ES2900749T3 - Moléculas de anticuerpos contra el virus del dengue y usos de las mismas - Google Patents

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Abstract

Una molécula de anticuerpo capaz de unirse al virus del dengue, que comprende: (a) una región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y (b) una región variable de inmunoglobulina de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

Description

DESCRIPCIÓN
Moléculas de anticuerpos contra el virus del dengue y usos de las mismas
ANTECEDENTES
[0001] El virus del dengue es un virus de ARN de sentido positivo que pertenece al género Flavivirus de la familia Flaviviridae. El virus del dengue se distribuye ampliamente en las regiones tropicales y semitropicales del mundo y se transmite a los seres humanos por los vectores de mosquitos. El virus del dengue es una de las principales causas de hospitalización y muerte de niños en al menos ocho países asiáticos tropicales (OMS, 1997. Dengue haemorrhagic fever: diagnosis, treatment prevention and control - 2a ed. Ginebra: OMS). Hay cuatro serotipos del virus del dengue (DV-1, DV-2, DV-3 y DV-4) que causan anualmente entre 50 y 100 millones de casos de dengue y 500.000 casos de la forma más grave de infección por el virus del dengue, fiebre hemorrágica del dengue/síndrome de choque por dengue (DHF/DSS) (Gubler, D. J. y Meltzer, M. 1999 Adv Virus Res 53: 35-70). El DHF/DSS se observa predominantemente en niños y adultos que experimentan una segunda infección por el virus del dengue con un serotipo diferente al de su primera infección por el virus del dengue y en la infección primaria de bebés que todavía tienen anticuerpos maternos específicos del dengue circulantes (Burke, D. S. et al. 1988 Am J Trop Med Hyg 38: 172­ 80; Halstead, SB y otros 1969 Am J Trop Med Hyg 18: 997-1021; Thein, S. y otros 1997 Am J Trop Med Hyg 56: 566­ 72).
[0002] Los diferentes serotipos de virus del dengue difieren en el nivel de aminoácidos en aproximadamente un 25-40% y tienen diferencias antigénicas, y esta variación ha obstaculizado los esfuerzos para producir una terapia eficaz contra todos los serotipos.
[0003] Todos los cuatro serotipos del virus del dengue muestran una proteína E (envoltura) en la superficie viral. La proteína E contribuye a la unión del virus a una célula huésped. La proteína E comprende un dominio DI (un barril beta de nueve hebras), un dominio DII (un dominio implicado en la fusión con la célula huésped) y un dominio DIII (un dominio de tipo inmunoglobulina). La respuesta humoral a la proteína E en humanos generalmente se dirige a las regiones DI y DII, y muchos de los anticuerpos exhiben una alta reactividad entre serotipos pero una baja actividad de neutralización.
[0004] Existe una necesidad en la técnica de nuevos tratamientos profilácticos y terapéuticos para el virus del dengue, y especialmente para los tratamientos que son eficaces contra los cuatro serotipos del virus.
[0005] El documento WO 2013/035345 se refiere a materiales y métodos para tratar las infecciones por dengue.
[0006] WO 2013/173348 se refiere a un anticuerpo anti-virus dengue humano que se une a una proteína de la envoltura DENV y es de reacción cruzada con DENV serotipo 1, DENV serotipo 2, DENV serotipo 3 y DENV serotipo 4.
[0007] Tharakaraman et al., (2013) PNAS 100(17) pg E1555-E1564, se relaciona con el rediseño de un anticuerpo de reacción cruzada contra el virus del dengue con actividad de amplio espectro y potencia in vivo aumentada.
RESUMEN
[0008] La presente invención está dirigida a una molécula de anticuerpo capaz de unirse al virus del dengue, que comprende:
(a) una región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y
(b) una región variable de inmunoglobulina de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
[0009] La invención también está dirigida a una composición farmacéutica que comprende la molécula de anticuerpo, tal como se define por las formas de reivindicación, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, excipiente o estabilizador.
[0010] La invención también se refiere a un ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada y de cadena ligera de anticuerpos de la molécula de anticuerpo, tal como se define por las formas de reivindicación.
[0011] La invención también se refiere a un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo de la molécula de anticuerpo, tal como se define por las formas de reivindicación, y un ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena ligera del anticuerpo de la molécula de anticuerpo como se ha definido por las formas de reivindicación.
[0012] La invención está dirigida también a una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo de la molécula de anticuerpo, tal como se define por las formas de reivindicación, y un ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena ligera del anticuerpo de la molécula de anticuerpo de la reivindicación según lo definido por las formas de reivindicación.
[0013] La invención también está dirigida a un método de producción de una molécula de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende cultivar la célula huésped, tal como se define por las formas de reivindicación, en condiciones adecuadas para la expresión génica.
[0014] La invención también se refiere a un kit que comprende un recipiente que tiene dispuesto en el mismo una molécula de anticuerpo tal como se define por las formas de reivindicación; un portador, excipiente o estabilizador farmacéuticamente aceptable; y opcionalmente un dispositivo de administración, en el que opcionalmente el dispositivo de administración comprende una jeringa o aguja, o en el que el kit comprende además instrucciones de uso.
[0015] La invención también se refiere a una molécula de anticuerpo tal como se define por las formas de reivindicación para su uso en un método de neutralización de virus del dengue en un sujeto, o para el uso en un método de tratamiento o prevención de virus del dengue, opcionalmente, en el que el virus del dengue es de serotipo DV-1, DV-2, DV-3 o DV-4, opcionalmente, en el que dicha molécula de anticuerpo se administra por vía parenteral o intravenosa.
[0016] La invención también se refiere a una molécula de anticuerpo, tal como se define por las formas de reivindicación, para uso en un método de reducción del riesgo de que un paciente contraiga el virus del dengue, o para uso en un método de reducción de la transmisión del virus del dengue entre un sujeto y un mosquito.
[0017] La invención también está dirigida a un método de detección de virus del dengue en una muestra biológica, que comprende (i) poner en contacto la muestra (y, opcionalmente, una muestra de referencia) con una molécula de anticuerpo, tal como se define por las formas de reivindicación, en condiciones que permitan que se produzca la interacción de la molécula de anticuerpo y la muestra, y (ii) detectar la formación de un complejo entre la molécula de anticuerpo y la muestra (y, opcionalmente, la muestra de referencia).
[0018] Esta divulgación proporciona, al menos en parte, moléculas de anticuerpos que se unen al virus del dengue, por ejemplo, la proteína E del virus del dengue, y que comprenden las propiedades funcionales y estructurales descritas en el presente documento. En algunas formas de realización, las moléculas de anticuerpo se unen a la cadena beta "A" de EDIII (el dominio DIII de la proteína E). En algunas formas de realización, las moléculas de anticuerpo se unen y/o neutralizan al menos 1,2, 3 o 4 serotipos del virus del dengue, por ejemplo, DV-1, DV-2, DV-3 y DV-4. Como se describe en este documento, a veces la molécula de anticuerpo se selecciona de la Tabla 1. Como se describe en este documento, a veces las moléculas de anticuerpo comprenden una deleción de VH S26 y/o una sustitución de VH T33V en comparación con el anticuerpo A11. Estas mutaciones pueden mejorar una o más propiedades, por ejemplo, mejorar la afinidad del anticuerpo por uno o más serotipos del virus del dengue, por ejemplo, el serotipo DV-4. En algunas formas de realización, la molécula de anticuerpo se dirige a un sitio en EDIII que se conserva en los cuatro serotipos de dengue. También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de anticuerpo, vectores de expresión, células huésped, composiciones farmacéuticas y métodos para preparar las moléculas de anticuerpo. Las moléculas de anticuerpo antidengue descritas en este documento se pueden usar (solas o en combinación con otros agentes o modalidades terapéuticas) para tratar, prevenir y/o diagnosticar el virus del dengue, por ejemplo, DV-1, DV-2, DV-3 o DV-4.
[0019] Por consiguiente, en ciertos aspectos, esta divulgación proporciona una molécula de anticuerpo (por ejemplo, una molécula de anticuerpo aislada, recombinante o humanizada) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23 o todas) de las siguientes propiedades de la Lista 1:
a) Se une a EDIII (p. ej., uno o más EDIII de cualquier serotipo del virus del dengue, p. ej., de DV-1, DV-2, DV-3 o DV-4, p. ej., los cuatro EDIII de DV-1, DV-2, DV-3 o DV-4) con alta afinidad, p. ej., con una constante de disociación (Kd) de menos de aproximadamente 100 nM, típicamente aproximadamente 10 nM, y más típicamente, aproximadamente 10-0.01 nM, aproximadamente 5-0.01 nM, aproximadamente 3- 0,05 nM, aproximadamente 1-0,1 nM, o más fuerte, por ejemplo, menos de aproximadamente 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 8, 6, 4, 3, 2, 1,0,5, 0,2, 0,1,0,05 o 0,01 nM,
b) Se une a DV-4 EDIII con alta afinidad, p. ej., con una constante de disociación (Kd) de menos de aproximadamente 100 nM, p. ej., aproximadamente 10 nM, p. ej., aproximadamente 10-1 nM o más fuerte, por ejemplo, menos de aproximadamente 10, 8, 6, 5, 4 o 3 nM,
c) Se une al dominio DV-4 y/o DV-3 EDIII con una mayor afinidad que el anticuerpo A11 (también denominado 4E5A en este documento) y/o el anticuerpo 4E11, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 15, 100, 1,000, 5,000 o 10,000 veces mayor afinidad,
d) Neutraliza el virus del dengue (por ejemplo, uno o más de DV-1, DV-2, DV-3 y DV-4, por ejemplo, todos de DV-1, DV-2, DV-3 y DV-4), por ejemplo, en una prueba de neutralización de reducción de enfoque o una prueba relacionada para evaluar la neutralización de la actividad viral,
e) Neutraliza DV-4 con un CI50 mejorado en comparación al anticuerpo A11 y/o al anticuerpo 4E11, p. ej., al menos 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 25, 50, 75, 100 o 1000 veces mejor CI50, p. ej., en una prueba de neutralización de reducción de foco o una prueba relacionada para evaluar la neutralización de la actividad viral, f) Tiene una mutación (p. ej., una o más de una deleción, una inserción, una sustitución, p. ej., una sustitución conservadora) en una o más posiciones relativas a A11, p. ej., en VH y/o VL, por ejemplo, en una o más CDR o regiones marco,
g) Tiene una mutación (por ejemplo, una o más de una deleción, una inserción, una sustitución, p. ej., una sustitución conservadora), p. ej., una sustitución, p. ej., una sustitución T33V, en la región CDR1 de la cadena pesada con respecto a A11,
h) Tiene una mutación (p. ej., una o más de una deleción, una inserción, una sustitución, por ejemplo, una sustitución conservadora), por ejemplo, una deleción, en la posición 26 en la cadena pesada FW1 con respecto a A11,
i) Tiene una mutación (por ejemplo, una o más de una deleción, una inserción, una sustitución, por ejemplo, una sustitución conservadora), por ejemplo, una sustitución, por ejemplo, una mutación de T33V en la región CDR1 de la cadena pesada con respecto a A11 y una mutación (por ejemplo, una o más de una deleción, una inserción, una sustitución, p. ej., una sustitución conservadora), p. ej., una deleción, en la posición 26 de la cadena pesada FW1 con respecto a A11,
j) Tiene una mutación (p. ej., una o más de una deleción, una inserción, una sustitución, p. ej., una sustitución conservadora), p. ej., una sustitución, p. ej., una mutación de T33V en la región CDR1 de la cadena pesada con respecto a A11, y ha mejorado (p. ej., con respecto a A11) la unión y/o neutralización del virus del dengue, p. ej., a uno o más (p. ej., todos) de DV-1, DV-2, DV-3 y DV-4,
k) Tiene una mutación (p. ej., una o más de una deleción, una inserción, una sustitución, por ejemplo, una sustitución conservadora), por ejemplo, una deleción, en la posición 26 de la cadena pesada FW1 con respecto a A11, y ha mejorado (por ejemplo, con respecto a A11) la unión a y/o neutralización del virus del dengue, por ejemplo, a uno o más (por ejemplo, todos) de DV-1, DV-2, DV-3 y DV-4, por ejemplo, a DV-4, l) Tiene una mutación (p. ej., una o más de una deleción, una inserción, una sustitución, p. ej., una sustitución conservadora), p. ej., una sustitución, p. ej., una mutación de T33V en la región CDR1 de la cadena pesada con respecto a A11 y una mutación (p. ej., una o más de una deleción, una inserción, una sustitución, por ejemplo, una sustitución conservadora), por ejemplo, una deleción, en la posición 26 de la cadena pesada FW1 con respecto a A11, y ha mejorado (por ejemplo, con respecto a A11) la unión a y/o neutralización del virus del dengue, por ejemplo, a uno o más (por ejemplo, todos) de DV-1, DV-2, DV- 3 y DV-4, p. ej., DV-4, m) Muestra la unión mejorada a EDIII de una o más (p. ej., todas) de las cepas del virus del dengue enumeradas en las Figuras 10A-10B, 11 y 19-21, p. ej., una o más cepas DV-2, una o más cepas DV-3, una o más cepas DV-4, por ejemplo, una o más de: DENV-4 BC2, DENV-4-Sing10, DENV-4 NewCa109, d En V-4 Phi156, DENV-3 Sing09, DENV-3 Nic10, DENV-3 H87, DENV-2 Peru95, DENV-2 Sing08, DENV-2 NGC, DENV-1 Hawaii/1944, DENV-2 Nueva Guinea/1944 (NGC), DENV-3 Filipinas/1956 (H87), DENV-4 México/1997 (BC287/97) y DENV-4 H241, por ejemplo, con al menos 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 25, 50, 75, 100 o 1000 veces mayor afinidad,
n) Altera la estructura nativa de la proteína E en la superficie del virión, p. ej., lo que puede causar la inactivación del virus,
o) Se une específicamente a un epítopo en EDIII, por ejemplo, el mismo o similar epítopo que el epítopo reconocido por un anticuerpo monoclonal A11 o B11,
p) Muestra la misma o similar afinidad o especificidad de unión, o ambas, como un anticuerpo de la Tabla 1, p. ej., D88, A48, F38, F108 o C88,
q) Muestra la misma o similar afinidad o especificidad de unión, o ambas, como molécula de anticuerpo (p. ej., una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera) descrita en la Tabla 1, p. ej., D88, A48, F38, F108 o C88,
r) Muestra la misma o similar afinidad o especificidad de unión, o ambas, como una molécula de anticuerpo (p. ej., una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera) que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 2,
s) Inhibe, p. ej., inhibe competitivamente, la unión de una segunda molécula de anticuerpo a EDIII en donde la segunda molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo descrita en este documento, p. ej., una molécula de anticuerpo elegida de la Tabla 1, p. ej., D88, A48, f38, F108 o C88,
t) Se une al mismo o un epítopo superpuesto con una segunda molécula de anticuerpo a EDIII, donde la segunda molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo descrita en este documento, por ejemplo, una molécula de anticuerpo elegida de la Tabla 1, p. ej., D88, A48, F38, F108 o C88,
u) Compite para la unión y se une al mismo epítopo, con una segunda molécula de anticuerpo para EDIII, donde la segunda molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo descrita en este documento, por ejemplo, una molécula de anticuerpo elegida de la Tabla 1, por ejemplo, D88, A48, F38, F108 o C88, v) Tiene una o más propiedades biológicas de una molécula de anticuerpo descrita en este documento, p. ej., una molécula de anticuerpo seleccionada de la Tabla 1, p. ej., D88, A48, F38, F108 o C88,
w) Tiene una o más propiedades farmacocinéticas de una molécula de anticuerpo descrita aquí, por ejemplo, una molécula de anticuerpo elegida de la Tabla 1, por ejemplo, D88, A48, F38, F108 o C88, o
x) Inhibe una o más actividades del virus del dengue, por ejemplo, neutraliza el virus (por ejemplo, medido en una prueba de neutralización de reducción de enfoque o una prueba relacionada para evaluar la neutralización de la actividad viral).
[0020] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo tiene una mutación (p. ej., una o más de una deleción, una inserción, una sustitución, por ejemplo, una sustitución conservativa), por ejemplo, una mutación T33V en la región de cadena pesada CDR1 relativa a A11, en combinación con una o más propiedades funcionales de la Lista 1 anterior, por ejemplo, una o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x). Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo tiene una mutación (por ejemplo, una o más de una deleción, una inserción, una sustitución, por ejemplo, una sustitución conservadora), por ejemplo, una deleción, en la posición 26 de la cadena pesada FW1 con respecto a A11, en combinación con una o más propiedades funcionales de la Lista 1 anterior, por ejemplo, una o más (p. ej., , dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x). Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo tiene una mutación (p. ej., , una o más de una deleción, una inserción, una sustitución, por ejemplo, una sustitución conservadora), por ejemplo, una mutación de T33V en la región CDR1 de la cadena pesada con respecto a A11 y una mutación (p. ej., una o más de una deleción, una inserción, una sustitución, por ejemplo, una sustitución conservadora), por ejemplo, una deleción, en la posición 26 de la cadena pesada FW1 con respecto a A11, en combinación con una o más propiedades funcionales de la Lista 1 anterior, por ejemplo, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x).
[0021] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo tiene una mutación T33V en la región CDR1 de cadena pesada con relación a A11, en combinación con una o más propiedades funcionales de la Lista 1 anterior, por ejemplo, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x). Como se describe en este documento, a veces la molécula de anticuerpo tiene una deleción en la posición 26 en la cadena pesada FW1 con respecto a A11, en combinación con una o más propiedades funcionales de la Lista 1 anterior, p. ej., una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x). Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo tiene una mutación de T33V en la región CDR1 de la cadena pesada en relación con A11 y una deleción en la posición 26 en la cadena pesada FW1 en relación con A11, en combinación con una o más propiedades funcionales de la Lista 1 anterior, por ejemplo, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x).
[0022] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo tiene una mutación T33V en la región CDR1 de la cadena pesada en relación con A11 y una deleción, en la posición 26 en la cadena pesada FW1 en relación con A11, combinación con una o más propiedades funcionales de la Lista 1 anterior, por ejemplo, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w), (x). Por ejemplo, la molécula de anticuerpo puede unirse a EDIII (p. ej., de DV-1, DV-2, DV-3 o DV-4) con alta afinidad, por ejemplo, con una constante de disociación (Kd) de menos de aproximadamente 100 nM, típicamente alrededor de 10 nM, y más típicamente, alrededor de 10-0,01 nM, alrededor de 5-0,01 nM, alrededor de 3-0,05 nM, o alrededor de 1-0,1 nM, o más fuerte, por ejemplo, menos de alrededor de 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 8, 6, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,2, 0,1, 0,05 o 0,01 nM. Como ejemplo adicional, la molécula de anticuerpo puede unirse a DV-4 EDIII con alta afinidad, p. ej., con una constante de disociación (Kd) de menos de aproximadamente 100 nM, por ejemplo, aproximadamente 10 nM, por ejemplo, aproximadamente 10-1 nM o más fuerte, por ejemplo, menos de aproximadamente 10, 8, 6, 5, 4 o 3 nM Además, la molécula de anticuerpo puede neutralizar DV-4 con una CI50 mejorada en comparación con el anticuerpo A11 y/o el anticuerpo 4E11, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 100, CI50 mejorada 1000 veces, por ejemplo, en una prueba de neutralización de reducción de enfoque o una prueba relacionada para evaluar la neutralización de la actividad viral.
[0023] Como se describe en el presente documento, a veces de afinidad se mide por ELISA o SPR de competición. A veces, la afinidad se mide mediante uno o más de BIAcore, ELISA o citometría de flujo.
[0024] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue es una molécula de anticuerpo humanizado y tiene una o más propiedades de la Lista 1 anterior, por ejemplo, una o más (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x).
[0025] Como se describe en el presente documento, a veces se une la molécula de anticuerpo a EDIII con alta afinidad, p. ej., con una Kd que es al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% menor que la KD de una molécula de anticuerpo antidengue murino, por ejemplo, 4E11, A11 o B11.
[0026] Como se describe en el presente documento, a veces el nivel de expresión de la molécula de anticuerpo es mayor, por ejemplo, al menos aproximadamente 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces mayor, que el nivel de expresión de una molécula de anticuerpo murino, por ejemplo, una molécula de anticuerpo antidengue murino descrita en el presente documento. Como se describe en el presente documento, a veces, la molécula de anticuerpo se expresa en células de mamíferos, por ejemplo, células humanas o de roedores.
[0027] Como se describe en el presente documento, a veces, la molécula de anticuerpo reduce una o más de las actividades del virus del dengue con una CI50 (concentración a la inhibición del 50%) que es inferior, por ejemplo, al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% menor que la CI50 de una molécula de anticuerpo antidengue murino, por ejemplo, una molécula de anticuerpo antidengue murino descrita en el presente documento. En algunas formas de realización, la actividad del virus del dengue se neutraliza, por ejemplo, en la prueba de neutralización por reducción de foco descrita en Tharakaramana y col., Proc Natl Acad Sci EE. UU. 23 de abril de 2013; 110 (17): E1555-64. doi: 10.1073/pnas.1303645110. Publicación electrónica del 8 de abril de 2013. Otras pruebas relacionadas que pueden usarse para evaluar la neutralización de la actividad viral incluyen, por ejemplo, ensayos de microneutralización (MN) basados en el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) (p. ej., como se describe en Vorndam et al., Am J Trop MedHyg 2002; 66: 208-212) y el ensayo de células dendríticas (CD) expresadoras de DCSIGN basado en el clasificador de células de anticuerpos fluorescentes (p. ej., como se describe en Martin et al., J Virol Methods 2006; 134: 74-85).
[0028] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo reduce la transmisión del virus del dengue (p. ej., reduce la transmisión entre un sujeto (p. ej., un ser humano) y un mosquito), por ejemplo, en al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90%, por ejemplo, medido por un modelo de mosquito descrito en el presente documento.
[0029] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo tiene una capacidad mejorada para reducir la transmisión del virus del dengue (p. ej., tiene una capacidad mejorada para reducir la transmisión del virus del dengue entre un sujeto (p. ej., un ser humano) y un mosquito), por ejemplo,, en al menos aproximadamente 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces mayor que una molécula de anticuerpo antidengue murino, por ejemplo, una molécula de anticuerpo antidengue murino descrita en este documento, por ejemplo, 4E11, A11 o B11, por ejemplo, medido por un modelo de mosquito descrito en el presente documento.
[0030] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo reduce la carga viral de mosquitos (p. ej., la cantidad de virus, y/o infectividad, llevada por un mosquito), por ejemplo, en al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90%, por ejemplo, medido por un modelo de mosquito descrito en el presente documento.
[0031] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo ha mejorado la estabilidad, p. ej., al menos aproximadamente 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces más estable in vivo o in vitro, que una molécula de anticuerpo antidengue murino, por ejemplo, una molécula de anticuerpo antidengue murino descrita en el presente documento, por ejemplo, 4E11, A11 o B11.
[0032] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue comprende al menos una región de unión al antígeno, por ejemplo, una región variable o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de un anticuerpo descrito en el presente documento, p. ej., Un anticuerpo elegido de la Tabla 1, por ejemplo, D88, A48, F38, F108 o C88, o una secuencia sustancialmente idéntica a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente (p. ej., una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o tener una, dos, tres o más sustituciones, inserciones o deleciones, por ejemplo, sustituciones conservadas). Como se describe en el presente documento, a veces una molécula de anticuerpo tiene una característica estructural discutida en este párrafo y una o más propiedades ventajosas tales como una afinidad mejorada (p. ej., en relación con A11) o una actividad de neutralización hacia el virus del dengue, p. ej., DV-4. Como se describe en este documento, a veces la propiedad ventajosa es una propiedad de la Lista 1, por ejemplo, uno o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x).
[0033] Como se describe en este documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue comprende al menos una, dos, tres o cuatro regiones variables de un anticuerpo descrito en este documento, por ejemplo, un anticuerpo de la Tabla 1, por ejemplo, D88, A48, F38., F108 o C88, o una secuencia sustancialmente idéntica a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente (p. ej., una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o que tiene uno, dos, tres o más sustituciones, inserciones o deleciones, por ejemplo, sustituciones conservadas). Como se describe en el presente documento, a veces una molécula de anticuerpo tiene una característica estructural discutida en este párrafo y una o más propiedades ventajosas tales como una afinidad mejorada (p. ej., en relación con A11) o una actividad de neutralización hacia el virus del dengue, p. ej., DV-4. Como se describe en este documento, a veces la propiedad ventajosa es una propiedad de la Lista 1, por ejemplo, uno o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x).
[0034] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue comprende al menos una o dos regiones variables de cadena pesada de un anticuerpo descrito en el presente documento, p. ej., un anticuerpo de la Tabla 1, por ejemplo, D88, A48, F38, F108, o C88, o una secuencia sustancialmente idéntica a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente (p. ej., una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y /o que tiene una, dos, tres o más sustituciones, inserciones o deleciones, por ejemplo, sustituciones conservadas). Como se describe en el presente documento, a veces una molécula de anticuerpo tiene una característica estructural discutida en este párrafo y una o más propiedades ventajosas tales como una afinidad mejorada (p. ej., en relación con A11) o una actividad de neutralización hacia el virus del dengue, p. ej., DV-4. Como se describe en este documento, a veces la propiedad ventajosa es una propiedad de la Lista 1, por ejemplo, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x).
[0035] Como se describe en el presente documento, a veces, la molécula de anticuerpo antidengue comprende al menos una o dos regiones variables de cadena ligera de un anticuerpo descrito en el presente documento, p. ej., un anticuerpo de la Tabla 1, por ejemplo, D88, A48, F38, F108, o C88 o una secuencia sustancialmente idéntica a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente (p. ej., una secuencia de al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idénticas a las mismas, y/o que tienen una, dos, tres o más sustituciones, inserciones o deleciones, por ejemplo, sustituciones conservadas). Como se describe en el presente documento, a veces una molécula de anticuerpo tiene una característica estructural discutida en este párrafo y una o más propiedades ventajosas tales como una afinidad mejorada (p. ej., en relación con A11) o una actividad de neutralización hacia el virus del dengue, p. ej., DV-4. Como se describe en este documento, a veces la propiedad ventajosa es una propiedad de la Lista 1, por ejemplo, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x).
[0036] La molécula de anticuerpo antidengue comprende una valina en la posición 33 (p. ej., una mutación T33V) en la región VH, por ejemplo, en relación con 4E5A y/o 4E11 o un anticuerpo de la Tabla 1. El anticuerpo antidengue comprende una del26 (deleción en la posición 26) en la región VH, p. ej., en relación con 4E5A o un anticuerpo de la Tabla 1. El anticuerpo antidengue comprende una valina en la posición 33 (p. ej., una mutación T33V) y una mutación del26 en la región VH, por ejemplo, en relación con 4E5A o un anticuerpo de la Tabla 1. Como se describe en este documento, a veces una molécula de anticuerpo tiene una característica estructural discutida en este párrafo y una o más propiedades ventajosas tales como una afinidad mejorada (p. ej., en relación con A11) o actividad de neutralización frente al virus del dengue, por ejemplo, DV-4. Como se describe en este documento, a veces la propiedad ventajosa es una propiedad de la Lista 1, por ejemplo, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x).
[0037] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue comprende al menos uno, dos, o tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una región variable de cadena pesada de un anticuerpo descrito en el presente documento, p. ej., un anticuerpo de la Tabla 1, p. ej., D88, A48, F38, F108 o C88, o una secuencia sustancialmente idéntica a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente (p. ej., una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o que tiene una, dos, tres o más sustituciones, inserciones o deleciones, por ejemplo, sustituciones conservadas). Como se describe en el presente documento, a veces una molécula de anticuerpo tiene una característica estructural discutida en este párrafo y una o más propiedades ventajosas tales como una afinidad mejorada (p. ej., en relación con A11) o una actividad de neutralización hacia el virus del dengue, p. ej., DV-4. Como se describe en este documento, a veces la propiedad ventajosa es una propiedad de la Lista 1, por ejemplo, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x).
[0038] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue incluye al menos una, dos, o tres CDR (o colectivamente todas las CDR) de una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos se muestra en la Tabla 3. Como se describe en este documento, a veces una o más de las CDR (o colectivamente todas las CDR) tienen uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más cambios, por ejemplo, sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos, en relación con las CDR mostradas en la Tabla 3. Como se describe en el presente documento, a veces una molécula de anticuerpo tiene una característica estructural discutida en este párrafo y una o más propiedades ventajosas tales como una afinidad mejorada (p. ej., en relación con A11) o una actividad de neutralización hacia el virus del dengue, por ejemplo, DV-4. Como se describe en este documento, a veces la propiedad ventajosa es una propiedad de Lista 1, por ejemplo, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x).
[0039] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue incluye al menos una, dos, o tres CDR (o colectivamente todas las CDR) de una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 3. Como se describe en este documento, a veces una o más de las CDR (o colectivamente todas las CDR) tienen uno, dos, tres, cuatro, siete, cinco, seis o más cambios, por ejemplo, sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos, en relación con las CDR se muestra en la Tabla 3. Como se describe en este documento, a veces una molécula de anticuerpo tiene una característica estructural discutida en este párrafo y una o más propiedades ventajosas tales como una afinidad mejorada (p. ej., en relación con A11) o una actividad de neutralización hacia el virus del dengue, p. ej., DV-4. Como se describe en este documento, a veces la propiedad ventajosa es una propiedad de la Lista 1, por ejemplo, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x).
[0040] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue incluye al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR (o colectivamente todas las CDR) de una región variable de cadena pesada y ligera que comprende una secuencia de aminoácidos se muestra en la Tabla 3. Como se describe en este documento, a veces una o más de las CDR (o colectivamente todas las CDR) tienen uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más cambios, por ejemplo, sustituciones de aminoácidos, inserciones o deleciones, con respecto a las CDR que se muestran en la Tabla 3. Como se describe en el presente documento, a veces una molécula de anticuerpo tiene una característica estructural discutida en este párrafo y una o más propiedades ventajosas tales como una afinidad mejorada (p. ej., en relación con A11) o una actividad de neutralización hacia virus del dengue, por ejemplo, DV-4. Como se describe en este documento, a veces la propiedad ventajosa es una propiedad de la Lista 1, por ejemplo, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x).
[0041] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue incluye las seis CDR de un anticuerpo descrito en el presente documento, p. ej., un anticuerpo de la Tabla 1, por ejemplo, D88, A48, F38, F108, o C88, o CDR estrechamente relacionadas, p. ej., CDR que son idénticas o que tienen al menos una alteración de aminoácidos, pero no más de dos, tres o cuatro alteraciones (p. ej., sustituciones p. ej., sustituciones conservadoras, deleciones, o inserciones). Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue puede incluir cualquier CDR descrita en el presente documento. Como se describe en el presente documento, a veces una molécula de anticuerpo tiene una característica estructural discutida en este párrafo y una o más propiedades ventajosas tales como una afinidad mejorada (p. ej., en relación con A11) o una actividad de neutralización hacia el virus del dengue, por ejemplo, DV-4. Como se describe en este documento, a veces la propiedad ventajosa es una propiedad de la Lista 1, por ejemplo, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x).
[0042] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue incluye al menos uno, dos, o tres bucles hipervariables de Chothia de una región variable de cadena pesada de un anticuerpo descrito en el presente documento, p. ej., un anticuerpo de la Tabla 1, por ejemplo, D88, A48, F38, F108 o C88, o al menos los aminoácidos de esos bucles hipervariables que entran en contacto con EDIII. Por ejemplo, una molécula de anticuerpo proporcionada en este documento tiene un VHCDR1 de SEQ ID NO: 9, un VHCDR2 de SEQ ID NO: 10 y un VHCDR3 de SEQ ID NO: 5. Una molécula de anticuerpo proporcionada en este documento también puede tener un VHCDR1 de SEQ ID NO: 15, un VHCDR2 de SEQ ID NO: 10 y un VHCDR3 de SEQ ID NO: 5. Una molécula de anticuerpo proporcionada en este documento también puede tener un VHCDR1 de SEQ ID NO: 22, 24, 26, 28 o 30; un VHCDR2 de SEQ ID NO: 10; y un VHCDR3 de SEQ ID NO: 5. Como se describe en el presente documento, a veces una molécula de anticuerpo tiene una característica estructural discutida en este párrafo y una o más propiedades ventajosas tales como una afinidad mejorada (p. ej., en relación con A11) o una actividad de neutralización hacia virus del dengue, por ejemplo, DV-4. Como se describe en este documento, a veces la propiedad ventajosa es una propiedad de la Lista 1, por ejemplo, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x).
[0043] Opcionalmente, en combinación con CDR de cadena pesada descritas en el presente documento, la molécula de anticuerpo antidengue puede incluir al menos uno, dos, o tres bucles hipervariables de Chothia de una región variable de cadena ligera de un anticuerpo descrito en el presente documento, p. ej., un anticuerpo de Tabla 1, por ejemplo, D88, A48, F38, F108 o C88, o al menos los aminoácidos de esos bucles hipervariables que entran en contacto con EDIII. Por ejemplo, como se describe en este documento, a veces una molécula de anticuerpo proporcionada en este documento tiene un VHCDR1 de SEQ ID NO: 6, un VHCDR2 de SEQ ID NO: 7 y un VHCDR3 de SeQ ID NO: 8. Como se describe en este documento, a veces una molécula de anticuerpo tiene una característica estructural discutida en este párrafo y una o más propiedades ventajosas tales como una afinidad mejorada (p. ej., en relación con A11) o una actividad de neutralización hacia el virus del dengue, por ejemplo, DV-4. Como se describe en este documento, a veces la propiedad ventajosa es una propiedad de la Lista 1, por ejemplo, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x).
[0044] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue incluye al menos uno, dos, o tres bucles hipervariables de Kabat de una región variable de cadena pesada de un anticuerpo descrito en el presente documento, p. ej., un anticuerpo de la Tabla 1, por ejemplo, D88, A48, F38, F108 o C88, o al menos los aminoácidos de esos bucles hipervariables que entran en contacto con EDIII. Como se describe en el presente documento, a veces una molécula de anticuerpo tiene una característica estructural discutida en este párrafo y una o más propiedades ventajosas tales como una afinidad mejorada (p. ej., en relación con A11) o una actividad de neutralización hacia el virus del dengue, p. ej., DV-4. Como se describe en este documento, a veces la propiedad ventajosa es una propiedad de la Lista 1, por ejemplo, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x).
[0045] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue incluye al menos uno, dos, o tres bucles hipervariables de Kabat de una región variable de cadena ligera de un anticuerpo descrito en el presente documento, p. ej., un anticuerpo de la Tabla 1, por ejemplo, D88, A48, F38, F108 o C88, o al menos los aminoácidos de esos bucles hipervariables que entran en contacto con EDIII. Como se describe en el presente documento, a veces una molécula de anticuerpo tiene una característica estructural discutida en este párrafo y una o más propiedades ventajosas tales como una afinidad mejorada (p. ej., en relación con A11) o actividad de neutralización hacia virus del dengue, p. ej., DV-4. Como se describe en este documento, a veces la propiedad ventajosa es una propiedad de la Lista 1, por ejemplo, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x).
[0046] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue incluye al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, o seis bucles hipervariables de las regiones pesada y variable de cadena ligera de un anticuerpo descrito en el presente documento, p. ej., un anticuerpo de la Tabla 1, por ejemplo, D88, A48, F38, F108 o C88, o al menos los aminoácidos de esos bucles hipervariables que entran en contacto con EDIII. Como se describe en el presente documento, a veces una molécula de anticuerpo tiene una característica estructural discutida en este párrafo y una o más propiedades ventajosas tales como una afinidad mejorada (p. ej., en relación con A11) o una actividad de neutralización hacia el virus del dengue, p. ej., DV-4. Como se describe en este documento, a veces la propiedad ventajosa es una propiedad de la Lista 1, por ejemplo, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x).
[0047] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue incluye todos los seis bucles hipervariables de la cadena pesada y regiones variables de cadena ligera de un anticuerpo descrito en el presente documento, p. ej., un anticuerpo de la Tabla 1, por ejemplo, D88, A48, F38, F108 o C88, o al menos los aminoácidos de esos bucles hipervariables que entran en contacto con EDIII, o bucles hipervariables estrechamente relacionados, por ejemplo, bucles hipervariables que son idénticos o que tienen al menos una alteración de aminoácidos, pero no más de dos, tres o cuatro alteraciones (p. ej., sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras, deleciones o inserciones). Como se describe en el presente documento, a veces una molécula de anticuerpo tiene una característica estructural discutida en este párrafo y una o más propiedades ventajosas tales como una afinidad mejorada (p. ej., en relación con A11) o una actividad de neutralización hacia el virus del dengue, p. ej., DV-4. Como se describe en este documento, a veces la propiedad ventajosa es una propiedad de la Lista 1, por ejemplo, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x).
[0048] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue incluye al menos uno, dos, o tres bucles hipervariables que tienen las mismas estructuras canónicas como el correspondiente bucle hipervariable de un anticuerpo descrito en el presente documento, p. ej., un anticuerpo de la Tabla 1, por ejemplo, D88, A48, F38, F108 o C88, por ejemplo, las mismas estructuras canónicas que al menos el bucle 1 y/o el bucle 2 de los dominios variables de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo descrito en este documento. Véase, por ejemplo, Chothia et al., (1992) J. Mol. Biol. 227: 799-817; Tomlinson y col., (1992) J. Mol. Biol. 227: 776-798 para descripciones de estructuras canónicas de bucle hipervariable. Estas estructuras se pueden determinar mediante la inspección de las tablas descritas en estas publicaciones. Como se describe en el presente documento, a veces una molécula de anticuerpo tiene una característica estructural discutida en este párrafo y una o más propiedades ventajosas tales como una afinidad mejorada (p. ej., en relación con A11) o una actividad de neutralización hacia el virus del dengue, p. ej., DV-4. Como se describe en este documento, a veces la propiedad ventajosa es una propiedad de la Lista 1, por ejemplo, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x).
[0049] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue comprende al menos una, dos, o tres (p. ej., todas) CDR de una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en la Tabla 3, o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma (p. ej., una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o que tiene una, dos, tres o más sustituciones, inserciones o deleciones, por ejemplo, sustituciones conservadas). Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue comprende al menos una, dos o tres (p. ej., todas) las CDR de una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la Tabla 3, o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma. (p. ej., una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o que tiene una, dos, tres o más sustituciones, inserciones o deleciones, por ejemplo, sustituciones conservadas). Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis (p. ej., todas) CDR de regiones variables de cadena pesada y ligera que tienen una secuencia de aminoácidos como se establece en la Tabla 3, o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma (p. ej., una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o que tiene una, dos, tres o más sustituciones, inserciones o deleciones, por ejemplo, sustituciones conservadas). Como se describe en el presente documento, a veces una molécula de anticuerpo tiene una característica estructural discutida en este párrafo y una o más propiedades ventajosas tales como una afinidad mejorada o una actividad de neutralización hacia el virus del dengue, por ejemplo, DV-4. Como se describe en este documento, a veces la propiedad ventajosa es una propiedad de la Lista 1, por ejemplo, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x).
[0050] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue comprende al menos una, dos, o tres (p. ej., todas) CDR de una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo descrito en el presente documento, p. ej., un anticuerpo de la Tabla 1, por ejemplo, D88, A48, F38, F108 o C88, o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma (p. ej., una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o que tiene una, dos, tres o más sustituciones, inserciones o deleciones, por ejemplo, sustituciones conservadas). Como se describe en este documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue comprende al menos una, dos o tres (p. ej., todas) las CDR de una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo descrito en este documento, p. ej., un anticuerpo de la Tabla 1, p. ej., D88, A48, F38, F108 o C88, o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma (p. ej., una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o que tiene una, dos, tres o más sustituciones, inserciones o deleciones, por ejemplo, sustituciones conservadas). Como se describe en este documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue comprende seis CDR descritas en este documento, por ejemplo, en una secuencia VL y VH de la Tabla 2. Como se describe en este documento, a veces una molécula de anticuerpo tiene una característica estructural discutida en este párrafo y una o más ventajosas propiedades tales como una afinidad mejorada (p. ej., en relación con A11) o una actividad de neutralización hacia el virus del dengue, p. ej., DV-4. Como se describe en este documento, a veces la propiedad ventajosa es una propiedad de la Lista 1, por ejemplo, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x).
[0051] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo tiene una VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 seleccionadas de la Tabla 3. Las seis CDR pueden ser todas definidas por Kabat, todas definidas por Chothia, o algunas definidas por Kabat y Chothia. Por ejemplo, VHCDR1 puede seleccionarse de SEQ ID NO: 3, 9, 14, 15, 22, 24, 26, 28 o 30; VHCDR2 puede seleccionarse entre SEQ ID NO: 4, 10 o 35; VHCDR3 puede ser SEQ ID NO: 5; VLCDR1 puede ser SEQ ID No : 6; VLCDR2 puede ser SEQ ID NO: 7; y VLCDR3 puede ser SEQ ID NO: 8.
[0052] Como se describe en el presente documento, a veces el marco variable de la cadena ligera o pesada del anticuerpo antidengue puede ser elegido a partir de: (a) un marco variable de cadena ligera o pesada que incluye al menos 80%, 85%, 87% 90%, 92%, 93%, 95%, 97%, 98%, o preferiblemente 100% de los residuos de aminoácidos de una estructura variable de cadena ligera o pesada humana, por ejemplo, un residuo de marco de estructura variable de cadena pesada de un anticuerpo humano maduro, una secuencia de línea germinal humana o una secuencia consenso humana; (b) una estructura variable de cadena ligera o pesada que incluye de 20% a 80%, 40% a 60%, 60% a 90% o 70% a 95% de los residuos de aminoácidos de una estructura variable de cadena ligera o pesada humana, por ejemplo, un residuo estructural variable de cadena ligera o pesada de un anticuerpo maduro humano, una secuencia de línea germinal humana o una secuencia consenso humana; (c) una estructura no humana (p. ej., una estructura de roedor); o (d) un marco no humano que se ha modificado, por ejemplo, para eliminar determinantes antigénicos o citotóxicos, por ejemplo, desinmunizados o parcialmente humanizados. Como se describe en el presente documento, a veces la región de estructura variable de cadena ligera o pesada incluye una secuencia de estructura variable de cadena ligera o pesada de al menos 70, 75, 80, 85, 87, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99% idéntica o idéntica a los marcos de un segmento VH o VL de un gen de la línea germinal humana. Como se describe en el presente documento, a veces una molécula de anticuerpo tiene una característica estructural discutida en este párrafo y una o más propiedades ventajosas tales como una afinidad mejorada (p. ej., en relación con A11) o una actividad de neutralización hacia el virus del dengue, p. ej., DV-4. Como se describe en este documento, a veces la propiedad ventajosa es una propiedad de la Lista 1, por ejemplo, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x).
[0053] Como se describe en el presente documento, a veces la región VH (p. ej., las regiones de marco de esta) de anticuerpo antidengue comprende una o más posiciones de una región VH humana, p. ej., la cadena pesada humana de la línea germinal para codificar secuencias de aminoácidos, por ejemplo, posiciones encontradas en uno o más (p. ej., todos) de FW1, FW2, FW3 y FW4. Opcionalmente en combinación con los residuos VH discutidos en la oración anterior, la región VL (p. ej., las regiones marco en la misma) del anticuerpo antidengue comprende una o más posiciones de una región VL humana, p. ej., aminoácido codificado en la línea germinal de cadena pesada humana. secuencias, por ejemplo, posiciones encontradas en una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco o todos) de FW1, FW2, FW3 y FW4.
[0054] Por ejemplo, como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo comprende uno o más (p. ej., al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, o todos) residuos de acuerdo con las regiones FW1, FW2, FW3 o FW4 de cadena pesada o cadena ligera de una secuencia de línea germinal humana de la Tabla 5. Más específicamente, como se describe en este documento, a veces la molécula de anticuerpo tiene uno o más (p. ej., al menos 2, 3, 4, 5, 10 o 15, o todos) residuos VH FW1 de una secuencia de línea germinal VH de la Tabla 6; a veces, la molécula de anticuerpo tiene uno o más (p. ej., al menos 2, 3, 4, 5, 10 o 15, o todos) residuos VH FW2 de una secuencia de línea germinal VH de la Tabla 6; a veces, la molécula de anticuerpo tiene uno o más (p. ej., al menos 2, 3, 4, 5, 10 o 15, o todos) residuos VH FW3 de una secuencia de línea germinal VH de la Tabla 6, y a veces la molécula de anticuerpo tiene uno o más (p. ej., al menos 2, 3, 4, 5, 10 o 15, o todos) residuos VH FW4 de una secuencia de línea germinal VH de la Tabla 6. Además, y opcionalmente en combinación con los residuos de la cadena pesada discutidos en la oración anterior, a veces, la molécula de anticuerpo tiene uno o más (p. ej., al menos 2, 3, 4, 5, 10 o 15, o todos) residuos VL FW1 de una secuencia de línea germinal VL de la Tabla 6; a veces, la molécula de anticuerpo tiene uno o más (p. ej., al menos 2, 3, 4, 5, 10 o 15, o todos) residuos VL FW2 de una secuencia de línea germinal VL de la Tabla 6; a veces, la molécula de anticuerpo tiene uno o más (p. ej., al menos 2, 3, 4, 5, 10 o 15, o todos) residuos VL FW3 de una secuencia de línea germinal VL de la Tabla 6 y, a veces, la molécula de anticuerpo tiene uno o más (p. ej., al menos 2, 3, 4, 5, 10 o 15, o todos) residuos VL FW4 de una secuencia de línea germinal VL de la Tabla 6. Como se describe en este documento, a veces la molécula de anticuerpo tiene un marco de cadena pesada VH1-18*01, JH4*01 y/o estructura de cadena ligera Vk4-1*01, Jk2*02.
[0055] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue comprende un dominio de variable de cadena pesada que tiene al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, diez, quince, veinte o más cambios, p. ej., sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos de la Tabla 1, por ejemplo, B11, D88, A48, F38, F108 o C88, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la región FR en la región variable completa. Como se describe en este documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene uno o más (p. ej., al menos 5, 10, 15 o 20, o todos) de: Q en la posición 3, V en la posición 5, una eliminación de E en la posición 6, V en la posición 12, K en la posición 13, K en la posición 20, V en la posición 21, K en la posición 24, una eliminación de S en la posición 26, V en la posición 33, R en la posición 39, A en la posición 41, G en la posición 43, M en la posición 49, L en la posición 65, R en la posición 68, V en la posición 69, M en la posición 71, T en la posición 77, M en la posición 82, E en la posición 83, R en la posición 85, R en la posición 88, D en la posición 90, A o V o S en la posición 98 y S en la posición 117 de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de la Tabla 1, por ejemplo, A11. Los ejemplos de anticuerpos que tienen una o más (p. ej., todas) de estas mutaciones incluyen A48, B48, C88, F38, F108 y D48. Como se describe en este documento, a veces la cadena pesada humanizada contiene uno o más de: Q en la posición 3, V en la posición 5, una deleción de E en la posición 6, V en la posición 12, K en la posición 13, K en la posición 20, V en posición 21, K en la posición 24, R en la posición 39, A en la posición 41, G en la posición 43, M en la posición 49, L en la posición 65, R en la posición 68, V en la posición 69, M en la posición 71, T en posición 77, M en la posición 82, E en la posición 83, R en la posición 85, R en la posición 88, D en la posición 90, V o A o S en la posición 98 y S en la posición 117 de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de la Tabla 1, por ejemplo, A11. Un ejemplo de un anticuerpo que tiene una o más (p. ej., todas) de estas mutaciones es A68. Como se describe en el presente documento, a veces una molécula de anticuerpo tiene una característica estructural discutida en este párrafo y una o más propiedades ventajosas tales como una afinidad mejorada (p. ej., en relación con A11) o una actividad de neutralización hacia el virus del dengue, p. ej., DV-4. Como se describe en este documento, a veces la propiedad ventajosa es una propiedad de la Lista 1, por ejemplo, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x).
[0056] Como se describe en el presente documento, a veces (y, opcionalmente, en combinación con las sustituciones de cadena pesada descritas en este documento, por ejemplo, en el párrafo anterior), la molécula de anticuerpo antidengue comprende un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, diez, quince, veinte o más cambios de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos, de
una secuencia de aminoácidos de la Tabla 1, por ejemplo, B11, D88, A48, F38, F108 o C88, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la región FR en toda la región variable. Como se describe en el presente documento, a veces, el anticuerpo antidengue comprende un dominio variable de cadena ligera que tiene uno o más (p. ej., al menos 5, 10, 15 o todos) de: D en la posición 1, I en la posición 2, S en la posición 7, E en la posición 17, P en la posición 44, V en la posición 62, D en la posición 64, G en la posición 72, S en la posición 80, S en la posición 81, L en la posición 82, Q en la posición 83, E en la posición 85, V en la posición 89, Y en la posición 91 y Q en la posición 104 de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de la Tabla 1, por ejemplo, B11, D88, A48, F38, F108 o C88. Como se describe en el presente documento, a veces, una molécula de anticuerpo tiene una característica estructural discutida en este párrafo y una o más propiedades ventajosas tales como una afinidad mejorada (p. ej., en relación con A11) o una actividad de neutralización hacia el virus del dengue, por ejemplo, DV-4. Como se describe en este documento, a veces, la propiedad ventajosa es una propiedad de la Lista 1, por ejemplo, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x).
[0057] Como se describe en el presente documento, a veces, el dominio variable de cadena pesada o cadena ligera, o ambas, de la molécula de anticuerpo antidengue incluye una secuencia de aminoácidos, que es sustancialmente idéntica a una de aminoácidos descritas en el presente documento, por ejemplo, al menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% o superior idéntica a una región variable de un anticuerpo descrito en este documento, p. ej., un anticuerpo de la Tabla 1, p. ej., D88, A48, F38, F108 o C88, o que difiere en al menos 1, 2, 3, 4 o 5 residuos, pero menos de 40, 30, 20 o 10 residuos, de una región variable de un anticuerpo descrito en este documento. Como se describe en el presente documento, a veces una molécula de anticuerpo tiene una característica estructural discutida en este párrafo y una o más propiedades ventajosas tales como una afinidad mejorada (p. ej., en relación con A11) o una actividad de neutralización hacia el virus del dengue, p. ej., DV-4. Como se describe en este documento, a veces la propiedad ventajosa es una propiedad de la Lista 1, p. ej., una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w), o (x).
[0058] Como se describe en el presente documento, a veces la región variable de cadena pesada o cadena ligera, o ambas, de la molécula de anticuerpo antidengue incluye una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico descrita en el presente documento, o un ácido nucleico que se hibrida con un ácido nucleico secuencia que codifica un anticuerpo de la Tabla 1, por ejemplo, D88, A48, F38, F108 o C88, o su complemento, por ejemplo, bajo rigurosidad baja, rigurosidad media o rigurosidad alta, u otra condición de hibridación descrita en el presente documento. Esta solicitud también describe la región variable de cadena ligera o pesada, o ambas, de la molécula de anticuerpo antidengue incluye una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico de la Tabla 4, o su complemento, por ejemplo, bajo rigurosidad baja, rigurosidad media, o alta rigurosidad, u otra condición de hibridación descrita en el presente documento. Como se describe en el presente documento, a veces, el ácido nucleico es al menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% o más idéntico a una secuencia de la Tabla 4 o una porción de la misma. Como se describe en el presente documento, a veces una molécula de anticuerpo tiene una característica estructural discutida en este párrafo y una o más propiedades ventajosas tales como una afinidad mejorada (p. ej., en relación con A11) o una actividad de neutralización hacia el virus del dengue, por ejemplo, DV-4. Como se describe en este documento, a veces la propiedad ventajosa es una propiedad de la Lista 1, por ejemplo, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x).
[0059] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue comprende al menos una, dos, tres, o cuatro regiones de unión a antígeno, por ejemplo, regiones variables, que tienen una secuencia de aminoácidos como se expone en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma (p. ej., una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, o que difiere en no más de 1,2, 5, 10 o 15 residuos de aminoácidos de las secuencias que se muestran en la Tabla 2). Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue incluye un dominio VH y/o VL codificado por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo de la Tabla 1, por ejemplo, D88, A48, F38, F108, o C88, o una secuencia sustancialmente idéntica a cualquiera de las secuencias de nucleótidos (p. ej., una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, o que difiere en no más de 3, 6, 15, 30, o 45 nucleótidos de cualquiera de las secuencias de nucleótidos). Como se describe en el presente documento, a veces una molécula de anticuerpo tiene una característica estructural discutida en este párrafo y una o más propiedades ventajosas tales como una afinidad mejorada (p. ej., en relación con A11) o una actividad de neutralización hacia el virus del dengue, p. ej., DV-4. Como se describe en este documento, a veces la propiedad ventajosa es una propiedad de la Lista 1, por ejemplo, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x).
[0060] En ciertos aspectos, la presente descripción proporciona una molécula de anticuerpo, opcionalmente capaz de unirse virus del dengue, que comprende:
(a) un segmento de región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende:
una CDR1 que comprende la secuencia DVYMS (SEQ ID NO: 3) (o una secuencia que no difiera en más de, 1,2 o 3 aminoácidos de la misma, opcionalmente siempre que V no cambie), una CDR2 que comprende la secuencia RIDPENGDTKYDPKLQG (SEQ ID NO: 4) (o una secuencia que difiere en no más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos de la mism, opcionalmente siempre que L no cambie), y
una CDR3 que comprende la secuencia GWEGFAY (SEQ ID NO: 5) (o una secuencia que no difiere en más de 1, 2 o 3 aminoácidos de la misma);
(b) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende:
una CDR1 que comprende la secuencia RASENVDKYGNSFMH (SEQ ID NO: 6) (o una secuencia que no difiere en más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos de la misma),
una CDR2 que comprende la secuencia RASELQW (SEQ ID NO: 7) (o una secuencia que no difiere en más de, 1, 2 o 3 aminoácidos de la misma), y
una CDR3 que comprende la secuencia QRSNEVPWT (SEQ ID NO: 8) (o una secuencia que no se diferencia en más de 1, 2 o 3 aminoácidos de la misma).
[0061] Como se describe en el presente documento, a veces V de HCDR1 es sin cambios; a veces, L de HCDR2 no cambia y, a veces, tanto V de HCDR1 como L de HCDR2 no cambian.
[0062] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo comprende una VH FW1 que tiene la secuencia QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAGFNIK (SEQ ID NO: 11), o una secuencia de aminoácidos no tiene más de 1,2, 3, 4, o 5 mutaciones relativas a la SEQ ID NO: 11.
[0063] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo comprende una VH FW2 que tiene la secuencia de WVRQAPGQGLEWMG (SEQ ID NO: 84), o una secuencia de aminoácidos que tiene no más de 1, 2, 3, 4, o 5 mutaciones relativas a SEQ ID NO: 84. Como se describe en este documento, a veces la molécula de anticuerpo comprende un VH FW2 que tiene la secuencia WVRQAPEQGLEWMG (SEQ ID NO: 85), o una secuencia de aminoácidos que no tiene más de 1,2, 3, 4, o 5 mutaciones relativas a la SEQ ID NO: 85.
[0064] En ciertos aspectos, la presente descripción proporciona una molécula de anticuerpo capaz de unirse virus del dengue, que comprende: (a) un segmento de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende:
un FW1 que comprende una deleción de la posición 26 con respecto a la SEQ ID NO: 33;
una CDR1 que comprende la secuencia DTYMS (SEQ ID NO: 14) (o una secuencia que no difiere en más de 1, 2 o 3 aminoácidos de la misma, opcionalmente siempre que T no haya cambiado), o una CDR1 que comprende la secuencia DVYMS (SEQ ID NO: 3) (o una secuencia que no difiera en más de, 1, 2 o 3 aminoácidos de la misma, opcionalmente siempre que V no cambie),
una CDR2 que comprende la secuencia RIDp En g Dt KYDPKLQG (SeQ ID NO: 4) (o una secuencia que no difiera en más de 1,2, 3, 4 o 5 aminoácidos de la misma, opcionalmente siempre que L no cambie), y una CDR3 que comprende la secuencia GWEGFAY (SEQ ID NO: 5) (o una secuencia que no se diferencia en más de 1, 2 o 3 aminoácidos de la misma); y
(b) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende:
una CDR1 que comprende la secuencia RASENVDKYGNSFMH (SEQ ID NO: 6) (o una secuencia que no difiere en más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos de la misma),
una CDR2 que comprende la secuencia RASELQW (SEQ ID NO: 7) (o una secuencia que no difiere en más de, 1, 2 o 3 aminoácidos de la misma), y
una CDR3 que comprende la secuencia QRSNEVPWT (SEQ ID NO: 8) (o una secuencia que no difiera en más de 1, 2 o 3 aminoácidos de la misma).
[0065] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo comprende una VH FW2 que tiene la WVRQAPGQGLEWMG secuencia (SEQ ID NO: 84), o una secuencia de aminoácidos no tener más de 1, 2, 3, 4, o 5 mutaciones comparación con la SEQ ID NO: 84. Como se describe en este documento, a veces la molécula de anticuerpo comprende un VH FW2 que tiene la secuencia WVRQAPEQGLEWMG (SEQ ID NO: 85), o una secuencia de aminoácidos que no tiene más de 1,2, 3, 4 o 5 mutaciones relativas a la SEQ ID NO: 85.
[0066] En ciertos aspectos, la presente descripción proporciona una molécula de anticuerpo, opcionalmente capaz de unirse virus del dengue, que comprende:
(a) un segmento de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende:
una CDR1 que comprende la secuencia DVYMS (SEQ ID NO: 3) (o una secuencia que no difiere en más de 1,2 o 3 aminoácidos de la misma, opcionalmente siempre que V no cambie), una CDR2 que comprende la secuencia RIDPENGDTKYDpKLQG (SEQ ID NO: 4) (o una secuencia que difiere en no más de, 1,2, 3, 4 o 5 aminoácidos de la misma, opcionalmente siempre que L no cambia), y una CDR3 que comprende la secuencia GWEGFAY (SEQ ID NO: 5) (o una secuencia que no difiere en más de 1, 2 o 3 aminoácidos de la misma), opcionalmente siempre que A sea reemplazado con I, K, D o E;
(b) un segmento de región variable de cadena ligera que comprende:
una CDR1 que comprende la secuencia RASENVDKYGNSFMH (SEQ ID NO: 6) (o una secuencia que no difiere en más de 1,2, 3, 4 o 5 aminoácidos de la misma), opcionalmente siempre que Y se reemplaza con F,
una CDR2 que comprende la secuencia RASELQW (SEQ ID NO: 7) (o una secuencia que no difiere en más de 1, 2 o 3 aminoácidos de la misma), y
una CDR3 que comprende la secuencia QRSNEVPWT (SEQ ID NO: 8) (o una secuencia que no difiere en más de 1, 2 o 3 aminoácidos de la misma).
[0067] Como se describe en el presente documento, a veces la cadena pesada CDR3 es GWEGFIY (SEQ ID NO: 90), GWEGFKY (SEQ ID NO: 91), GWEGFDY (SEQ ID NO: 92), o GWEGFEY (SEQ ID NO: 93). Como se describe en el presente documento, a veces la CDR1 de cadena ligera es RASENVDKFGNSFMH (SEQ ID NO: 94). Dicho de otra manera, a veces, la posición 105 de la cadena pesada, que es alanina en el anticuerpo A11, puede cambiarse a otro residuo, por ejemplo, una I, K, D o E. Como se describe en este documento, a veces, la posición 32 de la cadena ligera, que es tirosina en el anticuerpo A11, se cambia a otro residuo, p. ej., F. Como se describe en este documento, a veces, una mutación descrita en este párrafo mejora la afinidad de la molécula de anticuerpo por EDIII y/o su actividad de neutralización hacia una o más (o todas) cepas o serotipo del virus del dengue.
[0068] Como se describe en el presente documento, a veces, la molécula de anticuerpo comprende una VH FW1 que tiene la secuencia QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAGFNIK (SEQ ID NO: 11), o una secuencia de aminoácidos que tiene no más de 1,2, 3, 4, o 5 mutaciones en relación con SEQ ID NO: 11.
[0069] Como se describe en el presente documento, a veces, la molécula de anticuerpo comprende una VH FW2 que tiene la secuencia WVRQAPGQGLEWMG (SEQ ID NO: 84), o una secuencia de aminoácidos que no tiene más de 1, 2, 3, 4, o 5 mutaciones relativas a SEQ ID NO: 84. Como se describe en este documento, a veces, la molécula de anticuerpo comprende un VH FW2 que tiene la secuencia WVRQAPEQGLEWMG (SEQ ID NO: 85), o una secuencia de aminoácidos que no tiene más de 1,2, 3, 4, o 5 mutaciones relativas a la SEQ ID NO: 85.
[0070] La molécula de anticuerpo es capaz de unirse a virus del dengue EDIII (dominio de la proteína E III). Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo comprende una o más CDR que tienen la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOS: 3-8, 14 y 35 (o una secuencia que difiere en no más de, 1, 2 o 3 aminoácidos de las mismas). Por ejemplo, la molécula de anticuerpo puede comprender al menos dos, tres, cuatro, cinco, o seis CDR que tiene la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOS: 3-8, 14 y 35.
[0071] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo comprende un VH CDR1 de SEQ ID NO: 3 o 14, un VH CDR2 de SEQ ID NO: 4 o 35, un VH CDR3 de SEQ ID NO: 5, un VL CDR1 de SEQ ID NO: 6, un VL CDR2 de SEQ ID NO: 7, y un VL CDR3 de SEQ ID NO: 8. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo puede comprender un VH CDR1 de SEQ ID NO: 3, un VH CDR2 de SEQ ID NO: 4, un VH CDR3 de SEQ ID NO: 5, una VL CDR1 de la SEQ ID NO: 6, una VL CDR2 de la SEQ ID NO: 7, y una VL CDR3 de la SEQ ID NO: 8.
[0072] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos VH al menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, o 100% idéntica a SEQ ID NO: 1.
[0073] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos VH de al menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, o 100% idéntica a SEQ ID NO: 80.
[0074] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de VH al menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o 100% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO. 16­ 21, 24, 25, 27, 29, 31,32, 33, 36, 80 o 81. Como se describe en este documento, a veces la molécula de anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos VL de al menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, o 100% idéntica a s Eq ID NO: 2 o 34.
[0075] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo es un Fab, F(ab’)2, Fv, o un solo fragmento de cadena Fv (scFv). Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada seleccionada entre IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo comprende una región constante de cadena ligera elegida entre las regiones constantes de cadena ligera de kappa o lambda.
[0076] La molécula de anticuerpo puede ser una molécula de anticuerpo aislado y/o una molécula de anticuerpo humanizado. Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo contiene una o más regiones marco derivadas de una secuencia de línea germinal marco humana.
[0077] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo es capaz de unirse a virus del dengue EDIII con una constante de disociación (Kd) de menos de aproximadamente 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 8, 6, 4, 3, 2, 1,0,5, 0,2 ó 0,1 nM. La molécula de anticuerpo puede ser capaz de unirse al serotipo DV-4 EDIII del virus del dengue con una constante de disociación (Kd) de menos de aproximadamente 10, 8, 6, 5, 4 o 3 nM. La molécula de anticuerpo puede ser capaz de unirse al dominio DV-3 o DV-4 EDIII con al menos una afinidad 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 100, 1000 veces mayor que el anticuerpo A11 o el anticuerpo 4E11. La molécula de anticuerpo puede ser capaz de unirse a una cepa del virus del dengue elegida entre uno o más de DENV-4 BC2, DENV-4-Sing10, DENV-4 NewCa109, DENV-4 Phil56, DENV-3 Sing09, DENV-3 Nic10, DENV-3 H87, DENV-2 Peru95, DENV-2 Sing08, DENV-2 NGC, DENV-1 Hawaii/1944, DENV-2 Nueva Guinea/1944 (NGC), DENV-3 Filipinas/1956 (H87), DENV-4 México/1997 (BC287/97) y DENV-4 H241, con al menos 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 25, 50, 75, 100 o 1,000 veces mayor afinidad que anticuerpo A11 o anticuerpo 4E11. La molécula de anticuerpo puede ser capaz de neutralizar el virus del dengue en una prueba de neutralización por reducción de foco o una prueba relacionada para evaluar la neutralización de la actividad viral. La molécula de anticuerpo puede ser capaz de neutralizar el virus del dengue con una CI50 que sea al menos 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 50, 75 o 100 veces menor que el anticuerpo A11 o el anticuerpo 4E11 en una prueba de neutralización de reducción de foco o una prueba relacionada para evaluar la neutralización de la actividad viral.
[0078] En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende la molécula de anticuerpo de cualquiera de las formas de reivindicación anteriores y un portador farmacéuticamente aceptable, excipiente o estabilizador.
[0079] La presente descripción también proporciona, p. ej., un ácido nucleico que codifica la región variable del anticuerpo de cadena pesada o ligera de una molécula de anticuerpo como se describe aquí. La divulgación también proporciona, por ejemplo, un vector de expresión que comprende dicho ácido nucleico. La divulgación también proporciona, por ejemplo, una célula huésped que comprende dicho ácido nucleico. La presente divulgación proporciona adicionalmente, por ejemplo, un método para producir una molécula de anticuerpo o un fragmento de la misma como se describe en el presente documento, que comprende cultivar la célula huésped en condiciones adecuadas para la expresión génica.
[0080] En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un kit que comprende una molécula de anticuerpo como se describe aquí. El kit puede comprender un recipiente y el recipiente puede tener la molécula de anticuerpo dispuesta en el mismo. El kit también puede comprender un vehículo, excipiente o estabilizador farmacéuticamente aceptable, opcionalmente mezclado con la molécula de anticuerpo. El kit también puede comprender un dispositivo de administración, por ejemplo, uno que comprenda una jeringa o aguja. El kit también puede comprender instrucciones de uso.
[0081] En ciertos aspectos, la presente descripción proporciona un método de neutralización de virus del dengue, que comprende: poner en contacto el virus del dengue con una molécula de anticuerpo como se describe aquí. En algunas formas de realización, el virus del dengue es del serotipo DV-1, DV-2, DV-3 o DV-4.
[0082] La presente invención proporciona una molécula de anticuerpo, tal como se define en las formas de reivindicación, para uso en un método de tratamiento de una infección por el virus del dengue, que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una molécula de anticuerpo aislado como se describe en el presente documento, en una cantidad eficaz para tratar el virus. La molécula de anticuerpo, según se define en las formas de reivindicación, para su uso en un método de tratamiento o prevención del virus del dengue puede administrarse en combinación con un agente antivírico al sujeto, por ejemplo, un agente antivírico elegido entre uno o más de balapiravir, cloroquina, celgosivir, ivermectina o Carica folia. En determinadas formas de realización, el agente antivírico es una segunda molécula de anticuerpo antidengue, por ejemplo, una molécula de anticuerpo antidengue descrita en el presente documento diferente de una primera molécula de anticuerpo antidengue. En otras formas de realización, el agente antivírico se selecciona de un inhibidor de alfa-glucosidasa I (p. ej., celgosivir), un inhibidor de nucleósido de adenosina (p. ej., NITD008); un inhibidor de la ARN polimerasa dependiente de A r N (RdRp) (p. ej., NITD107), un inhibidor de la biosíntesis de pirimidina del huésped, p. ej., dihidroorotato deshidrogenasa del huésped (DHODH) (p. ej., NITD-982 y brequinar), un inhibidor de la proteína viral NS4B (p. ej., NITD-618) y un iminoazúcar (p. ej., UV-4). La molécula de anticuerpo, como se define en las formas de reivindicación, para su uso en un método de tratamiento o prevención del virus del dengue puede administrarse en combinación con una vacuna al sujeto, por ejemplo, una vacuna contra el virus del dengue. En algunas formas de realización, la administración de la molécula de anticuerpo es parenteral o intravenosa.
[0083] La divulgación también proporciona procedimientos profilácticos. La invención proporciona una molécula de anticuerpo, como se define en las formas de reivindicación, para su uso en un método de prevención de una infección por el virus del dengue administrando una molécula de anticuerpo como se describe en el presente documento a un sujeto que, en ese momento, no está infectado con el virus del dengue. Por ejemplo, en ciertos aspectos, la presente divulgación proporciona un método para reducir el riesgo de que un paciente contraiga el virus del dengue, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una molécula de anticuerpo aislada como se describe en el presente documento, en una cantidad eficaz para reducir el riesgo de contraer el virus del dengue. Por ejemplo, el riesgo de contraer el virus del dengue puede reducirse, por ejemplo, al menos en un 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o más. Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo se proporciona a un paciente que no está infectado con el virus del dengue, con el resultado de que si se produce la infección, el curso de la enfermedad es probable que sea más suave que el curso de la enfermedad en un paciente similares que no ha recibido la molécula de anticuerpo. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo puede reducir el riesgo de que se desarrolle la fiebre del dengue
(p. ej., es más probable que el paciente experimente una infección asintomática). El riesgo de desarrollar dengue puede reducirse, por ejemplo, en al menos un 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o más en comparación con un paciente que no recibió la molécula de anticuerpo. Como se describe en este documento, a veces se puede reducir el riesgo de que la fiebre del dengue progrese hacia el dengue hemorrágico, por ejemplo, en al menos un 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o más en comparación con un paciente que no recibió la molécula de anticuerpo.
[0084] La invención también proporciona una molécula de anticuerpo, tal como se define por las formas de reivindicación, para su uso en métodos para reducir o prevenir la transmisión del virus del dengue (p. ej., reducción o prevención de la transmisión entre un sujeto (p. ej., un humano) y un mosquito. En ciertas formas de realización, el sujeto está infectado con el virus del dengue. En otras formas de realización, el sujeto no está, en ese momento, infectado con el virus del dengue, pero tiene riesgo de infección viral del dengue. Por ejemplo, en ciertos aspectos, la presente divulgación proporciona una molécula de anticuerpo, como se define en las formas de reivindicación para su uso en un método para reducir o prevenir la transmisión del virus del dengue (p. ej., reducir o prevenir la transmisión del virus del dengue entre un sujeto (p. ej., un ser humano) y un mosquito), en el que la molécula de anticuerpo según se define en las formas de reivindicación se administra a un sujeto en una cantidad eficaz para reducir la transmisión del virus del dengue. Por ejemplo, la transmisión del virus del dengue, por ejemplo, de un sujeto a un mosquito, puede reducirse mediante, por ejemplo, a al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90%, en comparación con la transmisión de un sujeto que no recibió la molécula de anticuerpo, por ejemplo, como medido por un modelo de mosquito descrito en este documento. Como resultado, a veces, la transmisión del virus del dengue de un mosquito infectado a un sujeto no infectado (p. ej., un ser humano) puede reducirse aún más, p. ej., al menos alrededor del 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90%.
[0085] La invención proporciona un método de detección de virus del dengue en una muestra biológica, que comprende (i) poner en contacto la muestra o el sujeto (y opcionalmente, una muestra de referencia o sujeto) con una molécula de anticuerpo tal como se define por las formas de reivindicación en condiciones que permitan que se produzca la interacción de la molécula de anticuerpo y el polipéptido, y (ii) detectar la formación de un complejo entre la molécula de anticuerpo y la muestra o el sujeto (y opcionalmente, la muestra de referencia o el sujeto).
[0086] En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona una molécula de anticuerpo antidengue que comprende una región VH que tiene una deleción de la posición 26 con relación a la VH de anticuerpo A11. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo antidengue de la reivindicación puede tener una región VH con entre aproximadamente 1 -30, 5-30, 10-30, 15-30 o 20-25 mutaciones con respecto a un VH del anticuerpo A11.
[0087] En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona una molécula de anticuerpo capaz de unirse a virus del dengue, que comprende una VH CDR1 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 3, o una secuencia de aminoácidos que no tiene más de 1,2, 3, 4, 5, 10 o 15 mutaciones con respecto a SEQ ID NO: 3. Como se describe en el presente documento, a veces las mutaciones son sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras.
[0088] En ciertos aspectos, la presente divulgación proporciona una molécula de anticuerpo capaz de unirse a virus del dengue, que comprende un FW1 VH que tiene la secuencia QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAGFNIK (SEQ ID NO: 11), o una secuencia de aminoácidos que tiene no más de 1,2, 3, 4, 5, 10 o 15 mutaciones con respecto a SEQ ID NO: 11. Como se describe en el presente documento, a veces las mutaciones se seleccionan independientemente de deleciones y sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras. Una molécula de anticuerpo de este párrafo también puede tener las características descritas a lo largo de esta solicitud, por ejemplo, en el párrafo anterior.
[0089] En algunos aspectos, la presente descripción proporciona moléculas de anticuerpo capaz de unirse a virus del dengue, que comprende una VH CDR2 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 4, o una secuencia de aminoácidos no tener más de 1, 2, 3, 4, 5, 10 o 15 mutaciones con respecto a SEQ ID NO: 4. Como se describe en el presente documento, a veces, las mutaciones son sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservativas. Una molécula de anticuerpo de este párrafo también puede tener las características descritas a lo largo de esta solicitud, por ejemplo, en los dos párrafos anteriores.
[0090] En ciertos aspectos, la presente divulgación proporciona una molécula de anticuerpo capaz de unirse a virus del dengue, que comprende una VH FW2 que tiene la secuencia WVRQAPGQGLeW m G (SEQ ID NO: 84) o WVRQAPEQGLEWMG (SEQ ID NO: 85), o un aminoácido secuencia que no tiene más de 1,2, 3, 4, 5 o 10 mutaciones con respecto a SEQ ID NO: 84 o SEQ ID NO: 85. Como se describe en el presente documento, a veces las mutaciones se seleccionan independientemente de deleciones y sustituciones, p. ej., sustituciones conservadoras. Una molécula de anticuerpo de este párrafo también puede tener las características descritas a lo largo de esta solicitud, por ejemplo, en el párrafo anterior.
[0091] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo es capaz de unirse a EDIII de dos o más, por ejemplo, tres o cuatro serotipos del virus del dengue, por ejemplo, seleccionados de DV-1, DV-2, DV-3, y DV-4, con una constante de disociación (Kd) de menos de aproximadamente 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 8, 6, 4, 3, 2, 1,0,5, 0,2, 0,1,0,05, o 0,01 nM para cada uno de dichos dos o más serotipos.
[0092] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo tiene una región variable que es idéntica en secuencia, o que difiere en 1, 2, 3, o 4 aminoácidos a partir de una región variable descrita en este documento (p. ej., una región FR descrita en este documento).
[0093] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue es un anticuerpo completo o un fragmento del mismo (p. ej., un Fab, F(ab’)2, Fv, o un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv)). Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo con especificidad única. La molécula de anticuerpo antidengue también puede ser una molécula de anticuerpo humanizado, quimérico, camélido, de tiburón, o in vitro. Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue del mismo es una molécula de anticuerpo humanizado. Las cadenas pesada y ligera de la molécula de anticuerpo antidengue pueden ser de longitud completa (p. ej., un anticuerpo puede incluir al menos una o al menos dos cadenas pesadas completas y al menos una o al menos dos cadenas ligeras completas) o puede incluir un fragmento de unión a antígeno (p. ej., un Fab, F(ab’)2, Fv, un fragmento Fv de cadena sencilla, un anticuerpo de dominio único, un diacuerpo (dAb), un anticuerpo bivalente o biespecífico o un fragmento del mismo, una variante de dominio del mismo, o un anticuerpo de camélido).
[0094] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue tiene una región constante de cadena pesada (Fc) elegida entre, por ejemplo, las regiones constantes de la cadena pesada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, e IgE; particularmente, elegidas entre, por ejemplo, las regiones constantes de cadena pesada de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, más particularmente, la región constante de cadena pesada de IgG1 o IgG2 (p. ej., IgG1 o IgG2 humana). Como se describe en el presente documento, a veces la región constante de la cadena pesada es IgG1 humana. Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue tiene una región constante de cadena ligera elegida entre, por ejemplo, las regiones constantes de cadena ligera de kappa o lambda, a veces kappa (p. ej., kappa humano). Como se describe en este documento, a veces la región constante se altera, p. ej., muta, para modificar las propiedades de la molécula de anticuerpo antidengue (p. ej., para aumentar o disminuir uno o más de: unión al receptor Fc, glicosilación del anticuerpo, el número de residuos de cisteína, función de la célula efectora o función del complemento). Por ejemplo, la región constante puede estar mutada en las posiciones 234 (p. ej., L a A), 235 (p. ej., L a A), 296 (p. ej., M a Y), 297 (p. ej., N a A o G o Q), 298 (p. ej., S a T), 300 (p. ej., T a E), 477 (p. ej., H a K) y 478 (p. ej., N a F) para alterar la unión al receptor de Fc.
[0095] La molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo humanizado.
[0096] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo está aislada o recombinante.
[0097] Como se describe en el presente documento, a veces las moléculas de anticuerpo antidengue comprenden combinaciones de regiones de marco humanas o humanizadas con CDR (regiones determinantes de la complementariedad).
[0098] La presente descripción también proporciona ácidos nucleicos que comprende secuencias de nucleótidos que codifican las regiones variables de cadena ligera y pesada y las CDR de las moléculas de anticuerpo antidengue, como se describe en el presente documento. Por ejemplo, la divulgación proporciona un primer y un segundo ácido nucleico que codifica regiones variables de cadena pesada y ligera, respectivamente, de una molécula de anticuerpo antidengue de acuerdo con la Tabla 1, por ejemplo, D88, A48, F38, F108 o C88, o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma. Por ejemplo, el ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de anticuerpo antidengue de acuerdo con la Tabla 1, p. ej., D88, A48, F38, F108 o C88, o una secuencia sustancialmente idéntica a esa secuencia de nucleótidos (p. ej., una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, o que difiera en no más de 3, 6, 15, 30 o 45 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos antes mencionada). Como se describe en este documento, a veces el ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una, dos o tres CDR de una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente homóloga a la misma (p. ej., una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o que tiene una, dos, tres o más sustituciones, inserciones o deleciones, por ejemplo, sustituciones conservadas). Como se describe en este documento, a veces el ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una, dos o tres CDR de una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente homóloga a la misma (p. ej., una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o que tiene una, dos, tres o más sustituciones, inserciones o deleciones, por ejemplo, sustituciones conservadas). Como se describe en este documento, a veces el ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR de regiones variables de cadena pesada y ligera que tienen una secuencia de aminoácidos como se establece en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente homóloga a la misma (p. ej., una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o que tiene una, dos, tres o más mutaciones (p. ej., sustituciones, inserciones o deleciones, p. ej., sustituciones conservadas). Como se describe en este documento, a veces un ácido nucleico que tiene una característica estructural discutida en este párrafo codifica una molécula de anticuerpo o una porción de la misma que tiene una o más propiedades ventajosas tales como una afinidad mejorada (p. ej., en relación con A11) para la actividad de neutralización hacia el virus del dengue, por ejemplo, DV-4. Como se describe en este documento, a veces la propiedad ventajosa es una propiedad de la Lista 1, por ejemplo, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x).
[0099] Esta descripción también proporciona secuencias de ácidos nucleicos, p. ej., un ácido nucleico que se hibrida con una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo de la Tabla 1, por ejemplo, D88, A48, F38, F108, o C88, y su complemento, por ejemplo, bajo rigurosidad baja, rigurosidad media o rigurosidad alta, u otra condición de hibridación descrita en el presente documento. Esta solicitud también describe secuencias de ácido nucleico de la Tabla 4 y sus complementos, por ejemplo, bajo rigurosidad baja, rigurosidad media o rigurosidad alta, u otra condición de hibridación descrita en el presente documento. Como se describe en este documento, a veces el ácido nucleico es al menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% o superior idéntico a una secuencia de la Tabla 4, su complemento o una porción de cualquiera de las secuencias antes mencionadas. Como se describe en el presente documento, a veces un ácido nucleico que tiene una característica estructural discutida en este párrafo codifica una molécula de anticuerpo o una porción de la misma que tiene una o más propiedades ventajosas tales como una afinidad mejorada (p. ej., en relación con A11) o una actividad de neutralización hacia el virus del dengue, por ejemplo, DV-4. Como se describe en este documento, a veces la propiedad ventajosa es una propiedad de la Lista 1, por ejemplo, una o más (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o todas) de las propiedades (a), (b), (c), (d), (e), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s), (t), (u), (v), (w) o (x).
[0100] En ciertos aspectos, esta divulgación presenta células huésped y los vectores que contienen los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en un solo vector o en vectores separados presentes en la misma célula huésped o en una célula huésped separada. La célula huésped puede ser una célula eucariota, por ejemplo, una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula de levadura o una célula procariota, por ejemplo, E. coli. Por ejemplo, la célula de mamífero puede ser una célula cultivada o una línea celular. Las células de mamífero ejemplares incluyen células humanas, por ejemplo, células HEK293, líneas de células linfocíticas (p. ej., NS0), células de ovario de hámster chino (CHO), células COS, células de ovocitos y células de un animal transgénico.
[0101] En algunos aspectos, la presente descripción proporciona un método para proporcionar una molécula de anticuerpo descrito en este documento. El método puede incluir: proporcionar una molécula de anticuerpo que se una específicamente a un antígeno EDIII; realizar una o más mutaciones en el anticuerpo (p. ej., en la región constante, marco y/o CDR) y evaluar si la molécula de anticuerpo se une específicamente al antígeno EDIII, o evaluar la eficacia de la molécula de anticuerpo para inhibir la función del virus del dengue. El método puede incluir además purificar la molécula de anticuerpo. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo puede purificarse mediante una o más etapas de cromatografía que comprenden, por ejemplo, cromatografía de afinidad, por ejemplo, cromatografía de proteína A. El método puede incluir además administrar la molécula de anticuerpo a un sujeto, por ejemplo, un ser humano o un animal no humano.
[0102] La invención proporciona composiciones, p. ej., las composiciones farmacéuticas, que incluyen un vehículo farmacéuticamente aceptable, excipiente o estabilizador, y al menos una de las moléculas de anticuerpo antidengue tal como se define por las formas de reivindicación. Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo se conjuga con un marcador o un agente terapéutico. Como se describe en el presente documento, a veces las composiciones, por ejemplo, las composiciones farmacéuticas comprenden una combinación de la molécula de anticuerpo y un segundo agente, por ejemplo, un agente terapéutico, o dos o más de las moléculas de anticuerpo mencionadas anteriormente, como se describe adicionalmente en el presente documento.
[0103] Las moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento pueden inhibir una o más actividades de virus del dengue. Por ejemplo, las moléculas de anticuerpo pueden alterar la estructura nativa de la proteína E en la superficie del virión, por ejemplo, provocando la inactivación del virus. Como resultado, la molécula de anticuerpo puede neutralizar el virus, inhibir su capacidad para entrar en una célula huésped o reducir la estabilidad viral. Como se describe en este documento, a veces, una molécula de anticuerpo neutraliza el virus del dengue (p. ej., en una prueba de neutralización por reducción de enfoque o una prueba relacionada para evaluar la neutralización de la actividad viral) con una c E50 o FRNT50 menor o igual a 1400, 1000, 800, 600., 550, 500, 450, 400, 350, 300, 350, 200, 150, 100, 50 o 25 ng/ml. Como se describe en este documento, a veces el anticuerpo neutraliza el virus del dengue (p. ej., en una prueba de neutralización por reducción de enfoque o una prueba relacionada para evaluar la neutralización de la actividad viral) con una CI50 menor o igual a 20, 17,6, 15, 10, 5, 4, 2, 1,4, 1 o 0,50 pg/mL. Como se describe en el presente documento, a veces se prueba la neutralización de DV-4 y, a veces, se prueba la neutralización de uno de DV-1, DV-2 o DV-3.
[0104] El sujeto puede ser un mamífero, p. ej., un mono, un primate, preferiblemente un primate superior, por ejemplo, un ser humano (p. ej., un paciente que tiene, o está en riesgo de tener, virus del dengue).
[0105] Esta descripción también proporciona una molécula de anticuerpo tal como se define por las formas de reivindicación para su uso en un método de tratamiento de virus del dengue en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una molécula de anticuerpo antidengue descrita en este documento, por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula de anticuerpo antidengue, o una porción de la misma que se une al antígeno. En algunas formas de realización, la molécula de anticuerpo antidengue, como se define en las formas de reivindicación, para su uso en un método de tratamiento del virus del dengue en un sujeto se administra a un paciente que padece el virus del dengue, lo que da como resultado la reducción de la carga viral y/o la reducción
de al menos un síntoma, por ejemplo, seleccionado entre fiebre repentina, dolor de cabeza, dolores musculares y articulares, pérdida de peso, penetración del sistema nervioso central y/o erupción. En algunas formas de realización, la molécula de anticuerpo antidengue, tal como se define en las formas de reivindicación, para su uso en un método de prevención del virus del dengue en un sujeto se administra a un paciente con riesgo de infección por el virus del dengue, lo que reduce el riesgo de infectarse o reducir la gravedad de la infección si ocurre la infección.
[0106] La molécula de anticuerpo antidengue se puede administrar al sujeto sistémicamente (p. ej., por vía oral, parenteral, subcutánea, intravenosa, rectal, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, transdérmica o por inhalación o instalación intracavitaria), por vía tópica, o por aplicación a las membranas mucosas, como la nariz, la garganta y los bronquios.
[0107] Las composiciones descritas en este documento pueden usarse en combinación con otras modalidades terapéuticas. En algunas formas de realización, la molécula de anticuerpo definida por las formas de reivindicación para su uso en un método de tratamiento o prevención del virus del dengue puede administrarse al sujeto en combinación con un segundo tratamiento o profiláctico para el virus del dengue, en una cantidad eficaz para tratar o prevenir dicho trastorno. La molécula de anticuerpo y el segundo agente se pueden administrar de forma simultánea o secuencial.
[0108] Cualquier combinación y secuencia de las moléculas de anticuerpo antidengue y otras modalidades terapéuticas pueden ser utilizadas. La molécula de anticuerpo antidengue y/u otras modalidades terapéuticas se pueden administrar durante períodos de infección activa, o durante un período de remisión o enfermedad menos activa. La molécula de anticuerpo antidengue y otras modalidades terapéuticas se pueden administrar antes del tratamiento, al mismo tiempo que el tratamiento, después del tratamiento o durante la remisión de la infección.
[0109] La presente invención proporciona métodos para detectar la presencia del virus del dengue en una muestra, por ejemplo, in vitro o in vivo (p. ej., una muestra biológica, por ejemplo, sangre o suero). Los métodos de la presente pueden usarse para evaluar (p. ej., controlar el tratamiento o la progresión, diagnosticar y/o estadificar un trastorno descrito en la presente, por ejemplo, el virus del dengue, en un sujeto). El método puede incluir: (i) poner en contacto la muestra con (y opcionalmente, una referencia, por ejemplo, una muestra de control), o la administración al sujeto, una molécula de anticuerpo antidengue como se describe en el presente documento, en condiciones que permiten la interacción que se produzca y (ii) detectar si hay formación de un complejo entre la molécula de anticuerpo y la muestra (y opcionalmente, la muestra de referencia, por ejemplo, de control). La formación del complejo es indicativa de la presencia del virus del dengue y puede indicar la idoneidad o necesidad de un tratamiento descrito en este documento. El método puede implicar, por ejemplo, una inmunohistoquímica, inmunocitoquímica, FACS, perlas magnéticas complejadas con moléculas de anticuerpo, ensayos ELISA o técnicas de PCR (p. ej., RT-PCR).
[0110] Típicamente, la molécula de anticuerpo antidengue utilizado en los métodos de diagnóstico in vivo y in vitro está directa o indirectamente marcada con una sustancia detectable para facilitar la detección del agente de unión unido o no unido. Las sustancias detectables adecuadas incluyen diversas enzimas biológicamente activas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales paramagnéticos (p. ej., activos por resonancia magnética nuclear) y materiales radiactivos.
[0111] La invención proporciona kits de diagnóstico o terapéuticos que incluyen las moléculas de anticuerpo antidengue descritas en el presente documento e instrucciones para su uso.
[0112] Figuras y Tablas se proporcionan con la presente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0113] Cada una de las figuras se describe aquí con más detalle.
Las Figuras 1A-1I muestran las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de varios anticuerpos antidengue EDIII. Los CDR de Kabat están subrayados y ciertos residuos de interés están encuadrados (mostrados con un fondo gris en los documentos de prioridad).
La Figura 2 representa los resultados de una prueba de neutralización por reducción de foco usando virus vivo que muestra que el anticuerpo B11 mejora tras la neutralización de mAb A11 de DV4.
La Figura 3 muestra un ensayo repetido de anticuerpos A11 y B11 que neutralizan DV4.
La Figura 4 es una evaluación funcional de los marcos de varios anticuerpos EDIII humanizados.
La Figura 5 muestra la afinidad del anticuerpo tras las mutaciones inversas del extremo N-terminal de los anticuerpos antidengue. FW "04" de cadena pesada se refiere a un tipo de estructura que tiene la misma secuencia de aminoácidos de estructura de cadena pesada que, por ejemplo, mAb B48. La cadena ligera FW "08" se refiere a un tipo de marco que tiene la misma secuencia de aminoácidos del marco de cadena ligera que, por ejemplo, mAb B48. Las secuencias marco de cadena pesada y ligera de mAb B48 se muestran en las Tablas 1 y 2.
La Figura 6 muestra que la combinación de ciertas mutaciones puntuales conduce a una afinidad mejorada por EDIII. La cadena ligera FW "08" se refiere a un tipo de marco que tiene la misma secuencia de aminoácidos del marco de cadena ligera que, por ejemplo, mAb D88. La secuencia del marco de la cadena ligera del mAb D88 se muestra en las Tablas 1 y 2.
La Figura 7 muestra los resultados de establecer la posición 98 en A, V o S en combinación con otras mutaciones.
La Figura 8 muestra los resultados del ELISA de competición para determinar la afinidad de unión a EDIII de anticuerpos seleccionados.
La Figura 9 muestra la unión de anticuerpos antidengue seleccionados a EDIII de cuatro serotipos del virus del dengue.
La Figura 10A resume la relación filogenética de las secuencias de aminoácidos de EDIII de aislados seleccionados del virus del dengue. "DENV" es una abreviatura de virus del dengue y DENV-2 representa el serotipo DV-2, DENV-3 representa el serotipo DV-3 y DENV-4 representa el serotipo DV-4.
La Figura 10B muestra la unión del anticuerpo D88 a un panel de diversos aislados del virus del dengue. * indica la cepa utilizada para las pruebas de neutralización in vitro.
La Figura 11 muestra la afinidad de anticuerpos antidengue seleccionados por diversas cepas del virus del dengue.
La Figura 12 muestra la capacidad de varios anticuerpos antidengue para neutralizar el serotipo DV-4 del virus del dengue en una prueba de neutralización por reducción de foco.
La Figura 13 muestra la capacidad de varios anticuerpos antidengue para neutralizar el serotipo DV-3 del virus del dengue en una prueba de neutralización por reducción de foco. En esta prueba se utilizó DV-3 H87. La Figura 14 muestra la capacidad de varios anticuerpos antidengue para neutralizar el serotipo DV-4 del virus del dengue en una prueba de neutralización por reducción de foco.
Las Figuras 15A-15C muestran la estabilidad térmica de anticuerpos antidengue seleccionados basándose en un ensayo de análisis de desplazamiento térmico (Sypro Orange).
La Figura 16 muestra el efecto del anticuerpo D88 sobre la supervivencia de ratones infectados con el virus del dengue en un modelo de ratón AG129.
La Figura 17 muestra el efecto del anticuerpo D88 sobre el cambio de peso de ratones infectados con el virus del dengue en un modelo de ratón AG129.
La Figura 18 muestra el efecto del anticuerpo D88 sobre la viremia en ratones infectados con el serotipo 2 del virus del dengue (cepa NGC) en un modelo de ratón AG129.
La Figura 19 muestra la capacidad del anticuerpo D88 para neutralizar los serotipos del virus del dengue DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4 propagados en células de insecto C6/36 en una prueba de neutralización por reducción de foco (FRNT).
La Figura 20 muestra la capacidad del anticuerpo D88 para neutralizar los serotipos del virus del dengue DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4 propagados en células Vero (mono) en una prueba de neutralización por reducción de foco (FRNT).
La Figura 21 muestra la capacidad del anticuerpo D88 y A11 para neutralizar el virus del dengue DENV-4 cepa H241 propagado en células Vero (mono) en una prueba de neutralización por reducción de foco (FRNT).
La Figura 22 muestra la propensión a la agregación de los anticuerpos A48, C88 y D88 según se evaluó mediante cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento (HP-SEC).
La Figura 23 representa la ganancia de afinidad del anticuerpo D88 por DENV-4 con una afinidad mejorada concurrente por DENV-1, DENV-2 y DENV-3 en comparación con el anticuerpo 4E11.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS TABLAS
[0114] Cada una de las Tablas se describe aquí con más detalle.
La Tabla 1 resume las secuencias de ejemplos de anticuerpos antidengue.
La Tabla 2 representa las secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada y las secuencias del dominio variable de la cadena ligera de la Tabla 1. Las CDR de Kabat están subrayadas, las CDR de Chothia en cursiva y ciertos residuos de interés se muestran con un fondo gris.
La Tabla 3 representa las secuencias de aminoácidos de las CDR de la Tabla 1.
La Tabla 4 resume las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la Tabla 1.
La Tabla 5 representa las secuencias de ácidos nucleicos resumidas en la Tabla 4.
La Tabla 6 representa las secuencias de aminoácidos adicionales descritas en la solicitud.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0115] En el presente documento se describen moléculas de anticuerpo que se unen a epítopos del virus del dengue, por ejemplo, EDIII, con alta afinidad y especificidad. Ventajosamente, varias de las moléculas de anticuerpo de la presente se unen con alta afinidad a EDIII de los serotipos del virus del dengue DV-1, DV-2, DV-3 y DV-4. También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de anticuerpo, vectores de expresión, células huésped y métodos para preparar las moléculas de anticuerpo. Las moléculas de anticuerpo antidengue descritas en este documento se pueden usar (solas o en combinación con otros agentes o modalidades terapéuticas) para tratar, prevenir y/o diagnosticar el virus del dengue, por ejemplo, DV-1, DV-2, DV-3 o DV-4. Como se usa en este documento, DV-1, dV-2, DV-3 y DV-4 a veces se denominan De NV-1 , De Nv -2, De NV-3 y DENV-4, respectivamente.
Definiciones
[0116] Como se usa en este documento, los artículos "un" y "una" se refieren a uno o más de uno (p. ej., al menos uno) del objeto gramatical del artículo.
[0117] El término "o" se utiliza aquí para significar, y se utiliza de forma intercambiable con el término "y/o", a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
[0118] "Acerca de" y "aproximadamente" significa en general un grado aceptable de error para la cantidad medida dada la naturaleza o precisión de las mediciones. Los grados de error ejemplares están dentro del 20 por ciento (%), típicamente, dentro del 10%, y más típicamente, dentro del 5% de un valor o rango de valores dado.
[0119] Las composiciones y métodos descritos en el presente documento abarcan polipéptidos y ácidos nucleicos que tienen las secuencias especificadas, o secuencias sustancialmente idénticas o similares a los mismos, p. ej., las secuencias de al menos 85%, 90%, 95% idéntica o superior a la secuencia especificada. En el contexto de una secuencia de aminoácidos, el término "sustancialmente idéntico" se usa aquí para referirse a un primer aminoácido que contiene un número suficiente o mínimo de residuos de aminoácidos que son i) idénticos a, o ii) sustituciones conservativas de residuos alineados de aminoácidos en una segunda secuencia de aminoácidos de manera que las secuencias primera y segunda de aminoácidos pueden tener un dominio estructural común y/o una actividad funcional común. Por ejemplo, secuencias de aminoácidos que contienen un dominio estructural común que tiene al menos aproximadamente 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con una secuencia de referencia, por ejemplo, una secuencia proporcionada en este documento.
[0120] En el contexto de la secuencia de nucleótidos, la expresión "sustancialmente idéntica" se usa aquí para referirse a una primera secuencia de ácido nucleico que contiene un número suficiente o mínimo de nucleótidos que son idénticos a los nucleótidos alineados en una segunda secuencia de ácido nucleico de tal manera que las secuencias primera y segunda de nucleótidos codifican un polipéptido que tiene una actividad funcional común, o codifican un dominio polipeptídico estructural común o una actividad polipeptídica funcional común. Por ejemplo, secuencias de nucleótidos que tienen al menos aproximadamente 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con una secuencia de referencia, p. ej., una secuencia proporcionada en este documento.
[0121] El término "variante funcional" se refiere a polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácido sustancialmente idéntica a la secuencia de origen natural, o son codificados por una secuencia de nucleótidos sustancialmente idénticas, y que son capaces de tener una o más actividades de la secuencia de origen natural.
[0122] Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos, o de dos secuencias de ácidos nucleicos, las secuencias se alinean con fines de comparación óptimos (p. ej., se pueden introducir espacios en uno o ambos de un primer y un segundo aminoácido o la secuencia de ácido nucleico para una alineación óptima y las secuencias no homólogas pueden descartarse para fines de comparación). La longitud de una secuencia de referencia alineada con fines de comparación puede ser al menos el 30%, por ejemplo, al menos el 40%, 50%, 60%, por ejemplo, al menos el 70%, 80%, 90%, 100% de la longitud de la secuencia de referencia. A continuación, se comparan los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición.
[0123] El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para la alineación óptima de las dos secuencias.
[0124] La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede lograr utilizando un algoritmo matemático. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48: 444-453) que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1,2, 3, 4, 5 o 6. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar usando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz NWSgapdna.CMP y un espacio un peso de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1,2, 3, 4, 5 o 6. Un conjunto adecuado de parámetros (y el que debe usarse a menos que se especifique lo contrario) es un matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización por hueco de 12, una penalización de extensión de hueco de 4, y una penalización de hueco de desplazamiento de marco de 5.
[0125] El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller ((1989) CABIOS, 4:11-17) que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4.
[0126] Las secuencias de ácido nucleico y proteínas descritas en este documento pueden ser utilizadas como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda contra bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Estas búsquedas se pueden realizar utilizando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden realizar con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a un ácido nucleico como se describe en el presente documento. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteínas descritas en el presente documento. Para obtener alineaciones con huecos con fines de comparación, BLAST con huecos se puede utilizar como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Cuando se utilizan programas BLAST y BLAST con huecos, se pueden utilizar los parámetros predeterminados de los programas respectivos (p. ej., XBLAST y NBLAST). Consulte www.ncbi.nlm.nih.gov.
[0127] Como se usa en este documento, el término "híbrida en condiciones de baja rigurosidad, rigurosidad media, alta rigurosidad o condiciones de astringencia muy alta" describe condiciones para hibridación y lavado. Puede encontrarse orientación para realizar reacciones de hibridación en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6. Los métodos acuosos y no acuosos se describen en esa referencia y se pueden utilizar. Las condiciones de hibridación específicas a las que se hace referencia en este documento son las siguientes: 1) condiciones de hibridación de baja rigurosidad en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 6X a aproximadamente 45°C, seguido de dos lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1% al menos a 50°C (la temperatura de los lavados se puede aumentar a 55°C para condiciones de baja rigurosidad); 2) condiciones de hibridación de rigurosidad media en 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguido de uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 60°C; 3) condiciones de hibridación de alta rigurosidad en 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguido de uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 65°C; y preferiblemente 4) las condiciones de hibridación muy rigurosas son fosfato de sodio 0,5 M, SDS al 7% a 65°C, seguido de uno o más lavados a SSC 0,2X, SDS al 1% a 65°C. Las condiciones de rigurosidad muy alta (4) son condiciones adecuadas y las que deben utilizarse a menos que se especifique lo contrario.
[0128] Se entiende que las moléculas descritas en el presente documento pueden tener sustituciones de aminoácidos conservativas o no esenciales adicionales, que no tienen un efecto sustancial en sus funciones.
[0129] Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una en la que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas básicas laterales (p. ej., la lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales apolares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta ramificadas (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).
[0130] Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" (si sola cadena) se utilizan indistintamente en este documento.
[0131] Los términos "ácido nucleico", "secuencia de ácido nucleico", "secuencia de nucleótidos", o "secuencia de polinucleótido" y "polinucleótido" se usan indistintamente.
[0132] El término "aislado", como se usa aquí, se refiere a material que se retira de su entorno original o nativo (p. ej., El entorno natural si es de origen natural). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido de origen natural presente en un animal vivo no se aísla, pero se aísla el mismo polinucleótido o polipéptido, separado por intervención humana de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural. Dichos polinucleótidos podrían ser parte de un vector y/o tales polinucleótidos o polipéptidos podrían ser parte de una composición y aún estar aislados en el sentido de que dicho vector o composición no es parte del entorno en el que se encuentra en la naturaleza.
[0133] Como se usa en este documento, el término "tratar", por ejemplo, una infección de virus del dengue, significa que un sujeto (p. ej., un ser humano) que ha sido infectado con un virus y experimenta síntomas del virus, a veces, experimentará síntomas menos graves y/o se recuperará más rápido cuando se administra la molécula de anticuerpo que si el anticuerpo nunca se administrara. Como se describe en el presente documento, a veces, cuando se trata una infección, un ensayo para detectar virus en el sujeto detectará menos virus después de un tratamiento eficaz para la infección. Por ejemplo, un ensayo de diagnóstico que usa una molécula de anticuerpo, tal como una molécula de anticuerpo descrita en este documento, detectará menos o ningún virus en una muestra biológica de un paciente después de la administración de una molécula de anticuerpo para el tratamiento eficaz de la infección. También se pueden usar otros ensayos, tales como PCR (p. ej., qPCR) para controlar el tratamiento en un paciente, para detectar la presencia, por ejemplo, presencia disminuida (o ausencia) después del tratamiento de la infección viral en el paciente. El tratamiento puede, por ejemplo, aliviar, mejorar, aliviar, inhibir, reducir la gravedad y/o reducir la incidencia parcial o completamente y, opcionalmente, retrasar la aparición de una o más manifestaciones de los efectos o síntomas, características y/o causas de una enfermedad, trastorno y/o afección particular (p. ej., virus del dengue). Como se describe en el presente documento, a veces el tratamiento es de un sujeto que no muestra ciertos signos de la enfermedad, trastorno y/o condición relevante y/o de un sujeto que exhibe solo los primeros signos de la enfermedad, trastorno y/o condición. Como se describe en el presente documento, a veces se trata de un sujeto que exhibe uno o más signos establecidos de la enfermedad, trastorno y/o afección relevante. Como se describe en el presente documento, a veces el tratamiento es de un sujeto diagnosticado con el virus del dengue.
[0134] Como se usa en este documento, el término "prevenir", p. ej., una infección de virus del dengue, significa que es menos probable que un sujeto (p. ej., un ser humano) sea infectado por un virus (p. ej., virus del dengue) si el sujeto recibe el anticuerpo antes (p. ej., 1 día, 2 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas o 1 mes o más) de estar expuesto al virus.
[0135] Como se usa en este documento, los términos "marco", "FW" y "FR" se usan de forma intercambiable y tienen un significado idéntico en este documento y sus documentos de prioridad.
[0136] Varios aspectos de las composiciones y métodos se describen en este documento en más detalle a continuación. Se establecen definiciones adicionales a lo largo de la especificación.
Moléculas de anticuerpos antidengue
[0137] Se describen secuencias ejemplares de anticuerpos antidengue en las Tablas 1-4 a continuación.
Tabla 1. Resumen de las secuencias de aminoácidos de ejemplos de anticuerpos antidengue.
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(Continuación)
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(Continuación)
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(Continuación)
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[0138] A11 y B11 son anticuerpos de ratón y los otros anticuerpos de la Tabla 1 son anticuerpos humanizados.
Tabla 2. Representación de las secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada y las secuencias del dominio variable de la cadena ligera de la Tabla 1. Las CDR, definidas según el sistema Kabat, están subrayadas y en negrita, mientras que las CDR definidas según el sistema Chothia están en cursiva. Algunos residuos de interés se muestran con un fondo gris. Las eliminaciones se indican con un símbolo de intercalación (A).
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(Continuación)
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(Continuación)
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[0139] A lo largo de esta solicitud, se hace referencia a posiciones de aminoácidos basadas en la región variable del anticuerpo de ratón A11. La región variable del anticuerpo de ratón B11 tiene una deleción en la posición 26 con respecto a A11. Las secuencias de la región variable humana en la Tabla 1 tienen una deleción de la secuencia del ácido glutámico en la posición 6 de A11. En consecuencia, las secuencias que llevan una eliminación relativa a A11 utilizan un sistema de numeración que está desplazado. Por ejemplo, la cadena pesada de A48 tiene una deleción de la secuencia de ácido glutámico en la posición 6 con respecto a A11. Como resultado, la posición 26 (una serina) de A48 VH es en realidad el vigésimo quinto aminoácido de la secuencia A48 VH (SEQ ID NO: 16). Como otro ejemplo, la cadena pesada D88 tiene una deleción de la secuencia de ácido glutámico en la posición 6 de A11 y una deleción de la serina en la posición 26 con respecto a A11. Como consecuencia, la posición 33 (una valina) de D88 VH es en realidad el trigésimo primer aminoácido de la secuencia de D88 VH (SEQ ID NO: 1).
[0140] Algunas de las características estructurales de los anticuerpos se pueden observar en base a las secuencias de VH y VL en la Tabla 2. B11 tiene una deleción en la posición 26 con relación a la región A11 VH. D88 es un anticuerpo humanizado que tiene una deleción en la posición 26 y una mutación de T33V en relación con la región VH de A48 (siendo consistente con la numeración A11). F38 es un anticuerpo humanizado que tiene una deleción en la posición 26 y mutaciones T33V y E43G en relación con la región A48 VH. A48 es un anticuerpo humanizado con las mismas CDR que A11. C88 es un anticuerpo humanizado que tiene una mutación T33V relativa a la región A48 VH. F108 es un anticuerpo humanizado que tiene mutaciones T33V y E43G en relación con la región A48 VH. B48 es un anticuerpo humanizado que tiene una deleción en la posición 26 con respecto a la región VH de A48. A68 es un anticuerpo humanizado que tiene una mutación A98V relativa a la región A48 VH. A100 es un anticuerpo humanizado que tiene una mutación A98S relativa a la región A48 VH. C58 es un anticuerpo humanizado que tiene mutaciones G27Y y F28W en relación con la región VH de A48. C78 es un anticuerpo humanizado que tiene mutaciones K31Q y T33V en relación con la región VH de A48. C68 es un anticuerpo humanizado que tiene mutaciones K31S y T33V en relación con la región VH de A48. D98 es un anticuerpo humanizado que tiene una mutación G27A relativa a la región A48 VH.
[0141] Se prevén otras variaciones de los anticuerpos de las Tablas 1 y 2 . Por ejemplo, esta solicitud proporciona el anticuerpo B48 A98V, que tiene una mutación A98V relativa a B48; A48 V2L, que tiene una mutación V2L relativa a A48; A48 InsE6, que tiene una mutación InsE6 en relación con A48; B48 V2L, que tiene una mutación V2L relativa a B48; B48 InsE6, que tiene una mutación de InsE6 con respecto a B48; D118, que tiene mutaciones F28W y T33V con respecto a A48; D128, que tiene mutaciones G27A, F28W y T33V con respecto a A48; D138, que tiene mutaciones G27Y, F28A y T33V en relación con A48; D148, que tiene mutaciones G27Y y T33V en relación con A48; D158, que tiene mutaciones G27Y, F28G y T33V en relación con A48; D168, que tiene mutaciones F28Y y T33V en relación con A48; C98, que tiene mutaciones T33V y A98V en relación con A48; C128, que tiene mutaciones T33V y A98S en relación con A48; D178, que tiene mutaciones De126, T33V y A98V con respecto a A48; y D188, que tiene mutaciones De126, T33V y A98S en relación con A48.
Tabla 3. Representación de las secuencias de aminoácidos de las CDR de la Tabla 1.
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Tabla 4. Resumen de las secuencias de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de la Tabla 1.
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(Continuación)
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Tabla 6. Secuencias de aminoácidos adicionales.
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(Continuación)
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(Continuación)
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[0142] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo comprende una mutación VH T33V relativa a A11. Más específicamente, a veces, la molécula de anticuerpo antidengue comprende la CDR1 de la región VH de un anticuerpo de la Tabla 1 (p. ej., D88, F38, F108 o C88), usando las definiciones de CDR de Kabat o Chothia. Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue comprende la CDR1 y una o ambas CDR2 y c Dr 3 de la región VH de un anticuerpo de la Tabla 1 (p. ej., D88, A48, F38, F108 o C88), usando el Kabat o definiciones de Chothia de CDR. Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue comprende CDR1 de la región VH de un anticuerpo de la Tabla 1 (p. ej., D88, A48, F38, F108 o C88) en combinación con otro 1,2, 3, 4 o 5 (p. ej., colectivamente 6) CDR encontradas en una región VH y/o VL de la Tabla 2, usando las definiciones de CDR de Kabat de Chothia. Como se describe en este documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue comprende el VH CDR1 de SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo antidengue puede comprender el VH CDR1 de SEQ ID NO: 3 en combinación con un VH CDR2 y/o VHCDR3 de la Tabla 3 , por ejemplo, VH CDR2 de SEQ ID NO: 4 y VH CDR3 de SEQ ID NO: 5. Como un ejemplo adicional, la molécula de anticuerpo antidengue puede comprender el VH CDR1 de SEQ ID NO: 3 en combinación con otras 1,2, 3, 4 o 5 (p. ej., colectivamente 6) CDR encontradas en una región VH y/o VL de la Tabla 2.
[0143] Como se describe en este documento, a veces la molécula de anticuerpo comprende una mutación VH F65L relativa a A11. En una CDR definida por Kabat de A11, la posición 65 es un residuo de CDR, mientras que en una CDR definida por Chothia de A11, la posición 65 es un residuo de armazón. Como se describe en el presente documento, a veces la afinidad de una molécula de anticuerpo por el virus del dengue no se ve afectada por la mutación F65L. Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue comprende la CDR2 de la región VH de un anticuerpo de la
Tabla 1 (p. ej., D88, A48, F38, F108 o C88), usando las definiciones de CDR de Kabat o Chothia. Como se describe en este documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue comprende la CDR2 y una o ambas CDR1 y CDR3 de la región VH de un anticuerpo de la Tabla 1 (p. ej., D88, A48, F38, F108 o C88), usando el Kabat o definiciones de Chothia de CDR. Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue comprende CDR2 de la región VH de un anticuerpo de la Tabla 1 (p. ej., D88, A48, F38, F108 o C88) en combinación con otras 1,2, 3, 4 o 5 (p. ej., colectivamente 6) CDR encontradas en una región VH y/o VL de la Tabla 2, usando las definiciones de CDR de Kabat de Chothia. Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue comprende el VH CDR2 de SEQ ID NO: 4. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo antidengue puede comprender el VH CDR2 de SEQ ID NO: 4 en combinación con un VH CDR1 y/o VH CDR3 de la Tabla 3 , por ejemplo, VH CDR1 de SEQ ID NO: 3 y VH CDR3 de SEQ ID NO: 5. Como un ejemplo adicional, la molécula de anticuerpo antidengue puede comprender el VH CDR2 de SEQ ID NO: 4 en combinación con otras 1, 2, 3, 4 o 5 (p. ej., colectivamente 6) CDR que se encuentran en una región VH y/o VL de la Tabla 2. Como se describe en este documento, a veces la molécula de anticuerpo comprende una mutación VH F65L y una VH T33V mutación relativa a A11.
[0144] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue comprende una deleción de la S (DE126) en la posición 26 en el VH con relación a A11. Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo comprende la mutación del26 en combinación con una mutación VH T33V y/o una mutación VH F65L. Como se describe en este documento, a veces la molécula de anticuerpo comprende una mutación del26 y una o más CDR de la Tabla 3. Como se describe en este documento, a veces la molécula de anticuerpo comprende una mutación del26 en combinación con 1, 2, 3, 4, 5 o 6 CDR, en una región VH y/o VL de la Tabla 2, utilizando las definiciones de CDR de Kabat de Chothia.
[0145] Como se muestra en el Ejemplo 4 a continuación, el terminal N de la cadena pesada es tolerante a mutaciones. En consecuencia, como se describe en este documento, a veces las posiciones 1-6 de la secuencia de la cadena pesada tienen 1, 2, 3, 4, 5 o 6 mutaciones con respecto a un anticuerpo de la Tabla 1. Como se describe en este documento, a veces una molécula de anticuerpo tiene una sustitución, inserción o deleción en uno o más (p. ej., todos) de los residuos 2, 3, 5 o 6 de una secuencia de cadena pesada en la Tabla 2. Como se describe en este documento, a veces la molécula de anticuerpo comprende una parte de una secuencia de cadena pesada de la Tabla 2 , por ejemplo, posiciones de aminoácidos 2-117, 3-117, 4-117, 5-117, 6-117, 8-117 o 10-117.
[0146] Como se muestra en el Ejemplo 5 a continuación, las posiciones 27 y 28 en la VH son tolerantes de mutaciones, y, a veces, una mutación en la posición 27 y/o 28 potencia la unión. En consecuencia, a veces, una o ambas posiciones 27 y 28 tienen una mutación con respecto a un anticuerpo de la Tabla 1.
[0147] El Ejemplo 5 también muestra que la posición 98 en el VH es tolerante a mutaciones y, a veces, una mutación a la posición 98 mejora vinculante. En consecuencia, a veces, la posición 98 tiene una mutación con respecto a un anticuerpo de la Tabla 1.
[0148] Como se describe en este documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue comprende una región constante de cadena pesada, una región constante de cadena ligera y regiones variables de cadena pesada y ligera de la Tabla 2. Como se describe en este documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue comprende una región constante de cadena pesada, una región constante de cadena ligera y regiones variables que comprenden 1, 2, 3, 4, 5 o 6 CDR de la Tabla 3.
[0149] Como se describe en el presente documento, a veces la región variable de cadena pesada es una región variable de cadena pesada de la Tabla 1, donde el residuo 98 en el VH puede ser cualquier aminoácido. Como se describe en el presente documento, a veces el residuo 98 puede ser cualquier aminoácido no cargado. Como se describe en el presente documento, a veces la posición 98 puede ser A, V o S. El ejemplo 5 a continuación muestra que los anticuerpos que tienen el residuo A, V o S en la posición 98 tienen una buena unión a EDIII.
[0150] Durante el proceso de humanización, varias regiones de marco (p. ej., VH FW1) pueden estar mutadas inversamente para contener residuos de anticuerpos de ratón A11 o B11. Más ampliamente, como se describe en este documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue comprende la secuencia de toda o una parte de una región VH de la Tabla 1. Por ejemplo, a veces, la molécula de anticuerpo antidengue comprende los aminoácidos 5-117, 10­ 117, 15-117, 20-117, 25-117, 30-117 o 32-117 de una región VH de la Tabla 1. Como se describe en este documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue comprende una región VH FW1 seleccionada de un región de ratón VH FW1 (p. ej., la que se encuentra en A11 o B11) o una región VH FW1 humana (p. ej., una que se encuentra en un anticuerpo de la Tabla 1 o una secuencia VH FW1 de la línea germinal humana). Como se describe en el presente documento, a veces la región VH FW1 no tiene más de 1, 2, 3 o 4 posiciones de no identidad con respecto a los aminoácidos 1-31 de una secuencia VH de la Tabla 1. Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue comprende una región VH FW2 de un anticuerpo de la Tabla 1.
[0151] Como se describe en este documento, a veces la región VH FW2 no tiene más de 1,2, 3 o 4 posiciones de no identidad con respecto a los aminoácidos 37-50 de una secuencia VH de la Tabla 1. Una molécula de anticuerpo capaz de reaccionar de forma cruzada con EDIII de más de un serotipo del virus del dengue tiene varias propiedades ventajosas. Por ejemplo, se puede usar una terapia para tratar o diagnosticar múltiples serotipos de dengue. Además, un médico no necesita determinar qué serotipo infectó a un paciente para determinar la terapia apropiada. Por consiguiente, a veces, la molécula de anticuerpo antidengue es capaz de unirse independientemente a dos, tres, cuatro o más serotipos del virus del dengue con alta afinidad. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo puede unirse independientemente con alta afinidad a EDIII de DV-1 y DV-2; de DV-1 y dV-3; de DV-1 y DV-4; de DV-2 y DV-3; de DV-2 y DV-4; de DV-3 y DV-4; o DV-1 y DV-2 y DV-3; de DV-1 y DV-2 y DV-4; de DV-1 y DV-3 y DV-4; de DV-2 y DV-3 y DV-4; o de DV-1 y DV-2 y DV-3 y DV-4. Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo puede unirse independientemente con alta afinidad a EDIII de DV-4 y EDIII de uno o más de otros serotipos de DV.
[0152] Cada serotipo de virus del dengue que ha sido mencionado anteriormente es una clase que contiene numerosas cepas. Las moléculas de anticuerpo descritas en este documento muestran una buena amplitud de reactividad, uniéndose a múltiples cepas dentro de diferentes serotipos (ver Figura 11). Por consiguiente, a veces, una molécula de anticuerpo como se describe en el presente documento se une y/o neutraliza una o más (p. ej., al menos 2, 3, 4, 5, 10, 15 o 20, 25 o 30 o más) cepas del virus del dengue, por ejemplo, cepas seleccionadas de: DENV-4 BC2, DENV- 4-Sing10, DENV-4 NewCa109, DENV-4 Phil156, DENV-3 Sing09, DENV-3 Nic10, DENV-3 H87, DENV-2 Peru95, DENV-2 Sing08, DENV-2 NGC, DENV-1 Hawái/1944, DENV-2 Nueva Guinea/1944 (NGC), DENV-3 Filipinas/1956 (H87), DENV-4 México/1997 (BC287/97) y DENV-4 H241, las cepas enumeradas en el árbol filogenético de la Figura 10A, las cepas mostradas en las Figuras 10B y 19-21, las cepas enumeradas en la Tabla 6 en este documento (p. ej., aquellas cepas para las cuales se proporcionan secuencias EDIII en la Tabla 6), las cepas depositadas en la ATCC, las cepas enumeradas en el Centro de referencia mundial para virus emergentes y arbovirus (WRCEVA) (disponible en www.niaid.nih.gov/labsandresources/resources/dmid/wrceva/Pages/default.aspx), y las cepas enumeradas en la división de los CDC o enfermedades infecciosas transmitidas por vectores (disponible en www2a.cdc.gov/nczved/dvbid/misc/reg asp).
[0153] Como se describe en el presente documento, a veces, se une la molécula de anticuerpo con alta afinidad a uno o más de DV-1, DV-2, DV-3, y DV-4. Una secuencia de aminoácidos EDIII de la proteína E de cada uno de estos serotipos es, a veces, una secuencia de proteína E proporcionada en la Tabla 6.
[0154] Como se describe en este documento, a veces una molécula de anticuerpo descrita en este documento no activa la mejora dependiente de anticuerpos (ADE). La ADE se describe con más detalle en Balsitis et al., Lethal Antibody Enhancement of Dengue Disease in Mice Is Prevented by Fc Modification, PLoS Pathog 6(2): e1000790. doi: 10.1371/journal.ppat. 1000790. Brevemente, ADE describe una situación en la que una persona experimenta dos infecciones consecutivas de dengue con virus del dengue de diferentes serotipos, y la aparición de la primera infección hace que la segunda infección sea más grave (p. ej., es más probable que progrese a dengue hemorrágico). Un mecanismo de ADE puede ser que un anticuerpo antidengue se una simultáneamente al virus y al receptor Fc de un anticuerpo en una célula huésped, aumentando la infectividad. Como se desprende de los experimentos de FRNT descritos en el presente documento, esta solicitud proporciona numerosas moléculas de anticuerpos que reducen, en lugar de aumentar la infectividad. Por consiguiente, a veces, una molécula de anticuerpo como se describe en el presente documento no activa la ADE en un paciente. Como se describe en el presente documento, a veces, el anticuerpo inhibe la ADE inducida por otros anticuerpos (p. ej., los anticuerpos endógenos del paciente).
[0155] Como se describe en el presente documento, a veces, se une la molécula de anticuerpo a un epítopo lineal o conformacional en EDIII.
[0156] Como se usa en este documento, el término "molécula de anticuerpo" se refiere a una proteína que comprende la secuencia de dominio variable de al menos una inmunoglobulina. El término molécula de anticuerpo incluye, por ejemplo, anticuerpos maduros de longitud completa y fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo. Por ejemplo, una molécula de anticuerpo puede incluir una secuencia de dominio variable de cadena pesada (H) (abreviada aquí como VH) y una secuencia de dominio variable de cadena ligera (L) (abreviada aquí como VL). En otro ejemplo, una molécula de anticuerpo incluye dos secuencias de dominio variable de cadena pesada (H) y dos secuencias de dominio variable de cadena ligera (L), formando así dos sitios de unión al antígeno, como Fab, Fab’, F(ab’)2, Fc, Fd, Fd’, Fv, anticuerpos monocatenarios (scFv por ejemplo), anticuerpos de dominio variable único, diacuerpos (Dab) (bivalentes y biespecíficos) y anticuerpos quiméricos (p. ej., humanizados), que pueden producirse mediante la modificación de anticuerpos o los sintetizados de novo utilizando tecnologías de ADN recombinante. Estos fragmentos de anticuerpos funcionales conservan la capacidad de unirse selectivamente con su respectivo antígeno o receptor. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos pueden ser de cualquier clase de anticuerpos que incluyen, pero no se limitan a IgG, IgA, IgM, IgD e IgE, y de cualquier subclase (p. ej., IgG 1, IgG2, IgG3 e IgG4) de anticuerpos. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. El anticuerpo también puede ser un anticuerpo humano, humanizado, injertado con CDR o generado in vitro. El anticuerpo puede tener una región constante de cadena pesada elegida entre, por ejemplo, IgG 1, IgG2, IgG3 o IgG4. El anticuerpo también puede tener una cadena ligera elegida entre, por ejemplo, kappa o lambda.
[0157] Los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consta de los dominios VL, VH, CL y CHI; (ii) un fragmento F(ab’)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consta de los dominios VH y CHI; (iv) un fragmento Fv que consta de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento de diacuerpo (dAb), que consta de un dominio VH; (vi) un camélido o dominio variable de camélido; (vii) un Fv de cadena sencilla (scFv), véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 85: 5879-5883); (viii) un anticuerpo de dominio único. Estos fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse usando cualquier método adecuado, incluidas varias técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos pueden seleccionarse para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.
[0158] El término "anticuerpo" incluye moléculas intactas así como fragmentos funcionales de las mismas. Las regiones constantes de los anticuerpos se pueden alterar, p. ej., mutar, para modificar las propiedades del anticuerpo (p. ej., para aumentar o disminuir uno o más de: unión al receptor Fc, glicosilación del anticuerpo, número de residuos de cisteína, función de la célula efectora, o función de complemento).
[0159] Los anticuerpos descritos en este documento también pueden ser anticuerpos de dominio único. Los anticuerpos de dominio único pueden incluir anticuerpos cuyas regiones determinantes de complementariedad son parte de un polipéptido de dominio único. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a anticuerpos de cadena pesada, anticuerpos naturalmente desprovistos de cadenas ligeras, anticuerpos de dominio único derivadas de anticuerpos de 4 cadenas convencionales, los anticuerpos modificados y andamios de dominio único distintos de los derivados de anticuerpos. Los anticuerpos de dominio único pueden ser cualquiera de la técnica o cualquier anticuerpo de dominio único futuro. Los anticuerpos de dominio único pueden derivarse de cualquier especie, incluidos, entre otros, ratón, ser humano, camello, llama, pez, tiburón, cabra, conejo y bovino. Según algunos aspectos, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único de origen natural conocido como anticuerpo de cadena pesada desprovisto de cadenas ligeras. Dichos anticuerpos de dominio único se describen en el documento WO 9404678, por ejemplo. Por razones de claridad, este dominio variable derivado de un anticuerpo de cadena pesada naturalmente desprovisto de cadena ligera se conoce en el presente documento como VHH o nanocuerpo para distinguirlo del VH convencional de inmunoglobulinas de cuatro cadenas. Tal molécula de VHH puede derivarse de anticuerpos producidos en especies de Camelidae, por ejemplo en camello, llama, dromedario, alpaca y guanaco. Otras especies además de Camelidae pueden producir anticuerpos de cadena pesada naturalmente desprovistos de cadena ligera; también se contemplan tales VHH.
[0160] Las regiones VH y VL pueden subdividirse en regiones de hipervariabilidad, denominadas "regiones determinantes de complementariedad" (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas "regiones marco" (FR). El alcance de la región marco y las CDR se ha definido con precisión mediante varios métodos (ver, Kabat, EA, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU., Publicación de los NIH N° 91-3242; Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196: 901 -917; y la definición de AbM utilizada por el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Véase, en general, por ejemplo, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. En: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. y Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). Como se describe en el presente documento, a veces se utilizan las siguientes definiciones: Definición de AbM de CDR1 del dominio variable de cadena pesada y las definiciones de Kabat para las otras CDR. Como se describe en este documento, a veces, las definiciones de Kabat se utilizan para todas las CDR. Además, a veces las moléculas de anticuerpo descritas con respecto a las CDR de Kabat o AbM también se pueden implementar usando bucles hipervariables de Chothia. Cada VH y VL generalmente incluye tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
[0161] Como se usa en este documento, una "secuencia de dominio variable de inmunoglobulina" se refiere a una secuencia de aminoácidos que puede formar la estructura de un dominio variable de inmunoglobulina. Por ejemplo, la secuencia puede incluir toda o parte de la secuencia de aminoácidos de un dominio variable de origen natural. Por ejemplo, la secuencia puede incluir o no uno, dos o más aminoácidos de terminales N o C, o puede incluir otras alteraciones que sean compatibles con la formación de la estructura de la proteína.
[0162] El término "región de unión a antígeno" se refiere a la parte de una molécula de anticuerpo, que comprende determinantes que forman una interfaz que se une a una proteína E, o un epítopo de la misma. Con respecto a las proteínas (o miméticos de proteínas), la región de unión al antígeno incluye típicamente uno o más bucles (de al menos, por ejemplo, cuatro aminoácidos o miméticos de aminoácidos) que forman una interfaz que se une a la proteína E. Normalmente, la región de unión al antígeno de una molécula de anticuerpo incluye al menos una o dos CDR, o más típicamente al menos tres, cuatro, cinco o seis CDR.
[0163] Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" como se usa en este documento se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una única especificidad de unión y afinidad por un epítopo particular. Puede prepararse un anticuerpo monoclonal mediante tecnología de hibridomas o mediante métodos que no utilizan tecnología de hibridomas (p. ej., métodos recombinantes).
[0164] Una proteína "efectivamente humana" es una proteína que no evoca una respuesta de anticuerpos neutralizantes, por ejemplo, la respuesta de anticuerpos anti-murinos humanos (HAMA). HAMA puede ser problemático en varias circunstancias, por ejemplo, si la molécula de anticuerpo se administra repetidamente, por ejemplo, en el tratamiento de una enfermedad crónica o recurrente. Una respuesta HAMA puede hacer que la administración repetida de anticuerpos sea potencialmente ineficaz debido a un aumento de la eliminación de anticuerpos del suero (véase, por ejemplo, Saleh et al., Cancer Immunol. Immunother., 32: 180-190 (1990)) y también debido a posibles reacciones alérgicas (véase, por ejemplo, LoBuglio et al., Hybridoma, 5: 5117-5123 (1986)).
[0165] La molécula de anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal. Como se describe en el presente documento, a veces el anticuerpo se puede producir de forma recombinante, por ejemplo, mediante cualquier presentación en fagos o método combinatorio adecuado.
[0166] Varias presentaciones en fagos y los métodos combinatorios para generar anticuerpos son conocidos en la técnica (como se describe en, por ejemplo, Ladner Patente et al de Estados Unidos N° 5.223.409;. Kang et al Publicación Internacional N° WO 92/18619;. Dower et al. Publicación Internacional N° WO 91/17271; Winter et al. Publicación Internacional WO 92/20791; Markland et al. Publicación Internacional N° WO 92/15679; Breitling et al. Publicación Internacional WO 93/01288; McCafferty et al. Publicación N° WO 92/01047; Garrard et al. Publicación Internacional N° WO 92/09690; Ladner et al. Publicación Internacional N° WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; Griffths et al. (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226: 889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89: 3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9 : 1373­ 1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19: 4133-4137; y Barbas et al. (1991) PNAS 88: 7978-7982).
[0167] Como se describe en el presente documento, a veces el anticuerpo es un anticuerpo completamente humano (p. ej., un anticuerpo realizado en un ratón que ha sido manipulado genéticamente para producir un anticuerpo a partir de una secuencia de inmunoglobulina humana) o un anticuerpo no humano, p. ej., un roedor (ratón o rata), cabra, primate (p. ej., mono), anticuerpo de camello. Como se describe en el presente documento, a veces el anticuerpo no humano es un roedor (anticuerpo de ratón o rata). Se conocen en la técnica métodos para producir anticuerpos de roedores.
[0168] Los anticuerpos monoclonales humanos pueden generarse usando ratones transgénicos que llevan los genes de inmunoglobulina humana en lugar del sistema de ratón. Los esplenocitos de estos ratones transgénicos inmunizados con el antígeno de interés se utilizan para producir hibridomas que secretan mAb humanos con afinidades específicas por epítopos de una proteína humana (véase, por ejemplo, Wood et al. Solicitud Internacional WO 91/00906, Kucherlapati et al. Publicación PCT WO 91/10741; Lonberg et al. Solicitud Internacional WO 92/03918; Kay et al. Solicitud Internacional 92/03917; Lonberg, N. et al. 1994 Nature 368: 856-859; Green, LL et al. 1994 Nature Genet. 7: 13-21; Morrison, SL et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 81: 6851-6855; Bruggeman et al. 1993 Year Immunol 7: 33-40; Tuaillon et al. 1993 PNAS 90: 3720-3724; Bruggeman y col. 1991 Eur J Immunol 21: 1323-1326).
[0169] Un anticuerpo puede ser uno en el que la región variable, o una porción de la misma, por ejemplo, las CDR, se generan en un organismo no humano, p. ej., una rata o un ratón. También se contemplan anticuerpos quiméricos, injertados con CDR y humanizados. También se contemplan los anticuerpos generados en un organismo no humano, por ejemplo, una rata o un ratón, y luego modificados, por ejemplo, en el marco variable o región constante, para disminuir la antigenicidad en un ser humano.
[0170] Los anticuerpos quiméricos se pueden producir por cualquier técnica de ADN recombinante adecuado. Se conocen varios en la técnica (ver Robinson et al., Publicación de Patente Internacional PCT/US86/02269; Akira, et al., Solicitud de patente europea 184,187; Taniguchi, M., Solicitud de Patente Europea 171,496; Morrison et al., Solicitud de Patente Europea 173,494; Neuberger et al., Solicitud Internacional WO 86/01533; Cabilly et al. et al. (1987) PNAS 84: 3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84: 214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47: 999-1005; Wood y col. (1985) Nature 314: 446-449; y Shaw y col., 1988, J. Natl Cancer Inst. 80: 1553-1559).
[0171] Un anticuerpo humanizado o injertado con CDR tendrá al menos una o dos, pero generalmente las tres CDR de receptores (de cadenas de inmunoglobulina pesadas y/o ligeras) sustituidas con un donante de CDR. El anticuerpo se puede reemplazar con al menos una parte de una CDR no humana o solo algunas de las CDR se pueden reemplazar con CDR no humanas. Solo es necesario reemplazar el número de CDR requeridas para la unión del anticuerpo humanizado a EDIII. Como se describe en el presente documento, a veces el donante será un anticuerpo de roedor, por ejemplo, un anticuerpo de rata o ratón, y el receptor será un armazón humano o un armazón consenso humano. Normalmente, la inmunoglobulina que proporciona las CDR se denomina "donante" y la inmunoglobulina que proporciona el marco se denomina "aceptor". Como se describe en el presente documento, a veces la inmunoglobulina del donante no es humana (p. ej., roedor). El marco aceptor es típicamente un marco de origen natural (p. ej., un humano) o un marco de consenso, o una secuencia de aproximadamente 85% o más, p. ej., 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma.
[0172] Como se usa en este documento, el término "secuencia consenso" se refiere a la secuencia formada a partir de los aminoácidos (o nucleótidos) que se producen con más frecuencia en una familia de secuencias relacionadas (Véase p. ej., Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania 1987). En una familia de proteínas, cada posición en la secuencia consenso está ocupada por el aminoácido que se encuentra con mayor frecuencia en esa posición en la familia. Si dos aminoácidos ocurren con la misma frecuencia, cualquiera de los dos puede incluirse en la secuencia consenso. "Armazón de consenso" se refiere a la región marco en la secuencia de consenso de inmunoglobulina.
[0173] Un anticuerpo puede humanizarse mediante cualquier procedimiento adecuado, y varios de estos métodos conocidos en la técnica (Véase p. ej., Morrison, SL, 1985, Science 229: 1202 -1207, por Oi et al, 1986, BioTechniques 4: 214, y por Queen et al documento US 5.585.089, US 5.693.761 y US 5.693.762).
[0174] Anticuerpos humanizados o injertados con CDR pueden producirse por injerto de CDR o sustitución de CDR, en la que una, dos o todas las CDR de una cadena de inmunoglobulina se puede reemplazar. Véase, por ejemplo, la patente de e E.UU. 5.225.539; Jones y col. 1986 Nature 321: 552-525; Verhoeyan y col. 1988 Science 239: 1534; Beidler y col. 1988 J. Immunol. 141: 4053-4060; Winter US 5.225.539. Winter describe un método de injerto de CDR que puede usarse para preparar anticuerpos humanizados (Solicitud de Patente del Reino Unido GB 2188638A, presentada el 26 de marzo de 1987; Winter US 5.225.539).
[0175] También se proporcionan anticuerpos humanizados en los que aminoácidos específicos han sido sustituidos, eliminados o añadidos. Los criterios para seleccionar aminoácidos del donante se describen en, por ejemplo, el documento US 5.585.089, por ejemplo, las columnas 12-16 del documento US 5,585.089. Otras técnicas para humanizar anticuerpos se describen en Padlan et al. EP 519596 A1, publicada el 23 de diciembre de 1992.
[0176] La molécula de anticuerpo puede ser un anticuerpo de cadena única. Puede diseñarse un anticuerpo monocatenario (scFV) (véase, por ejemplo, Colcher, D. et al. (1999) Ann N YAcad Sci 880: 263-80; y Reiter, Y. (1996) Clin Cancer Res 2: 245-52). El anticuerpo monocatenario puede dimerizarse o multimerizarse para generar anticuerpos multivalentes que tienen especificidades por diferentes epítopos de la misma proteína diana.
[0177] Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo tiene una región constante de cadena pesada seleccionada de entre, por ejemplo, las regiones constantes de la cadena pesada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, e IgE; particularmente, elegidas entre, por ejemplo, las regiones constantes de cadena pesada (p. ej., humanas) de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo tiene una región constante de cadena ligera elegida entre, por ejemplo, las regiones constantes de cadena ligera (p. ej., humana) de kappa o lambda. La región constante puede ser alterada, por ejemplo, mutada, para modificar las propiedades del anticuerpo (p. ej., para aumentar o disminuir uno o más de: unión al receptor Fc de glicosilación, anticuerpo, el número de residuos de cisteína, la función celular efectora, y/o función de complemento). Como se describe en el presente documento, a veces el anticuerpo tiene una función efectora y puede fijar el complemento. Como se describe en el presente documento, a veces el anticuerpo no recluta células efectoras ni fija el complemento. Como se describe en el presente documento, a veces el anticuerpo tiene una capacidad reducida o nula para unirse a un receptor Fc. Por ejemplo, puede ser un isotipo o subtipo, fragmento u otro mutante, que no soporta la unión a un receptor Fc, por ejemplo, tiene una región de unión al receptor Fc mutagenizada o delecionada.
[0178] La región constante de anticuerpo puede ser alterada. Se conocen en la técnica métodos para alterar una región constante de anticuerpo. Se pueden producir anticuerpos con función alterada, por ejemplo, afinidad alterada por un ligando efector, como FcR en una célula, o el componente C1 del complemento reemplazando al menos un residuo de aminoácido en la porción constante del anticuerpo con un residuo diferente (ver p. ej., EP 388.151 A1, Patente de Estados Unidos N° 5.624.821 y Patente de Estados Unidos N° 5.648.260). También se contemplan mutaciones de aminoácidos que estabilizan la estructura del anticuerpo, tales como S228P (nomenclatura UE, S241P en nomenclatura Kabat) en IgG4 humana. Se podría describir un tipo similar de alteraciones que, si se aplicaran a la inmunoglobulina murina o de otra especie, reducirían o eliminarían estas funciones.
[0179] Como se describe en el presente documento, a veces los únicos aminoácidos de la molécula de anticuerpo antidengue son aminoácidos canónicos. Como se describe en el presente documento, a veces la molécula de anticuerpo antidengue comprende aminoácidos de origen natural; análogos, derivados y congéneres de los mismos; análogos de aminoácidos que tienen cadenas laterales variantes; y/o todos los estereoisómeros de cualquiera de los anteriores. La molécula de anticuerpo antidengue puede comprender los isómeros ópticos D o L de aminoácidos y peptidomiméticos.
[0180] Un polipéptido de una molécula de anticuerpo antidengue puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, y puede estar interrumpido por no aminoácidos. La molécula de anticuerpo también puede modificarse; por ejemplo, mediante formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación, tal como conjugación con un componente de marcaje. El polipéptido puede aislarse de fuentes naturales, puede producirse mediante técnicas recombinantes a partir de un huésped eucariota o procariota, o puede ser un producto de procedimientos sintéticos.
[0181] La molécula de anticuerpo antidengue puede utilizarse sola en forma no conjugada, o puede estar unida a una sustancia, por ejemplo, una toxina o un resto (p. ej., una droga terapéutica; un compuesto que emite radiación; moléculas de origen vegetal, fúngico o bacteriano; o una proteína biológica (p. ej., una toxina proteica) o partícula (p. ej., una partícula viral recombinante, por ejemplo, a través de una proteína de cubierta viral). Por ejemplo, el anticuerpo antidengue puede acoplarse a un isótopo radiactivo tal como un emisor a, p o y, o un emisor p y y.
[0182] Una molécula de anticuerpo se puede derivatizar o unir a otra molécula funcional (p. ej., otro péptido o proteína). Como se usa en este documento, una molécula de anticuerpo "derivatizada" es una que ha sido modificada. Los métodos de derivatización incluyen, pero no se limitan a la adición de un resto fluorescente, un radionucleótido, una toxina, una enzima o un ligando de afinidad tal como biotina. Por consiguiente, se pretende que las moléculas de anticuerpo incluyan formas derivatizadas y modificadas de otro modo de los anticuerpos descritos en el presente documento, incluidas moléculas de inmunoadhesión. Por ejemplo, una molécula de anticuerpo se puede unir funcionalmente (mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más de otras entidades moleculares, como otro anticuerpo (p. ej., un anticuerpo biespecífico o un diacuerpo), un agente detectable, una toxina, un agente farmacéutico y/o una proteína o péptido que puede mediar en la asociación del anticuerpo o la porción de anticuerpo con otra molécula (tal como una región central de estreptavidina o una etiqueta de polihistidina).
[0183] Algunos tipos de molécula de anticuerpo derivatizada se producen reticulando dos o más anticuerpos (del mismo tipo o de diferentes tipos, por ejemplo, para crear anticuerpos biespecíficos). Los reticulantes adecuados incluyen aquellos que son heterobifuncionales, que tienen dos grupos claramente reactivos separados por un espaciador apropiado (p. ej., éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) u homobifuncionales (p. ej., suberato de disuccinimidilo). Tales enlazadores están disponibles en Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.
[0184] Los agentes detectables útiles con los que una molécula de anticuerpo antidengue se puede derivatizar (o marcar) para incluir compuestos fluorescentes, diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, átomos metálicos emisores de fluorescencia, por ejemplo, europio (Eu) y otros antánidos, y materiales radiactivos (descritos a continuación). Los agentes detectables fluorescentes ejemplares incluyen fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5dimetilamina-1-naftalensulfonilo, ficoeritrina y similares. Un anticuerpo también puede derivatizarse con enzimas detectables, tales como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, acetilcolinesterasa, glucosa oxidasa y similares. Cuando un anticuerpo se deriva con una enzima detectable, se detecta agregando reactivos adicionales que la enzima usa para producir un producto de reacción detectable. Por ejemplo, cuando está presente el agente detectable peroxidasa de rábano picante, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina conduce a un producto de reacción coloreado, que es detectable. Una molécula de anticuerpo también puede derivatizarse con un grupo prostético (p. ej., estreptavidina/biotina y avidina/biotina). Por ejemplo, un anticuerpo puede derivatizarse con biotina y detectarse mediante medición indirecta de la unión de avidina o estreptavidina. Ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina, fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de material luminiscente incluye luminol; y los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aecuorina.
[0185] Una molécula de anticuerpo marcada se puede utilizar, por ejemplo, para el diagnóstico y/o experimentalmente en una serie de contextos, incluyendo (i) para aislar un antígeno predeterminado por técnicas estándar, tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación; (ii) para detectar un antígeno predeterminado (p. ej., en un lisado celular o sobrenadante celular) con el fin de evaluar la abundancia y patrón de expresión de la proteína; (iii) monitorear los niveles de proteína en el tejido como parte de un procedimiento de prueba clínica, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado.
[0186] Una molécula de anticuerpo se puede conjugar a otra entidad molecular, típicamente una etiqueta o agente o resto terapéutico (p. ej., inmunomodulador, inmunoestimulador, citotóxico o citostático). Los isótopos radiactivos se pueden usar en aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas. Los isótopos radiactivos que se pueden acoplar a los anticuerpos antidengue incluyen, pero no se limitan a emisores a, p o y, o emisores p y y. Dichos isótopos radiactivos incluyen, entre otros, yodo (131gI o 125gI), itrio (90gY), lutecio (177Lu), actinio (225gAc), praseodimio, astato (211 gAt), renio (186gRe), bismuto (212gBi o 213gBi), indio (111In), tecnecio (99gmTc), fósforo (32gP), rodio (188gRh), azufre (35gS), carbono (14gC), tritio (3gH), cromo (51gCr), cloro (36gCl), cobalto (57gCo o 58gCo), hierro (59gFe), selenio (75gSe) o galio (67gGa). Los radioisótopos útiles como agentes terapéuticos incluyen itrio (90gY), lutecio (177Lu), actinio (225gAc), praseodimio, astato (211 gAt), renio (116gRe), bismuto (212gBi o 213gBi) y rodio (188gRh). Los radioisótopos útiles como marcadores, por ejemplo, para uso en diagnósticos, incluyen yodo (131gI o 125gI), indio (111In), tecnecio (99gmTc), fósforo (32gP), carbono (14gC) y tritio (3gH), o uno o más de los isótopos terapéuticos enumerados anteriormente.
[0187] La presente descripción proporciona moléculas de anticuerpo radiomarcadas y métodos de marcaje de las mismas. Como se describe en el presente documento, a veces se describe un método para marcar una molécula de anticuerpo. El método incluye poner en contacto una molécula de anticuerpo, con un agente quelante, para producir de ese modo un anticuerpo conjugado. El anticuerpo conjugado se marca radiactivamente con un radioisótopo, por ejemplo, 1111ndio, 90itrio y 177Lutecio, para producir de ese modo una molécula de anticuerpo marcada.
[0188] Como se discute anteriormente, la molécula de anticuerpo se puede conjugar a un agente terapéutico. Ya se han mencionado radioisótopos terapéuticamente activos. Los ejemplos de otros agentes terapéuticos incluyen agentes antivirales.
[0189] En algunos aspectos, esta descripción proporciona un método para proporcionar una molécula de anticuerpo descrita en este documento. El método incluye: proporcionar un antígeno, por ejemplo, una proteína E del virus del dengue o una porción de la misma; obtener una molécula de anticuerpo que se una específicamente al antígeno; evaluar la eficacia de la molécula de anticuerpo para modular la actividad del antígeno y/o el organismo que expresa el antígeno, por ejemplo, el virus del dengue. El método puede incluir además administrar la molécula de anticuerpo, incluyendo un derivado de la misma (p. ej., una molécula de anticuerpo humanizada) a un sujeto, por ejemplo, un ser humano.
[0190] Esta descripción proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que codifica la anterior molécula de anticuerpo, vectores y células huésped de la misma. La molécula de ácido nucleico incluye, pero no se limita a, ARN, ADN genómico y ADNc.
Modelos animales
[0191] Las moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento se pueden evaluar en un modelo animal. Por ejemplo, se puede usar un modelo animal para probar la eficacia de una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento para reducir la infección, replicación y/o transmisión del virus del dengue. Los modelos animales ejemplares que pueden usarse para evaluar una molécula de anticuerpo descrita en este documento incluyen, pero no se limitan a modelos de ratón AG129 (p. ej., como se describe en Tharakaraman et al., Proc Natl Acad Sci EE. UU.
2013; 110 (17): E1555 -64; Johnson et al. J Virol. 1999; 73 (1): 783-6); modelos de ratón no adaptados a ratón (p. ej., modelo de ratón DENV-2 D2Y98P no adaptado a ratón como se describe en Tan et al. PLoS Negl Trop Dis. 2010; 4 (4): e672); modelos de ratón humanizados (p. ej., como se describe en Sridharan et al. J Virol. 2013; 87 (21): 11648­ 58); modelos de primates no humanos (p. ej., como se describe en Goncalvez y col. Proc Natl Acad Sci EE. UU. 2007; 104 (22): 9422-7); y modelos de mosquitos (p. ej., como se describe en Vu et al. PLoS Negl Trop Dis. 2010; 4 (7): e757).
[0192] La cepa de ratón AG129, que carece de receptores de interferón tanto de tipo I como de tipo II, es un modelo animal que reproduce ciertas manifestaciones de la enfermedad observadas en casos clínicos de dengue, incluyendo viremia y otros signos de enfermedad (Tharakaraman et al., Proc Natl Acad Sci EE. UU. 2013; 110 (17): E1555-64; Johnson et al. J Virol. 1999; 73 (1): 783-6). Este modelo es útil en la evaluación de tratamientos antivirales y también se puede utilizar en estudios de prueba de principio. Brevemente, el ratón AG129 (que es deficiente en receptores de IFN- a/p e IFN-y) se desafía con el virus del dengue y se administra una molécula de anticuerpo terapéutico candidata. Normalmente, la viremia (título del virus en una muestra de sangre) es el punto final del experimento. La viremia se puede medir, por ejemplo, con RT-PCR cuantitativa. Un modelo de ratón AG129 ejemplar se describe en el Ejemplo 10.
[0193] Modelos de ratón no adaptados a ratón se pueden generar, por ejemplo, usando una cepa de virus DEN2 no de ratón adaptada (D2Y98P) que es altamente infecciosa en ratones AG129 tras la administración intraperitoneal (Tan et al.PLoS Negl Trop Dis, 2010; 4 (4): e672). La infección con una dosis alta de D2Y98P puede inducir una tormenta de citocinas, daño orgánico masivo y fuga vascular severa, lo que lleva a hemorragia y muerte rápida de los animales en el pico de viremia. La infección con una dosis baja de D2Y98P puede conducir a la diseminación y replicación viral asintomática en órganos relevantes, seguida de muerte no paralítica de los animales pocos días después de la eliminación del virus, similar a la cinética de la enfermedad en humanos. En animales moribundos se pueden observar daños en el bazo, disfunción hepática y aumento de la permeabilidad vascular, pero sin hemorragia, lo que sugiere una integridad vascular intacta, una característica fundamental en el síndrome de choque por dengue.
[0194] Modelos de ratón humanizado se pueden generar, por ejemplo, por transferencia adoptiva de células de hígado fetal de CD34+ humano en ratones NOD-scid Il2rg'/' (NSG) que desarrollan niveles significativos de plaquetas humanas, monocitos/macrófagos, y los hepatocitos (Sridharan y col. J Virol,2013; 87 (21): 11648-58). La infección de estos ratones con el virus del dengue, como el serotipo 2 de DENV (DENV-2), puede recuperar ciertos rasgos característicos de la infección viral del dengue en humanos, por ejemplo, leucopenia transitoria y trombocitopenia.
[0195] Modelos de primates no humanos se pueden generar, p. ej., en monos rhesus juveniles después de la exposición DENV, como se describe en Goncalvez et al. Proc Natl Acad Sci EE. UU. 2007; 104 (22): 9422-7. Los títulos de viremia de monos infectados pueden determinarse, por ejemplo, mediante PCR cuantitativa o ensayo de Unidades Formadoras de Foco (FFU).
[0196] Los modelos de mosquitos también pueden usarse para evaluar la actividad inhibidora de anticuerpos contra el virus del dengue, por ejemplo, neutralización de la infección viral o reducción de la transmisión entre sujetos infectados y mosquitos. El virus del dengue es un virus de ARN transmitido por mosquitos. Ciertos virus del dengue pueden desarrollar una ventaja de aptitud in vivo, lo que puede resultar en una mayor probabilidad de transmisión de humano a mosquito (Vu et al., PLoS Negl Trop Dis. 2010; 4 (7): e757). Para establecer un modelo de mosquito, se puede alimentar a los mosquitos con sangre que contenga virus y anticuerpos. La carga viral en el abdomen de los mosquitos se puede medir mediante qRT-PCR. Un modelo de mosquito ejemplar se describe en el Ejemplo 13.
Composiciones y kits farmacéuticos
[0197] En algunos aspectos, esta invención proporciona composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticamente aceptables, que incluyen una molécula de anticuerpo antidengue como se define en las formas de reivindicación, formulada junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares que sean fisiológicamente compatibles. El vehículo puede ser adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, rectal, espinal o epidérmica (p. ej., mediante inyección o infusión). Como se describe en el presente documento, a veces menos de aproximadamente 5%, por ejemplo, menos de aproximadamente 4%, 3%, 2% o 1% de las moléculas de anticuerpo en la composición farmacéutica están presentes como agregados. En otras formas de realización, al menos aproximadamente el 95%, por ejemplo, al menos aproximadamente el 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5%, 99,8% o más de las moléculas de anticuerpo en la composición farmacéutica están presentes como monómeros. Como se describe en el presente documento, a veces el nivel de agregados o monómeros de anticuerpos se determina mediante cromatografía, por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento (HP-SEC).
[0198] Las composiciones expuestas en el presente documento pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (p. ej., soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, liposomas y supositorios. Una forma adecuada depende del modo de administración y aplicación terapéutica previstos. Las composiciones adecuadas típicas se encuentran en forma de soluciones inyectables o infusibles. Un modo de administración adecuado es parenteral (p. ej., intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular). Como se describe en el presente documento, a veces, la molécula de anticuerpo se administra mediante infusión o inyección intravenosa. Como se describe en el presente documento, a veces el anticuerpo se administra mediante inyección intramuscular o subcutánea.
[0199] Las expresiones "administración parenteral" y "administrado parenteralmente" tal como se utilizan en este documento significan modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, habitualmente mediante inyección, e incluye, sin limitación, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, inyección e infusión intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal.
[0200] Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de anticuerpos. Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo (es decir, anticuerpo o porción de anticuerpo) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y la liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente esterilizada filtrada del mismo. La fluidez adecuada de una solución se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede conseguirse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
[0201] Las moléculas de anticuerpo se pueden administrar por una variedad de métodos. Se conocen varios en la técnica, y para muchas aplicaciones terapéuticas, una vía/modo de administración apropiado es la inyección o infusión intravenosa. Por ejemplo, las moléculas de anticuerpo pueden administrarse mediante infusión intravenosa a una velocidad inferior a 10 mg/min; preferiblemente menor o igual a 5 mg/min para alcanzar una dosis de aproximadamente 1 a 100 mg/m2, preferiblemente aproximadamente 5 a 50 mg/m2, aproximadamente 7 a 25 mg/m2 y más preferiblemente, aproximadamente 10 mg/m2. Como apreciará el experto en la técnica, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Como se describe en el presente documento, a veces el compuesto activo se puede preparar con un vehículo que protegerá al compuesto contra una liberación rápida, como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato de vinilo de etileno, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o son generalmente conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.
[0202] Como se describe en el presente documento, a veces una molécula de anticuerpo se puede administrar por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. La molécula de anticuerpo (y otros ingredientes, si se desea) también puede encerrarse en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, comprimirse en tabletas o incorporarse directamente en la dieta del sujeto. Para la administración terapéutica oral, la molécula de anticuerpo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, grageas, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Para administrar una molécula de anticuerpo mediante una administración distinta a la parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o coadministrar el compuesto con un material para evitar su inactivación. Las composiciones terapéuticas también se pueden administrar con dispositivos médicos y se conocen varias en la técnica.
[0203] Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta deseada (p. ej., una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La forma de unidad de dosificación, como se usa en este documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación de las formas unitarias de dosificación está dictada por y depende directamente de (a) las características únicas de la molécula de anticuerpo y el efecto terapéutico particular que se va a lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de combinar dicha molécula de anticuerpo para el tratamiento de la sensibilidad en los individuos.
[0204] Un modo de ejemplo, intervalo no limitante para una cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz de una molécula de anticuerpo es 0,1-20 mg/kg, más preferiblemente 1-10 mg/kg. La molécula de anticuerpo se puede administrar mediante infusión intravenosa a una velocidad de menos de 10 mg/min, preferiblemente menor o igual a 5 mg/min para alcanzar una dosis de aproximadamente 1 a 100 mg/m2, preferiblemente aproximadamente 5 a 50 mg/m2, aproximadamente de 7 a 25 mg/m2, y más preferiblemente, aproximadamente 10 mg/m2. Cabe señalar que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y la gravedad de la afección que se va a aliviar. Debe entenderse además que para cualquier sujeto en particular, los regímenes de dosificación específicos deben ajustarse con el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los rangos de dosificación establecidos en este documento son ejemplares. solamente y no pretenden limitar el alcance o la práctica de las composiciones reivindicadas.
[0205] Las composiciones farmacéuticas en el presente documento pueden incluir una "cantidad terapéuticamente eficaz" o una "cantidad profilácticamente eficaz" de una molécula de anticuerpo. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en las dosis y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo modificado o fragmento de anticuerpo puede variar según factores tales como el estado patológico, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o la porción de anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también aquella en la que los efectos terapéuticamente beneficiosos superan cualquier efecto tóxico o perjudicial de la molécula de anticuerpo. Una "dosis terapéuticamente eficaz" inhibe preferiblemente un parámetro medible en al menos aproximadamente un 20%, más preferiblemente en al menos aproximadamente un 40%, incluso más preferiblemente en al menos aproximadamente un 60%, y aún más preferiblemente en al menos aproximadamente un 80% con respecto a los sujetos no tratados. El parámetro medible puede ser, por ejemplo, carga viral, fiebre, dolor de cabeza, dolores musculares o articulares, erupción cutánea, sangrado, niveles reducidos de plaquetas y presión sanguínea reducida. La capacidad de una molécula de anticuerpo para inhibir un parámetro medible puede evaluarse en un sistema de modelo animal predictivo de la eficacia en la fiebre del dengue. Alternativamente, esta propiedad de una composición puede evaluarse examinando la capacidad de la molécula de anticuerpo para neutralizar el virus del dengue, por ejemplo, ensayando la formación de focos in vitro.
[0206] Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profiláctico deseado. Normalmente, dado que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.
[0207] También dentro de esta descripción es un kit que comprende una molécula de anticuerpo descrita en este documento. El kit puede incluir uno o más elementos que incluyen: instrucciones de uso; otros reactivos, por ejemplo, un marcador, un agente terapéutico o un agente útil para quelar, o acoplar de otro modo, un anticuerpo a un marcador o agente terapéutico, o una composición radioprotectora; dispositivos u otros materiales para preparar la molécula de anticuerpo para su administración; vehículos farmacéuticamente aceptables; y dispositivos u otros materiales para la administración a un sujeto.
Ácidos nucleicos
[0208] La presente divulgación también presenta ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican regiones variables de cadena pesada y ligera y CDR de las moléculas de anticuerpo antidengue, como se describe en el presente documento. Por ejemplo, la presente divulgación presenta un primer y segundo ácido nucleico que codifican regiones variables de cadena pesada y ligera, respectivamente, de una molécula de anticuerpo antidengue elegida entre una o más de las moléculas de anticuerpo descritas en este documento, por ejemplo, un anticuerpo de la Tabla 1, o una porción de un anticuerpo, por ejemplo, las regiones variables de la Tabla 2. El ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de las secuencias de aminoácidos en las tablas de este documento, o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma (p. ej., una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más a ésta, o que difiere en no más de 3, 6, 15, 30, o 45 nucleótidos de las secuencias mostradas en las tablas de la presente memoria.
[0209] Como se describe en este documento, a veces, el ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una, dos o tres CDR de una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en las tablas de este documento, o una secuencia sustancialmente homóloga a la misma (p. ej., una secuencia en al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idénticos a los mismos, y/o que tienen una o más sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadas). Como se describe en este documento, a veces el ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una, dos o tres CDR de una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en las tablas de este documento, o una secuencia sustancialmente homóloga a la misma (p. ej., una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o que tiene una o más sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadas). Como se describe en este documento, a veces el ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR de regiones variables de cadena pesada y ligera que tienen una secuencia de aminoácidos como se establece en las tablas de este documento, o una secuencia sustancialmente homóloga a la misma (p. ej., una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o que tiene una o más sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadas).
[0210] Como se describe en el presente documento, a veces el ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una, dos, o tres CDR de una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de nucleótidos como se expone en la Tabla 5 en el presente documento, una secuencia sustancialmente homóloga a la misma (p. ej., una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o capaz de hibridar en las condiciones de rigurosidad descritas en el presente documento). Como se describe en este documento, a veces el ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una, dos o tres CDR de una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de nucleótidos como se establece en la Tabla 5 de este documento, o una secuencia sustancialmente homóloga a la misma (p. ej., una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o capaz de hibridar en las condiciones de rigurosidad descritas en este documento). Como se describe en este documento, a veces el ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR de regiones variables de cadena pesada y ligera que tienen la secuencia de nucleótidos como se establece en la Tabla 5 de este documento, o una secuencia sustancialmente homóloga a la misma (p. ej., una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma, y/o capaz de hibridar en las condiciones de rigurosidad descritas en el presente documento).
[0211] Como se describe en el presente documento, a veces el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos como se expone en la Tabla 5 en el presente documento o una secuencia sustancialmente homóloga a ésta (p. ej., una secuencia de al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica al mismo, y/o capaz de hibridar bajo las condiciones de rigurosidad descritas en el presente documento). Como se describe en este documento, a veces el ácido nucleico comprende una porción de una secuencia de nucleótidos como se establece en la Tabla 5 en este documento o una secuencia sustancialmente homóloga a la misma (p. ej., una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica al mismo, y/o capaz de hibridar bajo las condiciones de rigurosidad descritas en el presente documento). La porción puede codificar, por ejemplo, una región variable (p. ej., VH o VL); una, dos o tres o más CDR; o una, dos, tres o cuatro o más regiones marco.
[0212] Los ácidos nucleicos descritos en este documento incluyen desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. El polinucleótido puede ser monocatenario o bicatenario, y si es monocatenario puede ser la hebra codificante o la hebra no codificante (antisentido). Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos puede estar interrumpida por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente después de la polimerización, como por conjugación con un componente de marcaje. El ácido nucleico puede ser un polinucleótido recombinante o un polinucleótido de origen genómico, ADNc, semisintético o sintético que no se encuentra en la naturaleza o está unido a otro polinucleótido en una disposición no natural.
[0213] En algunos aspectos, la aplicación cuenta con células huésped y los vectores que contienen los ácidos nucleicos descritos en este documento. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en un solo vector o vectores separados presentes en la misma célula huésped o en una célula huésped separada, como se describe con más detalle a continuación.
Vectores
[0214] Se proporcionan además en este documento vectores que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una molécula de anticuerpo descrita en este documento. En algunas formas de realización, los vectores comprenden nucleótidos que codifican una molécula de anticuerpo como se define en las formas de reivindicación. En algunas formas de realización, los vectores comprenden las secuencias de nucleótidos descritas en este documento. Los vectores incluyen, pero no se limitan a un virus, plásmido, cósmido, fago lambda o un cromosoma artificial de levadura (YAC).
[0215] Se pueden emplear numerosos sistemas de vectores. Por ejemplo, una clase de vectores utiliza elementos de ADN que se derivan de virus animales tales como, por ejemplo, virus del papiloma bovino, virus polioma, adenovirus, virus vaccinia, baculovirus, retrovirus (virus del sarcoma de Rous, MMTV o MOMLV) o virus SV40. Otra clase de vectores utiliza elementos de ARN derivados de virus de ARN como el virus Semliki Forest, el virus de la encefalitis equina del este y los flavivirus.
[0216] Además, las células que han integrado de forma estable el ADN en sus cromosomas pueden ser seleccionadas introduciendo uno o más marcadores que permiten la selección de células huésped transfectadas. El marcador puede proporcionar, por ejemplo, prototropía a un huésped auxotrófico, resistencia a biocidas (p. ej., antibióticos) o resistencia a metales pesados como el cobre o similares. El gen marcador seleccionable puede unirse directamente a las secuencias de ADN que se van a expresar o introducirse en la misma célula mediante cotransformación. También pueden ser necesarios elementos adicionales para la síntesis óptima de ARNm. Estos elementos pueden incluir señales de empalme, así como promotores, potenciadores y señales de terminación de la transcripción.
[0217] Una vez que el vector de expresión o secuencia de ADN que contiene las construcciones se ha preparado para la expresión, los vectores de expresión pueden transfectarse o introducirse en una célula huésped apropiada. Se pueden emplear varias técnicas para lograr esto, tales como, por ejemplo, fusión de protoplastos, precipitación con fosfato cálcico, electroporación, transducción retroviral, transfección viral, pistola génica, transfección basada en lípidos u otras técnicas convencionales. En el caso de la fusión de protoplastos, las células se cultivan en medio y se seleccionan para determinar la actividad apropiada.
[0218] Los métodos y condiciones para cultivar las células transfectadas resultantes y para recuperar la molécula de anticuerpo producida son conocidos por los expertos en la técnica, y pueden variarse u optimizarse dependiendo del vector de expresión específico y la célula huésped de mamífero empleados, en base a la presente descripción.
Células
[0219] La presente divulgación también proporciona células huésped que comprenden un ácido nucleico que codifica una molécula de anticuerpo como se describe en el presente documento. Por ejemplo, las células huésped pueden comprender un ácido nucleico de la Tabla 5, una secuencia sustancialmente homóloga al mismo (p. ej., una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma y/o capaz de hibridar bajo las condiciones de rigurosidad descritas en este documento), o una porción de uno de dichos ácidos nucleicos. Además, las células huésped pueden comprender un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2 o la Tabla 3, una secuencia sustancialmente homóloga a la misma (p. ej., una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma), o una parte de una de dichas secuencias.
[0220] En algunas formas de realización, las células huésped se modifican por ingeniería genética para comprender los ácidos nucleicos que codifican la molécula de anticuerpo como se define por las formas de reivindicación.
[0221] Como se describe en el presente documento, a veces las células huésped se modifican por ingeniería genética mediante el uso de un casete de expresión. La frase "casete de expresión" se refiere a secuencias de nucleótidos que son capaces de afectar la expresión de un gen en huéspedes compatibles con tales secuencias. Dichos casetes pueden incluir un promotor, un marco de lectura abierto con o sin intrones y una señal de terminación. También pueden usarse factores adicionales necesarios o útiles para efectuar la expresión, tales como, por ejemplo, un promotor inducible.
[0222] La divulgación también proporciona células huésped que comprenden los vectores descritos en el presente documento.
[0223] La célula puede ser, pero no se limita a una célula eucariota, una célula bacteriana, una célula de insecto, o una célula humana. Las células eucariotas adecuadas incluyen, pero no se limitan a células Vero, células HeLa, células COS, células CHO, células HEK293, células BHK y células MDCKII. Las células de insectos adecuadas incluyen, pero no se limitan a células Sf9.
Usos de moléculas de anticuerpo antidengue
[0224] Las moléculas de anticuerpo descritas en este documento tienen utilidades de diagnóstico in vitro e in vivo, así como terapéuticas y profilácticas. En algunas formas de realización, las moléculas de anticuerpo definidas por las formas de reivindicación neutralizan el virus del dengue. Por ejemplo, estas moléculas se pueden administrar a células en cultivo, in vitro o ex vivo, o a un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, por ejemplo, in vivo, para neutralizar el virus del dengue. Por consiguiente, en algunos aspectos, la invención proporciona una molécula de anticuerpo como se define en las formas de reivindicación, para su uso en un método de tratamiento de una infección por el virus del dengue en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una molécula de anticuerpo como se define en las formas de reivindicación, de manera que se trata la infección por el virus del dengue. Por ejemplo, estas moléculas de anticuerpo se pueden administrar a células en cultivo, por ejemplo, in vitro o ex vivo, o en un sujeto, por ejemplo, in vivo, para tratar, prevenir y/o diagnosticar una infección por el virus del dengue.
[0225] Tal como se utiliza aquí, el término "sujeto" pretende incluir humanos y animales no humanos. Como se describe en el presente documento, a veces el sujeto es un sujeto humano, por ejemplo, un paciente humano infectado con el virus del dengue o en riesgo de infectarse con el virus del dengue. El término "animales no humanos" incluye mamíferos y no mamíferos, como primates no humanos. Como se describe en el presente documento, a veces el sujeto es un ser humano. Las composiciones descritas en el presente documento son adecuadas para el tratamiento de pacientes humanos infectados con el virus del dengue. Los pacientes infectados con el virus del dengue incluyen aquellos que han estado expuestos al virus pero son (al menos temporalmente) asintomáticos, pacientes con dengue, pacientes con dengue hemorrágico y pacientes con síndrome de choque por dengue.
Métodos de tratamiento del virus del dengue
[0226] El virus del dengue presenta una proteína E (envoltura) en la superficie viral. La proteína E contribuye a la unión del virus a una célula huésped. La proteína E comprende un dominio DI (un barril beta de nueve hebras), un dominio DII (un dominio hidrófobo implicado en la fusión con la célula huésped) y un dominio DIII (un dominio extracelular). Sin desear estar ligado a la teoría, como se describe en este documento, a veces las moléculas de anticuerpo descritas en este documento pueden neutralizar el virus del dengue uniéndose a su dominio de proteína E DIII (EDIII), por ejemplo, evitando que el virus se fusione con una célula huésped, evitando que el virus se una a una célula huésped, altere la estructura de la proteína E o desestabilice el virus.
[0227] La fiebre del dengue es una enfermedad infecciosa, generalmente transmitida por mosquitos, causada por el virus del dengue. La infección inicial suele ir seguida de un breve período asintomático, generalmente de 4 a 7 días. A veces, un paciente infectado no presenta ningún síntoma de dengue. Sin embargo, en pacientes que manifiestan fiebre del dengue, los síntomas característicos son fiebre repentina
[0228] (a veces superior a 40°C), dolor de cabeza, dolores musculares y articulares y erupción cutánea. Durante la fase febril de la infección, se manifiestan fiebre, dolor y dolor de cabeza. En algunos pacientes, la fase febril va seguida de la fase crítica (asociada con el síndrome de choque por dengue y el dengue hemorrágico), en la que los pacientes pueden sufrir acumulación de líquido en el pecho y la cavidad abdominal, agotamiento del líquido circulatorio, suministro inadecuado de sangre a los órganos vitales y sangrado. A esto le sigue una fase de recuperación. Como se describe en el presente documento, a veces las moléculas de anticuerpo del presente documento se administran a un paciente en el período asintomático, la fase febril, la fase crítica y/o la fase de recuperación.
[0229] El virus del dengue se diagnostica normalmente basándose en un examen físico y los síntomas reportados del paciente. Se puede hacer un diagnóstico probable cuando un paciente muestra fiebre y al menos dos síntomas seleccionados entre náuseas/vómitos, erupción cutánea, dolor generalizado, niveles reducidos de glóbulos blancos o prueba de torniquete positiva. Las pruebas adicionales que indican fiebre del dengue incluyen una prueba de recuento reducido de glóbulos blancos, niveles bajos de plaquetas, acidosis metabólica, nivel elevado de aminotransferasa en el hígado, hemoconcentración, hipoalbuminemia, detección de líquido por ultrasonido (sugiere síndrome de choque por dengue), presión de pulso por debajo de 20 mm Hg (indica síndrome de choque por dengue), llenado capilar retrasado (indica colapso vascular periférico). Por consiguiente, a veces las moléculas de anticuerpo se administran a un paciente que satisface los criterios antes mencionados.
[0230] Ciertas moléculas de anticuerpo descritas en este documento son capaces de tratar por lo menos dos, tres, o cuatro serotipos del virus del dengue. En consecuencia, a veces, la molécula de anticuerpo se administra a un paciente infectado o con riesgo de infección por el virus del dengue, cuando no se ha realizado ninguna prueba para determinar el serotipo del virus del dengue, por ejemplo, el serotipo del virus del dengue puede ser desconocido. En algunas formas de realización, el virus del dengue es del serotipo DV-1, DV-2, DV-3 o DV-4.
[0231] Las moléculas de anticuerpo se administran típicamente a una frecuencia que mantiene un nivel terapéuticamente eficaz de anticuerpos en el sistema del paciente hasta que se recupera el paciente. Por ejemplo, las moléculas de anticuerpo pueden administrarse a una frecuencia que logre una concentración en suero suficiente para que al menos aproximadamente 1, 2, 5, 10, 20, 30 o 40 anticuerpos se unan a cada virión. Como se describe en el presente documento, a veces las moléculas de anticuerpo se administran cada 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días.
[0232] Los métodos de administración de diversas moléculas de anticuerpos se conocen en la técnica y se describen a continuación. Las dosis adecuadas de las moléculas de anticuerpo utilizadas dependerán de la edad y el peso del sujeto y del fármaco particular utilizado.
[0233] Las moléculas de anticuerpo pueden ser utilizadas por sí mismas o conjugarse con un segundo agente, por ejemplo, un agente antiviral, toxina, o proteína, por ejemplo, un segundo anticuerpo antidengue. Este método incluye: administrar la molécula de anticuerpo, sola o conjugada con un segundo agente, a un sujeto que requiera tal tratamiento. Las moléculas de anticuerpo se pueden usar para administrar una variedad de agentes terapéuticos, por ejemplo, una toxina o un agente antivírico, o mezclas de los mismos.
Terapias de combinación
[0234] Las moléculas de anticuerpo antidengue se pueden usar en combinación con otras terapias. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir una molécula de anticuerpo antidengue co-formulada y/o coadministrada con uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, agentes antivirales (incluidos otros anticuerpos antidengue), vacunas (incluidas las vacunas contra el virus del dengue) o agentes que mejoran la respuesta inmunitaria. En otras formas de realización, las moléculas de anticuerpo, según se definen en las formas de reivindicación, se administran en combinación con otras modalidades de tratamiento terapéutico, tales como hidratación intravenosa, agentes antifebriles (tales como acetaminofén) o transfusión de sangre. Tales terapias de combinación pueden utilizar ventajosamente dosis más bajas de los agentes terapéuticos administrados, evitando así posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias.
[0235] Administrado "en combinación", como se usa en el presente documento, significa que dos (o más) diferentes tratamientos se entregan al sujeto antes de, o durante el curso de la aflicción del sujeto con la enfermedad. Como se describe en el presente documento, a veces se administran dos o más tratamientos de manera profiláctica, por ejemplo, antes de que el sujeto sea infectado o diagnosticado con el virus del dengue. Como se describe en el presente documento, a veces los dos o más tratamientos se administran después de que el sujeto haya sido diagnosticado con el virus del dengue. Como se describe en el presente documento, a veces la administración de un tratamiento todavía se está produciendo cuando comienza la administración del segundo, de modo que hay superposición. A esto a veces se hace referencia en el presente documento como "administración simultánea" o "administración simultánea". Como se describe en el presente documento, a veces la administración de un tratamiento termina antes de que comience la administración del otro tratamiento. A veces, el tratamiento es más eficaz debido a la administración combinada. Por ejemplo, el segundo tratamiento es más eficaz, por ejemplo, se observa un efecto equivalente con menos del segundo tratamiento, o el segundo tratamiento reduce los síntomas en mayor medida que lo que se vería si el segundo tratamiento se administrara en ausencia del primer tratamiento, o la situación análoga se ve con el primer tratamiento. Como se describe en el presente documento, a veces la administración es tal que la reducción de un síntoma u otro parámetro relacionado con el trastorno es mayor de lo que se observaría con un tratamiento administrado en ausencia del otro. El efecto de los dos tratamientos puede ser parcialmente aditivo, totalmente aditivo o mayor que aditivo. La administración puede ser tal que un efecto del primer tratamiento administrado aún sea detectable cuando se administra el segundo.
[0236] El agente antivírico puede ser, por ejemplo, balapiravir, cloroquina, celgosivir, ivermectina o Carica folia.
[0237] La vacuna puede ser, por ejemplo, viva, atenuada, serotipos del dengue recombinantes 1,2, 3, y 4 del virus (p. ej., ensayo clínico NCT01488890 por Sanofi Pasteur.); vacuna tetravalente contra el dengue CYD (p. ej., ensayo clínico NCT01943825, de Sanofi Pasteur), serotipo de dengue quimérico (1,2, 3, 4) (p. ej., ensayo clínico NCT00730288 de Sanofi), vacuna contra el dengue CYD (p. ej., ensayo clínico NCT00993447 de Sanofi), vacuna tetravalente viva atenuada contra el dengue (p. ej., ensayo clínico NCT00322049 de GlaxoSmithKline), vacuna tetravalente contra el dengue (TVDV) (p. ej., ensayo clínico NCT01502358 del Mando de Investigación y Material Médico del Ejército de EE. UU.), dengue quimérico tetravalente (serotipo 1, 2, 3, 4) (p. ej., ensayo clínico NCT00842530 de Sanofi Pasteur), vacuna liofilizada contra el dengue (p. ej., ensayo clínico NCT01696422 del Instituto Butantan), vacuna tetravalente contra el dengue ChimeriVax™ (p. ej., ensayo clínico NCT00617344 de Sanofi), CYD-1,3 bivalente Dengue (Vero) (p. ej., ensayo clínico NCT00740155 de Sanofi Pasteur), Dengue CYD-2,4 bivalente (Vero) (p. ej., ensayo clínico NCT00740155 de Sanofi Pasteur), mezcla tetravalente VDV-2/CYD-1,3,4 Dengue (Vero) (p. ej., ensayo clínico NCT00740155 de Sanofi Pasteur), CYD-1,2,3,4 tetravalente (Vero) (p. ej., ensayo clínico NCT00740155 de Sanofi Pasteur), rDENldelta30 o rDEN2/4delta30 (ME) (p. ej., ensayo clínico NCT00458120 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas), vacuna contra el dengue quimérica tetravalente viva modificada (SC o ID) (p. ej., ensayo clínico NCT01110551 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas), vacuna contra el dengue (p. ej., ensayo clínico NCT00384670 de la actividad de desarrollo de material médico del ejército de los Estados Unidos), vacuna en fase de investigación para el virus del dengue subtipo 2 (p. ej., NCT01073306 por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas), F17 (p. ej., NCT01843621 por el Mando de Investigación y Material Médico del Ejército de EE. UU.), postransfección F17 o postransfección F19 (p. ej., ensayo clínico NCT00468858 de Mando de Investigación y Material Médico del Ejército de EE. UU.), DENVax (p. ej., ensayo clínico NCT01511250 de Inviragen Inc.), DIME (vacuna de ADN premembrana/envolvente dengue-1) (p. ej., ensayo clínico NCT00290147 de la Oficina del Cirujano General del Ejército de EE. UU.), vacuna en investigación para DEN1 (p. ej., ensayo clínico NCT01084291 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas), vacuna contra el dengue tetravalente vivo atenuado (p. ej., ensayo clínico NCT00350337 del Instituto de Investigación del Ejército Walter Reed), rDEN4delta30-200,201 (p. ej., ensayo clínico NCT00270699 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas), TetraVax-DV-TV003 o rDEN2A30-7169 (p. ej., ensayo clínico NCT02021968 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas), TetraVaxDV, opcionalmente en mezcla (p. ej., ensayo clínico NCT01436422 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas), candidato a la vacuna DEN4 (p. ej., ensayo clínico NCT00919178 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas), rDEN4delta30-4995 (p. ej., ensayo clínico NCT00322946 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas), rDEN3delta30/31-7164 (p. ej., ensayo clínico NCT00831012 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas), TDENVPIV (p. ej., ensayo clínico NC T01702857 del Comando de Material e Investigación Médica del Ejército de EE. UU.), De Nv -1 PIV (p. ej., ensayo clínico NCT01502735 del Mando de Material e Investigación Médica del Ejército de EE. UU.), RDEN3-3'D4delta30 (p. ej., ensayo clínico NCT00712803 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas), V180 (p. ej., ensayo clínico NCT01477580 de Merck Sharp & Dohme Corp.) o DEN1-80E (p. ej., ensayo clínico NCT00936429 de Hawaii Biotech, Inc.).
[0238] La otra terapia puede ser, por ejemplo, lactato sódico hipertónico, factor humano recombinante VII activado, o anti-d (p. ej., ensayo clínico NCT01443247 por Postgraduate Institute of Medical Education and Research).
[0239] En ciertas formas de realización, el agente antiviral adicional es una segunda molécula de anticuerpo antidengue, por ejemplo, una molécula de anticuerpo diferente antidengue a partir de una primera molécula de anticuerpo antidengue. Las moléculas de anticuerpo antidengue ejemplares que se pueden usar en combinación incluyen, pero no se limitan a cualquier combinación de los anticuerpos enumerados en la Tabla 1 (p. ej., cualquier combinación de dos o más de D88, F38, A48, C88, F108, B48, A68, A100, C58, C78, C68, D98, A11 (también conocido como anticuerpo monoclonal 4E5A (Tharakaraman et al., Proc Natl Acad Sci EE. UU. 2013; 110 (17): E1555-64)) o B11; anticuerpo monoclonal 4E11 (Thullier et al., J Biotechnol. 1999; 69 (2-3): 183-90); anticuerpo humano 14c10 (HM14c10) (Teoh et al. Sci Transl Med,20 de junio de 2012; 4 (139): 139ra83); anticuerpos monoclonales humanos 1F4, 2D22 y 5J7 (de Alwis et al., Proc Natl Acad Sci EE. UU. 2012; 109 (19): 7439-44); anticuerpos monoclonales humanos DV1,1, DV1,6, DV3,7, DV4,4, DV5,1, DV6,1, DV7,5, DV8,1, DV10,16, DV13,4, DV13,8, DV14,5, DV14,5, DV15,7, DV16,5, DV16,8, DV17,6, DV18,21, DV18,4, DV19,3, DV20,1, DV21,1, DV21,5, DV22,3, DV22,3 LALA, DV23,13, DV25,5, DV27, 2, DV28,1, DV28,8, DV34,4, DV35,3, DV38,1, DV51,6, DV52,1, DV53,4, DV54,7, DV 55,1, DV56,12, DV54,7, DV57,4, DV59,3, DV60,3, DV61,2, DV62,5, DV63,1, DV64,3, DV65,5, DV66,1, DV67,9, DV68,2, DV69,6, DV70,1, DV71,1, DV74,4, DV75,9, DV76,5, DV77,5, DV78,6, DV79,3, DV82,11, DV82,11 LALA, DV86,2, DV87,1, DV87,1 LALA, DV90,3, DV257,13, DV291,7, DV415,8 y DV470,12 (Beltramello et al, Cel1Host Microbe. 2010; 8 (3): 271-83); anticuerpos monoclonales humanos 3-147, 58/5, 2F5, 2G4, 5F9 y 135.3 (Dejnirattisai et al., Science.
2010; 328 (5979): 745-8); mAb 2H12 (Midgley y col. J Immunol. 2012; 188 (10): 4971-9); anticuerpo monoclonal humanizado 1A5 (Goncalvez y col., Proc Natl Acad Sci EE. UU. 2007; 104 (22): 9422-7); y anticuerpo monoclonal humano 1C19 (Smith et al., MBio. 2013; 4 (6): e00873-13); o cualquiera de los anticuerpos descritos en: WO 05/056600 de Lai, C. y Purcell, R. (p. ej., anticuerpos 1A5 y 5H2; WO2010/043977 de Lanzavecchia, A. et al.; WO2013/173348 de Dimitrov et al.; US2013/0259871 de Macary et al.; WO 2013/089647 de Fink et al.; WO 2013/035345 de Setthapramote et al.; US 8.637.035 de Han-Chung Wu et al.; o WO 2014/025546 de Sasisekharan, R. et al.; o un derivado de cualquiera de los anticuerpos antes mencionados (p. ej., un ser humano o forma humanizada del mismo).
[0240] Otros agentes terapéuticos que se pueden utilizar en combinación con un anticuerpo antidengue descrito en este documento también incluyen, pero no se limitan a por ejemplo, inhibidores de la alfa-glucosidasa I (p. ej., celgosivir como se describe en Rathore et al., Antiviral Res. 2011; 92 (3): 453-60); inhibidores de nucleósidos de adenosina (p. ej., NITD008 como se describe en Yin et al., Proc Natl Acad Sci EE. UU. 2009; 106 (48): 20435-9); inhibidores de n S3 y/o su cofactor NS2B (p. ej., compuestos que bloquean el bolsillo de unión de NS2B dentro de NS3, p. ej., compuestos de [5-amino-1-(fenil)sulfonil-pirazol-3-ilo], como se describe en Lescar et al., Antiviral Res. 2008; 80 (2): 94-101); Inhibidores de la ARN polimerasa (RdRp) dependiente de ARN (p. ej., NITD107 como se describe en Noble et al., J Virol. 2013; 87 (9): 5291-5); inhibidores de la biosíntesis de pirimidina del huésped, por ejemplo, dihidroorotato deshidrogenasa del huésped (DHODH) (p. ej., NITD-982 y brequinar como se describe en Wang et al., J Virol. 2011; 85 (13): 6548-56); inhibidores de la proteína NS4B viral (p. ej., NITD-618 como se describe en Xie et al., J Virol. 2011; 85 (2 1 ): 11183-95); e iminoazúcares (p. ej., UV-4 como se describe en Perry et al., Antiviral Res. 2013; 98 (1): 35-43).
Métodos de diagnóstico
[0241] En algunos aspectos, la presente invención proporciona un método de diagnóstico para detectar la presencia de una proteína E del virus del dengue in vitro (p. ej., en una muestra biológica, como una muestra de sangre) o in vivo (p. ej., en imagen in vivo en un sujeto). El método incluye: (i) poner en contacto la muestra con una molécula de anticuerpo como se define en las formas de reivindicación, o administrar al sujeto la molécula de anticuerpo; (opcionalmente) (ii) poner en contacto una muestra de referencia, por ejemplo, una muestra de control (p. ej., una muestra biológica de control, como plasma o sangre) o un sujeto de control con una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento; y (iii) detectar la formación de un complejo entre la molécula de anticuerpo y la muestra o sujeto, o la muestra de control o sujeto, en donde un cambio, por ejemplo, un cambio estadísticamente significativo, en la formación del complejo en la muestra o sujeto relativo para la muestra de control o el sujeto es indicativo de la presencia del virus del dengue en la muestra. La molécula de anticuerpo puede marcarse directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Las sustancias detectables adecuadas incluyen diversas enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos, como se describe anteriormente y se describe con más detalle a continuación.
[0242] El término "muestra", que se refiere a muestras usadas para la detección de polipéptidos incluye, pero no se limita a células, lisados de células, proteínas o extractos de membrana de las células, fluidos corporales tales como sangre, o muestras de tejidos.
[0243] La formación de complejos entre la molécula de anticuerpo y una proteína del virus del dengue puede detectarse midiendo o visualizando la molécula de anticuerpo unida a la proteína del virus del dengue o la molécula de anticuerpo no unida. Puede usarse cualquier ensayo de detección adecuado, y los ensayos de detección convencionales incluyen un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) o inmunohistoquímica de tejidos. Como alternativa al etiquetado de la molécula de anticuerpo, la presencia de una proteína del virus del dengue puede ensayarse en una muestra mediante un inmunoensayo competitivo utilizando estándares marcados con una sustancia detectable y una molécula de anticuerpo no marcada. En este ensayo, la muestra biológica, los estándares marcados y la molécula de anticuerpo se combinan y se determina la cantidad de estándar marcado unido a la molécula de unión no marcada. La cantidad de proteína del virus del dengue en la muestra es inversamente proporcional a la cantidad de patrón marcado unido a la molécula de anticuerpo.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Diseño guiado por la estructura de anticuerpos antidengue
Identificación de epítopo y plantilla
[0244] Existen varios epítopos neutralizantes en el dímero de la proteína E del virus del dengue. Estos epítopos incluyen regiones, por ejemplo, en EDI, EDII, EDIII, bucle de fusión, bisagra EDI/II y la cadena p "A" de EDIII. EDI y EDII son inmunodominantes en humanos y pueden inducir anticuerpos débilmente neutralizantes pero reactivos altamente cruzados. EDIII puede inducir potentes anticuerpos neutralizantes. Los anticuerpos dirigidos contra el bucle de fusión, ubicado en EDII, a menudo exhiben reactividad de serotipo cruzado pero una actividad neutralizante débil. Los anticuerpos dirigidos contra la región de bisagra de EDI/II pueden exhibir una potente neutralización pero son típicamente específicos de serotipo debido a la baja conservación de la región del epítopo. Los anticuerpos dirigidos contra la cadena A de EDIII a menudo exhiben una alta potencia debido en parte a la mayor accesibilidad de esta región a los anticuerpos, pero a menudo tienen una reactividad entre serotipos cruzados limitada.
[0245] Para modificar un anticuerpo neutralizante ampliamente reactivo y altamente potente para virus del dengue, el ratón mAb 4E11 fue identificado como un anticuerpo de plantilla, ya que se une a la región de epítopo EDIII de cadena A y exhibe una fuerte neutralización para DENV-1, DENV-2 y DENV-3 pero no DENV-4. 4E11 tiene una unión muy baja (gM) a DENV-4. Se utilizó un enfoque para aumentar los contactos moleculares de 4E11 a DENV-4 con el fin de aumentar la afinidad y, por lo tanto, la potencia de neutralización por DENV-4. Para hacer esto, se generó un modelo estructural de 4E11 con EDIII y luego se analizó para identificar determinantes de unión específicos de serotipo de 4E11.
Desarrollo de tecnología y herramientas
[0246] Sistemas de computación convencionales para la ingeniería de proteínas normalmente se basan en métodos basados en energéticos. Los resultados de estos métodos son generalmente muy sensibles a las ubicaciones precisas de los átomos en una estructura o modelo y, por lo tanto, estos métodos generalmente requieren una estructura cristalina o datos similares de alta resolución y calidad del complejo proteico de la proteína para un modelado preciso y predicciones de mutación beneficiosas. Además, los enfoques convencionales basados en la energía para la ingeniería de proteínas normalmente no incorporan propiedades y conocimientos específicos de anticuerpos.
[0247] Un enfoque diferente es usar la informática empírica, y métodos de propensión en pares específicamente en residuos (Tharakaraman K. et al. (2013) Proc Natl Acad Sci e E.UU. 23; 110(17):E1555-64). El diseño de un anticuerpo con reactividad cruzada amplia para el virus del dengue con actividad de amplio espectro y potencia in vivo aumentada se realizó mediante la evaluación de la propensión por pares ("idoneidad") para los residuos de paratopo dado el entorno del epítopo. Esta métrica de aptitud se basa en datos empíricos de las estructuras de anticuerpo-antígeno y es menos sensible a las ubicaciones precisas de los átomos en comparación con otros enfoques. Por tanto, este enfoque puede usarse eficazmente para mejorar la precisión del acoplamiento molecular computacional anticuerpo-antígeno y para aumentar la predicción de mutaciones potenciadoras de la afinidad y la identificación de posiciones para la maduración de la afinidad.
Solicitud: mAb de plantilla modificados para la unión de pM-nM a los cuatro serotipos de DENV.
[0248] Se generó un modelo estructural 4E11-EDIII y se predijeron mutaciones/posiciones potenciadoras de la afinidad. Por ejemplo, se predijeron mutaciones individuales en sitios específicos y se seleccionaron posiciones para la creación de bibliotecas combinatorias enfocadas y racionales. Como se muestra en la Figura 23, el anticuerpo D88 humanizado resultante demuestra, con respecto al anticuerpo 4E11, una ganancia de afinidad 10.000 veces a DENV-4 con una afinidad mejorada concurrente a DENV1-3.
Comparación de los mAb A11 con mAb 4E11
[0249] Una comparación entre los anticuerpos antidengue 4E11 (cuyo anticuerpo se describe en Thullier et al, J Biotechnol 1999 abr 15; 69 (2-3): 183-90) y A11 (4E5A) se proporciona en Tharakaraman et al., Proc Natl Acad Sci EE.UU. 2013; 110 (17): E1555-64. 4E5A tiene cinco mutaciones puntuales en relación con 4E11, en A55E (VH), R31K (VL), N57E (VL), E59Q (VL), y S60W (VL) (Tharakaraman et al., 2013, Proc Natl Acad Sci EE. UU. 2013; 110 (17): E1555-64).
Ejemplo 2. Del26 mejora la actividad de neutralización DV-4.
[0250] B11 es un anticuerpo antidengue con una deleción de la cadena pesada de S26 en marco 1 (FR1) con relación a A11 (4E5A). 4G2 es un anticuerpo antidengue control. La actividad de neutralización de cada anticuerpo para EDIII de cuatro serotipos del virus del dengue se ensayó mediante una prueba de neutralización de reducción de foco (FRNT).
[0251] La prueba de neutralización de reducción de foco detecta focos formados cuando el virus del dengue infecta las células huesped Vero. Brevemente, diluciones de anticuerpo se mezclan con un volumen igual de virus diluido, y la mezcla se transfiere a monocapas de células Vero, y los focos se detectan. Los datos se expresan como infectividad relativa. El FRNT50 representa la concentración de anticuerpo requerida para alcanzar 50% de neutralización de virus. Un protocolo más detallado para la prueba de reducción de enfoque de neutralización se puede encontrar en Tharakaraman et al., 2013, Proc Natl Acad Sci EE.UU. 2013; 110 (17): E1555-64.
[0252] Los cuatro paneles gráficos de la Figura 2 muestran las actividades de neutralización de cada anticuerpo contra cepas representativas de serotipos del virus de dengue. La Figura 3 es un ensayo repetido de cada anticuerpo contra el serotipo del virus del dengue DV-4. Los resultados se resumen en la tabla en la parte inferior de la Figura 2, que muestra la CI50 de cada anticuerpo contra el virus (en pg/ml).
[0253] Inesperadamente, la deleción de un aminoácido en la región de marco 1 otorga actividad de neutralización DV-4 mejorada en B11. Más específicamente, en comparación con A11, que tiene una CI50 de 4,0 a 17,6 pg/ml, el anticuerpo B11 mejora la neutralización de DV-4, el logro de una CI50 de 0,50 a 1,4 pg/mL. Estos resultados indican que B11 logra una CI50 aproximadamente 8 a aproximadamente 12 veces menor que A11. Sobre la base de la actividad de neutralización superior de B11, se crearon variantes humanizadas de B11.
Ejemplo 3. Anticuerpos antidengue humanizados.
[0254] La Figura 4 describe algunos anticuerpos humanizados relacionados con A11 y B11. Se ensayaron diversos marcos de humanización. Las cuatro columnas más a la derecha muestran la afinidad de cada anticuerpo para EDIII de los serotipos de virus del dengue DV-1, DV-2, DV-4, y DV-4. Una mutación A98V en la cadena pesada FW3 (comparar anticuerpo B48 A98V a anticuerpo B48) mejoró la unión a DV-4 en aproximadamente 5 veces, mientras que conserva o mejora de la unión a los otros serotipos.
Ejemplo 4. Mutaciones inversas de anticuerpos antidengue humanizados.
[0255] Para mejorar la afinidad del anticuerpo por EDIII, especialmente en DV-4, se hicieron varias copias de mutaciones para la cadena pesada N-terminal de anticuerpos humanizados seleccionados. La Figura 5 muestra que D48, que es una reversión completa de ratón de N-terminal, tiene una mejora en aproximadamente dos veces en la afinidad con respecto a un anticuerpo con un N-terminal completamente humanizado. En otros casos, la mutación inversa dio como resultado una afinidad similar, ligeramente inferior o ligeramente superior para EDIII-DV-4.
[0256] La columna más a la derecha en la tabla superior e inferior de la Figura 5 muestra que la afinidad de anticuerpos humanizados para DV-4 son entre 7,494 y 26,89 nM. Esta retención de actividad de unión indica que hay una buena cantidad de tolerancia para la mutación en la región N-terminal, por ejemplo, en las posiciones 1-6 de la cadena pesada.
Ejemplo 5. La mejora en la afinidad del anticuerpo a través de una combinación de mutaciones de mejora de la afinidad.
[0257] Para mejorar aún más la afinidad de los anticuerpos humanizados para DV-4, diversas mutaciones de afinidad de mejora se ensayaron solas o en combinación. En la Figura 6 , se ensayaron las siguientes mutaciones: T33V, DE126, G27A, G27Y, F28W, F28G, F28A, y F28Y, todas en el VH. Se encontró que Del26 y T33V juntos (en anticuerpo de D88) mejoraban la afinidad por EDIIIDV-4 en alrededor de 4 veces en comparación con la mutación T33V sola (en anticuerpo C88). La mutación doble del26 y T33V encontrada en el anticuerpo D88 también mejora la afinidad sobre un anticuerpo que tiene la mutación del26 sola. Esta mejora aditiva o sinérgica en la unión fue inesperada.
[0258] A partir de la Figura 6 , también es evidente que varias mutaciones se pueden combinar sin reducir la afinidad o con sólo una modesta reducción en la afinidad (p. ej., F28W y T33V en el anticuerpo D118, G27A y T33V en el anticuerpo D98, G27Y y T33V en el anticuerpo D148, G27Y y F28W y T33V en el anticuerpo D108, y G27A y F28W y T33V en el anticuerpo D128). Este experimento indica que el anticuerpo tiene una cierta tolerancia para las sustituciones en las posiciones 27 y 28.
[0259] A continuación, mutaciones en la posición 98 en el VH se ensayaron en combinación con otras mutaciones. La secuencia humanizada original tiene A en la posición 98. La Figura 7 muestra que 98V mejora la unión a DV-4 sobre de dos veces en relación con 98S o 98A, en el contexto de una mutación T33V (ver tres filas superiores de la tabla). Las tres filas inferiores de la tabla muestran que las mutaciones en la posición 98 no tienen un fuerte efecto en el contexto de la doble mutación DE126 T33V. Por consiguiente, la molécula de anticuerpo tiene una cierta tolerancia a mutaciones al residuo 98.
Ejemplo 6. Los estudios de unión adicionales en anticuerpos antidengue humanizados.
[0260] Varios anticuerpos antidengue humanizados se ensayaron para determinar su capacidad para unir EDIII de serotipos de virus del dengue DV-1, DV-2, DV-3, y DV-4. La Figura 8 muestra la afinidad de los anticuerpos tal como se determina mediante un ensayo de ELISA de competencia, y la Figura 9 muestra la afinidad de los anticuerpos como se determina por SPR. Mientras que todos los anticuerpos humanizados tienen una afinidad fuerte (p. ej., todos son de menos de o igual a 24,35 nM y muchos están en el intervalo sub-nanomolar), algunos anticuerpos tienen una unión particularmente fuerte. Por ejemplo, C88 y D88 se unen a DV-1 con una mayor afinidad en aproximadamente 20 veces que C98. Todos los tres anticuerpos de la Figura 9 tienen aproximadamente igual afinidad por DV-2 y para DV-3. De los anticuerpos en la Figura 9, D88 tiene la afinidad más fuerte para DV-4.
[0261] Existe diversidad genética y de antígenos del virus del dengue no sólo entre los serotipos sino también dentro de los serotipos. Para investigar más completamente la anchura de la unión por anticuerpos contra el virus del dengue, se realizaron una serie de análisis para identificar un panel de secuencias de cepas que captura adicionalmente la diversidad de secuencias de virus del dengue, específicamente en EDIII. En primer lugar, >3,500 secuencias de la proteína E de dengue aisladas de virus de NCBI GenBank se analizaron para diversidad de aminoácidos en EDIII. A partir de este análisis, se identificó y seleccionó un conjunto de 21 secuencias de cepa EDIII para representar más completamente la diversidad de virus del dengue. Más específicamente, aquellas secuencias representan todos los genotipos que tienen evidencia de reciente circulación y aislados recientes de las principales regiones endémicas (cepas clínicamente relevantes). Aislados, por ejemplo, los que tienen posiciones de diversidad cerca o en la región de epítopo, se seleccionaron siempre que sea posible. Adicionalmente, se incluyeron cepas prototípicas. La relación filogenética de las secuencias de aminoácidos EDIII del panel seleccionado de aislados de virus del dengue 21 se resume en la Figura 10A. Los resultados de la unión de anticuerpo D88 a un panel de proteínas EDIII de veintiún diversas cepas de dengue se muestran en la Figura 10B. Como se muestra en la Figura 10B, el anticuerpo D88 exhibe unión de espectro completo a virus del dengue.
Ejemplo 7. Anticuerpos antidengue humanizados se unen a EDIII de un número de cepas de serotipos DV-2, DV-3, y DV-4.
[0262] D88 (Figura 11, la columna más a la derecha) y C88 (segunda columna de la derecha) se ensayaron para determinar la capacidad de unirse de EDIII aislado a partir de diversas cepas de virus del dengue. El serotipo y la ubicación geográfica de la cepa se indican en las dos columnas de la izquierda. En general, los anticuerpos muestran una buena amplitud de unión, que indica que son probablemente eficaces contra una amplia gama de cepas de virus del dengue.
Ejemplo 8. Anticuerpos antidengue humanizados neutralizan virus del dengue en un ensayo de neutralización por reducción de enfoque.
[0263] Los anticuerpos humanizados tienen la capacidad de neutralizar DV-1, DV-2, DV-3 y DV-4 en un ensayo de neutralización por reducción de enfoque. El ensayo se describe anteriormente en el Ejemplo 2. Las Figuras 12, 13, y 14 muestran los resultados de estos experimentos con las cepas representativas DV-3 y DV-4. Los anticuerpos humanizados son eficaces en la neutralización de virus del dengue en este ensayo. Por ejemplo, A48, C98 y D88 logran una EC50 inferior para DV-4 que el anticuerpo antidengue A11 de ratón (Figura 12). La Figura 13 muestra que los anticuerpos D88, D188, y D128 tienen una CE50 en el intervalo de 426 a 506 ng/ml para esta cepa de DV-3. Además, D88, D188, D128 y tenían una CE50 inferior para DV-4 que el anticuerpo antidengue A11 de ratón (Figura 14). Los anticuerpos humanizados también tienen la capacidad de neutralizar DV-1 y DV-2 (datos no mostrados). Fue inesperado que los anticuerpos humanizados se harían con una actividad mayor que un anticuerpo antidengue de ratón. En base al menos en parte, en los datos que se muestran en el presente documento y análisis de secuencias de los aislados de dengue conocidos de unión, moléculas de anticuerpo antidengue humanizado como se describe en la presente memoria es probable que tengan amplia capacidad de neutralización a través de todos los serotipos y genotipos con esas cepas enumeradas en el presente documento representantes de la diversidad del virus del dengue.
Ejemplo 9. La estabilidad térmica de los anticuerpos humanizados se ensayó por análisis de desplazamiento térmico.
[0264] Los anticuerpos humanizados seleccionados se ensayaron para determinar la estabilidad mediante el análisis de desplazamiento térmico usando el reactivo de Sypro Orange. Los resultados de los experimentos se muestran en las Figuras 15A, 15B, y 15C. En general, los anticuerpos humanizados mostraron buena estabilidad, a menudo tiene una Tm entre aproximadamente 64 y 68.
Ejemplo 10. Modelos de ratón para el virus del dengue.
[0265] Las moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento pueden ser ensayadas para la eficacia en un modelo animal. Uno de estos modelos, el modelo AG129 de ratón se describe en Tharakaraman et al., 2013, Proc Natl Acad Sci EE.UU. 2013; 110 (17): E1555-64. La cepa AG129 de ratón, que carece de receptores de interferón tanto de tipo I como de tipo II, es un modelo animal comúnmente usado que se replica algunas de las manifestaciones de la enfermedad observados en casos clínicos de dengue, incluyendo viremia y otros signos de enfermedad. Ratones AG129 infectados pueden experimentar deterioro neurológico asociado con la replicación DENV en el cerebro, que es sólo muy raramente observada en pacientes humanos infectados con el virus. Esto a menudo conduce a la muerte de los ratones AG129 infectados aproximadamente 18 días después de la exposición al virus (Stein, D.A., et al, J Antimicrob Chemother, 2008. 62 (3): P 555-65.; Johnson AJ, Roehrig JT J Virol. 1999 ene; 73 (1): 783-6 a pesar de la falta de similitudes con la infección humana, este modelo es útil en la evaluación de los tratamientos antivirales y se puede utilizar en estudios de prueba de principio brevemente, el AG129 (que es deficiente en receptores IFN-a/p e IFN-y) del ratón es expuesto al virus del dengue, y se administra una molécula de anticuerpo terapéutico candidata. Típicamente, el título de viremia (virus en una muestra de sangre) es el punto final del experimento. La viremia se puede medir, por ejemplo, con RT-PCR cuantitativa. En este estudio, viremia, cambio de peso y supervivencia fueron utilizados como signos de la enfermedad después de la infección con la cepa de Nueva Guinea C (NGC) de DENV-2. Los resultados mostrados en este ejemplo demuestran una fuerte actividad inhibidora in vivo de D88 de anticuerpos en un modelo de ratón DENV-2.
[0266] Los animales se aleatorizaron en bloque según jaula a grupos, con 10 incluidos en cada uno. Los animales fueron tratados con anticuerpo D88, un control de isotipo irrelevante mAb (CMAB), o placebo un día antes de la exposición al virus. Un grupo de ratones, que no fueron expuestos al virus, se trataron con D88 y sirvieron como controles de toxicidad. Un grupo de ratones también se incluyó como controles normales, y no fueron tratados o expuestos al virus para controlar la manipulación y el enjaulado de técnicas para los efectos sobre los ratones AG129 inmunocomprometidos. Una dilución de 10-1 (1068 CCID50 (dosis infecciosa de cultivo celular 50%)/ml) del virus se preparó en medio esencial mínimo. Los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal (i.p.) con 0,4 ml del virus diluido (1064 CCID5ü/animal). Se observó la mortalidad diaria durante 31 días. Los ratones se pesaron el día 0 y cada dos días a partir de las 1 dpi (día después de la infección). Se recogió el suero de todos los animales en 3 dpi para la cuantificación de la viremia mediante qRT-PCR.
[0267] La Figura 16 muestra el porcentaje de supervivencia de ratones D88 administrada (25 mg/kg), D88 (5 mg/kg), CMAB, o PBS, después de la infección con virus del dengue. Como se muestra en la Figura 16, aproximadamente el 90% de los ratones tratados con 25 mg/kg de D88 y aproximadamente 60% de los ratones tratados con 5 mg/kg de D88 sobrevivió hasta el día 31, mientras que todos los ratones control tratados con CMAB o PBS murieron en o antes del día 17.
[0268] La Figura 17 muestra el cambio de peso medio de los ratones administrados con D88 (25 mg/kg), D88 (5 mg/kg), CMAB, o PBS, después de la infección con virus del dengue. Los ratones tratados con D88 (25 mg/kg) o PBS pero no infectados con el virus del dengue (simulado) se ensayaron también. Como se muestra en la Figura 17, los ratones administrados con anticuerpo D88 no tuvo cambio de peso significativo incluso 31 días después de la infección, mientras que los ratones administrados con CMAB o PBS tuvieron una pérdida de peso significativa en el día 15. Como control, los ratones tratados con D88 o PBS pero no infectados con virus del dengue no mostraron cambio de peso aparente.
[0269] La Figura 18 muestra el título de viremia en ratones administrados con D88 (25 mg/kg), D88 (5 mg/kg), CMAB, o PBS, después de la infección con virus del dengue. Los resultados se expresan como UFP extrapolada por ml y equivalentes de copias del genoma (CME)/mL. Significación con un valor de p <0,001 se muestra por los símbolos ***. Como se muestra en la Figura 18, los ratones administrados con CMAB (control de isotipo) o PBS tenía mayor título de viremia en comparación con los ratones tratados con 25 mg/kg de D88 o 5 mg/kg de D88.
[0270] Estos resultados demuestran que una sola administración sistémica de anticuerpo D88 resultó en una reducción rápida de la circulación de los títulos virales. El anticuerpo D88 proporcionó protección fuerte, con 9/10 y 6/10 animales a los 25 y 5 mg/kg, respectivamente, sobreviviendo la exposición letal a DENV-2. El anticuerpo D88 demostró una reducción significativa y dependiente de la dosis en el título viral en el día 3 después de la infección, el día del pico de viremia.
Ejemplo 11. Protección contra ADE in vivo.
[0271] Las moléculas de anticuerpo descrito en el presente documento pueden ser ensayadas para la eficacia en modelos animales. Uno de estos modelos, la infección por virus del dengue grave mejorada por anticuerpo en ratones AG129, se describe en Balsitis et al, 2010 (Lethal antibody enhancement of dengue disease in mice is prevented by Fc modification, PLoS Pathogens, 2010 Feb 12; 6 (2): e1000790). Brevemente, ratones AG129 fueron administrados con anticuerpo de mejora del virus del dengue (p. ej., antisuero DV1 o anticuerpo monoclonal 4G2) 1 día antes de la estimulación con virus del dengue (p. ej., D2S10). La molécula de anticuerpo candidata se administra 1 día antes de la exposición (profilaxis) o 1 o 2 días después de la exposición (terapéutica). Típicamente, la mortalidad es el punto final del experimento; viremia y citoquinas inflamatorias (p. ej., TNF-a) los niveles en el suero también pueden servir como puntos finales.
Ejemplo 12. La neutralización de serotipos dek virus del dengue propagados en insectos y células de mamíferos.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de anticuerpo capaz de unirse al virus del dengue, que comprende:
(a) una región variable de inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y
(b) una región variable de inmunoglobulina de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
2. La molécula de anticuerpo de la reivindicación 1, que
(a) es un Fab, F(ab’)2, Fv, o un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv); o
(b) comprende una región constante de cadena pesada seleccionada entre IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4; y/o (c) comprende una región constante de cadena ligera elegida entre las regiones constantes de cadena ligera de kappa o lambda.
3. Una composición farmacéutica que comprende la molécula de anticuerpo de la reivindicación 1 o 2 y un vehículo, excipiente o estabilizador farmacéuticamente aceptable.
4. Un ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena ligera y pesada del anticuerpo de la molécula de anticuerpo de la reivindicación 1 o 2.
5. Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo de la molécula de anticuerpo de la reivindicación 1 o 2 y un ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena ligera del anticuerpo de la molécula de anticuerpo de la reivindicación 1 o 2.
6. Una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo de la molécula de anticuerpo de la reivindicación 1 o 2 y un ácido nucleico que codifica el anticuerpo de cadena ligera de la región variable de la molécula de anticuerpo de la reivindicación 1 o 2.
7. Un método de producir una molécula de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la misma, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 6 en condiciones adecuadas para la expresión génica.
8. Un kit que comprende un recipiente que tiene dispuesta en él una molécula de anticuerpo según la reivindicación 1 o 2; un portador, excipiente o estabilizador farmacéuticamente aceptable; y opcionalmente un dispositivo de administración, en el que opcionalmente el dispositivo de administración comprende una jeringa o aguja, o en el que el kit comprende además instrucciones de uso.
9. Una molécula de anticuerpo de la reivindicación 1 o 2 para su uso en un método de neutralización del virus del dengue en un sujeto, o para su uso en un método de tratamiento o prevención del virus del dengue, opcionalmente, en el que el virus del dengue es del serotipo DV-1, DV. -2, DV-3 o DV-4, opcionalmente, en el que dicha molécula de anticuerpo se administra por vía parenteral o intravenosa.
10. La molécula de anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en la que dicha molécula de anticuerpo se administra al sujeto en combinación con:
(a) un agente antivírico, opcionalmente, en el que el agente antivírico es:
(i) elegido entre uno o más de balapiravir, cloroquina, celgosivir o ivermectina;
(ii) un anticuerpo antidengue elegido entre uno o más de los anticuerpos que comprenden: una secuencia de aminoácidos VH de SEQ ID NO: 80 y una secuencia de aminoácidos VL de SEQ ID NO: 2; una secuencia de aminoácidos VH de SEQ ID NO: 16 y una secuencia de aminoácidos VL de SEQ ID NO: 2; una secuencia de aminoácidos VH de SEQ ID NO: 17 y una secuencia de aminoácidos VL de SEQ ID NO: 2; una secuencia de aminoácidos VH de s Eq ID NO: 81 y una secuencia de aminoácidos VL de SEQ ID NO: 2; una secuencia de aminoácidos VH de SEQ ID NO: 18 y una secuencia de aminoácidos VL de SEQ ID NO: 2; una secuencia de aminoácidos VH de SEQ ID NO: 19 y una secuencia de aminoácidos VL de SEQ ID NO: 2; una secuencia de aminoácidos VH de SEQ ID NO: 20 y una secuencia de aminoácidos VL de SEQ ID NO: 2; una secuencia de aminoácidos VH de SEQ ID NO: 21 y una secuencia de aminoácidos VL de SEQ ID NO: 2; una secuencia de aminoácidos VH de SEQ ID NO: 23 y una secuencia de aminoácidos VL de SEQ ID NO: 2; una secuencia de aminoácidos VH de SEQ ID NO: 25 y una secuencia de aminoácidos VL de SEQ ID NO: 2; una secuencia de aminoácidos VH de SEQ ID NO: 27 y una secuencia de aminoácidos VL de SEQ ID NO: 2; una secuencia de aminoácidos VH de SEQ ID NO: 29 y una secuencia de aminoácidos VL de SEQ ID NO: 2; una secuencia de aminoácidos VH de SEQ ID NO: 31 y una secuencia de aminoácidos VL de SEQ ID NO: 2; una secuencia de aminoácidos VH de SEQ ID NO: 32 y una secuencia de aminoácidos VL de SEQ ID NO: 2; una secuencia de aminoácidos VH de SEQ ID NO: 33 y una secuencia de aminoácidos VL de SEQ ID NO: 34; o una secuencia de aminoácidos VH de SEQ ID NO: 36 y una secuencia de aminoácidos VL de SEQ ID NO: 34;
(iii) elegido entre uno o más de un inhibidor de la alfa-glucosidasa I, un inhibidor de nucleósido de adenosina, un inhibidor de NS3 y/o su cofactor NS2B, un inhibidor de la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp), un inhibidor de la biosíntesis de pirimidina del huésped, un inhibidor de la proteína NS4B viral, o un iminoazúcar, opcionalmente en donde el inhibidor de la alfaglucosidasa I es celgosivir, el inhibidor del nucleósido de adenosina es NITD008, el inhibidor de NS3 y/o su cofactor NS2B es un compuesto [5-amino-1 -(fenil)sulfonil-pirazol-3-il], el inhibidor de la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) es NITD107, el inhibidor de la biosíntesis de pirimidina del hospedador es un inhibidor de dihidroorotato deshidrogenasa del hospedador (DHODH) seleccionado de NITD-982 o brequinar, el inhibidor de la proteína viral NS4B es NITD-618, o el iminoazúcar es UV-4; o
(b) una vacuna.
11. Una molécula de anticuerpo según la reivindicación 1 o 2 para su uso en un método para reducir el riesgo de un paciente de contraer el virus del dengue, o para su uso en un método para reducir la transmisión del virus del dengue entre un sujeto y un mosquito.
12. Un método para detectar el virus del dengue en una muestra biológica, que comprende (i) poner en contacto la muestra (y opcionalmente, una muestra de referencia) con una molécula de anticuerpo de la reivindicación 1 o 2 en condiciones que permitan que ocurra la interacción de la molécula de anticuerpo y la muestra, y (ii) detectar la formación de un complejo entre la molécula de anticuerpo y la muestra (y opcionalmente, la muestra de referencia).
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