ES2907125T3 - Preparación de HGF adecuada para el tratamiento de trastornos neurológicos - Google Patents

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Abstract

Una preparación del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) que se obtiene mediante la liofilización de una solución acuosa que comprende una proteína del HGF como ingrediente activo y lactosa, glicina, cloruro de sodio, un agente tamponador del pH y un tensioactivo como ingredientes adicionales, en donde el contenido en lactosa está en el intervalo de 0,1 a 50 partes en peso con respecto a 1 parte en peso de HGF.

Description

DESCRIPCIÓN
Preparación de HGF adecuada para el tratamiento de trastornos neurológicos
Campo técnico
La presente invención se refiere a una preparación que contiene una proteína del factor de crecimiento de hepatocitos (en lo sucesivo puede abreviarse como "HGF"). Más particularmente, la presente invención se refiere a una preparación que contiene una proteína del HGF en forma de preparación liofilizada, inyección o similar. La presente invención también se refiere a una preparación que contiene una proteína de1HGF en forma de preparación liofilizada, inyección o similar, siendo la preparación adecuada para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central.
Técnica anterior
El HGF se descubrió como una proteína biológicamente activa que tiene actividad promotora del crecimiento para hepatocitos maduros (por ejemplo, véase la Bibliografía no de patentes 1). Estudios posteriores han revelado que la proteína del HGF actúa no solo sobre los hepatocitos sino también sobre diversas células epiteliales, células endoteliales vasculares, etc., estando implicada en la reparación y regeneración de tejidos y órganos dañados (véase la Bibliografía no de patentes 2). La proteína del HGF se puede producir en masa como una proteína recombinante mediante técnicas de bioingeniería (por ejemplo, véase la Bibliografía no de patentes 3), y se espera que una proteína del HGF recombinante se use como agente terapéutico no solo para la hepatitis y la cirrosis hepática, sino también para la nefropatía, heridas, etc. (véase la Bibliografía no de patentes 2).
Además, una gran cantidad de estudios recientes sobre análisis de la expresión génica y análisis funcional de los genes mediante enfoques de ratones con genes desactivados/activados, etc., han revelado que la proteína de1HGF también tiene el efecto de promover la supervivencia de las células neuronales y el crecimiento de neuritas y es un factor neurotrófico importante (véase la Bibliografía no de patentes 4 y 5).
La proteína del HGF tiene actividad neurotrófica sobre células neuronales tales como neuronas del hipocampo, neuronas dopaminérgicas, células granulares del cerebelo, neuronas sensoriales y neuronas motoras (véase la Bibliografía no de patentes 6). En particular, la proteína del HGF tiene un fuerte efecto que favorece la supervivencia de las neuronas motoras (véase la Bibliografía no de patentes 7). Ese efecto es comparable al de un factor neurotrófico obtenido a partir de una línea de células gliales (GDNF), un factor conocido por favorecer más fuertemente la supervivencia de las neuronas motoras.
Basándose en esa actividad neurotrófica, se ha informado que la proteína de1HGF es aplicable como agente terapéutico para diversos trastornos neurológicos, incluyendo la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la lesión de la médula espinal (véase la Bibliografía de patentes 1 a 3 y la Bibliografía no de patentes 5, 8 y 9).
En general, los productos farmacéuticos proteicos se inyectan por vía intravenosa, subcutánea o intramuscular. Sin embargo, las proteínas administradas a través de una ruta de ese tipo difícilmente pueden transferirse a los tejidos del sistema nervioso central a través de la barrera hematoencefálica entre los tejidos cerebrales y los vasos sanguíneos, como se conoce comúnmente. Por lo tanto, cuando la proteína del HGF se usa para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central, una administración intratecal o intracerebroventricular, que permite una administración directa de la proteína del HGF en los tejidos del sistema nervioso central, se considera que es eficaz, en lugar de una inyección intravenosa, subcutánea o intramuscular, que es una ruta utilizada para el tratamiento de enfermedades comunes de los órganos (véase la Bibliografía no de patentes 8 y 9). Una administración intratecal o intracerebroventricular también se usa en el tratamiento de tumores cerebrales con fármacos anticancerosos. Además, una administración directa de la proteína del HGF en el parénquima cerebral o espinal es otra vía de administración posible para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central.
Para la producción de productos farmacéuticos con la proteína del HGF, se requiere el desarrollo de preparaciones estabilizadas de la proteína del HGF. La Bibliografía de patentes 4 describe una preparación de proteína de1HGF que es una solución acuosa que contiene una proteína del HGF (también llamada TCF-II) más un agente estabilizador tal como albúmina, suero humano, gelatina, sorbitol, manitol y xilitol (véase la Bibliografía de patentes 4). Sin embargo, esa solución acuosa de HGF tiene algunas desventajas. Una es que la solución acuosa de HGF se vuelve gradualmente turbia y se gelatiniza durante el almacenamiento debido a la agregación de las moléculas de proteínas del HGF. Otra es que la solución acuosa de HGF tiene poca estabilidad fisicoquímica, por ejemplo, es propensa a la formación de polímeros a base de proteínas del HGF (formación de polímeros de HGF), lo que da como resultado una reducción de la actividad biológica del HGF.
Con el fin de proporcionar una solución para evitar esa formación de polímeros, por ejemplo, la Bibliografía de patentes 5 describe una preparación de HGF liofilizada que contiene HGF más un agente estabilizador tal como arginina, lisina, histidina, glutamina, prolina, ácido glutámico y ácido aspártico (véase la Bibliografía de patentes 5). La Bibliografía de patentes 6 describe una preparación de HGF liofilizada que contiene HGF más un agente estabilizador tal como glicina, alanina, sorbitol, manitol y sulfato de dextrano (véase la Bibliografía de patentes 6). La Bibliografía de patentes 7 describe una preparación de HGF liofilizada que contiene HGF más sacarosa purificada, alanina y similares (véase la Bibliografía de patentes 7).
La Bibliografía de patentes 8 describe una preparación liofilizada que comprende HGF, glicina, cloruro de sodio, tampón citrato y polisorbato 80.
Se supone que las inyecciones preparadas a partir de esas preparaciones son seguras para el uso en una administración intravenosa, subcutánea o intramuscular, que es una vía utilizada para el tratamiento de enfermedades comunes de los órganos. Sin embargo, por ejemplo, en el caso de una administración intratecal o intracerebroventricular, dado que la proteína del HGF se administra directamente en el sistema nervioso central, se debe haber confirmado que todos los ingredientes de la preparación de HGF, incluyendo diversos aditivos, son totalmente seguros para el sistema nervioso central. Hasta el momento, no hay una descripción de preparaciones de HGF que hayan sido confirmadas públicamente como seguras para uso en la administración intratecal o intracerebroventricular o para la administración en el parénquima espinal o cerebral.
Existe una necesidad de preparaciones de HGF muy seguras que puedan usarse para una administración intratecal o intracerebroventricular o para una administración en el parénquima espinal o cerebral, para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central.
Listado de citas
Bibliografía de patentes
Bibliografía de patentes 1: documento WO 2002/22162 (Publicación de EE.UU. n° 2003/0176347)
Bibliografía de patentes 2: documento WO 2007/122976 (Patente de EE.UU. n° 8.575.099)
Bibliografía de patentes 3: documento WO 2008/105507 (Patente de EE.UU. n° 8.518.880)
Bibliografía de patentes 4: documento WO 90/10651 (Patente EP n° 0462277)
Bibliografía de patentes 5: documento WO 00/72873 (Patente EP n° 1180368)
Bibliografía de patentes 6: documento JP-A 9-25241 (Patente de EE.UU. n° 7.173.008)
Bibliografía de patentes 7: documento WO 2008/102849 (Patente de EE.UU. n° 8.461.112)
Bibliografía de patentes 8: documento WO 97/02832 (Solicitud EP n° 0838221)
Bibliografía no de patentes
Bibliografía no de patentes 1: T. Nakamura et al., Biochem. Biografía. Res. Comun., vol. 122, pág. 1450, 1984
Bibliografía no de patentes 2: T. Nakamura et al., J. Gastroenterol. Hepatol., vol. 26, suplemento 1, págs. 188-202 (2011) Bibliografía no de patentes 3: Jeong Soo Park et al., Protein Expr. Purif., vol. 70, págs. 231 -235 (2010)
Bibliografía no de patentes 4: Flavio Maina et al., Nat. Neurosci., vol. 2, págs. 213-217 (1999)
Bibliografía no de patentes 5: Funakoshi H et al., Current Signal Transduction Therapy vol. 6, págs. 156-167 (2011) Bibliografía no de patentes 6: Honda, S. et al., Brain Res. Mol. Brain Res. vol. 32, págs. 197-210 (1995)
Bibliografía no de patentes 7: Allen Ebens et al., Neuron, vol. 17, págs. 1157-1172 (1996)
Bibliografía no de patentes 8: Ishigaki A et al., J Neuropathol Exp Neurol., vol. 66, págs. 1037-1044 (2007)
Bibliografía no de patentes 9: Kitamura K et al., PLoS One., vol. 6: e27706 (2011)
Compendio de la invención
Problema técnico
Un objeto de la presente invención es proporcionar una preparación de HGF en forma de inyección o similar que sea muy segura para los nervios centrales y pueda usarse para una administración intratecal o intracerebroventricular o para una administración en el parénquima espinal o cerebral, para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central. En general, también se requiere que la preparación de HGF sea muy estable para que pueda usarse prácticamente como un producto farmacéutico. Por consiguiente, otro objeto de la presente invención es proporcionar una preparación de HGF muy estable en forma de inyección, preparación liofilizada o similar.
Solución del problema
Los presentes inventores han llevado a cabo una intensa investigación para conseguir los objetos mencionados anteriormente. Como resultado, los presentes inventores han encontrado que la formación de polímeros a base de proteínas del HGF se evita mediante la adición de lactosa, glicina, cloruro de sodio, un agente tamponador del pH y un tensioactivo, a una proteína del HGF. Los presentes inventores también han descubierto que una solución de HGF que contiene esos ingredientes puede usarse como una inyección de HGF estable y que la liofilización de la solución de HGF produce una preparación de HGF liofilizada estable. Además, se ha descubierto que una inyección de HGF que contiene los ingredientes anteriores es mucho menos tóxica para el sistema nervioso central y muy segura para el sistema nervioso, tal como los nervios centrales.
Basándose en esos descubrimientos, los presentes inventores han llevado a cabo investigaciones adicionales y han completado la presente invención. La preparación de HGF de la presente invención es lo suficientemente estable para emplearla como un producto farmacéutico. Por ejemplo, la inyección de HGF de la presente invención se puede administrar de forma segura por vía intratecal o intracerebroventricular, o administrar en el parénquima espinal o cerebral para el tratamiento de diversas enfermedades del sistema nervioso central, tales como ELA y una lesión de la médula espinal.
Es decir, la presente invención proporciona la siguiente preparación de HGF.
(1) Una preparación de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) que se obtiene mediante la liofilización de una solución acuosa que comprende una proteína del HGF como ingrediente activo y lactosa, glicina, cloruro de sodio, un agente tamponador del pH y un tensioactivo como ingredientes adicionales, en donde el contenido en lactosa está en el intervalo de 0,1 a 50 partes en peso con respecto a 1 parte en peso de HGF.
(2) La preparación de HGF según el apartado (1) anterior, en la que la concentración de lactosa en la solución acuosa está en el intervalo de 0,1 a 100 mg/mL.
(3) La preparación de HGF según el apartado (1) anterior, en la que la concentración de glicina en la solución acuosa está en el intervalo de 0,05 a 50 mg/mL.
(4) La preparación de HGF según el apartado (1) anterior, en la que la concentración de proteína de1HGF en la solución acuosa está en el intervalo de 0,05 a 40 mg/mL.
(5) La preparación de HGF según el apartado (1) anterior, en la que el agente tamponador del pH es una combinación de ácido cítrico o un hidrato del mismo con una sal de ácido cítrico.
(6) La preparación de HGF según el apartado (1) anterior, en la que el tensioactivo es polisorbato.
(7) La preparación de HGF según el apartado (1) anterior, en la que la preparación de HGF es una inyección.
(8) La preparación de HGF según el apartado (7) anterior, en donde la inyección es una solución acuosa obtenida disolviendo la preparación liofilizada según el apartado (1) anterior en un disolvente farmacéuticamente aceptable.
(9) La preparación de HGF según el apartado (1) anterior, en donde la preparación de HGF es para uso en el tratamiento de una enfermedad del sistema nervioso central.
(10) La preparación de HGF según el apartado (9) anterior, en donde la enfermedad del sistema nervioso central es esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, ataxia espinocerebelosa, lesión de la médula espinal, infarto cerebral, isquemia cerebral o esclerosis múltiple.
(11) La preparación de HGF según el apartado (1) anterior, en donde la preparación de HGF se administra por vía intratecal o intracerebroventricular, o se administra en el parénquima espinal o cerebral.
(12) La preparación de HGF según el apartado (7) anterior, en la que la concentración de lactosa en la inyección está en el intervalo de 0,1 a 100 mg/mL.
(13) La preparación de HGF según el apartado (7) anterior, en la que la concentración de glicina en la inyección está en el intervalo de 0,05 a 50 mg/mL.
(14) La preparación de HGF según el apartado (7) anterior, en la que la concentración de proteína de1HGF en la inyección está en el intervalo de 0,05 a 40 mg/mL.
(15) La preparación de HGF según el apartado (1) anterior, en la que la proteína de1HGF es una proteína del HGF humana.
(16) La preparación de HGF según el apartado (15) anterior, en la que la proteína de1HGF es una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6.
(17) La preparación de HGF según el apartado (1) anterior, en la que la proteína de1HGF es una proteína que tiene un 80% o más de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 5 y tiene actividad biológica de HGF.
La presente descripción también se refiere a un método para estabilizar HGF, más particularmente para evitar la formación de polímeros basados en proteína del HGF en una solución acuosa de HGF o una preparación de HGF liofilizada, y el método comprende usar lactosa, glicina, cloruro de sodio, un agente tamponador del pH y un tensioactivo.
Además, la presente descripción se refiere a un método para tratar una enfermedad del sistema nervioso central, comprendiendo el método administrar la preparación de HGF de acuerdo con el apartado (1) anterior por vía intratecal o intracerebroventricular o administrarla en el parénquima espinal o cerebral a un paciente con una enfermedad del sistema nervioso central.
Efectos ventajosos de la invención
La preparación de HGF de la presente invención es una preparación estable y puede usarse con seguridad en los nervios centrales. Dado que la inyección de HGF de la presente invención es muy segura para el sistema nervioso central, por ejemplo, se puede administrar por vía intratecal o intracerebroventricular o administrar en el parénquima espinal o cerebral para el tratamiento de diversas enfermedades del sistema nervioso central, como ELA y una lesión de la médula espinal.
Descripción de las realizaciones
La preparación de HGF de la presente invención contiene una proteína del HGF como ingrediente activo y lactosa, glicina, cloruro de sodio, un agente tamponador del pH y un tensioactivo como ingredientes adicionales.
La preparación de HGF de la presente invención puede contener además uno o varios ingredientes activos adicionales (ingredientes medicinales) además de la proteína del HGF, pero preferiblemente no contiene ningún ingrediente activo excepto la proteína del HGF.
La forma de dosificación de la preparación de HGF de la presente invención no está particularmente limitada, pero se prefiere, por ejemplo, una forma de dosificación parenteral tal como una preparación liofilizada y una inyección. La preparación liofilizada es preferiblemente una preparación liofilizada para inyección.
La inyección significa una composición líquida que es inyectable directamente en el organismo vivo. En el caso de que la preparación de HGF de la presente invención sea una inyección, puede abreviarse simplemente como "inyección de HGF".
La preparación liofilizada significa una preparación en la que los ingredientes se encuentran en estado sólido liofilizado. En el caso de que la preparación de HGF de la presente invención sea una preparación liofilizada, puede abreviarse simplemente como "preparación de HGF liofilizada". Típicamente, una preparación liofilizada se disuelve en un disolvente apropiado (líquido para disolver) antes del uso, y la solución se administra como una inyección tal como está o, si es necesario, después de la dilución en un disolvente apropiado o similar. Es decir, se puede decir que una solución obtenida disolviendo una preparación liofilizada en un disolvente es sustancialmente equivalente a una inyección.
La preparación de HGF de la presente invención es preferiblemente una preparación liofilizada que contiene una proteína del HGF como ingrediente activo y lactosa, glicina, cloruro de sodio, un agente tamponador del pH y un tensioactivo como ingredientes adicionales. Otra realización preferible de la preparación de HGF de la presente invención es una inyección de HGF que contiene una proteína del HGF como ingrediente activo y lactosa, glicina, cloruro de sodio, un agente tamponador del pH y un tensioactivo como ingredientes adicionales.
La preparación de HGF de la presente invención es muy segura para el sistema nervioso central. La preparación de HGF de la presente invención que incluye la inyección de HGF es tan especialmente menos tóxica para el sistema nervioso central que se puede administrar, por ejemplo, por vía intratecal o intracerebroventricular, o administrar en el parénquima espinal o cerebral. Por lo tanto, la preparación de HGF de la presente invención es adecuada para uso en el tratamiento de diversas enfermedades del sistema nervioso central, etc.
La proteína del HGF en la presente invención puede proceder de cualquier especie sin una limitación particular, y se pueden usar preferiblemente proteínas del HGF procedentes de diversos animales (proteínas de1HGF naturales o proteínas recombinantes producidas por técnicas de ingeniería genética), etc. En la presente invención, se prefiere usar, por ejemplo, una proteína del HGF procedente de un animal en el que se pretende usar la preparación de HGF de la presente invención. Por ejemplo, cuando la preparación de HGF de la presente invención está destinada a ser utilizada en seres humanos, una proteína del HGF procedente de seres humanos (en lo sucesivo denominada proteína del HGF humana) es adecuada como proteína del HGF utilizada en la presente invención. Más preferida es una proteína del HGF humana recombinante. Cuando se pretende utilizar la preparación de HGF de la presente invención en mamíferos no humanos, se utilizan preferentemente HGFs procedentes de tales animales y, por ejemplo, se pueden emplear proteínas de HGFs procedentes de monos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, perros, gatos, ratas, ratones, conejos, hámsteres, cobayas, chimpancés, etc. Además, la proteína del HGF utilizada en la presente invención puede ser una proteína del HGF del tipo con deleción de 5 aminoácidos (dHGF).
La proteína del HGF humana es preferiblemente una proteína codificada por un ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, por ejemplo. Más específicamente, se prefiere una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3, una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4, una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 5, una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6, etc. En particular, la proteína del HGF humana es preferiblemente una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6, y más preferiblemente una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6. Por ejemplo, la proteína del HGF que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6, es una proteína de1HGF del tipo con deleción de 5 aminoácidos (dHGF) en la que se eliminan 5 residuos de aminoácidos en las posiciones 131 a 135 de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 5. La proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6 es una proteína de1HGF presente en la naturaleza (proteína del HGF natural) en el cuerpo humano y tiene actividades de HGF, tales como actividad mitogénica y actividad motogénica.
La proteína del HGF utilizada en la presente invención incluye proteínas que tienen al menos aproximadamente un 80% o más, preferiblemente aproximadamente un 90% o más, más preferiblemente aproximadamente un 95% o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de las proteínas de1HGF (proteínas de1HGF naturales) procedentes de varios animales y con actividades biológicas (actividad mitogénica y actividad motogénica) de HGF. La expresión "identidad de secuencia", tal y como se usa en este documento en relación con la secuencia de aminoácidos, significa una identidad de los residuos de aminoácidos entre las secuencias de aminoácidos (estructuras primarias) de dos proteínas. Un número junto con un "% o más" representa el grado de identidad de secuencia.
Las actividades mitogénicas y motogénicas de la proteína del HGF pueden confirmarse, por ejemplo, según el método descrito en J. Biol. Chem. 273, 22913-22920, 1998. Preferiblemente, la proteína de1Hg F utilizada para la presente invención tiene actividades mitogénicas y motogénicas medidas de acuerdo con J. Biol. Chem. 273, 22913-22920, 1998, que ascienden normalmente hasta aproximadamente un 50% o más, preferiblemente hasta aproximadamente un 70% o más, más preferiblemente hasta aproximadamente un 80% o más, aún más preferiblemente hasta aproximadamente un 90% o más de las de la proteína del HGF natural.
Ejemplos de proteínas que tienen la identidad de secuencia descrita anteriormente con proteínas de1HGF naturales, incluyen proteínas que tienen la misma secuencia de aminoácidos que la representada por SEQ ID NO: 5 o 6 excepto por sustitución, deleción y/o inserción de uno a varios residuos de aminoácidos o la modificación de uno a varios residuos de aminoácidos y tienen actividades biológicas de HGF.
El término "varios" generalmente significa un número entero de 1 a 8 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8), y normalmente es 8, preferiblemente 6, más preferiblemente 5, aún más preferiblemente 3, particularmente preferible 2. El aminoácido que se va a insertar o sustituir en lugar del original es preferiblemente un aminoácido natural, pero puede ser un aminoácido no natural distinto de los 20 tipos de aminoácidos codificados por genes. El aminoácido no natural puede ser cualquier compuesto que tenga un grupo amino y un grupo carboxilo y es, por ejemplo, ácido Y-aminobutírico o uno similar.
La sustitución de un residuo de aminoácidos significa reemplazar un residuo de aminoácidos por otro en un polipéptido, y preferiblemente es una sustitución conservadora. La expresión "sustitución conservadora" significa reemplazar uno a varios residuos de aminoácidos por otro u otros residuos de aminoácidos químicamente similares, sin cambios sustanciales en la actividad del polipéptido. Ejemplos de sustitución conservadora incluyen un caso en el que un residuo de aminoácido hidrofóbico se reemplaza por otro residuo de aminoácido hidrofóbico, o un caso en el que un residuo de aminoácido polar se reemplaza por otro residuo de aminoácido polar con la misma carga. El o los aminoácidos funcionalmente similares para una sustitución conservadora de cada aminoácido son conocidos en la técnica. Ejemplos de aminoácidos con una cadena lateral no polar (hidrofóbica) incluyen glicina, alanina, valina, isoleucina, leucina, prolina, triptófano, fenilalanina y metionina. Ejemplos de aminoácidos neutros con una cadena lateral polar incluyen serina, treonina, tirosina, glutamina, asparagina y cisteína. Ejemplos de aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, histidina y lisina. Ejemplos de aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico.
La proteína del HGF contenida en la preparación de la presente invención puede ser de un tipo o ser una combinación de dos o más de los tipos descritos anteriormente.
La proteína del HGF utilizada en la preparación de la presente invención se puede preparar mediante varios métodos, siempre que la pureza de la proteína del HGF preparada sea adecuada para un uso farmacéutico. Se conocen varios métodos de preparación y, por ejemplo, la proteína del HGF puede obtenerse mediante extracción y purificación a partir de órganos tales como hígado, bazo, pulmón, médula ósea, cerebro, riñón y placenta, células sanguíneas tales como plaquetas y leucocitos, plasma, suero y similares de mamíferos tales como ratas, vacas, caballos y ovejas.
Un procedimiento específico para la extracción y purificación de la proteína de1 HGF a partir de los tejidos vivos anteriores, etc., es, por ejemplo, del modo siguiente. Se inyecta tetracloruro de carbono por vía intraperitoneal a las ratas para inducir hepatitis, el hígado se aísla y se homogeneiza, y la proteína de1HGF se purifica mediante métodos ordinarios de purificación de proteínas, tales como cromatografía en columna con S-sefarosa, sefarosa de heparina, etc. y HPLC.
Alternativamente, la proteína del HGF se puede obtener mediante aislamiento y purificación desde un cultivo (material sobrenadante de un cultivo, células cultivadas, etc.) de células cultivadas primarias o líneas celulares establecidas que producen la proteína del HGF. Alternativamente, pueden usarse técnicas de ingeniería genética para la preparación de la proteína del HGF. Específicamente, un gen que codifica la proteína de1HGF (preferiblemente, un ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 1 o 2), se inserta en un vector apropiado, el vector se introduce en un hospedador apropiado para la transformación y se recoge una proteína de1 HGF recombinante de interés desde el cultivo del transformante resultante (por ejemplo, véase Biochem. Biophys. Res. Commun. 180: 1151-1158, 1991; J. Clin. Invest. 87: 1853-1857, 1991; Protein Expr. Purif. 70: 231-235, 2010; etc.). La célula hospedadora no está particularmente limitada, y pueden usarse varios tipos de células hospedadoras utilizadas convencionalmente en técnicas de ingeniería genética. Por ejemplo, se pueden utilizar E. coIí, Bacillus subtilis, levaduras, hongos filamentosos, células vegetales, células animales, etc. En un ejemplo en el que se utilizan células animales como célula hospedadora, se transforman células de ovario de hámster chino (CHO), células C127 de ratón, células COS de mono u otras células animales con un vector de expresión preparado mediante la inserción de un ADNc que codifica la secuencia de aminoácidos de una proteína del HGF humana, el material sobrenadante del cultivo se separa y se purifica la proteína del HGF en el material sobrenadante, por ejemplo, mediante cromatografía en columna, como se ha ejemplificado anteriormente.
Siempre que la proteína del HGF obtenida de ese modo tenga actividades biológicas de HGF, puede ser diferente de la proteína del HGF natural porque la secuencia de aminoácidos tiene una sustitución, deleción y/o inserción de uno o más aminoácidos. En ese contexto, "uno o más" es, por ejemplo, de uno a varios (el término "varios" es tal y como se ha definido anteriormente y es, por ejemplo, de 1 a 8, preferiblemente de 1 a 6, más preferiblemente de 1 a 5, aún más preferiblemente de 1 a 3, de manera particularmente preferida 1 o 2; lo mismo se aplicará a continuación). La sustitución es preferiblemente una sustitución conservadora. La proteína de1 HGF puede modificarse mediante sustitución, deleción o inserción de una cadena o cadenas de azúcar. La "deleción, sustitución y/o inserción de uno o varios aminoácidos", tal y como se usa en este documento en relación con la secuencia de aminoácidos, significa la deleción, sustitución y/o inserción de un cierto número de aminoácidos, en donde ese número se corresponde sustancialmente con el número de aminoácidos que se pueden delecionar, sustituir y/o insertar mediante métodos técnicos bien conocidos, tales como modificación de genes y mutagénesis dirigida al sitio, o de forma natural (generalmente de uno a varios aminoácidos). La "proteína del HGF modificada mediante sustitución, deleción o inserción de una o varias cadenas de azúcar" significa una proteína del HGF obtenida eliminando una o varias cadenas de azúcar de una proteína del HGF natural, mediante tratamiento con una enzima o similar; una proteína de1HGF obtenida mediante la mutación de uno o varios sitios de glicosilación en la secuencia de aminoácidos de una proteína del HGF natural para no permitir una glicosilación; una proteína del HGF obtenida mutando la secuencia de aminoácidos de una proteína del HGF natural para permitir la glicosilación de uno o varios sitios distintos del o de los sitios de glicosilación natural; o una forma similar.
La lactosa, la glicina, el cloruro de sodio, el agente tamponador del pH y el tensioactivo utilizados en la preparación del HGF de la presente invención son preferiblemente los mismos que se describen en las farmacopeas de varios países (por ejemplo, la Farmacopea japonesa, la Farmacopea de los Estados Unidos, la Farmacopea europea, etc.). En el caso en que se utilicen los que no están descritos en las farmacopeas, se utilizan preferentemente los farmacéuticamente aceptables. La expresión "farmacéuticamente aceptable" significa que normalmente es seguro, menos tóxico, exento de problemas biológicos y de otro tipo, y útil para preparar preparaciones farmacéuticas aceptables para uso animal o humano.
La lactosa usada en la preparación de HGF de la presente invención es preferiblemente la misma que se describe en las farmacopeas de varios países (por ejemplo, la Farmacopea Japonesa, la Farmacopea de los Estados Unidos, la Farmacopea Europea, etc.). La cantidad de lactosa es preferiblemente de 0,1 a 50 partes en peso, más preferiblemente de 0,5 a 10 partes en peso y aún más preferiblemente de 1 a 5 partes en peso (incluyendo 1 a 2 partes en peso, 1 a 3 partes en peso, 1 a 4 partes en peso, 1 a 5 partes en peso, 2 a 3 partes en peso, 2 a 4 partes en peso, 2 a 5 partes en peso, 3 a 4 partes en peso, 3 a 5 partes en peso y 4 a 5 partes en peso) con respecto a 1 parte en peso de la proteína del HGF.
La glicina utilizada en la preparación de HGF de la presente invención es preferiblemente la misma que se describe en las farmacopeas de varios países (por ejemplo, la Farmacopea japonesa, etc.). La cantidad de glicina es preferiblemente de 0,01 a 1 parte en peso, más preferiblemente de 0,05 a 1 parte en peso y aún más preferiblemente de 0,1 a 0,5 partes en peso (incluyendo 0,1 a 0,2 partes en peso, 0,1 a 0,3 partes en peso, 0,1 a 0,4 partes en peso, 0,1 a 0,5 partes en peso, 0,2 a 0,3 partes en peso, 0,2 a 0,4 partes en peso, 0,2 a 0,5 partes en peso, 0,3 a 0,4 partes en peso, 0,3 a 0,5 partes en peso y 0,4 a 0,5 partes en peso) con respecto a 1 parte en peso de la proteína de1HGF.
El agente tamponador del pH utilizado en la preparación de HGF de la presente invención significa un agente que, una vez disuelto en un disolvente tal como agua, puede servir como tampón, que tiene el efecto de mantener el pH de la solución dentro de un cierto intervalo. Un ejemplo típico es una combinación de un ácido débil y una de sus sales. Ejemplos preferibles de agente tamponador del pH incluyen una combinación de ácido fosfórico, ácido cítrico o ácido bórico con la sal correspondiente, que pueden servir como tampón fosfato, tampón citrato o tampón borato una vez disuelto. Más preferida es una combinación de ácido cítrico y una sal del mismo, que puede servir como tampón citrato. Esos ácidos débiles y sus sales pueden estar en forma de solvato, y el solvato es preferiblemente un hidrato, por ejemplo. Una solución de agente tamponador de pH puede servir como tampón, el cual tiene los efectos de ajustar el pH de una solución acuosa de HGF y mantener la solubilidad y estabilidad de la proteína de1HGF. Ejemplos de solución acuosa de HGF en la presente invención incluyen una inyección de HGF; una solución acuosa preparada antes de una etapa de liofilización durante la producción de la preparación liofilizada descrita más adelante; y una solución acuosa obtenida al volver a disolver la preparación liofilizada en un disolvente. Cuando la preparación de HGF es, por ejemplo, una preparación liofilizada, el agente tamponador del pH preferiblemente tiene el efecto de conservar el pH de una solución acuosa obtenida al volver a disolver la preparación de HGF, dentro del intervalo de aproximadamente 4,5 a 8,0. Cuando la preparación de HGF es una inyección de HGF, el agente tamponador del pH tiene preferentemente el efecto de conservar el pH de la inyección dentro del intervalo de aproximadamente 4,5 a 8,0. Específicamente, independientemente de la forma de las preparaciones de HGF que incluyen una inyección de HGF y una preparación de HGF liofilizada, el agente tamponador del pH en la presente invención es preferiblemente una combinación de ácido cítrico o su solvato con una sal de ácido cítrico o su solvato; más preferiblemente una combinación de ácido cítrico o su hidrato con una sal de ácido cítrico; y aún más preferiblemente una combinación de un ácido cítrico hidrato con citrato de sodio (preferiblemente citrato de trisodio dihidrato o citrato de trisodio (anhidro)). El tampón citrato es muy eficaz para estabilizar la proteína del HGF en una solución acuosa de HGF y puede contribuir a la estabilización de la proteína del HGF en la inyección de HGF; la solución acuosa de HGF preparada durante la producción de la preparación de HGF liofilizada; y la solución acuosa obtenida al volver a disolver la preparación de HGF liofilizada en un disolvente. En una realización preferible, la cantidad de agente tamponador del pH, por ejemplo en la inyección de HGF, es una cantidad tal que proporciona una concentración de preferiblemente aproximadamente 1 a 100 mM, más preferiblemente de aproximadamente 1 a 20 mM en la inyección. En una realización preferible, la cantidad de agente tamponador del pH en la preparación liofilizada es una cantidad tal que proporciona una concentración de aproximadamente 1 a 100 mM, más preferiblemente de aproximadamente 1 a 20 mM en una solución acuosa antes de una etapa de liofilización, durante la producción de la preparación liofilizada descrita más adelante.
Ejemplos de un tensioactivo utilizado en la preparación de HGF de la presente invención, incluyen polisorbato (por ejemplo, polisorbato 20 (monolaurato de polioxietilensorbitán), polisorbato 80 (monooleato de polioxietilensorbitán), etc.), Pluronic (marca registrada) F-68 (GIBCO) y polietilenglicol. Se pueden usar dos o más de los mismos en combinación. Se prefiere el polisorbato, y particularmente se prefiere el polisorbato 80. La proteína de1HGF se adsorbe fácilmente sobre la superficie de un recipiente de vidrio, resina u otros materiales, pero la adición de un tensioactivo de ese tipo puede evitar la adsorción de la proteína del HGF al recipiente durante la producción de la preparación de HGF. La adición del tensioactivo también puede evitar la adsorción de la proteína de1HGF a un recipiente que contenga la inyección de HGF o la solución acuosa de HGF obtenida al volver a disolver la preparación de HGF en un disolvente. La cantidad de tensioactivo en la inyección de HGF es, por ejemplo, una cantidad tal que proporciona una concentración preferiblemente de aproximadamente 0,001 a 2,0% en peso, más preferiblemente de aproximadamente 0,005 a 1,0% en peso en la inyección. La cantidad de tensioactivo en la preparación liofilizada es, por ejemplo, una cantidad tal que proporciona una concentración preferiblemente de aproximadamente 0,001 a 2,0% en peso, más preferiblemente de aproximadamente 0,005 a 1,0% en peso en una solución acuosa antes de una etapa de liofilización, durante la producción de la preparación liofilizada descrita más adelante.
El cloruro de sodio usado en la preparación de HGF de la presente invención tiene el efecto de mantener la solubilidad de la proteína del HGF. Es decir, la adición de cloruro de sodio, particularmente hasta aproximadamente 150 mM o más, aumenta la solubilidad de la proteína del HGF. Además, la adición de cloruro de sodio puede hacer que la presión osmótica de una solución acuosa de HGF se acerque a la presión osmótica del fluido corporal. La cantidad de cloruro de sodio se puede ajustar según sea apropiado, de acuerdo con la proporción de presión osmótica deseada. Preferiblemente, la cantidad de cloruro de sodio es tal que proporciona una proporción de presión osmótica (en relación con la solución salina fisiológica (proporción de presión osmótica: 1)) de aproximadamente 1 a 3, que es un intervalo aceptable para inyecciones de uso clínico o uso animal. La cantidad de cloruro de sodio, por ejemplo, en la inyección de HGF, es una cantidad tal que proporciona una concentración preferiblemente de aproximadamente 150 a 1000 mM, más preferiblemente de aproximadamente 150 a 300 mM en la inyección. La cantidad de cloruro de sodio en la preparación liofilizada es, por ejemplo, una cantidad tal que proporciona una concentración preferiblemente de aproximadamente 150 a 1000 mM, más preferiblemente de aproximadamente 150 a 300 mM en una solución acuosa de HGF preparada durante la producción de la preparación liofilizada descrita más adelante.
El método de producción de la preparación de HGF de la presente invención no está particularmente limitado. Por ejemplo, la preparación de HGF en forma de preparación liofilizada se puede producir mediante liofilización de una solución acuosa que contiene una proteína de HGF, lactosa, glicina, cloruro de sodio, un agente tamponador del pH y un tensioactivo. La preparación liofilizada así obtenida es una realización preferible de la preparación de HGF de la presente invención. Para la preparación de la solución acuosa utilizada en la producción de la preparación liofilizada, se puede utilizar cualquier método sin una limitación particular, siempre que la solución acuosa contenga una proteína del HGF, lactosa, glicina, cloruro de sodio, un agente tamponador del pH y un tensioactivo. Por ejemplo, a una solución de una proteína del HGF purificada (que normalmente contiene un tampón del pH, cloruro de sodio y un tensioactivo), se añade lactosa y glicina y, si es necesario, un disolvente farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, agua esterilizada, agua destilada para inyección, agua purificada, tampón, solución salina fisiológica, etc.) para preparar la solución acuosa. En una realización preferible, la concentración de la proteína de1HGF se ajusta preferiblemente de aproximadamente 0,05 a 40 mg/mL, más preferiblemente de aproximadamente 0,1 a 40 mg/mL y aún más preferible de aproximadamente 0,1 a 20 mg/mL en la solución acuosa. La lactosa se añade en una cantidad tal que proporciona una concentración tal como la indicada en la reivindicación 1. La glicina se añade en una cantidad tal que proporciona una concentración preferiblemente de aproximadamente 0,05 a 50 mg/mL, más preferiblemente de aproximadamente 0,05 a 20 mg/mL, y aún más preferiblemente de aproximadamente 0,1 a 10 mg/mL en la solución acuosa. Esa solución acuosa de HGF puede contener además uno o varios ingredientes adicionales, tales como agentes solubilizantes, antioxidantes, agentes calmantes y agentes tonificantes, si es necesario. En una realización preferible, la solución acuosa de HGF se esteriliza mediante filtración con un filtro o similar, se distribuye en viales o ampollas y luego se liofiliza. El filtro es preferiblemente un filtro esterilizante con un tamaño de poro de aproximadamente 0,22 gm o menos, por ejemplo. Ejemplos preferibles del filtro esterilizante incluyen Durapore (marca registrada, fabricado por Merck) y Sartopore 2 (marca registrada, fabricado por Sartorius).
El método para la liofilización de la solución acuosa no está particularmente limitado y se pueden usar métodos ordinarios de liofilización. Un ejemplo de método de liofilización comprende las tres etapas siguientes: una etapa de congelación en la que el enfriamiento y la congelación se realizan a presión normal; una etapa de secado primario en la que el agua exenta de solutos se sublima al vacío; y una etapa de secado secundario en la que se elimina el agua unida a solutos, como el agua adsorbida y el agua de cristalización. La temperatura de congelación de la etapa de congelación es preferiblemente de aproximadamente -60°C a -40°C, la temperatura de la etapa de secado primario es preferiblemente de aproximadamente -50°C a 0°C y la temperatura de la etapa de secado secundario es preferiblemente de aproximadamente 4°C a 40°C. La presión de vacío es preferiblemente de aproximadamente 0,1 a 1,5 Pa, y particularmente preferible de aproximadamente 0,5 a 1,2 Pa. La presión de la cámara de secado se recupera después de completar la liofilización. En un método preferible para recuperar la presión, se inyecta aire estéril o gas inerte (por ejemplo, gas nitrógeno estéril, gas helio estéril, etc.) a la cámara para permitir que la presión se recupere primero a un nivel de aproximadamente 70 a 100 kPa, más preferiblemente de aproximadamente 80 a 95 kPa (recuperación de la presión primaria) y luego a la presión atmosférica (recuperación de la presión secundaria). Los viales se taponan preferentemente con tapones después de la recuperación de la presión primaria, y los viales taponados se sellan preferentemente con tapas inmediatamente después de la recuperación de la presión secundaria. Las ampollas preferiblemente se termosellan aplicando calor a sus extremos (usando típicamente un quemador de gas) después de completar el secado.
La preparación de HGF liofilizada tiene preferiblemente un contenido en humedad de aproximadamente 2% en peso o menor.
La preparación de HGF liofilizada de la presente invención es menos propensa a la formación de polímeros basados en la proteína del HGF durante el almacenamiento y es muy estable. La expresión "polímero basado en proteínas" significa una sustancia en la que varios monómeros de proteínas están unidos entre sí, por ejemplo, en una cadena o estructura similar a una red. En la presente invención, se incluyen un dímero, un trímero y un tetrámero de proteínas del HGF.
Normalmente, la preparación de HGF liofilizada de la presente invención se disuelve en un disolvente farmacéuticamente aceptable y se usa en forma de solución acuosa. La expresión "farmacéuticamente aceptable" es como se ha definido anteriormente. Ejemplos preferibles del disolvente farmacéuticamente aceptable incluyen agua destilada para inyección, solución salina fisiológica, varios tipos de infusión (por ejemplo, solución de glucosa al 5%, solución de Ringer, etc.) y líquido cefalorraquídeo artificial. El disolvente es más preferiblemente agua destilada para inyección o solución salina fisiológica. En una realización preferible, la preparación de HGF liofilizada de la presente invención se disuelve en un disolvente farmacéuticamente aceptable, tal como agua destilada para inyección, para preparar una solución que contiene una proteína de HGF con una concentración preferible de aproximadamente 0,05 a 40 mg/mL, más preferible de aproximadamente 0,1 a 40 mg/mL, aún más preferible de aproximadamente 0,1 a 20 mg/mL, solución que puede usarse preferiblemente como una inyección.
La preparación de HGF liofilizada de la presente invención se puede envasar junto con el disolvente farmacéuticamente aceptable descrito anteriormente y se proporciona como un kit.
La inyección de HGF de la presente invención es preferiblemente una solución acuosa que contiene una proteína del HGF, lactosa, glicina, cloruro de sodio, un agente tamponador del pH y un tensioactivo. La lactosa, la glicina, el cloruro sódico, el agente tamponador del pH y el tensioactivo, y sus realizaciones preferidas y similares son como se han descrito anteriormente.
El método de producción de la inyección de HGF de la presente invención no está particularmente limitado. Por ejemplo, la preparación de HGF liofilizada se disuelve en un disolvente farmacéuticamente aceptable para preparar la inyección de HGF. Ejemplos preferibles del disolvente farmacéuticamente aceptable incluyen agua destilada para inyección, solución salina fisiológica, varios tipos de infusión (por ejemplo, solución de glucosa al 5%, solución de Ringer, etc.) y líquido cefalorraquídeo artificial. El disolvente es más preferiblemente agua destilada para inyección o solución salina fisiológica. Alternativamente, la inyección de HGF de la presente invención se puede preparar añadiendo lactosa y glicina y, si es necesario, un disolvente farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, agua esterilizada, agua destilada para inyección, agua purificada, tampón, solución salina fisiológica, etc.) a una solución acuosa de aproximadamente 0,1 a 40 mg/mL de una proteína del HGF purificada (que normalmente contiene un tampón del pH, cloruro de sodio y un tensioactivo). Por ejemplo, la solución acuosa utilizada en la producción de la preparación liofilizada descrita anteriormente, cuya solución contiene una proteína de1HGF, lactosa, glicina, cloruro sódico, un agente tamponador del pH y un tensioactivo, puede utilizarse como inyección de HGF.
La concentración de la proteína del HGF en la inyección de HGF de la presente invención es preferiblemente de 0,05 a 40 mg/mL, más preferiblemente de 0,1 a 40 mg/mL y aún más preferiblemente de 0,1 a 20 mg/mL.
La concentración de lactosa en la inyección de HGF de la presente invención es la indicada en la reivindicación 1.
La concentración de glicina en la inyección de HGF de la presente invención es preferiblemente de 0,05 a 50 mg/mL, más preferiblemente de 0,05 a 20 mg/mL y aún más preferiblemente de 0,1 a 10 mg/mL.
El pH de la inyección de HGF de la presente invención es preferentemente de aproximadamente 4,5 a 8,0.
La inyección de HGF de la presente invención puede contener además uno o varios ingredientes adicionales tales como agentes solubilizantes, antioxidantes, calmantes y tonificantes, si es necesario.
La inyección de HGF de la presente invención suele ser una solución transparente. La inyección de HGF de la presente invención es menos propensa a la formación de polímeros de HGF durante el almacenamiento y es muy estable aunque se encuentre en estado de solución.
El uso previsto de la preparación de HGF de la presente invención no está particularmente limitado, pero preferiblemente, la preparación de HGF se usa como una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de enfermedades del sistema nervioso central, por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, ataxia espinocerebelosa, lesión de la médula espinal, infarto cerebral, isquemia cerebral, esclerosis múltiple, etc. En particular, la preparación de HGF de la presente invención es adecuada para uso en el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central.
La preparación de HGF de la presente invención que incluye la inyección de HGF y la preparación de HGF liofilizada se puede administrar, por ejemplo, por vía intracerebroventricular o intratecal. Por ejemplo, la inyección de HGF de la presente invención es adecuada como preparación para una administración intracerebroventricular o intratecal. El espacio intratecal, dentro del cual se administra la inyección de HGF de la presente invención en el caso de una administración intratecal, es un espacio que está situado alrededor de la médula espinal y está lleno de líquido cefalorraquídeo. Ese espacio está rodeado por una membrana de doble capa que consiste en la aracnoides y la duramadre. El espacio intratecal es un espacio por debajo de la aracnoides, la capa interna de la membrana de doble capa y, por lo tanto, una administración intratecal significa una administración en el espacio subaracnoideo. El espacio alrededor del cerebro y el espacio alrededor de la médula espinal están ambos llenos de líquido cefalorraquídeo, y los ventrículos cerebrales en el cerebro también están llenos de líquido cefalorraquídeo. Los ventrículos cerebrales, el espacio pericerebral y el espacio intratecal están conectados para formar un espacio continuo, por el cual circula el líquido cefalorraquídeo. Por lo tanto, una administración intracerebroventricular y una administración intratecal son ambas la administración de un fármaco en el líquido cefalorraquídeo. Normalmente, la administración intracerebroventricular y la administración intratecal son sustancialmente la misma vía de administración. Además, la preparación de HGF de la presente invención que incluye la inyección de HGF, puede administrarse en el parénquima cerebral o espinal. Para una administración intracerebroventricular o intratecal o una administración en el parénquima cerebral o espinal, la inyección puede administrarse como un bolo o administrarse de forma continua como una infusión, utilizando una bomba de jeringa, etc.
El uso previsto de la preparación de HGF de la presente invención no se limita únicamente al tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central. Dado que la preparación de HGF de la presente invención tiene una estabilidad suficiente para el uso farmacéutico y es muy segura, también se puede usar para el tratamiento de enfermedades distintas de las enfermedades del sistema nervioso central. En ese caso, se puede seleccionar una vía de administración adecuada para el tratamiento de la enfermedad diana y, por ejemplo, se puede usar una inyección intravenosa, inyección subcutánea, inyección intramuscular, administración local, etc.
La dosis de la preparación de HGF de la presente invención se puede determinar según sea apropiado de acuerdo con el tipo de enfermedad diana, el estado de la enfermedad, etc. Por ejemplo, en el caso en que la inyección de HGF se utilice para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central, la dosis diaria de la proteína de1HGF es preferentemente de aproximadamente 0,01 a 50 mg, y más preferentemente de aproximadamente 0,1 a 10 mg por adulto. En ese caso, la inyección de HGF se administra preferiblemente por vía intracerebroventricular o intratecal. Además, la preparación de HGF de la presente invención que incluye la inyección de HGF, se puede diluir antes de la administración según corresponda con un disolvente farmacéuticamente aceptable, apropiado. Ejemplos de disolvente farmacéuticamente aceptable incluyen agua destilada para inyección, solución salina fisiológica, varios tipos de infusión (por ejemplo, solución de glucosa al 5%, solución de Ringer, etc.) y líquido cefalorraquídeo artificial. Son más preferidas el agua destilada para inyección y la solución salina fisiológica.
La presente descripción también incluye un método para tratar una enfermedad del sistema nervioso central, que comprende administrar, a un paciente con una enfermedad del sistema nervioso central, una preparación de HGF que contiene una proteína del HGF como ingrediente activo y lactosa, glicina, cloruro de sodio, un agente tamponador del pH y un tensioactivo como ingredientes adicionales.
La presente invención también incluye una preparación de HGF que contiene una proteína de1HGF como ingrediente activo y lactosa, glicina, cloruro de sodio, un agente tamponador del pH y un tensioactivo como ingredientes adicionales para uso en el tratamiento de una enfermedad del sistema nervioso central.
La preparación de HGF es preferiblemente una preparación liofilizada (preparación de HGF liofilizada) o una inyección (inyección de HGF), y más preferiblemente es una inyección.
La preparación de HGF, la preparación de HGF liofilizada y la inyección de HGF, y sus realizaciones preferidas y similares son como se han descrito anteriormente. En el tratamiento de una enfermedad del sistema nervioso central, la preparación de HGF se administra preferiblemente por vía intratecal o intracerebroventricular o se administra en el parénquima espinal o cerebral.
La presente descripción también incluye un método para evitar la formación de polímeros de HGF (polímeros basados en proteínas del HGF) en una solución acuosa que contiene una proteína de1HGF, en donde el método comprende añadir lactosa, glicina, cloruro de sodio, un agente tamponador del pH y un tensioactivo a la solución acuosa. En ese método, la proteína del HGF, la lactosa, la glicina, el cloruro sódico, el agente tamponador del pH y el tensioactivo, y sus cantidades preferibles y similares añadidas a la solución acuosa, son las mismas que las que se han descrito anteriormente para la inyección de HGF.
La presente descripción también incluye un método para evitar la formación de polímeros de HGF (polímeros basados en proteínas del HGF) en una preparación liofilizada que contiene una proteína de1HGF, en donde el método comprende añadir lactosa, glicina, cloruro de sodio, un agente tamponador del pH y un tensioactivo a la preparación liofilizada. En ese método, la proteína del HGF, la lactosa, la glicina, el cloruro sódico, el agente tamponador del pH y el tensioactivo, y sus cantidades preferibles y similares añadidas a la preparación liofilizada, son las mismas que las que se han descrito anteriormente para la preparación de HGF liofilizada.
Ejemplos
A continuación, la presente invención se ilustrará con más detalle mediante los Ejemplos.
Se añadieron varios tipos de aditivos a una proteína del HGF humana recombinante (en lo sucesivo denominada simplemente HGF) que consistía en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6, y el examen de estabilidad y seguridad se realizó como se indica a continuación. En los siguientes ejemplos, la concentración en ''%" se refiere a un porcentaje en masa, a menos que se especifique lo contrario. E1HGF se preparó utilizando células CHO según el método descrito en Biochem. Biophys. Res. Commun. 180: 1151-1158, 1991.
Ejemplo 1
La lactosa y la glicina se disolvieron hasta las concentraciones que se muestran en la Tabla 1 a continuación, en una solución de HGF que contenía tampón citrato 5 mM (pH 6,0), cloruro de sodio 0,375 M y polisorbato 80 al 0,005%.
Tabla 1
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La solución preparada se distribuyó asépticamente en partes alícuotas de 1 mL en viales (diámetro 23 x 43 mm). Los viales semitaponados con tapones de goma se alinearon en una bandeja, y la bandeja se colocó en un liofilizador (Triomaster; fabricado por Kyowa Vacuum Engineering Co., Ltd). La congelación preliminar se realizó a -50°C, seguida de un secado primario (-50°C ^ -20°C/4 horas, -20°C/24 horas o más, 0,01 a 0,1 Torr) y un secado secundario (-20°C ^ 20 a 30°c /8 a 10 horas, 20 a 30°C/10 horas o más, 0,01 a 0,1 Torr) para obtener una preparación liofilizada. Después de completar la liofilización, se introdujo nitrógeno estéril en la cámara de secado de Triomaster para recuperar la presión (presión deseada en la cámara: 88,0 kPa; recuperación de la presión primaria). Después de recuperar la presión primaria, los viales se taponaron completamente con tapones de goma y la presión de la cámara volvió a la presión atmosférica mediante el suministro de nitrógeno estéril (recuperación de la presión secundaria). Los viales se sacaron de la cámara e inmediatamente después se sellaron con tapas. De este modo, se obtuvo la preparación de HGF liofilizada de la presente invención.
Ejemplo 2
Se obtuvo otra preparación de HGF liofilizada de la misma manera que como se ha descrito en el Ejemplo 1, excepto que la concentración de lactosa era de 7,5 mg/mL.
Ejemplo 3
Se obtuvo otra preparación de HGF liofilizada de la misma manera que como se ha descrito en el Ejemplo 1, excepto que la concentración de lactosa era de 10 mg/mL.
Ejemplo 4
La lactosa y la glicina se disolvieron hasta las concentraciones que se muestran en la Tabla 2 a continuación, en una solución de HGF que contenía tampón citrato 2 mM (pH 6,0), cloruro de sodio 0,15 M y polisorbato 80 al 0,002%, y así se obtuvo una inyección de HGF. La inyección de HGF con la composición de la Tabla 2 también se puede obtener por otro método, es decir, disolviendo la preparación de HGF liofilizada obtenida en el Ejemplo 2 en 2,5 mL de agua destilada para inyección.
Tabla 2
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Ejemplo experimental 1
A los ingredientes básicos consistentes en 10 mg/mL de HGF, tampón citrato 10 mM (pH 6,0), cloruro de sodio 0,3 M y polisorbato 80 al 0,03%, se añadieron los aditivos que se muestran en la Tabla 3 para preparar soluciones de HGF con las formulaciones 1 a 3 (2 mL de cada una). Cada una de las soluciones de HGF se liofilizó en viales de la misma manera que en el Ejemplo 1 para proporcionar preparaciones liofilizadas. Cada preparación liofilizada se almacenó a 50°C durante una semana para pruebas de deterioro forzado, y se midió el contenido en polímero antes y después del almacenamiento. Los resultados se muestran en la Tabla 4.
Tabla 3
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El contenido en polímero de la preparación de HGF se determinó del modo siguiente. Cada preparación liofilizada se disolvió en 2 mL de agua destilada para inyección y la solución de HGF resultante se analizó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en las condiciones que se muestran a continuación. A partir de los resultados de la HPLC, se calculó el porcentaje de área (%) del polímero (en lo sucesivo denominado contenido en polímero (%)) mediante la siguiente fórmula 1.
[Matem. 1]
Contenido en polímero (%) = 100 x Aa/(Am + Aa) Fórmula 1
En la fórmula 1, Am representa el área del pico de HGF y Aa representa el área del pico del polímero.
Condiciones de la HPLC
Columna: columna de filtración en gel (nombre comercial: Superdex 200 10/300, fabricada por GE Healthcare) Fase móvil: 58,44 g de cloruro de sodio, 2,94 g de citrato trisódico dihidrato y 0,1 g de polisorbato 80 se disolvieron en agua purificada y luego se añadió más agua purificada hasta un volumen total de 1 L. Esta solución se denominó solución A. Se disolvieron 58,44 g de cloruro de sodio, 2,10 g de ácido cítrico monohidrato y 0,1 g de polisorbato 80 en agua purificada y luego se añadió más agua purificada hasta un volumen total de 1 L. Esta solución se denominó solución B. La solución B se añadió a la solución A y el pH de la solución mixta se ajustó a 6,0. La solución mixta se filtró a través de un filtro de 0,45 gm (nombre comercial: Millicup-HV, tamaño de poro: 0,45 gm, fabricado por Merck) y se desgasificó antes del uso. La solución se almacenó a temperatura ambiente y se usó en dos semanas.
Temperatura de la columna: 25°C
Caudal: 0,5 mL/min
Volumen de inyección de la muestra: 25 gL
Longitud de onda de detección: 280 nm
Tabla 4
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Para la preparación liofilizada producida a partir de la solución de HGF de la formulación 1, que contenía solo los ingredientes básicos, el almacenamiento en condiciones rigurosas daba como resultado una formación considerable de polímeros de HGF. Por otro lado, en las preparaciones liofilizadas producidas a partir de las soluciones de HGF de las formulaciones 2 y 3, se evitaba la formación de polímeros incluso en condiciones rigurosas. Estos resultados demuestran que la sacarosa o la L-alanina purificada tienen el efecto de conservar las preparaciones de HGF liofilizadas en condiciones estables, como se sabía hasta ahora.
Ejemplo experimental 2
A los ingredientes básicos consistentes en 2,5 mg/mL de HGF, tampón citrato 5 mM (pH 6,0), cloruro de sodio 0,375 M y polisorbato 80 al 0,005%, se añadieron los aditivos que se muestran en la Tabla 5 para preparar soluciones de HGF con las formulaciones 4 a 6 (1 mL de cada una). Cada una de las soluciones de HGF se liofilizó en viales de la misma manera que en el Ejemplo 1, para proporcionar preparaciones liofilizadas. Cada preparación liofilizada se almacenó a 50°C durante una semana y se midió el contenido en polímero antes y después del almacenamiento de la misma manera que en el Ejemplo experimental 1. Los resultados se muestran en la Tabla 6.
Tabla 5
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Tabla 6
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En la preparación de HGF liofilizada de la formulación 5, que contenía glicina y lactosa como aditivos, se evitaba la formación de polímeros, lo que indicaba una estabilidad elevada de la preparación.
Ejemplo experimental 3
En este ejemplo experimental, se examinó la estabilidad de las preparaciones de HGF liofilizadas que contenían glicina y lactosa como aditivos. A los ingredientes básicos que consistían en 2,5 mg/mL de HGF, tampón citrato 5 mM (pH 6,0), cloruro de sodio 0,375 M y polisorbato 80 al 0,005%, se añadieron los aditivos que se muestran en la Tabla 7 para preparar las soluciones de HGF con las formulaciones 4, 5, 7 y 8 (1 mL de cada una). Cada una de las soluciones de HGF se liofilizó en viales de la misma manera que en el Ejemplo 1 para proporcionar preparaciones liofilizadas. Cada preparación liofilizada se almacenó a 25°C durante 1 o 2 meses o a 50°C durante 2 semanas, y el contenido en polímero se midió antes y después del almacenamiento de la misma manera que en el Ejemplo experimental 1. Los resultados se muestran en la Tabla 8.
Tabla 7
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Tabla 8
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Para las preparaciones liofilizadas producidas a partir de las soluciones de HGF de las formulaciones 5 y 7, que contenían glicina y lactosa como aditivos, el aumento del contenido en polímero era solo leve, incluso después de 2 meses de almacenamiento a temperatura ambiente (25°C). Además, incluso después del almacenamiento en condiciones rigurosas, es decir, a 50°C durante 2 semanas, el contenido en polímero era tan bajo como ligeramente superior al 1%, lo que indicaba que se había evitado la formación de polímeros. El efecto de evitar la formación de polímeros en las preparaciones liofilizadas producidas a partir de las soluciones de HGF de las formulaciones 5 y 7 era casi comparable al de la formulación 8, en la que el aditivo distinto de la glicina era sacarosa purificada, que se sabe que es eficaz para la estabilización de preparaciones de HGF liofilizadas.
Ejemplo experimental 4
La preparación de HGF liofilizada obtenida en el Ejemplo 2 se disolvió en 2,5 mL de agua destilada para inyección para proporcionar una inyección de HGF con la composición de la Tabla 2. La inyección se almacenó a 40°C durante 2 semanas en un recipiente hermético. El contenido en polímero de la inyección de HGF se midió antes y después del almacenamiento de la misma manera que en el Ejemplo experimental 1. Las actividades biológicas de HGF en la inyección de HGF antes y después del almacenamiento se evaluaron utilizando el crecimiento de la línea celular epitelial de pulmón de visón MvlLu (Riken, BRC ID: RCB0996) como indicador.
Los contenidos en polímero en la inyección de HGF antes y después del almacenamiento eran 1,54% y 2,67%, respectivamente. Es decir, el aumento del contenido en polímero durante 2 semanas de almacenamiento a 40°C era solo del 1% aproximadamente. La actividad biológica de HGF en la inyección de HGF después de 2 semanas de almacenamiento a 40°C era un 89,4% (valor relativo calculado suponiendo que la actividad antes del almacenamiento era del 100%) de la actividad anterior al almacenamiento y se mantuvo en un nivel alto. Estos resultados muestran que la inyección de HGF de la presente invención se mantenía casi estable durante 2 semanas de almacenamiento a 40°C.
Ejemplo de ensayo 1
Cuarenta y cinco microlitros de una muestra de ensayo que se muestra en la Tabla 9, es decir, una solución de HGF 1 o 2, un vehículo (vehículo A o B) o una solución salina fisiológica, se administraron por vía intratecal como un bolo único a ratas, para examinar la seguridad para el sistema nervioso central. Dado que el volumen del líquido cefalorraquídeo en una rata es solo de aproximadamente 200 pL, si se administra un volumen excesivo de una solución en un solo bolo, la propia administración del bolo puede inducir anomalías en las ratas. Por lo tanto, el volumen máximo permisible por rata para una administración intratecal única en bolo, se fijó en 45 pL.
La piel en el área del cuello y la espalda de cada rata se afeitó con una maquinilla de afeitar eléctrica con anestesia de pentobarbital. La zona afeitada se limpió y desinfectó con etanol para desinfección y solución de ISODINE al 10% (nombre comercial, Meiji, Co., Ltd.: solución de povidona yodada al 10%). Se hizo una incisión a través de la piel de la espalda para dejar al descubierto la sección vertebral desde la 11a vértebra torácica hasta la 2a vértebra lumbar. Se extirpó el ligamento entre las vértebras torácicas 12a y 13a para dejar al descubierto la duramadre. Se realizó una pequeña incisión a través de la duramadre expuesta y la aracnoides y se confirmó la salida de líquido cefalorraquídeo. Inmediatamente después, la punta de un catéter de poliuretano (un catéter de dos piezas preparado conectando MRE025 (OD: 0,25 mm, 10 cm) y MRE010 (OD: 0,65 mm, 2,5 cm); Braintree, EE.UU.) llena de solución salina fisiológica (Otsuka Pharmaceutical Factory) se insertó a unos 2,5 cm de la incisión en el espacio intratecal (hacia la cabeza). El catéter se fijó a los tejidos periféricos con Aron Alpha médico (nombre comercial: Aron Alpha A "Sankyo", DAIICHI SANKYO Company, Limited). Además, el extremo abierto del catéter se cerró mediante termosellado, y el extremo exterior del catéter se dejó al descubierto con una longitud adecuada sobre la superficie de la piel cervical. La incisión se cerró con una sutura. Cada rata se mantuvo caliente sobre una almohadilla térmica hasta que despertó de la anestesia y luego se devolvió a una jaula de cría. Al día siguiente de la colocación del catéter, se administraron 45 pL de la muestra de ensayo que se muestra en la Tabla 9, es decir, la solución de HGF 1 o 2, vehículo (vehículo A o B) o solución salina fisiológica, como un bolo único a través del catéter que seguía en las ratas en estado de vigilia. Posteriormente, se inyectaron 10 pL de solución salina fisiológica a través del catéter conservado (con el fin de empujar hacia el espacio intratecal la solución de HGF o el vehículo que quedaba en el catéter). A continuación, la punta del catéter se cerró mediante termosellado y se colocó debajo de la piel, y se observó el estado de las ratas.
Tabla 9
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La administración intratecal en bolo de solución salina fisiológica a las ratas no provocaba anomalías. Por otro lado, en el caso de una administración intratecal del vehículo A, que se preparó mezclando aditivos que se sabía que tienen un efecto estabilizador sobre las preparaciones de HGF, en las ratas se encontraron anomalías neurológicas tales como actividad locomotora reducida, salivación y convulsiones, aunque transitoriamente Por el contrario, la administración intratecal del vehículo B, que se preparó mezclando los aditivos usados en la preparación de HGF de la presente invención, no provocaba anomalías en las ratas, como en el caso de la administración de solución salina fisiológica. El vehículo B se utilizó para la preparación de la solución 1 de HGF (esa solución es exactamente igual a la inyección del Ejemplo 4 y se corresponde con una realización de la inyección de HGF de la presente invención), y la administración intratecal de la solución 1 de HGF tampoco provocaba anomalías en las ratas. Estos resultados demuestran que la inyección de HGF de la presente invención no tiene efectos adversos sobre el sistema nervioso central y por tanto su composición es muy segura. Por otro lado, en el caso de una administración intratecal de la solución 2 de HGF, que se preparó con un vehículo que tenía la misma composición que el vehículo B, excepto que contenía sacarosa en lugar de lactosa, se observaron estados neurológicamente anormales, tales como fonación anormal y rigidez de las extremidades en las ratas, durante aproximadamente 20 minutos después de la administración.
Ejemplo de ensayo 2
Se preparó un modelo de lesión de la médula espinal en ratas e, inmediatamente después del inicio de la lesión, se inició la administración intratecal repetitiva de una solución de HGF (45 qL/inyección, 3 veces por semana, durante 4 semanas) (grupo de administración de HGF; n = 6). La solución de HGF utilizada era la misma que la solución de HGF con la composición de la Tabla 2, y se obtuvo disolviendo de nuevo la preparación liofilizada del Ejemplo 2 en 2,5 mL de agua destilada para inyección. En el grupo de control, se administró de manera similar un vehículo (tampón citrato 2 mM (pH 6,0), cloruro de sodio 0,15 M, polisorbato 80 al 0,002%, 0,16 mg/mL de glicina y 3 mg/mL de lactosa), que no contenía HGF, a las ratas del modelo con lesión de la médula espinal (n = 6).
Las ratas del modelo con lesión de la médula espinal se prepararon del modo siguiente. La piel en el área del cuello hasta la cintura de cada rata se afeitó con una maquinilla de afeitar eléctrica, con anestesia de ketamina y xilazina. La zona afeitada se limpió con alcohol al 70% y solución de ISODINE al 10% (nombre comercial, Meiji, Co., Ltd.: solución de povidona yodada al 10%). Se realizó una incisión a través de la piel de la espalda para dejar al descubierto la sección vertebral desde la 6a vértebra torácica hasta cerca de la 5a vértebra lumbar. Se extirparon los arcos vertebrales en las vértebras torácicas 9a y 10a y el ligamento entre ellas para dejar al descubierto la duramadre. Inmediatamente después de eso, se dejó caer un peso de 10 g desde una altura de 25 mm sobre la duramadre que estaba al descubierto a nivel de la 10a torácica, utilizando un aparato MASCIS Impactor (Universidad de Rutgers, EE.UU.) para inducir una lesión en la médula espinal. Inmediatamente después del inicio de la lesión de la médula espinal, se extirpó el ligamento entre la 1a y la 2a vértebra lumbar para dejar al descubierto la duramadre y se realizó una pequeña incisión a través de la duramadre y la aracnoides. Se confirmó la fuga de líquido cefalorraquídeo, e inmediatamente después se insertó la punta de un catéter de poliuretano (un catéter de dos piezas preparado conectando MRE025 (DE: 0,25 mm, 10 cm, Braintree, EE.UU.) y MRE010 (DE: 0,65 mm, 2,5 cm, Braintree, EE.UU.)) en el espacio intratecal (hacia la cabeza) hasta llegar a la proximidad del sitio de la lesión de la médula espinal. El catéter se fijó a las capas musculares con Aron Alpha médico (nombre comercial: Aron Alpha A "Sankyo", fabricado por DAIICHI SANKYO Company, Limited) y se sujetó. Después de la primera inyección de la solución del ensayo (solución de HGF o vehículo), se dejó el extremo exterior del catéter con una longitud adecuada sobre la superficie de la piel cervical y se cerró la incisión con una sutura. Cada animal se mantuvo caliente sobre una almohadilla térmica hasta que despertó de la anestesia y luego volvió a una jaula de reproducción. A partir de ese momento, la solución de HGF o el vehículo se administró repetidamente a través del catéter conservado, 3 veces/semana durante 4 semanas. En cada administración, una inyección de 45 qL de la solución de HGF o el vehículo venía seguida por una inyección de 10 qL de solución salina fisiológica (con el fin de empujar la solución de HGF o de vehículo que quedaba en el catéter hacia el espacio intratecal). Después de cada administración, el extremo abierto del catéter se cerraba mediante termosellado.
La función motora de las patas traseras de las ratas se evaluó a lo largo del tiempo usando la escala BBB (puntuación más alta, 21: una escala de calificación de 21 puntos desde 0 (parálisis completa) a 21 (movimiento normal de las patas traseras)) (Basso DM, Beattie MS, Bresnahan JC: A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J Neurotrauma 12: 1-21,1995), para examinar el efecto terapéutico de HGF sobre la lesión de la médula espinal. La puntuación BBB era cero en todos los animales al día siguiente del inicio de la lesión de la médula espinal. Sin embargo, 4 semanas después del inicio de la lesión de la médula espinal, la media de la puntuación BBB en el grupo con administración de HGF, se recuperaba a 10 o más, que era significativamente más alta que la puntuación (media: menos de 10) en el grupo con administración de vehículo (grupo de control). Estos resultados muestran que el HGF tiene un efecto terapéutico sobre una lesión de la médula espinal. Durante todo el período de administración de 4 semanas, no se observaron estados anormales, excepto la lesión de la médula espinal, ni en las ratas del grupo con administración de vehículo (grupo de control) ni en las ratas del grupo con administración de HGF. La autopsia de las ratas 4 semanas después del inicio de la lesión de la médula espinal, tampoco mostraba anomalías en la médula espinal, excepto en el sitio de la lesión de la médula espinal. Tal y como muestran estos resultados, la solución de HGF preparada disolviendo de nuevo la preparación liofilizada del Ejemplo 2, era segura y eficaz para el tratamiento de una lesión de la médula espinal.
Aplicabilidad industrial
De acuerdo con la presente invención, se proporciona una preparación de HGF que tiene una estabilidad durante el almacenamiento excelente para uso farmacéutico. La inyección de HGF de la presente invención se puede administrar por vía intratecal o intracerebroventricular o administrar en el parénquima espinal o cerebral para el tratamiento de

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Una preparación del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) que se obtiene mediante la liofilización de una solución acuosa que comprende una proteína del HGF como ingrediente activo y lactosa, glicina, cloruro de sodio, un agente tamponador del pH y un tensioactivo como ingredientes adicionales, en donde el contenido en lactosa está en el intervalo de 0,1 a 50 partes en peso con respecto a 1 parte en peso de HGF.
2. La preparación de HGF según la reivindicación 1, en la que la concentración de lactosa en la solución acuosa está en el intervalo de 0,1 a 100 mg/mL, o en la que la concentración de glicina en la solución acuosa está en el intervalo de 0,05 a 50 mg/mL, o en la que la concentración de proteína del HGF en la solución acuosa está en el intervalo de 0,05 a 40 mg/mL.
3. La preparación de HGF según la reivindicación 1, en la que el agente tamponador del pH es una combinación de ácido cítrico o un hidrato del mismo con una sal de ácido cítrico, o en la que el tensioactivo es polisorbato.
4. La preparación de HGF según la reivindicación 1, en la que la preparación de HGF es una solución para inyección acuosa.
5. La preparación de HGF según la reivindicación 4, en la que la solución para inyección es una solución acuosa obtenida disolviendo la preparación liofilizada según la reivindicación 1 en un disolvente farmacéuticamente aceptable.
6. La preparación de HGF según la reivindicación 1, para uso en el tratamiento de una enfermedad del sistema nervioso central.
7. La preparación de HGF para uso según la reivindicación 6, en donde la enfermedad del sistema nervioso central es esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, ataxia espinocerebelosa, lesión de la médula espinal, infarto cerebral, isquemia cerebral o esclerosis múltiple.
8. La preparación de HGF según la reivindicación 1, en donde la preparación de HGF está configurada para ser administrada por vía intratecal o intracerebroventricular o administrada en el parénquima espinal o cerebral.
9. La preparación de HGF según la reivindicación 4, en la que la concentración de lactosa en la solución para inyección está en el intervalo de 0,1 a 100 mg/mL, o en la que la concentración de glicina en la solución para inyección está en el intervalo de 0,05 a 50 mg/mL, o en la que la concentración de proteína de1HGF en la solución para inyección está en el intervalo de 0,05 a 40 mg/mL.
10. La preparación de HGF según la reivindicación 1, en la que la proteína de1HGF es una proteína de1HGF humana.
11. La preparación de HGF según la reivindicación 10, en la que la proteína de1HGF es una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6.
12. La preparación de HGF según la reivindicación 1, en la que la proteína de1HGF es una proteína que tiene un 80% o más de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 5 y tiene actividad biológica de HGF.
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