CN108912215A - 用于登革病毒表位的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于登革病毒表位的方法和组合物。本发明提供了含有包含登革病毒E糖蛋白骨架的嵌合登革病毒E糖蛋白的组合物和使用方法，所述嵌合登革病毒E糖蛋白包含引入登革病毒E糖蛋白结构域I和结构域II铰链区的氨基酸取代，所述登革病毒E糖蛋白结构域I和结构域II铰链区来自不同于登革病毒E糖蛋白骨架的登革病毒血清型的登革病毒血清型。

Description

用于登革病毒表位的方法和组合物
本申请是申请日为2013年3月15的中国专利申请 “201380028954.7”的分案申请。
优先权的声明
本申请要求根据35 U.S.C. § 119(e)，于2012年4月2日提交的美国临时申请序列号61/619,247的权益，所述申请的完整内容通过引用并入本文。
政府支持的声明
本发明是在美国国立卫生研究院授予的拨款号U54 AI057157下的政府支持进行的。美国政府享有本发明中的某些权利。
技术领域
本发明部分基于本发明人对新型复合四级结构(quaternary structure)登革病毒表位的发现，该登革病毒表位跨越装配病毒颗粒中的相邻E蛋白二聚体。进一步，本发明人已经证明，针对该表位的抗体中和登革病毒感染。这些发现对于旨在产生针对登革病毒的免疫应答的免疫原性组合物的设计和表征具有重要意义。
具体而言，本发明人已经鉴定了登革病毒表位，其具有跨越一个E蛋白同型二聚体中的E蛋白的结构域I和II之间的铰链区的足迹(footprint)。在一些情况下，该表位延伸到来自相邻同型二聚体中E蛋白的结构域III的部分中，其中两个E蛋白在它们各自的同型二聚体内都处于相同取向。
背景技术
登革热是由蚊子传播的黄病毒，其正在以前所未有的速度传播，并且已经发展成为超过50个国家中的主要的健康和经济负担。即使受感染个体发展出有效且持久的血清型特异性中和抗体(Ab)，但与人的中和性Ab连结的表位还没有得到鉴定。此处，本发明人证明，人中的登革病毒(DENV)特异性血清Ab应答由大部分交叉反应的中和不良的Ab和小部分血清型特异性的强效抑制性Ab组成。尽管很多小鼠生成的强烈中和性单克隆抗体(MAbs)识别存在于重组DENV包膜(E)蛋白上的表位，但出乎意料的是，人免疫血清中大多数中和性Ab结合至完整的病毒颗粒，但不结合至纯化的可溶性E蛋白的胞外结构域。使用源自DENV免疫个体的新生成的人MAb证实了这些使用多克隆Ab的结论。三种强烈中和性的人MAb中的两种结合至E蛋白表位，所述表位保存在病毒颗粒上但没有保存在重组E (rE)蛋白上。因此，提出人产生如下的Ab，所述Ab通过结合只有在E蛋白装配在病毒颗粒上时表达的复合四级结构表位而中和DENV感染。定位(mapping)研究表明，这种表位具有跨越相邻E蛋白二聚体的足迹且包括在E蛋白的结构域I和II之间的铰链处的残基。这些结果对于DENV Ab和疫苗领域具有重要意义。
发明内容
因此，本发明提供了登革病毒表位(例如，分离的登革病毒表位)，其跨越相邻的登革病毒E蛋白二聚体，并且包含来自第一E蛋白二聚体的第一E蛋白的结构域I和II之间的铰链区以及来自第二E蛋白二聚体的第二登革病毒E蛋白的结构域III。
本发明的登革病毒表位可以存在于完整的病毒颗粒(例如，杀灭的或活减毒的病毒颗粒或重组登革病毒载体)或病毒样颗粒(VLP)，其可以任选地为完整的登革病毒颗粒或登革病毒VLP。
或者，可以对登革病毒颗粒或VLP进行处理，例如，化学交联和/或用蛋白酶切割，以便从病毒衣壳释放表位且提供经处理形式的表位。
本发明还提供了分离的和/或重组的多肽，其包含登革病毒E蛋白结构域I和结构域II铰链区，肽间隔区，和至少部分的登革病毒E蛋白结构域III。尽管不希望受本发明的任何理论束缚，但看起来该表位在相邻的E蛋白同型二聚体之间形成，因为E蛋白结构域III在相同的E蛋白分子或甚至同型二聚体内不足够接近(参见，例如附录的图3)。因此，基于该知识，E蛋白可以进行工程改造，其中使E蛋白结构域III与E结构域I/II铰链区更密切接近，从而提供了在单一E蛋白分子内形成的表位。从制备和递送免疫原性组合物以产生针对登革病毒的免疫应答，例如，作为可溶性亚单位免疫原性组合物的观点来看，此类方法是期望的。
在进一步实施方案中，本发明提供了包含登革病毒E糖蛋白骨架的嵌合登革病毒E糖蛋白，其包含引入登革病毒E糖蛋白结构域I和结构域II铰链区的氨基酸取代，所述登革病毒E糖蛋白结构域I和结构域II铰链区来自不同于登革病毒E糖蛋白骨架的登革病毒血清型的登革病毒血清型。本文所述的嵌合登革病毒E糖蛋白可以进一步包含引入登革病毒E糖蛋白结构域III区的氨基酸取代，所述登革病毒E糖蛋白结构域III区来自不同于登革病毒E糖蛋白骨架的登革病毒血清型的登革病毒血清型。
本文还提供了嵌合黄病毒E糖蛋白，所述嵌合黄病毒E糖蛋白包含来自不是登革病毒的黄病毒的黄病毒E糖蛋白骨架，其包含将登革病毒E糖蛋白结构域I和结构域II铰链区引入黄病毒E糖蛋白骨架的氨基酸取代。本文所述的嵌合黄病毒E糖蛋白可以进一步包含将登革病毒E糖蛋白结构域III区引入黄病毒E糖蛋白骨架的氨基酸取代。
此外，本发明提供了在主体(subject)中产生针对登革病毒的免疫应答、在有需要的主体中治疗登革病毒感染、在主体中预防登革病毒感染和/或保护主体免于登革病毒感染的影响的方法，所述方法包括向所述主体施用有效量的本发明的分离的登革病毒表位、本发明的多肽、本发明的E糖蛋白、本发明的黄病毒颗粒或VLP、本发明的核酸、本发明的组合物和其任何组合。
在一些实施方案中，本发明的表位、蛋白、病毒颗粒和/或VLP可以容易地用于诊断方法中，以确定主体是否产生特异性结合天然四级表位的抗体，例如，以确定主体是否具有中和性抗体。此类诊断方法可用于，例如，确定登革病毒自然感染之后和/或施用意欲产生针对登革病毒的免疫应答的免疫原性组合物之后主体的免疫应答的质量(例如，以确定免疫原性组合物是否诱导特异性结合病毒上的天然四级表位的中和性抗体)。
本发明还提供了检测针对登革病毒的中和性抗体的方法，所述方法包括确定抗体是否结合本发明的分离的登革病毒表位、本发明的多肽、本发明的E糖蛋白和/或本发明的黄病毒颗粒或VLP的步骤，其中抗体与本发明的分离的登革病毒表位、本发明的多肽、本发明的E糖蛋白和/或本发明的黄病毒颗粒或VLP的结合检测到针对登革病毒的中和性抗体。
此外，本文提供了鉴定针对登革病毒的中和性抗体的方法，所述方法包括：(a) 使抗体与本发明的分离的登革病毒表位、本发明的多肽、本发明的E糖蛋白和/或本发明的黄病毒颗粒或VLP接触；和(b) 确定所述抗体是否结合本发明的分离的登革病毒表位、本发明的多肽、本发明的E糖蛋白和/或本发明的黄病毒颗粒或VLP，其中所述抗体与本发明的分离的登革病毒表位、本发明的多肽、本发明的E糖蛋白和/或本发明的黄病毒颗粒或VLP的结合将所述抗体鉴定为针对登革病毒的中和性抗体。
本发明进一步提供了鉴定在主体中诱导针对登革病毒的中和性抗体的免疫原性组合物的方法，所述方法包括：(a) 使来自已经施用免疫原性组合物的主体的生物样品与本发明的分离的登革病毒表位、本发明的多肽、本发明的E糖蛋白和/或本发明的黄病毒颗粒或VLP接触；(b) 确定所述生物样品是否包含结合本发明的分离的登革病毒表位、本发明的多肽、本发明的E糖蛋白和/或本发明的黄病毒颗粒或VLP的抗体；和(c) 如果所述生物样品包含结合至本发明的分离的登革病毒表位、本发明的多肽、本发明的E糖蛋白和/或本发明的黄病毒颗粒或VLP的抗体，则将所述免疫原性组合物鉴定为在主体中诱导针对登革病毒的中和性抗体。
本文还提供了鉴定在主体中诱导针对登革病毒的中和性抗体的免疫原性组合物的方法，所述方法包括：(a) 将包含登革病毒抗原的免疫原性组合物以有效诱导针对登革病毒抗原的抗体的量施用于主体；(b) 使来自所述主体的生物样品与本发明的分离的登革病毒表位、本发明的多肽、本发明的E糖蛋白和/或本发明的黄病毒颗粒或VLP接触；(c) 确定所述生物样品是否包含结合本发明的分离的登革病毒表位、本发明的多肽、本发明的E糖蛋白和/或本发明的黄病毒颗粒或VLP的抗体；和(d) 如果所述生物样品包含结合本发明的分离的登革病毒表位、本发明的多肽、本发明的E糖蛋白和/或本发明的黄病毒颗粒或VLP的抗体，则将所述免疫原性组合物鉴定为在主体中诱导针对登革病毒的中和性抗体。
本发明涉及以下项：
1. 分离的登革病毒表位，其跨越相邻的登革病毒E蛋白二聚体，并且包含来自第一E蛋白二聚体的第一E蛋白的结构域I和II之间的铰链区以及来自第二E蛋白二聚体的第二登革病毒E蛋白的结构域III。
2. 分离的多肽，其包含登革病毒E蛋白结构域I和结构域II铰链区，肽间隔区，和至少部分的登革病毒E蛋白结构域III。
3. 嵌合黄病毒病毒样颗粒(VLP)或嵌合黄病毒，其包含嵌合黄病毒E蛋白，所述嵌合黄病毒E蛋白包含登革病毒E蛋白结构域I和结构域II铰链区和至少部分的登革病毒E蛋白结构域III。
4. 包含登革病毒E糖蛋白骨架的嵌合登革病毒E糖蛋白，其包含引入登革病毒E糖蛋白结构域I和结构域II铰链区的氨基酸取代，所述登革病毒E糖蛋白结构域I和结构域II铰链区来自不同于所述登革病毒E糖蛋白骨架的登革病毒血清型的登革病毒血清型。
5. 项4的嵌合登革病毒E糖蛋白，其进一步包含引入登革病毒E糖蛋白结构域III区的氨基酸取代，所述登革病毒E糖蛋白结构域III区来自不同于所述登革病毒E糖蛋白骨架的登革病毒血清型的登革病毒血清型.
5.项4或5的嵌合登革病毒E糖蛋白，其中所述登革病毒E糖蛋白骨架来自登革病毒血清型1。
6. 项4或5的嵌合登革病毒E糖蛋白，其中所述登革病毒E糖蛋白骨架来自登革病毒血清型2。
7. 项4或5的嵌合登革病毒E糖蛋白，其中所述登革病毒E糖蛋白骨架来自登革病毒血清型3。
8. 项4或5的嵌合登革病毒E糖蛋白，其中所述登革病毒E糖蛋白骨架来自登革病毒血清型4。
9. 项4的嵌合登革病毒E糖蛋白，其中所述结构域I和结构域II铰链区来自登革病毒血清型1。
10. 项5的嵌合登革病毒E糖蛋白，其中所述结构域I和结构域II铰链区以及结构域III区来自登革病毒血清型1。
11. 项4的嵌合登革病毒E糖蛋白，其中所述结构域I和结构域II铰链区来自登革病毒血清型2。
12. 项5的嵌合登革病毒E糖蛋白，其中所述结构域I和结构域II铰链区以及结构域III区来自登革病毒血清型2。
13. 项4的嵌合登革病毒E糖蛋白，其中所述结构域I和结构域II铰链区来自登革病毒血清型3。
14. 项5的嵌合登革病毒E糖蛋白，其中所述结构域I和结构域II铰链区以及结构域III区来自登革病毒血清型3。
15. 项4的嵌合登革病毒E糖蛋白，其中所述结构域I和结构域II铰链区来自登革病毒血清型4。
16. 项5的嵌合登革病毒E糖蛋白，其中所述结构域I和结构域II铰链区以及结构域III区来自登革病毒血清型4。
17. 包含来自不是登革病毒的黄病毒的黄病毒E糖蛋白骨架的嵌合黄病毒E糖蛋白，其包含将登革病毒E糖蛋白结构域I和结构域II铰链区引入所述黄病毒E糖蛋白骨架的氨基酸取代。
18. 项17的嵌合黄病毒E糖蛋白，其进一步包含将登革病毒E糖蛋白结构域III区引入所述黄病毒E糖蛋白骨架的氨基酸取代。
19. 项17或项18的嵌合黄病毒E糖蛋白，其中所述黄病毒E糖蛋白骨架来自黄热病毒(YFV)、日本脑炎病毒(JEV)或西尼罗河病毒(WNV)。
20. 项17的嵌合黄病毒E糖蛋白，其中所述结构域I和结构域II铰链区来自登革病毒血清型1。
21. 项18的嵌合登革病毒E糖蛋白，其中所述结构域I和结构域II铰链区以及结构域III区来自登革病毒血清型1。
22. 项17的嵌合黄病毒E糖蛋白，其中所述结构域I和结构域II铰链区来自登革病毒血清型2。
23. 项18的嵌合登革病毒E糖蛋白，其中所述结构域I和结构域II铰链区以及结构域III区来自登革病毒血清型2。
24. 项17的嵌合黄病毒E糖蛋白，其中所述结构域I和结构域II铰链区来自登革病毒血清型3。
25. 项18的嵌合登革病毒E糖蛋白，其中所述结构域I和结构域II铰链区以及结构域III区来自登革病毒血清型3。
26. 项17的嵌合黄病毒E糖蛋白，其中所述结构域I和结构域II铰链区来自登革病毒血清型4。
27. 项18的嵌合登革病毒E糖蛋白，其中所述结构域I和结构域II铰链区以及结构域III区来自登革病毒血清型4。
28. 黄病毒颗粒或病毒样颗粒(VLP)，其包含项4-27中任一项的E糖蛋白。
29. 分离的核酸，其编码项4-27中任一项的E糖蛋白。
30. 分离的核酸，其编码项1的分离的登革病毒表位。
31. 分离的核酸，其编码项2的多肽。
32. 分离的核酸，其编码项3的嵌合VLP或项3的嵌合黄病毒的病毒衣壳。
33. 分离的核酸，其编码项28的黄病毒颗粒或VLP。
34. 组合物，其包含药学可接受的载体中的项1的分离的登革病毒表位、项2的多肽、项3的嵌合VLP、项4-27中任一项的E糖蛋白、项28的黄病毒颗粒或VLP、项29-33中任一项的核酸及其任何组合。
35. 在主体中产生针对登革病毒的免疫应答的方法，所述方法包括向所述主体施用有效量的项1的分离的登革病毒表位、项2的多肽、项3的嵌合VLP、项4-27中任一项的E糖蛋白、项28的黄病毒颗粒或VLP、项29-33中任一项的核酸、项34的组合物，及其任何组合。
36. 在有此需要的主体中治疗登革病毒感染的方法，所述方法包括向所述主体施用有效量的项1的分离的登革病毒表位、项2的多肽、项3的嵌合VLP、项4-27中任一项的E糖蛋白、项28的黄病毒颗粒或VLP、项29-33中任一项的核酸、项34的组合物，及其任何组合。
37. 在主体中预防登革病毒感染的方法，所述方法包括向所述主体施用有效量的项1的分离的登革病毒表位、项2的多肽、项3的嵌合VLP、项4-27中任一项的E糖蛋白、项28的黄病毒颗粒或VLP、项29-33中任一项的核酸、项34的组合物，及其任何组合。
38. 保护主体免于登革病毒感染的影响的方法，所述方法包括向所述主体施用有效量的项1的分离的登革病毒表位、项2的多肽、项3的嵌合VLP、项4-27中任一项的E糖蛋白、项28的黄病毒颗粒或VLP、项29-33中任一项的核酸、项34的组合物，及其任何组合。
39. 检测针对登革病毒的中和性抗体的方法，所述方法包括确定抗体是否结合项1的分离的登革病毒表位、项2的多肽、项3的嵌合VLP、项4-27中任一项的E糖蛋白，或项28的黄病毒颗粒或VLP，其中所述抗体与项1的分离的登革病毒表位、项2的多肽、项3的嵌合VLP、项4-27中任一项的E糖蛋白、和/或项28的黄病毒颗粒或VLP的结合表明所述抗体是针对登革病毒的中和性抗体。
40. 鉴定针对登革病毒的中和性抗体的方法，其包括：
(a) 使抗体与项1的分离的登革病毒表位、项2的多肽、项3的嵌合VLP、项4-27中任一项的E糖蛋白、和/或项28的黄病毒颗粒或VLP接触；和
(b) 确定所述抗体是否结合项1的分离的登革病毒表位、项2的多肽、项3的嵌合VLP、项4-27中任一项的E糖蛋白、和/或项28的黄病毒颗粒或VLP；
其中所述抗体与项1的分离的登革病毒表位、项2的多肽、项3的嵌合VLP、项4-27中任一项的E糖蛋白、和/或项28的黄病毒颗粒或VLP的结合将所述抗体鉴定为针对登革病毒的中和性抗体。
41. 鉴定在主体中诱导针对登革病毒的中和性抗体的免疫原性组合物的方法，所述方法包括：
(a) 使来自已经施用所述免疫原性组合物的主体的生物样品与项1的分离的登革病毒表位、项2的多肽、项3的嵌合VLP、项4-27中任一项的E糖蛋白、和/或项28的黄病毒颗粒或VLP接触；
(b) 确定所述生物样品是否包含结合项1的分离的登革病毒表位、项2的多肽、项3的嵌合VLP、项4-27中任一项的E糖蛋白、和/或项28的黄病毒颗粒或VLP的抗体；和
(c) 如果所述生物样品包含结合项1的分离的登革病毒表位、项2的多肽、项3的嵌合VLP、项4-27中任一项的E糖蛋白、和/或项28的黄病毒颗粒或VLP的抗体，则将所述免疫原性组合物鉴定为在所述主体中诱导针对登革病毒的中和性抗体。
42. 鉴定在主体中诱导针对登革病毒的中和性抗体的免疫原性组合物的方法，所述方法包括：
(a) 以有效诱导针对登革病毒抗原的抗体的量向主体施用包含登革病毒抗原的免疫原性组合物；
(b) 使来自所述主体的生物样品与项1的分离的登革病毒表位、项2的多肽、项3的嵌合VLP、项4-27中任一项的E糖蛋白、和/或项28的黄病毒颗粒或VLP接触；
(c) 确定所述生物样品是否包含结合项1的分离的登革病毒表位、项2的多肽、项3的嵌合VLP、项4-27中任一项的E糖蛋白、和/或项28的黄病毒颗粒或VLP的抗体；和
(d) 如果所述生物样品包含结合项1的分离的登革病毒表位、项2的多肽、项3的嵌合VLP、项4-27中任一项的E糖蛋白、和/或项28的黄病毒颗粒或VLP的抗体，则将所述免疫原性组合物鉴定为在所述主体中诱导针对登革病毒的中和性抗体。
附图说明
图1：耗尽总的或交叉反应的DENV结合Ab的初次DENV免疫血清的结合和中和特性。(A和B) 使用用纯化的DENV3包被的聚苯乙烯珠粒从DENV3初次免疫血清(例如，主体011)中去除总DENV特异性Ab，且测试(A) DENV结合和(B)中和。用同源血清型耗尽的血清不结合四种登革病毒中的任一种，且未能中和DENV3。对于用负责感染的同源血清型耗尽的四种其它初次免疫血清(两种DENV2血清和两种DENV3血清)观察到类似的结果。(C–F) 使用用异源血清型的病毒包被的珠粒耗尽初次DENV2 (C和D)和DENV3 (E和F)免疫血清的交叉反应的Ab，并测试DENV病毒结合(C和E)和同源血清型的中和(D和F)。耗尽交叉反应的Ab的免疫血清含有仅结合来自同源血清型的病毒的类型特异性Ab。耗尽交叉反应的Ab的免疫血清与未耗尽或对照耗尽血清一样有效地进行中和。此处对于交叉反应的抗体耗尽呈现的结果是用四种初次DENV2和三种初次DENV3人免疫血清获得的数据的代表(参见表1)。通过平均结合值的未配对的学生t检验，*P<0.001。
图2：耗尽rE结合性Ab的初次DENV免疫血清的结合和中和特性。将来自同型菌株的DENV rE共价偶联至琼脂糖珠粒，且与相关DENV免疫血清孵育以耗尽DENV rE特异性Ab。(A-B) 免疫血清与rE蛋白的结合。(A) 初次DENV2和(B) DENV3免疫血清分别用DENV2和DENV3rE蛋白耗尽，且通过ELISA测量与来自四种血清型中每一种的rE蛋白的结合。用来自同源血清型的rE的耗尽导致与来自四种血清型中每一种的rE蛋白的结合的损失。(C) 也通过Western印迹分析证实从血清(例如，初次DENV3免疫主体003)的成功去除所有rE反应的Ab。将纯化的同型DENV病毒(700 ng/孔)和rE蛋白(500 ng/孔)进行电泳，转移至硝酸纤维素膜，且用非耗尽、对照耗尽或rE耗尽的血清(以1:1000稀释度)探测。(D-E) rE耗尽的血清对同源DENV病毒的中和使用U937+DC-SIGN基于流式细胞术的测定法进行测量。测试耗尽rE结合性Ab的(D)初次DENV2 (主体031)、(E) 初次DENV3 (主体003)人免疫血清的同源DENV中和。在从这两种血清样品中任一种中去除rE结合性Ab之后观察到中和效力没有降低。将总共六种初次免疫血清耗尽rE结合性Ab并进行测试(参见表2)。(F) 用rE接种的非人灵长类动物发展出可以用rE抗原耗尽的中和性Ab。将恒河猴(Macaca mulatta)用表达DENV3 E胞外结构域的甲病毒载体接种且加强，且在接种后10周收集血清。从接种动物(例如，M630)的血清耗尽rE结合性Ab去除了大于98％(通过比较对照耗尽和rE耗尽之间的Neut50值而估计的值)的中和性Ab。数据是两个接种的恒河猴对照的代表。
图3：从类型特异性中和性hMAb生成的逃避突变体的表位定位。(A-C) 各野生型(WT)和针对(A) 1F4、(B) 2D22和(C) 5J7的逃逸突变体的中和概况。使用U937+DC-SIGN基于流式细胞术的测定法(对于1F4和2D22)和通过FRNT (对于5J7)证实突变病毒的中和逃逸。(D-F) 表示表明对于1F4 (D)、2D22 (E)和5J7 (F)，EDIII和EDI-EDII铰链区上的逃逸突变的初始氨基酸的位置的放大图。图像分别用DENV1、DENV2和DENV3 E二聚体结构生成。DENV2和DENV3 E二聚体结构(RCSB登录号分别为1OAN和1UZG) (8, 9)使用Swiss PDB观察器和Pymol建模，以生成DENV1和DENV3 (Thai 95) E二聚体的结构。(G) 在CR4354的中和hMAb结合表位中鉴定的来自DENV和WNV的E蛋白区段的比对。导致从1F4(蓝色)、2D22(绿色)或5J7(粉红色)逃逸的突变突出显示在比对的DENV E蛋白序列的相关区域上。与此处描述的相应DENV逃逸突变重叠的CR4354表位的部分在比对的WNV (New York 2000)序列上以粗体突出显示。H. 将逃逸突变定位到对于TBEV (RCSB登录号1K4R) (10)生成的E聚合结构上。从1F4、2D22和5J7生成的逃逸突变的位置在所述结构上分别以蓝色(Gly274、K47)、绿(Arg323、His282、Asp362)和粉色(Gln271、Asn272，即赖氨酸***周围的残基)突出显示。跨越E蛋白二聚体的抗WNV CR4354 hMAb的足迹用白线圈起来。注意，1F4、2D22和5J7的所有逃逸突变都落在CR4354足迹内。*每种逃逸突变体的Neut50值与相应WT病毒显著不同(P<0.0001)。
图4：用任一种异源病毒或所有三种异源病毒耗尽的初次DENV免疫人血清的中和特性的比较。(A) 用DENV3病毒或DENV1、3和4病毒耗尽初次DENV2免疫血清(例如，主体019)对针对同型病毒DENV2的Neut50没有统计学显著效果。(B) 用DENV2病毒或DENV1、2和4病毒耗尽初次DENV3免疫血清(例如，主体003)对针对DENV3的Neut50没有统计学显著效果。数据是一式两份进行的单次实验的代表。使用单向ANOVA分析，随后用Tukey多重比较检验，对于每种血清比较未耗尽的、对照耗尽的、和交叉反应性耗尽的血清的Neut50值，P <0.05。
图5：使用小鼠MAb证实CNBr活化珠粒上的DENV2 rE结构。将小鼠MAbs, 9F16 (EDIII-特异性) (12)，4G2 (融合环-特异性)，DV2-30，DV2-46和DV2-58 (二聚体界面-特异性) (11)，和人mAbs，2D22 (病毒-特异性)与对照珠粒或DENV2 rE缀合珠粒在37℃孵育连续三次，持续2小时。通过捕获ELISA，测试耗尽样品与DENV2 rE的结合。(A) 结合DENV rE蛋白上的表位的所有先前定位的小鼠MAb都用共价缀合至珠粒的rE蛋白成功耗尽。(B) 病毒特异性的人mAb：2D22没有被rE蛋白耗尽。数据是一式两份进行的单独实验的代表。通过平均结合值的未配对的学生t检验，*P<0.001。
图6：共价缀合至珠粒的DENV rE量的滴定。将CNBr活化的珠粒与不同量(即，0,0.02, 0.2, 2, 10, 20和40 μg/ml)的DENV2和DENV3 rE蛋白混合，然后分别与初次DENV2(即，主体001)和DENV3(即，主体003)孵育。通过捕获ELISA测试剩余上清液的同源rE结合性抗体的存在。灰色箭头代表在确保用免疫血清的rE耗尽实验过程中添加至珠粒的rE的量。
图7：rE耗尽血清对同型登革病毒的结合特性。从(A)初次DENV2和(B)DENV3血清去除rE结合性抗体导致与同源病毒的结合(EC50)的统计学显著性(P< 0.05) 45±7%降低。统计分析使用单向ANOVA进行。数据是三种初次DENV2和三种初次DENV3人免疫血清的代表(参见表5)。
图8. 功能丧失：初次猴抗DENV3血清针对DENV 4、DENV 3和具有DENV 4铰链的DENV 3 (3/4铰链)的50％中和滴度。X轴显示病毒，且Y轴显示对数标度上的血清稀释度倒数。稀释度倒数值越高，血清针对特定病毒越有效。三种血清，8F7、3H3和2G5明显失去针对DENV 3/4铰链病毒的功效。
图9. 功能获得：初次猴抗DENV4血清针对DENV 4、DENV 3和具有DENV 4铰链的DENV 3 (3/4铰链)的50％中和滴度。X轴显示病毒，且Y轴显示对数标度上的血清稀释度倒数。稀释度倒数值越高，血清针对特定病毒越有效。所有四种血清都明显获得针对DENV 3/4铰链病毒的功效。
图10. 功能获得和丧失：初次人抗DENV3血清和抗DENV 4血清针对DENV 4、DENV 3和具有DENV 4铰链的DENV 3 (3/4铰链)的50％中和滴度。X轴显示病毒，且Y轴显示对数标度上的血清稀释度倒数。稀释度倒数值越高，血清针对特定病毒越有效。两种初次DENV-3血清明显失去针对DENV 3/4铰链病毒的功效，且两种初次DENV-4血清明显获得针对DENV 3/4铰链病毒的功效。
图11. 登革病毒血清型和其它黄病毒的E糖蛋白序列的比对。
具体实施方式
本发明部分基于以下预想不到的发现：定义DENV血清型的表位区域可以被转移至嵌合分子中或在嵌合分子中生成。因此，在一个实施方案中，本发明提供了包含登革病毒E糖蛋白骨架的嵌合登革病毒E糖蛋白，其包含引入登革病毒E糖蛋白结构域I和结构域II铰链区的氨基酸取代，所述登革病毒E糖蛋白结构域I和结构域II铰链区来自不同于登革病毒E糖蛋白骨架的登革病毒血清型的登革病毒血清型。在一些实施方案中，本文上述嵌合登革病毒E糖蛋白可以进一步包含引入登革病毒E糖蛋白结构域III区的氨基酸取代，所述登革病毒E糖蛋白结构域III区来自不同于登革病毒E糖蛋白骨架的登革病毒血清型的登革病毒血清型。在此类实施方案中，所述登革病毒E糖蛋白骨架可以来自登革病毒血清型1、登革病毒血清型2、登革病毒血清型3或登革病毒血清型4。
此外，本发明的嵌合登革病毒E糖蛋白的结构域I和结构域II铰链区可以来自登革病毒血清型1、登革病毒血清型2、登革病毒血清型3或登革病毒血清型4。
在其中嵌合登革病毒E糖蛋白包含引入登革病毒E糖蛋白结构域I和结构域II铰链区E的氨基酸取代且进一步包含引入登革病毒E糖蛋白结构域III区的氨基酸取代的实施方案中，所述结构域I和结构域II铰链区以及结构域III区可以来自登革病毒血清型1、登革病毒血清型2、登革病毒血清型3或登革病毒血清型4。
在本发明的额外实施方案中，提供了嵌合黄病毒E糖蛋白，所述嵌合黄病毒E糖蛋白包含来自不是登革病毒的黄病毒的黄病毒E糖蛋白骨架，其包含将登革病毒E糖蛋白结构域I和结构域II铰链区引入黄病毒E糖蛋白骨架的氨基酸取代。在一些实施方案中，嵌合黄病毒E糖蛋白可以进一步包含将登革病毒E糖蛋白结构域III区引入黄病毒E糖蛋白骨架的氨基酸取代。
在一些实施方案中，黄病毒E糖蛋白骨架可以来自任何黄病毒，包括但不限于，黄热病毒(YFV)、日本脑炎病毒(JEV)或西尼罗河病毒(WNV)。
此外，本发明的嵌合黄病毒E糖蛋白的结构域I和结构域II铰链区可以来自登革病毒血清型1、登革病毒血清型2、登革病毒血清型3或登革病毒血清型4。
在其中嵌合黄病毒E糖蛋白包含引入登革病毒E糖蛋白结构域I和结构域II铰链区E的氨基酸取代且进一步包含引入登革病毒E糖蛋白结构域III区的氨基酸取代的实施方案中，所述结构域I和结构域II铰链区以及结构域III区可以来自登革病毒血清型1、登革病毒血清型2、登革病毒血清型3或登革病毒血清型4。
本发明还提供了包含本发明的嵌合登革病毒E糖蛋白或嵌合黄病毒E糖蛋白的黄病毒颗粒或病毒样颗粒(VLP)。
此外，本发明提供了编码本发明的嵌合登革病毒E糖蛋白或嵌合黄病毒E糖蛋白的分离的核酸，以及编码本发明的分离的登革病毒表位的分离的核酸，编码本发明的多肽的分离的核酸，编码本发明的黄病毒颗粒、VLP或嵌合黄病毒的病毒衣壳的分离的核酸。
本文进一步提供了一种组合物，其包含在药学上可接受的载体中的本发明的分离的登革病毒表位、本发明的多肽、本发明的嵌合VLP、本发明的嵌合登革病毒E糖蛋白或嵌合黄病毒E糖蛋白、本发明的黄病毒颗粒或VLP、本发明的核酸及其任何组合。
登革病毒E糖蛋白结构域I和结构域II铰链区构成诱导中和性抗体的产生的构象表位。可以包括所有或部分E糖蛋白的结构域III区以形成诱导中和性抗体的产生的构象表位。
术语“登革病毒E蛋白结构域I和结构域II铰链区”和类似术语在本领域中被理解为包括登革病毒E糖蛋白中结构域I和II之间的三维界面和，任选地，邻近氨基酸残基。此外，本领域技术人员将理解，铰链区中的某些氨基酸残基可以促进表位的正确折叠和递呈，即使它们本身不形成表位的部分。在代表性实施方案中，登革病毒E蛋白结构域I和结构域II铰链区包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：登革病毒血清型3 (DENV3；例如，GenBank®数据库登录号JQ411814)的E蛋白的氨基酸位置47-59、124-133、199-222和/或206-228或其它登革病毒(例如，登革病毒血清型1 (DENV1；例如，GenBank® 数据库登录号U88535), 2 (DENV2；例如，GenBank®数据库登录号NC_001474)或DENV4；完全E糖蛋白序列显示于图11，且对应氨基酸编号在表6中提供)的E蛋白的对应位置。
术语“至少部分的登革病毒E蛋白结构域III”和类似术语是指形成表位的部分的E蛋白结构域III的那些部分以及促进表位的正确折叠和递呈的那些氨基酸残基，即使它们本身不形成表位的部分。在代表性实施方案中，登革病毒E蛋白结构域III包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：登革病毒血清型3的E蛋白的氨基酸位置305-308、323-325、359-362和/或389-390或其它登革病毒(例如，登革病毒血清型1 (DENV1)、2 (DENV2)或DENV4；完全E糖蛋白序列显示于图11，且对应氨基酸编号在表6中提供)的E蛋白的对应位置。
因此，本发明提供了在DENV2、DENV3或DENV4 E糖蛋白骨架中包含DENV1结构域I和结构域II铰链区的嵌合登革病毒E糖蛋白。还提供了在DENV2、DENV3或DENV4 E糖蛋白骨架中包含DENV1结构域I和结构域II铰链区以及结构域III区的嵌合登革病毒E糖蛋白。进一步提供了在DENV1、DENV2或DENV4 E糖蛋白骨架中包含DENV3结构域I和结构域II铰链区的嵌合登革病毒E糖蛋白。还提供了在DENV1、DENV2或DENV4 E糖蛋白骨架中包含DENV3结构域I和结构域II铰链区以及结构域III区的嵌合登革病毒E糖蛋白。进一步提供了在DENV1、DENV2或DENV3 E糖蛋白骨架中包含DENV4结构域I和结构域II铰链区的嵌合登革病毒E糖蛋白。还提供了在DENV1、DENV2或DENV3 E糖蛋白骨架中包含DENV4结构域I和结构域II铰链区以及结构域III区的嵌合登革病毒E糖蛋白。这些嵌合体的产生可以通过引入一些(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个等)或所有表6中鉴定的氨基酸取代来实施。不是表6中鉴定的每个氨基酸都需要被取代以产生本发明的嵌合蛋白。例如，在一些实施方案中，在本发明的嵌合体的产生中可以包括在作为各自表位区域的表6中鉴定的连续氨基酸序列的任一端进一步取代约1、2、3、4或5个氨基酸和/或遗漏约1、2、3、4或5个氨基酸的取代。产生期望的构象表位必需的取代的数目可以由本领域普通技术人员根据本文的教导且根据本领域众所周知的方案容易地确定。
在一些实施方案中，本发明提供了嵌合黄病毒E糖蛋白，其中进行氨基酸取代以将登革病毒表位引入来自不是登革病毒的黄病毒的黄病毒E糖蛋白。可以使用的黄病毒的非限制性实例包括黄热病毒(YFV)(例如，GenBank®数据库登录号JX503529)、日本脑炎病毒(JEV)(例如，GenBank®数据库登录号U14163)、西尼罗河病毒(WNV) (例如，GenBank®数据库登录号DQ211652)和现在已知或以后鉴定的任何其它黄病毒。因此，本发明提供了，例如在YFV、JEV或WNV E糖蛋白骨架中包含DENV1、DENV2、DENV3、或DENV4结构域I和结构域II铰链区的嵌合黄病毒E糖蛋白。还提供了在YFV、JEV或WNV E糖蛋白骨架中包含DENV1、DENV2、DENV3或DENV4结构域I和结构域II铰链区以及结构域III区的嵌合登革病毒E糖蛋白。
在其它实施方案中，术语“至少部分的登革病毒E蛋白结构域III”(和类似术语)包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：至少约6、8、10、12、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸，任选连续氨基酸，和/或小于约12、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸，任选连续氨基酸，包括前述的任何组合，只要下限小于上限。
在代表性实施方案中，肽间隔区包含以下，由以下组成或基本上由以下组成：约1、2、3或更少、4或更少、5或更少、6或更少、7或更少、8或更少、9或更少、10或更少、11或更少、12或更少、13或更少、14或更少、15或更少、16或更少、17或更少、18或更少、19或更少、20或更少、25或更少、30或更少、35或更少、40或更少、45或更少、50或更少、55或更少、60或更少、70或更少、80或更少、90或更少或100或更少个氨基酸。在实施方案中，肽间隔区包含以下，由以下组成或基本上由以下组成：约1至约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或100个氨基酸。在实施方案中，肽间隔区包含以下，由以下组成或基本上由以下组成：约3至约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或10个氨基酸。在实施方案中，肽间隔区包含以下，由以下组成或基本上由以下组成：约4至约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或100个氨基酸。在实施方案中，肽间隔区包含以下，由以下组成或基本上由以下组成：约5至约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或100个氨基酸。在实施方案中，肽间隔区包含以下，由以下组成或基本上由以下组成：约10至约20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或100个氨基酸。在实施方案中，肽间隔区包含以下，由以下组成或基本上由以下组成：约15至约20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或100个氨基酸。在实施方案中，肽间隔区包含以下，由以下组成或基本上由以下组成：约20至约25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90 或100个氨基酸。
在实施方案中，间隔区使得参与四级表位的E蛋白结构域I/II铰链区和结构域III区分开约10或更少、15或更少、20或更少、25或更少、30或更少、35或更少、40或更少、45或更少、50或更少、60或更少或70或更少埃。在实施方案中，间隔区使得参与四级表位的E蛋白结构域I/II铰链区和结构域III区分开约10至20、25、30、35、40、45、50、60或70埃。在实施方案中，间隔区使得参与四级表位的E蛋白结构域I/II铰链区和结构域III区分开约15至25、30、35、40、45、50、60或70埃。在实施方案中，间隔区使得参与四级表位的E蛋白结构域I/II铰链区和结构域III区分开约20至30、35、40、45、50、60或70埃。在实施方案中，间隔区使得参与四级表位的E蛋白结构域I/II铰链区和结构域III区分开约25至35、40、45、50、60或70埃。在实施方案中，间隔区使得参与四级表位的E蛋白结构域I/II铰链区和结构域III区分开约30至40、45、50、60或70埃。在实施方案中，间隔区使得参与四级表位的E蛋白结构域I/II铰链区和结构域III区分开约35至45、50、60 或70埃。
肽间隔区可以全部或部分源自天然E蛋白，或者可以部分或完全合成的。
在实施方案中，肽间隔区形成二级结构，例如，β折叠、β桶和/或α螺旋结构。在实施方案中，肽间隔区包含一个或多个二硫键(例如，胱氨酸残基)。
本领域已知，产生登革病毒疫苗的许多尝试导致非中和性抗体的产生，所述非中和性抗体可以增加随后暴露于自然感染或疫苗之后病理学的可能性。提供工程改造的表位的另一种方法是递送并入另一种黄病毒颗粒或VLP的所有或部分登革病毒E蛋白。在代表性实施方案中，异源黄病毒是西尼罗河病毒或黄热病病毒。可以将E蛋白的部分移植到异源黄病毒骨架的E蛋白中，例如，以减少针对存在于登革病毒E蛋白和/或其它登革病毒结构蛋白中的非中和性表位的非中和性登革病毒抗体的生成。
因此，嵌合黄病毒或嵌合黄病毒VLP可以呈现正确构象的四级登革病毒表位，同时减少针对不存在于嵌合黄病毒或黄病毒VLP中的登革病毒E蛋白和/或其它结构蛋白的其它部分的非中和性抗体的生成。
因此，作为另一个方面，本发明提供了包含嵌合黄病毒E蛋白的嵌合黄病毒颗粒或嵌合黄病毒VLP，包含登革病毒E蛋白结构域I和结构域II铰链区和至少部分的登革病毒E蛋白结构域III的嵌合黄病毒E蛋白。在本发明的实施方案中，由登革病毒E蛋白区域取代异源黄病毒E蛋白的对应区域。在实施方案中，来自登革病毒prM蛋白和/或登革病毒C蛋白的氨基酸序列不被并入嵌合黄病毒或嵌合黄病毒VLP。
在本发明的一些实施方案中，黄病毒E糖蛋白或登革病毒E糖蛋白的单独和构象表位可以被递呈在合成骨架或支持结构上，从而使得合成骨架或支持结构内的表位模拟E糖蛋白、病毒颗粒或VLP的结构内表位的构象和排列。
在本发明的又进一步实施方案中，本发明提供了模拟本发明的E糖蛋白的单独和构象表位的肽模拟表位(minitopes; 参见，Meloen等人(2000) J.Mol.Recognit.13, 352–359)。模拟表位可以使用本领域中已知的任何技术，例如通过表面刺激、随机肽文库或噬菌体展示文库，使用针对本发明的E糖蛋白的单独和构象表位的一种或多种抗体，来鉴定。
本发明进一步提供了编码本发明的登革病毒表位或多肽的核酸(例如，分离的核酸)。
本发明进一步提供了编码本发明的嵌合黄病毒VLP或嵌合黄病毒颗粒的病毒衣壳的核酸(例如，分离的核酸)。
还提供了编码本发明的核酸的载体。
还提供了包含本发明的载体、核酸、登革病毒表位、多肽、嵌合黄病毒VLP或嵌合黄病毒颗粒的细胞。
本发明还提供了包含本发明的细胞、载体、核酸、登革病毒表位、多肽、嵌合黄病毒VLP或嵌合黄病毒颗粒的免疫原性组合物。在实施方案中，免疫原性组合物是单价的。在实施方案中，免疫原性组合物对于登革病毒血清型DEN1、DEN2、DEN 3和/或DEN4是多价的(例如，四价的)。
本发明包括在主体中产生针对登革病毒的免疫应答的方法，所述方法包括向所述主体施用有效量的本发明的登革病毒表位、多肽、嵌合黄病毒VLP或嵌合黄病毒颗粒、核酸、载体、细胞或免疫原性组合物。
进一步，可以有利地实施本发明以诱导针对DEN1、DEN2、DEN3和DEN4中的一种、两种、三种或所有四种的免疫应答。本领域众所周知的是，因为血清型间干扰的问题，有效且安全的多价登革热疫苗已然是设计的挑战。例如，免疫应答可以主要仅针对一些目标血清型。然后需要多次接种以尝试实现针对所有血清型的应答；然而，在登革病毒的情况下，该方法可以是危险的，因为向主体重复施用预先存在的抗体可以导致登革出血热。
本发明的又进一步方面是治疗登革病毒感染的方法，其包括向主体施用有效量的本发明的登革病毒表位、多肽、嵌合黄病毒VLP或嵌合黄病毒颗粒、核酸、载体、细胞或免疫原性组合物。
本发明的又进一步方面是预防登革病毒感染的方法，其包括向主体施用有效量的本发明的登革病毒表位、多肽、嵌合黄病毒VLP或嵌合黄病毒颗粒、核酸、载体、细胞或免疫原性组合物。
本发明的又进一步方面是预防主体免于登革病毒感染的影响的方法，其包括向主体施用有效量的本发明的登革病毒表位、多肽、嵌合黄病毒VLP或嵌合黄病毒颗粒、核酸、载体、细胞或免疫原性组合物。
也可以实施本发明以鉴定结合(例如特异地结合)四级登革病毒表位的抗体，例如，以鉴定针对登革病毒的中和性抗体。例如，本发明可以用作定性地确定疫苗候选物是否诱导中和性抗体的诊断技术。通常，由于许多候选登革病毒疫苗诱导的非中和性抗体的丰度，单独的抗体效价而没有进一步表征抗体特异性提供的信息不完整。
在代表性实施方案中，本发明提供了检测针对登革病毒的中和性抗体的方法，所述方法包括确定抗体是否结合本发明的登革病毒表位、多肽或嵌合VLP或嵌合黄病毒的步骤，其中所述抗体与所述登革病毒表位、多肽、嵌合VLP或嵌合黄病毒的结合表明所述抗体是针对登革病毒的中和性抗体。
在进一步代表性实施方案中，本发明提供了鉴定针对登革病毒的中和性抗体的方法，所述方法包括：(a) 使抗体与本发明的登革病毒表位、多肽或嵌合VLP或嵌合黄病毒接触；和(b) 确定所述抗体是否结合登革病毒表位、多肽、嵌合VLP或嵌合黄病毒；其中所述抗体与登革病毒表位、多肽、嵌合VLP或嵌合黄病毒的结合表明所述抗体是针对登革病毒的中和性抗体。
本发明还提供了鉴定针对登革病毒的中和性抗体的方法，所述方法包括：(a) 使抗体与本发明的登革病毒表位、多肽或嵌合VLP或嵌合黄病毒接触；(b) 确定所述抗体是否结合登革病毒表位、多肽、嵌合VLP或嵌合黄病毒；和(c)如果所述抗体结合登革病毒表位、多肽、嵌合VLP或嵌合黄病毒，则将所述抗体鉴定为针对登革病毒的中和性抗体。
又进一步，本发明提供了鉴定在主体中诱导针对登革病毒的中和性抗体的免疫原性组合物的方法，所述方法包括确定获得自已经施用所述免疫原性组合物的主体的生物样品是否包含结合本发明的登革病毒表位、多肽或嵌合VLP或嵌合黄病毒的抗体，其中如果所述生物样品包含结合登革病毒表位、多肽、嵌合VLP或嵌合黄病毒的抗体，则它表明所述免疫原性组合物在主体中诱导针对登革病毒的中和性抗体。
本发明还提供了鉴定在主体中诱导针对登革病毒的中和性抗体的免疫原性组合物的方法，所述方法包括：
(a) 使获得自已经施用所述免疫原性组合物的主体的生物样品与本发明的登革病毒表位、多肽、或嵌合VLP或嵌合黄病毒接触；和(b) 确定所述生物样品是否包含结合登革病毒表位、多肽、嵌合VLP或嵌合黄病毒的抗体；其中如果所述生物样品包含结合登革病毒表位、多肽、嵌合VLP或嵌合黄病毒的抗体，则它表明所述免疫原性组合物在主体中诱导针对登革病毒的中和性抗体。
在又另一个实施方案中，本发明提供了鉴定在主体中诱导针对登革病毒的中和性抗体的免疫原性组合物的方法，所述方法包括：(a) 使获得自已经施用所述免疫原性组合物的主体的生物样品与本发明的登革病毒表位、多肽、或嵌合VLP或嵌合黄病毒接触；(b)确定所述生物样品是否包含结合登革病毒表位、多肽、嵌合VLP或嵌合黄病毒的抗体；和(c)如果所述生物样品包含结合登革病毒表位、多肽、嵌合VLP或嵌合黄病毒的抗体，则将所述免疫原性组合物鉴定为在主体中诱导针对登革病毒的中和性抗体。
在其它代表性实施方案中，本发明提供了鉴定在主体中诱导针对登革病毒的中和性抗体的免疫原性组合物的方法，所述方法包括：(a) 以有效诱导针对登革病毒抗原的抗体的量向主体施用包含登革病毒抗原的免疫原性组合物；(b) 使来自所述主体的生物样品与本发明的登革病毒表位、多肽、或嵌合VLP或嵌合黄病毒接触；(c) 确定所述生物样品是否包含结合登革病毒表位、多肽、嵌合VLP或嵌合黄病毒的抗体；和(d) 如果所述生物样品包含结合登革病毒表位、多肽、嵌合VLP或嵌合黄病毒的抗体，则将所述免疫原性组合物鉴定为在主体中诱导针对登革病毒的中和性抗体。
存在四种血清型的登革病毒(DEN1、DEN2、DEN3和DEN4)。在每个血清型内，存在许多不同的毒株或基因型。本发明的登革病毒抗原和表位可以源自任何登革病毒，包括现在已知的或以后鉴定的所有血清型、毒株和基因型。
在本发明的实施方案中，所述登革病毒是UNC1017毒株(DEN1)、西太平洋74毒株(DEN1)、S16803毒株(DEN2)、UNC2005毒株(DEN2)、UNC3001毒株(DEN3)、UNC3043 (来自菲律宾的DEN3毒株059.AP-2，1984)、UNC3009毒株(DEN3, D2863, Sri Lanka 1989)、UNC3066(DEN3，来自波多黎各1977的毒株1342)、CH53489毒株(DEN3)、UNC4019毒株(DEN4)，或TVP-360 (DEN4)。
在本发明的实施方案中，登革病毒多肽的“免疫原性活性片段”(例如，E蛋白，或EDI、EDII或EDIII结构域)包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：至少约6、8、10、12、15、20、30、50、75、100、125、150、200、250、300、350、400、450或更多个氨基酸，任选连续氨基酸，和/或小于约495、475、450、425、400、350、300、250、200、150、100、75或50个氨基酸，任选连续氨基酸，包括前述的任何组合，只要下限小于上限，并且“免疫原性活性片段”在宿主中诱导针对登革病毒的免疫应答(例如，与天然抗原反应的IgG和/或IgA)，任选保护性免疫应答，并且诱导特异性结合本发明人新鉴定的四级登革病毒表位的抗体的产生。
如本文中所使用，术语“表位”意指当以正确构象存在时提供抗体的反应性位点(例如，B细胞表位)或T细胞受体的反应性位点(例如，T细胞表位)的特定氨基酸序列。
包括B细胞表位的给定多肽的部分可以使用任何数量的本领域已知的表位定位技术来鉴定。(参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed., 1996, Humana Press, Totowa, N.J.)。例如，线性表位可以通过，例如，在固体支持物上同时合成大量的肽(所述肽对应于蛋白分子的部分)并且当肽仍连接至支持物时使肽与抗体反应，来确定。此类技术是本领域已知的并且描述于，例如，美国专利号4,708,871；Geysen等人(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:3998-4002；Geysen等人(1986) Molec. Immunol. 23:709-715。
类似地，构象表位可以通过确定氨基酸的空间构象，诸如通过，例如x-射线晶体学和2维核磁共振容易地鉴定。蛋白的抗原性区域也可以使用标准的抗原性和亲水性图，诸如使用例如从Oxford Molecular Group可得的Omiga 1.0版软件程序计算的那些，来鉴定。这种计算机程序采用用于确定抗原性概况的Hopp/Woods方法(Hopp等人., Proc. Natl.Acad. Sci USA (1981) 78:3824-3828)和用于亲水性图的Kyte-Doolittle技术(Kyte等人, J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132)。
通常，参与刺激主体的免疫***的细胞武器(cellular arm)的T细胞表位是约8-25个氨基酸的短肽。鉴定T细胞表位的常见方法是使用重叠的合成肽和分析这些肽的合并物或单独肽，所述肽由来自对目标抗原免疫的动物的T细胞所识别，这使用，例如，酶联免疫斑点测定法(ELISPOT)。这些重叠肽也可以用于其它测定法(诸如细胞因子释放或分泌的刺激)，或通过构建含有肽的主要组织相容性(MHC)四聚体来评价。此类免疫原性活性片段也可以基于其响应来自目标抗原的各种片段的刺激而刺激淋巴细胞增殖的能力来鉴定。
可以实施本发明，用于预防、治疗和/或诊断目的。此外，可以实施本发明，以产生用于任何目的的抗体，诸如诊断或研究目的，或用于通过转移至另一主体的被动免疫。
本发明进一步提供了包含本发明的一种或多种组合物的试剂盒。本领域普通技术人员充分理解的是，本发明的试剂盒可以包含一个或多个容器和/或器具，其容纳试剂盒的试剂(例如，抗体、抗原、核酸)，连同适当的缓冲剂和/或稀释剂和/或其它溶液和用于使用该试剂盒的说明，如本领域中众所周知的。此类试剂盒可以进一步包含佐剂和/或其它免疫刺激或免疫调节剂，如本领域中众所周知的。
本发明的组合物和试剂盒还可以包括其它医药剂、药物剂、载体、稀释剂、免疫刺激性细胞因子等。制备此类剂型的实际方法是本领域技术人员已知的，或将显而易见的。
向主体施用可以通过本领域已知的任何途径。作为非限制性实例，施用途径可以是通过吸入(例如，经口和/或经鼻吸入)、经口、经颊(例如，舌下)、直肠、***、局部(包括施用于气道)、眼内、经皮、通过肠胃外(例如，肌内[例如，施用于骨骼肌]、静脉内、动脉内、腹膜内等)、皮下(包括施用于足垫)、真皮内、胸膜内、脑内和/或鞘内途径。
本发明的表位、多肽、VLP和病毒载体可以本身递送或通过递送编码其的核酸(例如，DNA)来递送。
可以向主体同时施用免疫调节性化合物，诸如免疫调节趋化因子和细胞因子(优选地，CTL诱导的细胞因子)。
细胞因子可以通过本领域已知的任何方法施用。外源性细胞因子可以施用于主体，或者可替代地，编码细胞因子的核酸可以使用合适的载体递送至主体，并且在体内产生细胞因子。在具体实施方案中，病毒佐剂表达细胞因子。
在本发明的实施方案中，可以施用多剂量(例如，两个、三个或更多剂)的本发明的组合物而没有可检测的致病性(例如登革休克综合征/登革出血热)。
在本发明的实施方案中，本发明的多价疫苗不会导致免疫干扰，例如，诱导针对所有递呈抗原的平衡免疫应答。在本发明的实施方案中，所述平衡应答导致针对DEN1、DEN2、DEN3和DEN4的保护性免疫。
在本发明的实施方案中，可以向具有存在的抗登革热母体抗体的主体施用多价疫苗。
应当理解的是，本发明可以不同的形式体现，并且不应解释为限于本文所给出的实施方案。反而，提供的这些实施方案使得本公开内容将是完整和全面的，并且向本领域技术人员全面地传达了本发明的范围。
除非另有规定，否则本文使用的所有科技术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。在本文中用于本发明说明书中的术语的目的只是为了描述具体的实施方案，并不意图限制本发明。
如本文中所使用，术语“一(a)”、“一(an)”或“该(the)”可意指一个或多于一个。例如，“一个”细胞可意指一个单细胞或多个细胞。
同样，如本文中所使用，“和/或”是指并且涵盖有关列出项目中的一个或多个的任何和所有可能的组合，以及当以或者(“或”)解释时是指不构成组合。
当提及可测量的值时，诸如剂量(例如，脂肪酸的量)的量等，如本文中所使用的术语“约”是指包括指定量的±20%、±10%、±5%、±1%、±0.5%或甚至±0.1%的变化。
如本文中所使用，连接词“基本上由......组成”意指权利要求的范围应当被解释为涵盖权利要求中所述的指定材料或步骤，“和对要求保护的发明的基本和新颖特性没有实质性影响的那些”。参见，In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 U.S.P.Q. 461,463 (CCPA 1976) (原稿中的强调)；还参见MPEP § 2111.03。因此，当在本发明权利要求中使用时，术语“基本上由......组成”不应被理解为等同于“包含”。
如本文中所使用，“核酸”包括RNA和DNA两者，包括cDNA、基因组DNA、合成(例如化学合成的) DNA及RNA和DNA的嵌合体。核酸可以是双链或单链的。核酸可以用核苷酸类似物或衍生物(例如肌苷或硫代磷酸核苷酸)合成。可将此类核苷酸用于例如制备具有改变的碱基配对能力或增强的核酸酶抗性的核酸。
除非另有说明，如本文中所使用，术语“多肽”包括肽和蛋白(包括融合蛋白)两者。
“融合蛋白”是当编码两条(或更多条)在自然中未发现其融合在一起的不同多肽的两条异源核苷酸序列或其片段，在正确翻译阅读框内融合在一起时产生的多肽。
“重组”核酸、多核苷酸或核苷酸序列是通过基因工程改造技术产生的核酸、多核苷酸或核苷酸序列。
“重组”多肽由重组核酸、多肽或核苷酸序列产生。
如本文中所使用，“分离的”多核苷酸(例如，“分离的核酸”或“分离的核苷酸序列”)意指至少部分与天然存在的生物体或病毒的其它组分(例如，细胞或病毒结构组分或通常发现与多核苷酸相关的其它多肽或核酸)中的至少一些相分离的多核苷酸。任选地，但不是必需地，“分离的”多核苷酸以与起始材料相比更大的浓度(即，富集的)(例如，至少约两倍、三倍、四倍、十倍、二十倍、五十倍、一百倍、五百倍、一千倍、一万倍或更高的浓度)存在。在代表性实施方案中，分离的多核苷酸为至少约1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更纯。
“分离的”多肽意指至少部分与天然存在的生物体或病毒的其它组分(例如，细胞或病毒结构组分或通常发现与多肽相关的其它多肽或核酸)中的至少一些相分离的多肽。任选地，但不是必需地，“分离的”多肽以与起始材料相比更大的浓度(即，富集的)(例如，至少约两倍、三倍、四倍、十倍、二十倍、五十倍、一百倍、五百倍、一千倍、一万倍或更高的浓度)存在。在代表性实施方案中，分离的多肽为至少约1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更纯。
此外，“分离的”细胞是已经部分或完全地与它在自然界中通常相关的其它组分相分离的细胞。例如，分离的细胞可以是在培养基中的细胞和/或在药学上可接受的载体中的细胞。
术语“免疫原”和“抗原”在本文中可互换使用，并且意指细胞和/或体液免疫应答可以针对的任何化合物(包括多肽)。在具体实施方案中，免疫原或抗原可以诱导针对登革病毒感染的影响的保护性免疫应答。
如本文中所使用，“有效量”是指足以产生期望的效果(其可以是治疗和/或有益效果)的本发明的载体、核酸、表位、多肽、细胞、组合物或制剂的量。有效量将随着主体的年龄，总体状况，待治疗的状况的严重度，施用的具体药剂，治疗的持续时间，任何同时治疗的性质，使用的药学上可接受的载体和本领域技术人员的知识和技能之内的类似因素而变化。适当时，在任何个体情况下的“有效量”可以由本领域普通技术人员通过参考相关文本和文献和/或通过使用常规实验来确定。
除非另有说明，如本文中所使用，术语“免疫原性量”或“有效免疫剂量”意指足以在受治疗的主体中诱导大于非免疫主体的内在免疫力的免疫应答(其可以任选地是保护性应答)的量或剂量。在任何特定上下文中的免疫原性量或有效免疫剂量可以使用本领域中已知的方法常规确定。
术语“疫苗”、“接种”和“免疫”是本领域众所周知的，并且在本文中可互换使用。例如，术语疫苗、接种或免疫可以被理解为增加主体对免疫原的免疫应答(例如，通过提供主动免疫应答)并因此增加其抵抗、克服感染和/或从感染中恢复的能力(例如，保护性免疫应答)的过程或组合物。
术语“治疗(Treat)”、“治疗(treating)”或“…的治疗(treatment of)”(及其语法变体)意指主体的状况的严重度得到降低，至少部分改善或缓减和/或实现至少一种临床症状的一些减轻、缓解或减少和/或存在所述疾病或病症的进程的延迟。在代表性实施方案中，“治疗(Treat)”、“治疗(treating)”或“…的治疗(treatment of)”(及其语法变体)是指有或没有其它临床疾病迹象的病毒血症的严重度的降低和/或病毒血症的进展的延迟。
如本文中所使用，“治疗有效”量是足以治疗(如本文中所定义)的主体的量。本领域技术人员将理解，治疗效果不必是完全的或治愈的，只要为主体提供一些益处。
术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”或“…的预防(prevention of)”(及其语法变体)是指主体中疾病、病症和/或临床症状的发作和/或进展的预防和/或延迟，和/或相对于本发明的方法不存在时发生的情形，疾病、病症和/或临床症状的发作和/或进展的严重度的降低。在代表性实施方案中，术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”或“…的预防(prevention of)”(及其语法变体)是指有或没有其它临床疾病迹象的情况下，主体中病毒血症的发作和/或进展的预防和/或延迟。预防可以是完整的，例如，完全不存在疾病、病症和/或临床症状。预防也可以是部分的，从而使得主体中疾病、病症和/或临床症状的发生和/或发作和/或进展的严重度低于本发明不存在时发生的情形。
如本文中所使用，“预防有效”量是足以预防(如本文中所定义)的主体中的疾病、病症和/或临床症状的量。本领域技术人员将理解，预防水平不必是完全的，只要为主体提供一些益处。
本发明的方法治疗和/或预防登革病毒感染的效力可以通过检测如通过主体的症状和/或临床参数(例如，病毒血症)的改变所指示的临床改善来确定，如本领域技术人员众所周知的。
除非另有说明，术语“保护(protect)”、“保护(protecting)”、“保护(protection)”和“保护性(protective)”(及其语法变体)包括预防和治疗主体中的登革病毒感染的方法两者，无论是针对登革病毒的一种或多种毒株、基因型或血清型。
如本文中所使用，术语“保护性”免疫应答或 “保护性”免疫是指该免疫应答为主体赋予一些益处，它防止或减少疾病的发生率和/或严重度和/或持续时间或感染的任何其它表现。例如，在代表性实施方案中，保护性免疫应答或保护性免疫导致降低的病毒血症，无论是否伴随临床疾病。或者，保护性免疫应答或保护性免疫可以在现有疾病的治疗性处理中是有用的。
“主动免疫应答”或“主动免疫”的特征在于“宿主组织和细胞在遇到免疫原之后的参与。它涉及淋巴网状组织中免疫活性细胞的分化和增殖，其导致抗体的合成或细胞介导的反应性的发展，或两者。” Herbert B. Herscowitz, Immunophysiology: CellFunction and Cellular Interactions in Antibody Formation, in IMMUNOLOGY:BASIC PROCESSES 117 (Joseph A. Bellanti ed., 1985). 或者说，主动免疫应答在通过感染或通过接种暴露于免疫原之后由宿主达到。主动免疫可以与被动免疫形成对比，所述被动免疫通过“将来自主动免疫的宿主的预形成的物质(抗体、转移因子、胸腺移植物、白介素-2)转移至未免疫宿主”而获得。同上。
本发明的“主体”包括易受登革病毒感染的任何动物。此类主体通常是哺乳动物主体(例如，实验室动物，诸如大鼠、小鼠、豚鼠、兔、灵长类动物等)，农场或商业动物(例如牛、马、山羊、驴、绵羊等)，或家畜动物(例如猫、狗、雪貂等)。在具体实施方案中，主体是灵长类动物主体、非人灵长类动物主体(例如黑猩猩、狒狒、猴、大猩猩等)或人。本发明的主体可以是已知或者被相信处于被登革病毒感染的风险中的主体。或者，根据本发明的主体也可以包括并非以前已知或疑似被登革病毒感染或需要针对登革病毒感染的治疗的主体。
主体可以出于任何目的来治疗，例如用于在该主体中引发保护性免疫应答，或用于引发抗体的产生，该抗体可以被收集并用于其它目的，诸如研究或诊断目的或用于施用到其它主体以产生被动免疫等。
主体包括任何年龄的雄性和/或雌性，包括新生儿、青少年、成年和老年主体。关于人主体，在代表性实施方案中，主体可以是婴儿(例如，小于约12个月、10个月、9个月、8个月、7个月、6个月或更小)，幼儿(例如，至少约12个、18个或24个月和/或小于约36个、30个或24个月)，或儿童(例如，至少约1、2、3、4或5岁龄和/或小于约14、12、10、8、7、6、5、或4岁龄)。在本发明的实施方案中，主体是约0至3、4、5、6、9、12、15、18、24、30、36、48 或60个月龄，约3至6、9、12、15、18、24、30、36、48 或60个月龄，约6至9、12、15、18、24、30、36、48 或60个月龄，约9至12、15、18、24、30、36、48 或60个月龄，约12至18、24、36、48 或60个月龄，约18至24、30、36、48 或60个月龄，或约24至30、36、48 或60个月龄的人主体。
在本发明的实施方案中，主体具有针对登革病毒的母体抗体。
“需要本发明的方法的主体”可以是已知被登革病毒感染、或疑似被登革病毒感染、被登革病毒感染、或处于被登革病毒感染的风险中的主体。
还提供了包含本发明的登革病毒表位、多肽、嵌合黄病毒VLP或嵌合黄病毒颗粒、核酸、载体、细胞或组合物，和药学上可接受的载体的药物制剂(例如，免疫原性制剂)，并可以根据已知技术将其配制用于在药物载体中施用。参见，例如，Remington, The ScienceAnd Practice of Pharmacy (最新版)。在根据本发明的实施方案的药物组合物的制备中，本发明的组合物通常尤其与药学上可接受的载体混合。“药学上可接受的载体”意指与药物组合物中的其它成分相容且对主体无害或无毒的载体。载体可以是固体或液体，或两者，且优选与本发明的组合物配制为单位剂量制剂，例如片剂，其可含有按重量计约0.01或0.5％至约95％或99％的组合物。药物组合物通过任何众所周知的药学技术，包括但不限于，混合组分，任选地包括一种或多种辅助成分，来制备。在某些实施方案中，药学上可接受的载体是无菌的，并且根据用于包含载体的药物组合物的法规准则，被视为适于施用于人主体。
此外，根据本发明的组合物的“药学上可接受的”组分诸如盐、载体、赋形剂或稀释剂是以下组分，所述组分：(i)与组合物的其它成分相容，因为它可以与本发明的组合物组合，而不使所述组合物不适合用于其预期目的，和(ii)适合于如本文中提供的主体使用，而没有过度的不良副作用(诸如毒性、刺激和过敏性应答)。当副作用的风险大于组合物提供的益处时，副作用是“过度的”。药学上可接受的组分的非限制性实例包括任何标准的药物载体，诸如磷酸缓冲盐水溶液、水、乳剂诸如油/水乳剂、微乳剂和各种类型的润湿剂。
在一些实施方案中，本发明的组合物可以进一步包含一种或多于一种佐剂。本发明的佐剂可以是氨基酸序列的形式，和/或编码佐剂的核酸的形式。当核酸形式时，佐剂可以是编码多肽或片段或表位的核酸的组分和/或包含编码本发明的多肽或片段或表位的核酸的组合物的分开组分。根据本发明，佐剂还可以是作为发挥佐剂功能的肽、蛋白片段或整个蛋白的氨基酸序列，和/或佐剂可以是编码发挥佐剂功能的肽、蛋白片段或整个蛋白的核酸。如本文中所使用，“佐剂”描述以下物质，所述物质可以是能够与本发明的组合物组合以增强、改善或以其它方式调节主体中的免疫应答的任何免疫调节物质。
在进一步实施方案中，佐剂可以是，但不限于，免疫刺激性细胞因子(包括但不限于，GM/CSF、白介素-2、白介素-12、干扰素-γ、白介素4、肿瘤坏死因子α、白介素-1，造血因子flt3L、CD40L、B7.1共刺激分子和B7.2共刺激分子)、由磷酸盐缓冲盐水中的5％(wt/vol)角鲨烯(DASF, Parsippany, N.J.)、2.5％Pluronic, L121聚合物(Aldrich Chemical,Milwaukee)和0.2％聚山梨醇酯(Tween 80, Sigma)构成的SYNTEX佐剂制剂1(SAF-1)。合适的佐剂不仅包括铝盐，诸如氢氧化铝凝胶(alum)、磷酸铝或algannmulin，还可以是钙、铁或锌的盐，或者可以是酰化酪氨酸或酰化糖的不溶性悬浮液，阳离子或阴离子衍生的多糖，或聚磷腈。
其它佐剂是本领域众所周知的，包括但不限于：MF59，LT-K63，LT-R72(Pal等人,Vaccine 24(6):766-75 (2005))，QS-21，弗氏佐剂(完全和不完全的)，氢氧化铝，N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)，N-乙酰基-降胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP11637，称为nor-MDP)，N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-sn-丙三基-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺(CGP19835A，称为MTP-PE)和RIBI，其在含有2％角鲨烯/Tween 80乳剂中的三种提取自细菌的组分：单磷酰脂质A，海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+ TDM+ CWS)。
额外佐剂可以包括，例如，单磷酰脂质A，优选3-脱-O-酰化单磷酰基脂质A (3D-MPL)连同铝盐的组合。增强的佐剂***涉及单磷酰脂质A和皂苷衍生物的组合，特别是如PCT公开号WO 94/00153中公开的QS21和3D-MPL的组合，或如PCT公开号WO 96/33739中公开的其中用胆固醇猝灭QS21的较低反应原性组合物。涉及水包油乳剂中的QS21 3D-MPL &生育酚的的特别有效的佐剂制剂描述于PCT公开号WO 95/17210。此外，本发明的核酸组合物可以通过包含编码抗原的核苷酸序列和提供佐剂功能的核苷酸序列(诸如CpG序列)而包括佐剂。此类CpG序列或基序是本领域众所周知的。
用于与本发明使用的佐剂，诸如，例如，免疫刺激性细胞因子，可以在向主体施用本发明的组合物之前，同时，和/或之前和/或之后几小时、数小时和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9和/或10天之内施用。
此外，佐剂诸如免疫刺激性细胞因子的任何组合可以在施用本发明的免疫原性组合物之前、之后和/或同时共施用于主体。例如，免疫刺激性细胞因子的组合，可以由两种或更多种免疫刺激性细胞因子组成，所述免疫刺激性细胞因子诸如GM/CSF、白介素-2、白介素-12、干扰素-γ、白介素-4、肿瘤坏死因子-α、白介素-1、造血因子flt3L、CD40L、B7.1共刺激分子和B7.2共刺激分子。佐剂或佐剂组合的有效性可以通过使用如本文中描述和本领域中已知的标准方法测量响应向主体施用带有或没有佐剂或佐剂组合的本发明组合物而产生的免疫应答来确定。
在本发明的实施方案中，佐剂包含如例如U.S. 7,862,829中描述的α病毒佐剂。
加强剂量可以经几天、几周、几个月或几年的时间过程进一步施用。在慢性感染中，初始高剂量和随后的加强剂量可以是有利的。
本发明的药物制剂可以任选地包含其它医药剂、药物剂、稳定剂、缓冲剂、载体、稀释剂、盐、张力调节剂、润湿剂等，例如，乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、山梨聚糖单月桂酸酯、油酸三乙醇胺等。
对于注射，载体将通常是液体。对于其它施用方法，载体可以是固体或液体。对于吸入施用，载体将是可吸入的，并且通常是固体或液体颗粒形式。
可根据已知技术，将本发明的组合物配制为用于在药用载体中施用。参见例如，Remington, The Science And Practice of Pharmacy (9th Ed. 1995)。在本发明药物组合物的制备中，通常将VLP尤其与可接受的载体相混合。载体可以是固体或液体或者两者，并任选与化合物一起配制为单位剂量制剂，例如片剂。可以使用各种药学上可接受的水性载体，例如，水、缓冲的水、0.9%盐水、0.3%甘氨酸、透明质酸、无热原的水、无热原的磷酸盐缓冲盐水溶液、抑菌水、或Cremophor EL[R] (BASF, Parsippany, N.J.)等。这些组合物可通过常规的技术来灭菌。本发明的制剂可以通过任何众所周知的药学技术来制备。
药物制剂可以包装用于原样使用，或冻干，冻干制剂通常在施用前与无菌水溶液组合。组合物可以进一步包装在单位/剂量或多剂量容器中，例如，在密封的安瓿和小瓶中。
药物制剂可以通过根据常规药学技术配制用于通过本领域中已知的任何方法来施用。例如，组合物可以配制成鼻内，通过吸入(例如，经口吸入)，经口，经颊(例如，舌下)，直肠，***，局部，鞘内，眼内，经皮，通过肠胃外施用(例如，肌内[例如，骨骼肌]，静脉内，皮下，皮内，胸膜内，脑内和动脉内，鞘内注射)，或局部(例如，施用于皮肤和粘膜表面，包括气道表面)施用。
用于鼻内或吸入施用，药物制剂可以配制成气溶胶(该术语包括液体和干粉气溶胶)。例如，药物制剂可以连同表面活性剂和推进剂以细分形式提供。组合物的典型百分比为0.01-20重量％，优选1-10重量％。表面活性剂通常无毒且可溶于推进剂。此类试剂的代表是含有6至22个碳原子的脂肪酸，诸如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、olesteric和油酸与脂族多元醇或其环状酸酐的酯或偏酯。可以采用混合酯，诸如混合的或天然的甘油酯。表面活性剂可以占组合物的0.1-20重量%，优选0.25-5重量%。组合物的余量通常是推进剂。如果需要，也可以包括载体，例如具有用于鼻内递送的卵磷脂。液体颗粒的气溶胶可通过本领域技术人员已知的任何合适的方法产生，例如用压力驱动的气溶胶喷雾器或超声喷雾器。参见例如美国专利号4,501,729。固体颗粒的气溶胶同样可以通过药学领域已知技术，用任何固体微粒药剂气溶胶发生器产生。鼻内施用也可以通过微滴施用至鼻表面。
可注射制剂可以以常规形式制备，作为液体溶液或悬浮液，适用于注射前液体中的溶液或悬浮液的固体形式，或作为乳剂。或者，可以局部而不是全身方式施用药物制剂，例如以积存制剂(depot)或缓释制剂施用。
即用的注射溶液和悬浮剂可由前述类型的无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备。例如，可以提供在密封容器中的单位剂型的本发明的可注射的、稳定的、无菌的制剂。制剂可以以冻干物形式提供，冻干物可以用合适的药学上可接受的载体重构以形成适用于注射至主体中的液体组合物。单位剂型可以是约1 μg至约10克的制剂。当制剂基本上不溶于水时，可以以足以在水性载体中乳化制剂的量包括足量药学上可接受的乳化剂。一种此类有用的乳化剂是磷脂酰胆碱。
适用于口服施用的药物制剂可以在离散单元中呈现，诸如胶囊、扁囊剂、锭剂或片剂，作为粉末或颗粒；作为水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；或者作为水包油或油包水乳剂。口服递送可以通过将本发明的化合物与能够抵御动物肠道中消化酶的降解的载体复合来进行。此类载体的实例包括如本领域已知的塑料胶囊剂或片剂。此类制剂通过任何合适的药学方法制备，所述方法包括使蛋白和合适载体(其可以含有如上所述的一种或多种辅助成分)关联的步骤。通常，药物制剂通过均匀且紧密地混合化合物与液体或细分的固体载体或两者，然后，如果需要，使所得混合物成型，来制备。例如，片剂可以通过任选与一种或多种辅助成分一起压制或模制粉末或颗粒来制备。压制片剂通过在合适的机器中压制自由流动形式的制剂(诸如任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂和/或表面活性剂/分散剂混合的粉末或颗粒)来制备。模制片剂通过在合适的机器中模制用惰性液体粘合剂润湿的粉末状蛋白来制备。
适用于口腔(舌下)施用的药物制剂包括包含调味基质(通常为蔗糖和***树胶或黄芪胶)中的化合物的锭剂；和惰性基质(诸如明胶和甘油或蔗糖和***树胶)中的软锭剂。
适用于胃肠外施用的药物制剂可以包含无菌含水和无水注射溶液，所述制剂优选与预期主体的血液等渗。这些制剂可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使组合物与预期主体血液等渗的溶质。含水和无水无菌混悬剂、溶液和乳剂可包括悬浮剂和增稠剂。非水溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油和可注射有机酯诸如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸化林格氏液或固定油。静脉内媒介物包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏葡萄糖的那些)等。也可以存在防腐剂和其它添加剂，诸如，例如，抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
适用于直肠施用的药物制剂任选以单位剂量栓剂提供。这些可通过使活性剂与一种或多种常规固体载体(诸如例如，可可脂)混合，并且然后使所得混合物成形来制备。
适用于局部施用于皮肤的药物制剂优选采取软膏剂、乳膏剂、洗剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气溶胶或油剂的形式。可以使用的载体包括但不限于，凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇、透皮促进剂及其两种或更多种的组合。在一些实施方案中，例如，局部递送可以通过将本发明的药物制剂与能够传递到皮肤内的亲脂性试剂(例如DMSO)混合来进行。
适用于经皮施用的药物制剂可以是适于与主体表皮保持长时间紧密接触的独立贴剂的形式。适用于经皮施用的制剂还可通过离子透入法递送(参见例如，Pharmaceutical Research 3:318 (1986))，并且通常采用化合物的缓冲水溶液形式。合适的制剂可包含柠檬酸盐或bis\tris缓冲液(pH 6)或乙醇/水，并可含有0.1-0.2M的有效成分。
在本发明的实施方案，本发明的病毒颗粒的剂量可以在约104至约107噬斑形成单位(PFU)的范围内。在本发明的实施方案，本发明的VLP的剂量可以在约500微克至约5毫克的范围内。在本发明的实施方案，本发明的蛋白的剂量可以在约100至约104微克+/-佐剂的范围内。
进一步，组合物可以配制为脂质体制剂。所采用的脂质层可以是任何常规组成，并且可以含有胆固醇，或者可以不含胆固醇。例如，通过使用标准超声处理和均质化技术，可以缩小所产生的脂质体的大小。
可以将脂质体制剂冻干以产生冻干物，所述冻干物可用药学上可接受的载体(诸如水)重构，以再次生成脂质体悬浮液。
本发明的免疫原性制剂可以任选地是无菌的，并且可以进一步在封闭的病原体不能渗透的容器中提供。
实施例1: 结合至登革病毒颗粒复合表位人中和性抗体的鉴定
血清样品。人血清样品收获自在旅行至流行地区过程中已经经历了DENV感染的个体。恒河猴(Macaca mulatta)血清取自用表达80%的DENV3 E蛋白的VEEV复制子颗粒(VRP-rE)接种的动物。更多信息提供在SI方法中。
病毒和rE蛋白。本研究中使用了DENV1 (西太平洋74)、DENV2 (S-16803)、DENV3(CH-53489和泰国95)和DENV4 (TVP-360)毒株。将中和测定中使用的所有病毒在28℃在C6/36白纹伊蚊(Aedes albopictus)蚊细胞中生长，并且如先前所述(15)在Vero-81细胞上滴定。如先前所述(42)纯化DENV。来自四种DENV血清型中每一种的rE蛋白购自HawaiiBiotech, Inc。
耗尽来自人免疫血清的DENV特异性Ab。遵循制造商的说明书(Polysciences,Inc.)，将纯化的DENV吸附至4.0 μm Polybead聚苯乙烯微球上。对照珠粒则吸附BSA。通过在37℃将血清与病毒吸附的珠粒孵育而耗尽人免疫血清的病毒特异性Ab。详细信息在SI方法中给出。
耗尽来自人和猴免疫血清的DENV rE特异性Ab。遵循制造商的方案(Sigma)，将DENV rE蛋白共价缀合至溴化氰(CNBr)活化的珠粒。对照珠粒与代替rE蛋白的封闭试剂缀合。通过在37℃将人和恒河猴免疫血清与rE缀合的珠粒孵育而耗尽DENV rE特异性Ab。详细信息在SI方法中给出。
通过ELISA检测DENV或rE结合性Ab。如先前所述(5)进行ELISA。在病毒和rE耗尽实验中，分别以1:40和1:25的稀释度使用血清，用于耗尽确认ELISA。更多信息提供在SI方法中。
通过Western印迹检测rE结合。详细信息提供在SI方法中。
SI方法
血清样品。人血液供体招募和样品收集符合北卡罗来纳-查佩尔山大学的机构审查委员会(Institutional Review Board of the University of North Carolina at ChapelHill)的规定。所有个体均知情，并且在供血前获得书面同意。将恒河猴(~7岁年龄)用表达DENV3 E胞外域的氨基酸1-424 (全长E蛋白的85％，也称为E85)的VEEV复制子颗粒(VRP-rE)接种，在7周加强。在加强后3周收集用于本实验的血清。
耗尽来自人免疫血清的DENV特异性Ab。将珠粒用0.1 M硼酸盐缓冲液(pH 8.5)洗涤三次，并且在室温(RT)与硼酸盐缓冲液中的相关纯化的DENV孵育过夜。将对照珠粒与等量的BSA孵育过夜。在RT将对照和病毒吸附的珠粒用硼酸盐缓冲液中的BSA (10 mg/mL)封闭30 min进行三次，且用PBS洗涤6次。通过在37℃在颠倒混合(end-over-end mixing)的情况下将血清与病毒吸附的珠粒孵育2 h而耗尽人免疫血清的病毒特异性Ab。各免疫血清经受至少三轮连续耗尽，然后通过包被(直接包被在板上的抗原)和捕获(由小鼠MAb 4G2捕获的抗原) ELISA证实各自Ab的成功去除。
耗尽来自人和猴免疫血清的DENV rE特异性Ab。遵循制造商的方案(Sigma)，将溴化氰(CNBr)活化的珠粒与rE蛋白共价缀合。将CNBr珠粒用蒸馏水洗涤四次，随后用偶联缓冲液[0.1M NaHCO3, 0.5 M NaCl (pH 8.5)]洗涤额外三次。在RT将偶联缓冲液中稀释的相关DENV rE蛋白与CNBr活化的珠粒孵育2 h。对照珠粒与代替rE蛋白的封闭试剂孵育更长时间。将rE缀合珠粒和对照珠粒上未反应基团封闭并与0.2 M甘氨酸(pH 8.0)孵育，用偶联缓冲液洗涤三次，然后用PBS洗涤四次。在37℃将人和恒河猴免疫血清与rE缀合的珠粒孵育2h。各血清样品经受至少三轮连续的Ab耗尽，然后通过包被或捕获ELISA证实可检测的各自Ab的成功去除。
通过ELISA检测DENV或rE结合性Ab。在RT将ELISA板用碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中50ng/孔的完整纯化病毒或100 ng/孔 的rE蛋白包被2 h。将板用含有0.05% (vol/vol)Tween 20的Tris缓冲的盐水(TBS) (封闭缓冲液)中3% (vol/vol)正常山羊血清封闭。将未耗尽、对照耗尽和抗原耗尽的免疫血清在封闭缓冲液中稀释，并在37℃在板上孵育1 h。在病毒和rE耗尽实验中，分别以1:40和1:25的稀释度使用血清，用于耗尽确认ELISA。如先前所述(5)，使用碱性磷酸酶缀合的山羊抗人IgG二级Ab和对硝基苯磷酸盐底物检测DENV或rE反应性Ab。
通过Western印迹检测rE结合性Ab。将纯化的DENV (700 ng/孔)和DENV rE蛋白(500 ng/孔)用非还原SDS样品缓冲液稀释，上样至12％聚丙烯酰胺SDS/PAGE凝胶上，并电泳。将病毒蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上，并在4℃用5% (wt/vol)干燥的脱脂乳封闭过夜。然后在37℃将膜用免疫血清(1:1,000稀释)探测1 h，用含有0.2% (vol/vol) Tween-20的TBS洗涤三次，在37℃与山羊抗人IgG-HRP二抗孵育1 h，洗涤三次，并用ECL底物显色。
测量免疫血清和单克隆抗体对DENV的中和。免疫血清和单克隆抗体两者的中和活性使用基于流式细胞术的中和测定法与用树突细胞特异性细胞间粘附分子-3-抓合非整合素(dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin, DC-SIGN)稳定转染的U937单核细胞测量，如先前所述(15)。简而言之，将病毒和抗体混合物在37℃预孵育1小时，然后添加表达DC-SIGN的U937细胞(U937+DC-SIGN)。在37℃与病毒-抗体免疫复合物孵育2小时之后，将细胞用感染培养基洗涤两次。感染后24小时将细胞固定和透化，用缀合至488的2H2 (抗prM抗体)探测，并使用Guava流式细胞仪(Milipore)定量感染的细胞。
如先前所述(15)，使用Vero-81细胞进行噬斑减少中和测定(focus reductionneutralization assays; FRNT)。简而言之，将病毒和系列稀释的血清在37℃预孵育1小时，在37℃与Vero-81细胞(生长至80％汇合度)孵育2小时，并且然后用含有甲基纤维素的营养培养基覆盖。在第3天(对于DENV2和DENV4)或第4天(对于DENV1和DENV3)将细胞固定，并使用抗E MAb、4G2和山羊抗小鼠HRP和True蓝色底物针对噬斑染色。
抗DENV hMAb的生成。通过ELISA筛选来自EBV转化的类淋巴母细胞系的上清液与DENV的结合，并且在一些情况下，使用基于流式细胞术的测定法测试DENV的中和。将阳性孔与HMMA2.5骨髓瘤细胞融合以生成杂交瘤系，如先前所述(33, 43)。然后生物学克隆杂交瘤细胞系，并在无血清培养基(no. 12045084, Gibco Hybridoma-SFM; Invitrogen)中生长，并使用G蛋白层析纯化hMAb。
hMAb中和逃逸突变病毒的生成和表征。将病毒-Ab混合物添加至Vero细胞并在Ab存在的情况下每3–5 d传代，以富集逃逸突变病毒。在Ab存在的情况下的病毒生长通过定量RT-PCR和通过免疫荧光检测单层细胞中的DENV抗原来监测。在Ab选择下四至六次传代之后，通过RT-PCR扩增逃逸变体的衣壳、prM和E基因，并测序以鉴定与Ab逃逸表型相关的突变。
统计分析。使用单向ANOVA分析，随后用Tukey多重比较检验，比较未耗尽的、对照耗尽的、和病毒耗尽的或rE耗尽的组之间的S形结合和中和曲线，P <0.05。使用平均值(means)的非配对的学生t检验比较对照耗尽的和病毒耗尽的或rE耗尽的样品的一次稀释结合数据(以柱状图表示)。所有统计分析都使用GraphPad Prism4进行。
耗尽来自免疫血清的同源DENV特异性Ab。进行研究以表征人免疫血清中负责同源病毒血清型的有效和长期中和的Ab。本发明人组装了一组来自健康志愿者的八份免疫血清，所述健康志愿者已经在血液收集前~2–9年暴露于初次DENV2或DENV3感染(表4)。来自缺乏过去DENV感染史(通过ELISA和中和测定证实)的个体的人血清用作阴性对照。
为了定义免疫血清中负责DENV中和的Ab亚群，本发明人开发了基于珠粒的技术，以分级免疫血清中DENV特异性的Ab。在37℃将用同源血清型的病毒颗粒包被的聚苯乙烯珠粒与免疫血清孵育以耗尽DENV结合性Ab。通过ELISA，未处理和对照耗尽的血清样品结合至来自四种DENV血清型的的每一种的完整病毒，并有效地中和DENV(图1A和1B)。使用用同源DENV包被的珠粒耗尽的血清样品表现出大大降低的DENV的结合和中和(图1A和1B)，表明用同源DENV包被的珠粒从免疫血清成功地去除了大部分DENV特异性Ab。
耗尽来自免疫血清的异源DENV特异性Ab。接下来，本发明人评价免疫血清中DENV交叉反应性Ab对病毒结合和中和的贡献。本发明人使用用异源血清型(即未曾感染DENV免疫主体的血清型)的病毒包被的聚苯乙烯珠粒，以从初次免疫血清耗尽交叉反应性Ab (图1和表1)。用DENV3包被的珠粒耗尽初次DENV2免疫血清导致所有交叉反应性Ab的去除，其中剩余的Ab以类型特异性的方式结合DENV2(图1C)。用DENV2包被的珠粒交互耗尽初次DENV3免疫血清去除了与DENV2和DENV4的所有结合，但没有去除与DENV3的结合，且在较小程度上，去除了与DENV1的结合(图1E)。该残留DENV1结合信号可归因于靶向在DENV1和DENV3之间优先共享的亚复合表位的Ab (11, 18, 36)。从初次免疫血清去除交叉反应性Ab没有改变血清中和负责感染的病毒的能力(图1D和1F，图4和表1)。这些结果表明，DENV特异性人Ab应答由交叉反应性Ab和类型特异性Ab二者组成。尽管血清型交叉反应性Ab在本发明人分析的样品中是大量的，但它们对中和的贡献是可忽略的。因此，类型特异性Ab看起来主要负责中和同源血清型。
耗尽来自免疫血清的DENV重组E蛋白结合性Ab。感染性病毒表面上DENV E蛋白二聚体的组织结构已经使用DENV重组E (rE)的晶体结构和病毒颗粒的冷冻-EM重构(16, 17,22, 44)来建模。此外，已经将中和性小鼠MAb充分定位到rE蛋白，并且目前正在开发使用rE蛋白的DENV亚单位疫苗(3, 4, 10, 11, 35-37, 39)。本发明人接下来评价由人免疫血清中的中和性Ab靶向的表位是否被保留在rE蛋白上。被共价偶联至琼脂糖珠粒的DENV rE蛋白用于耗尽免疫血清中的Ab。在37℃将血清与对照珠粒或同源rE-缀合的珠粒孵育。珠粒上DENV rE的结构被证实为在构象上得到保持，并且通过成功地耗尽先前定位到融合环(MAb4G2)、EDIII (MAb 9F16) (36)和E二聚体界面(MAbs DV2-10、DV2-46和DV2-58) (35)的小鼠MAb而证实rE二聚体是完整的(图5)。本发明人还滴定了从免疫血清有效地耗尽rE结合性Ab所需的珠粒上rE蛋白的量(图6)。未处理和对照耗尽的免疫血清两者都结合来自所有四种血清型的rE，但该结合对于同源血清型是最大的(图2A和2B)。使用同源rE耗尽初次免疫血清耗尽废除了与来自4种血清型中每一种的rE的结合(图2A和2B)。rE结合性Ab的成功耗尽也通过Western印迹来证实，其中rE和溶解的病毒颗粒被用作印迹上的抗原(图2C)。通过Western印迹，本发明人无法检测与rE蛋白(其在C末端缺少天然蛋白的20％)或来自病毒的全长E蛋白的结合(图2C)。这些结果确定了，用来自同源血清型的rE包被的珠粒有效去除所有识别纯化的rE蛋白的Ab。本发明人还通过由ELISA比较未处理、对照耗尽和rE耗尽的血清与同源病毒的结合来测量人免疫血清中结合rE的病毒颗粒结合性Ab的相对比例。结果表明在去除rE结合性Ab之后DENV结合降低约45 ± 7% (图7和表5)，表明初次免疫血清中接近一半的DENV特异性抗体识别完整病毒，但不识别rE蛋白。
接下来，本发明人评价了耗尽rE结合性Ab的六种免疫血清的中和活性。预想不到地，六种免疫血清中的四种显示出去除rE结合性Ab之后的中和效力没有任何损失(图2D和2E和表2)。三种初次DENV2免疫血清中的一种和测试的所有三种初次DENV3免疫血清显示在除rE特异性Ab之后针对同型病毒的中和没有任何显著损失。相比之下，三种初次DENV2免疫血清中的两种显示在去除rE特异性Ab时，50%中和(Neut50)滴度的统计学显著的两至三倍下降(P <0.05)(表2)。来自用表达DENV3 E85蛋白的委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)复制子免疫的恒河猴(Macaca mulatta)的血清被用作这些实验中的阳性对照。这些动物应当发展出结合rE蛋白的中和性Ab；因此，rE包被的珠粒从这些疫苗血清去除了>98%的中和性Abs (图2F)。本发明人得出结论，尽管在人免疫血清中，rE反应性Ab对同型DENV中和的贡献中存在一些变化，但人中大部分DENV中和性Ab由结合完整病毒颗粒、但不结合rE蛋白的中和性Ab组成。
强烈中和DENV的hMAb的表征。作为鉴定由DENV免疫个体靶向的中和病毒表位的替代方法，本发明人生成了一组强烈中和DENV的hMAb。这些Ab通过用EBV转化来自DENV免疫主体的记忆B细胞和通过电融合生成hMAb来生成，如先前所述(33)。因为强烈中和性hMAb包含从免疫主体分离的总hMAb的一小部分(2, 6, 7)，本发明人使用两步筛选以分离强烈抑制性Ab：本发明人首先鉴定结合至DENV病毒颗粒的Ab，并且然后测试它们的中和活性。本发明人分离了三种强烈中和性类型特异性hMAbs (Neut50值<0.2 μg/mL)，命名为1F4、2D22和5J7，其分别抑制DENV1、DENV2和DENV3的感染。这些hMAb中的两种结合完整病毒，但不结合rE (表3)。
逃逸hMAb中和的DENV突变体的生成。为了定位与中和性hMAb连结的表位，本发明人使适当DENV血清型经受Ab压力，并且在体外选择中和逃逸突变病毒。分别在不同浓度(0.2–10 μg/mL)的中和性hMAb 1F4、2D22或5J7下，将DENV1、DENV2或DENV3传代数次。在hMAb处理不存在的情况下，将初始WT病毒平行传代。将突变型和WT病毒的结构基因测序并比较，以鉴定负责中和逃逸的突变。本发明人成功地分离出针对DENV1类型特异性MAb 1F4的两种逃避突变体，其中两种独立的单核苷酸突变导致赋予中和损失的E蛋白的DI-DII铰链中位置274(G→E)和DI中位置47 (K→E)的氨基酸改变(图3A和3D)。K47和G274相距13.2Å并且可能包含相同1F4表位的一部分。对于DENV2特异性中和性hMAb 2D22，本发明人分离到具有导致中和逃避的在残基323的EDIII 突变(R→G)的一种突变体(图3B和3E)。用中和性DENV3特异性hMAb 5J7的选择导致具有在氨基酸残基Q269和N270之间的E DI-DII铰链区中的赖氨酸***的逃逸突变体(图3C和3F)。所有突变的残基都表面暴露于E蛋白二聚体的结构上并且在对于强烈中和西尼罗河病毒(WNV) (14, 34)的hMAb (CR4354)所述的复合表位的足迹内(图3G和3H和表3)。
表1. 在初次注射后从主体耗尽交叉反应性Ab的免疫血清的同源DENV血清型中和滴度。
a 数据代表每种血清样品重复至少三次的实验。使用稳定表达DC-SIGN的U937细胞(U937+DC-SIGN)的基于流式细胞术的中和测定法用于生成倒数Ncut50值。通过单向ANOVA分析，对于每种血清比较未耗尽的、对照耗尽的、和交叉反应性抗体耗尽的血清的Neut50值。对于任何测试血清，在对照耗尽和交叉反应性耗尽组之间没有发现统计学显著性。
b 使用GraphPad Prism4从S形中和曲线计算倒数Ncut50值的平均值标准误差(SEM)，并在括号中给出。
表2. 耗尽rE结合性Ab的初次免疫血清的同源DENV血清型中和滴度。
a 数据代表每种血清样品重复至少三次的实验。使用GraphPad Prism4从S形中和曲线计算倒数Ncut50值的平均值标准误差(SEM)，并在括号中给出。
b通过单向ANOVA分析，随后Tukey多重比较检验，样品的未耗尽的/对照耗尽的和rE耗尽的组之间存在统计学显著性差异，P <0.01。
c当通过单向ANOVA分析时，未耗尽的和rE耗尽的组之间存在统计学显著性差异，P <0.05。
表5. 具有和没有rE结合性Ab的DENV免疫血清与同源病毒血清型的结合性质
a 数据代表每种血清样品重复至少两次的实验。每种倒数的50%倒数结合滴度(EC50)的平均值标准误差在括号中给出。
b通过单向ANOVA分析，随后Tukey多重比较检验，对照耗尽的和rE耗尽的组之间存在统计学显著性差异，P <0.001。
c当通过单向ANOVA分析时，对照耗尽的和rE耗尽的组之间存在统计学显著性差异，P <0.05。
d rE反应性抗体占约45±7%的总同型病毒结合抗体。
表6. DENV1、DENV2、DENV3、DENV4的登革病毒E糖蛋白的DI-DII铰链区和DIII区以及YFV和JEV的对应区的氨基酸残基。氨基酸编号基于图11中序列比对中显示的氨基酸序列。
实施例2: 逃逸突变体研究
用一种DENV血清型感染不仅引发针对该血清型，而且还引发与其它DENV血清型交叉反应的的保护性抗体。这些交叉反应性抗体增强在该个体中被另一种DENV血清型第二次感染后严重登革热的风险。包膜蛋白(E)是登革病毒的主要抗原决定簇，并且先前还没有鉴定出仅仅提供中和、但不交叉反应的表位。这代表登革病毒疫苗设计中的一个主要挑战。
已经鉴定了构成DENV E糖蛋白的EDI-II铰链区的一组不连续链，作为中和性人抗体靶向的关键表位区。该表位在所有四种DENV血清型的E蛋白中是保守的。该区域通过多步骤过程鉴定。最初，DENV-3在DENV-3类型特异性的潜在中和性人mAb 5J7存在的情况下连续传代，导致生成几种病毒逃逸突变体。将这些突变体测序并鉴定了赋予逃逸的三个关键氨基酸突变。为了生成推定5J7表位的模型，将逃逸突变残基定位于DENV-3 E晶体结构上。使用最初开发以鉴定诺罗病毒表位的策略，使用(1-3)建模软件来鉴定所有三个突变位点的12 Å之内的所有残基。然后将DENV-4 E序列与DENV-3结构比对，并且鉴定在该12Å区域之内与DENV-3残基不同的每个DENV-4残基，总共25个残基(表和图3，随附的PDF)。为了评价由5J7逃逸突变体鉴定的该抗原性区域的作用，由Biobasic合成将可变DENV-4残基引入DENV- 3 E骨架的“嵌合”核苷酸E基因序列。然后使用反向遗传学将DENV 3/4 12Å (25个残基改变) E基因重组到现有的DENV-3 3001克隆中，参见方法(4)。将新克隆命名为3001A12。使用针对登革病毒血清型3和4的人血清(4)，在50％噬斑减少中和测定法(FRNT50)中筛选3001A12。测定结果清楚地证实了，3001A12被针对DENV 4的人和猴免疫血清完全中和，而DENV-3免疫血清中和3001A12的能力显著减弱(图8-10)。这是第一个用于鉴定和转移定义DENV血清型的表位区域的“概念验证”。正在进行研究，以评价这些嵌合病毒在小鼠中刺激中和抗体的生成和在DENV-3和-4免疫非人灵长类动物中评价在体内是否保留体外中和的获得和损失的免疫原性潜能。
以上是对本发明的说明，并且不应解释为是对其的限制。本发明由随附权利要求书以及其中包括的权利要求的等同内容限定。
本文引用的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都以其整体通过引用并入，用于与呈现参考文献的句子和/或段落相关的教导。
表7. 3001A12中的突变。数字左侧的字母表明初始氨基酸，数字表明氨基酸位置，且数字右侧的字母表明替代初始氨基酸的氨基酸。位置基于DENV3 E糖蛋白氨基酸序列。

Claims (10)

1.分离的登革病毒表位，其跨越相邻的登革病毒E蛋白二聚体，并且包含来自第一E蛋白二聚体的第一E蛋白的结构域I和II之间的铰链区以及来自第二E蛋白二聚体的第二登革病毒E蛋白的结构域III。
2.分离的多肽，其包含登革病毒E蛋白结构域I和结构域II铰链区，肽间隔区，和至少部分的登革病毒E蛋白结构域III。
3.嵌合黄病毒病毒样颗粒(VLP)或嵌合黄病毒，其包含嵌合黄病毒E蛋白，所述嵌合黄病毒E蛋白包含登革病毒E蛋白结构域I和结构域II铰链区和至少部分的登革病毒E蛋白结构域III。
4.包含登革病毒E糖蛋白骨架的嵌合登革病毒E糖蛋白，其包含引入登革病毒E糖蛋白结构域I和结构域II铰链区的氨基酸取代，所述登革病毒E糖蛋白结构域I和结构域II铰链区来自不同于所述登革病毒E糖蛋白骨架的登革病毒血清型的登革病毒血清型。
5.权利要求4的嵌合登革病毒E糖蛋白，其进一步包含引入登革病毒E糖蛋白结构域III区的氨基酸取代，所述登革病毒E糖蛋白结构域III区来自不同于所述登革病毒E糖蛋白骨架的登革病毒血清型的登革病毒血清型。
6.权利要求4或5的嵌合登革病毒E糖蛋白，其中所述登革病毒E糖蛋白骨架来自登革病毒血清型1。
7.权利要求4或5的嵌合登革病毒E糖蛋白，其中所述登革病毒E糖蛋白骨架来自登革病毒血清型2。
8.权利要求4或5的嵌合登革病毒E糖蛋白，其中所述登革病毒E糖蛋白骨架来自登革病毒血清型3。
9.权利要求4或5的嵌合登革病毒E糖蛋白，其中所述登革病毒E糖蛋白骨架来自登革病毒血清型4。
10.权利要求4的嵌合登革病毒E糖蛋白，其中所述结构域I和结构域II铰链区来自登革病毒血清型1。
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