CN112194722A - 抗h5亚型禽流感病毒的重组抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组单克隆抗体,该重组单克隆单抗可以用于H5亚型禽流感病毒的诊断,应用于竞争ELISA等方法对抗体水平的检测,以及对特异性抗体标定抗原或者竞争与抗原反应的抗体的检测。所述重组单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区,重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO:1所示,轻链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO:2所示。
Description
技术领域
本发明涉及重组抗体,尤其涉及抗禽流感病毒的重组抗体,属于生物制药领 域。
背景技术
在2017年1月至2018年上半年期间,国家禽流感参考实验室对国内重 点省市的家禽养殖场、屠宰场和活禽市场进行了禽流感的主动监测和临床样品收 集。先后对养殖场、屠宰场和活禽市场中的家禽群体或市场摊位采集咽喉和泄殖 腔拭子样品、集环境样品和野鸟样品。通过对H5亚型禽流感病毒进行了HA基 因序列分析,发现这些禽流感病毒HA主要分属于2.3.2.1和2.3.4.4这2个 大的分支。其中,H5N1亚型2.3.2.1分支病毒 A/Chicken/Liaoning/SD007/2017(简写为CK/LN/SD007/17)位于HA进化分支 中部,其血清与监测到的H5亚型2.3.2.1分支病毒均具有良好的HI抗体反 应性,是具有良好代表性的毒株,可以作为该分支流行株的代表。
为了检测新出现的2.3.2.1分支H5亚型禽流感病毒,需要有相对应的特异 性抗体。同时疫苗免疫后,利用血凝抑制试验、竞争ELISA等方法检测抗体水平 时候,也需要用到特异性抗体标定抗原或者竞争与抗原反应的抗体。目前用于检 测的抗体是通过免疫实验动物获得的多克隆抗体,采用这种方法制备抗体需要使 用大量的SPF鸡,不同批次SPF鸡制备的抗体还会因为采血、血清分离、收集等 繁琐的操作过程出现批间误差。
为了改进抗2.3.2.1分支H5亚型禽流感病毒抗体的制备技术,本发明提供 一种可以应用于2.3.2.1分支H5禽流感的诊断以及应用于抗体水平测定的重组 单抗。
发明内容
发明人实验室以CK/LN/SD007/17(H5N1)为HA基因和NA基因为两个表 面基因供体,并且通过定点突变和删除了HA基因裂解位点决定其高致病力所必 须的连续碱性氨基酸,以流感病毒A/PR/8/34株(H1N1)为6个内部基因供体, 利用反向遗传操作技术,人工构建出的用于H5亚型灭活疫苗种毒,命名为 Re-12株(商品名“禽流感病毒RE-12血凝抑制抗原”)。通过一系列的生物学特 性研究和免疫学分析,该毒株作为灭活疫苗的种毒株应用于生产实践中,取得了 非常好的免疫预防效果。
本发明在H5亚型禽流感病毒的RE-12株的基础上,获得了抗禽流感病毒H5 亚型RE-12株HA蛋白的重组表达的抗体,解决抗体制备离不开实验动物、抗体 质量不稳定等技术瓶颈问题,同时还可以永久保留单克隆抗体序列信息,防止杂 交瘤细胞不稳定丢失单抗反应性能的问题。
因此,本发明首先提供一种重组单克隆抗体(重组单抗),该重组单抗可以 用于H5亚型禽流感病毒的诊断,应用于竞争ELISA等方法对抗体水平的检测, 以及对特异性抗体标定抗原或者竞争与抗原反应的抗体的检测。所述H5亚型禽 流感病毒进一步包括根据HA基因序列进行分型的各种H5亚型禽流感病毒,更 进一步包括2.3.2.1和2.3.4.4的H5亚型禽流感病毒分支。
进一步,本发明的重组单抗是通过能分泌特定抗体的B细胞和瘤细胞融合后 得到的杂交瘤细胞产生的抗H5亚型禽流感病毒单克隆抗体,进一步所述单克隆 抗体应用测序技术测得包括5'和3'端完整序列的重链与轻链序列,将所得到的 重链与轻链全序列克隆到表达载体上,转染细胞后获得抗H5亚型禽流感病毒重 组表达的重组单体。
进一步,本发明的杂交瘤细胞产生的是抗禽流感病毒H5亚型RE-12株HA 蛋白单克隆抗体。
进一步,本发明的重组单抗是抗禽流感病毒H5亚型RE-12株HA蛋白的重组 表达的抗体。
优选表达载体是真核表达载体,更优选是载体pcDNA 3.1。
优选转染细胞是真核细胞,更优选是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovarycell,CHO)。
进一步,本发明的重组单抗包括序列为SEQ ID No:1的重链和序列为SEQ ID No:2所示的轻链。
更进一步,本发明提供一种抗体组合物,该组合物包含重组抗H5亚型禽流 感病毒的单克隆抗体,所述单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区,重链可变 区的氨基酸序列为SEQ IDNO:1所示,轻链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO:2 所示。
其次,本发明提供一株杂交瘤细胞,该杂交瘤细胞通过禽流感病毒纯化蛋白 免疫小鼠后,制备的杂交瘤细胞,用禽流感病毒抗原进行筛选,获得一株命名为 22G3的具有特定免疫性能的杂交瘤细胞(保藏编号:CCTCC NO:C2020145)。
进一步,用于免疫小鼠的禽流感病毒纯化蛋白是H5亚型禽流感病毒纯化蛋 白,优选是禽流感病毒H5亚型RE-12株纯化蛋白。
更进一步,用于筛选杂交瘤细胞的禽流感病毒抗原是H5亚型禽流感病毒, 优选是禽流感病毒H5亚型RE-12株。
更进一步,本发明的杂交瘤22G3细胞含有序列为SEQ ID No:1的重链和序 列为SEQ ID No:2所示的轻链。22G3单抗重链可变区种系为IGHV6,包括三个互 补决定区(CDR)(如SEQ IDNO:3、SEQ IDNO:4、SEQ IDNO:5所示)所示, 22G3单抗轻链可变区种系为IGKV8,包括三个CDR(如SEQ IDNO:6、SEQ IDNO: 7、SEQ IDNO:8所示)所示,
更进一步,本发明继续提供22G3杂交瘤细胞的制备方法,所述方法包括用 H5亚型禽流感病毒的Re-12株纯化蛋白免疫小鼠,取免疫效价最高的的小鼠的 脾细胞和SP2/0细胞细胞混合培养,获得融合的杂交瘤细胞,利用HI试验方法 筛选阳性杂交瘤细胞,用RE-12抗原进行筛选,获得有血凝抑制活性且不与其它 亚型以及H5亚型其它分支病毒反应的单抗共35株,其中效价最高的一株命名为 22G3,属于IgG亚型。
更进一步,本发明继续提供上述重组单抗的制备方法,其包括如下步骤,将 22G3杂交瘤细胞的重链与轻链全长基因通过双酶切,与真核表达载体pcDNA3.1 连接,构建表达质粒,重链与轻链同时通过瞬时共转染CHO细胞,检测重组抗体 表达情况,有荧光产生则表明抗体已成功表达,所表达的重组单抗命名为r22G3。
再次,本发明还提供所述的抗H5亚型禽流感病毒的重组抗体在诊断H5亚型 禽流感病毒疾病中的应用,H5亚型禽流感病毒进一步包括根据HA基因序列进 行分型的各种H5亚型禽流感病毒,更进一步包括2.3.2.1和2.3.4.4的H5亚 型禽流感病毒分支,更进一步优选抗禽流感病毒H5亚型RE-12株HA蛋白的重组 抗体。
本发明继续提供H5亚型禽流感病毒的重组抗体可用于对H5亚型RE-12分支 AIV的抗原抗体监测及免疫保护的评价。
本发明提出的抗禽流感病毒H5亚型RE-12株HA蛋白的重组抗体为进一步建 立高效检测禽流感的方法提供了依据,同时也为研究HA蛋白的结构和功能奠定 了基础。以此重组抗体为基础建立的H5亚型AIV抗体检测方法可用于对H5亚型 RE-12分支AIV的抗原抗体监测及免疫保护的评价。
本发明的22G3杂交瘤细胞已于2020年08月17日向CCTCC-中国典型培养 物保藏中心提供了生物保藏,保藏物名称:杂交瘤细胞株22G3,保藏号:CCTCC NO:C2020145。
附图说明
图1:22G3重链可变区抗体重排结果
图2:22G3轻链可变区抗体重排结果
图3:22G3表达载体转染CHO细胞后IFA验证抗体表达情况
图4:22G3表达载体转染CHO细胞后Western Blot结果:
(注:M:Marker;1:22G3腹水纯化的抗体原倍煮样;2:22G3腹水纯化的抗体原倍 未煮样;3:10倍稀释后腹水纯化的抗体煮样;4:22G3腹水纯化的抗体原倍未煮样;5: r22G3体外重组表达的细胞上清煮样。)
图5:竞争ELISA分析不同样本对r22G3重组抗体的抑制率
具体实施方式
通过以下实施例,对本发明内容做详细示例性说明。
实施例1:分泌抗禽流感病毒H5亚型RE-12株HA蛋白单抗的杂交瘤细胞的制备
首次免疫用100μg/每只的H5亚型RE-12株全病毒纯化抗原与等量的弗氏完 全佐剂乳化免疫6-8周龄BALB/C SPF小鼠,首次免疫后分别间隔两周,用100μg/ 每只的抗原剂量与等量的弗氏不完全佐剂乳化,继续三次免疫。最后一次免疫两 周后采血测定效价,取效价高的小鼠断颈处死。
把小鼠的四肢固定,在腹部皮肤剪开一小口,暴露腹膜。剪开腹膜,暴露腹 腔,找到脾脏。摘除脾脏上粘连的脂肪组织,将脾脏的两端各剪开一小口后置于 研磨器。加入3mL1640基础培养基于研磨器,研磨至脾细胞全部变至白色后取 出研磨棒。再加入10mL 1640基础培养基,静置2min,将上层细胞悬液小心 的吸取10mL至50mL离心管,继续加入10mL1640基础培养基。此操作重复2 次,最后将剩余不含组织的细胞悬液吸取;1000rpm、室温离心10min,用10mL 基础1640培养基,于5%CO2、37℃培养箱放置。
将SP2/0细胞从瓶壁上轻轻吹下,通过计数的方式取2×107个细胞。将计 好数的SP2/0细胞加至10mL免疫脾细胞中并混匀,以1000rpm、室温离心8min; 弃上清,再利用灭菌的滤纸吸干,轻轻敲击管底;将1640基础培养基和50%PEG 于37℃水浴锅中预热,再将细胞混合物的离心管于39℃水浴锅中融合。在1min 内慢慢滴入50%PEG 0.7mL,边加边搅拌;继续搅拌30s,静置30s;慢慢滴入1640 基础液共10mL,用量安排依次为:第1min滴入1mL、第2min滴入lmL、第3 和4min滴入3mL、第5分钟滴入剩余的5mL,整个滴加过程均需缓慢,并不断 轻轻地搅拌;整个滴加溶液过程不可超过10min。最后加入终止液;1000rpm、 室温离心5min,弃上清;HAT完全培养基(含饲养层细胞)与融合后的细胞混 合,滴加至96孔细胞板中,250ul/孔,于5%CO2、37℃培养箱培养。
融合后第4天用HT完全培养基半换液。待细胞集落大多长至培养孔1/4时, 用HT完全培养基换液,2天后可抗体检测。利用HI试验方法筛选阳性杂交瘤细 胞。将筛选的阳性孔细胞进行至少三轮亚克隆并检测,直至所有检测孔为阳性或 者确定为单个细胞株。
使用上述筛选出的21株单抗制备腹水,并对纯化的腹水通过Protein G柱子纯化,用纯 化的抗体,以4μg/ml包被ELISA板过夜,纯化抗体1μg/ml,鸡阳性血清1:50稀释,抗鼠二抗1:20000稀释,结果表明22G3单抗的竞争抑制率最高,选择该株单抗进行了后续的测序和重组表达工作。
实施例2:抗禽流感病毒H5亚型RE-12株HA蛋白单抗的测序
用试剂盒提取实施例1制备的杂交瘤细胞22G3株总RNA,按照如下组成进 行反转录。反应条件为37℃15min,42℃45min,95℃5min。
反转录后,进行PCR扩增,反应体系如下:
反应条件为94℃10min;94℃30s,52℃1min,72℃2min,30次循环; 72℃10min,4℃∞。
扩增出部分片段后,用5'Race,3'Race方法扩增获得重链与轻链全长完整 的片段,测序,得到全部序列(见图1和图2)。(将该序列在 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/网页上分析可得22G3(图1和图2) 重链与轻链抗体可变区重排情况,22G3单抗重链可变区种系为IGHV6,包括三个 互补决定区(CDR)(如SEQ IDNO:3、SEQ IDNO:4、SEQIDNO:5所示)所 示,22G3单抗轻链可变区种系为IGKV8,包括三个CDR(如SEQ IDNO:6、SEQIDNO: 7、SEQ IDNO:8所示)所示。
实施例3:重组抗体r22G3的体外表达
按照如下组分扩增重链与轻链全长,
22G3重链上游引物:ACA AAC ACA GAA TTC GAA CAC TCA CC,22G3重链下 游引物:GCT CCA AGG ACA CTC GAG TCA T。22G3轻链上游引物:GAC AGG CAG GGG AAT TCA G,22G3轻链下游引物:TGG TGG CGT CTC GAG ACC TTT GTC T。 反应条件为98℃10s,52℃5s,72℃1min,30次循环;72℃10min,4℃∞。
扩增出来的片段进行双酶切,用T4连接酶连接到pcDNA3.1载体、转化DH5α 感受态细胞、提取质粒,转染CHO细胞。抗体重链与轻链同时进行共转染,同时 设立阴性对照,37℃5%CO2培养箱内培养6h后,换成10%FBS的DMEM培养 基,继续培养72h,收集细胞用4%甲醛固定,5%脱脂乳封闭,1%Triton X-100 透化,FITC标记的抗鼠IgG抗体孵育,在荧光显微镜下观察有荧光产生,说明 抗体已成功表达,结果见图3;上清进行Western Blot分析,结果观察到目的 条带,说明抗体已成功表达,结果见图4。
实施例4:重组抗体r22G3的竞争ELISA实验
1、收集转染的CHO细胞,超声破碎,利用GE Healthcare的HiTrapTM Protein A HP过柱纯化。采用过碘酸钠法将纯化的重组抗体标记辣根过氧化物酶。
2、包被:用5μg/ml纯化的RE-12全病毒抗原包被ELISA板,100μl/孔, 加入96孔酶标板中,4℃过夜包被。
3、洗板:倒掉酶标板中液体,用PBST洗涤3次,每次5min,在摇床上震 荡洗涤。最后一次洗涤时,拍干酶标板底部的液体。
4、封闭:用5%脱脂乳,200μl/孔,加入酶标板中,37℃封闭2h。
5、洗板:倒掉酶标板中液体,用PBST洗涤3次,每次5min,在摇床上震 荡洗涤。最后一次洗涤时,拍干酶标板底部的液体。
6、竞争反应:将酶标重组抗体与待检血清等体积预混,100μl/孔,加入封 闭后的酶标板中,37℃孵育1h。以阴性血清作为空白对照。
7、洗板:倒掉酶标板中液体,用PBST洗涤3次,每次5min,在摇床上震 荡洗涤。最后一次洗涤时,拍干酶标板底部的液体。
8、显色:使用TMB显色液,等体积预混A液、B液,100μl/孔,室温避光 10min。
9、终止:使用0.25%HF,50μl/孔,终止显色。
10、读数:在655nm波长下测定酶标板各孔OD值。根据公式:PI=(1-OD655nm 被检血清/OD655nm阴性血清)×100%计算抑制率,(结果见图5)
该重组抗体r22G3与2.3.2.1分支H5亚型流感病毒有血凝抑制反应与其他 亚型以及2.3.4.4分支H5亚型流感病毒不反应,见表1。
表1用HI试验分析重组抗体r22G3的特异性
H1 | H2 | H3 | H4 | H6 | H7 | H8 | H9 | H10 | H11 | H12 | H13 | H14 | H15 | H5-2.3.4.4 | H5-2.3.2.1 | |
HI | No | No | No | No | No | No | No | No | No | No | No | No | No | No | No | Yes |
将禽流感RE-12株病毒纯化蛋白包被ELISA,用辣根过氧化酶标记重组单抗 r22G3与SPF血清、RE-12、H5-2.3.4.4、H7、H9、NDV、IBV阳性血清,结果发 现RE-12阳性血清能特异性抑制r22G3与包被抗原的结合,通过待检样品的对拉 跟过氧化酶标记r22G3重组抗体的抑制率可以判断被检样品是否含有RE-12类血 清抗体。
<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)
<120>抗H5亚型禽流感病毒的重组抗体及其制备方法和应用
<160>8
<210>1
<211>1612
<212>PRT
<213>H5亚型禽流感病毒RE-12株
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<213>H5亚型禽流感病毒RE-12株
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CAGCAATATTATAGCTATCCGCTCACG
序 列表
Claims (10)
1.一种重组抗H5亚型禽流感病毒的单克隆抗体,其包含重链可变区和轻链可变区,重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO:1所示,轻链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO:2所示。
2.如权利要求1所述的重组抗H5亚型禽流感病毒的单克隆抗体,其中所述H5亚型禽流感病毒是指禽流感病毒H5亚型RE-12株。
3.如权利要求1或2所述的重组抗H5亚型禽流感病毒的单克隆抗体,其中所述H5亚型禽流感病毒是指禽流感病毒H5亚型RE-12株的HA蛋白。
4.一种抗体组合物,其含有重组抗H5亚型禽流感病毒的单克隆抗体,所述单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区,重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO:1所示,轻链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO:2所示。
5.如权利要求4所述的抗体组合物,其中所述H5亚型禽流感病毒是指禽流感病毒H5亚型RE-12株。
6.如权利要求4或5所述的抗体组合物,其中所述H5亚型禽流感病毒是指禽流感病毒H5亚型RE-12株的HA蛋白。
7.一株杂交瘤细胞,其保藏号为:CCTCC NO:C2020145。
8.如权利要求7所述的杂交瘤细胞,其包含氨基酸序列为SEQ IDNO:1所示的重链可变区,和氨基酸序列为SEQ IDNO:2所示的轻链可变区。
9.如权利要求1-3任一项重组抗H5亚型禽流感病毒的单克隆抗体或权利要求4-6任一项抗体组合物在制备检测禽流感病毒的试剂中的用途。
10.如权利要求1-3任一项重组抗H5亚型禽流感病毒的单克隆抗体或权利要求4-6任一项抗体组合物在制备针对H5亚型RE-12分支AIV的抗原抗体监测及免疫保护评价制剂中的用途。
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