ES2905534T3

ES2905534T3 - Anticuerpo

Info

Publication number: ES2905534T3
Application number: ES16835194T
Authority: ES
Inventors: Naoki Hosen; Haruo Sugiyama; Atsushi Kumanogoh
Original assignee: Osaka University NUC
Current assignee: Osaka University NUC
Priority date: 2015-08-10
Filing date: 2016-08-09
Publication date: 2022-04-11
Anticipated expiration: 2036-08-09
Also published as: DK3336185T3; CY1124949T1; EP4005594A1; US20220064287A1; CN108138172B; EP3336185B1; PT3336185T; CA2995166A1; CA2995166C; EP3336185A1; PL3336185T3; HUE057499T2; US20180230212A1; US20230357390A1; LT3336185T; JP6534074B2; CN113683696A; JPWO2017026497A1; HRP20220069T1; SI3336185T1

Abstract

Anticuerpo, cuyo epítopo está presente dentro de una región de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 de CD98hc humana, que comprende: una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, una CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y una CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una CDR2 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y una CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo

Campo técnico

Se divulgan un nuevo anticuerpo, su uso, y similares.

Antecedentes de la técnica

El mieloma múltiple, que es un ejemplo típico de una enfermedad que provoca el crecimiento neoplásico de células ^{plasmáticas, representa aproximadamente el}1^{% de todos los cánceres y un poco más del}10^{% de todos los tumores}hemáticos malignos. El mieloma múltiple es una enfermedad en la que una célula plasmática presente en la médula ósea se vuelve cancerosa y experimenta un crecimiento monoclonal. En el mieloma múltiple, las células plasmáticas anómalas (células de mieloma) se diseminan a la médula ósea por todo el cuerpo y crecen en todas las partes de la médula ósea por todo el cuerpo. Cuando las células plasmáticas anómalas crecen, aparecen diversos síntomas, incluyendo la rotura de huesos. Las células de mieloma producen proteína M, que es una inmunoglobulina anómala, que aumenta la concentración de proteína M en sangre y, por tanto, la sangre se vuelve viscosa. La proteína M no funciona como un anticuerpo habitual, que reconoce una sustancia extraña que ha entrado en el cuerpo, tal como un patógeno, y por tanto reduce la inmunocompetencia. Estos fenómenos afectan a muchos órganos y provocan diversos síntomas. Los síntomas típicos son dolor óseo y daño óseo, hipercalcemia, nefropatía e insuficiencia renal, anemia, etc.

Los tratamientos del mieloma múltiple que se aplican principalmente en la actualidad son los inhibidores del proteasoma, los IMiD, tales como la talidomida y sus derivados, en concreto la lenalidomida, la quimioterapia usando, por ejemplo, melfalán en combinación con prednisona y el trasplante de células madre hematopoyéticas. Sin embargo, las células de mieloma eventualmente adquieren resistencia a estos agentes terapéuticos en la mayoría de los casos. Por tanto, la realidad es que con los enfoques de tratamiento actuales, un paciente con mieloma tiene un pronóstico poco prometedor con un periodo de supervivencia promedio después de la aparición de desde aproximadamente 3 años hasta 5 años. Además, surge el problema de que estos agentes terapéuticos no actúan específicamente sólo sobre las células tumorales diana; por tanto, los agentes también muestran toxicidad para las células normales, provocando así efectos secundarios graves.

Ha habido intentos de desarrollar un método de tratamiento para el mieloma múltiple usando un anticuerpo monoclonal. Por ejemplo, se han aplicado sólo recientemente un anticuerpo anti-CS1 (documento de patente 1) y un ^{anticuerpo anti-CD38 (documento de patente}2^{) en entornos clínicos.}

La solicitud de patente internacional publicada como WO 2013/078377 A1 describe anticuerpos que se unen a CD98. Más específicamente, se describe un anticuerpo aislado o un fragmento funcional del mismo, en el que el anticuerpo o fragmento funcional se une a un epítopo que comprende los residuos A377, D397, 1398, G400 y A401 de CD98 humana. Dicho epítopo puede comprender además uno o más residuos adicionales seleccionados del grupo que consiste en D374, L378, P379, G380, Q381, P382, F395, P296 y P399 de CD98 humana.

Lista de referencias

Bibliografía no de patente

NPL 1: Lonial et al., official journal of the American Society of Clinical Oncology, 1 de junio de 2012; 30(16): 1953 1959.

NPL 2: de Weers et al., Journal of immunology, 1 de febrero de 2011; 186(3): 1840-1848

NPL 3: J Immunol. 1 de noviembre de 2009; 183(9): 5563-74.

NPL 4: N Engl J Med. 16 de octubre 2014; 371(16): 1507-17.

Documento no de patente 5: Nat Biotechnol. Enero de 2002; 20(1): 70-5.

Sumario de la invención

Problema técnico

El anticuerpo anti-CS1 muestra una especificidad relativamente alta para las células de mieloma, pero el uso del anticuerpo solo no muestra necesariamente un alto grado de efecto anti-mieloma. La eficacia del anticuerpo como fármaco único no se ha demostrado en ensayos clínicos. Se encontró que el uso combinado del anticuerpo anti-CS1 con lenalidomida aumenta el efecto antitumoral del anticuerpo anti-CS1, y la FDA aprobó el anticuerpo anti-CS1 para este uso combinado. Aunque el anticuerpo anti-CD38 también fue aprobado por la FDA, CD38 es un antígeno que presenta baja especificidad como diana de tratamiento del mieloma múltiple debido a su expresión en células sanguíneas normales, incluyendo muchas células progenitoras hematopoyéticas positivas para CD34. En vista de este estado actual, un objeto es proporcionar un medio más eficaz para el tratamiento de enfermedades que implican el crecimiento neoplásico de células plasmáticas, tales como el mieloma múltiple.

Solución al problema

Los presentes inventores llevaron a cabo una extensa investigación para lograr el objetivo y llegaron a una nueva perspectiva de que incluso si una proteína no fuera específica para las células de mieloma, si la modificación postraduccional de la proteína fuera específica para las células de mieloma, un anticuerpo que la reconoce sería específico para mieloma. Los inventores esperaban entonces que aislando anticuerpos que se unían específicamente a las células de mieloma y a las células progenitoras de mieloma, e identificar las proteínas que los anticuerpos reconocen, se revelaría si las proteínas son específicas para las células de mieloma, o si los anticuerpos reconocen sólo a las que tienen alguna modificación postraduccional específica para mieloma a pesar de la no especificidad de las proteínas para las células de mieloma. Se supuso además que, en última instancia, será posible obtener un anticuerpo que sólo reconozca una proteína que tenga una modificación postraduccional específica para las células de mieloma y las células progenitoras de mieloma tal como se describió anteriormente.

Basándose en este concepto, los presentes inventores prepararon, usando líneas celulares de mieloma múltiple, 10.000 ^{clones o más de anticuerpos monoclonales que se unen a estas líneas celulares, se seleccionaron anticuerpos}que no se unen a los glóbulos sanguíneos normales de los clones e identificaron proteínas reconocidas por los anticuerpos. Como resultado, tal como se muestra en los ejemplos descritos más adelante, identificaron el anticuerpo R8H283 y revelaron que el antígeno unido por el anticuerpo R8H283 era CD98hc. Aunque CD98hc se expresa en glóbulos sanguíneos normales, se confirmó que el anticuerpo R8H283 reconoce específicamente las células de mieloma porque el epítopo del anticuerpo R8H283 está presente en la región afectada por la presencia del N-glicano en CD98hc, y porque la manera en que el N-glicano se une difiere entre una célula de mieloma (incluyendo las células plasmáticas de mieloma y las células progenitoras de mieloma) y un glóbulo sanguíneo normal. Además, los inventores confirmaron que el anticuerpo R8H283 tiene actividad citotóxica, que la proliferación de células de mieloma puede presentarse administrando el anticuerpo a un animal trasplantado con células de mieloma y que el anticuerpo R8H283 reconoce diversas otras células tumorales además de las células de mieloma. Después de una investigación adicional y una consideración exhaustiva basándose en estos hallazgos, los inventores han proporcionado invenciones representadas por el siguiente contenido.

Un anticuerpo, cuyo epítopo está presente dentro de una región de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 de CD98hc humana, que comprende

una región variable de cadena pesada que comprende

una CDR1 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1,

una CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y

una CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y

una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 de cadena ligera que comprende una secuencia de ^{aminoácidos que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:}6^,

una CDR2 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y

una CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene la secuencia de aminoácidos ^{de SEQ ID NO:}8^.

En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, y/o una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

En algunas realizaciones, el anticuerpo es un Fv, scFv, diacuerpo, triacuerpo, tetracuerpo, o una combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.

En algunas realizaciones, el anticuerpo es una inmunoglobulina, Fab, F(ab)', minicuerpo, scFv-Fc, o una combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, el anticuerpo tiene una sustancia que tiene actividad citotóxica, una enzima, una etiqueta, o un inmunomodulador unido al mismo.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un receptor de antígeno quimérico anti-CD98hc humana, cuyo epítopo está presente dentro de una región de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 de CD98hc humana, que comprende:

una región variable de cadena pesada que comprende

una región variable de cadena ligera que comprende

una CDR1 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene la secuencia de aminoácidos ^{de SEQ ID NO:}6^,

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un polinucleótido que codifica para el anticuerpo, tal como se define y describe en el presente documento, o el receptor de antígeno quimérico tal como se define y se describe en el presente documento.

En un aspecto adicional, la presente invención también se refiere a una célula huésped que comprende el polinucleótido tal como se define y se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula T.

En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula T con receptor de antígeno quimérico o un linfocito citolítico natural con receptor de antígeno quimérico.

En un aspecto final, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la presente invención, o el receptor de antígeno quimérico de la presente invención, o la célula de la presente invención.

Efectos ventajosos de la invención

Debido a que los anticuerpos según la presente invención reconocen específicamente células progenitoras de mieloma, células plasmáticas de mieloma, y otras células tumorales, los anticuerpos permiten el tratamiento eficaz de enfermedades, tales como tumores malignos, sin seleccionar como diana las células normales.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra (A) un procedimiento mediante el cual los anticuerpos que se unen a células plasmáticas de mieloma CD45-CD38++CD138+ y células progenitoras de mieloma CD45-CD38++CD138-, pero no a glóbulos sanguíneos CD45+ se seleccionaron a partir de los anticuerpos candidatos mediante citometría de flujo, y (B) los resultados confirmaron mediante FACS que el anticuerpo R8H283 se une a células plasmáticas de mieloma CD45-CD38++CD138+ y células progenitoras de mieloma CD45-CD38++CD138-, pero no a glóbulos sanguíneos CD45+. La figura 2 muestra la unión del anticuerpo R8H283 a células progenitoras de mieloma, células plasmáticas de mieloma, y células leucocitarias positivas para CD45 originadas a partir de pacientes con mieloma múltiple.

La figura 3 muestra un procedimiento mediante el cual células BaF3 unidas a anticuerpo R8H283 (inicialmente menos del 0,1%) se concentraron mediante clasificación FACS, y se identificó CD98hc, que era el antígeno unido.

La figura 4 muestra los resultados confirmados mediante FACS que el anticuerpo R8H283 se une a células U266, pero no a células U266 defectuosas en CD98hc. MEM-108 es un anticuerpo anti-CD98 humana.

La figura 5 muestra los resultados del análisis de FACS de la unión del anticuerpo R8H283 y el anticuerpo MEM-108 a fracciones celulares de células de sangre periférica (A) y células de médula ósea (B) de un individuo sano.

^{La figura}6 ^{muestra los resultados de un estudio en el que el anticuerpo R8H283 y el anticuerpo MEM-108 de}concentraciones diferentes se unieron a linfocitos B y células de linfocitos T de sangre periférica de un individuo sano y se tiñeron con un anticuerpo anti-IgG de ratón-PE, seguido por el análisis de FACs . El eje horizontal indica la concentración de anticuerpo, y el eje vertical indica la intensidad de fluorescencia. A diferencia de MEM108, R8H283 no se unió en absoluto a los linfocitos, incluso cuando se aumentó la concentración del anticuerpo.

La figura 7 muestra los resultados del análisis de FACS de la unión del anticuerpo R8H283 y el anticuerpo MEM-108 a células endoteliales vasculares normales (células HUVEC).

^{La figura}8 ^{muestra los resultados del análisis de FACS de la unión del anticuerpo R8H283 a diversas líneas de células}cancerosas.

La figura 9 muestra los resultados del análisis de FACS de la unión del anticuerpo R8H283, anticuerpo anti-CS1, anticuerpo CD38 y anticuerpo anti-BST2 a diversas fracciones celulares de células de sangre periférica de un individuo sano.

La figura 10 muestra (A) los resultados del análisis de FACS de la unión del anticuerpo R8H283 y el anticuerpo MEM-108 a una línea celular de mieloma RPMI8226 y una línea celular de leucemia mieloide U937, y (B) los resultados de un estudio en el que el anticuerpo R8H283 y el anticuerpo MEM-108 de concentraciones diferentes se unieron a una línea celular de mieloma RPMI8226 y una línea celular de leucemia mieloide U937 y se tiñeron con un anticuerpo anti-IgG de ratón-PE, seguido por análisis de FACS. El eje horizontal indica la concentración de anticuerpo, y el eje vertical indica la intensidad de fluorescencia. A diferencia de MEM108, R8H283 casi no se unió en absoluto a U937, incluso cuando se aumentó la concentración del anticuerpo.

La figura 11 muestra (A) los resultados del análisis de FACS de la unión de R8H283 y MEM-108 a células U937 tratadas con tunicamicina (2,5 |ig/ml) durante 48 horas y células U937 sin tratar. Los valores indican una intensidad de fluorescencia media de unión a R8H283 (un valor corregido dividiendo la intensidad de fluorescencia media (MFI) entre la MFI del control de isotipo). La figura 11 también muestra (B) los resultados del análisis de FACS de la unión del anticuerpo R8H283 o MEM-108 a células U937 tratadas con tapsigargina (1 mM) durante 48 horas y células U937 sin tratar.

La figura 12 muestra los resultados de un estudio en el que los lisados celulares de células U937 o células THP1, ambos tratados con tapsigargina (1 mM) durante 48 horas y un lisado celular de células sin tratar, se sometieron cada uno a electroforesis en gel SDS-PAGE. y luego se sometió a inmunotransferencia de tipo Western usando un anticuerpo policlonal anti-CD98 (H300: Santa Cruz Biotechnology, Inc.). El peso molecular de CD98 se redujo por inhibición de la función del retículo endoplásmico debido al tratamiento con tapsigargina, lo que indica su posible expresión con glicosilación incompleta.

La figura 13 muestra (A) los resultados del análisis de FACS de la unión del anticuerpo R8H283 a células de mieloma MM1 tratadas con bortezomib (10 nM) durante 16 horas y células MM1 sin tratar, y (B) los resultados del análisis de FACS de la unión del anticuerpo R8H283 y el anticuerpo MEM-108 a las células de médula ósea tratadas con bortezomib (2 nM) durante 48 horas y las células sin tratar se originaron a partir de un paciente con mieloma. La figura 13 muestra los resultados del análisis de FACS de la unión del anticuerpo R8H283 y el anticuerpo MEM-108 a células de mieloma (MM) fuertemente positivas para CD38 positivas para CD138 y células T positivas para CD3.

La figura 14 muestra la construcción de proteínas CD98hc de quimera humano/ratón y la presencia o ausencia de la unión del anticuerpo R8H283 o el anticuerpo MEM-108 a células CHO que expresan de manera transitoria las proteínas (figura superior), y los resultados del análisis de FACS de la unión del anticuerpo R8H283 y el anticuerpo MEM-108 a células CHO que expresan de manera transitoria proteínas CD98hc de quimera humano/ratón (figura inferior).

La figura 15 muestra la construcción de proteínas CD98hc de quimera humano/ratón y la presencia o ausencia de la unión del anticuerpo R8H283 a células CHO que expresan de manera transitoria las proteínas (figura superior), y los resultados del análisis de FACS de la unión del anticuerpo R8H283 a células CHO que expresan de manera transitoria proteínas CD98hc de quimera humano/ratón (figura inferior).

La figura 16 muestra (A) y (B) la presencia o ausencia de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos debida al anticuerpo R8H283, y muestra (C) y (D) la presencia o ausencia de citotoxicidad celular dependiente del complemento debida al anticuerpo R8H283. u 266, Op M2, NCI-H929 y RPMI8226 son todas líneas celulares de mieloma. En las pruebas cuyos resultados se muestran en (B) y (D), se añadió cada anticuerpo para dar una concentración final de 10 |ig/ml.

La figura 17 muestra (A) y (C) cambios en el volumen de la masa tumoral formada por la línea celular de mieloma OPM2 que se había trasplantado por vía subcutánea en ratones SCID, y (B) el tamaño del tumor de un ratón de control y un ratón al que se le administró el anticuerpo R8H283 el día 21. Las flechas indican el ancho del tumor.

La figura 18 muestra (A) un diseño de experimento para confirmar el efecto terapéutico del anticuerpo R8H283 sobre la línea celular de mieloma U266 trasplantada a un ratón NOG a través de la circulación venosa (parte izquierda) y un ejemplo de los resultados del análisis de médula ósea el día 14 (parte derecha). La figura 18 muestra (B) los resultados mediante los cuales se confirmó que el anticuerpo R8H283 tiene la capacidad de eliminar de manera dependiente de la dosis las células U266 injertadas en la médula ósea y (C) la diseminación de las células U266 en el día 40 observada mediante IVIS después de que se le administraran 5 mg/kg del anticuerpo.

La figura 19 muestra (A) un diseño experimental del tratamiento para confirmar el efecto terapéutico del anticuerpo R8H283 sobre la línea celular de mieloma U266 trasplantada en una médula ósea de ratón BRGs y (B) los resultados del volumen del tumor en la médula ósea antes y después de la administración del anticuerpo o bortezomib (Bor) detectado por expresión de luciferasa. La figura 19 también muestra (C) cambios en el volumen del tumor de cada grupo de tratamiento.

La figura 20 muestra las estructuras de la CD98hc de quimera humano/ratón en el lado superior. “m328h427” significa que los residuos de aminoácido en las posiciones 328 a 427 de CD98hc son residuos de aminoácido de CD98hc originados en humano, y que los residuos de aminoácido restantes son los de origen de ratón. Lo mismo se aplica a la otra CD98hc de quimera. La figura 20 muestra en el lado inferior la fuerza de unión del anticuerpo R8H283 a células 293T que expresan de manera transitoria la CD98hc de quimera humano/ratón. La MFI en el eje vertical indica la fuerza de unión del anticuerpo R8H283; cuanto mayor sea el valor, más fuerte será la unión.

La figura 21 muestra las secuencias de aminoácidos en las posiciones 365 a 409 de CD98hc humana y CD98hc de ratón. Las regiones rodeadas por una línea discontinua indican que cuando los residuos de aminoácidos en estas regiones se reemplazan por residuos de aminoácido originados en ratón, el anticuerpo R8H283 no se unirá a estas secuencias. Los residuos de aminoácido indicados por flechas son los que difieren entre CD98hc humana y CD98hc de ratón.

La figura 22 muestra la fuerza de unión del anticuerpo R8H283 a células 293T que expresan CD98hc humana, CD98hc de ratón o 7 tipos de variantes de CD98hc humana. Las tablas de la parte superior muestran los resultados de la citometría de flujo y la tabla de la parte inferior muestra gráficamente la MFI.

Descripción de las realizaciones

El alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

1. Definición

La “célula progenitora de mieloma” es una célula progenitora en la etapa inmediatamente anterior a la diferenciación en una célula plasmática de mieloma. Aunque la célula progenitora de mieloma expresa en gran medida CD38, la célula se caracteriza por la ausencia de expresión de CD138, que es un marcador específico para las células plasmáticas maduras. Por tanto, la célula progenitora de mieloma también puede denominarse “célula CD38++CD138-” o “célula CD19-CD38++CD138-”.

La “célula plasmática de mieloma” también se refiere normalmente a “célula de mieloma”, y produce proteína M, que es una inmunoglobulina anómala. En células plasmáticas de mieloma, además del alto nivel de expresión CD38, también se expresa CD138. Por tanto, la célula plasmática de mieloma también puede denominarse “célula CD38++CD138+” o “célula CD19-CD38++CD138+”.

“Célula progenitora de mieloma” y “célula plasmática de mieloma” también significan respectivamente una célula progenitora tumoral y una célula plasmática neoplásica en enfermedades que provocan crecimiento neoplásico de una célula plasmática, distinta de mieloma múltiple.

La “célula progenitora hematopoyética” es una célula capaz de diferenciarse en diversos glóbulos sanguíneos. La célula progenitora hematopoyética se caracteriza por la expresión de CD34. Por tanto, “célula progenitora hematopoyética” tal como se usa en el presente documento puede denominarse “célula CD34+”.

En esta memoria descriptiva, aunque “comprender”, “contener”, “incluir” y “tener” son términos de lenguaje abierto, estos términos incluyen el concepto del término de lenguaje cerrado “consiste en” y pueden reemplazarse por “consiste en” en una realización.

2. Anticuerpo

Se proporciona un anticuerpo que reconoce un epítopo que contiene un sitio de N-glicosilación de CD98hc humana y que está expuesto inhibiendo la glicosilación con unión a N. CD98 (o “4F2”) es una proteína de heterodímero de aproximadamente 120 kDa que se expresa en una membrana celular y se sabe que funciona como un transportador de aminoácidos. CD98hc es una proteína transmembrana de tipo II de aproximadamente 80 kDa que constituye CD98 y puede denominarse “4F2hc” o “SLC3A2”. Aunque existen varias isoformas (por ejemplo, b, c, e y f) para CD98hc humana, estas isoformas tienen una secuencia de aminoácidos común para su dominio extracelular. La lista de secuencias muestra la secuencia de aminoácidos de la isoforma f, que es una CD98hc humana típica, como SEQ ID NO: 21. La CD98hc humana tiene una estructura en la que los N-glicanos pueden unirse a la posición 264, posición 280, posición 323 y posición 405 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21. Aunque la secuencia de aminoácidos de la isoforma f de CD98hc humana se hace referencia como un ejemplo típico en esta memoria descriptiva, un experto en la técnica entendería que la secuencia correspondiente y los residuos de aminoácido correspondientes están presentes en otras isoformas y funcionan de manera equivalente.

Tal como se muestra en los ejemplos descritos más adelante, se considera que los N-glicanos en CD98hc en células de mieloma, células progenitoras de mieloma y otras células tumorales han experimentado un cambio (por ejemplo, fallo de la glicosilación con unión a N). Esto probablemente se deba a que las células de mieloma, las células progenitoras de mieloma y otras células tumorales siempre están sometidas a estrés del retículo endoplásmico y se inhibe la glicosilación con unión a N. Esto sugiere que una secuencia de aminoácidos de CD98hc a la que un anticuerpo no puede acceder en otras células normales está expuesta en la superficie de las células de mieloma, células progenitoras de mieloma u otras células tumorales, por lo que el anticuerpo puede acceder a la secuencia de aminoácidos. En esta memoria descriptiva, esta región de CD98hc específica para la célula de mieloma y la célula progenitora de mieloma se denomina la “región que contiene un sitio de N-glicosilación de CD98hc humana, y que está expuesta inhibiendo la glicosilación con unión a N” o la “región afectada por la presencia de un N-glicano”. Debido a que está presente un epítopo en esta región, el anticuerpo puede reconocer específicamente una célula de mieloma o una célula progenitora de mieloma. El tamaño de la región puede ser de cualquier tamaño y no está particularmente limitado. Por ejemplo, la región está compuesta por 40 residuos de aminoácido o menos, 35 residuos de aminoácido o menos, 30 residuos de aminoácido o menos, 25 residuos de aminoácido o menos, 20 residuos de aminoácido o menos, 15 residuos de aminoácido o menos, o 10 residuos de aminoácido o menos. Es posible que el epítopo no contenga ningún sitio de N-glicosilación de CD98hc humana.

“Sitio de N-glicosilación de CD98hc humana” se refiere, entre los residuos de aminoácido que constituyen la CD98hc humana, a residuos de aminoácido a los que se une un N-glicano. En una realización, el sitio de N-glicosilación es un residuo de asparagina en la posición 264, 280, 323 ó 405 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21. En una realización preferible, el sitio de N-glicosilación es un residuo de asparagina en posición 405 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

Un anticuerpo anti-CD98hc humana tiene preferiblemente la propiedad que su afinidad para CD98hc se aumenta inhibiendo la unión de un N-glicano a CD98hc expresada en una célula. La unión de un N-glicano a CD98hc puede inhibirse, por ejemplo, tratando la célula que expresa CD98hc con tunicamicina, tapsigargina o bortezomib. Por tanto, si la cantidad de unión del anticuerpo a CD98hc humana se aumenta tratando una célula que expresa CD98hc humana (por ejemplo, célula U937) con estos agentes medicinales en comparación con una célula sin tratar, se confirma que el anticuerpo tiene una afinidad aumentada por CD98hc humana inhibiendo la unión de un N-glicano a CD98hc humana o para reconocer un epítopo expuesto inhibiendo la glicosilación con unión a N. Este método también puede determinar si el epítopo para el anticuerpo está presente dentro de la región afectada por la presencia de un N-glicano. Específicamente, si se cambia la capacidad de unión del anticuerpo a CD98hc humana tratando una célula que expresa CD98hc humana con los agentes medicinales en comparación con la célula sin tratar, se determina que el epítopo para anticuerpo está dentro de la región afectado por la presencia de un N-glicano.

El anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo anti-CD98hc humana cuya afinidad por CD98hc humana se aumenta eliminando una cadena de azúcar que se une a CD98hc humana. Si un anticuerpo tiene esta propiedad puede confirmarse mediante cualquier técnica. Por ejemplo, la afinidad de un anticuerpo porCD98hc humana expresada con la condición de que una cadena de azúcar se una a CD98hc humana puede compararse con la afinidad del anticuerpo por CD98hc humana expresada con la condición de que la unión de una cadena de azúcar se inhiba o disminuya; entonces, se confirma si el anticuerpo tiene la propiedad de que la afinidad para CD98hc humana se aumente eliminando la cadena de azúcar que se une a CD98hc humana. La unión de una cadena de azúcar a CD98hc humana puede inhibirse o disminuirse, por ejemplo, tratando una célula que expresa CD98hc con tunicamicina, tapsigargina o bortezomib tal como se describió anteriormente. Las condiciones específicas en las que la célula que expresa CD98hc humana se trata con tunicamicina, tapsigargina o bortezomib no están particularmente limitadas, siempre que la unión de una cadena de azúcar se inhiba o disminuya. Por ejemplo, las condiciones pueden cumplir con las condiciones usadas en los ejemplos descritos posteriormente. la célula que expresa CD98hc para su uso es, por ejemplo, una célula U937. El aumento en la afinidad puede medirse usando como indicador un aumento en la intensidad de fluorescencia (intensidad de fluorescencia media) provocado por la unión del anticuerpo en un análisis de citometría de flujo realizado según las condiciones usadas en los ejemplos descritos posteriormente. El grado del aumento en la intensidad de fluorescencia no está particularmente limitado. Por ejemplo, cuando se usa una célula U937, el grado de aumento en la intensidad de fluorescencia es preferiblemente de 1,5 veces o más, 1,7 veces o más, o 2 veces o más la intensidad de fluorescencia antes del tratamiento. Cuando se usa una célula THP-1, el grado de aumento en ^{la intensidad de fluorescencia es preferiblemente, por ejemplo, 3 veces o más, 4 veces o más, 5 veces o más, o}6 veces o más la intensidad de fluorescencia antes del tratamiento.

El anticuerpo anti-CD98 humana es preferiblemente un anticuerpo anti-CD98hc humana cuya afinidad por una variante de CD98hc en la que los residuos de aminoácido en las posiciones 395 a 397 de CD98hc humana se reemplazan por residuos de aminoácido de CD98hc originada en ratón es equivalente a su afinidad para la CD98hc originada en ratón. La variante de CD98hc en la que los residuos de aminoácido en las posiciones 395 a 397 de CD98hc humana se reemplazan por residuos de aminoácido de CD98hc originada en ratón es una variante de CD98hc humana en la que F en la posición 395, P en la posición 396, y D en la posición 397 en CD98hc humana se reemplazan respectivamente por I, F y H. La afinidad del anticuerpo anti-CD98hc humana por una variante de CD98hc humana que es equivalente a su afinidad por CD98hc humana originada en ratón significa que el anticuerpo anti-CD98hc humana no se une sustancialmente a la variante de CD98hc humana.

El anticuerpo anti-CD98 humana es preferiblemente un anticuerpo anti-CD98hc humana cuya afinidad por una variante de CD98hc en la que los residuos de aminoácido en las posiciones 400 y 401 de CD98hc humana se reemplazan por residuos de aminoácido de CD98hc originada en ratón es equivalente a su afinidad por la CD98hc originada en ratón. La variante de CD98hc en la que los residuos de aminoácido en las posiciones 400 y 401 de CD98hc humana se reemplazan por residuos de aminoácido de CD98hc originada en ratón es una variante de CD98hc humana en la que G en la posición 400 y A en la posición 401 en CD98hc humana se reemplazan respectivamente por R y P. La afinidad del anticuerpo anti-CD98hc humana por una variante de CD98hc humana que es equivalente a su afinidad por CD98hc humana originada en ratón significa que el anticuerpo anti-CD98hc humana no se une sustancialmente a la variante de CD98hc humana.

La afinidad por una variante de CD98hc humana que es equivalente a su afinidad por CD98hc originada en ratón significa lo siguiente: la fuerza de unión de una CD98hc originada en ratón y la fuerza de unión de una variante de CD98hc se miden en las mismas condiciones con un citómetro de flujo; la razón de la fuerza de unión representada por una intensidad de fluorescencia media (MFI) entre las mismas (la fuerza de unión de la variante de CD98hc/la fuerza de unión de la CD98hc originada en ratón) es de 1,1 a 0,9, y preferiblemente de 1,05 a 0,95.

Un anticuerpo que tiene una propiedad de este tipo puede obtenerse mediante el siguiente procedimiento. En primer lugar, se obtiene un anticuerpo anti-CD98hc humana usando, como antígeno, una célula de ratón en la que se ha expresado CD98hc humana según el método de los ejemplos descritos posteriormente. A continuación, una célula c Ho que expresa una variante de CD98hc preparada reemplazando los residuos de aminoácido en las posiciones 395 a 397 de CD98hc humana por los residuos de aminoácido de la CD98hc originada en ratón según el método de los ejemplos (un constructo F395I/P396F/D397H en los ejemplos descritos posteriormente) se tiñe con el anticuerpo obtenido, y se realiza el análisis de citometría de flujo. Al mismo tiempo, una célula CHO que expresa CD98hc de ratón también se tiñe, y se analiza mediante citometría de flujo. Por último, es posible obtener un anticuerpo anti-CD98hc humana cuya afinidad por la variante de CD98hc en la que los residuos de aminoácido en las posiciones 395 a 397 de CD98hc humana se reemplazan por los residuos de aminoácido de CD98hc originada en ratón es equivalente a su afinidad por la CD98hc originada en ratón seleccionando uno cuya afinidad por la variante de CD98hc humana sea equivalente a su afinidad por la CD98hc originada en ratón. Afinidad equivalente significa que la razón de la fuerza de unión de una CD98hc originada en ratón con respecto a la fuerza de unión de una variante de CD98hc ambas medidas en las mismas condiciones con un citómetro de flujo (la fuerza de unión de variante de CD98hc/la fuerza de unión de CD98hc originada en ratón) es de 1,1 a 0,9, y preferiblemente de 1,05 a 0,95 (la fuerza de unión se representa por una intensidad de fluorescencia media (MFI)).

El epítopo expuesto inhibiendo la glicosilación con unión a N de CD98hc humana está presente preferiblemente en la región correspondiente a las posiciones 203 a 427 de SEQ ID NO: 21 en CD98hc humana. El epítopo para el anticuerpo está presente preferiblemente en la región correspondiente a las posiciones 365 a 427 de SEQ ID NO: 21 en CD98hc humana. El epítopo para el anticuerpo está presente preferiblemente en la región correspondiente a las posiciones 365 a 409 de SEQ ID NO: 21 en CD98hc humana. La expresión “correspondiente a” se usa en este caso ya que las dos regiones descritas anteriormente en CD98hc humana distintas de la isoforma f no están necesariamente en las posiciones 365 a 427 y las posiciones 365 a 409 del residuo de aminoácido en el extremo N-terminal tomado como la posición 1. La secuencia de aminoácidos en las posiciones 365 a 427 de SEQ ID NO: 21 es la siguiente: FSYGDEIGLDAAALPGQPMEAPVMLWDESSFPDIPGAVSANMTVKGQSEDPGSLLSLFRRLSDQR (SEQ ID NO: 22). La secuencia de aminoácidos en las posiciones 365 a 409 de SEQ ID NO: 21 es la siguiente:

FSYGDEIGLDAAALPGQPMEAPVMLWDESSFPDIPGAVSANMTVK (SEQ ID NO: 23). Por tanto, el epítopo expuesto inhibiendo la glicosilación con unión a N de CD98hc humana está presente preferiblemente en la región de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 de CD98hc humana, y más preferiblemente presente en la región de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23. La secuencia de aminoácidos en las posiciones 203 a 427 de SEQ ID NO: 21 se muestra como SEQ ID NO: 24 en la lista de secuencias.

El epítopo para el anticuerpo anti-CD98hc humana está presente preferiblemente en la región en las posiciones 365 a 376 y en la región en las posiciones 395 a 409 de CD98hc humana. El epítopo para el anticuerpo anti-CD98hc humana contiene preferiblemente los residuos de aminoácido en las posiciones 374, 375, 395, 396, 397, 400 y 401 de CD98hc humana. Tal como se usa en el presente documento, la posición de un residuo de aminoácido de CD98hc humana es la posición en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 a menos que se indique lo contrario.

Si un epítopo para el anticuerpo está presente en la región de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 23 puede confirmarse por el siguiente procedimiento. Específicamente, se construye un polinucleótido; el polinucleótido codifica para la CD98hc de quimera humano/ratón en la que la región distinta de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 23 se reemplaza por secuencias de aminoácidos de CD98hc originada en ratón. Luego se expresa de manera forzada el polinucleótido en una célula adecuada. Por separado, se prepara una célula de la misma clase en la que la CD98hc de ratón se ha expresado de manera forzada. Se mide la unión del anticuerpo a estas células. Cuando el anticuerpo se une a la célula que expresa la CD98hc de quimera, pero no a la célula que expresa CD98hc de ratón, se determina que está presente un epítopo en la región. En este caso, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 se describe como ejemplo, y la medición también puede realizarse de la misma manera en el caso de otras regiones o sitios.

Un ejemplo del anticuerpo que reconoce un epítopo que contiene un sitio de N-glicosilación de CD98hc humana y que se expone inhibiendo la glicosilación con unión a N, y presentando afinidad aumentada por CD98hc humana inhibiendo la unión del N-glicano a CD98hc humana, es el anticuerpo R8H283 obtenido en los ejemplos descritos posteriormente. Por tanto, en una realización, el epítopo para el anticuerpo es preferiblemente idéntico al epítopo para el anticuerpo R8H283. En otra realización, el anticuerpo es preferiblemente el anticuerpo R8H283.

El anticuerpo puede tener cualquier estructura, siempre que el anticuerpo presente las propiedades descritas anteriormente y esté dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. El anticuerpo tiene una preferiblemente una región determinante de complementariedad idéntica a al menos una región determinante de complementariedad seleccionada del grupo que consiste en tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3) y tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3) del anticuerpo R8H283. Las secuencias de aminoácidos de la región hipervariable de cadena pesada y región hipervariable de cadena ligera del anticuerpo R8H283 son tal como se muestran en la tabla 1 a continuación.

Tabla 1

^{Según la invención, el anticuerpo contiene todas las}6 ^CDR.

En una realización, la región variable de cadena pesada del anticuerpo preferiblemente tiene la misma secuencia de aminoácidos que la de la región variable de cadena pesada del anticuerpo R8H283 (SEQ ID NO: 4). En una realización, la región variable de cadena ligera del anticuerpo tiene preferiblemente la misma secuencia de aminoácidos que la de la región variable de cadena ligera del anticuerpo R8H283 (SEQ ID NO: 9). El anticuerpo tiene preferiblemente la misma secuencia de aminoácidos que la de la región variable de cadena pesada del anticuerpo R8H283 (SEQ ID NO: 4) y la misma secuencia de aminoácidos que la de la región variable de cadena ligera del anticuerpo R8H283 (SEQ ID NO: 9). Tal como se usa en el presente documento, el significado de “ la misma” incluye el significado de no sólo una coincidencia completa de secuencias de aminoácidos, sino también que tiene sustancialmente el mismo epítopo ^{que el del anticuerpo R8H283 con uno ovarios (por ejemplo, 15 o menos, preferiblemente}10 ^{o menos, preferiblemente}5 o menos, preferiblemente 3 o menos, preferiblemente 2) residuos de aminoácido que son diferentes.

En una realización, la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo tiene al menos el 90%, preferiblemente al menos el 95%, preferiblemente al menos el 98%, y preferiblemente al menos el 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En una realización, la región variable de cadena ligera del anticuerpo tiene al menos el 95%, preferiblemente al menos el 98%, y preferiblemente al menos el 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. La identidad de secuencias de aminoácidos se mide mediante la técnica descrita posteriormente.

El anticuerpo puede tener cualquier estructura siempre que el anticuerpo reconozca un epítopo que contenga un sitio de N-glicosilación de CD98hc humana y que se expone inhibiendo la glicosilación con unión a N, y el anticuerpo no necesita necesariamente contener una región constante. Por ejemplo, la estructura del anticuerpo puede ser cualquier estructura seleccionada del grupo que consiste en Fv, scFv, diacuerpo, triacuerpo, tetracuerpo, y cualquier combinaciones de los mismos.

“Fv” se considera que es la unidad de estructura más pequeña de un anticuerpo y tiene la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera que se agregan mediante interacción intermolecular no covalente. En Fv, un grupo tiol del residuo de cisteína presente en la región variable de cadena pesada y un grupo tiol del residuo de cisteína presente en la región variable de cadena ligera pueden estar unidos por enlaces disulfuro.

“scFv” tiene la estructura en la que el extremo C-terminal de la región variable de cadena pesada y el extremo N-terminal de la región variable de cadena ligera se unen a través de un ligador, y también se denomina “anticuerpo de cadena sencilla”. scFv puede tener la estructura en la que el extremo N-terminal de la región variable de cadena pesada y el extremo C-terminal de la región variable de cadena ligera se unen a través de un ligador.

El “diacuerpo,” “triacuerpo”, y “tetracuerpo” respectivamente se refieren a un dímero, un trímero y un tetrámero formados por scFv descrito anteriormente y son cada uno una estructura agregada y estructuralmente estabilizada, por ejemplo, mediante la interacción intermolecular no covalente de las regiones variables, como con Fv.

Un anticuerpo que tenga una estructura de este tipo puede prepararse seleccionando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo puede obtenerse construyendo un vector de expresión usando una técnica de ingeniería genética de genes, y permitiendo que se exprese en una célula huésped o sistema de expresión libre de células adecuados para la producción del anticuerpo. La célula huésped puede ser de cualquier tipo y el tipo no está particularmente limitado. Por ejemplo, la célula huésped puede seleccionarse de manera adecuada a partir de células procariotas (por ejemplo, Escherichia coli y actinomiceto) y células eucariotas (por ejemplo, células de levadura, células de insecto y células de mamífero). Un anticuerpo de alta pureza puede obtenerse sometiendo el anticuerpo expresado a cualquier técnica de purificación.

El anticuerpo tiene preferiblemente una región constante. Se sabe que una cadena pesada posee tres tipos de regiones constantes, CH1, CH2, y CH3 y una cadena ligera posee un tipo de región constante CL. La región que contiene CH2 y CH3 también se denomina “dominio Fc”. El anticuerpo puede contener al menos una región constante seleccionada del grupo que consiste en CH1, CH2, CH3 y CL, y puede contener todas las regiones constantes.

La secuencia de aminoácidos de la región constante es algo constante dependiendo del origen y la clase del anticuerpo. La región constante puede ser de cualquier origen. Por ejemplo, la región constante puede ser de origen humano, origen de ratón, origen de rata, origen de conejo, origen de mono u origen de chimpancé. El origen de la región constante puede seleccionarse dependiendo del propósito, tal como producción en serie o una disminución en la inmunogenicidad para humanos.

En una realización, el anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo quimérico. El anticuerpo quimérico puede obtenerse, por ejemplo, reemplazando la región constante de un anticuerpo de ratón por la región constante de origen humano. El anticuerpo quimérico puede prepararse según un método conocido.

En una realización, el anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo humanizado. El anticuerpo humanizado puede obtenerse, por ejemplo, reemplazando no sólo la secuencia de aminoácidos de la región constante de un anticuerpo de ratón, sino también la secuencia de aminoácidos en la región distinta de la región hipervariable presente en la región variable por las secuencias de aminoácidos de un anticuerpo humano. La región distinta de la región hipervariable presente en la región variable se denomina “FR”. La región FR1 entre el extremo N-terminal y la CDR1, la región FR2 entre la CDR1 y la CDR2, la región FR3 entre la CDR2 y la CDR3, y la región FR4 entre la CDR3 y el extremo carboxilo terminal (extremo C-terminal) de la región variable están presentes tanto en la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera. Un anticuerpo humanizado puede obtenerse humanizando al menos una región entre estas regiones o todas. Aproximadamente el 90% o más de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humanizado es normalmente de origen humano, pero el porcentaje no está limitado a esto. El anticuerpo humanizado puede prepararse según un método conocido.

En una realización, el anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo humano. El anticuerpo humano se refiere a un anticuerpo cuya estructura completa, incluyendo las regiones variables, se origina a partir de un humano. El anticuerpo humano también puede denominarse “anticuerpo completamente humanizado”. El anticuerpo humano puede prepararse, por ejemplo, mediante un método de clonación de genes de anticuerpos humanos usando exposición en fago, un método de preparación que implica la inmunización contra un ratón transgénico de tipo humano, inmortalización de una célula productora de anticuerpos humanos con virus de EB, o un método en el que un compañero de fusión se fusiona con una células mononuclear de sangre periférica humana.

En una realización, el anticuerpo contiene preferiblemente una región constante. La estructura del anticuerpo que incluye una región constante puede ser cualquier estructura. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser una inmunoglobulina que es una combinación de dos estructuras cada una se compone de una cadena pesada sencilla que tiene una región variable de cadena pesada y una región constante de cadena pesada y una cadena ligera sencilla que tiene una región variable de cadena ligera y una región constante de cadena ligera; o el anticuerpo también puede tener la estructura denominada “Fab”, “F(ab')2”, “minicuerpo”, “scFv-Fc”, o cualquier combinación de los mismos. En una realización, el anticuerpo puede ser un receptor de antígeno quimérico, una célula T con receptor de antígeno quimérico, un linfocito citolítico natural con receptor de antígeno quimérico, o similar descritos posteriormente.

“Fab” contiene un fragmento de una cadena pesada que contiene la región variable de cadena pesada y CH1 en la región constante de cadena pesada y una cadena ligera que contiene la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera (CL), y la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera se agregan mediante la interacción intermolecular no covalente descrita anteriormente, o se unen entre sí a través del enlace disulfuro. En el Fab, CH1 y CL pueden estar unidas por enlaces disulfuro por los grupos tiol de los respectivos residuos de cisteína.

^“F(ab')2^{” se refiere a la estructura que contiene un par de Fab en los que la CH1 de un Fab está unida por enlaces}disulfuro a la CH1 de otro Fab por grupos tiol de los respectivos residuos de cisteína.

“Minicuerpo” se refiere a la estructura en la que dos fragmentos que contienen cada uno CH3 unida a una región variable de cadena pesada que constituyen scFV se agregan entre CH3-CH3 por interacción intermolecular no covalente.

“scFv-Fc” se refiere a la estructura en la que dos fragmentos de anticuerpo que contienen cada uno scFv, CH2 y CH3 se agregan entre CH3-CH3 por interacción intermolecular no covalente, como con el minicuerpo, y los fragmentos están unidos por enlaces disulfuro a través de grupos tiol de los residuos de cisteína contenidos en la respectiva CH3.

Puede prepararse una variedad de anticuerpos que contienen estas regiones constantes mediante cualquier método conocido en la técnica, como con el anticuerpo que no contiene ninguna de estas regiones constantes descritas anteriormente. Fab también puede obtenerse, por ejemplo, descomponiendo una IgG (inmunoglobulina) usando una ^{proteasatal como papaína. F(ab}')2 ^{también puede obtenerse descomponiendo una IgG usando una proteasatal como}pepsina.

En una realización, el anticuerpo es preferiblemente una inmunoglobulina. La clase de la inmunoglobulina no está particularmente limitada. Los ejemplos incluyen IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y una subclase de las mismas. En una realización, el anticuerpo es preferiblemente IgG. Por ejemplo, si el anticuerpo es IgG originada en ratón, IgG2 es preferible entre las cuatro subclases.

Los ejemplos de la estructura del anticuerpo que contiene una región constante incluyen una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y/o una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 es una secuencia de aminoácidos que contiene la región variable de cadena pesada del anticuerpo R8H283 y la región constante de cadena pesada del anticuerpo IgG. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 contiene la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo R8H283 y la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena ligera del anticuerpo IgG. En una realización, el anticuerpo contiene una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

Cuando el anticuerpo contiene al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a 10, la al menos una secuencia de aminoácidos puede contener cualquier mutación siempre que el epítopo para el anticuerpo esté presente dentro de la región afectado por la presencia de un N-glicano en la CD98hc humana. En una realización, preferiblemente no existe ninguna mutación en la región hipervariable o región determinante de complementariedad del anticuerpo. Esto es debido a que una mutación en la región hipervariable o la región determinante de complementariedad se considera que afecta normalmente al epítopo. Por tanto, en una realización, una mutación en la región variable está presente preferiblemente en la región FR de cadena pesada y una región FR de cadena ligera. También es posible ajustar la actividad de ADCC y/o actividad de CDC del anticuerpo insertando una mutación en la región constante.

El número de mutaciones introducidas en la al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a 10 (conversión de residuos de aminoácido) no está particularmente limitado. En una realización, la identidad de la secuencia de aminoácidos antes de la introducción de mutaciones con la secuencia de aminoácidos después de la introducción de mutaciones es de al menos el 70%, preferiblemente al menos el 75%, preferiblemente al menos el 80%, preferiblemente al menos el 85%, preferiblemente al menos el 90%, preferiblemente al menos el 95%, preferiblemente al menos el 96%, preferiblemente al menos el 97%, preferiblemente al menos aproximadamente el 98%, y preferiblemente al menos el 99%. El porcentaje de identidad mediante redondeo.

La identidad de aminoácidos puede calcularse con una herramienta analítica comercialmente disponible o una herramienta analítica disponible a través de Internet (por ejemplo, un software tal como FASTA, BLAST, PSI-BLAST o SSEARCH). Por ejemplo, las condiciones iniciales principales aplicadas generalmente para una búsqueda por BLAST son tal como se describen a continuación. Específicamente, un valor (%) de la identidad de una secuencia de aminoácidos con otra secuencia puede calcularse realizando una búsqueda en Advanced BLAST 2.1 con blastp para el programa, con el valor esperado establecido en 10, todos los filtros apagados, BLOSUM62 usada para la matriz, el coste de existencia de huecos, coste de hueco por residuo y la razón lambda establecidos en 11, 1 y 0,85 (valores predeterminados), respectivamente, y otros diversos parámetros también se establecen en los valores predeterminados.

La mutación introducida en una secuencia de aminoácidos descrita anteriormente, por ejemplo, sustitución, deleción, o inserción. La introducción específica de mutaciones no está particularmente limitada, siempre que pueda lograrse usando un método convencional. La sustitución de un aminoácido es preferiblemente una sustitución conservativa. Sustitución conservativa se refiere a un reemplazo de un residuo de aminoácido por otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar a la cadena lateral del residuo de aminoácido reemplazado.

Las sustituciones conservativas de aminoácidos específicas incluyen las siguientes: sustitución entre residuos de aminoácido teniendo cada uno una cadena lateral básica, tal como lisina, arginina e histidina; sustitución entre residuos de aminoácido teniendo cada uno una cadena lateral ácida, tal como ácido aspártico y ácido glutámico; sustitución entre residuos de aminoácido teniendo cada uno una cadena lateral polar sin carga, tal como glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina y cisteína; sustitución entre residuos de aminoácido teniendo cada uno una cadena lateral no polar, tal como alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina y triptófano; sustitución entre residuos de aminoácido teniendo cada uno una cadena lateral p-ramificada, tal como treonina, valina e isoleucina; y sustitución entre residuos de aminoácido teniendo cada uno una cadena lateral aromática, tal como tirosina, fenilalanina, triptófano e histidina.

En una realización, el anticuerpo tiene preferiblemente actividad citotóxica. La actividad citotóxica se refiere a la actividad por la que el anticuerpo se une a una célula para destruir la célula (o detención proliferativa), y su mecanismo no está particularmente limitado. Por ejemplo, la actividad citotóxica se produce por la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), acción que induce la apoptosis o inhibición de señalización de supervivencia bloqueando un enlace de ligando, o mediante una combinación de dos o más de estos.

La actividad de ADCC se refiere a la actividad por la que una célula que tiene actividad citotóxica, tal como un linfocito citolítico natural que expresa un receptor específico para la región constante de un anticuerpo, se recluta en la vecindad del anticuerpo para dañar otra célula a la que se ha unido el anticuerpo por la acción de la célula etc. La actividad de CDC se refiere a la actividad por la que un anticuerpo recluta complementos en su vecindad para dañar una célula a la que se une el anticuerpo por la acción de complementos. La actividad de ADCC y la actividad de CDC pueden ajustarse añadiendo una mutación a la región constante del anticuerpo.

Por ejemplo, si la región constante es IgG1 humana, la actividad de ADCC puede aumentarse introduciendo al menos una de las siguientes mutaciones (sustituciones): S239D, I332E, S239D/I332E, S239D/I332E/A330L, S298A, K334A, S298A/K334A, S298A/E333A/K334A etc. La actividad de ADCC puede aumentarse introduciendo estas mutaciones. En este caso, “S239D” indica que la serina (S) en la posición 239 de la región constante se reemplaza por ácido aspártico (D). Lo mismo se aplica a otras sustituciones.

Cuando la región constante es IgG1 humana, la actividad de ADCC puede reducirse, por ejemplo, introduciendo al menos una de las siguientes mutaciones (sustituciones): V234A/G237A, H268Q/V309L/A330S/P331S.

En cuanto a la actividad de CDC, cuando la región constante es IgG1 humana, la actividad de CDC puede aumentarse, por ejemplo, introduciendo al menos una de las siguientes mutaciones (sustituciones): S267E, H268F, S324T, S267E/H268F, S267E/S324T, H268F/S324T y S267E/H268F/S324T.

Método de medición de la actividad de ADCC

La actividad de ADCC puede medirse según el método de Brunner K.T. et al. (Brunner, K.T. et al., Immunology, 1968.

14:181-96). Por ejemplo, se cultiva una célula de mieloma en un medio RPMI1640 que contiene FCS al 10%, y se ^{ajusta el número de células a de 0,5*10}4 ^{a 1,0*104. Luego se añade a la misma una cantidad adecuada de Na}251^CrO4^{, y se hace reaccionar a 37°C durante 1 hora, seguido por marcaje de la célula con}51^{Cr. Luego se usa el resultado}lavado como célula diana. Las células efectoras utilizables incluyen las obtenidas cultivando la célula de médula ósea de un ratón SCID en RPMI1640 que contiene FBS al 10%, GM-Cs F de ratón 10 ng/ml, y IL2 humana 40 Ul/ml durante 6 ^{días, o similar. Se añade un anticuerpo de prueba o su anticuerpo de isotipo como control a una placa de 96 pocillos}para proporcionar una concentración final de 0,05 a 10 |ig/ml, y se añaden adicionalmente a la misma una célula diana (1,0*104) y una célula efectora (5*105). Se realiza una reacción a 37°C durante 4 horas, y después de la centrifugación, se mide el 51Cr liberado en el sobrenadante con un contador y. La actividad de ADCC puede determinarse a partir de la siguiente ecuación.

Actividad de ADCC = {([liberación de 51Cr a partir de una célula diana] - [liberación de 51Cr de un voluntario en ausencia de un anticuerpo])/([una cantidad de liberación de 51Cr máxima lograda añadiendo Triton X-100 al 1%]-[liberación de 51Cr de un voluntario en ausencia de un anticuerpo])} x 100

Método de medición de la actividad de CDC

La actividad de CDC también puede medirse según el método de Brunner K.T. et al. (Brunner, K.T. et al., Immunology, 1968. 14:181-96). Por ejemplo, se cultiva una célula de mieloma que es una célula diana en un medio RPMI1640 que contiene FCS al 10%, y se ajusta el número de células a de 0,5*104 a 1,0*104. Luego se añade a la misma una ^{cantidad adecuada de Na}251^CrO4^{, y se hace reaccionar a 37°C durante 1 hora, seguido por marcaje de la célula}con 51Cr. Se usa el resultado lavado como célula diana. Se añade un anticuerpo de prueba o su anticuerpo de isotipo como control suspendido en un medio RPMI1640 al que se le ha añadido suero de vaca fetal, a una placa de 96 pocillos para proporcionar una concentración final de 0,5 a 50 |ig/ml. Posteriormente, se añaden a la misma la célula diana y complementos, seguido por reacción durante 1,5 horas. Se separa la disolución de reacción mediante centrifugación, y se mide el 51Cr que se ha liberado en el sobrenadante con un contador y. La actividad de CDC puede determinarse a partir de la siguiente ecuación.

Actividad de CDC = {([liberación de 51Cr a partir de una célula diana] - [liberación de 51Cr de un voluntario en ausencia de un anticuerpo])/([una cantidad de liberación de 51Cr máxima lograda añadiendo Triton X-100 al 1%]-[liberación de 51Cr de un voluntario en ausencia de un anticuerpo])} x 100

Un anticuerpo que tiene actividad citotóxica puede obtenerse evaluando la presencia o ausencia de actividad citotóxica usando el método mencionado anteriormente, y seleccionando un anticuerpo que tiene la actividad.

El anticuerpo que tiene actividad citotóxica es útil ya que un anticuerpo de este tipo puede usarse solo para tratar una enfermedad (por ejemplo, tumor maligno).

En una realización, el anticuerpo puede ser un anticuerpo multiespecífico cuyo epítopo está presente en la región afectada por la presencia de un N-glicano en CD98hc, y puede unirse específicamente a otros antígenos. Otros antígenos pueden seleccionarse libremente dependiendo del propósito, y no están particularmente limitados.

El anticuerpo multiespecífico puede prepararse de manera adecuada usando un método conocido en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo multiespecífico puede obtenerse mediante el siguiente procedimiento.

(1) Preparar hibridomas que producen un anticuerpo cuyo epítopo está presente en la región afectada por la presencia de un N-glicano en CD98hc.

(2) Preparar por separado hibridomas usando una célula productora de anticuerpos, tal como células B obtenidas de un animal inmunizado con otro antígeno.

(3) Preparar hibridomas sometiendo estas dos clases de hibridomas a fusión celular (un anticuerpo biespecífico también se denomina “cuadroma”).

(4) Cribar para determinar un hibridoma que produce el anticuerpo multiespecífico diana a partir de hibridomas preparados en la etapa (3).

Un anticuerpo biespecífico también puede obtenerse mediante el siguiente procedimiento.

^{(a) Preparar un anticuerpo en forma de F(ab')}2 ^{cuyo epítopo está presente en la región afectado por la presencia de}un N-glicano en CD98hc.

^{(b) Preparar por separado un anticuerpo en forma de F(ab')}2 ^{que se une específicamente a otro antígeno.}

^{(c) Tratar las dos clases de anticuerpos en forma de F(ab')}2 ^{obtenidos en las etapas (a) y (b) con un agente reductor}tal como DTT y tratar adicionalmente ambos productos tratados con un reactivo de Ellman.

^{(d) Mezclar los anticuerpos tratados en forma de F(ab')}2 ^{obtenidos en la etapa (c) para realizar una reacción.}

El anticuerpo puede tener cualquier otra sustancia unida al mismo. Los ejemplos de otras sustancias incluyen sustancias que tienen actividad citotóxica, enzimas, etiquetas e inmunomoduladores.

Puede añadirse actividad citotóxica a un anticuerpo permitiendo que una sustancia que tenga actividad citotóxica se una al anticuerpo. Una citotoxina es una sustancia que tiene actividad citotóxica (por ejemplo, actividad destructora de células y/o actividad inhibidora del crecimiento celular), y el tipo de citotoxina no está particularmente limitado siempre que tenga esta actividad. Los ejemplos incluyen sustancias conocidas como antineoplásicos.

Los ejemplos específicos de citotoxina incluyen los siguientes: agentes alquilantes, tales como ciclofosfamida hidratada, ifosfamida, tiotepa, busulfán, melfalán, clorhidrato de nimustina, ranimustina, dacarbacina y temozolomida; antimetabolitos, tales como metotrexato, pemetrexed sódico hidratado, fluorouracilo, doxifluridina, capecitabina, tegafur, citarabina, clorhidrato de gemcitabina, éster de fosfato de fludarabina, nelarabina, cladribina y levofolinato de calcio; antibióticos, tales como clorhidrato de doxorrubicina, clorhidrato de daunorrubicina, pirarrubicina, clorhidrato de epirrubicina, clorhidrato de idarrubicina, clorhidrato de aclarubicina, clorhidrato de amrubicina, clorhidrato de mitoxantrona, mitomicina C, actinomicina D, clorhidrato de bleomicina, clorhidrato de peplomicina, zinostatina estimalámero y caliqueamicina; inhibidores de microtúbulos, tales como sulfato de vincristina, sulfato de vinblastina, sulfato de vindesina y paclitaxel; inhibidores de aromatasa, tales como clorhidrato hidratado de anastrozol, exemestano, letrozol y fadrozol; fármacos a base de platino, tales como cisplatino, carboplatino, nedaplatino y oxaliplatino; inhibidores de topoisomerasas, tales como clorhidrato de irinotecán hidratado, clorhidrato de nogitecán, etopósido y sobuzoxano; corticosteroides, tales como prednisolona y dexametasona; talidomida y su derivado lenalidomida; bortezomib, que es un inhibidor de proteasas; y radioisótopos, tales como 90-itrio. De estos, son preferibles la caliqueamicina, melfalán, sulfato de vincristina, clorhidrato de doxorrubicina, prednisolona, dexametasona, talidomida, lenalidomida y bortezomib, y es más preferible la caliqueamicina que ha demostrado una excelente unión a anticuerpos. Estas citotoxinas están todas disponibles comercialmente, y puede seleccionarse de manera adecuada una o una combinación de dos o más de estas.

Una citotoxina y un anticuerpo pueden unirse entre sí mediante cualquier método. Por ejemplo, una citotoxina puede unirse a un grupo funcional tal como el grupo amino, grupo tiol, grupo guanidilo, grupo hidroxilo o grupo carboxilo de la cadena lateral de un residuo de aminoácido de un anticuerpo a través de un ligador.

El anticuerpo puede ser o bien un anticuerpo policlonal o bien un anticuerpo monoclonal. En una realización, el anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo monoclonal. El término “anticuerpo monoclonal” se refiere a un grupo de anticuerpos sustancialmente homogéneo. Específicamente, los anticuerpos individuales que pertenecen a un anticuerpo monoclonal (grupo) se consideran todos uniformes excepto por una pequeña cantidad de variantes.

El anticuerpo anti-CD98hc humana descrito anteriormente puede producirse mediante cualquier técnica conocida en la técnica con referencia a la información divulgada en esta memoria descriptiva. En una realización preferible, un anticuerpo que reconoce un epítopo que contiene un sitio de N-glicosilación de CD98hc humana y que se expone inhibiendo la glicosilación con unión a N puede obtenerse usando un fragmento peptídico o una proteína (por ejemplo, CD98hc) que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 (preferiblemente la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23), o una célula que expresa la proteína como un inmunógeno. En una realización, un inmunógeno preferible es una CD98hc de quimera de humano/animal que se compone de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 (preferiblemente la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23) y otras secuencias de aminoácidos de CD98hc originadas de un mamífero distinto de un humano, tal como a ratón, así como su fragmento, o una célula que lo expresa. El otro mamífero distinto del humano puede ser cualquier mamífero, y no está particularmente limitado; sin embargo, es preferible un mamífero usado como animal inmunizado. Los ejemplos de animales inmunizados incluyen ratones, ratas, hámsters, conejos, vacas, cabras, monos, cerdos y avestruces. En una realización, un animal inmunizado preferible es un ratón. Mediante la inmunización de estos animales con una CD98hc de quimera humano/animal de este tipo como inmunógeno, sólo la región de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 (preferiblemente la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23) se convierte en una proteína exógena para el animal inmunizado, y se induce de manera eficaz un anticuerpo que reconoce esta región como epítopo.

Puede obtenerse una CD98hc de quimera humano/animal mediante cualquier técnica con referencia a la información de secuencias de aminoácidos y secuencias de genes conocidas de CD98hc de diversos animales. En una realización, la CD98hc para su uso como inmunógeno preferiblemente no tiene N-glicano añadido a la misma. Esta CD98hc puede obtenerse, por ejemplo, reemplazando un residuo de asparagina (por ejemplo, el residuo de asparagina en la posición 405) al que se une un N-glicano de CD98hc por otro residuo de aminoácido (por ejemplo, glutamina). En una realización, el inmunógeno para obtener el anticuerpo es preferiblemente una célula que expresa una CD98hc de quimera humano/animal (por ejemplo, un ratón) o su fragmento. La célula puede ser de cualquier tipo, y no está particularmente limitado; sin embargo, la célula se origina preferiblemente a partir de la misma especie animal que el animal inmunizado. Esto impide que la célula en el animal inmunizado se reconozca como una célula exógena, induciendo así de manera eficaz que un anticuerpo reconozca la región de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 (preferiblemente la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23) como epítopo.

La inmunización para preparar un animal inmunizado se realiza normalmente cada 3 a 10 días varias veces. El número de células usadas para un tiempo de inmunización puede ser cualquier número. Sin embargo, se administran ^{normalmente de 10}3 ^{a 10}8 ^{células. En el uso de una proteína o su fragmento como inmunógeno, un animal se inmuniza}normalmente con 1 a 100 |ig. Las células productoras de anticuerpos se recogen del bazo o del ganglio linfático del animal inmunizado que se sometió a inmunización varias veces, y la célula que produce el anticuerpo diana se clona, obteniendo así un anticuerpo monoclonal. La clonación puede realizarse fusionando una célula productora de anticuerpos con una línea celular adecuada (por ejemplo, una célula de mieloma) para preparar un hibridoma y midiendo la capacidad de unión deseada del anticuerpo producido por el hibridoma. La medición de la capacidad de unión puede realizarse usando un método conocido, tal como FACS, ELISA, RIA y EIA.

El anticuerpo obtenido de esta manera reconoce específicamente la región afectada por la presencia de un N-glicano en CD98hc humana y, por tanto, reconoce así específicamente células de mieloma, células progenitoras de mieloma y otras células tumorales. Por tanto, el anticuerpo es útil para el tratamiento o la prevención de tumores, etc. El tipo de tumor no está particularmente limitado y es un tumor maligno, que incluye cáncer sólido y neoplasia hemática. Los ejemplos de cáncer sólido incluyen cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de ovario, cáncer de mama, tumor encefálico, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de lengua, cáncer de tiroides, cáncer de riñón, cáncer de próstata, cáncer de útero, osteosarcoma, condrosarcoma y rabdomiosarcoma. Los ejemplos de neoplasia hemática incluyen leucemia, enfermedades que implican el crecimiento neoplásico de células plasmáticas (por ejemplo, mieloma múltiple) y linfoma maligno. En una realización, la leucemia es preferiblemente leucemia linfática.

3. Polinucleótido

Se proporciona un polinucleótido que codifica para el anticuerpo descrito en la sección 2 anterior (que a continuación en el presente documento puede denominarse “anticuerpo A”). El término “polinucleótido” se refiere a un compuesto de alto peso molecular compuesto por nucleótidos linealmente polimerizados (por ejemplo, ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos). El polinucleótido puede ser una cadena monocatenaria o bicatenaria.

Las secuencias de bases de polinucleótidos que codifican para las secuencias de aminoácidos de la región hipervariable, región variable, cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo R8H283 se indican como las SEQ ID NO: 11 a 20. La tabla 2 a continuación muestra la correspondencia de estas secuencias.

Tabla 2

En una realización, el polinucleótido comprende al menos una secuencia de bases seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11 a 20 (la combinación de dos o más secuencias puede ser cualquier combinación). En una realización preferible, el polinucleótido comprende al menos una secuencia de bases seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11 a 13 (preferiblemente 2 o más, y más preferiblemente todas) y/o al menos una secuencia de bases seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16 a 18 (preferiblemente 2 o más, y más preferiblemente todas). En una realización preferible, el polinucleótido comprende las secuencias de bases de las SEQ ID NO: 11 a 13 y las secuencias de bases de SEQ ID NO: 16 a 18. En una realización preferible, el polinucleótido comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 14 y/o la secuencia de bases de SEQ ID NO: 19. En otra realización preferible, el polinucleótido comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 15 y/o la secuencia de bases de SEQ ID NO: 20.

La secuencia de bases del polinucleótido no es necesariamente una coincidencia completa con las SEQ ID NO: 11 a 20 siempre que el polinucleótido codifique para el anticuerpo A. Por ejemplo, la secuencia de bases del polinucleótido puede tener al menos el 80%, preferiblemente, al menos el 85%, preferiblemente al menos el 90%, preferiblemente al menos el 95%, preferiblemente al menos el 98%, y preferiblemente al menos el 99% de identidad con las SEQ ID NO: 11 a 20. La identidad puede calcularse usando una herramienta analítica comercialmente o una herramienta analítica disponible a través de líneas de telecomunicación (Internet). Específicamente, el valor (%) de la homología de secuencias de nucleótidos puede calcularse, por ejemplo, realizando una búsqueda usando blastn para el programa en Advanced BLAST 2.1, con diversos parámetros establecidos en valores predeterminados. La frecuencia del uso de codones para el polinucleótido puede optimizarse dependiendo del tipo del vector o la célula que lo expresa.

El estado del polinucleótido no está particularmente limitado; por ejemplo, el polinucleótido puede ser un polinucleótido aislado o un polinucleótido incorporado en un vector. El tipo y el uso del vector no están particularmente limitados. Por ejemplo, el vector puede ser un vector de plásmido o un vector de virus (por ejemplo, adenovirus o retrovirus). El vector puede ser, por ejemplo, un vector para clonación o para expresión. El vector para expresión incluye vectores para células procariotas, tales como Escherichia coli, y actinomiceto, y vectores para células eucariotas, tales como células de levadura, células de insecto y células de mamífero. El polinucleótido puede tener cualquier modificación; por ejemplo, el polinucleótido puede tener de manera adecuada una secuencia de bases que codifica para un péptido señal en el extremo 5' terminal.

4. Célula huésped

Se proporciona una célula huésped que comprende el polinucleótido que codifica para el anticuerpo A descrito anteriormente. La forma en la que una célula huésped contiene el polinucleótido no está particularmente limitada. Por ejemplo, la célula huésped puede contener el polinucleótido en forma de vector o puede contener el polinucleótido integrado en el ADN genómico intracelular del organismo huésped.

La célula huésped puede ser de cualquier tipo y no está particularmente limitada. Por ejemplo, la célula huésped puede ser una célula eucariota, tal como una célula de levadura, una célula de insecto y una célula de mamífero, y una célula procariota, tal como Escherichia coli y actinomiceto. En una realización, la célula huésped es preferiblemente una célula eucariota; por ejemplo, la célula huésped es preferiblemente una célula T o un linfocito citolítico natural.

La célula huésped que comprende el polinucleótido que codifica para el anticuerpo descrito anteriormente puede obtenerse, por ejemplo, incorporando el polinucleótido (por ejemplo, en forma de vector) en una célula huésped.

5. Receptor de antígeno quimérico

Se proporcionan un receptor de antígeno quimérico (CAR) que reconoce un epítopo que contiene un sitio de N-glicosilación de CD98hc humana y que se expone inhibiendo la glicosilación con unión a N, un receptor de antígeno quimérico cuyo epítopo está presente en la región afectado por la presencia de un N-glicano en CD98hc humana, un receptor de antígeno quimérico anti-CD98hc humana cuya afinidad para CD98hc humana se aumenta eliminando una cadena de azúcar unida a CD98hc humana, un receptor de antígeno quimérico anti-CD98hc humana cuya afinidad por una variante de CD98hc en la que los residuos de aminoácido en las posiciones 395 a 397 de CD98hc humana se reemplazan por residuos de aminoácido de la CD98hc originada en ratón es equivalente a su afinidad por la CD98hc originada en ratón, y un receptor de antígeno quimérico anti-CD98hc humana cuya afinidad por una variante de CD98hc en la que los residuos de aminoácido en las posiciones 400 y 401 de CD98hc humana se reemplazan por residuos de aminoácido de la CD98hc originada en ratón es equivalente a su afinidad por la CD98hc originada en ratón, etc. El receptor de antígeno quimérico es normalmente una proteína artificial similar al receptor de células T (TCR) y se conoce como proteína construida de manera que un sitio de reconocimiento de antígeno expresado en la membrana celular de una célula T (correspondiente al dominio extracelular) se reemplaza por un sitio de reconocimiento de antígeno deseado, y que las funciones de la célula T tales como la actividad citotóxica pueden producirse de manera más eficaz. El receptor de antígeno quimérico tiene normalmente su anticuerpo de cadena sencilla (scFv) que se compone de una región variable de cadena ligera unido a una región variable de cadena pesada en tándem en el lado del extremo N-terminal y su cadena C del receptor de células T (TCR) en el lado del extremo C-terminal. Una célula T o similar que expresa el receptor de antígeno quimérico reconoce un antígeno en su dominio scFv, y luego se transfiere de manera intracelular una señal de reconocimiento a través de la cadena C. El receptor de antígeno quimérico contiene preferiblemente una molécula coestimuladora (por ejemplo, CD28 y/o 4-1BB) entre el scFv y la cadena C para aumentar la activación de la célula T.

Las siguientes características se explican todas mediante la descripción del anticuerpo A: “un epítopo que contiene un sitio de N-glicosilación de CD98hc humana y que se expone inhibiendo la glicosilación con unión a N”, “ la región afectada por la presencia de un N-glicano en CD98hc humana”, “ la afinidad por CD98hc humana se aumenta eliminando una cadena de azúcar unida a CD98hc humana”, “ la afinidad por una variante de CD98hc en las que los residuos de aminoácido en las posiciones 395 a 397 de CD98hc humana se reemplazan por residuos de aminoácido de CD98hc originada en ratón es equivalente a su afinidad por la CD98hc originada en ratón”, y “ la afinidad por una variante de CD98hc en la que los residuos de aminoácido en las posiciones 400 y 401 de CD98hc humana se reemplazan por residuos de aminoácido de CD98hc originada en ratón es equivalente a su afinidad por la CD98hc originada en ratón.” Por tanto, en una realización, el epítopo para el receptor de antígeno quimérico está presente preferiblemente en la región de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 22 de CD98hc. En otra realización preferible, el epítopo para el receptor de antígeno quimérico está presente preferiblemente en la región de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 23. En una realización, el epítopo para el receptor de antígeno quimérico está presente preferiblemente en la región en las posiciones 365 a 376 y la región en las posiciones 395 a 409 de CD98hc humana. En una realización, el epítopo para el receptor de antígeno quimérico contiene preferiblemente los residuos de aminoácido en las posiciones 374, 375, 395, 396, 397, 400 y 401 de CD98hc humana.

En otra realización, el epítopo para el receptor de antígeno quimérico es preferiblemente idéntico al epítopo para el anticuerpo R8H283. Por tanto, el scFv del receptor de antígeno quimérico contiene preferiblemente la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera del anticuerpo descrito anteriormente. Más específicamente, el scFv del receptor de antígeno quimérico tiene la siguiente estructura:

una región variable de cadena pesada que comprende

una CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y/o

una CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, y/o

una región variable de cadena ligera que comprende

una CDR2 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y/o

En una realización preferible, el scFv del receptor de antígeno quimérico contiene una región variable de cadena pesada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y/o una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

El receptor de antígeno quimérico tiene preferiblemente una estructura en la que están dispuestos los siguientes desde su extremo N-terminal en orden: un dominio scFv que se compone de una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada del anticuerpo unidas en tándem descritas anteriormente; una secuencia espaciadora; un dominio transmembrana; un coestimulador; y un dominio intracelular de TCR.

El dominio scFv puede contener una secuencia espaciadora de, por ejemplo, aproximadamente de 10 a 25 residuos de aminoácido entre la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera. Una secuencia espaciadora de este tipo puede ser idéntica a o diferente de la secuencia espaciadora dispuesta entre el dominio scFv y el dominio transmembrana.

La longitud de la secuencia espaciadora dispuesta entre el dominio scFv y el dominio transmembrana y los tipos de los residuos de aminoácido que constituyen la secuencia espaciadora no están limitados, siempre que no se impida la función del receptor de antígeno quimérico. Por ejemplo, la secuencia espaciadora puede diseñarse para contener aproximadamente de 10 a 25 residuos de aminoácido.

El tipo del dominio transmembrana no está limitado, siempre que no se impida la función del receptor de antígeno quimérico. Por ejemplo, pueden usarse CD28, 4-1BB, y similares que se expresan en células T u otras células. Una mutación puede introducirse de manera adecuada en estos dominios transmembrana, siempre que no se impida la función del receptor de antígeno quimérico.

El coestimulador no está particularmente limitado, siempre que sea un coestimulador contenido en células T o similares. Por ejemplo, puede usarse al menos un miembro seleccionado de manera adecuada del grupo que consiste en OX40, 4-1BB y CD28. Una mutación puede introducirse de manera adecuada en estos coestimuladores, siempre que no se impida la función del receptor de antígeno quimérico.

El dominio intracelular de TCR puede ser, por ejemplo, un dominio intracelular originado a partir de CD3, que también puede denominarse una cadena C de TCR. Una mutación puede introducirse de manera adecuada en CD3, siempre que no se impida la función del receptor de antígeno quimérico. Cuando se introduce una mutación en CD3, es preferible realizar la introducción de manera que esté contenido un ITAM (un motivo de activación basado en tirosina del inmunoreceptor).

El receptor de antígeno quimérico puede producirse con referencia a, por ejemplo, el método divulgado en los documentos no de patente 2 a 4.

Se proporciona un polinucleótido que codifica para el receptor de antígeno quimérico. La secuencia de bases del polinucleótido puede ser cualquier secuencia y no está particularmente limitada, siempre que la secuencia codifique para el receptor de antígeno quimérico. El estado del polinucleótido no está particularmente limitado; por ejemplo, el polinucleótido puede ser un polinucleótido aislado o un polinucleótido incorporado en un vector. La descripción del polinucleótido que codifica para el anticuerpo también se aplica al polinucleótido que codifica para el receptor de antígeno quimérico.

Se proporciona una célula huésped que comprende el polinucleótido que codifica para el receptor de antígeno quimérico. La descripción de la célula huésped que comprende el polinucleótido que codifica para el anticuerpo también se aplica a la célula huésped que comprende el polinucleótido que codifica para el receptor de antígeno quimérico. La célula huésped puede ser de cualquier tipo; sin embargo, es preferible una célula que tiene actividad citotóxica. Los ejemplos de la célula que tiene actividad citotóxica incluyen células T, linfocitos citolíticos naturales y linfocitos citolíticos, siendo preferibles las células T citolíticas (que también se denominan “células T citotóxicas” o “CTL”).

La célula huésped puede estar en el estado de expresar el polinucleótido que codifica para el receptor de antígeno quimérico, o en el estado de no expresar el estado del polinucleótido. Cuando el polinucleótido que codifica para el receptor de antígeno quimérico se expresa en la célula huésped, el dominio scFv que constituye el receptor de antígeno quimérico se expone preferiblemente en el exterior de la célula, y el dominio transmembrana, el coestimulador, y el dominio intracelular de TCR están presentes preferiblemente en la membrana celular o el interior de la célula.

Cuando el dominio scFv reconoce su epítopo, el dominio scFv activa de manera intracelular una señal para provocar la actividad citotóxica a través del dominio transmembrana y el coestimulador. Conjuntamente con esto, las preparaciones celulares atacan contra otras células o tejidos que expresan el epítopo o ejerce su actividad citotóxica en las células o tejidos.

Cuando una célula que presenta una función de este tipo es una CTL, esta célula se denomina una “célula T con receptor de antígeno quimérico” (“célula T con CAR”). Las células que tienen el potencial para presentar esta actividad citotóxica, tal como linfocitos citolíticos naturales, también presentan actividad citotóxica cuando su dominio scFv está unido a su epítopo, como con la célula T con receptor de antígeno quimérico.

Por tanto, una célula huésped que comprende el polinucleótido que codifica para el receptor de antígeno quimérico (en particular, células huéspedes que tienen actividad citotóxica) es útil como principio activo de composiciones farmacéuticas. Una célula huésped que comprende el polinucleótido que codifica para el receptor de antígeno quimérico (por ejemplo, célula T con CAR) puede producirse con referencia a, por ejemplo, el método divulgado en los documentos no de patente 2 a 4.

Tales células T con CAR reconocen un epítopo que contiene un sitio de N-glicosilación de CD98hc humana y que se expone inhibiendo la glicosilación con unión a N para reconocer así específicamente las células de mielomas, células progenitoras de mieloma, y otras células tumorales; por tanto, estas células T con CAR son útiles para el tratamiento o prevención de tumores o similares. El tipo de tumor no está particularmente limitado, e incluye cáncer sólido y neoplasia hemática. Los ejemplos de cáncer sólido incluyen cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de ovario, cáncer de mama, tumor encefálico, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de lengua, cáncer de tiroides, cáncer de riñón, cáncer de próstata, cáncer de útero, osteosarcoma, condrosarcoma y rabdomiosarcoma. Los ejemplos de neoplasia hemática incluyen leucemia, enfermedades que implican el crecimiento neoplásico de células plasmáticas (por ejemplo, mieloma múltiple) y linfoma maligno. En una realización, la leucemia es preferiblemente leucemia linfática.

6^{. Composición farmacéutica y método de tratamiento}

Se proporcionan una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo A, una célula T con CAR, un linfocito citolítico natural con CAR, o similares y un método de tratamiento o prevención de la enfermedad usando el anticuerpo A, una célula T con CAR, un linfocito citolítico natural con CAR, o similares.

El contenido del anticuerpo o la célula en la composición farmacéutica puede determinarse de manera adecuada teniendo en cuenta el tipo de la enfermedad diana, el efecto del tratamiento pretendido, el método de administración, el periodo de tratamiento, la edad del paciente, el peso corporal del paciente, etc. Por ejemplo, el contenido del ^{anticuerpo en la composición farmacéutica puede ser de aproximadamente}0,001 ^{partes en peso a}10 ^{partes en peso}basándose en la composición farmacéutica completa tomada como 100 partes en peso. El contenido de la célula en ^{la composición farmacéutica puede ser de, por ejemplo, aproximadamente}1 ^{célula/ml a}104 ^células/ml.

La forma de administración de la composición farmacéutica no está particularmente limitada, siempre que se logre el efecto deseado. La composición puede administrarse a mamíferos, incluyendo humanos, a través de una vía de administración, o bien administración oral o bien administración parenteral, (por ejemplo, inyección intravenosa, inyección intramuscular, administración subcutánea, administración rectal, administración transdérmica y administración local). Debido a que el principio activo es un anticuerpo o una célula, la forma de administración preferible es la administración parenteral, y más preferiblemente la inyección intravenosa. La forma de dosificación y el método de producción de la composición para administración oral o administración parenteral sería bien conocido por un experto en la técnica, y la composición farmacéutica en cualquier forma de dosificación puede producirse según un método convencional mezclando el anticuerpo o la célula de la presente invención con un portador farmacéuticamente aceptable y similares.

La forma de dosificación de la composición para la administración parenteral incluye fármacos inyectables (por ejemplo, fármacos inyectables por goteo, fármacos inyectables por vía intravenosa, fármacos inyectables por vía intravenosa intramuscular, fármacos inyectables por vía intravenosa subcutánea y fármacos inyectables por vía intravenosa intradérmica), fármacos para uso externo (por ejemplo, pomadas, cataplasmas y lociones), supositorios, inhalatorios, colirios, pomadas oftálmicas, gotas nasales, gotas óticas y fármacos lisosómicos. Por ejemplo, un fármaco inyectable puede prepararse disolviendo el anticuerpo o la célula en agua destilada inyectable; y puede añadirse opcionalmente al mismo un agente solubilizante, un tampón, un agente de ajuste del pH, un agente de tonicidad, un agente calmante, un conservante, un estabilizador, y similares. La composición farmacéutica puede estar en forma de formulación liofilizada, que se preparará cuando se use.

La composición farmacéutica comprende además otro agente medicinal eficaz en el tratamiento o prevención de enfermedades. La composición farmacéutica también contener opcionalmente componentes tales como un esterilizador, un antiflogístico, un estimulante celular, vitaminas y un aminoácido.

Para el portador usado en la preparación de un fármaco de la composición farmacéutica, pueden usarse un excipiente, un aglutinante, un disgregante, un lubricante, un colorante y un agente aromatizante normalmente usados en la técnica; y también pueden usarse opcionalmente un estabilizador, un emulsionante, un promotor de la absorción, un tensioactivo, un agente de ajuste del pH, un antiséptico, un antioxidante, una carga, un agente humectante, un agente de activación de superficie, un dispersante, un tampón, un conservante, un agente solubilizante, un agente calmante, y similares.

El tipo de enfermedad tratada o prevenida usando la composición farmacéutica no está particularmente limitada, siempre que pueda lograrse el tratamiento o la prevención. Los ejemplos de enfermedades diana específicas incluyen tumores. El tipo de tumor no está particularmente limitado, e incluye cáncer sólido y neoplasia hemática. Los ejemplos de cáncer sólido incluyen cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de ovario, cáncer de mama, tumor encefálico, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de lengua, cáncer de tiroides, cáncer de riñón, cáncer de próstata, cáncer de útero, osteosarcoma, condrosarcoma y rabdomiosarcoma. Los ejemplos de neoplasia hemática incluyen leucemia, enfermedades que implican el crecimiento neoplásico de células plasmáticas (por ejemplo, mieloma múltiple) y linfoma maligno. En una realización, la leucemia es preferiblemente leucemia linfática. En una realización, una enfermedad preferible es una enfermedad que provoca crecimiento neoplásico de células plasmáticas. Una “enfermedad que provoca crecimiento neoplásico de células plasmáticas” es una enfermedad caracterizada por el crecimiento neoplásico anómalo de células plasmáticas y un aumento en la proteína anómala secretada por las célula plasmáticas. Los ejemplos de estas enfermedades incluyen mieloma múltiple, leucemia de células plasmáticas, plasmocitoma, enfermedad de cadenas pesadas y amiloidosis sistémica de cadenas ligeras (AL). En una realización, una enfermedad diana preferible es mieloma múltiple.

La diana de administración (sujeto de prueba) de la composición farmacéutica es, por ejemplo, un animal que tiene una enfermedad descrita anteriormente o un animal con un potencial para desarrollar una enfermedad de este tipo. Un “potencial para desarrollar una enfermedad de este tipo” puede determinarse, por ejemplo, mediante el método de diagnóstico descrito posteriormente. El animal es, por ejemplo, un mamífero, y preferiblemente un humano.

La dosis de la composición farmacéutica puede determinarla un médico clínico, teniendo en cuenta diversos factores, tales como vía de administración, tipo de enfermedad, grado de los síntomas, edad, sexo y peso corporal del paciente, gravedad de la enfermedad, hallazgos farmacológicos tales como las características farmacocinéticas y toxicológicas, uso o no del sistema de administración de fármacos, y si la composición se administra como parte de un fármaco en combinación con otros agentes medicinales. Por ejemplo, cuando el principio activo es el anticuerpo, la dosis de la ^{composición farmacéutica puede ser de aproximadamente}1 ^{|ig/kg (peso corporal) a}10 ^{g/kg (peso corporal) por día. Cuando el principio activo es la célula (VI), la dosis puede ser de aproximadamente 10}4 ^{células/kg (peso corporal) a 10}9 ^{células/kg (peso corporal). La pauta posológica de la composición farmacéutica también puede determinarse}teniendo en cuenta los mismos factores que para la dosis. Por ejemplo, la composición puede administrarse de una vez al día a una vez al mes en la dosis diaria descrita anteriormente.

Tal como se describió anteriormente, el anticuerpo, la célula T con CAR o el linfocito citolítico natural con CAR pueden usarse para producir la composición farmacéutica.

7. Método de cribado

Se proporciona un método de cribado de un principio activo de la composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de tumores. Este método comprende seleccionar una sustancia que se una específicamente a la región afectada por la presencia de un N-glicano en CD98hc de una biblioteca de compuestos (un grupo de sustancias candidatas). El tipo de tumor es tal como se describió anteriormente para la composición farmacéutica.

La biblioteca de compuestos no está particularmente limitada y puede usarse una biblioteca existente. La biblioteca de compuestos es preferiblemente una biblioteca de anticuerpos, y es preferible usar como biblioteca hibridomas preparados usando células productoras de anticuerpos, tales como células B obtenidas de un animal inmunizado con un antígeno deseado. El antígeno deseado no está particularmente limitado y es preferiblemente, por ejemplo, CD98hc o su fragmento (un fragmento que contiene la región afectada por la presencia de un N-glicano en CD98hc).

El método para seleccionar una sustancia que se une específicamente a la región afectada por la presencia de un N-glicano en CD98hc puede ser cualquier método y no está particularmente limitado. Por ejemplo, se preparan dos tipos de células, una célula que expresa la región afectada por la presencia de un N-glicano en CD98hc y una célula que no expresa la región. Estos dos tipos de células son idénticos excepto por la presencia o ausencia de la expresión de la región. Posteriormente, se añade una sustancia de prueba marcada (por ejemplo, marcaje fluorescente) a ambas células, y se mide si existe un enlace entre las células y la sustancia de prueba mediante citometría de flujo. Una sustancia que sólo se une a la célula que expresa la región tiene una afinidad específica por la región, y un anticuerpo que no se comporta así tiene una afinidad específica baja o nula por la región. El grado de afinidad de un anticuerpo por la región puede medirse basándose en la intensidad de la señal de fluorescencia detectada en la citometría de flujo.

Además del método que usa citometría de flujo, también puede usarse un inmunoensayo para medir la afinidad. En este caso, se recubre una placa de microtitulación con la región purificada y se añade una sustancia de prueba a cada pocillo, seguido por la reacción. Posteriormente, se le añade un anticuerpo que puede reconocer la sustancia y que está marcado con una enzima, una sustancia fluorescente, una sustancia luminiscente, una sustancia radiactiva, biotina o similar para permitir que el anticuerpo reaccione con la sustancia. Después de eso, la afinidad de la sustancia de prueba por la región puede medirse con el anticuerpo marcado como indicador.

La sustancia de prueba no está particularmente limitada, siempre que su afinidad por la región afectada por la presencia de un N-glicano en CD98hc pueda medirse mediante estos métodos, pero la sustancia de prueba es preferiblemente un anticuerpo.

El método de cribado puede comprender la etapa de seleccionar una sustancia que tenga actividad citotóxica. La selección de una sustancia que tenga actividad citotóxica es opcional y no está particularmente limitada. Por ejemplo, cuando una sustancia candidata es un anticuerpo, el método de medición de la actividad de ADCC y/o el método de medición de la actividad de CDC descritos anteriormente pueden usarse para la selección.

8^{. Método de diagnóstico}

Se proporciona un método para diagnosticar si un sujeto tiene un tumor. Este método comprende poner en contacto el anticuerpo descrito anteriormente con una muestra recogida de un sujeto de prueba. El tipo de tumor es tal como se describió anteriormente para la composición farmacéutica.

El anticuerpo se une específicamente a un epítopo que contiene un sitio de N-glicosilación de CD98hc humana y que se expone inhibiendo la glicosilación con unión a N para reconocer de ese modo específicamente las células progenitoras de mieloma, células plasmáticas de mieloma y otras células tumorales. Por tanto, las células plasmáticas neoplásicas en una muestra pueden identificarse permitiendo que el anticuerpo actúe sobre la muestra que contiene células plasmáticas neoplásicas y detectando el anticuerpo unido a una célula que expresa la región correspondiente al epítopo.

La muestra es preferiblemente una muestra biológica que contiene células plasmáticas neoplásicas recogidas de un enfermo de cáncer (por ejemplo, médula ósea, sangre y masa tumoral), más preferiblemente líquido corporal y todavía más preferiblemente sangre. Para una fácil detección, el anticuerpo preferiblemente está marcado (por ejemplo, colorante fluorescente o radioisótopo). La identificación de células plasmáticas de mieloma puede realizarse usando sólo el anticuerpo o usando una combinación del anticuerpo con otro anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo monoclonal anti-CD38 humana o anticuerpo monoclonal anti-CD48). Por ejemplo, una población de células de mieloma puede identificarse fácilmente tiñendo conjuntamente una muestra recogida de la médula ósea de un paciente con mieloma con estos anticuerpos marcados con fluorescencia y separando las células de la muestra mediante citometría de flujo.

Cuando se detectan células progenitoras de mieloma y/o células plasmáticas de mieloma en una muestra de esta manera, al sujeto de prueba se le diagnostica cáncer (o es muy probable que tenga cáncer).

9. Kit

Se proporcionan kits que comprenden el anticuerpo para diferentes propósitos. Por ejemplo, un kit puede ser para el tratamiento o la prevención de un tumor o para el diagnóstico de cáncer. El tipo de tumor es tal como se describió anteriormente para la composición farmacéutica.

El kit puede comprender sólo el anticuerpo, pero también puede comprender otros componentes (por ejemplo, otros anticuerpos, una disolución tampón y un colorante fluorescente), instrumentos y un manual, dependiendo del uso previsto.

Ejemplos

A continuación se describe la presente invención con referencia a los ejemplos. Sin embargo, la invención divulgada en esta memoria descriptiva no se limita a los ejemplos.

1. Citometría de flujo y clasificación

En la siguiente prueba, se realizó citometría de flujo para la selección de células según el siguiente procedimiento. Se suspendieron células mononucleares de médula ósea recogidas del ilion de un paciente con mieloma, de quien se ^{había obtenido el consentimiento informado, en una disolución de ACK (NH}4^{O 150 mM, KHCO}3^{10 mM), y se dejó}reposar a 4°C durante 3 minutos, seguido por extracción de glóbulos rojos. Se lavó el resultado con PBS (solución salina tamponada con fosfato) que contenía suero de vaca fetal al 2%, y se realizó el bloqueo en PBS que contenía suero AB humano al 10% a 4°C durante 20 minutos para evitar que un anticuerpo se una a él de manera inespecífica. Después de eso, se añadió a lo mismo cada anticuerpo marcado con un colorante fluorescente (véase a continuación) y se realizó la tinción a 4°C durante 30 minutos, seguido por lavado con PBS. Se suspendieron las células en PBS que contenía yoduro de propidio (PI) 1 |ig/ml y se sometieron a análisis de citometría de flujo. El análisis y la clasificación de células se realizaron con un clasificador de células FACS Aria (Becton Dickinson Immunocytometry System). Para la tinción de las células, se seleccionaron y usaron de manera adecuada los siguientes anticuerpos monoclonales.

Anticuerpo anti-CD34 conjugado con APC (BD Pharmingen), anticuerpo anti-CD34 conjugado con Cy7-PE (BD Pharmingen), anticuerpo anti-CD19 conjugado con Cy7-APC (Biolegend), anticuerpo anti-CD38 conjugado con FITC (eBioscience), anticuerpo anti-CD138 conjugado con APC (Biolegend), anticuerpo anti-CD3 conjugado con Cy7-PE (Biolegend), anticuerpo anti-CD14 conjugado con FITC (BD Pharmingen), anticuerpo contra CD45 humana conjugado con Cy7-PE (Biolegend)

2. Preparación de una biblioteca de anticuerpos monoclonales que se unen a la línea celular de mieloma pero no a la sangre periférica de individuos sanos

En el tratamiento con anticuerpos del mieloma múltiple, es preferible usar un anticuerpo que se una a las células de mieloma pero no a los glóbulos sanguíneos normales. Por tanto, se identificó un anticuerpo útil en el tratamiento del mieloma múltiple mediante el siguiente método.

En primer lugar, se prepararon 10.000 o más clones de anticuerpos monoclonales que se unen a una variedad de ^{líneas celulares de mieloma según la siguiente técnica. Se inmunizaron almohadillas de ratones Balb/c con}6 ^{tipos de líneas celulares de mieloma humano (MM1, RPMI8226, INA}6^{, U266, OPM2 y KMS121BM) como antígenos dos veces}por semana durante de 2 a 3 semanas. Después de eso, se extrajeron los ganglios linfáticos por debajo de las rodillas y se prepararon suspensiones celulares, seguido por la fusión celular con una línea celular de mieloma de ratón SP2/0. Se realizó la fusión celular mediante un método que usa polietilenglicol (método PEG). Se cultivaron las células en un medio de hipoxantina-aminopterina-timidina (medio HAT) para seleccionar hibridomas. Finalmente, se fusionaron los hibridomas con las líneas celulares de mieloma usadas para la inmunización usando el sobrenadante de cultivo de los hibridomas y se seleccionó un sobrenadante que contenía anticuerpos que no se unen a células mononucleares originadas a partir de sangre periférica de un individuo sano mediante citometría de flujo. Los candidatos resultantes ^{para el anticuerpo específico de células de mieloma fueron aproximadamente}200 ^{clones, y estos se hicieron crecer y}se crioconservaron.

3. Identificación del anticuerpo R8H283 que se une específicamente a la célula de mieloma en la médula ósea de un paciente humano con mieloma múltiple

Se tiñeron células de médula ósea originadas a partir de un paciente con mieloma con aproximadamente 200 clones de anticuerpos candidatos obtenidos en la sección 2 anterior y se analizaron mediante FACS. Se añadió cada anticuerpo a células de médula ósea originadas a partir de un paciente con mieloma múltiple y se incubó a 4°C durante 30 minutos, seguido por lavado. Se añadió a lo mismo anticuerpo anti-IgG-PE de ratón conjugado con PE como anticuerpo secundario y se incubó adicionalmente a 4°C durante 30 minutos. Después del lavado, se tiñó finalmente el resultado con un anticuerpo anti-CD138 conjugado con APC (Biolegend), un anticuerpo anti-CD38 conjugado con FITC (Biolegend) o un anticuerpo anti-CD45 conjugado con Cy7-PE (Biolegend). En lugar de anticuerpos candidatos, también se preparó una muestra que contenía IgG de ratón como control de isotipo. Estos se analizaron mediante citometría de flujo y se seleccionaron los anticuerpos que se unen a células plasmáticas de mieloma CD45-CD38++CD138+ y células progenitoras de mieloma CD45-CD38++CD138-, pero no a glóbulos sanguíneos CD45+. Como resultado, se identificó el anticuerpo R8H283 como un anticuerpo que satisface estas condiciones (figuras 1 y 2). En cada histograma, el eje Y indica el número de células y el eje X indica la fuerza de unión del anticuerpo R8H283. En muchos casos se realizó un examen adicional y en muchos casos se confirmó la unión del anticuerpo R8H283 a células plasmáticas de mieloma CD45-CD38++CD138+ y células progenitoras de mieloma CD45-CD38++CD138-. Sin embargo, quedó claro que el anticuerpo R8H283 casi no se une en absoluto a los glóbulos sanguíneos CD45+.

4. Identificación de la proteína antigénica a la que se une el anticuerpo R8H283

Se realizó la identificación de una proteína antigénica a la que se une el anticuerpo R8H283 mediante un método de clonación de expresión. En primer lugar, se preparó una biblioteca de ADNc a partir de células RPMI8226 que se sabe que están unidas por el anticuerpo R8H283 usando un sistema de elección SuperScript para la síntesis de ADNc (Invitrogen), y se introdujo en un vector retroviral pMXs (proporcionado por el profesor Toshio Kitamura en el Instituto de Ciencias Médicas, Universidad de Tokio) usando un adaptador BstXI (Invitrogen). Se infectaron células BaF3 con un retrovirus obtenido mediante la introducción de la biblioteca de ADNc así preparada en células plat-E (proporcionada por el profesor Toshio Kitamura), obteniendo de ese modo células BaF3 que expresan una biblioteca de ADNc originada a partir de RPMI8226. Posteriormente, se tiñeron estas células con el anticuerpo R8H283 y se repitió una operación de concentración de células positivas con clasificación FACS (figura 3). Después de la tercera clasificación, la mayoría de las células fueron las que se unieron a R8H283. Por tanto, se amplificó el inserto del retrovirus poseído por las células mediante PCR y luego se identificó mediante secuenciación. Los resultados revelaron que CD98hc es la proteína antigénica.

5. Confirmación de que el antígeno al que se une el anticuerpo R8H283 es la proteína CD98hc

Se preparó una línea celular de mieloma U266 defectuosa en CD98hc usando un sistema Crispr-Cas9 según el siguiente procedimiento, y se confirmó que la proteína antigénica a la que se une el anticuerpo R8H283 era CD98hc. En primer lugar, se preparó un vector insertando una secuencia de ADN bicatenario (una secuencia diana específica de CD98hc) en un vector PX330 (adgene). El vector obtenido junto con un vector de expresión génica de resistencia a higromicina lineal (Clontech), que es un vector para seleccionar un agente medicinal, se introdujo en células U266 usando NucleofectorII (Lonza). Después de eso, la expresión de CD98hc en clones que crecían en un medio que contenía higromicina se tiñó con un anticuerpo MEM-108 (anticuerpo anti-CD98, Biolegend) y se analizó mediante FACS, identificando de ese modo las células defectuosas en CD98hc (U266CD98hcKO). En segundo lugar, las células defectuosas en CD98hc se tiñeron con el anticuerpo R8H283 y se analizaron con FACS. Como resultado, mientras que el anticuerpo R8H283 se unía a la célula U266 de tipo natural, la unión del anticuerpo R8H283 a la línea defectuosa en CD98hc se perdió por completo (figura 4). Esto indica que R8H283 se une sólo a la proteína CD98hc y, por tanto, se confirmó que la proteína CD98hc es el antígeno del anticuerpo R8H283.

6^{. Medición del patrón de unión del anticuerpo R8H283 en fracciones celulares de sangre periférica y médula ósea de}individuos sanos

Usando un anticuerpo anti-CD98 disponible comercialmente (MEM-108, Biolegend) y el anticuerpo R8H283, se midió la unión de estos anticuerpos a diversas fracciones celulares en células de sangre periférica y de médula ósea en individuos sanos. Después de que se extrajeran los glóbulos rojos usando HES40 de células de sangre periférica originados a partir de un individuo sano, se añadió un reactivo de bloqueo del receptor de Fc (Miltenyi) para bloquear los anticuerpos que presentaban unión no específica. Después de eso, se añadió a lo mismo el anticuerpo R8H283, el anticuerpo MEM-108 o el control de isotipo IgG2 de ratón y se incubó a 4°C durante 30 minutos. Después del lavado, se añadió a lo mismo anticuerpo anti-IgG-PE de ratón conjugado con PE como anticuerpo secundario, y se incubó adicionalmente a 4°C durante 3o minutos. Después del lavado, se tiñó finalmente el resultado con un anticuerpo anti-CD19 conjugado con Cy7-APC (Biolegend), un anticuerpo anti-CD14 conjugado con FITC (Biolegend) o un anticuerpo anti-CD3 conjugado con Cy7-PE (Biolegend). Estos se analizaron mediante citometría de flujo para medir la unión del anticuerpo R8H283 o del anticuerpo MEM-108 en cada fracción (figura 5A). Además, se añadió 1 |il de sangre periférica a 100 |il de EDTA-PBS y también se tiñó con el anticuerpo R8H283 o el anticuerpo MEM-108 de la misma manera. Finalmente, se tiñó el resultado con un anticuerpo anti-CD235 conjugado con azul del Pacífico (BD Pharmingen) para examinar la presencia o ausencia de cada anticuerpo en glóbulos rojos positivos para CD235 (figura 5A).

Se tiñeron también células de médula ósea originadas a partir de un individuo sano con el anticuerpo R8H283 o el anticuerpo MEM-108 como con las células de sangre periférica, y finalmente se tiñeron con un anticuerpo anti-CD34 conjugado con APC (BD Pharmingen), anticuerpo anti-CD19 conjugado con Cy7-APC (BD Pharmingen), anticuerpo anti-CD38 conjugado con Cy7-PE (eBioscience), anticuerpo anti-CD3 conjugado con Alexa647 (BD Pharmingen) o anticuerpo anti-CD14 conjugado con FITC (eBioscience). Estos se analizaron mediante citometría de flujo y se midió la unión del anticuerpo R8H283 o del anticuerpo MEM-108 en cada fracción (figura 5B). Los resultados indican que mientras que el anticuerpo MEM-108 se une a todos los glóbulos sanguíneos excepto a los glóbulos rojos, el R8H283 no se une a los glóbulos sanguíneos normales excepto a una pequeña porción de células plasmáticas y células B.

Además, se tiñeron células B y células T de sangre periférica de un individuo sano con el anticuerpo R8H283 o MEM-108 de diferentes concentraciones, y se midió la unión de cada anticuerpo mediante FACS. Si bien el anticuerpo MEM-108 mostró un aumento dependiente de la concentración en la intensidad de fluorescencia, lo que indica la cantidad de enlace del anticuerpo, el anticuerpo R8H283 no mostró su unión a los linfocitos de un individuo sano incluso cuando ^{la concentración de anticuerpo aumentó hasta 50 |ig/ml (figura}6^{). Esto indica que la proteína CD98hc está presente}en los linfocitos, pero que el anticuerpo R8H283 no se une a los linfocitos normales.

Se sabe que la proteína CD98 se expresa en órganos distintos del sistema sanguíneo. El análisis se realizó sobre la unión del anticuerpo R8H283 o del anticuerpo MEM-108 a una célula HUVEC, que es una célula endotelial vascular normal y es una célula analizable por FACS entre células normales distintas del sistema sanguíneo. Los resultados indican que mientras MEM-108 se une a HUVEC, R8H283 casi no se une en absoluto a HUVEC (figura 7).

De la misma manera que anteriormente, se analizó la unión del anticuerpo R8H283 a líneas de células de cáncer ^{distintas de mieloma. Los resultados revelaron que, tal como se muestra en la figura}8^{, el anticuerpo R8H283 se une}a cualquiera de los siguientes: célula Jurkat y célula Molt4, que son una línea celular de leucemia/linfoma de células T; célula Raji y célula Daudi, que son una línea celular de leucemia/linfoma de células B; célula A549, que es una línea celular de cáncer de pulmón; célula DLD-1, que es una línea celular de cáncer de colon; célula TYK-nu-CPr, que es una línea celular de cáncer de ovario; célula MCF-7, que es una línea celular de cáncer de mama; y célula T98G, que es una línea celular de tumor encefálico. Estos resultados sugieren que el anticuerpo R8H283 no se une a las células normales, sino que se une específicamente a una amplia gama de células cancerosas. En las células cancerosas, se produce una alteración de estructura específica en CD98hc, y el anticuerpo R8H283 parece reconocer específicamente la estructura alterada.

7. Comparación de la capacidad de unión del anticuerpo R8H283 a la célula de sangre periférica de un individuo sano con capacidad de unión de otro anticuerpo

Se comparó la unión del anticuerpo R8H283 a la sangre periférica de un individuo sano con la unión de otros anticuerpos que se informan como útiles en el tratamiento del mieloma múltiple para estas células. Excepto que se usaron un anticuerpo anti-CS1 (Biolegend), un anticuerpo anti-CD38 (Biolegend) y un anticuerpo anti-BST2 (Biolegend) como anticuerpo primario, se realizó la tinción de la misma manera que anteriormente, seguido por un análisis de FACS (figura 9). Los resultados confirmaron que mientras que el anticuerpo R8H283 no se une a las células T normales en absoluto, el anticuerpo anti-CS1 se une a algunas células T normales. Se confirmó que el anticuerpo anti-CD38 se une significativamente a todas las células de sangre periférica normales en comparación con el anticuerpo R8H283. Se confirmó que el anticuerpo anti-BST2 se une significativamente a células T normales y monocitos en comparación con el anticuerpo R8H283. Estos resultados indican que el R8H283 tiene una mayor especificidad por las células cancerosas, incluyendo células de mieloma.

8^{. Análisis de asociación de la unión de R8H283 con glicosilación de proteína CD98hc}

Se analizó la unión del anticuerpo R8H283 o del anticuerpo MEM-108 a la línea celular de mieloma RPMI8226 o la línea celular de leucemia mieloide U937 mediante FACS. El método de tinción fue el mismo que en la prueba con ^{sangre periférica en la sección}6 ^{anterior. Los resultados confirmaron que a pesar de que la proteína CD98hc es un}antígeno para ambos, mientras que el anticuerpo MEM-108 se une a casi todas las líneas celulares, el anticuerpo R8H283 se une a algunas líneas celulares, pero no a otras líneas celulares. Por ejemplo, ambos anticuerpos se unen bien a RPMI8226 (línea celular de mieloma); sin embargo, mientras que el anticuerpo MEM-108 se une bien a U937 (línea celular de leucemia mieloide), el anticuerpo R8H283 casi no se une en absoluto a U937 (figura 10A). Se tiñeron células RPMI8226 y células U937 con el anticuerpo R8H283 o MEM-108 de diferentes concentraciones, y se midió la unión de cada anticuerpo mediante FACS. Los resultados muestran que mientras que RPMI8226 mostró un aumento dependiente de la concentración en la intensidad de fluorescencia tanto para el anticuerpo MEM-108 como para el anticuerpo R8H283, las células U937 casi no mostraron unión de R8H283 incluso cuando la concentración de anticuerpo del anticuerpo R8H283 aumentó hasta 50 |ig/ml (figura 10B).

Esto se debe probablemente a la diferencia en la modificación postraduccional de CD98hc, que se expresa en líneas celulares de mieloma y líneas celulares de leucemia. CD98hc es una proteína que está sujeta a glicosilación con unión a N en un grado significativamente alto, y el grado de glicosilación puede variar. Por tanto, se añadió tunicamicina (2,5 mg/ml), que es un inhibidor de la síntesis de N-glicanos, a una disolución de cultivo de células U937 o células THP1, que no están unidas por el anticuerpo R8H283, durante 24 horas y se analizó la unión del anticuerpo R8H283 o el anticuerpo MEM-108 mediante FACS. Se realizó la tinción de cada anticuerpo mediante el siguiente método. Se ^{suspendieron 1 * 10}5 ^{células en 50 |il de PBS suero fetal de vaca al 2%, y se añadió a las mismas 1 |il de un reactivo}de bloqueo de FC (Miltenyi Biotec, #130-059-901). Posteriormente, se añadió R8H283 o MEM-108 para dar una concentración final de 50 |ig/ml y 2,5 |ig/ml, y se dejó reposar la mezcla en hielo durante 30 minutos. Por separado, se añadieron los respectivos anticuerpos de control de isotipo para dar las mismas concentraciones a otras suspensiones celulares preparadas de la misma manera. Se lavaron las células dos veces con PBS suero fetal de vaca al 2% y se suspendieron de nuevo en 50 |il de un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado con ficoeritina (PE) diluido hasta 1 |ig/ml en PBS suero fetal de vaca al 2%. Se dejaron reposar las células adicionalmente durante 30 minutos. Después de eso, se lavaron las células dos veces con PBS suero fetal de vaca al 2% y se suspendieron de nuevo en PBS suero fetal de vaca al 2% que contenía yoduro de propidio (PI) 1 |ig/ml, seguido por análisis por FACS Canto II (Beckton Dickinson). En esta etapa, se excluyeron del análisis las células muertas positivas para Pl y se cuantificó la cantidad de anticuerpos que se unen a células viables como un valor medio de la intensidad de fluorescencia de PE (intensidad de fluorescencia media (MFI)). El valor de MFI que indica la cantidad de unión del anticuerpo R8H283 (un valor corregido obtenido al dividir entre el valor del control de isotipo (control de isotipo de IgG2a de ratón, Biolegend, #401502)) fue tal como sigue: antes del tratamiento con tunicamicina, células U937 1,5 y célula THP-1 2,6; y después del tratamiento con tunicamicina, célula U9373,0 y célula THP-1 17,1; esto indica que la ^{unión del anticuerpo R8H283 después del tratamiento con tunicamicina aumentó (U937: 2,0 veces, THP-1:}6,6 ^vecesen MFI). Sin embargo, el valor de MFI que indica la cantidad de unión del anticuerpo MEM-108 (un valor corregido obtenido al dividir entre un control de isotipo (control de isotipo IgG1 de ratón, Biolegend, #400102)) fue tal como sigue: antes del tratamiento, célula U937 11,8 y célula THP-1 29,4; y después del tratamiento, célula U9378,3 y célula THP-1 29,1; esto indica que no hay aumento en la cantidad de unión de R8H283 (figura 11A). Esto indica claramente que la diferencia en la glicosilación con unión a N determina la cantidad de unión del anticuerpo R8H283.

Debido a que la tunicamicina es un inhibidor de la síntesis de N-glicanos y también provoca un alto estrés del retículo endoplásmico, la tunicamicina se usa como agente medicinal para evocar el estrés del retículo endoplásmico. Debido a que siempre se produce una gran cantidad de síntesis de proteínas en las células de mieloma, el estrés del retículo endoplásmico siempre se ejerce sobre las células de mieloma. Los inventores especularon que la glicosilación de CD98hc puede cambiar bajo estrés del retículo endoplásmico, permitiendo de ese modo que el anticuerpo R8H283 se una a CD98hc. Por tanto, las células U937 o las células THP1 se trataron con tapsigargina (1 nM, un inductor de estrés del retículo endoplásmico), que no inhibe directamente la glicosilación, a diferencia de la tunicamicina, y se analizó la unión del anticuerpo R8H283 o del anticuerpo MEM-108 mediante FACS. Los resultados indicaron que la unión del anticuerpo R8H283 apareció debido al tratamiento con tapsigargina (figura 11B). Además, el peso molecular de CD98hc en las células tratadas con tapsigargina y las células sin tratar se examinó mediante inmunotransferencia de tipo Western, y quedó claro que CD98hc de menor peso molecular o CD98hc con glicosilación incompleta se ^{expresaba bajo estrés del retículo endoplásmico provocado por tapsigargina (figura}12^).

El bortezomib, que es un inhibidor del proteasoma, también provoca un alto estrés del retículo endoplásmico en las células de mieloma. A continuación, se trató MM1, que es una línea celular de mieloma a la que se une R8H283 de una manera relativamente débil, con bortezomib (10 nM) y se comparó con células sin tratar en cuanto a unión de R8H283. Como resultado, el tratamiento con bortezomib aumentó claramente la unión de R8H283 (figura 13A). Se realizó el mismo experimento con células de médula ósea originadas a partir de un paciente con mieloma. A pesar de que la cantidad de unión de MEM-108 en las células de mieloma no cambió, la cantidad de unión de R8H283 aumentó; sin embargo, tal cambio no se produjo en los linfocitos T en los que no se produce un aumento del estrés del retículo endoplásmico por bortezomib (figura 13B). Estos resultados sugieren que la alteración de la glicosilación provocada por un alto estrés del retículo endoplásmico que se produce normalmente en las células de mieloma puede estar asociada con la aparición del epítopo al que se une el anticuerpo R8H283.

9. Identificación del epítopo

Para identificar el epítopo que reconoce R8H283, se prepararon diversos vectores de expresión de proteína CD98hc de quimera humano/ratón usando PCR solapante tal como se describe a continuación. Las secuencias de los cebadores usados son las siguientes.

EcoRIhCD98F, CCGGAATTCCCACCATGAGCCAGGACACCGAGGTGGATATGA (SEQ ID NO: 25) BamHIhCD98R, AAAGGATCCTCATCAGGCCGCGTAGGGGAAGCGGAGCAGCAGCC (SEQ ID NO: 26) EcoRImCD98F, CCGGAATTCCCACCATGAGCCAGGACACCGAAGTGGACATGAAA (SEQ ID NO: 27) BamHImCD98R, CGCGGATCCTCATCAGGCCACAAAGGGGAACTGTA (SEQ ID NO: 28) cCD98-203F, TCATTCTGGACCTTACTCCCAACTACC (SEQ ID NO: 29) cCD98-203R, GGTAGTTGGGAGTAAGGTCCAGAATGA (SEQ ID NO: 30) cCD98-365F, TTCCGGCGGCTGAGTGAC (SEQ ID NO: 31) cCD98-365R, GTCACTCAGCCGCCGGAA (SEQ ID NO: 32) cCD98-427F, AGCTACGGGGATGAGATTGGCCT (SEQ ID NO: 33) cCD98-427R, AGGCCAATCTCATCCCCGTAGCT (SEQ ID NO: 34) cCD98-370F, TTGGCCTGGATGCAGCTGCCCTTCCTGGACAGC (SEQ ID NO: 35) cCD98-370R, GCTGTCCAGGAAGGGCAGCTGCATCCAGGCCAA (SEQ ID NO: 36) cCD98-376F, TGCCCTTCCTGGACAGCC (SEQ ID NO: 37) cCD98-376R, GGCTGTCCAGGAAGGGCA (SEQ ID NO: 38) cCD98-402F, CCAGCTTCCCTGACATCCCAGGGGCTGTAA (SEQ ID NO: 39) cCD98-402R, TTACAGCCCCTGGGATGTCAGGGAAGCTGG (SEQ ID NO: 40) cCD98-409F, CTGTAAGTGCCAACATGACTGTGAAG (SEQ ID NO: 41) cCD98-409R, CTTCACAGTCATGTTGGCACTTACAG (SEQ ID NO: 42).

Se realizó la PCR usando como molde un vector MSCV-ires-GFP en el que se insertó ADNc de CD98hc humana o de ratón. Se realizó la PCR usando primeSTAR (Takara Bio Inc.), KODfx (Toyobo Co., Ltd.) y Accuprime taq (Invitrogen). Se preparó ADNc quimérico (figura 14) tal como se describe a continuación. En primer lugar, se realizó una PCR de 25 ciclos con el cebador F 1 y el cebador R 1 usando ADNc1 como molde, y también se realizó una PCR de 25 ciclos por separado con el cebador F 2 y el cebador R 2 usando ADNc2 como molde, con cualquiera de las enzimas de PCR enumeradas anteriormente. Se sometieron a electroforesis los productos de PCR en gel de agarosa al 1% y luego se purificaron con un kit de extracción en gel QIAquick. Se añadieron 5 |il de agua a 2,5 |il de cada producto de PCR, y ^{se realizó la PCR a 94°C durante 15 segundos, 55°C durante 30 segundos y}68^{°C durante 2 minutos en tres ciclos,}seguido por incubación a 99°C durante 5 minutos. A continuación, se realizó una PCR solapante con el cebador F 1 y el cebador R 2 usando 1 |il de cada resultado como molde. Después de que se confirmaron los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa, se clonaron los productos usando un kit de clonación Ta (Invitrogen). Se confirmaron las secuencias mediante secuenciación. A continuación, se cortaron los insertos con EcoRI y BamHI y se insertaron en vectores MSCV-ires-GFP para su uso como vectores de expresión. La tabla 3 muestra las combinaciones de cebadores y moldes y los nombres de los vectores de expresión obtenidos.

Tabla 3

Se introdujeron individualmente los vectores de expresión en una célula CHO usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) y se tiñeron con el anticuerpo R8H283 y el anticuerpo MEM-108 durante 24 horas, analizando de ese modo la unión de cada anticuerpo mediante FACS en células positivas para GFP (que tienen un vector introducido). El método de tinción es el mismo que en la sección 3 anterior.

Los resultados revelaron que, en primer lugar, la secuencia de aminoácidos del epítopo necesaria para formar un antígeno que es reconocido por R8H283 está presente en la región en las posiciones 203 a 427 de CD98hc humana. Una búsqueda más refinada reveló que el epítopo está presente en la región entre el aminoácido en la posición 365 y el aminoácido en la posición 427 de CD98hc humana. Sin embargo, se pensó que el epítopo reconocido por el anticuerpo MEM-108 estaba presente en la región entre la posición 428 y el extremo C-terminal (figura 14). Una búsqueda todavía más refinada confirmó que el epítopo está presente en la región desde la posición 365 a la posición 407 de CD98hc humana (YGDEIGLDAAALPGQPMEAPVMLWDESSFPDIPGAVSANMTVK (SEQ ID NO: 23)) (figura 15). En esta secuencia, el quinto N del extremo C-terminal es un sitio de N-glicosilación.

10. Determinación de la secuencia de bases de la región variable de la molécula de anticuerpo del anticuerpo R8H283

Se confirmó la subclase del anticuerpo monoclonal R8H283 usando un kit de isotipificación (Roche) y se determinó que la subclase era IgG2sa. Además, se determinaron la secuencia de bases y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la molécula de anticuerpo producida por el hibridoma R8H283. Se realizó la determinación de las secuencias usando un kit de amplificación de ADNc Smarter RACE (Clontech). Específicamente, se amplificaron los fragmentos de ADNc de las regiones variables de cadena H y cadena k mediante reacción de PCR usando ADNc preparado a partir de ARNm originado a partir del hibridoma que produce el anticuerpo R8H283 como molde, y se descodificaron las secuencias de bases. Las tablas 4 y 5 muestran las secuencias de aminoácidos y las secuencias de bases de las regiones variables y las regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3) de la cadena H y la cadena L (cadena k) descodificadas.

Tabla 4

Tabla 5

________________________ 11. Medición de la actividad citotóxica del anticuerpo monoclonal R8H283

Se examinó si la actividad citotóxica está presente in vitro para un anticuerpo monoclonal R8H283 purificado a partir del sobrenadante de un cultivo de hibridoma productor de anticuerpo R8H283 mediante una proteína G (GE healthcare). Se realizó la prueba examinando si la actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) está presente mediante un ensayo de liberación de cromo. Como complemento se usó un complemento de cría de conejo (Cedarene). Para las células de mieloma, se usaron U266, OPM2, NCI-H929 y RPMI8226, que se sabe que están unidas por el anticuerpo R8H283. Cada línea celular de mieloma se marcó con 51Cr durante 2 horas y se lavó tres ^{veces. Se cultivaron las células marcadas (1 * 10}4 ^{células) en 160 |il de medio RPMI1640 suero fetal de vaca al que}se les había añadido un anticuerpo monoclonal R8H283 o un control de isotipo y un complemento de cría de conejo ^{al 25% en una placa con fondo en U de 96 pocillos (1 * 10}4 ^{células). En la prueba que usaba U266, cada anticuerpo}usado tenía una concentración final de 0,1 mg/ml o 1 mg/ml. En las pruebas que usaban OPM2, NCI-H929 o RPMI8226, cada anticuerpo usado tenía una concentración final de 10 |ig/ml. Después del cultivo a 37°C con el 5% ^{de CO}2 ^{durante 90 minutos, se contó el 51Cr liberado en el sobrenadante. Se calculó la actividad citotóxica específica}tal como se describe a continuación.

Actividad de CDC = (liberación de 51Cr a partir de las células usadas en la prueba - liberación de 51Cr de un voluntario en ausencia de un anticuerpo)/(liberación d e 51Cr máxima mediante la adición de Triton X-100 al 1% - liberación de 51Cr de un voluntario en ausencia de un anticuerpo) x 100

Las figuras 16C y 16D muestran los resultados de la medición. Se confirmó que el anticuerpo monoclonal R8H283 tenía una clara citotoxicidad celular dependiente del complemento contra todas las líneas celulares de mieloma examinadas.

Además, también se examinó la actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Se marcaron las células diana con 51Cr como con la medición de la citotoxicidad celular dependiente del complemento, y se usaron células de médula ósea de un ratón SCID cultivadas en un medio RPMI1640 que contenía FBS al 10%, GM-CSF de ^{ratón 10 ng/ml e IL2 humana 40 Ul/ml durante}6 ^{días como células efectoras. Se añadió el anticuerpo R8H283 o su}anticuerpo de isotipo (control) a una placa de 96 pocillos y se añadieron células diana (1,0 * 104) y células efectoras ^{(5 * 105) a la misma. En la prueba que usaba U}266^{, cada anticuerpo para su uso tenía una concentración final de 0,1}mg/ml o 1 mg/ml. En las pruebas que usaban OPM2, NCI-H929 o RPMI8226, cada anticuerpo para su uso tenía una concentración final de 10 |ig/ml. Se realizó una reacción a 37°C durante 4 horas. Después de la separación mediante centrifugación, se midió el 51Cr liberado en el sobrenadante con un contador y. Se determinó la actividad de ADCC según la siguiente ecuación.

Actividad de ADCC = (liberación de 51Cr a partir de células usadas en la prueba - liberación de 51Cr de un voluntario en ausencia de un anticuerpo)/(liberación de 51Cr máxima provocada por la adición de Triton X-100 al 1% - liberación de 51Cr de un voluntario en ausencia de un anticuerpo) x 100

Las figuras 16A y 16B muestran los resultados de la medición. Se confirmó que el anticuerpo monoclonal R8H283 tenía una clara actividad de ADCC contra todas las líneas celulares de mieloma examinadas.

Estos resultados indican que el anticuerpo monoclonal R8H283 y los anticuerpos que reconocen un epítopo idéntico al epítopo reconocido por el anticuerpo monoclonal R8H283 pueden ser un principio activo para el tratamiento del mieloma múltiple.

12. Efecto de inhibición sobre el crecimiento de células de mieloma por anticuerpo monoclonal anti-CD98hc humana que tiene actividad citotóxica in vivo (modelo de tumor subcutáneo)

Se examinó un efecto terapéutico sobre el mieloma múltiple in vivo usando el anticuerpo monoclonal R8H283 que se confirmó que tenía actividad citotóxica en la sección 11 anterior. Se trasplantaron subcutáneamente ratones SCID con una línea celular de mieloma OPM2 (1 x 107). Cuando el volumen del tumor superó los 30 mm3, se dividieron los ratones en un grupo al que se administra un anticuerpo anti-CD98hc y un grupo de control al que se administra IgG; se administraron a los grupos 10 mg/kg del anticuerpo monoclonal R8H283 o IgG de control dos veces por semana. Se midió el volumen del tumor dos veces por semana y se expresó el volumen como el siguiente valor aproximado: diámetro más largo * diámetro más corto * altura/2. El momento en el que el volumen de masa tumoral formada por ^{la línea celular de mieloma trasplantada OPM2 superó los 30 mm}3 ^{es el día 0, y la figura 17A muestra los cambios en}el volumen del tumor desde el día 0. La figura 17B muestra el tamaño de los tumores de un ratón de control (al que se le administró IgG) y un ratón al que se le administró el anticuerpo R8H283 el día 21. Las flechas indican el ancho de los tumores. Tal como se muestra en las figuras 17A y 17B, cuando se administró la IgG de control, las células de mieloma crecieron de manera exponencial; sin embargo, cuando se administró el anticuerpo monoclonal R8H283 que tiene actividad citotóxica (R8H283), el crecimiento de las células de mieloma se inhibió casi por completo. Posteriormente, la dosis se redujo hasta 1 mg/kg o 0,1 mg/kg, y se realizó completamente la misma prueba. Los ^{resultados indicaron que incluso la administración de}1 ^{mg/kg proporciona un efecto suficiente (figura 17C).}

13. Efecto de inhibición sobre el crecimiento de células de mieloma por anticuerpo monoclonal anti-CD98hc humana que tiene actividad citotóxica in vivo (modelo administrado por vía parenteral)

Para examinar el efecto sobre las células de mieloma en un entorno más fisiológico, se examinó el efecto de un anticuerpo sobre las células de mieloma transferidas a través de la circulación venosa e injertadas en una médula ^{ósea. Se trasplantaron 5 * 10}6 ^{células de la línea celular de mieloma U266 a las que se había introducido un vector}de expresión de luciferasa en una vena de ratones NOD/SCIDyc-/-(NOG) que se habían expuesto a una radiación de 2,4 Gy. Después de 7 días y 10 días, se administró el anticuerpo R8H283 o la IgG de control por vía intraperitoneal a los ratones. Para examinar el efecto de los anticuerpos, se analizó el quimerismo de las células de mieloma humano en médulas óseas de ratón el día 14. Mientras que el injerto de células CD138+U266 en médulas óseas se observó claramente en cada ratón del grupo al que se administró el anticuerpo IgG de control, se encontró que las células de mieloma habían desaparecido en el grupo de ratones a los que se les administró el anticuerpo R8H283 en ambas dosis de 10 mg/kg y 1 mg/kg. Sorprendentemente, incluso en una dosis extremadamente baja de 0,01 mg/kg, el número de células U266 en la médula ósea disminuyó significativamente (figuras 18A y 18B). Además, en el experimento en el que se administró un anticuerpo en una dosis de 5 mg/kg, los ratones no se analizaron el día 14, sino que se sometieron a obtención de imágenes del tumor el día 40 usando IVIS. Si bien se observó una diseminación del tumor por todo el cuerpo de los ratones en el grupo al que se administró la IgG de control, no se detectó ningún tumor en el grupo al que se administró R8H283, lo que indica que el tumor parecía haberse curado (figura 18C). Estos resultados revelaron que el anticuerpo monoclonal R8H283 (R8H283) y los anticuerpos que reconocen un epítopo idéntico al de R8H283 tienen una potente actividad citotóxica contra las células de mieloma que expresan CD98hc.

14. Efecto de inhibición sobre el crecimiento de células de mieloma por anticuerpo monoclonal anti-CD98hc humana con actividad citotóxica in vivo (modelo de trasplante de médula ósea)

En la mayoría de los casos, las células de mieloma son un tumor que crece sólo en la médula ósea y se considera que reciben un gran apoyo para la supervivencia del microambiente de la médula ósea. Para examinar adicionalmente el efecto sobre las células de mieloma en un entorno fisiológico, se trasplantaron células de mieloma directamente en la médula ósea y se examinó el efecto de un anticuerpo sobre una gran cantidad de células de mieloma injertadas en ^{la médula ósea. Se trasplantaron 4 * 10}5 ^{células de la línea celular de mieloma U266 a las que se había introducido}un vector de expresión de luciferasa en la médula ósea de la tibia de ratones B6-Rag2-/-yc-/-sirpa (BRGS) que se habían expuesto a una radiación de 2,4 Gy. Después de 7 días, se confirmó que las células U266 que expresaban luciferasa se habían injertado en la médula ósea de la tibia mediante IVIS. Después de eso, en los días 7, 10, 14 y 17, se administró a los ratones por vía intraperitoneal el anticuerpo R8H283 o IgG de control en una dosis de 0,5 mg/kg, o con bortezomib en una dosis de 1 mg/kg. Para examinar el efecto de los anticuerpos y bortezomib, se realizó obtención de imágenes de expresión de luciferasa con IVIS el día 21. Si bien se detectaron células U266 que expresaban luciferasa en el grupo al que se administró la IgG de control y al grupo al que se administró bortezomib, no se detectó ningún tumor en el grupo al que se administró el anticuerpo R8H283 (figura 19). Estos resultados revelaron que el anticuerpo monoclonal R8H283 (R8H283) y los anticuerpos que reconocen un epítopo idéntico al epítopo de R8H283 tienen una potente actividad citotóxica contra las células de mieloma que expresan CD98hc, incluso cuando las células de mieloma están presentes en la médula ósea.

15. Análisis de epítopo

Los resultados del examen del epítopo para el anticuerpo R8H283 en la sección 9 anterior se examinaron ^{adicionalmente con más detalle. Se prepararon vectores de expresión para}6 ^{tipos de proteínas CD98hc de quimera}humano/ratón mostradas en la figura 20 y se introdujeron en células CHO mediante lipofección. Después de 48 horas, se analizó mediante FACS la presencia o ausencia de la unión del anticuerpo R8H283.

Los resultados confirmaron que el reemplazo de la región de los residuos de aminoácido en las posiciones 365 a 376 ó 395 a 409 en la proteína CD98hc por los residuos de aminoácido originados en ratón provoca que el anticuerpo R8H283 no se una a la proteína CD98hc (figura 20). Tal como se muestra en la figura 21, los residuos de aminoácido que difieren entre CD98hc originada en humano y CD98hc originada en ratón en un fragmento que se compone de los residuos de aminoácido en las posiciones 365 a 409 de la proteína CD98hc son 15 residuos de aminoácido en las posiciones 371, 374, 375, 376, 383, 384, 387, 389, 391, 395, 396, 397, 400, 401 y 404. Por tanto, los resultados mostrados en la figura 20 sugieren que el anticuerpo R8H283 reconoce los residuos de aminoácido en las posiciones 371, 374, 375, 376, 395, 396, 397, 400, 401 y/o 404.

Por tanto, los vectores que expresan 7 tipos de variantes (I371L, D374/A375Q, A376G, D391N/F395I/P396F/D397H, F395I/P396F/D397H, G400R/A401P y A404L) se prepararon reemplazando los residuos de aminoácido en las posiciones 1 a 4 de CD98hc humana por las secuencias de aminoácidos originadas en ratón y se introdujeron en células CHO mediante lipofección. Los vectores de expresión para los 7 tipos de proteínas variantes de CD98hc se prepararon usando un kit basal de mutagénesis primeSTAR (Takara Bio Inc.). Las secuencias de los cebadores usados y los ADN usados como moldes son tal como se muestran a continuación.

Claims

REIVINDICACIONES

i . Anticuerpo, cuyo epítopo está presente dentro de una región de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:

24 de CD98hc humana, que comprende:

una región variable de cadena pesada que comprende

una CDR1 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1,

una CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y

una CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y

una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 de cadena ligera que comprende una ^{secuencia de aminoácidos que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:}6^,

una CDR2 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y

una CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene la secuencia de ^{aminoácidos de SEQ ID NO:}8^.
2. Anticuerpo según la reivindicación 1, que comprende:

una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, y/o una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
3. Anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2, que es un Fv, scFv, diacuerpo, triacuerpo, tetracuerpo, o una combinación de los mismos.
4. Anticuerpo según la reivindicación 1, que es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.
5. Anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1,2 y 4, que es un Fab, F(ab)', minicuerpo, scFv-Fc, o una combinación de los mismos.
6^.Anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que tiene una sustancia que tiene una actividad citotóxica, una enzima, una etiqueta, o un inmunomodulador unido al mismo.
7. Receptor de antígeno quimérico anti-CD98hc humana, cuyo epítopo está presente dentro de una región de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 de CD98hc humana, que comprende:

una región variable de cadena pesada que comprende

una CDR1 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1,

una CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y

una CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y

una región variable de cadena ligera que comprende

una CDR1 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene la secuencia de ^{aminoácidos de SEQ ID NO:}6^,

una CDR2 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y

una CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene la secuencia de ^{aminoácidos de SEQ ID NO:}8^.
8^{. Polinucleótido que codifica para el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a}6 ^{o receptor}de antígeno quimérico según la reivindicación 7.
9. ^{Célula huésped que comprende el polinucleótido según la reivindicación}8^.
10^{. Célula huésped según la reivindicación 9, que es una célula T.}
11. Célula huésped según la reivindicación 9 ó 10, que es una célula T con receptor de antígeno quimérico o un linfocito citolítico natural con receptor de antígeno quimérico.

12^{. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a}6^,o receptor de antígeno quimérico según la reivindicación 7, o célula según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.