KR102374576B1 - 열안정성 백신 조성물 및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 열안정성 백신에 관한 조성물 및 이를 제조하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 재조합체 리신 신경독소 단백질을 기초로 한 열안정성 백신을 제조하는 방법, 및 대상체에서 면역 반응을 유발할 수 있는 조성물을 제공하기 위한 공동-보조제의 사용을 제공한다.

Description

열안정성 백신 조성물 및 그의 제조방법{THERMOSTABLE VACCINE COMPOSITIONS AND METHODS OF PREPARING SAME}

정부 지원 선언

본 발명은 국립보건원(National Institutes of Health)로부터의 인가 UO1-A1-08-2201 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 확실한 권리를 갖는다.

본 발명은 일반적으로 건조된 백신 조성물의 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 보조제에 결합되고, 면역자극성 분자를 함유하는 건조된 백신 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

재조합 단백질을 함유하는 백신은 면역 반응을 유발하는 보조제 (adjuvant)로부터 이득을 얻거나, 이것을 절대적으로 필요로 한다 (Callahan et al., 1991, The importance of surface charge in the optimization of antigen-adjuvant interactions, Pharm. Res. 8(7):851-858; Singh and O'Hagan 1999, Advances in vaccine adjuvants, Nat Biotechnol 17(11): 1075-81; 및 O'Hagan et al., 2001, Recent developments in adjuvants for vaccines against infectious diseases, Biomol Eng 18(3): 69-85). 소아 및 성인에게 투여된 백신에서의 안전한 사용의 광범한 역사가 있기 때문에 알루미늄-염 보조제는 현재 인간에게서의 일반적인 사용을 위해서 가장 광범하게 사용되는 보조제이다. FDA-승인된 백신에서 현재 존재하는 유일한 보조제는 알루미늄 염 보조제, 알루미늄 하이드록사이드 및 알루미늄 포스페이트이다. 알루미늄-염 보조제는 백신의 면역원성을 증진시키며, 백신 내의 단백질의 용량 수준을 감소시키고, 보호성 항체의 역가를 상승시키고, 백신 접종의 일차 시리즈가 완료된 후에 연간 백신접종을 할 필요성을 감소시킴으로써 백신접종의 결과에서 상당한 개선을 야기한다. 그럼에도 불구하고 재조합 단백질, 펩타이드 및 화학적으로 합성된 백신을 기본으로 하는 다수의 서브유니트 백신에서 알루미늄-염 보조제의 사용은 상당한 제한이 있다. 알루미늄 보조제를 함유하는 백신은 단지 좁은 온도 범위 내에서만 저장될 수 있고 냉동시킬 수 없기 때문에, 이들 제한에는 백신 저장 및 안정성의 일반적 관점이 포함된다. 추가의 제한에는 알루미늄 보조제가 비교적 약하며, 세포 면역성의 발생을 촉진시키지 않고, 중화 항체가 바이러스 감염을 차단하거나 생물학적 독소의 활성을 지연시키기 위해서 필요한 경우에 비-중화성인 항체의 발생을 지지할 수 있다는 일반적으로 수용되는 견해가 포함된다.

알루미늄 보조제의 경우에는, 적절한 면역원성을 제공하기 위해서 항원은 반드시 보조제의 표면 상에 흡착되어야 하는 것으로 제시되었다 (Gupta et al., 1995, Adjuvant Properties of Aluminum and Calcium Compounds. Pharmaceutical Biotechnology. 6: 229-248; 및 White and Hem, 2000, Characterization of aluminium-containing adjuvants, Dev Biol (Basel) 103: 217-28). 이 흡착은 전형적으로 항원과 보조제 사이의 정전기적 상호작용을 통해서 용이하게 되며, 제제 pH는 통상적으로 항원과 보조제가 반대로 하전되도록 선택된다 (Callahan et al. 1991). 보조제 상의 표면 전하는 또한, 포스페이트, 석시네이트 및 시트레이트와 같은 완충제 염과의 표면 교환반응에 의해서 변형될 수 있다 (Hem and White, 1984, Characterization of aluminum hydroxide for use as an adjuvant in parenteral vaccines. J Parenter Sci Technol, 38(1): p. 2-10; Chang et al., 1997, Role of the electrostatic attractive force in the adsorption of proteins by aluminum hydroxide adjuvant. PDA J Pharm Sci Technol, 51(1): p. 25-9; 및 Rinella et al., 1996, Treatment of aluminium hydroxide adjuvant to optimize the adsorption of basic proteins. Vaccine, 14(4): p. 298-300). 알루미늄-염 보조제의 작용 기전은 잘 이해되지 않았지만, 몇 가지의 상이한 기전에 기인하는 것 같다 (Lindblad 2004. "Aluminium compounds for use in vaccines" Immunol. Cell. Biol. 82(5):497-505; Gupta and Siber, 1995, Adjuvants for Human Vaccines--Current Status, Problems and Future-Prospects. Vaccine 13(14):1263-1276; Gupta and Rost, 2000, Aluminum Compounds as Vaccine Adjuvants, In O'Hagan D, editor Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols, ed., Totowa, N.J.: Humana Press Inc. p 65-89; Cox and Coulter, 1997, Adjuvants--a classification and review of their modes of action, Vaccine 15(3):248-256). 통상적으로 제안된 기전은 보조제가 주사 부위에서 데포 (depot)로 작용하여, 여기에서 항원이 투여 후에 서서히 방출된다 (Cox and Coulter, 1997). 또 다른 제안된 기전은 보조제가 항원의 항원-제시 세포로의 송달에 도움을 준다는 것이다 (Lindblad 2004). 추가로 제안된 기전은 보조제가 면역자극제로 작용하여 Th2 사이토카인을 유도해 낸다는 것이다 (Grun and Maurer 1989, Different T helper cell subsets elicited in mice utilizing two different adjuvant vehicles: the role of endogenous interleukin 1 in proliferative responses. Cell Immunol 121(1):134-145). 또 다른 제안된 기전은 보조제가 보조제의 표면 상에서 단백질 항원을 불안정화시켜 이들을 단백분해적 분해에 더 민감하게 만든다는 것이다 (Jones et al., 2005, Effects of adsorption to aluminum salt adjuvants on the structure and stability of model protein antigens. J Biol Chem 280(14):13406-13414; 및 That et al., 2004. "Antigen stability controls antigen presentation" J. Biol. Chem. 279(48):50257-50266).

비록 작용의 기전이 완전히 이해되지는 않았지만, 보조제의 표면적, 표면 전하 및 형태학이 이들 보조제 상에 흡착된 항원의 면역반응을 지시하는 중요한 인자인 것으로 보인다 (Hem and White 1984). 일반적으로, 백신 보조제의 입자 크기가 작으면 작을수록 백신 제제의 면역원성은 더 큰 것으로 이론이 성립되며, 특히 입자 크기가 약 1 미크론인 경우에 크기가 전문적인 항원-제시 세포 내로 흡수시키는데 가장 적합하다 (Maa et al., 2003. Stabilization of alum-adjuvanted vaccine dry powder formulations: mechanism and application. J Pharm Sci 92(2):319-332, Diminsky et al., 1999. Physical, chemical and immunological stability of CHO-derived hepatitis B surface antigen (HBsAg) particles. Vaccine 18(1-2):3-17).

동결건조 (냉동 건조)는 다양한 단백질 제제의 장기간 안정성을 개선하기 위해서 빈번하게 이용되는 방법이다. 그러나, 알루미늄-염 보조제와 함께 제제화된 백신을 냉동 및 동결건조를 통해서 안정성을 개선시키는 시도로 처리하는 경우에는, 효력의 상실이 일어나며, 여기에서 효력은 동물에서의 면역원성, 단백질 항원의 화학적 분해, 단백질 항원의 변성, 또는 치환체 면역원성 에피토프의 상실을 포함할 수 있는 일련의 시험에 의해서 측정될 수 있는 백신의 품질의 요약이다. 효력의 상실은 인간에게서의 효능의 상실과 연관된다. 선행하는 연구는 보조제를 함유하는 냉동-건조된 백신 생성물이 보조제 입자의 응집에 기인하여 생산될 수 없다고 시사하였다 (Diminsky et al., 1999; Maa et al., 2003). 다수의 이론이 알루미늄-염 보조제로 제제화된 백신의 동결건조 후의 효력 상실에 책임이 있는 가능한 기전을 설명하기 위해서 제시되었다. 입자 응집이 상당한 상실의 이유가 될 수 있다. 예를 들어, 냉동 및 해동시킨 후의 알루미늄 하이드록시카보네이트 및 마그네슘 하이드록사이드 겔의 응집은 입자들이 함께하도록 강요하여 얼음 결정 형성에 기여함으로써 비가역적인 응집을 야기하였다 (Zapata et al., 1984, Mechanism of freeze-thaw instability of aluminum hydroxycarbonate and magnesium hydroxide gels. J Pharm Sci 73(1):3-8). 이 설명은 마 등 (Maa et al., 2003)에 의해서 제안되었으며, 이것은 추가로 더 빠른 냉각 속도가 더 큰 비율의 얼음 핵형성, 및 알루미늄 입자가 응집하도록 강요하지 않을 수 있는 더 작은 얼음 결정의 형성을 야기한다고 시사하였다. 따라서, 단백질 배열 (삼차 구조)의 상실, 단백질 이차 구조의 상실, 및 아미노산 측쇄의 탈아미드화 또는 산화를 통한 일차 구조의 변형과 같은 다른 인자들을 제외한 입자 응집은 효력 상실의 이유가 될 수 있다.

알레르기 민감화를 증가시키는 입자의 능력은 입자 질량에 의해서가 아니라, 입자 수 및 표면적에 의해서 예측된다. 무어필드 (Moorefield) 등은 보조제 입자의 항원 내재화 정도가 보조제 응집체의 입자 크기에 역으로 관련됨을 보여주었다 (Moorefield et al., 2005. "Role of aluminum-containing adjuvants in antigen internalization by dendritic cells in vitro" Vaccine 23(13):1588-1595). 나이가드 (Nygaard) 등은 입자 직경, 및 이에 따른 입자의 표면적 및 개수는 마우스에서 폴리스티렌 입자의 면역학적 반응에서 지배적인 특성이지만, 질량 또는 용적은 그렇지 않음을 보여주었다 (Nygaard et al., 2004). 입자 크기는 면역원성에 대한 중요한 특징적 매개변수인 것으로 보이는 반면에, 제제화의 함수로서 입자 크기 분포 (PDS) 및 생산된 생성물의 다른 물리적 특성과 함께 냉각 속도를 검사하는 포괄적인 연구는 아직 이루어지지 않았다.

알루미늄 보조제를 사용한 더욱 효과적인 백신은 항원이 용액 중에 유리된 것이 아니라 알루미늄 표면에 결합되어 있는 것이라는 일부의 공통적인 견해가 있다 (Lindblad, 2004, Aluminium adjuvants--in retrospect and prospect, Vaccine, 22:3658-68). 제제 및 안정성의 재현성의 경우에는, 결정 표면에 대한 항원의 최적 결합을 위한 조건, 및 항원이 시간의 경과에 따라, 또는 상승된 스트레스 조건 하에서 탈착하지 않는 조건을 규정하는 것이 바람직하다. 알루미늄 백신을 구성하기 위해서는, 결합 및 탈착을 최적화시키기 위한 연구를 수행하는 것이 필요하다. 알루미늄 보조제는 특정의 용액 pH에서 제로 전하점 (point of zero charge; PZC)을 갖지만, 이 값 이상 또는 이하의 pH에서는 하전된다 (White and Hem, 2000, Characterization of aluminium-containing adjuvants, Dev Biol (Basel), 103:217-28). 최적의 제제화 pH를 선택하는 것은, 바람직한 면역반응을 수득하는데 알루미늄-염 보조제에 대한 결합이 일반적으로 요구되는 재조합 단백질 백신의 경우 더 복잡하다 (McInerney, Brennan et al., 1999, Analysis of the ability of five adjuvants to enhance immune responses to a chimeric plant virus displaying an HIV-1 peptide, Vaccine, 17:1359-68). 보조제에 대한 단백질 결합을 촉진시키기 위해서는, 단백질 및 보조제가 반대 전하를 갖는 용액 pH가 선택된다. 그러나, 최적 단백질 안정성을 제공하는 용액 pH는 보조제에 대한 백신의 적절한 결합을 허용하지 않을 수 있다. 이러한 시나리오에서, 백신 단백질은 안정성에 대해서 최적하 (suboptimal)인 pH에서 제조되고, 장기간 저장 중에 분해를 최소화시키기 위해서 적절한 안정화 부형제를 사용하여 동결건조시킬 수 있다.

저장 및 재구성 중에 구조 및 활성을 안정화시키기 위한 단백질의 동결건조는 재조합체 단백질 치료학적 단백질에 통상적으로 적용되었다. 이것은 통상적으로, 트레할로즈와 같은 디사카라이드, 및 처리 및 저장 중에 유리 상태를 촉진시키는 다른 부형제의 존재 하에서 냉동 건조시킴으로써 성취되었다. 단백질은 생성물이 그 온도 이상에서는 고무상 상태로의 물질 이행이 일어나는 그의 유리 전이 온도 (T_g) 이하에서 저장되는 한은 장기간 동안 저장될 수 있다. 부형제는 건조 중에 물을 치환시키는 특정 부위와 안정화제의 상호작용을 통해서, 및 단백질 분자 (α-이완) 또는 분자의 일부분 (β-이완)의 해독 및 회전 운동을 동시에 억제함으로써 무정형 상태에서 단백질을 안정화시키는 것으로 생각된다. 건조 기술은, 특히 알루미늄 포스페이트 또는 알루미늄 하이드록사이드 보조제에 흡착된 백신의 경우에, 백신의 장기간 적용에는 덜 빈번하게 적용되어 왔다. 건조된 백신을 생성시키기 위한 대부분의 시도는 온도에서의 중등도의 탈선을 견뎌낼 수 있는 흡입용 분말 또는 제제를 수득하였기 때문에, 상승된 온도 조건 하에서 건조된 백신의 저장에 이용할 수 있는 데이터는 거의 없다. 예를 들어, 황열 백신은 주로 열대성 기후에서 사용되기 때문에, 안정화제 (락토즈, 소르비톨)의 존재 하에서의 동결건조가 생 바이러스 백신의 생존도를 보존하기 위해서 사용되었다 (Monath, 1996, Stability of yellow fever vaccine, Dev Biol Stand, 87:219-25). 동결건조 및 저장 중에 부형제가 없이는, 활성이 -20℃ 이상에서 빠르게 상실되지만, 안정화된 백신은 37℃에서 2 주일 이상을 견딜 수 있다. 소 질환인 우역 (rinderpest)에 대한 동결건조된 건조된 백신이 또한 개발되었으며, 아프리카 필드 조건에서 콜드 체인 (cold chain)을 떠난 후에 한 달까지 동안 사용될 수 있다 (House and Mariner, 1996, Stabilization of rinderpest vaccine by modification of the lyophilization process, Dev Biol Stand, 87:235-44). 과정 및 건조에 대한 변형을 사용하기 위한 유사한 시도는 최근에, 홍역 백신 개발 (Burger, Cape et al., 2008, Stabilizing formulations for inhalable powders of live-attenuated measles virus vaccine, J Aerosol Med Pulm Drug Deliv, 21:25-34; Burger, Cape et al., 2008, Stabilizing Formulations for Inhalable Powders of Live-Attenuated Measles Virus Vaccine, J Aerosol Med)에, 및 면역원의 구조의 유지를 허용하는 조건을 고안하는데 매우 중요할 것 같은 인플루엔자에 대한 건조된 백신 분말 (Amorij, Meulenaar et al., 2007, Rational design of an influenza subunit vaccine powder with sugar glass technology: preventing conformational changes of haemagglutinin during freezing and freeze-drying, Vaccine, 25:6447-57; Amorij, Huckriede et al., 2008, Development of Stable Influenza Vaccine Powder Formulations: Challenges and Possibilities, Pharm Res)을 위해서 적용되었다. 안정화제로서, 소량의 포름알데히드가 가끔, 현재의 AVA 탄저병 백신 (Biothrax®)을 포함한 백신에 첨가되며, 알루미늄 결정의 표면 상에서 더 많은 면역원성 단백질 응집체를 형성시키는 단백질을 교차-결합시킴으로써 작용할 수 있다 (Little, Ivins et al., 2007, Effect of aluminum hydroxide adjuvant and formaldehyde in the formulation of rPA anthrax vaccine, Vaccine, 25:2771-7). 포름알데히드는 파상풍 톡소이드, 보툴리누스 톡소이드 등과 같은 배양 상등액으로부터 유래된 오래된 백신에서 선택한 안정화제로서 역사적으로 사용되어 왔다. 현재의 AVA 백신은 3년 안정성을 위해서 라벨링되며, 여기에서 안정성은 다수의 생화학적 평가 및 효력의 함수이다. 비록 중등도 양의 안정성이 액체 현탁액 백신에 의해서 달성될 수 있지만, 모든 안정성 매개변수가 비축 및 분배될 백신에 필요한 더 긴 저장기간에 부합할 수 있는 것 같지는 않다.

구조 및 기능을 유지하면서 치료학적 단백질을 성공적으로 건조시키는 것은 안정화에 적절한 건조 및 부형제에 의해서 지연되거나 배제될 수 있는, 용액에서 발생하는 분해 경로에 대한 지식에 따라 좌우된다. 백신의 경우에, 기능은 대부분 효소적 활성이 아니라 면역원성 및 보호 연구에 의해서 결정된다. 알루미늄 보조제 결정에 흡착되는 단백질 면역원의 경우에는, 단백질이 격리될 수 있고, 분석을 위해서 제거하기 어려울 수 있기 때문에, 시험관내에서의 기능 및 그 밖의 다른 매개변수의 측정은 상응하게 더 어렵다. 따라서, 기능은 단지 면역원성 및 보호 연구에 의해서만 시험될 수 있다. 단백질의 삼차 입체형태는 존재하는 경우에, 효소 기능에 명백하게 영향을 미칠 수 있지만, 또한 입체형태에 의존적인 B 세포 에피토프의 면역원성에도 영향을 미칠 수 있다. 여기에 함유된 선형 B 및 T 세포 에피토프는 또한, 산화 (메티오닌 및 시스테인 잔기의) 및 탈아미드화 (특히 아스파라긴 잔기의)에 의해서 영향을 받을 수 있다. pH는 치료학적 단백질의 안정성을 지배하는 가장 중요한 제제 변수 중의 하나이다 (Carpenter, Chang et al., 2002, Rational design of stable lyophilized protein formulations: theory and practice, Pharm Biotechnol, 13:109-33; Chi, Krishnan et al., 2003, Physical stability of proteins in aqueous solution: mechanism and driving forces in nonnative protein aggregation, Pharm Res, 20:1325-36). 용액 내의 단백질의 입체형태 및 콜로이드 안정성에 영향을 미침으로써, pH는 그들의 응집률을 크게 변조시킬 수 있다 (Chi, Krishnan et al., 2003, Physical stability of proteins in aqueous solution: mechanism and driving forces in nonnative protein aggregation, Pharm Res, 20:1325-36). 또한, 탈아미드화의 속도는 pH에 크게 의존한다 (Manning, Patel et al., 1989, Stability of protein pharmaceuticals, Pharm Res, 6:903-18). 소정의 단백질에 대한 물리적 및 화학적 안정성을 위해서는 상이한 최적 pH 값이 있을 수 있다 (Kolvenbach, Narhi et al., 1997, Granulocyte-colony stimulating factor maintains a thermally stable, compact, partially folded structure at pH2, J Pept Res, 50:310-8). 예를 들어, 물리적 안정성은 탈아미드화가 허용할 수 없게 빠른 pH에서 최적일 수 있다 (Chang, Reeder et al., 1996, Development of a stable freeze-dried formulation of recombinant human interleukin-1 receptor antagonist, Pharm Res, 13:243-9). 이러한 경우에, 이들 반응의 속도가 최소화된 동결건조된 제제의 개발은 안정한 생성물을 수득하는 실행가능한 전략을 제공할 수 있다. 건조된 제제에서 동결건조 및 저장 중에 치료학적 단백질의 안정성에 대한 전-동결건조 용액 pH의 영향을 검사한 몇 가지의 공개된 연구는 이 매개변수의 중요성을 입증하였다 (Prestrelski, Pikal et al., 1995, Optimization of lyophilization conditions for recombinant human interleukin-2 by dried-state conformational analysis using Fourier-transform infrared spectroscopy, Pharm Res, 12:1250-9; Chang, Reeder et al., 1996, Development of a stable freeze-dried formulation of recombinant human interleukin-1 receptor antagonist, Pharm Res, 13:243-9; Katayama, Kirchhoff et al., 2004, Retrospective statistical analysis of lyophilized protein formulations of progenipoietin using PLS: determination of the critical parameters for long-term storage stability, J Pharm Sci, 93:2609-23). 이들 연구는 동결건조 및 저장 중에 연구된 단백질에 대해서 적합한 물리적 및 화학적 안정성을 부여하는 전-동결건조 용액 pH를 확인하는데 있어서의 곤란성을 입증하였다. 그러나, 단백질의 분해는 충분한 양의 안정화 부형제가 제제에 포함된다면 최소화될 수 있었다. 예를 들어, 재조합 인간 인터류킨-1-수용체 길항제 (rhIL-1ra)가 0.3 질량비 (mass ratio) 미만의 수크로즈/단백질의 수준 및 6.5 미만의 pH에서 최적하 수크로즈를 함유하는 용액 중에서 동결건조 전에 제제화되었다면, 동결건조 후, 저장 및 재구성 중에 심각한 단백질 응집이 일어났다 (Chang, Reeder et al., 1996, Development of a stable freeze-dried formulation of recombinant human interleukin-1 receptor antagonist, Pharm Res, 13:243-9). 단백질 응집은 6 이상의 pH에서 용액으로부터 동결건조시킨 후에 최소화되었지만, 탈아미드화는 허용할 수 없게 높은 속도로 일어났다. pH 6.5에서 0.3 수크로즈/단백질 질량비 이상의 수크로즈의 양을 함유하는 용액으로부터의 동결건조 후에, 탈안정화 경로는 둘 다 억제될 수 있었다. 또 다른 예로서, 인터류킨-2 (IL-2)는 pH 7에서 냉동-건조 중에 상당히 더 큰 구조적 동요를 가지며, 이것은 저장 및 재수화 후에 pH 5에서 용액으로부터 동결건조된 샘플보다 더 큰 수준의 응집을 야기하였다 (Prestrelski, Pikal et al., 1995, Optimization of lyophilization conditions for recombinant human interleukin-2 by dried-state conformational analysis using Fourier-transform infrared spectroscopy, Pharm Res, 12:1250-9). pH 7에서 전-동결건조 용액 제제에 대한 수크로즈의 첨가는 동결건조 후의 저장 중에 IL-2의 안정성을 개선시켰다. 더욱 최근에, 전-제제화에 대한 이러한 접근방법은 탄저병 rPA를 사용하여 수행되어 비내 투여를 위한 건조된 분말 백신 후보물질을 생성시켰다 (Jiang, Joshi et al., 2006, Anthrax vaccine powder formulations for nasal mucosal delivery, J Pharm Sci, 95:80-96). 이 경우에, pH 및 부형제 안정화제를 최적화시키는 조건은 동결건조 전의 용액에서 rPA에 대해 설정되었다. 트레할로즈는 열 스트레스에 대해 가용성 rPA를 안정화시키는 것으로 결정된 부형제 중의 하나이기 때문에, rPA가 빠르게 소실된 액체 샘플과 비교하여 rPA의 총 함량의 관점에서 건조된 트레할로즈-함유 백신에 대한 40℃에서의 적어도 30일 안정성의 증거가 있었다. 가스-구동된 주사 장치를 사용한 표피 송달을 위한 건조된 분말 조성물을 수득하기 위한 노력으로, 만니톨, 글리신 및 덱스트란의 혼합물의 존재 (총 부형제의 ~6% w/v 이하) 하에서 알루미늄-흡착된 간염 B 백신 (HBsAg)의 빠른 냉동은 건조 전에 스프레이된 백신의 액체 질소 내로의 주입을 수반하는 빠른 냉동 (스프레이 냉동 건조) 후에 마우스에서 상대적 면역원성 및 입자 크기를 유지하는 백신을 제공하였다 (Maa, Zhao et al., 2003, Stabilization of alum-adjuvanted vaccine dry powder formulations: mechanism and application, J Pharm Sci, 92:319-32). 열 스트레스 조건 하에서의 스프레이-냉동된 건조 백신의 거동은 결정되지 않았지만, 통상적으로 동결건조된 백신은 처리 후에 응집하였으며, 최소한도로 면역원성이었다. 감소된 면역원성은 재구성 후의 알루미늄 입자 응집과 연관되었다.

더욱 최근에, 로저 (Roser) 등은 알루미늄 입자의 응집을 방지할 수 있는 조 방법을 제한하였다. 로저 등은 미국 특허 제6,890,512호에서 알루미늄 하이드록사이드의 미립자 현탁액에 트레할로즈를 15% (w/v) 과량으로 첨가함으로써 현탁액 중의 미립자의 탈수 및 재수화 중에 총체적인 응집을 방지하는 방법을 기술하였다. 트레할로즈, 즉 알파-D-글루코피라노실-알파-D-글루코피라노사이드는 식물 세포를 건조로부터 보호하는데 책임이 있는 천연적으로 존재하는 디사카라이드이다. 트레할로즈는 단백질 구조를 고정화시키는 당 유리 (sugar glass)를 형성시킴으로써 건조 중에 단백질의 변성을 방지하는 것으로 나타났다. 그러나, 로저 등은 총체적인 입자 응집의 방지를 기술하면서, 미립자 현탁액의 냉동 속도 또는 트레할로즈의 존재 하의 알루미늄-염 함유 백신에서 전-동결건조 입자 크기 및 단백질 구조를 조절 및 유지시키는데 중요한 다른 인자의 중요성은 기술하지 않았다. 입자 크기의 유지는 알루미늄 입자의 표면에 대한 단백질 면역원의 흡착도를 조절하는데 중요한 매개변수이며, 트레할로즈 또는 다른 유리화 부형제의 함량 이외에도 동결건조 사이클 중의 몇 개의 인자에 의해서 영향을 받는다. 이들 인자는 면역원성 및 보호성 면역반응의 생성에 영향을 미친다.

알루미늄-염 보조제는 단백질 또는 펩타이드 서브유니트 백신의 면역원성을 증강시키는 잘 탐구된 수단을 제공한다. 그러나, 백신을 향상시키는 다양한 탐구용 제제가 알루미늄-염 보조제에 대한 더욱 강력한 대용으로 개발되었지만, FDA-승인된 인간 백신에서 현재 이용가능하지 않다. 면역반응을 향상시키기 위해서 디자인된 제제에는 유중수 에멀션, 수중유 에멀션, 자체-조립성 마크로구조 (self-assembling macrostructures), 사이토카인, 사포닌, 톨-유사 수용체 아고니스트 (TLR-4, TLR-5, 및 TLR-9), 면역자극성 이중 스트랜드화 RNA 종, 비메틸화된 DNA 올리고뉴클레오타이드, 및 폴리머 마이크로입자 및 나노구조를 기본으로 하는 다양한 조성물이 포함된다. 이들 조성물의 대부분은 주사된 백신의 면역원성을 개선시키는 쪽으로 지시되며, 일부의 변이는 비내 또는 경구 백신접종을 위한 송달의 경로를 변화시키도록 적용될 수 있다. 백신 면역원성을 증진시키기 위해서 사용될 수 있는 면역자극성 분자의 한가지 부류의 예로는, 림프구를 활성화시키는 직접적인 면역자극성 효과로 인하여 척추동물 DNA가 아닌 세균 DNA가 사용될 수 있다. 이것은 비메틸화된 CpG 디뉴클레오타이드가 세균 DNA 내에는 예상된 빈도로 존재하지만, 척추동물 DNA 내에서는 더 적게 나타나고 메틸화되기 때문이다 (Krieg et al., 1995). 활성화는 또한, 특별한 서열 환경에서 비메틸화된 CpG 디뉴클레오타이드를 함유하는 합성 올리고데옥시뉴클레오타이드 (ODN)를 첨가함으로써 유발될 수도 있다. CpG DNA는 거의 모든 (>95%) B 세포의 증식을 유도하며, 면역글로불린 (Ig) 분비를 증가시킨다. CpG DNA에 의한 이 B 세포 활성화는 T 세포 의존적이고, 항원 비-특이적이다. 그러나, 낮은 농도의 CpG DNA에 의한 B 세포 활성화는 B 세포 증식 및 Ig 분비 둘 다에 대해서 B 세포 항원 수용체를 통해서 송달된 시그날과의 강력한 상승작용을 갖는다 (Krieg et al., 1995). B 세포 항원 수용체를 통해서 및 CpG DNA에 의해서 유발된 B 세포 시그날링 경로들 사이의 이러한 강력한 상승작용은 항원 특이적 면역반응을 촉진시킨다. B 세포에 대한 그의 직접적인 효과 이외에도, CpG DNA는 또한 높은 수준의 IL-12를 포함하는 다양한 사이토카인을 분비하도록 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포를 직접적으로 활성화시킨다 (Klinman et al., 1996; Halpern et al., 1996; Cowdery et al., 1996). 이들 사이토카인은 감마-인터페론 (IFN-.감마.-)을 분비하도록 천연 킬러 (NK) 세포를 자극하고, 증가된 용해 활성을 갖는다 (Klinman et al., 1996, supra; Cowdery et al., 1996, supra; Yamamoto et al., 1992; Ballas et al., 1996). 전반적으로, CpG DNA는 Th2 사이토카인의 분비가 거의 없이 IL-12 및 IFN-감마에 의해서 지배된 사이토카인 생산의 Th1 패턴을 유도한다 (Klinman et al., 1996). 다른 분자는 톨 유사 수용체를 자극한다. 한가지 예는 다수의 세균 편모를 포함하는 단백질 서브유니트인 플라겔린 (flagellin)이다. 플라겔린은 TLR-5 리간드이며, 이러한 결합에 의해서 항원 제시 세포의 생물학적 기능들 중의 적어도 하나를 유발한다. 편모는 에스케리키아 (Escherichia), 살모넬라 (Salmonella), 프로테우스 (Proteus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 바실러스 (Bacillus), 캄필로박터 (Campylobacter), 비브리오 (Vibrio), 트레포네마 (Treponema), 레지오넬라 (Legionella), 클로스트리디아 (Clostridia), 및 카울로박터 (Caulobacter) 속을 포함한 간상 및 나선형 세균의 표면 상에서 발견된다. 플라겔린의 보존된 지역은 TLR5 결합에 중요한 반면에, 다형성 중앙 지역은 TLR5에 대한 결합에 영향을 미침이 없이 결실될 수 있다. 진뱅크 수탁번호 (Genbank accession numbers) D13689, YP.sub.--275549, YP.sub.--275550, AAU18718, AAU18717, ZP.sub.--00743095, EAO52626, YP.sub.--315348, AAT28337, AAT28336, AAT28335, AAT28334, AAT28333, AAZ36356, AAZ33167, AAZ94424, AAZ91670, NP.sub.--414908, BAD18052, 및 BAD18051과 같은 다수의 세균으로부터의 플라겔린 서열이 본 기술분야에서 이용될 수 있다. 정제된 보조제 면역 자극제의 세 번째 예로서, 그람 음성 리포폴리사카라이드의 비-독성의 화학적으로 합성되거나 효소적으로 변형된 유도체는 강력한 보조제이며, TLR-4 결합 및 활성화를 통해서 림프구를 자극함으로써 작용한다. 예를 들어, 모노포스포릴 지질 A (MPL)는 리포폴리사카라이드의 지질 A 성분의 유도체이며, 전-염증성 사이토카인의 강력한 활성화제이다. 비록 천연 지질 A 및 그의 모 LPS가 강력한 발열 특성을 가지며, 인간에게서 발열 반응을 유도한다고 하더라도 (Greisman and Homick, J Immunol, 109:1210-1215 (1972); Greisman and Homick, J Infect Dis, 128:257-263 (1973); Abemathy and Spink, J Clin Invest, 37:219-225 (1958); Rietschel et al, supra; 및 Raetz, supra (1993)), MPL 및 그의 화학적으로 합성된 유사체는 독성이 아니라, IL-1, IL-6, 및 TNF-알파를 포함한 숙주 전염증성 사이토카인의 컴펜디움 (compendium)을 유도한다.

또한, 알루미늄 염에 흡착된 서브유니트에 대한 면역반응을 증진시키기 위해서는 1 또는 2 용량 후에 인간에게서 효과적인 항체 반응을 생성시키기 위해서 공동-보조제가 필요할 것으로 보인다. 알루미늄 염과 상호적인 다수의 보조제 화합물이 최근에 보조제로서 평가되었다. 주로 이들 보조제에는 모노포스포릴 지질 A (MPL) 및 QS-21, 및 CpG 서열이 포함된다. 인간 연구에서, 탄저병 백신에 의한 최근의 데이터는 AlOH 흡착된 백신인 AVA가, 비-인간 영장류 및 인간에게서 보조제 제제에 CpG 7909를 첨가함으로써 총 항-rPA 항체 및 탄저병 독소 중화 항체의 관점에서 상당히 증진될 수 있음을 나타내고 있지만, CpG-함유 백신의 장기간 열안정성은 기술하지 않았다 (Klinman, 2006, CpG oligonucleotides accelerate and boost the immune response elicited by AVA, the licensed anthrax vaccine, Expert Rev Vaccines, 5:365-9). MPL 및 QS-21이 또한 알루미늄 염과 함께 뿐 아니라 Glaxo Smith Kline Biologics에 의해서 개발된 전매 오일 에멀션 제제에서 사용되었다. QS-21은 인간 및 동물 모델에서 AlOH 백신에서 평가되어 내성 (tolerability) 및 전신계적 안전성의 좋은 증거를 갖는다. QS-21은 이온성 및 소수성 상호작용을 통해서 알루미늄 염에 결합할 뿐만 아니라 그의 일부분은 용액 (수성 백신) 중에 미셀 형태로 남는 것으로 생각된다. QS-21은 항체 및 세포 매개된 면역성 둘 다를 유도하기 위한 광범한 보조제 효과를 갖는, 나무 껍질로부터 정제된 사포닌이다. 기전이 이해되지는 않았지만, 인간 백신과 함께 효과적인 용량 수준이 평가되었다. 알루미늄을 갖는 QS-21이 임상 연구에서 평가되었으며, 항원에 의해서 제제화된 QS-21의 독립적인 안전성 연구가 이루어졌다. QS-21은 용해되는(that resolves) 주사 부위에서의 자통 (stinging)과 연관되었으며, 전신계적 부작용의 증거는 거의 없다 (Waite, Jacobson et al., 2001, Three double-blind, randomized trials evaluating the safety and tolerance of different formulations of the saponin adjuvant QS-21, Vaccine, 19:3957-67). 인간에게서의 몇 가지 연구는 QS-21이 알루미늄에 흡착된 항원에 대한 반응을 증진시키는 것을 보여주었다. 이들에는 말라리아 백신 후보물질 (Nardin, Oliveira et al., 2000, Synthetic malaria peptide vaccine elicits high levels of antibodies in vaccinees of defined HLA genotypes, J Infect Dis, 182:1486-96; Kashala, Amador et al., 2002, Safety, tolerability and immunogenicity of new formulations of the Plasmodium falciparum malaria peptide vaccine SPf66 combined with the immunological adjuvant QS-21, Vaccine, 20:2263-77), HIV gp120 (Evans, McElrath et al., 2001, QS-21 promotes an adjuvant effect allowing for reduced antigen dose during HIV-1 envelope subunit immunization in humans, Vaccine, 19:2080-91), 및 중화 역가 및 보호가 QS-21에 의해서 증진된 더욱 최근의 뎅기열 바이러스 (Dengue virus) 서브유니트의 레수스 마카크 (Rhesus macaque) 실험 (Putnak, Coller et al., 2005, An evaluation of dengue type-2 inactivated, recombinant subunit, and live-attenuated vaccine candidates in the rhesus macaque model, Vaccine, 23:4442-52)에서의 몇 가지 실험이 포함된다. QS-21의 용액 안정성은 장기간 안정성 시험으로 잘 연구되었으며, 보조제 활성 QS-21 (실제로 두 개의 이성체 형태로 구성된다)은 약하게 산성인 완충제 중에서 4년 이상 동안 매우 안정한 반면에 40℃에서는 10일 미만임을 나타내었다 (Kensil and Kammer, 1998, QS-21: a water-soluble triterpene glycoside adjuvant, Expert Opin Investig Drugs, 7:1475-82). QS-21은 건조 분말로서 저장되며, 이 형태는 무한하게 안정하다.

리신 독소는 아주까리씨 (castor beans; Ricinus communis)에 의해서 생산된 64 kDa 단백질이다 (Doan LG. Ricin: mechanism of toxicity, clinical manifestations, and vaccine development. A review. Journal of Toxicology - Clinical Toxicology 2004;42(2):201-8; Audi J, Belson M, Patel M, Schier J, Osterloh J. Ricin poisoning: a comprehensive review. JAMA 2005;294(18):2342-51). 홀로톡신 (holotoxin)은 디설파이드 결합에 의해서 결합된 두 개의 폴리펩타이드 쇄 (A 및 B)로 구성된다. A 쇄 (RTA)는 포유동물 세포에서 단백질 합성을 억제하는 리보좀 불활성화 단백질 (RIP)이다. B 쇄 (RTB)는 세포의 표면 상에서 갈락토즈에 결합하는 렉틴이다. 일단 세포에 의해서 내재화되면, RTA는 사이토졸 내로 전좌하며, 여기에서 이것은 60S 리보좀을 효소적으로 불활성화시킨다 (Smallshaw, JE and Vitetta, ES, A lyophilized formulation of RiVax, a recombinant ricin subunit vaccine, retains immunogenicity. Vaccine 2010 March 11; 28(12): 2428-2435). 세포의 세포질 내에서 RTA의 단일 분자는 단백질 합성을 완전히 억제한다. 인간에게서 리신의 보고된 추정 치사량은 흡입, 주사 또는 섭취된 경우에 1-25 ㎍/㎏이다 (Audi et al). 그의 광범한 이용가능성 및 비상한 독성으로 인하여, 리신은 생물테러 (bioterrorism)에서 사용하기 위한 잠재적 작용제를 나타내며, 따라서 Centers for Disease Control, Atlanta GA (CDC)에서 B 수준의 생물위협 (biothreat)으로 분류되었다. 리신 중독은 톡소이드 또는 탈글리코실화된 리신 A 쇄 (dgRTA)로 백신접종함으로써, 또는 항-리신 항체에 의해 수동 면역시킴으로써 실험 동물에서 방지될 수 있다. 그러나, 톡소이드는 인간에게서 일상적으로 사용하기에는 지나치게 독성인 것으로 생각되며, dgRTA는 생산하기가 어렵고 비싸며, 또한 활성 부위 둘 다를 보유하여 인간에게서 독성 부작용을 유도할 수 있었다. 리신 용량이 비교적 낮고, 항체가 노출 후 몇 시간 이내에 투여된다면, 항-리신 항체에 의한 수동 면역이 유일하게 효과적이다 (Hewetson JF, Rivera VR, Creasia DA, Lemley PV, Rippy MK, Poli MA. Protection of mice from inhaled ricin by vaccination with ricin or by passive treatment with heterologous antibody. Vaccine 1993;11(7):743-6).

이들 제한을 피하기 위해서, 재조합 RTA 백신 (RiVax)이 개발되었다 (Smallshaw et al.). RiVax는 두 개의 점 돌연변이 Y80A 및 V76M을 통합시켜 그의 공지된 독성 둘 다, 즉 리보독성 (ribotoxicity) 및 혈관 누출-유도능 (vascular leak-inducing ability)을 크게 감소시키거나 배제시켰다. 보조제의 부재 하에서, RiVax는 마우스, 토끼 및 인간에게서 비독성이고 면역원성이다 (Smallshaw JE, Firan A, Fulmer JR, Ruback SL, Ghetie V, Vitetta ES. A novel recombinant vaccine which protects mice against ricin intoxication. Vaccine 2002;20(27-28):3422-7). 이러한 모델은 다른 백신 모델과 연루된 대부분의 독성이 없이 양성인 결과를 수득하는 것으로 나타났다.

리신은 현재 NIAID 및 Centers for Disease Control and Prevention (CDC)에서 수준 B의 생물위협제로 기재되어 있다 (Rotz, Khan et al., 2002, Public health assessment of potential biological terrorism agents, Emerging Infectious Diseases, 8:225-30). 백신 후보물질은 분자의 잘 특정화된 활성에 포함된 리신 독소 A 쇄 (RTA) 내의 잔기의 유전적 불활성화에 의해서 수득된 리신 독소에 대한 재조합 서브유니트 백신을 기초로 한다. 이 변형된 분자는 마우스, 토끼 및 인간에게서 면역원성이며, 독소를 중화시키거나 각각의 종에서 전신계적으로 또는 점막에 의한 독소의 청소와 연관된 항체를 유도한다. 천연두 또는 탄저병의 경우에, 테러리스트 유도된 전염병은 발병의 증거 후에, 집단 백신접종, 선택적 백신접종, 또는 전원 백신접종 (ring vaccination)에 의해서 제어될 수 있었다 (Halloran, Longini et al., 2002, Containing bioterrorist smallpox, Science, 298:1428-32; Kaplan, Craft et al., 2002, Emergency response to a smallpox attack: the case for mass vaccination, Proc Natl Acad Sci U S A, 99:10935-40; Bozzette, Boer et al., 2003, A model for a smallpox-vaccination policy, N Engl J Med, 348:416-25; Kretzschmar, van den Hof et al., 2004, Ring vaccination and smallpox control, Emerg Infect Dis, 10:832-41). 다른 한편으로, 생물학적 독소에 대한 생물테러리스트 (bioterrorist) 노출에 대한 백신접종은 작용제가 복제하지 않기 때문에, 집단 백신접종보다는 군대 또는 최초 반응자들과 같은 선택 집단에서 더 사용될 것 같다. 리신의 분리된 A 및 B 서브유니트는 이. 콜라이 및 다른 재조합 숙주 내에서 생산될 수 있다. B 쇄는 또한, 백신 내에 포함시키기 위한 후보물질이지만, A 쇄보다 덜 면역원성이고, 덜 보호적인 것으로 생각된다 (Maddaloni, Cooke et al., 2004, Immunological characteristics associated with the protective efficacy of antibodies to ricin, Journal of Immunology, 172:6221-8). 비록 리신 A 쇄가 천연 리신보다 적어도 1000-배 독성이 덜 하지만, 이것은 여전히 백신으로 사용되는 경우에 독성을 야기할 수 있는 효소 활성을 보유한다 (Thorpe, Detre et al., 1985, Modification of the carbohydrate in ricin with metaperiodate-cyanoborohydride mixtures. Effects on toxicity and in vivo distribution, European Journal of Biochemistry, 147:197-206). 리신 A 쇄 내의 몇 가지 주요 아미노산 잔기인 Y80, Y123, E177, R180, N209, 및 W211이 그의 효소적으로-활성인 부위를 구성한다 (Olson, 1997, Ricin A-chain structural determinant for binding substrate analogues: a molecular dynamics simulation analysis, Proteins, 27:80-95; Lebeda and Olson, 1999, Prediction of a conserved, neutralizing epitope in ribosome-inactivating proteins, International Journal of Biological Macromolecules, 24:19-26). 이들 아미노산 잔기 중의 일부에서의 돌연변이는 단백질 합성의 억제에 의해서 측정된 것으로서 무시할 수 있는 독성을 갖는 리신 A 쇄를 제공하였다 (Kim and Robertus, 1992, Analysis of several key active site residues of ricin A chain by mutagenesis and X-ray crystallography, Protein Engineering, 5:775-9). 내피 세포에 대한 RTA의 결합에 포함되는 추가의 부위 및 잔기가 또한 확인되었으며, 이들은 세포외적으로 나타나고, 숙주 세포 내로의 독소 침입을 필요로 하지 않는다 (Baluna and Vitetta, 1999, An in vivo model to study immunotoxin-induced vascular leak in human tissue, J Immunother, 22:41-7; Baluna, Coleman et al., 2000, The effect of a monoclonal antibody coupled to ricin A chain-derived peptides on endothelial cells in vitro: insights into toxin-mediated vascular damage, Exp Cell Res, 258:417-24; Smallshaw, Ghetie et al., 2003, Genetic engineering of an immunotoxin to eliminate pulmonary vascular leak in mice, Nature Biotechnology, 21:387-91). RTA 상의 내피 결합 부위는 분리된 HUVEC 세포에서의 손상, 및 RTA-함유 면역독소의 사용에서 용량 제한 독성 (dose limiting toxicity)인 것으로 결정된 혈관 누출 증후군 (VLS)에 연루되었다 (Smallshaw, Ghetie et al., 2003, Genetic engineering of an immunotoxin to eliminate pulmonary vascular leak in mice, Nature Biotechnology, 21:387-91). 폐 혈관 누출, SCID 마우스에서 인간 피부 이종이식 시의 혈관 누출 둘 다, 및 HUVEC 세포에 수반된 RTA의 부분은 아미노산 잔기 L74, D75, 및 V76을 포함하는 것으로 보인다 (Baluna, Rizo et al., 1999, Evidence for a structural motif in toxins and interleukin-2 that may be responsible for binding to endothelial cells and initiating vascular leak syndrome, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 96:3957-62). 따라서, 이들 독성 부위를 고려한 A 쇄 백신이 구성되었으며, 리신 A 쇄의 이중 돌연변이체를 포함한다. 티로신 80이 효소 부위 내에서 알라닌으로 돌연변이되고, 발린 76이 혈관 누출 부위에서 메티오닌으로 돌연변이되어 내피 세포 손상에서의 모든 가능한 것을 최소화시킨다. 현재 결정 구조 데이터를 기초로 하여, 이 단백질은 구조적으로 천연 리신 A 쇄 (RTA)와 동일한 것으로 알려져 있으며, 이것은 분자 내에 함유된 점 돌연변이가 어떤 잠재적 삼차 구조 (또는 잠재적 입체형태-의존성 에피토프)도 붕괴시키지 않음을 나타낸다. 보조제의 부재 하에서 마우스에게 근육내로 (i.m.) 투여하는 경우에, 돌연변이체 A 쇄는 리신을 인식하는 항체를 유발하였으며, 동물은 리신의 10×LD₅₀ 용량으로부터 보호되었다 (Smallshaw, Firan et al., 2002, A novel recombinant vaccine which protects mice against ricin intoxication, Vaccine, 20:3422-7).

천연 PA는 AVA (흡착된 탄저병 백신)에서 우성 면역원이며, 단일 성분 백신으로서 노출-전의 보호적 면역성 및 노출-후 예방에 대한 표적이다. 무병원성 비. 안트라시스 (B. anthracis)에서 천연 PA의 발현을 기초로 한 몇 가지 알루미늄 흡착된 재조합 PA 백신 (제2 세대)은 최근의 I 상 실험에서 진전되고 시험하였으며, AVA에 대한 관계에서 면역원성인 것으로 나타났다 (Gorse, Keitel et al., 2006, Immunogenicity and tolerance of ascending doses of a recombinant protective antigen (rPA102) anthrax vaccine: a randomized, double-blinded, controlled, multicenter trial, Vaccine, 24:5950-9; Campbell, Clement et al., 2007, Safety, reactogenicity and immunogenicity of a recombinant protective antigen anthrax vaccine given to healthy adults, Hum Vaccin, 3:205-11). 면역성의 주된 상관관계는 토끼 에어로졸 포자 시험접종 (challenge) 연구 (총 ELISA-반응성 항체 및 독소 중화 활성 (TNA))에서 잘 특정화되었다 (Little, Ivins et al., 2004, Defining a serological correlate of protection in rabbits for a recombinant anthrax vaccine, Vaccine, 22:422-30). 탄저병 독소는 비. 안트라시스 (B. anthracis)에 의해서 발현된 3 개의 플라스미드-코드화된 단백질의 세트, 즉 반응성 항원 (PA; 83 kDa), 치사 인자 (LF; 90 kDa) 및 부종 인자 (EF; 89 kDa)로 구성된 삼중 독소인 것으로 잘 알려져 있다. LF 및 EF는 헵타머화된 PA에 의해서 세포외 표면으로부터 세포질 내로 수송되며, 여기에서 이들은 포유동물 세포의 분자 표적을 효소적으로 변형시킴으로써 작용한다. LF는 몇 개의 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK 키나제)를 분해하고 활성화시키는 메탈로프로테아제이며, EF는 세포내 cAMP 수준의 빠른 증가를 야기하는 칼모듈린-의존적 아데닐레이트 사이클라제이다 (Young and Collier, 2007, Anthrax toxin: receptor binding, internalization, pore formation, and translocation, Annu Rev Biochem, 76:243-65). 이들 단백질은 개별적으로는 비독성이지만, 함께 투여하면 빠른 세포사를 야기하는 강력한 독소이다.

AVA 백신은 여전히 탄저병에 대한 유일한 백신이며, 이것을 개선하기 위한 주된 움직임은 몇 가지의 인지된 단점을 기초로 한다: 견고한 면역성을 달성하기 위한 6-용량 레지멘에 대한 필요성 및 이것이 안전하지 않고 반응원성 (reactogenic)이며, AVA의 제조 과정이 조잡하고 일관성이 결여된다는 견해. 비록 PA가 AVA 내의 주된 면역원이지만, 일부의 로트 (lot)에 존재할 수 있는 소량의 LF 및 EF가 백신의 유효성에 기여하는지 여부는 명백하지 않다. 탄저병 rPA의 면역원성의 상실에서의 주된 인자는 보조제 표면 상에서의 가속화된 탈아미드화를 포함한다. 이것은 표면 pH를 저하시키기 위한 소량의 포스페이트의 존재에 의해서 방지될 수 있었다. 개발 중에 있는 다른 특별한 rPA 백신 후보물질이 있다. AVA 또는 PA-기본 백신은 일반적으로 독소 중화 항체를 유도한다 (Pitt, Little et al., 1999, In vitro correlate of immunity in an animal model of inhalational anthrax, J Appl Microbiol, 87:304; Reuveny, White et al., 2001, Search for correlates of protective immunity conferred by anthrax vaccine, Infect Immun, 69:2888-93; Little, Ivins et al., 2004, Defining a serological correlate of protection in rabbits for a recombinant anthrax vaccine, Vaccine, 22:422-30). 비록 PA 백신이 감염의 발현을 제한하도록 디자인되지는 않았지만, PA-기본 백신의 보호 작용의 근원적인 기전은 중독으로부터 숙주를 보호하고, 따라서 면역 시스템이 유기체를 처리하도록 하는 항-PA 항체에 기인할 수 있다.

현재 미국에는 FDA에 의해서 승인된 72 종의 백신이 있다 (U.S. Food and Drug Administration. Complete List of Vaccines Licensed for Immunization and Distribution in the US. FDA. 6/3/2010). 이들 72 개의 백신 중에서, 36%는 알루미늄 보조제를 함유하며, 30%는 냉동 건조된다. 72 개의 백신 중의 어떤 것도 알루미늄 보조제와 냉동 건조된 성분 둘 다를 함유하지는 않는다.

본 기술분야에서는 보호적 면역성의 빠른 발현을 촉진시키기 위해서 재조합 항원을 통합시킨, 열안정성이고 면역학적으로-활성인 냉동 건조된 백신 제제를 생산하는 방법을 개발할 필요성이 있다.

발명의 요약

본 발명은 열안정성이며, 냉동 건조된 백신 보조제-함유 제제를 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로, 백신 항원이 재조합 항원인 열안정성이며, 냉동 건조된 백신 제제를 생산하는 방법을 제공한다.

한가지 구체예에서, 본 발명은 적어도 하나의 알루미늄-염 보조제, 적어도 하나의 휘발성 염을 함유하는 적어도 하나의 완충제 시스템, 적어도 하나의 유리-형성제, 적어도 하나의 면역학적으로 활성인 공동-보조제 및 적어도 하나의 항원을 조합하여 액체 백신 제제를 생성시키고; 상기의 액체 백신 제제를 냉동시켜 냉동된 백신 제제를 생성시키고; 냉동된 백신 제제를 동결건조시켜 대상체에서 면역 반응을 유발할 수 있는 건조된 백신 조성물을 생성시키는 단계를 포함하는, 면역학적으로-활성인 보조제-결합된 건조된 백신 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 대상체에 의해서 발현된 면역 반응은 항원에 특이적인 체액성 면역 및/또는 세포-매개 면역일 수 있다. 한가지 관점에서, 적어도 하나의 알루미늄-염 보조제는 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트 및 알루미늄 설페이트로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 관점에서, 알루미늄-염 보조제는 알루미늄 하이드록사이드이다. 추가의 관점에서, 적어도 하나의 완충제 시스템은 아세테이트, 석시네이트, 시트레이트, 프롤라민, 아르기닌, 글리신, 히스티딘, 보레이트, 카보네이트 및 포스페이트 완충제 시스템으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 추가의 또 다른 관점에서, 적어도 하나의 완충제 시스템은 암모늄 아세테이트, 암모늄 포르메이트, 암모늄 카보네이트, 암모늄 비카보네이트, 트리에틸암모늄 아세테이트, 트리에틸암모늄 포르메이트, 트리에틸암모늄 카보네이트, 트리메틸아민 아세테이트, 트리메틸아민 포르메이트, 트리메틸아민 카보네이트, 피리디날 아세테이트 및 피리디날 포르메이트로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 관점에서, 적어도 하나의 유리-형성제는 트레할로즈, 수크로즈, 피콜 (ficoll), 덱스트란, 수크로즈, 말토트리오즈, 락토즈, 만니톨, 하이드록시에틸 전분, 글리신, 사이클로덱스트린, 및 포비돈으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 추가의 관점에서, 유리-형성제는 트레할로즈이다. 한가지 관점에서, 유리-형성제인 트레할로즈는 냉동 건조시키기 전에 액체 백신 제제 내에 약 5% 내지 약 15%의 중량-대-용적 농도로 존재한다. 또 다른 관점에서, 유리-형성제인 트레할로즈는 액체 백신 제제 내에 약 8% 내지 약 20%의 중량-대-용적 농도로 존재한다. 또 다른 구체예에서, 적어도 하나의 면역학적으로-활성인 공동-보조제가 방법 단계에 첨가된다. 이 관점에서, 적어도 하나의 면역학적으로-활성인 공동-보조제는 지질 A, 지질 A 유도체, 모노포스포릴 지질 A, 모노포스포릴 지질 A의 화학적 유사체, CpG 함유 올리고뉴클레오타이드, TLR-4 아고니스트, 플라겔린, 그람 음성 세균 유래 플라겔린, TLR-5 아고니스트, TLR-5 수용체에 결합할 수 있는 플라겔린의 단편, 사포닌, 사포닌의 유사체, QS-21, 정제된 사포닌 분획, ISCOMS, 및 스테롤 및 지질과의 사포닌 조합물로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 추가의 관점에서, 공동-보조제 화합물은 QS-21이다. 추가의 관점에서, 냉동 단계는 트레이 (tray) 냉동, 선반 (shelf) 냉동, 스프레이-냉동 및 쉘 (shell)-냉동 중의 하나를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 냉동 단계는 냉동 단계를 개시하기 위해서 전-냉각된 트레이를 사용하는 것을 포함한다.

또 다른 관점에서, 항원은 로타바이러스, 구제역 바이러스, 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스, H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7, 인간 파라인플루엔자 타입 2, 단순 포진 바이러스, 엡스타인-바르 (Epstein-Barr) 바이러스, 수두 바이러스, 돼지 헤르페스바이러스 1, 사이토메갈로바이러스, 리사바이러스, 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis), 탄저병 PA 및 유도체, 폴리오바이러스, 간염 A, 간염 B, 간염 C, 간염 E, 디스템퍼 (distemper) 바이러스, 베네주엘라 말 뇌척수막염, 고양이 백혈병 바이러스, 레오바이러스 (reovirus), 호흡기 합포체 바이러스, 라사열 (Lassa fever) 바이러스, 폴리오마 (polyoma) 종양 바이러스, 개 파르보바이러스, 유두종 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 우역 바이러스, 인간 리노바이러스 종, 엔테로바이러스 (Enterovirus) 종, 멩고바이러스 (Mengovirus), 파라믹소바이러스, 닭 전염성 기관지염 바이러스, 인간 T-세포 백혈병-림프종 바이러스 1, 인간 면역결핍 바이러스-1, 인간 면역결핍 바이러스-2, 림프구성 맥락수막염 바이러스, 파르보바이러스 B19, 아데노바이러스, 풍진 바이러스, 황열 바이러스, 뎅기열 바이러스, 소 호흡기 합포체 바이러스, 코로나 바이러스, 보르데텔라 퍼튜시스 (Bordetella pertussis), 보르데텔라 브론키셉티카 (Bordetella bronchiseptica), 보르데텔라 파라퍼튜시스 (Bordetella parapertussis), 브루셀라 아보르티스 (Brucella abortis), 브루셀라 멜리텐시스 (Brucella melitensis), 브루셀라 수이스 (Brucella suis), 브루셀라 오비스 (Brucella ovis), 브루셀라 종, 에스케리키아 콜라이, 살모넬라 종, 살모넬라 티피 (Salmonella typhi), 스트렙토코커스 (Streptococci), 비브리오 콜레라 (Vibrio cholera), 비브리오 파라헤몰리티쿠스 (Vibrio parahaemolyticus), 시겔라 (Shigella), 슈도모나스 (Pseudomonas), 결핵, 아비움 (avium), 바실 칼메테 구에린 (Bacille Calmette Guerin), 마이코박테리움 레프레 (Mycobacterium leprae), 뉴모코커스 (Pneumococci), 스타필로코커스 (Staphlylococci), 엔테로박터 (Enterobacter) 종, 로칼리마야 헨셀레 (Rochalimaia henselae), 파스튜렐라 헤몰리티카 (Pasteurella haemolytica), 파스튜렐라 멀토시다 (Pasteurella multocida), 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis), 클라미디아 프시타시 (Chlamydia psittaci), 림포그래뉼로마 베네륨 (Lymphogranuloma venereum), 트레포네마 팔리둠 (Treponema pallidum), 헤모필루스 (Haemophilus) 종, 마이코플라즈마 보비게니탈륨 (Mycoplasma bovigenitalium), 마이코플라즈마 풀모니스 (Mycoplasma pulmonis), 마이코플라즈마 종, 보렐리아 버그도르페리 (Borrelia burgdorferi), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionalla pneumophila), 클로스트리디움 보툴리눔 (Colstridium botulinum), 코리네박테리움 디프테리에 (Corynebacterium diphtheriae), 예르시니아 엔터콜리티카 (Yersinia entercolitica), 리케치아 리케치 (Rickettsia rickettsii), 리케치아 티피 (Rickettsia typhi), 리케치아 프로우세키 (Rickettsia prowsaekii), 에를리키아 샤펜시스 (Ehrlichia chaffeensis), 아나플라즈마 파고사이토필룸 (Anaplasma phagocytophilum), 플라스모디움 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 플라스모디움 비박스 (Plasmodium vivax), 플라스모디움 말라리에 (Plasmodium malariae), 스키스토좀 (Schistosomes), 트리파노소마 (trypanosomes), 라이쉬마니아 (Leishmania) 종, 필라리알 네마토드 (Filarial nematodes), 트리코모나스증 (trichomoniasis), 육포자충증 (sarcosporidiasis), 테니아 사기나타 (Taenia saginata), 테니아 솔륨 (Taenia solium), 라이쉬마니아 (Leishmania), 톡소플라즈마 곤디 (Toxoplasma gondii), 트리키넬라 스피랄리스 (Trichinella spiralis), 콕시듐증 (coccidiosis), 아이메리아 테넬라 (Eimeria tenella), 크립토코커스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 칸디다 알비칸 (Candida albican), 아스퍼질러스 푸미가투스 (Apergillus fumigatus), 콕시디오이데스 진균증 (coccidioidomycosis), 나이세리아 고노레아 (Neisseria gonorrhoeae), 말라리아 서컴스포로조이테 (malaria circumsporozoite) 단백질, 말라리아 메로조이테 (malaria merozoite) 단백질, 트리파노소마 표면 항원 단백질, 백일해, 알파바이러스, 아데노바이러스, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 수막염균 외막 단백질, 스트렙토코커스 M 단백질, 인플루엔자 헤마글루티닌, 암 항원, 종양 항원, 독소, 클로스트리듐 퍼프린젠스 입실론 (clostridium perfringens epsilon) 독소, 리신 독소, 슈도모나스 외독소, 외독소, 신경독소, 사이토카인, 사이토카인 수용체, 모노킨 (monokines), 모노킨 수용체, 식물 화분, 동물 비듬, 및 먼지 진드기로 구성된 그룹으로부터 선택되거나, 이들로부터 유래한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 적어도 하나의 알루미늄-염 보조제; 휘발성 염을 포함하는 적어도 하나의 완충제; 적어도 하나의 유리-형성제; 및 적어도 하나의 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 여기에서 조성물은 동결건조되어 건조된 백신 조성물을 생성시키며, 나아가 건조된 백신 조성물은 대상체에서 면역 반응을 유발할 수 있다. 한가지 관점에서, 적어도 하나의 알루미늄-염 보조제는 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트 및 알루미늄 설페이트로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 관점에서, 적어도 하나의 완충제는 아세테이트, 석시네이트, 시트레이트, 프롤라민, 아르기닌, 글리신, 히스티딘, 보레이트, 카보네이트 및 포스페이트로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 대체 관점에서, 적어도 하나의 완충제는 암모늄 아세테이트, 암모늄 포르메이트, 암모늄 카보네이트, 암모늄 비카보네이트, 트리에틸암모늄 아세테이트, 트리에틸암모늄 포르메이트, 트리에틸암모늄 카보네이트, 트리메틸아민 아세테이트, 트리메틸아민 포르메이트, 트리메틸아민 카보네이트, 피리디날 아세테이트 및 피리디날 포르메이트로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 또한 또 다른 관점에서, 적어도 하나의 유리-형성제는 트레할로즈, 수크로즈, 피콜, 덱스트란, 수크로즈, 말토트리오즈, 락토즈, 만니톨, 하이드록시에틸 전분, 글리신, 사이클로덱스트린, 및 포비돈으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 추가의 관점에서, 항원은 로타바이러스, 구제역 바이러스, 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스, H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7, 인간 파라인플루엔자 타입 2, 단순 포진 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스, 수두 바이러스, 돼지 헤르페스바이러스 1, 사이토메갈로바이러스, 리사바이러스, 바실러스 안트라시스, 탄저병 PA 및 유도체, 폴리오바이러스, 간염 A, 간염 B, 간염 C, 간염 E, 디스템퍼 바이러스, 베네주엘라 말 뇌척수막염, 고양이 백혈병 바이러스, 레오바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 라사열 바이러스, 폴리오마 종양 바이러스, 개 파르보바이러스, 유두종 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 우역 바이러스, 인간 리노바이러스 종, 엔테로바이러스 종, 멩고바이러스, 파라믹소바이러스, 닭 전염성 기관지염 바이러스, 인간 T-세포 백혈병-림프종 바이러스 1, 인간 면역결핍 바이러스-1, 인간 면역결핍 바이러스-2, 림프구성 맥락수막염 바이러스, 파르보바이러스 B19, 아데노바이러스, 풍진 바이러스, 황열 바이러스, 뎅기열 바이러스, 소 호흡기 합포체 바이러스, 코로나 바이러스, 보르데텔라 퍼튜시스, 보르데텔라 브론키셉티카, 보르데텔라 파라퍼튜시스, 브루셀라 아보르티스, 브루셀라 멜리텐시스, 브루셀라 수이스, 브루셀라 오비스, 브루셀라 종, 에스케리키아 콜라이, 살모넬라 종, 살모넬라 티피, 스트렙토코커스, 비브리오 콜레라, 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 시겔라, 슈도모나스, 결핵, 아비움, 바실 칼메테 구에린, 마이코박테리움 레프레, 뉴모코커스, 스타필로코커스, 엔테로박터 종, 로칼리마야 헨셀레, 파스튜렐라 헤몰리티카, 파스튜렐라 멀토시다, 클라미디아 트라코마티스, 클라미디아 프시타시, 림포그래뉼로마 베네륨, 트레포네마 팔리둠, 헤모필루스 종, 마이코플라즈마 보비게니탈륨, 마이코플라즈마 풀모니스, 마이코플라즈마 종, 보렐리아 버그도르페리, 레지오넬라 뉴모필라, 클로스트리디움 보툴리눔, 코리네박테리움 디프테리에, 예르시니아 엔터콜리티카, 리케치아 리케치, 리케치아 티피, 리케치아 프로우세키, 에를리키아 샤펜시스, 아나플라즈마 파고사이토필룸, 플라스모디움 팔시파룸, 플라스모디움 비박스, 플라스모디움 말라리에, 스키스토좀, 트리파노소마, 라이쉬마니아 종, 필라리알 네마토드, 트리코모나스증, 육포자충증, 테니아 사기나타, 테니아 솔륨, 라이쉬마니아, 톡소플라즈마 곤디, 트리키넬라 스피랄리스, 콕시듐증, 아이메리아 테넬라, 크립토코커스 네오포르만스, 칸디다 알비칸, 아스퍼질러스 푸미가투스, 콕시디오이데스 진균증, 나이세리아 고노레아, 말라리아 서컴스포로조이테 단백질, 말라리아 메로조이테 단백질, 트리파노소마 표면 항원 단백질, 백일해, 알파바이러스, 아데노바이러스, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 수막염균 외막 단백질, 스트렙토코커스 M 단백질, 인플루엔자 헤마글루티닌, 암 항원, 종양 항원, 독소, 클로스트리듐 퍼프린젠스 입실론 독소, 리신 독소, 슈도모나스 외독소, 외독소, 신경독소, 사이토카인, 사이토카인 수용체, 모노킨, 모노킨 수용체, 식물 화분, 동물 비듬, 및 먼지 진드기로 구성된 그룹으로부터 선택되거나, 이들로부터 유래한다.

대체 구체예에서, 백신 조성물은 추가로 적어도 하나의 면역학적으로-활성인 공동-보조제를 포함한다. 한가지 관점에서, 적어도 하나의 면역학적으로-활성인 공동-보조제는 지질 A, 지질 A 유도체, 모노포스포릴 지질 A, 모노포스포릴 지질 A의 화학적 유사체, CpG 함유 올리고뉴클레오타이드, TLR-4 아고니스트, 플라겔린, 그람 음성 세균 유래 플라겔린, TLR-5 아고니스트, TLR-5 수용체에 결합할 수 있는 플라겔린의 단편, 사포닌, 사포닌의 유사체, QS-21, 정제된 사포닌 분획, ISCOMS, 및 스테롤 및 지질과의 사포닌 조합물로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

또한 또 다른 구체예에서, 본 발명은 적어도 하나의 알루미늄-염 보조제, 적어도 하나의 완충제 시스템, 적어도 하나의 유리-형성제, 및 적어도 하나의 항원을 조합하여 액체 백신 제제를 생성시키고; 액체 백신 제제를 냉동시켜 냉동된 백신 제제를 생성시키고; 냉동된 백신 제제를 동결건조시켜 건조된 백신 조성물을 생성시키는 단계를 포함하는, 보조제-결합된 건조된 백신 조성물 내의 입자 크기를 조절하는 방법을 제공하며, 여기에서 건조된 백신 조성물을 수성 희석제로 희석하여 재구성된 백신 조성물을 형성시킨 후에 재구성된 백신 조성물의 평균 입자 직경은 100 마이크로미터 미만이다. 또 다른 관점에서, 적어도 하나의 알루미늄-염 보조제는 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트 및 알루미늄 설페이트로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 추가의 관점에서, 알루미늄-염 보조제는 알루미늄 하이드록사이드이다. 또 다른 관점에서, 적어도 하나의 완충제 시스템은 아세테이트, 석시네이트, 시트레이트, 프롤라민, 히스티딘, 보레이트, 카보네이트 및 포스페이트 완충제 시스템으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 추가의 관점에서, 적어도 하나의 완충제 시스템은 석시네이트 및 포스페이트 완충제 시스템으로부터 선택된다. 한가지 관점에서, 적어도 하나의 유리-형성제는 트레할로즈, 수크로즈, 피콜, 덱스트란, 수크로즈, 말토트리오즈, 락토즈, 만니톨, 하이드록시에틸 전분, 글리신, 사이클로덱스트린, 포비돈, 및 칼륨 염으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 특정의 관점에서, 유리-형성제는 트레할로즈이다. 추가의 특정한 관점에서, 유리-형성제인 트레할로즈는 액체 백신 제제 내에 약 5% 내지 약 20%의 중량-대-용적 농도로 존재한다. 또 다른 관점에서, 유리-형성제인 트레할로즈는 액체 백신 제제 내에 약 7% 내지 약 15%의 중량-대-용적 농도로 존재한다. 한가지 관점에서, 냉동 단계는 트레이 냉동, 선반 냉동, 스프레이-냉동 및 쉘-냉동 중의 하나를 포함한다. 또 다른 관점에서, 냉동 단계는 스프레이-냉동을 포함한다. 추가의 관점에서, 재구성된 백신 조성물의 평균 입자 직경은 6 마이크로미터 미만이다. 한가지 관점에서, 선택 단계에서 유리 형성제의 농도는 냉각 단계에서 액체 백신 제제를 냉동된 상태로 냉각시키는 속도가 증가함에 따라 감소한다.

대체 구체예에서, 본 발명은 알루미늄-염 보조제, 유리-형성제 및 완충제 염을 포함하는, 건조된 백신 조성물에서 사용하기 위한 보조제 조성물을 제공한다. 한가지 관점에서, 알루미늄-염 보조제는 알루미늄 하이드록사이드 및 알루미늄 포스페이트로부터 선택된다. 또 다른 관점에서, 유리-형성제는 트레할로즈다. 추가의 관점에서, 완충제 염은 나트륨 석시네이트, 칼륨 석시네이트, 나트륨 포스페이트 및 칼륨 포스페이트로 구성된 그룹 중의 하나 또는 그 이상으로부터 선택된다.

또한 또 다른 구체예에서, 본 발명은 완충제 시스템 내에서 적어도 하나의 보조제, 적어도 하나의 유리 형성제, 및 적어도 하나의 항원을 블렌딩하여 액체 백신 제제를 생성시키고; 액체 백신 제제를 빠르게 냉동된 상태로 냉각시켜 냉동된 백신 제제를 생성시키고; 냉동된 백신 제제를 동결건조시켜 건조된 백신 조성물을 생성시키는 단계를 포함하는 방법에 의해서 생산된 것으로서 제한된 평균 입자 직경을 갖는 보조제-결합된 건조된 백신 조성물을 제공하며, 여기에서 건조된 백신 조성물을 수성 희석제로 희석하여 재구성된 백신 조성물을 형성시킨 후에 재구성된 백신 조성물의 평균 입자 직경은 100 마이크로미터 미만이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 적어도 하나의 알루미늄-염 보조제, 적어도 하나의 완충제 시스템, 적어도 하나의 유리-형성제, 및 적어도 하나의 항원을 조합하여 액체 백신 제제를 생성시키고; 액체 백신 제제를 냉동시켜 냉동된 백신 제제를 생성시키고; 냉동된 백신 제제를 동결건조시켜 건조된 백신 조성물을 생성시키는 단계를 포함하는, 냉동된 백신 제제에서 입자 크기를 조절하는 방법을 제공하며, 여기에서 건조된 백신 조성물을 수성 희석제로 해동 및 희석하여 재구성된 백신 조성물을 형성시킨 후에 재구성된 백신 조성물의 평균 입자 직경은 100 마이크로미터 미만이다. 한가지 관점에서, 적어도 하나의 알루미늄-염 보조제는 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트 및 알루미늄 설페이트로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 관점에서, 알루미늄-염 보조제는 알루미늄 하이드록사이드이다. 추가의 관점에서, 적어도 하나의 완충제 시스템은 아세테이트, 석시네이트, 시트레이트, 프롤라민, 히스티딘, 보레이트, 카보네이트 및 포스페이트 완충제 시스템으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 한가지 관점에서, 적어도 하나의 완충제 시스템은 석시네이트 및 포스페이트 완충제 시스템으로부터 선택된다. 또 다른 관점에서, 적어도 하나의 유리-형성제는 트레할로즈, 수크로즈, 피콜, 덱스트란, 수크로즈, 말토트리오즈, 락토즈, 만니톨, 하이드록시에틸 전분, 글리신, 사이클로덱스트린, 포비돈 및 칼륨 염으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 특정의 관점에서, 유리-형성제는 트레할로즈다. 추가의 특정한 관점에서, 유리-형성제인 트레할로즈는 액체 백신 제제 내에 약 5% 내지 약 20%의 중량-대-용적 농도로 존재한다. 또 다른 특정한 관점에서, 유리-형성제인 트레할로즈는 액체 백신 제제 내에 약 7% 내지 약 15%의 중량-대-용적 농도로 존재한다. 한가지 관점에서, 냉동 단계는 트레이 냉동, 선반 냉동, 스프레이-냉동 및 쉘-냉동 중의 하나를 포함한다. 또 다른 관점에서, 냉동 단계는 스프레이-냉동을 포함한다. 추가의 관점에서, 재구성된 백신 조성물의 평균 입자 직경은 6 마이크로미터 미만이다.

또 다른 관점에서, 액체 백신 제제는 냉동시키기 전에 고장성 혼합물 (hypertonic mixture)로서 제조되며, 여기에서 건조된 백신 조성물을 수성 희석제로 희석하여 재구성된 백신 조성물을 형성시키면, 재구성된 백신 조성물의 장성 (tonicity)은 등장성 수준으로 조정된다. 또한 또 다른 관점에서, 휘발성 염이 동결건조에 의해서 제거되어 재구성에 의해, 항원 및 보조제는 동일한 농도를 유지하면서 출발 제제에 비해서 감소된 장성을 갖는 백신 제제를 수득한 제제가 제조된다.

본 발명은 보호적 면역성의 빠른 발현을 촉진시키기 위해서 재조합 항원을 통합시킨, 열안정성이고 면역학적으로-활성인 냉동 건조된 백신 제제를 생산하는 방법을 제공한다.

도 1은 표면적 %를 기준으로 하여 냉동 건조 및 재구성 전 및 후의 입자 크기 분포를 도시한 것이다.
도 2는 냉동 건조 전 및 후의 표면적 %를 기준으로 한 히스티딘 제제의 입자 크기 분포를 도시한 것이다.
도 3은 냉동 건조 전 및 후의 표면적 %를 기준으로 한 아르기닌 제제의 입자 크기 분포를 도시한 것이다.
도 4는 냉동 건조 전 및 후의 표면적 %를 기준으로 한 글리신 제제의 입자 크기 분포를 도시한 것이다.
도 5는 10 mM 히스티딘 완충액 pH 6 중에서 시간의 경과에 따른 알하이드로겔 (Alhydrogel) 입자 침강을 나타낸다. (a) 침강 없음; (b) 침강 30 분 후; 및 (c) 침강 3 시간 후.
도 6은 입자가 -10℃ 전-냉각된 선반으로 냉동 건조시키기 전에 다양한 시간 동안 침강하도록 한 후에 표면적을 기초로 한 입자 크기 분포를 도시한다. 샘플은 pH 6의 10 mM 히스티딘 완충액 중에 1 ㎎/㎖ Al을 함유하였다.
도 7은 입자가 -10℃ 전-냉각된 선반으로 냉동 건조시키기 전에 다양한 시간 동안 침강하도록 한 후에 표면적을 기초로 한 입자 크기 분포를 도시한다. 샘플은 pH 6의 10 mM 히스티딘 완충액 중에 1 ㎎/㎖ Al 및 8 w/v% 트레할로즈를 함유하였다.
도 8은 냉동 건조시키기 전에 침강 시간을 변화시키면서, 트레할로즈의 존재 및 부재 하에 10 mM 히스티딘 중의 1 ㎎/㎖ Al의 제제들 사이의 평균 입자 크기를 비교하여 나타낸 것이다.
도 9는 3 ㎖ 유리 바이알 내에 함유된 1 ㎖ 백신 샘플을 일차 및 이차 냉동시키기 전에 FTS 시스템 니오스타 냉동 건조 시스템 (FTS System LyoStar Freeze Drying System)에 의해 다양한 냉동 속도로 처리하는 동결건조 중의 단계를 예시한다. 냉동 건조 후에, 바이알을 질소 카스로 퍼지하고, 밀봉시키고, 추가의 분석 전에 -80℃에서 저장하였다.
도 10은 4 가지 조건 및 트레할로즈의 증가하는 농도 하에서 냉동 건조 전 및 후의 입자 크기 분포를 나타낸다. 일차 및 이차 건조 전의 더 빠른 속도의 냉동 및 더 큰 농도의 트레할로즈는 냉동 건조 후에 초기 입자 분포와 가장 유사한 입자 크기 분포를 제공한다. 가장 느린 것부터 가장 빠른 것까지: 실온 트레이 A (A), -10℃ 전-냉각된 트레이 (B), 액체 질소 침지 (C), 액체 질소 스프레이 냉동 건조 (D). 제제는 0-12% 트레할로즈와 함께 알하이드로겔로서 1 ㎎/㎖, 10 mM 히스티딘, pH 6.0으로 구성되었다.
도 11은 실온 냉동 건조의 냉동 건조 후에 입자 크기 분포의 의존성을 나타낸다. 실온 냉동 건조는 도 10에서와 같이 수행되었다. 냉동 사이클 전에 트레이 상에서의 실온 배양에 의해, 입자 크기 분포는 < 1 미크론으로부터 > 20 미크론 이상으로 이동하였으며, 8% 트레할로즈의 존재는 입자 크기 이동의 크기를 감소시킨다.
도 12는 투석, 농축 및 -20℃에서 저장된 RTA와 비교하여, 50% w/v 글리세롤과 함께 10 mM 히스티딘, pH 6.0, 144 mM NaCl에 용해된 RTA의 SDS PAGE를 나타낸 것이다 (상부 패널 - 은 염색, 하부 패널 - 쿠마시 염색. 동일한 세트의 샘플을 사용하여 두 가지 연구를 수행하였다).
도 13은 동결건조 전의 알하이드로겔에 대한 RTA의 흡착을 나타낸다. RTA의 농도는 1 ㎎/㎖의 Al의 농도를 유지시키면서 변화시켰다. 적어도 95%의 RTA 단백질이 pH 6.0에서 알하이드로겔의 표면에 흡착되었다.
도 14는 알하이드로겔에 흡착된 액체 RTA의 백신접종의 결과를 나타내는데, 여기에서는 다양한 용량의 RTA를 사용하여 8 마리의 스위스 웹스터 (Swiss Webster) 마우스의 그룹을 백신접종시켰다. 백신을 백신접종 전에 1 개월 동안 40℃에서 저장한 경우에, 리신 독소에 노출된 동물 중의 어떤 것도 생존하지 않았으며, 면역원성의 상당한 손실이 관찰되었다. 1 개월 동안 4℃에서 저장된 백신은 최고의 용량에서 총 보호를 유도하였으며, 더 낮은 용량에서는 마우스에서 부분적인 보호를 유도하였다.
도 15는 무-배양, 40℃에서 1 주일 및 1 개월 배양 후에 각각의 백신에 대해 1 회 주사 후 (3 주일) 및 2 회 주사 후 (5 주일)의 rRTA 항체 역가를 나타낸다. 평균 역가는 이들 마우스의 표준 편차로 응답한 마우스 만의 평균으로 나타낸다.
도 16은 면역된 마우스로부터의 종말점 역가 데이터를 나타낸다. 종말점 역가 = 상호 종말점 (reciprocal endpoint) 항-RTA 역가. 중화 IC50 역가 = 리신 세포독성으로부터 웰 내의 세포의 50%를 보호하는데 필요한 혈청의 희석도. 여기에 나타내지 않았지만, 샴 면역된 마우스 (#1-10 (5는 제외) 중의 어떤 것도 그들의 혈청에서 어떤 항-RTA 역가를 갖지 않았다. # 1 샴 면역된 마우스 혈청은 또한, 시험관내에서의 중화능에 대해서 시험하였으며, 세포를 보호하지 않았다.
도 17은 동결건조 전의 흡착된 액체 백신에 의한 스위스 웹스터 마우스의 2 번째 백신접종 후에 개개 혈청으로부터 수득된 총 및 중화 역가를 나타낸다.

정의

트레할로즈 데하이드레이트 (고순도, 저 내독소)는 Ferro Pfanstiehl (Cleveland, OH)로부터 수득하였다. 아르기닌, 글리신, 히스티딘, 나트륨 시트레이트, 및 암모늄 아세테이트는 Sigma Chemical Company (St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 브렌타그 바이오섹터 (Brenntag Biosector)에 의해서 만들어진 알하이드로겔 (Alhydrogel™) 2.0% (알루미늄 하이드록사이드 보조제)는 E.M. Sergeant Pulp & Chemical Co, Inc. (Clifton, NJ)를 통해서 구입하였다. 3-㎖ 및 5-㎖ 동결건조 바이알 및 캡은 West Pharmaceutical Services로부터 입수하였다.

샘플 제조

다양한 농도의 트레할로즈 (0-15 w/v%)를 함유하는 수용액을 제조하였다. 다른 식으로 나타내지 않는 한, 샘플은 pH 6.0의 10 mM 완충액 (지시된 바와 같음) 중에서 제조하였으며, 1 ㎎/㎖ Al (알하이드로겔로서)을 함유하였다. 샘플은 1-미리 분취액으로 가공하였다. 보조제를 제외하고는, 모든 수용액을 제제화하기 전에 0.2 ㎛ 필터를 통해서 통과시켰다.

표면 전하 제타 전위

제타 전위는 정전기적 상호작용을 프로브화하기 위하여 다양한 제제 내의 알루미늄 하이드록사이드 (알하이드로겔)의 현탁액에 대해서 측정되었다. 그 후, 항원이 없는 제제를 제조하여 냉동 건조 중에 나타나는 입자의 응집 여부를 측정하였다. 1 ㎎ Al/㎖의 농도의 알하이드로겔을 0-12 w/v% 범위의 안정화제 트레할로즈와 함께 pH 6의 10 mM 완충액 (글리신, 아르기닌, 히스티딘, 암모늄 아세테이트, 나트륨 시트레이트) 중에서 조합하였다. 냉동의 속도가 입자 응집에 영향을 미치는지 여부를 측정하기 위해서, 제제를 냉동의 4 가지 방법을 사용하여 냉동 건조시켰다: 일차 및 이차 건조 전의 실온 트레이 냉동, -10℃ 전-냉각된 트레이 냉동, 액체 질소 침지 냉동, 및 액체 질소 스프레이 냉동. 단백질을 또한 제제에 첨가하여 냉동 건조 및 재구성 후의 입자 크기에 대한 그의 효과를 조사하였다. 0.04-2000 ㎛의 범위의 입자 크기 분포는 각각의 제제에 대한 레이저 회절에 의해서 특정화되었다.

동결건조

FTS 시스템인 리오스타 (Lyostar) 동결건조기가 샘플을 냉동-건조시키기 위해서 사용되었다. 샘플을 가장 느린 것으로부터 가장 빠른 것으로 다음과 같은 다양한 냉각 속도로 냉동시켰다: (i) 실온에서 제조된 바이알을 동결건조기 트레이 상에 배치하고, 실온에서 1 시간 동안 유지시킨 후에 샘플을 동결건조기 내에 배치하고, 1 시간 동안 -10℃의 선반 온도에서 평형화시킨 다음에, 선반을 0.5℃/분으로 -40℃까지 냉각시킴으로써 (ii) 냉동을 개시하였다 ("-10 전-냉각된 트레이-냉동"); (ii.) 바이알의 바닥을 액체 N₂ 내에 액침시킴으로써 냉동 (LN2 침지 냉동 건조); 및 (iii.) ~20 ㎕ 소적을 액체 N₂에 적하함으로써 스프레이-냉동 (LN2 스프레이 냉동 건조). 트레이-냉동 및 액체 N₂-액침된 샘플은 3-㎖ 동결건조 바이알 내에서 가공하는 반면에, 스프레이-냉동된 샘플은 5-㎖ 동결건조 바이알 내에서 가공하였다. 액체 N₂를 사용하여 냉동시킨 샘플을 함유하는 바이알을 -40℃로 전-냉각된 동결건조기 선반 상에 배치된 동결건조기에 빠르게 옮겼다. 샘플은 서로 분리되고, 물을 함유하는 바이알의 열로 둘러싸이도록 동결건조기 내에서 공간을 정하였다.

샘플의 일차 건조는 선반 온도를 -20℃로 설정하고, 60 mTorr에서 진공을 20 시간 동안 적용함으로써 달성되었으며, 이어서 선반 온도를 0.2℃/분의 속도로 -20℃로부터 0℃로, 0.5℃/분의 속도로 30℃로 상승시키고, 마지막으로 30℃에서 5 시간 동안 유지시키는 이차 건조를 수행하였다. 샘플을 진공 하에서 밀봉시키고, 분석하기 전에 DI 물로 재구성하였다. 냉동 및 건조 사이클의 변이는 도 10에 도시된다.

입자 크기 분포

입자 크기 분포 (PSD)는 베크만-코울터 (Beckman-Coulter) LS230 레이저 회절 입자 크기 분석기를 사용하여 측정되었다. 3개의 1-㎖ 샘플이 각각의 주행(run)에 필요하였으며, 각각의 주행의 3회의 반복이 제제에 대해서 완료되었다. 보고된 PSD는 가중된 표면적이며, 3회 주행의 합성 함수이다.

실시예

I. 입자의 다양한 침강시간에 의한 -10℃ 전-냉각된 트레이 냉동 건조

pH 6.0의 10 mM 히스티딘 완충액, 알하이드로겔로부터의 1 ㎎/㎖ Al, 및 0, 4, 8 또는 12 w/v% 트레할로즈를 조합하고, 4℃에서 30분 동안 빙글빙글 회전시켰다. 1 ㎖의 용액을 각각 3 ㎖의 유리 냉동 건조 바이알에 배치하였다. 제제를 냉동 건조기 내의 -10℃ 전-냉각된 선반 상에 배치하고, 이하의 표에서와 같이 냉동 건조시켰다. 냉동 건조 후에, 챔버를 건조 질소 가스로 역충전하고, 바이알을 밀봉하였다.

[표 1]

입자 크기 분석

입자 크기 분석은 냉동 건조시키기 전의 용액에 대해서뿐만 아니라 1 ㎖의 DI 물로 재구성된 냉동 건조된 샘플에 대해서 수행되었다. 레이저 회절 입자 크기 분석은 베크만 (Beckman)에 의해서 만들어진 LS 230 장치를 사용하여 수행되었다. 분석을 위해서, 샘플 챔버에 대한 초음파처리는 수행되지 않았다. 입자 크기 분포를 계산하기 위해서 사용된 모델은 1.33의 용액 굴절률 및 1.57의 샘플 굴절률을 사용하였다. 판독을 하기 전에 분석기 내의 여과된 DI 물에 약 6 ㎖의 샘플을 첨가하는 것이 필요하였다. 각각의 주행을 위해서, 3개의 90초 평균화된 입자 크기 분포를 채택하였다. 각각의 제제에 대해서 3회의 주행을 수행하였다.

결과

제제가 고농도의 트레할로즈 (8-12 w/v%)를 함유한다면, 초기 입자 크기 분포는 도 1에 나타낸 바와 같이 유지될 수 있었다.

II. -10℃ 전-냉각된 트레이 냉동 건조

0.26 ㎎/㎖ rRTA의 존재 및 부재 하에서 10 mM 완충액, 알하이드로겔로부터 1 ㎎/㎖ Al, 10 w/v% 트레할로즈를 조합하고, 4℃에서 30분 동안 빙글빙글 회전시켰다. 1 ㎖의 용액을 각각 3 ㎖의 유리 냉동 건조 바이알에 배치하였다. 제제를 냉동 건조기 내의 -10℃ 전-냉각된 선반 상에 배치하고, 이하의 표에서와 같이 냉동 건조시켰다. 냉동 건조 후에, 챔버를 건조 질소 가스로 역충전하고, 바이알을 밀봉하였다.

[표 2]

입자 크기 분석

입자 크기 분석은 냉동 건조시키기 전의 용액에 대해서뿐만 아니라 1 ㎖의 DI 물로 재구성된 냉동 건조된 샘플에 대해서 수행되었다. 레이저 회절 입자 크기 분석은 베크만에 의해서 만들어진 LS 230 장치를 사용하여 수행되었다. 분석을 위해서, 샘플 챔버에 대한 초음파처리는 수행되지 않았다. 입자 크기 분포를 계산하기 위해서 사용된 모델은 1.33의 용액 굴절률 및 1.57의 샘플 굴절률을 사용하였다. 판독을 하기 전에 분석기 내의 여과된 DI 물에 약 6-7 ㎖의 샘플을 첨가하는 것이 필요하였다. 각각의 주행을 위해서, 3개의 90초 평균화된 입자 크기 분포를 채택하였다. 각각의 제제에 대해서 3회의 주행을 수행하였다.

결과

존재하는 rRTA 단백질의 존재 및 부재 하 둘 다에서 10 w/v% 트레할로즈를 함유하는 아르기닌, 히스티딘, 및 글리신 완충액 중에서, 입자 크기 분포는 냉동 건조시키기 전, 및 냉동 건조시키기 전에 -10℃ 전-냉각된 선반을 사용한 후에 유지될 수 있었다. 입자 크기 분포는 도 1-3에서 볼 수 있다. 보조제 입자는 전-냉각된 선반을 사용한 경우에 제제를 냉동시키기 전에 침강하기까지의 시간이 더 작았기 때문에, 입자 크기 분포는 아마도 트레이 냉동 건조보다는 냉동 건조시키기 전에 전-냉각된 선반을 사용함으로써 더 잘 유지될 수 있었다.

III. 냉동 건조 전의 3시간, 30분 및 0 시점에서 입자의 다양한 침강 시간에 의한 -10℃ 전-냉각된 트레이 냉동 건조

pH 6.0의 10 mM 히스티딘 완충액, 알하이드로겔로부터의 1 ㎎/㎖ Al, 및 0 또는 8 w/v% 트레할로즈를 조합하고, 4℃에서 30분 동안 빙글빙글 회전시켰다. 1 ㎖의 용액을 각각 3 ㎖의 유리 냉동 건조 바이알에 배치하였다. 바이알을 냉동 건조기 내에 배치하기 전에 3시간, 30분 및 0분 동안 정치시키도록 한 3개의 그룹으로 분류하였다. 일단 바이알이 충진되면, 이들은 냉동 건조기 내에 부하시킬 시간까지 4℃에서 정치시켰다. 제제를 냉동 건조기 내의 -10℃ 전-냉각된 선반 상에 배치하고, 이하의 표에서와 같이 냉동 건조시켰다. 냉동 건조 후에, 챔버를 건조 질소 가스로 역충전하고, 바이알을 밀봉하였다.

[표 3]

입자 크기 분석

입자 크기 분석은 냉동 건조시키기 전의 용액에 대해서뿐만 아니라 1 ㎖의 DI 물로 재구성된 냉동 건조된 샘플에 대해서 수행되었다. 레이저 회절 입자 크기 분석은 베크만에 의해서 만들어진 LS 230 장치를 사용하여 수행되었다. 분석을 위해서, 샘플 챔버에 대한 초음파처리는 수행되지 않았다. 입자 크기 분포를 계산하기 위해서 사용된 모델은 1.33의 용액 굴절률 및 1.57의 샘플 굴절률을 사용하였다. 판독을 하기 전에 분석기 내의 여과된 DI 물에 약 6 ㎖의 샘플을 첨가하는 것이 필요하였다. 각각의 주행을 위해서, 3개의 90초 평균화된 입자 크기 분포를 채택하였다. 각각의 제제에 대해서 3회의 주행을 수행하였다.

결과

샘플을 냉동 건조기 내에 배치하기 전에, 이들은 0분, 30분 또는 3시간 동안 침강하도록 하였다. 도 5에서는, 10 mM 히스티딘 중에 알하이드로겔로부터의 1 ㎎/㎖ Al을 함유하는 바이알을 침강 중의 다양한 시점에서 나타낸다. 침강이 없이 제제는 용액 전체적으로 혼탁한 것으로 보인다 (도 5a). 침강의 30분 후에, 대부분의 알하이드로겔 입자는 상기의 약하게 혼탁한 용액과 함께 바이알의 바닥에 가까운 것으로 보인다 (도 5b). 침강의 3 시간 후에, 알하이드로겔 입자는 바이알의 바닥에 더 가깝게 침강하였으며, 알하이드로겔 층 위에 맑은 용액이 남는다 (도 5c).

제제가 트레할로즈가 없이 알하이드로겔 및 히스티딘을 함유한 경우에, 입자 크기 분포는 초기 입자 크기 분포로부터 더 큰 입자 쪽으로 이동하였다 (도 6). 더 적은 시간 동안 침강하도록 한 제제는 더 장시간 동안 침강하도록 한 경우보다 약간 더 작은 입자를 생산하였다.

제제가 8 w/v% 트레할로즈를 함유한 경우에, 샘플을 냉동 건조기 내에 배치하기 전에 침강하도록 허용한 시간의 양은 입자 크기 분포에 영향을 미쳤다 (도 7). 제제를 냉동 건조기 내에 배치하기 전에 침강하도록 허용하지 않은 경우에, 입자 크기 분포는 냉동 건조 전의 초기 입자 크기 분포와 매우 유사하였다. 침강 30분 후에, 입자 크기 분포는 더 큰 입자 크기 쪽으로 이동하기 시작하며, 침강 3시간째에 입자는 초기 입자 크기 분포보다 상당히 더 크다.

트레할로즈를 갖는 제제를 트레할로즈가 없는 것과 비교하면, 제제 내에서 트레할로즈의 존재는 냉동 건조 공정 후에 입자 크기 분포를 유지시킨다. 비록 냉동 건조 전의 초기 평균 입자 크기는 제제 내에 존재하는 트레할로즈의 존재 및 부재 하에서 동일하지만, 냉동 건조 후의 평균 입자 크기는 도 8에서 볼 수 있는 바와 같이, 냉동 건조 전에 침강의 각각의 양에서 제제 내에 트레할로즈가 존재하는 경우에 더 작았다. 이들 실험으로부터, 본 발명자들은 또한 초기 입자 크기를 유지시키는 것이 바람직하다면, 냉동 건조기 내에 부하시키기 전에 샘플이 침강하도록 허용하지 않는 것의 중요성을 볼 수 있었다.

IV. 실험 동물에서 리신 백신 서브유니트의 면역원성

예로서, 열안정성인 동결건조된 리신 서브유니트 백신을 구성하여 시험하였다. 리신 A 쇄 백신이 사용되었으며, 이는 이것이 수성 완충액 중에서 응집 및 변성을 받기 쉽고, 면역원성 및 리신 독소 노출에 대한 보호에 포함되는 중화 항체의 유도에 영향을 미치는 구조적 일체성을 상실하기 쉽기 때문이다. 동결건조된 리신 백신은 다음과 같이 제조되었다. 글리세롤에 용해된 RTA를 10 mM 히스티딘 완충액, pH 6.0에 대해서 투석하여 글리세롤을 제거하였다 (도 11). 액체 현탁액 백신을 바이알 내에 넣고, 도 10에 기술된 바와 같이 동결건조에 적용하여 -10℃에서 전냉각된 냉동 건조를 -40℃에서 일차 냉동 건조를 개시하기 전의 실온에서의 백신과 비교하였다. 건조된 백신을 냉장고 온도 (4-8℃) 또는 상승된 온도 (40-60℃)에서 저장하였다. 저장된 동결건조 백신으로부터 샘플을 주기적으로 배출시키고, R70으로 불리는 진단용 모노클로날 항체의 결합을 평가함으로써 구조적 일체성에 대해 시험하였다 (Neal, O'Hara et al., 2010, A monoclonal immunoglobulin G antibody directed against an immunodominant linear epitope on the ricin A chain confers systemic and mucosal immunity to ricin, Infect Immun, 78:552-61). 또한, 백신을 알루미늄에 결합된 단백질의 삼차 구조의 고유 형광 진단의 측정, 잔류수 (residual water)의 측정, 및 마우스에서의 면역원성/효능을 포함한 추가의 생물물리학적 시험에 적용하였다. 면역원성은 스위스 웹스터 마우스를 이하에서와 같이 주사하고, ELISA 및 리신 중화 항체의 측정에 의해서 백신에 대한 총 항체를 측정함으로써 결정되었다. 마우스를 35일째에 10×LD50 용량의 독소의 주사에 의해서 리신 독소에 노출시키고, 노출된 동물에서 치사율을 측정하였다. 또한, 백신접종 및 대조군 마우스로부터의 혈청을 RTA 분자를 포함하는 중복성 펩타이드에 대한 반응에 관하여 평가하는 펩타이드 스캔을 수행하였다. 이것을 수행하여 면역우성 지역, 및 고온 및 저온 저장 조건 중에서의 그들의 보존을 측정하였다. 대조군 액체 백신을 사용하여 근육내 주사에 의해서 마우스를 3× 백신접종한 경우에, 40℃에서 한달 동안의 백신의 배양은 면역원성 및 방어 면역성을 유도하는 능력의 상실을 야기하였다 (도 14).

연구 중에, 각각의 스위스 웹스터 마우스는 3 회 출혈시켰으며, 백신 제제로 2 회 주사하였다. 초기 주사하기 전에, 마우스를 출혈시킨 다음, 0일에 백신 제제로 주사하였다. 초기 출혈은 각각의 마우스가 그 자신의 기준선에 있을 수 있도록 하는데 필요하였다. 21일 후에 마우스를 출혈시키고, 부스터 (booster) 백신 제제로 주사하였다. 초기 주사한 지 35일 후에 마우스를 마지막으로 한번 출혈시켰다. 출혈 절차 전에, 마우스는 이소플루오란 흡입제를 사용하여 마취시켰다. 혈액은 마우스의 후-안와 정맥동 (retro-orbital venous sinus)으로부터 뽑아내었다. 혈액을 뽑아 낸 눈에 프로파라카인의 점적제를 적용하고, 혈액은 50 ㎕ 모세관을 사용하여 수거하였다. 매회의 출혈 중에 약 100-200 ㎕의 혈액을 뽑아 내었었다.

[표 4]

제제 입자 크기에서의 변이를 만들기 위해서, 히스티딘 및 암모늄 아세테이트와 같은 상이한 완충제 및 냉동 건조 전의 냉동 속도의 변이 (예를 들어, 냉동 건조 전에 실온 선반 또는 전-냉각된 선반)가 사용되었다. 모든 샘플은 디사카라이드 트레할로즈를 15% (w/V)까지 함유하였으며, 알하이드로겔은 0.85-1 ㎎/㎖ 총 알루미늄으로 사용된 알루미늄 하이드록사이드 백신 보조제이다.

V. 흡착된 리신 백신의 조절된 동결건조

본 발명의 중심 목적은 사용 시점에 물로 재구성하기 위하여 단백질, 알루미늄 보조제 및 면역자극제 성분의 조절된 동결건조를 사용함으로써 서브유니트 백신을 제조하는 것이다. 알루미늄 보조제를 사용하여, 지금까지는 한편으로 백신 유효성의 상실이 없고, 총체적인 클럼핑 (clumping) 및 적절한 재수화의 불가능성이 없이 이들 성분을 함께 적절하게 조합하는 것은 실행할 수 없었거나 불가능하였다. 동결건조 사이클에서 완충제 조건, 염 조건 및 동결건조 사이클 조건을 검사하는 시점을 정확하게 조절하기 위한 다수의 상이한 조건들을 검사하고, 본 발명자들은 동결건조 전 및 후의 단백질 구조를 포함한 총체적 일체성을 보유하기 위한 조건을 정의할 수 있었음을 보고하였다.

VI. 원형 냉동 건조된 백신의 생성

일련의 냉동 건조된 제제는 표 1에 제시된 일반적인 동결건조 계획에 따라 제조하였다. 10 mM 히스티딘 또는 암모늄 아세테이트 완충제 pH 6 중에 1.0 ㎎ Al/㎖, 8 w/v% 트레할로즈 및 0.2 또는 0 ㎎/㎖ rRTA를 함유하는, RTA 단백질을 갖는 냉동 건조된 제제 및 단백질이 없는 위약 제제를 동결건조 전의 전-냉각 (PC) 또는 동결건조 전의 실온 배양에 의해서 생성시켰다. 제제는 단백질이 알하이드로겔 보조제에 흡착하도록 교반 막대로 4-8℃에서 1시간 동안 혼합시킴으로써 제조되었다. 1 ㎖의 제제를 3 ㎖ 유리 바이알 내에 넣고, 표 4에 기술된 바와 같이 냉동 건조시켰다. 각각의 공정 조건으로부터의 샘플을 40℃에서 배양하고, 분석 및 백신접종 연구를 위해 1주일, 1개월째에 (6개월까지 계속해서) 배출시켰다. 전- 및 후-동결건조 샘플을 또한 수득하였다.

[표 5]

냉동 건조 사이클

VII. 재구성된 건조된 백신의 입자 크기 분석

입자 크기 분석은 냉동 건조시키기 전의 용액에 대해서뿐만 아니라 1 ㎖의 탈이온수 중에서 재구성된 냉동 건조된 샘플에 대해서 수행되었다. 레이저 회절 입자 크기 분석은 베크만에 의해서 만들어진 LS 230 장치를 사용하여 수행되었다. 분석을 위해서, 샘플 챔버에 대한 초음파처리는 수행되지 않았다. 입자 크기 분포를 계산하기 위해서 사용된 모델은 1.33의 용액 굴절률 및 1.57의 샘플 굴절률을 사용하였다. 판독을 하기 전에 분석기 내의 여과된 DI 물에 약 6 ㎖의 샘플을 첨가하는 것이 필요하였다. 각각의 주행을 위해서, 3개의 90초 평균화된 입자 크기 분포를 채택하였다. 각각의 제제에 대해서 3회의 주행을 수행하였다. 위약 안정성 연구 샘플의 입자 크기 분포는 레이저 회절을 사용하여 모니터링한다. 초기 시간 0 액체 제제는 모두 표 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 표면적에 기초하여 유사한 입자 크기 분포 및 평균 입자 크기를 가졌다. 제제가 실온으로부터 트레이 냉동 건조되었다면, 입자 크기에서의 증가가 나타났다. 제제가 -10℃ 전-냉각된 선반으로부터 트레이 냉동 건조되었다면, 입자 크기 분포는 초기 입자 크기 분포와 매우 유사하게 유지되었다.

[표 6]

표면적에 기초한 평균 입자 크기±표준 편차

VIII. 동물의 백신접종

5-6 주령의 암컷 스위스 웹스터 마우스를 0 및 20일에 10 마이크로그램의 RTA 단백질을 함유하는 50 ㎕의 지시된 제제에 의해서 피하로 백신접종하였다. 이소플루란에 의한 마취 하에서 마우스를 후-안와 공동 (retro orbital cavity)을 통해서 출혈시켜 0, 20 및 34일에 약 200 ㎕의 혈액을 수거하였다. 각각의 그룹에서 10 마리의 마우스가 사용되었다. 마우스는 케이지 (cage) 당 5 마리씩 수용하고, 먹이와 물은 언제나 허용하였다. 혈청은 4℃에서 14분 동안 10,000 rpm으로 원심분리시킴으로써 혈액으로부터 분리시켰다.

백신접종된 스위스 웹스터 마우스로부터의 개별적인 혈청 내의 RTA에 대한 총 항체는 ELISA 및 중화 항체 측정에 의해서 측정되었다 (도 6 및 7). 눈크 편평 바닥 맥시소브 (Nunc flat bottom MaxiSorb) 96 웰 플레이트를 PBS 중에서 1 ㎕ rRTA/㎖로 희석된 저장 단백질 50 ㎕/웰로 코팅하고, 2-6℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 0.05% 트윈 20을 함유하는 300 ㎕/웰의 PBS로 4회 세척하였다. 플레이트를 1% BSA를 함유하는 300 ㎕/웰의 PBS로 차단하고, 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 플레이트를 전술한 바와 같이 세척하였다. 1% BSA 및 0.05% 트윈 20을 함유하는 40 ㎕의 PBS를 각각의 웰에 첨가하였다. 혈청은 초기에 1% BSA 및 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS의 희석 완충액 중에서 희석시켰다. 70 ㎕의 샘플을 출발 웰에 첨가한 다음에, 각각의 샘플에 대해서 7 개의 플레이트-내 (in-plate) 2.33-배 희석액을 생성시켰다. 그 후, 플레이트를 실온에서 2 시간 동안 배양하였다. 플레이트를 다시 세척하였다. 10,000 배 희석된 40 ㎕의 HRP-컨주게이트된 당나귀 항-마우스 항체를 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 플레이트를 다시 세척하였다. TMB를 각각의 웰에 40 ㎕로 첨가하고, 30분 동안 배양하였다. 2 N 황산의 정지 용액 (stop solution)을 40 ㎕로 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 450 ㎚에서 판독하였다. 백신접종된 마우스로부터의 개별적인 혈청 샘플의 종말점 희석 분석 (endpoint dilution analysis)은 도 15에 나타내었다. 시험한 백신은 다음과 같이 요약된다:

RT His - 음성 대조군 (단백질이 없이 히스티딘 중에서 실온 트레이 냉동 건조됨)

RT AA - 음성 대조군 (단백질이 없이 암모늄 아세테이트 중에서 실온 트레이 냉동 건조됨)

His + rRTA 액체 - 양성 대조군 (단백질을 함유하는 히스티딘 중의 액체 제제)

RT His + rRTA - 실험 1 (단백질을 함유하는 히스티딘 중에서 실온 트레이 냉동 건조됨)

RT AA + rRTA - 실험 2 (단백질을 함유하는 암모늄 아세테이트 중에서 실온 트레이 냉동 건조됨)

RPC His + rRTA - 실험 3 (단백질을 함유하는 히스티딘 중에서 전-냉각된 트레이 냉동 건조됨)

PC AA + rRTA - 실험 4 (단백질을 함유하는 암모늄 아세테이트 중에서 전-냉각된 트레이 냉동 건조됨)

백신을 40℃에서 1 주일 또는 1 개월 동안 저장한 경우에, 40℃에서 저장하지 않고 제조된 백신 (도 15에서 시간 0)과 관련해서 10 마이크로그램을 1 회 주사 (3 주일 역가) 또는 2 회 주사 (5 주일)한 후에 RTA에 대한 항체를 생성시키는 백신의 능력 (ELISA에 의함)에는 유의적인 차이가 없었다. 3 주일째에, 각각의 실험 그룹 및 양성 대조군 그룹에서는 마우스의 90-100%가 반응하였으며, 5 주일까지는 모든 실험 그룹 및 양성 그룹이 반응하였다 (표 3). 더욱 중요하게는, 포스트 (post) 2 (5 주일)로부터 수득된 혈청은 리신을 중화시키는 (시험관내에서)항체를 함유하였으며, 여기에서 역가 및 이러한 역가를 갖는 마우스의 비율은 시간 0 백신 (도 16) 또는 액체 백신 (도 17)과 분명하게 상이하지 않았다. 추가로, 중화 역가는 40℃에서 1 개월 동안 동결건조된 RTA 백신을 저장한 후에, 냉동 건조 전에 실온 트레이 상에 배치한 소정의 백신을 제공한 마우스로부터의 혈청에서 감소하였다. 그에 반해서, 냉동 건조시키기 전에 전냉각시킴으로써 제조된 백신은 액체 백신으로 면역시킨 경우보다 더 우수한 총 및 중화 항-RTA 역가를 가졌다.

[표 7]

3 주일 및 5 주일 후에 백신에 반응한 마우스의 수

IX. 이차 공동-보조제를 함유하는 백신에 의한 동물의 백신접종

일련의 냉동 건조된 제제를 표 1에 제시된 일반적으로 동결건조 계획에 따라 제조하였다. 1.0 ㎎ Al/㎖, 8 w/v% 트레할로즈 및 0.2 또는 0 ㎎/㎖ rRTA, 및 Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)로부터 입수한 60 마이크로그램의 TLR-4 아고니스트인 PHAD로 불리는 모노포스포릴 지질 A (MPL)의 합성 유도체를 함유하는, RTA 단백질을 갖는 냉동 건조된 제제 및 단백질이 없는 위약 제제를 생성시켰다. 백신은 몇 가지의 상이한 방식으로 제조되었다. 방법 (1)에서는, RTA 단백질을 8% 트레할로즈의 존재 하에서 10 mM 히스티딘 또는 암모늄 아세테이트 완충액 pH 6 중의 알루미늄 하이드록사이드에 흡착 (결합)시키고, 이어서 PHAD 아고니스트를 수성 현탁액에 첨가하였다. 이 방법의 경우에, 10 mM 히스티딘, pH 6.0, 및 144 mM NaCl로 구성된 안정화제 완충액 중에서 저장된 RTA는 알루미늄 보조제에 흡착시키기 전에 무-글리세롤 및 무-염 완충액 내에서의 투석에 적용하였다. 방법 (2)에서는, 희석된 안정화 완충액에 알루미늄을 첨가하기 전에 안정화 글리세롤 완충액 중에서 저장된 RTA를 10 mM 히스티딘, pH 6.0, 144 mM NaCl에 10배 희석시켰다. 이 방법의 경우에는, 95% 이상의 RTA가 알루미늄 겔 입자에 결합되도록 흡착이 4℃에서 5시간 동안 일어나도록 하였다. 이어서, 알루미늄 입자가 흡착 용기의 바닥에 침강하도록 하거나, 혼합물을 원심분리에 적용하여 수성 완충액으로부터 입자를 분리시켰다. 알루미늄 혼합물에 8% 트레할로즈를 함유하는 완충제 시스템 (암모늄 아세테이트 또는 히스티딘)을 첨가하였다. 이 방식으로, 시스템의 등장성이 유지될 수 있었다. 방법 1 및 방법 2의 경우에, 후속 동결건조는 동결건조 전의 전-냉각 (PC) 또는 동결건조 전의 실온 배양으로 이어졌다.

각각의 공정 조건으로부터의 샘플을 4℃ 및 40℃에서 배양하고, 분석 및 백신접종 연구를 위해 1 주일, 1 개월, 2 개월, 3 개월, 6 개월, 9 개월, 12 개월, 18 개월, 및 24 개월째에 배출시켰다. 효력 분석을 위해서, 스위스 웹스터 마우스는 보조제 성분 (알루미늄 및 PHAD)을 일정하게 유지시키면서 RTA 면역원의 용량을 변화시키는 농도 범위로 백신접종하였다. 대조 시험을 위해서, 마우스를 PHAD 함유 동결건조된 백신과 동일 용량 범위를 사용하여 공동-보조제 PHAD를 함유하지 않는 백신으로 백신접종하였다. 두 가지 백신접종 프로토콜이 사용되었다.

한 세트의 마우스는 시험 제1일에 1 용량의 백신으로 백신접종하였으며, 또 다른 세트의 마우스는 시험 제1 및 21일에 백신으로 백신접종하였다. 혈청은 각각의 백신접종 시점 및 그로부터 2 주일 후에 동물로부터 수득되었다. 마지막 분석을 위해서, 마우스를 제35일에 10×LD 50의 리신 독소에 노출시키고, 생존수를 기록하였다. PHAD-함유 건조 재구성된 백신 샘플로 백신접종된 동물은 혈청학적 종말점 (총 RTA 반응성 항체 및 리신 중화 항체)에 관해서 RTA 면역원의 저용량쪽으로 용량 반응 곡선의 상당한 이동을 나타냈으며, 또한 공동-보조제가 없는 백신과 비교하여 리신 노출에 적용된 경우에 더 저용량 범위에서 보호 면역성을 나타내었다. 동등하게 유의적으로, 더 고온에서 배양된 백신 샘플은 또한 증진된 면역 반응을 나타내어, 백신의 모든 성분들이 안정화되었음을 시사하였다. 더욱이, PHAD 백신은 중화 항체의 더 큰 역가 및 중화 에피토프에 대한 더 광범위한 반응에 의해서 반영되는 더 광범한 면역 반응을 유도하였다.

X. 유리 전이 온도

유리 전이 온도 (Tg)는 백신 생성물의 안정성의 지표이다. Tg 이하 또는 그에 근접에서, 백신은 유리와 같이 행동하며, 백신의 모든 성분은 유리 내에서 안정화된다. Tg 이상에서, 샘플은 덜 안정하게 되며, 매트릭스 내의 성분들도 또한 덜 안정하게 된다. Tg는 다음의 방식으로 시차 주사 열량측정법 (differential scanning calorimetry)에 의해서 측정된다. 샘플의 Tg는 샘플을 10℃/분의 속도로 0℃로부터 150℃까지의 조절된 온도 프로그램에 적용함으로써 결정된다. 샘플에 대한 열 흐름을 측정하고, 기준선에서의 이동으로 표현한다. Tg는 기준선 이동의 중간점 (midpoint)에서의 온도로 표현된다.

DSC 분석에 적용된 동결건조된 RTA 백신은 100℃ 이상의 높은 유리 전이 온도 및 0.5% 미만의 수분 함량 (칼 피셔 (Karl Fischer) 분석)을 나타내었다.

본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 것으로서, 단수형은 복수형을 포함한다. 예를 들어, 용어 "하나" (a, an) 및 "상기" (the)는 내용이 다른 식으로 기술되지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 추가로, 일련의 요소들에 선행하는 용어 "적어도"는 일련의 요소들 중의 모든 요소를 언급하는 것으로 이해된다. 본 명세서에 예시적으로 기술된 본 발명은 여기에 구체적으로 기술되지 않는 어떤 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에서 적절하게 실행될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 용어 "포함하는 (comprising)", "포함하는 (including)", "함유하는 (containing)" 등은 제한이 없이 확장적으로 읽어야 한다. 추가로, 본 명세서에서 사용된 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명적 용어로 사용되며, 이러한 용어 및 표현의 사용 시에 앞으로 나타내고 기술되는 어떤 등가물 또는 그의 어떤 일부분을 제외할 의도는 없고, 다양한 변형이 특허청구된 본 발명의 범주 내에서 가능할 수 있는 것으로 인식된다. 따라서, 비록 본 발명이 바람직한 구체예 및 임의의 특징에 의해서 구체적으로 기술되었지만, 본 명세서에 기술된 발명의 변형 및 변이는 본 기술분야에서 숙련된 전문에 의해서 재분류될 수 있으며, 이러한 변형 및 변이는 본 명세서에 기술된 발명의 범주 내에 있다고 생각되는 것으로 이해된다. 본 발명은 본 명세서에 광범하게 일반적으로 기술되었다. 포괄적인 기술의 범주 내에 속하는 더 좁은 종 및 서브제네릭 그룹 (subgeneric groupings) 각각은 또한 이들 발명의 일부분을 형성한다. 이것은 제거된 대상이 거기에 구체적으로 존재하는지 아닌지와는 무관하게, 단서 또는 음성 제한으로 포괄적인 것으로부터 어떤 대상을 제거하면서 각각의 발명의 포괄적 설명을 포함한다. 또한, 본 발명의 특징 또는 관점이 마커쉬 (Markush) 그룹으로 기술되는 경우에, 본 기술분야에서 훈련된 전문가는 본 발명이 또한 이에 의해서 마커쉬 그룹의 모든 개별적인 구성원 또는 구성원의 서브그룹에 관해서 기술한 것으로 인식할 것이다. 또한, 상기의 설명은 설명을 하기 위한 것이고, 제한하고자 하는 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다. 다수의 구체예는 상기의 설명을 검토함으로써 본 기술분야의 전문가에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 범위는 상기의 설명을 참고 하여 결정되지 않아야 하며, 대신에 특허청구범위가 명시하는 것과 동등한 전체 범위와 함께 첨부된 특허청구범위를 참조하여 결정되어야 한다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 단지 일상적인 실험을 사용하여, 기술된 본 발명의 특정한 구체예에 대한 다수의 등가물을 인식하거나, 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 이하의 특허청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (29)

1. 면역학적으로-활성인 보조제-결합된 건조된 백신 조성물의 제조 방법으로서, 상기 방법은
   (a) (ⅰ) 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트 및 알루미늄 설페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 알루미늄-염 보조제; (ⅱ) 히스티딘을 포함하는 완충제; 또는 완충제 및 휘발성 염의 혼합물로서, 여기서 상기 완충제는 아세테이트, 석시네이트, 시트레이트, 프롤라민, 아르기닌, 글리신, 히스티딘, 보레이트, 카보네이트 및 포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 휘발성 염은 암모늄 아세테이트, 암모늄 포르메이트, 암모늄 카보네이트, 암모늄 비카보네이트, 트리에틸암모늄 아세테이트, 트리에틸암모늄 포르메이트, 트리에틸암모늄 카보네이트, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며; (ⅲ) 트레할로즈, 수크로즈, 만니톨 및 글리신, 하이드록시에틸 전분, 및 글리신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유리-형성제; 및 (ⅳ) 적어도 하나의 항원;을 제공하는 단계;
   (b) (a)를 함께 조합하여 액체 제제를 생성하는 단계;
   (c) (b)에서의 액체 제제를 냉동시켜 냉동된 제제를 생성하는 단계; 및
   (d) (c)에서의 냉동된 면역원성 제제를 동결건조시켜 건조된 면역원성 조성물을 생성하는 단계;를 포함하는 방법.
2. 청구항 1에 있어서,
   (ⅱ)에서 상기 휘발성 염은 암모늄 아세테이트인 방법.
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 알루미늄 염 보조제는 알루미늄 하이드록사이드인 방법.
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 유리-형성제는 트레할로즈, 수크로즈 및 하이드록시에틸 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
5. 청구항 1에 있어서,
   상기 유리-형성제는 트레할로즈인 방법.
6. 청구항 1에 있어서,
   상기 트레할로즈는 액체 제제 내에 5% 내지 20%의 중량-대-용적 농도로 존재하는 방법.
7. 청구항 1에 있어서,
   (a)는 (ⅴ) 지질 A, 지질 A 유도체, 모노포스포릴 지질 A, 모노포스포릴 지질 A의 화학적 유사체, CpG 함유 올리고뉴클레오타이드, TLR-4 아고니스트, 플라겔린, 그람 음성 세균 유래 플라겔린, TLR-5 아고니스트, TLR-5 수용체에 결합할 수 있는 플라겔린의 단편, 사포닌, 사포닌의 유사체, QS-21, 정제된 사포닌 분획, ISCOMS, 및 스테롤 및 지질과의 사포닌 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역학적으로 활성인 공동-보조제를 추가로 포함하는 방법.
8. 삭제
9. 청구항 1에 있어서,
   상기 냉동 단계는 트레이 냉동, 선반 냉동, 침지-냉동, 스프레이-냉동 및 쉘-냉동 중의 적어도 하나를 포함하는 방법.
10. 청구항 1에 있어서,
    상기 냉동 단계는 조성물의 냉동을 위해 전-냉각된 트레이를 사용하거나 선반을 사용하는 단계를 포함하는 방법.
11. 청구항 1에 있어서,
    상기 항원은 로타바이러스, 구제역 바이러스, 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스, H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7, 인간 파라인플루엔자 타입 2, 단순 포진 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스, 수두 바이러스, 돼지 헤르페스바이러스 1, 사이토메갈로바이러스, 리사바이러스, 바실러스 안트라시스, 탄저병 PA 및 유도체, 폴리오바이러스, 간염 A, 간염 B, 간염 C, 간염 E, 디스템퍼 바이러스, 베네주엘라 말 뇌척수막염, 고양이 백혈병 바이러스, 레오바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 라사열 바이러스, 폴리오마 종양 바이러스, 개 파르보바이러스, 유두종 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 우역 바이러스, 인간 리노바이러스 종, 엔테로바이러스 종, 멩고바이러스, 파라믹소바이러스, 닭 전염성 기관지염 바이러스, 인간 T-세포 백혈병-림프종 바이러스 1, 인간 면역결핍 바이러스-1, 인간 면역결핍 바이러스-2, 림프구성 맥락수막염 바이러스, 파르보바이러스 B19, 아데노바이러스, 풍진 바이러스, 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, 소 호흡기 합포체 바이러스, 코로나 바이러스, 보르데텔라 퍼튜시스, 보르데텔라 브론키셉티카, 보르데텔라 파라퍼튜시스, 브루셀라 아보르티스, 브루셀라 멜리텐시스, 브루셀라 수이스, 브루셀라 오비스, 브루셀라 종, 에스케리키아 콜라이, 살모넬라 종, 살모넬라 티피, 스트렙토코커스, 비브리오 콜레라, 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 시겔라, 슈도모나스, 결핵, 아비움, 바실 칼메테 구에린, 마이코박테리움 레프레, 뉴모코커스, 스타필로코커스, 엔테로박터 종, 로칼리마야 헨셀레, 파스튜렐라 헤몰리티카, 파스튜렐라 멀토시다, 클라미디아 트라코마티스, 클라미디아 프시타시, 림포그래뉼로마 베네륨, 트레포네마 팔리둠, 헤모필루스 종, 마이코플라즈마 보비게니탈륨, 마이코플라즈마 풀모니스, 마이코플라즈마 종, 보렐리아 버그도르페리, 레지오넬라 뉴모필라, 클로스트리디움 보툴리눔, 코리네박테리움 디프테리에, 예르시니아 엔터콜리티카, 리케치아 리케치, 리케치아 티피, 리케치아 프로우세키, 에를리키아 샤펜시스, 아나플라즈마 파고사이토필룸, 플라스모디움 팔시파룸, 플라스모디움 비박스, 플라스모디움 말라리에, 스키스토좀, 트리파노소마, 라이쉬마니아 종, 필라리알 네마토드, 트리코모나스증, 육포자충증, 테니아 사기나타, 테니아 솔륨, 라이쉬마니아, 톡소플라즈마 곤디, 트리키넬라 스피랄리스, 콕시듐증, 아이메리아 테넬라, 크립토코커스 네오포르만스, 칸디다 알비칸, 아스퍼질러스 푸미가투스, 콕시디오이데스 진균증, 나이세리아 고노레아, 말라리아 서컴스포로조이테 단백질, 말라리아 메로조이테 단백질, 트리파노소마 표면 항원 단백질, 백일해, 알파바이러스, 아데노바이러스, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 수막염균 외막 단백질, 스트렙토코커스 M 단백질, 인플루엔자 헤마글루티닌, 암 항원, 종양 항원, 독소, 클로스트리듐 퍼프린젠스 입실론 독소, 리신 독소, 슈도모나스 외독소, 외독소, 신경독소, 사이토카인, 사이토카인 수용체, 모노킨, 모노킨 수용체, 식물 화분, 동물 비듬, 및 먼지 진드기로 이루어진 군으로부터 선택되되거나, 이들로부터 유래되는 방법.
12. 청구항 1에 있어서,
    (a)에서 상기 알루미늄-염 보조제는 재구성시 감소된 응집을 갖는 방법.
13. 삭제
14. 청구항 1에 있어서,
    상기 건조된 조성물은 재구성되어 대상체에서 항원에 특이적인 체액성 면역 및/또는 세포-매개 면역을 포함하는 면역 반응을 유도하기 위한 재구성된 면역원성 조성물을 형성하는 방법.
15. 청구항 14에 있어서,
    상기 재구성된 조성물은 100 마이크로미터 미만의 평균 입자 직경을 갖는 보조제를 포함하는 방법.
16. (a) 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트 및 알루미늄 설페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 알루미늄-염 보조제;
    (b) 히스티딘을 포함하는 완충제; 또는 완충제 및 휘발성 염의 혼합물로서, 여기서 상기 완충제는 아세테이트, 석시네이트, 시트레이트, 프롤라민, 아르기닌, 글리신, 히스티딘, 보레이트, 카보네이트 및 포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 휘발성 염은 암모늄 아세테이트, 암모늄 포르메이트, 암모늄 카보네이트, 암모늄 비카보네이트, 트리에틸암모늄 아세테이트, 트리에틸암모늄 포르메이트, 트리에틸암모늄 카보네이트, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    (c) 트레할로즈, 수크로즈, 만니톨 및 글리신, 하이드록시에틸 전분, 및 글리신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유리-형성제; 및
    (d) 적어도 하나의 항원;을 포함하는 조성물.
17. 청구항 16에 있어서,
    (b)에서 상기 휘발성 염은 암모늄 아세테이트인 조성물.
18. 청구항 16에 있어서,
    휘발성 염을 포함하는 상기 완충제는 아세테이트, 석시네이트, 시트레이트, 프롤라민, 아르기닌, 글리신, 히스티딘, 보레이트, 카보네이트 및 포스페이트 완충제 중 적어도 하나를 포함하는 조성물.
19. 청구항 16에 있어서,
    상기 유리-형성제는 트레할로즈, 수크로즈 및 하이드록시에틸 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
20. 청구항 16에 있어서,
    상기 조성물은 지질 A, 지질 A 유도체, 모노포스포릴 지질 A, 모노포스포릴 지질 A의 화학적 유사체, CpG 함유 올리고뉴클레오타이드, TLR-4 아고니스트, 플라겔린, 그람 음성 세균 유래 플라겔린, TLR-5 아고니스트, TLR-5 수용체에 결합할 수 있는 플라겔린의 단편, 사포닌, 사포닌의 유사체, QS-21, 정제된 사포닌 분획, ISCOMS, 및 스테롤 및 지질과의 사포닌 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역학적으로 활성인 공동-보조제를 추가로 포함하는 조성물.
21. 삭제
22. 청구항 16에 있어서,
    상기 항원은 로타바이러스, 구제역 바이러스, 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스, H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7, 인간 파라인플루엔자 타입 2, 단순 포진 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스, 수두 바이러스, 돼지 헤르페스바이러스 1, 사이토메갈로바이러스, 리사바이러스, 바실러스 안트라시스, 탄저병 PA 및 유도체, 폴리오바이러스, 간염 A, 간염 B, 간염 C, 간염 E, 디스템퍼 바이러스, 베네주엘라 말 뇌척수막염, 고양이 백혈병 바이러스, 레오바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 라사열 바이러스, 폴리오마 종양 바이러스, 개 파르보바이러스, 유두종 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 우역 바이러스, 인간 리노바이러스 종, 엔테로바이러스 종, 멩고바이러스, 파라믹소바이러스, 닭 전염성 기관지염 바이러스, 인간 T-세포 백혈병-림프종 바이러스 1, 인간 면역결핍 바이러스-1, 인간 면역결핍 바이러스-2, 림프구성 맥락수막염 바이러스, 파르보바이러스 B19, 아데노바이러스, 풍진 바이러스, 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, 소 호흡기 합포체 바이러스, 코로나 바이러스, 보르데텔라 퍼튜시스, 보르데텔라 브론키셉티카, 보르데텔라 파라퍼튜시스, 브루셀라 아보르티스, 브루셀라 멜리텐시스, 브루셀라 수이스, 브루셀라 오비스, 브루셀라 종, 에스케리키아 콜라이, 살모넬라 종, 살모넬라 티피, 스트렙토코커스, 비브리오 콜레라, 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 시겔라, 슈도모나스, 결핵, 아비움, 바실 칼메테 구에린, 마이코박테리움 레프레, 뉴모코커스, 스타필로코커스, 엔테로박터 종, 로칼리마야 헨셀레, 파스튜렐라 헤몰리티카, 파스튜렐라 멀토시다, 클라미디아 트라코마티스, 클라미디아 프시타시, 림포그래뉼로마 베네륨, 트레포네마 팔리둠, 헤모필루스 종, 마이코플라즈마 보비게니탈륨, 마이코플라즈마 풀모니스, 마이코플라즈마 종, 보렐리아 버그도르페리, 레지오넬라 뉴모필라, 클로스트리디움 보툴리눔, 코리네박테리움 디프테리에, 예르시니아 엔터콜리티카, 리케치아 리케치, 리케치아 티피, 리케치아 프로우세키, 에를리키아 샤펜시스, 아나플라즈마 파고사이토필룸, 플라스모디움 팔시파룸, 플라스모디움 비박스, 플라스모디움 말라리에, 스키스토좀, 트리파노소마, 라이쉬마니아 종, 필라리알 네마토드, 트리코모나스증, 육포자충증, 테니아 사기나타, 테니아 솔륨, 라이쉬마니아, 톡소플라즈마 곤디, 트리키넬라 스피랄리스, 콕시듐증, 아이메리아 테넬라, 크립토코커스 네오포르만스, 칸디다 알비칸, 아스퍼질러스 푸미가투스, 콕시디오이데스 진균증, 나이세리아 고노레아, 말라리아 서컴스포로조이테 단백질, 말라리아 메로조이테 단백질, 트리파노소마 표면 항원 단백질, 백일해, 알파바이러스, 아데노바이러스, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 수막염균 외막 단백질, 스트렙토코커스 M 단백질, 인플루엔자 헤마글루티닌, 암 항원, 종양 항원, 독소, 클로스트리듐 퍼프린젠스 입실론 독소, 리신 독소, 슈도모나스 외독소, 외독소, 신경독소, 사이토카인, 사이토카인 수용체, 모노킨, 모노킨 수용체, 식물 화분, 동물 비듬, 및 먼지 진드기로 이루어진 군으로부터 선택되되거나, 이들로부터 유래되는 조성물.
23. 청구항 16에 있어서,
    상기 알루미늄 염 보조제는 알루미늄 하이드록사이드인 조성물.
24. 청구항 16에 있어서,
    상기 조성물은 냉동 상태인 조성물.
25. 청구항 24에 있어서,
    상기 냉동 조성물은 동결건조된 것인 조성물.
26. 청구항 24에 있어서,
    상기 알루미늄 염 보조제는 알루미늄 하이드록사이드인 조성물.
27. 청구항 25에 있어서,
    상기 동결건조된 조성물은 재구성되고, 상기 재구성된 면역원성 조성물 내의 보조제화 입자는 휘발성 염 완충제가 없는 조성물과 비교하여 감소된 응집을 갖는 조성물.
28. 청구항 25에 있어서,
    상기 동결건조된 조성물은 수성 희석제 내에서 재구성되는 조성물.
29. 청구항 28에 있어서,
    상기 수성 희석제 내에서 재구성된 조성물은 재구성된 백신 조성물을 포함하는 조성물.

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