ES2897659T3 - Formulaciones de vacunas térmicamente estables, procesos y microagujas que incluyen las formulaciones de vacunas - Google Patents

Abstract

Una composición de vacuna que comprende: (i) un virus de la gripe inactivado de subunidades seleccionado entre el grupo que consiste en gripe A, gripe B, gripe C y combinaciones de los mismos; y (ii) una mezcla de excipientes que comprenden sacarosa y arginina, en donde la composición está en forma sólida desecada; en donde la mezcla de excipientes está presente en la composición en una cantidad total del 1 % al 90 % en peso; y en donde los excipientes de la mezcla están presentes en la composición en una proporción de 1:15 a 15:1.

Description

DESCRIPCIÓN

Formulaciones de vacunas térmicamente estables, procesos y microagujas que incluyen las formulaciones de vacunas

Referencia cruzada a solicitud relacionada

La presente solicitud reivindica prioridad sobre la solicitud de patente provisional de Estados Unidos N.° 61/873.419, presentada el 4 de septiembre de 2013 y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos N.° 61/873.032, presentada el 3 de septiembre de 2013.

Declaración con respecto a la investigación o desarrollo con fondos federales

La presente invención se realizó con soporte del Gobierno con la Subvención N.° U01EB012495 otorgada por el National Institutes of Health.

Antecedentes

La presente solicitud se refiere a composiciones de vacuna contra el virus de la gripe y a métodos para preparar composiciones de vacuna contra el virus de la gripe de acuerdo con las reivindicaciones independientes 1 y 9. La solicitud además se refiere a formulaciones sólidas secas de vacunas antigripales adecuadas para su uso en microagujas solubles o microagujas recubiertas.

Las estadísticas de la Organización Mundial de la Salud (OMS) indican que millones de personas padecen enfermedades transmisibles cada año. Por ejemplo, se estima que la gripe causa enfermedades graves en 3 a 5 millones de personas anualmente y da como resultado hasta de 250.000 a 500.000 muertes. Se estima que el sarampión infecta a más de 20 millones de personas anualmente y provoca más de 150.000 muertes (en su mayoría niños menores de cinco años). La forma principal de prevenir estas infecciones son las campañas de vacunación exitosas.

Por ejemplo, la OMS estima que la interrupción de la transmisión del sarampión requiere tasas de cobertura de la vacuna superiores al 90 %. Esta alta tasa requiere una vacuna potente y un esfuerzo coordinado entre los fabricantes de vacunas, expertos en salud pública y personal de salud que administra las vacunas en el campo. Por lo tanto, existen numerosos obstáculos que dificultan la difusión generalizada de este tipo de vacunas.

Aunque una vacuna viva contra el sarampión ha estado disponible desde principios de la década de 1960 y es extremadamente eficaz cuando se administra correctamente, los requisitos de almacenamiento pueden impedir su amplia difusión, ya que se considera una de las vacunas vivas más inestables aprobadas para uso humano. La OMS estima que más del 60 % de las existencias de vacunas contra el sarampión entregadas al campo no se pueden utilizar debido al deterioro, mal manejo o reconstitución inadecuada.

Existen obstáculos similares con las vacunas antigripales, que actualmente solo están disponibles en formulaciones líquidas que deben mantenerse a temperaturas de 2-8 °C. Por lo tanto, existe la necesidad de formulaciones sólidas desecadas de vacunas que permitan la producción de vacunas que tengan una estabilidad mejorada, se transportan más fácilmente y son más convenientes para las vacunaciones masivas. A pesar de esta necesidad, el desarrollo de formulaciones de vacunas desecadas implica numerosas variables que deben tenerse en cuenta. Véase, por ejemplo, Chen et al., "Opportunities and challenges of developing thermostable vaccines", Expert Rev. Vaccines 8(5), 547-557 (2009).

Algunas de las consideraciones clave implicadas en la preparación de formulaciones de vacunas desecadas incluyen la exposición del virus a diversas tensiones térmicas y mecánicas y la selección de excipientes para minimizar esos daños. De manera adicional, los componentes de la formulación deben ser compatibles con el método de procesamiento elegido.

La liofilización y la desecación por pulverización son dos de los métodos más utilizados para secar soluciones de principios farmacéuticos activos (API) en la industria farmacéutica. La liofilización se ha empleado para producir varios productos API comerciales, incluidas las vacunas contra el sarampión. Los retos de emplear un proceso de liofilización en una biomolécula lábil incluyen la exposición del virus a baja temperatura, adsorción de partículas víricas a la superficie de los cristales de hielo y estrés por deshidratación, por citar algunos.

La desecación por pulverización ofrece las ventajas de ofrecer un rendimiento de producto de alto volumen (> 5.000 lb/h) y tiempos de fabricación reducidos en comparación con otras tecnologías de conservación/desecado de proteínas, tal como la liofilización. El reto de utilizar desecación por pulverización para estabilizar los API térmicamente lábiles, tales como virus, implica el control de tres áreas clave: condiciones de atomización, condiciones de desecado y propiedades de estado sólido resultantes del material desecado. Por ejemplo, durante la atomización, el proceso de descomposición de la corriente líquida en gotículas finas puede implicar excesivos esfuerzo cortante, tensión superficial y presión aplicados al producto, que conduce a la pérdida de bioactividad. Otro reto implica el control de la velocidad de desecado de las gotículas y su interacción con los componentes dentro de cada gotícula. Dependiendo de los parámetros del proceso, por ejemplo, la velocidad de desecado y el tamaño de las gotículas y los componentes de la formulación, por ejemplo, la actividad superficial y el tamaño molecular (es decir, velocidad de difusión), es posible manipular las propiedades de las partículas secas resultantes, que incluyen el tamaño de partícula, la composición de la superficie y la morfología de la superficie. Este control es importante, dado que la estabilidad de almacenamiento del biofarmacéutico generalmente está influenciada por el grado de enriquecimiento de su superficie, así como por la porosidad y el área de superficie de las partículas desecadas por pulverización. Por lo tanto, numerosas desventajas están asociadas a los métodos más utilizados para preparar formulaciones de vacunas, incluyendo muchas desventajas asociadas a las técnicas de deshidratación más comúnmente utilizadas.

El documento US 2011/0243988 A1 proporciona composiciones y métodos para estabilizar un virus vivo atenuado en formulaciones desecadas. El documento WO 2012/158978 A1 describe composiciones para vacunas termoestables y métodos para preparar las mismas. El documento WO 2009/108689 A1 se refiere a partículas similares a virus (VLP) asociadas al vidrio de azúcar para mejorar la estabilidad general de las VLP.

Por lo tanto, sería deseable proporcionar formulaciones mejoradas de vacunas antigripales que sean más estables y más adecuadas para la vacunación masiva al proporcionar presentaciones de dosificación simples, convenientes fáciles de administrar. También sería deseable proporcionar métodos mejorados para preparar formulaciones de vacunas estables desecadas.

Sumario

La presente solicitud aborda uno o más de los deseos y necesidades anteriores proporcionando formulaciones sólidas desecadas de vacunas antigripales que tienen una estabilidad mejorada. También se proporcionan métodos para su preparación, junto con dispositivos y métodos para su administración a los pacientes.

En un aspecto, se proporciona una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 1.

La composición de vacuna comprende un virus de la gripe inactivado de subunidades y una mezcla de excipientes que comprenden sacarosa y arginina.

En aún otro aspecto, se proporciona un parche transdérmico de acuerdo con la reivindicación 10 que incluye una serie de microagujas que incluyen una de las composiciones de vacuna proporcionadas.

En otro aspecto, se proporcionan métodos para preparar composiciones de vacuna de acuerdo con la reivindicación 9.

En la siguiente descripción se expondrán en parte aspectos adicionales y en parte serán obvios a partir de la descripción siguiente o se pueden aprender mediante la práctica de los aspectos que se describen más adelante. Las ventajas descritas más adelante se realizarán y conseguirán por medio de los elementos y combinaciones destacadas particularmente en las reivindicaciones adjuntas. Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada siguiente son ejemplos y explicaciones únicamente y no son restrictivas.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una vista lateral de una pluralidad de microagujas que comprenden una composición de vacuna de acuerdo con una realización.

La figura 2 es un gráfico de barras que muestra la actividad relativa de hemaglutinina (HA) que queda después del desecado de diversas formulaciones de vacunas.

La figura 3 es un gráfico de barras que muestra la actividad relativa de HA que queda después del desecado de diversas mezclas de excipientes en comparación con los excipientes individuales.

La figura 4 es un gráfico de líneas que muestra la actividad relativa de HA que queda después del desecado de diversas formulaciones de vacuna después del almacenamiento durante varios períodos.

La figura 5 es un gráfico de barras que muestra la actividad de HA después del desecado de diversas formulaciones de vacunas antigripales de subunidades trivalente en parches de microagujas y después del almacenamiento durante varios períodos.

La figura 6 es un gráfico de barras que muestra la actividad de HA después del desecado de diversas formulaciones de vacuna antigripal de subunidades monovalente en parches de microagujas y después del almacenamiento durante varios períodos.

La figura 7 es un gráfico de barras que muestra la actividad relativa de HA que queda después del desecado de las formulaciones de vacuna de subunidades monovalente en parches de microagujas y después de un almacenamiento acelerado durante varios períodos.

La figura 8 es un gráfico de barras que muestra la actividad relativa de eGFP-MeV que queda después de secar varias formulaciones de vacuna contra el sarampión con varios excipientes y almacenarlas durante una semana a 37 °C.

La figura 9 es un gráfico de barras que muestra la actividad relativa de eGFP-MeV que queda después de secar varias formulaciones de vacuna contra el sarampión con varios excipientes y almacenarlas durante un mes a 37 °C. La figura 10 es un gráfico de barras que muestra la actividad relativa de eGFP-MeV que queda después de secar varias formulaciones de vacunas con mezclas de excipientes y almacenarlas durante un mes a 37 °C.

La figura 11 es un gráfico de barras que muestra la actividad relativa de eGFP-MeV que queda después de secar varias formulaciones de vacunas con mezclas de excipientes y almacenarlas durante un mes a 45 °C.

La figura 12 es un gráfico de líneas que muestra la actividad relativa de eGFP-MeV que queda después de secar una formulación de vacuna que incluye una mezcla de treonina y sacarosa y el almacenamiento durante varios períodos y temperaturas.

Las figuras 13A-13C muestran la estabilidad de una formulación de vacuna contra el sarampión de ejemplo en parches de microagujas almacenados en bolsas desecantes (Figura 13C) en comparación con una vacuna comercial reconstituida contra el sarampión (Figura 13A) y una vacuna comercial liofilizada contra el sarampión (Figura 13B).

Descripción detallada

Se han desarrollado formas sólidas secas de composiciones de vacuna para la gripe o el sarampión (no siendo parte de la invención las vacunas contra el sarampión) que tienen estabilidad mejorada. Se usaron procesos de selección para identificar qué excipientes o mezclas de excipientes proporcionaban de forma inesperada estabilidad térmica mejorada a los antígenos de la gripe o el sarampión de entre los numerosos excipientes conocidos en la materia para su uso en formulaciones farmacéuticas. Se ha descubierto que al proporcionar formas sólidas desecadas de las composiciones de vacuna que comprenden antígeno combinado con ciertos excipientes, muchos de los problemas comúnmente asociados a la pérdida de actividad y el deterioro de las vacunas pueden evitarse, disminuyendo así el desperdicio de la vacuna y aumentando la cantidad de producto disponible en las campañas de vacunación u otros escenarios de vacunación.

A menos que se defina lo contrario en el presente documento o más adelante en el resto de la memoria descriptiva, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el significado comprendido habitualmente por los expertos en la materia a la que pertenece la presente invención. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento es únicamente con el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea una limitación. En la descripción y la reivindicación de la presente invención, se usará la siguiente terminología de acuerdo con las definiciones que se exponen a continuación.

El término "aproximadamente", como se usa en el presente documento, indica que el valor de una cantidad dada puede incluir cantidades que oscilan dentro del 10 % del valor establecido u, opcionalmente, dentro del 5 % del valor, o, en algunas realizaciones, dentro del 1 % del valor.

Como se usa en el presente documento, la expresión "temperatura ambiente" se refiere a temperaturas interiores controladas típicas, tal como de aproximadamente 16 °C a aproximadamente 27 °C o, más normalmente, de aproximadamente 18 °C a aproximadamente 24 °C y, a menudo, a aproximadamente 22 °C.

Una formulación o composición "estable" es aquella en la cual el material biológicamente activo en la misma retiene esencialmente su estabilidad física y/o su estabilidad química y/o su actividad biológica tras el almacenamiento. La estabilidad puede medirse a una temperatura seleccionada durante un periodo de tiempo seleccionado. El análisis de tendencias se puede utilizar para estimar una vida útil esperada antes de que un material haya estado realmente almacenado durante ese período de tiempo.

Como se usa en el presente documento, el término "seco" o "desecado" en referencia a las formulaciones de vacunas sólidas descritas en el presente documento se refiere a una composición de la que se ha eliminado una parte sustancial de cualquier agua para producir una fase sólida de la composición. El término no requiere la ausencia total de humedad. Las composiciones de vacuna descritas en el presente documento generalmente tienen un contenido de humedad de aproximadamente el 0,1 % en peso y aproximadamente el 25 % en peso.

Las realizaciones de la presente solicitud incluyen composiciones de vacunas que comprenden uno o más virus de la gripe inactivados de subunidades y una mezcla de excipientes que comprenden sacarosa y arginina en una formulación sólida seca. Se ha descubierto que la mezcla de excipientes mejora ventajosamente la estabilidad de uno o más virus de la gripe inactivados de subunidades durante el desecado y almacenamiento de las composiciones de vacuna.

En una realización preferida, la composición de la vacuna tiene la forma de una microaguja o un recubrimiento sobre una microaguja formado por otro material. La composición de la vacuna se solubiliza in vivo tras la inserción de la microaguja en un tejido biológico, por ejemplo, en la piel de un paciente. Por tanto, la microaguja de formulación o el recubrimiento de formulación se denominan en el presente documento "soluble". En una realización alternativa, la forma sólida desecada de la formulación de vacuna puede estar en forma de partículas u otra forma adecuada para la reconstitución antes de la administración a un paciente. Por ejemplo, la composición de vacuna se puede reconstituir en un líquido fisiológicamente aceptable para producir una solución o suspensión adecuada para inyección a través de una aguja hueca o microaguja hueca.

En la figura 1 se ilustra una matriz de microagujas de ejemplo con una pluralidad de microagujas solubles. La matriz de microagujas 10 incluye un sustrato base 12 con una pluralidad de microagujas 14. En las realizaciones, la pluralidad de microagujas 14 tiene una altura de aproximadamente 100 jm a aproximadamente 2000 |jm, de aproximadamente 100 jm a aproximadamente 1500 jm , de aproximadamente l00 jm a aproximadamente 1000 jm , o de aproximadamente 500 jm a aproximadamente 1000 jm . La matriz de las microagujas puede tener cualquier densidad adecuada. Por ejemplo, las microagujas en la matriz pueden estar dispuestas en filas pares o escalonadas, en donde cada microaguja está separada de su microaguja vecina más cercana por una distancia aproximadamente igual a la altura de la microaguja. La matriz puede incluir esencialmente cualquier número adecuado de microagujas. En una realización, la masa total de la composición de vacuna en las microagujas de una matriz es adecuada para administrar una cantidad profilácticamente eficaz del antígeno a un paciente. En ejemplos no limitantes, la matriz puede incluir de 5 a 10.000 microagujas, tales como de 50 a 1000 microagujas o de 50 a 200 microagujas.

En algunas realizaciones, las microagujas solubles pueden formarse secando la composición de vacuna en un molde adecuado usando los métodos descritos a continuación. En otras realizaciones, la composición de vacuna puede recubrirse sobre una o más microagujas que comprenden un material biocompatible, tal como un metal, polímero o silicio. En la patente de Estados Unidos n. 6.334.856 y en la publicación de patente de Estados Unidos n.° 2008/0213461 se desvelan ejemplos no limitantes de tales microagujas y sus métodos de fabricación.

Las composiciones de vacuna pueden contener una cantidad biológicamente eficaz de uno o más antígenos. Como se usa en el presente documento, "cantidad biológicamente eficaz" se refiere a la cantidad de uno o más antígenos necesarios para estimular o iniciar la respuesta inmunológica deseada. Por lo tanto, la cantidad del uno o más antígenos necesarios para lograr la respuesta inmunológica deseada variará necesariamente dependiendo de diversos factores, incluido el tipo de antígeno, el sitio de administración (por ejemplo, subcutáneo o intramuscular) y la cinética de disolución y liberación para la administración del antígeno. Por ejemplo, en las realizaciones, es deseable que la composición de vacuna se formule para disolverse in vivo durante un período de disolución de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 60 minutos. Como se usa en el presente documento, el "período de disolución" o "período de disolución" significa, en el caso de microagujas solubles, el tiempo necesario para que la microaguja se humedezca lo suficiente durante la administración de modo que la microaguja se separe sustancialmente del sustrato base, o en el caso de un recubrimiento de microagujas, el tiempo que tarda el recubrimiento de la microaguja en separarse sustancialmente de la microaguja durante la administración.

Formulaciones de vacunas antigripales

De acuerdo con la invención, el antígeno es un virus de la gripe inactivado de subunidades. El antígeno puede prepararse a partir de viriones de gripe o expresarse en un huésped recombinante y usarse en forma purificada.

El antígeno de la gripe puede incluir una o más cepas del virus de la gripe, que se clasifican como gripe A, gripe B o gripe C. Las composiciones pueden incluir un antígeno (monovalente), dos antígenos (2-valente), tres antígenos (trivalente/3-valente), o cuatro o más antígenos (4-valente o n-valente). Por ejemplo, en realizaciones, el antígeno de gripe puede ser una combinación de dos cepas de gripe A y una cepa de gripe B o una combinación de dos cepas de gripe A y dos cepas de gripe B. Los ejemplos no limitantes de cepas de gripe A incluyen los subtipos de hemaglutinina (HA) H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17 o H18, y los subtipos de neuraminidasa (NA) N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 o N9. Las cepas particulares del antígeno de la gripe pueden incluir H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H5N3, H7N1, H7N7, H7N9 o H9N2.

La cantidad de uno o más antígenos de la gripe en la formulación de vacuna puede ajustarse para obtener una respuesta inmunológica deseada. En las realizaciones, una cantidad biológicamente eficaz de un antígeno de gripe puede ser de aproximadamente 1 jg a aproximadamente 100 jg de HA por cepa de antígeno de gripe. Por ejemplo, una cantidad biológicamente eficaz de un antígeno de la gripe en una vacuna de la gripe que ahorra dosis puede ser de aproximadamente 1 jg a aproximadamente 10 jg de HA por cepa de antígeno de la gripe; una cantidad biológicamente eficaz de un antígeno de gripe en una dosis normal de vacuna de gripe estacional puede ser de aproximadamente 15 jg de HA por cepa de antígeno de gripe; o una cantidad biológicamente eficaz de un antígeno de gripe en una dosis alta de vacuna de gripe estacional puede ser de aproximadamente 60 jg de HA por cepa de antígeno de gripe. Por ejemplo, el contenido de HA de cada cepa en la vacuna trivalente normalmente se establece en 15 jg para una sola dosis humana, es decir, 45 jg de HA total.

Las composiciones de vacuna antigripal de acuerdo con la invención incluyen una mezcla seleccionada de excipientes que comprenden sacarosa y arginina que se encontró que aumenta la estabilidad del antígeno de la gripe en una formulación sólida desecada en comparación con una formulación sólida desecada del antígeno de la gripe sin excipientes.

La mezcla de excipientes está presente en la composición en una cantidad total de aproximadamente 1 % a aproximadamente 90 % en peso. Por ejemplo, la mezcla de excipientes puede estar presente en la composición en una cantidad total de aproximadamente 2 % a aproximadamente 75 %, de aproximadamente 5 % a aproximadamente 50 % o de aproximadamente 5 % a aproximadamente 20 %. La proporción de cada excipiente en la mezcla se puede variar. Los excipientes en la mezcla de dos excipientes están presentes en la composición de vacuna en una proporción de aproximadamente 1:15 a aproximadamente 15:1. Por ejemplo, los excipientes de la mezcla pueden estar presentes en la composición en una proporción de aproximadamente 1:9 a aproximadamente 9:1, aproximadamente 1:2 o aproximadamente 1:1.

En las realizaciones, la composición de vacuna incluye además uno o más adyuvantes que aumentan la respuesta inmunitaria del paciente al antígeno. Los adyuvantes adecuados que aumentan la respuesta inmunitaria incluyen, sin limitación, geles de aluminio o sales de aluminio. Por ejemplo, el adyuvante puede ser hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio o sulfato de aluminio y potasio. Los adyuvantes adicionales pueden incluir poli(I:C), imiquimod y otros conocidos en la técnica.

Las composiciones de vacuna antigripal proporcionadas en el presente documento pueden caracterizarse ventajosamente por tener una estabilidad mejorada. Como se usa en el presente documento, "estabilidad mejorada" de una composición de vacuna antigripal se puede determinar usando inmunodifusión radial simple (SRID) o un ensayo de inmunosorción ligado a enzima (ELISA) para medir la actividad DE HA de la composición cuando se disuelve en una solución acuosa después del almacenamiento para un determinado tiempo y temperatura. Por ejemplo, el ELISA puede ser un ELISA DE tipo sándwich típico en el que un anticuerpo específico de la cepa se recubre sobre una placa de micropocillos y la solución acuosa de vacuna se incuba para permitir que el antígeno diana se una al anticuerpo inmovilizado. A continuación, se deja que otro anticuerpo específico de la cepa conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) se una al antígeno diana. La adición de 3,3', 5,5'-tetrametilbencidina (TMB) a los micropocillos convierte el HRP en una señal azul, que se puede leer y comparar con un control.

Por ejemplo, la composición de vacuna puede caracterizarse por un virus de la gripe inactivado de subunidades que tiene una estabilidad mejorada en la composición durante un mes en comparación con una composición comparativa que comprende el virus de la gripe inactivado de subunidades sin un excipiente, más de tres meses en comparación con dicha composición comparativa, más de seis meses en comparación con dicha composición comparativa, más de nueve meses en comparación con dicha composición comparativa, o más de un año en comparación con dicha composición comparativa.

En algunas realizaciones, la estabilidad de la composición se muestra por la actividad relativa del virus de la gripe inactivado de subunidades después del almacenamiento a temperatura ambiente o a temperaturas elevadas de hasta 40 °C en comparación con la actividad inicial del virus de la gripe inactivado de subunidades. Por ejemplo, la estabilidad de la composición puede caracterizarse porque el virus de la gripe inactivado de subunidades mantiene al menos el 50 % de su actividad después de tres meses de almacenamiento a temperaturas de hasta 40 °C, al menos el 60 % de su actividad después de tres meses de almacenamiento a temperaturas de hasta 40 °C, al menos el 70 % de su actividad después de tres meses de almacenamiento a temperaturas de hasta 40 °C, al menos el 75 % de su actividad después de tres meses de almacenamiento a temperaturas de hasta 40 °C, al menos el 80 % de su actividad después de tres meses de almacenamiento a temperaturas de hasta 40 °C, o al menos el 90 % de su actividad después de tres meses de almacenamiento a temperaturas de hasta 40 °C.

Formulaciones de la vacuna contra el sarampión (todas las formulaciones de la vacuna contra el sarampión descritas en el presente documento no forman parte de la invención)

Se describen formulaciones de vacunas, en donde el antígeno es un antígeno del sarampión. Aunque el antígeno puede tomar la forma de un virus vivo o de un virus inactivado, el antígeno del sarampión se encuentra normalmente en forma de virus vivo atenuado. En algunos ejemplos, el antígeno del sarampión puede combinarse con un antígeno de las paperas, antígeno de rubéola, antígeno de varicela, o combinaciones de los mismos (cada uno de los cuales se encuentra más comúnmente en forma de virus vivo atenuado).

La cantidad de antígeno del sarampión en la composición de vacuna puede ajustarse para obtener una respuesta inmunológica deseada. Por ejemplo, el contenido de sarampión en las vacunas se establece normalmente en 1.000 DICT50 a aproximadamente 10.000 DICT50 (donde DICT50 se define como la dosis infecciosa media de cultivo tisular) para una sola dosis humana. Por ejemplo, una cantidad biológicamente eficaz de vacuna contra el sarampión en la composición de vacuna puede ser de aproximadamente 1.000 DICT50.

Las composiciones de la vacuna contra el sarampión incluyen además uno o más excipientes seleccionados que se ha encontrado que aumentan la estabilidad del antígeno del sarampión en una formulación sólida desecada en comparación con una formulación sólida desecada del antígeno del sarampión sin ningún excipiente. En los ejemplos, los excipientes que aumentan la estabilidad de los antígenos del sarampión incluyen serina, sacarosa, asparagina, glicina, treonina, histidina, trehalosa, prolina, sorbitol, maltosa, taurina, dulcitol y combinaciones de los mismos.

En ejemplos concretos, las composiciones de la vacuna contra el sarampión incluyen además una mezcla seleccionada de excipientes que incluyen uno o más aminoácidos y carbohidratos. En determinados ejemplos, la mezcla incluye uno o más aminoácidos seleccionados entre el grupo que consiste en serina, asparagina, glicina, treonina, histidina, prolina, taurina y combinaciones de los mismos, y uno o más carbohidratos seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, sorbitol, maltosa, ducitol y combinaciones de los mismos. En los ejemplos, el aminoácido comprende taurina o treonina y el carbohidrato comprende sacarosa, trehalosa o sorbitol. Otras mezclas de excipientes que son eficaces para estabilizar el antígeno del sarampión incluyen treonina y sacarosa; treonina y trehalosa; treonina y sorbitol; asparagina y trehalosa; asparagina y sorbitol; serina y sacarosa; serina y sorbitol; glicina y sacarosa; glicina y trehalosa; histidina y sacarosa; taurina y sacarosa; y taurina y trehalosa.

La mezcla de excipientes puede estar presente en la composición de vacuna contra el sarampión en una cantidad total de aproximadamente 1 % a aproximadamente 90 % en peso. Por ejemplo, la mezcla de excipientes puede estar presente en la composición en una cantidad total de aproximadamente 2 a aproximadamente 75 %, de aproximadamente 5 % a aproximadamente 50 % o de aproximadamente 5 % a aproximadamente 20 %. La proporción de cada excipiente en la mezcla se puede variar. En determinados ejemplos, los excipientes en una mezcla de dos excipientes están presentes en la composición de vacuna en una proporción de aproximadamente 1:15 a aproximadamente 15:1. Por ejemplo, los excipientes de la mezcla pueden estar presentes en la composición en una proporción de aproximadamente 1:9 a aproximadamente 9:1, aproximadamente 1:2 o aproximadamente 1:1.

Las composiciones de vacuna contra el sarampión descritas en el presente documento se pueden caracterizar ventajosamente por tener una estabilidad mejorada. Como se usa en el presente documento, la "estabilidad mejorada" de una composición de vacuna contra el sarampión se puede determinar usando un ensayo infeccioso de cultivo de tisular (DICT50) después del almacenamiento durante un tiempo y a una temperatura determinados. Como alternativa, la estabilidad mejorada se puede determinar usando una variante de sarampión modificada genéticamente que produce GFP tras la replicación como se describe en el ejemplo 8.

Por ejemplo, la composición de la vacuna puede caracterizarse por un antígeno del sarampión que tiene una estabilidad mejorada durante un mes en la composición en comparación con una composición comparativa que comprende el antígeno del sarampión sin un excipiente, más de tres meses en comparación con dicha composición comparativa, más de seis meses en comparación con dicha composición comparativa, más de nueve meses en comparación con dicha composición comparativa, o más de un año en comparación con dicha composición comparativa.

En los ejemplos, la estabilidad de la composición puede demostrarse por la actividad relativa del antígeno del sarampión después del almacenamiento a temperatura ambiente o a temperaturas elevadas de hasta 40 °C en comparación con la actividad inicial del antígeno del sarampión. Por ejemplo, la estabilidad de la composición puede caracterizarse porque el antígeno del sarampión mantiene al menos el 10 % de su actividad después de una semana de almacenamiento a temperaturas de hasta 40 °C, al menos el 10 % de su actividad después de un mes de almacenamiento a temperaturas de hasta 40 °C, al menos el 25 % de su actividad después de un mes de almacenamiento a temperaturas de hasta 40 °C, al menos el 50 % de su actividad después de un mes de almacenamiento a temperaturas de hasta 40 °C, al menos el 80 % de su actividad después de un mes de almacenamiento a temperaturas de hasta 40 °C, al menos el 10 % de su actividad después de tres meses de almacenamiento a temperaturas de hasta 40 °C, al menos el 50 % de su actividad después de tres meses de almacenamiento a temperaturas de hasta 40 °C, al menos el 80 % de su actividad después de tres meses de almacenamiento a temperaturas de hasta 40 °C, al menos el 10 % de su actividad después de seis meses de almacenamiento a temperaturas de hasta 40 °C, al menos el 50 % de su actividad después de tres meses de almacenamiento a temperaturas de hasta 40 °C o al menos el 80 % de su actividad después de seis meses de almacenamiento a temperaturas de hasta 40 °C.

Métodos de fabricación

Las formulaciones de la vacuna antigripal de acuerdo con la invención y las formulaciones de la vacuna contra el sarampión (las formulaciones de la vacuna contra el sarampión que no forman parte de la invención) descritas en el presente documento generalmente se preparan desecando una solución acuosa que comprende el antígeno y el excipiente o excipientes seleccionados sobre un sustrato adecuado. La solución acuosa se puede preparar mezclando uno o más antígenos y uno o más excipientes en una solución que comprende una sal tampón acuosa, algunos ejemplos no limitantes de los cuales incluyen HEPES, acetato de amonio, solución salina tamponada con fosfato y fosfato potásico dibásico.

La solución acuosa se puede desecar sobre varios sustratos adecuados; sin embargo, se prefiere que el sustrato se seleccione para minimizar la pérdida de actividad antigénica durante el proceso de desecado. Por ejemplo, la solución acuosa se puede desecar sobre un sustrato metálico, un sustrato polimérico, un sustrato de silicio o un sustrato textil.

En las realizaciones, la solución acuosa se deseca sobre un sustrato de polidimetilsiloxano (PDMS). En una realización, el sustrato es un molde para formar una o más microagujas.

La solución acuosa se puede desecar a cualquier temperatura y em condiciones de presión adecuadas, que, preferentemente, se seleccionan para mantener la actividad biológica del antígeno. En una realización preferida, la solución acuosa se deseca a temperatura ambiente durante un tiempo suficiente para formar la forma sólida desecada de la composición de vacuna. Por ejemplo, la solución acuosa se puede desecar a temperatura ambiente durante un período de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente una semana para formar la formulación de vacuna sólida desecada (por ejemplo, de aproximadamente 45 minutos a aproximadamente una semana, de aproximadamente una hora a aproximadamente una semana, de aproximadamente una hora a aproximadamente un día, etc.). En otras realizaciones, la solución acuosa se puede desecar al vacío o desecar usando una combinación de desecado al aire y desecado al vacío. Aunque se pueden emplear varias temperaturas y niveles de humedad para desecar la solución acuosa, las formulaciones se desecan, preferentemente a una temperatura de 1 °C a 60 °C (por ejemplo, de 15 °C a aproximadamente 45 °C, de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 45 °C o a aproximadamente la temperatura ambiente) y de 0 a 10 % de humedad relativa.

En una realización en la que la composición de vacuna está en forma de microaguja soluble, la solución acuosa se vierte en un molde para formar una microaguja o una matriz de microagujas antes de desecar la solución. Como se usa en el presente documento, "vertida" o "que vierte" la solución acuosa incluye cualquier método adecuado para llenar el molde con la solución acuosa, algunos ejemplos no limitantes de los cuales incluyen técnicas de depósito, recubrimiento, impresión, pulverización y de microrelleno.

En realizaciones en las que la formulación está en forma de microaguja recubierta, la microaguja o matriz de microagujas se recubre con la solución acuosa antes de desecar la solución, por ejemplo, utilizando los métodos de recubrimiento por inmersión descritos en la publicación de patente de Estados Unidos n.° 2008/0213461.

Después de la fabricación y antes de su uso, las composiciones de vacuna se envasan y almacenan en refrigeración, por ejemplo, a temperaturas de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 8 °C; en un congelador, por ejemplo, a temperaturas inferiores a 0 °C; a temperatura ambiente; o a temperatura no controlada, por ejemplo hasta 50 °C. El almacenamiento puede ser durante la vida útil del producto o durante un período menor que la vida útil del producto. Pueden usarse monitores de viales de vacuna u otros indicadores de temperatura para identificar cuándo la composición de la vacuna ha excedido un nivel permisible de exposición térmica. Ventajosamente, las composiciones de vacuna proporcionadas en el presente documento imparten mayor termoestabilidad que las formulaciones previamente existentes, minimizando así la contaminación, degradación y pérdida de actividad que puede ocurrir cuando las composiciones de vacuna se exponen a temperaturas variables. Por lo tanto, la temperatura de almacenamiento de las composiciones de vacuna proporcionadas en el presente documento es menos crítica que la de las formulaciones previamente existentes.

Métodos de administración

Las formulaciones de vacuna antigripal de acuerdo con la invención y las formulaciones de vacuna contra el sarampión (las formulaciones de vacuna contra el sarampión que no forman parte de la invención) proporcionadas en el presente documento pueden administrarse a los pacientes por cualquier medio adecuado. Como se usa en el presente documento, el término "paciente" se refiere normalmente a un niño o un ser humano adulto que necesita vacunación. Los ejemplos de medios de administración adecuados incluyen inyección y/o administración transdérmica mediante microagujas. Por ejemplo, un paciente puede ser vacunado insertando una o más microagujas, que están formadas o recubiertas con la composición de vacuna, a través del estrato córneo de la piel del paciente.

En otro ejemplo, la composición de vacuna se reconstituye en un vehículo líquido fisiológicamente aceptable para formar una solución o suspensión inyectable y luego la solución o suspensión inyectable se inyecta al paciente. La formulación de vacuna se puede reconstituir directamente en una jeringa hipodérmica o en un vial u otro recipiente estéril. La composición de vacuna reconstituida se puede inyectar al paciente, por ejemplo, mediante inyección intramuscular, inyección intradérmica o subcutánea.

La presente invención puede entenderse mejor con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1

Se prepararon soluciones de vacuna antigripal utilizando varios tensioactivos para identificar si alguno afectaba negativamente a la actividad del antígeno de la gripe. Los tensioactivos (Lutrol F68, Tween 20, SDS, CTAB, CHAPS) a las soluciones de vacuna antigripal de subunidades (B/Brisbane/60/2008, 60 pg/ml de HA) sin otros excipientes, que se desecaron sobre superficies de acero inoxidable a temperatura ambiente durante 40 minutos. Posteriormente, la vacuna se volvió a disolver en una solución salina. Esta solución se evaluó con un ensayo de inmunosorción ligado a enzimas (ELISA) para medir la actividad de HA y se comparó con una reserva de vacuna que no se había desecado. Cuando se tuvo en cuenta el efecto del tensioactivo en la solución de control, no se observaron diferencias significativas entre cualquiera de los tensioactivos analizados sobre la estabilidad de la vacuna tras el desecado (datos no mostrados).

Ejemplo 2

La vacuna antigripal de subunidades (B/Brisbane/60/2008, 60 pg/ml de HA) se mezcló con diversos posibles excipientes a concentraciones del 15 % p/v en acetato amónico 150 mM (Tabla 1). Estas soluciones se desecaron sobre superficies de polidimetilsiloxano a temperatura ambiente y se almacenaron con desecante durante un total de 24 horas. A continuación, la vacuna se volvió a disolver en una solución salina y se analizó su actividad como se describe en el ejemplo 1.

Tabla 1: Exci ientes analizados

Los resultados se ilustran en la figura 2 (valores de p <0,05 en comparación con la vacuna sin formular). La barra del lado derecho de la figura representa la vacuna sin excipientes añadidos. Los excipientes se clasificaron generalmente en 3 categorías: excipientes que mostraron un efecto positivo e impartieron un efecto estabilizante (maltodextrina 4, arginina, trehalosa, maltosa, histidina, heptagluconato cálcico, maltodextrina 13, sacarosa, glucosa, heparina, rafinosa, mio-inositol, lactosa, sorbitol, arabitol, fructosa, ciclodextrina-y, gluconato de potasio, adonitol, xilitol, tiosulfato de sodio, asparagina, 2-hidroxipropil-p-ciclodextrina, TRIS, citrato sódico y dulcitol), excipientes que no mostraron un efecto estadísticamente significativo (citrato potásico, ovoalbúmina, glicina, metilglucósido, ciclodextrina-p, lisina, fosfato de sodio, valina, treonina, galactosa, alanina, metionina, prolina, manitol, seroalbúmina humana 2, glutamina, seroalbúmina humana 1, triptófano, tirosina, serina, seroalbúmina bovina, creatina, leucina y sulfato potásico) y excipientes que redujeron aún más la actividad de la vacuna al desecarse (succinato sódico, isoleucina, lactato de etilo, fenilalanina, arabinosa, fosfato potásico, xilosa, sulfito de potasio, cisteína, glicerol y tioglicolato sódico).

Ejemplo 3

Se eligieron combinaciones de excipientes para compararlas con la estabilidad proporcionada por excipientes de un solo constituyente. La vacuna antigripal de subunidades (B/Brisbane/60/2008, 60 pg/ml de HA) se formuló con uno o dos excipientes a la misma concentración total de excipiente (15% p/v) y luego se desecó sobre superficies de polidimetilsiloxano a temperatura ambiente durante una hora y se almacenó durante 1 semana a 40 °C con desecante. La vacuna se volvió a disolver en solución salina y luego se analizó su actividad como se describe en el ejemplo 1. Los resultados se ilustran en la figura 3. La mayoría de las combinaciones retuvieron una cantidad de actividad dentro del intervalo de los excipientes constituyentes; sin embargo, se demostró que dos combinaciones tenían una actividad superior en comparación con sus constituyentes: maltodextrina 17/lactosa y sorbitol/citrato sódico.

Ejemplo 4

Las formulaciones de la vacuna antigripal de subunidades (B/Brisbane/60/2008, 60 |jg/ml de HA) con varios excipientes (15 % p/v) se desecaron sobre superficies de polidimetilsiloxano a temperatura ambiente durante una hora y se almacenaron con desecante a 40 °C. durante hasta un mes. La vacuna se volvió a disolver en solución salina y luego se analizó su actividad como se describe en el ejemplo 1. Los resultados se ilustran en la figura 4.

La vacuna sin formular perdió su actividad muy rápidamente. Todas las demás formulaciones funcionaron bien durante el almacenamiento a corto plazo; sin embargo, solo unas pocas formulaciones no tuvieron diferencias estadísticamente significativas en la actividad durante todo el estudio. Estas formulaciones incluían combinaciones de excipientes, tales como trehalosa/sacarosa, sacarosa/arginina y arginina/heptagluconato cálcico.

Ejemplo 5

Vacuna antigripal de subunidades trivalente (B/Brisbane/60/2008, A/Brisbane/59/2007 (H1N1) y A/Victoria/210/2009 (H3N2), 1700-1850 jg/m l) se formuló con varias combinaciones de excipientes (concentración total del 15 % p/v). Se produjeron parches de microagujas disolventes con estas formulaciones desecando la formulación en un molde de polidimetilsiloxano a temperatura ambiente y al vacío durante 4 horas, seguido de un desecado adicional en un desecador a temperatura ambiente durante 2 días, después de lo cual se desmoldaron las microagujas, se envasaron en bolsas de aluminio con desecante y se almacenaron a 25 °C. En momentos determinados, algunos parches se disolvieron en solución salina y se analizaron para determinar la actividad de las tres cepas como se describe en el ejemplo 1. Los resultados se ilustran en la figura 5.

Ejemplo 6

La vacuna antigripal de subunidades monovalente (B/Brisbane/60/2008, 630 jg/m l) se formuló con varios excipientes (10 % p/v) o combinaciones de excipientes (concentración total del 10 % p/v en proporciones iguales). Se produjeron parches de microagujas en disolución con estas formulaciones como se describe en el ejemplo 5 y se almacenaron con desecante a 25 °C. En momentos determinados, algunos parches se disolvieron en solución salina y se analizó su actividad como se describe en el ejemplo 1. Los resultados se ilustran en la figura 6.

Ejemplo 7

La vacuna antigripal de subunidades (B/Brisbane/60/2008, 60 jg/m l) se formuló con excipientes (10% p/v) o combinaciones de excipientes (concentración total del 10 % p/v en proporciones iguales). A continuación, estas formulaciones se desecaron sobre superficies de polidimetilsiloxano a temperatura ambiente durante una hora y se almacenaron a 40 °C con desecante. En un momento dado, la vacuna se volvió a disolver en una solución salina y se analizó su actividad como se describe en el ejemplo 1. Los resultados se ilustran en la figura 7.

Ejemplo 8 (las vacunas contra el sarampión no forman parte de la invención)

Se desarrolló un ensayo de alto rendimiento utilizando eGFP-MeV para examinar la estabilidad del virus del sarampión después del desecado y almacenamiento en un intervalo de temperaturas. El virus de la vacuna contra el sarampión genéticamente alterado diseñado para producir eGFP durante la replicación se adquirió del laboratorio del Dr. Paul DuPrex en la Universidad de Boston. Esta se propagó luego en células Vero como se ha descrito anteriormente para aumentar el título viral. El título final se midió usando un ensayo DICT50 y fue de 3,0 x 105 unidades víricas/ml.

Se seleccionaron varios excipientes para evaluar la estabilidad del virus del sarampión alterado. En la Tabla 2 se proporciona una lista de excipientes y las concentraciones probadas. Todos los porcentajes enumerados representan un porcentaje en peso/volumen de la solución acuosa antes del desecado.

Tabla 2: Exci ientes concentración analizados

continuación

Todas las formulaciones de excipientes se mezclaron en una proporción 1:1 con una reserva de eGFP-virus de la vacuna contra el sarampión (eGFP-MeV) con un título de 3,0 x 105 DICT50/ml. A continuación, se recubrió una muestra de 3 |jl de esta formulación sobre chips de acero inoxidable que se colocaron en tubos de centrífuga y se almacenaron en una bolsa opaca junto con desecante que cambia de color (Drierite, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) que fue sellado para proteger contra la contaminación por humedad. Todas las muestras se secaron durante 24 horas a 22 °C en una campana extractora antes de almacenarlas durante varios períodos de tiempo. Después de sacarlo del almacenamiento, se verificó el desecante de cada muestra para determinar si había humedad. Si se detectó alguna contaminación, la muestra se descartó.

Las muestras desecadas se reconstituyeron con 1 ml de una solución de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Gibco, Grand Island, NY) que contenía suero bovino fetal al 2 % (FBS, Gibco) y se evaluó la actividad de fluorescencia utilizando placas de 96 pocillos que contenían una monocapa de células Vero. A cada pocillo de la placa, se añadieron 100 j l de la solución vírica reconstituida. Las placas se incubaron durante 72 horas a 37 °C para estimular la propagación del virus. Después de la incubación, cada pocillo se lavó con 300 j l de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS, Sigma-Aldrich) para eliminar el medio y las partículas de virus no infectadas. Cualquier solución restante se aspiró de los pocillos antes de la prueba. La detección de la fluorescencia se logró midiendo cada pocillo usando un lector de placas de 96 pocillos con una longitud de onda de excitación de 485 y una longitud de onda de emisión de 520. La señal detectada de cada muestra se comparó con un control positivo que contenía la misma concentración de eGFP-MeV líquido.

Las muestras que incluían los excipientes enumerados se almacenaron para diversos tiempos y temperaturas para evaluar su capacidad para mantener la actividad de eGF-MeV después del desecado. Los excipientes se eliminaron de la consideración de forma escalonada después de la exposición a condiciones más estrictas.

Se creó una solución estabilizante que consistía en 300 mM de treonina (Sigma-Aldrich) y sacarosa al 15% p/v (Sigma-Aldrich) en DI-H2O para el experimento de almacenamiento final. Las muestras se crearon utilizando el método descrito anteriormente y se almacenaron a 4 °C, 22 °C y 45 °C entre 1 y 24 semanas. También se incluyó un control que consistía en una muestra desecada de eGFP-MeV que no contenía estabilizantes almacenados a 22 °C durante de 1 a 4 semanas.

Todas las estadísticas se calcularon utilizando el software Prism versión 6.02 (Graphpad, La Jolla, CA). Las comparaciones entre muestras individuales se realizaron utilizando una prueba t no apareada con un valor de corte de significación de p <0,05. Las comparaciones entre múltiples muestras se realizaron mediante un ANOVA de dos vías con una prueba posterior de Tukey y un valor de corte de significación de p <0,05. La línea de mejor ajuste exponencial se determinó utilizando Excel 2013 (Microsoft, Redmond, WA). Los promedios de todos los resultados representan la media aritmética de las muestras analizadas.

Antes de pasar al selección de estabilidad, se realizaron experimentos iniciales para comprender mejor los parámetros del ensayo eGFP. Se infectaron múltiples placas de 96 pocillos que contenían capas confluentes de células Vero con concentraciones decrecientes de eGFP-MeV y luego se dejaron incubar durante 2, 3 o 4 días para examinar cómo cambiaba la actividad de fluorescencia con el tiempo. Los resultados mostraron que después de 3 días de incubación había una correlación lineal entre la concentración de virus y la intensidad de la fluorescencia a partir de una concentración de 250 DICT50/ml (no mostrado). Este tiempo de incubación se eligió para todos los experimentos posteriores.

Para evaluar rápidamente el potencial estabilizador de la lista inicial de excipientes, a alta temperatura, se realizó un estudio de almacenamiento a corto plazo. El estudio de selección inicial dio como resultado la eliminación de la mayoría de los excipientes elegidos. Tras almacenar durante 7 días a 37 °C, aproximadamente el 41 % de las muestras analizadas retuvo menos del 1 % de su actividad inicial. Se eligió el valor de corte del 10 % de la actividad restante porque corresponde al requisito de la OMS para la vacuna contra el sarampión viva atenuada almacenada durante 1 semana a 37 °C. Esto dio como resultado la eliminación de aproximadamente el 60 % de la lista inicial (figura 8). Después del selección inicial, se eligieron 14 muestras para una mayor investigación en el segundo experimento de selección.

Para evaluar mejor el potencial estabilizador de los excipientes restantes, se eligió una condición de almacenamiento más prolongada para la segunda pantalla. Después de 1 mes a 37 ° C, solo 4 muestras demostraron una actividad remanente de más del 1% (Figura 9). Durante esta pantalla secundaria, se observó que cuando los excipientes, glicina y sacarosa, exhibían individualmente una actividad estabilizadora extremadamente baja (permanecían un 0,53% y un 0,61% de actividad, respectivamente); sin embargo, cuando estos excipientes se combinaron, la actividad restante de la vacuna desecada aumentó significativamente al 30,45% (p <0,0005). Esto llevó a la investigación del efecto de utilizar una mayor variedad de carbohidratos, azúcar y aminoácidos para estabilizar la vacuna contra el sarampión.

Se realizaron combinaciones de todos los excipientes en estas dos categorías que exhibieran cualquier actividad estabilizante durante la selección inicial. Todos los aminoácidos también se analizaron individualmente para que sirvieran como control. Después del almacenamiento durante 1 mes a 37 °C, los resultados coincidieron con las observaciones anteriores, mostrando cada aminoácido analizado una mayor capacidad estabilizante cuando se emparejó con un azúcar carbohidrato (figura 10). Se determinó que la sacarosa es el estabilizante secundario más potente, ya que las combinaciones que incluían sacarosa tenían la actividad restante más alta para 6 de los 7 aminoácidos analizados. Se utilizó un límite de corte del 40 % para esta selección para excluir las combinaciones estabilizantes que tenían una actividad más baja.

Se llevó a cabo un selección final para determinar la mejor combinación de excipientes a utilizar para experimentos de estabilidad más extensos. Tras almacenar durante 1 mes a 45 °C, se analizó la actividad restante de cada muestra. Este selección mostró que una combinación del aminoácido treonina y el azúcar sacarosa tenía el mayor potencial estabilizador (figura 11), reteniendo casi el 14% de su actividad original después del almacenamiento en esta dura condición de temperatura.

La mezcla de excipientes de mayor rendimiento se sometió luego a un experimento a más largo plazo para examinar más a fondo su capacidad para mantener la infectividad de eGFP-MeV. Las muestras se almacenaron en un intervalo de temperaturas durante hasta 2 meses. Después del almacenamiento durante 1 semana a temperatura ambiente (25 °C), la muestra de control que no incluía ningún excipiente estabilizante había perdido el 100 % de su infectividad medida usando el ensayo eGFP. Las muestras que incluyeron la solución estabilizante (treonina sacarosa) funcionaron mucho mejor (figura 12). Las muestras almacenadas a 4 °C y 25 °C retuvieron en promedio el 95 % y el 89 % de su actividad, respectivamente, después de 1 mes de almacenamiento. Las muestras almacenadas a la temperatura más alta (45 °C) tuvieron una pérdida significativamente mayor en este punto de tiempo, conservando solo el 32 % de su infectividad medida mediante la detección de fluorescencia eGFP. En el último punto de tiempo de 6 meses, las muestras almacenadas a temperaturas más bajas demostraron ser muy estables. Las muestras a 4 °C y 25 °C retuvieron el 100 % y el 90 % de su infectividad original, respectivamente. Las muestras almacenadas a 45 °C mantuvieron menos del 1 % de su infectividad en este punto de tiempo. Se observó que la tasa de descomposición para la muestra de 45 °C calculada por una línea de mejor ajuste exponencial con un R2 = 0,9961 era k = -0,216. La tasa de descomposición para las muestras de 4 °C y 25 °C no se calculó porque no habían perdido una cantidad significativa de actividad en el punto de tiempo de 6 meses.

Si bien se ha estudiado anteriormente la estabilización de la vacuna contra el sarampión con virus vivos atenuados, el desecado a temperatura y presión ambiente es una alternativa que no ha sido bien estudiada. Muchos sistemas de administración de vacunas, tal como el parche de microagujas, no son adecuados para compuestos desecados mediante desecado por pulverización, liofilización o métodos similares. Por lo tanto, estos experimentos examinaron la capacidad de los compuestos excipientes disponibles comercialmente aprobados para uso humano para estabilizar la vacuna contra el sarampión después del desecado y posterior almacenamiento. Las formulaciones de excipientes que contenían tanto un azúcar como un aminoácido demostraron un potencial estabilizador muy superior al que mostraron los excipientes cuando se analizaron individualmente. La formulación más eficaz incluía una mezcla de treonina y sacarosa y pudo mantener la actividad de la vacuna contra el sarampión casi completa según lo medido mediante el ensayo con eGFP de los inventores después de 6 meses a 4 °C y 25 °C. También pudo mantener más del 10 % de actividad a 45 °C durante más de 8 semanas.

Ejemplo 9 (las vacunas contra el sarampión no forman parte de la invención)

Se formuló un parche que contenía agujas poliméricas de escala micrométrica para encapsular la vacuna contra el sarampión. Los parches de microagujas se produjeron mediante un proceso de dos etapas en el que la vacuna estabilizada contra el sarampión se cargó en micromoldes, localizándose la vacuna hacia las puntas de las microagujas. A continuación, se vertió una solución de material de matriz de microagujas sobre los moldes para formar la parte restante de las microagujas y el forro del parche.

El parche de microagujas contenía 100 microagujas piramidales, midiendo cada una 600 pm de altura, 300 pm de anchura en la base y estrechándose hasta un radio de punta de menos de 3 pm. Las microagujas contenían la dosis estándar de vacuna contra el sarampión viva atenuada encapsulada en cada parche.

La estabilidad de la vacuna de microagujas contra el sarampión se evaluó midiendo el título del virus de la vacuna en parches de microagujas almacenados a diversas temperaturas durante casi 4 meses. La vacuna líquida reconstituida contra el sarampión era inestable y perdió esencialmente toda su potencia en 28 días a 25 °C y en menos de una semana a 40°C (figura 13A-13C). La vacuna liofilizada disponible comercialmente también demostró inestabilidad a 40 °C, perdiendo más de 100 veces la infectividad después de 28 días y más de 1000 veces la infectividad en 3 meses. En cambio, el parche de microagujas mantuvo su potencia total durante casi cuatro meses a 25 °C y perdió menos de 10 veces la infectividad después de casi 4 meses a 40 °C.

Una comparación de las figuras 13A y 13B demuestra que las formulaciones que son efectivas para estabilizar la vacuna contra el sarampión en estado sólido no son necesariamente efectivas para estabilizar la vacuna contra el sarampión en su estado líquido. Aunque se utilizó la misma formulación de vacuna para el líquido y el sólido, los perfiles de estabilidad del líquido y del sólido eran muy diferentes. Estas observaciones están respaldadas más ampliamente por estudios que han demostrado que la estabilidad de las formulaciones de vacunas puede reducirse significativamente cuando la vacuna desecada se reconstituye en líquido.

La imprevisibilidad de si un excipiente será eficaz para estabilizar una formulación de vacuna líquida o sólida también se evidencia por las diferencias observadas entre los estudios de la técnica anterior sobre la estabilidad de la vacuna líquida y los resultados de la presente solicitud. Por ejemplo, mientras que estudios previos identificaron a la lactosa como estabilizador de formulaciones de vacunas líquidas contra el sarampión, la lactosa no fue capaz de estabilizar las formulaciones desecadas de la vacuna contra el sarampión. Compárese, por ejemplo, Kissmann J, et al., "Stabilization of measles virus for vaccine formulation", Hum. Vaccine 4(5):350-9 (2008), y el Ejemplo 8. La sacarosa, sin embargo, fue eficaz para estabilizar las formas líquidas y sólidas de las formulaciones de la vacuna contra el sarampión. Id.

Ejemplo 10 (las vacunas contra el sarampión no forman parte de la invención)

Se evaluó la respuesta inmunitaria después de la vacunación contra el sarampión usando el parche de microagujas del ejemplo 9 en macacos rhesus. El macaco rhesus es un modelo bien establecido para los estudios de vacunación contra el sarampión, ya que la respuesta inmunitaria en los macacos muestra una fuerte correlación con la respuesta inmunitaria humana. Un grupo de monos recibió una dosis humana estándar de la vacuna contra el sarampión viva atenuada mediante un parche de microagujas y el grupo de control positivo recibió la misma dosis de vacuna mediante una inyección subcutánea.

El parche de microagujas se puede presionar en la piel con una fuerza de 28 N, que corresponde a 0,28 N por microaguja, de acuerdo con los hallazgos anteriores. Esta fuerza puede ser aplicada fácilmente por un pulgar humano. Las microagujas se disolvieron rápidamente al insertarlas en la piel de un cadáver porcino. En un minuto, las puntas de las microagujas se disolvieron. Al cabo de 10 minutos, las microagujas se habían disuelto casi por completo.

Para minimizar el desperdicio de vacunas y proporcionar una dosificación precisa, se confirmó que la vacuna contra el sarampión se había concentrado dentro de las microagujas, que entran en la piel, en lugar de en el forro del parche. Antes de su uso, cada parche utilizado para la vacunación de los monos contenía aproximadamente 3100 DICT50 de vacuna contra el sarampión. Diez minutos después de la aplicación manual sobre la piel de los macacos rhesus, el forro del parche de microagujas y cualquier resto de microagujas restante contenían 9,4 ± 2,2 % de la vacuna original cargada en los parches de microagujas, lo que indica que más del 90 % de la dosis de la vacuna se había administrado a la piel.

Se obtuvieron muestras de suero semanalmente y se analizaron para detectar anticuerpos contra el virus del sarampión. Para controlar la progresión de la respuesta inmunitaria, las muestras de suero se analizaron para detectar la presencia de IgM específica contra el sarampión mediante ELISA. Se detectó IgM específica contra el sarampión para todos los animales en ambos grupos ya en el día 14 después de la vacunación. La presencia de anticuerpos IgM específicos contra el sarampión confirmó que todos los animales habían generado una respuesta inmunitaria primaria al sarampión después de la vacunación.

Los anticuerpos neutralizantes se detectaron por primera vez a partir de los 21 días posteriores a la vacunación y aumentaron hasta un máximo el día 28 de aproximadamente 4700 mUI/ml en ambos grupos. Los títulos máximos y los tiempos hasta el título máximo no fueron significativamente diferentes entre los dos grupos (p> 0,05). Tanto en el grupo de parche de microagujas como en el de inyección subcutánea, todos los animales se seroconvirtieron y todos los animales tenían un título de> 120 mUI/ml, que se considera protector en seres humanos. Los títulos de anticuerpos neutralizantes se mantuvieron durante al menos 133 días después de la vacunación. En conjunto, ambas vacunas generaron una sólida respuesta de anticuerpos en los macacos rhesus y estos datos muestran que la vacunación contra el sarampión usando un parche de microagujas indujo títulos de anticuerpos neutralizantes equivalentes a la vacunación por inyección subcutánea convencional. El momento y la magnitud de las respuestas de anticuerpos fueron similares a los observados después de la vacunación experimental de macacos rhesus mediante inyección subcutánea en estudios anteriores.

La inmunogenicidad del parche de microagujas se comparó con la inyección subcutánea en macacos rhesus (Macaca mulatta), según lo aprobado por los Comités Institucionales de Uso y Cuidado de Animales de los CDC y el Instituto de Tecnología de Georgia. Los títulos de anticuerpos neutralizantes del sarampión se midieron mediante el ensayo de neutralización por reducción de placa. Se analizaron diluciones por dos de suero comenzando con una dilución de 1:4. Se utilizó un ensayo de IgM de inmunosorción ligado a enzimas desarrollado previamente en el CDC41 para detectar anticuerpos IgM en suero contra el virus del sarampión. Los resultados se determinaron utilizando los valores de corte estándar.

El parche de microagujas no requirió reconstitución con diluyente, se disolvió en la piel en 10 minutos y únicamente causó eritema cutáneo transitorio leve. Ambos grupos de rhesus generaron respuestas de anticuerpos neutralizantes contra el sarampión que fueron consistentes con la protección y los títulos de anticuerpos neutralizantes fueron equivalentes. Además, los parches de microagujas mantuvieron un nivel aceptable de potencia después del almacenamiento a temperatura elevada, lo que sugiere una termoestabilidad mejorada en comparación con la vacuna liofilizada estándar. Por lo tanto, una vacuna con parche de microagujas contra el sarampión fue inmunogénica en primates no humanos y este enfoque ofreció un método de administración prometedor que podría ayudar a mejorar la cobertura de vacunación.

Aunque la invención se ha descrito con detalle y con referencia a las realizaciones específicas de la misma, se apreciará que los expertos en la materia, al lograr una comprensión de lo anterior, pueden concebir fácilmente modificaciones, variaciones y equivalentes de estas realizaciones. En consecuencia, el alcance de la presente invención deberá evaluarse como el de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Una composición de vacuna que comprende:

(i) un virus de la gripe inactivado de subunidades seleccionado entre el grupo que consiste en gripe A, gripe B, gripe C y combinaciones de los mismos; y

(ii) una mezcla de excipientes que comprenden sacarosa y arginina, en donde la composición está en forma sólida desecada;

en donde la mezcla de excipientes está presente en la composición en una cantidad total del 1 % al 90 % en peso; y en donde los excipientes de la mezcla están presentes en la composición en una proporción de 1:15 a 15:1.

2. La composición de vacuna de la reivindicación 1, en donde los excipientes de la mezcla están presentes en la composición en una relación de 1:1.

3. La composición de vacuna de la reivindicación 1, que comprende además uno o más adyuvantes.

4. La composición de vacuna de la reivindicación 1, en donde el virus de la gripe inactivado de subunidades se caracteriza por tener una estabilidad mejorada durante seis meses en la composición en comparación con una composición comparativa que comprende el virus de la gripe inactivado de subunidades sin uno o más excipientes.

5. La composición de vacuna de la reivindicación 1, en donde el virus de la gripe inactivado de subunidades se caracteriza por tener una estabilidad mejorada durante tres meses en la composición en comparación con una composición comparativa que comprende el virus de la gripe inactivado de subunidades sin uno o más excipientes.

6. La composición de vacuna de la reivindicación 1, en donde el virus de la gripe inactivado de subunidades mantiene al menos el 50 % de su actividad después de tres meses de almacenamiento a temperaturas de hasta 40 °C.

7. La composición de vacuna de la reivindicación 1, en donde el virus de la gripe inactivado de subunidades mantiene al menos el 75 % de su actividad después de tres meses de almacenamiento a temperaturas de hasta 40 °C.

8. La composición de vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la composición de vacuna está en forma de microaguja soluble o de recubrimiento de microaguja.

9. Un método de preparación de una composición de vacuna, que comprende:

preparar una solución acuosa que comprende:

(i) un virus de la gripe inactivado de subunidades seleccionado entre el grupo que consiste en gripe A, gripe B, gripe C y combinaciones de los mismos, y

(ii) una mezcla de excipientes que comprenden sacarosa y arginina; en donde la mezcla de excipientes está presente en la composición en una cantidad total del 1 % al 90 % en peso; y en donde los excipientes de la mezcla están presentes en la composición en una proporción de 1:15 a 15:1; y

desecar la solución a una temperatura de 1 °C a 60 °C para formar una composición de vacuna sólida seca, en donde la solución acuosa se vierte en un molde para formar una matriz de microagujas antes de desecar la solución.

10. Un parche transdérmico que comprende una base y una matriz de microagujas que se extienden desde la base y comprenden la composición de vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.