ES2902403T3 - Acidos pentanoicos sustituidos con pirrolo-[2-3,B]pirimidin-piridinas para el tratamiento de infecciones víricas de la gripe - Google Patents

Abstract

Un compuesto seleccionado de **(Ver fórmula)**

Description

d e s c r ip c ió n

Ácidos pentanoicos sustituidos con pirrolo-[2-3,B]pirimidin-piridinas para el tratamiento de infecciones víricas de la gripe

La gripe es un problema de salud pública grave con una alta incidencia en la población humana, que produce una morbilidad y mortalidad a gran escala permanentes. Es una enfermedad transmitida por el aire muy contagiosa que provoca enfermedad febril aguda. Los síntomas sistémicos varían en gravedad desde fatiga leve a insuficiencia respiratoria y muerte. De acuerdo con la OMS el promedio de carga global de la epidemia anual puede ser del orden de 1000 millones de casos, 3-5 millones de casos de enfermedad grave y 300.000-500.000 muertes anualmente. Cada año, los virus de la gripe circulan en los seres humanos, típicamente afectando a un 5-20 % de la población en todos los grupos de edad, con esta cifra elevándose a un 30 % durante la epidemia principal. Las tasas de enfermedad grave y muerte son las más altas entre personas con edades >65 años, niños con edades <2 años y personas de cualquier edad que tengan afecciones médicas que les sitúen en riesgo aumentado de complicaciones por gripe, tal como cardiopatía crónica, enfermedad pulmonar, enfermedad renal, enfermedad hepática, enfermedad hemática o enfermedad metabólica, o sistemas inmunitarios debilitados. Aunque las muertes son infrecuentes entre los niños, las tasas de hospitalización varían de aproximadamente 100 a 500 por cada 100.000 para niños <5 años de edad dependiendo de la presencia o ausencia de afecciones concomitantes. Las tasas de hospitalización entre niños con edades <24 meses son comparables con las tasas presentadas entre personas con edades >65 años.

En los Estados Unidos, la epidemia anual por gripe da lugar a aproximadamente 30 millones de visitas ambulatorias, lo que provoca costes médicos de 10.000 millones de dólares americanos anualmente. Las ganancias perdidas debidas a enfermedad y las pérdidas de vidas representan un coste de más de 15.000 millones de dólares americanos anualmente y la carga económica total en los Estados Unidos de la epidemia anual por gripe asciende a más de 85.000 millones de dólares americanos.

Los patógenos que provocan la gripe son virus de ARN monocatenario, de sentido negativo, que pertenecen a la familia de Orthomyxoviridae. Hay tres tipos de virus de la gripe: A, B y C. Los virus de la gripe A son la forma más común, que puede propagarse en mamíferos y aves. Los subtipos de gripe A se denominan por los tipos de proteínas de superficie hemaglutinina (H) y neuraminidasa (N). Hay 18 diferentes hemaglutininas y 11 neuraminidasas conocidas. Los virus actuales de la gripe estacional encontrados en seres humanos son principalmente los subtipos H1N1 y H3N2. Los virus de gripe B normalmente se encuentran solamente en seres humanos. No se dividen en subtipos, pero pueden desglosarse adicionalmente en diferentes cepas. Los virus de la gripe en circulación son muy variables cada año, y tanto la gripe A como B provoca epidemia estacional en todo el mundo. Los virus de gripe C dan síntomas mucho más leves, que no provocan epidemia.

Estos tres tipos de virus tienen estructuras genómicas similares. El genoma comprende 8 segmentos, que codifican 9-11 proteínas, dependiendo del tipo. La gripe A codifica 11 proteínas, que incluyen las proteínas de superficie (hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA), el complejo polimerasa (PA, PB1 y PB2), nucleoproteína (NP), proteínas de membrana (M1 y M2) y otras proteínas (NS1, NS2, NEP). Entre los tres tipos de virus de la gripe, la gripe A tiene la tasa más alta de mutación. La gripe B evoluciona más lentamente que la A, pero más rápidamente que la C. El genoma segmentado permite un intercambio génico entre diferentes cepas víricas, lo que genera nuevas variantes de virus de la gripe.

El virus de la gripe puede transmitirse entre los seres humanos por contacto directo con individuos infectados o material contaminado por virus. Uno se puede infectar también por inhalación de gotas de virus suspendidas en el aire. Esas gotas se generar por tos, estornudos o al hablar los individuos infectados. La gripe estacional se caracteriza por una repentina aparición de fiebre alta, tos (habitualmente seca), cefalea, dolor muscular y articular, malestar general intenso (sentirse indispuesto), dolor de garganta y rinorrea. La tos puede ser intensa y puede durar dos o más semanas. La mayoría de las personas se recuperan de la fiebre y otros síntomas en una semana sin necesidad de atención médica. Pero la gripe puede provocar enfermedad grave o muerte especialmente en personas de alto riesgo como se menciona anteriormente. El tiempo desde la infección hasta la enfermedad, conocido como periodo de incubación, es de aproximadamente dos días.

La manera más eficaz de prevenir la enfermedad y/o los resultados graves de la enfermedad es la vacunación. Están disponibles vacunas seguras y eficaces y se han usado durante más de 60 años. Entre los adultos sanos, las vacunas de la gripe pueden proporcionar una protección razonable. Sin embargo, la vacunación tiene varias limitaciones. En primer lugar, la vacuna de la gripe puede ser menos eficaz en la prevención de enfermedad entre los ancianos, y puede solamente reducir la gravedad de la enfermedad y la incidencia de las complicaciones y las muertes. Además, la vacunación contra la gripe es más eficaz cuando los virus en circulación tienen buena equivalencia con los virus de la vacuna, y el éxito de la vacunación es en gran medida dependiente de la buena predicción del tipo de virus más prevalente de la temporada. La evolución rápida y continua de las cepas víricas de la gripe a través de variaciones antigénicas menores, acopladas con la naturaleza de vida corta de las respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna a las vacunas actuales de la gripe, significa que es necesaria la vacunación con cepas estacionalmente apropiadas cada año para la prevención.

El tratamiento actual de la gripe usa fármacos antivíricos directos o medicinas que alivian los síntomas inducidos por la gripe. Hay dos clases de fármacos antivíricos contra la gripe disponibles en el mercado: inhibidores de la neuraminidasa e inhibidores del canal M2. Los inhibidores de la neuraminidasa oseltamivir o zanamivir son los agentes antivíricos principales recomendados para la prevención y tratamiento de la gripe. Son eficaces contra virus de la gripe tanto de tipo A como B. Se ha identificado desarrollo de resistencia a estos fármacos antivíricos durante el tratamiento de la gripe estacional y en virus 2009 H1N1 resistentes a oseltamivir esporádicos, pero el impacto en la salud pública ha sido limitado hasta la fecha. Los inhibidores del canal M2, tales como amantadina y rimantadina (amantadanos), son activos contra cepas de gripe A, pero no cepas de gripe B. La resistencia a adamantano contra virus en circulación de gripe A aumentó rápidamente en todo el mundo empezando durante 2003-2004. Por lo tanto, la amantadina y la rimantadina no se recomiendan para tratamiento antivírico o quimioprofilaxis de las cepas de virus de gripe A actualmente en circulación.

En 2009, la cepa H1N1 porcina novedosa provocó una pandemia de gripe inesperada como resultado del reagrupamiento de genes de virus H1N1 de humanos, cerdos y aves. Esta pasada pandemia, junto con la circulación en curso de cepas H5N1 aviares altamente patógenas y la reciente aparición de los virus H7N9, un nuevo reagrupamiento de origen aviar aislado en China, y asociado con enfermedad respiratoria grave con un 40 % de mortalidad, que podía adaptarse potencialmente para transmisión entre seres humanos, resaltó la vulnerabilidad de la población mundial a cepas de gripe novedosas. Aunque la vacunación sigue siendo la estrategia profiláctica principal para controlar la infección por gripe, para superar el periodo antes de que una nueva vacuna esté disponible y para tratar los casos graves de gripe, así como para contrarrestar el problema de resistencia vírica, se requiere una elección más amplia de fármacos antigripales. El desarrollo de nuevos antivíricos contra la gripe, por lo tanto, se ha convertido de nuevo en una alta prioridad y una necesidad médica insatisfecha.

La presente invención se refiere a compuestos ejemplificados a continuación que pueden usarse para el tratamiento de, o contra, infecciones víricas de gripe.

Uno de los compuestos más preferidos de acuerdo con la invención tiene la fórmula estructural (II):

El compuesto más preferido de acuerdo con la invención tiene la siguiente estructura (III):

Parte de la invención también es una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (II) o (III), una forma estereoisomérica, una sal, solvato o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo junto con uno o más excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables.

La composición farmacéutica también puede incluir agentes terapéuticos adicionales como otro agente antivírico o una vacuna contra la gripe, o ambos.

Parte de la invención también es un compuesto de fórmula (II) o (III), una forma estereoisomérica, una sal, solvato o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo o una composición farmacéutica para su uso como medicamento.

Además, la invención se refiere a un compuesto de fórmula (II) o (III), una forma estereoisomérica, una sal, solvato o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo o una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de la gripe.

De modo que parte de la invención es el uso de los compuestos ejemplificados a continuación para inhibir la replicación de uno o más virus de la gripe en una muestra biológica o paciente.

Dicho uso también puede comprender la coadministración de un agente terapéutico adicional, en el que dicho agente terapéutico se selecciona de un agente antivírico o vacuna contra la gripe, o ambos.

Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención incluyen las sales de adición de ácidos y bases de los mismos. Las sales de adición de ácidos adecuadas se forman a partir de ácidos que forman sales atóxicas. Las sales de bases adecuadas se forman a partir de bases que forman sales atóxicas.

Los compuestos de la invención también pueden existir en formas no solvatadas y solvatadas. El término "solvato" se usa en este documento para describir un complejo molecular que comprende el compuesto de la invención y una o más moléculas de disolvente farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, etanol.

El término "polimorfo" se refiere a la capacidad del compuesto de la invención de existir en más de una forma o estructura cristalina.

Los compuestos de la presente invención pueden administrarse como productos cristalinos o amorfos. Pueden obtenerse, por ejemplo, como tapones sólidos, polvos o películas por métodos tales como precipitación, cristalización, liofilización, secado por pulverización o secado evaporativo. Pueden administrarse en solitario o en combinación con uno o más compuestos distintos de la invención o en combinación con uno o más fármacos distintos. En general, se administrarán como una formulación en asociación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. El término "excipiente" se usa en este documento para describir cualquier ingrediente distinto del compuesto o compuestos de la invención. La elección de excipiente depende en gran medida de factores tales como el modo particular de administración, el efecto del excipiente sobre la solubilidad y estabilidad, y la naturaleza de la forma farmacéutica.

Los compuestos de la presente invención o cualquier subgrupo de los mismos pueden formularse en diversas formas farmacéuticas para fines de administración. Como composiciones apropiadas, pueden citarse todas las composiciones empleadas habitualmente para administrar fármacos por vía sistémica. Para preparar las composiciones farmacéuticas de esta invención, se combina una cantidad eficaz del compuesto particular, opcionalmente en forma de sal por adición, ya que el ingrediente activo se combina en una mezcla íntima con un vehículo farmacéuticamente aceptable, que puede adoptar una amplia diversidad de formas dependiendo de la forma de preparación deseada para la administración. Estas composiciones farmacéuticas están de forma deseable en forma farmacéutica unitaria adecuada, por ejemplo, para administración oral, rectal o percutánea. Por ejemplo, en la preparación de las composiciones en forma farmacéutica oral, puede emplearse cualquiera de los medios farmacéuticos habituales tales como, por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes y similares en el caso de preparaciones líquidas orales tales como suspensiones, jarabes, elixires, emulsiones y soluciones; o vehículos sólidos tales como almidones, glúcidos, caolín, diluyentes, lubricantes, aglutinantes, agentes disgregantes y similares en el caso de polvos, píldoras, cápsulas y comprimidos. Debido a su facilidad de administración, los comprimidos y las cápsulas representan las formas unitarias de dosificación oral más ventajosas, en cuyo caso obviamente se emplean vehículos farmacéuticos sólidos. También se incluyen preparaciones en forma sólida que pueden convertirse, poco antes de su uso, en formas líquidas. En las composiciones adecuadas para la administración percutánea, el vehículo comprende opcionalmente un agente potenciador de la penetración y/o un agente humectante adecuado, opcionalmente combinado con aditivos adecuados de cualquier naturaleza en proporciones menores, que son aditivos que no introducen un efecto perjudicial significativo sobre la piel. Dichos aditivos pueden facilitar la administración a la piel y/o pueden ser útiles para preparar las composiciones deseadas. Estas composiciones pueden administrarse de varias maneras, por ejemplo, como un parche transdérmico, como una unción puntual, como un ungüento. Los compuestos de la presente invención también pueden administrarse por inhalación o insuflación por medio de métodos y formulaciones empleados en la técnica para la administración por este medio. Por lo tanto, en general, los compuestos de la presente invención pueden administrarse a los pulmones en forma de una solución, una suspensión o un polvo seco.

Es especialmente ventajoso formular las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente en forma farmacéutica unitaria para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. Forma farmacéutica unitaria, como se usa en este documento, se refiere a unidades físicamente diferenciadas adecuadas como dosificaciones unitarias, conteniendo cada una de las unidades una cantidad predeterminada de ingrediente activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. Ejemplos de dichas formas farmacéuticas unitarias son comprimidos (incluyendo comprimidos ranurados o recubiertos), cápsulas, píldoras, sobres de polvos, obleas, supositorios, soluciones o suspensiones inyectables y similares, y múltiplos segregados de las mismas.

Los expertos en el tratamiento de enfermedades infecciosas podrán determinar la cantidad eficaz a partir de los resultados de ensayo presentados posteriormente en este documento. En general, se contempla que una cantidad diaria eficaz sería de 0,01 mg/kg a 50 mg/kg de peso corporal, más preferiblemente de 0,1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal. Puede ser apropiado administrar la dosis requerida como dos, tres, cuatro o más subdosis a intervalos apropiados a lo largo del día. Dichas subdosis pueden formularse como formas farmacéuticas unitarias, por ejemplo, que contienen de 1 a 1000 mg y, en particular, de 5 a 200 mg de ingrediente activo por forma farmacéutica unitaria.

La dosificación exacta y frecuencia de administración dependen del compuesto particular de la invención usado, la afección particular que se esté tratando, la gravedad de la afección que se esté tratando, la edad, peso y estado físico general del paciente particular, así como otra medicación que el individuo pueda estar tomando, como es bien conocido por los expertos en la materia. Además, es evidente que la cantidad eficaz puede reducirse o aumentarse dependiendo de la respuesta del sujeto tratado y/o dependiendo de la evaluación del médico que prescribe los compuestos de la presente invención. Los intervalos de cantidad eficaz mencionados anteriormente, por lo tanto, son solamente directrices y no se pretende que limiten el alcance o uso de la invención en ninguna medida.

También se pretende que la presente divulgación incluya cualquier isótopo de átomos presentes en los compuestos de la invención. Por ejemplo, los isótopos de hidrógeno incluyen tritio y deuterio y los isótopos de carbono incluyen C-13 y C-14.

Los presentes compuestos usados en la presente invención también pueden existir en su forma isomérica estereoquímicamente, que define todos los posibles compuestos formados de los mismos átomos enlazados por la misma secuencia de enlaces, pero que tienen diferentes estructuras tridimensionales, que no son intercambiables. Salvo que se mencione o indique de otro modo, la denominación química de compuestos abarca la mezcla de todas las posibles formas isoméricas estereoquímicamente, que dichos compuestos podrían poseer.

Dicha mezcla puede contener todos los diastereoisómeros y/o enantiómeros de la estructura molecular básica de dicho compuesto. Se pretende que todas las formas isoméricas estereoquímicamente de los compuestos usados en la presente invención en forma pura o en mezcla entre sí estén incluidas dentro del alcance de la presente invención, incluyendo cualquier mezcla racémica o racemato.

Las formas estereoisoméricas puras de los compuestos e intermedio como se menciona en este documento se definen como isómeros sustancialmente libres de otras formas enantioméricas o diastereoisoméricas de la misma estructura molecular básica de dichos compuestos o intermedios. En particular, la expresión "estereoisoméricamente puro" se refiere a compuestos o intermedios que tienen un exceso estereoisomérico de al menos un 80 % (es decir, un 90 % mínimo de un isómero y un 10 % máximo de los otros posibles isómeros) hasta un exceso estereoisomérico de un 100 % (es decir, un 100 % de un isómero y nada del otro), más en particular, compuestos o intermedios que tienen un exceso estereoisomérico de un 90 % hasta un 100 %, incluso más en particular que tienen un exceso estereoisomérico de un 94 % hasta un 100 % y lo más en particular que tienen un exceso estereoisomérico de un 97 % hasta un 100 %. Las expresiones "enantioméricamente puro" y "diastereoisoméricamente puro" deben entenderse de una manera similar, pero entonces teniendo en cuenta el exceso enantiomérico, respectivamente el exceso diastereoisomérico de la mezcla en cuestión.

Las formas estereoisoméricas puras de compuestos e intermedios usadas en esta invención pueden obtenerse mediante la aplicación de procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los enantiómeros pueden separarse entre sí por cristalización selectiva de sus sales diastereoisoméricas con ácidos o bases ópticamente activos. Ejemplos de los mismos son ácido tartárico, ácido dibenzoiltartárico, ácido ditoluoiltartárico y ácido alcanfosulfónico. Como alternativa, los enantiómeros pueden separarse por técnicas cromatográficas usando fases estacionarias quirales. Dichas formas isoméricas estereoquímicamente puras también pueden derivar de las correspondientes formas isoméricas estereoquímicamente puras de los materiales de partida apropiados, con la condición de que la reacción se produzca de forma estereospecífica. Preferiblemente, si se desea un estereoisómero específico, dicho compuesto se sinterizará por métodos estereoespecíficos de preparación. Estos métodos emplearán ventajosamente materiales de partida enantioméricamente puros.

Preparación de compuestos de acuerdo con la invención,

Preparación de compuesto intermedio A1

Se añadió ácido metanosulfónico (1,3 ml, 20,4 mmol) a una suspensión de Zn activado (17,4 g, 267 mmol) en THF (150 ml) a ta. La mezcla de reacción se agitó a reflujo durante 15 minutos y se añadió una solución de 2-metil-2-(2-piridil)propanonitrilo [CA-81039-18-1] (7,8 g, 55,3 mmol) en THF (50 ml). Después se añadió gota a gota una solución de bromoacetato de etilo (17,8 ml, ^{16 0} mmol) en THF (50 ml) durante 45 min a reflujo. La mezcla de reacción se agitó a reflujo durante 1 h. Se añadió una solución saturada acuosa de NaHCO3 y se lavó con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó por CL preparativa (SiOH irregular, 15-40 gm, GraceResolv, fase móvil) usando gradiente de ciclohexano/EtOAc. Las fracciones puras se recogieron y se evaporaron para dar 12,8 g de intermedio A1 como un líquido incoloro (cuant.).

Preparación de compuesto intermedio A2

Se añadió NaBH3CN (1,9 g; 30,7 mmol) a una solución de intermedio A1 ^{( 6} g; 25,6 mmol) en EtOH (300 ml) y AcOH (28 ml). La mezcla resultante se calentó a 60 °C durante 3 h. Una solución saturada acuosa de NaHCO3 y después la capa acuosa se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron al vacío para dar 3,6 g de intermedio A2 (59 %) como un aceite amarillo.

Preparación de compuesto A3

Una solución del intermedio A2 (1,8 g, 7,62 mmol), 2,4-dicloro-5-fluoro-pirimidina (31,15 g, 6,9 mmol) y diisopropilamina (7,6 ml, 41,55 mmol) se agitó y se calentó a 70 °C durante 17 h. Se añadió agua a la mezcla de reacción y después la capa acuosa se extrajo dos veces con EtOAc. Las capas orgánicas se recogieron, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se evaporaron para obtener el producto en bruto. El material en bruto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (SiOH irregular, 15-40 gm, 80 g GraveREsolv), usando gradiente de heptano/EtOAc. Las fracciones se combinaron y el disolvente se retiró para producir A3, 2,08 g, 65 % de un aceite incoloro.

Preparación de compuesto A5

Una solución de intermedio A4 [CAS-934178-97-9] (273 mg, 0,7 mmol), intermedio A3 (275,9 mg, 0,8 mmol) y K²CO³ (1 ml, 2 M, 2,1 mmol) en DME (3 ml) se purgó con flujo de N² durante 5 min y después se añadió Pd(dppf)Cl² (56 mg, 0,07 mmol). La mezcla resultante se agitó y se calentó a 120 °C usando un microondas de modo único (Biotage initiator60) con una potencia de salida que varía de 0 a 400 W durante 40 min. La mezcla se vertió en agua y DCM, la capa orgánica se separó con una frita hidrófoba y se evaporó hasta sequedad. La purificación se realizó por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (SiOH irregular, 15-35 gm, 40 g, heptano/EtOAc de ^{10 0 / 0} a 80/20). Las fracciones puras se recogieron y se evaporaron en intermedio A5 como un aceite incoloro, 0,270 g, 65 %.

Preparación de compuesto A6

Se añadió KOH (248,4 mg, 4,4 mmol) a una solución de A5 (270 mg, 0,4 mmol) en una mezcla de MeOH/agua ([2:1], 0,75 ml). La solución resultante se agitó y se calentó a 50 °C durante 17 h. La solución se enfrió hasta temperatura ambiente. Se añadió DCM (2 ml), la mezcla se neutralizó con HCI 3 N. Las capas se separaron a través de una frita hidrófoba. La capa orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y se evaporó. La purificación se realizó mediante fase inversa preparativa (fase estacionaria: X-Bridge-C185 gm 30*150 mm, fase móvil: gradiente de un 90 % de NH⁴HCO³ al 0,5 %, 10 % de ACN a un 50 % de NH⁴HCO³ al 0,5 %, 50 % de ACN). Las fracciones puras se recogieron y se evaporaron. El sólido resultante se secó a presión reducida a 40 °C durante 5 h para dar compuesto A6, 0,11 g, 4,6 %. pf °C: 158.

1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 1,30 (s, 3 H) 1,38(s, 3 H) 2,01 (dd, J=15,4 Hz, 2,8 Hz, 1H) 2,38 (m, 2H) 5,65 (m, 1H) 7,23 (dd, J=7,9 Hz, 5,0 Hz, 1 H) 7,44 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 7,73 (td, J=8,9 Hz 1,9 Hz, 1 H) 8,04 (a, d, J=8,2 Hz, 1 H) 8,13 (d, J=4,1 Hz, 1H) 8,16 (s, 1H) 8,76 (d, J=3,8 Hz, 1H) 8,85 (s, 1H) 10,2 (s, 1H)

Preparación de compuesto intermedio B2

En atmósfera de nitrógeno, se añadió TEA (0,87 ml, 6,3 mmol) a una mezcla de B1 [1123787-64-3] (710 mg, 4,2 mmol) y clorhidrato de N-bencilhidroxilamina (0,87 g, 5,4 mmol) en DCM seco (27 ml) y se agitó a ta durante una noche. La mezcla se concentró para dar un residuo que se purificó por CL preparativa (fase estacionaria: Interchim, 30 gm, 24 g, gradiente de fase móvil: heptano/EtOAc de 90/10 a 60/40) para dar 561 mg (46 %) de B2 como un aceite incoloro.

Preparación de compuesto intermedio B3

En una bomba inoxidable, se agitó una solución de B2 (561 mg, 1,9 mmol) y catalizador Pearlman (537 mg; 38 gmol) en EtOH (22 ml) en una atmósfera de H² (5 bar) durante una noche. La mezcla se diluyó con AcOEt y se filtró a través de una capa de Celite®. El disolvente se retiró al vacío para dar B3 (311 mg, aceite incoloro, 87 %).

Preparación de compuesto intermedio B4

Se calentó 2,4-dicloro-5-fluoro-pirimidina (0,138 g; 0,828 mmol), DIPEA (0,71 ml; 4,1 mmol), B3 (0,155 g; 0,828 mmol) en THF (2,1 ml) y EtOH (2,1 ml) a 90 °C durante 18 horas en un tubo precintado. Se añadió EtOAc y se lavó dos veces con salmuera. La capa orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y se evaporó al vacío para dar un aceite incoloro que se purificó por CL preparativa (SiOH regular 30 gm, 24 g Interchim, gradiente de fase móvil: de heptano/EtOAc 80/20 a 50/50) para dar 170 mg de B4 como un sólido blanco (65 %).

Preparación de compuesto intermedio B5

En atmósfera de N² , en un tubo precintado, una mezcla de compuesto X (141 mg; 0,29 mmol, 90 % de pureza), B4 (85 mg; 0,27 mmol) y Cs2CO3 (0,31 g; 0,94 mmol) en 1,4 dioxano (2,3 ml) y agua (0,72 ml) se desgasificó con N² durante 5 min. Se añadió PdCl2(PPh3)2 (19 mg; 27 gmol) y la mezcla de reacción se desgasificó de nuevo con N² durante 2 min. La mezcla de reacción se calentó a 90 °C durante 1 h 30. La mezcla de reacción se enfrió hasta ta. Se añadieron DCM y salmuera a la mezcla de reacción. La capa acuosa se extrajo con DCM. Las capas orgánicas combinadas se lavaron, se secaron sobre MgSO4, se retiraron por filtración y se concentraron a sequedad para producir un residuo que se purificó por CL preparativa (SiOH regular 30 pm, 12 g, Interchim, gradiente de fase móvil: de heptano/EtOAc 85/15 a 60/40) para dar 89 mg de B5 como un sólido blanco (57 %).

Preparación de compuesto B6

Se añadió LiOH monohidrato (128 mg, 3,1 mmol) a una mezcla de B5 (90 mg, 0,15 mmol) en agua (0,29 ml) y THF (0,84 ml). La mezcla se agitó durante 18 h a 60 °C. La solución se neutralizó con HCI 3 N (precaución: mantener preferiblemente a pH básico, lo mejor aproximadamente a 7-8) y el disolvente se evaporó al vacío para dar 250 mg de un residuo que se purificó mediante fase inversa (fase estacionaria: X-Bridge-C18 5 pm 30*150 mm, fase móvil: gradiente de un 90 % de (NH⁴HCO³ ac. al 0,5 %), 10 % de MeCN a un 50 % de (NH⁴HCO³ ac. al 0,5 %), 50 % de MeCN). Las fracciones que contenían compuesto puro se evaporaron y el sólido obtenido se liofilizó en MeCN/H²O para dar B6 (18 mg, sólido blanco, 29 %). Masa encontrada por CL-EM [M+H]+= 406,1. TR (min)= 1,78 (método A) 1H RMN (500 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 1,39 (s, 3H), 2,45-2,55 (m, 1H), 2,58 (dd, J=15,8, 10,4 Hz, 1 H), 4,10 (d, J=5,7 Hz, 1 H), 4,19 (d, J=6,0 Hz, 1 H), 4,51 (d, J=6,0 Hz, 1 H), 4,73 (d, J=5,7 Hz, 1 H), 5,18-5,30 (m, 1H), 7,77 (s a, 1H), 8,18(d J=4,1 Hz, 1 H), 8,19 (s, 1H), 8,28 (d, J=2,2 Hz, 1 H), 8,81 (d, 2,2 Hz, 1 H), 12,35 (s a, 2H)

Preparación de compuesto intermedio C2

Se añadió ácido metanosulfónico (0,675 ml, 10,4 mmol) a una suspensión de Zn activado (8,94 g, 137 mmol) en THF (60 ml) a ta. La mezcla de reacción se agitó a reflujo durante 15 minutos y se añadió una solución de compuesto C1 [J. Org. Chem. 2013, 78, 762-769] (4,00 g, 27,4 mmol) en THF (20 ml). Después se añadió gota a gota una solución de bromoacetato de etilo (9,14 ml, 82,1 mmol) en THF (40 ml) a reflujo. La mezcla de reacción se agitó a reflujo durante 1 h. Se añadió una solución acuosa de NaHCO3 saturado y la mezcla se filtró sobre celite. El filtrado se extrajo con acetato de etilo (2 x 15 ml), se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por CL preparativa (SiOH irregular, 40-63 pm, Fluka, carga líquida (DCM), fase móvil: DCM al 100 %) para dar 3,6 g de intermedio C2 como un líquido amarillo (56 %).

Preparación de compuesto intermedio C3

A una mezcla de intermedio C2 (2,3 g; 5,67 mmol) en EtOH (50 ml) se le añadió NH4OAc (2,19 g; 28,3 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 80 °C durante 18 h. La mezcla se enfrió hasta ta y se añadió AcOH (6,17 ml; 108 mmol) y una solución comercial de NaBH3CN 1 M en THF (85 ml; 85,0 mmol) y la mezcla de reacción se calentó a 60 °C durante 4 h. Se añadió una solución saturada acuosa de NaHCO3 y EtOAc. La capa acuosa se extrajo con EtOAc (dos veces). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se evaporaron al vacío. El residuo se purificó por CL preparativa (SiOH irregular 15-40 pm, 80 g GraceResolv, gradiente de fase móvil: de DCM/MeOH/NH3 ac. 100/0/0 a 90/10/1) para dar 1,63 g de intermedio C3 (cuant.).

Preparación de compuesto intermedio C4

Intermedio C3 (1,80 g; 7,62 mmol), 2,6-dicloro-3 ciano-5 fluoropiridina (1,46 g; 762 mmol), DIPEA (6,65 ml; 38,1 mmol) en THF (50 ml) y EtOH (50 ml) se calentaron a 90 °C durante 18 h.

Se añadió una cantidad adicional de 2,6-dicloro-3 ciano-5 fluoropiridina (0,145 g; 0,762 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a 90 °C durante 4 h. Se añadieron agua y salmuera. La capa acuosa se extrajo con EtOAc (dos veces). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgSÜ4, se filtraron, se evaporaron al vacío y se purificaron por CL preparativa (SiÜH irregular 15-40 pm, 120 g GraceResolv, carga líquida (DCM), gradiente de fase móvil: de heptano/EtÜAc: 90/10 a 60/40) para dar 1,76 g de intermedio C4 (59 %).

Preparación de compuesto C5

En atmósfera de N² , en un tubo precintado, una mezcla de compuesto X [CA-866546-11-4] (1,22 g; 2,83 mmol), intermedio C4 (0,850 g; 2,18 mmol) y Cs2CÜ3 (2,48 g; 7,61 mmol) en dioxano (15 ml) y H²O (6 ml) se desgasificó con N² durante 5 min. Se añadió PdCl2(PPh3)2 (153 mg; 0,217 mmol) y la mezcla de reacción se desgasificó de nuevo con N² durante 2 min. La mezcla de reacción se calentó a 90 °C durante 2 h.

La mezcla de reacción se enfrió hasta ta. Se añadieron EtOAc y salmuera a mezcla de reacción. La capa acuosa se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSÜ4, se retiraron por filtración, se evaporaron al vacío y se purificaron por CL preparativa (SiÜH irregular 15-40 pm, 40 g Graceresolv, carga seca sobre SiÜH, gradiente de fase móvil: de heptano/EtÜAc 90/10 a 50/50) para dar 230 mg de compuesto C5 como un sólido (14 %).

Preparación de compuesto C6

En un tubo precintado, a una solución de compuesto X (300 mg; 0,227 mmol) en THF (2 ml) y H²Ü (0,7 ml) se le añadió LiÜH monohidrato (68 mg; 1,59 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 25 °C durante una noche.

La mezcla de reacción se evaporó y se purificó por CL preparativa (SiÜH irregular 15-40 pm, 40 g GraceResolv, carga seca (sobre SiÜH), gradiente de fase móvil: de DCM/MeÜH 100/0 a 80/20), 80 mg de compuesto impuro. Se añadió DCM al compuesto impuro y el sólido se filtró y se aclaró con DCM, después acetona. El sólido se purificó de nuevo por CL preparativa (SiÜH irregular 15-40 pm, 24 g GraceResolv, carga seca sobre SiÜH, gradiente de fase móvil: de DCM/MeÜH 100/0 a 93/7) para dar 75 mg de C6 (69 %), pf = 256,46 °C.

1H RMN (500 MHz, DMSÜ-ofe) ó ppm 1,34 (s, 3 H) 1,37 (s, 3 H) 2,17 (a d, J=15,1 Hz, 1 H) 2,50 (m, 1 H) 5,58 (a t, J=9,5 Hz, 1 H) 7,18 (t, J=6,6 Hz, 1 H) 7,39 (a d, J=7,9 Hz, 1 H) 7,67 (t, J=7,6 Hz, 1 H) 7,64 - 7,81 (s a, 1 H) 7,85 (a d, J=11,4 Hz, 1 H) 8,32 (s, 1 H) 8,37 (s, 1 H) 8,47 (a d, J=3,8 Hz, 1 H) 9,13 (s a, 1 H) 12,08 (s a, 1 H) 12,47 (s, 1 H)

Masa encontrada por CL-EM [M+H]+= 479,0. TR (min)= 2,39 min (método A)

Separación de isómeros puros de C6

El compuesto C6 se purificó mediante SFC quiral (fase estacionaria: CHIRALCEL AD (5,0 cm D.I. x 25 cml), fase móvil: 70 % de Cܲ , 30 % de EtÜH. Entonces cada isómero se volvió a purificar por HPLC quiral (fase estacionaria: CHIRALPAK AD, fase móvil: 70 % de hexano, 30 % de EtÜH, 0,1 % de AcÜH para dar 30 mg de enantiómero 1 denominado [(-)-C6]; pf °C = 231,52, [a]25°C589nm = -37,1 y 35 mg de enantiómero 2 denominado [(+)-C6], m = 35 mg; pf °C = 229,28, [a]25°C589nm = 41,0.

Preparación de compuesto intermedio D2

Una suspensión de Zn activado (13 g; 198 mmol) en THF seco (100 ml) se calentó a reflujo, después se añadió 1,2-dibromoetano (855 pl; 9,92 mmol) y unas pocas gotas de bromoacetato de etilo. Después de 20 min a reflujo, se añadió una solución de compuesto DI (5 g; 33,1 mmol) en THF seco (100 ml) en una porción. Se añadió gota a gota bromoacetato de etilo (15 ml; 132 mmol) durante 50 min. La mezcla se agitó a 70 °C durante 20 min, después se enfrió hasta ta, después se trató con una solución acuosa de NaHCO3 y se filtró a través de una capa de celite. El filtrado se extrajo con EtOAc (dos veces). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO⁴ , se filtraron y se concentraron al vacío para dar 10 g de D2 en bruto.

El material en bruto se purificó por CL preparativa (SiOH regular 30 pm, 200 g Interchim, carga líquida (DCM), gradiente de fase móvil: de heptano/EtOAc 100:0 a 80:20). Las fracciones que contenían el producto se combinaron y el disolvente se retiró al vacío para dar 5,7 g de intermedio D2 (72 %) como un aceite incoloro.

Preparación de compuesto intermedio D3

Se añadió NaBH3CN (1,5 g; 23,9 mmol) a una solución de intermedio D2 (4,7 g; 19,6 mmol) en MeOH (118 ml) y AcOH (12 ml). La mezcla resultante se agitó a ta durante una noche. La mezcla se inactivó mediante la adición de agua y el disolvente se evaporó al vacío. La mezcla resultante se basificó mediante la adición de una solución de NaOH (1 N) pH = 10-14, después se extrajo con DCM (dos veces). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron al vacío para dar 4,6 g de intermedio D3 (97 %) como un aceite incoloro.

Preparación de compuesto intermedio D4

Una mezcla de 2,6-dicloro-3 ciano-5 fluoropiridina (396 mg; 2,07 mmol), intermedio D3 (500 mg; 2,07 mmol) y DIPEA (543 pl; 3,11 mmol) en THF (10 ml) y EtOH (10 ml) se agitó a 90 °C durante 2 h. La mezcla se transfirió a un tubo precintado y se añadió 2,6-dicloro-3 ciano-5 fluoropiridina (396 mg; 2,07 mmol), la mezcla resultante se agitó a 90 °C durante 16 h. Se añadió 2,6-dicloro-3 ciano-5 fluoropiridina (396 mg; 2,07 mmol) y DIPEA (543 pl; 3,11 mmol) y la mezcla se agitó a 90 °C durante 6 h. La mezcla se concentró hasta sequedad y se purificó por CL preparativa (SiOH irregular 15-40 pm, 50 g Merck, gradiente de fase móvil: de heptano/DCM 80:20 a 0:100). Las fracciones que contenían el producto se combinaron y el disolvente se retiró al vacío para dar 224 mg de intermedio D4 como un sólido amarillo (40 %).

El compuesto D5 se preparó de la misma manera que el compuesto racemato C6 partiendo de compuesto X e intermedio D4

1H RMN (500 MHz, DMSO-ofe) ó ppm 1,18 (s, 3 H) 1,37 (s, 3 H) 2,26 (brd, J=15,1 Hz, 1 H) 2,57 - 2,67 (m, 1 H) 5,35 (a t, J=9,9 Hz, 1 H) 6,90 - 6,95 (m, 2 H) 7,34 (dd, J=4,9, 1,4 Hz, 1 H) 7,67-7,86 (s a, 1 H)7,88 (d, J=11,4 Hz, 1 H) 8,31 (s, 1 H) 8,36 (d, J=2,5 Hz, 1 H) 9,03 (d, J=2,2 Hz, 1 H) 12,17 (s a, 1H) 12,48 (s a, 1 H). LC-MS Masa Encontrado [M+H]+= 484,1. Rt(min)= 2,55 (Método A), PF°C= 280,59.

Preparación de compuesto intermedio E2

Se añadió en porciones tBuOK (14,5 g; 130 mmol) a una solución de compuesto El [1142927-97-6] (6,28 g; 51,8 mmol) y 18-corona-6 (2,1 g; 7,8 mmol) en THF (200 ml) a 0 °C. La mezcla se agitó a 0 °C durante 15 min antes de la adición lenta de yodometano (9,7 ml; 156 mmol). La mezcla se agitó a 0 °C durante 15 min, después a ta durante 16 h. La mezcla de reacción se inactivó con una solución acuosa de NH4Cl y se extrajo con EtOAc (dos veces). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se evaporaron al vacío para dar 8 g de E2 en bruto

El material en bruto se purificó por CL preparativa (SiOH regular 30 pm, 300 g Interchim, carga seca (en sílice), gradiente de fase móvil: de heptano/EtOAc 80/20 a 0/100) para dar 6 g de intermedio E2 como un aceite incoloro (78 %).

Preparación de compuesto intermedio E3

Una suspensión de Zn activado (10,5 g; 161 mmol) y ácido metanosulfónico (800 pl; 12,3 mmol) en THF (65 ml) se calentó a reflujo durante 15 min, después se añadió intermedio E2 (4,8 g; 32,2 mmol) en THF (15 ml). Después se añadió gota a gota bromoacetato de etilo (10,7 ml; 96,7 mmol) en THF (50 ml) durante 45 min. La mezcla se agitó a reflujo durante 1 h, después se enfrió hasta ta, después se trató con una solución saturada acuosa de NaHCO³ , se filtró a través de una capa de celite y se lavó con EtOAc. Las capas se separaron. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO4, se filtró, se concentró al vacío y se purificó por CL preparativa (SiOH regular 30 pm, 300 g, Interchim, carga seca (en sílice), gradiente de fase móvil: de heptano/EtOAc 80/20 a 50/50) para dar 6,37 g de intermedio E3 como un aceite incoloro (83 %).

Preparación de compuesto intermedio E4

Se añadió NaBH³CN (1,86 g; 29,6 mmol) a una solución de intermedio E3 (2,94 g; 12,4 mmol) en MeOH (80 ml) y AcOH (15 ml). La mezcla resultante se agitó a ta durante 56 h. La mezcla se inactivó mediante la adición de agua y el disolvente se evaporó al vacío. La mezcla resultante se basificó mediante la adición de una solución de NaOH (1 N) hasta pH = 10-14, después se extrajo con DCM (dos veces). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron al vacío para dar 2,9 g de E4 en bruto.

El material en bruto se purificó por CL preparativa (SiOH regular 15-30 pm, 80 g Interchim, gradiente de fase móvil: de DCM/MeOH: 100/0 a 90/10) para dar 2,09 g de intermedio E4 como un aceite incoloro (70 %).

Preparación de compuesto intermedio E5

Se calentó 2,6-dicloro-3 ciano-5 fluoropiridina (851 mg; 4,46 mmol), DIPEA (3,9 ml; 22,3 mmol), intermedio E4 (1 g; 4,18 mmol) en THF (10 ml) y EtOH (10 ml) a 90 °C durante 16 h en un tubo precintado. Los disolventes se evaporaron. Se añadió agua. La capa acuosa se extrajo con DCM (3 veces). La capa orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y se evaporó al vacío y se purificó por CL preparativa (SiOH irregular 15-40 pm, 50 g Merck, carga seca (en SiOH), gradiente de fase móvil: de heptano/EtOAc: 90/10 a 50/50) para dar 843 mg de intermedio E5 como una goma (48 %).

Compuesto E6

El compuesto E6 se preparó de la misma manera que el compuesto racemato C6 partiendo de compuesto X e intermedio E5

1H RMN (400 MHz, DMSO-ofe) 5 ppm 1,16 (s, 3 H) 1,26 (s, 3 H) 2,35- 2,56 (m, 2 H) 3,73 (s, 3 H) 5,24 (a t, J=9,4 Hz, 1 H) 6,06 (d, J=2,0 Hz, 1 H) 7,46-7,60 (m, 1 H) 7,53 (d, J=1,5 Hz, 1 H) 7,85 (d, J=11,1 Hz, 1 H) 8,31 (s a, 1 H) 8,34 (d, J=2,5 Hz, 1 H) 9,03 (d, J=2,5 Hz, 1 H) 12,07 (s a, 1 H) 12,45 (s a, 1 H). LC-MS Masa Encontrado [M+H]+= 484,1. Rt(min)= 2,55 (Método A), PF°C= 288,09.

Preparación de compuesto intermedio F2

Una suspensión de Zn activado (1,41 g; 21,6 mmol) y ácido metanosulfónico (107 pl; 1,65 mmol) en THF seco (10 ml) se calentó a reflujo durante 15 min, después se añadió compuesto F1 [856659-63-7] (930 mg; 4,32 mmol) en THF seco (5 ml). Después se añadió gota a gota bromoacetato de etilo (1,4 ml; 13,0 mmol) en THF seco (5 ml) durante 10 min. La mezcla se agitó a reflujo durante 1 h, después se enfrió hasta ta, después se trató con una solución saturada acuosa de NaHCÜ3, se filtró a través de una capa de celite y se lavó con EtOAc. Las capas se separaron. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre MgSÜ4, se filtró, se concentró al vacío y se purificó por CL preparativa (SiOH irregular 15-40 pm, 40 g, Grace, carga seca (en SiOH), gradiente de fase móvil: de heptano/EtOAc 90/10 a 50/50) para dar 672 mg de intermedio F2 como un aceite incoloro (51 %).

Preparación de intermedio F3/F3’

Una mezcla de intermedio F2 (670 mg; 2,21 mmol) y HCI [3 M] en CPME (2,2 ml; 6,62 mmol) en MeOH (20 ml) se agitó a ta durante 56 h. La mezcla se evaporó a sequedad para dar un residuo que se recogió con Et²O y pentano y los disolventes se evaporaron para dar 510 mg de una mezcla de intermedios F3 y F3’ (70/30) como un aceite incoloro (98 %).

Preparación de intermedio F4/F4’

Se calentó 2,6-dicloro-3 ciano-5 fluoropiridina (457 mg; 2,39 mmol), DIPEA (2,1 ml; 12,0 mmol), intermedios F3/F3’ (510 mg; 2,56 mmol) en THF(6,4 ml) y EtOH (6,4 ml) a 90 °C durante 2 h en un tubo precintado. Los disolventes se evaporaron. Se añadió EtOAc y la solución resultante se lavó dos veces con agua. La capa orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró, se evaporó y se purificó por CL preparativa (SiOH regular 30 pm, 25 g Interchim, gradiente de fase móvil: de heptano/EtOAc 90/10 a 50/50) para dar 304 mg de intermedio F4 como un sólido amarillo (36 %), y 76 mg de intermedio F4’ como un aceite amarillo (9 %).

Compuesto F5

El compuesto F5 se preparó de la misma manera que el compuesto racemato C6 partiendo de compuesto X y mezcla de intermedios F4/F4’

1H RMN (400 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 0,84 (s, 3 H) 0,89 (s, 3 H) 2,05 (a d, J=7,6 Hz, 2 H) 2,56 - 2,74 (m, 2 H) 4,88 -4,99 (m, 3 H) 5,82 (m, 1 H) 7,52 (a d, J=7,6 Hz, 1 H) 7,84 (d, J=11,1 Hz, 1 H) 8,32 (d, J=3,0 Hz, 1 H) 8,33 (t, J=3,0 Hz, 1 H) 8,97 (d, J=2,0 Hz, 1 H) 12,09 (s a, 1 H) 12,45 (s a, 1 H). LC-MS Masa Encontrado [M+H]+= 442,1. Rt(min)= 2,60 (Método A), PF°C= 257,3 & 263,62.

Preparación de compuesto intermedio G2

Se añadió tBuOK (4,74 g, 42,3 mmol) a una solución de compuesto G1 [101010-74-6] (2,10 g, 16,9 mmol) en THF (65 ml), a 0 °C. Se añadió 18-corona-6 (0,670 g, 2,50 mmol) a la mezcla. La mezcla se agitó a 0 °C durante 15 minutos y se añadió gota a gota yodometano (2,57 ml, 50,7 mmol) a 0 °C. La mezcla de reacción se agitó a 0 °C durante 15 minutos, después a ta durante una noche. Se añadió una solución saturada acuosa de NH⁴CL La mezcla de reacción se extrajo con acetato de etilo (2 x 150 ml), se secó sobre Na²SO⁴ , se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por CL preparativa (SiOH irregular, 40-63 qm, Fluka, carga líquida (DCM), fase móvil: gradiente de ciclohexano/EtOAc: de 90/10 a 70/30) para dar 1,64 g de intermedio G2 como un líquido amarillo (64 %).

Preparación de compuesto intermedio G3

Se añadió ácido metanosulfónico (0,260 ml, 4,00 mmol) a una suspensión de Zn activado (3,43 g, 52,5 mmol) en THF (24 ml) a ta. La mezcla de reacción se agitó a reflujo durante 15 minutos y se añadió una solución de intermedio G2 (1,60 g, 10,5 mmol) en THF ^{( 8} ml). Después se añadió gota a gota una solución de bromoacetato de etilo (3,50 ml, 31,5 mmol) en THF (16 ml) a reflujo. La mezcla de reacción se agitó a reflujo durante 1 h. Se añadió una solución saturada acuosa de NaHCO³ y la mezcla se filtró sobre celite. El filtrado se extrajo con acetato de etilo (2 x 15 ml), se secó sobre Na²SO⁴ , se filtró y se concentró a presión reducida y el residuo se purificó por CL preparativa (SiOH irregular, 40-63 qm, Fluka, carga líquida (DCM), fase móvil: ciclohexano/EtOAc 8/2) para dar 1,90 g de intermedio G3 como un líquido incoloro (75 %).

Preparación de compuesto intermedio G4

A una solución de intermedio G3 (1,89 g; 7,86 mmol) en MeOH (73 ml) y AcOH (20,5 ml) se le añadió una solución comercial de NaBHaCN 1 M en THF (18,9 ml; 18,9 mmol) gota a gota a ta. La mezcla de reacción se agitó a ta durante 16 h. La mezcla se evaporó a sequedad y el residuo se evaporó conjuntamente con tolueno para dar una goma blanca. Después el residuo se recogió en agua, se añadió una solución acuosa de NaOH (1 M) y la capa acuosa se extrajo con DCM (3x). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO⁴ y se concentraron para dar 1,7 g de G4 en bruto. El aceite se purificó por CL preparativa (SiOH irregular 15-40 qm, 50 g Merck, gradiente de fase móvil: de DCM/MeOH: 100/0 a 90/10) para dar 583 mg de intermedio G4 como un aceite incoloro (31 %).

Preparación de compuesto intermedio G5

Se calentó 2,6-dicloro-3 ciano-5 fluoropiridina (429 mg; 2,24 mmol), DIPEA (2 ml; 11,4 mmol), intermedio G4 (582 mg; 2,40 mmol) en THF ^{( 6} ml) y EtOH ^{( 6} ml) a 90 °C durante 2 h en un tubo precintado. Los disolventes se evaporaron. Se añadió EtOAc y la mezcla resultante se lavó dos veces con agua. La capa orgánica se secó sobre MgSO⁴ , se filtró, se evaporó al vacío y se purificó por CL preparativa (SiOH regular 30 qm, 40 g Interchim, gradiente de fase móvil: de heptano/EtOAc: 90/10 a 50/50) para dar 500 mg de intermedio G5 como un sólido beis (56 %).

Compuesto G6

El compuesto G6 se preparó de la misma manera que el compuesto racemato C6 partiendo de compuesto X e intermedio G5

1H RMN (400 MHz, DMSO-ofe) 5 ppm 1,33 (s, 3 H) 1,45 (s, 3 H) 2,42 (a d, J=14,7 Hz, 1 H) 2,62 (dd, J=15,7, 11,1 Hz, 1 H) 5,45 (a t, J=9,9 Hz, 1 H) 7,58 (d, J=3,0 Hz, 1 H) 7,60 - 7,71 (m, 1 H) 7,67 (d, J=3,0 Hz, 1 H) 7,88 (d, J=11,6 Hz, 1 H) 8,31 (d, J=2,5 Hz, 1 H) 8,34 (d, J=2,0 Hz, 1 H) 9,02 (d, J=2,5 Hz, 1 H) 12,11 (s a, 1 H) 12,45 (s a, 1 H). LC-MS Masa Encontrado [M+H]+= 485. Rt(min)= 2,24 (Método A), PF°C= 263,9.

Preparación de compuesto intermedio H1

En tubo precintado, se agitó una solución de 2,4-dicloro-5-fluoro-pirimidina (318 mg; 1,91 mmol), intermedio D3 (460 mg; 1,91 mmol) y DIPEA (1,6 ml; 9,53 mmol) en THF (10 ml) y EtOH (10 ml) a 80 °C durante una noche. La mezcla se evaporó hasta sequedad, el residuo se solubilizó en EtOAc, después se añadió agua y las capas se separaron. La capa orgánica se lavó con salmuera (una vez), se secó sobre MgSO4, se filtró, se concentró al vacío y se purificó por CL preparativa (SiOH irregular 15-40 pm, 30 g Merck, carga líquida, gradiente de fase móvil: de heptano/DCM 50:50 a 80:20). Las fracciones que contenían el producto se combinaron y el disolvente se retiró al vacío para dar 338 mg de intermedio H1 como un sólido amarillo (48 %).

Compuesto H2

El compuesto H2 se preparó de la misma manera que el compuesto racemato C6 partiendo de compuesto X e intermedio H1 excepto que la saponificación final se realizó con KOH (10 equiv.) en una mezcla de EtOH/H²O a ta.

1H RMN (400 MHz, DMSO-ofe) 5 ppm 1,31 (s, 3 H) 1,41 (s, 3 H) 2,25 (brd, J=16,7 Hz, 1 H) 2,50 (m, 1 H) 5,12 - 5,32 (m, 1 H) 6,97 (m, 1 H) 7,04 (m, 1 H) 7,30-7,96 (m, 1 H)7,39 (d, J=5,1 Hz, 1 H) 8,16 (d, J=3,5 Hz 1 H) 8,19 (s, 1H) 8,30 (d, J=2,5 Hz, 1 H) 8,93 (s, 1 H) 12,04 (s a, 1 H) 12,31 (s a, 1 H). LC-MS Masa Encontrado [M+H]+= 460. Rt(min)= 2,36 (Método A), PF°C= 175,6 & 228,74.

Sintesis de compuesto 13 (compuesto de referencia)

Preparación de compuesto intermedio 11

Se calentó 2,6-dicloro-3 ciano-5 fluoropiridina (0,23 g; 1,2 mmol), diisopropiletilamina (1,1 ml; 6,1 mmol), 3-amino-4-metoxi-4-metilpentanoato de etilo (CAS [1878209-66-5], 0,23 g; 1,2 mmol) en THF (3,0 ml) y EtOH (3,0 ml) a 90 °C durante 18 horas en un tubo precintado. Se añadió EtOAc y se lavó dos veces con salmuera. La capa orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y se evaporó al vacío para dar un aceite incoloro. Se purificó por CL preparativa (SiOH regular 30 gm, 24 g, gradiente de fase móvil: de heptano/AcOEt 80/20 a 70/30) para dar 0,195 g de intermedio 11 como un sólido blanco (47 %).

Preparación de compuesto intermedio 12

En atmósfera de N² , en un tubo precintado, una mezcla de X (144 mg; 0,33 mmol), 11 (95 mg; 0,28 mmol) y carbonato de cesio (0,32 g; 0,97 mmol) en 1,4-dioxano (2,4 ml) y agua (0,75 ml) se desgasificó con N² durante 5 min. Se añadió PdCl2(PPh3)2 (19 mg; 28 gmol) y la mezcla de reacción se desgasificó de nuevo con N² durante 2 min. La mezcla de reacción se calentó a 90 °C durante 2 horas. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente. Se añadieron DCM y salmuera a la mezcla de reacción. La capa acuosa se extrajo con DCM. Las capas orgánicas combinadas se lavaron, se secaron sobre MgSO⁴ , se retiraron por filtración y se concentraron a sequedad para producir el compuesto en bruto. Se purificó por CL preparativa (SiOH regular 30 gm, 12 g, carga seca, gradiente de fase móvil: de heptano/EtOAc 90/10 a 70/30) para dar 81 mg de intermedio 12 como un sólido blanco (48 %).

Preparación de compuesto 13

Una solución de hidróxido de litio monohidrato (28 mg, 0,66 mmol) en agua (0,25 ml) se añadió a una mezcla de ¡2 (81 mg, 0,13 mmol) en THF (0,73 ml). La mezcla se agitó durante 18 horas a 60 °C.

La solución se evaporó al vacío y se purificó por CL preparativa (SiOH regular 30 gm, 12 g, gradiente de fase móvil: de DCM/MeOH/ácido acético 99/1/0,1 a 95/5/0,5) para dar después de la evaporación una fracción que se liofilizó en MeCN/H²O para dar 37 mg de compuesto 13 como un sólido blanco (65 %, p.f. =275 °C).

1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 1,07 (s, 3 H) 1,12 (s, 3 H) 2,61 - 2,72 (m, 2 H) 3,15 (s, 3 H) 5,14 (dt, J=9,6; 2,0 Hz, 1 H) 7,57 (a d, J=8,6 Hz, 1 H) 7,86 (d, J=11,1 Hz, 1 H) 8,31 (s, 1H) 8,32 (s, 1 H) 8,97 (d, J=2,0 Hz, 1 H) 11,7-12,4 (m, 1 H) 12,45 (s a, 1 H)

Preparación de compuesto intermedio J1

Se calentó 2,6-dicloro-3 ciano-5 fluoropiridina (1 g; 5,24 mmol), diisopropiletilamina (4,5 ml; 26,2 mmol), 3-amino-4,4-dimetilpentanoato de etilo (CAS [197904-09-9], 1,09 g; 6,28 mmol) en THF (13 ml) y EtOH (13 ml) a 90 °C durante 18 horas en un tubo precintado. Se añadió EtOAc y se lavó dos veces con salmuera. La capa orgánica se secó sobre MgSO⁴ , se filtró y se evaporó al vacío para dar 2,4 g como un aceite amarillo. Se purificó por CL preparativa (SiOH irregular 15-40 gm, 80 g Grace, carga seca (en SiOH), gradiente de fase móvil: de heptano/EtOAc 95/5 a 50/50) para dar 1,33 g de intermedio J1 como un sólido amarillo (77 %).

Preparación de compuesto intermedio J2

En atmósfera de N², en un tubo precintado, una mezcla de X (250 mg; 0,578 mmol), J1 (246 mg; 0,751 mmol) y carbonato de cesio (0,659 g; 2,02 mmol) en 1,4-dioxano (11 ml) y agua (3 ml) se desgasificó con N² durante 5 min. Se añadió PdCl2(PPh3)2 (41 mg; 58 gmol) y la mezcla de reacción se desgasificó de nuevo con N² durante 2 min. La mezcla de reacción se calentó a 90 °C durante 1 hora. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente. Se añadieron DCM y salmuera a la mezcla de reacción. La capa acuosa se extrajo con DCM. Las capas orgánicas combinadas se lavaron, se secaron sobre MgSO4, se retiraron por filtración y se concentraron a sequedad para producir el compuesto en bruto. Se purificó por CL preparativa (SiOH irregular 15-40 gm, 10 g, carga seca (en SiOH), gradiente de fase móvil: de heptano/EtOAc 95/5 a 70/30) para dar 142 mg de intermedio J2 como un sólido verde pálido (41 %).

Preparación de compuesto J3

A una solución de J2 (142 mg; 237 gmol) en agua (3,7 ml) se le añadió hidróxido de sodio 3 M en H²O (475 gl; 1,42 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. El disolvente se evaporó al vacío y el residuo se recogió en agua. Se añadió una solución acuosa de HCI (1 N) hasta pH = 1. El precipitado formado se retiró por filtración, se lavó con agua y se secó al vacío para producir 69 mg de un sólido beis.

Se trituró en MeOH/H²O/DMSO (5/2/3 ml) y se sonicó. El precipitado se filtró para dar 43 mg de compuesto J3 (44 %).

1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) 5 ppm 0,93 (s, 9 H) 2,53 - 2,71 (m, 2 H) 4,84 (a t, J=9,5 Hz, 1 H) 7,59 (s a, 1 H) 7,83 (d, J=11,4 Hz, 1 H) 8,33 (s, 1H) 8,36 (s, 1 H) 8,99 (s, 1 H) 12,07 (s a, 1 H) 12,47 (s a, 1 H)

Procedimiento general

La medición de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) se realizó usando una bomba de CL, una matriz de diodos (DAD) o un detector UV y una columna como se especifica en los métodos respectivos. Si era necesario, se incluían detectores adicionales (véase la tabla de métodos a continuación).

El flujo desde la columna se llevó al espectrómetro de masas (EM) que estaba configurado con una fuente de iones a presión atmosférica. Pertenece a los conocimientos de los expertos en la materia el ajuste de los parámetros de calibrado (por ejemplo, intervalo de exploración, tiempo de permanencia...) para obtener iones que permitan la identificación del peso molecular (PM) monoisotópico nominal del compuesto. La adquisición de datos se realizó con el programa informático apropiado. Los compuestos se describe por sus tiempos de retención experimentales (T^r) e iones. Si no se especifica de forma diferente en la tabla de datos, el ion molecular presentado corresponde a [M+H]+ (molécula protonada) y/o [M-H]- (molécula desprotonada). En caso de que el compuesto no fuera directamente ionizable, se especifica el tipo de aducto (es decir [M+NH4]+, [M+HCOO]-, etc.). Para moléculas con múltiples patrones isotópicos (Br, CI), el valor presentado es el obtenido para la masa más baja del isótopo. Todos los resultados se obtuvieron con imprecisiones experimentales que están habitualmente asociadas con el método usado.

En lo que sigue "SQD" significa detector de cuadrupolo simple, "TA" temperatura ambiente, "BEH" híbrido de etilsiloxano/sílice puenteado, "HSS" sílice de alta resistencia, "DAD" detector de matriz de diodos.

Tabla Códigos del método de CLEM (flujo expresado en ml/min; temperatura de columna (T) en °C; tiempo de migración en minutos).

Actividad biológica de compuestos de la invención

La actividad antivírica in vitro de los compuestos se determinó usando un ensayo antivírico basado en células. En este ensayo, se controló el efecto citopático (CPE) en células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) infectadas por virus de la gripe A/Taiwan/1/86 (H1N1) en presencia o ausencia de los compuestos. Se llenaron placas blancas de ensayo de microvaloración de 384 pocillos (Greiner) mediante expulsión acústica de gotas usando el manipulador de líquidos por eco (Labcyte, Sunnyvale, California). Se transfirieron doscientos nanolitros de soluciones madre de compuesto (DMSO al 100 %) a las placas de ensayo. Las células MDCK se distribuyeron en la placa a densidad final de 25.000 o 6.000 células/pocillo. Después se añadió el virus de la gripe A/Taiwan/1/86 (H1N1) a una multiplicidad de infección de 0,001 o 0,01, respectivamente. Los pocillos contienen un 0,5 % de DMSO por volumen. Se incluyeron controles infectados con virus y de forma simulada en cada ensayo. Las placas se incubaron a 37 °C en un 5 % de CO². Tres días después de la exposición al virus, se cuantificó el efecto citopático midiendo la reducción en los niveles de ATP usando el kit ATPlite™ (PerkinElmer, Zaventem, Bélgica) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La CI⁵⁰ se definió como la concentración inhibidora del 50 %. En paralelo, se incubaron compuestos durante tres días en placas blancas de microvaloración de 384 pocillos y se determinó la citotoxicidad in vitro de los compuestos en células MDCK midiendo el contenido de ATP de las células usando el kit ATPlite™ (PerkinElmer, Zaventem, Bélgica) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La citotoxicidad se presentó como CC⁵⁰, la concentración que provoca un 50 % de reducción en la viabilidad celular.

Claims (7)

1. r e iv in d ic a c io n e s 1. Un compuesto seleccionado de

   

   
2. 2. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 junto con uno o más excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
3. 3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 2 para su uso como medicamento.
4. 4. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento de la gripe.
5. 5. Un compuesto como se describe en la reivindicación 1 para su uso en la inhibición de la replicación de uno o más virus de la gripe en una muestra biológica o paciente.
6. 6. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 5 que comprende además coadministrar un agente terapéutico adicional.
7. 7. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el agente terapéutico adicional se selecciona de un agente antivírico o vacuna de la gripe, o ambos.