JP5906447B2 - 上皮性卵巣癌鑑別マーカー - Google Patents
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(11)前記レクチンがAAL又はWFAである、(10)に記載の方法。
本発明の第1の実施形態は、前記表1に記載の上皮性卵巣癌鑑別マーカー用糖タンパク質及びその糖タンパク質断片である。
本実施形態の「上皮性卵巣癌鑑別マーカー用糖タンパク質」とは、上記表1においてタンパク質番号#1〜262で示される糖タンパク質であって、それぞれのアミノ酸配列において、少なくとも表1中の「糖鎖付加位置」で示される位置(開始アミノ酸残基(開始メチオニン)の位置を1とする)のアスパラギン残基に上皮性卵巣癌特有の糖鎖が付加された糖タンパク質である。例えば、表1のタンパク質#1の場合であれば、そのアミノ酸配列上の少なくとも212位のアスパラギン残基に糖鎖が付加されている6型コラーゲンα1タンパク質(collagen type VI alpha 1; 以下「COL6α1」とする)が該当する。また、表1において、一つのタンパク質に対して糖鎖付加位置が複数箇所記載されている場合であれば、それらの中の少なくとも一つが糖鎖付加されていればよい。例えば、タンパク質#2のバイグリカン(biglycan)のように、270位と311位の2箇所のアスパラギン残基が記載されている場合や、タンパク質#15の補体成分4(C4)結合タンパク質α鎖(complement component 4 binding protein alpha chain)のように、506位と528位の2箇所のアスパラギン残基が記載されている場合には、それぞれ、少なくとも一方のアスパラギン残基が糖鎖付加されていれば本発明の上皮性卵巣癌鑑別マーカー用糖タンパク質として足りる。本明細書では、以下、糖鎖が付加されたタンパク質を「糖タンパク質」として表し、糖鎖以外のベースとなるタンパク質部分を「コアタンパク質」として表す。
本実施形態の「上皮性卵巣癌鑑別マーカー用糖タンパク質断片」とは、前記上皮性卵巣癌鑑別マーカー用糖タンパク質の一部からなるオリゴペプチド又はポリペプチドの断片であって、表1に示す糖付加位置のアスパラギン残基をそのアミノ酸配列中に少なくとも一つ含み、かつそのアスパラギン残基に前記「1−1.上皮性卵巣癌鑑別マーカー用糖タンパク質」で説明した上皮性卵巣癌特有の糖鎖が付加されていることを特徴とする。
本発明の第2の実施形態は、上皮性卵巣癌罹患判定方法である。
本実施形態の方法は、検出工程と判定工程を含む。以下、それぞれの工程について具体的に説明をする。
「検出工程」とは、被験者より採取された試料から、一以上の前記実施形態1に記載の上皮性卵巣癌鑑別マーカー用糖タンパク質及び/又は一以上のその糖タンパク質断片、すなわち上皮性卵巣癌鑑別マーカーを検出する工程である。本工程は、必要に応じて、さらに糖タンパク質富化ステップとタンパク質検出ステップを含む。
「判定工程」とは、検出工程において被験者より採取された試料から上皮性卵巣癌鑑別マーカーが検出された場合には、その被験者が上皮性卵巣癌に罹患していると判定する工程である。
1.培養上清を用いたレクチンマイクロアレイによるプローブレクチンの選択
(方法)
(1)上皮性卵巣癌、胃癌、及び大腸癌細胞株培養上清の調製
上皮性卵巣癌細胞株5種(RMG-I、RMG-II、RTSG、RMG-V、RMUG-S)を90% HamF12、10% FBS(PS+)の培地を用いて、また、非上皮性卵巣癌細胞株として、胃癌細胞株1種(KATOIII)及び大腸癌細胞株2種(Colo201、Colo205)を90% RPMI-1640、10% FBS (PS+)の培地を用いて、それぞれ培養した。ここで、RMG-I、RMG-V、RMUG-S、RMG-II、及びRTSGについては、直径14cmディッシュにて80〜90%コンフルエントになるまで培養し、前記FBS含有培地を吸引除去後に無添加培地(FBS-、PS-)10mL/ディッシュで7回洗浄した後、同培地30mLを添加して48時間培養した。また、KATOIII、Colo201、及びColo205については、直径14cmディッシュあたり1×107細胞に調製し、上記無添加培地10mLを加えて懸濁と遠心(1000rpm、5分、室温)による上清除去での洗浄を7回行った後、14cmディッシュに播種し、無添加培地30mLを添加して48時間培養した。培養後、遠心(1000rmp、5分、室温)により上清を回収し、回収した上清を再度遠心(3000rpm、5分、室温)して上清を回収し、-80℃で凍結保存した。保存試料は、使用前に融解して0.46μmフィルターを用いてろ過した後、以下の解析に用いた。
上述調製培養上清を2-D Clean-Up kit(GE社)を用いて濃縮脱塩処理し、得られた沈殿物を20μLのPBSで再溶解した。各培養上清のタンパク質濃度をMicro BCA protein assay kit(Pierce社)を用いて測定後、PBSで10倍希釈して100ng総タンパク質量分を採取して、PBSTx(1% Triton X-100含有PBS)で10μLに調製した後、20ngの蛍光ラベル化試薬(Cy3-SE、GE社)を加えて1時間室温下で反応させた。反応後に90μLのグリシン含有緩衝液を加えて、さらに2時間室温下で反応させ、余剰ラベル化試薬の不活化を行ったものを蛍光標識糖タンパク質溶液としてレクチンマイクロアレイに供した。レクチンマイクアロアレイは、43種の異なるレクチンが3スポットずつ固定化されているものを使用した。獲得される結合シグナルの比較解析を最適なものとすべく、試料毎に4点の希釈系列を調製して解析した。レクチンへの結合反応は、20℃で12時間行った。反応後、アレイ上の試料溶液を除去し、専用の緩衝液で3回洗浄した後、GPバイオサイエンス社製レクチンマイクロアレイ用スキャナー(GlycoStation TM Reader 1200)を用いてシグナル強度を測定した。バックグラウンド値を引いた真値算出後、各レクチン3スポット間の平均値を算出し、全レクチンで最大のシグナル強度を基準値と定めて、相対値を求め、以下の統計処理を行った。算出した相対値を常用定数に変換した後、クラスター分析法及び主成分分析法を用いたシグナルパターン解析により、上皮性卵巣癌と非上皮性卵巣癌(胃癌及び大腸癌)の2群に分かれることを確認した。次に、t検定によって、これら二群間で有意差が確認できるWFAレクチンを抽出した。同時に、レクチンマイクロアレイ解析に供した全ての試料で高いシグナルが検出されたAALレクチンを抽出した。これらWFAレクチン及びAALレクチンを、以後使用するプローブとして選定した。
各癌細胞株由来の糖タンパク質と上記工程によって抽出された2種類のレクチンの結合シグナル強度を図1に示す。図1AはWFAレクチンを、図1BはAALレクチンを、それぞれ示す。この図で示すように、WFAレクチンは、上皮性卵巣癌細胞株で高いシグナルを示す一方、非上皮性卵巣癌細胞株である大腸癌細胞株や胃癌細胞株でのシグナルは低かった。また、AALレクチンは、上皮性卵巣癌細胞株及び非上皮性卵巣癌細胞株で高いシグナルを示す一方、胃癌細胞株(KATOIII)でのシグナルは低かった。なお、WFAレクチン及びAALレクチンは、上皮性卵巣癌細胞株の一つであるRMUG-Sに対してはシグナルが低かったが、これは、本実験がプローブレクチンの選択として糖タンパク質を全体で解析した結果によるものであり、実施例のような個々の糖タンパク質のレクチン結合性に関する挙動を示すものではない。以上のように、WFAレクチンとAALレクチンは、上皮性卵巣癌細胞株が分泌する糖タンパク質が有する糖鎖に結合するプローブレクチンとなり得ることが明らかとなった。
(方法)
(1)ペプチド試料の調製
上皮性卵巣癌細胞株の培養上清、及び腹腔洗浄液から試料タンパク質を調製した。上皮性卵巣癌細胞株の培養上清は、上記1.(1)に記載の方法に準じて調製した。腹腔洗浄液は、愛知がんセンター中央病院にて、手術時に採取された上皮性卵巣癌患者腹腔洗浄液7例(56〜77y)(明細胞癌患者3例、stage IIIC〜IV;類内膜腺癌1例、stage IV;漿液性腺癌3例、IIIC〜IV)を用いた。3.6〜7.6mg総タンパク質分の培養上清(1260〜3300mL)及び8.2〜15.4mg総タンパク質分の腹腔洗浄液(0.3〜300mL)に、終濃度10%となるようにトリクロロ酢酸(TCA、100%飽和水溶液)を加え、氷上で10〜60分間冷却してタンパク質を沈殿させた。4℃下で高速遠心分離により沈殿物を回収した後、氷冷アセトンに懸濁し、2回の洗浄によってTCAを除去した。得られた沈殿物に、可溶化緩衝液(0.5Mトリス-塩酸緩衝液(pH8〜8.5)、7Mグアニジン塩酸、10mM EDTAを含む)を、タンパク質濃度が5〜10mg/mLとなるように加えて溶解して試料タンパク質とした。別法として、それぞれ培養上清及び腹腔洗浄液を4℃下で分子量1万カットの限外濾過膜を用いて濃縮し、これに可溶化緩衝液を加えて再度濾過したものを試料タンパク質とした。
上記試料ペプチドを、プローブレクチン(AALレクチン及び/又はWFAレクチン)を固定化したカラムに供して洗浄後、レクチンの特異性に応じた方法、すなわち、AALレクチンについては、5mMフコースを含有する緩衝液を、WFAレクチンについては、10mM GalNAcを含む緩衝液を用いて、糖ペプチドを溶出した。得られた糖ペプチド溶液に等容量のエタノール及び4倍容量の1-ブタノールを加え、水:エタノール:1-ブタノール(1:1:4(v/v))で予め平衡化したセファロースカラムに供した。カラムを同平衡化溶媒で洗浄後、50%エタノール(v/v)を用いて糖ペプチドを溶出した。糖ペプチド画分を、2μLのグリセロールの入ったマイクロチューブに少量ずつ移し、減圧遠心による水の除去を繰り返して糖ペプチド画分を濃縮した。得られた精製糖ペプチドのグリセロール溶液を糖ペプチド試料とした。
上記糖ペプチド試料に必要量の緩衝液を加え、再度減圧遠心濃縮した後、安定同位体酸素-18(18O)で標識した水(H2 18O)を加えて溶解した(グリセロール濃度は10%以下とする)。これに標識水で調製したペプチド-N-グリカナーゼ(グリコペプチダーゼF、PNGase)を加えて、37℃で終夜反応させた。この反応により、糖鎖結合部位のアスパラギンがアスパラギン酸となり、その際の水中同位体酸素(18O)が糖ペプチドに取り込まれることで糖ペプチドが標識される。
上記IGOT法により標識された糖ペプチドを含む反応液を0.1%ギ酸で希釈し、LC/MSショットガン分析した。高分離能、高再現性、高感度に検出するため、ダイレクトナノフローポンプを基礎とするナノLCシステムを利用した。インジェクトした糖ペプチド試料は、脱塩を目的としたトラップカラム(逆相C18シリカゲル系の担体)上に一旦捕集し、洗浄後、同じ樹脂を詰めたスプレーチップの形状をしたフリットレス微小カラム(内径150μm × 50mL)を用い、アセトニトリルの濃度グラジェント法により分離した。溶出液は、エレクトロスプレーインターフェースを介してイオン化し、直接質量分析機に導入した。質量分析はデータ依存モードで最大2つのイオンを選択しながら、衝突誘起解離(CID)によるタンデム質量分析を行った。
得られた数千のMS/MSスペクトルについて、個々にスムージング、中心化処理を行ってピークリストを作成した。このデータに基づいてタンパク質アミノ酸配列データベースを用いてMS/MSイオンサーチ法により検出糖ペプチドを同定した。検索エンジンにはマトリックスサイエンス社のMascotを用いた。検索条件のパラメータとして、使用した断片化法(トリプシン消化)、ミスクリーベージ許容数:2、固定する修飾:システインのカルバミドメチル化、変動的な修飾:N末端アミノ基の脱アミノ化(末端グルタミン)、酸化(メチオニン)、18Oを取り込んだ脱アミド化(アスパラギン:糖鎖付加部位)、MSスペクトルの許容誤差:500ppm、MS/MSスペクトルの許容誤差:0.5Daを用いた。
上述条件での検索から得られた糖ペプチドに対して、下記(i)〜(iv)の同定確認処理を行い、全ての条件を満たす糖ペプチドを選択した。
(i)同定の確からしさのスコア(偶然の一致の確率:Expect値)が0.05以下であること。
(ii)同定に寄与したフラグメントイオンの数が4つ以上であること。
(iii)誤差(ppm)が系統的誤差より大きくずれていないこと(質量誤差が0.5Da以下であること)。
(iv)同定されたペプチドにコンセンサス配列があり、その数以下のAsn修飾(Aspへの変換、及び18Oの取り込み)があること。
選択された糖ペプチドを前記表1で「ペプチド配列」として配列番号1〜388で示す。これらのペプチドのアミノ酸配列に基づき、アミノ酸配列データベースNCBI-Refseqより対応する上皮性卵巣癌鑑別マーカー用糖タンパク質におけるコアタンパク質の全アミノ酸配列を同定した。その結果、262種の上皮性卵巣癌鑑別マーカー用糖タンパク質が同定された。前記表1に上皮性卵巣癌鑑別マーカー用糖タンパク質のコアタンパク質名を示す。
実施例1で選択、同定された上皮性卵巣癌鑑別マーカーによる上皮性卵巣癌の検出を検証した。
(方法)
(1)プローブレクチンを用いた腹腔洗浄液の分画
明細胞腫瘍、粘液性腫瘍、漿液性腫瘍及び類内膜腫瘍の卵巣癌患者各2名、及び手術時に生理食塩水約100mLを腹腔内に注入し、ダグラス窩より注射器等を用いて腹腔洗浄液を回収した後、qPCR法で腹腔内進展が確認された胃癌患者各2名の腹腔洗浄液を用いた。各腹腔洗浄液中に含まれるタンパク質の濃度をBCA法により測定し、各試料中の総タンパク質量を等量に調製した後、以下のAALレクチン又はWFAレクチン分画に供した。
前記プールした各試料をAmicon Ultra-154 centrifugal filter units (10kDaカットオフ、ミリポア社)を用いて濃縮した後、実施例1で得られた上皮性卵巣癌鑑別マーカー用糖タンパク質のコアタンパク質と特異的に結合する抗体を用いてイムノブロッティングを行った。
上記各癌患者における腹腔洗浄液中の各上皮性卵巣癌鑑別マーカー用糖タンパク質の検出結果を図2〜6に示す。
Claims (12)
- 前記糖鎖がフコース修飾を伴う糖鎖及び/又は末端N−アセチルガラクトサミンを含む糖鎖である、請求項1に記載の上皮性卵巣癌鑑別マーカー。
- 前記糖鎖がAALレクチン及び/又はWFAレクチンと結合する、請求項1又は2に記載の上皮性卵巣癌鑑別マーカー。
- 上皮性卵巣癌が明細胞腫瘍、粘液性腫瘍、漿液性腫瘍及び類内膜腫瘍の少なくとも一つである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の上皮性卵巣癌鑑別マーカー。
- 被験者より採取された試料から請求項1〜5のいずれか一項に記載の上皮性卵巣癌鑑別マーカーを検出する工程、及び
前記上皮性卵巣癌鑑別マーカーが検出された場合に、その被験者が上皮性卵巣癌に罹患していると判定する工程
を含む上皮性卵巣癌の罹患の診断を補助する方法。 - 前記検出工程が糖タンパク質富化ステップとタンパク質検出ステップを含む、請求項6に記載の方法。
- 前記上皮性卵巣癌鑑別マーカーを、前記糖鎖に結合する一以上の糖鎖プローブを用いて検出する、請求項6又は7に記載の方法。
- 前記糖鎖プローブがレクチン、抗体又はファージ抗体である、請求項8に記載の方法。
- 前記レクチンがAAL又はWFAである、請求項9に記載の方法。
- 前記試料が体液、細胞又は腹腔洗浄液である、請求項6〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 上皮性卵巣癌が明細胞腫瘍、粘液性腫瘍、漿液性腫瘍及び類内膜腫瘍の少なくとも一つである、請求項6〜11のいずれか一項に記載の方法。
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