ES2895941T3 - Activación de la inmunidad innata para una reprogramación nuclear mejorada de células somáticas con ARNm - Google Patents

Activación de la inmunidad innata para una reprogramación nuclear mejorada de células somáticas con ARNm Download PDF

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Abstract

Un método de reprogramación nuclear de una célula somática de mamífero, comprendiendo el método: poner en contacto una población de células somáticas de mamífero in vitro con (a) una dosis eficaz de un activador de la respuesta inmunitaria innata; y (b) una población de ARNm modificado (ARNmm), en donde al menos el 1 % de la población de ARNmm comprende trifosfato 5', codificar un cóctel de reprogramación o factores transcripcionales específicos de linaje; durante un período de tiempo suficiente para reprogramar o transdiferenciar dichas células somáticas de mamífero al tipo de célula de interés deseado; en donde el activador de la respuesta inmunitaria innata lo proporciona el propio ARNm modificado o un agonista de TLR3 o TLR4.

Description

DESCRIPCIÓN
Activación de la inmunidad innata para una reprogramación nuclear mejorada de células somáticas con ARNm
Apoyo gubernamental
La presente invención se realizó con soporte del Gobierno con la Subvención N.° HL100397 otorgada por el National Institutes of Health. El gobierno posee determinados derechos sobre la invención.
Antecedentes de la invención
Los estudios seminales de Yamanaka y sus colegas revelaron que la expresión ectópica de ciertos factores transcripcionales podría inducir pluripotencia en las células somáticas. Estas células madre pluripotenciales inducidas (CMPi) se autorrenuevan y se diferencian en una amplia variedad de tipos de células, lo que las convierten en una opción atractiva para terapias de medicina regenerativa específicas para enfermedades y pacientes. Se han utilizado para modelar con éxito enfermedades humanas y tienen un gran potencial para su uso en la detección de fármacos y la terapia celular específica del paciente. De forma adicional, las CMPi generadas a partir de células enfermas pueden servir como herramientas útiles para estudiar los mecanismos de la enfermedad y las posibles terapias. Sin embargo, queda mucho por entender acerca de los mecanismos subyacentes de la reprogramación de células somáticas en CMPi y existe preocupación con respecto a posibles aplicaciones clínicas en ausencia de conocimientos mecanicistas.
El conjunto de factores (FR) para la reprogramación a pluripotencia incluye Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4, Lin28 y Nanog. Oct3/4 y Sox2 son factores de transcripción que mantienen la pluripotencia en las células madre embrionarias (ME), mientras que Klf4 y c-Myc son factores de transcripción que se cree que aumentan la eficiencia de generación de CMPi. Se cree que el factor de transcripción c-Myc modifica la estructura de la cromatina para permitir que Oct3/4 y Sox2 accedan de manera más eficiente a los genes necesarios para la reprogramación, mientras que Klf4 mejora la activación de ciertos genes por Oct3/4 y Sox2. Nanog, como Oct3/4 y Sox2, es un factor de transcripción que mantiene la pluripotencia en las células ME, mientras que Lin28 es una proteína de unión al ARNm que se cree que influye en la traducción o estabilidad de ARNm específicos durante la diferenciación. Recientemente, se ha demostrado que la expresión retroviral de Oct3/4 y Sox2, junto con la coadministración de ácido valproico, un desestabilizador de cromatina e inhibidor de la histona desacetilasa, es suficiente para reprogramar fibroblastos en CMPi.
Para generar CMPi a partir de células somáticas, se han utilizado plásmidos o vectores virales para sobreexpresar alguna combinación de estos factores de reprogramación. Sin embargo, estos métodos dan como resultado una baja eficiencia de reprogramación y no proporcionan un control preciso del proceso de reprogramación. De forma adicional, estos métodos de reprogramación nuclear plantean intrínsecamente preocupaciones sobre la potencial tumorigenicidad y mutaciones de silenciamiento de genes causadas por la integración de ADN. La integración de ADN extraño en el genoma del hospedador a partir de una infección retroviral plantea la preocupación de que la integración de ADN extraño podría silenciar genes indispensables o inducir la alteración de la regulación de estos genes. Si bien se han utilizado la liberación de genes en el sitio Cre-LoxP o los enfoques de transposón PiggyBac para escindir el ADN extraño del genoma del hospedador después de la liberación de genes, ninguna estrategia elimina el riesgo de mutagénesis porque dejan un pequeño inserto de ADN extraño residual.
Recientemente, otra forma de reprogramación nuclear ha implicado la transdiferenciación de una célula somática en otra, utilizando un enfoque similar al de la generación de CMPi. Sin embargo, en este caso, la mayoría de los investigadores han utilizado factores de transcripción específicos de linaje que codifican ADN exógeno. También se puede emplear la expresión condicional de los factores de Yamanaka para inducir células "parcialmente reprogramadas" y luego mantener las células en un medio que favorezca la generación de la célula somática de interés. Véase Ginsberg et al. (2012) Cell 151(3):559-75; y Li et al. (2013) Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33(6):1366-75.
Otra forma de reprogramación nuclear está relacionada con la extensión de los telómeros. Generalmente, las células somáticas no tienen actividad telomerasa. Se puede emplear un activador de la inmunidad innata y la enzima telomerasa y/o su subunidad de ARN TERC, para aumentar la longitud de los telómeros. En este caso, el activador de la inmunidad innata mejora la extensión de los telómeros ya que aumenta la actividad de la telomerasa endógena y/o aumenta la plasticidad epigenética para que la enzima telomerasa pueda interaccionar de manera más eficiente con la región telomérica de los cromosomas.
Como alternativa a la reprogramación con ADN extraño, se han desarrollado enfoques que transfieren el ARNm que codifica factores de reprogramación en células somáticas. Un enfoque basado en ARNmm para la generación o transdiferenciación de CMPi en un tipo de célula somática diferente evita preocupaciones por la integración de ADN extraño y proporciona un mayor control sobre la concentración, la temporalización y la secuencia de estimulación del factor. La liberación citosólica de ARNm en células de mamíferos se puede lograr usando electroporación o formando complejos con el ARN y un vehículo catióni
exosomas, nanopartículas o micropartículas. Véanse, por ejemplo, Warren et al. (2010) Cell Stem Cell 7(5):618-630, revisión de Mandal and Rossi (20l3) Nat. Protocol. 8(3):568-582; y Yakubov et al. (2010) Biochem Biophys Res Commun. 394(1): 189-93. Para potenciar la actividad de la funcionalidad del ARNm, los ARN mensajeros sintéticos han incorporado modificaciones diseñadas para evitar las respuestas inmunitarias innatas. Usando reacciones de protección de cotranscripción in vitro, el ARNm sintético para estos fines incorpora normalmente un capuchón de guanina 5' sintetizado químicamente que es un homólogo estructural del capuchón de 7-metilguanosina [m7G(5')] natural. Este tipo de reacción de transcripción in vitro (IVT) de uso común, sin embargo, produce una fracción significativa de productos de ARN sin proteger cebados con trifosfatos de 5' que se asemejan a algunos ARN virales y bacterianos (véase Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, Pensilvania, ed. 5, 2007; y Bieger et al. (1989) J. Bacteriol. 171:141. Estos productos de ARN pueden inducir una señalización inmunitaria innata, ya que son sensores detectados para el ARNss 5' trifosfato, véase Fields Virology, D. Knipe, P. M. Howley, Eds.
Los enfoques de la técnica anterior han buscado reducir el perfil inmunogénico del ARN sintético mediante el tratamiento con fosfatasa para reducir la activación de las defensas antivirales y bacterianas por el ARN trifosfato 5' monocatenario. Las modificaciones adicionales para reducir las respuestas inmunitarias innatas al ARN transfectado pueden incluir la incorporación de bases de ribonucleósidos modificados, por ejemplo, 5-metilcitidina (5mC) para citidina y/o pseudouridina (psi) para uridina. Las células también se pueden cultivar en medios complementados con un receptor señuelo de interferón de tipo I, por ejemplo, la proteína vaccinia B18R.
Sin embargo, siguen existiendo problemas importantes en la práctica real de tales métodos. La presente invención aborda este problema.
Sumario de la invención
Aspectos de la invención se exponen en las reivindicaciones. Se proporcionan composiciones y métodos para la generación eficiente de células pluripotenciales inducidas o células transdiferenciadas o células somáticas con telómeros alargados, utilizando métodos no integradores, particularmente métodos basados en ARNm. En los métodos de la divulgación, una célula somática para la que se desea reprogramación a pluripotencia o transdiferenciación se pone en contacto con una dosis eficaz de un activador de la inmunidad innata, particularmente un activador de la vía PKR o sensores de patrones moleculares asociados a patógenos (tales como receptores de tipo toll, por ejemplo, TLR3) y/o patrones moleculares asociados al daño (tales como RAGE). La etapa de contacto puede realizarse antes, concurrentemente o después del contacto de la célula con factores de reprogramación no integradores, generalmente al mismo tiempo. Los factores de reprogramación no integradores se proporcionan como ARNm que codifica polipéptidos de acción nuclear que alteran la transcripción e inducen la reprogramación en las células diana. En alguna divulgación del presente documento, el factor de reprogramación es el ARNm que codifica uno o más de Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4, Lin28 y Nanog. En alguna divulgación del presente documento, los factores de reprogramación son ARNm que codifica factores de transcripción específicos de linaje que mejoran la transdiferenciación en otro tipo de células somáticas. En alguna divulgación del presente documento, los factores de reprogramación son ARNm que codifica la telomerasa y/o su subunidad de ARN TERC, y/o proteínas asociadas a los telómeros (por ejemplo, las proteínas shelterina). Convenientemente, la activación de la inmunidad innata la proporciona el propio ARNm.
En alguna divulgación del presente documento, el ARNm para reprogramación es una composición de ARNm modificado (ARNmm) que codifica uno o un cóctel de factores de reprogramación y que comprende una o más modificaciones, tales como nucleótidos no naturales. En alguna divulgación del presente documento, una parte de la composición de ARNmm comprende un trifosfato 5', que proporciona un activador de la inmunidad innata. La parte de la composición que comprende un trifosfato 5' puede ser de hasta aproximadamente 1 %, hasta aproximadamente 5%, hasta aproximadamente 10%, hasta aproximadamente 15%, hasta aproximadamente 20%, hasta aproximadamente 25 %, hasta aproximadamente 30 %, hasta aproximadamente 50 %, hasta aproximadamente 75 % y puede ser sustancialmente todo el ARNmm. En alguna divulgación del presente documento, la parte de ARNm que comprende un trifosfato 5' es de aproximadamente 5 % a aproximadamente 25 % y el resto de ARNmm en la composición comprende una estructura de capuchón en el extremo 5'. La estructura del capuchón puede ser un capuchón de 7-metilguanilato nativo o un análogo del capuchón, por ejemplo, análogo del capuchón anti-inverso (ARCA), 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G, (m7G(5')ppp(5')G), etc.
En otra divulgación en el presente documento, una composición de ARNmm que carece de un trifosfato 5', por ejemplo, mediante la introducción de un capuchón en 5', tratamiento con fosfatasa, etc., se combina con un activador de molécula pequeña de PKR, incluyendo, sin limitación, ARNbc, ARNm que no codifica un factor de reprogramación y que comprende un trifosfato 5'; y similares.
En otra divulgación en el presente documento, se proporcionan kits para la reprogramación nuclear de células somáticas. Dichos kits pueden comprender una composición de ARNmm o reactivos para su transcripción in vitro, que codifica uno o un cóctel de factores de reprogramación, por ejemplo, SOX2, OCT4, Nanog, KLF4, cMYC y similares. Dichos kits pueden proporcionar alternativamente o en combinación uno o un cóctel de factores útiles para transdiferenciar células en un linaje de interés. Por ejemplo, un kit de transdiferenciación endotelial puede comprender uno o más ARN (por ejemplo, poli I:C) para activar la inmunidad innata y los factores de crecimiento BMP4, VEGF, bFGF y/o las moléculas pequeñas 8-Br-cAMP, SB431542, etc. Dichos kits pueden comprender además tampones adecuados, medio de crecimiento celular, instrucciones y similares necesarios para realizar los métodos de divulgación. Un activador de la inmunidad innata, por ejemplo, uno o más agonistas de TLR, incluyendo, sin limitación, ácidos nucleicos bicatenarios, tal como poli I:C.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Generación de ARNmm de nPhT- y PhT-ARNmm.
Figura 2. Descripción del entorno experimental.
Figura 3. Esquema de la reprogramación de BJ-FB utilizando nPhT-ARNmm y PhT-ARNmm.
Figura 4. La reprogramación de BJ-FB con ARNmm de nPhT OKSML es más eficiente que con ARNmm de PhT. Figura 5. Células pluripotenciales inducidas por ARN (RiPS, pase n.° 1/día8) derivadas después de 10 transfecciones de 2 x 103 células positivas para TRA-1-60 clasificadas con FACS sembradas en placa en pocillo de placa de 96 pocillos.
Descripción detallada de las realizaciones
Debe entenderse que la presente invención no está limitada a la metodología concreta, protocolos, líneas celulares, especies o géneros animales y reactivos descritos, ya que pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento tiene el fin de describir realizaciones particulares únicamente, y no se pretende que limite el alcance de la presente invención que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Tal como se usa en el presente documento, las formas en singular "un", "y" y "el/la" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de dichas células y la referencia a "la proteína" incluye la referencia a una o más proteínas y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la materia, y así sucesivamente. Todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la materia a la cual pertenece la presente invención, a menos que se indique claramente lo contrario.
Inmunidad innata. El sistema inmunitario innato es una respuesta celular primitiva que proporciona la respuesta de las células a patógenos, estrés o daño celular. El reconocimiento de estos antígenos por el sistema inmunológico innato puede dar como resultado una respuesta inflamatoria caracterizada por la producción de citocinas, tales como TNF, IL-1, IL-6 e IL-8; así como la activación génica de ICAM-1 y E-selectina, entre otros.
Las amplias clases de patógenos, por ejemplo, virus, bacterias y hongos, pueden expresar de forma constitutiva un conjunto de moléculas resistentes a mutaciones específicas de clase denominadas patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP). Estos marcadores moleculares microbianos pueden estar compuestos de proteínas, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos y/o combinaciones de los mismos, y pueden estar localizados interna o externamente. Los ejemplos incluyen el lipopolisacárido de endotoxina (LPS), ARN monocatenario o bicatenario y similares. De forma adicional, el estrés o daño celular (por ejemplo, generado por cambios significativos en el pH, oxígeno u otras agresiones ambientales o químicas) pueden generar patrones moleculares asociados a daños (DAMp ) que son detectados por receptores tales como RAGE, véase, por ejemplo, Tang et al. (2012) Immunol Rev. 249(1):158-75.
La proteína quinasa activada por ARN, también conocida como proteína quinasa R (PKR), es una proteína quinasa activada por ARN bicatenario inducida por interferón. La PKR es activada por ARN bicatenario (ARNbc). Contiene un dominio de unión de ARNbc N-terminal (dsRBD) y un dominio de quinasa C-terminal, que le confiere funciones proapoptóticas (destrucción de células). Se cree que la unión al ARNbc activa la PKR induciendo dimerización y las reacciones de autofosforilación posteriores. Una vez activa, la PKR es capaz de fosforilar el factor de iniciación de la traducción eucariota EIF2A. Esto inhibe la traducción de ARNm celular adicional, evitando así la síntesis de proteínas virales. La PKR activa también puede mediar en la activación del factor de transcripción NFkB, fosforilando su subunidad inhibidora, IkB. El NFkB activado regula por aumento la expresión de interferones, que funcionan para difundir la señal antiviral localmente.
Los agonistas de PKR de particular interés incluyen ARNm que comprende un trifosfato 5'. Dicho ARNm se puede sintetizar mediante síntesis in vitro.
Los receptores de tipo Toll son proteínas transmembrana (TM) de tipo I que funcionan como receptores de reconocimiento de patrones (PRR) que poseen un número variable de motivos extracelulares de repetición rica en leucina N-terminal (LRR), seguido de una región rica en cisteína, un dominio TM y un motivo Toll/IL-1 R (TIR) intracelular. El dominio LLR es importante para la unión del ligando y la señalización asociada y es una característica común de los PRR. El dominio TlR es importante en las interacciones proteína-proteína y se asocia normalmente con la inmunidad innata. El dominio TIR también une una superfamilia IL-1 R/TLR más grande que se compone de tres subgrupos. La familia TLR humana está compuesta por al menos 10 miembros, de TLR1 hasta 10. Cada TLR es específico en sus patrones de expresión y sensibilidades a PAMP.
El receptor de tipo Toll 3 (TLR3) reconoce el ARN bicatenario (ARNbc) y sus miméticos, un patrón molecular asociado con infección viral. Se asigna al cromosoma 4q35 y su secuencia codifica una supuesta proteína de 904 aa con 24 LRR N-terminales y un peso molecular calculado de 97 kDa. TLR3 está más estrechamente relacionado con TLR5, TLR7 y TLR8, cada uno con un 26 % de identidad de secuencia de aa total. El ARNm de TLR3 se eleva después de la exposición a bacterias Gramnegativas y en mayor medida en respuesta a las bacterias Grampositivas.
TLR3 reconoce específicamente ARN bicatenario (ARNdc) e induce múltiples eventos intracelulares responsables de la inmunidad antiviral innata contra varias infecciones virales. La proteína TLR3 de 904 aminoácidos prevista contiene los motivos característicos de Toll: un dominio de repetición extracelular rica en leucina (LRR) y una región similar al receptor de interleucina-1 citoplasmática.
La exposición a ARN bicatenario (ARNbc) o ácido poliinosina-policitidílico (poli(I:C)), un análogo de ARNbc sintético, induce la producción de interferón a y p y, mediante la señalización a través de TLR3, activa el NFkB. IRF3 se induce específicamente mediante la estimulación de TLR3 o TLR4, que media en un programa génico específico responsable de las respuestas antivirales innatas. TRIF es necesario para la activación de NFKB dependiente de TLR3. Sirve como una proteína adaptadora que une RIP1 y TLR3 para mediar en la activación de NFKB inducida por TLR3.
RIG-1 (gen 1 inducible por ácido retinoico) es una enzima helicasa de ARNbc del receptor similar a RIG-I que está codificada (en seres humanos) por el gen DDX58. RIG-I es parte de la familia de receptores similares a RIG-I (RLR), que también incluye MDA5 y LGP2, y funciona como un receptor de reconocimiento de patrones que es un sensor de virus. RIG-I normalmente reconoce el ARNdc trifosfato 5' corto (< 4.000 nt). RIG-I y MDA5 participan en la activación de MAVS y desencadenan una respuesta antiviral. Se puede acceder al gen RIG1 humano en Genbank NM_014314.3 y a la proteína en Genbank NP_055129.2.
El receptor 4 de tipo Toll es una proteína que en los seres humanos está codificada por el gen TLR4. Detecta lipopolisacáridos de bacterias gramnegativas y, por tanto, es importante en la activación del sistema inmunológico innato. Este receptor se expresa con mayor abundancia en la placenta y en la subpoblación mielomonocítica de leucocitos. Se puede acceder al gen t LR4 humano en Genbank NM_003266.3 y a la proteína en Genbank NP_003257.1.
La activación de TLR4 conduce a la liberación aguas abajo de moduladores inflamatorios, incluidos TNF-a e interleucina-1. Los agonistas incluyen morfina, oxicodona, fentanilo, metadona, lipopolisacáridos (LPS), carbamazepina, oxcarbazepina, etc.
agonista de TLR. Los agonistas de TLR activan los TLR, incluyendo, sin limitación, TLR3, TLR4 y RIG1. Los ejemplos de agonistas de TLR incluyen patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) y miméticos de los mismos. Estos marcadores moleculares microbianos pueden estar compuestos de proteínas, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos y/o combinaciones de los mismos, y pueden estar localizados interna o externamente, como se conocen en la técnica. Los ejemplos incluyen LPS, zimosano, peptidoglicanos, flagelina, agonista sintético de TLR2 Pam3cys, Pam3CSK4, MALP-2, imiquimod, CpG ODN y similares.
Los agonistas de TLR3 incluyen ARN bicatenario; Poli(I:C), Poli(A.U), etc., donde tales ácidos nucleicos generalmente tienen un tamaño de al menos aproximadamente 10 pb, al menos aproximadamente 20 pb, al menos aproximadamente 50 pb y pueden tener un alto peso molecular de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 kb, normalmente de no más de aproximadamente 50 a 100 kb. Los agonistas alternativos de TLR3 pueden unirse directamente a la proteína, por ejemplo, anticuerpos o moléculas pequeñas que se unen selectivamente a TLR3 y lo activan. Otros agonistas de TLR3 incluyen retrovirus, por ejemplo un retrovirus diseñado para carecer de la capacidad de integrarse en el genoma.
La dosis de agonista que es eficaz en los métodos de la divulgación es una dosis que aumenta la eficiencia de la reprogramación de una célula o población celular, en relación con la misma población en ausencia del agonista de PKR y/o TLR. Se entenderá que el ARNm que codifica los factores de reprogramación también puede actuar como un activador de la inmunidad innata proporcionando al menos una parte del ARNm con un trifosfato 5'. El término "reprogramación", como se usa en el presente documento, significa la reprogramación nuclear de una célula somática en una célula pluripotencial (por ejemplo, un fibroblasto en una célula pluripotencial inducida) o la reprogramación nuclear de una célula somática en una célula somática sustancialmente diferente (por ejemplo, un fibroblasto en una célula endotelial), in vitro o in vivo. Este último proceso también se conoce como transdiferenciación. La extensión de los telómeros en sí misma puede considerarse otra forma de reprogramación nuclear. Además, este proceso de extensión de los telómeros también se activa durante la reprogramación nuclear a pluripotencia, véase, por ejemplo, Lapasset et al. (2011) Genes Dev. 25(21):2248-53.
Convenientemente, se puede evaluar un marcador de activación inmunitaria innata para la determinación de dosis adecuadas, incluida la activación de NFkB en las células somáticas de interés para la reprogramación, producción de interferones a y p y similares. Por ejemplo, donde el agonista de TLR es poli I:C o un análogo del mismo, una dosis eficaz puede ser de al menos aproximadamente 10 ng/ml, al menos aproximadamente 50 ng/ml, al menos aproximadamente 100 ng/ml, al menos aproximadamente 250 ng/ml, al menos aproximadamente 500 ng/ml. Una concentración optimizada de poli I:C en el medio de cultivo es de al menos 10 ng/ml y no más de 3.000 ng/ml, incluyendo un intervalo de 20 ng/ml a 300 ng/ml, y particularmente de 25 ng/ml a 150 ng/ml, por ejemplo de aproximadamente 30 ng/ml. La dosis de un agonista de TLR distinto de poli I:C puede calcularse basándose en la provisión de actividad equivalente a la dosis optimizada de poli I:C.
Composición de ARNm modificado (ARNmm). En los métodos de la divulgación, una forma de reprogramación nuclear se logra poniendo en contacto las células somáticas con un cóctel de ARNmm que codifica factores de reprogramación. El ARNm modificado puede proporcionarse como un transcrito de IVT purificado. Se conocen y se utilizan en la técnica diversas combinaciones y proporciones de factores de reprogramación, incluyendo, por ejemplo, para la reprogramación nuclear de una célula somática en pluripotencia, se puede utilizar un cóctel que comprende los cinco factores de reprogramación (OKSML; Oct 4, KLF4, Sox2, cMyc y Lin28) en cantidades equimolares excepto el Oct 4. Para la reprogramación nuclear implicada en la transdiferenciación, un cóctel de ejemplo comprende los factores de transcripción ETV2, FLI1 y ERG1 para transdiferenciar una célula somática en una célula endotelial, véase Ginsberg et al. (2012) Cell 151(3):559-75. La transdiferenciación de fibroblastos en células endoteliales se puede lograr usando el agonista TLR3 (Poli I:C) administrado para activar la inmunidad innata, combinado con pequeñas moléculas y factores de crecimiento, tales como VEGF, FGF, 8Br-cAMP y un inhibidor del receptor de TGFp.
Como se conoce en la técnica, el ARNm puede comprender uno o más nucleótidos no naturales. La modificación de nucleósidos puede incluir un compuesto seleccionado del grupo que consiste en piridin-4-ona ribonucleósido, 5-azauridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tiouridina, 4-tio-pseudouridina, 2-tio-pseudouridina, 5-hidroxiuridina, 3-metiluridina, 5-carboximetiluridina, 1-carboximetil-pseudouridina, 5-propinil-uridina, 1-propinil-pseudouridina, 5-taurinometiluridina, 1-taurinometil-pseudouridina, 5-taurinometil-1,2-tiouridina, 1-taurinometil-1-4-tio-uridina, 5-metil-uridina, 1-metilpseudouridina, 4-tio-1-metilpseudouridina, 2-tio-1-metil-pseudouridina, 1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio-1 -metil-1-deaza-pseudouridina, dihidrouridina, dihidropseudouridina. 2-tio-dihidrouridina, 2-tiodihidropseudouridina, 2-metoxiuridina, 2-metoxi-4-tirouridina, 4-metoxipseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudouridina, 5-azacitidina, pseudoisocitidina, 3-metilcitidina, N4-acetilcitidina, 5-formilcitidina, N4-metilcitidina, 5-hidroximetilcitidina, 1-metilpseudoisocitidina, pirrolo-citidina, pirrolo-pseudoisocitidina, 2-tio-citidina, 2-tio-5-metil-citidina, 4-tio-pseudoisocitidina, 4- tio-1-metil-pseudoisocitidina, 4-tio-1-metil-1-deaza-pseudoisocitidina, 1-metil-1-deaza-pseudoisocitidina, zebularina, 5- aza-zebularina, 5-metil-zebularina, 5-aza-2-tio-zebularina, 2-tio-zebularina, 2-metoxi-citidina, 2-metoxi-5-metilcitidina, 4-metoxi-pseudoisocitidina, 4-metoxi-1-metil-pseudoisocitidina, 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 7-desazaadenina, 7-deaza-8-aza-adenina, 7-deaza-2-aminopurina, 7-deaza-8-aza-2-aminopurina, 7-deaza-2,6-diaminopurina, 7-deaza-8-aza-2, 6-diaminopurina, 1-metiladenosina, N6-metiladenosina, N6-isopenteniladenosina, N6-(cishidroxiisopenteniladenosina, 2-metiltio-N-6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina, N6-glicinilcarbamoiladenosina, N6-treonilcarbamoiladenosina, 2-metiltio-N6-treonilcarbamoiladenosina, N6,N6-dimetiladenosina, 7-metiladenina, 2-metiltio-adenina, 2-metoxi-adenina, inosina, 1-metil-inosina, wiosina, wibutosina, 7-desazaguanosina, 7-deaza-8-azaguanosina, 6-tioguanosina, 6-tio-7-deaza-guanosina, 6-tio-7-deaza-8-azaguanosina, 7-metil-guanosina, 6-tio-7-metilguanosina, 7-metilinosina, 6-metoxiguanosina, 1-metilguanosina, N2-metilguanosina, N2,N2-dimetilguanosina, 8-oxoguanosina, 7-metil-8-oxo-guanosina, 1-metil-1-6-tioguanosina, N2-metil-1-6-tio-guanosina y N2,N2-dimetil1-6-tioguanosina.
En alguna divulgación del presente documento, las modificaciones se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en 5-metilcitosina, pseudouridina y 1-metilpseudouridina. Se pueden localizar dos modificaciones de la molécula de ácido nucleico en los nucleósidos de la molécula de ácido nucleico modificada. Los nucleósidos modificados se pueden seleccionar entre 5-metilcitosina y pseudouridina.
La población de ARNmm puede comprender trifosfato 5' en todas o algunas de las moléculas de ARNmm. Cuando se hace referencia a una "parte" de la población que comprende un trifosfato 5', se pretende que se considere a la población en su conjunto. Por ejemplo, cuando se proporciona un cóctel de especificidades de ARNm, el porcentaje de moléculas con trifosfato 5' se puede distribuir entre las especificidades o se puede proporcionar en una sola especificidad. La parte de la composición que comprende un trifosfato 5' puede ser de hasta aproximadamente 1 %, hasta aproximadamente 5 %, hasta aproximadamente 10 %, hasta aproximadamente 15 %, hasta aproximadamente 20 %, hasta aproximadamente 25 %, hasta aproximadamente 30 %, hasta aproximadamente 50 %, hasta aproximadamente 75 % y puede ser sustancialmente todo el ARNmm. En alguna divulgación del presente documento, la parte de ARNm que comprende un trifosfato 5' es de aproximadamente 5 % a aproximadamente 25 % y el resto de ARNmm en la composición comprende una estructura de capuchón en el extremo 5'.
Una estructura de capuchón en 5' puede ser uncapuchón de 7-metilguanilato nativo o un análogo del capuchón, por ejemplo, análogo del capuchón anti-inverso (ARCA), 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G, (m7G(5')ppp(5')G), CapO, Cap1, inosina, N1-metilguanosina, 2'-fluoro-guanosina, 7-deaza-guanosina, 8-oxo-guanosina, 2-amino-guanosina, l NA-guanosina, 2-azidoguanosina, etc.
Factor esde reprogramación, como se usa en el presente documento, se refiere a uno o un cóctel de polipéptidos biológicamente activos que actúan sobre una célula para alterar la transcripción y que, tras la expresión, reprograman una célula somática en un tipo celular diferente, o en multipotencia o en pluripotencia. En el caso especial de la extensión de los telómeros utilizando el ARNm que codifica la telomerasa, TERC y/o proteínas asociadas a los telómeros, la acción dirigida para extender el telómero indirectamente tiene efectos globales sobre el perfil transcripcional que cambia un tipo de célula de una forma senescente a una juvenil, que es prácticamente una forma de reprogramación nuclear, véase Matsushita et al. (2001) Circ Res. 89(9):793-8. Para los fines de la presente divulgación, los factores de reprogramación se proporcionan como ARNm que codifica los polipéptidos descritos a continuación.
En alguna divulgación del presente documento, el factor de reprogramación es un factor de transcripción, incluyendo, sin limitación, Oct3/4; Sox2; Klf4; c-Myc; y Nanog. También de interés como factor de reprogramación es Lin28, que es una proteína de unión a ARNm que se cree que influye en la traducción o estabilidad de los ARNm específicos durante la diferenciación.
Los factores de reprogramación de interés también incluyen factores útiles en la transdiferenciación, donde una célula somática se reprograma en una célula somática diferente. Con el propósito de la transdiferenciación de una célula somática en otro tipo de célula somática sustancialmente diferente, encuentra uso un conjunto diferente de factores de reprogramación. Por ejemplo, para transdiferenciar un fibroblasto en un cardiomiocito, se podría usar Gata4, Mef2c y Tbx5 (véase Cell, Volumen 142, Issue 3, 375-386, 6 August 2010).
Una composición de ARNmm de la divulgación puede codificar uno o más factores de reprogramación biológicamente activos. La composición puede comprender al menos aproximadamente 10 ng/pl de cada especificidad de ARNmm, (es decir, que codifica cada factor de reprogramación), al menos aproximadamente 50 ng/ml; al menos aproximadamente 100 ng/ml, al menos aproximadamente 200 ng/ml, al menos aproximadamente 250 ng/ml, al menos aproximadamente 300 ng/ml o más.
Un polipéptido Klf4 es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de Klf4 humano, es decir, factor 4 de tipo Kruppel, cuya secuencia se puede encontrar en los números de acceso de GenBank NP_004226 y NM_004235. Los polipéptidos Klf4, por ejemplo aquellos que son al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 % idénticos a la secuencia proporcionada en GenBank con n.° de acceso NM_004235. Los ácidos nucleicos que los codifican encuentran uso como factor de reprogramación en la presente divulgación.
Un polipéptido c-Myc es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de c-Myc humano, es decir, homólogo del oncogén viral de mielocitomatosis, cuya secuencia se puede encontrar en los números de acceso de GenBank NP_002458 y NM_002467. polipéptidos c-Myc, por ejemplo aquellos que son al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 % idénticos a la secuencia proporcionada en GenBank con n.° de acceso NM_002467. Los ácidos nucleicos que los codifican encuentran uso como factor de reprogramación en la presente divulgación.
Un polipéptido Nanog es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de Nanog humano, es decir, la homeosecuencia Nanog, cuya secuencia se puede encontrar en los números de acceso de GenBank NP_079141 y NM_024865. Polipéptidos nanog, por ejemplo aquellos que son al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 % idénticos a la secuencia proporcionada en GenBank con n.° de acceso NM_024865. Los ácidos nucleicos que los codifican encuentran uso como factor de reprogramación en la presente divulgación.
Un polipéptido Lin-28 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 % idéntica a la secuencia de aminoácidos del Lin-28 humano, es decir, Homólogo de Lin-28 de C. elegans, cuya secuencia se puede encontrar en los números de acceso de GenBank NP_078950 y NM_024674. Polipéptidos Lin-28, por ejemplo aquellos que son al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 % idénticos a la secuencia proporcionada en GenBank con n.° de acceso NM_024674. Los ácidos nucleicos que los codifican encuentran uso como factor de reprogramación en la presente divulgación.
Un polipéptido Oct3/4 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de Oct 3/4 humano, también conocido como homeosecuencia 1 de clase 5 POU de Homo sapiens (POU5F1) cuya secuencia se puede encontrar en los números de acceso de GenBank NP_002692 y NM_002701. Polipéptidos Oct3/4, por ejemplo aquellos que son al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 % idénticos a la secuencia proporcionada en GenBank con n.° de acceso NM_002701. Los ácidos nucleicos que los codifican encuentran uso como factor de reprogramación en la presente divulgación.
Un polipéptido Sox2 es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos al menos un 70 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de Sox2 humano, es decir, proteína Y-box 2 de la región determinante del sexo, cuya secuencia se puede encontrar en los números de acceso de GenBank NP_003097 y NM_003106. Los polipéptidos Sox2, por ejemplo aquellos que son al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 % idénticos a la secuencia proporcionada en GenBank con n.° de acceso NM_003106. Los ácidos nucleicos que los codifican encuentran uso como factor de reprogramación en la presente divulgación.
Por "pluripotencia" y células madre pluripotenciales se entiende que tales células tienen la capacidad de diferenciarse en todos los tipos de células de un organismo. La expresión "célula madre pluripotencial inducida" abarca células pluripotenciales, que, como las células madre embrionarias (ME), se pueden cultivar durante un largo período de tiempo mientras se mantiene la capacidad de diferenciarse en todo tipo de células en un organismo, pero que, a diferencia de las células ME (que se derivan de la masa celular interna de los blastocistos), derivan de células somáticas diferenciadas, es decir, células que tenían un potencial estrecho más definido y que en ausencia de manipulación experimental no podría dar lugar a todos los tipos de células en el organismo. Por "que tiene el potencial de convertirse en células MPi" se entiende que se puede inducir a las células somáticas diferenciadas a convertirse, es decir, se pueden reprogramar para convertirse en, células MPi. En otras palabras, se puede inducir a la célula somática a rediferenciarse para establecer células que tengan las características morfológicas, la capacidad de crecimiento y la pluripotencia de células pluripotenciales. Las células MPi tienen una morfología similar a la de CMEh, creciendo como colonias planas con grandes proporciones nucleocitoplasmáticas, fronteras definidas y núcleos prominentes. Además, las células MPi expresan uno o más marcadores de pluripotencia clave conocidos por un experto en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, fosfatasa alcalina, SSEA3, SSEA4, Sox2, Oct3/4, Nanog, TRA160, TRA181, TDGF 1, Dnmt3b, FoxD3, GDF3, Cyp26a1, TERT y zfp42. Además, las células MPi son capaces de formar teratomas. Además, son capaces de formar o contribuir a los tejidos ectodérmico, mesodérmico o endodérmico en un organismo vivo.
Las expresiones "células primarias", "líneas celulares primarias" y "cultivos primarios" se usan indistintamente en el presente documento para hacer referencia a células y a cultivos celulares que se han derivado de un sujeto y que se dejaron crecer in vitro durante un número limitado de pases, es decir, escisiones, del cultivo. Por ejemplo, los cultivos primarios son cultivos que pueden haber sido pasados 0 veces, 1 vez, 2 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o 15 veces, pero no pasan por la etapa de crisis suficientes veces.
Población celular inicial. Como se usa en el presente documento, una "población celular de partida" o "población celular inicial" se refiere a una célula somática, generalmente a una célula somática primaria, o no transformada, que sufre reprogramación nuclear mediante los métodos de la divulgación. La población de células de partida puede ser de cualquier especie de mamífero, pero particularmente incluyendo células humanas. Las fuentes de poblaciones de células iniciales incluyen individuos deseosos de terapia celular, individuos que tienen un defecto genético de interés para su estudio, y similares.
En alguna divulgación del presente documento, las células humanas obtenidas de un sujeto con el propósito de reprogramación nuclear pueden elegirse de cualquier tipo de célula humana, incluidas células fibroblastos, células de tejido adiposo, células mesenquimatosas, células de médula ósea, células de estómago, células hepáticas, células epiteliales, células epiteliales nasales, células epiteliales de la mucosa, células foliculares, células del tejido conjuntivo, miocitos, células óseas, células de cartílago, células gastrointestinales, células esplénicas, células renales, células pulmonares, células testiculares, células de tejido nervioso, etc. En alguna divulgación del presente documento, el tipo de célula humana es un fibroblasto, que puede obtenerse convenientemente de un sujeto mediante una biopsia por punción. En cierta divulgación del presente documento, las células se obtienen de sujetos que se sabe o se sospecha que tienen una variación en el número de copias (VNC) o mutación del gen de interés. En otra divulgación en el presente documento, las células son de un paciente que presenta una forma idiopática/esporádica de la enfermedad. En otra divulgación más del presente documento, las células son de un sujeto no humano. Luego, las células se reprograman y pueden transdiferenciarse para adoptar un destino celular específico, tales como células endodérmicas, células neuronales, por ejemplo, célula dopaminérgica, colinérgica serotoninérgica, GABAérgica o glutamatérgica; células pancreáticas, por ejemplo, células de los islotes, células musculares, incluidos, entre otros, cardiomiocitos, células hematopoyéticas y similares.
La expresión "eficacia de reprogramación" puede usarse para referirse a la capacidad de una célula para dar lugar a colonias de células MPi cuando se pone en contacto con factores de reprogramación. Las células somáticas que demuestran una eficiencia mejorada de reprogramación en pluripotencialidad demostrarán una capacidad mejorada para dar lugar a células MPi cuando se pongan en contacto con factores de reprogramación en relación con un control. La expresión "eficiencia de la reprogramación" también puede referirse a la capacidad de las células somáticas de reprogramarse a un tipo de célula somática sustancialmente diferente, un proceso conocido como transdiferenciación. La expresión "eficiencia de la reprogramación" también puede referirse al grado de extensión de los telómeros cuando se reprograma una célula de una forma senescente a una juvenil. La eficiencia de la reprogramación con los métodos de la divulgación varía con la combinación particular de células somáticas, el método de introducción de factores de reprogramación y el método de cultivo después de la inducción de reprogramación.
Los términos "tratamiento", "que trata", "tratar" y similares se usan en el presente documento para hacer referencia generalmente a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en cuanto a la prevención completa o parcial de una enfermedad o de un síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en cuanto a la estabilización o curación parcial o completa para una enfermedad y/o un efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", como se usa en el presente documento, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad de un mamífero, particularmente un ser humano, e incluye: (a) evitar la aparición de la enfermedad o síntoma en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad o síntoma, pero aún no se ha diagnosticado que la padece; (b) inhibir el síntoma de enfermedad, es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar el síntoma de enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad o síntoma.
Los términos "individuo", "sujeto", "huésped" y "paciente", se usan indistintamente en el presente documento y hacen referencia a cualquier sujeto mamífero para el que se desea el diagnóstico, tratamiento o terapia, en particular, seres humanos.
Métodos de inducción de pluripotencia in vitro
Una población de partida de células somáticas se pone en contacto con una población de ARNmm que codifica factores de reprogramación, como se ha definido anteriormente, en una combinación y cantidad suficiente para reprogramar la célula en pluripotencia antes de, concurrente o después de la activación de la célula somática con una dosis eficaz de un activador de la inmunidad innata, donde se proporciona el activador de la inmunidad innata trifosfato 5' presente en al menos una parte del ARNmm, o, como alternativa, se proporciona como un agente adicional. En alguna divulgación del presente documento, el TLR es TLR3 o PKR. En alguna divulgación del presente documento, el agonista de TLR es un ARN bicatenario o un análogo del mismo. Los factores de reprogramación se pueden proporcionar a las células somáticas individualmente o como una sola composición, es decir, como una composición premezclada, de factores de reprogramación.
En alguna divulgación del presente documento, la población de partida de células se pone en contacto con una dosis eficaz de una composición de ARNm de la composición, que comprende al menos una parte de la población con un trifosfato 5' como se ha descrito anteriormente. Como se conoce en la técnica, por lo general, se requieren transfecciones repetidas, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10 transfecciones, que se pueden repetir a diario, aparentemente a diario, cada dos días, etc.
En otra divulgación del presente documento, una población convencional de ARNmm, es decir, que carece de trifosfato 5', se puede administrar con un activador de la inmunidad innata, por ejemplo un agonista de TLR o PKR, por ejemplo, LPS, ARNbc, etc., en una dosis que es funcionalmente equivalente a una dosis de 5 ng/ml a 3.000 ng/ml de poli I:C y se mantiene en cultivo en presencia de dicho agonista desde un periodo de tiempo de aproximadamente 4 a aproximadamente 18 días, por ejemplo, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 días, y puede ser de aproximadamente 6 a 8 días.
El ARNmm que codifica los factores de reprogramación puede añadirse a las células del sujeto de forma simultánea 0 secuencial en diferentes momentos, y puede añadirse en combinación con un activador adicional de la inmunidad innata y/o que comprenden trifosfato 5' en al menos una parte del ARNmm. En alguna divulgación del presente documento, se añade un conjunto de al menos tres factores de reprogramación que codifican ARNm, por ejemplo, Oct3/4, Sox2 y Klf4, c-myc, nanog o Iin28. En alguna divulgación del presente documento, se proporciona a las células un conjunto de al menos cuatro factores de reprogramación que codifican ARNm, por ejemplo, Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc; u Oct3/4, Sox2, Iin28 y nanog. En alguna divulgación del presente documento, se proporciona a las células un conjunto de cinco factores de reprogramación que codifican ARNm, por ejemplo, Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc e Iin28 o nanog.
Los métodos para introducir el ARNm que codifica los factores de reprogramación en las células somáticas incluyen transfección, lipofección, electroporación, liberación exosomal y similares, como se conocen en la técnica. Tras la introducción del ARNmm, las células se incuban durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 72 horas, por ejemplo, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 60 horas, 72 horas, o cualquier otro período de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 72 horas. Los factores de reprogramación se pueden proporcionar a las células del sujeto durante aproximadamente una a aproximadamente 4 semanas, por ejemplo, de aproximadamente dos a aproximadamente 3 semanas.
La dosis de ARNmm que codifica los factores de reprogramación variará con la naturaleza de las células, los factores, las condiciones de cultivo, etc. En alguna divulgación del presente documento, la dosis será de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 1 pM para cada factor, más habitualmente de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 500 nM o de aproximadamente 100 a 200 nM. En la divulgación del presente documento donde se usa un activador adicional, las células están inicialmente expuestas durante la exposición a los actores de reprogramación durante al menos aproximadamente 1 día, al menos aproximadamente 2 días, al menos aproximadamente 4 días, al menos aproximadamente 6 días o una semana, y pueden estar expuestos durante todo el proceso de reprogramación, o menos. La dosis dependerá del agonista específico, pero puede ser de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 1 pg/ml, desde aproximadamente 10 ng/ml hasta aproximadamente 500 ng/ml.
Tras la introducción de factores de reprogramación, las células somáticas pueden mantenerse en un medio de cultivo convencional que comprende células de la capa alimentadora, o pueden cultivarse en ausencia de capas alimentadoras, es decir, que carecen de células somáticas distintas de las que se inducen a la pluripotencia. Los cultivos libres de la capa alimentadora pueden utilizar una superficie recubierta de proteína, por ejemplo matrigel, etc.
Las células MPi inducidas a convertirse en tales mediante los métodos de la divulgación tienen una morfología similar a la de CMEh, creciendo como colonias planas con grandes proporciones nucleocitoplasmáticas, fronteras definidas y núcleos prominentes. Además, las células MPi pueden expresar uno o más marcadores de pluripotencia clave conocidos por un experto en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, fosfatasa alcalina, SSEA3, SSEA4, Sox2, Oct3/4, Nanog, TRA160, TRA181, TDGF 1, Dnmt3b, FoxD3, GDF3, Cyp26a1, TERT y zfp42. Además, las células MPi son capaces de formar teratomas.
Además, son capaces de formar o contribuir a los tejidos ectodérmico, mesodérmico o endodérmico en un organismo vivo.
Los genes pueden introducirse en las células somáticas o en las células MPi derivadas de las mismas con diversas finalidades, por ejemplo para reemplazar genes que tienen una mutación de pérdida de función, proporcionar genes marcadores, etc. Como alternativa, se introducen vectores que expresan ARNm antisentido o ribozimas, bloqueando así la expresión de un gen no deseado. Otros métodos de terapia génica son la introducción de genes de resistencia a fármacos para permitir que las células progenitoras normales tengan una ventaja y estén sujetas a presión selectiva, por ejemplo, el gen de resistencia a múltiples fármacos (RMF), o genes antiapoptosis, tales como bcl-2. Se pueden usar varias técnicas conocidas en la técnica para introducir ácidos nucleicos en las células diana, por ejemplo electroporación, ADN precipitado con calcio, fusión, transfección, lipofección, infección y similares, como se ha tratado anteriormente. La manera particular en la que se introduce el ADN no es crítica para la práctica de la divulgación.
Las células MPi producidas por los métodos anteriores pueden usarse para reconstituir o complementar células diferenciadoras o diferenciadas en un receptor. Las células inducidas pueden diferenciarse en tipos de células de varios linajes. Los ejemplos de células diferenciadas incluyen cualquier célula diferenciada de los linajes ectodérmico (por ejemplo, neuronas y fibroblastos), mesodérmicos (por ejemplo, cardiomiocitos) o endodérmicos (por ejemplo, células pancreáticas). Las células diferenciadas pueden ser una o más: células beta pancreáticas, células madre neuronales, neuronas (por ejemplo, neuronas dopaminérgicas), oligodendrocitos, células progenitoras de oligodendrocitos, hepatocitos, células madre hepáticas, astrocitos, miocitos, células hematopoyéticas o cardiomiocitos.
Existen numerosos métodos para diferenciar las células inducidas en un tipo celular más especializado. Los métodos para diferenciar las células inducidas pueden ser similares a los que se utilizan para diferenciar las células madre, particularmente células ME, CMM, CMAP, MIAMI, células madre hematopoyéticas (CMH). En algunos casos, la diferenciación ocurre ex vivo; en algunos casos, la diferenciación ocurre in vivo.
Las células inducidas, o células diferenciadas de las células inducidas, pueden usarse como terapia para tratar una enfermedad (por ejemplo, un defecto genético). La terapia puede estar dirigida a tratar la causa de la enfermedad; o, como alternativa, la terapia puede ser para tratar los efectos de la enfermedad o afección. Las células inducidas pueden transferirse a, o cerca de, un sitio dañado en un sujeto; o las células pueden introducirse en el sujeto de una manera que permita que las células migren o se vuelvan a casa, al sitio dañado. Las células transferidas pueden reemplazar ventajosamente a las células dañadas o lesionadas y permitir una mejora en la condición general del sujeto. En algunos casos, las células transferidas pueden estimular la regeneración o reparación de tejidos.
Las células transferidas pueden ser células diferenciadas de células inducidas. Las células transferidas también pueden ser células madre multipotenciales diferenciadas de las células inducidas. En algunos casos, las células transferidas pueden ser células inducidas que no se han diferenciado.
El número de administraciones de tratamiento a un sujeto puede variar. La introducción de las células inducidas y/o diferenciadas en el sujeto puede ser un evento único; pero en determinadas situaciones, dicho tratamiento puede producir una mejoría durante un período de tiempo limitado y requiere una serie continua de tratamientos repetidos. En otras situaciones, pueden ser necesarias múltiples administraciones de las células antes de que se observe un efecto. Los protocolos exactos dependen de la enfermedad o afección, el estadio de la enfermedad y los parámetros del sujeto individual que se está tratando.
Las células se pueden introducir al sujeto a través de cualquiera de las siguientes rutas: parenteral, intravenosa, intraarterial, intramuscular, subcutánea, transdérmica, intratraqueal, intraperitoneal o en el líquido cefalorraquídeo.
Las células MPi se pueden administrar en cualquier medio fisiológicamente aceptable. Pueden proporcionarse solos o con un sustrato o matriz adecuados, por ejemplo, para apoyar su crecimiento y/u organización en el tejido al que se trasplantan. Por lo general, se administrarán al menos 1 x 105 células, preferiblemente 1x106 o más. Las células pueden introducirse mediante inyección, catéter o similar. Las células pueden congelarse a temperaturas de nitrógeno líquido y almacenarse durante largos períodos de tiempo, pudiéndose usar al descongelar. Si se congelan, las células normalmente se almacenarán en DMSO al 10 %, FCS al 50 %, medio RPMI 1640 al 40 %. Una vez descongeladas, las células pueden desarrollarse mediante el uso de los factores de crecimiento y/o células estromales asociadas a la proliferación y diferenciación de las células progenitoras.
Métodos para inducir la transdiferenciación in vitro o in vivo.
La transdiferenciación, como se ha definido anteriormente, es la reprogramación nuclear de una célula somática en una célula somática sustancialmente diferente, por ejemplo, una célula somática de un linaje diferente. Los ejemplos de transdiferenciación incluyen, sin limitación: fibroblasto ^ miocito; fibroblasto ^ célula endotelial; fibroblasto ^ célula neural; fibroblasto ^ célula de islote; fibroblasto ^ célula hematopoyética; etc.; célula de tejido adiposo en cualquiera de miocitos, células endoteliales, célula neural, células hematopoyéticas, célula de los islotes, etc.; y similares. Las células adecuadas como poblaciones de partida se han definido anteriormente. Esta metodología puede proporcionar consistencia y aplicación práctica en la medicina regenerativa.
Con el fin de transdiferenciación, se usará un conjunto diferente de factores y medios específicos para el fenotipo celular derivado. En alguna divulgación del presente documento, la célula se expone a un activador de la inmunidad innata en presencia de ARNm que codifica factores de reprogramación específicos del linaje. En alguna divulgación del presente documento, la inmunidad innata es activada en ausencia de factores de reprogramación específicos de linaje, pero en presencia de factores de crecimiento y/o moléculas pequeñas que promueven la transdiferenciación en la célula somática deseada. En alguna divulgación del presente documento, la población de partida de células se pone en contacto con una dosis eficaz de un agonista de TLR, por ejemplo, LPS, ARNbc, etc., en una dosis que es funcionalmente equivalente a una dosis de 5 ng/ml a 3.000 ng/ml de poli I:C y se mantiene en cultivo en presencia de dicho agonista desde un periodo de tiempo de aproximadamente 4 a aproximadamente 18 días, por ejemplo, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 días, y puede ser de aproximadamente 6 a 8 días. Tras la inducción de la inmunidad innata mediante este proceso, las células se exponen a uno o un cóctel de ARNmm que codifican factores de reprogramación específicos del linaje.
Por ejemplo, después del tratamiento con agonistas de TLR con una dosis eficaz durante aproximadamente una semana, las células se transdiferencian exponiéndolas a ARNmm que codifican factores de diferenciación durante una a cuatro semanas más. El medio puede reemplazarse con medio fresco suplementado con factores de crecimiento específicos para la célula que se deriva. La concentración apropiada de los factores requeridos se determina realizando una curva de dosis-respuesta. De manera similar, las células transdiferenciadas se caracterizan con una serie de ensayos secundarios estándar que incluyen expresión génica, análisis morfológico y funcional. En muchas divulgaciones del presente documento, se pueden aplicar a la transdiferenciación protocolos de cultivo utilizados para la diferenciación de un tipo de célula somática desde una población de células pluripotenciales, por ejemplo, células ME, células MPi etc. Es decir, una célula que ha sido expuesta a un agonista de TLR en cultivo durante un período de tiempo suficiente para inducir inmunidad innata puede entonces exponerse a un conjunto convencional de factores para la diferenciación específica de linaje.
Las células pueden diferenciarse en tipos de células de varios linajes. Los ejemplos de células transdiferenciadas incluyen cualquier célula diferenciada de los linajes ectodérmico (por ejemplo, neuronas y fibroblastos), mesodérmicos (por ejemplo, cardiomiocitos) o endodérmicos (por ejemplo, células endodérmicas, células pancreáticas). Las células transdiferenciadas pueden ser una o más: células beta pancreáticas, células madre neuronales, neuronas (por ejemplo, neuronas dopaminérgicas), oligodendrocitos, células progenitoras de oligodendrocitos, hepatocitos, células madre hepáticas, astrocitos, miocitos, células hematopoyéticas, células endodérmicas o cardiomiocitos, etc.
Las células transdiferenciadas pueden ser células diferenciadas terminalmente o pueden ser capaces de dar lugar a células de un linaje específico. Por ejemplo, las células se pueden diferenciar en varios tipos de células multipotenciales, por ejemplo, células madre neuronales, células madre cardíacas o células madre hepáticas. Las células madre pueden luego diferenciarse aún más en nuevos tipos de células, por ejemplo, las células madre neurales pueden diferenciarse en neuronas; las células madre cardíacas pueden diferenciarse en cardiomiocitos; y las células madre hepáticas pueden diferenciarse en hepatocitos.
Existen numerosos métodos para diferenciar las células inducidas en un tipo celular más especializado. Los métodos para diferenciar las células inducidas pueden ser similares a los que se utilizan para diferenciar las células madre, particularmente células ME, CMM, CMAP, MIAMI, células madre hematopoyéticas (CMH). En algunos casos, la diferenciación ocurre ex vivo; en algunos casos, la diferenciación ocurre in vivo.
En algunos casos, las subpoblaciones de células somáticas transdiferenciadas pueden purificarse o aislarse. En algunos casos, se incuban uno o más anticuerpos monoclonales específicos para el tipo de célula deseado con la población celular y se aíslan las células unidas. En otros casos, la subpoblación deseada de células expresa un gen indicador que está bajo el control de un promotor específico del tipo de célula.
Las células transdiferenciadas pueden usarse como terapia para tratar una enfermedad (por ejemplo, un defecto genético). La terapia puede estar dirigida a tratar la causa de la enfermedad; o, como alternativa, la terapia puede ser para tratar los efectos de la enfermedad o afección. Las células transdiferenciadas pueden transferirse a o cerca de un sitio dañado en un sujeto; o las células pueden introducirse en el sujeto de una manera que permita que las células migren o se vuelvan a casa, al sitio dañado. Las células transferidas pueden reemplazar ventajosamente a las células dañadas o lesionadas y permitir una mejora en la condición general del sujeto. En algunos casos, las células transferidas pueden estimular la regeneración o reparación de tejidos.
El número de administraciones de tratamiento a un sujeto puede variar. La introducción de las células inducidas y/o diferenciadas en el sujeto puede ser un evento único; pero en determinadas situaciones, dicho tratamiento puede producir una mejoría durante un período de tiempo limitado y requiere una serie continua de tratamientos repetidos. En otras situaciones, pueden ser necesarias múltiples administraciones de las células antes de que se observe un efecto. Los protocolos exactos dependen de la enfermedad o afección, el estadio de la enfermedad y los parámetros del sujeto individual que se está tratando.
Las células se pueden introducir al sujeto a través de cualquiera de las siguientes rutas: parenteral, intravenosa, intraarterial, intramuscular, subcutánea, transdérmica, intratraqueal, intraperitoneal o en el líquido cefalorraquídeo.
Las células transdiferenciadas pueden transferirse a sujetos que padecen una amplia gama de enfermedades o trastornos. Los sujetos que padecen enfermedades o trastornos neurológicos podrían beneficiarse especialmente de las terapias celulares. En algunas estrategias, las células transdiferenciadas son células madre neurales o células neurales trasplantadas a un sitio lesionado para tratar una condición neurológica, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, infarto cerebral, lesión de la médula espinal u otro trastorno del sistema nervioso central, véase, por ejemplo, Morizane et al., (2008), Cell Tissue Res., 331(1):323-326; Coutts y Keirstead (2008), Exp. Neurol., 209(2):368-377; Goswami y Rao (2007), Drugs, 10(10):713-719. Las enfermedades cardíacas degenerativas como la miocardiopatía isquémica, enfermedad de la conducción y los defectos congénitos podrían beneficiarse de las terapias con células madre, véase, por ejemplo, Janssens et al., (2006), Lancet, 367:113-121. Las células endoteliales son útiles para mejorar la estructura y función vascular, mejorar la angiogénesis y mejorar la perfusión, por ejemplo, en la enfermedad arterial periférica. Las células de los islotes pancreáticos (o células primarias de los islotes de Langerhans) se pueden trasplantar a un sujeto que padece diabetes (por ejemplo, diabetes mellitus, de tipo 1), véase, por ejemplo, Burns et al., (2006) Curr. Stem Cell Res. Ther., 2:255-266. En alguna divulgación del presente documento, las células beta pancreáticas derivadas de los métodos de la divulgación pueden trasplantarse a un sujeto que padece diabetes (por ejemplo, diabetes mellitus, tipo 1). En otros ejemplos, se trasplantan células hepáticas o células madre hepáticas derivadas de células inducidas a un sujeto que padece una enfermedad hepática, por ejemplo, hepatitis, cirrosis o insuficiencia hepática.
Se pueden trasplantar células hematopoyéticas o células madre hematopoyéticas (CMH) a un sujeto que padece cáncer de sangre u otro trastorno sanguíneo o inmunológico. Los ejemplos de cánceres de la sangre que son potencialmente tratados por células hematopoyéticas o CMH incluyen: leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia mielógena crónica (LMC), enfermedad de Hodgkin, mieloma múltiple y linfoma no Hodgkin. Con frecuencia, un sujeto que padece dicha enfermedad debe someterse a radiación y/o tratamiento quimioterapéuti
de los métodos de la divulgación a estos sujetos puede ayudar a repoblar los reservorios de células agotados. En algunos casos, también se pueden usar células hematopoyéticas o CMH derivadas por transdiferenciación para combatir directamente el cáncer. Por ejemplo, el trasplante de CMH alogénicas se ha mostrado prometedor en el tratamiento del cáncer de riñón, véase, por ejemplo, Childs et al., (2000), N. Engl. J. Med., 343:750-758. En alguna divulgación del presente documento, las CMH alogénicas o incluso autólogas derivadas de células inducidas pueden introducirse en un sujeto para tratar cánceres de riñón u otros cánceres. Las células hematopoyéticas o CMH derivadas de células inducidas también pueden introducirse en un sujeto para generar o reparar células o tejidos distintos de las células sanguíneas, por ejemplo, músculo, vasos sanguíneos o huesos. Dichos tratamientos pueden ser útiles para una multitud de trastornos.
En alguna divulgación del presente documento, las células se transdiferencian in vivo. En otras palabras, el cóctel de factores de transdiferenciación se administra al huésped, para modificar terapéuticamente el fenotipo celular in vivo. Por ejemplo, se administra un cóctel de transdiferenciación de factores de crecimiento y/o moléculas pequeñas en el marco de la activación inmune innata para generar una célula terapéutica. Por ejemplo, en un paciente con daño cardíaco, uno podría proporcionar un cóctel de tales factores que generaría una célula cardiovascular a partir de un fibroblasto cardíaco.
En alguna divulgación del presente documento, las células están expuestas a un activador de la inmunidad innata y proteínas para mejorar la extensión de los telómeros, por ejemplo, telomerasa. En el caso del ARNmm que codifica la telomerasa, convenientemente, el activador de la inmunidad innata es el ARNmm que codifica la proteína telomerasa. Como se ha descrito anteriormente, el ARNmm se diseñará para proporcionar el nivel óptimo de activación inmune innata para tener el efecto deseado.
Debe entenderse que la presente invención no está limitada a la metodología concreta, protocolos, líneas celulares, especies o géneros animales, construcciones y reactivos descritos, ya que pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento es para el fin de describir únicamente realizaciones concretas y no se pretende que limite el ámbito de la presente invención, que estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Salvo que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la materia a la cual pertenece la presente invención. Aunque cualquier método, dispositivos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento se pueden utilizar en la práctica o pruebas de la presente invención, a continuación se describen los procedimientos, dispositivos y materiales preferentes.
Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y descripción completa de cómo preparar y usar la invención objeto y no se pretende que limiten el ámbito de lo que se considera la invención. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, concentraciones, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados; y la presión es la atmosférica o próxima a ella.
Parte experimental
Ejemplo 1
La activación de la inmunidad innata mejora el efecto del tratamiento con ARN.
Los inventores han descubierto que la activación de la inmunidad innata es esencial para una reprogramación nuclear eficiente. Durante la reprogramación de células con ARNm modificado, se encontró que retener el trifosfato 5' en al menos una porción de las construcciones de ARN sintetizadas artificialmente es importante para la reprogramación de fibroblastos basada en ARNmm eficaz para inducir células madre pluripotenciales.
Las células de mamíferos contienen sensores de ARN que activan el sistema inmunológico innato. La activación de la inmunidad innata puede provocar inflamación o apoptosis. En consecuencia, en un intento de reducir sustancialmente la activación de la inmunidad innata, los investigadores han modificado el ARN terapéutico incorporando nucleósidos modificados y eliminando el trifosfato 5' del ARN sintetizado. La activación inmune innata, a través de los receptores TLR3,TLR7 y TLR8 humanos; o a través de la vía PKR (proteína quinasa R) se reduce de ese modo. Véanse, por ejemplo, Kariko et al. (2005) Immunity 23(2):165-175; y Warren et al. (2010), citado anteriormente.
Sin embargo, los inventores han descubierto que se necesita una activación sustancial de la respuesta inmune innata para tener efectos óptimos en algunos casos. En particular, los inventores han demostrado que el uso de ARNmm para la reprogramación de células somáticas a CMPi (células madre pluripotenciales inducidas) requiere la activación de TLR3 para un efecto máximo. La activación de la inmunidad innata provoca cambios globales en los modificadores epigenéticos que colocan a la cromatina en una "configuración abierta". Este efecto de activación inmune innata facilita la acción de los factores transcripcionales codificados por ARNmm.
Además de utilizar nucleótidos modificados para suprimir la activación inmune innata, algunos grupos han tratado el ARNm con protección cotranscripcional y fosfatasa para eliminar los trifosfatos 5'. Estos trifosfatos 5' pueden ser detectados por la proteína quinasa dependiente de a Rn (PKR), que es un sensor celular que activa las vías inmunes innatas y la represión global de la traducción de proteínas (Nallagatla y Bevilacqua (2008) ARN 14 (6): 1201-13). Los protocolos convencionales para generar CMPi usando ARNmm incluyen el uso de ARNmm tratado con fosfatasa.
Los inventores han descubierto que este método para reducir la activación inmune innata en realidad reduce la eficacia del ARNmm en la generación de CMPi. De acuerdo con los protocolos convencionales, se usó fosfatasa para eliminar los trifosfatos 5' del ARNmm (PhT-ARNmm) que codifica los cinco factores de reprogramación (OKSML; Oct 4, KLF4, Sox2, cMyc y Lin28). En otro conjunto de reactivos omitimos el tratamiento con fosfatasa (nPhT-ARNmm).
Generación de ARNmm de nPhT- y PhT- ARNmm. Como se muestra en la Figura 1, el plásmido pTM1 se describió previamente (B. Moss et al., Nature, Vol 348, 1990] y se modificó para producir pJRG-3s, mediante la sustitución de la secuencia entre los sitios Xbal/Sall en una secuencia que contiene el promotor T7, el 5' UTR de la beta globina humana (BBh), el marco de lectura abierto de GFP vinculado por el sitio de clonación Spel/Mfel, el 3 'UTR de BBh, una secuencia poli-A de 151 pb, y un sitio de restricción para la linealización con la enzima de clase Ils siguiendo la secuencia poli-A (Fig. 1). Para clonar el ADNc de los factores de reprogramación en pJRG-3s, la región codificante de GFP se escindió de pJRG-3s con enzimas Spel/Mfel y se reemplazó por las secuencias codificantes de Oct4, Klf4, Sox2, cMyc o Lin28 (O,K,S,M,L) respectivamente. Los ADNc se amplificaron por reacción en cadena de la polimerasa de los respectivos plásmidos (Addgene n.° cat. 16579, 16580, 16577, 16578, 17219) usando ADN polimerasa de alta fidelidad (Invitrogen) y cebadores que incluyen en su 5' las secuencias Spel y Mfel para la clonación en pJRG -3s después de la escisión de GFP.
Cada plásmido intermedio resultante se secuenció bidireccionalmente para asegurar la fidelidad, y luego se linealizó y transcribió a ARNm modificado con capuchón (ARNmm) utilizando la ARN polimerasa del kit MEGAscript T7 (Ambion,) y una mezcla de nucleótidos personalizada de nucleótidos canónicos y modificados (TriLink BioTechnologies) en la que las concentraciones finales de nucleótidos por 40 pl de reacción IVT fueron 7,5 mM para cada adenosina-5'-trifosfato (ATP), 5-metilcitidina-5'-trifosfato (m5C) y pseudouridina-5'-trifosfato (^), 1,5 mM para guanosina-5'-trifosfato (GTP) y 6 mM para el análogo de la tapa (ARCA, NEB), o una relación molar de ATP: m5C: ^:GTP:ARCA de 1:1:1:0,2:0,8. El A r N se purificó con columnas de espín MEGAclear (Ambion) y se dividió en dos alícuotas. De ellos, una alícuota se trató con Fosfatasa Antártica (New England Biolabs). El otro, para guardar trifosfatos 5' residuales, fue omitido del tratamiento con fosfatasa. Se volvió a purificar el ARN tratado y se verificó el tamaño y la integridad de todos los productos de ARNm utilizando electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante.
Se obtuvieron fibroblastos de prepucio neonatal humano BJ a partir de ATCC y se cultivaron células alimentadoras de fibroblastos de prepucio humano recién nacido (NuFF) tratadas con mitomicina-C de GlobalStem Cells en DMEM de alta glucosa complementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % y PenStrep (1:100). Los 2 x 104 de fibroblastos BJ se sembraron en un alimentador NuFF a 2,5 x 105 y se sometieron a reprogramación.
El cóctel de reprogramación de ARNm de OKSML se preparó agrupando reservas de ARN individuales para producir una mezcla de 100ng/|jl con la misma molaridad para cada componente excepto para OCT4 incluido a una concentración molar 3x. Los 2,0 x 104 fibroblastos BJ sembrados en un alimentador NuFF a 2,5 x 105 se transfectaron con 1,2 jg de cóctel de OKSML por pocillo de placa de 6 pocillos usando Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante. La transfección se realizó en medio Pluriton (Stemgent) suplementado con suplemento Pluriton (Stemgent) y 200 ng/ml de B18R (eBioscience). El medio se reemplazó 4 horas después de la transfección. Por lo general, se realizaron diez transfecciones consecutivas con 24 horas de diferencia. El experimento se ejecutó en oxígeno ambiental y 5 % de CO2.
Los BJ-FB se transfectaron diariamente 10 veces con nPhT y PhT-OKSML-ARNmm. Después de 10 transfecciones, las células se tiñeron en vivo con 5 jg/m l de anticuerpo StainAlive DyLight 488 TRA-1-60 (Stemgent) y se evaluó la eficacia de la reprogramación usando microscopía fluorescente y FACS. Mostrado en la Figura 4, (A, B, C, D) Análisis inmunofluorescente del marcador pluripotencial TRA-1-60 (A) Campo brillante (BF), (B) células positivas para TRA1-60 el día 10 después de la reprogramación con PhT OKSML-ARNmm Mag x20 y (B) BF, (C) Células positivas para TRA1-60 el día 10 después de la reprogramación con nPhT OKSML-ARNmm Mag x20. Inmediatamente después de la microscopía fluorescente, las células se digirieron con tripsina y se clasificaron por FACS (Becton Dickinson) para detectar células positivas para TRA-1-60. Un gráfico FACS típico (E) demuestra un aumento de la frecuencia de células reprogramadas que expresan el marcador TRA-1-60 con nPh-OKSML ARNmm (el número indica el %). F) Datos cuantitativos de clasificación FACS. Los datos representados como media ± desviación estándar, n=3. Los inventores descubrieron que omitir el tratamiento con fosfatasa aumentó significativamente la eficiencia de la reprogramación de fibroblastos humanos.
Como se muestra en la Figura 5, la reprogramación de BJ-FB con ARNmm de nPhT OKSML es más eficaz y rinde el día 18 (8 días en matrigel) después de la primera transfección de colonias primarias de RiPS con morfología más madura.
Estos datos demuestran que se requiere la activación de la inmunidad innata para una reprogramación nuclear óptima usando ARNmm. La eficiencia de la reprogramación aumentó mediante el uso de ARNm que comprenden un grupo trifosfato 5' intacto. De forma adicional, el uso de ARNmm para modificar la señalización celular y/o el destino celular se mejora utilizando ARNmm que comprenden un trifosfato 5' intacto. De manera más amplia, los inventores mostraron que la activación sustancial de la inmunidad innata por ARNmm es un requisito de la modificación celular óptima por ARNmm.
Ejemplo 2. Importancia de la señalización inmunitaria innata en la extensión de los telómeros.
Las células endoteliales humanas se cultivan en medio completo y en el Pase 14 se pretratan con diferentes inhibidores de NF-kB y PKR. Posteriormente, las células se transfectan con ARNmm de hTERT o p-hTERT usando Lipofec-tomin RNiMax para un total de tres transfecciones a intervalos de 48 horas. Dos días después del tercer tratamiento, se recogen todas las células tratadas y los controles, se prepara el ADN genómico y se cuantifica el alargamiento de los telómeros por el método de qPCR multiplex monocromo (MMqPCR). En algunos casos, las células se tratan con inhibidores de PKR o inhibidores de elementos aguas abajo de la vía de señalización de PKR, tal como NF-kB. El tratamiento con ARNm hTERT o phTERT aumentó la longitud de los telómeros y se duplicó la población, un efecto que fue reducido por inhibidores de PKR o nFkB. Estos estudios indican que la extensión de los telómeros utilizando el ARNm que codifica la telomerasa se beneficia de la activación de la señalización inmune innata para un efecto óptimo.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un método de reprogramación nuclear de una célula somática de mamífero, comprendiendo el método: poner en contacto una población de células somáticas de mamífero in vitro con (a) una dosis eficaz de un activador de la respuesta inmunitaria innata; y (b) una población de ARNm modificado (ARNmm), en donde al menos el 1 % de la población de ARNmm comprende trifosfato 5', codificar un cóctel de reprogramación o factores transcripcionales específicos de linaje; durante un período de tiempo suficiente para reprogramar o transdiferenciar dichas células somáticas de mamífero al tipo de célula de interés deseado; en donde el activador de la respuesta inmunitaria innata lo proporciona el propio ARNm modificado o un agonista de TLR3 o TLR4.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el activador de la respuesta inmunitaria innata y el cóctel de factores de reprogramación codificados por ARNmm se proporcionan simultáneamente.
3. El método de la reivindicación 1, en donde al menos el 5 % de la población de ARNmm, y opcionalmente hasta aproximadamente el 25 %, comprende trifosfato 5'.
4. El método de la reivindicación 1, en donde el resto de ARNm en la población comprende una estructura de capuchón en 5'.
5. El método de la reivindicación 1, en donde el ARNmm se modifica mediante la inclusión de una o ambas de 5-metilcitidina y pseudouridina.
6. El método de la reivindicación 1, en donde el agonista de TLR3 o TLR4 es un ARN bicatenario o un análogo del mismo, en donde la dosis eficaz de un ARN bicatenario o de un análogo del mismo es de 10 ng/ml a 3.000 ng/ml.
7. El método de la reivindicación 1, en donde las células somáticas de mamífero son células humanas.
8. El método de la reivindicación 1, en donde las células se reprograman de una forma senescente a una juvenil, extendiendo los telómeros.
9. El uso de una población de ARNmm en el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que codifica un cóctel de factores de reprogramación o de diferenciación, en donde al menos el 1 % de la población de ARNmm comprende trifosfato 5'.
10. El uso de una población de ARNmm según la reivindicación 9, en donde los factores de reprogramación se seleccionan de Oct 4, KLF4, Sox2, cMyc, Lin28 y Nanog.
11. El uso de una población de ARNmm según la reivindicación 9, en donde uno o más de la población de ARNmm codifican además uno o más de telomerasa, proteínas Shelterina u otras proteínas asociadas a los telómeros.
12. El uso de una población de ARNmm según la reivindicación 9, en donde una o más de la población de ARNmm codifican además hTERT o phTERT.
13. El uso de una población de ARNmm según la reivindicación 9, en donde una o más de la población de ARNmm codifica además t Er C.
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