ES2882915T3 - Proceso escalable para la producción y purificación del parvovirus H-1 oncolítico de la rata basado en la eliminación de partículas vacías a partir del punto isoeléctrico - Google Patents
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Abstract
Un método para producir partículas de parvovirus H-1 completamente activas, dicho método comprende: (a) proporcionar la línea celular productora NB-324K; (b) cultivar la línea celular en condiciones adecuadas e infectar las células a una densidad celular de 2,0 a 5,0 x 104 células/cm2 con el parvovirus a una MOI de 0,5 a 2 x 10-2 UFP/células; (c) recolectar las células de 2 a 6 días después de la infección y obtener un sedimento celular por centrifugación; (d) someter el sedimento celular resuspendido a un método de lisis celular mecánico, físico o químico para obtener un lisado celular que contiene parvovirus; (e) sonicar el lisado celular y someterlo a tratamiento con ADNasa; (f) clarificar por filtración el parvovirus recolectado tratado con ADNasa; y (g) cromatografía de intercambio aniónico para eliminar partículas vacías y la mayoría de las impurezas; (h) intercambio de tampón y concentración a través de una columna de desalinización o mediante filtración de flujo tangencial; (i) formulación final en solución Visipaque/Ringer.
Description
DESCRIPCIÓN
Proceso escalable para la producción y purificación del parvovirus H-1 oncolítico de la rata basado en la eliminación de partículas vacías a partir del punto isoeléctrico
La presente invención proporciona un proceso reproducible, eficaz y escalable para la producción y purificación de partículas (infecciosas) de parvovirus H-1. El proceso de purificación permite la separación de partículas vacías de partículas que contienen un genoma completo y es compatible con la producción de H-1PV a gran escala para aplicaciones clínicas.
El H-1PV pertenece al género Protoparvovirus dentro de la subfamilia Parvovirinae de Parvoviridae (Cotmore y otros, 2014). Consiste en una cápside icosaédrica no envuelta de 25 nm de diámetro y contiene un genoma de ADN monocatenario de aproximadamente 5 kb de largo, que codifica proteínas no estructurales, en particular NS1 (83 kDa) y NS2 (25 kDa), y las proteínas de la cápside VP1 (81 kDa) y VP2 (65 kDa). Otra proteína de la cápside, VP3 (63 kDa), se genera mediante escisión postraduccional de VP2 (Faisst y otros, 1995; Halder y otros, 2012; Hanson y Rhode, 1991; Toolan y otros, 1960). Los protoparvovirus se replican de una manera dependiente de la fase S y experimentan un ciclo lítico después de la infección de células permisivas (Burnett y otros, 2006). Si bien el huésped natural de1H-1PV es la rata, este virus despierta recientemente mucho interés porque se replica preferentemente en células transformadas, incluidas varias células tumorales humanas. Por lo tanto, el virus tiene propiedades oncolíticas y oncosupresoras que se demuestran en varios cultivos celulares y modelos animales (Ourch y otros, 2012; Rommelaere y otros, 2010). En modelos de xenoinjerto, se demuestra que el H-1 PV suprime varios tumores humanos, incluidos los tumores cervicales (Faisst y otros, 1998; Li y otros, 2013), los tumores pancreáticos (Angelova y otros, 2009b; Grekova y otros, 2011), carcinomas mamarios (Dupressoir y otros, 1989), gliomas (Geletneky y otros, 2010; Kiprianova y otros, 2011) y linfomas (Angelova y otros, 2009a). Además, se demuestra que el H-1PV tiene éxito en la eliminación de las células madre cancerosas ( E p 2404609 A1). Sobre la base de estas pruebas preclínicas de concepto, en 2011 se puso en marcha un primer ensayo clínico (fase I/IIa) de H-1PV para pacientes con glioblastoma multiforme recurrente (Geletneky y otros, 2012).
Para probar y finalmente aprovechar el potencial terapéutico del H-1PV, es necesario desarrollar un proceso de purificación y producción del virus eficiente, simple y reproducible. Se han publicado métodos de purificación para la producción a pequeña escala mediante centrifugación en gradiente de densidad con cloruro de cesio (Halder y otros, 2012; Paradiso, 1981) o Yodixanol (Wrzesinski y otros, 2003; Zolotukhin y otros, 1999).
La investigación sobre protoparvovirus oncolíticos alcanza la etapa de traslación a la práctica clínica, con un primer estudio de fase I/IIa de H-1PV en pacientes con glioma maligno resecable recurrente (Geletneky y otros, 2012).
Por el momento, se inició un segundo ensayo clínico de fase I/II en pacientes con cáncer de páncreas metastásico inoperable (ClinicalTrials.gov Identificador: NCT02653313; manuscrito en preparación).
Para estos ensayos, los lotes de GMP de H-1PV se purificaron mediante centrifugación en gradiente de densidad (Leuchs y otros, 2016; Ungerechts y otros, 2016), sin embargo, este método está limitado en escala y la separación de partículas vacías de partículas que contienen un genoma completo no es satisfactoria. Además, e1H-1 PV purificado debe formularse en última instancia en Visipaque (48 % de Yodixanol en solución Ringer), donde el virus tiene una estabilidad conocida y que también es un reactivo de contraste de rayos X para la visualización de fármacos en el cuerpo humano.
Por tanto, el problema técnico subyacente a la presente invención es para proporcionar un proceso de purificación escalable que permita la separación de partículas vacías de partículas que contienen un genoma completo.
La solución a este problema técnico se logra mediante la provisión de las modalidades caracterizadas en las reivindicaciones.
Para satisfacer estas necesidades, los inventores desarrollaron un método de purificación de alto grado, simple y escalable para el H-1PV. Las partículas vacías son un subproducto indeseable de la producción de H-1PV, susceptibles de causar una respuesta inmune sin eficacia (Gao y otros, 2014). Aunque los métodos basados en ultracentrifugación se usan con éxito para eliminar partículas vacías (Halder y otros, 2012; Leuchs y otros, 2016), estos procedimientos no son realmente escalables, solo son semiestériles y el fraccionamiento no es bien controlable. Esto explica por qué era urgente desarrollar nuevos enfoques de purificación adecuados para el escalado. Durante los experimentos que dieron como resultado la presente invención, se introdujeron importantes innovaciones para la producción de virus a gran escala, con la eliminación de contaminantes no deseados a través de una mejor clarificación de lotes de virus y purificación de partículas infecciosas. Los inventores se centraron en desarrollar procedimientos de purificación estandarizados como base para aprovechar el H-1PV tanto de forma preclínica como en ensayos clínicos para viroterapia anticancerosa.
Por tanto, la presente solicitud se refiere a un método para producir partículas de parvovirus H-1 completamente activas, dicho método comprende:
(a) proporcionar la línea celular productora NB-324K;
(b) cultivar la línea celular en condiciones adecuadas e infectar las células a una densidad celular de 2,0 a 5,0 x 104 células/cm2 con el parvovirus a una MOI de 0,5 a 2 x 10-2 UFP/células;
(c) recolectar las células de 2 a 6 días después de la infección y obtener un sedimento celular por centrifugación;
(d) someter el sedimento celular resuspendido a un método de lisis celular mecánico, físico o químico para obtener un lisado celular que contiene parvovirus;
(e) sonicar el lisado celular y someterlo a tratamiento con ADNasa;
(f) clarificar por filtración el parvovirus recolectado tratado con ADNasa; y
(g) cromatografía de intercambio aniónico para eliminar partículas vacías y la mayoría de las impurezas;
(h) cambio de tampón y concentración a través de una columna de desalinización o mediante una filtración de flujo tangencial;
(i) formulación final en solución Visipaque/Ringer.
La invención se describe con más detalle en relación con las figuras que muestran:
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Determinación de los puntos isoeléctricos de las cápsides vacías y llenas del H-1PV wt por isoelectroenfoque.
Se cargaron dos lotes purificados de forma independiente de cápsides vacías o llenas en el gel de agarosa al 0,9 % y se enfocaron en el campo eléctrico de acuerdo con sus respectivos valores de pI. Las bandas se visualizaron mediante tinción con plata. M: Marcadores Biorad pH 4,45-9,6, carril 1: partículas llenas del lote 1, carril 2: partículas vacías del lote 1, carril 3: partículas llenas del lote 2, carril 4: partículas vacías del lote 2
Figura 2 a: Perfiles de pI de cápsides del H-1PV vacías y llenas obtenidas por cromatoenfoque con una columna Mono P 5/50. Se cargaron dos lotes purificados de forma independiente de cápsides vacías o llenas en una columna Mono P 5/50 y se eluyeron de acuerdo con sus respectivos valores de pI. Las fracciones se analizaron en busca de partículas que contienen genoma (GP) y partículas físicas (PP). El punto isoeléctrico de las partículas vacías de la cápside está a pH 6,3, como se representa por el pico de partículas físicas y como lo demuestra la relación PP-GP (no mostrada); proporción ~ 900 al pH correspondiente al pico PP. El punto isoeléctrico de las partículas de la cápside llena fue de aproximadamente pH 6,1-5,6. La relación PP-GP (no mostrada) fue cercana a 1 en este intervalo de pH.
Figura 2 b: Perfiles de pI de cápsides del H-1PV vacías y llenas e impurezas obtenidas por cromatoenfoque con una columna Mono P 5/50.
Se cargó un lote sin purificar en una columna Mono P 5/50 y se eluyó con un gradiente de pH de 9,5 a 3,5. Las fracciones se analizaron en cuanto a partículas que contienen genoma (GP), partículas físicas (PP) y contenido de proteínas (impurezas de proteínas).
Las impurezas en el lisado celular clarificado (proteínas de la célula huésped, SFB) mostraron puntos isoeléctricos entre pH 9,5 y 7,0, con elución de la columna Mono P antes de pH 7,0.
Figura 3 a: Condiciones óptimas de tampón y sal para la cromatografía DEAE
Se aplicaron partículas del H-1PV vacías y llenas previamente purificadas en Tris-HCl 50 mM, pH 8,7 a la columna DEAE y se eluyeron con un gradiente continuo de NaCl 0-0,5 M. El perfil de elución muestra la elución de las partículas de la cápside vacía en la fracción 8 (primer pico de absorbancia UV) con NaCl 0,15 M (conductividad: 22 mS). El segundo pico de absorbancia UV, que comienza en la fracción 11, muestra la desorción de las partículas de la cápside llena a NaCl 0,2-0,25 M (conductividad: 29-32 mS). Se cuantificaron las partículas físicas (PP) y las partículas que contienen genoma (GP).
Figura 3 b: Condiciones óptimas de tampón y sal para la cromatografía DEAE
El lisado celular clarificado se diluyó en Tris-HCl 50 mM, pH 8,7 que contiene NaCl 0,15 M y se aplicó a la columna DEAE. Las partículas vacías se recuperaron en el flujo continuo y en el lavado 0,15 M (primer pico de absorbancia UV). Tras la elución con un gradiente de NaCl 0,15-0,4 M, las partículas llenas eluyeron cerca de NaCl 0,25 M (segundo pico de absorbancia UV). Se cuantificaron las partículas físicas (PP) y las partículas que contienen genoma (GP).
Figura 4: Cromatografía a gran escala de células 2.3E8 recolectadas (correspondiente a un Cellstack® de 10 capas, reproducido 5 veces) Cuando se cargó el lisado celular clarificado diluido en Tris-HCl 50 mM pH 8,7 que contiene NaCl 0,15 M en la columna DEAE de 8 ml, se eluyeron las cápsides vacías en el flujo continuo y se lavaron (primer pico de UV). Las cápsides llenas se eluyeron en fracciones 1-5 a una concentración de NaCl 0,25 M durante la elución con un gradiente continuo de NaCl 0,15-0,3 M (segundo pico UV, relación PP/GP ~1). Figura 5: Composición de proteínas e imágenes de microscopio electrónico de lotes de virus antes y después del proceso aguas abajo
Paneles a, b: Los extractos de proteínas de muestras de virus (1.0E10 PP) se analizaron mediante SDS-PAGE y se revelaron mediante (a) tinción con plata o (b) inmunotransferencia con anticuerpos aVP. M: marcadores que constituyen la escala de proteínas BenchMark™, carril 1: recolección de virus, carril 2: YOD-PBS-VIS-Ringer, línea 3: DEAE-VivaspinTM-formulación final línea 4: DEAE-HiTrap-formulación final.
Paneles c, d, e: Micrografías electrónicas que muestran el lisado celular clarificado (c), YOD-PBS-VIS-Ringer (d), DEAE-formulación final (e). La barra de escala es de 100 nm.
Figura 6: Diagrama de flujo de los métodos de purificación aguas abajo de1H-1PV, comparando la purificación en gradiente YOD-PBS-VIS-Ringer conocida (A) con los métodos de DEAE-formulación final (B)
El proceso de producción adoptado de la presente invención, que implica cultivar e infectar células renales de recién nacidos humanos NB-324K transformadas con virus simio 40 (SV40) (Tattersall y Bratton, 1983) en un sistema de recolección convencional (por ejemplo, cámaras CellSTACK® (CS) de 10 capas; rendimiento preferido: 1 x 103 unidades infecciosas por célula infectada), es simple, escalable y reproducible. El proceso final aguas abajo de la presente invención, que logra el título de virus diana de 1E10 UFP/ml, implica las siguientes etapas: (1) tratamiento con ADNasa para eliminar el ADN de la célula huésped; (2) Clarificación (por ejemplo, 0,2 pm seguido de etapas de filtración de 0,1 pm); (3) cromatografía de intercambio aniónico para eliminar partículas vacías y la mayoría de las impurezas; (4) hacer pasar el eluido de la etapa (3) a través de una columna de desalinización o una filtración de flujo tangencial para el intercambio de tampón y la concentración; (5) formulación final en solución Visipaque/Ringer. En detalle, la presente invención se refiere a un método para producir partículas de parvovirus H-1 completamente activas, dicho método comprende:
(a) proporcionar la línea celular productora NB-324K;
(b) cultivar la línea celular en condiciones adecuadas e infectar las células a una densidad celular de 2,0 a 5,0 x 104 células/cm2 con el parvovirus a una MOI de 0,5 a 2 x 10'2 UFP/células;
(c) recolectar las células de 2 a 6 días después de la infección y obtener un sedimento celular por centrifugación; (d) someter el sedimento celular resuspendido a un método de lisis celular mecánico, físico o químico para obtener un lisado celular que contiene parvovirus;
(e) sonicar el lisado celular y someterlo a tratamiento con ADNasa;
(f) clarificar por filtración el parvovirus recolectado tratado con ADNasa (por ejemplo, 0,2 pm seguido de etapas de filtración de 0,1 pm);
(g) cromatografía de intercambio aniónico para eliminar partículas vacías y la mayoría de las impurezas;
(h) intercambio de tampón y concentración a través de una columna de desalinización o mediante filtración de flujo tangencial;
(i) formulación final en solución Visipaque/Ringer.
El proceso de la presente invención se muestra en el diagrama de flujo de la Figura 6 al que se hace referencia. (A) Producción del H-1PV reproducible, estandarizada y a gran escala
Un rendimiento de virus de 2 x 1011 UFP con una concentración de 1 x 1010 UFP/ml, compatible con el uso preclínico y clínico, se logró con una sola cámara CS de 10 capas. Este rendimiento corresponde a una productividad de aproximadamente 1 x 103 partículas infecciosas por célula infectada. El sistema de 10 capas proporciona aproximadamente la misma superficie de unión que una placa de cultivo celular de 100 x 10 cm (Halder y otros, 2012). La producción eficiente fue posible gracias al buen estado de las células productoras (NB-324K), con una viabilidad superior al 95 %, un número de pases por debajo de 20, sin contaminación por micoplasmas (Multiplexion, Alemania) y la calidad constante del SFB.
Una forma simple y eficiente de lograr el escalado era usar cámaras CS, lo que brinda recuperaciones de hasta 1 x 1012 UFP de cinco cámaras de 10 capas. Un escalado adicional sería posible con cámaras de 40 capas, aunque su manejo de agitación y gaseado es más engorroso. Un escalado adicional con células adherentes implicaría el uso de vehículos, como se describe para la producción de vacunas (Rajendran y otros, 2014). Una alternativa atractiva sería usar cultivos de células en suspensión en reactores de onda, como se describe para la producción de vacunas contra el PV de la enteritis del visón (Hundt y otros, 2007).
Para obtener resultados óptimos, la línea de células productoras NB-324K se caracteriza por (i) una viabilidad de al menos el 95 %, (ii) un número de pases por debajo de 20 (iii) la ausencia de contaminación por micoplasmas y (iv) la ausencia de producción de SV 40.
El experto en la técnica conoce las condiciones habituales para el cultivo de la línea celular productora y para infectar las células con el parvovirus. Por lo general, las células se cultivan a 37 °C, por ejemplo, en un medio esencial mínimo con suero fetal bovino inactivado por calor (por ejemplo, SFB al 5 %) en un 5 % de atmósfera de CO2. Preferiblemente, el medio debe complementarse con penicilina, estreptomicina y L-glutamina.
En una modalidad preferida de la presente invención, la densidad celular de la etapa (b) es de 3,0 a 4,0 x 104 células/cm2.
En una modalidad preferida adicional del método de la presente invención, la producción de virus se realiza en un sistema de cultivo celular de un solo uso, preferiblemente una cámara de cultivo celular de 10 capas, por ejemplo, una cámara CellSTACK® (CS). Un escalado adicional se puede lograr con una cámara CS de 40 capas o un sistema de soporte.
Preferiblemente, para la recolección, el medio de cultivo se aspira y las células infectadas se tratan con un tampón y/o enzima adecuados, por ejemplo, PBS-EDTA o tripsina. El sobrenadante del medio y las células desprendidas se centrifugan para obtener un sedimento celular, preferiblemente a 5000 x g, preferiblemente durante aproximadamente 5 min. El experto en la técnica conoce métodos mecánicos, químicos o físicos adecuados para liberar el parvovirus de las células productoras. Preferiblemente, esto puede realizar mediante ciclos de congelación/descongelación, tratamiento con ultrasonidos y/o tratamiento con Triton® S100. El experto en la técnica también conoce métodos adecuados para sonicar las células y el tratamiento posterior con ADNasa. Por ejemplo, las células se pueden sonicar de 30 a 70 W durante un tiempo suficiente y el tratamiento con ADNasa se lleva a cabo con 20-80 U/ml de ADNasa, normalmente a 37 °C durante 10 a 50 min.
(B) Purificación y concentración eficientes de preparaciones del H-1PV
Los virus recolectados sin procesar contenían partículas llenas, vacías y de densidad intermedia, y estaban contaminadas por proteínas y ADN vírico y de la célula huésped. Primero se trataron con ADNasa y luego se clarificaron a través de un filtro (por ejemplo, filtración a través de un filtro de 0,2 pm seguido de filtración a través de un filtro de 0,1 pm). Esto resultó en la eliminación del 37 % del ADN de la célula huésped y del ADN viral sin empaquetar y del 24 % de la proteína total. Los fragmentos residuales de ADN de la célula huésped demostraron ser menores de 62 pb.
(C) Purificación cromatográfica
Como base para la purificación cromatográfica, los inventores primero determinaron los valores de pl de (a) partículas vacías y (b) llenas: (a) 6,3 y (b) 6,1 a 5,8. El isoelectroenfoque y el cromatoenfoque dieron resultados similares. Para partículas llenas, solo se obtuvo un intervalo de pl debido a posibles partículas virales interferentes defectuosas (Faust y Ward, 1979). El conocimiento de los puntos isoeléctricos del H-1PV vacío y lleno fue esencial para desarrollar el procedimiento de purificación y tiene implicaciones para las interacciones del virus, la estabilidad, la producción y los estudios in vitro.
Los inventores probaron la capacidad de diferentes sistemas cromatográficos para eliminar partículas vacías e impurezas. Los estudios de unión con H-1PV demostraron que el virus se une y eluye tanto de los intercambiadores de cationes como de aniones, pero las mejores recuperaciones se lograron con cromatografía AEX y elución a pH 8,7. Los inventores también pudieron purificar el H-1PV en una columna de intercambio aniónico fuerte (QA), con una recuperación similar de partículas llenas. Ambos sistemas fueron comparables en términos de recuperación y eliminación de impurezas proteicas. En una modalidad preferida particular se usa cromatografía DEAE. Igualmente, dado que el cloruro de sodio, el acetato de sodio y el acetato de amonio en el eluyente dieron lugar a una resolución similar de los picos correspondientes a las cápsides vacías y llenas, se prefiere el cloruro de sodio para la purificación del H-1PV porque el H-1PV es estable en esta sal y porque el NaCl está presente en la formulación final.
El hecho de que la diferencia de pl entre partículas llenas y vacías sea de al menos 0,1 unidades de pH permitió a los inventores desarrollar un método de purificación que se basa en una modalidad preferida en una cromatografía en columna DEAE. En la presente invención se demuestra que aproximadamente el 65 % de las partículas vacías y aproximadamente el 67 % de las impurezas principales ya se pueden eliminar a través del flujo con NaCl 0,1-0,2 M,
preferiblemente NaCI 0,15 M, y que aproximadamente el 50 % de las partículas de virus infecciosas llenas se pueden eluir con sal 0,25-0,4 M, preferiblemente sal 0,3 M. Gracias a la alta estabilidad de1H-1PV, la purificación se puede realizar aproximadamente a temperatura ambiente (temperatura de funcionamiento preferida: 29 ± 5 °C).
Con el método y las condiciones presentes, el perfil de elución del H-1PV no pudo reproducirse con el virus diminuto de protoparvovirus de ratones (MVM) estrechamente relacionado (datos no mostrados), y las partículas de MVM vacías no pudieron separarse de las llenas. Por tanto, el método desarrollado aquí es específico para e1H-1PV.
Aunque el presente método ofrece un rendimiento de H-1PV de casi el 50 % del lisado celular clarificado, se debe tener en cuenta que el sobrenadante del medio del proceso aguas arriba todavía se descarta de forma rutinaria, lo que equivale a una pérdida del 30 % (B. Leuchs y otros, 2016). Para demostrar la prueba de concepto y probar la capacidad del método de la invención para purificar y concentrar el H-1PV, se purificó el sobrenadante del medio clarificado de la producción de rutina (correspondiente a una producción 1/10 de 10 capas CS) como se describe aquí. Después de la purificación con DEAE, la recuperación total de UFP fue de aproximadamente el 50 %, como se observó con el lisado celular, pero el contenido de impurezas del H-1PV purificado del sobrenadante del medio de cultivo todavía era alto. Por lo tanto, se realizó una segunda ronda de purificación con DEAE, produciendo ~20 % de recuperación total de UPF en una quincuagésima parte del volumen inicial. Más del 99,7 % de las impurezas proteicas se eliminaron después de la segunda etapa de purificación con DEAE, de modo que el contenido de proteína fue el mismo que para el lisado celular purificado (datos no mostrados).
En comparación con la ultracentrifugación basada en yodixanol (PCT/EP 2016/0001066) el uso de esta nueva estrategia de purificación que implica cromatografía de intercambio aniónico, preferiblemente cromatografía de intercambio aniónico DEAE basada en monolitos, mejora significativamente la recuperación y la actividad específica, lo que lleva a una relación PP-GP óptima y una eliminación significativa de partículas vacías (valores de p <0,05). El rendimiento del nuevo método es similar al del método de ultracentifugación basado en gradiente de densidad de CsCl, en términos de la relación PP-GP y UFP/mg de proteína (Leuchs y otros, 2016). El título de virus de 1E10 UFP/ml es óptimo, porque las partículas de virus comienzan a agregarse a 1E11 UFP/ml (como lo demuestra la alta variación del título), y porque las preparaciones con un título de virus más bajo de 1E8 UFP/ml son inestables con los años. Sin embargo, la recuperación global del 40 % con la estrategia de purificación de la presente invención es superior a las conocidas anteriormente (gradiente YOD-PBS-VIS-Ringer). Con respecto a esto, se hace referencia a la Tabla 2 más abajo.
El escalado para aplicaciones clínicas es posible, con las columnas monolito CIM® DEAE más grandes (BIA Separations, EE. u U . ) Disponibles comercialmente hasta 8L. El monolito CIM® es una pieza única y homogénea moldeada a partir de polímeros de metacrilato que contienen flujo a través de los poros (1,3 pm). El DEAE (dietilaminoetil) es un intercambiador de aniones débil con un grupo dietilamino cargado que une selectivamente moléculas con una carga negativa predominante. Estos se podrían cargar con un total de 5E14 UFP, (correspondientes a mil CS de 10 capas). Las columnas monolíticas no pierden resolución con el escalado, por lo que no es necesario realizar nuevos estudios de caracterización. Las columnas de monolito CIM® DEAE ofrecen una alta capacidad de unión con alta velocidad de flujo y baja presión, lo que podría reducir significativamente el tiempo y los costos de purificación. Además, estas columnas pueden usarse como desechables o para usos múltiples y como una sola columna o en configuraciones de varias columnas. Como la capacidad de carga límite de una columna de 8 ml es de 20 mg BSA/ml y los inventores cargaron dicha columna con solo ~15 mg de proteína total (del lisado celular correspondiente a células 2,3E8 que suman aproximadamente 5E11 UFP), la columna se podría cargar 10 veces más.
Tabla 1
Comparación de cinco lotes de cromatografía individuales
Agotamiento de Elución de
lote impurezas proteicas [%] PP [%] GP [%] Recuperación de UFP [%]
1 100 26 93 45
2 72 53 74 55
3 52 71 73 28
4 47 100 64 60
5 64 77 58 58
media [n=5] 67 ± 21 65 ± 28 72 ± 13 49 ± 13
Medias con desviaciones estándar para 5 ciclos de cromatografía independientes.
(D) Formulación del H-1PV purificado después de la columna DEAE preparativa que incluye intercambio de tampón con filtración de flujo tangencial o cromatografía de exclusión por tamaño
El eluido del H-1PV de la columna DEAE contenía aproximadamente 0,25 M de NaCl. Para eliminar la sal y formular en Visipaque (48 % de yodixanol en Ringer), fue necesario realizar un intercambio de tampón a una solución Ringer (AlleMan Pharma GmbH, Reutlingen, Alemania) seguido de una formulación en Visipaque (48 % de yodixanol en Ringer).
Para el intercambio de tampón en solución Ringer, se usaron dos enfoques:
Por un lado, se usó una columna de desalinización HiTrap™ de 5 ml (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Alemania) con el sistema ÁKTAprime. HiTrap™ utiliza dextrano reticulado para cromatografía de exclusión por tamaño. La columna se equilibró primero con 5 volúmenes de columna (VC) de solución Ringer. Luego, la muestra se inyectó en un lazo de muestra de 5 ml rellenado con solución Ringer, se cargó en la columna y se eluyó con dos VC de solución Ringer. Se recogieron fracciones de un mililitro y se analizaron en busca de partículas que contenían genoma y partículas físicas.
Por otro lado, se usaron concentradores Vivaspin® de 6 ml (una membrana de polietersulfona con un corte de 30 KDa; Sartorius AG, Gottingen, Alemania). El sistema de ultrafiltración de membrana se esterilizó primero con etanol al 70 % durante 20 min, se centrifugó a 3000 x g, se enjuagó con 6 ml de agua estéril para uso inyectable, se centrifugó de nuevo y se dejó secar bajo flujo laminar. Se pipetearon muestras con un volumen inicial de aproximadamente 1 ml en el concentrador, se diluyeron 1:5 con solución Ringer y se centrifugaron a 3000 x g hasta que el volumen alcanzó 1 ml. Las muestras con un volumen inicial de 2 ml o más se concentraron primero a 1 ml y luego se diluyeron con una solución Ringer. Esto se hizo tres veces para diluir el tampón inicial 1:125 en solución Ringer. La última etapa de concentración se llevó a cabo hasta un volumen de muestra de ~300 pl. El índice de refracción de la muestra se midió luego con un refractómetro digital AR200 (Reichert, Inc., Depew, NY, EE. UU.) y tenía que ser el de la solución Ringer (1,3342 ± 0,0002).
Las muestras en solución Ringer obtenidas mediante uno de los métodos anteriores se mezclaron con Visipaque™ 320 (contiene 65,2 % de yodixanol; GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Alemania) hasta una concentración final de 48 % de yodixanol. A continuación, se midió el índice de refracción de la muestra y tenía que ser el de una solución de Visipaque al 48 % (1,41 ± 0,005).
"Yodixanol" es un sinónimo de "Visipaque" (para uso inyectable en humanos) o "Yodixanolum" (grado de investigación). El nombre de la IUPAC es 5-[acetil-[3-N-acetil-3,5-bis(2,3-dihidroxipropilcarbamoil) 2,4,6,-triyodoanilino]2-hidroxipropil]amino]-1-N,3,N-bis(2,3-dihidroxipropil)-2,4,6-triyodobenceno-1,3-dicarboxamida. El número CAS es 92339-11-2. Visipaque también es un conocido agente de contraste para la obtención de imágenes por TC.
Para la formulación final, ambos métodos de intercambio de tampón fueron adecuados, pero se prefiere el uso del sistema de filtración de flujo tangencial Vivaspin® para intercambiar el tampón y concentrar simultáneamente la muestra al volumen deseado con una pérdida insignificante. Además, la filtración de flujo tangencial es fácilmente escalable mediante el uso de la membrana de polietersulfona probada con un tamaño de los poros de aproximadamente 30 kDa.
El intercambio de tampón con la columna de desalinización HiTrap™ conduce a la dilución de la muestra y, por lo tanto, a un título de virus infeccioso más bajo en la formulación final. Entre los dos métodos de intercambio de tampón, hay una diferencia de título de virus infeccioso de un logaritmo en la formulación final (3,5E10 y 3,0E9 UFP/ml para la desalinización de Vivaspin® y HiTrap™, respectivamente).
Los resultados se resumen en la Tabla 2:
Tabla 2
Comparación de la recuperación del H-1PV y el agotamiento de las partículas vacías, así como también de las impurezas de proteínas mediante cromatografía y un proceso aguas abajo basado en la ultracentrifugación en gradiente de densidad del mismo material de partida
Método de purificación Gradiente YOD-PBS- DEAE-Vivaspin® DEAE-HiTrap™
VIS-Ringer
Formulación final Visipaque (48 % Visipaque (48 % Visipaque (48 % Yodixanol)/Ringer Yodixanol)/Ringer Yodixanol)/Ringer UFP/ml 3,7 ± 0,6 E+10 3,5 ± 0,5 E+10 3,0 ± 0,3E+09 volumen [ml] 1,3 ± 0,5 4,4 ± 0,2 39,1 ± 9,3 UFP/mg proteína* 2,1 ± 0,1 E+11 6,8 ± 2,5 E+11 2,3 ± 0,3E11 Recuperación UFP% * 13,1 ± 1,6 41,3 ± 15,5 42,3 ± 2,9 Relación PP-GP * 2,8 ± 0,5 1,1 ± 0,3 1,2 ± 0,0 Agotamiento de impurezas 98,5 ± 0,1 98,3 ± 0,3 96,5 ± 0,5 proteicas %
Agotamiento de partículas 85,0 ±1,3 95,8 ± 5,9 97,8 ± 1,5 vacías % *
Medias con desviaciones estándar (n=2) del título infeccioso (UFP/ml), recuperación de partículas infecciosas*, actividad específica* (UFP/mg de proteína), la relación PP a GP* y el agotamiento de partículas vacías* e impurezas proteicas. El valor p es < 0,05 para las características marcadas con *. Para el cálculo del valor p se tuvo en cuenta dos lotes más purificados con gradiente de densidad YOD-PBS-Vis-Ringer.
En resumen, la presente invención se refiere a un proceso escalable que ofrece alta pureza y recuperación. Que aprovecha la diferencia de punto isoeléctrico entre partículas llenas y vacías, elimina la mayoría de las partículas vacías. Las partículas llenas tienen una carga catiónica significativamente más alta que las vacías, con un punto isoeléctrico de 5,8-6,2 frente a 6,3 (que se determina por isoelectroenfoque y cromatoenfoque). Gracias a esta diferencia, las partículas infecciosas llenas se pueden separar de las partículas vacías y de la mayoría de las impurezas de las proteínas mediante cromatografía de intercambio aniónico, por ejemplo, cromatografía de intercambio aniónico CIM® DEAE: la aplicación del H-1PV sin purificar a la columna en aproximadamente 0,15 M de NaCl deja el primero en la columna y este último en el flujo. A continuación, las partículas llenas se recuperan mediante elución con aproximadamente 0,25-0,30 M de NaCl. Todo el proceso de purificación a gran escala implica filtración, cromatografía de intercambio aniónico (DEAE) de un solo paso, intercambio de tampón mediante filtración de flujo cruzado y formulación final en solución Visipaque/Ringer. Da como resultado una eliminación de proteínas contaminantes del 98 % y una eliminación de partículas vacías del 96 %. La concentración final de partículas infecciosas alcanza 3,5E10 UFP/ml, con una actividad específica de 6,8 E11 UFP/mg de proteína. La recuperación general es superior al 40 %. Facilitará el escalado aséptico de acuerdo con las directrices de BPF para aplicaciones clínicas.
La presente invención ilustra este esfuerzo de estandarización. Describe métodos para apoyar la investigación preclínica. Se logró mejoras en tres etapas de la preparación de reserva de1H-1PV: (1) producción de virus reproducible, estandarizada y a gran escala, (2) purificación y concentración de virus mediante procedimientos alternativos, y (3) implementación de criterios de control de calidad.
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar la invención. Si bien tales ejemplos son típicos de los que se podrían usar, alternativamente se pueden utilizar otros métodos conocidos por los expertos en la técnica.
Ejemplo 1
Determinación del pI del H-1PV
Isoelectroenfoque
Preparaciones de cápside viral llena y vacía (purificado en gradiente de densidad de CsCl) obtenidas con el método descrito por Leuchs y otros, 2016 y en PCT/EP 2016/001066 se separan en el campo eléctrico en función de sus puntos isoeléctricos diferentes (valores de pI).
Todos los materiales usados para el isoelectroenfoque se adquirieron de Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemania. Los geles de agarosa al 0,9 % se fundieron sobre una película GelBond con anfolitos portadores de Servalyt añadidos al 2,5 % pH 5-8 formando un gradiente de pH en un campo eléctrico. La electroforesis en gel se realizó con
la fuente de suministro de energía de electroforesis EPS 3500 XL (Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Freiburg im Breisgau, Alemania) bajo flujo laminar. El sistema se enfrió a 10 °C y se aplicó el reactivo de enfriamiento Bayol F a la placa de enfriamiento de cerámica entre el gel y la placa. Se aplicaron tiras de papel de filtro empapadas en soluciones de electrodos entre el gel y los electrodos para mantener un gradiente estable. Se usó una solución ácida en el ánodo y una básica en el cátodo. Se colocó una muestra de 10 pl sobre la superficie del gel por medio de una tira aplicadora de silicona con orificios para muestras, colocada sobre la superficie del gel. Las condiciones de separación fueron las siguientes: isoelectroenfoque de la muestra a 250 V, 10 mA, 10 W durante 10 min; 500 V, 10 mA, 10 W durante 20 min; 1000 V, 10 mA, 10 W durante 40 min. La fijación y la tinción con plata se realizaron de acuerdo con Willoughby y Lambert, 1983 (Willoughby y Lambert, 1983).
Cromatoenfoque
El cromatoenfoque es una técnica de separación de proteínas en la que las proteínas eluyen de la columna de acuerdo con su pl. El cromatoenfoque de preparaciones de virus de cápside vacías y llenas (purificado en gradiente de densidad de CsCl) se realizó a TA bajo flujo laminar con una columna Mono P 5/50 (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Alemania) y un ÁKTAprime equipado con un lazo de inyección de 500 pL. El Mono P es un intercambiador de aniones débil cargado con una mezcla de aminas cuaternarias y terciarias. El régimen de flujo de la fase móvil fue de 0,7 ml/min. La absorbancia se controló a 280 nm. Todos los tampones y la muestra se filtraron a través de filtros de 0,2 pm. El tampón de aplicación fue trietanolamina 0,025 M (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Alemania) ajustado a pH 8,3 (para preparaciones llenas y vacías) o 9,5 (para lisado celular no purificado) con ácido iminodiacético concentrado (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, EE. UU.). El tampón de elución consistía en Polybuffer 96 y Polybuffer 74 (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Alemania) diluidos según las instrucciones del manual en agua para inyección y el pH se ajustó a 5,0 (para preparaciones llenas y vacías) o 3,5 (para lisado celular no purificado) con ácido iminodiacético concentrado. Los gradientes de pH lineales descendentes (pH 8 a 5 para preparaciones de partículas llenas y vacías y pH 9,4 a 3,5 para lisado celular no purificado) se obtuvieron de acuerdo con las instrucciones del fabricante de Mono P 5/50. Para ello, la columna se equilibró con tampón de aplicación a un pH ligeramente por encima del pH más alto requerido. El tampón de elución (ajustado al pH más bajo requerido) se pasó a través de la columna para generar primero un gradiente previo. A esto siguió la aplicación de la muestra diluida en tampón de aplicación. La aplicación adicional del tampón de elución a la columna dio como resultado un gradiente de pH descendente en movimiento. Este procedimiento de elución condujo a la formación de un gradiente de pH de 8,0 a 5,0 o de 9,4 a 3,5 con un A pH de 0,1-0,3 entre fracciones. Se recogieron fracciones de 0,5 o 1 ml y se analizaron para GP y PP. El pH de las fracciones recogidas se midió manualmente con un electrodo de pH Mettler Toledo InLab Viscous Pro.
Punto isoeléctrico del H-1PV e impurezas del proceso
Para separar las partículas virales H-1PV wt vacías de las llenas, fue necesario encontrar una diferencia aprovechable en sus propiedades físicas. Se realizó un isoelectroenfoque en preparaciones de partículas vacías y llenas purificadas para determinar los puntos isoeléctricos respectivos de estas partículas. Los resultados (Figura 1) revelaron un pl de 6,3 para partículas vacías y de 5,8-6,2 para partículas llenas (con contaminación insignificante por cápsides vacías). Para ver si esta diferencia de pl podría aprovecharse en la purificación de virus infecciosos (es decir, para eliminar partículas vacías y proteínas contaminantes), se usó el cromatoenfoque. En primer lugar, se cargaron preparaciones de partículas vacías o llenas purificadas con CsCl en una columna Mono P 5/50 y se eluyeron como se describe anteriormente. Mediante este procedimiento (Figura 2a), el cromatoenfoque identificó un pl de 6,3 para partículas vacías (relación PP-GP: ~ 869; datos no mostrados) y de 6,1-5,8 para partículas llenas (relación PP-GP: ~ 1; datos no mostrados), confirmando así los resultados obtenidos por isoelectroenfoque. Además, se usó cromatoenfoque para estimar el intervalo de pl de las impurezas (proteínas de la célula huésped, SFB) presentes en el lisado celular clarificado. Se eluyó una cantidad significativa de impurezas de la columna Mono P a pH básico (intervalo de pl de 9,4 a 7). La relación PP-GP fue 43 a pH 6,4 frente a 13 a pH cercano a 5,7, de acuerdo con los valores de pl determinados para partículas vacías y llenas.
Ejemplo 2
Cromatografía de intercambio aniónico a pequeña escala (AEX) para determinar las condiciones óptimas de tampón y sal
Los puntos isoeléctricos de las proteínas se correlacionan con la carga a la que se unen o eluyen de la columna de cromatografía. A medida que aumenta la concentración de sal, las proteínas con las interacciones iónicas más débiles eluyen primero de la columna. Con el conocimiento de los valores de pl de las partículas H-1PV vacías y llenas y de las impurezas que surgen durante la producción, es posible separar estas entidades mediante cromatografía AEX: la mayoría de las impurezas proteicas deben eluir primero, seguidas de las partículas vacías y finalmente las partículas llenas.
Como tampón de equilibrio para la cromatografía AEX, se eligió Tris-HCl 50 mM pH 8,7 por su compatibilidad con la recolección de virus. Para una unión óptima, en teoría, el pH del tampón debe estar al menos 1-2 unidades de pH por encima del pl de la proteína (Fekete y otros, 2015). A pH 8,7, las impurezas no deben unirse, ya que tienen una carga débilmente negativa, neutra o incluso positiva (pl entre pH 9,5 y 7,0). Dado que el pl es 6,3 para partículas vacías de
H-1PV y 5,8-6,1 para partículas llenas, el virus está cargado negativamente a pH 8,7. Los estudios preliminares realizados con diferentes columnas de intercambio iónico para determinar las condiciones de unión y elución (datos no mostrados) demostraron que una columna de intercambiador de aniones débil (DEAE) es la mejor opción para la purificación del H-1PV. Se eligió una columna de monolito CIM® DEAE con un tamaño de los poros de 1,3 pm para los estudios cromatográficos debido a su capacidad para acomodar moléculas grandes específicamente mientras se mantiene una buena estabilidad mecánica.
Se analizaron el cloruro de sodio, el acetato de sodio y el acetato de amonio para determinar la mejor sal para la elución. Se aplicó una mezcla de partículas vacías y llenas previamente purificadas a un disco monolítico CIM® DEAE de 0,34 ml y se eluyó con un gradiente continuo 0-0,5 M de la sal probada en Tris-HCl 50 mM pH 8,7. Las fracciones de los picos se analizaron para determinar su contenido de PP y GP. Todos los perfiles de elución mostraron dos picos de absorbancia UV: uno correspondiente a partículas vacías seguido de otro correspondiente a partículas llenas. Como todas las sales probadas resultaron adecuadas para separar las partículas vacías de las llenas, se decidió continuar trabajando con NaCl porque el H-1PV es estable en la solución de NaCl (datos no mostrados) y porque el NaCl está presente en la formulación final deseada de Visipaque/Ringer (NaCl 0,053 M). Cuando se aplicó un gradiente continuo de NaCl (NaCl 0-0,5 M en Tris-HCl 50 mM pH 8,7), las partículas vacías eluyeron a NaCl 0,13-0,15 M (relación PP-a-GP: ~300) y partículas llenas a 0,2-0,25 M de NaCl (relación PP-a-GP: ~ 1) (Figura 3a). Como estas concentraciones de sal no se pudieron medir directamente, también se midieron los valores de conductividad correspondientes (18-22 mS para partículas vacías y más de 25 mS para partículas llenas) para asegurar un proceso de purificación reproducible en experimentos de desarrollo posteriores.
En un experimento posterior, se preparó una pequeña cantidad del H-1PV recolectado clarificado en Tris-HCl 50 mM pH 8,7 con NaCl 0,15 M y se cargó en el disco monolítico CIM® DEAE de 0,34 ml para permitir el flujo de partículas vacías, así como también las impurezas y la unión de partículas llenas a la columna. A continuación, el disco se eluyó con un gradiente de NaCl 0,15-0,4 M. Como se muestra en el cromatograma de la Figura 3b, aproximadamente el 70 % de las partículas vacías y el 60 % de las impurezas proteicas se eliminaron en el flujo y el lavado (primer pico de UV), mientras que aproximadamente el 60 % de las partículas llenas eluyeron cerca de 0,25 M de NaCl. (segundo pico de UV).
Cromatografía AEX de una sola etapa reproducida a gran escala
Después de la determinación de las condiciones óptimas de tampón y sal, se realizó una purificación a gran escala con lisado celular clarificado de células 2.3E8 (correspondiente a la producción de un CS de 10 capas). Se cargó lisado celular clarificado diluido en Tris-HCl 50 mM pH 8,7 que contiene NaCl 0,15 M en una columna monolítica CIM® DEAE de 8 ml y se eluyó con un gradiente de sal continuo (NaCl 0,15-0,3 M en Tris-HCl 50 mM pH 8,7). Como se ve en la Figura 4, las partículas vacías eluyeron en el flujo y el lavado (primer pico de UV) (relación PP-GP cercana a 50,0; PP total 2,3E14). Las partículas llenas eluyeron a NaCl 0,2-0,25 M (conductividad: 26-31,8 mS, segundo pico de UV). La concentración de virus fue aproximadamente 1E13 GP/ml y 1E10 UFP/ml (datos no mostrados) y la relación PP-GP fue aproximadamente 1.
La purificación cromatográfica del lisado celular del H-1PV clarificado se reprodujo para cinco lotes individuales. Estos experimentos revelaron la eliminación de 67 ± 21 % de impurezas proteicas y 65 ± 28 % de partículas vacías, con recuperación de 72 ± 13 % GP y 49 ± 13 % UFP (Tabla 1). La concentración de sal requerida para las partículas infecciosas llenas fue 0,2-0,25 M NaCl, con una conductividad de 25-31,8 mS. Tomados en conjunto, estos resultados muestran que, para la formulación final, debería ser posible, en el futuro, recolectar solo una fracción, correspondiente a este intervalo de conductividad.
Intercambio de tampón y formulación final después de la cromatografía AEX
Para la formulación final en solución Visipaque/Ringer, el eluido de partículas llenas de la columna DEAE primero tuvo que ser intercambiado con tampón en solución Ringer y finalmente mezclado con Visipaque para obtener un índice de refracción de 1,41 ± 0,05, correspondiente a 48 % de Yodixanol. Se probaron dos métodos de intercambio de tampones: uso de una columna de desalinización HiTrap™ y uso de concentradores Vivaspin®. Cada método se aplicó dos veces. Los resultados se compararon con los obtenidos por el método de purificación estándar (centrifugación en gradiente de densidad en YOD-PBS seguido de VIS-Ringer) aplicado al mismo lote de recolección de virus. La Tabla 2 resume los resultados. Con el método de purificación cromatográfica recientemente desarrollado, se obtuvo una preparación que contiene solo partículas llenas (relación PP-GP ~1). La recuperación de UFP fue al menos dos veces más alta (alrededor del 40 %) que, con el método estándar, y la actividad específica fue similar (o incluso mayor después de la filtración de flujo cruzado Vivaspin®).
El título de virus infeccioso obtenido por el método estándar o por cromatografía DEAE con filtración Vivaspin® fue de aproximadamente 3E10 UFP/ml; después de la cromatografía DEAE y la desalación de HiTrap™, fue 3E9 UFP/ml. Los tres métodos redujeron las impurezas de proteínas con la misma eficacia (> 96 %), pero la purificación cromatográfica seguida de cualquier procedimiento de intercambio de tampón eliminó las partículas vacías de forma más eficaz (> 95 %) que el método estándar (85 %). La pureza del virus, determinada por SDS-PAGE con tinción con plata, fue la misma después de los tres procedimientos (Figura 5). Las micrografías electrónicas de las preparaciones
obtenidas mediante la nueva estrategia mostraron predominantemente partículas llenas, en contraste con las preparaciones estándar. El diagrama de flujo en la Figura 6 resume las etapas del proceso aguas abajo de los tres métodos. Las pruebas de control de calidad demostraron que todos los lotes formulados finales eran estériles.
Ejemplo 3
Preparación purificada del H-1PV
(A) Línea celular productora, reserva de virus H-1PV
Se cultivaron células de riñón de recién nacido humano NB-324K transformadas con virus de simio 40 (SV40) (Tattersall y Bratton, 1983) a 37 °C en medio esencial mínimo (MEM, Sigma, Alemania) con suero fetal bovino inactivado por calor al 5 % (SFB, Biowest, Francia) en un 5 % de atmosfera de CO2. El medio se complementó con 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina y L-glutamina 2 mM (Life Technologies, Alemania). Para la producción, las células NB-324K propagadas en matraces en Y de 175 cm2 (Nunc, Dinamarca) se sembraron en una cámara de cultivo CellSTACK® de 10 capas (Corning, Alemania) con un área de crecimiento de 6,360 cm2. La densidad celular y la viabilidad se midieron tiñendo las células vivas con azul de tripano al 0,4 % (Invitrogen™, Alemania). Las células se contaron con un contador de células Countess® (Life Technologies, Alemania). Se usó una reserva de virus H-1PV purificado internamente para infectar las células.
(B) Producción del H-1PV
Se eligió un CellSTACK® (CS) de 10 capas como un sistema conveniente de producción de un solo uso. Para la siembra e infección celular simultánea, las células NB-324K se sembraron a 3,6 x 104 células/cm2 en el CS de 10 capas e infectado inmediatamente con el H-1PV a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01 unidades formadoras de placa (UFP) por célula. El pH durante la infección fue de 7,0 ± 0,1. Las células infectadas se incubaron durante 4 días a 37 °C bajo 5 % de CO2 hasta que el efecto citopático (ECP), medido como el porcentaje de células muertas y desprendidas observadas al microscopio, alcanza al menos el 30 %. Para la siembra e infección no simultáneas, las células NB-324K se sembraron a 7,9 x 103 células/cm2 en un CS de 10 capas y se dejaron en cultivo durante tres días, momento en el que habían alcanzado una densidad de aproximadamente 3,6 x 104 células/cm2, medido en un matraz de cultivo control. Estas células ancladas se infectaron luego a una MOI de 0,01 UFP/célula y se incubaron durante 4 días como se describió anteriormente. Para la recolección, se aspiró el medio y las células infectadas se trataron con PBS/EDTA 1 mM. El sobrenadante del medio y las células desprendidas se centrifugaron durante 5 min a 5000 x g. El sedimento se lavó con PBS, se resuspendió en tampón Tris/EDTA (clorhidrato de Trizma®; Sigma-Aldrich Co. St. Louis, EE. UU.) y se sometió a tres ciclos de congelación/descongelación. Después de la centrifugación durante 5 min a 5000 x g, se descartaron los restos celulares. A continuación, el lisado celular se sometió a ultrasonidos a 48 W durante 1 min en un homogeneizador ultrasónico Sonorex Super 10 P (Bandelin, Alemania) y se trató con ADNasa (50 U/ml, Sigma, Alemania) durante 30 min a 37 °C.
Para más detalles, se hace referencia a Leuchs y otros, 2016 y PCT/EP 2016/001066.
(C) Purificación del H-1PV
El virus recolectado tratado con ADNasa se clarificó mediante filtración a través de un filtro Sartolab® P20 Plus de 0,2 pm y un filtro Sartolab® P20 Plus de 0,1 pm (Sartorius, Alemania)
(D) Cromatografía de intercambio aniónico DEAE a pequeña y gran escala (AEX)
Todos los estudios cromatográficos se realizaron con un disco monolítico CIM® DEAE de 0,34 ml o una columna monolítica CIM® DEAE de 8 ml (tamaño de los poros de 1,3 pm; Bia Separations, Ajdovscina, Eslovenia) y ÁKTAprime (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Alemania) a temperatura ambiente (TA) bajo flujo laminar. El monolito CIM® es una pieza única y homogénea moldeada de polímeros de metacrilato que contienen flujo a través de los poros. El DEAE (dietilaminoetil) es un intercambiador de aniones débil con un grupo dietilamino cargado que une selectivamente moléculas con una carga negativa predominante. El régimen de flujo de la fase móvil fue de 0,7 ml/min o 2 ml/min en dependencia del tamaño de la columna. La absorbancia se controló a 280 nm y se expresa en mili unidades de absorbancia (mAu). La conductividad se expresa en miliSiemens (mS). Todos los tampones se filtraron a través de filtros de 0,2 pm. La columna se equilibró con el tampón de aplicación antes del inicio de cada ejecución, hasta que se observaron valores constantes de conductividad y absorbancia UV. Las etapas de elución fueron seguidas por un lavado con alto contenido de sal con NaCl 1 M (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Alemania). El tampón de aplicación fue Tris-HCl 50 mM o NaCl 0,15 M en Tris-HCl 50 mM, ajustado a pH 8,7. La muestra obtenida en (C) anterior se diluyó en tampón de aplicación y se aplicó a la columna. A esto le siguió un lavado con tampón de aplicación hasta que se alcanzó la absorbancia UV de la línea base. La elución se realizó con un gradiente de sal continuo de NaCl 0 a 0,5 M en Tris-HCl 50 mM pH 8,7 o de NaCl 0,15 M a 0,4 M (0,3 M para gran escala) en Tris-HCl 50 mM pH 8,7. Se recogieron fracciones de un mililitro durante las pruebas y se analizaron en busca de partículas que contienen genoma (GP), partículas físicas (PP) y unidades formadoras de placa. Debido a que la evaluación de unidades formadoras de placa es un método laborioso basado en células, se realizó solo en experimentos cromatográficos a
gran escala y para el análisis de la formulación final, dada la importancia del título de virus infeccioso en la viroterapia anticancerosa.
(E) Formulación del H-1PV purificado después de la columna DEAE preparativa
El eluido del H-1PV de la columna DEAE contenía NaCl 0,25 M. Para eliminar la sal y formular en Visipaque (48 % de yodixanol en Ringer), fue necesario realizar un intercambio de tampón a una solución Ringer (AlleMan Pharma GmbH, Reutlingen, Alemania) seguido de una formulación en Visipaque (48 % de yodixanol en Ringer).
Para el intercambio de tampón en solución Ringer, se usaron dos enfoques:
Por un lado, se usó una columna de desalinización HiTrap™ de 5 ml (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Alemania) con el sistema ÁKTAprime. HiTrap™ utiliza dextrano reticulado para cromatografía de exclusión por tamaño. La columna se equilibró primero con 5 volúmenes de columna (VC) de solución Ringer. Luego, la muestra se inyectó en un lazo de muestra de 5 ml rellenado con solución Ringer, se cargó en la columna y se eluyó con dos VC de solución Ringer. Se recogieron fracciones de un mililitro y se analizaron en busca de partículas que contenían genoma y partículas físicas. Por otro lado, se usaron concentradores Vivaspin® de 6 ml (corte 30 kDa; Sartorius AG, Gottingen, Alemania). El sistema de ultrafiltración de membrana se esterilizó primero con etanol al 70 % durante 20 min, se centrifugó a 3000 x g, se enjuagó con 6 ml de agua estéril para uso inyectable, se centrifugó de nuevo y se dejó secar bajo flujo laminar. Se pipetearon muestras con un volumen inicial de aproximadamente 1 ml en el concentrador, se diluyeron 1:5 con solución Ringer y se centrifugaron a 3000 x g hasta que el volumen alcanzó 1 ml. Las muestras con un volumen inicial de 2 ml o más se concentraron primero a 1 ml y luego se diluyeron con una solución Ringer. Esto se hizo tres veces para diluir el tampón inicial 1:125 en solución Ringer. La última etapa de concentración se llevó a cabo hasta un volumen de muestra de ~300 pl. El índice de refracción de la muestra se midió luego con un refractómetro digital AR200 (Reichert, Inc., Depew, NY, EE. UU.) y tenía que ser el de la solución Ringer (1,3342 ± 0,0002).
Las muestras en solución Ringer obtenidas mediante uno de los métodos anteriores se mezclaron con Visipaque™ 320 (contiene 65,2 % de Yodixanol; GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Alemania) hasta una concentración final de 48 % de Yodixanol. A continuación, se midió el índice de refracción de la muestra y tenía que ser el de una solución de Visipaque al 48 % (1,41 ± 0,005).
(F) Cuantificación y calificación de lotes del H-1PV
La cuantificación y caracterización del virus se realizó mediante un ensayo de formación de placa (para partículas infecciosas), qPCR (para GP), H-1PV Capsid-ELISA (para PP), cuantificación de proteínas y SDS-PAGE (tinción de plata), transferencia Western y evaluación de esterilidad. (ver B. Leuchs y otros, 2016 para la descripción del método).
Microscopía electrónica.
El análisis microscópico electrónico de los lotes de virus purificados se realizó de acuerdo con Leuchs y otros, 2016 con algunas modificaciones menores. Se añadió una etapa de preincubación con solución de BSA al 0,05 % durante 1 minuto antes de la incubación de la muestra, así como también una etapa de desactivación del virus con glutaraldehído al 0,1 % durante 5 minutos después de la incubación de la muestra. Las fotografías se tomaron con un microscopio electrónico de transmisión Zeiss Em 900 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemania) con un aumento de 85000 x.
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Claims (8)
- REIVINDICACIONESi. Un método para producir partículas de parvovirus H-1 completamente activas, dicho método comprende:(a) proporcionar la línea celular productora NB-324K;(b) cultivar la línea celular en condiciones adecuadas e infectar las células a una densidad celular de 2,0 a 5,0 x 104 células/cm2 con el parvovirus a una MOI de 0,5 a 2 x 10-2 UFP/células;(c) recolectar las células de 2 a 6 días después de la infección y obtener un sedimento celular por centrifugación;(d) someter el sedimento celular resuspendido a un método de lisis celular mecánico, físico o químico para obtener un lisado celular que contiene parvovirus;(e) sonicar el lisado celular y someterlo a tratamiento con ADNasa;(f) clarificar por filtración el parvovirus recolectado tratado con ADNasa; y(g) cromatografía de intercambio aniónico para eliminar partículas vacías y la mayoría de las impurezas; (h) intercambio de tampón y concentración a través de una columna de desalinización o mediante filtración de flujo tangencial;(i) formulación final en solución Visipaque/Ringer.
- 2. El método de la reivindicación 1, en donde la densidad celular de la etapa (b) es de 3,0 a 4,0 x 104 células/cm2.
- 3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde para la etapa (f) se usa un filtro de 0,2 pm seguido de un filtro de 0,1 pm.
- 4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la cromatografía de intercambio aniónico es cromatografía en columna DEAE.
- 5. El método de la reivindicación 4, en donde la cromatografía de intercambio aniónico comprende aplicar el extracto de la etapa (f) a la columna en aproximadamente 0,15 M de NaCl que deja las partículas vacías e impurezas en el flujo pasante y las partículas llenas en la columna, en donde las partículas llenas se recuperan mediante elución con aproximadamente 0,25-0,30 M de NaCl.
- 6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde en la etapa (h) la columna de desalinización es un dextrano reticulado para cromatografía de exclusión por tamaño.
- 7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde en la etapa (h) la filtración de flujo tangencial se realiza a través de una membrana de polietersulfona con un corte de 30 KDa.
- 8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde las partículas virales obtenidas en la etapa (h) están en solución Ringer y luego se mezclan con 65,2 % de Yodixanol a una concentración final de 48 % de Yodixanol.
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