ES2909074T3

ES2909074T3 - Proteínas de fusión ELP para liberación controlada y sostenida

Info

Publication number: ES2909074T3
Application number: ES17793073T
Authority: ES
Inventors: James Jowett; David Ballance
Original assignee: Phasebio Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Phasebio Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2016-05-06
Filing date: 2017-05-01
Publication date: 2022-05-05
Anticipated expiration: 2037-05-01
Also published as: KR20190005171A; US20190218274A1; CN118078955A; JP2019514949A; CA3021644A1; BR112018072783A2; AU2017261216B2; AU2017261216A1; EP3452021A1; KR102449167B1; CN118078956A; WO2017192449A1; AU2023254863A1; EP4043010A1; EP3452021B1; CN109310641A; KR102646323B1; JP7050003B2; MX2018013546A; EP3452021A4

Abstract

Una formulación farmacéutica de liberación sostenida, que comprende: un agente terapéutico para administración sistémica, comprendiendo el agente terapéutico un agente activo proteico y al menos 60 unidades estructurales de péptido similar a elastina (ELP) de SEQ ID NO: 3, y en el que el agente activo proteico es un agonista del receptor del péptido similar a glucagón (GLP)-2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de fusión ELP para liberación controlada y sostenida

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente descripción se refiere a formulaciones farmacéuticas para liberación sostenida, y a su uso en métodos para suministrar un régimen de tratamiento.

ANTECEDENTES

La eficacia de los fármacos peptídicos y de moléculas pequeñas a menudo está limitada por la vida media de dichos fármacos en la circulación, así como por las dificultades para obtener niveles plasmáticos sustancialmente constantes. Por ejemplo, la incretina GLP-1 debe administrarse en dosis relativamente altas para contrarrestar su corta vida media en la circulación, y estas dosis altas se asocian con náuseas, entre otras cosas (Murphy and Bloom, Nonpeptidic glucagon-like peptide 1 receptor agonists: A magic bullet for diabetes? PNAS 104 (3):689-690 (2007)). Además, el agente peptídico péptido intestinal vasoactivo (VIP) exhibe una vida media, en algunas estimaciones, de menos de un minuto, lo que hace que este agente no sea práctico para uso farmacéutico (Domschke et al., Vasoactive intestinal peptide in man: pharmacokinetics, metabolic and circulatory effects, Gut 19:1049-1053 (1978); Henning and Sawmiller, Vasoactive intestinal peptide: cardiovascular effects, Cardiovascular Research 49:27-37 (2001)). Una vida media plasmática corta para los fármacos peptídicos a menudo se debe a la eliminación renal rápida, así como a la degradación enzimática durante la circulación sistémica.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

La invención está definida por el conjunto de reivindicaciones adjunto.

La presente descripción, que comprende la invención, proporciona formulaciones farmacéuticas para liberación sostenida, y su uso para suministrar un régimen de tratamiento. La descripción proporciona de ese modo una farmacocinética mejorada para fármacos peptídicos y de moléculas pequeñas.

En algunos aspectos, la descripción proporciona una formulación farmacéutica de liberación sostenida. La formulación incluye un agente terapéutico para administración sistémica, en la que el agente terapéutico incluye un agente activo y una secuencia de aminoácidos capaz de formar una matriz reversible a la temperatura corporal de un sujeto. La matriz reversible se forma a partir de enlaces de hidrógeno (por ejemplo, enlaces de hidrógeno intra- y/o intermoleculares), así como de contribuciones hidrófobas. La formulación incluye además uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. La matriz proporciona una absorción lenta a la circulación desde un sitio de inyección. La liberación sostenida, o absorción lenta desde el sitio de inyección, se debe a una inversión lenta de la matriz a medida que la concentración se disipa en el sitio de inyección. Una vez que el producto pasa a la circulación, la formulación confiere una vida media prolongada y una estabilidad mejorada. De este modo, se logra una combinación única de absorción lenta y vida media prolongada que conduce a un perfil PK deseable con un pico a valle bajo (Cmax a Cmin) y Tmax retrasado o tardío.

La secuencia de aminoácidos capaz de formar una matriz reversible a la temperatura corporal de un sujeto es una secuencia de péptido similar a elastina (ELP). La secuencia de ELP incluye o consiste en unidades de péptidos estructurales o secuencias que están relacionadas con, o imitan, la secuencia repetida presente en la proteína elastina. Según la invención, la secuencia de ELP comprende o consiste en al menos 60 unidades estructurales de ELP de SEQ ID NO.3. La secuencia de aminoácidos de ELP puede exhibir una transición de fase inversa visible y reversible en la formulación seleccionada. Es decir, la secuencia de aminoácidos puede estar estructuralmente desordenada y ser altamente soluble en la formulación por debajo de una temperatura de transición (Tt), pero exhibir una transición de fase brusca (intervalo de 2-3°C) de desorden a orden cuando la temperatura de la formulación se eleva por encima de la Tt. En algunos casos, la presente descripción proporciona agentes terapéuticos que tienen temperaturas de transición entre alrededor de 26°C y alrededor de 37°C. Además de la temperatura, la longitud del polímero ELP, la composición de aminoácidos del ELP, la fuerza iónica, el pH, la presión, los disolventes seleccionados, la presencia de solutos orgánicos, y la concentración de proteínas también pueden afectar las propiedades de transición, y éstos pueden adaptarse para el perfil de absorción deseado. La concentración de proteína y la concentración de sal afectan las propiedades de transición (por ejemplo, la temperatura de transición).

El agente activo para la administración sistémica es una proteína o un péptido, que puede tener una vida media circulatoria corta, tal como de alrededor de 30 segundos a alrededor de 1 hora, a alrededor de 2 horas, o a alrededor de 5 horas, o de 30 segundos a alrededor de 10 horas. El agente terapéutico puede ser una proteína de fusión recombinante entre el agente activo proteico y la secuencia de aminoácidos capaz de formar la matriz. Según la invención, el agente activo peptídico es un agonista del receptor de GLP-2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70. Al proporcionar una absorción lenta desde el sitio de inyección, se puede controlar el aclaramiento y la degradación renal, logrando así el perfil PK deseado.

En otros aspectos, la descripción proporciona la formulación de la invención para uso como medicamento. La formulación se puede administrar de alrededor de 1 a alrededor de 8 veces al mes. La formulación puede administrarse semanalmente, y puede administrarse por vía subcutánea o intramuscular (por ejemplo). Opcionalmente, el sitio de administración no es un sitio patológico, es decir, el agente terapéutico no se administra directamente en el sitio de acción pretendido.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 A-B muestra la potencia de las construcciones de CNP.

La Figura 2A-C muestra el efecto sobre el crecimiento de la inyección subcutánea de ratones macho FVB/nJ de cinco semanas de edad (n = 12/grupo) con PE0552 o disolución salina (control) tres veces por semana. El efecto sobre el crecimiento se determinó midiendo la longitud de la nariz a la cola (A), la nariz al ano (B), y la longitud de la cola (C). Los gráficos muestran las medidas medias y el error estándar para cada grupo.

La Figura 3A-C muestra el efecto sobre el crecimiento de la inyección subcutánea de ratones machos FVB/nJ de tres semanas de edad (n = 11/grupo) con PE9206, PE9216, PE9306, PE9326, o disolución salina (control) diariamente durante 3 semanas. El efecto sobre el crecimiento se determinó midiendo la longitud de la nariz a la cola (A), la longitud de la nariz al ano (B), y la longitud de la cola (C). Los gráficos muestran el cambio medio en el crecimiento frente al valor inicial durante el período de 3 semanas.

La Figura 4 muestra el efecto sobre el peso del intestino delgado de la inyección subcutánea de PE0503 o GLP-2 (A2G) durante un período de dosificación de once días en ratas macho Sprague Dawley (200 - 220 g, n = 12/grupo). La dosificación fue la siguiente: grupo de vehículo dosificado con disolución salina diariamente; PE0503 dosificada Q1D, con PE0503 a 1,3 mg/kg una vez al día; PE0503 dosificada Q2D, con PE0503 a 5,1 mg/kg en días alternos; PE0503 dosificada Q4D, con PE0503 a 20,5 mg/kg una vez cada cuatro días; GLP-2(A2G) dosificada TID, dos veces al día con 0,1 mg/kg de GLP2(A2G).

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La invención está definida por el conjunto de reivindicaciones adjunto. La presente descripción que comprende la invención proporciona formulaciones farmacéuticas para liberación sostenida, y métodos para suministrar un régimen de tratamiento con las formulaciones de liberación sostenida. Las composiciones farmacéuticas descritas aquí tienen mayor eficacia, biodisponibilidad, vida media circulatoria, persistencia, resistencia a la degradación, etc. De ese modo, la descripción proporciona una farmacocinética mejorada para agentes activos, tales como péptidos y fármacos de molécula pequeña, que incluyen un perfil PK relativamente plano con una relación baja de pico a valle, y/o un Tmax largo. El perfil PK se puede mantener con un programa de administración relativamente poco frecuente, tal como de una a ocho inyecciones por mes en algunos casos.

En algunos aspectos, la descripción proporciona formulaciones farmacéuticas de liberación sostenida. La formulación incluye agentes terapéuticos para administración sistémica, en la que el agente terapéutico incluye un agente activo y una secuencia de aminoácidos capaz de formar una matriz o coacervado a la temperatura corporal de un sujeto. La matriz reversible se forma a partir de enlaces de hidrógeno (por ejemplo, enlaces de hidrógeno intra- y/o intermoleculares), así como de contribuciones hidrófobas. La formulación incluye además uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. La matriz proporciona una absorción lenta a la circulación desde un sitio de inyección. Sin pretender imponer ninguna teoría, esta lenta absorción se debe a la lenta inversión de la matriz o coacervado en la periferia del depósito del sitio de inyección. El perfil de absorción lenta proporciona un perfil PK plano, así como un régimen de administración conveniente y cómodo. Por ejemplo, la concentración plasmática del agente activo a lo largo de los días (por ejemplo, de 2 a alrededor de 60 días, o de alrededor de 4 a alrededor de 30 días) no cambia en más de un factor de 20, o en más de un factor de alrededor de 10, o en más de un factor de alrededor de 5, o en más que un factor de alrededor de 3. Generalmente, este perfil PK plano se observa en una pluralidad de administraciones (espaciadas de forma sustancialmente uniforme), tal como al menos alrededor de 2, al menos alrededor de 5, o al menos alrededor de 10 administraciones de la formulación. En algunos casos, la absorción lenta se manifiesta por un T max (tiempo hasta la concentración plasmática máxima) de más de alrededor de 5 horas, más de alrededor de 10 horas, más de alrededor de 20 horas, más de alrededor de 30 horas, o más de alrededor de 50 horas.

SECUENCIAS DE AMINOÁCIDOS QUE FORMAN UNA MATRIZ REVERSIBLE

La liberación sostenida, o absorción lenta desde el sitio de inyección, está controlada por la secuencia de aminoácidos capaz de formar una matriz con enlaces de hidrógeno o coacervado a la temperatura corporal del sujeto.

La secuencia de aminoácidos contiene unidades estructurales que forman enlaces de hidrógeno a través de grupos de cadena principal y/o grupos de cadenas laterales de proteínas, y que pueden contribuir con interacciones hidrófobas a la formación de la matriz. En algunos casos, las cadenas laterales de aminoácidos no contienen grupos donantes de enlaces de hidrógeno, formándose enlaces de hidrógeno sustancialmente a través del esqueleto de la proteína.

Los ejemplos de aminoácidos incluyen prolina, alanina, valina, glicina, e isoleucina, y aminoácidos similares. En algunos casos, las unidades estructurales son unidades estructurales sustancialmente repetitivas, para crear un motivo estructural sustancialmente repetitivo y una capacidad de formación de enlaces de hidrógeno sustancialmente repetitiva. En estos y otros casos, la secuencia de aminoácidos contiene al menos alrededor de 10%, al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 40%, o al menos alrededor de 50% de prolina, que puede estar posicionada en un patrón sustancialmente repetitivo. En este contexto, un patrón sustancialmente repetitivo significa que al menos alrededor de 50% o al menos alrededor de 75% de los restos de prolina de la secuencia de aminoácidos son parte de una unidad estructural definible. Todavía en otros casos, la secuencia de aminoácidos contiene aminoácidos con cadenas laterales donantes de enlaces de hidrógeno, tales como serina, treonina, y/o tirosina. En algunos casos, la secuencia repetitiva puede contener de uno a alrededor de cuatro restos de prolina, seleccionándose los restos restantes independientemente de restos no polares, tales como glicina, alanina, leucina, isoleucina, y valina. Los restos no polares o hidrófobos pueden contribuir con interacciones hidrófobas a la formación de la matriz.

En otros casos, la secuencia de aminoácidos capaz de formar la matriz a la temperatura corporal puede incluir una estructura de espiral aleatoria o una estructura extendida no globular. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos capaz de formar la matriz a temperatura corporal puede comprender una secuencia de aminoácidos descrita en la Publicación de Patente U.S. No. 2008/0286808, Publicación de Patente WIPO No. 2008/155134, y Publicación de Patente U.S. No. 2011/0123487.

En algunos casos, la secuencia de aminoácidos incluye un polímero recombinante no estructurado de al menos 40 aminoácidos. El polímero no estructurado puede incluir más de alrededor de 100, alrededor de 150, alrededor de 200, o más aminoácidos contiguos. En algunos casos, la secuencia de aminoácidos forma un dominio de espiral aleatoria. En particular, un polipéptido o polímero de aminoácidos que tiene o que forma una «conformación de hélice aleatoria» carece sustancialmente de una estructura secundaria y terciaria definida. En algunos casos, el polímero no estructurado se define como un polímero que tiene al menos 40 aminoácidos, en el que el número total de restos de glicina (G), aspartato (D), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) y prolina (P) constituye más de alrededor de 80% del total de aminoácidos en el polímero. En algunos casos, al menos el 50% de los aminoácidos carecen de estructura secundaria según lo determinado por el algoritmo de Chou-Fasman.

Las secuencias de aminoácidos pueden formar un estado "similar a un gel" tras la inyección a una temperatura mayor que la temperatura de almacenamiento. Las secuencias ejemplares tienen unidades peptídicas repetitivas, y/o pueden estar relativamente no estructuradas a la temperatura más baja, y alcanzar un estado estructurado con enlaces de hidrógeno a la temperatura más alta.

Péptidos similares a elastina (ELP)

En algunos casos, la secuencia de aminoácidos capaz de formar una matriz a la temperatura corporal es un péptido que tiene unidades repetitivas de cuatro a diez aminoácidos. La unidad repetitiva puede formar uno, dos o tres enlaces de hidrógeno en la formación de la matriz. En ciertos casos, la secuencia de aminoácidos capaz de formar una matriz a la temperatura corporal es una secuencia de aminoácidos de seda, elastina, colágeno, queratina, o imitadora de los mismos, o una secuencia de aminoácidos descrita en La Patente U.S. 6.355.776.

En ciertos casos, la secuencia de aminoácidos es una secuencia de péptido similar a elastina (ELP). La secuencia de ELP incluye o consiste en unidades peptídicas estructurales o secuencias que están relacionadas con, o imitan a, la proteína elastina. La secuencia de ELP se construye a partir de unidades estructurales de tres a alrededor de veinte aminoácidos, o en algunos casos, de alrededor de cuatro a alrededor de diez aminoácidos, tal como alrededor de cuatro, alrededor de cinco, o alrededor de seis aminoácidos. La longitud de las unidades estructurales individuales puede variar o puede ser uniforme. Esta descripción proporciona unidades estructurales ejemplares definidas por SEQ ID NOS: 1-13 (más abajo), que pueden emplearse como unidades estructurales repetitivas, incluyendo unidades repetitivas en tándem, o pueden emplearse en alguna combinación. Según la invención, el ELP comprende unidades estructurales de SEQ ID NO:3. Así, el ELP de la invención puede comprender o consistir esencialmente en unidades estructurales seleccionadas de SEQ ID NO: 3, como se define más abajo.

En algunos casos, incluyendo casos en los que las unidades estructurales son unidades de ELP, la secuencia de aminoácidos incluye o consiste esencialmente en alrededor de 1 a alrededor de 500 unidades estructurales, o alrededor de 9 a alrededor de 200 unidades estructurales, o alrededor de 10 a 200 unidades estructurales, o alrededor de 50 a alrededor de 200 unidades estructurales, o alrededor de 80 a alrededor de 200 unidades estructurales, o alrededor de 80 a alrededor de 150 unidades estructurales. Según la invención, la secuencia de aminoácidos incluye o consiste esencialmente en 60 unidades estructurales, en la que las unidades estructurales son unidades de ELP definidas por SEQ ID NO: 3. La descripción también proporciona casos en los que el ELP incluye una combinación de unidades definidas por SEQ ID NOs: 1-13. En casos ejemplares, la secuencia de aminoácidos de la unidad estructural de ELP incluye o consiste esencialmente en alrededor de 80 unidades estructurales, alrededor de 90 unidades estructurales, alrededor de 100 unidades estructurales, alrededor de 120 unidades estructurales, alrededor de 140 unidades estructurales, alrededor de 144 unidades estructurales unidades, alrededor de 160 unidades estructurales, alrededor de 180 unidades estructurales, alrededor de 200 unidades estructurales, o alrededor de 500 unidades estructurales. En casos ejemplares, las unidades estructurales colectivamente tienen una longitud de alrededor de 300 restos de aminoácidos, alrededor de 400 restos de aminoácidos, alrededor de 500 restos de aminoácidos, alrededor de 600 restos de aminoácidos, alrededor de 700 restos de aminoácidos, alrededor de 720 restos de aminoácidos, alrededor de 800 restos de aminoácidos, o alrededor de 1000 restos de aminoácidos.

La secuencia de aminoácidos puede exhibir una transición de fase inversa visible y reversible con la formulación seleccionada. Es decir, la secuencia de aminoácidos puede estar estructuralmente desordenada y ser altamente soluble en la formulación por debajo de una temperatura de transición (Tt), pero exhibir una transición de fase brusca (intervalo de 2-3°C) de desorden a orden, o coacervación, cuando la temperatura de la formulación se eleva por encima de la Tt. Además de la temperatura, la longitud del polímero de aminoácidos, la composición de aminoácidos, la fuerza iónica, el pH, la presión, los disolventes seleccionados, la presencia de solutos orgánicos, y la concentración de proteínas también pueden afectar las propiedades de transición, y éstos pueden adaptarse en la formulación para el perfil de absorción deseado. El perfil de absorción se puede evaluar fácilmente determinando la concentración plasmática o la actividad del agente activo a lo largo del tiempo.

Según la invención, el componente de ELP puede estar formado por la unidad estructural:

el pentapéptido Val-Pro-Gly-X-Gly (SEQ ID NO: 3), o VPGXG, en el que X es cualquier resto de aminoácido natural o no natural excepto prolina, y en el que X varía opcionalmente entre repeticiones poliméricas u oligoméricas.

La descripción también proporciona otras unidades estructurales de ELP, que incluyen:

(a) el tetrapéptido Val-Pro-Gly-Gly o VPGG (SEQ ID NO: 1);

(b) el tetrapéptido Ile-Pro-Gly-Gly o IPGG (SEQ ID NO: 2);

(c) el pentapéptido Ala-Val-Gly-Val-Pro, o AVGVP (SEQ ID NO: 4);

(d) el pentapéptido Ile-Pro-Gly-X-Gly, o IPGXG (SEQ ID NO: 5), donde X es cualquier residuo aminoacídico natural o no natural, y donde X varía opcionalmente entre repeticiones poliméricas u oligoméricas;

(e) el pentapéptido Ile-Pro-Gly-Val-Gly o IPGVG (SEQ ID NO: 6);

(f) el pentapéptido Leu-Pro-Gly-X-Gly o LPGXG (SEQ ID NO: 7), en el que X es

cualquier resto de aminoácido natural o no natural, y en el que X varía opcionalmente entre repeticiones poliméricas u oligoméricas;

(g) el pentapéptido Leu-Pro-Gly-Val-Gly o LPGVG (SEQ ID NO: 8);

(h) el hexapéptido Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly o VAPGVG (SEQ ID NO: 9);

(i) el octapéptido Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Val-Gly o GVGVPGVG (SEQ ID NO: 10);

(j) el nonapéptido Val-Pro-Gly-Phe-Gly-Val-Gly-Ala-Gly o VPGFGVGAG (SEQ ID NO: 11);

(k) los nonapéptidos Val-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Gly o VPGVGVPGG (SEQ ID NO: 12); y

(l) el pentapéptido Xaa-Pro-Gly-Val-Gly o XPGVG (SEQ ID NO:13) donde X es cualquier residuo aminoacídico natural o no natural, y donde X varía opcionalmente entre repeticiones poliméricas u oligoméricas.

En los casos de la descripción, tales unidades estructurales definidas por SEQ ID NOs: 1-13 pueden formar unidades estructurales repetitivas, o pueden usarse en combinación para formar un ELP. En algunos casos, el componente de ELP está formado enteramente (o casi enteramente) por una o una combinación de (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10) unidades estructurales seleccionadas de SEQ ID NOs: 1-13. En otros casos, al menos alrededor de 75%, o al menos alrededor de 80%, o al menos alrededor de 90% del componente de ELP está formado por una o una combinación de unidades estructurales seleccionadas de SEQ ID NOs: 1-13, y que pueden estar presentes como unidades repetitivas.

En ciertos casos, el ELP contiene unidades repetidas, incluyendo unidades repetitivas en tándem, de Val-Pro-Gly-X-Gly (SEQ ID NO: 3), en las que X es como se definió anteriormente, y en el que el porcentaje de unidades de Val-Pro-Gly-X-Gly (SEQ ID NO: 3), tomado con respecto al componente de ELP completo (que puede comprender unidades estructurales distintas de VPGXG (SEQ ID NO: 3)), es mayor que alrededor de 50%, o mayor que alrededor de 75%, o mayor que alrededor de 85%, o mayor que alrededor de 95% del ELP. El ELP puede contener motivos de 5 a 15 unidades estructurales (por ejemplo alrededor de 9 o alrededor de 10 unidades estructurales) de SEQ ID NO: 3, donde el residuo invitado X varía entre al menos 2 o al menos 3 de las unidades en el motivo. Los residuos invitado se pueden seleccionar independientemente, tal como entre residuos no polares o hidrófobos, tales como los aminoácidos V, I, L, A, G y W (y se pueden seleccionar de modo que se conserve una propiedad de la transición de fase deseada). En ciertos casos, los restos invitados se seleccionan de V, G, y A.

En ciertos casos, el ELP contiene unidades repetitivas, incluyendo unidades repetitivas en tándem de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-13 ya sean solas o combinadas. En algunos casos, el ELP contiene repeticiones de dos o más de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1 -13 combinadas. En ciertos casos, el ELP contiene repeticiones de SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 13. En algunos casos, el ELP contiene repeticiones de SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 13, donde los residuos invitado se seleccionan independientemente, tal como entre residuos no polares o hidrófobos, tales como los aminoácidos V, I, L, A, G y W (y se pueden seleccionar de modo que se conserve una propiedad de la transición de fase deseada). En ciertos casos, los restos invitados se seleccionan de V, G, y A.

En algunos casos, el ELP incluye 9-meros que incluyen nueve copias de una o más unidades estructurales de ELP descritas aquí. En algunos casos, el ELP incluye 9-meros que incluyen nueve copias de un pentapéptido descrito aquí. En algunos casos, el ELP incluye 9-meros que incluyen SEQ ID NOs: 3 y 13 en cualquier combinación. En algunos casos, el ELP incluye una secuencia que alterna entre SEQ ID NOs: 3 y 13. Los ELP de números variables de 9-meros se pueden combinar para producir los ELP con, por ejemplo, 18, 27, 36, 45, 54, 63, 72, 81, 90, 99, 108, 117, 126, 135, 144, 153, 162, 171, o 180 copias del 9-mero.

En ciertos casos, el ELP incluye 9-meros que incluyen SEQ ID NO: 3, en la que el resto invitado se selecciona de V, G, y A. En ciertos casos, el ELP incluye 9-meros que incluyen SEQ ID NO: 3, donde V, G y A están en una proporción de 7:2:0 (alfa). En ciertos casos, el ELP incluye 9-meros que incluyen SEQ ID NO:3, en los que V, G y A están en una proporción de 7:0:2 (beta v1). En ciertos casos, el ELP incluye 9-meros que incluyen SEQ ID NO:3, en los que V, G y A están en una proporción de 6:0:3 (beta v2). En ciertos casos, el ELP incluye 9-meros que incluyen SEQ ID NO:3, en los que V, G y A están en una proporción de 5:2:2 (gamma). En ciertos casos, el ELP incluye 9-meros que incluyen SEQ ID NO: 13, en el que el resto invitado se selecciona de V, G y A. En ciertos casos, ELP incluye 9-meros que incluyen SEQ ID NO: 13, en los que V, G y A están en la proporción de 5:0:4 (delta). Los 9-meros ejemplares se describen en la Tabla 1. La Tabla 2 demuestra las temperaturas de transición de varios 9-meros ejemplares.

Tabla 1 Relaciones de restos invitado en 9-meros ejemplares. Los polímeros de ELP tienen hidrofobias entre la serie 1 de ELP de 10-meros (menos hidrófoba) y la serie 4 de ELP de 10-meros (más hidrófoba).

Tabla 2 Comparación de las temperaturas de transición medidas de 9-meros ejemplares con la serie ELP1. La inflexión de la turbidez medida con un espectrofotómetro Cary es el resultado de la transición de fase del biopolímero de ELP.

En algunos casos, el ELP incluye combinaciones de los 9-meros enumerados en la Tabla 1. En algunos casos, el ELP incluye combinaciones de los 9-meros alfa, beta v1, beta v2, y/o delta. Por ejemplo, el ELP gamma se construye alternando entre un 9-mero alfa y un 9-mero beta v1 durante 16 copias hasta que se construye un 144mero. En ciertos casos, el ELP incluye combinaciones de 9-meros alfa y beta v1. En ciertos casos, el ELP incluye combinaciones de 9-meros alfa y beta v2. En ciertos casos, el ELP incluye combinaciones de 9-meros alfa y delta. En ciertos casos, el ELP incluye combinaciones de 9-meros beta v1 y beta v2. En ciertos casos, el ELP incluye combinaciones de 9-meros beta v1 y delta. En ciertos casos, el ELP incluye combinaciones de 9-meros beta v2 y delta. En ciertos casos, el ELP incluye combinaciones de 9-meros alfa, beta v1, y beta v2. En ciertos casos, el ELP incluye combinaciones de 9-meros alfa, beta v1 y delta. En ciertos casos, el ELP incluye combinaciones de 9-meros alfa, beta v2 y delta. Por ejemplo, en disposiciones particulares, el ELP beta v2 puede incluir los siguientes residuos invitado en unidades estructurales iteradas en la siguiente secuencia: A-V-A-V-V-A-V-A-V. La secuencia iterada puede repetirse secuencialmente en el ELP alrededor de 10 veces, alrededor de 12 veces, alrededor de 15 veces, alrededor de 16 veces, alrededor de 20 veces, alrededor de 25 veces, alrededor de 30 veces, o alrededor de 35 veces o más. En algunos aspectos, el ELP contiene de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 secuencias iteradas. En otros aspectos, el ELP contiene de aproximadamente 15 a 20 secuencias iteradas. En algunos aspectos, el ELP contiene aproximadamente 16 secuencias iteradas.

En algunos casos, el ELP incluye 10-meros que incluyen diez copias de una o más unidades estructurales de ELP descritas aquí. En algunos casos, el ELP incluye 10-meros que incluyen diez copias de un pentapéptido descrito aquí. En algunos casos, el ELP incluye 10-meros que incluyen s Eq ID NOs: 3 y 13 en cualquier combinación. En algunos casos, el ELP incluye una secuencia que alterna entre SEQ ID NOs: 3 y 13. Los ELP de números variables de 10-meros se pueden combinar para producir los ELP con, por ejemplo, 20, 30, 40, 60, 90, 100, 120, 150, 160, o 200 copias del 10-mero. Los 10-meros ejemplares se describen en la Tabla 3.

Tabla 3 Relaciones de restos invitado en 10-meros ejemplares. Los polímeros de ELP tienen hidrófobas entre la serie 1 de ELP (menos hidrófoba) y la serie 4 de ELP (más hidrófoba).

En algunos casos, el ELP puede formar una estructura de giro p. En la solicitud de patente internacional PCT/US96/05186 se describen secuencias peptídicas a modo de ejemplo adecuadas para crear una estructura de giro p. Por ejemplo, el cuarto resto (X) en la secuencia VPGXG (SEQ ID NO: 3) puede variarse sin eliminar la formación de un giro p.

La estructura de los ELP ejemplares puede describirse usando la notación ELPk [XiYj-n], en la k designa una unidad de repetición de ELP particular, las letras mayúsculas entre corchetes son códigos de aminoácidos de una sola letra, y sus subíndices correspondientes designan la relación relativa de cada resto invitado X en las unidades estructurales (cuando corresponda), y n describe la longitud total del ELP, en número, de las repeticiones estructurales. Por ejemplo, ELP1 [V⁵A²G³-¹⁰] designa un componente de ELP que contiene 10 unidades repetitivas del pentapéptido VPGXG (SEQ ID NO: 3), en el que X es valina, alanina, y glicina en una relación relativa de alrededor de 5:2:3; ELP1 [K¹V²F¹-4] designa un componente de ELP que contiene 4 unidades repetitivas del pentapéptido VPGXG (SEQ ID NO: 3), en el que X es lisina, valina, y fenilalanina en una relación relativa de alrededor de 1:2:1; ELP1 [K¹V⁷F¹-⁹] designa un polipéptido que contiene 9 unidades repetitivas del pentapéptido VPGXG (SEQ ID NO: 3), en el que X es lisina, valina y fenilalanina en una relación relativa de alrededor de 1:7:1; ELP1 [V-5] designa un polipéptido que contiene 5 unidades repetitivas del pentapéptido VPGXG (SEQ ID NO:3), en el que X es valina; ELP1 [V-20] designa un polipéptido que contiene 20 unidades repetitivas del pentapéptido VPGXG (SEQ ID NO: 3), en el que X es valina; ELP2 [5] designa un polipéptido que contiene 5 unidades repetitivas del pentapéptido AVGVP (SEQ ID NO: 4); ELP3 [V-5] designa un polipéptido que contiene 5 unidades repetitivas del pentapéptido IPGXG (SEQ ID NO: 5); donde X es valina; ELP4 [V-5] designa un polipéptido que contiene 5 unidades repetitivas del pentapéptido LPGXG (SEQ ID NO: 7), donde X es valina.

Con respecto a ELP, la Tt es una función de la hidrofobia del resto invitado. De este modo, al variar la identidad del resto o restos invitado y su fracción o fracciones molares, se pueden sintetizar los ELP que muestren una transición de fase inversa en un amplio intervalo de temperaturas. Por lo tanto, se puede reducir la Tt con una longitud de ELP concreta incorporando una fracción mayor de residuos invitado hidrófobos en la secuencia de ELP. Los ejemplos de residuos invitado hidrófobos incluyen valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, triptófano y metionina. También se puede utilizar tirosina, que es moderadamente hidrófoba. En consecuencia, se puede aumentar la Tt incorporando residuos tales como los seleccionados entre: ácido glutámico, cisteína, lisina, aspartato, alanina, asparagina, serina, treonina, glicina, arginina y glutamina.

Para polipéptidos que tienen un peso molecular >100.000, la escala de hidrofobia descrita en el documento PCT/US96/05186 proporciona un medio para predecir la Tt aproximada de una secuencia de ELP específica. Para polipéptidos que tienen un peso molecular <100.000, la Tt puede predecirse o determinarse mediante la siguiente función cuadrática: Tt = M0 MIX M2X2 donde X es el p M de la proteína de fusión, y M0 = 116,21; M1 = -1,7499; M2 = 0,010349.

El ELP en algunos casos se selecciona o diseña para proporcionar una Tt que oscila de alrededor de 10 a alrededor de 37°C, tal como de alrededor de 20 a alrededor de 37°C, o de alrededor de 25°C a alrededor de 37°C. En algunos casos, la temperatura de transición en condiciones fisiológicas (por ejemplo, disolución salina al 0,9%) es de alrededor de 34°C a 36°C, para tener en cuenta una temperatura corporal periférica ligeramente más baja.

En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]m, en el que m es cualquier número de 1 a 200. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]m, en el que m es cualquier número de 1 a 200, y cada X se selecciona de V, G, y A. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]m, en el que m es cualquier número de 1 a 200, cada X se selecciona de V, G, y A, y en el que la relación de V:G:A puede ser alrededor de 5:3:2. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]⁶⁰, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A puede ser de alrededor de 5:3:2. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]gü, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A puede ser de alrededor de 5:3:2. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos capaz de formar la matriz con enlaces de hidrógeno a temperatura corporal incluye [VPGXG]¹²⁰, en la que cada X se selecciona de V, G, y A, y en la que la relación de V:G:A puede ser alrededor de 5:3:2. Como se muestra aquí, 120 unidades estructurales de este ELP pueden proporcionar una temperatura de transición de alrededor de 37°C con alrededor de 5 a 15 mg/ml (por ejemplo, alrededor de 10 mg/ml) de proteína. A concentraciones de alrededor de 50 a alrededor de 100 mg/ml, la temperatura de transición de fase es alrededor de 35,5 grados centígrados (justo por debajo de la temperatura corporal), lo que permite que la temperatura corporal periférica sea un poco menos de 37°C. En algunos casos, el ELP puede incluir [VPGXG]144, en el que cada X se selecciona de V, G, y A, y en el que la relación de V:G:A puede ser alrededor de 5:3:2. En algunos casos, el ELP incluye [VPGXG]¹⁸⁰, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A puede ser de alrededor de 5:3:2.

En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]m, en el que m es cualquier número de 1 a 200, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que relación de V:G:A es de alrededor de 7:2:0. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]⁶⁰, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 7:2:0. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]90, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 7:2:0. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]¹⁰⁸, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 7:2:0. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]¹²⁰, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 7:2:0. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]144, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 7:2:0. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]⁸⁰, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 7:2:0.

En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]m, en el que m es cualquier número de 1 a 200, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que relación de V:G:A es de alrededor de 7:0:2. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]⁶⁰, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 7:0:2. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]90, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 7:0:2. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]¹⁰⁸, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 7:0:2. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]¹²⁰, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 7:0:2. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]144, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 7:0:2. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]¹⁸⁰, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 7:0:2.

En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]m, en el que m es cualquier número de 1 a 200, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que relación de V:G:A es de alrededor de 6:0:3. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]⁶⁰, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 6:0:3. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]90, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 6:0:3. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]¹⁰⁸, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 6:0:3. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]¹²⁰, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 6:0:3. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]144, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 6:0:3. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]¹⁸⁰, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 6:0:3.

En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]m, en el que m es cualquier número de 1 a 200, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que relación de V:G:A es de alrededor de 5:2:2. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]⁶⁰, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 5:2:2. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]90, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 5:2:2. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]¹⁰⁸, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 5:2:2. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]¹²⁰, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 5:2:2. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]144, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 5:2:2. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]¹⁸⁰, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 5:2:2.

En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]m, en el que m es cualquier número de 1 a 200, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que relación de V:G:A es de alrededor de 10:0:0. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]⁶⁰, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 10:0:0. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]90, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 10:0:0. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]¹⁰⁸, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 10:0:0. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]¹²⁰, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 10:0:0. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]144, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 10:0:0. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]¹⁸⁰, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 10:0:0.

En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]m, en el que m es cualquier número de 1 a 100, en el que cada X se selecciona de V y L, y en el que la relación de V:L es alrededor de 3:7 o alrededor de 4:6 o alrededor de 1:1 o alrededor de 6:4 o alrededor de 3:7. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]⁶⁰, en el que cada X se selecciona de V y L, y en el que la relación de V:L es alrededor de 3:7 o alrededor de 4:6 o alrededor de 1:1 o alrededor de 6:4 o alrededor de 3:7. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]50, en el que cada X se selecciona de V y L, y en el que la relación de V:L es alrededor de 3:7 o alrededor de 4:6 o alrededor de 1:1 o alrededor de 6:4 o alrededor de 3:7. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]40, en el que cada X se selecciona de V y L, y en el que la relación de V:L es alrededor de 3:7 o alrededor de 4:6 o alrededor de 1:1 o alrededor de 6:4 o alrededor de 3:7. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]30, en el que cada X se selecciona de V y L, y en el que la relación de V:L es alrededor de 3:7 o alrededor de 4:6 o alrededor de 1:1 o alrededor de 6:4 o alrededor de 3:7. En ciertos casos, el ELP incluye [VPGXG]²⁰, en el que cada X se selecciona de V y L, y en el que la relación de V:L es alrededor de 3:7 o alrededor de 4:6 o alrededor de 1:1 o alrededor de 6:4 o alrededor de 3:7.

La descripción también proporciona ciertos casos en los que el ELP incluye [XPGVG]m, en el que m es cualquier número de 1 a 200. En ciertos casos, el ELP incluye [XPGVG]m, en el que m es cualquier número de 1 a 200, y cada X se selecciona de V, G, y A. En ciertos casos, el ELP incluye [XPGVG]m, en el que m es cualquier número de 1 a 200, cada X se selecciona de V, G, y A, y en el que la relación de V:G:A es alrededor de 5:0:4. En ciertos casos, el ELP incluye [XPGVG]⁶⁰, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 5:0:4. En ciertos casos, el ELP incluye [XPGVG]90, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 5:0:4. En ciertos casos, el ELP incluye [XPGVG]¹²⁰, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 5:0:4. En ciertos casos, el ELP incluye [XPGVG]144, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 5:0:4. En ciertos casos, el ELP incluye [XPGVG]¹⁸⁰, en el que cada X se selecciona de V, G y A, y en el que la relación de V:G:A es de alrededor de 5:0:4.

En ciertos casos, el ELP incluye [VPGVG]m, en el que m es cualquier número de 1 a 200. En algunos casos, el ELP incluye [VPGVG]⁶⁰, [VPGVG]90, o [VPGVG]¹²⁰. Como se muestra aquí, 120 unidades estructurales de este ELP pueden proporcionar una temperatura de transición de alrededor de 37°C con alrededor de 0,005 a alrededor de 0,05 mg/ml (por ejemplo, alrededor de 0,01 mg/ml) de proteína. Como alternativa, el ELP incluye [VPGXG]144 o [XPGVG]144. Como se muestra aquí (Tabla 2), 144 unidades estructurales de cualquiera de estos ELP pueden proporcionar una temperatura de transición de 28°C a 35°C inclusive.

En diversos casos, el sujeto previsto es un ser humano, y la temperatura corporal es alrededor de 37°C, y de este modo el agente terapéutico se diseña para proporcionar una liberación sostenida a esta temperatura o cerca de ella (por ejemplo, entre alrededor de 28°C y alrededor de 37°C). Una liberación lenta en la circulación con eliminación de enlaces de hidrógeno y/o interacciones hidrófobas está impulsada por una caída en la concentración según se difunde el producto en el sitio de inyección, aún cuando la temperatura corporal permanezca constante. En otros casos, el sujeto es un mamífero no humano, y el agente terapéutico está diseñado para exhibir una liberación sostenida a la temperatura corporal del mamífero, que puede ser de alrededor de 30 a alrededor de 40°C en algunos casos, tal como para ciertas mascotas domesticadas (por ejemplo, perro o gato) o ganado (por ejemplo, vaca, caballo, oveja, o cerdo). Generalmente, la Tt es más alta que las condiciones de almacenamiento de la formulación (que pueden ser de 2 a alrededor de 25°C, o de 15 a 22°C), de modo que el agente terapéutico permanece en disolución para inyección.

En algunos casos, el ELP puede proporcionar una temperatura de transición en un intervalo de 27°C a 36°C inclusive. En algunos casos, el ELP puede proporcionar una temperatura de transición en un intervalo de 28°C a 35°C inclusive. En algunos casos, el ELP puede proporcionar una temperatura de transición en un intervalo de 29°C a 34°C inclusive. En algunos casos, el ELP puede proporcionar una temperatura de transición en un intervalo de 27°C a 33°C inclusive. En algunos casos, el ELP puede proporcionar una temperatura de transición en un intervalo de 30°C a 33°C inclusive. En algunos casos, el ELP puede proporcionar una temperatura de transición en un intervalo de 31 °C a 31 °C inclusive. En algunos casos, el ELP puede proporcionar una temperatura de transición de 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31 °C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C o 36°C. En algunos casos, el ELP puede proporcionar una temperatura de transición en un intervalo de 28°C a 35°C inclusive a una concentración de proteína de 10 mg/ml en NaCl 110 mM.

Los polímeros proteicos de péptido de tipo elastina (ELP) y las proteínas de fusión recombinantes se pueden preparar como se describe en la publicación de patente de EE. UU. n.° 2010/0022455. En algunos casos, los polímeros de proteína de ELP se construyen a través de la ligadura recursiva para clonar rápidamente el ADN que codifica polipéptidos altamente repetitivos de cualquier secuencia y longitud especificada a lo largo de un gran intervalo de pesos moleculares. En un único ciclo, se unen entre sí dos mitades de un plásmido progenitor, conteniendo cada una una copia de un oligómero, para de esta manera dimerizar el oligómero y reconstituir un plásmido funcional. Este proceso se lleva a cabo de manera recursiva para ensamblar un gen oligomérico con el número deseado de repeticiones. Por ejemplo, una subunidad estructural de ELP (por ejemplo, un pentapéptido o un 9-mero de pentapéptido) se inserta en un vector. El vector se digiere, y se inserta otra unidad estructural de ELP (por ejemplo, un pentapéptido o un 9-mero de pentapéptidos). Cada ronda posterior de digestión y unión dobla el número de unidades estructurales de ELP contenidas en el vector resultante hasta que el polímero de ELP tiene la longitud deseada. Al variar el número de pentapéptidos en la unidad estructural inicial, se pueden construir fácilmente ELP de longitud variable. Se pueden utilizar medios de construcción alternativos (es decir, que no sean unión recursiva) para producir longitudes alternativas de ELP.

En algunos casos, el vector contiene uno o más aminoácidos adicionales o repeticiones de la unidad estructural de ELP. Por ejemplo, pPE0248 añade una repetición de pentámero adicional al término N del 144mero con valina en la posición de invitado, y un pentámero adicional al término C con un triptófano en la posición de resto invitado. Se puede utilizar triptófano como un medio para aumentar el coeficiente de extinción de la molécula, y permitir así una mejor medida de la absorbancia, por ejemplo, a 280 nm, que puede ser útil para la determinación de la concentración proteica, o para monitorizar el contenido proteico durante la purificación. Los pentámeros añadidos en cualquier extremo también se pueden diseñar de manera que el ADN codificante contenga sitios de reconocimiento de enzimas de restricción para la clonación de compañeros de fusión en cualquier extremo de la secuencia codificante del ELP.

En algunos casos, el agente terapéutico incluye un agente activo y uno o más ELP. En algunos casos, el agente terapéutico incluye un agente activo con uno o más ELP en el extremo N o C. En algunos casos, el agente terapéutico incluye un agente activo con uno o más ELP tanto en el extremo N como en el extremo C. En algunos casos, los ELP tienen aproximadamente el mismo tamaño. En algunos casos, los ELP difieren en tamaño. En algunos casos, un ELP en un extremo es mayor que un ELP en el otro extremo. En algunos casos, un ELP en el extremo N es mayor que un ELP en el extremo C. En algunos casos, un ELP en el extremo C es mayor que un ELP en el extremo N.

AGENTES ACTIVOS

Agentes activos de proteínas

Según la invención, el agente activo comprendido en la formulación de liberación sostenida es un agonista del receptor del péptido similar a glucagón (GLP)-2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70.

La descripción establece que el agente activo puede ser una proteína o un péptido, que por sí mismo puede tener una vida media circulatoria corta, tal como de alrededor de 30 segundos a alrededor de 1 hora. El agente terapéutico puede ser una proteína de fusión recombinante entre el agente activo proteico y la secuencia de aminoácidos capaz de formar la matriz con enlaces de hidrógeno a la temperatura corporal del sujeto (por ejemplo un ELP). En los agentes terapéuticos de la presente descripción puede usarse cualquier agente activo proteico apropiado. La descripción ejemplifica diversos agentes activos proteicos alternativos, tales como el dominio extracelular del receptor 2A de activina, la hormona adrenocorticotrófica (ACTH), macroglobulina alfa-2, alfa-MSH/afamelanotida, amilina (pramlintida), angiotensina (1-7), anexina A1, apelina, arginasa, asparaginasa, antagonista del receptor de bradicinina B2, compstatina, coversina, CTLA-4, péptido natriurético tipo C, cenderitida (CD-NP), elafina, exendina-4, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF)-18/esprifermina, FGF-19, FGF-21, galanina, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), grelina, agonista dual GLP-1/GIP, agonista dual GLP-1/glucagón, agonista dual GLP-1/GLP-2, glucagón, antagonista del receptor del péptido similar a glucagón (GLP)-1, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), hepcidina, hormona de crecimiento humana (hGH), antagonista de hGH, icatibant, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF)-1, antagonista del receptor de interleucina 1 (IL-IRa), infestina-4, kisspeptina, péptido L4F, lacritina, hormona paratiroidea (PTH), proteína relacionada con la hormona paratiroidea (PTHrP), PYY, relamorelina, relaxina, somatostatina, tiorredoxina, timosina p4, ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL), urato oxidasa, urodilatina, uroguanilina, fragmentos de hormona paratiroidea (por ejemplo restos 1 -34), hormona paratiroidea de longitud completa, hormona adrenocorticotrófica, coversina, kisspeptina, fragmentos de kisspeptina (por ejemplo restos de aminoácidos 1-10 o restos de aminoácidos 1-54), péptidos derivados de la anexina A1 (por ejemplo restos de aminoácidos 2-26), análogos, derivados, miméticos, fragmentos, combinaciones, o variantes funcionales de los mismos. La presente descripción proporciona agentes terapéuticos que incluyen un agente activo proteico y una secuencia de aminoácidos que proporciona una liberación sostenida. En algunos casos, la secuencia de aminoácidos que proporciona la liberación sostenida es un péptido similar a la elastina (ELP).

La vida media de los agentes activos proteicos se puede extender por una variedad de medios, incluyendo el aumento del tamaño, y de este modo el volumen hidrodinámico, del agente activo proteico, la adición de aminoácidos modificados o no naturales, la conjugación de restos (por ejemplo pegilación), la adición de secuencias sintéticas (por ejemplo secuencias XTEN®, PASylation®), extensión carboxi-terminal de hCG (CTP), adición de secuencias de unión a albúmina (por ejemplo AlbudAb®), conjugación de compuestos de unión a albúmina, por ejemplo ácidos grasos, modificaciones postraduccionales tales como N-glicosilación y fusión con otros péptidos, o fusión con una proteína heteróloga de mamífero, tal como albúmina, transferrina, o secuencias Fc de anticuerpos. Tales secuencias se describen en la Patente US No. 7.238.667 (particularmente con respecto a los conjugados de albúmina), Patente US No. 7.176.278 (particularmente con respecto a los conjugados de transferrina), y Patente US No. 5.766.883.

En algunos casos, la descripción proporciona miméticos, análogos, derivados, variantes, o mutantes de uno o más agentes proteicos activos descritos aquí. En algunos casos, el mimético, análogo, derivado, variante, o mutante contiene una o más sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos del agente peptídico terapéutico nativo. En algunos casos, se sustituyen uno a 20 aminoácidos. En algunos casos, el mimético, análogo, derivado, variante, o mutante contiene alrededor de 1, alrededor de 2, alrededor de 3, alrededor de 4, alrededor de 5, alrededor de 6, alrededor de 7, alrededor de 8, alrededor de 9, o alrededor de 10 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos del agente peptídico terapéutico nativo. En algunos casos, el mimético, análogo, derivado, variante, o mutante contiene una o más supresiones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos del agente peptídico terapéutico nativo. En algunos casos, se eliminan uno a 20 aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos del agente proteico nativo. En algunos casos, el mimético, análogo, derivado, variante, o mutante tiene alrededor de 1, alrededor de 2, alrededor de 3, alrededor de 4, alrededor de 5, alrededor de 6, alrededor de 7, alrededor de 8, alrededor de 9, o alrededor de 10 supresiones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos del agente proteico nativo. En algunos casos, se eliminan uno a diez aminoácidos en cualquiera de los extremos en comparación con la secuencia de aminoácidos del agente proteico nativo. En algunos casos, se eliminan uno a diez aminoácidos de ambos extremos en comparación con la secuencia de aminoácidos del agente proteico nativo. En algunos casos, la secuencia de aminoácidos del mimético, análogo, derivado, variante, o muíante es al menos alrededor de 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos del agente proteico nativo. En algunos casos, la secuencia de aminoácidos del mimético, análogo, derivado, variante, o mutante es alrededor de 70%, alrededor de 80%, alrededor de 85%, alrededor de 90%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos del agente proteico nativo. El porcentaje de identidad se puede calcular utilizando el programa de alineación EMBOSS Needle, disponible en http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/. Se pueden utilizar los siguientes parámetros por defecto para la alineación por pares: Matriz de peso de proteínas = BLOSUM62; Apertura de hueco = 10; Extensión de hueco = 0,1.

En algunos casos, la descripción proporciona la coformulación de dos o más agentes activos descritos aquí. En algunos casos, la coformulación incluye dos o más agentes activos peptídicos y agentes activos de molécula pequeña.

En algunos casos, la coformulación incluye dos o más agentes activos de molécula pequeña. En algunos casos, la coformulación incluye dos o más agentes activos peptídicos. En algunos casos, uno o más de los agentes activos en la coformulación no están conjugados con un ELP. En algunos casos, todos los agentes activos en la coformulación están conjugados con un ELP.

Agente activo de la invención: Agonistas del receptor del péptido similar a glucagón (GLP)-2

Según la invención, el agente terapéutico incluye un ELP fusionado o conjugado con un agonista del receptor de GLP-2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:70. La descripción también describe derivados, análogos, miméticos, fragmentos, o variantes funcionales de un agonista del receptor de GLP-2. En algunos casos, el agonista del receptor de GLP-2 es GLP-2.

El GLP-2 es un péptido de 33 aminoácidos liberado a partir del procesamiento postraduccional del proglucagón en las células L enteroendocrinas del intestino y en regiones específicas del tronco encefálico. Se co-segrega junto con GLP-1, oxintomodulina y glicentina, en respuesta a la ingestión de nutrientes. GLP-2 muestra una notable homología en términos de secuencia de aminoácidos con glucagón y GLP-1. Las diferentes formas de GLP-2 de los mamíferos también están muy conservadas. Por ejemplo, el GLP-2 humano (hGLP-2) y el GLP-2 de degu (un roedor sudamericano) difieren del GLP-2 de rata (rGLP-2) en uno y tres aminoácidos respectivamente. GLP-2 se une a un solo receptor acoplado a proteína G que pertenece a la familia de secretina de glucagón de clase II. El receptor de GLP-2 se localiza en el intestino delgado, el colon y el estómago, que son sitios que se sabe que responden al GLP-2 (Yusta et al., 2000, Gastroenterology, 119: 744-55).

En ciertos casos de la descripción, el agente activo incluye una secuencia de aminoácidos que proporciona una liberación sostenida, fusionada o conjugada con un agonista del receptor de GLP-2, derivados, análogos, miméticos, fragmentos, o variantes funcionales del mismo. En ciertos casos de la descripción, el agente activo incluye una secuencia de aminoácidos que proporciona una liberación sostenida, fusionada o conjugada con un agonista del receptor de GLP-2 y hGH. En algunos casos, el agonista del receptor de GLP-2 y la hGH se unen en diferentes extremos de la secuencia de aminoácidos que proporciona liberación sostenida. En algunos casos, el agonista del receptor de GLP-2 se une al extremo amino de la secuencia de aminoácidos que proporciona liberación sostenida, y la hGH se une al extremo carboxi. En algunos casos, la hGH se une al extremo amino de la secuencia de aminoácido que proporciona liberación sostenida, y el agonista del receptor de GLP-2 se une al extremo carboxi. En algunos casos, la secuencia de aminoácidos que proporciona liberación sostenida es ELP.

En ciertos casos, el agonista del receptor de GLP-2 es un agonista del receptor de GLP-2 de mamífero, tal como un agonista del receptor de GLP-2 humano. El péptido GLP-2 humano está codificado por SEQ ID NO: 68. El agonista del receptor de GLP-2 usado en la invención es un análogo del péptido GLP-2 en el que la alanina (A) en la posición

2 del extremo N del péptido GLP-2 ha sido reemplazada por glicina (G) (SEQ ID NO: 70). La descripción también proporciona el agonista del receptor de GLP-2 en el que incluye una secuencia HXDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD (SEQ ID NO: 74), en la que X es alanina (A), glicina (G), leucina (L), isoleucina (I), o valina (V). En algunos casos, X es alanina (A) o glicina (G).

La descripción también describe casos en los que el agonista del receptor de GLP-2 es una variante funcional de un péptido GLP-2 de mamífero, incluyendo fragmentos funcionales truncados en el extremo C del péptido GLP-2 humano en alrededor de 1 a alrededor de 25 aminoácidos, incluyendo, por ejemplo, hasta alrededor de 3 aminoácidos, hasta alrededor de 5 aminoácidos, hasta alrededor de 10 aminoácidos, hasta alrededor de 15 aminoácidos, hasta alrededor de 20 aminoácidos, o hasta alrededor de 25 aminoácidos. En otros casos, las variantes funcionales pueden contener inserciones, supresiones, y/o sustituciones de alrededor de 1 a alrededor de 25 aminoácidos con respecto a una secuencia nativa o de consenso (por ejemplo, SEQ ID NOs: 68 o 74). Por ejemplo, las variantes funcionales pueden tener inserciones, supresiones, y/o sustituciones de hasta alrededor de 3 aminoácidos, hasta alrededor de 5 aminoácidos, hasta alrededor de 10 aminoácidos, hasta alrededor de 15 aminoácidos, hasta alrededor de 20 aminoácidos, o hasta alrededor de 25 aminoácidos con respecto a una secuencia consenso (por ejemplo, SEQ ID NOs: 68 o 74). La actividad de la proteína puede confirmarse o evaluarse usando cualquier ensayo disponible.

También se describen aquí otros casos en los que el agonista del receptor de GLP-2 tiene al menos alrededor de 75% de identidad, alrededor de 80% de identidad, alrededor de 90% de identidad, alrededor de 95% de identidad, alrededor de 96% de identidad, alrededor de 97% de identidad, alrededor de 98% de identidad, o alrededor de 99% de identidad con una secuencia nativa o de consenso (por ejemplo, SEQ ID NOs: 68 o 74). El porcentaje de identidad se puede calcular utilizando el programa de alineación EMBOSS needle, disponible en http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/. Se pueden utilizar los siguientes parámetros por defecto para la alineación por pares: Matriz de peso de proteínas = BLOSUM62; Apertura de hueco = 10; Extensión de hueco = 0,1. En algunos casos, el agonista del receptor de GLP-2 puede contener modificaciones químicas adicionales conocidas en la técnica.

En ciertos casos, el agente terapéutico incluye un ELP fusionado con el extremo N o el extremo C de un agonista del receptor de GLP-2, fragmentos, o variantes funcionales del mismo. Se describen aquí casos en los que el agente terapéutico incluye un ELP fusionado con el extremo C de un péptido GLP-2 (SEQ ID NOs: 69, 71, y 73).

En algunos casos, el agonista del receptor de GLP-2 se encuentra en una proteína de fusión con más de una secuencia de ELP. En algunos casos, el agonista del receptor de GLP-2 tiene uno o más ELP tanto en el extremo N como en el extremo C. En algunos casos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N del agonista del receptor de GLP-2 incluye alrededor de 90 a alrededor de 180 unidades estructurales repetitivas. En otros casos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N del agonista del receptor de GLP-2 incluye menos de alrededor de 90 unidades estructurales repetidas. En otros aspectos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N del agonista del receptor de GLP-2 incluye más de alrededor de 180 unidades estructurales repetitivas. En algunos casos, los dos o más ELP en los extremos N y C tienen aproximadamente el mismo tamaño. En algunos casos, los dos o más ELP en los extremos N y C difieren en tamaño. En algunos casos, el ELP en el extremo N del agonista del receptor de GLP-2 es mayor que el ELP en el extremo C del agonista del receptor de GLP-2. En otros casos, el ELP en el extremo C del agonista del receptor de GLP-2 es mayor que el ELP en el extremo N del agonista del receptor de GLP-2. Se describen aquí casos en los que el ELP se une al extremo C y/o al extremo N del agonista del receptor de GLP-2 a través de un enlazador (SEQ ID NOs: 71 y 73). En algunos casos, el enlazador comprende una secuencia de tripéptido GGS (SEQ ID NO: 87). En algunos casos, el enlazador comprende una única copia del tripéptido GGS, o alternativamente, el enlazador comprende múltiples repeticiones del tripéptido GGS. En algunos casos, el enlazador comprende dos repeticiones de la secuencia GGS (SEQ ID NO: 102). En algunos casos, el enlazador comprende tres repeticiones de la secuencia GGS (SEQ ID NO: 103). En algunos casos, el enlazador comprende una secuencia de pentapéptido GGGGS (SEQ ID NO: 93). En algunos aspectos, el enlazador comprende una única copia del pentapéptido GGGGS (SEQ ID NO: 93). En otro aspecto, el enlazador comprende múltiples repeticiones del pentapéptido GGGGS. En algunos casos, el enlazador comprende dos repeticiones de la secuencia GGGGS (SEQ ID NO: 104). En algunos casos, el enlazador comprende tres repeticiones de la secuencia GGGGS (SEQ ID NO: 105). En algunos casos, el enlazador comprende una secuencia de pentapéptido PAPAP (SEQ ID NO: 94). En algunos aspectos, el enlazador comprende una sola copia del pentapéptido PAPAP. En otro aspecto, el enlazador comprende múltiples repeticiones del pentapéptido PAPAP. En algunos casos, el enlazador comprende dos repeticiones de la secuencia PAPAP (SEQ ID NO: 106). En algunos casos, el enlazador comprende tres repeticiones de la secuencia PAPAP (SEQ ID NO: 107). En algunos casos, el enlazador comprende una secuencia de pentapéptido EAAAK (SEQ ID NO: 95). En algunos aspectos, el enlazador comprende una sola copia del pentapéptido EAAAK. En otro aspecto, el enlazador comprende múltiples repeticiones del pentapéptido EAAAK. En algunos casos, el enlazador comprende dos repeticiones de la secuencia EAAAK (SEQ ID NO: 108). En algunos casos, el enlazador comprende tres repeticiones de la secuencia EAAAK (SEQ ID NO: 109).

En otros aspectos, la presente descripción proporciona un agente terapéutico que incluye un ELP y un agonista del receptor de GLP-2 (como se describió anteriormente) para uso en métodos para tratar o prevenir enfermedades intestinales que incluyen, pero no se limitan a, enfermedades intestinales tal como enfermedad intestinal inflamatoria (IBD), tales como colitis ulcerosa (UC) y enfermedad de Crohn (CD), o síndrome del intestino corto (SBS); mucositis inducida por quimioterapia; diarrea inducida por quimioterapia; o lesión por isquemia-reperfusión. Los métodos incluyen administrar el agente terapéutico, que incluye un ELP y un agonista del receptor de GLP-2 (como se describe anteriormente), a un paciente que necesita dicho tratamiento. Generalmente, el paciente puede ser un paciente humano o animal no humano (por ejemplo, perro, gato, vaca, o caballo). Preferiblemente, el paciente es un ser humano. En algunos casos, el tratamiento con un agonista del receptor de GLP-2 según la presente descripción también puede combinarse con una o más sustancias farmacológicamente activas, por ejemplo seleccionadas de agentes para el tratamiento y/o prevención de diversas complicaciones y trastornos, resultantes de o asociados con diversas enfermedades, incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedades intestinales, incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedades intestinales tales como IBD (tales como UC o CD) o SBS; mucositis inducida por quimioterapia; diarrea inducida por quimioterapia; o lesión por isquemia-reperfusión.

Además del agente activo comprendido dentro de la formulación de liberación sostenida de la invención (agonista del receptor de GLP-2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7), la descripción también proporciona una descripción de los siguientes agentes activos.

Agente activo de la descripción: Apelina

Un ejemplo de un agente activo proteico es la apelina, análogos, miméticos, derivados, fragmentos, o variantes funcionales de la misma. La apelina humana es un ligando endógeno para el receptor de apelina (receptor acoplado a proteína G de clase A APJ). Apelina se expresa en varios tipos de células, incluyendo los cardiomiocitos humanos, las células endoteliales, y las células del músculo liso vascular. El gen apelina se ha identificado en diversas especies, incluyendo seres humanos, perros, bóvidos, ratas, ratones, monos rhesus, y peces cebra, y codifica una preproproteína de apelina de 77 aminoácidos. Abarcando 1726 pares de bases de ADN genómico con 3 exones, el locus de apelina está altamente conservado entre especies. En el procesamiento de la preproproteína de apelina, se escinde un péptido señal correspondiente a los restos 1-22 de la preproproteína de apelina, lo que da como resultado una proproteína de apelina de 55 aminoácidos, que se procesa en varias formas moleculares activas, incluyendo apelina-12, apelina-13, apelina-16, apelina-17, y apelina-36. (Kawamata et al., 2001, Biochim Biophys Acta 1538:162-71). Tales formas moleculares activas se denominan colectivamente como apelina, y se nombran según su longitud y/o estado de modificación. El péptido maduro de longitud completa, apelina-36, es un péptido de 36 aminoácidos de longitud derivado de la proproteína de apelina de 55 aminoácidos de longitud (Tatemoto et al., 1998, Biochem. Biophys. Res. Comm. 251:471-476, 1998) y corresponde a los restos 42-77 de la preproproteína. La apelina-17 y la apelina-13 derivan del extremo carboxi (C) terminal de apelina. La apelina-17 corresponde a los restos 61-77 de la proproteína de apelina. La apelina-13 corresponde a los restos 65-77 de la proproteína de apelina. Las proteínas de apelina pueden incluir derivados o modificaciones de aminoácidos. Por ejemplo, la isoforma más activa es la forma piroglutamada de apelina-13 (pyr-apelina 13).

Apelina es un vasodilatador e inótropo endógeno que puede disminuir la tensión arterial al antagonizar el sistema renina-angiotensina, posiblemente a través de la formación de heterotrímeros receptores.

Se describen aquí casos en los que el agente activo incluye una secuencia de aminoácidos que proporciona una liberación sostenida, fusionada o conjugada con apelina, miméticos, análogos, derivados, fragmentos, o variantes funcionales de la misma. En algunos casos, la secuencia de aminoácidos que proporciona liberación sostenida es ELP. En ciertos casos, la apelina es una apelina de mamífero. En algunos casos, la apelina es apelina humana (por ejemplo, SEQ ID NO: 39), que es el péptido de apelina humana madura de longitud completa, apelina-36 (SEQ ID NO: 39). En otros casos, la apelina es un truncamiento de apelina-36 que incluye, pero no se limita a, apelina-16, apelina-17 (SEQ ID NO: 41), apelina-13 (SEQ ID NO: 43), y apelina-12 (s Eq ID n O: 44). En algunos casos, la apelina incluye uno o más aminoácidos modificados. En algunos casos, la apelina incluye uno o más derivados de aminoácidos. En algunos casos, la apelina es pyr-apelina 13 (SEQ ID NO: 42).

En algunos casos, la apelina es un análogo funcional de la apelina de mamífero, que incluye fragmentos funcionales truncados en el extremo N y/o el extremo C de la apelina en alrededor de 1 a alrededor de 30 aminoácidos, incluyendo, por ejemplo, en hasta alrededor de 3 aminoácidos, hasta alrededor de 5 aminoácidos, hasta alrededor de 10 aminoácidos, hasta alrededor de 15 aminoácidos, hasta alrededor de 20 aminoácidos, hasta alrededor de 25 aminoácidos, o hasta alrededor de 30 aminoácidos. En otros casos, las variantes funcionales contienen inserciones, supresiones, y/o sustituciones de alrededor de 1 a alrededor de 30 aminoácidos con respecto a una secuencia nativa o truncada (por ejemplo, SEQ ID NOs: 39, 41, 42, 43, o 44). Por ejemplo, las variantes funcionales pueden tener inserciones, supresiones y/o sustituciones de hasta alrededor de 3 aminoácidos, hasta alrededor de 5 aminoácidos, hasta alrededor de 10 aminoácidos, hasta alrededor de 15 aminoácidos, hasta alrededor de 20 aminoácidos, hasta alrededor de 25 aminoácidos, o hasta alrededor de 30 aminoácidos con respecto a una secuencia nativa o truncada (por ejemplo, SEQ ID NOs: 39, 41,42, 43, o 44). La actividad de la proteína puede confirmarse o evaluarse usando cualquier ensayo disponible. En otros casos, la apelina tiene al menos alrededor de 75% de identidad, alrededor de 80% de identidad, alrededor de 90% de identidad, alrededor de 95% de identidad, alrededor de 96% de identidad, alrededor de 97% de identidad, alrededor de 98% de identidad, o alrededor de 99% de identidad con una secuencia nativa o truncada (por ejemplo, SEQ ID NO: 39, 41, 42, 43, o 44). El porcentaje de identidad se puede calcular utilizando el programa de alineación EMBOSS needle, disponible en http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/. Se pueden utilizar los siguientes parámetros por defecto para la alineación por pares: Matriz de peso de proteínas = BLOSUM62; Apertura de hueco = 10; Extensión de hueco = 0,1. En algunos casos, la apelina puede contener modificaciones químicas adicionales conocidas en la técnica. En algunos casos, el análogo funcional de apelina es Elabella/Toddler, o un análogo o derivado de la misma (Yang et al., 2015, Trends in Pharmacol. Sci. 36:560-567)

Se describen aquí casos en los que el agente terapéutico incluye un ELP fusionado con el extremo N o el extremo C de apelina, miméticos, análogos, derivados, fragmentos, o variantes funcionales de la misma. En algunos casos, el agente terapéutico incluye un ELP fusionado con el extremo N de la apelina-36 humana (SEQ ID NO: 40). En algunos casos, la apelina se encuentra en una proteína de fusión con más de una secuencia de ELP. En algunos casos, la apelina tiene uno o más ELP en los extremos N y C. En algunos casos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N de la apelina incluye alrededor de 90 a alrededor de 180 unidades estructurales repetitivas. En otros casos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N de la apelina incluye menos de alrededor de 90 unidades estructurales repetidas. En otros aspectos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N de la apelina incluye más de alrededor de 180 unidades estructurales repetitivas. En algunos casos, los dos o más ELP en los extremos N y C tienen aproximadamente el mismo tamaño. En otros casos, los dos o más ELP en los extremos N y C difieren en tamaño. En algunos casos, el ELP en el extremo N de la apelina es mayor que el ELP en el extremo C de la apelina. En otros casos, el ELP en el extremo C de la apelina es mayor que el ELP en el extremo N de la apelina.

En otros aspectos, la presente descripción proporciona métodos para tratar o prevenir enfermedades que incluyen, pero no se limitan a, insuficiencia cardíaca, hipertensión arterial pulmonar (PAH), cardiopatía isquémica, diabetes, cáncer, obesidad, defectos cardiovasculares, o afecciones patológicas que involucran angiogénesis (por ejemplo, cáncer), mediante la administración de un ELP y una apelina. En algunos casos, los agentes terapéuticos descritos aquí pueden administrarse para proporcionar efectos que incluyen, pero no se limitan a, efectos vasodilatadores (por ejemplo, mediados por el óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS)), efectos ionotrópicos positivos (por ejemplo, debido al aumento del calcio intracelular y al aumento de la sensibilidad al calcio de los miofilamentos), protección contra la lesión por isquemia-reperfusión (por ejemplo a través de las rutas dependientes e independientes del óxido nítrico (NO), y la hipertrofia cardíaca mediada por el receptor de APJ (por ejemplo, mediada por p-arrestina, en lugar de mediada por proteína G). Los métodos incluyen la administración de un agente terapéutico, que incluye un ELP y una apelina (como se describe anteriormente) a un paciente que necesita dicho tratamiento. Generalmente, el paciente puede ser un paciente humano o animal no humano (por ejemplo, perro, gato, vaca, o caballo). Preferiblemente, el paciente es un ser humano.

En algunos casos, el tratamiento con un agente terapéutico de apelina según la presente descripción también puede combinarse con una o más sustancias farmacológicamente activas, por ejemplo seleccionadas de agentes para el tratamiento y/o prevención de complicaciones y trastornos resultantes o asociados con diversas enfermedades, que incluyen, pero no se limitan a, insuficiencia cardíaca, PAH, cardiopatía isquémica, diabetes, cáncer, obesidad, defectos cardiovasculares, o afecciones patológicas que implican angiogénesis (por ejemplo, cáncer). En casos adicionales, el tratamiento con un agente terapéutico de apelina según la presente descripción puede combinarse con una o más sustancias farmacológicamente activas, por ejemplo seleccionadas de agentes que proporcionan efectos que incluyen, pero no se limitan a, efectos vasodilatadores (por ejemplo, mediados por el óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS)), efectos ionotrópicos positivos (por ejemplo, debido al aumento del calcio intracelular y al aumento de la sensibilidad al calcio de los miofilamentos), protección contra la lesión por isquemia-reperfusión (por ejemplo, a través de las rutas dependientes e independientes del óxido nítrico (NO), y la hipertrofia cardíaca mediada por el receptor de APJ (por ejemplo, mediada por p-arrestina, en lugar de mediada por proteína G).

Agente activo de la descripción: Arginasa

Un ejemplo de un agente activo proteico es la arginasa (EC 3.5.3.1; L-arginina amidinohidrolasa), isoenzimas, fragmentos, o variantes funcionales de la misma. La arginasa es una enzima clave de 35 kDa del ciclo de la urea que cataliza la conversión de L-arginina en ornitina y urea, que es la reacción citosólica final de formación de urea en el hígado de los mamíferos. La arginasa cumple tres funciones importantes: la producción de urea, la producción de ornitina, y la regulación de los niveles de sustrato de arginina para el óxido nítrico sintasa (Jenkinson et al., 1996, Comp. Biochem. Physiol. 114B: 107-132; Kanyo et al., 1996, Nature 383:554-557; Christianson, 1997, Prog. Biophys. Molec. Biol. 67:217-252). La producción de urea proporciona un mecanismo para excretar nitrógeno en forma de un compuesto no tóxico altamente soluble, evitando así las consecuencias potencialmente peligrosas de los altos niveles de amoníaco. La L-ornitina es un precursor de la biosíntesis de poliaminas, espermina, y espermidina, que tienen funciones importantes en la proliferación y diferenciación celulares. Finalmente, la arginasa modula la producción de óxido nítrico al regular los niveles de arginina presentes en los tejidos.

En general, la arginasa se expresa en hígado, riñón, y testículos de animales productores de urea (por ejemplo, mamíferos, elasmobranquios, anfibios, y tortugas). En la mayoría de los mamíferos, incluyendo los seres humanos, la familia de proteínas de arginasa incluye las isoenzimas arginasa I, que se expresa principalmente en las células del hígado, y arginasa II, que se expresa principalmente en el riñón y los eritrocitos.

Una deficiencia en la arginasa hepática humana puede provocar argininemia, un trastorno autosómico recesivo heredado, acompañada de hiperamonemia, una afección en la que el exceso de arginina provoca convulsiones, deterioro de las capacidades cognitivas, y deterioro neuronal. La hiperargininemia clínicamente significativa resulta de mutaciones en el gen arginasa I (Cederbaum S. D. et al., 1979, Pediat. Res. 13:827-833; Cederbaum S. et al., 1977, J. Pediatr. 90:569-573; Michel V. V. et al., 1978, Clin. Genet. 13:61-67). Debido a una deficiencia de arginasa, la arginina no se puede degradar a urea y participar en el ciclo metabólico de la ornitina, lo que da como resultado niveles de arginina en la sangre alrededor de 7 a alrededor de 10 veces más altos de lo normal, aumento de los niveles de arginina en el líquido cefalorraquídeo, aumento de la producción de orina, y aumento de la excreción de creatinina en la urea. Los pacientes con deficiencia de arginasa I pueden presentar espasticidad, retraso del crecimiento, deterioro mental progresivo, e hiperamonemia episódica (Cederbaum S.D. et al., 1979, Pediat Res 13:827-833; Cederbaum S.D., et al., 1977, J. Pediatr 90:569-573; Thomas K.R. y Capecchi M.R., 1987, Cell 51:503-512).

Se describen aquí casos en los que el agente terapéutico de arginasa incluye una secuencia de aminoácidos que proporciona liberación sostenida, fusionada o conjugada con una arginasa, miméticos, análogos, derivados, fragmentos, o variantes funcionales de la misma. En algunos casos, el agente de aminoácidos que proporciona liberación sostenida es un ELP.

En ciertos casos, la arginasa es una arginasa de mamífero. En algunos casos, la arginasa es arginasa I. En otros casos, la arginasa es arginasa II. En algunos casos, la arginasa es arginasa humana (SEQ ID NO: 45).

En algunos casos, la arginasa es un análogo funcional de la arginasa de mamífero, incluyendo fragmentos funcionales truncados en el extremo N y/o el extremo C de arginasa en alrededor de 1 a alrededor de 50 aminoácidos, incluyendo, por ejemplo, en hasta alrededor de 3 aminoácidos, hasta alrededor de 5 aminoácidos, hasta alrededor de 10 aminoácidos, hasta alrededor de 15 aminoácidos, hasta alrededor de 20 aminoácidos, hasta alrededor de 25 aminoácidos, hasta alrededor de 30 aminoácidos, hasta alrededor de 35 aminoácidos, hasta alrededor de 40 aminoácidos, hasta alrededor de 45 aminoácidos, o hasta alrededor de 50 aminoácidos. En otros casos, las variantes funcionales contienen inserciones, supresiones, y/o sustituciones de alrededor de 1 a alrededor de 50 aminoácidos con respecto a una secuencia nativa (por ejemplo, SEQ ID NO: 45). Por ejemplo, las variantes funcionales pueden tener inserciones, supresiones y/o sustituciones de hasta alrededor de 3 aminoácidos, alrededor de 5 aminoácidos, hasta alrededor de 10 aminoácidos, hasta alrededor de 15 aminoácidos, hasta alrededor de 20 aminoácidos, hasta alrededor de 25 aminoácidos, hasta alrededor de 30 aminoácidos, hasta alrededor de 35 aminoácidos, hasta alrededor de 40 aminoácidos, hasta alrededor de 45 aminoácidos, o hasta alrededor de 50 aminoácidos con respecto a una secuencia nativa (por ejemplo, SEQ ID NO: 45). La actividad de la proteína puede confirmarse o evaluarse usando cualquier ensayo disponible. En otros casos, la arginasa tiene al menos alrededor de 75% de identidad, alrededor de 80% de identidad, alrededor de 90% de identidad, alrededor de 95% de identidad, alrededor de 96% de identidad, alrededor de 97% de identidad, alrededor de 98% de identidad, o alrededor de 99% de identidad con una secuencia nativa (por ejemplo, SEQ ID NO: 45). El porcentaje de identidad se puede calcular utilizando el programa de alineación EMBOSS needle, disponible en http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/. Se pueden utilizar los siguientes parámetros por defecto para la alineación por pares: Matriz de peso de proteínas = BLOSUM62; Apertura de hueco = 10; Extensión de hueco = 0,1. En algunos casos, la arginasa puede contener modificaciones químicas adicionales conocidas en la técnica. En algunos casos, la arginasa puede utilizar manganeso como cofactor, en lugar de cobalto.

En ciertos casos, el agente terapéutico incluye un ELP fusionado con el extremo N o el extremo C de una arginasa, miméticos, análogos, derivados, fragmentos, o variantes funcionales de la misma. En algunos casos, el agente terapéutico incluye un ELP fusionado con el extremo C de arginasa humana (SEQ ID NO: 46). En algunos casos, la arginasa se encuentra en una proteína de fusión con más de una secuencia de ELP. En algunos casos, la arginasa tiene uno o más ELP en los extremos N y C. En algunos casos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N de la arginasa incluye alrededor de 90 a alrededor de 180 unidades estructurales repetitivas. En otros casos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N de la arginasa incluye menos de alrededor de 90 unidades estructurales repetidas. En otros aspectos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N de la arginasa incluye más de alrededor de 180 unidades estructurales repetitivas. En algunos casos, los dos o más ELP en los extremos N y C tienen aproximadamente el mismo tamaño. En otros casos, los dos o más ELP en los extremos N y C difieren en tamaño. En algunos casos, el ELP en el extremo N de la arginasa es mayor que el ELP en el extremo C de la arginasa. En otros casos, el ELP en el extremo C de la arginasa es mayor que el e Lp en el extremo N de la arginasa.

En otros aspectos, la presente descripción proporciona métodos para tratar o prevenir enfermedades asociadas con, o causadas por, un defecto en un gen de arginasa o en la expresión del gen de arginasa, tal como, por ejemplo, enfermedades del ciclo de la urea; hipertensión; hipotensión; hiperamonemia; hiperamonemia episódica; defectos en la biosíntesis de prolina, glutamato, óxido nítrico, y ornitina; hiperargininemia y su espasticidad relacionada; retraso del crecimiento; deterioro mental progresivo; enfermedad de próstata, cáncer de próstata, prostatitis, o hiperplasia o hipertrofia prostática benigna, daño prostático; nefropatía, y daño renal; cánceres, que incluyen, sin limitación, linfoma no de Hodgkin, hepatocarcinomas, melanomas, o carcinomas de células renales; enfermedad autoinmune; enfermedades fibróticas; disfunción eréctil; hipertensión pulmonar; aterosclerosis; enfermedad renal; asma; disfunción de las células T; lesión por isquemia-reperfusión; enfermedades neurodegenerativas; cicatrización de heridas; hiperplasia dependiente de arginina; tumores; hepatocarcinomas; melanomas; carcinomas de células renales; HCC; o melanoma. Los métodos incluyen la administración de un agente terapéutico, que incluye un ELP y una arginasa (como se describe anteriormente) a un paciente que necesita dicho tratamiento. Generalmente, el paciente puede ser un paciente humano o animal no humano (por ejemplo, perro, gato, vaca, o caballo). Preferiblemente, el paciente es un ser humano.

En algunos casos, el tratamiento con un agente terapéutico de arginasa según la presente descripción también puede combinarse con una o más sustancias farmacológicamente activas, por ejemplo seleccionadas de agentes para el tratamiento y/o prevención de complicaciones y trastornos resultantes o asociados con diversas enfermedades, incluyendo, sin limitación, hipertensión; hipotensión; hiperamonemia; hiperamonemia episódica; defectos en la biosíntesis de prolina, glutamato, óxido nítrico, y ornitina; hiperargininemia y su espasticidad relacionada; retraso del crecimiento; deterioro mental progresivo; enfermedad prostática, cáncer de próstata; prostatitis, o hiperplasia o hipertrofia prostática benigna; daño prostático; nefropatía; daño renal; cánceres, que incluyen, sin limitación, linfoma no de Hodgkin, hepatocarcinomas, melanomas, o carcinomas de células renales; enfermedad autoinmune; enfermedades fibróticas; disfunción eréctil; hipertensión pulmonar; aterosclerosis; nefropatía; asma; disfunción de las células T; lesión por isquemia-reperfusión; enfermedades neurodegenerativas; cicatrización de heridas; hiperplasia dependiente de arginina; tumores; hepatocarcinomas; melanomas; carcinomas de células renales; HCC; o melanoma.

Agente activo de la descripción: Péptido Natriurético tipo C (CNP)

Un ejemplo de un agente activo proteico es el péptido natriurético de tipo C (CNP), miméticos, análogos, derivados, fragmentos, o variantes funcionales del mismo. Los péptidos natriuréticos desempeñan un papel en la homeostasis cardiovascular, la diuresis, la natriuresis, y la vasodilatación. La familia de péptidos natriuréticos consiste en tres péptidos estructuralmente relacionados: péptido natriurético auricular (ANP), péptido natriurético cerebral (BNP), y péptido natriurético tipo C (CNP). Estos pequeños péptidos monocatenarios (ANP, BNP, y CNP) tienen una estructura de bucle de 17 aminoácidos (Levin et al., N. Engl. J. Med., 339: 863-870 (1998)) y desempeñan papeles importantes en múltiples procesos biológicos. ANP y BNP se producen principalmente dentro de las células musculares del corazón, y tienen funciones importantes en la homeostasis cardiovascular (Science, 252: 120-123 (1991)). El CNP se expresa más ampliamente, incluso en el sistema nervioso central, el tracto reproductivo, los huesos, y el endotelio de los vasos sanguíneos (Hypertension, 49: 419-426 (2007)), y actúa, por ejemplo, como regulador del crecimiento óseo, un vasodilatador e inótropo, y tiene efectos cardiovasculares.

En los seres humanos, el CNP se produce inicialmente a partir del gen precursor del péptido natriurético C (NPPC) como un pre-pro polipéptido monocatenario de 126 aminoácidos (Sudoh, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1990, 168: 863-870). La eliminación del péptido señal produce pro-CNP, y la escisión adicional por parte de la endoproteasa furina genera un péptido activo de 53 aminoácidos (CNP-53), que se segrega y se escinde nuevamente para producir el péptido maduro de 22 aminoácidos (CNP-22) (Wu, J. Biol. Chem., 2003, 278: 25847-852). CNP-53 y CNP-22 difieren en su distribución, predominando CNP-53 en los tejidos, mientras que CNP-22 se encuentra principalmente en plasma y líquido cefalorraquídeo (J. Alfonzo, Recept. Signal. Transduct. Res., 2006, 26: 269-297). La forma bioactiva predominante de CNP es CNP-22.

Los péptidos natriuréticos actúan principalmente a través de dos receptores: el receptor del péptido natriurético A (NPR-A) y el receptor del péptido natriurético B (NPR-B). Estos receptores tienen dominios de guanilil ciclasa citoplásmicos, que se activan con la unión de ANP, BNP, o CNP, y conducen a la acumulación de cGMP intracelular. Tanto CNP-53 como CNP-22 se unen de manera similar a NPR-B, y ambos pueden inducir la producción de cGMP de manera similar y dependiente de la dosis (Yeung, V.T., Peptides, 1996, 17: 101-106). Un tercer receptor, NPR-C, se une a cada uno de los péptidos natriuréticos con alta afinidad, y funciona principalmente para capturar los péptidos del compartimento extracelular y depositarlos en los lisosomas, en los que se degradan (Maak, T. et al., Science, 1987, 238: 675-678).

El CNP se une a NPR-B y lo activa, lo que da como resultado un aumento de los niveles intracelulares de monofosfato de guanosina cíclico (cGMP). La señalización aguas abajo mediada por la generación de cGMP influye en un conjunto diverso de procesos biológicos, incluyendo la osificación endocondral (el proceso que rige el crecimiento longitudinal de los huesos largos).

La descripción proporciona casos en los que el agente terapéutico incluye una secuencia de aminoácidos que proporciona liberación sostenida fusionada, o conjugada con CNP, fragmentos, o variantes funcionales del mismo. En algunos casos, la secuencia de aminoácidos que proporciona liberación sostenida es ELP.

En ciertos casos, el CNP es un CNP de mamífero. En algunos casos, el CNP es CNP-53 humano (SEQ ID NO: 51). En otros casos, el CNP es CNP-22 (SEQ ID NO: 47). En otros casos, el CNP es CNP-37 (SEQ ID NO: 49). En aún otros casos, el CNP es CNP-39 (SEQ ID NO: 52).

En algunos casos, el CNP es un fragmento o variante funcional de CNP de mamífero, incluyendo fragmentos funcionales truncados en el extremo N y/o el extremo C de CNP de alrededor de 1 a alrededor de 30 aminoácidos, incluyendo, por ejemplo, en hasta alrededor de 3 aminoácidos, hasta alrededor de 5 aminoácidos, hasta alrededor de 10 aminoácidos, hasta alrededor de 15 aminoácidos, hasta alrededor de 20 aminoácidos, hasta alrededor de 25 aminoácidos, o hasta alrededor de 30 aminoácidos. En otros casos, las variantes funcionales contienen inserciones, supresiones, y/o sustituciones de alrededor de 1 a alrededor de 30 aminoácidos con respecto a una secuencia nativa o truncada (por ejemplo, SEQ ID NOs: 47, 49, 51, o 52). Por ejemplo, las variantes funcionales pueden tener inserciones, supresiones y/o sustituciones de hasta alrededor de 3 aminoácidos, hasta alrededor de 5 aminoácidos, hasta alrededor de 10 aminoácidos, hasta alrededor de 15 aminoácidos, hasta alrededor de 20 aminoácidos, hasta alrededor de 25 aminoácidos, o hasta alrededor de 30 aminoácidos con respecto a una secuencia nativa o truncada (por ejemplo, SEQ ID NOs: 47, 49, 51, o 52). La actividad de la proteína puede confirmarse o evaluarse usando cualquier ensayo disponible. En otros casos, el CNP tiene al menos alrededor de 75% de identidad, alrededor de 80% de identidad, alrededor de 90% de identidad, alrededor de 95% de identidad, alrededor de 96% de identidad, alrededor de 97% de identidad, alrededor de 98% de identidad, o alrededor de 99% de identidad con una secuencia nativa o truncada (por ejemplo, SEQ ID NO: 47, 49, 51, o 52). El porcentaje de identidad se puede calcular utilizando el programa de alineación EMBOSS needle, disponible en http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/. Se pueden utilizar los siguientes parámetros por defecto para la alineación por pares: Matriz de peso de proteínas = BLOSUM62; Apertura de hueco = 10; Extensión de hueco = 0,1. En algunos casos, el CNP puede contener modificaciones químicas adicionales conocidas en la técnica.

En algunos aspectos, el agente terapéutico incluye un ELP fusionado con el extremo N o el extremo C de CNP, fragmentos, o variantes funcionales del mismo. En algunos casos, el agente terapéutico incluye un ELP fusionado con el extremo N de CNP-22 (SEQ ID NO: 48). En otro aspecto, el agente terapéutico incluye un ELP fusionado con el extremo N de CNP-37 (SEQ ID NO: 50). En algunos casos, el agente terapéutico incluye un ELP fusionado con el extremo C de CNP (por ejemplo, SEQ ID NO: 57 o 98). En algunos casos, el agente terapéutico incluye un ELP fusionado con un pro-CNP (SEQ ID NO: 56). En algunos casos, el CNP se encuentra en una proteína de fusión con más de una secuencia de ELP. En algunos casos, el CNP tiene uno o más ELP en los extremos N y C. En algunos casos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N del CNP incluye alrededor de 90 a alrededor de 180 unidades estructurales repetitivas. En otros casos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N del CNP incluye menos de alrededor de 90 unidades estructurales repetidas. En otros casos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N del CNP incluye menos de alrededor de 40 unidades estructurales repetidas. En otros aspectos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N del CNP incluye más de alrededor de 180 unidades estructurales repetitivas. En algunos casos, los dos o más ELP en los extremos N y C tienen aproximadamente el mismo tamaño. En otros casos, los dos o más ELP en los extremos N y C difieren en tamaño. En algunos casos, el ELP en el extremo N del CNP es mayor que el ELP en el extremo C del CNP. En otros casos, el ELP en el extremo C del CNP es mayor que el ELP en el extremo N del CNP.

En algunos casos, el ELP está unido al extremo C y/o al extremo N del CNP a través de un enlazador (SEQ ID NOs: 83 y 55). En algunos casos, el enlazador comprende una secuencia de tripéptido GGS (SEQ ID NO: 87). En algunos aspectos, el enlazador comprende una única copia tripéptido GGC (SEQ ID NO: 87). En otro aspecto, el enlazador comprende múltiples repeticiones del tripéptido GGS. En algunos casos, el enlazador comprende dos repeticiones de la secuencia GGS (SEQ ID NO: 102). En algunos casos, el enlazador comprende tres repeticiones de la secuencia GGS (SEQ ID NO: 103). En algunos casos, el enlazador comprende una secuencia de pentapéptido GGGGS (SEQ ID NO: 93). En algunos aspectos, el enlazador comprende una única copia del pentapéptido GGGGS (SEQ ID NO: 93). En otro aspecto, el enlazador comprende múltiples repeticiones del pentapéptido GGGGS. En algunos casos, el enlazador comprende dos repeticiones de la secuencia GGGGS (SEQ ID NO: 104). En algunos casos, el enlazador comprende tres repeticiones de la secuencia GGGGS (SEQ ID NO: 105). En algunos casos, el enlazador comprende una secuencia de pentapéptido PAPAP (SEQ ID NO: 94). En algunos aspectos, el enlazador comprende una sola copia del pentapéptido PAPAP. En otro aspecto, el enlazador comprende múltiples repeticiones del pentapéptido PAPAP. En algunos casos, el enlazador comprende dos repeticiones de la secuencia PAPAP (SEQ ID NO: 106). En algunos casos, el enlazador comprende tres repeticiones de la secuencia PAPAP (SEQ ID NO: 107). En algunos casos, el enlazador comprende una secuencia de pentapéptido EAAAK (SEQ ID NO: 95). En algunos aspectos, el enlazador comprende una sola copia del pentapéptido EAAAK. En otro aspecto, el enlazador comprende múltiples repeticiones del pentapéptido EAAAK. En algunos casos, el enlazador comprende dos repeticiones de la secuencia EAAAK (SEQ ID NO: 108). En algunos casos, el enlazador comprende tres repeticiones de la secuencia EAAAK (SEQ ID NO: 109).

En algunos casos, el ELP está unido al extremo C y/o al extremo N del CNP a través de una secuencia peptídica que comprende un sitio de reconocimiento de proteasa. En algunos casos, el sitio de reconocimiento de proteasa se escinde in vivo, liberando así el CNP. En algunos casos, el sitio de reconocimiento de proteasa se escinde en el sitio de inyección, liberando así el CNP. En algunos casos, el sitio de reconocimiento de proteasa se escinde en la circulación, liberando así el CNP. En algunos casos, el sitio de reconocimiento de proteasa se escinde en la articulación en la proximidad de la placa de crecimiento, liberando así el CNP, en el que se requiere, y minimizando los efectos secundarios. Los sitios de reconocimiento de proteasa incluyen los del Factor Xa (por ejemplo IEGRJ,, IDGR|, GR|), trombina (por ejemplo LVPR|GS, LVPR|GF), catepsina (por ejemplo catepsina K, RKPR|G, RKLR|G), metaloproteasa de la matriz (MMP) (por ejemplo secuencia de reconocimiento de "consenso" PLGL|WAg para MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, y MMP9 (Eckhard et al. (2016) Matrix Biology 49, 37-60). El análisis del sitio de escisión preferido para la catepsina K humana por Chou et al. (2006. J. Biol. Chem. 281, 12824-12832) sugiere sitios de escisión alternativos que se pueden utilizar, por ejemplo, P3 podría ser K, G, H o M, P2 podría ser P, I o L, P1 podría ser Q, R o K.

En otros aspectos, la presente descripción proporciona métodos para tratar o prevenir enfermedades que incluyen, pero no se limitan a, enfermedades asociadas con la regulación del crecimiento óseo (por ejemplo, displasias esqueléticas que incluyen enanismo y acondroplasia); artritis idiopática juvenil; osteoartritis; enfermedades cardiovasculares; enfermedades que afectan a la homeostasis cardiovascular, diuresis, natriuresis, o vasodilatación; enfermedades del sistema nervioso central, enfermedades del tracto reproductivo; o enfermedades que afectan al endotelio de los vasos sanguíneos. Los métodos incluyen la administración de un agente terapéutico, que incluye un ELP y un CNP (como se describe anteriormente) a un paciente que necesita dicho tratamiento. Generalmente, el paciente puede ser un paciente humano o animal no humano (por ejemplo, perro, gato, vaca, o caballo). Preferiblemente, el paciente es un ser humano.

En algunos casos, el tratamiento con un agente terapéutico de CNP según la presente descripción también puede combinarse con una o más sustancias farmacológicamente activas, por ejemplo, seleccionadas de agentes para el tratamiento y/o prevención de complicaciones y trastornos resultantes o asociados con diversas enfermedades, incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedades que afectan la regulación del crecimiento óseo (por ejemplo, displasias esqueléticas que incluyen enanismo y acondroplasia); artritis idiopática juvenil; osteoartritis; enfermedades cardiovasculares; enfermedades que afectan a la homeostasis cardiovascular, diuresis, natriuresis, o vasodilatación; enfermedades del sistema nervioso central, enfermedades del tracto reproductivo; o enfermedades que afectan al endotelio de los vasos sanguíneos.

Agente activo de la descripción: Antagonistas del receptor del péptido similar a glucagón (GLP)-1

También se describen aquí casos en los que el agente terapéutico incluye un componente de ELP fusionado o conjugado con un antagonista del receptor de GLP-1, tal como exendina-4 que carece de los aminoácidos 1-8, derivados, análogos, miméticos, fragmentos, o variantes funcionales del mismo.

El GLP-1 humano es un péptido de 37 restos de aminoácidos que se origina a partir del preproglucagón que se sintetiza en las células L en el íleon distal, el páncreas, y el cerebro. El procesamiento de preproglucagón para dar amida de

GLP-1 (7-36), GLP-1 (7-37), y GLP-2 ocurre principalmente en las células L.

Después del procesamiento en las células L intestinales, el GLP-1 se libera en la circulación, sobre todo en respuesta a una comida. La concentración plasmática de GLP-1 aumenta desde un nivel en ayunas de aproximadamente 15 pmol/l hasta un nivel posprandial máximo de 40 pmol/l.

En algunos aspectos, los agentes activos proteicos de la presente invención son antagonistas del receptor de GLP-1.

En algunos casos, los antagonistas del receptor de GLP-1 son fragmentos N-terminales y/o C-terminales de GLP-1.

En otros casos, los antagonistas del receptor de GLP-1 incluyen la secuencia de aminoácidos:

DVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR (SEQ ID NOs: 54, 64, y 65), o un fragmento de la misma. En algunos aspectos, antagonista del receptor de GLP-1 es GLP-1 (9-31) (SEQ ID NO: 54). En otros aspectos, el antagonista del receptor de GLP-1 es GLP-1 (9-29) (SEQ ID NO: 64). En aún otros aspectos, el antagonista del receptor de GLP-1 es GLP-1-exendina-4 (SEQ ID NO: 65).

En otros casos, los antagonistas del receptor de GLP-1 son fragmentos N-terminal y/o C-terminal de exendina-4. En ciertos casos, los antagonistas del receptor de GLP-1 comprenden la siguiente secuencia de aminoácidos:

DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGP (SEQ iD NOs: 27, 28, 60, 61, 62, y 63), o un fragmento de la misma. En ciertos casos, los fragmentos de exendina-4 incluyen, pero no se limitan a, exendina-4 (9-39) (SEQ ID NO: 27), exendina-4

(9-31) (SEQ ID NO: 28), exendina-4 (9-30) (SEQ ID NO: 60), M-exendina-4 (9-39) (SEQ ID NO: 62), M-exendina-4 (9

31) (SEQ ID NO: 61), o M-exendina-4 (9-30) (SEQ ID NO: 63).

DVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR (SEQ ID NOs: 66 y 67), o un fragmento de la misma. En algunos aspectos, el antagonista del receptor de GLP-1 es Jant-4 (9-30) (SEQ ID NO: 66). En otro aspecto, el antagonista del receptor de

GLP-1 es Jant-4 (9-39) (SEQ ID NO: 67).

En ciertos casos, el antagonista del receptor de GLP-1 es el antagonista del receptor GLP-1 de mamífero. En algunos casos, el antagonista del receptor de GLP-1 es un antagonista del receptor de GLP-1 humano (SEQ ID NOs: 27, 28,

54, 56, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, o 67). En algunos casos, el antagonista de receptor de GLP-1 es un análogo funcional del antagonista del receptor de GLP-1 de mamífero, que incluye fragmentos funcionales truncados en el extremo N y/o el extremo C de un antagonista del receptor de GLP-1 en alrededor de 1 a alrededor de 30 aminoácidos, incluyendo, por ejemplo, en hasta alrededor de 3 aminoácidos, hasta alrededor de 5 aminoácidos, hasta alrededor de 10 aminoácidos, hasta alrededor de 15 aminoácidos, hasta alrededor de 20 aminoácidos, hasta alrededor de 25 aminoácidos, o hasta alrededor de 30 aminoácidos. En otros casos, las variantes funcionales contienen inserciones, supresiones, y/o sustituciones de alrededor de 1 a alrededor de 30 aminoácidos con respecto a una secuencia nativa o truncada (por ejemplo, SEQ ID NOs: 27, 28, 54, 56, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, o 67). Por ejemplo, las variantes funcionales pueden tener inserciones, supresiones y/o sustituciones de hasta alrededor de 3 aminoácidos, hasta alrededor de 5 aminoácidos, hasta alrededor de 10 aminoácidos, hasta alrededor de 15 aminoácidos, hasta alrededor de 20 aminoácidos, hasta alrededor de 25 aminoácidos, o hasta alrededor de 30 aminoácidos con respecto a una secuencia nativa o truncada (por ejemplo, SEQ ID NOs: 27, 28, 54, 56, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, o 67). La actividad de la proteína puede confirmarse o evaluarse usando cualquier ensayo disponible. En otros casos, el antagonista del receptor de GLP-1 tiene una secuencia de aminoácidos con al menos alrededor de 75% de identidad, alrededor de

80% de identidad, alrededor de 90% de identidad, alrededor de 95% de identidad, alrededor de 96% de identidad, alrededor de 97% de identidad, alrededor de 98% de identidad, o alrededor de 99% de identidad con una secuencia nativa o truncada (por ejemplo, SEQ ID NO: 27, 28, 54, 56, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, o 67). El porcentaje de identidad se puede calcular utilizando el programa de alineación EMBOSS needle, disponible en http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/. Se pueden utilizar los siguientes parámetros por defecto para la alineación por pares: Matriz de peso de proteínas = BLOSUM62; Apertura de hueco = 10; Extensión de hueco = 0,1.

En algunos casos, el antagonista del receptor de GLP-1 puede contener modificaciones químicas adicionales conocidas en la técnica.

En ciertos casos, el agente terapéutico incluye un ELP fusionado con el extremo C del antagonista del receptor de

GLP-1, análogos, miméticos, derivados, fragmentos, o variantes funcionales del mismo. En algunos casos, el agente terapéutico incluye un ELP fusionado con el extremo N de antagonista del receptor de GLP-1 humano (SEQ ID NO:

58 y 59). En algunos casos, el antagonista del receptor de GLP-1 se encuentra en una proteína de fusión con más de una secuencia de ELP. En algunos casos, el antagonista del receptor de GLP-1 tiene uno o más ELP tanto en el extremo N como en el extremo C. En algunos casos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N del antagonista del receptor de GLP-1 incluye alrededor de 90 a alrededor de 180 unidades estructurales repetitivas. En otros casos, el

ELP en el extremo C y/o el extremo N del antagonista del receptor de GLP-1 incluye menos de alrededor de 90 unidades estructurales repetidas. En otros aspectos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N del antagonista del receptor de GLP-1 incluye más de alrededor de 180 unidades estructurales repetitivas. En algunos casos, los dos o más ELP en los extremos N y C tienen aproximadamente el mismo tamaño. En otros casos, los dos o más ELP en los extremos N y C difieren en tamaño. En algunos casos, el ELP en el extremo N del antagonista del receptor de GLP-1

es mayor que el ELP en el extremo C del antagonista del receptor de GLP-1. En otros casos, el ELP en el extremo C del antagonista del receptor de GLP-1 es mayor que el ELP en el extremo N del antagonista del receptor de GLP-1.

En otros casos, el agente terapéutico antagonista del receptor de GLP-1 se usa para tratar enfermedades que incluyen, pero no se limitan a, diabetes (tipo 1 o 2); enfermedad metabólica; obesidad; enfermedades resultantes de una secreción excesiva de insulina que incluye, pero no se limita a, hipoglucemia asociada con hiperinsulinemia; hipoglucemia hiperinsulinémica adquirida tras cirugía gástrica; o hiperinsulinismo, tal como hiperinsulinismo congénito o hiperinsulinismo adquirido después de cirugía gástrica, por ejemplo cirugía gástrica para tratar la obesidad. Los métodos incluyen administrar un agente terapéutico, que incluye un ELP y un antagonista del receptor de GLP-1 (como se describe anteriormente), a un paciente que necesita dicho tratamiento. Generalmente, el paciente puede ser un paciente humano o animal no humano (por ejemplo, perro, gato, vaca, o caballo). Preferiblemente, el paciente es un ser humano.

En algunos casos, el tratamiento con un agente terapéutico antagonista del receptor de GLP-1 según la presente descripción también puede combinarse con una o más sustancias farmacológicamente activas, por ejemplo seleccionadas de agentes para el tratamiento y/o prevención de diversas complicaciones y trastornos, resultantes de o asociados con enfermedades que incluyen, sin limitación, diabetes (tipo 1 o 2); enfermedad metabólica; obesidad; enfermedades resultantes de una secreción excesiva de insulina que incluye, pero no se limita a, hipoglucemia asociada con hiperinsulinemia; hipoglucemia hiperinsulinémica adquirida tras cirugía gástrica; o hiperinsulinismo, tal como hiperinsulinismo congénito o hiperinsulinismo adquirido después de cirugía gástrica, por ejemplo cirugía gástrica para tratar la obesidad.

Agente activo de la descripción: Hepcidina

Un ejemplo de un agente activo es la hepcidina (también conocida como LEAP-1 (péptido antimicrobiano expresado en el hígado)), derivados, análogos, miméticos, fragmentos, o variantes funcionales de la misma. La hepcidina es una hormona peptídica de 8 kDa producida por los hepatocitos en respuesta a la inflamación o al aumento de los niveles de hierro en la sangre.

Se identificó un ADNc de hepcidina que codifica un pre-propéptido de 83 aminoácidos en ratones y un pre-propéptido de 84 aminoácidos en ratas y seres humanos en una búsqueda de genes específicos del hígado que estaban regulados por el hierro (Pigeon et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:7811 (2001)). El péptido señal N-terminal de 24 restos se escinde primero para producir pro-hepcidina, que entonces se procesa posteriormente para producir hepcidina madura, que se encuentra tanto en la sangre como en la orina. En la orina humana, la forma predominante de hepcidina contiene 25 aminoácidos, aunque también están presentes péptidos más cortos de 22 y 20 aminoácidos.

La hepcidina humana es un péptido de 25 aminoácidos (Hep25). (véanse Krause et al., 2000, FEBS Lett 480:147-150, y Park et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:7806-7810). La estructura de la forma bioactiva de 25 aminoácidos de hepcidina es una horquilla simple con 8 cisteínas que forman 4 enlaces de disulfuro (Jordan et al., 2009, J. Biol. Chem.

284:24155-67).

La hepcidina se une a su receptor, el canal de exportación de hierro ferroportina, y provoca su internalización y degradación, reduciendo así la liberación de hierro mediada por ferroportina en la sangre. La internalización reduce aún más el transporte de hierro a través de la mucosa intestinal y la absorción por el hígado y los macrófagos. La expresión de hepcidina aumenta en la inflamación aguda y crónica, lo que disminuye la disponibilidad de hierro para la eritropoyesis. En ciertos casos, el agente terapéutico de hepcidina incluye una secuencia de aminoácidos que proporciona liberación sostenida, fusionada o conjugada con hepcidina, fragmentos, o variantes funcionales de la misma. En algunos casos, la secuencia de aminoácidos que proporciona liberación sostenida es ELP.

En ciertos casos, la hepcidina es un hepcidina de mamífero. En algunos casos, la hepcidina es hepcidina humana (SEQ ID NO: 75). En algunos casos, la hepcidina de mamífero incluye el fragmento N-terminal de hepcidina, DTHFPICIF (SEQ ID NO: 88) que es fundamental para la actividad. En ciertos casos, la presente invención proporciona fragmentos peptídicos que imitan la actividad de hepcidina de Hep25, la forma humana bioactiva de 25 aminoácidos. Tales péptidos se denominan "mini-hepcidinas".

En algunos casos, la hepcidina es una variante funcional de hepcidina humana, incluyendo fragmentos funcionales truncados en el extremo C de hepcidina de alrededor de 1 a alrededor de 20 aminoácidos, incluyendo, por ejemplo, en hasta alrededor de 3 aminoácidos, hasta alrededor de 5 aminoácidos, hasta alrededor de 10 aminoácidos, hasta alrededor de 15 aminoácidos, o hasta alrededor de 20 aminoácidos. En otros casos, las variantes funcionales contienen inserciones, supresiones, y/o sustituciones en el extremo C de alrededor de 1 a alrededor de 20 aminoácidos con respecto a la secuencia nativa (por ejemplo, SEQ ID NO: 75). Por ejemplo, las variantes funcionales pueden tener inserciones, supresiones, y/o sustituciones de hasta alrededor de 3 aminoácidos, hasta alrededor de 5 aminoácidos, hasta alrededor de 10 aminoácidos, hasta alrededor de 15 aminoácidos, o hasta alrededor de 20 aminoácidos con respecto a una secuencia nativa (por ejemplo, SEQ ID NO: 75).

La actividad de la proteína puede confirmarse o evaluarse usando cualquier ensayo disponible. Como se usa aquí, en algunos casos, un compuesto que tiene "actividad de hepcidina'' indica que el compuesto tiene la capacidad de reducir las concentraciones de hierro en plasma en sujetos (por ejemplo ratones o seres humanos), cuando se les administra (por ejemplo inyectado por vía parenteral o administrado por vía oral), de manera dependiente de la dosis y del tiempo. (Véanse, por ejemplo, como se demuestra en Rivera et al., 2005, Blood, 106: 2196-2199). En algunos casos, los péptidos de la presente invención tienen actividad in vitro según lo ensayado por la capacidad de causar la internalización y degradación de ferroportina en una línea celular que expresa ferroportina como se enseña en Nemeth et al., 2006, Blood, 107: 328-333. La actividad in vitro se puede medir, por ejemplo, mediante la pérdida de fluorescencia dependiente de la dosis de células modificadas para mostrar ferroportina fusionada con proteína fluorescente verde como se enseña en Nemeth et al., 2006, Blood, 107: 328-33.

En algunos casos, la hepcidina tiene al menos alrededor de 75% de identidad, alrededor de 80% de identidad, alrededor de 90% de identidad, alrededor de 95% de identidad, alrededor de 96% de identidad, alrededor de 97% de identidad, alrededor de 98% de identidad, o alrededor de 99% de identidad con una secuencia nativa (por ejemplo, SEQ ID NO: 75). El porcentaje de identidad se puede calcular utilizando el programa de alineación EMBOSS needle, disponible en http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/. Se pueden utilizar los siguientes parámetros por defecto para la alineación por pares: Matriz de peso de proteínas = BLOSUM62; Apertura de hueco = 10; Extensión de hueco = 0,1. En algunos casos, la hepcidina puede contener modificaciones químicas adicionales conocidas en la técnica.

En ciertos casos, el agente terapéutico incluye un ELP fusionado con el extremo N o el extremo C de hepcidina, fragmentos, o variantes funcionales del mismo. En algunos casos, el agente terapéutico incluye un ELP fusionado con el extremo N de hepcidina humana (SEQ ID NO: 76). En otros casos, el agente terapéutico incluye un ELP fusionado con el extremo C de hepcidina humana (SEQ ID NO: 77).

En algunos casos, la hepcidina se encuentra en una proteína de fusión con más de una secuencia de ELP. En algunos casos, la hepcidina tiene uno o más ELP en los extremos N y C. En algunos casos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N de la hepcidina incluye alrededor de 90 a alrededor de 180 unidades estructurales repetitivas. En otros casos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N de la hepcidina incluye menos de alrededor de 90 unidades estructurales repetidas. En otros aspectos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N de la hepcidina incluye más de alrededor de 180 unidades estructurales repetitivas. En algunos casos, los dos o más ELP en los extremos N y C tienen aproximadamente el mismo tamaño. En otros casos, los dos o más ELP en los extremos N y C difieren en tamaño. En algunos casos, el ELP en el extremo N de la hepcidina es mayor que el ELP en el extremo C del péptido de hepcidina. En otros casos, el ELP en el extremo C de la hepcidina es mayor que el ELP en el extremo N de la hepcidina.

En otros aspectos, la presente descripción proporciona métodos para tratar o prevenir enfermedades intestinales que incluyen, pero no se limitan a, enfermedades por carga de hierro tales como hemocromatosis hereditaria (HH) o anemias por sobrecarga de hierro; hemocromatosis tipo 2; enfermedades cardíacas tales como siderosis miocárdica o insuficiencia cardíaca; enfermedades que causan daño endocrino; enfermedades hepáticas tales como cirrosis hepática o carcinoma hepatocelular; diabetes; beta-talasemia; infecciones graves agudas; o policitemia vera. Los métodos incluyen la administración de un agente terapéutico, que incluye un ELP y una hepcidina (como se describe anteriormente) a un paciente que necesita dicho tratamiento. Generalmente, el paciente puede ser un paciente humano o animal no humano (por ejemplo, perro, gato, vaca, o caballo). Preferiblemente, el paciente es un ser humano.

En algunos casos, el tratamiento con un agente terapéutico de hepcidina según la presente descripción también puede combinarse con una o más sustancias farmacológicamente activas, por ejemplo seleccionadas de agentes para el tratamiento y/o prevención de diversas complicaciones y trastornos, resultantes o asociados con diversas enfermedades, incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedades por sobrecarga de hierro tales como hemocromatosis hereditaria (HH) o anemias por carga de hierro; hemocromatosis tipo 2; enfermedades cardíacas tales como siderosis miocárdica o insuficiencia cardíaca; enfermedades que causan daño endocrino; enfermedades hepáticas tales como cirrosis hepática o carcinoma hepatocelular; diabetes; beta-talasemia; infecciones graves agudas; o policitemia vera.

Agente activo de la descripción: Factor 1 de crecimiento similar a insulina (IGF-1)

Un ejemplo de un agente activo proteico es IGF-1 derivados, análogos, miméticos, fragmentos, o variantes funcionales del mismo. IGF-I es un péptido monocatenario presente en el plasma y otros fluidos corporales, así como en muchas células/tejidos, que comprende 70 aminoácidos, que incluye 3 enlaces de disulfuro, y estimula la proliferación de un amplio intervalo de tipos celulares, y media algunos de los efectos de la hormona del crecimiento.

IGF-1 tiene efectos tanto sistémicos como locales, y se asocia principalmente con diferentes proteínas de unión específica, cuatro de las cuales se denominan IGFBP1, IGFBP2, IGFBP3 e IGFBP4. Estas proteínas de unión modulan las funciones biológicas y la disponibilidad de IGF-1 tanto de forma positiva como negativa.

El IGF-1 actúa principalmente mediante interacciones con el receptor de IGF tipo 1 expuesto en la superficie externa de las membranas plasmáticas en muchos tipos de células diferentes. El IGF-1 R se expresa en muchos tipos celulares diferentes, y por tanto varios tejidos del organismo dependen de la acción del IGF-1: hígado, riñones, pulmones,

músculos, tejido óseo, y cartílago, así como tejido nervioso.

En ciertos casos, el agente terapéutico de IGF-1 de la presente descripción incluye una secuencia de aminoácidos

que proporciona liberación sostenida, fusionada o conjugada con IGF-1, fragmentos, o variantes funcionales del mismo.

En algunos casos, la secuencia de aminoácidos que proporciona liberación sostenida es ELP.

En ciertos casos, el IGF-1 es un IGF-1 de mamífero. En algunos casos, el IGF-1 es IGF-1 humano (SEQ ID NO: 78).

En algunos casos, el IGF-1 es un fragmento o variante funcional de IGF-1 humano, incluyendo fragmentos funcionales

truncados en el extremo N y/o el extremo C de IGF-1 en alrededor de 1 a alrededor de 50 aminoácidos, incluyendo,

por ejemplo, en hasta alrededor de 3 aminoácidos, hasta alrededor de 5 aminoácidos, hasta alrededor de 10

aminoácidos, hasta alrededor de 15 aminoácidos, hasta alrededor de 20 aminoácidos, hasta alre aminoácidos, hasta alrededor de

aminoácidos, hasta alrededor de 35 aminoácidos, hasta alre aminoácidos, hasta alrededor de 45 aminoácidos, o hasta alrededor de 50 aminoácidos. En otros casos, l fragmentos o variantes funcionales contienen inserciones, supresiones, y/o sustituciones de alrededor de 1 a alrededor

de 50 aminoácidos con respecto a una secuencia nativa (por ejemplo, SEQ ID NO: 78). Por ejemplo, los fragmentos

o variantes funcionales pueden tener inserciones, supresiones y/o sustituciones de hasta alrededor de 3 aminoácidos,

de hasta alrededor de 5 aminoácidos, hasta alrededor de 10 aminoácidos, hasta alrededor de 15 aminoácidos, hasta

alrededor de 20 aminoácidos, hasta alrededor de 25 aminoácidos, hasta alrededor de 30 aminoácidos, hasta alrededor

de 35 aminoácidos, hasta alrededor de 40 aminoácidos, hasta alrededor de 45 aminoácidos, o hasta alrededor de 50

aminoácidos con respecto a una secuencia nativa (por ejemplo, SEQ ID NO: 78). La actividad de la proteína puede

confirmarse o evaluarse usando cualquier ensayo disponible. En otros casos, el IGF-1, derivado, análogo, mimético,

fragmento, o variante funcional del mismo tiene al menos alrededor de 75% de identidad, alrededor de 80% de

identidad, alrededor de 90% de identidad, alrededor de 95% de identidad, alrededor de 96% de identidad, alrededor

de 97% de identidad, alrededor de 98% de identidad, o alrededor de 99% de identidad con una secuencia nativa (por

ejemplo, SEQ ID NO: 78). El porcentaje de identidad se puede calcular utilizando el programa de alineación EMBOSS

needle, disponible en http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/. Se pueden utilizar los siguientes parámetros

por defecto para la alineación por pares: Matriz de peso de proteínas = BLOSUM62; Apertura de hueco = 10; Extensión

de hueco = 0,1. En algunos casos, el IGF-1, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional del mismo

puede contener modificaciones químicas adicionales conocidas en la técnica.

En ciertos casos, el agente terapéutico incluye un ELP fusionado con el extremo N o el extremo C de IGF-1, derivados,

análogos, miméticos, fragmentos, o variantes funcionales del mismo. En algunos casos, el agente terapéutico incluye

un ELP fusionado con el extremo C de IGF-1 (SEQ ID NOs: 79 y 80).

En algunos casos, el IGF-1, derivados, análogos, miméticos, fragmentos, o variantes funcionales del mismo se

encuentra en una proteína de fusión con más de una secuencia de ELP. En algunos casos, el IGF-1 tiene uno o más

ELP en los extremos N y C. En algunos casos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N del IGF-1 incluye alrededor

de 90 a alrededor de 180 unidades estructurales repetitivas. En otros casos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N

del el IGF-1 incluye menos de alrededor de 90 unidades estructurales repetidas. En otros aspectos, el ELP en el

extremo C y/o el extremo N del el IGF-1 incluye más de alrededor de 180 unidades estructurales repetitivas. En algunos

casos, los dos o más ELP en los extremos N y C tienen aproximadamente el mismo tamaño. En otros casos, los dos

o más ELP en los extremos N y C difieren en tamaño. En algunos casos, el ELP en el extremo N del IGF-1 es mayor

que el ELP en el extremo C del IGF-1. En otros casos, el ELP en el extremo C del IGF-1 es mayor que el ELP en el

extremo N del IGF-1.

En otros aspectos, la presente descripción proporciona métodos para tratar o prevenir enfermedades que incluyen,

pero no se limitan a, la deficiencia primaria de IGF-1; neuropatía; enfermedades neurológicas; cáncer; enfermedad

renal; enfermedad hepática; enfermedades de los pulmones; diabetes; defectos de crecimiento; tratamiento de niños

con supresión del gen GH que han desarrollado anticuerpos neutralizantes contra la GH recombinante; síndrome de

Laron, o enanismo tipo Laron; cardiopatía; o accidente cerebrovascular. Los métodos incluyen la administración de un

agente terapéutico, que comprende un ELP y un IGF-1 (como se describe anteriormente) a un paciente que necesita

dicho tratamiento. Generalmente, el paciente puede ser un paciente humano o animal no humano (por ejemplo, perro,

gato, vaca, o caballo). Preferiblemente, el paciente es un ser humano.

En algunos casos, el tratamiento con un compuesto de IGF-1 según la presente descripción también puede

combinarse con quimioterapia e irradiación, así como con una o más sustancias farmacológicamente activas, por

ejemplo seleccionadas de agentes para el tratamiento y/o prevención de complicaciones y trastornos resultantes o

asociados con diversas enfermedades, incluyendo, sin limitación, deficiencia primaria de IGF-1; neuropatía;

enfermedades neuronales; cáncer; enfermedad renal; enfermedad hepática; enfermedades de los pulmones; diabetes;

defectos de crecimiento; tratamiento de niños con supresión del gen GH que han desarrollado anticuerpos

neutralizantes contra la GH recombinante; síndrome de Laron, o enanismo tipo Laron; cardiopatía; o accidente

cerebrovascular.

Agente activo de la descripción: Urodilatina

Un ejemplo de un agente activo proteico es urodilatina derivados, análogos, miméticos, fragmentos, o variantes funcionales del mismo. La urodilatina es una hormona peptídica de 32 aminoácidos que es un agonista del receptor A del péptido natriurético (NPR-A). La urodilatina es la isoforma renal del péptido natriurético auricular (ANP). Se forma por un procesamiento diferencial de la prohormona ANP en el riñón, a diferencia de todos los demás tejidos, en los que en lugar de que la prohormona de 126 aminoácidos se escinda entre los aminoácidos 98 y 99 para formar ANP y péptido kaliurético, la prohormona se escinde entre el aminoácido 95 y 96. La escisión de la prohormona ANP en el riñón da como resultado 4 aminoácidos del extremo C-terminal del péptido kaliurético (es decir, treonina-alaninaprolina-arginina) que se une al extremo N de ANP. Por lo tanto, la urodilatina es un péptido que contiene 32 aminoácidos con la misma estructura que el ANP que contiene 28 aminoácidos, excepto por la adición de cuatro aminoácidos (TAPR) en la extensión N-terminal.

La urodilatina se produce en cantidades fisiológicas en el riñón, se procesa de forma diferente, y se segrega en la orina y constituye la base de un sistema paracrino que regula la reabsorción de agua y sodio a nivel del conducto colector (Forssmann, W.-G. et al., 1998, Histochemistry and Cell Biology 110(4): 335-357). La urodilatina provoca diuresis al aumentar el flujo sanguíneo renal. Se segrega en respuesta al aumento de la tensión arterial media y al aumento del volumen sanguíneo de las células del túbulo distal y del conducto colector. Es importante en pacientes oligúricos (tales como aquellos con insuficiencia renal aguda e insuficiencia renal crónica) ya que reduce la creatinina sérica y aumenta la diuresis.

La urodilatina es más potente que el ANP, y tiene una vida media dos veces mayor que la del ANP, lo que puede deberse a que el extremo N de la urodilatina es resistente a la desactivación por la endopeptidasa neutra. En ciertos casos, el agente terapéutico de urodilatina de la presente descripción incluye una secuencia de aminoácidos que proporciona liberación sostenida, fusionada o conjugada con urodilatina, fragmentos, o variantes funcionales de la misma. En algunos casos, la secuencia de aminoácidos que proporciona liberación sostenida es ELP.

En ciertos casos, la urodilatina es una urodilatina de mamífero. En algunos casos, la urodilatina es urodilatina humana (SEQ ID NO: 84). En algunos casos, la urodilatina es un derivado, análogo mimético, fragmento, o variante funcional de urodilatina de mamífero, incluyendo fragmentos funcionales truncados en el extremo C de urodilatina en alrededor de 1 a alrededor de 25 aminoácidos, incluyendo, por ejemplo, en hasta alrededor de 3 aminoácidos, hasta alrededor de 5 aminoácidos, hasta alrededor de 10 aminoácidos, hasta alrededor de 15 aminoácidos, hasta alrededor de 20 aminoácidos, o hasta alrededor de 25 aminoácidos. En otros casos, la urodilatina, derivados, análogos, miméticos, fragmentos o variantes funcionales contienen inserciones, supresiones, y/o sustituciones de alrededor de 1 a alrededor de 25 aminoácidos con respecto a una secuencia nativa (por ejemplo, SEQ ID NO: 84). Por ejemplo, la urodilatina, derivados, análogos, miméticos, fragmentos o variantes funcionales pueden tener inserciones, supresiones, y/o sustituciones de hasta alrededor de 3 aminoácidos, hasta alrededor de 5 aminoácidos, hasta alrededor de 10 aminoácidos, hasta alrededor de 15 aminoácidos, hasta alrededor de 20 aminoácidos, o hasta alrededor de 25 aminoácidos con respecto a una secuencia consenso (por ejemplo, SEQ ID NO: 84). La actividad de la proteína puede confirmarse o evaluarse usando cualquier ensayo disponible. En otros casos, la urodilatina, derivados, análogos, miméticos, fragmentos o variantes funcionales tiene al menos alrededor de 75% de identidad, alrededor de 80% de identidad, alrededor de 90% de identidad, alrededor de 95% de identidad, alrededor de 96% de identidad, alrededor de 97% de identidad, alrededor de 98% de identidad, o alrededor de 99% de identidad con una secuencia nativa (por ejemplo, SEQ ID NO: 84). El porcentaje de identidad se puede calcular utilizando el programa de alineación EMBOSS needle, disponible en http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/. Se pueden utilizar los siguientes parámetros por defecto para la alineación por pares: Matriz de peso de proteínas = BLOSUM62; Apertura de hueco = 10; Extensión de hueco = 0,1. En algunos casos, la urodilatina, derivados, análogos, miméticos, fragmentos o variantes funcionales pueden contener modificaciones químicas adicionales conocidas en la técnica.

En ciertos casos, el agente terapéutico incluye un ELP fusionado con el extremo N o el extremo C de urodilatina, derivados, análogos, miméticos, fragmentos, o variantes funcionales de la misma. En algunos casos, el agente terapéutico incluye un ELP fusionado con el extremo C de urodilatina humana (SEQ ID NO: 85). En otros casos, el agente terapéutico incluye un ELP fusionado con el extremo N de urodilatina humana (SEQ ID NO: 86).

En algunos casos, la urodilatina, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional se encuentra en una proteína de fusión con más de una secuencia de ELP. En algunos casos, la urodilatina, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional tiene uno o más ELP en los extremos N y C. En algunos casos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N de la urodilatina, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional incluye alrededor de 90 a alrededor de 180 unidades estructurales repetitivas. En otros casos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N de la urodilatina, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional incluye menos de alrededor de 90 unidades estructurales repetidas. En otros aspectos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N de la urodilatina, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional incluye más de alrededor de 180 unidades estructurales repetitivas. En algunos casos, los dos o más ELP en los extremos N y C tienen aproximadamente el mismo tamaño. En otros casos, los dos o más ELP en los extremos N y C difieren en tamaño. En algunos casos, el ELP en el extremo N de la urodilatina es mayor que el ELP en el extremo C de la urodilatina, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional. En otros casos, el ELP en el extremo C de la urodilatina es mayor que el ELP en el extremo N de la urodilatina, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional.

En otros aspectos, la presente descripción proporciona métodos para tratar o prevenir enfermedades que incluyen, pero no se limitan a, enfermedades cardíacas tales como insuficiencia cardíaca aguda (AHF); o enfermedad renal tal como insuficiencia renal aguda o insuficiencia renal crónica. Los métodos incluyen la administración de un agente terapéutico, que incluye un ELP y una urodilatina (como se describe anteriormente) a un paciente que necesita dicho tratamiento. Generalmente, el paciente puede ser un paciente humano o animal no humano (por ejemplo, perro, gato, vaca, o caballo). Preferiblemente, el paciente es un ser humano.

En algunos casos, el tratamiento con una urodilatina según la presente descripción también puede combinarse con una o más sustancias farmacológicamente activas, que incluyen, pero no se limitan a, diuréticos y agentes para el tratamiento y/o prevención de complicaciones y trastornos resultantes o asociados con diversas enfermedades que incluyen, sin limitación, enfermedades cardíacas tales como AHF; o enfermedad renal tal como insuficiencia renal aguda o insuficiencia renal crónica.

Agente activo de la descripción: Timosina 04

Un ejemplo de un agente activo proteico es timosina p4, derivados, análogos, miméticos, fragmentos, o variantes funcionales del mismo. Las timosinas se refieren a una familia de proteínas bioquímica y funcionalmente distintas que se identificaron originalmente en el timo, y ahora se sabe que están presentes en muchos otros tejidos, y que tienen una variedad de funciones fisiológicas diferentes. Se han identificado más de 20 isoformas de p-timosina en diferentes especies, y entre los seres humanos se han identificado tres p-timosinas que incluyen timosina p4, timosina p10, y timosina p15, todas las cuales comparten una homología significativa de secuencia de aminoácidos. A pesar de esta homología, cada una de estas proteínas timosina beta es un producto génico distinto con funciones diferentes.

La timosina p4, la más abundante de las p-timosinas, es un polipéptido ácido soluble en agua altamente conservado. La timosina p4 se identificó inicialmente como una proteína que aumenta durante la migración y diferenciación de las células endoteliales in vitro. El gen de mamífero que codifica la timosina p-4 se localiza en el cromosoma X. La timosina p-4 humana, ligada al cromosoma X, tiene 44 aminoácidos, y escapa a la inactivación del cromosoma X al ser procesada en un péptido de 43 aminoácidos, con un peso molecular de 4,9 kDa, mediante la eliminación del primer resto de metionilo (Girardi, M., et al., 2003, Immunology 109: 1-7). La timosina p-4 se localiza tanto en el citoplasma como en el núcleo de las células. La timosina p-4 está presente en muchos tejidos, y tiene múltiples funciones biológicas. Regula potentemente la polimerización de actina, estimula la remodelación de tejidos, la diferenciación celular, y la curación de células y tejidos después de una lesión, y también participa en la expresión de varias quimiocinas y citocinas inflamatorias.

En ciertos casos, el agente terapéutico de timosina p4 de la presente descripción incluye una secuencia de aminoácidos que proporciona liberación sostenida, fusionada o conjugada con timosina p4, fragmentos, o variantes funcionales del mismo. En algunos casos, la secuencia de aminoácidos que proporciona liberación sostenida es ELP.

En ciertos casos, la timosina p4, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional es una timosina p4 de mamífero. En algunos casos, la timosina p4 es timosina p4 humana (SEQ ID NO: 89). En algunos casos, la timosina p4 derivado, análogo, mimético, fragmento o variante funcional de timosina p4 de mamífero, incluyendo fragmentos funcionales truncados en el extremo N y/o el extremo C de timosina p4 de alrededor de 1 a alrededor de 35 aminoácidos, incluyendo, por ejemplo, en hasta alrededor de 3 aminoácidos, hasta alrededor de 5 aminoácidos, hasta alrededor de 10 aminoácidos, hasta alrededor de 15 aminoácidos, hasta alrededor de 20 aminoácidos, hasta alrededor de 25 aminoácidos, hasta alrededor de 30 aminoácidos, o hasta alrededor de 35 aminoácidos. En otros casos, la timosina p4, derivados, análogos, miméticos, fragmentos o variantes funcionales contienen inserciones, supresiones, y/o sustituciones de alrededor de 1 a alrededor de 35 aminoácidos con respecto a una secuencia nativa (por ejemplo, SEQ ID NO: 89). Por ejemplo, la timosina p4, derivados, análogos, miméticos, fragmentos o variantes funcionales pueden tener inserciones, supresiones, y/o sustituciones de hasta alrededor de 3 aminoácidos, hasta alrededor de 5 aminoácidos, hasta alrededor de 10 aminoácidos, hasta alrededor de 15 aminoácidos, hasta alrededor de 20 aminoácidos, hasta alrededor de 25 aminoácidos, hasta alrededor de 30 aminoácidos, o hasta alrededor de 35 aminoácidos con respecto a una secuencia consenso (por ejemplo, SEQ ID NO: 89). La actividad de la proteína puede confirmarse o evaluarse usando cualquier ensayo disponible. En otros casos, la timosina p4, derivados, análogos, miméticos, fragmentos o variantes funcionales tiene al menos alrededor de 75% de identidad, alrededor de 80% de identidad, alrededor de 90% de identidad, alrededor de 95% de identidad, alrededor de 96% de identidad, alrededor de 97% de identidad, alrededor de 98% de identidad, o alrededor de 99% de identidad con una secuencia nativa (por ejemplo, SEQ ID NO: 89). El porcentaje de identidad se puede calcular utilizando el programa de alineación EMBOSS needle, disponible en http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/. Se pueden utilizar los siguientes parámetros por defecto para la alineación por pares: Matriz de peso de proteínas = BLOSUM62; Apertura de hueco = 10; Extensión de hueco = 0,1. En algunos casos, la timosina p4, derivados, análogos, miméticos, fragmentos o variantes funcionales pueden contener modificaciones químicas adicionales conocidas en la técnica.

En ciertos casos, el agente terapéutico incluye un ELP fusionado con el extremo N o el extremo C de timosina p4, derivados, análogos, miméticos, fragmentos, o variantes funcionales de la misma. En algunos casos, el agente terapéutico incluye un ELP fusionado con el extremo C de timosina p4 humana (SEQ ID NO: 90).

En algunos casos, la timosina p4, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional se encuentra en una proteína de fusión con más de una secuencia de ELP. En algunos casos, la timosina p4, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional tiene uno o más ELP en los extremos N y C. En algunos casos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N de la timosina p4, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional incluye alrededor de 90 a alrededor de 180 unidades estructurales repetitivas. En otros casos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N de la timosina p4, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional incluye menos de alrededor de 90 unidades estructurales repetidas. En otros aspectos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N de la timosina p4, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional incluye más de alrededor de 180 unidades estructurales repetitivas. En algunos casos, los dos o más ELP en los extremos N y C tienen aproximadamente el mismo tamaño. En otros casos, los dos o más ELP en los extremos N y C difieren en tamaño. En algunos casos, el ELP en el extremo N de la timosina p4, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional es mayor que el ELP en el extremo C de timosina p4. En otros casos, el ELP en el extremo C de la timosina p4, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional es mayor que el ELP en el extremo N.

En otros aspectos, la presente descripción proporciona métodos para tratar o prevenir enfermedades que incluyen, pero no se limitan a, insuficiencia cardíaca; hipertensión pulmonar; cardiopatía isquémica; ojo seco; o fibrosis hepática. Los métodos incluyen la administración de un agente terapéutico, que incluye un ELP y una timosina p4 (como se describe anteriormente) a un paciente que necesita dicho tratamiento. Generalmente, el paciente puede ser un paciente humano o animal no humano (por ejemplo, perro, gato, vaca, o caballo). Preferiblemente, el paciente es un ser humano.

En algunos casos, el tratamiento con una timosina p4 según la presente descripción también puede combinarse con una o más sustancias farmacológicamente activas, por ejemplo seleccionadas de agentes para el tratamiento y/o prevención de complicaciones y trastornos resultantes o asociados con diversas enfermedades que incluyen, sin limitación, insuficiencia cardiaca; hipertensión pulmonar; cardiopatía isquémica; ojo seco; o fibrosis hepática.

Agente activo de la descripción: TRAIL

Un ejemplo de un agente activo proteico es TRAIL (ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF), derivados, análogos, miméticos, fragmentos, o variantes funcionales del mismo.

La ruta de muerte celular extrínseca se desencadena por interacciones ligando-receptor que conducen a eventos de señalización intracelular, que finalmente dan como resultado la muerte de la célula diana (apoptosis). Uno de estos ligandos es un miembro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF), TRAIL o Apo2L (Wiley, S. R., et al., 1995, Immunity 3:673-682; Pitti, R. M., et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 12687-12690). TRAIL es una proteína de membrana tipo II de 281 aminoácidos. Su región extracelular comprende los restos de aminoácidos 114-281, y, tras la escisión por proteasas, forma una molécula soluble de sTRAIL de 20 kDa de tamaño, que también es biológicamente activa. El TRAIL endógeno existe como un homotrímero que es un requisito fundamental para su función biológica. Los linfocitos T activados y las células NK expresan altos niveles de TRAIL.

La proteína TRAIL actúa, por ejemplo, uniéndose y activando los receptores 1 y 2 de superficie proapoptóticos TRAIL (TRAIL-R1/R2 o DR4 y DR5). Tanto TRAIL como sTRAIL son capaces de desencadenar la apoptosis a través de la interacción con los receptores de TRAIL presentes en las células diana.

En ciertos casos, el agente terapéutico de TRAIL de la presente descripción incluye una secuencia de aminoácidos que proporciona liberación sostenida, fusionada o conjugada con TRAIL, fragmentos, o variantes funcionales del mismo. En algunos casos, la secuencia de aminoácidos que proporciona liberación sostenida es ELP.

En ciertos casos, el TRAIL es un TRAIL de mamífero. En algunos casos, el TRAIL de mamífero es TRAIL humano (SEQ ID NO: 91). En algunos casos, el TRAIL puede ser un derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional del mismo TRAIL de mamífero, incluyendo fragmentos funcionales truncados en el extremo N y/o el extremo C de TRAIL en alrededor de 1 a alrededor de 160 aminoácidos, incluyendo, por ejemplo, en hasta alrededor de 3 aminoácidos, hasta alrededor de 5 aminoácidos, hasta alrededor de 10 aminoácidos, hasta alrededor de 15 aminoácidos, hasta alrededor de 20 aminoácidos hasta alrededor de 25 aminoácidos hasta alrededor de 30 aminoácidos, hasta alrededor de 35 aminoácidos hasta alrededor de 40 aminoácidos hasta alrededor de 45 aminoácidos, hasta alrededor de 50 aminoácidos hasta alrededor de 55 aminoácidos hasta alrededor de 60 aminoácidos, hasta alrededor de 65 aminoácidos hasta alrededor de 70 aminoácidos hasta alrededor de 75 aminoácidos, hasta alrededor de 80 aminoácidos hasta alrededor de 85 aminoácidos hasta alrededor de 90 aminoácidos, hasta alrededor de 95 aminoácidos, hasta alrededor de 100 aminoácidos, hasta alrededor de 105 aminoácidos, hasta alrededor de 110 aminoácidos hasta alrededor de 115 aminoácidos, hasta alrededor de 120 aminoácidos, hasta alrededor de 125 aminoácidos, hasta alrededor de 130 aminoácidos, hasta alrededor de 135 aminoácidos, hasta alrededor de 140 aminoácidos hasta alrededor de 145 aminoácidos hasta alrededor de 150 aminoácidos, hasta alrededor de 155 aminoácidos, o hasta alrededor de 160 aminoácidos. TRAIL, derivados, análogos miméticos, fragmentos o variantes funcionales puede contener inserciones, supresiones, y/o sustituciones de alrededor de 1 a alrededor de 160 aminoácidos con respecto a una secuencia nativa (por ejemplo, SEQ ID NO: 91). Por ejemplo, TRAIL, derivados, análogos, miméticos, fragmentos, o variantes funcionales pueden tener inserciones, supresiones y/o sustituciones de hasta alrededor de 3 aminoácidos, hasta alrededor de 5 aminoácidos, hasta alrededor de 10 aminoácidos, hasta alrededor de 15 aminoácidos, hasta alrededor de 20 aminoácidos, hasta alrededor de 25 aminoácidos, hasta alrededor de 30 aminoácidos, hasta alrededor de 35 aminoácidos, hasta alrededor de 40 aminoácidos, hasta alrededor de 45 aminoácidos, hasta alrededor de 50 aminoácidos, hasta alrededor de 55 aminoácidos, hasta alrededor de 60 aminoácidos, hasta alrededor de 65 aminoácidos, hasta alrededor de 70 aminoácidos, hasta alrededor de 75 aminoácidos, hasta alrededor de 80 aminoácidos, hasta alrededor de 85 aminoácidos, hasta alrededor de 90 aminoácidos, hasta alrededor de 95 aminoácidos, hasta alrededor de 100 aminoácidos, hasta alrededor de 105 aminoácidos, hasta alrededor de 110 aminoácidos, hasta alrededor de 115 aminoácidos, hasta alrededor de 120 aminoácidos, hasta alrededor de 125 aminoácidos, hasta alrededor de 130 aminoácidos, hasta alrededor de 135 aminoácidos, hasta alrededor de 140 aminoácidos, hasta 1 alrededor de 45 aminoácidos, hasta alrededor de 150 aminoácidos, hasta alrededor de 155 aminoácidos, o hasta alrededor de 160 aminoácidos con respecto a una secuencia nativa (por ejemplo, SEQ ID NO: 91). La actividad de la proteína puede confirmarse o evaluarse usando cualquier ensayo disponible. En otros casos, el TRAIL, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional tiene al menos alrededor de 75% de identidad, alrededor de 80% de identidad, alrededor de 90% de identidad, alrededor de 95% de identidad, alrededor de 96% de identidad, alrededor de 97% de identidad, alrededor de 98% de identidad, o alrededor de 99% de identidad con una secuencia nativa (por ejemplo, SEQ ID NO: 91). El porcentaje de identidad se puede calcular utilizando el programa de alineación EMBOSS needle, disponible en http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/. Se pueden utilizar los siguientes parámetros por defecto para la alineación por pares: Matriz de peso de proteínas = BLOSUM62; Apertura de hueco = 10; Extensión de hueco = 0,1. En algunos casos, el TRAIL, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional puede contener modificaciones químicas adicionales conocidas en la técnica.

En ciertos casos, el agente terapéutico incluye un ELP fusionado con el extremo N o el extremo C de TRAIL, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional del mismo. En algunos casos, el agente terapéutico incluye un ELP fusionado con el extremo N de TRAIL (SEQ ID NO: 92).

En algunos casos, el TRAIL, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional se encuentra en una proteína de fusión con más de una secuencia de ELP. En algunos casos, el TRAIL, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional tiene uno o más ELP en los extremos N y C. En algunos casos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N del TRAIL, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional incluye alrededor de 90 a alrededor de 180 unidades estructurales repetitivas. En otros casos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N del TRAIL, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional incluye menos de alrededor de 90 unidades estructurales repetidas. En otros aspectos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N del TRAIL, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional incluye más de alrededor de 180 unidades estructurales repetitivas. En algunos casos, los dos o más ELP en los extremos N y C tienen aproximadamente el mismo tamaño. En otros casos, los dos o más ELP en los extremos N y C difieren en tamaño. En algunos casos, el ELP en el extremo N del TRAIL, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional es mayor que el ELP en el extremo C. En otros casos, el TRAIL en el extremo C del ELP es mayor que el ELP en el extremo N.

En otros aspectos, la presente descripción proporciona métodos para tratar o prevenir enfermedades que incluyen, pero no se limitan a, tumorigénesis y diversos tipos de cáncer; enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD); esteatohepatitis no alcohólica (NASH); cirrosis; fibrosis hepática posterior al trasplante o cirrosis en receptores de trasplante hepático postortotópico (POLT) como resultado de la infección recurrente por el virus de la hepatitis C (VHC); fibrosis pancreática. Los métodos incluyen la administración de un agente terapéutico, que incluye un ELP y un TRAIL (como se describe anteriormente) a un paciente que necesita dicho tratamiento. Generalmente, el paciente puede ser un paciente humano o animal no humano (por ejemplo, perro, gato, vaca, o caballo). Preferiblemente, el paciente es un ser humano.

En algunos casos, el tratamiento con un TRAIL según la presente descripción también puede combinarse con quimioterapia o radioterapia. En otros casos, el tratamiento con un TRAIL según la presente descripción también puede combinarse con una o más sustancias farmacológicamente activas, por ejemplo seleccionadas de agentes para el tratamiento y/o prevención de complicaciones y trastornos asociados con diversas enfermedades, incluyendo, sin limitación, tumorigénesis y diversos tipos de cáncer; enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD); esteatohepatitis no alcohólica (NASH); cirrosis; fibrosis hepática posterior al trasplante o cirrosis en receptores de trasplante hepático postortotópico (POLT) como resultado de la infección recurrente por el virus de la hepatitis C (VHC); fibrosis pancreática.

Agente activo de la descripción: Factor 21 de crecimiento de fibroblastos (FGF21)

El factor 21 de crecimiento de fibroblastos (FGF21) es un miembro de la familia de FGF que produce efectos beneficiosos sobre los niveles de lípidos, el peso corporal, y el metabolismo de la glucosa en animales. Se ha demostrado que la sobreexpresión de FGF21 en ratones transgénicos da como resultado niveles reducidos de glucosa y triglicéridos, y resistencia a la obesidad inducida por la dieta. (Kharitonenkov et al. (2005), J. Clin. Invest. 115; 1627 1635). La administración de FGF21 exógeno a roedores y primates da como resultado la normalización de los niveles de glucosa en sangre, reducción de los niveles de triglicéridos y colesterol, mejora de la tolerancia a la glucosa, y mejora de la sensibilidad a la insulina (Kharitonenkov et al. (2007), Endocrinol. 48:774-781). Se ha demostrado que la administración de FGF21 en modelos animales experimentales reduce el peso corporal y la grasa corporal al aumentar el gasto de energía, la actividad física, y la tasa metabólica. (Long y Kharitonenkov (2011) Biochim. Biophys. Acta 1812:791-795).

La señalización de FGF21 está mediada a través de su interacción con un complejo receptor que incluye p(Klotho (KLB) y uno de tres receptores de FGF diferentes (FGFR1c, FGFR2c, o FGFR3c) (Ogawa et al. (2007), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:7432-7437; Suzuki et al. (2008), Mol. Endocrinol. 22:1006-1014). Se cree que el principal receptor funcional para la señalización de FGF21 in vivo es el complejo KLB/FGFR1c (este complejo se denomina aquí "FGF21R").

Se ha propuesto la activación farmacológica de la señalización de FGF21 para el tratamiento de diversas enfermedades y trastornos en seres humanos, incluyendo la diabetes tipo 2, la obesidad, la dislipidemia, la enfermedad del hígado graso no alcohólico (esteatohepatitis no alcohólica, NASH), y otras afecciones metabólicas (Gimeno y Moller (2014) Trends Endocrinol. Metab. 25, 303-311). Un análogo de Fg F, LY2405319 (Kharitonenkov et al. (2013) PLOS One, 8, e58575) se evaluó en un ensayo clínico en pacientes con diabetes tipo 2 y obesidad (Gaich et al. (2013) Cell Metabolism 18, 333-340). Hecht et al. (2012, PLOS One, 7(11): e49345) desarrollaron un análogo de FGF²¹de acción prolongada fusionado con el dominio Fc de la IgG1 humana.

En ciertos casos, el agente terapéutico de FGF21 de la presente descripción incluye una secuencia de aminoácidos que proporciona liberación sostenida, fusionada o conjugada con FGF21, fragmentos, o variantes funcionales del mismo. En algunos casos, la secuencia de aminoácidos que proporciona liberación sostenida es ELP.

En ciertos casos, el FGF21 es un FGF21 de mamífero. En algunos casos, el FGF21 es FGF21 humano (SEQ ID NO: 110). En algunos casos, el FGF21 puede ser un derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional del mismo del FGF21 de mamífero, incluyendo fragmentos funcionales truncados en el extremo N y/o extremo C del FGF21 en alrededor de 1 a alrededor de 160 aminoácidos, incluyendo, por ejemplo, en hasta alrededor de 3 aminoácidos, hasta alrededor de 5 aminoácidos, hasta alrededor de 10 aminoácidos, hasta alrededor de 15 aminoácidos, hasta alrededor de 20 aminoácidos, hasta alrededor de 25 aminoácidos, hasta alrededor de 30 aminoácidos, hasta alrededor de 35 aminoácidos, hasta alrededor de 40 aminoácidos, hasta alrededor de 45 aminoácidos, hasta alrededor de 50 aminoácidos, hasta alrededor de 55 aminoácidos, hasta alrededor de 60 aminoácidos, hasta alrededor de 65 aminoácidos, hasta alrededor de 70 aminoácidos, hasta alrededor de 75 aminoácidos, hasta alrededor de 80 aminoácidos, hasta alrededor de 85 aminoácidos, hasta alrededor de 90 aminoácidos, hasta alrededor de 95 aminoácidos, hasta alrededor de 100 aminoácidos, hasta alrededor de 105 aminoácidos, hasta alrededor de 110 aminoácidos, hasta alrededor de 115 aminoácidos, hasta alrededor de 120 aminoácidos, hasta alrededor de 125 aminoácidos, hasta alrededor de 130 aminoácidos, hasta alrededor de 135 aminoácidos, hasta alrededor de 140 aminoácidos, hasta alrededor de 145 aminoácidos, hasta alrededor de 150 aminoácidos, hasta alrededor de 155 aminoácidos, o hasta alrededor de 160 aminoácidos. FGF21, derivados, análogos, miméticos, fragmentos, o variantes funcionales pueden contener inserciones, supresiones, y/o sustituciones de alrededor de 1 a alrededor de 160 aminoácidos con respecto a una secuencia nativa (por ejemplo, SEQ ID NO: 110). Por ejemplo, FGF21, derivados, análogos, miméticos, fragmentos, o variantes funcionales pueden tener inserciones, supresiones y/o sustituciones de hasta alrededor de 3 aminoácidos, hasta alrededor de 5 aminoácidos, hasta alrededor de 10 aminoácidos, hasta alrededor de 15 aminoácidos, hasta alrededor de 20 aminoácidos, hasta alrededor de 25 aminoácidos, hasta alrededor de 30 aminoácidos, hasta alrededor de 35 aminoácidos, hasta alrededor de 40 aminoácidos, hasta alrededor de 45 aminoácidos, hasta alrededor de 50 aminoácidos, hasta alrededor de 55 aminoácidos, hasta alrededor de 60 aminoácidos, hasta alrededor de 65 aminoácidos, hasta alrededor de 70 aminoácidos, hasta alrededor de 75 aminoácidos, hasta alrededor de 80 aminoácidos, hasta alrededor de 85 aminoácidos, hasta alrededor de 90 aminoácidos, hasta alrededor de 95 aminoácidos, hasta alrededor de 100 aminoácidos, hasta alrededor de 105 aminoácidos, hasta alrededor de 110 aminoácidos, hasta alrededor de 115 aminoácidos, hasta alrededor de 120 aminoácidos, hasta alrededor de 125 aminoácidos, hasta alrededor de 130 aminoácidos, hasta alrededor de 135 aminoácidos, hasta alrededor de 140 aminoácidos, hasta 1 alrededor de 45 aminoácidos, hasta alrededor de 150 aminoácidos, hasta alrededor de 155 aminoácidos, o hasta alrededor de 160 aminoácidos con respecto a una secuencia nativa (por ejemplo, SEQ ID NO: 110). La actividad de la proteína puede confirmarse o evaluarse usando cualquier ensayo disponible. En otros casos, el FGF21, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional tiene al menos alrededor de 75% de identidad, alrededor de 80% de identidad, alrededor de 90% de identidad, alrededor de 95% de identidad, alrededor de 96% de identidad, alrededor de 97% de identidad, alrededor de 98% de identidad, o alrededor de 99% de identidad con una secuencia nativa (por ejemplo, SEQ ID NO: 110). El porcentaje de identidad se puede calcular utilizando el programa de alineación EMBOSS needle, disponible en http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/. Se pueden utilizar los siguientes parámetros por defecto para la alineación por pares: Matriz de peso de proteínas = BLOSUM62; Apertura de hueco = 10; Extensión de hueco = 0,1. En algunos casos, el TRAIL, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional puede contener modificaciones químicas adicionales conocidas en la técnica.

En ciertos casos, el agente terapéutico incluye un ELP fusionado con el extremo N o el extremo C de FGF21, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional del mismo. En algunos casos, el agente terapéutico incluye un ELP fusionado con el extremo N de FGF21 (SEQ ID NO: 110).

En algunos casos, el FGF21, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional se encuentra en una proteína de fusión con más de una secuencia de ELP. En algunos casos, el FGF21, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional tiene uno o más ELP en los extremos N y C. En algunos casos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N del FGF21, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional incluye alrededor de 90 a alrededor de 180 unidades estructurales repetitivas. En otros casos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N del FGF21, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional incluye menos de alrededor de 90 unidades estructurales repetidas. En otros aspectos, el ELP en el extremo C y/o el extremo N del FGF21, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional incluye más de alrededor de 180 unidades estructurales repetitivas. En algunos casos, los dos o más ELP en los extremos N y C tienen aproximadamente el mismo tamaño. En otros casos, los dos o más ELP en los extremos N y C difieren en tamaño. En algunos casos, el ELP en el extremo N del FGF21, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional es mayor que el ELP en el extremo C. En otros casos, el ELP en el extremo C del FGF21 es mayor que el ELP en el extremo N.

En algunos casos, el agente terapéutico incluye un ELP fusionado con el extremo N del FGF21, derivado, análogo, mimético, fragmento, o variante funcional del mismo, y un agonista de GLP-1 se fusiona con el extremo N del ELP (SEQ ID NOs: 133 y 134). Tal agente terapéutico combina los beneficios de la actividad tanto de FGF21 como de GLP-1 para el tratamiento de diabetes, obesidad, y trastornos relacionados.

En otros aspectos, la presente descripción proporciona métodos para tratar o prevenir enfermedades que incluyen, pero no se limitan a, tumorigénesis y diversos tipos de cáncer; enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD); esteatohepatitis no alcohólica (NASH); cirrosis; fibrosis hepática posterior al trasplante o cirrosis en receptores de trasplante hepático postortotópico (POLT) como resultado de la infección recurrente por el virus de la hepatitis C (VHC); fibrosis pancreática. Los métodos incluyen la administración de un agente terapéutico, que incluye un ELP y un FGF21 (como se describe anteriormente) a un paciente que necesita dicho tratamiento. Generalmente, el paciente puede ser un paciente humano o animal no humano (por ejemplo, perro, gato, vaca, o caballo). Preferiblemente, el paciente es un ser humano.

En algunos casos, el tratamiento con un FGF21 según la presente descripción también puede combinarse con una o más sustancias farmacológicamente activas, por ejemplo seleccionadas de agentes para el tratamiento y/o prevención de complicaciones y trastornos asociados con diversas enfermedades, incluyendo, sin limitación, tumorigénesis y diversos tipos de cáncer; enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD); esteatohepatitis no alcohólica (NASH); cirrosis; fibrosis hepática posterior al trasplante o cirrosis en receptores de trasplante hepático postortotópico (POLT) como resultado de la infección recurrente por el virus de la hepatitis C (VHC); fibrosis pancreática.

FORMULACIONES

La presente divulgación proporciona formulaciones de liberación sostenida que incluyen un agente terapéutico divulgado en la presente y uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, tales excipientes incluyen sales y otros excipientes que pueden actuar para estabilizar los enlaces de hidrógeno. Se puede utilizar cualquier excipiente apropiado conocido en la técnica. Los excipientes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos tales como histidina, glicina, o arginina; glicerol; azúcares, tal como sacarosa; agentes tensioactivos tales como polisorbato 20 y polisorbato 80; ácido cítrico; citrato de sodio; antioxidantes; sales que incluyen sales de metales alcalino-térreos tales como sodio, potasio, y calcio; contraiones tales como cloruro y fosfato; alcoholes de azúcar (por ejemplo, manitol); conservantes; alcoholes de azúcar (por ejemplo, manitol, sorbitol); y agentes amortiguadores. Las sales ejemplares incluyen cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, fosfato de sodio dibásico, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio, y fosfato de potasio.

El agente terapéutico se formula a un pH, fuerza iónica, y generalmente con excipientes suficientes para permitir la formación de la matriz a temperatura corporal (por ejemplo, 37°C, o de 34 a 36°C). El agente terapéutico generalmente se prepara de manera que no forme la matriz en las condiciones de almacenamiento. La formulación se puede almacenar congelada, refrigerada o a temperatura ambiente. Las condiciones de almacenamiento son generalmente inferiores a la temperatura de transición de la formulación, tal como menos de alrededor de 32°C, o menos de alrededor de 30°C, o menos de alrededor de 27°C, o menos de alrededor de 25°C, o menos de alrededor de 20°C, o menos de alrededor de 15°C. Por ejemplo, la formulación puede ser isotónica con la sangre, o puede tener una fuerza iónica que imite las condiciones fisiológicas. Por ejemplo, la formulación puede tener una fuerza iónica de al menos la de cloruro de sodio 25 mM, o al menos la de cloruro de sodio 30 mM, o al menos la de cloruro de sodio 40 mM, o al menos la de cloruro de sodio 50 mM, o al menos la de cloruro de sodio 75 mM, o al menos la de cloruro de sodio 100 mM o al menos la de cloruro de sodio 150 mM. La formulación puede tener una fuerza iónica equivalente a la de una disolución salina al 0,9% (cloruro de sodio 154 mM).

En algunos casos, la formulación es estable en condiciones de almacenamiento. Las condiciones de almacenamiento pueden ser cualquier condición utilizada para almacenar de forma estable una formulación. En algunos casos, la formulación se refrigera. En algunos casos, la formulación se congela. En algunos casos, las condiciones de almacenamiento incluyen temperaturas de menos de alrededor de 30°C. En algunos casos, las condiciones de almacenamiento incluyen temperaturas de alrededor de 2°C a alrededor de 8°C. En algunos casos, las condiciones de almacenamiento incluyen temperaturas por debajo de 02C. En algunos casos, las condiciones de almacenamiento incluyen temperaturas de alrededor de -15°C a alrededor de -80°C.

La estabilidad se puede medir utilizando cualquier medio adecuado de la técnica. Por lo general, una formulación estable es una que muestra menos de un 5% de incremento en productos de degradación o impurezas. En algunos casos, la formulación es estable durante al menos alrededor de 1 mes, al menos alrededor de 2 meses, al menos alrededor de 3 meses, al menos alrededor de 4 meses, al menos alrededor de 5 meses, al menos alrededor de 6 meses, o al menos alrededor de un año o más en las condiciones de almacenamiento. En algunos casos, la formulación es estable durante al menos alrededor de 1 mes, al menos alrededor de 2 meses, al menos alrededor de 3 meses, al menos alrededor de 4 meses, al menos alrededor de 5 meses, al menos alrededor de 6 meses, al menos alrededor de un año, o al menos alrededor de dos años o más a 2-8°C. En algunos casos, la formulación es estable durante al menos alrededor de 1 mes, al menos alrededor de 2 meses, al menos alrededor de 3 meses, al menos alrededor de 4 meses, al menos alrededor de 5 meses, al menos alrededor de 6 meses, al menos alrededor de un año, o al menos alrededor de dos años o más a 25°C. En algunos casos, la formulación es estable durante al menos alrededor de 1 mes, al menos alrededor de 2 meses, al menos alrededor de 3 meses, al menos alrededor de 4 meses, al menos alrededor de 5 meses, al menos alrededor de 6 meses, al menos alrededor de un año, o al menos alrededor de dos años o más a -15°C hasta alrededor de -80°C.

En algunos casos, la formulación incluye dos o más de cloruro de calcio, cloruro de magnesio, cloruro de potasio, fosfato de potasio monobásico, cloruro de sodio, fosfato de sodio dibásico, fosfato de sodio monobásico, histidina, arginina, glicina, glicerol, conservante antimicrobiano (por ejemplo metacresol), agente de ajuste de la tonicidad (por ejemplo manitol), ácido acético glacial, trihidrato de acetato de sodio; sacarosa, fosfato de sodio monobásico monohidratado, fosfato de sodio dibásico heptahidratado, zinc, m-cresol, fenol, sorbitol, polisorbato 80, y polisorbato 20.

En algunos casos, la formulación incluye histidina u otro aminoácido en un intervalo de alrededor de 10 mM a alrededor de 100 mM de histidina. En algunos casos, la formulación incluye histidina u otro aminoácido en un intervalo de alrededor de 10 mM a alrededor de 30 mM de histidina. En algunos casos, la formulación incluye histidina u otro aminoácido en un intervalo de alrededor de 15 mM a alrededor de 25 mM de histidina. En algunos casos, la formulación incluye NaCl en un intervalo de alrededor de 10 mM a alrededor de 165 mM de NaCl. En algunos casos, la formulación incluye entre alrededor de 50 mM y alrededor de 165 mM de NaCl. En algunos casos, la formulación incluye entre alrededor de 54 mM y alrededor de 162 mM de NaCl. En algunos casos, la formulación incluye entre alrededor de 110 mM y alrededor de 162 mM de NaCl. En algunos casos, la formulación incluye fosfato de sodio en un intervalo de alrededor de 1 mM a alrededor de 20 mM. En algunos casos, la formulación incluye fosfato de sodio en un intervalo de alrededor de 5 mM a alrededor de 15 mM. En algunos casos, la formulación incluye fosfato de sodio monobásico en un intervalo de alrededor de 2 mM a alrededor de 10 mM. En algunos casos, la formulación incluye fosfato de sodio monobásico en un intervalo de alrededor de 4 mM a alrededor de 8 mM. En algunos casos, la formulación incluye fosfato de sodio dibásico en un intervalo de alrededor de 1 mM a alrededor de 10 mM. En algunos casos, la formulación incluye fosfato de sodio dibásico en un intervalo de alrededor de 2 mM a alrededor de 7 mM. En algunos casos, la formulación incluye fosfato de sodio dibásico en un intervalo de alrededor de 2 mM a alrededor de 5 mM. En algunos casos, la formulación incluye polisorbato 20 en un intervalo de alrededor de 0,01% a alrededor de 0,2%. En algunos casos, la formulación incluye polisorbato 80 en un intervalo de alrededor de 0,01% a alrededor de 0,2%. En algunos casos, la formulación incluye fosfato de sodio, cloruro de sodio, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, y polisorbato 20. En algunos casos, la formulación incluye alrededor de 10 mM de fosfato de sodio (alrededor de 7 mM de fosfato de sodio monobásico y alrededor de 3 mM de fosfato de sodio dibásico), alrededor de 110 mM de cloruro de sodio, y alrededor de 0,1% de polisorbato 20.

En algunos casos, la formulación se formula a pH fisiológico. En algunos casos, la formulación se formula a un pH en el intervalo de alrededor de 5,5 a alrededor de 7,5. En algunos casos, la formulación se formula a un pH en el intervalo de alrededor de 6,0 a alrededor de 7,0. En algunos casos, la formulación se formula a un pH en el intervalo de alrededor de 6,5 a alrededor de 7,0. En algunos casos, las formulaciones con un pH más bajo demuestran una estabilidad mejorada de la formulación en comparación con las formulaciones a un pH más alto. En algunos casos, las formulaciones con un pH de alrededor de 6,5 demuestran una estabilidad mejorada en comparación con las formulaciones con un pH de alrededor de 7,0. En algunos casos, las formulaciones con un pH de alrededor de 6,0 demuestran una estabilidad mejorada en comparación con las formulaciones con un pH de alrededor de 6,5. En algunos casos, las formulaciones con un pH más bajo mantienen un mayor porcentaje de monómeros en comparación con las formulaciones con un pH más alto. En algunos casos, las formulaciones con un pH de alrededor de 6,5 mantienen un mayor porcentaje de monómeros en comparación con las formulaciones con un pH de alrededor de 7,0. En algunos casos, las formulaciones con un pH de alrededor de 6,0 mantienen un mayor porcentaje de monómeros en comparación con las formulaciones con un pH de alrededor de 6,5.

La concentración de proteína del agente terapéutico en la formulación se adapta para impulsar la formación de la matriz a la temperatura de administración. Por ejemplo, las concentraciones de proteína más altas ayudan a impulsar la formación de la matriz, y la concentración de proteína necesaria para este fin varía según la serie de ELP utilizada. Por ejemplo, en los casos en que se usa un ELP1 -120, o secuencias de aminoácidos con temperaturas de transición comparables, la proteína está presente en el intervalo de alrededor de 1 mg/ml a alrededor de 200 mg/ml, o está presente en el intervalo de alrededor de 30 mg/ml a alrededor de 150 mg/ml. En los casos en que se usa un ELP4-120, o secuencias de aminoácidos con temperaturas de transición comparables, la proteína está presente en el intervalo de alrededor de 0,005 mg/ml a alrededor de 10 mg/ml, o está presente en el intervalo de alrededor de 0,01 mg/ml a alrededor de 5 mg/ml.

En algunos casos, el agente terapéutico puede estar presente en el intervalo de alrededor de 0,5 mg/ml a alrededor de 200 mg/ml, o está presente en el intervalo de alrededor de 30 mg/ml a alrededor de 150 mg/ml. En algunos casos, el agente terapéutico está presente en el intervalo de alrededor de 50 mg/ml a alrededor de 125 mg/ml, o en el intervalo de alrededor de 75 mg/ml a alrededor de 110 mg/ml. En algunos casos, el agente terapéutico está presente en una concentración de alrededor de 100 mg/ml.

En algunos aspectos, la descripción proporciona un método para administrar un régimen de liberación sostenida de un agente activo descrito aquí. El método incluye administrar de la composición farmacéutica descrita aquí a un sujeto que lo necesite, en el que la composición farmacéutica se administra de alrededor de 1 a alrededor de 8 veces al mes. En algunos casos, la composición farmacéutica se administra alrededor de 1 vez, alrededor de 2 veces, alrededor de 3 veces, y/o alrededor de 4 veces al mes. En algunos casos, la composición farmacéutica se administra semanalmente. En algunos casos, la composición farmacéutica se administra diariamente. En algunos casos, la composición farmacéutica se administra de una a tres veces por semana. En algunos casos, la composición farmacéutica se administra una vez cada dos semanas. En algunos casos, la composición farmacéutica se administra de una a dos veces al mes. En casos particulares, la composición farmacéutica se administra alrededor de 1 vez al mes. En algunos casos, la composición farmacéutica se administra alrededor de una vez cada 2 meses, alrededor de una vez cada 3 meses, alrededor de una vez cada 4 meses, alrededor de una vez cada 5 meses, y/o alrededor de una vez cada 6 meses. La composición farmacéutica se puede empaquetar en forma de bolígrafos rellenados o jeringuillas rellenados previamente para la administración una vez a la semana, dos veces a la semana, o de una a ocho veces al mes, o como alternativa, utilizar para rellenar viales convencionales y similares.

En algunos casos, la formulación se administra aproximadamente de forma mensual, y puede administrarse por vía subcutánea o intramuscular. En algunos casos, la formulación se administra aproximadamente de forma semanal, y puede administrarse por vía subcutánea o intramuscular. En algunos casos, el sitio de administración no es un sitio patológico, por ejemplo no es el sitio de acción previsto.

En algunos casos, las composiciones farmacéuticas descritas aquí se administran de forma crónica. En algunos casos, las composiciones farmacéuticas descritas aquí se administran durante alrededor de 6 meses, durante alrededor de 7 meses, durante alrededor de 8 meses, durante alrededor de 9 meses, durante alrededor de 10 meses, durante alrededor de 11 meses, durante alrededor de 1 año, durante alrededor de 2 años, durante alrededor de 3 años, durante alrededor de 4 años, durante alrededor de 5 años, durante alrededor de 10 años, o más. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar en cualquier dosis y/o frecuencia requeridas divulgadas en la presente.

En algunos casos, las composiciones farmacéuticas descritas aquí se administran hasta que mejoran los síntomas de la enfermedad o trastorno. En algunos casos, las composiciones farmacéuticas descritas aquí se administran hasta que mejoran, se retrasan, y/o se curan los síntomas de la enfermedad o el trastorno.

En algunos casos, las composiciones farmacéuticas descritas aquí se administran antes de que el paciente comience a mostrar uno o más síntomas de enfermedad o trastorno. En algunos casos, las composiciones farmacéuticas descritas aquí se administran al comienzo de los síntomas de la enfermedad o trastorno.

El agente terapéutico se formula generalmente para "administración sistémica'', lo que significa que el agente no se administra localmente en un sitio patológico o un sitio de acción. En su lugar, el agente es absorbido por el torrente sanguíneo desde el sitio de inyección, donde el agente actúa de manera sistémica o es transportado a un sitio de acción por la circulación. El agente terapéutico se puede administrar por cualquier vía conocida tal como, por ejemplo, vía oral, intravenosa, intramuscular, nasal, subucutánea, intravaginal e intrarrectal. En algunos casos, la formulación es generalmente para administración subcutánea. En algunos casos, los parámetros farmacocinéticos (PK) se prolongan cuando el agente se administra por vía subcutánea. En algunos casos, se prolonga la vida media de la proteína de fusión. En algunos casos, los parámetros PK cuando el agente se administra por vía subcutánea se prolongan en comparación con el agente administrado por otros medios (por ejemplo, por vía intravenosa). En algunos casos, el depósito del agente se prolonga cuando el agente se administra por vía subcutánea en comparación con el agente administrado por otros medios (por ejemplo, por vía intravenosa). Al proporcionar una absorción lenta desde el sitio de inyección, se puede controlar el aclaramiento y la degradación renal, logrando así el perfil PK deseado.

Convenientemente, las composiciones proporcionan una exposición farmacocinética prolongada debido a la liberación sostenida del agente activo. En aspectos particulares, el nivel de exposición máximo se puede conseguir aproximadamente 10 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 48 horas o aproximadamente 72 horas después de la administración; normalmente el nivel de exposición máximo se consigue entre aproximadamente 10 horas y aproximadamente 48 horas después de la administración. Una vez alcanzado el nivel máximo de exposición, las composiciones pueden alcanzar una tasa sostenida de liberación mediante la cual se obtiene un porcentaje sustancial del nivel máximo durante un período de tiempo. Por ejemplo, la tasa sostenida puede ser alrededor de 50%, alrededor de 60%, alrededor de 70%, alrededor de 80%, alrededor de 90%, o alrededor de 100% del nivel máximo de exposición. Ejemplos de períodos de tiempo para mantener la tasa sostenida son alrededor de 3 días, alrededor de 4 días, alrededor de 5 días, alrededor de 6 días, alrededor de 1 semana, alrededor de 2 semanas, alrededor de 4 semanas, alrededor de 6 semanas, o alrededor de 8 semanas, después de que se alcanza el nivel máximo de exposición. Posteriormente, la tasa sostenida puede reducirse hasta una tasa de exposición reducida. Dichas tasas de exposición reducidas pueden ser alrededor de 5%, alrededor de 10%, alrededor de 20%, alrededor de 30%, alrededor de 40%, alrededor de 50%, o alrededor de 60% del nivel máximo de exposición. Por ejemplo, en una realización (PE0256) se obtiene un nivel máximo de exposición de 1000 ng/ml en alrededor de 1 -2 días. Después de este período, se mantiene una tasa sostenida de alrededor de 70-100% del nivel máximo de exposición hasta alrededor de los días 10-12, después de lo cual se obtiene una tasa de exposición reducida desde alrededor de 60% disminuyendo hasta alrededor de 10% durante el resto del estudio.

En diversos casos, la concentración plasmática del agente activo no cambia en más de un factor de alrededor de 20, o un factor de alrededor de 10, o un factor de alrededor de 5, o un factor de alrededor de 3 en el transcurso de una pluralidad de administraciones, tales como al menos 2, al menos alrededor de 5, o al menos alrededor de 10 administraciones de la formulación. En algunos casos, la concentración plasmática del agente activo no cambia en más de un factor de alrededor de 20, o un factor de alrededor de 10, o un factor de alrededor de 5, o un factor de alrededor de 3 entre cada administración. En algunos casos, hay cierta acumulación hasta que se alcanza el estado estacionario (por ejemplo después de alrededor de 3 a alrededor de 4 administraciones). Las administraciones se espacian de manera sustancialmente regular tal como, por ejemplo, aproximadamente diaria, o aproximadamente una vez a la semana, o de una a aproximadamente cinco veces al mes, o aproximadamente una vez cada dos meses, o aproximadamente una vez cada tres meses. En otros casos, la dosis puede aumentarse de manera constante durante varias administraciones, de modo que el estado estacionario se alcance después de 5 o más administraciones.

Las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente se pueden administrar en dosis más pequeñas y/o con menos frecuencia que los equivalentes no infundido o no conjugados. Si bien un experto en la técnica puede determinar la dosis deseable en cada caso, una dosis adecuada del agente terapéutico para lograr el beneficio terapéutico puede estar, por ejemplo, en un intervalo de alrededor de 1 microgramo (pg) a alrededor de 100 miligramos (mg) por kilogramo de peso corporal del receptor por dosis, preferiblemente en un intervalo de alrededor de 10 pg a alrededor de 50 mg por kilogramo de peso corporal por dosis, y lo más preferible en un intervalo de alrededor de 10 pg a alrededor de 50 mg por kilogramo de peso corporal por dosis. En algunos casos, la composición farmacéutica se administra a una dosis baja. En algunos casos, la composición farmacéutica se administra a una dosis entre 1 mg por kilogramo de peso corporal por dosis y alrededor de 9 mg por kilogramo de peso corporal por dosis. En algunos casos, la composición farmacéutica se administra a alrededor de 1 mg por kilogramo de peso corporal por dosis, alrededor de 3 mg por kilogramo de peso corporal por dosis, y/o alrededor de 9 mg por kilogramo de peso corporal por dosis. La dosis deseada se puede presentar como una dosis o dos o más subdosis administradas a intervalos apropiados a lo largo del día. Estas subdosis se pueden administrar en formas farmacéuticas unitarias, por ejemplo, que contienen de aproximadamente 10 pg a aproximadamente 1000 mg, preferentemente de aproximadamente 50 pg a aproximadamente 500 mg, y de la manera más preferente de aproximadamente 50 pg a aproximadamente 250 mg de principio activo por forma farmacéutica unitaria. Como alternativa, si la afección del receptor lo requiere, las dosis se pueden administrar como una infusión continua.

En ciertos casos, el sujeto es un ser humano, pero en otros casos puede ser un mamífero no humano, tal como una mascota domesticada (por ejemplo, perro o gato), o ganado o animal de granja (por ejemplo, caballo, vaca, oveja, o cerdo).

Se debe entender que las formas en singular tales como «un», «uno/a» y «el/la» se utilizan a lo largo de esta solicitud por conveniencia, sin embargo, excepto cuando el contexto o una afirmación explícita indica lo contrario, se pretende que las formas en singular incluyan el plural. Se debe entender que todos los intervalos numéricos incluyen todos y cada uno de los puntos numéricos dentro del intervalo numérico, y se deben interpretar como si todos y cada uno de los puntos numéricos se enumeraran individualmente. Los puntos finales de todos los intervalos referidos al mismo componente o propiedad son inclusivos y se pretende que sean combinables independientemente.

El término «aproximadamente» cuando se utiliza en relación con una indicación numérica citada se refiere a la indicación numérica citada más o menos hasta un 10% de la indicación numérica citada. Por ejemplo, la expresión «aproximadamente 50» cubre el intervalo de 45 a 55.

Tal como se utiliza en la presente, se pretende que la palabra «incluir», y sus variantes, no sea limitante, de modo que la enumeración de artículos en una lista no excluya otros artículos similares que también puedan ser útiles en los materiales, composiciones, dispositivos y métodos de esta tecnología. De manera similar, se pretende que el término «puede» y sus variantes no sean limitantes, de modo que la lectura de que una realización puede comprender ciertos elementos o características no excluye otras realizaciones de la presente tecnología que no contenga esos elementos o características. Aunque la expresión abierta «que comprende», como un sinónimo de expresiones tales como que incluye, que contiene o que tiene, se utiliza en la presente para describir y reivindicar la divulgación, la presente tecnología, o realizaciones de esta, se pueden describir de manera alternativa, utilizando expresiones más limitantes tales como «que consiste en» o «que consiste esencialmente en» los ingredientes enumerados.

Como se usa aquí, "vida media" (que generalmente se refiere a vida media in vivo o vida media circulatoria) es el período de tiempo que se requiere para que se produzca una disminución de 50% de la bioactividad del agente activo. En algunos casos, este término incluye tanto la exposición prolongada como una vida media prolongada (por ejemplo, tanto una captación lenta desde el sitio de inyección como un retraso en la eliminación, en comparación con el péptido no conjugado).

A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos de la presente tienen el mismo significado que le adjudica habitualmente un experto en la técnica a la que pertenece esta divulgación.

Esta divulgación se ilustrará adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 Comparativo - Preparación de construcciones de CNP ELP

Se sintetizó ADN que codifica una versión de 37 aminoácidos de la secuencia de CNP, se digirió con enzimas de restricción BGLI/EcoRI, y después se subclonó en el plásmido pPE0003 para proporcionar el plásmido pPE0493, colocando la secuencia de CNP en el extremo C de la secuencia de ELP1 -120.

Se sintetizó ADN que codifica una versión de 37 aminoácidos de la secuencia de CNP, se digirió con enzimas de restricción XbaI y BsrGI, y después se subclonó en el plásmido pPE0003 cortado con XbaI y Acc65I para proporcionar el plásmido pPE0531, colocando la secuencia de CNP en el extremo N de la secuencia de ELP1 -120.

El ADN que codifica una versión de 37 aminoácidos de la secuencia de CNP se sintetizó para incluir un enlazador repetido de glicina y serina (Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser). Éste se digirió con enzimas de restricción XbaI y BsrGI, y después se subclonó en el plásmido pPE0003 cortado con XbaI y Acc65I para proporcionar el plásmido pPE0552, colocando la secuencia de CNP en el extremo N de la secuencia de ELP1-120 con el enlazador colocado entre los dos.

Se sintetizó ADN que codifica una versión de 22 aminoácidos de la secuencia de CNP, se digirió con enzimas de restricción BglI y EcoRI, y después se subclonó en el plásmido pPE0003 para proporcionar el plásmido pPE0514, colocando la secuencia de CNP en el extremo C de la secuencia de ELP1 -120.

Se sintetizó ADN que codifica una versión de 22 aminoácidos de la secuencia de CNP, se digirió con enzimas de restricción XbaI y BsrGI, y después se subclonó en el plásmido pPE0003 cortado con XbaI y Acc65I para proporcionar el plásmido pPE0550, colocando la secuencia de CNP en el extremo N de la secuencia de ELP1-120.

Se sintetizó ADN que codifica una versión de 22 aminoácidos de la secuencia de CNP que incluye un enlazador repetido de glicina y serina (Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser). Éste se digirió con enzimas de restricción XbaI y BsrGI, y después se subclonó en el plásmido pPE0003 cortado con XbaI y Acc651 para proporcionar el plásmido pPE0565, colocando la secuencia de CNP en el extremo N de la secuencia de ELP1-120 con el enlazador colocado entre los dos.

Ejemplo 2 Comparativo - Determinación de la potencia de construcciones de CNP

La potencia de las construcciones de CNP purificadas descritas en Ejemplo 1 se demostró utilizando el receptor natriurético de tipo B (NPRB), que expresa células de fibroblastos uterinos primarios, y un kit de ensayo fluorescente de cGMP (CatchPoint, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Cuando el receptor se activa, provoca la generación de cGMP dentro de las células. Estas células se lisan, y la cantidad de cGMP se detecta mediante un inmunoensayo competitivo para cGMP. El cGMP en cada muestra compite con un conjugado de cGMP marcado con peroxidasa de rábano picante (HRP) por los sitios de unión en los anticuerpos anti-cGMP. En ausencia de cGMP, la mayor parte del conjugado se une al anticuerpo. El aumento de la concentración de cGMP disminuye competitivamente la cantidad de conjugado unido, disminuyendo la actividad de HRP medida.

El día anterior al ensayo, se sembraron células de fibroblastos uterinos primarios en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos, y se incubaron durante la noche a 37°C, 5% de CO². Al día siguiente, se prepararon diluciones en serie de construcciones de CNP en disolución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco (DPBS). Las células se enjuagaron con amortiguador de bicarbonato de Ringer Krebs (KRB), y después se incubaron a temperatura ambiente con 3-isobutil-1 -metilxantina (IBMX) 2 mM en KRB durante 10 min para evitar la degradación de cGMP. Después, las diluciones en serie de las muestras se añadieron a la placa por duplicado, y la placa se incubó a 37°C, 5% de CO²durante 40 min. A continuación, se añadió amortiguador de lisis celular a cada pocillo para lisar las células y liberar el cGMP. A continuación, estas muestras se transfirieron a la placa de ensayo de cGMP. Tanto el anticuerpo anti-cGMP como el HRP-cGMP se añadieron a la placa de ensayo y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 h. A continuación, la placa se lavó con amortiguador de lavado de cGMP. Después del lavado, se añadió sustrato rojo semáforo a cada pocilio, y la placa se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, se leyó la placa en un lector de placas de fluorescencia con excitación de 530 nm, emisión de 590 nm, y corte de 570 nm.

Las construcciones en las que el CNP estaba situado en el extremo N de la proteína de fusión eran más potentes que aquellas en las que el CNP estaba situado en el extremo C. La construcción más potente fue PE0552, que fue aproximadamente 30 veces menos potente que el péptido CNP. Véase la Figura 1A-B.

La construcción PE0552 se inyectó por vía subcutánea tres veces por semana en ratones normales (raza FVB/nj) durante un máximo de cinco semanas. Los ratones tenían de 3 a 5 semanas de edad al comienzo del experimento. El efecto sobre el crecimiento lineal de los ratones se determinó midiendo la longitud de la cola, la longitud de la nariz al ano, y la longitud de la nariz a la cola después de cada semana de dosificación en comparación con un grupo de control inyectado con disolución salina normal. La Figura 2A-C muestra que ambos niveles de dosis de PE0552 dieron como resultado una tasa más rápida de crecimiento lineal.

Ejemplo 3 Comparativo - Preparación de construcciones de CNP ELP escindióles por proteasa

Se sintetizaron cinco genes diferentes, cada uno de los cuales contenía una versión de 37 aminoácidos de la secuencia de CNP y uno de los cinco sitios de escisión de proteasa diferentes (Tabla 4).

Cada secuencia de genes se digirió con enzimas de restricción XbaI/BsrGI, y después se subclonó en el plásmido pPE0003 digerido con XbaI/Acc65i para proporcionar los plásmidos pPE9206, pPE9216, pPE9306, pPE9316, y pPE9326. Estas fusiones colocan la secuencia de CNP en el extremo N de la secuencia de ELP1-120 con el sitio sensible a la proteasa diferente entre los dos para permitir la escisión para liberar la secuencia de CNP in vivo.

La potencia de las construcciones de CNP purificadas descritas en el Ejemplo 3 se demostró utilizando el receptor natriurético de tipo B (NPRB) que expresa células de fibroblastos uterinos primarios como se describe en el Ejemplo 2. El pretratamiento de las construcciones de CNP ELP sensibles a proteasa aumentó la potencia en comparación con la construcción no tratada, debido a la liberación del resto de CNP.

Las construcciones anteriores se inyectaron diariamente en ratones normales (raza FVB/nj) durante tres semanas. Los ratones tenían 3 semanas de edad al comienzo del experimento. El efecto sobre el crecimiento lineal de los ratones se determinó midiendo la longitud de la cola, la longitud de la nariz al ano, y la longitud de la nariz a la cola después de cada semana de dosificación en comparación con un grupo de control inyectado con disolución salina normal. La Figura 3A-C muestra que solo PE9306 dio como resultado una tasa de crecimiento lineal más rápida. No hubo un efecto significativo sobre el peso corporal.

Se realizaron construcciones ejemplares adicionales que comprenden CNP53 en el extremo N enlazado a ELP1-120 a través de un enlazador de sitio de escisión de catepsina K (PE9446; SEQ ID NOs: 111 y 112), CNP22 en el extremo N enlazado a ELP1 -120 a través de un enlazador de sitio de escisión de catepsina K (PE9456; SEQ ID NOs: 113 y 114), CNP37 en el extremo C enlazado a ELP1-120 a través de un enlazador de sitio de escisión de catepsina K (PE9486; SEQ ID NOs: 115 y 116), CNP53 en el extremo C enlazado a ELP1 -120 a través de un enlazador de sitio de escisión de catepsina K (PE9496; SEQ ID NOs: 117 y 118), y CNP22 en el extremo C enlazado a ELP1-120 a través de un enlazador de sitio de escisión de catepsina K (PE9506; SEQ ID NOs: 119 y 120).

Ejemplo 4 - Preparación de la construcción de GLP-2 ELP

El ADN que c^odifica la secuencia de GLP-2 se sintetizó para incorporar la mutación A2G para aumentar la resistencia a DPP-IV. Éste se digirió con enzimas de restricción XbaI y BsrGI, y después se subclonó en el plásmido pPE0003 cortado con XbaI y Acc65I para proporcionar el plásmido pPE0503. La fusión coloca la secuencia de GLP-2 en el extremo N de la secuencia de ELP1 -120.

La proteína PE0503 purificada se analizó en un ensayo de potencia de cAMP basado en células, y mostró tener una EC⁵⁰de 1,75 nM, en comparación con 0,24 nM para el péptido GLP-2.

Ejemplo 5 - Evaluación de la construcción de GLP-2 ELP in v iv o

A ratas macho Sprague Dawley (200 - 220 g, n = 12/grupo) se les inyectó por vía subcutánea PE0503 o péptido GLP-2 (A2G) durante un período de dosificación de once días como se muestra en la Tabla 5.

Tabla 5

Los animales se sacrificaron el día 12, y se realizó una incisión en la línea media, se extrajeron los intestinos delgados, se estiraron a su máxima longitud, y se midieron. A continuación, se eliminó la materia fecal de la luz, y se registró el peso del intestino delgado. La Figura 4 muestra que el tratamiento con PE0503 dio resultado un aumento altamente significativo en el peso del intestino delgado en comparación con el placebo, incluso cuando se administró cada cuatro días (Q4D). El análisis histológico de secciones del intestino delgado indicó un claro aumento en la altura de las vellosidades en comparación con el vehículo (disolución salina), como se esperaba para un agonista del receptor de GLP-2. Dado que la vida media es significativamente más larga en seres humanos, los datos verifican que PE0503 es adecuado para dosificar una vez por semana o menos en seres humanos.

Ejemplo 6 Comparativo - Preparación de construcciones de FGF21 ELP

La secuencia del gen FGF21 se sintetizó, se digirió con enzimas de restricción Bgl\/EcoR\, y después se subclonó en el plásmido pPE0003 para proporcionar el plásmido pPE9183 (SEQ \D Nos: 131 y 132), colocando la secuencia de FGF21 en el extremo C de la secuencia de ELP1 -120.

La secuencia del gen FGF21 se sintetizó, se digirió con enzimas de restricción Bgl\/EcoR\, y después se subclonó en el plásmido pPB1023 para proporcionar el plásmido pPE9193 (SEQ \D Nos: 133 y 134), colocando la secuencia de FGF21 en el extremo C de la secuencia de ELP1-120. Esto crea un agonista dual con GLP-1 en un extremo del polímero de ELP y FGF21 en el otro.

REFERENCIAS

Esta solicitud hace referencia a las siguientes publicaciones y solicitudes en sus totalidades: US 2001/0034050 A1; US 2009/0220455; US 8.334.257; US 2013/0310538; US 2013/0172274; US 2011/0236384; US 6.582.926; US 7.429.458; US 7.364.859; US 8.178.495; US 2013/0079277; US 2013/0085099; US 2013/0143802; US 2014/0024600; US 2011/0178017; US 7.709.227; US 2011/0123487; US 8.729.018; US 2014/0171370; US 2013/0150291; WO/2014/113434; US 2014/0213516, PCT/US2015/061955; y las Solicitudes Provisionales US Nos. 62/113.943, 62/145.770, y 62/150.679.

REFERENCIAS

Amarante-Mendes and Griffith. Therapeutic applications of TRA\L receptor agonists in cancer and beyond. Pharm. & Thera. 155: 117-131 (2015).

Anker et al. Ularitide for the treatment of acute decompensated heart failure: from preclinical to clinical studies. European Heart J. 36: 715-723 (2015).

Barnes et al. Sustained Cardiovasuclar Actions of APJ Agonism During Renin-Angiotensin System Activation and in Patients with Heart Failure. Circ Heart Fail. 6:482-491 (2013).

Brame et al. Design, Characterization, and First-\n-Human Study of the Vascular Actions of a Novel Biased Apelin Receptor Agonist. Hypertension 65:834-840 (2015).

Bukulmez et al. Protective Effects of C-Type natruiretic Peptide on Linear Growth and Articular Cartilage Integrity in a Mouse Model of Inlfammtory Arthritis. Arthritis & Rheum. 66(1):78-89 (2014).

Calabria et al. GLP-1 Receptor Antagonist Exendin-(9-39) Elevates Fasting Blood Glucose Levels in Congenital Hyperinsulinism Owing to Inactivating Mutations in the ATP-Sensitive K+ Channel. Diabetes 61:2585-2591 (2012).

Chou et al. Substrate Profiling of Cysteine Proteases Using a Combinatorial Peptide Library Identifies Functionally Unique Specificities. J. Biol. Chem. 281, 12824-12832 (2006)

Chua et al. Small cyclic agonists of iron regulatory hormone hepcidin. Bioorg. & Med. Chem. Ltr. 25:4961-4969 (2015).

Dalzell et al. The Emerging Potential of the Apelin-APJ System in Heart Failure. J. Card. Fail. 21:489-498 (2015).

De Leon et al. Exendin-(-39) Corrects Fasting Hypoglycemia in SUR-1-/- Mice by Lowering cAMP in Pancreatic p-cells and Inhibiting Insulin Secretion. J.Biol. Chem. 283:25786-25793 (2008).

Folino et al. Effects of apelin on the cardiovascular system. Heart Fail Rev. 20:505-518 (2015).

Gaich et al. The Effects of LY2405319, an FGF21 Analog, in Obese Human Subjects with Type 2 Diabetes. Cell Metabolism 18, 333-340 (2013).

Gimeno and Moller FGF21-based pharmacotherapy - potential utility for metabolic disorders. Trends Endocrinol. Metab. 25, 303-311 (2014).

Hecht et al. Rationale-Based Engineering of a Potent Long-Acting FGF21 Analog for the Treatment of Type 2 Diabetes. PLOS One, 7(11): e49345 (2012).

Jia et al. Cardiovascular effects of a PEGylated apelin. Peptides 38:181-188 (2012).

Kharitonenkov et al. FGF-21 as a novel metabolic regulator. J. Clin. Invest. 115; 1627-1635 (2005).

Kharitonenkov et al. The metabolic state of diabetic monkeys is regulated by fibroblast growth factor-21. Endocrinol. 48:774-781 (2007).

Kharitonenkov et al. Rational Design of a Fibroblast Growth Factor 21-Based Clinical Candidate, LY2405319. PLOS One, 8, e58575 (2013).

Lemke et al. Getting TRAIL back on track for cancer therapy. Cell Death & Diff. 21:1350-1364 (2014).

Long and Kharitonenkov Hormone-like fibroblast growth factors and metabolic regulation. Biochim. Biophys. Acta 1812:791-795 (2011).

Lord and De Leon. Monogenic hyperinsulinemic hypoglycemia: current insights into the pathogenesis and management. Int. J. Ped. Endocrin. 2013:3 (2013).

Lorget et al. Evaluation of the Therapeutic potential of a CNP analog in a Fgfr3 mouse model recapitulating achondroplasia. Am. J. Hum. Genet. 91:1108-1114 (2012).

Mitrovic et al. Effects of the renal natriuretic peptide urodilatin (ularitide) in patients with decompensated chronic heart failure: A double-blind, placebo-controlled, ascending-dose trial. Am. Heart J. 150:1239.e1-1239.e8 (2005).

Ogawa et al. BetaKlotho is required for metabolic activity of fibroblast growth factor 21. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:7432-7437 (2007).

Oh et al. Systemic PEGylated TRAIL treatment ameliorates liver cirrhosis in rats by eliminating activated hepatic stellate cells. Hepatology. Dec 28. doi: 10.1002/hep.28432 (2015).

Peake et al. C-type natriuretic peptide signalling drives homeostatic effects in human chondrocytes. Biochem. & Biophys. Res. Comm. 465:784-789 (2015).

Preza et al. Minihepcidins are rationally designed small peptides that mimic hepcidin activity in mice and may be useful for the treatment of iron overload. J. Clin. Invest. 121:4880-4888 (2011).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una formulación farmacéutica de liberación sostenida, que comprende:

un agente terapéutico para administración sistémica, comprendiendo el agente terapéutico un agente activo proteico y al menos 60 unidades estructurales de péptido similar a elastina (ELP) de SEQ ID NO: 3, y

en el que el agente activo proteico es un agonista del receptor del péptido similar a glucagón (GLP)-2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70.

2. La formulación farmacéutica de la reivindicación 1, en la que cada X se selecciona de V, G, y A.

3. La formulación farmacéutica de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la formulación proporciona una absorción lenta desde un sitio de inyección tras la administración.

4. La formulación farmacéutica de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la formulación proporciona un perfil PK plano tras la administración, en comparación con el perfil PK del agente activo en ausencia de la secuencia de aminoácidos que forma una matriz reversible,

opcionalmente en la que el perfil PK tiene un pico a valle bajo (Cmax a Cmin) y Tmax retrasado o tardío.

5. La formulación farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que una matriz reversible formada a la temperatura corporal se invierte a medida que disminuye la concentración de proteína.

6. La formulación farmacéutica de la reivindicación 2, en la que la relación de V:G:A es 5:3:2.

7. La formulación farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el sujeto es un ser humano o un mamífero no humano.

8. La formulación farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el agente terapéutico es una proteína de fusión recombinante entre el agente activo proteico y ELP.

9. La formulación farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el agente activo proteico tiene una vida media circulatoria en el intervalo de alrededor de 30 segundos a alrededor de 10 horas, o alrededor de 30 segundos a alrededor de 1 hora.

10. La formulación farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y 9, en la que el agente terapéutico es un conjugado químico entre el agente activo proteico y ELP.

11. La formulación farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el agente terapéutico está presente en el intervalo de 0,5 mg/ml a 200 mg/ml, opcionalmente 30 mg/ml a 150 mg/ml, 50 mg/ml a 125 mg/ml, o 75 mg/ml a 110 mg/ml, opcionalmente en la que el agente terapéutico está presente en la cantidad de 100 mg/ml.

12. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que el agente terapéutico no forma una matriz de transición de fase en las condiciones de almacenamiento.

13. La composición farmacéutica de la reivindicación 12, en la que las condiciones de almacenamiento son menos de 40°C, o menos de 37°C, menos de 30°C, menos de 27°C, menos de 25°C, menos de 0°C, menos de -15°C, o menos de -60°C,

opcionalmente en la que la formulación es estable durante más de 1 mes en las condiciones de almacenamiento, opcionalmente en la que la formulación es estable durante más de alrededor de 1 mes a una temperatura seleccionada del grupo que consiste en:

a) 25°C;

b) 2°C;

c) 8°C;

d) -15°C; y

e) -80°C.

14. La formulación farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en la que la formulación comprende dos o más de cloruro de calcio, cloruro de magnesio, cloruro de potasio, fosfato de potasio monobásico, cloruro de sodio, polisorbato 20, polisorbato 80, fosfato de sodio, fosfato de sodio monobásico, histidina, y fosfato de sodio dibásico, opcionalmente en la que la formulación comprende fosfato de sodio, cloruro de sodio, y polisorbato 20, opcionalmente en la que la formulación comprende fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 110 mM, y polisorbato 20 al 0,1%, o

en la que la formulación comprende cloruro de sodio e histidina.

15. La formulación farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que la formulación se envasa en forma de plumas o jeringas predosificadas para su administración alrededor de una vez por semana, alrededor de dos veces por semana, o de una a ocho veces por mes.

16. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para uso como medicamento,

opcionalmente en la que el agente terapéutico se administra a un sujeto alrededor de 1 a alrededor de 8 veces al mes, opcionalmente en la que la formulación se administra aproximadamente de forma semanal,

opcionalmente en la que la formulación se administra por vía subcutánea o intramuscular,

opcionalmente en la que el sitio de administración no es un sitio patológico.

17. La formulación farmacéutica de la reivindicación 1, en la que el agente terapéutico es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71.

18. La formulación farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 8-9 y 11 -15, o la formulación para uso según la reivindicación 16, en la que el ELP está fusionado con el extremo C o el extremo N del agente activo proteico.