selecciona de entre el grupo que consiste en (a) C1-20 alquilo (p.ej., C1-6 alquilo), (b) C2-20 alquenilo (p.ej., C2-6 alquenilo),
(c) C6-10 aril, (d) hidrógeno, (e) C1-6 alc-C6-10 aril, (f) amino-C1-20 alquilo, (g) polietileno glicol de -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', donde s1 es un entero de 1 a 10 (p.ej., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3,
independientemente, es un entero de 0 a 10 (p.ej., de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y R' es H o C1-20 alquilo, y (h) amino-polietileno glicol de -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, donde s1 es un entero de 1 a 10
(p.ej., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un entero de 0 a 10 (p.ej., de 0 a 4, de 0 a 6,
de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y cada RN1 es, independientemente, hidrógeno o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido;
(19) - NRH'C(O)R'\ donde RH' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a1) hidrógeno y (b1) C1-6 alquilo, y R1'
se selecciona de entre el grupo que consiste en (a2) C1-20 alquilo (p.ej., C1-6 alquilo), (b2) C2-20 alquenilo (p.ej., C2-6
alquenilo), (c2) C6-10 aril, (d2) hidrógeno, (e2) C1-6 alc-C6-10 aril, (f2) amino-C1-20 alquilo, (g2) polietileno glicol de -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3oR', donde s1 es un entero de 1 a 10 (p.ej., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3,
independientemente, es un entero de 0 a 10 (p.ej., de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y R' es H o C1-20 alquilo, y (h2) amino-polietileno glicol de -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, donde s1 es un entero de 1 a 10
(p.ej., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un entero de 0 a 10 (p.ej., de 0 a 4, de 0 a 6,
de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y cada RN1 es, independientemente, hidrógeno o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido;
(20) -NRJ'C(O)ORK', donde RJ' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a1) hidrógeno y (b1) C1-6 alquilo, y
RK' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a2) C1-20 alquilo (p.ej., C1-6 alquilo), (b2) C2-20 alquenilo (p.ej., C2-6 alquenilo), (c2) C6-10 aril, (d2) hidrógeno, (e2) C1-6 alc-C6-10 aril, (f2) amino-C1-20 alquilo, (g2) polietileno glicol de -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', donde s1 es un entero de 1 a 10 (p.ej., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3,
independientemente, es un entero de 0 a 10 (p.ej., de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y R' es H o C1-20 alquilo, y (h2) amino-polietileno glicol de - NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1, donde s1 es un entero de 1 a 10
(p.ej., de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un entero de 0 a 10 (p.ej., de 0 a 4, de 0 a 6,
de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y cada RN1 es, independientemente, hidrógeno o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido;
y (21) amidina. En algunas realizaciones, cada uno de estos grupos se puede sustituir adicionalmente como se
describe en esta invención.
El término "arilo", como se usa en esta invención, representa un sistema de anillo carbocíclico mono, bicíclico o
multicíclico que tiene uno o dos anillos aromáticos y está ejemplificado por fenilo, naftilo, 1,2-dihidronaftilo, 1,2,3,4-tetrahidronaftilo, antracenilo, fenantrenilo, fluorenilo, indanilo, indenilo y similares, y pueden estar opcionalmente
sustituidos con 1, 2, 3, 4 o 5 sustituyentes seleccionados independientemente de entre el grupo que consiste en: (1)
C1-7 acilo (p.ej., carboxialdehido); (2) C1-20 alquilo (p.ej., C1-6 alquilo, C1-6 alcoxi-C1-6 alquilo, C1-6 alquilsulfinil-C1-6 alquilo,
amino-C1-6 alquilo, azido-C1-6 alquilo, (carboxialdehido)-C1-6 alquilo, halo-C1-6 alquilo (p.ej., perfluoroalquilo), hidroxi-C1-6 alquilo, nitro-C1-6 alquilo, o C1-6 tioalcoxi-C1-6 alquilo); (3) C1-20 alcoxi (p.ej., C1-6 alcoxi, tal como perfluoroalcoxi);
(4) C1-6 alquilsulfinilo; (5) C6-10 arilo; (6) amino; (7) C1-6 alc-C6-10 arilo; (8) azido; (9) C3-8 cicloalquilo; (10) C1-6 alc-C3-8
cicloalquilo; (11) halo; (12) C1-12 heterociclilo (p.ej., C1-12 heteroarilo); (13) (C1-12 heterociclil)oxi; (14) hidroxi; (15) nitro;
(16) C1-20 tioalcoxi (p.ej., C1-6 tioalcoxi); (17) —(CH2)qCO2RA', donde q es un entero de cero a cuatro, y RA' se selecciona
de entre el grupo que consiste en (a) C1-6 alquilo, (b) C6-10 arilo, (c) hidrógeno, y (d) C1-6 alc-C6-10 arilo; (18) -(CH2)qCONRB'RC', donde q es un entero de cero a cuatro y donde RB' y RC' son independientemente seleccionados
de entre el grupo que consiste en (a) hidrógeno, (b) C1-6 alquilo, (c) C6-10 arilo, y (d) C1-6 alc-C6-10 arilo; (19)
—(CH2)qSO2RD', donde q es un entero de cero a cuatro y donde RD' se selecciona de entre el grupo que consiste en
(a) alquilo, (b) C6-10 arilo, y (c) alc-C6-10 aril; (20) —(CH2)qSO2NRE'RF', donde q es un entero de cero a cuatro y donde
cada uno de RE' y RF' es, independientemente, seleccionado de entre el grupo que consiste en (a) hidrógeno, (b) C1-6
alquilo, (c) C6-10 arilo, y (d) C1-6 alc-C6-10 arilo; (21) tiol; (22) C6-10 ariloxi; (23) C3-8 cicloalcoxi; (24) C6-10 arilo-C1-6 alcoxi;
(25) C1-6 alc-C1-12 heterociclilo (p.ej., C1-6 alc-C1-12 heteroarilo); (26) C2-20 alquenilo; y (27) C2-20 alquinilo. En algunas
realizaciones, cada uno de estos grupos se puede sustituir adicionalmente como se describe en esta invención. Por
ejemplo, el grupo alquileno de un C1alcarilo o un C1-alc-heterociclilo se puede sustituir adicionalmente con un grupo
oxo para producir el respectivo grupo sustituyente ariloílo y (heterociclil)oílo.
El grupo "arilalquilo", que como se usa en esta invención, representa un grupo arilo, como se define en esta invención,
unido al grupo molecular de origen a través de un grupo alquileno, como se define en esta invención. Ejemplos de
grupos arilalquilo no sustituidos son de 7 a 30 carbonos (por ejemplo, de 7 a 16 o de 7 a 20 carbonos, tales como C1-6 alc-C6-10 arilo, C1-10 alc-C6-10 arilo, o C1-20 alc-C6-10 arilo). En algunas realizaciones, el alquileno y el arilo pueden estar
sustituidos cada uno con 1,2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se define en esta invención para los grupos respectivos.
Otros grupos precedidos por el prefijo "alc-" se definen de la misma manera, donde "alc" se refiere a un C1-6 alquileno,
a menos que se indique lo contrario, y la estructura química adjunta es como se define en esta invención.
El término "azido" representa un grupo —N3 , que también se puede representar como -N=N=N.
El término "bicíclico", como se usa en esta invención, se refiere a una estructura que tiene dos anillos, que pueden ser aromáticos o no aromáticos. Las estructuras bicíclicas incluyen grupos espirociclilo, como se define en esta invención,
y dos anillos que comparten uno o más puentes, donde dichos puentes pueden incluir un átomo o una cadena que
incluye dos, tres o más átomos. Grupos bicíclicos ejemplares incluyen un grupo carbociclilo bicíclico, donde el primer y segundo anillos son grupos carbociclilo, como se define en esta invención; grupos arilo bicíclicos, donde el primer y segundo anillos son grupos arilo, como se define en esta invención; grupos heterociclilo bicíclicos, donde el primer
anillo es un grupo heterociclilo y el segundo anillo es un grupo carbociclilo (por ejemplo, arilo) o heterociclilo (por ejemplo, heteroarilo); y grupos heteroarilo bicíclicos, donde el primer anillo es un grupo heteroarilo y el segundo anillo
es un grupo carbociclilo (por ejemplo, arilo) o heterociclilo (por ejemplo, heteroarilo). En algunas realizaciones, el grupo bicíclico puede estar sustituido con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes como se define en esta invención para los grupos cicloalquilo, heterociclilo y arilo.
El término "boranilo", como se usa en esta invención, representa —B(RB1)3, donde cada RB1 se selecciona, independientemente, de entre el grupo que consiste en H y alquilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones,
el grupo boranilo puede estar sustituido con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes como se define en esta invención para alquilo.
Los términos "carbocíclico" y "carbociclilo", como se usan en esta invención, se refieren a una estructura C3-12 monocíclica, bicíclica o tricíclica opcionalmente sustituida donde los anillos, que pueden ser aromáticos o no aromáticos, están formados por átomos de carbono. Las estructuras carbocíclicas incluyen grupos cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquinilo y arilo.
El término "carbonilo", como se usa en esta invención, representa un grupo C (O), que también se puede representar
como C=O.
El término "carboxi", como se usa en esta invención, significa —CO2H.
El término "ciano", como se usa en esta invención, representa un grupo -CN.
El término "cicloalquilo", como se usa en esta invención, representa un grupo hidrocarburo cíclico no aromático saturado o insaturado monovalente de tres a ocho carbonos, a menos que se especifique lo contrario, y se ejemplifica
por ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, biciclo heptilo y análogos. Cuando lo que de otro modo
sería un grupo cicloalquilo incluye uno o más dobles enlaces carbono-carbono, el grupo se denomina grupo "cicloalquenilo". Para los propósitos de esta invención, el cicloalquenilo excluye los grupos arilo. Cuando lo que de
otro modo sería un grupo cicloalquilo incluye uno o más triples enlaces carbono-carbono, el grupo se denomina grupo "cicloalquinilo". Grupos cicloalquenilo ejemplares incluyen ciclopentenilo, ciclohexenilo y similares. Los grupos cicloalquilo de esta invención pueden estar opcionalmente sustituidos con: (1) C1-7 acilo (p.ej., carboxialdehido); (2)
C1-20 alquilo (p.ej., C1-6 alquilo, C1-6 alcoxi-C1-6 alquilo, C1-6 alquilsulfinil-C1-6 alquilo, amino-C1-6 alquil alquilo, (carboxialdehido)-C1-6 alquilo, halo-C1-6 alquilo (p.ej., perfluoroalquilo), hidroxi-C1-6 alquilo, nitro-C1-6 alquilo, o
C1-6 tioalcoxi-C1-6 alquilo); (3) C1-20 alcoxi (p.ej., C1-6 alcoxi, tal como perfluoroalcoxi); (4) C1-6 alquilsulfinilo; (5) C6-10
arilo; (6) amino; (7) C1-6 alc-C6-10 arilo; (8) azido; (9) C3-8 cicloalquilo; (10) C1-6 alc-C3-8 cicloalquilo; (11) halo; (12) C1-12 heterociclilo (p.ej., C1-12 heteroarilo); (13) (C1-12 heterociclil)oxi; (14) hidroxi; (15) nitro; (16) C1-20 tioalcoxi (p.ej., C1-6 tioalcoxi); (17) —(CH2)qCO2RA', donde q es un entero de cero a cuatro, y RA' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a) C1-6 alquilo, (b) C6-10 arilo, (c) hidrógeno, y (d) C1-6 alc-C6-10 arilo; (18) - (CH2)qCONRB'RC', donde q es
un entero de cero a cuatro y donde RB' y RC' son independientemente seleccionados de entre el grupo que consiste
en (a) hidrógeno, (b) C6-10 alquilo, (c) C6-10 arilo, y (d) C1-6 alc-C6-10 arilo; (19) —(CH2)qSO2RD', donde q es un entero
de cero a cuatro y donde RD' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a) C6-10 alquilo, (b) C6-10 arilo, y (c) C1-6
alc-C6-10 arilo; (20) —(CH2)qSO2NRE'RF', donde q es un entero de cero a cuatro y donde cada uno de RE' y RF' es, independientemente, seleccionado de entre el grupo que consiste en (a) hidrógeno, (b) C6-10 alquilo, (c) C6-10 arilo, y
(d) C1-6 alc-C6-10 arilo; (21) tiol; (22) C6-10 ariloxi; (23) C3-8 cicloalcoxi; (24) C6-10 aril-C1-6 alcoxi; (25) C1-6 alc-C1-12 heterociclilo (p.ej., C1-6 alc-C1-12 heteroarilo); (26) oxo; (27) C2-20 alquenilo; y (28) C2-20 alquinilo. En algunas realizaciones, cada uno de estos grupos se puede sustituir adicionalmente como se describe en esta invención. Por ejemplo, el grupo alquileno de un C1alcarilo o un C1-alc-heterociclilo se puede sustituir adicionalmente con un grupo
oxo para producir el respectivo grupo sustituyente ariloílo y (heterociclil)oílo.
El grupo "cicloalquilalquilo", que como se usa en esta invención, representa un grupo cicloalquilo, como se define en
esta invención, unido al grupo molecular de origen a través de un grupo alquileno, como se define en esta invención
(por ejemplo, un grupo alquileno de 1 a 4, de 1 a 6, de 1 a 10, o de 1 a 20 carbonos). En algunas realizaciones, el alquileno y el cicloalquilo pueden estar sustituidos cada uno con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se define en
esta invención para el grupo respectivo.
El término "halo", tal como se usa en esta invención, representa un halógeno seleccionado de entre bromo, cloro, yodo
o flúor.
El término "heteroalquilo", como se usa en esta invención, se refiere a un grupo alquilo, como se define en esta invención, donde uno o dos de los átomos de carbono constituyentes han sido reemplazados cada uno por nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, el grupo heteroalquilo se puede sustituir adicionalmente con 1, 2, 3 o 4
grupos sustituyentes como se describe en esta invención para los grupos alquilo. Los términos "heteroalquenilo" y heteroalquinilo ", como se usan en esta invención, se refieren a grupos alquenilo y alquinilo, como se definen en esta invención, respectivamente, en los que uno o dos de los átomos de carbono constituyentes se han reemplazado cada uno por nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, los grupos heteroalquenilo y heteroalquinilo se pueden sustituir adicionalmente con 1,2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención para grupos alquilo.
Los ejemplos no limitantes de grupos heteroalquilo, heteroalquenilo y heteroalquinilo opcionalmente sustituidos incluyen aciloxi, alqueniloxi, alcoxi, alcoxialcoxi, alcoxicarbonilalcoxi, alquiniloxi, aminoalcoxi, arilalcoxi, carboxialcoxi, cicloalcoxi, haloalcoxi, (heterociclil)oxi, perfluoroalcoxi, tioalcoxi y tioheterociclilalquilo:
El grupo "aciloxi", que como se usa en esta invención, representa un grupo acilo, como se define en esta invención, unido al grupo molecular principal a través de un átomo de oxígeno (es decir, - OC(O)-R, donde R es H o un grupo alquilo C1-6, C1-10, o C1-20 opcionalmente sustituido). Grupos aciloxi no sustituidos ejemplares incluyen de 1 a 21 carbonos (por ejemplo, de 1 a 7 o de 1 a 11 carbonos). En algunas realizaciones, el grupo alquilo está sustituido adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes, tal como se describen en esta invención.
El grupo "alqueniloxi", que como se usa en esta invención, representa un sustituyente químico de fórmula -OR, donde R es un grupo alquenilo C2-20 (p.ej., C2-6 o C2-10 alquenilo), a menos que se especifique lo contrario.. Grupos alqueniloxi ejemplares incluyen eteniloxi, propeniloxi y similares. En algunas realizaciones, el grupo alquenilo se puede sustituir adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se define en esta invención (p. ej., un grupo hidroxi).
Los grupos "alcoxi", que como se usa en esta invención, representan un sustituyente químico de fórmula -OR, donde R es un grupo alquilo C1-20 (p.ej., C1-6 o C1-10 alquilo), a menos que se especifique lo contrario.. Grupos alcoxi ejemplares incluyen metoxi, etoxi, propoxi (p. ej., n-propoxi e isopropoxi), t-butoxi y similares. En algunas realizaciones, el grupo alquilo se puede sustituir adicionalmente con 1,2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se define en esta invención (p. ej., hidroxi o alcoxi).
El grupo "alcoxialcoxi", que como se usa en esta invención, representa un grupo alcoxi que está sustituido con un grupo alcoxi. Grupos alcoxialcoxi no sustituidos ejemplares incluyen entre 2 y 40 carbonos (por ejemplo, de 2 a 12 o de 2 a 20 carbonos, como C1-6 alcoxi-C1-6 alcoxi, C1-10 alcoxi-C1-10 alcoxi, o C1-20 alcoxi-C1-20 alcoxi). En algunas realizaciones, cada grupo alcoxi puede estar además sustituido con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se define en esta invención.
El grupo "alcoxicarbonilalcoxi", que como se usa en esta invención, representa un grupo alcoxi, como se define en esta invención, que está sustituido con un grupo alcoxicarbonilo, como se define en esta invención (por ejemplo, -O-alquilo-C(O)-OR, donde R es un grupo alquilo C1-6, C1-10, o C1-20 opcionalmente sustituido). Alcoxicarbonilalcoxi no sustituidos ejemplares incluyen de 3 a 41 carbonos (p. ej., de 3 a 10, de 3 a 13, de 3 a 17, de 3 a 21 o de 3 a 31 carbonos, como C1-6 alcoxicarbonilo-C1-6 alcoxi, C1-10 alcoxicarbonilo-C1-10 alcoxi, o C1-20 alcoxicarbonilo-C1-20 alcoxi). En algunas realizaciones, cada grupo alcoxi está además sustituido de forma independiente con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes, como se describe en esta invención (p. ej., un grupo hidroxi).
El grupo "alquiniloxi", que como se usa en esta invención, representan un sustituyente químico de fórmula -OR, donde R es un grupo alquinilo C2-20 (p.ej., C2-6 o C2-10 alquinilo), a menos que se especifique lo contrario.. Los ejemplos de grupos alquiniloxi incluyen etiniloxi, propiniloxi y similares. En algunas realizaciones, el grupo alquinilo se puede sustituir adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se define en esta invención (p. ej., un grupo hidroxi).
El grupo "aminoalcoxi", que como se usa en esta invención, representa un grupo alcoxi, como se define en esta invención, sustituido con un grupo amino, como se define en esta invención. El alquilo y el amino pueden estar sustituidos cada uno adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención para el grupo respectivo (por ejemplo, CO2RA', donde RA' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a) alquilo C1-6, (b) arilo C6-10, (c) hidrógeno, y (d) arilo C1-6 alc-C6-10, por ejemplo, carboxi).
El grupo "arilalcoxi", que como se usa en esta invención, representa un grupo alcarilo, como se define en esta invención, unido al grupo molecular parental a través de un átomo de oxígeno. Grupos arilalcoxi no sustituidos ejemplares incluyen de 7 a 30 carbonos (por ejemplo, de 7 a 16 o de 7 a 20 carbonos, tales como C6-10 arilo-C1-6 alcoxi, C6-10 arilo-C1-10 alcoxi, o C6-10 arilo-C1-20 alcoxi). En algunas realizaciones, el grupo arilalcoxi puede ser sustituido adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes, tal como se describen en esta invención.
El grupo "ariloxi", que como se usa en esta invención, representa un sustituyente químico de fórmula -OR', donde R' es un grupo arilo de 6 a 18 carbonos, a menos que se especifique lo contrario. En algunas realizaciones, el grupo alquilo está sustituido adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes, tal como se describen en esta invención.
El grupo "carboxialcoxi", que como se usa en esta invención, representa un grupo alcoxi, como se define en esta invención, sustituido con un grupo carboxi, como se define en esta invención. El grupo alcoxi se puede sustituir adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención para el grupo alquilo, y el grupo carboxi se puede sustituir opcionalmente con uno o más O-grupos protectores.
El grupo "cicloalcoxi", que como se usa en esta invención, representa un sustituyente químico de fórmula -OR, donde R es un grupo cicloalquilo C3-8 como se define en esta invención, a menos que se especifique lo contrario. En algunas realizaciones, el grupo ciclloalquilo puede estar sustituido adicionalmente con 1,2, 3 o 4 grupos sustituyentes, tal como se describen en esta invención. Grupos cicloalcoxi no sustituidos ejemplares son de 3 a 8 carbonos. En algunas realizaciones, el grupo cicloalquilo puede estar sustituido adicionalmente con 1,2, 3 o 4 grupos sustituyentes, tal como se describen en esta invención.
El término "haloalcoxi", tal como se usa en esta invención, representa un grupo alcoxi, tal como se define en esta invención, sustituido con un grupo halógeno (es decir, F, Cl, Br o I). Un haloalcoxi puede estar sustituido con uno, dos 0 tres, o en el caso de grupos alquilo de dos carbonos o más, cuatro halógenos. Los grupos haloalcoxi incluyen perfluoroalcoxis (por ejemplo, -OCF3), -OCHF2, -OCH2F, -OCCb, -OCH2CH2Br, -OCH2CH(CH2CH2Br)CH3, y -OCHICH3. En algunas realizaciones, el grupo haloalcoxi puede estar sustituido adicionalmente con 1,2, 3 o 4 grupos sustituyentes, tal como se describen en esta invención para grupos alquilo.
El grupo "(heterociclil)oxi", que como se usa en esta invención, representa un grupo heterociclilo, como se define en esta invención, unido al grupo molecular original a través de un átomo de oxígeno. En algunas realizaciones, el grupo haloalquilo puede estar sustituido adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes, tal como se describen en esta invención para grupos alquilo.
El grupo "perfluoroalcoxi", que como se usa en esta invención, representa un grupo alcoxi, como se define en esta invención, donde cada radical de hidrógeno unido al grupo alcoxi ha sido reemplazado por un radical fluoruro. Los grupos perfluoroalcoxi son ejemplificados por trifluorometoxi, pentafluoroetoxi y similares.
El grupo "alquilsulfinilo", que como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo unido al grupo molecular de origen a través de un grupo -S (O) -. Los grupos alquilsulfinilo no sustituidos ejemplares son de 1 a 6, de 1 a 10 o de 1 a 20 carbonos. En algunas realizaciones, el grupo alquilo puede estar sustituido adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes, tal como se describen en esta invención.
El grupo "tioarilalquilo", que como se usa en esta invención, representa un sustituyente químico de fórmula -SR, donde R es un grupo arilalquilo. En algunas realizaciones, el grupo arialquilo está sustituido adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes, tal como se describen en esta invención.
El grupo "tioalcoxi", como se usa en esta invención, representa un sustituyente químico de fórmula -SR, donde R es un grupo alquilo, como se define en esta invención. En algunas realizaciones, el grupo alquilo está sustituido adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes, tal como se describen en esta invención.
El grupo "tioheterociclilalquilo", que como se usa en esta invención, representa un sustituyente químico de fórmula -SR, donde R es un grupo heterociclilalquilo. En algunas realizaciones, el grupo heterociclilalquilo se puede sustituir adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención.
El término "heteroarilo", como se usa en esta invención, representa ese subconjunto de heterociclilos, como se define en esta invención, que son aromáticos: es decir, contienen 4n+2 pi electrones pi dentro del sistema de anillo mono o multicíclico. Grupos heteroarilo no sustituidos ejemplares tienen de 1 a 12 (por ejemplo, 1 a 11, 1 a 10, 1 a 9, 2 a 12, 2 a 11,2 a 10 o 2 a 9) carbonos. En alguna realización, el heteroarilo está sustituido con 1,2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se define para un grupo heterociclilo.
El término "heteroarilalquilo" se refiere a un grupo heteroarilo, como se define en esta invención, unido al grupo molecular de origen a través de un grupo alquileno, como se define en esta invención. Grupos heteroarilalquilo no sustituidos ejemplares son de 2 a 32 carbonos (por ejemplo, de 2 a 22, de 2 a 18, de 2 a 17, de 2 a 16, de 3 a 15, de 2 a 14, de 2 a 13 o de 2 a 12 carbonos, tales como C1-6 alc-C1-12 heteroarilo, C1-10 alc-C1-12 heteroarilo, o C1-20 alc-C1-12 heteroarilo). En algunas realizaciones, el alquileno y el heteroarilo pueden estar sustituidos cada uno con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se define en esta invención para el grupo respectivo. Los grupos heteroarilalquilo son un subconjunto de grupos heterociclilalquilo.
El término "heterociclilo", como se usa en esta invención, representa un anillo de 5, 6 o 7 miembros, a menos que se especifique lo contrario, que contiene uno, dos, tres o cuatro heteroátomos seleccionados independientemente de entre el grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre. El anillo de 5 miembros tiene de cero a dos enlaces dobles, y los anillos de 6 y 7 miembros tienen de cero a tres enlaces dobles. Grupos heterociclilo no sustituidos ejemplares tienen de 1 a 12 (por ejemplo, 1 a 11, 1 a 10, 1 a 9, 2 a 12, 2 a 11, 2 a 10 o 2 a 9) carbonos. EL término "heterociclilo" también representa un compuesto heterocíclico que tiene una estructura multicíclica puenteada en la cual uno o más carbonos y/o heteroátomos forman puentes entre dos miembros no adyacentes de un anillo monocíclico (por ejemplo, un grupo quinuclidinilo). El término "heterociclilo" incluye grupos bicíclicos, tricíclicos y tetracíclicos en los cuales cualquiera de los anillos heterocíclicos antemencionados está fusionado a uno, dos o tres anillos carbocíclicos, por ejemplo, un anillo de arilo, un anillo de ciclohexano, un anillo de ciclohexeno, un anillo de ciclopentano, un anillo de ciclopenteno, y otro anillo heterocíclico monocíclico, tal como indolilo, quinolilo, isoquinolilo, tetrahidroquinolilo, benzofurilo, benzotienilo y similares. Los ejemplos de heterociclilos fusionados incluyen tropanos y 1,2,3,5,8,8a hexahidroindolizina. Los heterocíclicos incluyen pirrolilo, pirrolinilo, pirrolidinilo, pirazolilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, imidazolilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, piridilo, piperidinilo, homopiperidinilo, pirazinilo, piperazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, oxazolilo, oxazolidinilo, isoxazolilo, isoxazolidiniilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, tiazolilo, tiazolidinilo, isotiazolilo, isotiazolidinilo, indolilo, indazolilo, quinolilo, isoquinolilo, quinoxalinilo, dihidroquinoxalinilo, quinazolinilo, cinolinilo, ftalazinilo, benzimidazolilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo, benzotiadiazolilo, furilo, tienilo, tiazolidinilo, isotiazolilo, triazolilo, tetrazolilo, oxadiazolilo (por ejemplo, 1,2,3-oxadiazolilo), purinilo, tiadiazolilo (por ejemplo, 1,2,3-tiadiazolilo), tetrahidrofuranilo, dihidrofuranilo, tetrahidrotienilo, dihidrotienilo, dihidroindolilo, dihidroquinolilo, tetrahidroquinolilo, tetrahidroisoquinolilo, dihidroisoquinolilo, piranilo, dihidropiranilo, ditiazolilo, benzofuranilo, isobenzofuranilo, benzotienilo y similares, inclusive formas dihidro y tetrahidro de los mismos, donde uno o más enlaces dobles se reducen y reemplazan con hidrógenos. Todavía otros heterociclilos ejemplares incluyen: 2,3,4,5-tetrahidro-2-oxo-oxazolil; 2,3-dihidro-2-oxo-1H-imidazolil; 2,3,4,5-tetrahidro-5-oxo-1H-pirazolil (p.ej., 2,3,4,5-tetrahidro-2-fenil-5-oxo-1 H-pirazolil); 2,3,4,5-tetrahidro-2,4-dioxo-1 H-imidazolil (p.ej., 2,3,4,5-tetrahidro-2,4-dioxo-5-metil-5-fenil-1 H-imidazolil); 2,3-dihidro-2-tioxo-1,3,4-oxadiazolil (p.ej., 2,3-dihidro-2-tioxo-5-fenil-1,3,4-oxadiazolil); 4,5-dihidro-5-oxo-1H-triazolil (p.ej., 4,5-dihidro-3-metil-4-amino 5-oxo-1H-triazolil); 1,2,3,4-tetrahidro-2,4-dioxopiridinil (p.ej., 1,2,3,4-tetrahidro-2,4-dioxo-3,3-dietilpiridinil); 2,6-dioxo-piperidinil (p.ej., 2,6-dioxo-3-etil-3-fenilpiperidinil); 1,6-dihidro-6-oxopiridiminil; 1,6-dihidro-4-oxopirimidinil (p.ej., 2-(metiltio)-1,6-dihidro-4-oxo-5-metilpirimidin-1-yl); 1,2,3,4-tetrahidro-2,4-dioxopirimidinil (p.ej., 1,2,3,4-tetrahidro-2,4-dioxo-3-etilpirimidinil); 1,6-dihidro-6-oxo-piridazinil (p.ej., 1,6-dihidro-6-oxo-3-etilpiridazinil); 1,6-dihidro-6-oxo-1,2,4-triazinil (p.ej., 1,6-dihidro-5-isopropil-6-oxo-1,2,4-triazinil); 2,3-dihidro-2-oxo-1 H-indolil (p.ej., 3,3-dimetil-2,3-dihidro-2-oxo-1H-indolil and 2,3-dihidro-2-oxo-3,3'-spiropropano-1H-indol-1-il); 1,3-dihidro-1-oxo-2H-iso-indolil; 1,3-dihidro-1,3-dioxo-2H-iso-indolil; 1H-benzopirazolil (p.ej., 1-(etoxicarbonil)- 1H-benzopirazolil); 2,3-dihidro-2-oxo-1H-benzimidazolil (p.ej., 3-etil-2,3-dihidro-2-oxo-1H-benzimidazolil); 2,3-dihidro-2-oxo-benzoxazolil (p.ej., 5-cloro-2,3-dihidro-2-oxo-benzoxazolil); 2,3-dihidro-2-oxobenzoxazolil; 2-oxo-2H-benzopiranil; 1,4-benzodioxanil; 1,3-benzodioxanil; 2,3-dihidro-3-oxo,4H-1,3-benzotiazinil; 3,4-dihidro-4-oxo-3H-quinazolinil (p.ej., 2-metil-3,4-dihidro-4-oxo-3H-quinazolinil); 1,2,3,4-tetrahidro-2,4-dioxo-3H-quinazolil (p.ej., 1-etil-1,2,3,4-tetrahidro-2,4-dioxo-3H-quinazolil); 1,2,3,6-tetrahidro-2,6-dioxo-7H-purinil (p.ej., 1,2,3,6-tetrahidro-1,3-dimetil-2,6-dioxo-7 H -purinil); 1,2,3,6-tetrahidro-2,6-dioxo-1 H -purinil (p.ej., 1,2,3,6-tetrahidro-3,7-dimetil-2,6-dioxo-1 H -purinil); 2-oxobenz[c,d]indolil; 1,1-dioxo-2H-naft[1,8-c,d]isotiazolil; y 1,8-naftilenedicarboxamido. Los heterocíclicos adicionales incluyen 3,3a,4,5,6,6a-hexahidro-pirrolo[3,4-b]pirrol-(2H)-ilo, y 2,5-diazabiciclo[2.2.1]heptan-2-ilo, homopiperazinilo (o diazepanil), tetrahidropiranilo, ditiazolilo, benzofuranilo, benzotienilo, oxepanilo, tiepanilo, azocanilo, oxecanilo y tiocanilo. Los grupos heterocíclicos también incluyen grupos de fórmula
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donde E 'se selecciona de entre el grupo que consiste en -N- y -CH-; F 'se selecciona del grupo que consta de -N=CH-, -NH-CH2-, -NH-C (O) -, -NH-, -CH=N-, -CH2-NH-, -C (O) -NH-, -CH=CH-, -CH2-, -CH2CH2-, -CH2O-, -OCH2-, -O- y -S-; y G 'se selecciona del grupo que consiste en -CH- y -N-. Cualquiera de los grupos heterociclilo mencionados en este documento puede estar opcionalmente sustituido con uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en: (1) C1-7 acil (p.ej., carboxialdehido ); (2) C1-20 alquilo (p.ej., C1-6 alquilo, C1-6 alcoxi-C1-6 alquilo, C1-6 alquilsulfinil-C1-6 alquilo, amino-C1-6 alquilo, azido-C1-6 alquilo, (carboxialdehido)-C1-6 alquilo, halo-C1-6 alquilo (p.ej., perfluoroalquilo), hidroxi-C1-6 alquilo, nitro-C1-6 alquilo, o C1-6 tioalcoxi-C1-6 alquilo); (3) C1-20 alcoxi (p.ej., C1-6 alcoxi, such as perfluoroalcoxi); (4) C1-6 alquilsulfinil; (5) C6-10 aril; (6) amino; (7) C1-6 alc-C6-10 aril; (8) azido; (9) C3-8 cycloalquilo; (10) C1-6 alc-C3-8 cycloalquilo; (11) halo; (12) C1-12 heterociclil (p.ej., C2-2 heteroaryl); (13) (C1-12 heterociclil)oxi; (14) hidroxi; (15) nitro; (16) C1-20 tioalcoxi (p.ej., C1-6 tioalcoxi); (17) -(CH2)qCO2RA', donde q es un entero de cero a cuatro, y RA' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a) C1-6 alquilo, (b) C6-10 aril, (c) hidrógeno, y (d) C1-6 alc-C6-10 aril; (18) -(CH2)qCONRB'RC', donde q es un entero de cero a cuatro y donde RB' y RC' are independientemente seleccionado de entre el grupo que consiste en (a) hidrógeno, (b) C1-6 alquilo, (c) C6-10 aril, y (d) C1-6 alc-C6-10 aril; (19) -(CH2)qSO2RD' , donde q es un entero de cero a cuatro y donde RD' se selecciona de entre el grupo que consiste en (a) C1-6 alquilo, (b) C6-10 aril, y (c) C1-6 alc-C6-10 aril; (20) -(CH2)qSO2NRE'RF', donde q es un entero de cero a cuatro y donde cada uno de RE' y RF' es, independientemente, seleccionado de entre el grupo que consiste en (a) hidrógeno, (b) C1-6 alquilo, (c) C6-10 aril, y (d) C1-6 alc-C6-10 aril; (21) tiol; (22) C6-10 aryloxi; (23) C3-8 cycloalcoxi; (24) arylalcoxi; (25) C1-6 alc-C1-12 heterociclil (p.ej., C1-6 alc-C1-12 heteroaryl); (26) oxo; (27) (C1-12 heterociclil)imino; (28) C2-20 alquenilo; y (29) C2-20 alquinil. En algunas realizaciones, cada uno de estos grupos se puede sustituir adicionalmente como se describe en esta invención. Por ejemplo, el grupo alquileno de un Calcadlo o un C1-alc-heterociclilo se puede sustituir adicionalmente con un grupo oxo para producir el respectivo grupo sustituyente ariloílo y (heterociclil)oílo.
El grupo "heterociclilalquilo", que como se usa en esta invención, representa un grupo heterociclilo, como se define en esta invención, unido al grupo molecular original a través de un grupo alquileno, como se define en esta invención. Grupos heterociclialquilo no sustituidos ejemplares son de 2 a 32 carbonos (por ejemplo, de 2 a 22, de 2 a 18, de 2 a 17, de 2 a 16, de 3 a 15, de 2 a 14, de 2 a 13 o de 2 a 12 carbonos, tales como C1-6 alc-C1-12 heterociclilo, C1-10 alc-C1-12 heterociclilo, o C1-20 alc-C1-12 heterociclilo). En algunas realizaciones, el alquileno y el heterociclilo pueden estar sustituidos cada uno con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se define en esta invención para el grupo respectivo El término "hidrocarburo", como se usa en esta invención, representa un grupo que consiste únicamente en átomos de carbono e hidrógeno.
El término "hidroxi", como se usa en esta invención, representa un grupo -OH.
El término "W-amino protegido," como se usa en esta invención, se refiere a un grupo amino, como se define en esta invención, al que se une uno o dos W-grupos protectores, como se define en esta invención..
El término "W-grupo protector," como se usa en esta invención, representa aquellos grupos destinados a proteger un grupo amino contra reacciones indeseables durante los procedimientos sintéticos. Grupos W-protectores comúnmente usados son descritos en Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis," 3a Ed. (John Wiley & Sons, New York, 1999), grupos W-protectores incluyen grupos acilo, ariloílo o carbamilo como formilo, acetilo , propionilo, pivaloilo, tbutilacetilo, 2-cloroacetilo, 2-bromoacetilo, trifluoroacetilo, tricloroacetilo, ftalilo, o-nitrofenoxiacetilo, a-clorobutirilo, benzoilo, 4-clorobenzoilo, 4-bromobenzoilo, 4-nitrobenzoilo y auxiliares quirales tales como D, L o D, L-aminoácidos protegidos o no protegidos tales como alanina, leucina, fenilalanina y similares; grupos que contienen sulfonilo tales como bencenosulfonilo, p-toluenosulfonilo y similares; grupos formadores de carbamato tales como benciloxicarbonilo, p-clorobenciloxicarbonilo, p-metoxibenciloxicarbonilo, p-nitrobenciloxicarbonilo, 2-nitrobenciloxicarbonilo, pbromobenciloxicarbonilo, 3,4-dimetoxibenciloxicarbonilo, 3,5-dimetoxibenciloxicarbonilo, 2,4-dimetoxibenciloxicarbonilo, 4-metoxibenciloxicarbonilo, 2 -nitro-4,5-dimetoxibenciloxicarbonilo, 3,4,5-trimetoxibenciloxicarbonilo, 1 -(p-bifenilil)-l -metiletoxicarbonilo, a,a-dimetil-3,5-dimetoxibenciloxicarbonilo, benzhidriloxicarbonilo, t-butiloxicarbonilo, diisopropilmetoxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, etoxicarbonilo, metoxicarbonilo, aliloxicarbonilo, 2,2,2,-tricloroetoxicarbonilo, fenoxicarbonilo, 4-nitrofenoxicarbonilo, fluorenil-9-metoxicarbonilo, ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo, ciclohexiloxicarbonilo, feniltiocarbonilo y similares, grupos alcarilo tales como bencilo, trifenilmetilo, benciloximetilo y similares y grupos sililo, tales como trimetilsililo y similares. Grupos W-protectores preferidos incluyen formilo, acetilo, benzoilo, pivaloilo, t-butiloacetilo, fenilsulfonilo, bencilo (Bz), t-butoxicarbonilo (BOC) y benciloxicarbonilo (Cbz).
El término “nitro”, como se emplea en esta solicitud, se refiere a un grupo —NO2.
El término « grupoO-protector," como se usa en esta invención, representa aquellos grupos destinados a proteger un grupo que contiene oxígeno (por ejemplo, fenol, hidroxilo o carbonilo) contra reacciones indeseables durante los procedimientos sintéticos. Grupos O-protectores comúnmente usados son descritos en Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis," 3a Ed. (John Wiley & Sons, New York, 1999),. Grupos O-protectores ejemplares incluyen grupos acilo, ariloílo o carbamilo, tales como formilo, acetilo, propionilo, pivaloilo, t-butilacetilo, 2-cloroacetilo, 2-bromoacetilo, trifluoroacetilo, tricloroacetilo, ftalilo, o-nitrofenoxiacetilo, a-clorobutirilo, benzoilo, 4-clorobenzoílo, 4-bromobenzoílo, tbutildimetilsililo, tri-/so-propilsililoximetilo, 4,4'-dimetoxitritilo, isobutirilo, fenoxiacetilo, 4-isopropilfenoxiacetilo, dimetilformamidino y 4-nitrobenzoílo; grupos alquilcarbonilo, tales como acilo, acetilo, propionilo, pivaloilo y similares; grupos arilcarbonilo opcionalmente sustituidos, tales como benzoílo; grupos sililo, tales como trimetilsililo (TMS), tercbutildimetilsililo (TBDMS), triisopropilsililoximetilo (TOM), triisopropilsililo (TIPS) y similares; grupos formadores de éter con el hidroxilo, tales como metilo, metoximetilo, tetrahidropiranilo, bencilo, p-metoxibencilo, tritilo y similares; alcoxicarbonilos, tales como metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, isopropoxicarbonilo, n-isopropoxicarbonilo, nbutiloxicarbonilo, isobutiloxicarbonilo, sec-butiloxicarbonilo, t-butiloxicarbonilo, 2-etilhexiloxicarbonilo, ciclohexiloxicarbonilo, metiloxicarbonilo y similares; grupos alcoxialcoxicarbonilo, tales como metoximetoxicarbonilo, etoximetoxicarbonilo, 2-metoxietoxicarbonilo, 2-etoxietoxicarbonilo, 2-butoxietoxicarbonilo, 2-metoxietoxicarbonilo, aliloxicarbonilo, propargiloxicarbonilo, 2-butenoxicarbonilo, 3-metil-2-butenoxicarbonilo y similares; haloalcoxicarbonilos, tales como 2-cloroetoxicarbonilo, 2-cloroetoxicarbonilo, 2,2,2-tricloroetoxicarbonilo y similares; grupos arilalcoxicarbonilo opcionalmente sustituidos, tales como benciloxicarbonilo, p-metilbenciloxicarbonilo, pmetoxibenciloxicarbonilo, p-nitrobenciloxicarbonilo, 2,4-dinitrobenciloxicarbonilo, 3,5-dimetilbenciloxicarbonilo, pclorobenciloxicarbonilo, p-bromobenciloxicarbonilo, fluorenilmetiloxicarbonilo y similares; y grupos ariloxicarbonilo opcionalmente sustituidos, tales como fenoxicarbonilo, p-nitrofenoxicarbonilo, o-nitrofenoxicarbonilo, 2,4-dinitrofenoxicarbonilo, p-metilfenoxicarbonilo, m-metilfenoxicarbonilo, o-bromofenoxicarbonilo, 3,5-dimetilfenoxicarbonilo, p-clorofenoxicarbonilo, 2- cloro-4-nitrofenoxi-carbonilo y similares); éteres de alquilo, arilo y alcarilo sustituidos (p. ej., tritilo, metiltiometilo, metoximetilo, benciloximetilo, siloximetilo, 2,2,2,-tricloroetoximetilo, tetrahidropiranilo, tetrahidrofuranilo, etoxietilo, 1-[2-(trimetilsilil)etoxi]etilo, 2- trimetilsililetilo, t-butil éter, p-clorofenilo, pmetoxifenilo, p-nitrofenilo, bencilo, p-metoxibencilo y nitrobencilo); éteres de sililo (por ejemplo, trimetilsililo, trietilsililo, triisopropilsililo, dimetilisopropilsililo, t-butildimetilsililo, t-butildifenilsililo, tribencilsililo, trifenilsililo y difenimetilsililo); carbonatos (por ejemplo, metilo, metoximetilo, 9-fluorenilmetilo, etilo, 2,2,2-tricloroetilo, 2-(trimetilsilil)etilo, vinilo, alilo, nitrofenilo, bencilo, metoxibencilo, 3,4-dimetoxibencilo y nitrobencilo); grupos protectores de carbonilo (p. ej., grupos acetal y cetal, como dimetilacetal, 1,3-dioxolano y similares; grupos acilal y grupos ditiano, como 1,3-ditianos, 1,3-ditiolano y el me gusta); grupos protectores de ácido carboxílico (por ejemplo, grupos éster, tales como éster metílico, éster bencílico, éster t-butílico, ortoésteres y similares; y grupos oxazolina.
El término "oxo" como se usa en esta invención, representa =O.
El prefijo "perfluoro", como se usa en esta invención, representa cualquier grupo, como se define en esta invención, donde cada radical hidrógeno unido al grupo alquilo ha sido reemplazado por un radical fluoruro. Por ejemplo, los grupos perfluoroalquilo se ejemplifican con trifluorometilo, pentafluoroetilo y similares.
El término "hidroxilo protegido", como se usa en esta invención, se refiere a un átomo de oxígeno unido a un grupo O­ protegido.
El término "espirociclilo", como se usa en esta invención, representa un dirradical de alquileno C2-7 cuyos extremos están unidos al mismo átomo de carbono del grupo parental para formar un grupo espirocíclico, y también un dirradical heteroalquileno C1-6 ambos extremos de los cuales están unidos al mismo átomo. El radical heteroalquileno que forma el grupo espirociclilo puede contener uno, dos, tres o cuatro heteroátomos seleccionados independientemente de entre el grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre. En algunas realizaciones, el grupo espirociclilo incluye de uno a siete carbonos, excluyendo el átomo de carbono al que está unido el dirradical. Los grupos espirociclilo de la invención pueden estar opcionalmente sustituidos con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes proporcionados en esta invención como sustituyentes opcionales para cicloalquilo y/o grupos heterociclilo.
El término “sulfonil”, como se emplea en esta solicitud, se refiere a un grupo -S(O)2.
El término "tiol", como se usa en esta invención, representa un grupo -SH.
Quimera: Como se usa en esta invención, "quimera" es una entidad que tiene dos o más partes o regiones incongruentes o heterogéneas.
Polinucleótido quimérico: Como se usa en esta invención, "polinucleótidos quiméricos" son aquellos polímeros de ácido nucleico que tienen porciones o regiones que difieren en tamaño y/o patrón de modificación química, posición de modificación química, porcentaje de modificación química o población de modificación química y combinaciones de los anteriores.
Compuesto: Tal como se usa en esta invención, el término "compuesto" pretende incluir todos los estereoisómeros, isómeros geométricos, tautómeros e isótopos de las estructuras representadas.
Los compuestos descritos en esta invención pueden ser asimétricos (por ejemplo, tener uno o más estereocentros). Todos los estereoisómeros, tales como enantiómeros y diastereómeros, están destinados a menos que se indique lo contrario. Los compuestos de la presente divulgación que contienen átomos de carbono sustituidos asimétricamente pueden aislarse en formas ópticamente activas o racémicas. Se conocen en la técnica procedimientos sobre cómo preparar formas ópticamente activas a partir de materiales de partida ópticamente activos, tales como por resolución de mezclas racémicas o por síntesis estereoselectiva. Muchos isómeros geométricos de olefinas, dobles enlaces C=N y similares también pueden estar presentes en los compuestos descritos en esta invención, y todos estos isómeros estables se contemplan en la presente descripción. Los isómeros geométricos cis y trans de los compuestos de la presente divulgación se describen y pueden aislarse como una mezcla de isómeros o como formas isoméricas separadas.
Los compuestos de la presente divulgación también incluyen formas tautoméricas. Las formas tautoméricas resultan del intercambio de un enlace simple con un enlace doble adyacente y la migración concomitante de un protón. Las formas tautoméricas incluyen tautómeros prototrópicos que son estados de protonación isoméricos que tienen la misma fórmula empírica y carga total. Ejemplos de tautómeros prototrópicos incluyen pares cetona-enol, pares amidaácido imídico, pares lactama-lactima, pares amida-ácido imídico, pares enamina-imina y formas anulares donde un protón puede ocupar dos o más posiciones de un sistema heterocíclico, como, 1H- y 3H-imidazol, 1H-, 2H- y 4H-1,2,4-triazol, 1H- y 2H- isoindol y 1H- y 2H-pirazol. Las formas tautoméricas pueden estar en equilibrio o bloqueadas estéricamente en una forma mediante una sustitución apropiada.
Los compuestos de la presente divulgación también incluyen todos los isótopos de los átomos que se encuentran en los compuestos intermedios o finales. "Isótopos" se refiere a átomos que tienen el mismo número atómico pero diferentes números de masa resultantes de un número diferente de neutrones en los núcleos. Por ejemplo, los isótopos de hidrógeno incluyen tritio y deuterio.
Los compuestos y sales de la presente divulgación se pueden preparar en combinación con moléculas de agua o disolvente para formar solvatos e hidratos mediante procedimientos rutinarios.
Conservado: Tal como se usa en esta invención, el término "conservado" se refiere a nucleótidos o residuos de aminoácidos de una secuencia de polinucleótidos o secuencia de polipéptidos, respectivamente, que son los que se producen inalterados en la misma posición de dos o más secuencias que se comparan. Los nucleótidos o aminoácidos que están relativamente conservados son aquellos que se conservan entre más secuencias relacionadas que los nucleótidos o aminoácidos que aparecen en otras partes de las secuencias.
En algunas realizaciones, se dice que dos o más secuencias están "completamente conservadas" si son 100 % idénticas entre sí. En algunas realizaciones, se dice que dos o más secuencias están "altamente conservadas" si son al menos un 70 % idénticas, al menos un 80 % idénticas, al menos un 90 % idénticas o al menos un 95 % idénticas entre sí. En algunas realizaciones, se dice que dos o más secuencias están "altamente conservadas" si son aproximadamente un 70 % idénticas, aproximadamente un 80 % idénticas, aproximadamente un 90 % idénticas, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 % idénticas entre sí. . En algunas realizaciones, se dice que dos o más secuencias están "conservadas" si son al menos un 30 % idénticas, al menos un 40 % idénticas, al menos un 50 % idénticas, al menos un 60 % idénticas, al menos un 70 % idénticas, al menos 80 % idénticas, al menos 90 % idénticas o al menos 95 % idénticas entre sí. En algunas realizaciones, se dice que dos o más secuencias están "conservadas" si son aproximadamente un 30 % idénticas, aproximadamente un 40 % idénticas, aproximadamente un 50 % idénticas, aproximadamente un 60 % idénticas, aproximadamente un 70 % idénticas, aproximadamente un 80 % idénticas, aproximadamente un 90 % idénticas, aproximadamente un 95 % idénticas, aproximadamente un 98 % idénticas o aproximadamente un 99 % idénticas entre sí. La conservación de la secuencia puede aplicarse a la longitud completa de un oligonucleótido o polipéptido o puede aplicarse a una porción, región o característica del mismo.
Liberación controlada: Tal como se usa en esta invención, “ liberación controlada” se refiere a un perfil de liberación de un compuesto o composición farmacéutica que se conforma a un patrón particular de liberación para efectuar un resultado terapéutico.
Cíclico o ciclado: Tal como se usa en esta invención, el término "cíclico" se refiere a la presencia de un bucle continuo. Las moléculas cíclicas no necesitan ser circulares, solo unidas para formar una cadena ininterrumpida de subconjuntos. Las moléculas cíclicas tales como el ARN o ARNm modificado por ingeniería genética de la presente invención pueden ser conjuntos únicos o multímeros o comprender uno o más componentes de una estructura compleja o de orden superior.
Citostático: Tal como se usa en esta invención, "citostático" se refiere a inhibir, reducir, suprimir el crecimiento, la división o la multiplicación de una célula (p.ej., una célula de mamífero (p.ej., una célula humana)), bacteria, virus, hongo, protozoo, parásito, prión, o una combinación de los mismos.
Citotóxico: Tal como se usa en esta invención, "citotóxico" se refiere a matar o causar un efecto nocivo, tóxico o mortal en una célula (p.ej., una célula de mamífero (p.ej., una célula humana)), bacteria, virus, hongo, protozoo, parásito, prión, o una combinación de los mismos.
Administración: Tal como se usa en esta invención, "administración" se refiere al acto o la manera de administrar un compuesto, sustancia, entidad, fracción, carga o carga útil.
Agente de administración: Tal como se usa en esta invención, "agente de administración" se refiere a cualquier sustancia que facilite, al menos en parte, la administración in vivo de un polinucleótido, construcción primaria o ARNmm a células diana.
Inestable: Tal como se usa en esta invención, el término "inestable", "no estable" o "región inestable" significa una región o molécula que es menos estable que una forma inicial, de tipo salvaje o nativa de la misma región o molécula.
Etiqueta detectable: Tal como se usa en esta invención, "etiqueta detectable" se refiere a uno o más marcadores, señales o restos que están unidos, incorporados o asociados con otra entidad que se detecta fácilmente mediante procedimientos conocidos en la técnica que incluyen radiografía, fluorescencia, quimioluminiscencia, actividad enzimática, absorbancia y similares. Etiquetas detectables incluyen radioisótopos, fluoróforos, cromóforos, enzimas, colorantes, iones metálicos, ligandos tales como biotina, avidina, estreptavidina y haptenos, puntos cuánticos y similares. Etiquetas detectables se pueden ubicar en cualquier posición en los péptidos o proteínas descritos en esta invención. Pueden estar dentro de los aminoácidos, péptidos o proteínas, o localizados en los extremos N- o C-.
Diastereoisómero: El término "diastereoisómero", como se usa en esta invención, significa estereoisómeros que no son imágenes especulares entre sí y no se pueden superponer entre sí.
Digerir. Tal como se usa en esta invención, el término "digerir" significa romper en piezas o componentes más pequeños. Cuando se hace referencia a polipéptidos o proteínas, la digestión da como resultado la producción de péptidos.
Célula diferenciada: Tal como se usa en esta invención, el término "célula diferenciada" se refiere a cualquier célula somática que no es, en su forma nativa, pluripotente. La célula diferenciada también incluye células que están parcialmente diferenciadas.
Diferenciación: Tal como se usa en esta invención, el término "factor de diferenciación" se refiere a un factor de alteración del potencial de desarrollo tal como una proteína, ARN o molécula pequeña que puede inducir a una célula a diferenciarse a un tipo celular deseado.
Diferenciar. Tal como se usa en esta invención, "diferenciar" se refiere al procedimiento donde una célula no comprometida o menos comprometida adquiere las características de una célula comprometida.
Distal: Tal como se usa en esta invención, el término "distal" significa situado lejos del centro o lejos de un punto o región de interés.
Régimen de dosificación: Como se usa en esta invención, un "régimen de dosificación" es un programa de administración o régimen de tratamiento, profilaxis o cuidados paliativos determinado por el médico.
Factor de división de dosis (DSF)-relación de la PUD del tratamiento de división de dosis dividida por la PUD de la dosis diaria total o la dosis unitaria única. El valor se deriva de la comparación de los grupos de regímenes de dosificación.
Enantiómero: El término "enantiómero", como se usa en esta invención, significa cada forma ópticamente activa individual de un compuesto de la divulgación, que tiene una pureza óptica o exceso enantiomérico (según se determina mediante procedimientos estándar en la técnica) de al menos 80 % (es decir, al menos 90 % de un enantiómero y como máximo 10 % del otro enantiómero), preferiblemente al menos 90 % y más preferiblemente al menos 98 %. Encapsular: Tal como se usa en esta invención, el término "encapsular" significa envolver, encerrar o rodear.
Señal de escisión de proteína codificada: Tal como se usa en esta invención, "señal de escisión de proteína codificada" se refiere a la secuencia de nucleótidos que codifica una señal de escisión de proteína.
Ingeniería: Tal como se usa en esta invención, realizacionesw de la invención se "someten a ingeniería" cuando son diseñados para tener una característica o propiedad, ya sea estructural o química, que varía desde un punto de partida, una molécula silvestre o una molécula nativa.
Cantidad efectiva: Tal como se usa en esta invención, el término "cantidad efectiva" de un agente es la cantidad suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados, por ejemplo, resultados clínicos y, como tal, una "cantidad efectiva" depende del contexto donde se aplica. Por ejemplo, en el contexto de la administración de un agente que trata el cáncer, una cantidad efectiva de un agente es, por ejemplo, una cantidad suficiente para lograr el tratamiento, como se define en esta invención, del cáncer, en comparación con la respuesta obtenida sin la administración del agente.
Exosoma: Tal como se usa en esta invención, "exosoma" es una vesícula secretada por células de mamífero o un complejo involucrado en la degradación del ARN.
Expresión: Tal como se usa en esta invención, la "expresión" de una secuencia de ácido nucleico se refiere a uno o más de los eventos siguientes: (1) producción de una plantilla de ARN a partir de una secuencia de ADN (p.ej., mediante transcripción); (2) procesamiento de una transcripción de ARN (p.ej., mediante corte, edición, formación de extremo 5' y/o procesamiento de extremo 3'); (3) traducción de un ARN a un polipéptido o proteína; y (4) modificación postraduccional de un polipéptido o proteína.
Característica: Tal como se usa en esta invención, una "característica" se refiere a un rasgo, una propiedad o un elemento distintivo.
Formulación: Tal como se usa en esta invención, una "formulación" incluye al menos un polinucleótido de una VAN y un agente de administración.
Fragmento: Un "fragmento", como se usa en esta invención, se refiere a una porción. Por ejemplo, los fragmentos de proteínas pueden comprender polipéptidos obtenidos al digerir proteínas de longitud completa aisladas de células cultivadas.
Funcional: Tal como se usa en esta invención, una molécula biológica "funcional" es una molécula biológica en una forma donde exhibe una propiedad y/o actividad por la que se caracteriza.
Homología: Tal como se usa en esta invención, el término "homología" se refiere a la relación general entre moléculas poliméricas, p.ej. entre moléculas de ácido nucleico (p.ej. Moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas polipeptídicas. En algunas realizaciones, las moléculas poliméricas se consideran homólogas entre sí si sus secuencias son al menos 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % idénticas o similares. El término "homólogo" se refiere necesariamente a una comparación entre al menos dos secuencias (secuencias de polinucleótidos o polipéptidos). De acuerdo con la invención, se considera que dos secuencias de polinucleótidos son homólogas si los polipéptidos que codifican son al menos alrededor del 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o incluso 99 % para al menos un tramo. de al menos unos 20 aminoácidos. En algunas realizaciones, las secuencias de polinucleótidos homólogas se caracterizan por la capacidad de codificar un tramo de al menos 4--5 aminoácidos especificados de forma única. Para secuencias de polinucleótidos de de 60 nucleótidos de longitud, la homología se determina por la capacidad de codificar un tramo de al menos 4--5 aminoácidos especificados de forma única. De acuerdo con la invención, se considera que dos secuencias de proteínas son homologas si las proteínas son al menos aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % idénticas en al menos un tramo de al menos aproximadamente 20 aminoácidos.
Identidad: Tal como se usa en esta invención, el término "identidad" se refiere a la relación general entre moléculas poliméricas, p.ej., entre moléculas de oligonucleótidos (p.ej.,moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas polipeptídicas. El cálculo del porcentaje de identidad de dos secuencias de ácido de polinucleótidos se puede efectuar, por ejemplo, alineando las dos secuencias para una comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir espacios en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de ácido nucleico para una alineación óptima, y se pueden ignorar las secuencias no idénticas a los efectos de la comparación). En determinadas realizaciones, la longitud de una secuencia alineada con fines comparativos es de al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos menos el 95% o el 100% de la longitud de la secuencia de referencia. A continuación, se comparan los nucleótidos en posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo nucleótido que en la posición correspondiente en la segunda secuencia, a continuación, las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función de la cantidad de posiciones idénticas que comparten las secuencias, teniendo en cuenta la cantidad de espacios y la longitud de cada espacio, que es necesario introducir para la alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede obtener usando un algoritmo matemático. Por ejemplo, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar usando procedimientos tales como los que se describen en el documento Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., Ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics y Genome Projects, Smith, D. W., Ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Computer Analysis de Sequence Data, Part I, Griffin, A. M. y Griffin, H. G., Ed., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., Ed., M Stockton Press, Nueva York, 1991. Por ejemplo, es posible determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos usando el algoritmo de Meyers y Miller (CABIOS, 1989, 4:11-17), el cual se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) mediante el uso de una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de espacio de 12 y una penalización de espacio de 4. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede determinarse, de manera alternativa, usando el programa GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz NWSgapdna.CMP. Los procedimientos comúnmente empleados para determinar el porcentaje de identidad entre secuencias incluyen, entre otros, aquellos descritos en Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988); Las técnicas para determinar la identidad están codificadas en programas informáticos disponibles públicamente. Software informático ejemplar para determinar la homología entre dos secuencias incluyen, entre otros, el paquete de programa GCG, Devereux y col, Nucleic Acids Research, 12(1), 387( 1984, BLASTP, BLASTN, y FASTA, Altschul, S. F. y col., J. Molec. Biol., 215, 403 (1990)).
Agente infeccioso: Como se usa en esta invención, la frase "agente infeccioso" significa un agente capaz de producir una infección en un organismo, por ejemplo, en un animal. Un agente infeccioso puede referirse a cualquier microorganismo, virus, sustancia infecciosa o producto biológico que pueda ser diseñado como resultado de la biotecnología, o cualquier componente natural o de bioingeniería de cualquier microorganismo, virus, sustancia infecciosa o producto biológico que pueda causar Enfermedad emergente y contagiosa, muerte u otro mal funcionamiento biológico en un ser humano, un animal, una planta u otro organismo vivo.
Inhibir la expresión de un gen: Tal como se usa en esta invención, la frase "inhibir la expresión de un gen" significa provocar una reducción en la cantidad de un producto de expresión del gen.: El producto de expresión puede ser un ARN transcrito del gen (p.ej., un ARNm) o un polipéptido traducido de un ARNm transcrito del gen. Normalmente, una reducción en el nivel de un ARNm da como resultado una reducción en el nivel de un polipéptido traducido del mismo. El nivel de expresión se puede determinar usando técnicas estándar para medir ARNm o proteína.
Influenza: Como se usa en esta invención, "influenza" o "gripe" es una enfermedad infecciosa de aves y mamíferos causada por virus de ARN de la familia Orthomyxoviridae, los virus de la influenza.
Isómero: El término "isómero", como se usa en esta invención, significa cualquier tautómero, estereoisómero, enantiómero o diastereómero de cualquier compuesto de la divulgación. Se reconoce que los compuestos de la invención pueden tener uno o más centros quirales y/o dobles enlaces y, por lo tanto, existen como estereoisómeros, tales como isómeros de doble enlace (es decir, isómeros geométricos E/Z) o diastereómeros (p. ej., enantiómeros (es decir, (+) o (-)) o isómeros cis/trans). Según la invención, las estructuras químicas representadas en esta invención, y por lo tanto los compuestos de la divulgación, abarcan todos los estereoisómeros correspondientes, es decir, tanto la forma estereoméricamente pura (por ejemplo, geométricamente pura, enantioméricamente pura o diastereoméricamente pura) como enantiomérica y mezclas estereoisoméricas, por ejemplo, racematos. Las mezclas enantioméricas y estereoisoméricas de compuestos de la invención pueden resolverse típicamente en sus componentes enantiómeros o estereoisómeros mediante procedimienrtos bien conocidos, tales como cromatografía de gases en fase quiral, cromatografía líquida de alta resolución en fase quiral, cristalización del compuesto como un complejo de sal quiral, o cristalizar el compuesto en un disolvente quiral. Los enantiómeros y estereoisómeros también se pueden obtener a partir de intermedios, reactivos y catalizadores estereomérica o enantioméricamente puros mediante procedimientos sintéticos asimétricos bien conocidos.
In vitro: Tal como se usa en esta invención, el término "in vitro" se refiere a eventos que se producen en un ambiente artificial, por ejemplo, en un tubo de ensayo o recipiente de reacción, en un cultivo celular, en una placa de Petri, etc., en lugar de dentro de un organismo (p.ej., animal, planta, o microbio).
In vivo: Tal como se usa en esta invención, el término "in vivo" se refiere a eventos que se producen dentro de un organismo (por ejemplo, animal, planta o microbio o célula o tejido del mismo).
Aislado: Tal como se usa en esta invención, el término "aislado" hace referencia a una sustancia o entidad que ha sido separada de al menos algunos de los componentes con los cuales estuvo asociada (ya sea naturalmente o en condiciones experimentales). Las sustancias aisladas pueden tener niveles variables de pureza en referencia a las sustancias desde las cuales han sido asociadas. Sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse de al menos alrededor del 10, alrededor del 20, alrededor del 30, alrededor del 40, alrededor del 50, alrededor del 60, alrededor del 70, alrededor del 80, alrededor del 90 % o más de otros componentes a los cuales estuvieron inicialmente asociadas. En algunas realizaciones, los agentes aislados son más de aproximadamentel 80, aproximadamentel 85, aproximadamentel 90, aproximadamentel 91, aproximadamentel 92, aproximadamentel 93, aproximadamentel 94, aproximadamentel 95, aproximadamentel 96, aproximadamentel 97, aproximadamentel 98, aproximadamentel 99 % o más de aproximadamentel 99 % puros. Como se usa en esta invención, una sustancia es "pura" si está sustancialmente libre de otros componentes.Sustancialmente aislado: Por "sustancialmente aislado" se entiende que el compuesto está sustancialmente separado del entorno donde se formó o detectó. La separación parcial puede incluir, por ejemplo, una composición enriquecida en el compuesto de la presente divulgación. La separación sustancial puede incluir composiciones que contienen al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 97 % o al menos aproximadamente el 99 % en peso del compuesto de la presente divulgación, o una sal del mismo. Los procedimientos para aislar compuestos y sus sales son habituales en la técnica.
Polinucleótido IVT: Como se usa en esta invención, un "polinucleótido IVT" es un polinucleótido lineal que puede prepararse usando procedimientos de síntesis enzimática de transcripción in vitro (IVT).
Enlazador: Tal como se usa en esta invención, un enlazador se refiere a un grupo de átomos, por ejemplo, 10--1.000 átomos, y puede estar comprendido por átomos o grupos tales como, pero no limitado a, carbono, amino, alquilamino, oxígeno, azufre, sulfóxido, sulfonilo, carbonilo e imina. El enlazador se puede unir a un nucleósido o nucleótido modificado en la nucleobase o resto de azúcar en un primer extremo, y a una carga útil, por ejemplo, un agente detectable o terapéutico, en un segundo extremo. El enlazador puede tener una longitud suficiente para no interferir con la incorporación en una secuencia de ácido nucleico. El enlazador se puede usar para cualquier propósito útil, como para formar multímeros de polinucleótidos (p. ej., mediante el enlace de dos o más moléculas de polinucleótidos quiméricos o polinucleótidos IVT) o conjugados de polinucleótidos, así como para administrar una carga útil, como se describe en esta invención. Los ejemplos de grupos químicos que se pueden incorporar en el enlazador incluyen, pero no se limitan a, alquilo, alquenilo, alquinilo, amido, amino, éter, tioéter, éster, alquileno, heteroalquileno, arilo o heterociclilo, cada uno de los cuales puede ser opcionalmente sustituido, como se describe en esta invención. Ejemplos de enlazadores incluyen, entre otros, alcanos insaturados, polietilenglicoles (por ejemplo, conjuntos monoméricos de etilenglicol o propilenglicol, por ejemplo, dietilenglicol, dipropilenglicol, trietilenglicol, tripropilenglicol, tetraetilenglicol o tetraetilenglicol) y dextrano. polímeros y derivados de los mismos. Otros ejemplos incluyen, entre otros, restos escindibles dentro del enlazador, como, por ejemplo, un enlace disulfuro (-SS-) o un enlace azo (-N=N-), que pueden ser escindido usando un agente reductor o fotólisis. Los ejemplos no limitantes de un enlace selectivamente escindible incluyen un enlace amido que se puede escindir, por ejemplo, mediante el uso de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) u otros agentes reductores, y/o fotólisis, así como un enlace éster puede ser escindido, por ejemplo, mediante hidrólisis ácida o básica.
Sitio de unión de microARN: Tal como se usa en esta invención, un sitio de unión de microARN (miARN) representa una ubicación o región de nucleótidos de una transcripción de ácido nucleico a la que se une al menos la región "semilla" de un miARN.
Modificado: Tal como se usa en esta invención, "modificado" se refiere a un estado o estructura cambiada de una molécula de la invención. Las moléculas pueden modificarse de muchas maneras, incluso química, estructural y funcionalmente. En una realización, las moléculas de ARNm de la presente invención se modifican mediante la introducción de nucleósidos no naturales y/o nucleótidos, por ejemplo, en lo que se refiere a los ribonucleótidos naturales A, U, G y C. Los nucleótidos no canónicos, como las estructuras de extremo, no se consideran "modificados", aunque difieren de la estructura química de los ribonucleótidos A, C, G, U.
Moco: Tal como se usa en esta invención, "moco" se refiere a la sustancia natural que es viscosa y comprende glicoproteínas de mucina.
De origen natural: Tal como se usa en esta invención, "de origen natural" significa que existe en la naturaleza sin ayuda artificial.
Anticuerpo neutralizante: Como se usa en esta invención, un "anticuerpo neutralizante" se refiere a un anticuerpo que se une a su antígeno y defiende una célula de un antígeno o agente infeccioso neutralizando o aboliendo cualquier actividad biológica que tenga.
Vertebrado no humano: Tal como se usa en esta invención, un "vertebrado no humano" incluye todos los vertebrados excepto el Homo sapiens, incluidas las especies silvestres y domesticadas. Ejemplos de vertebrados no humanos incluyen, entre otros, mamíferos, como alpaca, banteng, bisonte, camello, gato, ganado, venado, perro, burro, gayal, cabra, cobaya, caballo, llama, mula, cerdo, conejo, reno, búfalo de agua, oveja y yak.
Vacuna de ácido nucleico: Como se usa en esta invención, "vacuna de ácido nucleico" o "VAN" o "composición de VAN" se refiere a una vacuna o composición de vacuna que incluye un ácido nucleico o molécula de ácido nucleico (p.ej., un polinucleótido) que codifica un antígeno ( p. ej., una proteína o polipéptido antigénico.) En aspectos ejemplares, una vacuna de ácido nucleico o VAN incluye una molécula de polinucleótido ribonucleico ("ARN"), ácido ribonucleico ("ARN") o ácido ribonucleico ("ARN"). Tales aspectos pueden denominarse vacunas de ácido ribonucleico ("ARN") (RVAN). En aspectos preferidos, una vacuna de ácido nucleico o VAN incluye un polinucleótido de ARN mensajero ("ARNm"), a Rn mensajero ("ARNm") o molécula de ARN mensajero ("ARNm") como se describe en detalle en esta invención. Tales aspectos pueden denominarse vacunas de ARN mensajero ("ARNm") (ARNm).
Fuera de diana: Tal como se usa en esta invención, "fuera del diana" se refiere a cualquier efecto no intencionado sobre una o más dianas, genes o transcripciones celulares.
Marco de lectura abierto: Como se usa en esta invención, el término "marco de lectura abierto" u "ORF" se refiere a una secuencia de polinucleótidos continua, por ejemplo, una secuencia de ADN o secuencia de ARN (por ejemplo, una secuencia de ARNm), que comprende un codón de inicio, un región que comprende una pluralidad de codones que codifican aminoácidos y un codón de parada en extremo, donde la región que comprende la pluralidad de codones que codifican aminoácidos no contiene codones de terminación.
Unido operativamente: Tal como se usa en esta invención, la frase "unido operativamente" se refiere a una conexión funcional entre dos o más moléculas, construcciones, transcripciones, entidades, restos o similares.
Opcionalmente sustituido: En esta invención, una frase de la forma "X opcionalmente sustituido" (por ejemplo, alquilo opcionalmente sustituido) pretende ser equivalente a "X, donde X está opcionalmente sustituido" (por ejemplo, "alquilo, donde dicho alquilo está opcionalmente sustituido"). No se pretende que signifique que la característica "X" (p.ej. alquilo) per se sea opcional.
Parte: Como se usa en esta invención, una "parte" o "región" de un polinucleótido se define como cualquier porción del polinucleótido que sea menor que la longitud total del polinucleótido.
Péptido: Tal como se usa en esta invención, "péptido" tiene una longitud menor o igual a 50 aminoácidos, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoácidos de longitud.
Paratopo: Tal como se usa en esta invención, un "paratopo" se refiere al sitio de unión al antígeno de un anticuerpo.
Paciente: Tal como se usa en esta invención, "paciente" se refiere a un sujeto que puede buscar o necesitar tratamiento, que requiere tratamiento, está recibiendo tratamiento, recibirá tratamiento o un sujeto que está bajo el cuidado de un profesional capacitado para una enfermedad o afección particular.
Farmacéuticamente aceptable: La frase “farmacéuticamente aceptable” se emplea en esta invención para referirse a los compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance de un criterio médico sensato, son adecuados para su uso en contacto con tejidos humanos y animales sin provocar una toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otros problemas o complicaciones, con una relación beneficio/riesgo correspondiente razonable.
Excipiente farmacéuticamente aceptable: La frase "excipiente farmacéuticamente aceptable", como se usa en esta invención, se refiere a cualquier ingrediente distinto de los compuestos descritos en esta invención (por ejemplo, un vehículo capaz de suspender o disolver el compuesto activo) y que tiene las propiedades de ser sustancialmente no tóxico y no inflamatorio en un paciente. Los excipientes pueden incluir, por ejemplo: antiadherentes, antioxidantes, aglutinantes, recubrimientos, auxiliares de compresión, desintegrantes, colorantes (colores), emolientes, emulsionantes, rellenos (diluyentes), formadores de película o recubrimientos, saborizantes, fragancias, deslizantes (potenciadores de flujo), lubricantes, conservantes, impresión. tintas, sorbentes, agentes de suspensión o dispersantes, edulcorantes y aguas de hidratación. Excipientes ejemplares incluyen, entre otros: hidroxitolueno butilado (BHT), carbonato de calcio, fosfato de calcio (dibásico), estearato de calcio, croscarmelosa, polivinilpirrolidona reticulada, ácido cítrico, crospovidona, cisteína, etilcelulosa, gelatina, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, lactosa, estearato de magnesio, maltitol, manitol, metionina, metilcelulosa, metilparabeno, celulosa microcristalina, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, povidona, almidón pregelatinizado, propilparabeno, palmitato de retinilo, goma laca, dióxido de silicio, carboximetilcelulosa sódica, citrato de sodio, glicolato de almidón de sodio, sorbitol, almidón (de maíz), ácido esteárico, sacarosa, talco, dióxido de titanio, vitamina A, vitamina E, vitamina C y xilitol.
Sales farmacéuticamente aceptables: La presente divulgación también incluye sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en esta invención. Tal como se usa en esta invención, "sales farmacéuticamente aceptables" hace referencia a derivados de los compuestos descritos donde se modifica el compuesto principal al convertir un resto básico o ácido existente en su forma de sal (por ejemplo, haciendo reaccionar el grupo de base libre con un ácido orgánico adecuado). Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otros, sales de ácidos minerales u orgánicos de residuos básicos tales como aminas; sales alcalinas u orgánicas de residuos ácidos tales como ácidos carboxílicos; y similares. Las sales de adición ácida representativas incluyen sales de acetato, adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidroxibromuro, hidroxicloruro, hidroyoduro, 2-hidroxi-etanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, sulfato de laurilo, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, toluenosulfonato, undecanoato, valerato y similares. Las sales representativas de metales alcalinos o alcalinotérreos incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares, así como también cationes de amonio, amonio cuaternario y amina no tóxicos, incluyendo, entre otros, amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, etilamina y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente descripción incluyen las sales no tóxicas convencionales del compuesto precursor formadas, por ejemplo, a partir de ácidos inorgánicos u orgánicos no tóxicos. Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente descripción se pueden sintetizar a partir del compuesto principal que contiene un resto ácido o básico mediante procedimientos químicos convencionales. Generalmente, dichas sales pueden prepararse haciendo reaccionar las formas de ácido o base libre de estos compuestos con la base o ácido adecuados en agua o en un solvente orgánico, o en una mezcla de los dos; generalmente, se prefieren los medios no acuosos, tales como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Listas de sales adecuadas se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, pág.
1418, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P.H. Stahl y C.G. Wermuth (ed.), Wiley-VCH, 2008, y Berge y col., Journal de Pharmaceutical Science, 66, 1--19 (1977).
Solvato farmacéuticamente aceptable: El término "solvato farmacéuticamente aceptable", tal como se usa en esta invención, significa un compuesto de la divulgación donde se incorporan moléculas de un disolvente adecuado en la red cristalina.: Un disolvente adecuado es fisiológicamente tolerable a la dosis administrada. Por ejemplo, los solvatos se pueden preparar mediante cristalización, recristalización o precipitación a partir de una solución que incluye disolventes orgánicos, agua o una mezcla de los mismos. Ejemplos de disolventes adecuados son etanol, agua (por ejemplo, mono, di y trihidratos), N-metilpirrolidinona (NMP), dimetil sulfóxido (DMSO), N,N'-dimetilformamida (DMF), N,N'-dimetilacetamida (DMAC), 1,3-dimetil-2-imidazolidinona (DMEU), 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2-(1H)-pirimidinona (DMPU), acetonitrilo (ACN), propilenglicol, acetato de etilo, alcohol bencílico, 2-pirrolidona, benzoato de bencilo, y similares. Cuando el agua es el disolvente, el solvato se denomina "hidrato".
Farmacocinética: Tal como se usa en esta invención, "farmacocinética" se refiere a una o más propiedades de una molécula o compuesto en lo que se refiere a la determinación del destino de las sustancias administradas a un organismo vivo. La farmacocinética se divide en varias áreas que incluyen el grado y la velocidad de absorción, distribución, metabolismo y excreción. Esto se conoce comúnmente como ADME donde: (A) Absorción es el procedimiento de una sustancia que ingresa a la circulación sanguínea; (D) Distribución es la dispersión o diseminación de sustancias por los fluidos y tejidos del cuerpo; (M) Metabolismo (o biotransformación) es la transformación irreversible de compuestos parentales en metabolitos hijos; y (E) Excreción (o eliminación) se refiere a la eliminación de las sustancias del cuerpo. En casos raros, algunos fármacos se acumulan irreversiblemente en el tejido corporal.
Fisicoquímica: Tal como se usa en esta invención, "fisicoquímica" significa o se relaciona con una propiedad física y/o química.:
Polipéptido por conjunto de fármaco (PUD):Como se usa en esta invención, un PUD o producto por conjunto de fármaco, se define como una porción subdividida de la dosis diaria total, generalmente 1 mg, pg, kg, etc., de un producto (como un polipéptido) medido en fluidos o tejidos corporales. , generalmente definido en concentración como pmol/mL, mmol/mL, etc dividido por la medida en el líquido corporal.
Prevenir. Como se usa en esta invención, el término "prevenir" se refiere a retrasar parcial o completamente la aparición de una infección, enfermedad, trastorno y/o afección; retrasar parcial o completamente la aparición de uno o más síntomas, características o manifestaciones clínicas de una infección, enfermedad, trastorno y/o afección particular; retrasar parcial o completamente la aparición de uno o más síntomas, características o manifestaciones de una infección, enfermedad, trastorno y/o afección particular; retrasar parcial o completamente la progresión de una infección, una enfermedad, trastorno y/o afección particular; y/o disminuir el riesgo de desarrollar patología asociada con la infección, la enfermedad, trastorno y/o afección.
Profármaco: La presente divulgación también incluye profármacos de los compuestos descritos en esta invención. Como se usa en esta invención, "profármacos" se refiere a cualquier sustancia, molécula o entidad que se encuentra en una forma predicada para que esa sustancia, molécula o entidad actúe como terapéutica tras una alteración química o física. Los profármacos pueden unirse covalentemente o secuestrarse de alguna manera y liberan o se convierten en el resto de fármaco activo antes, durante o después de su administración a un sujeto mamífero. Los profármacos se pueden preparar modificando grupos funcionales presentin vivo, a los compuestos parentales. es en los compuestos de tal manera que las modificaciones se escinden, ya sea en la manipulación rutinaria o in vivo, a los compuestos parentales. Los profármacos incluyen compuestos en los que los grupos hidroxilo, amino, sulfhidrilo o carboxilo están unidos a cualquier grupo que, cuando se administra a un sujeto mamífero, se escinde para formar un grupo hidroxilo, amino, sulfhidrilo o carboxilo libre, respectivamente. La preparación y uso de profármacos se discute en T. Higuchi y V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems," Vol. 14 de la A.C.S. Symposium Series, y en Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987, .
Proliferar: Como se usa en esta invención, el término "proliferar" significa crecer, expandirse o aumentar o hacer crecer, expandirse o aumentar rápidamente. "Proliferativo" significa tener la capacidad de proliferar. "Antiproliferativo" significa que tiene propiedades contrarias o inapropiadas a las propiedades proliferativas.
Profiláctico: Como se usa en esta invención, "profiláctico" se refiere a un tratamiento o curso de acción usado para impedir la propagación de una enfermedad.
Profilaxis: Como se usa en esta invención, una "profilaxis" se refiere a una medida tomada para mantener la salud e impedir la propagación de enfermedades. Una "profilaxis inmune" se refiere a una medida para producir inmunidad activa o pasiva para impedir la propagación de una enfermedad.
Sitio de escisión de proteínas: Tal como se usa en esta invención, "sitio de escisión de proteínas" se refiere a un sitio donde se puede lograr la escisión controlada de la cadena de aminoácidos por medios químicos, enzimáticos o fotoquímicos.
Señal de escisión de proteínas: Tal como se usa en esta invención, "señal de escisión de proteínas" se refiere a al menos un aminoácido que marca o señala un polipéptido para la escisión.
Proteína de interés: Como se usa en esta invención, los términos "proteínas de interés" o "proteínas deseadas" incluyen los proporcionados en esta invención y fragmentos, mutantes, variantes y alteraciones de los mismos.
Proximal: Tal como se usa en esta invención, el término "proximal" significa situado más cerca del centro o a un punto o región de interés.
Pseudouridina: Como se usa en esta invención, pseudouridina se refiere al isómero C-glucósido del nucleósido uridina. Un "análogo de pseudouridina" es cualquier modificación, variante, isoforma o derivado de pseudouridina. Por ejemplo, los análogos de pseudouridina incluyen pero no se limitan a 1-carboximetil-pseudouridina, 1-propinil-pseudouridina, 1-taurinometil-pseudouridina, 1-taurinometil-4-tio-pseudouridina, 1-metilpseudouridina (m1^ , 1- metil-4-tiopseudouridina (m1s4^ ), 4-tio-1-metil-pseudouridina, 3-metil-pseudouridina (m3^ ), 2-tio-1-metil-pseudouridina, 1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina, dihidropseudouridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-metoxiuridina, 2-metoxi-4-tio-uridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4- metoxi-2-tio-pseudouridina, N1-metil-pseudouridina, 1-metil-3-(3-amino-3-carboxipropil) pseudouridina (acp3^ ) y 2-O-metil-pseudouridina (^m).
Purificado: Como se usa en esta invención, "purificar", "purificado", "purificación" significa hacer sustancialmente puro o claro a partir de componentes no deseados, contaminación del material, mezcla o imperfección.
Transfección repetida: Como se usa en esta invención, el término "transfección repetida" se refiere a la transfección del mismo cultivo celular con un polinucleótido, construcción primaria o ARNm una pluralidad de veces. El cultivo celular se puede transfectar al menos dos veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 11 veces, al menos 12 veces, al menos 13 veces, al menos 14 veces, al menos 15 veces, al menos 16 veces, al menos 17 veces al menos 18 veces, al menos 19 veces, al menos 20 veces, al menos al menos 25 veces, al menos 30 veces, al menos 35 veces, al menos 40 veces, al menos 45 veces, al menos 50 veces o más.
Muestra: Como se usa en esta invención, el término "muestra" o "muestra biológica" se refiere a un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes (por ejemplo, fluidos corporales, que incluyen, entre otros, sangre, moco, líquido linfático, líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo, saliva, líquido amniótico, sangre del cordón amniótico, orina, líquido vaginal y semen). Una muestra puede incluir además un homogeneizado, lisado o extracto preparado a partir de un organismo completo o un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes, o una fracción o porción de los mismos, incluyendo pero no limitado a, por ejemplo, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, las secciones externas de la piel, tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, glóbulos, tumores, órganos. Una muestra se refiere además a un medio, como un caldo o gel nutritivo, que puede contener componentes celulares, como proteínas o molécula de ácido nucleico.
Secuencias señal: Como se usa en esta invención, la frase "secuencias señal" se refiere a una secuencia que puede dirigir el transporte o la localización de una proteína.
Dosis unitaria única: Tal como se usa en esta invención, una "dosis unitaria única" es una dosis de cualquier terapéutico administrado en una dosis/en un momento/vía única/punto único de contacto, es decir, evento de administración única.
Similaridad: Tal como se usa en esta invención, el término "similaridad" se refiere a la relación general entre moléculas poliméricas, p.ej. entre moléculas de polinucleótidos (e.g. Moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas polipeptídicas. El cálculo del porcentaje de similitud de moléculas poliméricas entre sí se puede realizar de la misma manera que el cálculo del porcentaje de identidad, excepto que el cálculo del porcentaje de similitud tiene en cuenta las sustituciones conservadoras como se entiende en la técnica.
Dosis dividida: Tal como se usa en esta invención, una "dosis dividida" es la división de la dosis unitaria única o la dosis diaria total en dos o más dosis.
Estable: Como se usa en esta invención, "estable" se refiere a un compuesto que es suficientemente robusto para sobrevivir al aislamiento hasta un grado útil de pureza de una mezcla de reacción, y preferiblemente capaz de formularse en un agente terapéutico efectiva.
Estabilizado: Tal como se usa en esta invención, el término "estabilizar", "estabilizado", "región estabilizada" significa hacer o volverse estable.
Estereoisómero: El término "estereoisómero", como se usa en esta invención, se refiere a todas las posibles formas isoméricas y conformacionales diferentes que puede poseer un compuesto (por ejemplo, un compuesto de cualquier fórmula descrita en esta invención), en particular todas las formas estereoquímicas y conformacionalmente isoméricas posibles, todos los diastereómeros, enantiómeros y/o confórmeros de estructura molecular básica. Algunos compuestos de la presente divulgación pueden existir en diferentes formas tautoméricas, todas las últimas incluidas dentro del alcance de la presente invención.
Sujeto: Tal como se usa en esta invención, el término “sujeto” o "paciente" hace referencia a cualquier organismo al que se pueda administrar una composición según la invención, por ejemplo, con fines experimentales, diagnósticos, profilácticos, y/o terapéuticos. Los sujetos típicos incluyen animales (por ejemplo, mamíferos tales como ratones, ratas, conejos, primates no humanos y humanos) y/o plantas.
Sustancialmente: Tal como se usa en esta invención, el término "sustancialmente" se refiere a la condición cualitativa de mostrar una medida o grado total, o casi total, de una característica o propiedad de interés. Un experto en la materia biológica comprenderá que los fenómenos biológicos y químicos en raras ocasiones, si es que ocurre, se completan y/o llegan a completarse o logran o evitan un resultado absoluto. El término "sustancialmente" se usa en esta invención, por lo tanto, para capturar la posible falta de compleción inherente a muchos fenómenos biológicos y químicos.
Sustancialmente igual: Tal como se usa en esta invención en relación con las diferencias de tiempo entre dosis, el término significa más/menos 2 %.
Sustancialmente simultáneamente: Tal como se usa en esta invención y en lo que se refiere a una pluralidad de dosis, el término significa dentro de 2 segundos.
Que padece: Un individuo "que padece" una enfermedad, trastorno y/o afección ha sido diagnosticado y/o presenta uno o más síntomas de una enfermedad, trastorno y/o afección.
Susceptible a: Una persona que es "susceptible a" una enfermedad, trastorno o afección no ha sido diagnosticada o puede no presentar síntomas de la enfermedad, trastorno o afección, pero tiene una propensión a desarrollar una enfermedad o sus síntomas. En algunas realizaciones, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección (por ejemplo, cáncer) puede caracterizarse por uno o más de los siguientes: (1) una mutación genética asociada con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección; (2) un polimorfismo genético asociado con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección; (3) expresión y/o actividad aumentada y/o disminuida de una proteína y/o ácido nucleico asociado con la enfermedad, trastorno y/o afección; (4) hábitos y/o estilos de vida asociados con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección; (5) antecedentes familiares de la enfermedad, trastorno y/o afección; y (6) exposición y/o infección con un microbio asociado con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección. En algunas realizaciones, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección desarrollará la enfermedad, trastorno y/o afección. En algunas realizaciones, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección no desarrollará la enfermedad, trastorno y/o afección.
Liberación sostenida: Tal como se usa en esta invención, “ liberación sostenida” se refiere a un perfil de liberación de un compuesto o composición farmacéutica que se conforma a una velocidad de liberación durante un período específico de tiempo.
Sintético: El término "sintético" significa producido, preparado y/o fabricado por la mano del hombre. La síntesis de polinucleótidos o polipéptidos u otras moléculas de la presente divulgación puede ser química o enzimática.
Vacuna: Como se usa en esta invención, una vacuna es un compuesto o composición que comprende al menos un polinucleótido que codifica al menos un antígeno.
Células diana: Tal como se usa en esta invención, "células diana" se refiere a una o más células de interés. Las células se pueden encontrar in vitro, in vivo, in situ o en el tejido u órgano de un organismo. El organismo puede ser un animal, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano y lo más preferiblemente un paciente.
Agente terapéutico: El término "agente terapéutico" se refiere a cualquier agente que, tras ser administrado a un sujeto, tiene un efecto terapéutico, diagnóstico y/o profiláctico, y/o produce un efecto farmacológico y/o biológico deseado.
Cantidad terapéuticamente efectiva: Tal como se usa en esta invención, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" significa una cantidad de un agente a administrar (p.ej., ácido nucleico, fármaco, agente terapéutico, agente de diagnóstico, agente profiláctico, etc.) que es suficiente, cuando se administra. a un sujeto que padece o es susceptible a una infección, enfermedad, trastorno y/o afección, para tratar, mejorar los síntomas, diagnosticar, impedir y/o retrasar la aparición de la infección, enfermedad, trastorno y/o afección.
Resultado terapéuticamente efectivo: Tal como se usa en esta invención, el término "resultado terapéuticamente efectiva" significa un resultado que es suficiente en un sujeto que padece o es susceptible a una infección, enfermedad, trastorno y/o afección, para tratar, mejorar los síntomas de, diagnosticar, impedir y/o retrasar la aparición de la infección, enfermedad, trastorno y/o afección.
Dosis diaria total: Tal como se usa en esta invención, una "dosis diaria total" es una cantidad administrada o prescrita en un período de 24 horas. Puede administrarse como una dosis unitaria única.
Factor de transcripción: Como se usa en esta invención, el término "factor de transcripción" se refiere a una proteína de unión al ADN que regula la transcripción del ADN en ARN, por ejemplo, mediante la activación o represión de la transcripción. Algunos factores de transcripción efectúan la regulación de la transcripción por sí solos, mientras que otros actúan en conjunto con otras proteínas. Algún factor de transcripción puede activar y reprimir la transcripción bajo ciertas condiciones. En general, los factores de transcripción se unen a una secuencia o secuencias diana específicas muy similares a una secuencia consenso específica en una región reguladora de un gen diana. Los factores de transcripción pueden regular la transcripción de un gen diana solo o en un complejo con otras moléculas.
Transcripción: Tal como se usa en esta invención, el término "transcripción" se refiere a procedimientos para introducir ácidos nucleicos exógenos en una célula. Los procedimientos de transfección incluyen, pero no se limitan a, procedimientos químicos, tratamientos plísicos y lípidos catiónicos o mezclas.
Traducción: Como se usa en esta invención, "traducción" es el procedimiento mediante el cual una molécula de polinucleótido es procesada por un ribosoma o maquinaria de tipo ribosómico, por ejemplo, celular o artificial, para producir un péptido o polipéptido.
Transcripción: Como se usa en esta invención, "transcripción" es el procedimiento mediante el cual una molécula de polinucleótido es procesada por una polimerasa u otra enzima para producir un polinucleótido, por ejemplo, un polinucleótido de ARN.
Tratar: Tal como se usa en esta invención, el término "tratar" se refiere a aliviar, mejorar, inhibir, prevenir, retrasar el inicio de, reducir la gravedad y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de una infección, enfermedad, trastorno y/o afección particular. El tratamiento puede administrarse a un sujeto que no muestra signos de una enfermedad, trastorno y/o afección, y/o a un sujeto que muestra únicamente síntomas iniciales de la enfermedad, trastorno y/o afección, con el fin de disminuir el riesgo de desarrollar patologías asociadas con la enfermedad, trastorno y/o afección.
Sin modificar. Tal como se usa en esta invención, "sin modificar" se refiere a cualquier sustancia, compuesto o molécula antes de ser cambiado de alguna manera. Sin modificar puede, pero no siempre, referirse al tipo salvaje o la forma nativa de una biomolécula. Las moléculas pueden sufrir una serie de modificaciones mediante las cuales cada molécula modificada puede servir como la molécula de partida "no modificada" para una modificación posterior.
Vacuna: Como se usa en esta invención, la frase "vacuna" se refiere a una preparación biológica que mejora la inmunidad en el contexto de una enfermedad, trastorno o afección particular.
Proteína viral: Como se usa en esta invención, la "proteína viral" en fase significa cualquier proteína que se origine a partir de un virus.
Equivalentes y alcance
Los expertos en la materia reconocerán o serán capaces de determinar, usando nada más que los experimentos de rutina, muchos equivalentes de realizaciones específicas según la descripción proporcionada en esta invención. No se pretende limitar el alcance de la presente invención a la descripción anterior, sino que el mismo se establece en las reivindicaciones adjuntas.
En las reivindicaciones, los artículos tales como "un", "uno(a)" y "el(la)" pueden significar uno o más a menos que se indique lo contrario o resulte evidente de otro modo a partir del contexto. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen "o" entre uno o más miembros de un grupo se consideran cumplidas si uno, más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes, se emplean, o de otro modo son relevantes para un producto o procedimiento dado, a menos que se indique lo contrario o que sea evidente de otra modo a partir del contexto. La invención incluye realizaciones donde exactamente un miembro del grupo está presente, se emplea o de otro modo es relevante para un producto o procedimiento dado. La invención incluye realizaciones donde más de uno o todos los miembros del grupo están presentes, se emplean o son de otro modo relevantes para un producto o procedimiento dado.
Cabe señalar también que la expresión "que comprende" pretende ser abarcativa y permite, aunque no exige, la inclusión de elementos o etapas adicionales. En esta invención, cuando se usa la expresión "que comprende", por consiguiente, se abarca y se describe también la expresión "que consiste en".
Cuando se proporcionan intervalos, se incluyen criterios de valoración. Además, se debe entender que, a menos que se indique lo contrario, o sea evidente de otro modo mediante el contexto y el entendimiento de un experto en la materia, los valores que se expresan como intervalos pueden adoptar cualquier valor o subintervalo específico dentro de los intervalos establecidos en las diferentes realizaciones de la invención, hasta una décima parte de la conjunto del extremo inferior del intervalo, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
No se pretende que los encabezados de tablas y secciones sean taxativos.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Fabricación de polinucleótidos
Según la presente invención, la fabricación de polinucleótidos y / o partes o regiones de los mismos se puede lograr utilizando los procedimientos enseñados en USSN 61/800,049 depositada el 15 de marzo de 2013 titulada "Manufacturing Methods for Production of RNA T ranscripts".
Los procedimientos de purificación pueden incluir los enseñados en la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No.
61/799.872, Solicitud de patente provisional de EE. UU. No. 61/794.842, Solicitud de patente provisional de EE. UU.
61/800,326, cada una de los cuales se incorpora en esta invención como referencia en su totalidad.
Los procedimientos de detección y caracterización de los polinucleótidos se pueden realizar como se enseña en la Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. 61/799.780 y Solicitud de patente provisional de EE. UU. No 61/798.945,.
La caracterización de los polinucleótidos de la invención se puede lograr usando un procedimiento seleccionado de entre el grupo que consiste en mapeo de polinucleótidos, secuenciación de transcriptasa inversa, análisis de distribución de carga y detección de impurezas de ARN, en donde la caracterización comprende determinar la secuencia de transcripción de ARN, determinando la pureza de la Transcripción de ARN, o determinación de la heterogeneidad de carga de la transcripción de ARN. Dichos procedimientos se enseñan, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No. 61/799.905 y Solicitud de patente provisional de e E. UU. No. 61/800.110,.
Ejemplo 2. Síntesis de polinucleótidos quiméricos
Introducción
Según la presente invención, se pueden unir o ligar dos regiones o partes de un polinucleótido quimérico usando la química del trifosfato.
Según este procedimiento, una primera región o parte de 100 nucleótidos o menos se sintetiza químicamente con un monofosfato 5' y 3' desOH extremo u OH bloqueado. Si la región tiene más de 80 nucleótidos, se puede sintetizar como dos cadenas para la ligación.
Si la primera región o parte se sintetiza como una región o parte modificada en forma no posicional mediante transcripción in vitro (IVT), puede seguir la conversión de monofosfato en 5' con posterior formación de capas del extremo 3'.
Los grupos protectores de monofosfato se pueden seleccionar de entre cualesquiera de los conocidos en la técnica.
La segunda región o parte del polinucleótido quimérico puede sintetizarse utilizando procedimientos de síntesis química o IVT. Los procedimientos IVT pueden incluir una ARN polimerasa que puede utilizar un cebador con una capa modificada. Alternativamente, una capa de hasta 130 nucleótidos puede sintetizarse químicamente y acoplarse a la región o parte de IVT.
Para los procedimientos de ligación, la ligación con ADN ligasa T4 seguida del tratamiento con DNasa debería evitar la concatenación fácilmente.
No es necesario fabricar el polinucleótido quimérico completo con una estructuras principales de fosfato-azúcar. Si una de las regiones o partes codifica un polipéptido, a continuación es npreferible que dicha región o parte comprenda una estructura principal de fosfato-azúcar.
A continuación, se realiza la ligadura usando cualquier química de clic conocida, química de ortoclic, solulink u otras químicas de bioconjugado conocidas por los expertos en la técnica.
Ruta sintética
El polinucleótido quimérico puede elaborarse mediante una serie de segmentos de partida. Dichos segmentos incluyen:
(a) un segmento en 5' protegido y con capa que comprende un OH en 3' normal (SEG. 1)
(b) un segmento de trifosfato en 5' que puede incluir la región codificante de un polipéptido y comprender un OH en 3' normal (SEG. 2)
(c) el segmento de monofosfato en 5' para el extremo 3' del polinucleótido quimérico (por ejemplo, la cola) que comprende cordicepina o carece de OH en 3' (SEG. 3)
Después de la síntesis (química o IVT), el segmento 3 (SEG. 3) se trata con cordicepina y a continuación con pirofosfatasa para crear el 5'monofosfato.
El segmento 2 (SEG. 2) se liga a continuación a SEG. 3 usando ARN ligasa. A continuación, el polinucleótido ligado se purifica y se trata con pirofosfatasa para escindir el difosfato. La construcción SEG.2-SEG 3 tratada es a continuación purificada y SEG. 1 es ligado al extremo 5'. Puede realizarse una etapa de purificación adicional del polinucleótido quimérico.
Cuando el polinucleótido quimérico codifica un polipéptido, los segmentos ligados o unidos pueden representarse como: 5'UTR (SEG. 1), marco de lectura abierto u ORF (SEG. 2) y 3'UTR+PoliA (SEG. 3).
Los rendimientos de cada etapa pueden ser tanto como 90-95 %.
E j e m p l o 3. P C R p a r a l a p r o d u c c i ó n d e A D N c
Los procedimientos de PCR para la preparación de ADNc se realizan usando 2x KAPA HIFI™ HotStart ReadyMix por Kapa Biosystems (Woburn, Ma ). Este sistema incluye 2x KAPA ReadyMix12,5 pl; Cebador directo (10 uM); 0,75 pl; Cebador inverso (10 uM) 0,75 pl; ADNc Plantilla; -100 ng; y dH20 diluido a 25,0 pl. Las condiciones de reacción son a 95 °C durante 5 min. y 25 ciclos de 98 °C durante 20 segundos, a continuación 58 °C durante 15 segundos, a continuación 72 °C durante 45 segundos, a continuación 72 °C durante 5 min. a continuación 4 °C hasta la terminación.
El cebador inverso de la presente divulgación incorpora un poli-T120 (SEQ ID NO: 2283) para un poli-A120 (SEQ ID NO: 2282) en el ARNm. Se pueden usar otros cebadores inversos con tractos poli(T) más largos o más cortos para ajustar la longitud de la cola poli(A) en el ARNm del polinucleótido.
La reacción se limpia con el micro kit PURELINK™ PCR de Invitrogen (Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante (hasta 5 pg) Las reacciones más grandes requerirán una limpieza con un producto de mayor capacidad. Después de la limpieza, el ADNc se cuantifica usando el NANODROP™ y se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa para confirmar que el ADNc tiene el tamaño esperado. A continuación, el ADNc se envía para análisis de secuenciación antes de proceder a la reacción de transcripción in vitro .
E j e m p l o 4. Transcripción in vitro ( I V T )
La reacción de tyranscripción in vitro genera polinucletodios que contienen polinucleótidos uniformemente modificados. Dichos polinucleótidos uniformemente modificados pueden comprender una región o parte de los polinucleótidos de la invención. La mezcla de trifosfato de nucleótidos de entrada (NTP) se fabrica internamente utilizando NTP naturales y no naturales.
Una reacción de transcripción in vitro in vitro típica inclu e lo si uiente:
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La mezcla IVT bruta se puede almacenar a 4 °C durante la noche para su limpieza al día siguiente. A continuación, se utiliza 1 U de DNasa libre de RNasa para digerir la plantilla original. Después de 15 minutos de incubación a 37 °C, el ARNm se purifica usando el kit MEGACLEAR™ de Ambion (Austin, TX) siguiendo las instrucciones del fabricante. Este kit puede purificar hasta 500 pg de ARN. Después de la limpieza, el ARN se cuantifica utilizando el NanoDrop y se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa para confirmar que el ARN tiene el tamaño adecuado y que no se ha producido degradación del ARN.
Ejemplo n5. Protección enzimática
La protección de un polinucleótido se realiza de la siguiente manera, donde la mezcla incluye: IVT ARN 60 pg-180 pg y dH20 hasta 72 pl, La mezcla se incuba a 65 °C durante 5 minutos para desnaturalizar el ARN y a continuación se transfiere inmediatamente a hielo.
A continuación, el protocolo implica la mezcla de tampón de protección 10x (Tris-HCl 0,5 M (pH 8,0), KCl 60 mM, MgCh12,5 mM (10,0 pl); GTP 20 mM (5,0 pl); S-adenosil metionina 20 mM (2,5 pl); Inhibidor de ARNasa (100 U); 2'-O-metiltransferasa (400 U); Enzima de protección contra Vaccinia (Guanilil transferasa) (40 U); dH20 (hasta 28 pl); e incubación a 37 °C durante 30 minutos para 60 pg de ARN o hasta 2 horas para 180 pg de ARN.
A continuación, el polinucleótido se purifica usando el kit MEGACLEAR™ de Ambion (Austin, TX) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de la limpieza, el ARN se cuantifica con NANODROP™ (ThermoFisher, Waltham, MA) y se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa para confirmar que el ARN tiene el tamaño adecuado y que no se ha producido ninguna degradación. El producto de ARN también se puede secuenciar ejecutando una PCR de transcripción inversa para generar el ADNc para la secuenciación.
Ejemplo 6. Reacción de descapado de poliA
Sin una poli-T en el ADNc, se debe realizar una reacción de descolado de poli-A antes de limpiar el producto final. Esto se hace mezclando ARN de IVT protegido (100 pl); Inhibidor de ARNasa (20 U); Tampón de cola 10x (Tris-HCl 0,5 M (pH 8,0), NaCl 2,5 M, MgCh100 mM)(12,0 pl); 20 mM ATP (6,0 pl); Poli-A Polimerasa (20 U); dH20 hasta 123,5 pl e incubación a 37 °C durante 30 min. Si la cola de poli-A ya está en la transcripción, a continuación la reacción de cola puede omitirse y proceder directamente a la limpieza con el kit MEGACLEAR™ de Ambion (Austin, TX) (hasta 500 pg). La polimerasa poli-A es preferiblemente una enzima recombinante expresada en levadura.
Debe entenderse que la procesividad o integridad de la reacción de cola de poliA no siempre puede dar como resultado una cola de poliA del tamaño exacto. Por ende, las colas de poliA de aproximadamente entre 40-200 nucleótidos (SEQ ID NO: 2284), p.ej, aproximadamente 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 150-165, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 o 165 se encuentran dentro del alcance de a invención.
Ejemplo 7. Capas naturales en 5’ y análogos de capas en 5’
La protección en 5' de los polinucleótidos se puede completar de manera concomitante durante la reacción de transcripción in vitro, usando los siguientes análogos químicos de protección de ARN para generar la estructura de protección de 5'-guanosina de acuerdo con los protocolos del fabricante: 3'-O-Me-m7G(5') ppp(5') G [el tope ARCA];G(5')ppp(5')A; G(5')ppp(5')G; m7G(5')ppp(5')A; m7G(5')ppp(5')G (New England BioLabs, Ipswich, Ma ). La protección 5' del ARN modificado puede completarse después de la transcripción utilizando una enzima de protección del virus Vaccinia para generar la estructura "Cap 0": m7G(5')ppp(5')G (New England BioLabs, Ipswich, MA). La estructura Capa 1 puede generarse usando tanto la Enzima de Protección del Virus Vaccinia como una 2'-O metiltransferasa para generar: m7G (5') ppp (5') G-2'-O-metilo. La estructura Capa 2 puede generarse a partir de la estructura Capa 1 seguida de la 2'-O-metilación del nucleótido 5'-antepenúltimo usando una 2'-O metiltransferasa. La estructura Capa 3 puede generarse a partir de la estructura Capa 2 seguida de la 2'-O-metilación del nucleótido 5'-antepenúltimo usando una 2'-O metiltransferasa. Las enzimas se derivan preferiblemente de una fuente recombinante.
Cuando se transfectan en células de mamífero, los ARNm modificados tienen una estabilidad de entre 12-18 horas, o mayor que 18 horas, por ejemplo, 24, 36, 48, 60, 72, o mayor que 72 horas.
Ejemplo 8: Ensayos de protección
A. Ensayo de expresión de proteínas
Los polinucleótidos que codifican un polipéptido, que contienen cualquiera de los casquillos enseñados en esta invención, pueden transfectarse en células a concentraciones iguales. 6, 12, 24 y 36 horas después de la transfección, la cantidad de proteína secretada en el medio de cultivo se puede analizar mediante ELISA. Los polinucleótidos sintéticos que secretan altos niveles de proteína al medio corresponden a un polinucleótido sintético con una estructura de Capa competente traduccionalmente mayor.
B. Síntesis de análisis de pureza
Los polinucleótidos de ARN que codifican un polipéptido que contiene cualquiera de los capas presentados en esta invención se pueden comparar en cuanto a la pureza utilizando electroforesis en gel de agarosa-urea desnaturalizante o análisis HPLC Los polinucleótidos de ARN con una banda consolidada única por electroforesis corresponden al producto de mayor pureza comparado con los polinucleótidos con múltiples bandas o bandas veteadas. Los polinucleótidos de ARN modificados químicamente con un único pico de HPLC también corresponderán a un producto de mayor pureza. La reacción de protección con mayor eficacia proporcionará una población de polinucleótidos más pura.
C. Análisis de citocina
Los polinucleótidos que codifican un polipéptido, que contienen cualquiera de las capas enseñadas en esta invención, pueden transfectarse en células a múltiples concentraciones. 6, 12, 24 y 36 horas después de la transfección, la cantidad de citocinas proinflamatorias, como TNF-alfa e IFN-beta secretadas en el medio de cultivo, puede analizarse mediante ELISA. Los polinucleótidos que producen la secreción de mayores niveles de citocinas proinflamatorias en el medio corresponderán a polinucleótidos que contienen una estructura de capa de activación inmunitaria.
D. Eficacia de reacción de protección
Los polinucleótidos que codifican un polipéptido que contiene cualquiera de las capas presentadas en esta invención se pueden analizar en cuanto a la eficacia de la reacción de protección por LC-MS después del tratamiento con nucleasa. El tratamiento con nucleasa de polinucleótidos protegidos produciría una mezcla de nucleótidos libres y la estructura de protección 5'-5-trifosfato protegida detectable por LC-MS. La cantidad de producto protegido en los espectros de LC-MS se puede expresar como un porcentaje del polinucleótido total de la reacción y correspondería a la eficacia de la reacción de protección. La estructura de capa con mayor eficiencia de reacción de protección tendría una mayor cantidad de producto protegido por LC-MS.
Ejemplo 9. Electroforesis en ael de aaarosa de ARN modificado o productos de PCR de RT
Se cargan polinucleótidos individuales (200-400 ng en un volumen de 20 pl) o productos de PCR transcritos inversamente (200-400 ng) en un pocillo en un E-Gel de agarosa al 1,2 % no desnaturalizante (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se corren durante 12-15 minutos según el protocolo del fabricante.
Ejemplo 10. Datos espectrales UV y cuantificación de ARN modificado con Nanodrop
Polinucleótidos modificados en tampón TE (1 pl) se utilizan para las lecturas de absorbancia UV de Nanodrop para cuantificar el rendimiento de cada polinucleótido de una síntesis química o una reacción de transcripción in vitro
Ejemplo 11. Formulación de ARNm modificado utilizando lipidoides
Polinucleótidos de ARN se formularn para experimentos in vitro mezclando los polinucleótidos con el lipidoide en una proporción establecida antes de la adición a las células. La formulación in vivo puede requerir la adición de ingredientes adicionales para facilitar la circulación por el cuerpo. Para evaluar la capacidad de estos lipidoides para formar partículas adecuadas para el trabajo in vivo, se puede utilizar un procedimiento de formulación estándar para las formulaciones de siARN-lipidoide como punto de partida. Luego de la formación de la partícula, se agrega polinucleótido y se deja integrar en el complejo. La eficacia de encapsulación se determina mediante el uso de ensayos de exclusión de colorante estándar.
Ejemplo 12. Procedimiento de detección de la expresión de proteínas
A. Ionización por electropulverización
Una muestra biológica que puede contener proteínas codificadas por polinucleótidos sintéticos administrados a las células o al sujeto se prepara y analiza según el protocolo del fabricante para ionización por electropulverización (ESI) usando 1, 2, 3 o 4 analizadores de masa. También se puede analizar una muestra biológica utilizando un sistema de espectrometría de masas ESI en tándem.
Los patrones de fragmentos de proteína, o proteínas completas, se comparan con controles conocidos para una proteína dada y la identidad se determina por comparación.
B. Desorción/ionización láser asistida por matriz
Una muestra biológica que puede contener proteínas codificadas por polinucleótidos sintéticos administrados a las células o al sujeto se prepara y analiza según el protocolo del fabricante para la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI).
Los patrones de fragmentos de proteína, o proteínas completas, se comparan con controles conocidos para una proteína dada y la identidad se determina por comparación.
C. Cromatografía líquida-Espectrometría de masas-Espectrometría de masas
Una muestra biológica, que puede contener proteínas codificadas por uno o más polinucleótidos, puede tratarse con una enzima tripsina para digerir las proteínas que contiene. Los péptidos resultantes se analizan mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas-espectrometría de masas (LC/MS/MS). Los péptidos se fragmentan en el espectrómetro de masas para producir patrones de diagnóstico que pueden compararse con las bases de datos de secuencias de proteínas mediante algoritmos informáticos. La muestra digerida se puede diluir para lograr 1 ng o menos de material de partida para una proteína dada. Muestras biológicas que contienen un fondo tampón simple (por ejemplo, agua o sales volátiles) son susceptibles de digestión directa en solución; fondos más complejos (por ejemplo, detergente, sales no volátiles, glicerol) requieren un etapa de limpieza adicional para facilitar el análisis de la muestra.
Los patrones de fragmentos de proteína, o proteínas completas, se comparan con controles conocidos para una proteína dada y la identidad se determina por comparación.
Ejemplo 13. Ciclación y/o concatemerización
Según la presente invención, un polinucleótido puede ciclarse o concatemerizarse para generar una molécula competente en traducción para ayudar a las interacciones entre las proteínas de unión a poli-A y las proteínas de unión del extremo 5'. El mecanismo de ciclación o concatemerización puede ocurrir a través de al menos 3 rutas diferentes: 1) química, 2) enzimática y 3) catalizada por ribozimas. El enlace 5'-/3' recién formado puede ser intramolecular o intermolecular.
En la primera ruta, el extremo 5' y el extremo 3' del ácido nucleico contienen grupos químicamente reactivos que, cuando están juntos, forman un nuevo enlace covalente entre el extremo 5' y el extremo 3' de la molécula. El extremo 5' puede contener un grupo reactivo éster NHS y el extremo 3' puede contener un nucleótido terminado en 3' amino de manera que en un disolvente orgánico el nucleótido terminado en 3' amino en el extremo 3' de una molécula de ARNm sintético sufrirá un ataque nucleofílico en el resto del éster 5'-NHS formando un nuevo enlace 5'-/3'-amida.
En la segunda ruta, la ARN ligasa T4 puede usarse para enlazar enzimáticamente una molécula de ácido nucleico fosforilado en 5' al grupo hidroxilo 3' de un ácido nucleico formando un nuevo enlace fosforodiéster. En una reacción de ejemplo, se incuba 1 |jg de una molécula de ácido nucleico a 37 °C durante 1 hora con 1--10 conjuntos de ARN ligasa T4 (New England Biolabs, Ipswich, MA) según el protocolo del fabricante. La reacción de ligación puede producirse en presencia de un oligonucleótido dividido capaz de parearse con las regiones 5' y 3' en yuxtaposición para ayudar a la reacción de ligación enzimática.
En la tercera ruta, el extremo 5' o 3' de la plantilla de ADNc codifica una secuencia de ribozima ligasa de modo que durante la transcripción in vitro, la molécula de ácido nucleico resultante puede contener una secuencia de ribozima activa capaz de ligar el extremo 5' de una molécula de ácido nucleico al extremo 3' de una molécula de ácido nucleico. La ribozima ligasa puede derivarse del intrón del grupo I, virus de la hepatitis delta, ribozima de horquilla o puede seleccionarse mediante SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial). La reacción de la ribozima ligasa puede tardar de 1 a 24 horas a temperaturas entre 0 y 37°C.
Ejemplo 14. Polinucleótidos nAntígenos
Los polinucleótidos usados en los estudios en esta invención presentados que codifican ciertos antígenos de agentes infecciosos o variantes de los mismos se muestran en la Tabla 28.
Tabla 28. Polinucleótidos de antí eno vacuna de ARN
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En las Tablas 29 y 30 se muestran antígenos adicionales que incluyen antígenos de tipo salvaje y modificados genéticamente.
VAN contra pan-flu
En una realización, la región de "cabeza HA" de una o más cepas del virus de la influenza se elimina dejando solo el tronco o la región transmembrana. Esta región o múltiples regiones, si se seleccionan, se usa a continuación como inmunógeno para seleccionar una respuesta óptima a una exposición viral. Como tal, se podría lograr una neutralización amplia contra múltiples cepas o una respuesta múltiple a una cepa. La vacuna resultante representaría una vacuna contra la influenza.
Además, una vacuna contra la influenza también podría combinarse con cualquier potenciador inmunológico descrito en esta invención.
Los polinucleótidos usados en los estudios en esta invención que codifican ciertos antígenos de agentes infecciosos o variantes de los mismos pueden formularse en cualquiera de las formulaciones descritas en esta invención incluyendo NPL y pueden administrarse por vía intradérmica (ID) o intramuscular (IM) o por cualquier vía adecuada. En la Tabla 29 se describen las regiones HA, las regiones transmembrana y citoplásmica de varias cepas de influenza que se utilizarán en el protocolo de generación de vacunación con tronco que se acaba de describir.
Tabla 29. Antígenos de tipo salvaje codificados por polinucleótidos VAN
Virus Cepa Secuencia HA AA de HA1 HA2 TM CY longitud completa
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ID
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En la tabla, TM significa transmembrana y CY significa citoplasmático.
Siguiendo la estrategia de generación de vacunas anterior, también se pueden usar antígenos modificados genéticamente para desarrollar vacunas antigripales. Tales construccionesd se muestran en la tabla 30.
Tabla 30. Antígenos diseñados codificados por polinucleótidos VAN
Virus Cepa Configuración Ingeniería de Secuencia de longitud completa SEQ roteínas ID
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Ejemplo 15. Estudio de influenza - Antígeno de hemaglutinina (HA) H1N1
El presente estudio se diseñó en dos fases, primero para probar la inmunogenicidad de las vacunas de ARNm que codifican HA de la influenza A/PR/8 (H1N1) en ratones y en segundo lugar para probar la eficacia de las vacunas contra la influenza candidatas en ratones contra una exposición letal con la influenza (INFV) A/ PR/8/34 (H1N1). El diseño del estudio se describe en la Tabla 31. El polinucleótido VAN usado en el estudio fue la construcción 4 de la Tabla 28 (ORF SEQ ID NO: 2045, ARNm SEQ ID NO: 2118).
En la fase I de este estudio, ratones se vacunaron en las semanas 0 y 3 por vía intravenosa (IV), intramuscular (IM) o intradérmica (ID). Un grupo permaneció sin vacunar y a otro se le administró antígeno PR8 inactivado. Se recogió suero de cada ratón en las semanas 1, 3 (antes de la dosis) y 5. Se analizaron las hemorragias individuales para determinar la actividad anti-HA mediante un ensayo de neutralización de virus e inhibición de HA (HAI) de los tres puntos de tiempo y muestras agrupadas de la semana 5 solo fueron probados por Western blot usando A/PR/8/34 (H1N1).
Fase II
Dado que se logró la respuesta inmune deseada (título HAI > 40), se realizó la fase II del estudio. En la fase II, los ratones se expusieron a una dosis letal (10xLD90; ~100 conjuntos formadores de placa; PFU) de A/PR/8/34 (H1N1) por instilación intranasal (IN). Se controló el peso, la salud y la supervivencia de los ratones durante 14 días.
Este estudio probó la inmunogenicidad de las vacunas de ARNm que codifican HA de la influenza A/PR/8 (H1N1) en ratones. El estudio utilizó 12 grupos de cinco ratones hembra BALB/c. Los ratones se vacunaron en las semanas 0 y 3 por vía intranasal (control positivo), intravenosa, intramuscular o intradérmica. Un grupo no estaba vacunado y al otro se le administró antígeno PR8 inactivado mediante vacunación intranasal.
Este estudio probó si las vacunas y formulaciones de ácido ribonucleico candidatas podrían proteger a los ratones de la infección por la influenza letal A/PR/8/34 (H1N1). Los ratones utilizados fueron ratones BALB/c hembras de 6-8 semanas de edad en grupos de 10. Los ratones se vacunaron en las semanas 0 y 3 por vía IM, ID o IV. Se analizó el suero de ratón para detectar microneutralización y HAI. A continuación, los ratones fueron expuestos con ~1 LD90 de influenza A/PR/8/34 (H1N1) en la semana 7 administrada por vía intranasal (IN). El punto final fue el día 13 después de la infección, muerte o eutanasia. Se sometió a eutanasia a los animales que presentaron una enfermedad grave, determinada por una pérdida de peso > 30 %, letargo extremo o parálisis. La temperatura y el peso se tomaron diariamente.
La formulación de NPL consistió en un lípido catiónico, un lípido no catiónico, un lípido PEG y un lípido estructural en las proporciones 50:10:1.5:38.5. El lípido catiónico fue DLin-KC2-DMA (50 mol %), el lípido no catiónico fue DSPC (10 mol %), el lípido PEG era PEG-DOMG (1,5 mol %) y el lípido estructural fue el colesterol (38,5 mol %).
Se recogió suero de cada ratón en las semanas 1, 3 (antes de la dosis) y 5. Se analizó la actividad anti-HA en muestras de sangre individuales a través del ensayo de neutralización del virus y la inhibición de HA (HAI) de los tres puntos temporales (animales individuales) y las muestras agrupadas de la semana 5 solo se analizaron mediante Western blot utilizando Influenza A/PR/8 inactivada (H1N1 ).
Protocolo estándar para la infección intranasal de ratones
Ratones BALB/c hembras de 6 a 8 semanas de edad se alojaron en grupos de 5 ratones. Los ratones se pusieron en cuarentena en el sitio del estudio (Noble Life Sciences, Gaithersburg, m D) durante al menos 3 días antes del inicio del estudio. Se proporcionó comida y agua ad libitum.
Los grupos de ratones expuestos a INFV se infectaron mediante inoculación intranasal (IN) con ~10xLD90 en 100 pl de INFV en PBS bajo anestesia ligera (isoflurano). Después de la infección, los ratones se volvieron a situar en sus jaulas para observación y posterior dosificación.
Microneutralización
El protocolo de microneutralización fue el protocolo estándar para la microneutralización de la influenza según lo publicado por la Organización Mundial de la Salud el 6 de diciembre de 2010 y descrito por el Centro Colaborador de la OMS para la Vigilancia, Epidemiología y Control de la Influenza, Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, Atlanta, EE. UU.
Diagnóstico serológico de infecciones por el virus de la influenza por inhibición de la hemaglutinación.
El protocolo estándar para la inhibición de la hemaglutinación se puede encontrar en la publicación WHO Influenza Manual, WHO/CDS/CSR/NCS/2002.5 Rev.1, en la página 37,
Brevemente, el protocolo es el siguiente.
Procedimiento
I. Tratamiento de sueros
1. Identificación de aislados de influenza por hemaglutinación.
2. Adsorber sueros para eliminar aglutininas inespecíficas como se describe anteriormente.
II. Estandarización de glóbulos rojos
Estandarizar los glóbulos rojos según el procedimiento en procedimientos reconocidos en la técnica.
III. Titulación HA de antígenos de control
Siguiendo el procedimiento de titulación de los antígenos de control indicado anteriormente.
IV. Preparación de antígenos estandarizados para la prueba de HAI y "Retro-Titulación"
Cada antígeno de control debe estar estandarizado para contener 4 HA conjuntos/25 pl, 8 HA conjuntos/50 pl. Nota: Se agregan cuatro conjuntos de HA a la prueba en 25 pl porque los cálculos del conjunto de HA se basan en un volumen de 50 pl.
V. Prueba de HAI para diagnóstico serológico
1. Etiquetar placas de microtitulación adecuadas.
2. Agregar 25 pl de PBS a los pocillos B a H (B1 - H12) de cada columna numerada.
3. Agregar 50 pl de cada suero tratado (1:10) al primer pocillo apropiado (A1 -A12) de la columna numerada.
4. Preparar diluciones dobles en serie de los sueros tratados transfiriendo 25 pl del primer pocillo de las columnas numeradas 1-12 a los pocillos sucesivos.
Desechar los últimos 25 pl después de la fila H.
5. Agregar 25 pl de antígeno estandarizado a todos los pocillos (A1 - H12) en un conjunto de sueros tratados.
6. Añadir 25 pl de PBS en lugar de antígeno al conjunto de sueros tratados para los controles de suero (A1 - H12).
7. Mezclar el contenido de las placas agitando en un vibrador mecánico durante 10 segundos o agitando las placas manualmente.
8. Cubrir las placas e incubar a temperatura ambiente (22 a 25 °C) durante 30-45 min.
9. Agregar 50 |jl de glóbulos rojos estandarizados a todos los pocilios. Mezclar como antes.
10. Cubrir las placas y dejar que los glóbulos rojos se asienten a temperatura ambiente (22 a 25 °C) durante el tiempo apropiado según los glóbulos rojos que se estén utilizando.
11. Registrar los títulos de HAI.
Los antígenos de control positivo y los antisueros correspondientes deben dar resultados consistentes en comparación con las pruebas anteriores. Un aumento de cuatro veces en el título entre el suero agudo y convaleciente se considera positivo para el diagnóstico de ese tipo/subtipo de influenza.
Western Blots
El suero de las hemorragias realizadas en ratones vacunados en la semana 5 se combinó y diluyó 1:1000 para análisis en Western blots. El antígeno PR8 inactivado se separó mediante SDS-PAGE y se sondaron con los sueros combinados. Se observaron señales positivas en los grupos 2-7 y 12, y las señales más altas se observaron en los grupos 4-7 y 12.
Se separaron 500 ng por carril de antígeno PR8 inactivado mediante SDS en geles bis-tris al 10 %. La proteína se transfirió a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) y las membranas se bloquearon con leche y se sondaron con dilución 1:1000 de sueros combinados de cada grupo de hemorragias de la semana 5.
Se detectó anticuerpo con dilución 1:3000 de fosfatasa alcalina (AP) de cabra anti-ratón
Observación de ratones
Los ratones se observaron durante 13 días después de la infección (14 días en total, 0-13 días después de la infección). Los ratones se pesaron diariamente en una balanza Ohause y se registraron los pesos.
A todos los animales se les implantaron chips al menos 3 días antes de la exposición al virus que monitoreaban la temperatura corporal. Las temperaturas se registraron diariamente.
Se evaluó la supervivencia y la salud de cada ratón una vez al día.
Tabla 31. Diseño del estudio
Grupo Cepa de ratón Vacuna (n=5 ratones/grupo) Posología / Lecturas
Administrado semana 0, 3 Ruta
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En la Tabla se aplican las siguientes abreviaturas; IM, intramuscular; ID, intradérmico; IN, intranasal; IV, intravenoso; NPL, nanopartícula lipídica
Tabla 32. Títulos HAI medios
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2
Inhibición de Hemaglutinación
La inhibición de la hemaglutinación (HAI) se midió en muestras de suero de ratón en las semanas 1, 3 y 5 posteriores a la vacunación. Después de la semana 1, ambos grupos 5 y 7 mostraron títulos de HAI superiores a 40, a 60 y 114, respectivamente. En la semana 3, los grupos 3-7 mostraron actividad HAI por encima de 40, siendo el grupo 7 el más alto con 965. En la semana 5, todos los grupos, excepto el 1 (no tratado) y el 9, mostraron actividad HAI superior a 40, con el grupo 7 >10.000.
Se observa que 1:40 es predictivo de eficacia. Un título de HAI de >40 se considera necesario para protegerse de una exposición letal de la influenza..
Los datos mostraron que hubo un rescate del 100 % de la exposición letal a la influenza con un inicio rápido de títulos de anticuerpos protectores después de 1 semana y títulos de anticuerpos altos, es decir, 50 veces más que el ARNm sin modificar y 20 veces más que la vacuna de proteína. Además, se demostró que para las vacunas de ácido ribonucleico de la invención se requiere una dosis de ARNm efectiva mucho más baja, es decir, diez veces menos que el ARNm sin modificar. (Figura 10).
Microneutralización
Se agregaron diluciones dobles de sueros de ratón a 100 TCID50/ml de virus en placas de 96 pocillos. Después de 24 horas de incubación, se añadieron a cada pocillo 1,5 x 104 células Madin-Darby Canine-Kidney. Después de una incubación de -20 horas a 37 °C, se detectó el virus y se puntuó con un anticuerpo anti-NP y se leyó a 490 nm. No se detectó actividad de neutralización con muestras de la semana 1 (señal < 50; límite inferior de detección). En la semana 3, los ratones de los grupos 5 y 7 mostraron una actividad neutralizante entre 79 y 250 (grupo 5) y 250 (grupo 7). Ninguno de los otros grupos mostró actividad neutralizante. En la semana 5, los grupos 2-4 mostraron una alta actividad neutralizante entre 789 y 2493, con el grupo 7 mostrando una actividad neutralizante 2494 y -25.000. El grupo de control de ratones, vacunados con PR8 inactivado, mostró actividad de neutralización en 3 de 5 ratones y osciló entre 79 y 250. Los datos se muestran en las tablas 33-35.
Tabla 33. Semana 1 Microneutralización
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Supervivencia
Todos los ratones fueron expuestos a una dosis letal (10xLD90) de INFV. A/PR/8/34 en la semana 7 después de la vacunación. Se observó la morbilidad y mortalidad de los ratones hasta por 14 días. Todos los ratones vacunados mostraron un 100 % de supervivencia, en comparación con el grupo sin tratamiento previo (grupo 1), que no fue vacunado. Se expusieron 12 grupos de 5 ratones mediante instilación IN con ~100 PFU de In Fv A/PR/8/34 (H1N1). Los ratones se observaron diariamente durante 14 días para determinar su estado de salud, morbilidad y mortalidad. Todos los animales, excepto los no vacunados, que murieron aproximadamente en el día 7, sobrevivieron al estudio de 14 días.
Datos de pérdida de peso
Pérdida de peso y salud de ratones desafiados con A/PR/8/34. Se desafiaron 12 grupos de 5 ratones mediante instilación IN con ~100 PFU de INFV A/PR/8/34 (H1N1). Los ratones se observaron diariamente durante 14 días para determinar su estado de salud, morbilidad y mortalidad.
Todos los ratones vacunados mostraron un 100 % de supervivencia, aunque algunos grupos mostraron pérdida de peso. Se muestra el grupo no vacunado 0 % supervivencia y murió los días 6 y 7, después de la infección. Si bien se observaron diferencias en la pérdida de peso en ratones vacunados expuestos, no se puede sacar ninguna conclusión sobre su importancia. El grupo vacunado con VAN que tienen N1 metilpseudouridina/5-metil la citosina con ARNm desnudo mostró puntuaciones de salud de "2" en los días 2 y 3 posteriores a la infección, pero se recuperó a "saludable" durante el resto del estudio. Los grupos vacunados con VAN que tienen N1 metilpseudouridina/5-metil citosina ID 80 ug c/ lipofecatmina 2000 (LF2000) y N1metilpseudouridina y 5-metilcitosina NPL ID mostraron puntuaciones de salud de "2" en los días 5 y 6 posteriores a la infección, que continuaron durante la duración del estudio. La formulación de LNP consistió en un lípido catiónico, un lípido no catiónico, un lípido PEG y un lípido estructural en proporciones de 50:10:1,5:38,5. El lípido catiónico fue DLin-KC2-DMA (50 mol %), el lípido no catiónico fue DSPC (10 mol %), el lípido PEG fue PEG-DOMG (1,5 mol %) y el lípido estructural fue colesterol (38,5 mol % ).
Todos los grupos mantuvieron generalmente un peso entre el 90-110 % del peso original, con la excepción del grupo no vacunado. Estos animales tenían aproximadamente el 70 % de su peso original el día 6. La puntuación de salud fue según la Tabla 36.
Tabla 36. Gráfico de puntuación de salud
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Ejemplo 16. Estudio MRSA (ejemplo de referencia)
Los antígenos de MRSA que pueden estar codificados por las vacunas de ácido ribonucleico incluyen, SpA, SpAKKAA, IsdA, IsdB, SDRD, SDRE, t Ss T-1, PVL, a-HL, NMD-1 y SCCmec. El diseño del estudio se muestra en la Tabla 37.. En estos estudios, se utilizó la construcción número 27 de la Tabla 28.
A. Prueba de eficacia de vacunas de ácido ribonucleico modificado en modelo de exposición a neumonía por Staph. aureus en ratones.
Este estudio probará la eficacia de la vacuna de ácido ribonucleico que codifica MRSA Ag808 en ratones BALB/c. El estudio utiliza 15 grupos de 15 ratones BALB/c hembra (225 en total. Los ratones se vacunan en la semana 0 y 3 por vía intradérmica (ID) o intramuscular (IM) con una formulación de NPL que comprende DLin-KC2-DMA ("KC2") o DLin-MC3-DMA ("Mc 3"). La formulación de KC2 NPL consistía en un lípido catiónico (DLin-KC2-DMA, 50 mol %), lípido no catiónico (DSPC, 10 mol %), Lípido PEG (PEG-DOMG 1.5 mol %) y un lípido estructural (colesterol, 38,5 mol %). La formulación de MC3 NPL consistía en un lípido catiónico (DLin-MC3-DMA, 50 mol %), lípido no catiónico (DSPC, 10 mol %), Lípido PEG (PEG-DOMG 1.5 mol %) y un lípido estructural (colesterol, 38,5 mol %). Un grupo no está vacunado y al otro se le administra un antígeno de control positivo. Antes de la exposición, los ratones se sangrarán por la vena de la cola en las semanas 1, 3 y 5 y muestras de suero se conservarán para análisis posteriores. Los ratones serán expuestos a MRSA (cepa Newman) en ~1xLD90 mediante inoculación intranasal (IN) en la semana 5. Se controlará la morbilidad de los ratones utilizando una puntuación de salud asignada en función de un sistema de puntuación estándar, pérdida de peso y mortalidad, y el criterio de valoración es el día 14 después de la infección, muerte o eutanasia. Se sometió a eutanasia a los animales que presentaron una enfermedad grave, determinada por una pérdida de peso > 30 %, letargo extremo o parálisis. Los ratones se mantendrán hasta la semana 7, para realizar trabajo adicional con los animales (por ejemplo, más vacunaciones, sangrado o exposición infecciosa).
B. Prueba de eficacia de las vacunas con ácido ribonucleico modificado con N1-metilpseudouridina en la Exposición a peritonitis por Staphylococcus aureus
Este estudio probó la eficacia de una vacuna de ácido ribonucleico que codifica MRSA Ag808 en ratones BALB/c. El estudio utilizó 15 grupos de 15 ratones BALB/c hembra (270 en total). Los ratones se vacunan en la semana 0 y 3 por vía intradérmica (ID) o intramuscular (IM) con una formulación de NPL que comprende DLin-KC2-DMA ("KC2") o DLin-MC3-DMA ("Mc 3"). La formulación de KC2 NPL consistía en un lípido catiónico (DLin-KC2-DMA, 50 mol %), lípido no catiónico (DSPC, 10 mol %), Lípido PEG (PEG-DOMG 1.5 mol %) y un lípido estructural (colesterol, 38,5 mol %). La formulación de MC3 NPL consistía en un lípido catiónico (DLin-MC3-DMA, 50 mol %), lípido no catiónico (DSPC, 10 mol %), Lípido PEG (PEG-DOMG 1.5 mol %) y un lípido estructural (colesterol, 38,5 mol %). Un grupo no está vacunado y al otro se le administró un antígeno de control positivo. Antes de la exposición, los ratones se sangraron por la vena de la cola en las semanas 1, 3 y 5 y muestras de suero se conservaron para análisis posteriores. Los ratones que fueron expuestos por instilación intranasal recibieron una dosis de exposición prevista de 2e8 CFU/ratón (real tras la retro-titulación fue 3,3e8/ratón) y los ratones que fueron desafiados a través de la infección por IP recibieron una predicción de 1e7 CFU/ratón (real tras retro-titulación 6,7e6 CFU/ratón). Se controló la morbilidad de los ratones utilizando una puntuación de salud asignada en función de un sistema de puntuación estándar, pérdida de peso y mortalidad, y el criterio de valoración es el día 14 después de la infección, muerte o eutanasia. Se sometió a eutanasia a los animales que presentaron una enfermedad grave, determinada por una pérdida de peso > 30 %, letargo extremo o parálisis.
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Ratones que fueron vacunados y expuestos por vía IP con mucina de cerdo 3 % todos mostraron 0 % supervivencia dentro de las 24 horas posteriores a la exposición. Los ratones que fueron vacunados y expuestos mediante instilación IN mostraron entre un 6 y un 33 % de supervivencia y una mediana de supervivencia entre 2 y 3 días. No se demostró eficacia ni con la construcción de vacuna de ARN probada ni con los controles (bacterias inactivadas y control de proteínas) en ninguno de los modelos de exposición, lo que sugiere que el modelo no era adecuado para probar las construcciones. El grupo vacunado con vehículo mostró un 20 % de supervivencia y un tiempo medio de supervivencia de 3 días. Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que la gravedad del modelo de infección por MRSA impidió la detección de la eficacia de la vacuna. Se pueden probar otros modelos para determinar la eficacia.
Ejemplo 17. Estudio del dengue: Inmunoaenicidad de la vacuna de ARN del virus del dengue en ratones (Ejemplo de referencia)
Este estudio proporciona un análisis preliminar de la inmunogenicidad de una vacuna de ARNm de ácido nucleico utilizando un antígeno del serotipo 2 del virus del dengue (DENV) en ratones BALB/c. El estudio utiliza 44 grupos de 10 ratones BALB/c hembras (5) y machos (5) (440 en total, 6-8 semanas de edad al inicio del estudio, ver Tabla 38 para el resumen del diseño). En este estudio, los números de construcción utilizados se referencian y se encuentran en la Tabla 28.
Los ratones se vacunaron en las semanas 0 y 3 por vía intramuscular (IM) o intradérmica (ID). Un grupo permaneció sin vacunar y a uno se administraron 105 conjuntos formadores de placas (PFU) DENV2 D2Y98P vivas, mediante inyección intravenosa (IV) aislada como control positivo. Se recogió suero de cada ratón en las semanas 1, 3 y 5; las hemorragias en las semanas 1 y 3 fueron muestras en vida (hemorragias en la vena de la cola o submandibulares) y en la semana 5 será una hemorragia terminal (intracardíaca). Muestras de suero individuales se almacenaron a -80 °C hasta su análisis mediante ensayo de neutralización o microneutralización. Las muestras reunidas de cada grupo en los puntos temporales de la semana 5 se analizaron mediante Western blot para determinar la reactividad con el lisado viral.
T l . Di ñ x rim n l ll r mi n l r
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La señal se detectó en los grupos 5, 15, 39 y 44 (control de virus vivos) por una banda que apareció entre 50 y 60 kDa en los datos del Western blot. Los datos sugieren que una vacuna de ARNm para un solo antígeno viral del dengue puede producir anticuerpos en estudios preliminares.
Ejemplo 18. Vacuna contra la tuberculosis con ácido ribonucleico: estrategia combinatoria de adyuvantes y antígenos (Ejemplo de referencia)
El objetivo del estudio es identificar una vacuna multivalente y multadyuvante efectiva en diferentes etapas de la enfermedad de la tuberculosis. El experimento inicial evalúa 12 antígenos con 8 adyuvantes de citocinas en tres modelos de estadio de la enfermedad. Los antígenos codificados por los polinucleótidos de la divulgación incluyen Ag85A (Rv3804c), Ag85B (Rv1886c), TB10.4 (Rv0288), ESAT6 (Rv3785), Rv2660L, Rv3619, Rv1813c, Rv3620c, Rv2608, Rv1196, Rv0125 y/o MT401. Los adyuvantes de citocinas diana incluyen GM-CSF, IL-17, IFNg, IL-15, IL-2, IL-21, Anti-PD1/2 y/o Lactoferrina.
Ejemplo 19. Estudio de enterovirus humano (HEV68 y HEV71). (Ejemplos de referencia)
Se han identificado varios antígenos clave para su uso en la generación de vacunas. Estos incluyen: (i) VP1 BC/DE bucle de los tres linajes HEV68 y (ii) VP1+VP2 de HEV71. El polinucleótido RVAN para uso en la generación de vacunas a partir del antígeno HEV71 es la construcción 72 de la Tabla 28 (ORF SEQ ID NO: 2113, ARNm SEQ ID NO: 2186).
Ejemplo 20. Estudio MERS-CoV. (Ejemplos de referencia)
Como MERS-CoV se une a las células a través de DPP4Fc, el tratamiento para MERS-CoV puede incluir un ARNm que codifica DPP4-Fc con o sin sitio de unión MERS-CoA y sitios de unión mutantes para la señalización de diabetes y dominio de unión al receptor truncado de la proteína MERS-CoV Spike. Véase PLoS One. 2013; 8 (12): e81587). Esta vacuna actuaría como un señuelo para el virus, ya que atraerá al MERS-CoV.
Otra vacuna clave para MERS-CoV se identifica como un ARNm que codifica la glucoproteína de MERS-CoV Spike como antígeno. La secuencia de la proteína se proporciona aquí (SEQ ID NO: 2275).
SEQ ID NO. 2275:
mihsvfllmflltptesyvdvgpdsiksacievdiqqtffdktwprpidvskadgiiypqgrtysniti tyqglfpyqgdhgdmyvysaghatgttpqklfvanysqdvkqfangfvvrigaaanstgtviispst satirkiypafmlgssvgnfsdgkmgrffnhtlvllpdgcgtllrafycileprsgnhcpagnsytsfat yhtpatdcsdgnynrnaslnsfkeyfnlrnctfmytynitedeilewfgitqtaqgvhlfssryvdlyg gnmfqfatlpvydtikyysiiphsirsiqsdrkawaafyvyklqpltflldfsvdgyirraidcgfndls qlhcsyesfdvesgvysvssfeakpsgsvveqaegvecdfspllsgtppqvynfkiivftncnynlt kllslfsvndftcsqispaaiasncysslildyfsyplsmksdlsvssagpisqfnykqsfsnptclilat vphnlttitkplkysyinkcsrllsddrtevpqlvnanqyspcvsivpstvwedgdyyrkqlsplegg
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Ejemplo 21: Estudios in vitro de H10N8
Se realizaron estudios in vitro sobre la traducibilidad del ARNm de hemaglutinina H10 en células HeLa.
El análisis de Western blot reveló que HA se expresa en células HeLa después de la transfección con la VAN de ARNm que codifica la proteína HA de la cepa H10N8 del virus de la influenza.
Ejemplo 22: Estudio de influenza: dosificación y formulaciones
Se probó una vacuna de ARNm que codifica la proteína HA de la cepa H1N1 del virus de la influenza en varias dosis y en varias formulaciones para determinar la capacidad de provocar una respuesta inmune en ratones.
Se evaluó la eficacia de diferentes dosis y formulaciones en ratones. Los títulos de HAI de ratones determinados el día 35 después de la vacunación el día 0 y el día 21 con ARNm que codifica HA del virus H1N1 se muestran en la Figura 11. Los títulos fueron más altos con dosis de 10 gg. ARNm/ratón (400 gg ARNm/kg) con las formulaciones de KC2 y MC3 administradas ID o IM (Tabla 39).
Tabla 39: Títulos de inhibición de hemaglutinina en ratones después de la vacunación con diferentes dosis y formulaciones de ARNm que codifica la proteína hemaglutinina de la vacuna del virus H1N1.
Grupo No. (n=10 por Vía de vacunación Vacuna Formulación Dosis Media de grupo) los días 0 y 21 (gg/ratón) título HAI ±
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SD
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Ejemplo 23: Estudio de influenza - Inicio de la inmunidad - Supervivencia y HAI
Este estudio evaluó la eficacia de una vacuna de ARNm que codifica A/PR/8 (H1N1) de influenza en ratones BALB/c hembras después de una exposición letal con virus A/PR/8 de influenza. Se vacunaron y expusieron grupos de animales después de la semana 1,2, 3 o 4. Se recogió suero de cada ratón un día antes de la exposición. Se analizaron hemorragias individuales para determinar la inhibición de la hemaglutinación utilizando A/PR/8 (H1N1) de Influenza. Los grupos de control incluyeron ratones no vacunados y ratones vacunados con el virus PR8 inactivado como control positivo. Estos animales fueron expuestos en paralelo con grupos que fueron vacunados con la vacuna de ARNm. La nexposición se realizó con una dosis letal (100 PFU) de A/p R/8/34 (H1N1) por instilación intranasal. Se controló la morbilidad de los animales usando una puntuación de salud asignada en base a un sistema de puntuación estándar, pérdida de peso y mortalidad. Todos los ratones que recibieron la vacuna de ARNm mostraron una supervivencia del 100 % y una pérdida de peso corporal mínima (Figura 12A-12D). En la semana 1 después de la vacunación, los títulos de inhibición de la hemaglutinación de los ratones que recibieron la vacuna de ARNm y los ratones que recibieron la vacuna de control positivo fueron similares. Sin embargo, en las semanas 2, 3 y 4 después de la vacunación, los ratones que recibieron la vacuna de ARNm mostraron títulos medios más altos en comparación con los ratones que recibieron la vacuna de control positivo (Figura 13).
Grupos de 15 ratones BALB/c hembra (6-8 semanas de edad) se vacunaron en la semana 0 con: ARNm encapsulado en NPL a una dosis de 0,4 mg/kg por inyección ID; virus PR8 inactivado administrado IN; o vehículo.
En las semanas 1,2, 3 y 4 después de la vacunación, los animales fueron inoculados con virus A/PR/8/34 de influenza bajo anestesia ligera. Los animales recibieron 100 pL del virus diluido en PBS hasta una concentración final de 1 * 103 PFU/mL vía instilación IN.
Se realizaron evaluaciones de salud y se registraron los pesos diariamente durante 14 días (días 0-13 después de la infección). La supervivencia y la salud se evaluaron mediante el sistema de puntuación que se muestra en la Tabla 36.
A todos los animales se les implantaron chips al menos 3 días antes de la exposición al virus que monitoreaban la temperatura corporal. Las temperaturas se registraron diariamente. Un día antes de cada exposición, se recogieron muestras de suero y el suero se analizó en un ensayo HAI.
Las curvas de supervivencia se presentan en la Figura 15. Se controló la supervivencia de los animales durante 14 días. El análisis de intervalo logarítmico se realizó en GraphPad Prism v6.
Los ratones vacunados con la vacuna de ARNm o con PR8 inactivado mostraron todos un 100 % de supervivencia, mientras que los ratones no vacunados mostraron entre 0 y 40 % de supervivencia (Tabla 40). No se detectaron disminuciones significativas en el peso corporal de los ratones tratados.
Tabla 40: Porcentaje y supervivencia media de los ratones después de la vacunación y la exposición con virus A/PR/8/34 de influenza
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Títulos de HA medios se muestran en la Figura 13 y en la Tabla 41.
Tabla 41. Títulos medios de inhibición de hemaglutinación (± DE) de ratones después de la vacunación y ex i i n n vir A PR 4 infl nz
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Los valores son la media ± DE (desviación estándar)
Estos datos demuestran que los ratones vacunados con la vacuna de ARNm a una dosis de 0.4 mg/kg o el virus ID o PR8 inactivado mostraron una supervivencia del 100 % después del exposición con el virus A/PR/8/34 de influenza en las semanas 1, 2, 3 o 4, lo que indica que la vacuna transmitía protección contra la infección por virus A/PR/8/34 de influenza en las condiciones de este estudio. La actividad de hA i permaneció baja en las semanas 1 a 4 para los animales vacunados con el virus PR8 inactivado. Los ratones vacunados con ARNm mostraron títulos medios bajos de HAI en la semana 1 después de la exposición, pero títulos aumentados en las semanas 2, 3 y 4, respectivamente.
Ejemplo 24: Evaluación de las respuestas de células T específicos de H1 y H7 en la vacuna contra la influenza Los ratones se inmunizaron ID en la semana 0 y 3 con la vacuna de ARNm que codifica la proteína HA del virus de la influenza H1N1 o H7N9 y se recolectaron esplenocitos en la semana 5. Las células T se estimularon durante 16-18 horas con una biblioteca de péptidos HA (15 proteína de longitud completa) que reproducen la secuencia H1 o H7. La estimulación no específica de las células T se realizó utilizando p Ma ionomicina. Se utilizó IFNy ELISpot para identificar la tinción para IFNy. Las células B se estimularon con una biblioteca de péptidos (15 meros de una proteína de longitud completa) que reproducen la secuencia H1 o H7. La estimulación de células B policlonales se realizó utilizando R848 rIL-2. Se utilizó ELISpot de células B para identificar la tinción para IgG específica de antígeno. Los resultados de ELISpot de IFNy demostraron un aumento de la secreción de IFNy por las células T después de la estimulación con péptidos H1 o H7 (Figuras 14A y 14B). No se observó un aumento de la secreción de iFNy en las células T estimuladas con PMA ionomicina (Figura 14C). Los resultados demostraron que las respuestas de las células T son específicas de antígenos.
Los resultados de ELISpot de células B demostraron la secreción de IgG tras la estimulación de las células B con antígeno completo, pero no con péptidos H1/H7 (Figuras 15A-15D). Era de esperar la falta de estimulación con la biblioteca de péptidos porque se estimula una respuesta de IgG a través de antígenos MHCII, que tienden a ser más largos que el antígeno MHCI necesario para la estimulación de una respuesta de células T.
Ejemplo 25: Evaluación de la respuesta de células T y B específicas de H1, H7 y H10
Contra las vacunas contra la influenza en esplenocitos de ratón
Se evaluaron las respuestas de las células T y B específicas de la influenza después de la administración de vacunas de ARNm (VAN) que codifican las proteínas de hemaglutinina H1, H10 y H7. Brevemente, 36 grupos de 5 ratones BALB/c hembras de 6 a 8 semanas de edad se vacunaron con diversas dosis por vía intradérmica (ID) el día 0. Siete semanas después de la vacunación, se sacrificaron los animales y se recogieron los bazos. Los esplenocitos se evaluaron mediante IFNy ELISpot; Tinción de citocinas intracelulares (ICS) para marcadores CD3, CD4, CD8, CD45, CCR7, CD44, CD25, IL-2 IFNy y TNFo; y por ELISpot de células B.
Análisis de IFNv ELISpot
Esplenocitos de grupos de ratones a los que se les había administrado H10N8/N1-metil pseudouridina /C0 fueron evaluados para la producción de IFNy específico de H1, H7 y H10 mediante IFNy ELISpot. Los ratones sin tratamiento previo no produjeron una respuesta de citocinas de IFNy medible, mientras que se detectaron respuestas de ELISpot de IFNy específicas del péptido H10 en ratones vacunados por vía intradérmica con H10N8/N1-metil pseudouridina /C0. Se encontró que la magnitud de estas respuestas dependía de la dosis de vacuna administrada. Los esplenocitos estimulados por péptidos no produjeron respuestas ELISpot de IFNy específicas de H1 o H7 detectables. Todos los grupos produjeron respuestas ELISpot de IFNy después de la estimulación con PMA+ionomicina (control positivo). Se detectaron respuestas ELISpot de IFNy específicas del péptido H1 a partir de esplenocitos aislados de ratones a los que se les había administrado H1N1/G2/C1, H1N1/G2/C0 (Formulación MC3), o H1N1/G2/C0 (Formulación KC2) por vía intradérmica, así como de esplenocitos de ratones a los que se les había administrado H1N1/G2/C0 (Formulación MC3) por vía intramuscular.
Se detectaron respuestas ELISpot de IFNy específicas del péptido H7 a partir de esplenocitos aislados de ratones a los que se les había administrado H7N9/G2/C0 ya sea por vía intradérmica o intramuscular.
Esplenocitos de ratones de control que habían recibido H1N1/G2/C1/PBS no mostraron respuesta a la estimulación peptídica.
Análisis ELISpot de células B
Brevemente, se detectaron respuestas de IgG e IgM específicas de H1 en varios grupos de ratones vacunados con diferentes formulaciones de la vacuna H1. También se obtuvieron respuestas de IgG e IgM específicas de H7 y H10 en la H7N9/N1-metil pseudouridina /C0- y H10N8/N1-metil pseudouridina /C0-ratones vacunados, respectivamente. Resultados de la tinción de citocina intracelular:
La tinción de citocinas intracelulares y el análisis de citometría de flujo indicaron que se indujeron respuestas de citocinas Thl (IFNy, TNFo, IL-2) específicas de H1 a las 16-18 horas y a las 48 horas en células T CD4 y células T CD8 después de la estimulación de esplenocitos de H1- ratones vacunados con el péptido o proteína correspondiente.
Además, también se detectaron respuestas Thl (IFNy, TNFo, IL-2) específicas de proteínas y péptidos H7 y H-10 en células T CD4 y CD8 . Se observaron respuestas específicas de H7 en grupos vacunados con formulaciones de vacuna H7, y se observaron respuestas específicas de H10 en grupos vacunados con formulaciones de vacuna H10.
Ejemplo 26: Evaluación de la respuesta de las células T y B específicas de H7 y H10 frente a las vacunas contra
la influenza en esplenocitos de ratón - Curso temporal
Las respuestas de células T y B específicas de la influenza se evaluaron luego de la administración de vacunas de ARNm (VAN) que codifican las proteínas de hemaglutinina H10 y H7. Brevemente, 27 grupos de 5 ratones BALB/c hembras de 6 a 8 semanas de edad (135 ratones en total) se vacunaron con varias dosis por vía intradérmica (ID) el día 0 que se muestra en la Tabla 42. Los días 7, 21 y 84 se sacrificaron grupos de 5 animales y se recogieron muestras de sangre y bazos.
Los bazos de Ios ratones se analizaron utilizando FNy ELISPOT, IgG ELISPOT (para respuestas de células B) y tinción intracelular de citocinas (ICS). Las muestras de suero se analizaron para determinar la inhibición de la hemaglutina (HAI) tratando primero con la enzima destructora del receptor (RDE) para inactivar los inhibidores no específicos de la hemaglutinación (falsos positivos) presentes en los sueros. A continuación, los sueros tratados con RDE se adsorbieron utilizando glóbulos rojos (RBC) para eliminar la aglutinina inespecífica (falsos negativos). Se preincubaron sueros tratados diluidos en serie (diluciones 2 veces) con una cantidad estandarizada de antígeno de influenza recombinante antes de que se añadieran glóbulos rojos a la mezcla. La inhibición de la hemaglutinación indica la presencia de anticuerpos específicos de HA. Se usó suero de ratón combinado anti-H10 como control positivo y mostró títulos de HAI dentro del intervalo de los datos observados previamente.
Después de recibir una dosis única de las VAN de ARNm el día 0, los títulos de HAI no se detectaron el día 7 (Tabla 42) pero se detectaron el día 21 (Tabla 43) y continuaron aumentando hasta el día 84 (Tabla 44). Los títulos del día 84 fueron de 2 a 15 veces más altos que los del día 21 (Figuras 15 y 16).
Administración de la pseudouridina H10N8 / N1-metil /C1 formulación MC3 dio como resultado títulos de HAI más altos en comparación con los títulos de HAI inducidos por el H10N8/N1-metil pseudouridina/CO formulación MC3 (Figura 17). La formulación de MC3 LNP consistía en un lípido catiónico (DLin-MC3-DMA, 50 mol %), un lípido no catiónico (DSPC, 10 mol %), un lípido PEG (PEG-DOMG 1,5 mol %) y un lípido estructural (colesterol, 38,5% en moles
Administración de H10N8 / N1 -metil pseudouridina /C1 formulación MC3 en 10 pg/dosis alcanzaron los títulos de HAI más altos, mientras que los títulos de HAI después de la administración de 2,0 pg/dosis y 0,4 pg/dosis son similares entre sí (Figura 16).
Tabla 42: Títulos de HAI contra H10 y H7 en el Día 7
Vacuna de ARNm una vez el Dosis Grupo Títulos de HAI de sueros de ratón Día 0 (10/11/2014) día 0 mediante inyección ID por (N=5) = día de vacunación 0 Día 7 (17/11/2014) =
ratón sangrados terminales grupos 1-9
(pg)
M1 M2 M3 M4 M5 Media Desviación estándar
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Tabla 44: Títulos de HAI contra H10 H7 en el Día 84
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Ejemplo 27: Análisis de hemaglutinina anti-HIO en primates no humanos - Estudio de intervalo de dosis Se vacunaron grupos de monos cynomoglus con varias dosis de VAN que codifica formulaciones H10. HA/NPL (50 pg/dosis, 200 pg/dosis, 400 pg/dosis), codificación VAN H10 HA/NPL administrado con dispositivo 3M, o codificación VAN de control H10 HA/PBS. Se tomaron muestras de suero de los monos semanalmente y se evaluaron para determinar la inhibición de la hemaglutinina (Tabla 45, Figura 19).
Tabla 45: Títulos de HAI contra proteína H10
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Ejemplo 28: Determinación del tiempo hasta el inicio de la inmunidad usando una vacuna H7N9 en un modelo de hurón
El tiempo hasta el inicio de la inmunidad (medido por los títulos de anticuerpos y la reducción de los títulos virales después de la exposición) de una influenza A/Anhui/1/2013 (H7N9) se evaluó en un modelo de hurones de infección por influenza. Brevemente, veinte grupos de 8 hurones cada uno fueron vacunados el día 0 con la vacuna VAN de ARNm de H7N9 a una dosis de 10 pg, 50 pg o 200 pg, una vacuna vH7N9 que carece de capa 14 kDa a una dosis de 200 pg, o PBS control por vía intradérmica. Cinco de los 20 grupos recibieron una segunda vacuna (un refuerzo) para determinar si una segunda dosis aumentaba la protección. A continuación, los animales fueron expuestos a influenza A/Anhui/1/2013 (H7N9) por vía intranasal. El diseño del estudio se muestra en la Tabla 45..
Tabla 45. Diseño del estudio
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Debido a que el H7N9 no induce una enfermedad letal en los hurones, el criterio de valoración principal fue la carga viral en los tejidos (principalmente pulmones) 3 días después de la exposición, según lo determinado por TCID50 (dosis infecciosa del cultivo de tejidos al 50 %). Además de los títulos virales, se extrajo sangre antes de la vacunación e inmediatamente antes de la exposición para determinar los títulos de anticuerpos específicos de influenza, según lo determinado por los ensayos de inhibición de la hemaglutinación (HAI) y microneutralización (MN).
Los datos del homogeneizado de pulmón muestran que una sola vacunación a cualquier concentración resultó en una reducción de los títulos virales, con un tiempo para el inicio de la inmunidad antes de 7 días después de la vacunación (Tabla 46). Hubo una reducción de 1 log en todos los grupos de vacunas expuestos 7 días después de la vacunación.
Esto mejoró para los grupos expuestos 21 días después de la vacunación de una manera dependiente de la dosis a una reducción logarítmica de 3, 2 y 1 para los grupos de 200, 50 y 10 pg, respectivamente (Figura 20). Esto mejoró para los grupos expuestos 49 días después de la vacunación de una manera dependiente de la dosis una reducción logarítmica de 4, 2 y 3 para los grupos de 200, 50 y 10 pg, respectivamente. Se observó una diferencia estadísticamente significativa en relación con el grupo de control de PBS a los 7 días después de la vacunación en los grupos de 10 y 200 pg (p < 0,05). El grupo de dosis de 50 pg también tendió a reducir los títulos virales pulmonares, pero solo tuvo diferencias estadísticamente significativas con respecto al grupo de PBS cuando se administró un refuerzo. Esto probablemente se debió a la muestra ocasional de títulos virales elevados, que aumentaron la variabilidad en este grupo.
Tabla 46: Car a de virus medias eo ráficas del rupo TCID50
Figure imgf000698_0003
No se observó ningún beneficio estadístico de la vacunación de refuerzo en comparación con una sola vacunación, pero esto probablemente se deba a la reducción de 2-4 logaritmos en los títulos pulmonares virales a los 49 días observada tanto en la vacunación única como en los grupos de vacunación 2 (de refuerzo) (Tabla 47).
Tabla 47: Car a de virus ulmonar medias eo ráficas del ru o TCID50 - reforzado vs. Sin refuerzo
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Se recogió suero de cada animal inmediatamente antes de la vacunación y el exposición y se analizó mediante el ensayo HAI. Como se ve en la Tabla 48, un aumento dependiente de la dosis fue visible 7 días después de la vacunación y los títulos aumentaron con el tiempo. La vacuna capa de 200 pg a 14 kDa proporcionó algún título por encima del fondo, entre la vacuna de 10 pg y la respuesta al PBS. Los grupos que recibieron una segunda vacunación mostraron un aumento dependiente de la dosis de 38 veces en los títulos de anticuerpos después de la segunda vacunación. La vacuna capa de 200 pg a 14 kDa también mostró un aumento de aproximadamente 2 veces en los títulos de anticuerpos después de la segunda vacunación. En todos los casos, se observó por primera vez un aumento estadísticamente significativo en relación con la muestra de sangre previa a la vacunación 21 días después de la vacunación (p < 0,05).
Tabla 48: Resultados del título de anticuerpos HAI
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Geomedia
Cohorte Tratamiento Día 0 Día 7 Día 21 Día 49
1 200 pg Vacuna 5,00t 5,45 N/A* N/A
1
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50 pg Vacuna 5,00 6,48 N/A N/A
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Las muestras de suero también se analizaron mediante el ensayo MN. Como se muestra en la Tabla 49, se observaron aumentos en el título de MN tan pronto como 7 días después de la vacunación y continuaron aumentando durante 49 días después de la vacunación. Los títulos fueron más altos en el grupo de vacuna de 200 |jg y fueron similares en los grupos de 50 y 10 jg . Para los grupos de dosis de vacuna de 50 y 200 jg , se observó un aumento estadísticamente significativo 7 días después de la vacunación (p < 0,05). Para los grupos de dosis de vacuna de 10 jg , el aumento significativo no se observó hasta 21 días después de la vacunación (p < 0,05). La vacuna capa de 200 jg a 14 kDa proporcionó algún título por encima del fondo, que fue estadísticamente significativo 49 días después de la vacunación (p < 0,05) y fueron inferiores a los títulos de los grupos de 50 y 10 jg . Los grupos que recibieron una segunda vacunación experimentaron un aumento de 3,0 a 4,5 veces en los títulos después de la segunda vacunación. La vacuna capa de 200 jg a 14 kDa también mostró un aumento de aproximadamente 1,5 veces en los títulos después de la segunda vacunación.
Tabla 49: Resultados del título de anticuer os MN
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Sorprendentemente, las construcciones de vacuna de la invención redujeron los títulos virales en los pulmones cuando se expusieron al virus solo 7 días después de la vacunación. Se detectaron aumentos estadísticamente significativos en el título de anticuerpos medidos por HAI y MN tan pronto como 7 días después de la vacunación. Una segunda vacunación (es decir, de refuerzo) aumentó los títulos de anticuerpos, pero no redujo estadísticamente el título viral, ya que una sola vacuna eliminó todos los virus en la mayoría de los animales. La vacuna capa de -14 kDa a 200 pg/animal proporcionó menos protección que la vacuna completa de 10 pg, pero redujo la carga viral en el pulmón y aumentó los títulos de anticuerpos, ambos en relación con el control de PBS.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Una vacuna de ácido nucleico, que comprende:
uno o más polinucleótidos de ARNm que tienen un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido antigénico, donde uno o más polinucleótidos de ARNm comprenden al menos una modificación química y se formulan en una nanopartícula lipídica que tiene una relación molar de 20-60% de lípido catiónico: 5-25 % de lípidos no catiónicos: 25-55% de esterol; y 0,5-15% de lípidos modificados con PEG,
donde la al menos una modificación química se selecciona de entre el grupo que consiste en pseudouridina, Nlmetilpseudouridina, 2-tiouridina, 4-tiouridina, 5-metilcitosina, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio- 1-metilpseudouridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-2-tiopseudouridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 4-tio-pseudouridina, 5-aza-uridina, dihidropseudouridina, 5-metoxiuridina, 2'-O-metil uridina, 1-carboximetil-pseudouridina, 1-propinil-pseudouridina, 1-taurinometil-pseudouridina, 1-taurinometil-4-tio-pseudouridina, 3-metil-pseudouridina (m3^ ), 1-metil-l-deazapseudouridina, 2-metoxiuridina, 2-metoxi-4-tio-uridina, 1-metil-3-(3-amino-3-carboxipropil) pseudouridina (acp3^ ), y 2'-0 - metil-pseudouridina (^m),
donde el polipéptido antigénico se deriva de un agente infeccioso,
donde el agente infeccioso es una cepa de Influenza A o Influenza B o combinaciones de las mismas y
donde el polipéptido antigénico es una proteína hemaglutinina o un fragmento de la misma.
2. La vacuna de la reivindicación 1, donde el lípido catiónico en un lípido catiónico ionizable, el lípido no catiónico es un lípido neutro y el esterol es un colesterol.
3. La vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la al menos una modificación química es una N1-metil pseudouridina.
4. La vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde proteína hemaglutinina comprende
a) una porción del dominio principal (HA1),
b) una porción del dominio citoplásmico, y/o
c) una porción del dominio transmembrana.
5. La vacuna de la reivindicación 1, donde el agente infeccioso es un virus seleccionado de entre el grupo que consiste en H1N1, H3N2, H7N9 y H10N8.
6. La vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la modificación química se selecciona de entre el mgrupo que consiste en pseudouridina, Nl-metilpseudouridina, 2-tiouridina, 4-tiouridina, 5-metilcitosina, 2-tio-1- metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-pseudouridina, 2-tio-5-aza- uridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-tiodihidrouridina, 2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 4-tio- pseudouridina, 5-aza-uridina, dihidropseudouridina, 5-metoxiuridina y 2'-O-metil uridina.
7. La vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde la nanopartícula lipídica tiene:
a) un diámetro medio de 50-200 nm, o
b) una carga neta neutra a pH neutro.
8. La vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde el polinucleótido de ARNm comprende un polinucleótido que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO 2459-2621.
9. La vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde el polinucleótido de ARNm comprende un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO 2254, 2259 o 2624.
10. La vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde el polinucleótido de ARNm comprende un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 2254, 2259 o 2624.
11. Una vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 para su uso en un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria específica para un antígeno en un sujeto, cuyo procedimiento comprende la administración al sujeto de la vacuna en una cantidad efectiva para producir una respuesta inmunitaria específica para un antígeno.
12. Una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1-10 para su uso en un procedimiento para impedir o tratar la infección viral de la influenza, comprendiendo el procedimiento administrar la vacuna a un sujeto.
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