JPWO2010001671A1 - マイクロニードルデバイスおよびマイクロニードルデバイスによるインフルエンザワクチンの奏功性を上昇させる方法 - Google Patents

Abstract

インフルエンザワクチンの免疫原性を増強させるマイクロニードルデバイスによる免疫原性増強方法を提供する。本マイクロニードルデバイスによる免疫原性増強方法は、Ａ型（Ｈ１Ｎ１）株、Ａ型（Ｈ３Ｎ２）株及びＢ型株を有効成分とする抗原からなるインフルエンザワクチンをコーティングしたポリ乳酸からなるマイクロニードルを備えたマイクロニードルデバイスを皮膚に当接し前記インフルエンザワクチンを経皮投与する。経皮投与後にマイクロニードルデバイスを皮膚に当接した箇所にラウリルアルコールを塗布する。

Description

本発明は、マイクロニードルデバイスによる免疫原性増強方法に関する。

皮膚は、最外層の角質層、表皮、真皮、および皮下結合組織からなる。通常、死細胞層および脂質二重層からなる角質層は、多くの物質に対して強力なバリア機能を示す。真皮層には、ランゲルハンス細胞と呼ばれる抗原提示細胞が存在し免疫機能を担っている。ランゲルハンス細胞は、皮膚内に侵入したタンパク質抗原を補足し、内部で分解し、ＭＨＣ分子上にペプチド断片を表出する。ＭＨＣ−ペプチド複合体は、輸入リンパ管から所属リンパ節の皮質下層へと移動し、Ｔ細胞と指状突起細胞とを介して接触する。ランゲルハンス細胞が、このように移動することによって、抗原が皮膚からリンパ節内に存在するＴ_Ｈ細胞へと伝えられる。ランゲルハンス細胞は、抗原をＴ_Ｈ細胞へ提示するために必要なＭＨＣクラスＩＩ分子を有している。

このように皮膚の角質層による強力なバリア機能のため真皮層へのワクチンは有効であることは知られていたが、３００〜２０００μｍと限られた真皮層への注射針による投与は技術的難しさから精度上の問題があった。

これを解決するための手段として、マイクロニードルが開発されている。これらは、最外層である角質層を穿刺することを目的とし、様々なサイズや形状（高さ数十〜数百マイクロメートル程度の非常に小さな突起物）が考案されており、特に非侵襲的なワクチン投与方法として期待されている。

また、マイクロニードルを備えたデバイスを利用した場合の薬剤の適用方法についても様々な方法が考案されており、薬剤をマイクロニードル表面にコーティングして投与する方法や、針に薬剤あるいは生体成分を透過させるための穴（中空針）や溝を形成する方法、針自身に薬剤を混合する方法等が提案されている。これらのマイクロニードルデバイスは、何れも高さ数十〜数百マイクロメートル程度の非常に小さな突起物（マイクロニードル）を備えたものであるため、薬剤の適用方法によっては薬剤の経皮吸収性や吸収効率も大きく異なると考えられる。

例えば、マイクロニードルを用いて抗原（ワクチン）の経皮吸収性を効率的に促進させる方法として、マイクロニードル表面の一部分に薬剤をコーティングする方法があり、例えば非特許文献１に開示されている。これは、マイクロニードルの一部分（特に針部分のみ）に抗原（ワクチン）をコーティングした場合、適用した抗原（ワクチン）の全てまたはそのほとんどが体内へ移行し、正確な真皮への投与手段として有用であることを示している。

ところで、診断薬や薬剤のような医薬物質を効率的かつ安全に投与することの重要性が最近認識されてきている。特に最近は新型インフルエンザ対策としてプレパンデミックワクチン（Ａ／Ｈ５Ｎ１亜型）の開発が進んでいる（非特許文献２）。その接種方法は３週間の間隔で皮下あるいは筋肉内に２回接種する必要があり、この種の新型インフルエンザの大流行を考えた場合、いかに少ないワクチンでいかに多くの人に免疫を惹起させるかという、ワクチンの効率的で簡便な投与方法の開発が望まれる。

また、現在日本において広くインフルエンザワクチンとして使用されている日本薬局方生物学的製剤基準「インフルエンザＨＡワクチン」は、Ａ型（Ｈ１Ｎ１）、Ａ型（Ｈ３Ｎ２）及びＢ型の３価混合であり、用法として１回またはおよそ１〜４週間の間隔をおいて２回皮下注射となっている。これにもまれに免疫が惹起しにくい人がいることがわかっており、やはりワクチンの効率的な投与が必要とされる。

インフルエンザワクチンを用いたマイクロニードル製剤については、特許文献１に開示されている。開示されたマイクロニードル製剤はインフルエンザワクチンの投与方法、処方を含むが、マイクロニードルによる抗原の投与量と効果（抗体価）の関係について、筋肉内注射（ＩＭ）や皮下注射（ＳＣ）を使った投与量以下での検討は行っていない。また、抗原の投与量の低減や効果を増強させるための方策は講じていない。

特許文献２には、インフルエンザワクチンを経口投与、鼻腔内投与あるいは注射により投与した後、アジュバントを皮膚表面から適用する経皮的免疫賦活方法が開示されており、経口、骨格筋内、皮下等の投与方法が例示されているが、マイクロニードルによる投与は記載されていない。

特許文献３には、治療用物質の量を低減させ治療効果を達成する目的で中空針を持ったマイクロニードルによる投与が開示されているが、免疫の惹起についての記載はない。

特表２００７−５３０６８０号公報 特表２００４−５２９９０６号公報 特表２００６−５０６１０３号公報

Ｐｈａｒｍａ．Ｒｅｓ．１９（１），６３−７０（２００２） 日本ワクチン学会ニュースレター，ｖｏｌ．１２（２００７．１．１０）

上述のようにインフルエンザワクチンをマイクロニードルにコーティングして真皮への正確な投与を行うことにより、効率的で簡便なインフルエンザワクチンの投与の可能性があるにもかかわらず、これまでインフルエンザワクチンのマイクロニードルによる投与と注射による投与についての十分な比較検討がなされていない。
本発明の目的は、インフルエンザワクチンの免疫原性を増強させるマイクロニードルデバイスによる免疫原性増強方法を提供することにある。

本発明者は以上を技術背景として日々検討を重ねた結果、Ａ型（Ｈ１Ｎ１）株、Ａ型（Ｈ３Ｎ２）株及びＢ型株を有効成分とする抗原からなるインフルエンザワクチンをコーティングしたマイクロニードルを用いてインフルエンザワクチンを経皮投与することで、皮下注射に比べて効率的にインフルエンザワクチンの抗体性が上昇することを見いだした。更にインフルエンザワクチンをコーティングしたマイクロニードルを経皮投与後、投与部位にラウリルアルコールを塗布することで、皮下投与に比べて効率的に３価の全ての亜型の顕著な抗体価の上昇が確認できた。

すなわち、本発明に係るマイクロニードルデバイスによる免疫原性増強方法は、Ａ型（Ｈ１Ｎ１）株、Ａ型（Ｈ３Ｎ２）株及びＢ型株を有効成分とする抗原からなるインフルエンザワクチンをコーティングしたポリ乳酸からなるマイクロニードルを備えたマイクロニードルデバイスを皮膚に当接し前記インフルエンザワクチンを経皮投与するものである。ここで、前記インフルエンザワクチンの経皮投与後、前記マイクロニードルデバイスを皮膚に当接した箇所にアジュバント効果を有するラウリルアルコールの塗布ではさらに免疫原性が増強される。その他にも皮膚浸透が可能なアジュバント活性を有する物質の塗布は免疫原性の増強効果が期待できる。

本発明に係るマイクロニードルデバイスは、Ａ型（Ｈ１Ｎ１）株、Ａ型（Ｈ３Ｎ２）株及びＢ型株を有効成分とする抗原からなるインフルエンザワクチンをコーティングしたポリ乳酸からなるマイクロニードルを備える。ここで、前記コーティングは、コーティング担体としてプルランを含むことが好ましい。また、前記コーティングは、ラウリルアルコールを含むことができる。

本発明によれば、Ａ型（Ｈ１Ｎ１）株、Ａ型（Ｈ３Ｎ２）株及びＢ型株を有効成分とする抗原からなるインフルエンザワクチンを、注射による皮下投与に比べ、効率的で簡便な操作で３価全ての亜型の免疫原性を上昇させることができる。経皮的免疫賦活用のマイクロニードルデバイスを用いることにより、インフルエンザワクチンにより誘発される免疫応答を刺激し、ワクチン内の抗原の有効用量を減らすことができる。

本発明に係るマイクロニードルデバイスの一例を示す図であり、（ａ）は斜視図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ｂ断面図である。 ＩｇＧ抗体価についてマイクロニードル投与群と皮内投与群との比較を示す図である。 ＩｇＡ抗体価についてコントロール群とマイクロニードル投与群との比較（鼻腔）を示す図である。 ＩｇＡ抗体価についてコントロール群とマイクロニードル投与群との比較（肺）を示す図である。 インフルエンザワクチン投与後の経時における個別抗体価の測定結果の一例を示すグラフである。 インフルエンザワクチン投与後の抗体価の推移の一例を示すグラフである。 ＨＩ抗体価の測定結果の一例を示すグラフである。

図１は本発明に係るマイクロニードルデバイスの一例を示す図であり、（ａ）は斜視図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ｂ断面図である。図１（ａ）に示すように、本発明に係るマイクロニードルデバイス（インターフェイス）５は、マイクロニードル基板８と、皮膚又は粘膜を穿孔可能な二次元状に配置された複数のマイクロニードル６とを有する。マイクロニードル基板８は、各マイクロニードル６に対応して配置された複数の開口部７を備える。本例では、マイクロニードル６の形状は円錐状であるが、本発明はこれに限定されず、四角錐等の多角錐でもよく、また別の形状でもよい。また、複数のマイクロニードル６と複数の開口部７とが交互にそれぞれ正方格子状に配置されているが、本発明はこれに限定されない。さらに、マイクロニードル６と開口部７の数は図では１：１であるが、本発明はこれに限定されることなく、開口部７を含まないものも含む。

本例では、マイクロニードル６の一部又は全面が、Ａ型（Ｈ１Ｎ１）株、Ａ型（Ｈ３Ｎ２）株及びＢ型株を有効成分とする抗原からなるインフルエンザワクチンでコーティングされている。コーティング１は、例えば、図１（ｂ）に示すように、各マイクロニードル６の表面に配置される。コーティング１は、マイクロニードル６の全体に配置されているが、その一部に配置することもできる。用時に、図１（ａ）に示すマイクロニードル６の配置されたマイクロニードル基板面を皮膚に当接し、その反対面から薬物の溶解液を流すと、各開口部７から液体が流れ出て各マイクロニードル６に伝達され、上記インフルエンザワクチンが経皮吸収される。ここで、開口部７は必須ではなく、液体は開口部７を用いることなく別の手段でマイクロニードル６に供給してもよい。また、コーティング１は外部から液体を付与することなく、マイクロニードルを皮膚に穿孔したときの体液により溶解させることで、インフルエンザワクチンを皮膚内に放出させることができる。

マイクロニードルデバイス中のマイクロニードルは、皮膚又は粘膜に穿刺されるマイクロニードル（針）とこの針部を支持する基板からなり、マイクロニードルは基板に複数配列されている。マイクロニードルは微小構造であり、マイクロニードルの高さ（長さ）ｈは、好ましくは５０μｍ〜７００μｍであり、より好ましくは１００μｍ〜６００μｍ、更に好ましくは２００μｍ〜５００μｍである。ここで、マイクロニードルの長さを５０μｍ以上とするのはインフルエンザワクチンの経皮からの投与を確実とするためであり、７００μｍ以下とするのはマイクロニードルの神経との接触を回避し、痛みの可能性を確実に減少させることができると同時に出血の可能性を確実に回避するためである。また、その長さが７００μｍ以下であると、皮内に入るインフルエンザワクチンの量を効率よく投与することができる。

ここで、マイクロニードルとは、凸状構造物であって広い意味での針形状又は針形状を含む構造物を意味し、円錐状構造の場合、通常その基底における直径は５０〜２００μｍ程度である。また、マイクロニードルは、先鋭な先端を有する針形状のものに限定されるものではなく、先の尖っていない形状も含むものである。マイクロニードルは、好適には非金属製の合成または天然の樹脂素材を用いて作製される。また、マイクロニードルの形状は本例では円錐状であるが、本発明はこれに限定されず、四角錘等の多角錘でもよく、また別の形状でもよい。

マイクロニードル基板はマイクロニードルを支持するための土台であり、その形態は限定されるものではなく、例えば図１のように貫通した穴（開口部）を備えた基板であってもよく、この場合、基板の背面から、マイクロニードルにコーティングしたインフルエンザワクチンの溶解液を流すことができる他、インフルエンザワクチンを開口部およびマイクロニードルを介して流して投与することもできる。マイクロニードルあるいは基板の材質としては、シリコン、二酸化ケイ素、セラミック、金属（ステンレス、チタン、ニッケル、モリブテン、クロム、コバルト等）及び合成または天然の樹脂素材等が挙げられるが、マイクロニードルの抗原性および材質の単価を考慮すると、ポリ乳酸、ポリグリコリド、ポリ乳酸−ｃｏ−ポリグリコリド、プルラン、カプロノラクトン、ポリウレタン、ポリ無水物等の生分解性ポリマーや、非分解性ポリマーであるポリカーボネート、ポリメタクリル酸、エチレンビニルアセテート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリオキシメチレン等の合成または天然の樹脂素材が特に好ましい。また、多糖類であるヒアルロン酸、プルラン、デキストラン、デキストリン若しくはコンドロイチン硫酸等も好適である。特に、ポリ乳酸は生分解性樹脂であり、インプラント製剤としても使用実績がある（特表２００２−５１７３００号公報または、Journal of Controlled Release 104 (2005) 51-66）ことから、強度面、安全面からみて最も好適なマイクロニードル素材の一つである。

マイクロニードル（針）の密度は、典型的には、針の横列は１ミリメートル（ｍｍ）当たり約１ないし１０の密度が提供される様に横列間が空けられている。一般に、横列は横列内の針の空間に対し実質等しい距離だけ離れており、１ｃｍ^２当たり１００〜１００００本の針密度を有し、好ましくは１００〜５０００本、より好ましくは２００〜２０００本、更に好ましくは４００〜１０００本である。１００本以上の針密度があると、効率良く皮膚を穿孔することができ、１００００本を超える針密度では、マイクロニードルに皮膚穿孔可能な強度を付与することが難しくなる。

マイクロニードルの製法としては、シリコン基板を用いたウエットエッチング加工又はドライエッチング加工、金属又は樹脂を用いた精密機械加工（放電加工、レーザー加工、ダイシング加工、ホットエンボス加工、射出成型加工等）、機械切削加工等が挙げられる。これらの加工法により、針部と支持部は、一体に成型される。針部を中空にする方法としては、針部を作製後、レーザー加工等で２次加工する方法が挙げられる。

マイクロニードルへコーティングを行う際に、コーティング液の溶媒揮発による薬剤の濃度変化および物性の変化を最小限にするために、装置の設置環境の温湿度を一定に制御することもできる。溶媒の蒸散を防ぐためには、温度を下げるか湿度を上げるかのどちらかまたはその両方を制御することが好ましい。温度を制御しない場合の室温での湿度は、相対湿度として５０〜１００％ＲＨであり、好ましくは７０．０〜１００％ＲＨである。５０％ＲＨ以下であると溶媒の蒸発が起こり、コーティング液の物性の変化が起こる場合がある。加湿方式には、目的の湿度状態が確保できれば特に限定されないが、気化式、蒸気式、水噴霧式などがある。

インフルエンザワクチンはその型に限定されるものではなく、シーズン性ワクチンからパンデミックワクチンであればＡ型、Ｂ型、Ｃ型と各々に存在する亜型をも含みうる。例えば、日本薬局方の生物学的製剤基準「インフルエンザＨＡワクチン」は、Ａ型（Ｈ１Ｎ１）株、Ａ型（Ｈ３Ｎ２）株及びＢ型株を有効成分とする抗原からなるインフルエンザワクチンである。

マイクロニードルにコーティングするコーティング液は、インフルエンザワクチンの他、コーティング担体及び液体組成物を含み得る。また本発明コーティングとは、マイクロニードル（針）にコーティング液が留まり固着した状態が好ましく、そのためにコーティング液に乾燥工程を加えて固着させることもある。

コーティング担体としては、インフルエンザワクチンと比較的相溶性（均一に交わる性質）のある多糖類の担体が好ましく、ポリヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリメチルセルロース、デキストラン、ポリエチレングリコール、プルラン、カルメロースナトリウム、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デキストラン、アラビアゴム等が好ましく、更にヒドロキシプロピルセルロース、プルラン、アラビアゴムがより好ましい。また、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ−ＳＳＬ（分子量：１５，０００〜３０，０００）、ＨＰＣ−ＳＬ（分子量：３０，０００〜５０，０００）、ＨＰＣ−Ｌ（分子量：５５，０００〜７０，０００）、ＨＰＣ−Ｍ（分子量：１１０，０００〜１５０，０００）、ＨＰＣ−Ｈ（分子量：２５０，０００〜４００，０００））、プルラン、ヒアルロン酸が更に好ましい。特に、インフルエンザワクチンとの相溶性の面でプルランが最も好ましい。

コーティング液全体のコーティング担体の含量は、１〜７０重量％であり、好ましくは１〜４０重量％であり、特に好ましくは３〜２５重量％である。また、このコーティング担体は、液だれすることのないようある程度の粘性が必要である場合があり、粘度として１００〜１０００００ｃｐｓ程度必要である。より好ましい粘度は、５００〜６００００ｃｐｓである。粘度がこの範囲にあることにより、マイクロニードルの材質に依存することなく、所望量のコーティング液を一度に塗布することが可能となる。また、一般的に粘度が高くなればなるほどコーティング液の量が増える傾向になる。

マイクロニードルをコーティングするのに使用される液体組成物は、生体適合性の担体、送達されるべきインフルエンザワクチン、および場合によってはいずれかのコーティング補助物質を揮発性液体と混合することにより調製する。揮発性液体は、水、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、エタノール、イソプロピルアルコールおよびそれらの混合物等であることができる。これらの中で水が最も好ましい。液体のコーティング液もしくは懸濁液は、典型的には、０．１〜６５重量％のインフルエンザワクチン濃度を有することができ、好ましくは１〜３０重量％、更に好ましくは、３〜２０重量％である。
他の既知の製剤補助物質は、それらがコーティングの必要な溶解性および粘度の特徴ならびに乾燥されたコーティングの性状および物性に有害な影響を及ぼさない限りは、コーティングに添加してもよい。

マイクロニードルのコーティングの厚さは、５０μｍ未満であり、好ましくは２５μｍ未満、さらに好ましくは１〜１０μｍである。一般に、コーティングの厚さは、乾燥後にマイクロニードルの表面にわたって測定される平均の厚さである。コーティングの厚さは、一般に、コーティング担体の複数の被膜を適用することにより増大させること、すなわち、コーティング担体固着後にコーティング工程をくり返すことで増大させることができる。

マイクロニードルの高さ（長さ）ｈは、上述のとおり、好ましくは５０μｍ〜７００μｍである。マイクロニードルのコーティングの高さＨは、マイクロニードルの高さｈによって変動するが、０μｍ〜７００μｍの範囲とすることができ、通常１０μｍ〜７００μｍの範囲内であり、好ましくは、３０μｍ〜５００μｍ程度である。

本発明のマイクロニードルデバイスを使用してインフルエンザワクチンによる免疫の惹起をより完全なものにするために、例えば、アジュバント効果のある脂肪族アルコール類を本発明マイクロニードルデバイスにより投与した部位に塗布することができる。このような脂肪族アルコール類においては、直鎖または分枝状の脂肪族アルコール類が好ましい。このような脂肪族アルコール類において、炭素数および分子量に特に限定はないが、皮膚透過性を考慮すると、炭素数８〜２０であることがより好ましい。また、かかる脂肪族アルコール類は、飽和または不飽和のいずれであってもよい。
これら脂肪族アルコール類の中には経皮吸収における吸収促進剤として利用されるものも多いが、本発明における脂肪族アルコール類は、ＷＯ２００７／０１５４４１を参照すると吸収促進作用に加えて、アジュバント効果を期待することができる。

そのような脂肪族アルコール類は、例えばオクチルドデカノール、ラウリルアルコール、オレイルアルコール、イソステアリルアルコール、デカノールなどであるが、その中でもラウリルアルコール、オクチルドデカノール、イソステアリルアルコールが特に好ましく、ラウリルアルコールが最も好ましい。

ワクチンに混ぜ合わせる場合には、本発明の脂肪族アルコール類は０．１〜９９重量％で好ましく配合され、５〜９０重量％で配合されるのがより好ましく、とくに１０〜８０重量％であるとさらに好ましい。最も好ましい組成中における脂肪族アルコール類の含量は１５〜７５重量％である。

また、後から塗布する場合においては、当然脂肪族アルコール類そのものを塗布することができるが、既知の製剤補助物質を含ませることもでき、その組成は、０．１〜９９重量％で好ましく配合され、５〜９０重量％で配合されるのがより好ましく、とくに１０〜８０重量％であるとさらに好ましい。最も好ましい組成中における脂肪族アルコール類の含量は１５〜７５重量％である。

本発明のマイクロニードルデバイスの投与時間は、４分〜６００分程度と考えられるが、コンプライアンス向上のためには、できるだけ短い方が好ましい。
マイクロニードルデバイスにコーティングされたインフルエンザワクチンのほとんどの投与が終了した時点が最適な投与時間であり、コーティングの組成やアジュバント、更にはマイクロニードルの形状によっても変化すると考えられる。
マイクロニードルデバイスの好ましい投与時間は４分〜１８０分である。４分未満では溶解に時間がかかるためインフルエンザワクチンの投与が不十分となる場合があり、１８０分を超える場合はコンプライアンス上好ましくない。また、この投与時間はより好ましくは４分〜６０分であり、最も好ましくは４分〜１０分である。

本発明のマイクロニードルデバイスは、皮膚内での免疫応答を刺激し、血清中ＩｇＧ抗体価を上昇させる。そして、さらにアジュバントを添加することなくＩｇＡ抗体価も上昇させることが可能となる。特にＩｇＡ抗体価は肺、鼻粘膜等の局所において上昇する。

（実験例１）
以下の通り調整したＡ型（Ｈ１Ｎ１）株、Ａ型（Ｈ３Ｎ２）株及びＢ型株を有効成分とする抗原を含むインフルエンザＨＡワクチンをＢＩＯＭＡＸ−１０Ｋ（ミリポア社製）を用い、遠心分離により濃縮し、高分子ポリマー（プルラン）と混合の後、加湿器にて相対湿度９０〜１００％ＲＨを維持しながら、ポリ乳酸製マイクロニードル（高さ約３００μｍ、密度８４１本／ｃｍ^２、四角錐形状）にコーティングした。コーティング含量は各抗原０．３μｇ／ｐａｔｃｈとし、４週齢のｄｄＹマウス（メス）に麻酔下で腹部剃毛後、コーティングマイクロニードルを皮膚に２時間穿刺投与した。一部投与後にアジュバント液（ラウリルアルコール）を投与部位に滴下した後、同様に２時間穿刺投与した。皮下投与群は背部皮下に１μｇ／５０μＬ／ｈｅａｄを投与した。１週間後に同条件でブーストし、その１週間後に採血後３価の抗体価を測定した。同様に、上記ワクチンを上記マイクロニードルへのコーティング量の３倍分を注射により皮下投与し抗体価を測定した。表１にその結果を示す。

（インフルエンザウイルスＨＡ抗原の調整）
有精卵（受精卵）を孵卵機内で約１１日間、３８〜３９℃で保温し、胚の発生を確認した後、卵殻に注射針が通る程度の穴をあけ、そこから將尿液にワクチン製造株であるインフルエンザウイルス（A/Hiroshima (H3N2)、A/New Caledonia (H1N1)及びB/Malaysia）を直接注入し、その穴をふさぎ、再度、孵卵機に戻し、３２〜３６℃で３日ほど保温した。その後、ウイルス接種卵を冷蔵庫に一晩入れ、卵殻を切り取り、將尿液を無菌的に採取した。採取液中の血液などの混入物を除いた後、ゾーナル遠心機を用いた蔗糖密度勾配遠心法によりウイルス粒子を精製濃縮した。このインフルエンザウイルス浮遊液をエーテル処理し、その後にホルマリンを添加した。
以上のように調整した３株のインフルエンザＨＡ抗原量を生物学的製剤基準（厚生労働省）のインフルエンザＨＡワクチンに記載された力価試験法のうち、一元放射免疫拡散試験法に従い測定し、これを混合、希釈してインフルエンザＨＡワクチンとした。

（ＨＩ抗体価の測定）
マウス血清中のＨＩ抗体価の測定は、３株のＨＡ抗原（Ａ型（Ｈ１Ｎ１）株、Ａ型（Ｈ３Ｎ２）株及びＢ型株）ごとに以下に示す方法で行った。
まず、マウス血清１００μＬの前処理により非特異的赤血球阻害活性及び赤血球自然凝集素を除去した。次に前処理後の１０倍希釈マウス血清をマイクロプレート上で、ＰＢＳを用いて１０倍から６４０倍まで２倍階段希釈（２５μＬ／ｗｅｌｌ）し、これに予め４倍の赤血球凝集活性に調整しておいたＨＡ抗原液（インフルエンザＨＩ試薬「生研」、デンカ生研株式会社）を等量（２５μＬ／ｗｅｌｌ）添加した。これをミキサーでよく振とうした後、室温で１時間静置し、０．５％ニワトリ血球浮遊液を５０μＬずつ各ｗｅｌｌに添加した。室温で１時間静置した後、赤血球凝集阻害を起こした最高希釈倍率を測定し、ＨＩ抗体価とした。

表１に示すように、本発明マイクロニードルデバイスを用いることで投与抗原量が１／３で皮下投与とほぼ同等の効果を示すことが判明した。これより本発明マイクロニードルデバイス投与により、注射による皮下投与に比べ、約３倍の効率的なＨＩ抗体価の上昇が確認された。

さらに、ラウリルアルコールをアジュバントとして併用することでＡ型のＨＩ抗体価が上昇するとともに、これまでＨＩ抗体価が上昇しにくかったＢ型（日本薬局方生物学的製剤 インフルエンザＨＡワクチン参照）にも顕著な効果を示すことが判明した。

（実験例２）
以下の通り調整したＡ型（Ｈ１Ｎ１）株を有効成分とする抗原を含むインフルエンザＨＡワクチンをＢＩＯＭＡＸ−１０Ｋ（ミリポア社製）を用い、遠心分離により濃縮し、高分子ポリマー（プルラン）と混合の後、相対湿度９０〜１００％ＲＨの条件下で、前記混合液をポリ乳酸製マイクロニードル（高さ約３００μｍ、密度８４１本／ｃｍ^２、四角錐形状）に、含量０．３μｇ／ｐａｔｃｈでコーティングした。
１０週齢のｄｄＹマウス（メス）を麻酔下で腹部剃毛後、上記のマイクロニードルをマイクロニードル投与群として皮膚に２時間穿刺投与した。１週間後、さらに１週間後の計２回に同一条件でブーストし、さらに２週間後に採血および鼻腔と肺洗浄を行なった。
一方、皮内投与群として、インフルエンザＨＡワクチン／ＰＢＳを背部皮下に３μｇ／５０μＬ／ｈｅａｄを投与し、１週間後、さらに１週間後の計２回に同一条件でブーストし、さらに２週間後に採血した。
上記で得られた血清から下記方法によりＩｇＧ抗体価を測定し、鼻腔及び肺洗浄の洗浄液から、下記方法によりＩｇＡ抗体価を測定した（ｎ＝４）。

（実験例３）
以下の通り調整したＡ型（Ｈ１Ｎ１）株を有効成分とする抗原を含むインフルエンザＨＡワクチンをＢＩＯＭＡＸ−１０Ｋ（ミリポア社製）を用い、遠心分離により濃縮し、高分子ポリマー（プルラン）と混合の後、相対湿度９０〜１００％ＲＨの条件下で、前記混合液をポリ乳酸製マイクロニードル（高さ約３００μｍ、密度８４１本／ｃｍ^２、四角錐形状）に、含量０．３μｇ／ｐａｔｃｈでコーティングした。
未使用分のマイクロニードルより、抗原を抽出し、タンパクを定量し、ＨＡ換算により算出した結果、投与１回目：２．５μｇ、２回目：１．５μｇ、３回目：３．９μｇであったため、同等量の抗原を皮下投与群に投与した。
動物への投与は、マウス（ｄｄＹ／雌／４Ｗ）の腹部を投与前日に剃毛し、投与当日、ネンブタール麻酔下にて穿刺部位をアルコール綿で消毒し、マイクロニードルを５秒間指で押し、５もしくは１２０分間テープを巻きマイクロニードルを固定した。＜群構成：（１）皮下投与（４匹）、（２）マイクロニードル５分間投与（５匹）、（３）マイクロニードル１２０分間投与（５匹）＞
投与スケジュールは、初回投与の２、４週間後の計３回投与し、採血は、２、４、５週間（２ｗ、４ｗ、５ｗ）後に行った。採血後、ＥＬＩＳＡにてインフルエンザ抗原特異的抗体価（ＩｇＧ）を測定した。また、５週間（５ｗ）後の血清においては、ＨＩ抗体価を測定した。

図５は、インフルエンザワクチン投与後の経時における個別抗体価の測定結果の一例を示すグラフである。図６は、インフルエンザワクチン投与後の抗体価の推移の一例を示すグラフである。図５及び図６に示すように、マウスへの５および１２０分間マイクロニードル（ＭＮ）穿刺投与後のＩｇＧ抗体価に大きな差はなかった。更に、皮下投与（ｓ．ｃ．）とほぼ同等の効果であった。また、表２に示すように、マウスへの５および１２０分間マイクロニードル（ＭＮ）穿刺投与後のＨＩ抗体価においてもほぼ同等であり、皮下投与（ｓ．ｃ．）群と比べ同レベルであることから、５分間の穿刺投与で十分なＨＩ抗体価が期待できると思われる。

（ＩｇＧ抗体価の測定）
採血した血液より血清を分離し、非働化（５６℃、３０分間処理）したものを検体として用いる。コーティングバッファーにより０．２μｇ／ｍＬに希釈したウイルス抗原を１００μＬ／ｗｅｌｌにてｗｅｌｌに添加し、４℃、一夜静置した。固相化したプレートを洗浄バッファー３００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄し、ブロッキングバッファーを３００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、１５分反応した。その後、洗浄バッファー３００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄し、希釈バッファーにて１００倍希釈し、２倍系列で段階希釈した検体を各１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、１時間反応させた。
次に、洗浄バッファー３００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄し、希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体１００μＬ／ｗｅｌｌを添加し、３７℃、１時間反応させた。バッファー３００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄し、ＡＢＴＳ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、暗所にて室温、３０分間反応後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｉｔｉｏｎを１００μＬ／ｗｅｌｌ添加して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
コーティングバッファー；０．０５Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）
洗浄バッファー；０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）
ブロッキングバッファー；１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ
希釈バッファー；１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−Ｔ

（ＩｇＡ抗体価の測定）
鼻腔及び肺洗浄液を検体とする。コーティングバッファーにより０．１μｇ／ｍＬに希釈したウイルス抗原を１００μＬ／ｗｅｌｌにてｗｅｌｌに添加し、４℃、一夜静置した。固相化したプレートを洗浄バッファー３００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄し、ブロッキングバッファーを３００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、１５分反応した。その後、洗浄バッファー３００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄し、希釈バッファーにて２倍希釈し、検体を各１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、１時間反応させた。
次に、洗浄バッファー３００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄し、希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＡ抗体１００μＬ／ｗｅｌｌを添加し、３７℃、１時間反応させた。バッファー３００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄し、ＡＢＴＳ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、暗所にて室温、３０分間反応後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｉｔｉｏｎを１００μＬ／ｗｅｌｌ添加して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
コーティングバッファー；０．０５Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）
洗浄バッファー；０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）
ブロッキングバッファー；１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ
希釈バッファー；１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−Ｔ

ＩｇＧ抗体価については、マイクロニードル投与群と皮内投与群との比較を図２に示す。また、ＩｇＡ抗体価については、抗原投与を行わない群をコントロール群とし、それとマイクロニードル投与群との比較を図３（鼻腔）、図４（肺）にそれぞれ示す。

（実験例４）
以下の通り調整したＡ型（Ｈ１Ｎ１）株を有効成分とする抗原を含むインフルエンザＨＡワクチンをＢＩＯＭＡＸ−１０Ｋ（ミリポア社製）を用い、遠心分離により濃縮し、高分子ポリマー（プルラン）と混合の後、相対湿度９０〜１００％ＲＨの条件下で、前記混合液をポリ乳酸製マイクロニードル（高さ約３００μｍ、密度８４１本／ｃｍ^２、四角錐形状）に、含量０．３μｇ／ｐａｔｃｈもしくは３μｇ／ｐａｔｃｈでコーティングした。
４週齢のｄｄＹマウス（メス）に麻酔下で腹部剃毛後、コーティングマイクロニードルを皮膚に２時間穿刺投与した。対照に同用量（０．３もしくは３μｇＨＡ／ｈｅａｄ）で皮下投与及び皮内投与した。３週間後に同条件でブーストし、その２週間後に採血し、ＨＩ抗体価を測定した。

図７は、ＨＩ抗体価の測定結果の一例を示すグラフである。マイクロニードル（ＭＮ）を用いることで０．３及び３μｇＨＡ／ｈｅａｄ群共に皮下投与（ＳＣ）と同等もしくはそれ以上の抗体価を示すことがわかった。３μｇＨＡ／ｈｅａｄ群においては、皮内投与（ＩＣ）と同程度の抗体価を示した。皮下投与の３μｇＨＡ／ｈｅａｄではすべて防御反応を示すのに十分な抗体価を示す。一方、０．３μｇＨＡ／ｈｅａｄでは１例、低めのＨＩ抗体価（２０）のものが観察された。

本発明は、以下のものを含む。
（１）基板に二次元状に配置された皮膚を穿孔可能なポリ乳酸からなる複数のマイクロニードルを備え、該マイクロニードルに、Ａ型株およびＢ型株よりなるインフルエンザウイルス抗原がコーティングされたマイクロニードルデバイス。
（２）前記マイクロニードルが円錐型または角錐型である、上記（１）に記載のマイクロニードルデバイス。
（３）前記コーティングが、コーティング担体としてプルランを含む、上記（１）または（２）に記載のマイクロニードルデバイス。
（４）前記コーティングが、室温での相対湿度７０．０〜１００％ＲＨにて行われる、上記（１）から（３）のいずれかに記載のマイクロニードルデバイス。
（５）前記コーティングが、アジュバント活性を有する物質を含む、上記（１）から（４）のいずれかに記載のマイクロニードルデバイス。
（６）前記アジュバント活性を有する物質が、ラウリルアルコールである、上記（５）に記載のマイクロニードルデバイス。
（７）前記マイクロニードルデバイスの基板が、インフルエンザウイルス抗原液またはインフルエンザウイルス抗原溶解液を伝達可能な複数の開口部を有するものである、上記（１）から（６）のいずれかに記載のマイクロニードルデバイス。
（８）前記マイクロニードルの高さ２００〜５００μｍである、上記（１）から（７）のいずれかに記載のマイクロニードルデバイス。
（９）前記マイクロニードルが４００〜１０００本／ｃｍ^２の密度で配置される、上記（１）から（８）のいずれかに記載のマイクロニードルデバイス。

（１０）基板に二次元状に配置された皮膚を穿孔可能なポリ乳酸からなる複数のマイクロニードルに、Ａ型株およびＢ型株よりなるインフルエンザウイルス抗原をコーティングしてなるマイクロニードルデバイスによるインフルエンザワクチンの奏功性を上昇させる方法。
（１１）前記マイクロニードルデバイスの投与時間が４分〜１８０分の間である上記（１０）に記載のマイクロニードルデバイスによるインフルエンザワクチンの奏功性を上昇させる方法。
（１２）前記マイクロニードルが円錐型または角錐型である、上記（１０）または（１１）に記載のマイクロニードルデバイスによるインフルエンザワクチンの奏功性を上昇させる方法。
（１３）前記コーティングが、コーティング担体としてプルランを含む、上記（１０）から（１２）のいずれかに記載のマイクロニードルデバイスによるインフルエンザワクチンの奏功性を上昇させる方法。
（１４）前記コーティングが、室温での相対湿度７０．０〜１００％ＲＨにて行われる、上記（１０）から（１３）のいずれかに記載のマイクロニードルデバイスによるインフルエンザワクチンの奏功性を上昇させる方法。
（１５）前記コーティングが、アジュバント活性を有する物質を含む、上記（１０）から（１４）のいずれかに記載のマイクロニードルデバイスによるインフルエンザワクチンの奏功性を上昇させる方法。
（１６）前記アジュバント活性を有する物質が、ラウリルアルコールである、上記（１５）に記載のマイクロニードルデバイスによるインフルエンザワクチンの奏功性を上昇させる方法。
（１７）前記マイクロニードルデバイスの基板が、インフルエンザウイルス抗原液またはインフルエンザウイルス抗原溶解液を伝達可能な複数の開口部を有するものである、上記（１０）から（１６）のいずれかに記載のマイクロニードルデバイスによるインフルエンザワクチンの奏功性を上昇させる方法。
（１８）前記マイクロニードルの高さ２００〜５００μｍである、上記（１０）から（１７）のいずれかに記載のマイクロニードルデバイスによるインフルエンザワクチンの奏功性を上昇させる方法。
（１９）前記マイクロニードルが４００〜１０００本／ｃｍ^２の密度で配置される、上記（１０）から（１８）のいずれかに記載のマイクロニードルデバイスによるインフルエンザワクチンの奏功性を上昇させる方法。

本発明は、マイクロニードルデバイスを用いることにより、効率的で、しかも簡便な操作でＡ型（Ｈ１Ｎ１）株、Ａ型（Ｈ３Ｎ２）株及びＢ型株を有効成分とする抗原からなるインフルエンザワクチンの３価全ての亜型の抗原性を上昇させることを可能とするものであり、産業上の利用可能性がある。

１ コーティング
５ マイクロニードルデバイス
６ マイクロニードル
７ 開口部
８ マイクロニードル基板

Claims (19)

1. 基板に二次元状に配置された皮膚を穿孔可能なポリ乳酸からなる複数のマイクロニードルを備え、該マイクロニードルに、Ａ型株およびＢ型株よりなるインフルエンザウイルス抗原がコーティングされたマイクロニードルデバイス。
2. 前記マイクロニードルが円錐型または角錐型である、請求項１に記載のマイクロニードルデバイス。
3. 前記コーティングが、コーティング担体としてプルランを含む、請求項１または２に記載のマイクロニードルデバイス。
4. 前記コーティングが、室温での相対湿度７０．０〜１００％ＲＨにて行われる、請求項１から３のいずれかに記載のマイクロニードルデバイス。
5. 前記コーティングが、アジュバント活性を有する物質を含む、請求項１から４のいずれかに記載のマイクロニードルデバイス。
6. 前記アジュバント活性を有する物質が、ラウリルアルコールである、請求項５に記載のマイクロニードルデバイス。
7. 前記マイクロニードルデバイスの基板が、インフルエンザウイルス抗原液またはインフルエンザウイルス抗原溶解液を伝達可能な複数の開口部を有するものである、請求項１から６のいずれかに記載のマイクロニードルデバイス。
8. 前記マイクロニードルの高さ２００〜５００μｍである、請求項１から７のいずれかに記載のマイクロニードルデバイス。
9. 前記マイクロニードルが４００〜１０００本／ｃｍ^２の密度で配置される、請求項１から８のいずれかに記載のマイクロニードルデバイス。
10. 基板に二次元状に配置された皮膚を穿孔可能なポリ乳酸からなる複数のマイクロニードルに、Ａ型株およびＢ型株よりなるインフルエンザウイルス抗原をコーティングしてなるマイクロニードルデバイスによるインフルエンザワクチンの奏功性を上昇させる方法。
11. 前記マイクロニードルデバイスの投与時間が４分〜１８０分の間である請求項１０に記載のマイクロニードルデバイスによるインフルエンザワクチンの奏功性を上昇させる方法。
12. 前記マイクロニードルが円錐型または角錐型である、請求項１０または１１に記載のマイクロニードルデバイスによるインフルエンザワクチンの奏功性を上昇させる方法。
13. 前記コーティングが、コーティング担体としてプルランを含む、請求項１０から１２のいずれかに記載のマイクロニードルデバイスによるインフルエンザワクチンの奏功性を上昇させる方法。
14. 前記コーティングが、室温での相対湿度７０．０〜１００％ＲＨにて行われる、請求項１０から１３のいずれかに記載のマイクロニードルデバイスによるインフルエンザワクチンの奏功性を上昇させる方法。
15. 前記コーティングが、アジュバント活性を有する物質を含む、請求項１０から１４のいずれかに記載のマイクロニードルデバイスによるインフルエンザワクチンの奏功性を上昇させる方法。
16. 前記アジュバント活性を有する物質が、ラウリルアルコールである、請求項１５に記載のマイクロニードルデバイスによるインフルエンザワクチンの奏功性を上昇させる方法。
17. 前記マイクロニードルデバイスの基板が、インフルエンザウイルス抗原液またはインフルエンザウイルス抗原溶解液を伝達可能な複数の開口部を有するものである、請求項１０から１６のいずれかに記載のマイクロニードルデバイスによるインフルエンザワクチンの奏功性を上昇させる方法。
18. 前記マイクロニードルの高さ２００〜５００μｍである、請求項１０から１７のいずれかに記載のマイクロニードルデバイスによるインフルエンザワクチンの奏功性を上昇させる方法。
19. 前記マイクロニードルが４００〜１０００本／ｃｍ^２の密度で配置される、請求項１０から１８のいずれかに記載のマイクロニードルデバイスによるインフルエンザワクチンの奏功性を上昇させる方法。

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