CN109890833A - 用于递送亲水性药物的基于三嵌段多肽的纳米粒子 - Google Patents

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Abstract

本文中描述了组合物，所述组合物可以包含三嵌段自组装多肽和附连到所述多肽的分子。本文中还描述了制造所述组合物的方法和使用所述组合物的方法。

Description

用于递送亲水性药物的基于三嵌段多肽的纳米粒子
与相关申请的交叉引用
本申请要求2016年9月14日提交的美国临时申请号62/394,662的优先权，所述美国临时申请通过引用完整地并入本文。
背景技术
亲水性小分子药物由于它们的快速肾清除而遭受次优的药代动力学，并且也遭受过早的体内降解。此外，亲水性药物也可能表现出不良的细胞内摄入，这损害了它们的体内效能。由于这些限制，为了获得治疗相关的浓度，需要亲水性药物的多次高剂量注射，但最高剂量受到对健康器官的***性副作用的限制。因此，需要递送亲水性化学治疗剂的更好的方法。
发明内容
一方面，公开了包含自组装多肽的聚集体的组合物，其中自组装多肽包含(a)第一氨基酸序列(X1GVPG)x(SEQ ID NO：1)，其中X1是氨基酸并且x是20至240；(b)第二氨基酸序列(X2Gm)y(SEQ ID NO：2)，其中X2是Y、F或W，m是0至3，并且y是1至50；(c)第三氨基酸序列(CGG)z(SEQ ID NO：3)，其中z大于1；和(d)通过半胱氨酸基团附连到所述第三氨基酸序列的至少一个分子，其中所述分子在7.4的pH下具有小于或等于1.5的辛醇-水分配系数(logD)。
另一方面，公开了杀死多个癌细胞的方法，所述方法包括将多个癌细胞与本文中所公开的组合物接触。
另一方面，公开了在对象中治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述对象给药本文中所公开的组合物。
附图说明
本专利或申请文件含有至少一张彩图。本专利或专利申请公开的带有彩图的拷贝将在提出要求并支付必要费用后，由专利局提供。
图1(A)-(C)示出了示例性的不对称三嵌段多肽(ATBP)、小分子马来酰亚胺衍生物(SMM)的结构和示例性的ATBP-SMM/吉西他滨(GEM)纳米粒子的合成的示意图。图1(A)示出了ATBP的序列，其具有三个区段：包括160个AGVPG的重复序列的ELP区段，促进自组装的(YG)6区段，和为各种分子的马来酰亚胺衍生物的共价缀合提供反应性半胱氨酸(Cys)残基的的富含半胱氨酸的(CGG)8药物附连区段。图1(B)示出了SMM的结构和log(D)。所述圆圈充当模型化合物的结构和它们的由logD度量的疏水性的视觉图；在图中疏水性以顺时针方式提高。图1(C)是示意图，示出了GEM的附连不破坏ATBP自组装成具有被疏水性核心包围的富含药物的核心和亲水性多肽冠的圆柱状纳米粒子。
图2(A)-(E)示出了示例性的ATBP–N-羟基马来酰亚胺(ATBP-SMM1)缀合物的表征。图2(A)是通过动态光散射(DLS)测量到的ATBP-SMM1缀合物的流体动力学半径(Rh)的角度依赖性的图。图2(B)为通过SLS为ATBP-SMM1缀合物获得的部分Zimm图(Kc/R相对于q2)。图2(C)是ATBP-SMM1缀合物的冷冻TEM显微照片。图2(D)是通过热浊度测量术在350nm处进行的ATBP-SMM1缀合物的相变温度(Tt)的测定。图2(E)是通过芘荧光测定法进行的ATBP-SMM1缀合物的临界聚集浓度(CAC)的测定。
图3(A)-(H)示出了示例性ATBP–GEM缀合物的表征。ATBP和ATBP-GEM缀合物的图3(A)：SDS-PAGE和图3(B)：MALDI-MASS。图3(C)是通过单角度DLS进行的流体动力学半径的测定。图3(D)是通过DLS测量的ATBP–GEM纳米粒子的流体动力学半径的角度依赖性的图。图3(E)是通过SLS为ATBP–GEM缀合物获得的部分Zimm图(Kc/R相对于q2)，图3(F)是ATBP-GEM缀合物的冷冻TEM显微照片。图3(G)是通过热浊度测量术在350nm处进行的ATBP-GEM缀合物的相变温度(Tt)的测定。图3(H)是通过芘荧光测定法进行的ATBP-GEM缀合物的CAC的测定。
图4(A)-(F)示出了示例性ATBP–GEM纳米粒子的体外和体内活性。图4(A)-(B)分别示出了在HCT-116和Colo 205细胞中ATBP–GEM和游离GEM的细胞活力(平均值±95％CI)。图4(C)是血浆花菁5(cy5)浓度随给药后时间变化的图。图4(D)是体内肿瘤摄入的图。在cy5标记的GEM和cy5-ATBP-GEM纳米粒子给药后1、6和24h，肿瘤中cy5的浓度。**和****分别指示p<0.01和p<0.0001(双向ANOVA，Sidak’s检验)(平均值±95％CI，n＝4)。图4(E)-(F)分别是在右胁中接种肿瘤细胞(HCT-116)的小鼠的肿瘤体积和存活百分率的图。
图5(A)-(F)示出了示例性ATBP的表征。图5(A)示出了通过MALDI-MS进行的ATBP的分子量的测定。图5(B)是示出了通过多角度DLS测量的ATBP纳米粒子的Rh的角度依赖性的图。图5(C)是ATBP纳米粒子的部分Zimm图(Kc/R相对于q2)。图5(D)是ATBP纳米粒子的冷冻TEM显微照片(比例尺：200nm)。图5(E)是通过热浊度测量术在350nm进行的ATBP纳米粒子的相变温度(Tt)的测定。图5(F)是通过芘荧光测定法进行的ATBP纳米粒子的CAC的测定。
图6(A)-(B)是示出了示例性ATBP和示例性ATBP-SMM缀合物的纯度的图像。ATBP和ATBP-SMM缀合物的SDS-PAGE，使用了图6(A)：SMM 1-4和图6(B)：SMM 5-8。
图7(A)-(D)示出了示例性ATBP-N-1-(2-氨基-乙基)-吡咯-2,5-二酮盐酸盐(SMM2)缀合物的表征。图7(A)是通过多角度DLS测量的SMM2纳米粒子的Rh的角度依赖性的图。图7(B)是SMM2缀合物的部分Zimm图(Kc/R相对于q2)。图7(C)是通过热浊度测量术在350nm进行的SMM2缀合物的Tt的测定。图7(D)是通过芘荧光测定法进行的SMM2缀合物的CAC的测定。
图8(A)-(E)示出了示例性ATBP-N-2-马来酰亚胺乙基甲磺酸酯(SMM3)缀合物的表征。图8(A)是通过多角度DLS测量的SMM3纳米粒子的Rh的角度依赖性的图。图8(B)是SMM3缀合物的部分Zimm图(Kc/R相对于q2)。图8(C)是SMM3缀合物的冷冻TEM显微照片(比例尺：200nm)。图8(D)是通过热浊度测量术在350nm进行的SMM3缀合物的Tt的测定。图8(E)是通过芘荧光测定法进行的SMM3缀合物的CAC的测定。
图9(A)-(E)示出了示例性ATBP–N-马来酰基-β-丙氨酸(SMM4)缀合物的表征。图9(A)是通过多角度DLS测量的SMM4纳米粒子的Rh的角度依赖性的图。图9(B)是SMM4缀合物的部分Zimm图(Kc/R相对于q2)。图9(C)是SMM4缀合物的冷冻TEM显微照片(比例尺：200nm)。图9(D)是通过热浊度测量术在350nm进行的SMM4缀合物的Tt的测定。图9(E)是通过芘荧光测定法进行的SMM4缀合物的CAC的测定。
图10(A)-(E)示出了示例性ATBP–N-甲基马来酰亚胺(SMM5)缀合物的表征。图10(A)示出了通过多角度DLS测量的SMM5纳米粒子的Rh的角度依赖性的图。图10(B)是SMM5缀合物的部分Zimm图(Kc/R相对于q2)。图10(C)是SMM5缀合物的冷冻TEM显微照片(比例尺：200nm)。图10(D)是通过热浊度测量术在350nm进行的SMM5缀合物的Tt的测定。图10(E)是通过芘荧光测定法进行的SMM5缀合物的CAC的测定。
图11(A)-(E)示出了示例性ATBP-N-乙基马来酰亚胺(SMM6)缀合物的表征。图11(A)示出了通过多角度DLS测量的SMM6纳米粒子的Rh的角度依赖性的图。图11(B)是SMM6缀合物的部分Zimm图(Kc/R相对于q2)。图11(C)是SMM6缀合物的冷冻TEM显微照片(比例尺：200nm)。图11(D)是通过热浊度测量术在350nm进行的SMM6缀合物的Tt的测定。图11(E)是通过芘荧光测定法进行的SMM6缀合物的CAC的测定。
图12(A)-(E)示出了示例性ATBP-N-苯基马来酰亚胺(SMM7)缀合物的表征。图12(A)示出了通过多角度DLS测量的SMM7纳米粒子的Rh的角度依赖性的图。图12(B)是SMM7缀合物的部分Zimm图(Kc/R相对于q2)。图12(C)是SMM7缀合物的冷冻TEM显微照片(比例尺：200nm)。图12(D)是通过热浊度测量术在350nm进行的SMM7缀合物的Tt的测定。图12(E)是通过芘荧光测定法进行的SMM7缀合物的CAC的测定。
图13(A)-(E)示出了示例性ATBP–N-叔丁基马来酰亚胺(SMM8)缀合物的表征。图13(A)是示出了通过多角度DLS测量的SMM8纳米粒子的Rh的角度依赖性的图。图13(B)是SMM8缀合物的部分Zimm图(Kc/R相对于q2)。图13(C)是SMM8缀合物的冷冻TEM显微照片(比例尺：200nm)。图13(D)是通过热浊度测量术在350nm进行的SMM8缀合物的Tt的测定。图13(E)是通过芘荧光测定法进行的SMM8缀合物的CAC的测定。
图14是示例性ATBP-GEM缀合物的冷冻TEM显微照片。
图15(A)-(B)是AFM图像，示出了图15(A)：示例性ATBP和图15(B)：示例性ATBP-GEM缀合物。
图16(A)-(B)是示出了示例性ATBP-GEM缀合物的Tt的测定的图。所述Tt使用热浊度测量术在350nm下，在90％小鼠血清中和PBS中测定，图16(A)：10、25和50μM ATBP浓度，图16(B)：1-10μM ATBP浓度。
图17是示出了cy5标记的示例性ATBP-GEM缀合物的高效液相色谱(HPLC)迹线的图。HPLC在Shodex OHPak SB-804柱中，使用0.5mL min-1的PBS：乙腈[70:30]的等度流速运行。
图18(A)-(B)是一系列图像，示出了cy5标记的示例性ATBP-GEM缀合物的细胞摄入。将图18(A)：HCT 116和图18(B)：Colo 205细胞用cy5标记的ATBP-GEM缀合物或PBS处理。在处理4h后，将细胞用含4％聚甲醛的PBS固定，并用含Hoechst 33342和CellMaskTM绿色细胞质膜染色剂的Hank’s平衡盐溶液(HBSS)染色，并立即在倒置荧光显微镜中使用60x1.25NA油浸物镜成像。
图19是示出了带有皮下HCT-116肿瘤的小鼠的体重变化的图。在第0天静脉内(i.v.)实施处理。处理包括以5至25mg GEM当量/kg体重(BW)范围内的剂量单次i.v.注射示例性ATBP-GEM。点代表平均值±SD(n＝5)。
图20是示出了带有皮下HCT-116肿瘤并用示例性ATBP-GEM、游离GEM和PBS处理的小鼠的体重的图(最多30天)。
具体实施方式
在临床中使用的亲水性小分子癌症药物，由于它们的快速清除、不良的组织吸收和快速代谢，通常具有不良的生物可利用性和次优的药代动力学。通过将亲水性药物附连到基于自组装肽的纳米粒子来包封它们，可以通过与游离药物相比提高它们的半衰期、组织穿透性并减少过早降解来克服这些限制。然而，众所周知，亲水性药物的缀合/包封使多肽的自组装失稳。
本文公开了一种通过使用三嵌段自组装多肽将亲水性分子包装在纳米粒子中的方法。出人意料地发现，可以将亲水性分子缀合到所述自组装肽而不破坏所述多肽进行自组装的能力。此外，通过将所述亲水性分子缀合到所述自组装多肽，相对于单独的所述亲水性分子可以显著改进药代动力学和药效学，正如由吉西他滨在肿瘤模型中的改善的递送所证实的。
1.定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的意义。在有冲突的情况下，以包括定义的本文件为准。下文描述了优选的方法和材料，但是与本文中所描述的相似或等同的方法和材料也可用于本发明的实践或试验。本文中提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以整体并入本文。本文公开的材料、方法和实例仅仅是为了说明而不打算作为限制。
本文中使用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“可以”、“含有”及其变化形式，旨在作为开放性过渡短语、术语或词语，其不排除其他行动或结构的可能性。没有具体数目的指称包括复数指称物，除非上下文明确叙述不是如此。本公开还设想了包含本文中呈现的实施方式或要素、由它们构成和基本上由它们构成的其他实施方式，不论是否明确阐述都是如此。
连词“或”包括由所述连词相连的一个或多个列出的要素的任何和所有组合。例如，短语“包含A或B的装置”可以是指包含A而B不存在的装置、包含B而A不存在的装置或其中A和B两者都存在的装置。短语“A、B、……和N中的至少一者”或“A、B、……N中的至少一者或其组合”以最宽泛的意义定义，意味着选自A、B、……和N的一个或多个要素，也就是说要素A、B、……或N中的一者或多者的任何组合，包括单独的任一要素或其与一个或多个其他要素的组合，所述其他要素也可以组合性地包括未列出的另外的要素。
与数量结合使用的修饰语“约”包含了所陈述的值并具有由上下文决定的意义(例如，它至少包括与所述特定数量的测量相关的误差度)。修饰语“约”也应该被认为是公开了由所述两个端点的绝对值所定义的范围。例如，表述“约2至约4”也公开了“2至4”的范围。术语“约”可以是指所指示的数字的加或减10％。例如，“约10％”可以指示9％至11％的范围，并且“约1”可以意味着0.9-1.1。“约”的其他意义可以从上下文明显看出，例如四舍五入，因此例如“约1”也可以意味着0.5至1.4。
2.组合物
本文公开了可以包含自组装多肽的聚集体的组合物。所述自组装多肽可以包括至少三个不同的氨基酸序列和附连到所述氨基酸序列之一的亲水性分子。所述多肽的聚集体在适当条件下可以自组装，并且可以形成各种不同形状的粒子。附连分子例如亲水性药物分子的尝试可能扰乱多肽自组装的能力。此外，难以预测这种改变是否将消除所述多肽进行自组装的能力。
正如上文提到的，所述自组装多肽的聚集体可以自组装成各种不同的形状和尺寸。所述自组装多肽的聚集体可以具有约1μM至约10μM、例如约1.2μM至约9μM或约1.5μM至约8.5μM的临界聚集浓度(CAC)。在某些实施方式中，所述自组装多肽的聚集体可以是纳米粒子。所述纳米粒子可以是杆状或球形的，或者所述组合物可以包括不同形状的纳米粒子的组合。在某些实施方式中，所述纳米粒子可以是胶束。在某些实施方式中，所述纳米粒子可以是杆状胶束。
所述纳米粒子可以具有变化的平均流体动力学半径。例如，所述纳米粒子可以具有约20nm至约200nm、例如约25nm至约150nm或约40nm至约100nm的平均流体动力学半径。在某些实施方式中，所述纳米粒子可以具有大于20nm、大于25nm、大于30nm、大于35nm、大于40nm、大于45nm或大于50nm的平均流体动力学半径。在某些实施方式中，所述纳米粒子可以具有小于200nm、小于175nm、小于150nm、小于125nm、小于100nm或小于75nm的平均流体动力学半径。
所述纳米粒子也可以通过它的平均回转半径来描述。例如，所述纳米粒子可以具有约20nm至约200nm、例如约25nm至约150nm或约40nm至约100nm的平均回转半径。在某些实施方式中，所述纳米粒子可以具有大于20nm、大于25nm、大于30nm、大于35nm、大于40nm、大于45nm或大于50nm的平均回转半径。在某些实施方式中，所述纳米粒子可以具有小于200nm、小于175nm、小于150nm、小于125nm、小于100nm或小于75nm的平均回转半径。
所述自组装多肽的聚集体可以包含变化量的自组装多肽。例如，所述多肽的聚集体可以包含每个聚集体约50至约1,000个自组装多肽，例如每个聚集体约75至约800、约80至约600或约90至约400个自组装多肽。在某些实施方式中，所述多肽的聚集体可以包含每个聚集体超过50个自组装多肽、每个聚集体超过60个自组装多肽、每个聚集体超过70个自组装多肽、每个聚集体超过80个自组装多肽或每个聚集体超过90个自组装多肽。在某些实施方式中，所述自组装多肽的聚集体可以包含每个聚集体少于1,000个自组装多肽、每个聚集体少于900个自组装多肽、每个聚集体少于800个自组装多肽、每个聚集体少于700个自组装多肽、每个聚集体少于600个自组装多肽或每个聚集体少于500个自组装多肽。正如上文提到的，在某些实施方式中，所述聚集体可以是纳米粒子，并且对每个聚集体的自组装多肽的数目的描述也可适用于所述纳米粒子。
此外，所述自组装多肽可以具有一定范围的分子量。例如，每个自组装多肽可以各自具有约20kDa至约300kDa、例如约30kDa至约200kDa或约30kDa至约100kDa的分子量。在某些实施方式中，每个自组装多肽可以各自具有超过20kDa、超过30kDa、超过40kDa或超过50kDa的分子量。在某些实施方式中，每个自组装多肽可以各自具有小于300kDa、小于250kDa、小于200kDa、小于150kDa或小于100kDa的分子量。
所述自组装多肽可以包含能够提供其他优点例如产率提高、易于纯化和/或自组装增强的其他氨基酸序列。例如，所述自组装多肽可以包含第四氨基酸序列SKGPG(SEQ IDNO：9)和/或第五氨基酸序列WP(SEQ ID NO：10)。所述第四氨基酸序列可以被附连到所述自组装多肽的5’末端(例如附连到所述第一氨基酸序列)。所述第五氨基酸序列可以被附连到所述自组装多肽的3’末端(例如附连到所述第三氨基酸序列)，并且它可以使得能够通过UV-VIS光谱术便捷地对蛋白质浓度进行定量。
在某些实施方式中，所述自组装多肽可以是SKGPG-第一氨基酸序列-第二氨基酸序列-第三氨基酸序列-WP(SEQ ID NO：11)，其中所述第一、第二和第三氨基酸序列在下文中进一步详细描述。
A.第一氨基酸序列
所述第一氨基酸序列可以是亲水性和热响应性的。所述第一氨基酸序列可以是弹性蛋白样多肽(ELP)。ELP受到人类弹性蛋白启示，并且它们可以具有下临界溶解温度相变行为，所述行为可用于生物环境中的刺激物响应性应用。例如，ELP可以在低于特征性浊点温度(Tt)(也被称为逆相变温度)的温度下可溶，并在高于所述Tt时聚集成纳米至微米尺度的粒子。对弹性蛋白样多肽的进一步描述可以见于美国专利号8,470,967、美国专利号8,912,310、美国专利号9,127,047和美国专利申请公布号2014/0024600，所有所述文献都通过引用以整体并入本文。
所述第一氨基酸序列可以是(X1GVPG)x(SEQ ID NO：1)，其中X1是氨基酸并且x是20至240。在某些实施方式中，所述第一氨基酸序列可以是(X1GVPG)m(SEQ ID NO：3)，其中X1是氨基酸并且m是120至200。在某些实施方式中，X1可以是A。在某些实施方式中，所述第一氨基酸序列可以是(AGVPG)160(SEQ ID NO：6)。
B.第二氨基酸序列
所述第二氨基酸序列可以是疏水性的，并且可以有助于驱动所述多肽的自组装。所述第二氨基酸序列可以被附连到所述第一氨基酸序列并且可以被附连到所述第三氨基酸序列(例如参见图1)。
所述第二氨基酸序列可以是(X2Gm)y(SEQ ID NO：2)，其中X2是Y、F或W，m是0至3，并且y是1至50。在某些实施方式中，所述第二氨基酸序列可以是(X2G)n(SEQ ID NO：4)，其中n是4至8。在某些实施方式中，X2可以是Y。在某些实施方式中，所述第二氨基酸序列可以是(YG)6(SEQ ID NO：7)。
C.第三氨基酸序列
所述第三氨基酸序列可以被附连到所述第二氨基酸序列，并且也可以包括反应性位点例如半胱氨酸基团，所述分子可以附连到所述位点(例如参见图1)。所述第三氨基酸序列可以是(CGG)z(SEQ ID NO：3)，其中z大于1。在某些实施方式中，所述第三氨基酸序列可以是(CGG)p(SEQ ID NO：5)，其中p是4至12。在某些实施方式中，所述第三氨基酸序列可以是(CGG)8(SEQ ID NO：8)。
D.分子
所述组合物可以包含可以通过半胱氨酸基团附连到所述第三氨基酸序列的任何亲水性分子(例如药物、化学治疗剂、成像剂等)。所述分子可以位于所述自组装多肽的聚集体的核心中(例如位于所述纳米粒子的核心中)。所述分子的亲水性可以通过它的辛醇-水分配系数(logD)来表征，其中较大的值指示较大的疏水性。例如，所述分子可以具有在7.4的pH下小于或等于1.5、在7.4的pH下小于或等于1.4、在7.4的pH下小于或等于1.3、在7.4的pH下小于或等于1.2、在7.4的pH下小于或等于1.1或在7.4的pH下小于或等于1的log(D)。在某些实施方式中，所述分子在7.4的pH下具有约-1至约1.5的logD。
所述分子可以是化学治疗剂或成像剂。在某些实施方式中，所述分子可以是吉西他滨。当在本文中使用时，术语“成像剂”是指可以直接地或在施加刺激后检测到的分子或化合物。成像剂的实例包括在暴露于外部辐射源或其他刺激物后发出辐射的发光标记物，例如荧光材料或荧光团(其在暴露于光时发光)、化学发光材料(其在化学反应期间发光)、电致发光材料(其在施加电流后发光)、磷光材料(其中在结束暴露于光刺激后发光继续)和热致发光材料(其在超过一定温度后发光)。荧光团的实例包括荧光素、呫吨类、花菁类、萘类、香豆素类、噁二唑类、芘类、噁嗪类、吖啶类、芳基甲川类、Alexa Fluor和四吡咯类。其他荧光团包括量子点，其在例如用电或光刺激后发出高度特异性的波长的电磁辐射。
其他成像剂包括放射活性标记物，包括发射正电子的核例如18F、64Cu或124I，其可以通过成像技术例如正电子发射断层扫描(PET)来检测。也可以使用其他放射活性标记物例如14C、3H或碘同位素例如123I和131I，其可以使用放射自显影分析或闪烁检测技术来检测。在发射γ射线的核的情况下，可以使用诸如单光子发射计算机断层扫描(SPECT)的成像技术。其他成像剂包括具有NMR活性的成像剂，其可以通过磁共振技术例如磁共振成像(MRI)或核磁共振(NMR)检测器来检测，所述成像剂通常包含一般不以高浓度形式存在于生物体或生物样品中其他地方的一种或多种具有NMR活性的核，其实例是13C、2H(氘)或19F。其他成像剂包括包含大核原子的成像剂，所述大核原子例如原子序数为35或更大、优选地40或更大、甚至更优选地50或更大的原子，例如碘或钡，其是用于X-射线照相技术或计算机断层扫描(CT)成像技术的有效造影剂。
所述分子可以通过存在于所述第三氨基酸序列上的硫醇基团附连到所述第三氨基酸序列。或者换句话说，所述分子可以通过任何适合类型的硫醇生物缀合连键，附连到所述第三氨基酸序列。实例包括但不限于硫醇-马来酰亚胺连键、二硫键、硫醇-乙烯基连键(例如硫醇-乙烯砜)以及通过所述第三氨基酸序列上的硫醇基团介导的其他类型的Michael加成类型的反应。
在某些实施方式中，所述分子可以被当作是小分子。例如，所述分子可以具有小于或等于1.5kDa、小于或等于1.4kDa、小于或等于1.3kDa、小于或等于1.2kDa、小于或等于1.1kDa、小于或等于1kDa、小于或等于0.9kDa、小于或等于0.8kDa、小于或等于0.7kDa、小于或等于0.6kDa或小于或等于0.5kDa的分子量。
所述组合物可以包含变化量的所述分子。例如，所述组合物可以包含附连到所述第三氨基酸序列的约2至约15个分子，例如附连到所述第三氨基酸序列的约3至约12个分子或约4至约10个分子。在某些实施方式中，所述组合物可以包含附连到所述第三氨基酸序列的超过1个分子、超过2个分子、超过3个分子、超过4个分子、超过5个分子、超过6个分子或超过7个分子。在某些实施方式中，所述组合物可以包含附连到所述第三氨基酸序列的少于15个分子、少于14个分子、少于13个分子、少于12个分子、少于11个分子或少于10个分子。
E.其他组分
所述组合物还可以包含可药用载体。当在本文中使用时，“可药用载体”是指生理上可接受的稀释剂，包括但不限于水、磷酸盐缓冲盐水或盐水。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对接受者来说是无毒的，并且可以包括缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸，抗氧化剂包括抗坏血酸、BHA和BHT，低分子量(少于约10个残基)多肽，蛋白质例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白，亲水性聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮，氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、精氨酸或赖氨酸，单糖、二糖和其他糖类包括葡萄糖、甘露糖或糊精，螯合剂例如EDTA，糖醇例如甘露糖醇或山梨糖醇，成盐平衡离子例如钠，和/或非离子型表面活性剂例如Tween、Pluronics或PEG。包含可药用载体的所述组合物任选地可以是无菌的。所述组合物可以被冷冻或冻干储存，并在使用之前在适合的无菌载体中重构。具有可药用载体的所述组合物可以按照在例如《雷明顿药物科学与实践》(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)，第21版，Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA(2001)中所描述的常规技术来产生，所述文献通过引用以整体并入本文。
F.制造所述组合物的方法
本文中公开了制造所述组合物的方法。制造所述自组装多肽的方法描述在实施例部分中，并且相似和可替选的方法的进一步描述可以见于美国专利号8,470,967、美国专利号8,912,310、美国专利号9,127,047和美国专利申请公布号2014/0024600，所有所述文献都通过引用以整体并入本文。
为了提供所公开的组合物，可以将所述自组装多肽与所述分子接触。例如，可以将所述自组装多肽添加到第一溶剂以提供多肽溶液，并且可以将所述分子添加到第二溶剂以提供分子溶液。所述第一溶剂可以包含磷酸盐缓冲液和/或二甲基甲酰胺，并且所述第二溶剂可以包含二甲基甲酰胺。所述第一和第二溶剂可以包含至少一种相同的溶剂，和/或所述第一和第二溶剂可以各自包含至少一种可与另一者中的溶剂混溶的溶剂。可以将所述多肽溶液搅拌不同的时间长度(例如至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟等)，并且可以向它进一步添加还原剂例如三(2-羧基乙基)膦。
在花费一段时间搅拌后，可以将所述分子溶液添加到所述多肽溶液以提供第一混合物。在某些实施方式中，逐滴添加所述分子溶液。在提供所述第一混合物后，可以允许搅拌它至少15分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时或至少4小时。所述第一混合物的搅拌可以在室温下进行。在所述第一混合物的搅拌期间，所述分子可以通过例如所述第三氨基酸序列上存在的硫醇基团缀合到所述自组装多肽。
在缀合后，可以将所述组合物通过层析和超滤技术进行纯化，例如使用凝胶过滤柱和离心过滤装置。在纯化后，可以将所述组合物冷冻干燥并储存在低于-10℃的温度下。所述多肽的自组装聚集体，可以由个体多肽通过本领域内已知的自组装原理(例如通过阈值浓缩)自组装成聚集体来提供。
3.使用所述组合物的方法
本文中还公开了使用所述组合物的方法。一方面，公开了杀死多个癌细胞的方法，所述方法包括将多个癌细胞与所公开的组合物接触。所述癌细胞可以在体外环境或体内环境中。在某些实施方式中，所述细胞在对象中。所公开的方法的对象可以是人类对象，但是应该理解本文描述的方法对所有脊椎动物物种有效，所述所有脊椎动物物种旨在包含在术语“对象”中。因此，出于医学目的，“对象”可以包括人类对象。适合的动物对象包括哺乳动物，包括但不限于灵长动物例如人类、猴、猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猕猴等，牛科动物例如家牛、公牛等，绵羊类例如绵羊等，山羊类例如山羊等，猪科动物例如猪、生猪等，马科动物例如马、驴、斑马等，猫科动物包括野猫和家猫，犬科动物包括狗，兔形目动物包括兔、野兔等，以及啮齿动物包括小鼠、大鼠、豚鼠等。在某些实施方式中，所述对象是人类，包括但不限于胎儿、新生儿、婴儿、青少年和成人对象。此外，“对象”可以包括患有或疑似患有疾病、障碍或病症的患者。因此，术语“对象”和“患者”在本文中可互换使用。在某些实施方式中，所述对象是人类或狗。
另一方面，公开了在对象中治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述对象给药所公开的组合物。所述疾病或障碍可以是癌症，尤其可以是包含实体肿瘤的癌症。包含实体肿瘤的癌症的实例包括但不限于胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌和卵巢癌。
当在本文中使用时，术语“给药”是指将对象与所公开的组合物接触。所述组合物可以根据所述对象和被探究的特定疾病、障碍或病症，使用本领域中已知的各种不同方法来给药。所述给药可以通过例如静脉内输注、静脉内、腹膜内、肌肉内、眼内或动脉内注射来进行。在某些实施方式中，给药所述组合物包括将所述组合物静脉内注射到所述对象的血管中。
所述组合物的给药可以是***性给药。当在本文中使用时，术语“***性给药”和“***地给药”是指化合物或药物的给药使得它进入所述患者的***并因此经历代谢和其他类似的过程，例如皮下给药。
取决于对象、疾病、细胞类型等，所述组合物可以被给药和/或接触变化量的时间。例如，所述组合物可以以任何适合的间隔每日1至4次给药共6个月的时间段。所述组合物也可以以任何适合的间隔在6个月的时间段内给药1至10次(总共)。从所述组合物的给药开始，所述方法可以进行约10秒至约6个月的时间段。
取决于对象、疾病、细胞类型等，所述组合物可以以变化的剂量给药和/或接触。所述组合物可以以约0.1mg/kg至约35mg/kg、例如约1mg/kg至约30mg/kg或约5mg/kg至约25mg/kg的剂量给药。在某些实施方式中，所述组合物以小于或等于35mg/kg、小于或等于34mg/kg、小于或等于33mg/kg、小于或等于32mg/kg、小于或等于31mg/kg、小于或等于30mg/kg、小于或等于25mg/kg、小于或等于20mg/kg或小于或等于15mg/kg的剂量给药。在某些实施方式中，所述组合物可以以大于或等于0.1mg/kg、大于或等于1mg/kg、大于或等于2mg/kg、大于或等于4mg/kg、大于或等于6mg/kg、大于或等于8mg/kg或大于或等于10mg/kg的剂量给药。
所述方法可以包括具有化学治疗剂的组合物。所述方法相对于单独给药所述化学治疗剂可以具有提高的效能。例如，当在给药后约10至约30天测量时，所述方法相对于单独给药所述化学治疗剂可以能够将肿瘤体积多减小至少1.1倍、多减小至少1.2倍、多减小至少5倍、多减小至少10倍、多减小至少15倍、多减小至少20倍、多减小至少25倍、多减小至少50倍、多减小至少100倍、多减小至少250倍或多减小至少500倍。
肿瘤体积的减小可以提高所述对象的存活率。例如，所述方法相对于单独给药所述化学治疗剂可以将所述对象的存活时间(当通过带病存活时间例如天、月、年等度量时)多提高至少1.1倍、多提高至少1.2倍、多提高至少5倍、多提高至少10倍、多提高至少15倍或多提高至少20倍。
所述方法和组合物也可以相对于单独给药所述化学治疗剂使得所述化学治疗剂以更大的量集中到患病组织(例如实体肿瘤)。例如，当通过在给药后大约24小时时的注射剂量/克组织的百分数(％ID/g)来度量时，包含化学治疗剂的所述组合物相对于单独给药所述化学治疗剂可以多1.1倍、多1.2倍、多1.3倍、多1.4倍、多1.5倍、多2倍、多2.5倍、多3倍、多4倍、多5倍或多10倍集中到患病组织(在所述组合物的给药后)。
包含化学治疗剂的组合物集中到特定组织的能力，可能是由它与单独的化学治疗剂的药代动力学相比有利的药代动力学造成的。例如，包含化学治疗剂的所述组合物可以具有约0.5μg/mL至约6μg/mL、例如约0.75μg/mL至约5μg/mL或约1μg/mL至约4μg/mL的Cmax。在某些实施方式中，包含化学治疗剂的所述组合物可以具有高于0.5μg/mL、高于0.75μg/mL、高于1μg/mL、高于1.5μg/mL、高于2μg/mL或高于2.5μg/mL的Cmax。
包含化学治疗剂的所述组合物可以具有约5小时至约20小时、例如约6小时至约18小时或约10小时至约15小时的t1/2。在某些实施方式中，包含化学治疗剂的所述组合物可以具有超过5小时、超过6小时、超过7小时、超过8小时、超过9小时或超过10小时的t1/2。此外，包含化学治疗剂的所述组合物可以具有与单独的所述化学治疗剂的t1/2相比更大至少1.1倍、更大1.2倍、更大1.5倍、更大2倍、更大2.5倍、更大3倍、更大4倍、更大5倍、更大10倍、更大20倍、更大100倍或更大500倍的t1/2。
包含化学治疗剂的所述组合物可以具有约15μg*h/mL至约50μg*h/mL、例如约20μg*h/mL至约45μg*h/mL或约25至约40μg*h/mL的AUC(总)。
此外，所述方法和组合物相对于单独的所述化学治疗剂可以具有降低的剂量限制性毒性。例如，所公开的方法可以允许所述组合物以相对于单独给药的所述化学治疗剂更低的剂量给药。
4.实施例
通过参考下述实施例，本发明的组合物和方法将被更好地理解，所述实施例旨在作为本发明的说明而不是本发明范围的限制。
实施例1
ATBP缀合物的合成和表征
方法
不对称三嵌段多肽的合成：用于与SMM缀合的示例性ATBP(在整个实施例中被称为ATBP)从可商购的寡聚体(IDT Inc.)合成。简单来说，将77-bp的寡聚体(5-GGGCCGGAGTGCCTGGTGCAGGTGTGCCAGGCGCGGGTGTTCCAGGAGCAGGCGTTCCAGGTGCGGGTGTTCCTGGC-3’)及其互补体(5′-CCGCCAGGAACACCCGCACCTGGAACGCCTGCTCCTGGAACACCCGCGCCTGGCACACCTGCACCAGGCACTCCGGC-3’)杂交并***到从Novagen Inc.(Madison,WI)购买的pET-24a+载体中。然后使用被称为质粒重建递归定向连接的方法，通过将所述序列与其自身递归二聚化来延长所述序列。将短的MSKGPG前导寡聚体附连到最终的生物聚合物序列的5′末端以提高收率，并将三种尾随寡聚体顺序附连到所述生物聚合物序列的3’末端：(YG)6用于促进所述生物聚合物组装成核-壳式蠕虫状胶束结构，(CGG)8用于为含有马来酰亚胺的小分子的化学缀合提供正交的硫醇，WP用于使蛋白质浓度能够通过UV-VIS光谱术便捷地定量。所述ATBP生物聚合物的最终结构包括序列SKGPG–(AGVPG)160–(YG)6–(CGG)8–WP。
ATBP的表达和纯化：所述ATBP使用转染到大肠埃希氏杆菌菌株BL21(DE3)中的pET-24a+表达质粒来表达。接种50mL培养物并在37℃和210rpm下生长16h，然后将其转移到6个含有TB Dry并增补有45μg/mL卡那霉素的1L烧瓶中。然后将所述1L烧瓶在37℃和210rpm下温育8h，用2mM IPTG诱导并继续生长16h，然后将细胞悬液在4℃下以3,000rpm离心10min。所述ATBP使用本领域中已知的的标准流程来纯化。简单来说，将重悬浮的细胞沉积物通过在冰上超声处理3min(开10s，关40s)(Masonix S-4000；Farmingdale,NY)进行裂解，然后添加0.7％w/v的聚乙烯亚胺(PEI)以沉淀核酸。然后将上清液通过2至3轮的如下逆相变循环(ITC)进行纯化：向所述上清液添加3M NaCl并加热至37℃，以引发所述ATBP从水性相向水不溶性团聚体相的相变。将所述溶液在14,000g和37℃下离心10-15min，并舍弃水性层(含有可溶性污染物)。然后将所述ATBP团聚体沉积物重悬浮在冷的pH 6-8的20mM TCEP水溶液中。将这种混合物冷却至4℃，然后在14,000g和4℃下离心10min，以除去任何不溶性污染物。通常，2-3轮的ITC产生显著纯的蛋白质(通过SDS-PAGE检测纯度>95％)。
纯度分析：ATBP的纯度在具有4-20％Tris梯度的Biorad Ready凝胶上通过SDS-PAGE进行分析。通过铜染色(0.5M)可视化所述凝胶。使用Detoxi-Gel内毒素去除凝胶(Thermo Scientific)作为基质并使用PBS作为洗脱剂，通过层析技术来去除所述纯化的ATBP的内毒素。
ATBP-小分子马来酰亚胺(ATBP-SMM)缀合物的合成：将25mg冷冻干燥的ATBP重悬浮在700μL pH 7.4的100mM磷酸盐缓冲液中，并向其添加100μL二甲基甲酰胺(DMF)。将所述溶液搅拌15min，并掺入另外100uL的100mM TCEP水溶液(pH 7.4)。最后，向所述ATBP溶液逐滴添加100μL每种马来酰亚胺衍生物在DMF中的50mM溶液，并使其混合3h。在缀合后，将所述ATBP-SMM缀合物通过PD-10凝胶过滤柱(GE Healthcare Life Sciences)进行纯化。将洗脱的级分用含20％乙腈的ddH2O稀释，并通过将所述混合物在10℃下在AmiconUltra-15离心过滤装置(MWCO：10KDa，Millipore)中以2,500rpm离心来进一步纯化。将所述ATBP-SMM缀合物用ddH2O清洗两次。将所述溶液在4℃下以13,000g离心10分钟，冷冻干燥，并储存在-20℃下。
SMM缀合率的测定：在纯化后，将2-3mg冷冻干燥的ATBP溶解在1mL ddH2O中。为了断裂未缀合的半胱氨酸残基之间任何预先存在的二硫键，将100μL所述缀合物与100μL固定化的TCEP还原凝胶(Thermo Fisher Scientific；Rockford,IL)在25℃温育1hr。使用包含的离心纯化柱将TCEP珠子与所述ATBP缀合物分离。然后将所述溶液拆分以用于两个平行测定中。为了确定ATBP浓度，在Victor3TM微孔板读板器(Perkin Elmer；Waltham,MA)上使用96孔二喹啉甲酸测定体系(Thermo Fisher Scientific)。将10μL ATBP溶液与200μL BCA工作试剂混合，在37℃温育30min，并与拟合到二阶多项式的ATBP标准曲线(100、50、25、10、5、0μM)进行比较，以便根据在560nm处的吸光度估算ATBP浓度。每种缀合物测量三份平行样。为了确定游离硫醇的浓度，开发了在Victor3TM微孔板读板器上，在405nm的吸光值处使用的96孔Ellman’s测定体系。将40μL ATBP溶液与200μL工作试剂(25μM Ellman’s试剂，在100mM pH 8.0的磷酸盐缓冲液，1mM EDTA中)混合，在25℃温育2h，并与缀合之前ATBP的标准曲线(100、50、25、10、5、0μM)进行比较。然后可以通过确定Ellman’s测定法标准曲线(假设每个ATBP具有8个游离的半胱氨酸残基)与在通过BCA测定法确定的浓度下Ellman’s测定法的样品测量值之间的比率，来计算每个样品中未反应的半胱氨酸残基。缀合率是半胱氨酸的数目(8/ATBP)与计算出的游离半胱氨酸的数目之间的差异。
静态和动态光散射：静态和动态光散射测量在ALV/CGS-3测角仪***(Langen,Germany)上进行，以确定ATBP和ATBP-SMM纳米粒子的Rh和Rg。对于ALV/CGS-3测角仪***来说，将ATBP和ATBP-SMM缀合物重悬浮在PBS中，并通过0.22μm Millex-GV滤器过滤到直径10mm的一次性硼硅酸盐玻璃管(Fisher)中。对于30°-150°之间增量为5°的角度，在22℃下同时测量SLS和DLS，其中在每个角度下的测量为3次15秒的运行。差示折射率(dn/dc)通过使用Abbemat500折射计(Anton Paar,Graz,Austria)在5种不同稀释度下确定折射率来定量。DLS数据通过使用HDRC软件包(Germany)将自相关函数拟合到双指数衰减进行分析。将Rh针对角度作图并外推到零散射角，以便消除形状因子的影响并观察真实的流体动力学半径。使用部分Zimm图来分析SLS测量，并使用ALV/动态和静态拟合及作图软件来确定所述纳米粒子的Rg和MW。通过用所述纳米粒子的MW除以所述ATBP或ATBP-SMM缀合物的MW，来计算Nagg。
程序升温比浊法：为了确定Tt，将ATBP-SMM缀合物或母体ATBP以25、50和100μM的ATBP浓度重悬浮在PBS中，并在温度受控的UV–vis分光光度计(Cary 300Bio；VarianInstruments,Palo Alto,CA)上通过以1℃/min的速率升温，在350nm处测量每个样品的光密度。Tt从浊度曲线的拐点确定。
冷冻TEM：冷冻TEM在杜克大学的共享材料及仪器平台(Duke University’sShared Materials Instrumentation Facility)(Durham,NC)处进行。将蕾丝多孔碳网(Ted Pella,Redding,CA)在PELCO EasiGlow清洁***(Ted Pella,Redding,CA)中辉光放电。将3μl的样品液滴沉积在所述网上，使用-3mm的偏移共3s形成印迹，并使用VitrobotMark III(FEI,Eindhoven,Netherlands)在液态乙烷中玻璃化。在玻璃化之前，将样品室维持在22℃和100％相对湿度下，以防止样品蒸发。将网转移到Gatan 626冷冻样品架(Gatan,Pleasanton,CA)，并在以80keV的低压条件运行的FEI Tecnai G2Twin TEM(FEI,Eindhoven,Netherlands)上成像。
CAC的确定：ATBP和ATBP-SMM缀合物的CAC通过使用芘的荧光光谱术来确定，所述芘被用作局部疏水性的探针。在不同ATBP浓度下测量第一荧光发射峰(I370-373)与第三峰(I381-384)的比率。使用所述曲线的拐点来确定CAC。
ATBP-GEM缀合物的合成：首先通过将GEM与N-ε-马来酰亚胺己酸(EMCA)反应来将GEM活化。将EMCA(0.04g，0.189mmol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCI)(0.036g，0.189mmol)分开溶解在无水二甲基甲酰胺(DMF)中并混合，同时在-20℃下搅拌30min。将GEM(0.025g，0.168mmol)溶解在无水DMF中，并添加到这种混合物。将所述反应混合物在4℃搅拌24h，然后过滤，并将DMF蒸发至干。将所述干燥的产物使用硅胶并使用4:1至3:1的丙酮：氯仿作为洗脱剂，利用柱层析进行纯化。保留因子(Rf)：在CHCl3/丙酮/EtOH＝5:4:1中为0.25。ESI-MS：457[M+H]。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ1.17(m,2H,11),1.48(m,4H,10,12),2.35(t,2H,9),3.34(t,2H,13),3.63(m,1H,5′A),3.85(m,1H,5′B),4.14(m,1H,3′),5.27(m,1H,4′),6.294(s,1H,1′),6.97(s,2H,16),7.22(d,1H,5),8.19(d,1H,6)。
在与活化的GEM反应之前，将ATBP重悬浮在反应缓冲液(0.1M磷酸钠，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 7.0)中。为了减少ATBP中任何自发形成的二硫化物，以相对于硫醇～5摩尔过量的量添加1mL100mM三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)(pH 7.4)。通过添加氯化钠(2.5M)触发ATBP的相变以聚集它，然后在25℃下以4,000rpm离心10min以分离所述ATBP，从而从所述混合物中除去未反应的TCEP。将在前一步骤中获得的ATBP沉积物重悬浮在～2mL反应缓冲液中，使用所述ATBP沉积物在其下溶解的条件。将所述纯化的GEM-EMCA重悬浮在～2mLDMF中，并缓慢添加到所述搅拌的ATBP溶液。添加1mL TCEP(100mM，pH 7.4)，并将所述混合物在20℃下在暗处搅拌16h。在反应后，通过在10℃下以13,000rpm离心10min，分离未反应的GEM-EMCA。通过将所述ATBP-GEM缀合物在含20％乙腈的PBS溶液中稀释，并将所述溶液在Amicon Ultra-15离心过滤装置(MWCO：10KDa，Millipore)中在10℃下以2,500rpm离心，将所述ATBP-GEM缀合物进一步纯化。将所述ATBP-GEM产物用NH4HCO3缓冲液(pH 7.4)清洗两次，然后冷冻干燥。
GEM缀合率的确定：使用装备有氮激光器(337nm)的VoyagerDE-Pro MALDI-MS(Applied Biosystems)仪器，通过ATBP-GEM缀合物和游离ATBP的MALDI-TOF-MS来测量GEM与ATBP的缀合率。在含有50％乙腈和0.1％三氟乙酸(TFA)的水性溶液中，使用芥子酸作为基质来制备样品。所述缀合率从ATBP-GEM缀合物相对于未修饰的ATBP的MW增加来计算。
ATBP-GEM缀合物的表征：通过DLS、SLS、冷冻TEM、AFM、程序升温比浊法和芘荧光测定法来表征ATBP-GEM。详细的程序与用于表征ATBP-SMM缀合物的程序一致。在1、2.5、5、10、25、50和100μM的ATBP浓度下的PBS中测量ATBP-GEM缀合物的Tt。
原子力显微术(AFM)：通过将样品溶液的液滴(～0.2mg/ml)置于新鲜切割的云母表面上并温育15分钟来制备用于AFM成像的样品。然后，将所述样品用Milli-Q H2O轻柔漂洗，并在N2气流下干燥。使用MultiMode AFM(Bruker)，在环境条件下使用轻敲模式来获取所有AFM图像。将轻敲模式硅针臂用于所有AFM图像(kF＝40N/m，fres＝300kHz)。
结果
ATBP-小分子马来酰亚胺(SMM)缀合物的合成：所述ATBP在摇瓶中培养的大肠杆菌中以高产率过表达，并通过逆相变循环(ITC)这种非层析蛋白质纯化技术从细菌裂解液中纯化。几轮ITC产生>100mg l-1的纯ATBP。通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱术(MALDI-TOF-MS)测量的所述ATBP的分子量为64681Da，其接近64816Da的理论质量(图1(A)、图5(A)和表1)。SDS-PAGE证实了通过ITC纯化的所述ATBP是纯且均匀的产物(图6)。
接下来，通过将8种不同的亲水性小分子的马来酰亚胺衍生物共价缀合到所述ATBP，对ATBP的(CGG)8区段进行修饰。选择这些模型化合物时考虑了两种因素：首先，它们跨越一定的亲水性范围，正如由它们的LogD所反映的，其次，它们都含有反应性马来酰亚胺组成部分，以使它们能够通过Michael加成反应共价缀合到ATBP的Cys残基。图1(B)显示了根据在pH 7.4下的LogD值排列的模型小分子马来酰亚胺(SMM)衍生物的结构，其中较大的值指示较大的疏水性。所述logD值使用ACD/Labs PhysChem Suite来计算。所述ATBP-SMM缀合物中每个ATBP附连有～6-7个小分子，正如通过Ellmans’试剂测定法所测定的(表1)。
表1：
1Tt通过程序升温比浊法测量。
2Rh通过DLS确定；平均值±SD(n＝3)。
3Rg通过SLS确定；平均值±SD(n＝3)。
4聚集数目(Nagg)：纳米粒子中ATBP-SMM缀合物分子的数目，通过SLS确定。
5CAC通过芘测定法确定。
6每个ATBP缀合的SMM的数目使用Ellman’s试剂来测量。
ATBP-SMM缀合物的表征。接下来，通过动态光散射(DLS)、静态光散射(SLS)和冷冻透射电子显微术(冷冻TEM)表征未修饰的ATBP和ATBP-SMM缀合物的结构，并通过程序升温比浊法表征它们的热学行为，通过芘荧光测定法表征它们的热力学稳定性。所述ATBP-SMM胶束在它们的Rh下表现出中度的角度依赖性。在整个组中，所述ATBP-SMM缀合物的Rh在大小方面显示出三倍的变化性，范围从40至123nm(表1和图5-13)。尽管SMM4-SMM8缀合物具有在40-60nm范围内的Rh，接近于为母体ATBP所观察到的50nm的Rh，但亲水性更高的缀合物即SMM1-SMM4具有在80-120nm范围内的Rh。显然，SMM的缀合不废除ATBP的自组装，但特定SMM及其亲水性似乎对形成的纳米粒子的总尺寸具有一定影响。然而，在纳米粒子的Rh与每个ATBP分子缀合的SMM的数目之间没有观察到相关性。
接下来，通过SLS分析每种ATBP-SMM缀合物以确定它们的回转半径(Rg)。所述ATBP-SMM缀合物具有与它们的Rh平行的40至140nm范围内的Rg值(表1和图5-13)。还通过部分Zimm图的分析来计算聚集数目(Nagg，每个纳米粒子的ATBP分子的数目)，并从DLS和SLS数据计算形状因子(ρ＝Rg/Rh)。所述形状因子的范围为0.89至1(表1、图2和图7-13)；该范围表明在这些纳米粒子的形态上可能不存在显著差异。尽管不可能通过光散***确确定纳米粒子的形态，但0.89至1的形状因子与具有相对低的宽高比的多分散杆相符。对于不同缀合物来说，聚集数目(Nagg)也在60至220之间显著变化，但在纳米粒子的Nagg与SMM的logD之间不存在相关性(表1)。
为了直接观察纳米粒子的形态，将所有SMM-ATBP缀合物通过冷冻TEM进行成像。ATBP-SMM胶束难以通过冷冻TEM来观察，这是由于它们的尺寸小并且对比度低，因为多肽是高度水合的并且电子密度仅仅比水略高。因此，只有ATBP-SMM纳米粒子的富含酪氨酸的核心可以通过冷冻TEM成像。此外，所述疏水性核心也被水合，尽管程度比冠低，这进一步降低了总体对比度。考虑到这些限制，选择80keV电压来最大化对比度，以便成像纳米尺度的结构。尽管存在这些限制，冷冻TEM显示所有ATBP-SMM缀合物自组装成纳米粒子，其均匀分布在整个冰层中(图2(C)、表1和图5-13)。与光散射数据一致，所述缀合物主要由圆柱状纳米粒子构成，这与通过光散射测量到的形状因子相符。对于所有8种模型化合物来说，来自于所有这些技术的合并的证据表明，6–7个拷贝的logD小于1.5的亲水性化合物的附连(图1(B))不破坏所述ATBP自组装成杆状胶束，其中推测所缀合的分子坐落于疏水性核心附近(图1(C))。
接下来，通过程序升温比浊法对所述ATBP-SMM缀合物进行表征。在所述SMM缀合后，ATBP的相变行为不显著改变(图2(D)、表1和图5-13)。与未修饰的ATBP相似，ATBP-SMM也表现出特征性的相变温度(Tt)，低于所述温度时它们在水性溶剂中形成单一的稳定悬浮的纳米粒子相，并且高于所述温度时它们发生相分离成为由不溶性的富含ATB的相和富含溶剂的相构成的两个相。与ELP单聚体的相转变不同，ATBP-SMM缀合物的相转变从可溶性纳米粒子相发展到微米尺寸的聚集体，并且它们的Tt对ATBP浓度显示出非常弱的依赖性。所有自组装的ATBP-SMM缀合物纳米粒子在它们的Tt与ATBP的溶液浓度之间表现出相似的微弱关系这一事实，可能表明它们的相行为受到纳米粒子内高且不变的局部ATBP浓度控制，而不受溶液中ATBP的总浓度控制。
接下来，通过使用芘作为探针的荧光光谱术确定母体ATBP和ATBP-SMM缀合物的临界聚集浓度(CAC)。当ATBP的浓度降低时，370-373nm峰与381-384nm峰的荧光强度比(I1/I3)随着ATBP浓度的增加呈S形增加，反映出纳米粒子的崩解和芘从纳米粒子的亲脂性核心释放到水性环境中。TBAP-SMM缀合物的CAC在1.5-8.5μM之间，而未修饰的ATBP的CAC为约3.6μM(图2(E)和图5-13)。除了几个异常值之外，亲水性更高、即具有负logD的SMM的缀合，产生与母体ATBP相比具有更大CAC的胶束，而具有正logD值的ATBP-SMM缀合物与未修饰的ATBP相比具有更低的CAC，这与所述自组装纳米粒子的热力学稳定性可以使用螯合在纳米粒子核心中的SMM的疏水性来增减的见解一致。
ATBP-GEM缀合物的合成：为了进一步探究ATBP递送化学治疗剂的用途，选择亲水性小分子用于通过异双官能连接物缀合到ATBP，其中所述连接物的一个末端附连到ATBP，另一个末端附连到药物上的反应性组成部分。选择吉西他滨(GEM)作为所述药物，因为它是高度水溶性的，在pH 7.4下具有-2.2的LogD值，并且所述马来酰亚胺衍生物的该值为0.43±0.82，并且它作为化学治疗剂被用于治疗多种实体肿瘤，包括胰腺癌、膀胱癌、NSCLC、乳腺癌和卵巢癌。简单来说，首先将GEM用n-ε-马来酰亚胺己酸(EMCA)活化以引入末端的马来酰亚胺(反应方案1)，并将活化的GEM共价缀合到ATBP的Cys(图1(A)和(C))。所述纯化的ATBP-GEM缀合物(图3(A))含有每个ATBP～4个GEM分子，如通过MALDI-TOF MS(图3(B)和表3)从所述缀合物与母体ATBP之间的MW变化(表2)所计算。
反应方案1：
ATBP-GEM缀合物的表征：为了证实GEM的缀合不扰乱ATBP自组装成纳米粒子，通过DLS、SLS、程序升温比浊法和荧光光谱术对所述ATBP-GEM缀合物进行表征。DLS显示所述ATBP-GEM缀合物与其他ATBP-SMM缀合物的纳米粒子的尺寸相近(图3(C)和表2)。在37℃下PBS中的ATBP-GEM缀合物的DLS显示出纳米粒子具有约56nm的Rh(图3(D)和表2)。源自于SLS的部分Zimm图显示ATBP-GEM缀合物的Rg为约57nm，并且所述纳米粒子的聚集数目为约109(图3(E)和表2)。实验确定的被计算为Rg/Rh的形状因子(ρ)约为1.02，这接近圆柱状胶束的1的理论值。所述ATBP-GEM纳米粒子的形状和杆状结构通过冷冻TEM得以确认(图3(F)和图14)。通过冷冻TEM测定的所述圆柱状纳米粒子的平均长度(LTEM)为87±14nm(n＝20)，平均宽度(DTEM)为18.5±4.5nm。蠕虫状胶束形态在环境条件下通过原子力显微术(AFM)被进一步证实(图15)。AFM图像显示出具有杆或蠕虫状形态的不同粒子。所述蠕虫状胶束的观察到的宽度远大于它们的高度，这可能归因于在样品制备期间胶束在云母表面上的铺展，并且也由于AFM固有的尖端引起的拓宽效应。接下来，测量ATBP-GEM缀合物的Tt并与未修饰的ATBP进行比较。所述ATBP-GEM缀合物的Tt为42℃，而所述未修饰的ATBP的Tt为47℃(图3(G))。接下来，测量所述ATBP-GEM缀合物的Tt随小鼠血清中ATBP浓度的变化，以探究ATBP-GEM缀合物在i.v.注射后在生理环境中是否仍自组装成纳米粒子(图16(A))。在血清中，所述ATBP-GEM缀合物的Tt独立于ATBP浓度(图16(A))。这个结果证实了所述ATBP-GEM缀合物在血清中是纳米粒子，因为基于ELP的纳米粒子、包括由所述ATBP-GEM缀合物形成的纳米粒子具有几乎独立于浓度的Tt，而ELP单聚体对ELP浓度表现出陡峭的反对数依赖性。通过芘荧光测定法测量的ATBP–GEM纳米粒子的CAC为6.4μM(图3(H))。还测量了所述ATBP-GEM缀合物的Tt在1-10μM的浓度范围内随ATBP浓度的变化，以探究ATBP-GEM缀合物在稀释后是否仍自组装成纳米粒子(图16(B))。在1-10μM的浓度范围内，发现所述ATBP-GEM缀合物的Tt与25和50μM浓度的溶液相似，并且Tt独立于ATBP浓度(图16(B))。这个结果表明所述ATBP-GEM缀合物在至少1-10μM的浓度范围内也是稳定的。
表2：ATBP-GEM缀合物的物理化学性质
1从MALDI-MS计算的每个ATBP的药物分子的数目。
2在37℃下在PBS中通过DLS确定的Rh。平均值±SD(n＝3)。
3Rg、Nagg、ρ、dn/dc：通过SLS确定。
4CAC通过芘荧光测定法测量。
实施例2
ATBP缀合物的体外表征
方法
体外细胞毒性：HCT116和Colo205人类结肠癌细胞获自Duke CellCultureFacility，并在含有增补有10％胎牛血清(FBS)的Eagle最低必需培养基(MEME)的完全培养基中培养。将细胞维持在37℃和5％CO2下并且每2-3天传代。体外细胞毒性通过比色测定法如下测量：将每100μL培养基1-5×103个HCT116或Colo205细胞接种在BDFalconTM96孔细胞培养板(BD；Franklin Lakes,NJ)上，并允许附着16-18h。然后舍弃培养基并补充100μL含有GEM或ATBP-GEM缀合物的完全培养基，并在37℃下温育72h。向每个孔添加20μLCellTiter96AQueousTM(Promega；Madison,WI)3-(4,5,-二甲基2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑(MTS)溶液，并在37℃下温育。在温育2h后，使用Victor3微孔板读板器(Perkin Elmer；Waltham,MA)在490nm处测量溶液的吸光度。为了确定IC50，将数据拟合到下述方程：活力＝1/(1+(ATBP-GEM/IC50)p)，其中ATBP-GEM是孔中的GEM当量浓度，IC50是杀死50％的细胞所需的药物的量，p表示S形曲线的斜率。
ATBP-GEM缀合物的荧光标记：将所述ATBP-GEM缀合物(45mg，0.678μmole)重悬浮在～0.5mL反应缓冲液(0.1M NaPO4，1mMEDTA，pH 7.4)中。将花菁5-NHS酯(Lumiprobe，USA)(3.3mg，5.4μmole)重悬浮在～100μL DMF中，然后缓慢转移到搅拌中的ATBP-GEM溶液并在20℃下在暗处搅拌4h。在反应后，在PD-10柱(GE Healthcare,Sweden)上通过凝胶过滤分离未反应的花菁5-NHS酯。将来自于PD-10柱的洗脱物在含有20％乙腈的PBS中稀释，并将所述混合物在Amicon Ultra-15离心过滤装置(MWCO：10KDa，Millipore)中，在10℃下以2,500rpm离心。将所述Cy5-ATBP-GEM缀合物用NH4HCO3缓冲液(pH 7.4)洗涤两次，然后冷冻干燥。使用高效液相色谱(HPLC)确定Cy5标记的ATBP-GEM缀合物的纯度(图15)，其中在LC10HPLC(Shimadzu Scientific Instruments,Columbia,MD)中使用Shodex OHPak SB-804柱(New York,NY)和0.5mL min-1的PBS：乙腈[70:30]的等度流速。
Cy-5标记的ATBP-GEM胶束的制备：为了制备混合胶束，将1％(w/w)cy5标记的ATBP-GEM缀合物与ATBP-GEM缀合物在30％乙腈和70％PBS中混合。将所述溶液涡旋振荡，并通过重复的数轮超滤(Amicon Ultra-15离心过滤套件)将缓冲液替换为PBS。
免疫荧光显微术：将每孔1X 104个细胞接种在8孔分室盖玻片(ElectronMicroscopy Sciences；Hatfield,PA)上过夜。将细胞用Cy5标记的ATBP-GEM缀合物处理4h，用PBS清洗，然后用含4％聚甲醛的PBS在室温固定15min。将所述固定的细胞用Hank’s平衡盐溶液(HBSS)中的2μM Hoechst 33342(Invitrogen；Grand Island,NY)和CellMaskTM绿色细胞质膜染色剂(1X)染色10min。将细胞用PBS清洗3次，然后立即在Nikon TE2000-U倒置荧光显微镜上使用60x1.25NA油浸物镜成像。
结果
体外抗癌活性：选择两种人类结肠癌细胞系HCT116和Colo 205来评估ATBP-GEM缀合物的体外细胞毒性，因为GEM被用于人类结肠癌的治疗。在用ATBP-GEM缀合物处理72h后，HCT116和Colo 205细胞的生长被显著抑制(图4(A)和(B))。被描述为杀死50％的细胞所需的GEM剂量或GEM当量(对于ATBP-GEM纳米粒子来说)的IC50，对于HCT-116和Colo 205细胞来说分别为对于ATBP-GEM为约94nM和约1.44μM，对于GEM为约4.1nM和约46.4nM(表3)。这些结果证实了ATBP-GEM纳米粒子阻止HCT116和Colo 205细胞两者的体外生长。
表3：在HCT-116和Colo 205细胞系中ATBP-GEM缀合物和游离GEM的IC50
IC<sub>50</sub>(nM) HCT-116细胞 Colo 205细胞
游离GEM 4.1 46.4
ATBP-GEM 94 1440
体外细胞摄取研究：接下来，评估了所述ATBP-GEM纳米粒子被HCT-116和Colo205细胞系的摄取。将细胞用花菁5(cy5)标记的ATBP-GEM纳米粒子处理。在处理4h后，将细胞用4％甲醛固定，并用Hoechst 33342和CellMaskTM绿色细胞质膜染料染色。倒置荧光显微术图像显示出cy5标记的ATBP-GEM纳米粒子在两种细胞系中的积累，而在未处理的细胞中没有观察到红色荧光(图18)。所述结果揭示出在两种细胞系中都观察到ATBP-GEM纳米粒子的显著细胞摄取。
实施例3
ATBP缀合物的体内表征
方法
药代动力学和体内肿瘤摄取：为了测量药代动力学(PK)，将Cy5标记的ATBP-GEM缀合物通过尾静脉静脉内输注到雄性裸小鼠(119.6μg cy5equiv.kg-1BW)中。在输注后40s、30min、1、2、4、8、24和48h时，从尾静脉抽取10μL血液，并在90μL含有终浓度为1,000U mL-1的肝素的PBS中稀释。所有荧光测量在Molecular Dynamics Typhoon 9410分子成像仪(GEHealthcare,USA)上进行。为了确定药代动力学参数的估算值和置信区间，使用WinNonlin软件将数据集拟合到非房室药代动力学模型。对血浆cy5浓度(n＝5)进行拟合以确定初始分布体积(VZ)、消除半衰期(t1/2)和稳态下的分布体积(Vss)(表4)。从这些数据和注射剂量D计算其他药代动力学参数，包括血浆清除率。上述拟合的单位、估算值和置信区间都呈现在表4中。
为了定量GEM和ATBP-GEM缀合物在肿瘤中的积累，将cy5-GEM或cy5标记的ATBPP-GEM缀合物通过尾静脉静脉内输注到雄性裸小鼠(119.6μg cy5equiv.kg-1BW)中。在注射后1、6或24h，获取肿瘤。将组织称重，悬浮在0.1-0.5mL酸化异丙醇中，并使用直径2mm的二氧化锆珠子和MiniBeadbeater-1TM(Biospec；Bartlesville,OK)以每分钟5,000拍的频率匀浆60s并离心(13,000RPM，10min，4℃)。取出上清液并如对药代动力学分析所述测定荧光。肿瘤药物浓度使用通过GraphPad Prism 6软件确定的ANOVA和随后的事后检验(TukeyHSD)进行比较。
剂量递增和肿瘤消退：将带有皮下HCT116肿瘤的雄性裸小鼠(6-8周龄)在所述小鼠具有75-100mm3的肿瘤体积时进行治疗。所有治疗在总体积为500μL的PBS中通过尾静脉输注(50μL/min)来给药。使用ATBP-GEM缀合物，使用5、10、15、20和25mg.kg-1BW(BW：体重)的游离药物当量来进行剂量递增。
对于消退研究来说，将带有皮下移植的HCT116肿瘤的小鼠在第0、2和4天用PBS、25mg.kg-1BW游离GEM或25mg.kg-1BW的ATBP-GEM(药物当量)治疗三次。所述PBS对照或药物通过500μL的尾静脉输注(50μL/min)来给药。每周3-4次确定肿瘤尺寸和BW，并使用下述公式计算肿瘤体积：体积[mm3]＝长度x宽度x宽度x1/2。
监测小鼠的BW并在BW损失超过15％时或它们的肿瘤体积大于1000mm3时将小鼠安乐死。杜克大学(Duke University)的IACUC将15％的体重损失定义为严重病态，人道死亡终点。在具有肿瘤的小鼠中确定最大耐受剂量(MTD)。使用Kaplan-Meier分析来比较累积存活率，并且Sidak检验、Tukey检验、Wilcoxon检验使用GraphPad Prism6软件来进行。
结果
ATBP-GEM缀合物的PK和肿瘤摄取的测定：为了评估ATBP-GEM缀合物的血浆半衰期，将cy5标记的ATBP-GEM纳米粒子静脉内输注，并确定血浆中的药物浓度随给药后时间的变化(图4(C))。药代动力学参数使用非房室药代动力学方法，使用WinNonlin软件来确定，得到的ATBP-GEM纳米粒子的终末半衰期为12.8±2.2h，血浆AUC为32.48±4.8μgmL-1h(表4)。作为比较，在裸小鼠中报道的游离GEM的终末半衰期为204min。这些数据清楚地证实ATBP-GEM缀合物与游离药物相比递送更长至少4倍的血浆终末半衰期，这对于通过增强渗透和滞留(EPR)效应增加实体肿瘤的摄取来说是重要的。
还测定了在ATBP-GEM纳米粒子和游离GEM的静脉内注射后，GEM在肿瘤中的积累。向小鼠给药cy5-GEM和cy5-ATBP-GEM纳米粒子，并在1h、6h和24h后收集被治疗小鼠的组织样品(图19)。值得注意的是，在给药后24h，与相同剂量下的游离药物相比，ATBP-GEM显示出肿瘤中药物浓度的10倍提高(图4(D)；双向ANOVA和Sidak’s检验；p＝0.0001)。
表4：ATBP-GEM纳米粒子的药代动力学参数
1理论Cmax：119.6μg/kg＝>2.99μg/mL血浆(接近于实验获得的Cmax＝2.97μg/mL)。
2剂量依赖性参数(CL和Vss)是“每kg体重”。
体内抗癌活性：为了评估和比较ATBP–GEM纳米粒子和游离GEM的肿瘤消退效能，在剂量递增实验中注射ATBP-GEM以评估它的最大耐受剂量(MTD)。ATBP–GEM的MTD为至少25mgGEMEquiv.kg-1.BW(图19)。ATBP-GEM纳米粒子的真实MTD可能大于25mg.kg-1，这是因为由于制剂的粘度和可以给药到小鼠的溶液的体积的限制，不能给药高于25mg.kg-1的剂量。
接下来，在皮下HCT-116异种移植物模型中测定了ATBP-GEM的肿瘤消退效能。将具有HCT-116肿瘤的小鼠在第0、2和4天用PBS、GEM(25mg.kg-1)或ATBP–GEM纳米粒子(25mg.kg-1的GEM当量)静脉内输注3次(图4(E))。在治疗后12天，ATBP–GEM治疗的平均肿瘤体积为82mm3(n＝6)，游离药物治疗的小鼠为343mm3(n＝6)(Tukey；p＝0.0001)，PBS治疗的小鼠为832mm3(n＝6)(Tukey；p＝0.0001)。在相同的药物剂量下，在与提高动物存活率相关的减小肿瘤体积方面，ATBP–GEM制剂的性能优于游离药物(p<0.0001)和PBS(p<0.0001)(图4(F))。
接受PBS的小鼠(n＝6)具有14天的中值存活时间，使用游离GEM的治疗(n＝6)将存活期增加到21天(Kaplan–Meier，对数秩检验，p<0.0001)。使用ATBP-GEM的治疗将存活期进一步提高到至少30天(Kaplan–Meier，对数秩检验，p<0.0001)。在整个治疗期间也监测体重，以鉴定游离GEM和ATBP-GEM缀合物的相对毒性。在研究期间，所有治疗都耐受良好，并且体重损失良好地保持低于作为显著***毒性的代用指标的15％的截止值(图20)。
所述ATBP-GEM缀合物纳米粒子与游离药物相比具有明显更长的血浆半衰期和增加的肿瘤积累。此外，所述ATBP-GEM缀合物纳米粒子与相同剂量的游离药物相比在HCT-116肿瘤的鼠类模型中显示出明显更好的抗肿瘤效能。所述抗肿瘤效应也反映在ATBP-GEM纳米粒子治疗的动物与使用游离药物的治疗相比中值存活时间的显著改进。本研究第一次演示了可用于递送大量亲水性化学治疗剂的高度可溶性、热响应性自组装多肽纳米粒子的设计。

Claims (27)

1.一种组合物，其包含自组装多肽的聚集体，其中自组装多肽包含：
(a)第一氨基酸序列(X1GVPG)x(SEQ ID NO：1)，其中X1是氨基酸并且x是20至240；
(b)第二氨基酸序列(X2Gm)y(SEQ ID NO：2)，其中X2是Y、F或W，m是0至3，并且y是1至50；
(c)第三氨基酸序列(CGG)z(SEQ ID NO：3)，其中z大于1；和
(d)通过半胱氨酸基团附连到所述第三氨基酸序列的至少一个分子，其中所述分子在7.4的pH下具有小于或等于1.5的辛醇-水分配系数(logD)。
2.权利要求1的组合物，其中所述分子是化学治疗剂或成像剂。
3.权利要求1或2的组合物，其中所述分子是吉西他滨。
4.权利要求1-3任一项的组合物，其中约2至约15个分子被附连到所述第三氨基酸序列。
5.权利要求1-4任一项的组合物，其中所述分子通过硫醇基团附连到所述第三氨基酸序列。
6.权利要求1-5任一项的组合物，其中所述第一氨基酸序列是(X1GVPG)m(SEQ ID NO：3)，并且其中m是120至200。
7.权利要求1-6任一项的组合物，其中所述第二氨基酸序列是(X2G)n(SEQ ID NO：4)，并且其中n是4至8。
8.权利要求1-7任一项的组合物，其中所述第三氨基酸序列是(CGG)p(SEQ ID NO：5)，并且其中p是4至12。
9.权利要求1-8任一项的组合物，其中X1是A。
10.权利要求1-9任一项的组合物，其中X2是Y。
11.权利要求1-10任一项的组合物，其中所述第一氨基酸序列是(AGVPG)160(SEQ IDNO：6)。
12.权利要求1-11任一项的组合物，其中所述第二氨基酸序列是(YG)6(SEQ ID NO：7)。
13.权利要求1-12任一项的组合物，其中所述第三氨基酸序列是(CGG)8(SEQ ID NO：8)。
14.权利要求1-13任一项的组合物，其中每个自组装多肽各自具有约20kDa至约300kDa的分子量。
15.权利要求1-14任一项的组合物，其中所述自组装多肽的聚集体是纳米粒子。
16.权利要求15的组合物，其中所述分子位于所述纳米粒子的核心中。
17.权利要求15或16的组合物，其中所述纳米粒子具有约20nm至约200nm的平均流体动力学半径。
18.权利要求15-17任一项的组合物，其中所述纳米粒子是杆状或球形的。
19.权利要求15-18任一项的组合物，其中所述纳米粒子包含每个粒子约50至约1000个自组装多肽。
20.权利要求1-19任一项的组合物，其还包含可药用载体。
21.一种杀死多个癌细胞的方法，所述方法包括将多个癌细胞与权利要求1-20任一项的组合物接触。
22.权利要求21的方法，其中所述多个癌细胞在人类或狗中。
23.权利要求21或22的方法，其中所述多个癌细胞在体外。
24.一种在对象中治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述对象给药权利要求1-20任一项的组合物。
25.权利要求24的方法，其中所述疾病或障碍是癌症。
26.权利要求24或25的方法，其中所述对象是人类或狗。
27.权利要求21-26任一项的方法，其中所述癌症包括实体肿瘤。
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