ES2895391T3 - Análisis celular de fluidos corporales - Google Patents

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Abstract

Un método in vitro para analizar una población de células en una muestra de fluido corporal, el método comprende: diluir la población de células en la muestra de fluido corporal que no comprende sangre completa, con una composición de marcaje, en donde la composición de marcaje comprende: una solución que contiene un tinte fluorescente que penetra una membrana celular y se une a un ácido nucleico para formar un complejo de tinción dentro de la célula, en donde el tinte fluorescente está presente en una cantidad que varía de 0,000001 a 0,5 % (p/v); irradiar el fluido corporal diluido con energía de una fuente de energía; medir una señal de fluorescencia emitida por el complejo de tinción en el fluido corporal teñido; y enumerar las células que contienen ADN en la muestra de fluido en base a la señal de fluorescencia.

Description

DESCRIPCIÓN
Análisis celular de fluidos corporales
Antecedentes de la invención
Se usan diversos métodos para el análisis celular, incluida la inspección visual y/o automatizada mediante microscopía de luz o luz fluorescente. Los exámenes y análisis celulares de estos tipos se practican comúnmente para obtener información sobre el linaje celular, la etapa de maduración y los recuentos de células en una muestra. La citometría de flujo es un método para identificar y distinguir entre diferentes tipos de células en una muestra no homogénea. En el citómetro de flujo, las células pasan una a la vez o casi una a la vez a través de una región de detección donde cada célula es irradiada por una fuente de energía. Típicamente, se usan fuentes de luz de longitud de onda única (por ejemplo, láseres, etc.) como fuente de energía y uno o más de una variedad de sensores registran datos en base a la interacción de las células con la energía aplicada. La citometría de flujo se usa comúnmente en hematología y ha sido particularmente exitosa en el diagnóstico de cánceres sanguíneos. Además de la citometría de flujo, se usan otros métodos analíticos en hematología y en la caracterización de una población de células.
Las muestras de sangre tienden a tener una alta concentración de células. El análisis de muestras con concentraciones de células significativamente más bajas, ya sea por citometría de flujo u otras técnicas, es más difícil y por lo tanto menos común. Además, los analizadores de hematología tradicionales, que están diseñados para medir muestras de sangre total, tienden a tener una sensibilidad de detección limitada para concentraciones bajas de células. En algunos casos, el examen manual de muestras es el único método disponible para el análisis celular. Los métodos mejorados para analizar muestras con bajos recuentos de células son convenientes en los campos de la medicina, la microbiología y otros.
Resumen de la invención
En un aspecto, la descripción proporciona un método para analizar un fluido corporal que contiene células, comprendiendo el método: teñir el fluido corporal con un tinte fluorescente, en donde el tinte fluorescente penetra una membrana celular y se une a un ácido nucleico para formar un complejo de tinción dentro de la célula; irradiar el fluido corporal teñido con energía de una fuente de energía; y medir una señal de fluorescencia emitida por el complejo de tinción en el fluido corporal teñido.
En algunos de estos aspectos, el fluido corporal comprende menos de aproximadamente 20 células/pl.
En algunos de estos aspectos, el fluido corporal comprende más de aproximadamente 20 células/pl.
En algunos de estos aspectos, el ácido nucleico se selecciona entre un ADN y un ARN.
En algunos de estos aspectos, la fuente de energía proporciona luz monocromática que tiene una longitud de onda en el espectro visible, y en donde la longitud de onda de la luz monocromática y la longitud de onda de la señal de fluorescencia son diferentes.
En algunos de estos aspectos, el tinte fluorescente no unido emite menos luz fluorescente cuando se irradia con energía de la fuente de energía en comparación con el complejo de tinción.
En algunos de estos aspectos, el tinte fluorescente no unido no emite fluorescencia cuando se irradia con energía de la fuente de energía mientras no está unido al ácido nucleico, de manera que las células que carecen del complejo de tinción no emiten una señal de fluorescencia.
En algunos de estos aspectos, el método comprende diferenciar las células con núcleo de las células sin núcleo en base a la presencia o ausencia del tinte fluorescente.
En algunos de estos aspectos, la medición implica enumerar y diferenciar RBC y WBC.
En algunos de estos aspectos, el método no implica lisar los RBC antes de la medición.
En algunos de estos aspectos, el fluido corporal comprende WBC y RBC intactos.
En algunos de estos aspectos, la medición se lleva a cabo mediante el uso de un analizador hematológico automático, un citómetro de flujo u otro analizador de diagnóstico para muestras de fluidos corporales.
En algunos de estos aspectos, la medición comprende hacer fluir el fluido corporal a través de una celda de flujo en un citómetro.
En algunos de estos aspectos, el tinte fluorescente se proporciona en una composición que además comprende agua.
En otro aspecto, la descripción proporciona un método para analizar un fluido, en donde el fluido contiene menos de aproximadamente 40 células/pl, el método comprende: poner en contacto el fluido con un tinte fluorescente, en donde el tinte fluorescente penetra una membrana celular y se une a un ácido nucleico para formar un complejo de tinción dentro de la célula; irradiar el fluido con energía de una fuente de energía; y medir una señal de fluorescencia emitida por el complejo de tinción en el fluido.
En algunos de estos aspectos, el fluido contiene menos de aproximadamente 20 células/pl.
En algunos de estos aspectos, el fluido contiene menos de aproximadamente 5 células/pl.
En algunos de estos aspectos, el fluido es un fluido corporal.
En algunos de estos aspectos, el fluido es un fluido biológico.
En otro aspecto, la descripción proporciona un método para diferenciar células, el método comprende: poner en contacto las células con una solución que comprende un tinte fluorescente, en donde el tinte fluorescente es soluble en agua, capaz de penetrar una membrana celular y capaz de unirse a un ácido nucleico; irradiar las células con una luz de excitación de una fuente de luz de excitación; y medir las emisiones de luz de las células y diferenciar las células que contienen ácidos nucleicos de las células que carecen de ácidos nucleicos en base a la medición.
En otro aspecto, la descripción proporciona una composición para analizar un fluido corporal, la composición comprende agua y un tinte fluorescente, en donde el tinte fluorescente es soluble en agua, capaz de penetrar una membrana celular y capaz de unirse a un ácido nucleico.
En otro aspecto, la descripción proporciona un sistema de hematología que comprende: un portamuestras para contener una muestra a analizar; un recipiente de mezcla para mezclar al menos una porción de la muestra a analizar con una composición de tinción; un receptáculo de almacenamiento para almacenar la composición de tinción, en donde la composición de tinción comprende un tinte capaz de penetrar una membrana celular y unirse a un ácido nucleico, y en donde el tinte es fluorescente cuando se une a un ácido nucleico; una celda de flujo; al menos una fuente de energía para aplicar energía electromagnética a la celda de flujo; uno o más detectores para detectar la fluorescencia que se origina dentro de la celda de flujo; y uno o más detectores de luz visible para detectar luz visible dispersa.
En algunos de estos aspectos, el sistema comprende un mecanismo de aspiración para aspirar al menos una porción de la muestra a analizar desde el portamuestras al receptáculo de mezcla.
En algunos de estos aspectos, el sistema comprende un mecanismo de aspiración para aspirar la composición de tinción desde el receptáculo de almacenamiento al receptáculo de mezcla.
En algunos de estos aspectos, al menos una fuente de energía proporciona luz monocromática a una longitud de onda A1.
En algunos de estos aspectos, el tinte absorbe luz en la longitud de onda A1 y emite luz en la longitud de onda A2 cuando el tinte se une a un ácido nucleico.
En algunos de estos aspectos, el detector detecta luz en la longitud de onda A2.
En algunos de estos aspectos, el sistema comprende al menos una fuente de energía adicional para proporcionar luz visible no monocromática.
En algunos de estos aspectos, la muestra a analizar es un fluido corporal.
En otro aspecto, la descripción proporciona un método para preparar un sistema de hematología, el método comprende: proporcionar un receptáculo de mezcla para mezclar al menos una porción de una muestra a analizar con una composición de tinción; proporcionar un receptáculo de almacenamiento para almacenar la composición de tinción, en donde la composición de tinción comprende un tinte capaz de penetrar una membrana celular y unirse a un ácido nucleico, y en donde el tinte es fluorescente cuando se une a un ácido nucleico; proporcionar una celda de flujo; posicionar una fuente de energía para proporcionar energía electromagnética a la celda de flujo; colocar un detector para detectar la fluorescencia emitida dentro de la celda de flujo.
En otro aspecto, la descripción proporciona un método para preparar un receptáculo para su uso en el análisis de un fluido corporal, el método comprende añadir al receptáculo una composición que comprende un tinte capaz de penetrar una membrana celular y unirse a un ácido nucleico, en donde el tinte es fluorescente cuando se une a un ácido nucleico, y en donde el receptáculo es una parte integrada o modular de un sistema de hematología.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 proporciona una imagen esquemática de un aspecto de un método de análisis de fluidos corporales descrito en la presente descripción. Los WBC se separan de los RBC tras la interacción ADN-colorante y la posterior emisión de fluorescencia. La información de fluorescencia, así como también otras señales de dispersión óptica, se usan en el análisis celular de muestras de fluidos corporales. FL1 indica la fluorescencia recogida con un filtro de ancho de banda de 530 ± 20 nm. ALL e IAS son las señales de dispersión de luz recopiladas en 0 a 1 grados y 3 a 10 grados, respectivamente.
La Figura 2A es un diagrama de dispersión (ALL frente a IAS) de análisis celular para una muestra de fluido corporal. WBC = 89/pl (referencia = 81/pl); RBC = 2012/pl (referencia = 1733/pl).
La Figura 2B es un diagrama de dispersión (FL1 frente a ALL) de análisis celular para una muestra de fluido corporal. Los WBC y los RBC están bien separados en fluorescencia (FL1). WBC = 89/pl (referencia = 81/pl); RBC = 2012/pl (referencia = 1733/pl).
La Figura 3A es un diagrama de dispersión (ALL frente a IAS) del análisis celular de otra muestra de fluido corporal. WBC = 0,95/pl (referencia = 0,33/pl); RBC = 142/pl (referencia = 122/pl).
La Figura 3B es un diagrama de dispersión (FL1 frente a ALL) del análisis celular de otra muestra de fluido corporal. Los WBC y los RBC están bien separados en fluorescencia (FL1). WBC = 0,95/pl (referencia = 0,33/pl); RBC = 142/pl (referencia = 122/pl).
La Figura 4A es un diagrama de dispersión FL1 frente a IAS de la primera dilución de una dilución en serie de seis niveles de una muestra de capa linfocitaria. La muestra de capa linfocitaria original contiene 6,1 x 103/pl de WBC y 15 x 103/pl de RBC. Los seis niveles, (A), (B), (C), (D), (E) y (F), se prepararon en base a 1:10, 1:30, 1:100, 1:300, 1:1000 y 1:3000, respectivamente, diluidos con PBS. Todas las muestras se midieron mediante el uso de una dilución en un analizador de prototipo.
La Figura 4B es un diagrama de dispersión FL1 frente a IAS de la segunda dilución de una serie de diluciones de seis niveles de una muestra de capa linfocitaria. La muestra de capa linfocitaria original contiene 6,1 x 103/pl WBC y 15 x 103/pl de RBC. Los seis niveles, (A), (B), (C), (D), (E) y (F), se prepararon en base a 1:10, 1:30, 1:100, 1:300, 1:1000 y 1:3000, respectivamente, diluidos con PBS. Todas las muestras se midieron mediante el uso de una dilución en un analizador de prototipo.
La Figura 4C es un diagrama de dispersión FL1 frente a IAS de la tercera dilución de una serie de diluciones de seis niveles de una muestra de capa linfocitaria. La muestra de capa linfocitaria original contiene 6,1 x 103/pl WBC y 15 x 103/pl de RBC. Los seis niveles, (A), (B), (C), (D), (E) y (F), se prepararon en base a 1:10, 1:30, 1:100, 1:300, 1:1000 y 1:3000, respectivamente, diluidos con PBS. Todas las muestras se midieron mediante el uso de una dilución en un analizador de prototipo.
La Figura 4D es un diagrama de dispersión FL1 frente a IAS de la cuarta dilución de una serie de diluciones de seis niveles de una muestra de capa linfocitaria. La muestra de capa linfocitaria original contiene 6,1 x 103/pl WBC y 15 x 103/pl de RBC. Los seis niveles, (A), (B), (C), (D), (E) y (F), se prepararon en base a 1:10, 1:30, 1:100, 1:300, 1:1000 y 1:3000, respectivamente, diluidos con PBS. Todas las muestras se midieron mediante el uso de una dilución en un analizador de prototipo.
La Figura 4E es un diagrama de dispersión f L1 frente a IAS de la quinta dilución de una serie de diluciones de seis niveles de una muestra de capa linfocitaria. La muestra de capa linfocitaria original contiene 6,1 x 103/pl WBC y 15 x 103/pl de RBC. Los seis niveles, (A), (B), (C), (D), (E) y (F), se prepararon en base a 1:10, 1:30, 1:100, 1:300, 1:1000 y 1:3000, respectivamente, diluidos con PBS. Todas las muestras se midieron mediante el uso de una dilución en un analizador de prototipo.
La Figura 4F es un diagrama de dispersión FL1 v IAS de la sexta dilución de una dilución en serie de seis niveles de una muestra de capa linfocitaria. La muestra de capa linfocitaria original contiene 6,1 x 103/pl WBC y 15 x 103/pl de RBC. Los seis niveles, (A), (B), (C), (D), (E) y (F), se prepararon en base a 1:10, 1:30, 1:100, 1:300, 1:1000 y 1:3000, respectivamente, diluidos con PBS. Todas las muestras se midieron mediante el uso de una dilución en un analizador de prototipo.
La Figura 5 proporciona gráficos de correlación de conteo de WBC (medidos frente a calculados) entre los seis niveles de muestras de capa linfocitaria diluidas (A) y tres muestras de gama baja únicamente (B). Múltiples puntos en cada nivel indican que se realizaron múltiples corridas. Las correlaciones generales fueron: Y = 1,0239 X - 4,9 (R2 = 0,9984) para los seis niveles y Y = 1,0787 X - 1,5 (R2 = 0,9598) para los tres niveles con las concentraciones de células más bajas.
La Figura 6 proporciona gráficos de correlación de conteo de células blancos (método actual frente a referencia) para 91 muestras de fluidos corporales. Las correlaciones se trazaron en diferentes intervalos: (A) intervalo completo (~ 40 000/pl), (B) <2000/pl, (C) <200/pl y (D) <50/pl. La relación de dilución fue 1:35 (muestra a reactivo de marcaje).
La Figura 7 proporciona gráficos de correlación de conteo de RBC (método actual frente a referencia) para 91 muestras de fluidos corporales. Las correlaciones se trazaron en diferentes intervalos: (A) intervalo completo (~ 200000/pl), (B) <3000/pl, (C) <200/pl y (D) <50/pl. Las muestras con conteos de células rojas fantasmas no se incluyeron en el análisis de correlación. La relación de dilución fue 1:35 (muestra a reactivo de marcaje).
La Figura 8 es un gráfico de correlación de conteo de WBC (método inventado frente a referencia) para 72 muestras de fluidos corporales con concentraciones de células muy bajas (conteo de células blancas <50/pl). La relación de dilución fue 1:10 (muestra a reactivo de marcaje).
La Figura 9 es un gráfico de correlación de conteo de RBC (método actual frente a referencia) para 38 muestras de fluidos corporales con concentraciones de células muy bajas (conteo de células rojas <50/pl). Las muestras con muchas células rojas fantasmas no se incluyeron en el análisis de correlación. La relación de dilución fue 1:10 (muestra a reactivo de marcaje).
Descripción detallada
Definiciones
A menos que se especifique de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que el que se conoce comúnmente por los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente descripción también se puede usar en la práctica o prueba de la presente descripción, los métodos y materiales ilustrativos y representativos se describen en la presente descripción. Se entiende que la presente descripción reemplaza cualquier descripción de una publicación citada en la medida en que exista una contradicción. Se hace notar que, como se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto lo dicte claramente de cualquier otra manera. Se hace notar además que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración pretende servir como base de antecedente para el uso de tal terminología exclusiva como "únicamente", "solo" y similares en relación con la recitación de los elementos de acuerdo con la reivindicación, o el uso de una limitación "negativa".
El término "típicamente" se usa para indicar prácticas comunes de la descripción. El término indica que tal descripción es ilustrativo, aunque (a menos que se indique de otra forma) no es necesaria, para los materiales y métodos de la descripción. Por lo tanto, el término "típicamente" debe interpretarse como "típicamente, aunque no necesariamente". De manera similar, el término "opcionalmente", como en un material o componente que está opcionalmente presente, indica que la descripción incluye casos en donde el material o componente está presente, y también incluye casos en los que el material o componente no está presente.
Como se usa en la presente, el término "fluido corporal" se refiere a los fluidos presentes u obtenidos de un animal, incluidos los fluidos como el fluido cefalorraquídeo, el fluido peritoneal, el fluido pericárdico, el fluido pleural, el fluido sinovial, la orina, la saliva, las lágrimas, el semen, el líquido amniótico, esputo y similares, así como también fluidos obtenidos de quistes, tumores y similares. A menos que se especifique de cualquier otra manera, el término "fluido corporal" no incluye sangre completa, aunque un fluido corporal puede contener glóbulos rojos (RBC) y/o glóbulos blancos (WBC).
En algunos aspectos, la descripción proporciona métodos y materiales para analizar fluidos con bajo recuento de células. Por recuento de células bajo se entiende fluidos que tienen menos de aproximadamente 100 células/pl, o menos de aproximadamente 80 células/pl, o menos de aproximadamente 60 células/pl, o menos de aproximadamente 40 células/ pl, o menos de aproximadamente 30 células/pl, o menos de aproximadamente 20 células/pl, o menos de aproximadamente 10 células/pl, o menos de aproximadamente 5 células/pl. En algunas modalidades, este recuento de células tan bajo es el resultado de la dilución de una muestra original más concentrada. En otras modalidades, dicho recuento de células bajo es una característica natural del fluido que se va a analizar (es decir, no es necesaria ninguna dilución para lograr el recuento de células bajo).
Los fluidos a analizar mediante el uso de los métodos y materiales descritos en la presente descripción se seleccionan, en algunas modalidades, de un fluido corporal. En otras modalidades, los fluidos a analizar son de naturaleza biológica pero no son fluidos corporales. En algunas modalidades, el fluido que se va a analizar se "sintetiza", lo que significa que se añade una población de células a un fluido, en donde el fluido es biológicamente compatible pero no es el fluido en el que normalmente se encuentran las células. Los ejemplos de tales fluidos incluyen soluciones acuosas tamponadas y similares.
Materiales
En algunas modalidades, los métodos de interés implican poner en contacto una población de células con una composición de marcaje adecuada para ayudar en la caracterización deseada de las células. En algunas modalidades, la composición de marcaje comprende un tinte fluorescente y, opcionalmente, comprende además componentes adicionales tales como los que se describen más abajo en la presente descripción. Los componentes de la composición de marcaje y la concentración relativa de dichos componentes se pueden variar de acuerdo con las necesidades y requisitos del uso previsto. La composición de marcaje, con o sin el tinte presente, puede denominarse alternativamente en la presente descripción como "reactivo".
Los métodos y materiales de interés implican un tinte fluorescente (también denominado en la presente descripción "tinte"). El tinte fluorescente puede ser cualquier tinte adecuado que tenga las características necesarias o adecuadas para llevar a cabo los métodos de interés. Por ejemplo, en algunas modalidades, el tinte es soluble en agua. Por ejemplo, en algunas modalidades, el tinte fluorescente tiene una solubilidad acuosa de al menos 1 pg/L, o al menos 5 pg/L, o al menos 10 pg/L, o al menos 20 pg/L, o al menos 50 pg/L. En algunas modalidades, el tinte es estable en soluciones acuosas, lo que significa que el tinte no se degrada significativamente en la escala de tiempo adecuada para los métodos de análisis descritos en la presente descripción. Por ejemplo, el tinte es estable en una solución acuosa tamponada (por ejemplo, reactivo celular) a temperatura ambiente (por ejemplo, aproximadamente 20-25 °C) durante al menos 30 min, o al menos 1 hora o al menos 6 horas, o al menos al menos 12 horas, o al menos 24 horas, o al menos 2 días, o al menos 7 días, o al menos 1 mes. También, por ejemplo, el tinte es estable en una solución acuosa tamponada (por ejemplo, reactivo celular) bajo refrigeración (por ejemplo, más abajo de aproximadamente 10 °C) durante al menos 1 hora, o al menos 12 horas, o al menos 24 horas, o al menos al menos 2 días, o al menos 7 días, o al menos 1 mes, o al menos 6 meses, o al menos 12 meses.
En algunas modalidades, el tinte puede penetrar una membrana celular, como las paredes de las células sanguíneas o similares. En algunas modalidades, el tinte puede penetrar además en el núcleo de una célula una vez dentro de una célula.
En algunas modalidades, el tinte se une a un ácido nucleico. En algunas modalidades, el tinte se une al ADN. En algunas modalidades, los colorantes de interés se unen al ADN, pero no al ARN. En algunas modalidades, los colorantes de interés se unen preferentemente al ADN sobre al ARN. En algunas modalidades, la unión del tinte a una molécula de ADN implica enlaces de hidrógeno u otra interacción no covalente. En algunas modalidades, el colorante se une a una hebra sencilla de ADN o una hebra sencilla de un complejo de ADN de doble hebra. En algunas modalidades, el tinte se une a ambas cadenas de un complejo de ADN de doble cadena.
A lo largo de esta especificación, un tinte unido al ADN se denomina complejo de tinción. En algunas modalidades, el tinte se une al ADN con una alta afinidad y una constante de unión alta. En algunas modalidades, y como se menciona en la presente descripción, la afinidad y concentración del tinte es lo suficientemente grande como para que el tinte sea suficiente para "teñir" (después de la penetración y unión a ADN) al menos 250000 células/pl.
En algunas modalidades, el tinte es fluorescente. Por lo tanto, el tinte absorbe la luz incidente en una longitud de onda o un grupo de longitudes de onda alrededor de una longitud de onda de absorción máxima (también denominada longitud de onda de excitación máxima) y emite luz en otra longitud de onda o en un grupo de longitudes de onda alrededor de un pico de emisión de longitud de onda. En algunas modalidades, el pico de absorción de longitud de onda es diferente del pico de emisión de longitud de onda. Además, en algunas modalidades, el pico de adsorción de longitud de onda y/o el pico de emisión de longitud de onda de emisión es dependiente del entorno del tinte. Por ejemplo, en algunas modalidades, el pico de absorción de longitud de onda y/o el pico de emisión de longitud de onda para un colorante unido al ADN (es decir, un complejo de tinción) difiere del pico de adsorción de longitud de onda y/o el pico de emisión de longitud de onda para un colorante no ligado.
En algunas modalidades, el pico de adsorción de longitud de onda y el pico de emisión de longitud de onda para un complejo de tinción difieren en al menos 10 nm, o al menos 15 nm, o al menos 20 nm, o al menos 25 nm, o al menos 30 nm, o al menos al menos 35 nm, o al menos 40 nm, o al menos 45 nm, o al menos 50 nm. En algunas modalidades, el pico de absorción de longitud de onda para un complejo de tinción está en el intervalo de 400­ 700 nm. Por ejemplo, en algunas modalidades el pico de absorción está en el intervalo de 425-550 nm, o en el intervalo de 450-525 nm, o en el intervalo de 475-500 nm, o en el intervalo de 480-495 nm, o en el intervalo de 485­ 490 nm. También, por ejemplo, en algunas modalidades el pico de absorción está en el intervalo de 500-700 nm, o en el intervalo de 550-675 nm, o en el intervalo de 600-650 nm, o en el intervalo de 620-640 nm.
En algunas modalidades, el pico de emisión de longitud de onda para un complejo de tinción está en el intervalo de 425-800 nm, tal como en el intervalo de 425-700 nm. Por ejemplo, en algunas modalidades, el pico de emisión de longitud de onda está en el intervalo de 450-650 nm, o en el intervalo de 475-625 nm, o en el intervalo de 500­ 550 nm, o en el intervalo de 510-540 nm, o en el intervalo de 520-530 nm.
Por ejemplo, en algunas modalidades, el tinte fluorescente se selecciona entre naranja tiazol o 1-metil-4-[(3-metil-2-(3H)-benzotiazoliliden)metil] quinolinio-tosilato, azul de tiazol, 4-[(3-Diyoduro de metil-2-(3H)-benzotiazoliliden)metil]-1-[3-(trimetilamonio)propil]quinolinio, yoduro de 3,3'-dimetiloxacarbocianina o 3-metil-2-[3(3-metil-2(3H))-benzotiazoliliden-1-propenilo] yoduro de benzoxazolio, tioflavina T, los tintes SYTO® y TOTO® (Life Technologies), bromuro de etidio, yoduro de propidio, naranja de acridina, corifosfina O, auramina O, los tintes HOECHST 33258 (2'-(Hidrato de triclorhidrato de 4-hidroxifenilo)-5-(4metil-1-piperizinilo)-2,5'-bi-1H-bencimidazol) y HOECHST 33342® (2'-(4-etoxifenilo)-5-(4-metil-1-piperizinilo)-2,5'-bi-1H-benzimidazol triclorhidrato), 4'6-diamino-2-fenilindol diclorhidrato (DAPI), 4',6-(diimidazolin-2-il)-2-fenilindol diclorhidrato(DIPI), 7-aminoactinomicina D, actinomicina D y LDS 751 (2-(4-(4-dimetilaminofenilo)-1,3-butadienil)-3-perquiorato de etilbenzotiazolio), o un colorante vendido con el nombre comercial SYBR® (Life Technologies, por ejemplo, SYBR Green, SYBR Gold, SYBR 11, etc.) o similares.
En algunas modalidades, además de un tinte como se describió anteriormente, una composición de mareaje de interés comprende además uno o más de los componentes identificados en los siguientes párrafos. Se apreciará que las listas más abajo son sólo representativas y que se pueden realizar sustituciones cuando se desee mediante el uso de materiales química y/o biológicamente equivalentes.
En algunas modalidades, la composición de marcaje contiene un tensioactivo o detergente. Pueden emplearse tensioactivos iónicos y neutros. Por ejemplo, pueden usarse tensioactivos de ion híbrido tales como glucósidos esteroides (por ejemplo, Big CHAP, Big Doxy CHAP, etc.) y glucopiranósidos, así como también otros tensioactivos conocidos en la técnica. Los tensioactivos pueden estar presentes en la composición de marcaje en cualquier cantidad adecuada, tal como 0,0001 - 0,1 % (p/v).
En algunas modalidades, la composición de marcaje contiene además un tampón o modificador de pH. Los ejemplos de tampones o modificadores de pH incluyen, pero no se limitan a, PBS, MOPs y HEPES. Ejemplos de tampones o modificadores de pH adicionales incluyen: ácidos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido acético, ácido fosfórico y similares; bases tales como hidróxido de sodio, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, aminas orgánicas (por ejemplo, imidazol, trietilamina, etc.) y similares; y sales tales como cloruro de sodio, cloruro de calcio y similares. Por ejemplo, un material tampón orgánico tal como imidazol puede estar presente en la composición de marcaje en una concentración en el intervalo de aproximadamente 0,001 - 3 % (p/v). También, por ejemplo, un material inorgánico tal como HCl puede estar presente en una concentración en el intervalo de aproximadamente 0,001 - 5 % (p/v). De manera similar, una sal tal como NaCl puede estar presente en una concentración en el intervalo de aproximadamente 0,001 - 3 % (p/v). Como se mencionó anteriormente, se conocen equivalentes de tales materiales y pueden sustituirse cuando sea apropiado.
En algunas modalidades, los métodos y materiales de interés implican además componentes adicionales según sea necesario o deseado. Ejemplos de tales componentes adicionales incluyen colorantes, conservantes, agentes antimicrobianos, ajustadores de osmolalidad y cosolventes.
Por ejemplo, puede estar presente un agente antimicrobiano como Proclin (por ejemplo, Proclin 150, 200, 300, etc.), vancomicina, penicilina y similares. El agente antimicrobiano puede estar presente en una concentración en el intervalo de aproximadamente 0,001 - 0,5 % (p/v).
En algunas modalidades, se pueden preparar soluciones madre de varios componentes durante la preparación de las composiciones de marcaje de interés. Por ejemplo, se pueden preparar soluciones madre de cualquier componente (por ejemplo, compuesto colorante, etc.), para ayudar a solubilizar los componentes o medir con precisión los volúmenes de los componentes. Las soluciones madre se pueden preparar mediante el uso de agua como solvente o mediante el uso un solvente orgánico tal como dimetilsulfóxido, isopropanol, etanol o metanol, o mediante el uso de una combinación de los mismos.
En algunas modalidades, los métodos y materiales de interés implican una solución acuosa de los componentes identificados anteriormente. Se apreciará que la concentración de los diversos componentes presentes en la composición de marcaje puede variar de acuerdo con el uso pretendido. Los párrafos anteriores y más abajo proporcionan algunas pautas para las concentraciones de materiales presentes en la composición de marcaje. Como se indica en la presente descripción, en algunas modalidades la composición de marcaje se combina con un fluido a analizar (por ejemplo, un fluido corporal). En consecuencia, aunque las pautas proporcionadas en la presente descripción se refieren a cantidades de varios componentes presentes en la composición de marcaje, se apreciará que dichas pautas también son aplicables a la combinación de la composición de marcaje y el fluido a analizar (es decir, en algunas modalidades, el material que se analiza realmente en un analizador de hematología como se describe en la presente descripción contendrá porcentajes y cantidades relativas similares de los diversos componentes).
En algunas modalidades, el tinte está presente en la composición de marcaje en una concentración predeterminada. Se apreciará que la concentración predeterminada puede variar en dependencia de la identidad del tinte (es decir, la estructura química, afinidad de unión por el ácido nucleico diana, etc.) así como también de los parámetros operativos del analizador que se usará. En algunas modalidades, el componente colorante está presente en una cantidad necesaria para teñir al menos el número de células presentes en el fluido corporal, como 10 células/pl o más, o 50 células/pl o más. Por ejemplo, el tinte está presente en una cantidad necesaria para teñir 100 000 células/pl o más, o 200000 células/pl o más, o 250000 células/pl o más. En algunas modalidades, la cantidad de compuesto colorante presente está en el intervalo de 0,000001-0,5 % o 0,00001-0,5 % o 0,0001-0,5 % o 0,001­ 0,1 % (p/v).
En algunas modalidades, está presente un agente tamponador orgánico en la composición de marcaje. Los ejemplos de dicho material incluyen aminas orgánicas, como trietilamina, trimetilamina y aminas cíclicas como imidazol y similares. El agente tampón orgánico (junto con cualquier otro tampón) puede estar presente en una cantidad necesaria para crear y mantener un pH deseado en la composición de analito.
En algunas modalidades, la composición de mareaje que contiene un tinte de interés es isotónica o sustancialmente isotónica (es decir, dentro de aproximadamente el 20 % de isotónico, o dentro de aproximadamente el 10 % de isotónico, o dentro de aproximadamente el 5 % de isotónico). En algunas modalidades, la composición de marcaje que contiene un tinte de interés tiene un pH neutro o un pH sustancialmente neutro (es decir, dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 6-8, o aproximadamente 6,5-7,5). Estas características de la composición de marcaje ayudan a reducir el daño a las células de cualquier tipo durante la preparación y el análisis de la muestra y, por lo tanto, dan como resultado un análisis celular más preciso de las muestras de fluidos corporales.
Métodos
En algunas modalidades, los métodos de interés implican poner en contacto la población de células con la composición de marcaje. En algunas de tales modalidades, el contacto implica mezclar la composición de marcaje con un fluido (por ejemplo, un fluido corporal) que contiene las células que se van a analizar. Por tanto, en algunas modalidades, los métodos de interés implican diluir una muestra de fluido que contiene células con una composición de marcaje, en donde la composición de marcaje comprende agua y un tinte, y opcionalmente comprende otros componentes tales como los proporcionados en la presente descripción. En algunas de tales modalidades, los métodos implican una única etapa de dilución (es decir, añadir la composición de marcaje a la muestra de fluido sólo una vez) en una relación de dilución predeterminada que proporciona una concentración óptima de analito para la detección y medición de fluorescencia.
En algunas modalidades, debido a que los tintes de interés se unen al ADN, las células que carecen de ADN no pueden formar un complejo de tinción cuando se exponen al tinte. Las células que carecen de ADN que han sido expuestas al tinte, por lo tanto, no exhiben las características de emisión del complejo de tinción cuando se analizan mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción (por ejemplo, cuando se exponen a una fuente de energía de excitación de fluorescencia) o solo emiten una fluorescencia mínima o débil debido a la autofluorescencia. Por el contrario, las células que contienen ADN pueden formar un complejo de tinción. Tales células, cuando se tiñen con un tinte de interés, exhiben las características de emisión del complejo de tinción cuando se analizan mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción. En vista de esta distinción, en algunas modalidades los métodos de interés proporcionan un medio para diferenciar las células que contienen ADN de las células que carecen de ADN. En algunas modalidades, los métodos de interés también proporcionan un medio para diferenciar las células que contienen un núcleo de las células que carecen de núcleo, particularmente cuando el núcleo contiene ADN. En algunas modalidades, la diferenciación se proporciona en base a mediciones de fluorescencia que observan la fluorescencia de una célula (indicando la presencia de ADN y posiblemente indicando la presencia de un núcleo) o no observan la fluorescencia de una célula (lo que indica la falta de ADN y posiblemente indicando la falta de un núcleo en la célula). Además, los eventos no celulares (por ejemplo, objetos no celulares que carecen de ADN) presentes en el fluido que se analiza se diferencian por la falta de emisión de la fluorescencia característica.
Por ejemplo, cuando los RBC se exponen al tinte, los RBC maduros (que carecen de núcleo y carecen de ADN) no forman el complejo de tinción. Por lo tanto, los RBC expuestos al tinte no exhiben las características de emisión del complejo de tinción cuando se analizan mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción. Por el contrario, los WBC contienen un núcleo y ADN y, por lo tanto, forman el complejo de tinción cuando se exponen al tinte. En algunas modalidades, por lo tanto, los métodos de interés permiten la diferenciación de los WBC de los RBC en una muestra que contiene tales células. La diferenciación se basa en la presencia o ausencia de una señal fluorescente indicativa de la formación del complejo de tinción.
Además de la diferenciación como se describió anteriormente, la formación del complejo de tinción entre un tinte de interés y el ADN también permite la enumeración de células que contienen ADN en una muestra de fluido que contiene células. Por ejemplo, los métodos de interés incluyen enumerar los WBC en una muestra de fluido que contiene tales células. La enumeración se basa en la observación de la fluorescencia indicativa de la formación del complejo de tinción en un método adecuado para contar células. Los métodos adecuados incluyen analizadores de hematología automatizados tales como citómetros de flujo y otros métodos de recuento de células basados en fluorescencia.
Como se menciona en la presente descripción, los métodos de interés permiten la enumeración y diferenciación de WBC en una muestra que contiene WBC y otros objetos (por ejemplo, RBC y eventos no celulares). En algunas modalidades, la muestra es un fluido, como un fluido corporal, y contiene una concentración muy baja de células como se describe con más detalle en la presente descripción. En algunas modalidades, los métodos de la presente descripción permiten además la clasificación de WBC en diferenciales de 2 partes, 3 partes o 5 partes mediante el uso de tecnologías de dispersión de múltiples ángulos. En determinadas modalidades, los RBC se pueden separar adicionalmente de otras partículas que no son RBC mediante el uso de tecnologías de dispersión de múltiples ángulos.
En algunas modalidades, los métodos de interés no implican un agente de lisis y no implican lisar células antes de registrar datos. Por ejemplo, los métodos de interés no implican añadir un agente de lisis a la muestra de fluido que contiene las células antes del análisis de la muestra de fluido. Por tanto, en algunas modalidades, la composición de mareaje no contiene un agente de lisis. Las muestras de fluido que se analizan no son lisados y no contienen contenidos celulares que se hayan liberado de una célula mediante lisis. En algunas modalidades, las muestras de fluido a analizar contienen RBC intactos y dichos RBC no se lisan antes de las mediciones de fluorescencia. Por "agente de lisis" se entiende que incluye cualquier material que provoque una lisis celular significativa, particularmente (pero no se limita a) lisis de RBC. Los agentes de lisis incluyen, pero no se limitan a, varios tipos de tensioactivos, enzimas, anticuerpos, agentes de ajuste del pH, osmolitos (agentes de ajuste de la osmolalidad) y similares que se conocen en la técnica o se descubren posteriormente.
Debido a que los agentes de lisis no están involucrados en la preparación de las muestras de fluido que se van a analizar, los WBC presentes en el fluido no se dañan como lo estarían o podrían estar si se emplearan agentes de lisis. Esto es particularmente ventajoso en los fluidos corporales que contienen WBC, porque los WBC contenidos en ellos son típicamente más frágiles que los WBC en sangre completa.
Como se mencionó anteriormente, en algunas modalidades los métodos de interés implican la dilución con una cantidad predeterminada de composición de marcaje para proporcionar una relación de dilución deseada y una concentración de analito deseada. La cantidad predeterminada se puede determinar en base a los límites de detección en el aparato usado para el análisis de la muestra de fluido. En algunas modalidades, el límite de detección se optimiza mediante ajustes en la velocidad de inyección de la muestra (con relación a la velocidad de la celda de flujo), la duración de la medición y similares. Por ejemplo, un analizador de prototipo con una relación de dilución 1:l0 (sangre: reactivo), una velocidad de inyección de 4,0 pl por segundo y una medición de muestra en 60 segundos (recogida de datos), daría como resultado una recopilación de aproximadamente 240 eventos para una muestra a 10 células por pl, suficiente para soportar un análisis celular preciso.
En algunas modalidades, los métodos de interés son adecuados para analizar cualquier muestra de fluido con WBC. Como se mencionó anteriormente, tales muestras de fluidos incluyen fluidos corporales, y también incluyen otras muestras de fluidos como soluciones acuosas preparadas de células, soluciones a base de plantas y derivadas de plantas, y similares, particularmente donde tales muestras de fluidos contienen recuentos de células bajos (por ejemplo, menos de 40 células/pl, o menos de 30 células/pl, etc.).
En algunas modalidades, los métodos de interés proporcionan un medio simple, confiable y preciso para enumerar y diferenciar los WBC en una muestra de fluido que contiene WBC y opcionalmente que contiene r Bc . La detección de fluorescencia mediante el uso de analizadores de hematología automatizados garantiza precisión y confiabilidad, y el uso de dilución en un solo paso proporciona simplicidad en la preparación de muestras. La muestra de fluido que contiene las células se tiñe con un marcador fluorescente contenido en una composición de marcaje, en donde el marcador fluorescente penetra las paredes celulares y se une al ADN para crear un complejo de tinción. Los WBC teñidos emiten señales de emisión fluorescentes indicativas del complejo de tinción, mientras que los RBC no emiten tales señales ni las emiten con una intensidad significativamente menor. La composición de marcaje está libre de agentes de lisis y no se añaden agentes de lisis a la muestra de fluido, lo que protege de esta manera los WBC presentes. Los límites de detección óptimos se determinan mediante el ajuste de variables que incluyen el régimen de flujo de muestra, la frecuencia de detección y similares.
Resultados y ventajas
En algunas modalidades, el análisis de los fluidos teñidos da como resultado una variedad de información adecuada para análisis de datos multidimensionales, gráficos y similares. Por ejemplo, en algunas modalidades, los métodos descritos en la presente descripción proporcionan un recuento total de WBC exacto. En algunas modalidades, los métodos proporcionan datos sobre las proporciones relativas de diferentes tipos de WBC en una muestra (por ejemplo, recuentos celulares de neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfocitos y/o monocitos, o varias de sus combinaciones). Dichos datos pueden usarse, por ejemplo, como información de diagnóstico en el tratamiento de pacientes.
Como se menciona en la presente descripción, en algunas modalidades los métodos de interés implican teñir selectivamente los WBC en una muestra de fluido mediante la introducción de un tinte que se une selectivamente al ADN y emite fluorescencia cuando así se une. En consecuencia, el análisis de una muestra de fluido teñida incluye registrar las emisiones de fluorescencia más fuertes que se originan en las células que contienen un complejo de tinción (por ejemplo, WBC) en comparación con las emisiones de fluorescencia débiles o inexistentes que se originan en las células que carecen del complejo de tinción (por ejemplo, RBC). Las medidas de fluorescencia se pueden obtener mediante el uso de, por ejemplo, analizadores de dispersión óptica multicanal.
En algunas modalidades, los materiales y métodos de interés permiten el análisis celular de fluidos corporales y otros fluidos útiles, por ejemplo, en diagnósticos médicos. El análisis celular de muestras de fluidos con recuentos de células muy bajos (por ejemplo, menos de 40 por pl, o menos de 10 por pl, etc.) se permite mediante los métodos descritos en la presente descripción, incluidos los fluidos corporales que tienen células particularmente frágiles. La simplicidad de los métodos permite que tales muestras se analicen dentro de 1-2 horas después de la extracción de la muestra de un paciente, lo que también ayuda en el análisis de células frágiles. La falta de agentes de lisis celular en las composiciones y métodos descritos en la presente descripción se suma además a la capacidad de analizar muestras que contienen células frágiles. El daño a las células frágiles en los fluidos de interés da como resultado potencialmente un análisis inexacto, como recuentos de células y diferenciación celular inexactos.
Las relaciones de dilución óptimas ofrecidas por los métodos descritos en la presente descripción son una mejora adicional con respecto al análisis hematológico tradicional. Por ejemplo, las proporciones de dilución (es decir, sangre: diluyente = 1:300 para la dilución de RBC) usadas por los analizadores de hematología tradicionales no son lo suficientemente sensibles para soportar la medición de muestras con concentraciones celulares muy bajas. Por el contrario, en algunas modalidades, los métodos descritos en la presente descripción permiten una sola dilución para proporcionar una relación de dilución óptima para una detección de fluorescencia óptima.
Los métodos de la presente descripción son simples, por ejemplo, en algunas modalidades, solo se requiere un único reactivo y una única dilución. En algunas modalidades, las proporciones de dilución se pueden ajustar y/u optimizar fácilmente. Además, los métodos de la presente descripción son sencillos de implementar y se pueden realizar, por ejemplo, en un analizador de hematología tradicional, sin la necesidad de ajustes y/o modificaciones extensos.
Estas y otras ventajas resultarán evidentes para un experto en la técnica en base a la descripción proporcionada en la presente descripción, incluidos los ejemplos más abajo.
Ejemplos
Procedimiento de prueba general: (A) Modifique el protocolo de flujo y el algoritmo de un analizador de hematología CELL-DYN Sapphire para permitir su uso en un análisis de fluidos corporales. (B) Todos los análisis de fluidos corporales (FC) se realizan mediante el uso del modo de recuento extendido de WBC (ligeramente modificado): Aspiración de muestra de FC (~120 pl), seguida de mezcla de la muestra (FC) con reactivo (reactivo de reticulocitos Sapphire), relación de 1 a 35, seguida de la incubación de la muestra mixta (40 °C x 25 s), seguido del envío de la muestra incubada a la celda de flujo para la medición (medición de 32 segundos), seguida de la recogida de datos, los datos sin procesar se registran como archivos .fcs, seguido del uso de un software como FCS Express para analizar los datos sin procesar.
Todos los resultados de referencia se midieron mediante el uso de procedimientos de recuento de cámara manual estándar.
El reactivo se formuló mediante el uso de los siguientes componentes y concentraciones:
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Ejemplo 1
Análisis de muestras con recuento de células bajas
Un analizador de prototipo con una relación de dilución 1:35 (sangre:reactivo), una velocidad de inyección de 2,3 pl por segundo y una medición de muestra de 32 segundos (recogida de datos), da como resultado una colección de más de 20 eventos para una muestra a 10 células por pl.
Las Figuras 2A y 2B muestran diagramas de dispersión del análisis celular de una muestra de fluido corporal. Las células se enumeraron después del análisis: WBC = 89/pl (referencia = 81/pl); RBC = 2012/pl (referencia = 1733/pl). Las Figuras 3A y 3B muestran diagramas de dispersión del análisis celular de otra muestra de fluido corporal. Las células se enumeraron después del análisis: WBC = 0,95/pl (referencia = 0,33/pl); RBC = 142/pl (referencia = 122/pl).
Ejemplo 2
Análisis de muestras con recuento de células muy bajo
El límite de detección se validó aún más en un estudio mediante el uso de muestras de capa linfocitaria diluidas. Se prepararon muestras de capa linfocitaria mediante el uso de diluciones seriadas de seis niveles. Los diagramas de dispersión de FL1 frente a IAS para los seis niveles de muestras de capa linfocitaria diluidas se muestran en las Figuras 4A-4F. La Figura 5 muestra la correlación del conteo de WBC (medido frente a calculado). Se lograron muy buenas correlaciones: (A) Y = 1,0239 X - 4,9 (R2 = 0,9984) para los seis niveles y (B) Y = 1,0787 X - 1,5 (R2 = 0,9598) para los tres niveles con concentraciones celulares más bajas.
Ejemplo 3
Análisis celular de muestras de fluidos corporales con una relación de dilución de 1:35
Se realizó un estudio completo de fluidos corporales para evaluar los métodos proporcionados en la presente descripción. Se midieron y analizaron un total de 91 muestras de fluidos corporales, incluidos los fluidos de LCR, pleural, peritoneal y ascítico, en un analizador de prototipo con una relación de dilución 1:35 (sangre: reactivo), velocidad de inyección de 2,3 pl por segundo y muestra de 32 segundos medición (recogida de datos). Los valores de referencia de conteo de WBC y conteo de RBC se obtuvieron mediante el recuento manual de la cámara.
Se lograron excelentes correlaciones en conteo de WBC entre los métodos descritos anteriormente y el método de referencia (Figura 6): (A) Y = 1,1305 X - 9,8411, R2 = 0,997 (intervalo completo, hasta aproximadamente 40000/pl); (B) Y = 1,017 X 7,1395, R2 = 0,9765 (<2000/pl); (C) Y = 1,0899 X 1,1253, R2 = 0,9663 (<200/pl); y (D) Y = 1,149 X 1,1461, R2 = 0,8459 (<50/pl). Se lograron muy buenas correlaciones en conteo de RBC entre los métodos descritos anteriormente y el método de referencia (Figura 7): (A) Y = 0,8996 X 403,62, R2 = 0,9595 (intervalo completo, hasta aproximadamente 200000/pl); (B) Y = 1,0833 X - 11,427, R2 = 0,9513 (<3000/pl); (C) Y = 0,979 X -1,0747, R2 = 0,8284 (<200/pl); y (D) Y = 0,9994 X 0,5951, R2 = 0,6917 (<50/pl). Para el análisis de RBC, las muestras con muchos fantasmas de RBC no se incluyeron en el análisis de correlación.
Ejemplo 4
Análisis celular de muestras de fluidos corporales con una relación de dilución de 1: 10
Se realizó otro estudio completo de fluidos corporales para evaluar los métodos proporcionados en la presente descripción. Se midieron y analizaron un total de 155 muestras de fluidos corporales, incluidos los fluidos de LCR, pleural, peritoneal y ascítico, en un analizador de prototipo con una relación de dilución 1:10 (sangre:reactivo), una velocidad de inyección de 2,3 pE por segundo y 32 segundos de medición de muestras (recogida de datos). Los valores de referencia de conteo de WBC y conteo de RBC se obtuvieron mediante el recuento manual de la cámara. Se lograron excelentes correlaciones en conteo de WBC, incluso para las muestras con concentraciones bajas de WBC, entre los métodos descritos anteriormente y el método de referencia (Figura 8): Y = 1,1327 X 1,1937, R2 = 0,8195 (WBC <50/pl, 72 muestras). Se lograron muy buenas correlaciones en conteo de WBC, incluso para las muestras con concentraciones de RBC bajas, entre los métodos descritos anteriormente y el método de referencia (Figura 9): Y = 0,8244 X 0,6128, R2 = 0,7465 (RBC <50/pl, 38 muestras). Para el análisis de RBC, las muestras corporales con muchos fantasmas de RBC no se incluyeron en el análisis de correlación.
Un método para analizar un fluido corporal que contiene células comprende:
teñir el fluido corporal con un tinte fluorescente, en donde el tinte fluorescente penetra una membrana celular y se une a un ácido nucleico para formar un complejo de tinción dentro de la célula;
irradiar el fluido corporal teñido con energía de una fuente de energía; y
medir una señal de fluorescencia emitida por el complejo de tinción en el fluido corporal teñido.
El fluido corporal puede comprender menos de aproximadamente 20 células/pl.
El fluido corporal puede comprender más de aproximadamente 20 células/pl.
El ácido nucleico puede ser un ADN o un ARN.
La fuente de energía produce preferentemente luz monocromática que tiene una longitud de onda en el espectro visible, y en donde la longitud de onda de la luz monocromática y la longitud de onda de la señal de fluorescencia son diferentes.
El tinte fluorescente no unido puede emitir menos luz fluorescente cuando se irradia con energía de la fuente de energía en comparación con el complejo de tinción.
El tinte fluorescente no unido preferentemente no emite fluorescencia cuando se irradia con energía de la fuente de energía mientras no está unido al ácido nucleico, de manera que las células que carecen del complejo de tinción no emiten una señal fluorescente.
El método puede comprender además diferenciar células con núcleos de células sin núcleos en base a la presencia o ausencia del tinte fluorescente.
La medición puede implicar la enumeración y diferenciación de glóbulos rojos (RBC) y glóbulos blancos (WBC). El método preferentemente no implica lisar los RBC antes de la medición.
El fluido corporal puede comprender WBC y RBC intactos.
La medición se puede realizar mediante el uso de un analizador hematológico automático, un citómetro de flujo u otro analizador de diagnóstico para muestras de fluidos corporales.
La medición puede comprender hacer fluir el fluido corporal a través de una celda de flujo en un citómetro.
El tinte fluorescente se puede proporcionar en una composición que además comprenda agua.
Un método para analizar un fluido, en donde el fluido contiene menos de aproximadamente 40 células/pl, comprende:
poner en contacto el fluido con un tinte fluorescente, en donde el tinte fluorescente penetra una membrana celular y se une a un ácido nucleico para formar un complejo de tinción dentro de la célula;
irradiar el fluido con energía de una fuente de energía; y
medir una señal de fluorescencia emitida por el complejo de tinción en el fluido.
El fluido puede contener menos de aproximadamente 20 células/pl.
El fluido puede contener menos de aproximadamente 5 células/pl.
El fluido puede ser un fluido corporal.
El fluido puede ser un fluido biológico.
Un método para diferenciar células comprende:
poner en contacto las células con una solución que comprende un tinte fluorescente, en donde el tinte fluorescente es soluble en agua, penetra una membrana celular y se une a un ácido nucleico; irradiar las células con una luz de excitación de una fuente de luz de excitación; medir las emisiones de luz de las células; diferenciar las células que contienen ácidos nucleicos de las células que carecen de ácidos nucleicos en base a las emisiones de luz medidas; y clasificar las células como glóbulos blancos (WBC) o glóbulos rojos (RBC) en base a
una pluralidad de datos ópticos obtenidos de la muestra mediante el uso de uno o más detectores de dispersión de luz.
Una composición para analizar un fluido corporal comprende agua y un tinte fluorescente, en donde el tinte fluorescente es soluble en agua, penetra una membrana celular y se une a un ácido nucleico.
Un sistema de hematología comprende:
un portamuestras para contener una muestra;
un receptáculo de mezcla para mezclar una composición de tinción con al menos una porción de la muestra; un receptáculo de almacenamiento para almacenar la composición de tinción, en donde la composición de tinción comprende un tinte que penetra una membrana celular y se une a un ácido nucleico, y en donde el tinte es fluorescente cuando se une a un ácido nucleico;
una celda de flujo;
al menos una fuente de energía para aplicar energía electromagnética a la celda de flujo;
un detector para detectar la fluorescencia que se origina dentro de la celda de flujo; y
uno o más detectores de luz visible para detectar la luz visible dispersa.
El sistema de hematología comprende además un mecanismo de aspiración para aspirar al menos una porción de la muestra del portamuestras y moverla al receptáculo de mezcla.
El sistema de hematología comprende además un mecanismo de aspiración para aspirar la composición de tinción y moverla desde el receptáculo de almacenamiento al receptáculo de mezcla.
Al menos una fuente de energía puede producir luz monocromática con una longitud de onda A1.
El tinte puede absorber luz a una longitud de onda A1 y emite luz a una longitud de onda A2 cuando el tinte se une a un ácido nucleico.
El detector puede detectar luz con una longitud de onda A2.
El sistema de hematología puede comprender además al menos una fuente de energía adicional para proporcionar luz visible no monocromática.
La muestra puede ser un fluido corporal.
Un método para preparar un sistema de hematología comprende:
proporcionar un receptáculo de mezcla para mezclar al menos una porción de una muestra a analizar con una composición de tinción;
proporcionar un receptáculo de almacenamiento para almacenar la composición de tinción, en donde la composición de tinción comprende un tinte que penetra una membrana celular y se une a un ácido nucleico, y en donde el tinte es fluorescente cuando se une a un ácido nucleico;
proporcionar una celda de flujo;
establecer una corriente central estable para permitir que la muestra pase a través de la celda de flujo;
posicionar una fuente de energía para proporcionar energía electromagnética a la celda de flujo; y
colocar un detector para detectar la fluorescencia emitida dentro de la celda de flujo.
Un método para preparar un receptáculo para usar en el análisis de un fluido corporal comprende agregar al receptáculo una composición que comprende un tinte que penetra una membrana celular y se une a un ácido nucleico, en donde el tinte es fluorescente cuando se une a un ácido nucleico, y en donde el receptáculo es una parte integrada o modular de un sistema de hematología.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método in vitro para analizar una población de células en una muestra de fluido corporal, el método comprende:
diluir la población de células en la muestra de fluido corporal que no comprende sangre completa, con una composición de marcaje, en donde la composición de marcaje comprende:
una solución que contiene un tinte fluorescente que penetra una membrana celular y se une a un ácido nucleico para formar un complejo de tinción dentro de la célula, en donde el tinte fluorescente está presente en una cantidad que varía de 0,000001 a 0,5 % (p/v);
irradiar el fluido corporal diluido con energía de una fuente de energía;
medir una señal de fluorescencia emitida por el complejo de tinción en el fluido corporal teñido; y enumerar las células que contienen ADN en la muestra de fluido en base a la señal de fluorescencia.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el fluido corporal comprende menos de aproximadamente 100 células/pl.
3. El método de la reivindicación 1, en donde el fluido corporal comprende menos de aproximadamente 20 células/pl.
4. El método de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico es un ADN o un ARN.
5. El método de la reivindicación 1, en donde la fuente de energía produce luz monocromática que tiene una longitud de onda en el espectro visible, y en donde la longitud de onda de la luz monocromática y la longitud de onda de la señal de fluorescencia son diferentes.
6. El método de la reivindicación 1, en donde el tinte fluorescente no unido emite menos luz fluorescente cuando se irradia con energía de la fuente de energía en comparación con el complejo de tinción.
7. El método de la reivindicación 1, en donde el tinte fluorescente no unido no emite fluorescencia cuando se irradia con energía de la fuente de energía mientras no se une al ácido nucleico, de manera que las células que carecen del complejo de tinción no emiten una señal fluorescente.
8. El método de la reivindicación 1, en donde la enumeración implica el recuento de glóbulos blancos (WBC) en base a la señal de fluorescencia indicativa de la formación del complejo de tinción.
9. El método de la reivindicación 1, en donde el método no implica lisar los RBC antes de la medición.
10. El método de la reivindicación 1, en donde el fluido corporal comprende WBC y RBC intactos.
11. El método de la reivindicación 1, en donde la medición y el recuento se llevan a cabo mediante el uso de un analizador hematológico automático, un citómetro de flujo u otro analizador de diagnóstico para muestras de fluidos corporales.
12. El método de la reivindicación 1, en donde el método comprende además diferenciar células con núcleos de células sin núcleos en base a la presencia o ausencia del tinte fluorescente.
13. Un método in vitro para analizar un fluido corporal, el método comprende:
aspirar el fluido corporal que no comprende sangre completa para obtener un volumen del fluido corporal; mezclar la población de células en la muestra de fluido corporal con una composición de marcaje, en donde la composición de marcaje comprende:
una solución que contiene un tinte fluorescente que penetra una membrana celular y se une a un ácido nucleico para formar un complejo de tinción dentro de la célula, en donde el tinte fluorescente está presente en una cantidad que varía de 0,000001 a 0,5 % (p/v) y un agente antimicrobiano;
irradiar las células marcadas con energía de una fuente de energía;
medir una señal de fluorescencia emitida por el complejo de tinción en el fluido corporal teñido; y enumerar las células que contienen ADN en la muestra de fluido en base a la señal de fluorescencia.
14. El método de la reivindicación 13, en donde el volumen del fluido corporal es 120 pl.
15. El método de la reivindicación 13, en donde la muestra comprende menos de 5 células/pl, 5 a 20 células/pl o 20-40 células/pl.
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