ES2882401T3 - Método de detección de polimorfismos basado en AFLP de alto rendimiento - Google Patents

Abstract

Método de alto rendimiento para el descubrimiento, la detección y el genotipado de un marcador genético en al menos una muestra, que comprende los pasos de: (a) proporcionar ADN de la al menos una muestra; (b) restringir el ADN con al menos una endonucleasa de restricción para producir fragmentos de restricción; (c) ligar adaptadores a los fragmentos de restricción para producir fragmentos de restricción ligados a un adaptador; (d) amplificar los fragmentos de restricción ligados a un adaptador con un par de cebadores, en el que al menos uno de los cebadores es complementario a al menos parte del adaptador para producir una biblioteca de fragmentos de restricción ligados a un adaptador amplificados; (e) someter la biblioteca a una secuenciación de alto rendimiento; (f) alinear las secuencias de los fragmentos de restricción ligados a un adaptador amplificados, en donde las secuencias que están alineadas se han secuenciado al menos 6 veces; (g) identificar el marcador genético comparando las secuencias alineadas; y (h) determinar el genotipo del marcador genético en las secuencias.

Description

DESCRIPCIÓN

Método de detección de polimorfismos basado en AFLP de alto rendimiento

Campo técnico

[0001] La presente invención se refiere a los campos de la biología molecular y la genética. La invención se refiere al descubrimiento, detección y genotipado rápido a gran escala de polimorfismos en una muestra de ácido nucleico o entre muestras. Los polimorfismos identificados pueden usarse como marcadores genéticos.

Antecedentes de la invención

[0002] La exploración del ADN genómico ha sido deseada durante mucho tiempo por la comunidad científica, en particular la comunidad médica. El ADN genómico es la clave para la identificación, el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades como el cáncer y la enfermedad de Alzheimer. Además de la identificación y el tratamiento de enfermedades, la exploración del ADN genómico puede proporcionar ventajas significativas en los esfuerzos de reproducción de plantas y animales, lo que puede proporcionar respuestas a los problemas de alimentación y nutrición en el mundo.

[0003] Se sabe que muchas enfermedades están asociadas con componentes genéticos específicos, en particular con polimorfismos en genes específicos. La identificación de polimorfismos en muestras grandes, como los genomas, en la actualidad es una tarea laboriosa y que requiere mucho tiempo. Sin embargo, dicha identificación es de gran valor en áreas como la investigación biomédica, el desarrollo de productos farmacéuticos, la tipificación de tejidos, la genotipificación y los estudios de población.

[0004] Los marcadores, esto es, los marcadores genéticos, se han utilizado durante mucho tiempo como método de tipificación genética, es decir, para asociar un rasgo fenotípico a la presencia, ausencia o cantidad de una parte concreta del ADN (gen). Una de las tecnologías de tipificación genética más versátiles es la de los AFLP, que ya existe desde hace muchos años y se aplica ampliamente a cualquier organismo (para ver revisiones, véase Savelkoul y col. J. Clin. Microbiol, 1999, 37 (10), 3083-3091; Bensch y col. Molecular Ecology, 2005, 14, 2899-2914)

[0005] La tecnología AFLP (Zabeau & Vos, 1993; Vos y col., 1995) ha encontrado un uso generalizado en el fitomejoramiento y otros campos desde su invención a principios de los noventa. Esto se debe a varias características de los AFLP, de las cuales la más importante es que no se necesita información de secuencia previa para generar un gran número de marcadores genéticos de forma reproducible. Además, el principio de amplificación selectiva, una piedra angular de la tecnología AFLP, asegura que el número de fragmentos amplificados pueda alinearse con la resolución del sistema de detección, independientemente del tamaño del genoma o del origen.

[0006] La detección de fragmentos de AFLP se lleva a cabo comúnmente mediante electroforesis en geles en lámina (Vos y col., 1995) o electroforesis capilar (van der Meulen y col., 2002). La mayoría de los marcadores AFLP puntuados de esta manera representan polimorfismos (de un único nucleótido) que se producen en los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción usados para la preparación del molde AFLP o sus nucleótidos flanqueantes cubiertos por cebadores AFLP selectivos. El resto de los marcadores AFLP son polimorfismos de inserción/deleción que se producen en las secuencias internas de los fragmentos de restricción y, una fracción muy pequeña, en las sustituciones de un único nucleótido que se producen en pequeños fragmentos de restricción (<aproximadamente 100 pb), que para estos fragmentos causan variaciones de movilidad reproducibles entre ambos alelos; estos marcadores AFLP se pueden puntuar de forma codominante sin tener que depender de las intensidades de las bandas.

[0007] En una huella genética AFLP típica, los marcadores AFLP constituyen, por tanto, la minoría de los fragmentos amplificados (menos del 50 por ciento, pero a menudo menos del 20 por ciento), mientras que el resto se denomina comúnmente fragmentos AFLP constantes. No obstante, estos últimos son útiles en el procedimiento de puntuación en gel, ya que sirven como puntos de anclaje para calcular la movilidad de los fragmentos de los marcadores AFLP y ayudan a cuantificar los marcadores para la puntuación codominante. La puntuación codominante (puntuación de homo o heterocigosidad) de los marcadores AFLP está actualmente restringida al contexto del análisis de la huella genética de una población en segregación. En un panel de líneas no relacionadas, solo es posible la puntuación dominante.

[0008] Aunque el rendimiento de la técnica de los AFLP es muy alto debido a los altos niveles de multiplexación en los pasos de amplificación y detección, el paso de limitación de la velocidad es el poder de resolución de la electroforesis. La electroforesis permite la identificación única de la mayoría de los fragmentos amplificados basándose en la combinación de combinaciones de enzimas de restricción (EC), combinaciones de cebadores (PC) y la movilidad, pero lo ideal es que el sistema de detección sea capaz de determinar la secuencia completa de los fragmentos amplificados para capturar todos los polimorfismos.

[0009] La detección por secuenciación en lugar de la determinación de la movilidad aumentará el rendimiento porque:

1) Los polimorfismos localizados en las secuencias internas se detectarán en la mayoría (o en todos) de los fragmentos amplificados; esto aumentará considerablemente el número de marcadores por PC.

2) No hay pérdida de marcadores AFLP debido a la comigración de bandas constantes y marcadores AFLP.

3) La puntuación codominante no se basa en la cuantificación de las intensidades de las bandas y es independiente del parentesco de los individuos cuyas huellas genéticas se analizan.

[0010] Hasta ahora, la detección de marcadores/secuencias AFLP mediante secuenciación no ha sido económicamente viable debido, entre otras limitaciones, a las limitaciones económicas de la tecnología de secuenciación didesoxi de Sanger y otras tecnologías de secuenciación convencionales.

[0011] Por consiguiente, uno de los objetivos de la presente invención es proporcionar métodos viables económicamente para la detección de marcadores AFLP u otros marcadores genéticos tales como marcadores SNP con base en la secuenciación.

[0012] Un problema importante asociado además con la detección de una colección de fragmentos que contienen AFLP o SNP mediante secuenciación con fines de genotipado (es decir, de diagnóstico) es el de la variación en la obtención de las muestras. Específicamente, esto significa que, cuando se analiza una colección de fragmentos y no se observan fragmentos particulares, hay que asegurarse de que esto no se deba al hecho de que los fragmentos involucrados no se habían muestreado en el paso de detección, aunque están presentes en la mezcla de fragmentos, porque esto conduciría a un falso negativo del marcador. Esta limitación no se aplica a la detección por electroforesis porque se dispone de información sobre la posición en el gel.

[0013] Por consiguiente, uno de los objetivos adicionales de la presente invención es proporcionar un método que resuelva el problema de la variación muestral o que al menos reduzca los errores causados por la variación muestral a un mínimo aceptable.

Resumen de la invención

[0014] Los presentes inventores han descubierto que la secuenciación se puede lograr para la detección de marcadores AFLP y SNP con el uso de AFLP en ciertos procedimientos adaptados para la secuenciación de alto rendimiento. Por lo tanto, la invención proporciona un método o estrategia que combina el poder y la aplicabilidad genérica de los AFLP con ciertas tecnologías de secuenciación de alto rendimiento para establecer un sistema de puntuación de polimorfismo aplicable de manera genérica. En esta estrategia, la cuestión de la variación muestral también se aborda para garantizar una genotipificación con alta precisión y maximizar las posibilidades de obtener conjuntos de datos con un número mínimo de genotipos ausentes.

Definiciones

[0015] En la siguiente descripción y ejemplos se utiliza una serie de términos. Con el fin de proporcionar una comprensión clara y coherente de la memoria y las reivindicaciones, incluyendo el alcance que se les dará a dichos términos, se proporcionan las definiciones siguientes. A menos que se definan de otra manera en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos utilizados tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece esta invención. Las descripciones de todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias se incorporan al presente documento en su totalidad como referencia.

[0016] Polimorfismo: el polimorfismo se refiere a la presencia de dos o más variantes de una secuencia de nucleótidos en una población. Un polimorfismo puede comprender uno o más cambios de bases, una inserción, una repetición o una deleción. Un polimorfismo incluye, por ejemplo, una repetición de secuencia simple (SSR) y un polimorfismo de un único nucleótido (SNP), que es una variación que se produce cuando se altera un único nucleótido: adenina (A), timina (T), citosina (C) o guanina (G). Generalmente, debe producirse una variación en al menos el 1 % de la población para que se considere un SNP. Los SNP constituyen, por ejemplo, el 90 % de todas las variaciones genéticas humanas, y se producen cada 100 a 300 bases a lo largo del genoma humano. Dos de cada tres SNP sustituyen la citosina (C) con timina (T). Las variaciones en las secuencias de ADN de, por ejemplo, los seres humanos o las plantas pueden afectar a la forma en que estos reaccionan frente a enfermedades, bacterias, virus, compuestos químicos, fármacos, etc.

[0017] Ácido nucleico: un ácido nucleico según la presente invención puede incluir cualquier polímero u oligómero de base pirimidina y purina, preferiblemente citosina, timina y uracilo, y adenina y guanina, respectivamente (véase Albert L. Lehninger, Principles of Biochemistry, páginas 793-800 (Worth Pub. 1982) que se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad a todos los efectos). La presente invención contempla cualquier desoxirribonucleótido, ribonucleótido o componente de ácido peptidonucleico, y cualquier variante química del mismo, tales como formas metiladas, hidroximetiladas o glicosiladas de estas bases, y similares. Los polímeros u oligómeros pueden ser de composición heterogénea u homogénea y pueden aislarse a partir de fuentes naturales o pueden producirse de manera artificial o sintética. Además, los ácidos nucleicos pueden ser ADN o ARN, o una mezcla de los mismos, y pueden existir de forma permanente o transitoria en forma monocatenaria o bicatenaria, incluidos estados homodúplex, heterodúplex e híbridos.

[0018] Reducción de la complejidad: el término reducción de la complejidad se utiliza para indicar un método en el que la complejidad de una muestra de ácido nucleico, como el ADN genómico, se reduce mediante la generación de un subconjunto de la muestra. Este subconjunto puede ser representativo de la muestra completa (es decir, de la muestra compleja) y es preferiblemente un subconjunto reproducible. En este contexto, reproducible significa que, cuando la misma muestra se reduce en complejidad utilizando el mismo método, se obtiene el mismo subconjunto, o al menos uno comparable. El método utilizado para la reducción de la complejidad puede ser cualquier método para la reducción de la complejidad conocido en la técnica. Un ejemplo preferido de un método para la reducción de la complejidad incluye, por ejemplo, AFLP® (Keygene N.V., Países Bajos; véase, por ejemplo, la patente EP 0534858, US6045994), los métodos descritos por Dong (véase, por ejemplo, las patentes WO 03/012118, WO 00/24939), unión indexada (Unrau y col., vide infra), PCR mediada por ligación (WO90/008821) y PCR SALSA (WO00/23620) Schouten et al) etc. Los métodos de reducción de la complejidad usados en la presente invención tienen en común que son reproducibles. Reproducibles en el sentido de que, cuando se reduce la complejidad de la misma muestra de la misma manera, se obtiene el mismo subconjunto de la muestra, en contraposición a una reducción de complejidad más aleatoria como la microdisección o el uso de ARNm (ADNc) que representa una porción del genoma transcrito en un tejido seleccionado y para su reproducibilidad depende de la selección del tejido, del tiempo de aislamiento, etc.

[0019] AFLP: AFLP se refiere a un método para la amplificación selectiva de ADN que se basa en la digestión de un ácido nucleico con una o más endonucleasas de restricción para producir fragmentos de restricción, la ligación de adaptadores a los fragmentos de restricción y la amplificación de los fragmentos de restricción ligados al adaptador con al menos un cebador que es (parcialmente) complementario al adaptador, (parcialmente) complementario a los restos de la endonucleasa de restricción y que además contiene al menos un nucleótido seleccionado aleatoriamente de entre A, C, T o G (o U según el caso). La técnica de AFLP no requiere ninguna información de secuencia previa y se puede realizar en cualquier ADN de partida. En general, la técnica AFLP comprende los pasos de:

(a) digerir un ácido nucleico, en particular un ADN o ADNc, con una o más endonucleasas de restricción específicas, para fragmentar el ADN en una serie de fragmentos de restricción correspondientes;

(b) ligar los fragmentos de restricción obtenidos de esta manera con un adaptador oligonucleotídico sintético bicatenario, un extremo del cual es compatible con uno o ambos extremos de los fragmentos de restricción, para producir de ese modo fragmentos de restricción ligados al adaptador, preferiblemente marcados, del ADN de partida;

(c) poner en contacto los fragmentos de restricción ligados al adaptador, preferiblemente etiquetados, en condiciones de hibridación con uno o más cebadores oligonucleotídicos que contienen nucleótidos selectivos en su extremo 3';

(d) amplificar el fragmento de restricción ligado al adaptador, preferiblemente etiquetado, hibridado con los cebadores por PCR o una técnica similar para provocar una mayor elongación de los cebadores hibridados a lo largo de los fragmentos de restricción del ADN de partida con que se han hibridado los cebadores; y (e) detectar, identificar o recuperar el fragmento de ADN amplificado o alargado obtenido de este modo.

[0020] Por lo tanto, el método AFLP proporciona un subconjunto reproducible de fragmentos ligados a un adaptador. El método AFLP se describe en las patentes EP 534858, US 6045994 y en Vos y col. Se hace referencia a estas publicaciones para obtener más detalles sobre la técnica AFLP. La técnica AFLP se usa comúnmente como una técnica de reducción de la complejidad y una tecnología de análisis de las huellas del ADN. En el contexto del uso de AFLP como tecnología de análisis de huellas genéticas, se ha desarrollado el concepto de marcador AFLP.

[0021] Marcador AFLP: un marcador AFLP es un fragmento de restricción ligado a un adaptador amplificado que es diferente entre dos muestras que se han amplificado usando AFLP (análisis de la huella genética), usando el mismo conjunto de cebadores. Como tal, la presencia o ausencia de este fragmento de restricción ligado a un adaptador amplificado puede usarse como un marcador que está ligado a un rasgo o fenotipo. En la tecnología en gel convencional, un marcador AFLP aparece como una banda en el gel ubicada en una determinada movilidad. Otras técnicas electroforéticas como la electroforesis capilar pueden no referirse a esto como una banda, pero el concepto es el mismo, esto es, un ácido nucleico con una cierta longitud y movilidad. La ausencia o presencia de la banda puede ser indicativa de (o estar asociada con) la presencia o ausencia del fenotipo. Los marcadores AFLP típicamente involucran SNP en el sitio de restricción de la endonucleasa o los nucleótidos selectivos. Ocasionalmente, los marcadores AFLP pueden involucrar inserciones y deleciones (indeles) en el fragmento de restricción.

[0022] Marcador SNP: un marcador SNP es un marcador que se basa en un polimorfismo de un único nucleótido identificado en una posición determinada. Los marcadores SNP se pueden ubicar en posiciones idénticas a los marcadores AFLP, pero los marcadores SNP también se pueden ubicar en el propio fragmento de restricción. Como tales, los marcadores SNP de género abarcan así los marcadores AFLP de especie.

[0023] Banda constante: una banda constante en la tecnología AFLP es un fragmento de restricción ligado a un adaptador amplificado que es relativamente invariable entre muestras. Por tanto, una banda constante en la tecnología AFLP, en un rango de muestras, aparecerá aproximadamente en la misma posición en el gel, es decir, tendrá la misma longitud/movilidad. En AFLP convencional, se utilizan típicamente para anclar los carriles correspondientes a muestras en un gel o electroferogramas de múltiples muestras de AFLP detectadas por electroforesis capilar. Normalmente, una banda constante es menos informativa que un marcador AFLP. No obstante, como los marcadores AFLP habitualmente implican SNP en los nucleótidos selectivos o en el sitio de restricción, las bandas constantes pueden comprender SNP en los propios fragmentos de restricción, lo que convierte a las bandas constantes en una interesante fuente alternativa de información genética que es complementaria a los marcadores AFLP.

[0024] Base selectiva: Ubicada en el extremo 3' del cebador que contiene una parte que es complementaria al adaptador y una parte que es complementaria a los restos del sitio de restricción, la base selectiva se selecciona aleatoriamente de entre A, C, T o G. Al extender un cebador con una base selectiva, la amplificación subsiguiente producirá solo un subconjunto reproducible de los fragmentos de restricción ligados al adaptador, es decir, solo los fragmentos que pueden amplificarse usando el cebador que lleva la base selectiva. Pueden añadirse nucleótidos selectivos al extremo 3' del cebador en un número que varía entre 1 y 10. Normalmente, basta con 1-4. Ambos cebadores pueden contener un número variable de bases selectivas. Con cada base selectiva añadida, el subconjunto reduce la cantidad de fragmentos de restricción amplificados ligados al adaptador en el subconjunto en un factor de aproximadamente 4. Normalmente, el número de bases selectivas utilizadas en AFLP se indica mediante N+M, donde un cebador lleva N nucleótidos selectivos y los otros cebadores llevan M nucleótidos selectivos. Por lo tanto, un AFLP Eco/Mse 1/+2 es una abreviatura para la digestión del ADN de partida con EcoRI y Msel, ligación de adaptadores apropiados y amplificación con un cebador dirigido a la posición restringida de EcoRI que lleva una base selectiva y el otro cebador dirigido al sitio restringido de Msel que lleva 2 nucleótidos selectivos.

[0025] Agrupamiento: con el término "agrupamiento" se entiende la comparación de dos o más secuencias de nucleótidos basándose en la presencia de tramos cortos o largos de nucleótidos idénticos o similares. Se conocen en la técnica varios métodos para el alineamiento de secuencias de nucleótidos, como se explicará con más detalle a continuación. A veces, los términos "ensamblaje" o "alineación" se utilizan como sinónimos.

[0026] Etiqueta: una secuencia corta que puede agregarse a un cebador o incluirse en su secuencia o usarse como etiqueta para proporcionar un identificador único. Dicho identificador de secuencia puede ser una secuencia de bases única de longitud variable pero definida utilizada solo para identificar una muestra de ácido nucleico específica. Por ejemplo, las etiquetas de 4 pb permiten 4(exp4) = 256 etiquetas diferentes. Los ejemplos típicos son las secuencias ZIP, conocidas en la técnica como etiquetas de uso común para la detección única por hibridación (lannone y col. Cytometry 39: 131-140, 2000). Usando una etiqueta de este tipo, el origen de una muestra de PCR se puede determinar después de un procesamiento adicional. En el caso de combinar productos procesados provenientes de diferentes muestras de ácido nucleico, las diferentes muestras de ácido nucleico generalmente se identifican usando diferentes etiquetas. En el caso de la presente invención, la adición de una etiqueta de secuencia única sirve para identificar las coordenadas de la planta individual en el conjunto de productos de amplificación de secuencias. Se pueden utilizar varias etiquetas.

[0027] Etiquetado: el término etiquetado se refiere a la adición de una etiqueta a una muestra de ácido nucleico para poder distinguirla de una segunda o más muestras de ácido nucleico. El etiquetado puede realizarse, por ejemplo, mediante la adición de un identificador de secuencia durante la reducción de la complejidad o mediante cualquier otro medio conocido en la técnica. Tal identificador de secuencia puede, por ejemplo, ser una secuencia de bases única de longitud variable pero definida utilizada de forma única para identificar una muestra de ácido nucleico específica. Los ejemplos típicos de los mismos son, por ejemplo, secuencias ZIP. Usando una etiqueta de este tipo, el origen de una muestra se puede determinar en el procesamiento posterior. En caso de combinar productos procesados procedentes de diferentes muestras de ácido nucleico, las diferentes muestras de ácido nucleico deben identificarse utilizando diferentes etiquetas.

Biblioteca etiquetada: el término biblioteca etiquetada se refiere a una biblioteca de ácidos nucleicos etiquetados.

Secuenciación: el término secuenciación se refiere la determinación del orden de los nucleótidos (secuencias de bases) en una muestra de ácido nucleico, por ejemplo ADN o ARN.

Cribado de alto rendimiento: el cribado de alto rendimiento, a menudo abreviado como HTS, es un método de experimentación científica especialmente relevante para los campos de la biología y la química. Mediante una combinación de robótica moderna y otras herramientas de laboratorio especializadas, permite a un investigador analizar de forma eficaz grandes cantidades de muestras de forma simultánea.

Endonucleasa de restricción: una endonucleasa de restricción o enzima de restricción es una enzima que reconoce una secuencia de nucleótidos específica (sitio diana) en una molécula de ADN bicatenario y escindirá ambas hebras de la molécula de a Dn en cada sitio diana.

Fragmentos de restricción: las moléculas de ADN producidas por digestión con una endonucleasa de restricción se denominan fragmentos de restricción. Cualquier genoma dado (o ácido nucleico, independientemente de su origen) será digerido por una endonucleasa de restricción particular para dar un conjunto discreto de fragmentos de restricción. Los fragmentos de ADN que resultan de la escisión de endonucleasas de restricción se pueden usar adicionalmente en una variedad de técnicas y, por ejemplo, se pueden detectar mediante electroforesis en gel.

Electroforesis en gel: para detectar fragmentos de restricción, puede ser necesario un método analítico para fraccionar moléculas de ADN bicatenario en función del tamaño. La técnica más utilizada para lograr dicho fraccionamiento es la electroforesis en gel (capilar). La velocidad a la que se mueven los fragmentos de ADN en tales geles depende de su peso molecular; por lo tanto, las distancias recorridas disminuyen a medida que aumentan las longitudes de los fragmentos. Los fragmentos de ADN fraccionados mediante electroforesis en gel se pueden visualizar directamente mediante un procedimiento de tinción, por ejemplo, tinción con plata o tinción con bromuro de etidio, si el número de fragmentos incluidos en el patrón es suficientemente pequeño. Alternativamente, el tratamiento adicional de los fragmentos de ADN puede incorporar marcadores detectables en los fragmentos, tales como fluoróforos o marcadores radiactivos. Ligación: la reacción enzimática catalizada por una enzima ligasa en la que dos moléculas de ADN bicatenario se unen covalentemente se denomina ligación. En general, ambas hebras de ADN se unen covalentemente, pero también es posible evitar la ligación de una de las dos hebras mediante la modificación química o enzimática de uno de los extremos de las hebras. En ese caso, la unión covalente se producirá solo en una de las dos cadenas del ADN.

Oligonucleótido sintético: las moléculas de ADN monocatenario que tienen preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 bases, que se pueden sintetizar químicamente, se denominan oligonucleótidos sintéticos. En general, estas moléculas de ADN sintético están diseñadas para que tengan una secuencia de nucleótidos única o deseada, aunque es posible sintetizar familias de moléculas que tengan secuencias relacionadas y que tengan diferentes composiciones de nucleótidos en posiciones específicas dentro de la secuencia de nucleótidos. El término oligonucleótido sintético se utilizará para referirse a moléculas de ADN que tengan una secuencia de nucleótidos diseñada o deseada.

[0028] Adaptadores: moléculas de ADN bicatenario corto con un número limitado de pares de bases, por ejemplo, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 pares de bases de longitud, que están diseñadas de manera que se puedan ligar a los extremos de los fragmentos de restricción. Los adaptadores se componen generalmente de dos oligonucleótidos sintéticos que tienen secuencias de nucleótidos que son parcialmente complementarias entre sí. Cuando se mezclan los dos oligonucleótidos sintéticos en solución en condiciones apropiadas, se reasociarán entre sí formando una estructura bicatenaria. Después de la hibridación, un extremo de la molécula adaptadora se diseña de manera que sea compatible con el extremo de un fragmento de restricción y pueda ligarse a este; el otro extremo del adaptador puede diseñarse de modo que no se pueda ligar, pero no es necesario que sea así (adaptadores de doble ligación).

[0029] Fragmentos de restricción ligados a un adaptador: fragmentos de restricción a los que se han añadido adaptadores en el extremo 5'.

Cebadores: en general, el término cebadores se refiere a cadenas de ADN que pueden iniciar la síntesis de ADN. La ADN polimerasa no puede sintetizar ADN de novo sin cebadores: solo puede extender una hebra de ADN existente en una reacción en la que la hebra complementaria se usa como plantilla para dirigir el orden de los nucleótidos que se ha de ensamblar. Se hará referencia a las moléculas de oligonucleótidos sintéticos que se utilizan en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como cebadores.

Amplificación de ADN: el término amplificación de ADN se utilizará normalmente para denotar la síntesis in vitro de moléculas de ADN bicatenario mediante PCR. Se observa que existen otros métodos de amplificación y se pueden usar en la presente invención sin apartarse de su esencia.

Hibridación selectiva: se relaciona con la hibridación, en condiciones de hibridación rigurosas, de una secuencia de ácido nucleico con una secuencia diana de ácido nucleico especificada en un grado detectablemente mayor (por ejemplo, al menos 2 veces sobre el fondo) que su hibridación con secuencias de ácido nucleico no diana y con la exclusión sustancial de ácidos nucleicos no diana. Los términos "condiciones rigurosas" o "condiciones rigurosas de hibridación" incluyen una referencia a las condiciones en las que una sonda se hibridará con su secuencia diana, en un grado detectablemente mayor que otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 sobre el fondo). Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Al controlar la rigurosidad de las condiciones de hibridación y/o lavado, se pueden identificar secuencias diana que son 100 % complementarias a la sonda (sondeo homólogo). Alternativamente, las condiciones de rigurosidad pueden ajustarse para permitir algún desajuste en las secuencias de modo que se detecten grados más bajos de similitud (sondeo heterólogo). Generalmente, una sonda tiene menos de aproximadamente 100 nucleótidos de longitud, opcionalmente no más de 50 o 25 nucleótidos de longitud. Normalmente, las condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración de sal sea inferior a aproximadamente 1,5 M de iones de Na, normalmente una concentración de aproximadamente 0,01 a 1,0 M de iones de Na (u otras sales) a un pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente a 60 °C para sondas largas (por ejemplo, más de 50 nucleótidos). También se pueden lograr condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizadores tales como la formamida. Las condiciones de baja rigurosidad a modo de ejemplo incluyen la hibridación con una solución tampón de 30 a 35 % de formamida, NaCl 1 M, SDS (dodecilsulfato de sodio) al 1 % a 37 °C y un lavado en 1* a 2* SSC (20* SSC = 3,0 M NaCl/citrato trisódico 0,3 M) de 50 a 55 °C. Las condiciones de rigurosidad moderada ejemplares incluyen hibridación en formamida del 40 al 45 %, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37 °C y un lavado en SSC 0,5* a 1* a 55 a 60°C. Las condiciones de alta rigurosidad ejemplares incluyen hibridación en formamida al 50 %, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37 °C y un lavado en 0,1 x SSC a 60 a 65 °C. La especificidad depende típicamente de los lavados posteriores a la hibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para híbridos de ADN-ADN, la Tm se puede aproximar a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284 (1984): Tm = 81,5 °C+ 16,6 (log ^m )+0,41 (% de GC)-0,61 (% de form.)-500/L; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, % GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % de form. es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica y un pH definidos) a la que el 50 % de una secuencia diana complementaria se hibrida con una sonda perfectamente emparejada. La Tm se reduce en aproximadamente 1 °C por cada 1 % de desajuste; por tanto, la Tm, las condiciones de hibridación y/o lavado se pueden ajustar para hibridar con secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con > 90 % de identidad, la Tm puede reducirse 10 °C. Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5 °C menos que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones estrictamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o un lavado a 1, 2, 3 o 4 °C menos que el punto de fusión térmico (Tm); Las condiciones moderadamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o un lavado a 6, 7, 8, 9 o 10 °C menos que el punto de fusión térmico (Tm); las condiciones de baja rigurosidad pueden utilizar una hibridación y/o un lavado a 11, 12, 13, 14, 15 o 20 °C menos que el punto de fusión térmico (Tm). Utilizando la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado, y la Tm deseada, los expertos en la materia comprenderán que se describen inherentemente variaciones en la rigurosidad de las soluciones de hibridación y/o lavado. Si el grado deseado de desajuste da como resultado una Tm de menos de 45 °C (solución acuosa) o 32 °C (solución de formamida), se prefiere aumentar la concentración de SSC para poder utilizar una temperatura más alta. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridisation with Nucleic Acid Probes, Part 1, Chapter 2 "Overview of principles of hybridisation and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, N.Y. (1993); y Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York (1995).

Descripción detallada de la invención

[0030] En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para el descubrimiento, la detección y el genotipado de alto rendimiento a gran escala de uno o más marcadores genéticos en una o más muestras, que comprende los pasos de:

(a) proporcionar ADN de una o más muestras;

(b) restringir el ADN con al menos una endonucleasa de restricción para producir fragmentos de restricción; (c) ligar adaptadores a los fragmentos de restricción para producir fragmentos de restricción ligados a un adaptador;

(d) opcionalmente, amplificar los fragmentos de restricción ligados a un adaptador con un par de cebadores que es al menos complementario a los adaptadores para producir fragmentos de restricción preamplificados ligados a un adaptador;

(e) amplificar los fragmentos de restricción ligados a un adaptador (opcionalmente preamplificados) con un par de cebadores, en el que al menos uno de los cebadores contiene una etiqueta de identificador en el extremo 5' del cebador para producir una biblioteca de subconjuntos amplificados y etiquetados de fragmentos de restricción ligados a un adaptador para cada muestra;

(f) opcionalmente, agrupar las bibliotecas derivadas de múltiples muestras;

(g) secuenciar las bibliotecas utilizando tecnología de secuenciación de alto rendimiento;

(h) agrupar las secuencias por biblioteca, utilizando la etiqueta de identificación;

(i) identificar marcadores genéticos comparando secuencias agrupadas dentro de una biblioteca y/o entre las bibliotecas.

(j) determinar los genotipos (co)dominantes de los marcadores genéticos en una o más bibliotecas, preferiblemente para todas las muestras y para todos los marcadores identificados.

[0031] El método se refiere al descubrimiento, la detección y el genotipado de uno o más marcadores genéticos en una o más muestras. En determinadas formas de realización, los métodos se refieren a la puntuación de la presencia/ausencia de los marcadores genéticos de interés. En determinadas formas de realización, el método se refiere a la determinación de genotipos (co)dominantes de una o más muestras para uno o más marcadores genéticos. Esto puede requerir la normalización del número observado de secuencias de marcadores o alelos de marcadores entre muestras.

[0032] En el primer paso (a) del método, se proporcionará ADN. Esto puede realizarse mediante métodos conocidos en la técnica de por sí. El aislamiento de ADN generalmente se logra utilizando métodos comunes en la técnica, como la obtención de tejido de un miembro de la población, extracción de ADN (por ejemplo, usando el kit de ADN rápido Q-Biogene), cuantificación y normalización para obtener cantidades iguales de ADN por muestra. El ADN puede provenir de una variedad de fuentes (genómicas, ARN, ADNc, BAc, YAC, etc.) y organismos (humanos, mamíferos, plantas, microorganismos, etc.). El ADN aislado se puede combinar.

[0033] El ADN se restringe en el paso (b) usando al menos una endonucleasa de restricción. Dependiendo del caso, es decir, del tamaño del genoma, se pueden usar más endonucleasas. En determinadas formas de realización, se pueden utilizar 2 o más endonucleasas. Para la mayoría de los genomas, 2 endonucleasas son suficientes y, por lo tanto, esta es la más preferida. En algunas formas de realización, especialmente para genomas grandes o complejos, se pueden usar más endonucleasas. Preferiblemente, la endonucleasa proporciona fragmentos de restricción relativamente cortos del orden de 250-500 pb, pero esto no es esencial. Normalmente, se prefiere al menos una endonucleasa de corte frecuente, es decir, endonucleasas que tienen una secuencia de reconocimiento de 4 o 5 pares de bases. Una de estas enzimas es Msel, pero muchas otras están disponibles comercialmente y pueden usarse. También se pueden usar enzimas que cortan fuera de su secuencia de reconocimiento (tipo Ils), o enzimas que proporcionan fragmentos de restricción de extremos romos. Una combinación preferida usa un cortador raro (secuencia de reconocimiento de 6 o más pares de bases, por ejemplo EcoRI) y un cortador frecuente.

[0034] Después de la restricción de los ADN combinados, o simultáneamente a esta, los adaptadores se ligan a los fragmentos de restricción para proporcionar fragmentos de restricción ligados a un adaptador. Se pueden usar uno o más adaptadores diferentes, por ejemplo, dos adaptadores, uno directo y otro inverso. Alternativamente, se puede usar un adaptador para todos los fragmentos o se pueden usar conjuntos de adaptadores que contengan, en el extremo sobresaliente del adaptador, permutaciones de nucleótidos para proporcionar enlazadores de indexación que pueden permitir un paso de preselección (Unrau y col., Gene, 1994, 145, 163-169.). Alternativamente, se pueden usar adaptadores de extremos romos, en el caso de fragmentos de restricción de extremos romos. La ligación con adaptador es ampliamentes conocida en la técnica y se describe, entre otros, en el documento EP 534858.

Una variante útil de la tecnología AFLP no utiliza nucleótidos selectivos (por ejemplo, cebadores 0/+0) y, a veces, se denomina PCR mediada por ligación. Al igual que con la PCR Salsa, el paso de selección se logra mediante el uso de enzimas de restricción; diferentes enzimas de restricción producen diferentes subconjuntos. Esto a veces también se indica como una preamplificación en la que se utilizan cebadores que son al menos complementarios a los adaptadores y, opcionalmente, también a parte de los restos de la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción. La preamplificación puede servir para normalizar (aún más) la cantidad de ADN de cada muestra, o para aumentar la cantidad total de ADN para permitir múltiples análisis (es decir, dividir muestras) y mejorar la relación señal-ruido. La preamplificación también puede usarse para introducir etiquetas que permitan el agrupamiento antes de la amplificación selectiva. Mediante la introducción de etiquetas de nucleótidos (por ejemplo, de 4 pb) en el extremo 5' del cebador, se pueden etiquetar fragmentos de restricción para una muestra distinta y al final del proceso se pueden recuperar utilizando la etiqueta.

[0035] Los fragmentos de restricción ligados a un adaptador se amplifican, después de la preamplificación opcional, en el paso (d) del método de la invención con un par de cebadores. Uno de los cebadores es complementario de al menos parte del adaptador y además puede ser complementario de parte del resto de la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa y puede contener además nucleótidos selectivos (seleccionados al azar) en su extremo 3', de manera similar a como se describe en el documento EP534858. Preferiblemente, los cebadores son capaces de una hibridación selectiva en condiciones rigurosas de hibridación. La amplificación selectiva también se puede realizar con cebadores que llevan una etiqueta 5' para identificar el origen de la muestra, de manera similar a lo anterior. El resultado es una biblioteca de subconjuntos (etiquetados) de fragmentos de restricción amplificados ligados a un adaptador.

[0036] Los fragmentos amplificados selectivamente en las bibliotecas preparadas a partir de múltiples muestras se pueden combinar opcionalmente en este punto. Esto puede ser útil en caso de que se busquen marcadores que sean específicos para ciertos grupos de muestras, como los que comparten ciertas características fenotípicas. El cribado de muestras agrupadas se denomina comúnmente análisis de segregantes agrupados (BSA; Michelmore, Paran y Kesseli, 1991). En determinadas formas de realización, la combinación también se puede realizar antes de la extracción de ADN en el paso de muestreo, lo que reduce el número de preparaciones de ADN. La combinación del ADN sirve además para normalizar los ADN antes de la amplificación por PCR para proporcionar una representación más equitativa en las bibliotecas para la secuenciación.

[0037] Las bibliotecas, opcionalmente agrupadas, de fragmentos de restricción ligados a un adaptador amplificados selectivamente se secuencian en este momento usando tecnología de secuenciación de alto rendimiento.

[0038] En principio, la secuenciación puede realizarse mediante cualquier medio conocido en la técnica, tal como el método de terminación de cadena didesoxi (secuenciación de Sanger). Sin embargo, es preferible y más ventajoso que la secuenciación se realice utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento, como los métodos descritos en las patentes WO 03/004690, WO 03/054142, WO 2004/069849, WO 2004/070005, WO 2004/070007, y WO 2005/003375 (todas a nombre de 454 Life Sciences), por Seo y col. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 101: 5488-93 y tecnologías de Helios, Solexa, US Genomics, etcétera. Lo más preferido es que la secuenciación se realice utilizando el aparato y/o método descrito en las patentes WO 03/004690, WO 03/054142, WO 2004/069849, WO 2004/070005, WO 2004/070007, y WO 2005/003375 (todas a nombre de 454 Life Sciences). La tecnología descrita actualmente permite la secuenciación de hasta 40 millones de bases en una sola tanda y es 100 veces más rápida y económica que la tecnología de la competencia basada en la secuenciación de Sanger y utilizando instrumentos de electroforesis capilar disponibles actualmente, como MegaBACE (GE Healthcare) o ABI3700 (xl) (Applied Biosystems). Esto aumentará al aumentar la longitud de lectura por reacción y/o al aumentar el número de reacciones paralelas. La tecnología de secuenciación consiste aproximadamente en 5 pasos: 1) fragmentación del ADN y ligación de un adaptador específico para crear una biblioteca de ADN monocatenario (ADNmc); 2) hibridación de ADNmc en microesferas, emulsificación de las microesferas en microrreactores de agua en aceite y realización de PCR en emulsión para amplificar las moléculas de ADNmc individuales en microesferas; 3) selección de/enriquecimiento de microesferas que contienen moléculas de ADNmc amplificadas en su superficie 4) depósito de microesferas portadoras de ADN en un PicoTiterPlate®; y 5) secuenciación simultánea en 100000 pocillos mediante la generación de una señal luminosa de pirofosfato.

[0039] En una forma de realización preferida, la secuenciación comprende los pasos de:

(1) hibridación de fragmentos ligados con adaptador de secuenciación a microesferas, donde cada una de las microesferas se hibrida con un solo fragmento;

(2) emulsionar las microesferas en microrreactores de agua en aceite, donde cada microrreactor de agua en aceite comprende una sola microesfera;

(3) realizar PCR en emulsión para amplificar fragmentos ligados a un adaptador en la superficie de las microesferas

(4) seleccionar/enriquecer las microesferas que contienen fragmentos amplificados ligados a un adaptador; (5) cargar las microesferas en pocillos, cada uno de los cuales comprende una única microesfera; y

(6) generar una señal de pirofosfato.

[0040] En el primer paso (1), los adaptadores que están presentes en los fragmentos de restricción ligados a un adaptador se hibridan con las microesferas. Como se ha descrito anteriormente en el presente documento, el adaptador de secuenciación incluye al menos una región "clave" para el apareamiento con una microesfera, una región de cebador de secuenciación y una región de cebador de ^pC^r . En particular, los fragmentos de restricción ligados a un adaptador amplificados ahora contienen en uno de los extremos la siguiente secuencia 5'-Secuencia del sitio de unión del cebador—Etiqueta—Secuencia del cebador de PCR-3', mientras que en el otro extremo está presente un segmento que puede ser el siguiente: 5'-Secuencia de hibridación con microesferas --- Etiqueta --- Secuencia específica del adaptador --- Secuencia específica del sitio de restricción (opcional) — Secuencia selectiva (aleatoriamente) (opcional) - 3'. Puede estar claro que la secuencia del sitio de unión del cebador y la secuencia de hibridación con microesferas pueden intercambiarse. Esta secuencia de hibridación con microesferas puede usarse ahora para hibridar los fragmentos con la microesfera, para lo cual la microesfera lleva una secuencia de nucleótidos.

[0041] Por tanto, los fragmentos adaptados se hibridan en microesferas, donde cada microesfera se hibrida con un único fragmento adaptado. Al conjunto de fragmentos adaptados se añaden microesferas en exceso para asegurar la hibridación de un solo fragmento adaptado por microesfera para la mayoría de las microesferas (distribución de Poisson).

[0042] En una forma de realización preferida, para aumentar aún más la eficacia del cribado, es beneficioso amplificar el producto de PCR direccionalmente sobre la microesfera para la secuenciación. Esto se puede lograr para realizar la PCR con cebadores de PCR con cola de adaptador, de los cuales una hebra del adaptador en el lado de Msel (u otra enzima de restricción) es complementaria al oligonucleótido acoplado a las microesferas de secuencia.

[0043] En un paso siguiente, las microesferas se emulsionan en microrreactores de agua en aceite, donde cada microrreactor de agua en aceite comprende una sola microesfera. Los reactivos de PCR están presentes en los microrreactores de agua en aceite, lo que permite que tenga lugar una reacción de PCR dentro de los microrreactores. Posteriormente, los microrreactores se rompen y las microesferas que comprenden ADN (microesferas positivas de ADN) se enriquecen.

[0044] En un paso siguiente, las microesferas se cargan en pocilios, donde cada pocilio comprende una sola microesfera. Preferiblemente los pocillos forman parte de una placa PicoTiter™ que permite la secuenciación simultánea de una gran cantidad de fragmentos.

[0045] Después de la adición de microesferas portadoras de enzimas, se determina la secuencia de los fragmentos usando pirosecuenciación. En pasos sucesivos, la placa PicoTiter™ y las microesferas, así como las microesferas con enzimas de esta, se someten a diferentes desoxirribonucleótidos en presencia de reactivos de secuenciación convencionales y, tras la incorporación de un desoxirribonucleótido, se genera una señal luminosa que se registra. La incorporación del nucleótido correcto generará una señal de pirosecuenciación que puede detectarse.

[0046] La propia pirosecuenciación es conocida en la técnica y se describe, entre otros, en www.biotagebio.com; www.pyrosequencing.com/section technology. La tecnología se aplica además en, por ejemplo, las patentes WO 03/004690, WO 03/054142, WO 2004/069849, WO 2004/070005, WO 2004/070007, y WO 2005/003375 (todas a nombre de 454 Life Sciences).

[0047] Después de la secuenciación, las secuencias de los fragmentos que se obtienen directamente del paso de secuenciación se pueden recortar, preferiblemente in silico, para eliminar cualquier secuencia de hibridación con microesferas, cebador de secuenciación, adaptador o información de secuencia relacionada con un cebador.

[0048] Normalmente, la alineación o agrupamiento se realiza en datos de secuencia de los que se ha recortado cualquier secuencia de adaptador/cebador añadida, es decir, utilizando solo los datos de secuencia de los fragmentos que se originan en la muestra de ácido nucleico, junto con la etiqueta de identificación opcional.

[0049] Los métodos de alineación de secuencias para fines de comparación son ampliamente conocidos en la técnica. Varios programas y algoritmos de alineación se describen en: Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-244; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Computer Appl. in the Biosci. 8:155-65; y Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-31, Altschul et al. (1994) Nature Genet. 6:119-29) presentan una consideración detallada de los métodos de alineación de secuencias y los cálculos de homología.

[0050] La herramienta de búsqueda de alineación local básica (BLAST) del NCBI (Altschul y col., 1990) está disponible en varias fuentes, incluido el National Center for Biological Information (NCBI, Bethesda, Md., EE. UU.) y en Internet, para su uso en conexión con los programas de análisis de secuencias blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. Se puede acceder a ella en <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/>. Una descripción de cómo determinar la identidad de secuencia usando este programa está disponible en <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html>. La base de datos comprende preferiblemente secuencias EST, secuencias genómicas de las especies de interés y/o la base de datos de secuencias no redundantes de GenBank o bases de datos de secuencias similares.

[0051] Los métodos de secuenciación de alto rendimiento se pueden utilizar como se describe en Shendure y col. Science, Vol 309, Número 5741, 1728-1732. Ejemplos de estos son la secuenciación microelectroforética, la secuenciación de hibridación/secuenciación por hibridación (SBH), la secuenciación cíclica en moléculas amplificadas, secuenciación cíclica en moléculas individuales, métodos no cíclicos, de una única molécula, en tiempo real, como secuenciación de polimerasa, secuenciación de exonucleasas, secuenciación de nanoporos.

[0052] Dentro de la biblioteca, ahora se puede determinar la presencia de un marcador genético y/o el genotipo de la muestra para un marcador genético.

[0053] El método de la presente invención puede usarse para la identificación y la detección de marcadores AFLP de determinación de genotipo, pero también para la identificación, la detección y el genotipado de marcadores SNP contenidos en bandas constantes.

[0054] Para proporcionar una solución al problema de la variación muestral que afecta a la precisión de la determinación del genotipo de los marcadores genéticos mediante la secuenciación de fragmentos alélicos (marcadores) contenidos en una biblioteca de fragmentos múltiples, los presentes inventores también han descubierto que la detección de marcadores AFLP mediante secuenciación se realiza preferiblemente con suficiente redundancia (profundidad) para muestrear todos los fragmentos amplificados al menos una vez y acompañados de medios estadísticos que abordan el tema de la variación muestral en relación con la precisión de los genotipos en cuestión. Además, al igual que con la puntuación de AFLP, en el contexto de una población segregante, la puntuación simultánea de los individuos progenitores en un experimento ayudará a determinar el umbral estadístico, porque todos los alelos posibles de la muestra se puntuarán en el progenitor 1 o en el progenitor 2. Nótese que se sugiere tomar muestras de los progenitores con mayor redundancia que los individuos de poblaciones segregantes.

[0055] Por lo tanto, en algunas formas de realización, la redundancia de los fragmentos de restricción etiquetados amplificados ligados a un adaptador es de al menos 6, preferiblemente al menos 7, más preferiblemente al menos 8 y, de la manera más preferible, al menos 9. En algunas formas de realización, la secuencia de cada fragmento de restricción ligado a un adaptador se determina al menos 6, preferiblemente al menos 7, más preferiblemente al menos 8 y lo más preferiblemente al menos 9 veces. En algunas formas de realización, la redundancia se selecciona de tal manera que, asumiendo una probabilidad total de 50/50 de identificar el locus correctamente como homocigoto, la probabilidad de identificación correcta del locus sea de más del 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %.

[0056] En determinadas formas de realización, el número de muestras puede variar entre 1 y 100000; esto también depende en gran medida del tamaño del genoma que se vaya a analizar y del número de fragmentos amplificados selectivamente. Normalmente, la capacidad de la tecnología de secuenciación empleada supone el factor más limitante a este respecto.

Breve descripción de los dibujos

[0057]

La figura 1A muestra un fragmento según la presente invención hibridado en una microesfera ("microesfera 454") y la secuencia del cebador usada para la preamplificación de las dos líneas de pimiento. 'Fragmento de ADN' indica el fragmento obtenido después de la digestión con una endonucleasa de restricción; ‘adaptador de gen clave' indica un adaptador que proporciona un sitio de hibridación para los cebadores de oligonucleótidos (fosforilados) utilizados para generar una biblioteca; ‘KRS' indica una secuencia de identificación (etiqueta); 'Adaptador de la SEQ. 454' denota un adaptador de secuenciación, y 'adaptador de PCR 454' denota un adaptador para permitir la amplificación en emulsión del fragmento de ADN. El adaptador de PCR permite el apareamiento con la microesfera y la amplificación y puede contener una T protuberante en el extremo 3'.

La Figura 1B muestra un cebador esquemático utilizado en el paso de reducción de la complejidad. Dicho cebador generalmente comprende una región del sitio de reconocimiento indicada como (2), una región constante que puede incluir una sección de etiqueta indicada como (1) y uno o más nucleótidos selectivos en una región selectiva indicada como (3) en su extremo 3').

La Figura 2 muestra la estimación de la concentración de ADN usando electroforesis en gel de agarosa al 2 %. S1 indica PSP11; S2 denota PI201234. 50, 100, 250 y 500 ng denotan respectivamente 50 ng, 100 ng, 250 ng y 500 ng para estimar las cantidades de ADN de S1 y S2. Las figuras 2C y 2D muestran la determinación de la concentración de ADN mediante espectrofotometría con Nanodrop.

La figura 3 muestra los resultados de las evaluaciones de calidad intermedias del ejemplo 3.

La figura 4 muestra diagramas de flujo de la arquitectura de procesamiento de datos de secuencia, es decir, los pasos tomados desde la generación de los datos de secuenciación hasta la identificación de SNP, SSR e indels putativos, a través de los pasos de eliminación de información de secuencia conocida en recorte y etiquetado que dan como resultado datos de secuencia recortados que se agrupan y ensamblan para producir contigs y singletons (fragmentos que no se pueden ensamblar en un contig) según los cuales se pueden identificar y evaluar los polimorfismos putativos. La Figura 4B profundiza en el proceso de extracción de polimorfismos.

Figura 5: Alineación múltiple "10037_CL989contig2" de secuencias de fragmentos de AFLP de pimiento, que contienen un polimorfismo de nucleótido único putativo (SNP). Nótese que el SNP (indicado por una flecha negra) está definido por un alelo A presente en ambas lecturas de la muestra 1 (PSP11), denotado por la presencia de la etiqueta MS1 en el nombre de las dos lecturas superiores, y un alelo G presente en la muestra 2 (PI201234), denotado por la presencia de la etiqueta MS2 en el nombre de las dos últimas lecturas. Los nombres leídos se muestran a la izquierda. La secuencia de consenso de esta alineación múltiple es (5'- 3'):

TAACACG ACTTT G AACAAACCCAAACT CCCCCAAT CG ATTT CAAACCTAG AACA[A/G]T GTTG GTTT

TG GTG CT AACTT C AACC CC ACTACTGTTTTGCTCT ATTTTT G.

Figura 6: Representación gráfica de la probabilidad de clasificación correcta del genotipo en función del número de lecturas observadas por locus.

Ejemplos

[0058] El método se ejemplifica de la siguiente manera:

1) Las plantillas de AFLP se preparan según un protocolo modificado de Vos y col. que implica un paso de desnaturalización por calor durante 20 min a 80 °C entre los pasos de restricción y ligación. Después de la incubación durante 20 min a 80 °C, la enzima de restricción digerida se enfría a temperatura ambiente y se agrega ADN ligasa. El paso de desnaturalización conduce a la disociación de las cadenas complementarias de los fragmentos de restricción hasta 120 pb, de modo que no se ligarán adaptadores a los extremos. Como resultado, los fragmentos menores de 120 pb no se amplificarán, por lo que se logra la selección del tamaño.

2) Las reacciones de preamplificación, si procede, se realizan como en la técnica de AFLP convencional. 3) El último paso de amplificación (selectiva) se realiza usando cebadores AFLP con etiquetas de identificación únicas para cada muestra de la población/experimento (usando una secuencia de identificación única de 4 pb; KIS). Los KIS se encuentran en el extremo 5' de los cebadores AFLP selectivos. Se usará un nucleótido selectivo adicional en comparación con el número de bases selectivas usadas en la detección convencional de AFLP por electroforesis, por ejemplo 4/+3 para una huella EcoRI/Msel en pimiento (detección en gel 3/+3) y 4/+4 para una huella EcoRI/Msel en maíz (detección en gel 4/+3). El número de nucleótidos selectivos que se aplican debe determinarse empíricamente; puede ser de modo que se pueda aplicar el mismo número de nucleótidos selectivos que se utiliza para la detección en gel. Este número depende además del número de muestras incluidas en el experimento, ya que se supone que el número de trazas de secuencia se fija en 200000 en el estado actual de la tecnología de secuenciación, pero esto puede aumentar y probablemente lo hará. El punto de partida preferido es lograr un muestreo de 10 veces de fragmentos de AFLP por biblioteca de muestras.

4) La colección de muestras preparadas según los pasos 1-4 se somete a secuenciación mediante la tecnología de 454 Life Sciences. Esto significa que los fragmentos de AFLP individuales se clonan en microesferas, se amplifican y secuencian por PCR. Se espera una salida de 200000 secuencias de 100 pb de longitud. Para una colección de 100 muestras, esto equivale a un promedio de 2000 trazos de secuencias/muestra, trazables al n.° de muestra a través de la etiqueta de 5'.

5) Suponiendo la amplificación de 100 fragmentos de AFLP por PC cuando se usa 1 nucleótido selectivo adicional en comparación con el número usado con la detección en gel, de los cuales el 90 por ciento son bandas constantes, los fragmentos de AFLP se muestrean con una redundancia promedio de 20 veces por fragmento. Sin embargo, dado que la secuenciación no es direccional y la mayoría de las bandas son> 200 pb, la redundancia de secuenciación será ligeramente superior a 10 veces para cada extremo de fragmento.

6) Todas las secuencias se agrupan por muestra utilizando la etiqueta KRS. Dado un muestreo de 10 veces superior, esto significa que se esperan 200 trazos de secuencia diferentes por muestra, lo que representa 200 x 100 pb = 20 kb de secuencia/muestra. Cuando el 10 por ciento de estas secuencias se derivan de marcadores AFLP (es decir, se amplifica 1 alelo y el otro está ausente en la reacción de PCR), el 90 por ciento (18 kb) de las secuencias se derivan de bandas constantes.

7) Se puntúan dos tipos de marcadores genéticos: A) Marcadores AFLP: son secuencias que se observan en algunas muestras, pero ausentes en otras.

[0059] La inspección de la frecuencia de las secuencias en la recolección de muestras revelará esta categoría. La puntuación dominante se realiza en función de la observación de la presencia/ausencia de estas secuencias en cada muestra. La puntuación fiable de los marcadores AFLP requiere que se establezca un umbral estadístico con respecto a la frecuencia con la que se observan otras secuencias AFLP en el experimento. Es decir, un marcador AFLP puede puntuarse como presente (dominante) si se observa la secuencia del marcador AFLP en la muestra, pero la fiabilidad de la puntuación ausente depende de la frecuencia (media) de los fragmentos AFLP (constante). Se requieren niveles de umbral estadístico de manera que la puntuación de presencia/ausencia se realice preferiblemente con al menos un 99,5 % de precisión, dependiendo del nivel aceptable necesario para la aplicación específica. Si se analiza una población segregante y sus progenitores, estos marcadores posiblemente también se pueden puntuar de forma codominante definiendo categorías de frecuencia de las secuencias marcadoras. En realidad, esto último puede complicarse por la influencia de la variación de muestreo del marcador AFLP que difiere entre muestras.

B) Polimorfismos (SN) en fragmentos de AFLP constantes.

[0060] Esta es la categoría más interesante (y abundante) de marcadores genéticos. La esencia es que los marcadores SNP contenidos en las secuencias internas de los fragmentos de AFLP constantes se puntúan como marcadores SNP codominantes. De nuevo, esto requiere preferiblemente la aplicación de un nivel de umbral estadístico para determinar con precisión la presencia o ausencia de un alelo. Se espera que sea suficiente una redundancia de secuenciación de 10 veces de la biblioteca de fragmentos, pero se necesita un método de análisis estadístico para determinar la precisión de los genotipos del marcador SNP dependiendo del número de cada secuencia de alelos que se observe. La razón es que, cuando una banda constante contiene un SNP y se observa un alelo, por ejemplo 5 veces mientras (la secuencia que contiene el) otro alelo no se observa, es muy probable que la muestra sea homocigótica para el alelo observado. En consecuencia, cuando se observan ambos alelos, la muestra se puntúa como heterocigótica para el marcador SNP, independientemente de sus frecuencias.

[0061] 8) El resultado será una tabla de genotipado que contiene los genotipos de marcadores AFLP puntuados de forma (co)dominante y SNP puntuados codominantemente, junto con las probabilidades de corrección de los genotipos para todos los marcadores. Alternativamente, se genera un conjunto de datos que contiene genotipos que han superado el nivel de umbral estadístico establecido.

[0062] El enfoque asume 10 veces más de muestreo de fragmentos de AFLP por muestra, produciendo 18 kb de secuencia constante/muestra y 2 kb de secuencias marcadoras de AFLP.

[0063] El número de marcadores genéticos observados depende de la tasa de SNP en el germoplasma investigado. A continuación, se proporcionan estimaciones del número de marcadores genéticos a diferentes tasas de SNP en el germoplasma, al muestrear una secuencia de 20 kb. Se supone que la longitud media de los marcadores/fragmentos AFLP es de 200 pb:

Tabla 1. Números esperados de marcadores genéticos puntuados secuenciando fragmentos AFLP usando tecnología de 454 Life Sciences asumiendo 10 veces más de muestreo, 200000 trazas de secuencia, 90 por ciento de bandas constantes/10 por ciento de marcadores AFLP a varias tasas de SNP.

[0064] Es importante señalar que los números proporcionados en la tabla 1 son promedios, que pueden diferir entre combinaciones de diferentes cebadores. De manera análoga a la tipificación de AFLP convencional, la identificación de las combinaciones de cebadores (PC) superiores puede producir un mayor número de marcadores por PC. Además, los números presentados en la Tabla 1 pueden cambiar dependiendo del nivel requerido de sobremuestreo necesario para alcanzar el nivel de precisión requerido.

[0065] El cálculo de la clasificación correcta del genotipo es el siguiente:

P(corr)=P(aa) P(AA) P(Aa) * [1-0,5*exp(n-1))]

[0066] Donde P(aa) es la fracción de la población con genotipo aa (en el gráfico adjunto, figura 9, establecida en 0,25. P(AA) es la fracción de la población con genotipo ^aA (establecida en 0,25. P(Aa) es la fracción de la población con genotipo Aa (en la figura 6 y la tabla siguiente, establecida en 0,5. n es igual al número de individuos.

Tabla

n P

1 0,5

2 0,75

3 0,875

4 0,9375

5 0,96875

6 0,984375

7 0,992188

8 0,996094

9 0,998047

10 0,999023

Ejemplo 1 PIMIENTO

[0067] Se utilizó ADN de las líneas de pimiento PSP-11 y PI201234 para generar el producto AFLP mediante el uso de cebadores específicos de sitio de reconocimiento AFLP de Keygene. (Estos cebadores AFLP son esencialmente los mismos que los cebadores AFLP convencionales, por ejemplo, descritos en EP 0534858, y generalmente contendrán una región de sitio de reconocimiento, una región constante y uno o más nucleótidos selectivos en una región selectiva.

[0068] De las líneas de pimiento PSP-11 o PI201234 se digirieron 150 ng de ADN con las endonucleasas de restricción EcoRI (5U/reacción) y Msel (2U/reacción) durante 1 hora a 37 °C seguido de inactivación durante 10 minutos a 80 °C. Los fragmentos de restricción obtenidos se ligaron con un adaptador de oligonucleótido sintético bicatenario, uno de cuyos extremos es compatible con uno o ambos extremos de los fragmentos de restricción EcoRI y/o Msel. La mezcla de ligación de restricción se diluyó 10 veces y se preamplificaron 5 microlitros de cada muestra (2) con los cebadores EcoRI 1(A) y Msel 1(C) (grupo I). Después de la amplificación, se comprobó la calidad del producto de preamplificación de las dos muestras de pimiento en un gel de agarosa al 1 %. Los productos de preamplificación se diluyeron 20 veces, seguido de una preamplificación AFLP de KRSEcoRI 1(A) y KRSMsel 2(CA). Las secciones de KRS (identificador) están subrayadas y los nucleótidos selectivos están en negrita en el extremo 3' de la secuencia del cebador SEQ ID 1-4 a continuación. Después de la amplificación, se comprobó la calidad del producto de preamplificación de las dos muestras de pimiento en un gel de agarosa al 1 % y mediante una huella AFLP (4) EcoRI 3(A) y Msel 3(C) (3). Los productos de preamplificación de las dos líneas de pimiento se purificaron por separado en una columna QiagenPCR (5). La concentración de las muestras se midió en un espectrofotómetro NanoDrop® ND-1000. Se mezclaron y secuenciaron un total de 5 microgramos de PSP-11 y 5 microgramos de productos de PCR de PI201234.

Conjunto de cebadores I utilizado para la preamplificación de PSP-11

E01LKRS1 5'-CGTCAGACTGCGTACCAATTCA-3' [SEQ ID 1]

M15KKRS1 5’-TGGTGATGAGTCCTGAGTAACA-3' [SEQ ID 2]

Conjunto de cebadores II utilizado para la preamplificación de PI201234

E01LKRS25'-CAAGAGACTGCGT ACCAATT CA-3' [SEQ ID 3]

M15KKRS25’-AGCCGATGAGTCCTGAGTAACA-3' [SEQ ID 4]

(1) Mezcla de ligación de restricción EcoRI/Msel

Mezcla de restricción (40ul/muestra)

[0069]

ADN 6 jl (± 300 ng)

ECoRI (5U) 0,1 j l

Msel (2U) 0,05 j l

5xRL 8 j l

MQ 25,85 j l

Total 40 |jl

Incubación durante 1h. a 37 °C

Adición de:

Mezcla de ligación (10ul/muestra)

[0070]

10 mM ATP 1 j l

ADN ligasa T4 1 j l

Adaptación ECoRI. (5 pmol/jl) 1 j l

Adaptación MseI (50 pmol/jl) 1 j l

5xRL 2 j l

MQ 4 j l

Total 10 j l

Incubación durante 3 h. a 37 °C

Adaptador EcoRI

[0071]

91 M35/91 M36: * -CTCGT AGACTGCGT ACC 91M35 [SEC ID 5]

± bio CAT CT GACGCAT G GTTAA 91M36 [SEQ ID 6]

Adaptador Msel

[0072]

92A 18/92A 19: 5-GACGAT GAGT CCT GAG-3 : 92A18 [SEC ID 7]

3-TACTCAGGACTCAT-5 92A19 [SEQ ID 8]

(2) Preamplificación

Preamplificación (A/C):

[0073]

Mezcla RL (10x) 5 |jl

ceb. EcoRI E01L (50 ng/ul) 0,6 j l

Msel-pr M02K (50 ng/ul) 0,6 j l

dNTP (25 mM) 0,16 jl

Pol. taq. (5U) 0,08 j l

10XPCR 2,0 j l

MQ 11,56 j l

Total 20 jl/reacción

Perfil térmico de preamplificación

[0074] La preamplificación selectiva se realizó en un volumen de reacción de 50 jl. La PCR se realizó en un PE GeneAmp PCR System 9700 y un perfil de 20 ciclos se inició con un paso de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, seguido de un paso de hibridación de 56 °C durante 60 segundos y un paso de extensión de 72 °C durante 60 segundos.

EcoRI 1 (A)1 E01 L 92R11: 5-AGACTGCGTACCAATTCA-3 [SEQ ID 9]

Msel 1 (C)1 M02k 93E42: 5-GATGAGTCCTGAGTAAC-3 [SEQ ID 10]

Preamplificación A/CA:

[0075]

PA 1/+ 1-mezcla (20x) : 5 j l

ceb. EcoRI : 1,5 j l

ceb. Msel : 1,5 j l

dNTP (25 mM): : 0,4 j l

Pol. taq. (5U) : 0,2 j l

10XPCR : 5 j l

MQ : 36,3 j l

Total : 50 j l

[0076] La preamplificación selectiva se realizó en un volumen de reacción de 50 jl. La PCR se realizó en un PE GeneAmp PCR System 9700 y un perfil de 30 ciclos se inició con un paso de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, seguido de un paso de hibridación de 56 °C durante 60 segundos y un paso de extensión de 72 °C durante 60 segundos.

(3) KRSEcoRI 1 (A) y KRSMsel 2 (CA)2

[0077]

05F212 E01LKRS1 CGTCAGACTGCGTACCAATTCA -3'[SEQ ID 11]

05F213 E01LKRS2 CAAGAGACTGCGTACCAATTCA -3'[SEQ ID 12]

05F214 M15KKRS1 TGGTGATGAGTCCTGAGTAACA -3'[SEQ ID 13]

05F215 M15KKRS2 AGCCGAT GAGT CCT GAGT AACA -3'[SEQ ID 14]

Los nucleótidos selectivos están en negrita y las etiquetas (KRS), subrayadas

Muestra PSP11: E01LKRS1/ M15KKRS1

Muestra PI120234: E01LKRS2/ M15KKRS2

(4) Protocolo AFLP

[0078] La amplificación selectiva se realizó en un volumen de reacción de 20 jl. La PCR se realizó en un PE GeneAmp PCR System 9700. Se inició un perfil de 13 ciclos con un paso de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, seguido de un paso de hibridación de 65 °C durante 30 segundos, con una fase de toma de contacto en la que la temperatura de hibridación se redujo 0,7 °C en cada ciclo y un paso de extensión de 72 °C durante 60 segundos. Este perfil fue seguido por un perfil de 23 ciclos con un paso de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, seguido de un paso de hibridación de 56 °C durante 30 segundos y un paso de extensión de 72 °C durante 60 segundos.

EcoRI 3 (AAC) y Msel 3(CAG)

E3292S02: 5-GACTGCGTACCAATTCAAC-3 [SEQ ID 15]

M4992G23: 5-GAT GAGT CCT GAGTAACAG-3 [SEQ ID 16]

(5) Columna Qiagen

[0079] El producto de AFLP se purificó utilizando el kit de purificación QIAquick PCR (QIAGEN) siguiendo el manual QIAquick® Spin Handbook 07/2002, página 18, y la concentración se midió con un espectrofotómetro NanoDrop® ND-1000. Un total de 5 pg de producto de AFLP 1/+2 PSP-11 y 5 pg de producto de AFLP 1/+2 PI201234 se juntaron y se disolvieron en 23,3 pl de TE. Finalmente, se obtuvo una mezcla con una concentración de 430ng/pl de producto de AFLP 1/+2.

Preparación de bibliotecas de secuencias y secuenciación de alto rendimiento

[0080] Los productos de amplificación mixtos de ambas líneas de pimiento se sometieron a secuenciación de alto rendimiento utilizando la tecnología de secuenciación 454 Life Sciences como se describe en Margulies y col., (Margulies y col., Nature 437, págs. 376-380 y suplementos en línea). Específicamente, los productos de AFLP de la PCR se pulieron primero en los extremos y posteriormente se ligaron a adaptadores para facilitar la amplificación por PCR en emulsión y la posterior secuenciación de fragmentos como lo describen Margulies y col. Las secuencias adaptadoras 454, los cebadores de PCR en emulsión, los cebadores de secuencia y las condiciones de ejecución de la secuencia fueron todos como lo describen Margulies y col. El orden lineal de los elementos funcionales en un fragmento de PCR en emulsión amplificado en microesferas de Sepharose en el proceso de secuenciación 454 fue el siguiente, como se ejemplifica en la figura 1A:

Adaptador de PCR 454- Adaptador de secuencia 454 - Etiqueta 1 del cebador AFLP de 4 pb - Secuencia 1 del cebador AFLP que incluye nucleótido(s) selectivo(s) - Secuencia interna del fragmento de AFLP -Secuencia 2 del cebador AFLP que incluye nucleótido(s) selectivo(s), etiqueta 2 del cebador AFLP de 4 pb -Secuencia del adaptador 454 - Adaptador PCR 454 - Microesfera de Sepharose

454 Life Sciences (Branford, CT; eE. UU:) realizó dos tandas de secuenciación 454 de alto rendimiento. Procesamiento de datos de ejecución de secuencia 454

[0081] Los datos de secuencia resultantes de una ejecución de secuencia 454 se procesaron utilizando una tubería bioinformática (Keygene N.V.). Específicamente, las lecturas de la secuencia 454 sin procesar y realizada la llamada de base se convirtieron en formato FASTA y se inspeccionaron para detectar la presencia de secuencias adaptadoras AFLP marcadas utilizando un algoritmo BLAST. Cuando se obtuvieron coincidencias de alta confianza con las secuencias de cebadores AFLP etiquetados conocidos, se recortaron las secuencias, se restauraron los sitios de endonucleasas de restricción y se asignaron las etiquetas apropiadas (muestra 1 EcoRI (ES1), muestra 1 Msel (MS1), muestra 2 EcoRI (ES2) o muestra 2 Msel (MS2), respectivamente). A continuación, todas las secuencias recortadas de más de 33 bases se agruparon mediante un procedimiento megaBLAST basado en las homologías generales de las secuencias. A continuación, los agrupamientos (clusters) se ensamblaron en uno o más contigs y/o singletons por agrupamiento, utilizando un algoritmo de alineación múltiple CAP3. Los contigs que contenían más de una secuencia se inspeccionaron en busca de los desajustes de secuencia, que representaban polimorfismos putativos. A los desajustes de secuencia se les asignaron puntuaciones de calidad basadas en los siguientes criterios:

* el número de lecturas en un contig

* la distribución alélica observada

[0082] Los dos criterios anteriores constituyen la base de la llamada puntuación Q asignada a cada SNP/indel putativo. Las puntuaciones Q van de 0 a 1; una puntuación Q de 0,3 sólo puede alcanzarse en caso de que ambos alelos se observen al menos dos veces.

* localización en homopolímeros de cierta longitud (ajustable; configuración por defecto para evitar polimorfismos localizados en homopolímeros de 3 bases o más).

* número de contigs en el agrupamiento.

* la distancia a los desajustes de la secuencia adyacente más cercanos (ajustable; importante para ciertos tipos de ensayos de genotipado que sondean secuencias de flanqueo)

* el nivel de asociación de los alelos observados con la muestra 1 o la muestra 2; en caso de una asociación consistente y perfecta entre los alelos de un polimorfismo putativo y las muestras 1 y 2, el polimorfismo (SNP) se indica como un polimorfismo putativo (SNP) de "élite". Se considera que un polimorfismo de élite tiene una alta probabilidad de estar localizado en una secuencia genómica única o con pocas copias en caso de que se hayan utilizado dos líneas homocigóticas en el proceso de descubrimiento. Por el contrario, una débil asociación de un polimorfismo con el origen de la muestra conlleva un alto riesgo de haber descubierto falsos polimorfismos derivados de la alineación de secuencias no alélicas en un contig.

[0083] Las secuencias que contenían motivos SSR se identificaron utilizando la herramienta de búsqueda MISA (herramienta de identificación MIcroSAtellelite; disponible en http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)

[0084] Las estadísticas generales de la tanda se muestran en la tabla siguiente.

Tabla. Estadísticas generales de una secuencia 454 para el descubrimiento de SNP en pimiento.

[0085] En la Figura 5 se muestra un ejemplo de una alineación múltiple que contiene un polimorfismo de nucleótido único putativo de élite.

Ejemplo 2: Maíz

[0086] Se utilizó ADN de las líneas de maíz B73 y M017 para generar el producto AFLP mediante el uso de cebadores AFLP específicos de sitio de reconocimiento de Keygene. (Estos cebadores AFLP son esencialmente los mismos que los cebadores AFLP convencionales, por ejemplo los descritos en el documento EP 0534858, y generalmente contendrán una región de sitio de reconocimiento, una región constante y uno o más nucleótidos selectivos en su extremo 3').

[0087] El ADN de las líneas de pimiento B73 o M017 se digirió con las endonucleasas de restricción Taql (5U/reacción) durante 1 hora a 65 °C y MseI (2U/reacción) durante 1 hora a 37 °C, seguido de una inactivación durante 10 minutos a 80 °C. Los fragmentos de restricción obtenidos se ligaron con un adaptador de oligonucleótido sintético de doble cadena, uno de cuyos extremos es compatible con uno o ambos extremos de los fragmentos de restricción TaqI y/o Msel.

[0088] Las reacciones de preamplificación de AFLP (20pl/reacción) con cebadores AFLP 1/+1 se realizaron en una mezcla de restricción-ligación diluida 10 veces. Perfil PCR: 20*(30 s a 94 °C 60 s a 56 °C 120 s a 72°C). Se llevaron a cabo reacciones adicionales de AFLP (50pl/reacción) con diferentes cebadores AFLP específicos de sitio de reconocimiento de Keygene 2 TaqI y (Tabla siguiente, las etiquetas están en negrita, los nucleótidos selectivos están subrayados) sobre el producto de preamplificación AFLP 1/+1 Taql/Msel diluido 20 veces. Perfil de PCR: 30*(30 s a 94 °C 60 s a 56 °C 120 s a 72 °C). El producto AFLP se purificó utilizando el kit de purificación de PCR QIAquick (QIAGEN) siguiendo el manual QIAquick® Spin Handbook 07/2002, página 18, y la concentración se midió con un espectrofotómetro NanoDrop® nD-1000. Se juntaron 1,25 pg de cada producto AFLP B73 2/+2 y 1,25 pg de cada producto AFLP M017 2/+2 y se disolvieron en 30 pl de TE. Finalmente se obtuvo una mezcla con una concentración de 333 ng/pl de producto AFLP 2/+2.

Tabla

[0089] Finalmente, las 4 muestras P1 y las 4 muestras P2 se combinaron y concentraron. Se obtuvo una cantidad total de 25 j l de producto de ADN y una concentración final de 400 ng/ul (total de 10 jg). Las evaluaciones de calidad intermedias se muestran en la Figura 3.

SECUENCIACIÓN POR 454

[0090] Se procesaron muestras de fragmentos de AFLP de pimiento y maíz, preparadas como se describe anteriormente en el presente documento, por 454 Life Sciences como se describe en Margulies y col., 2005. Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature 437 (7057):376-80. Epub 31 de julio de 2005).

PROCESAMIENTO DE DATOS

Canal de procesamiento:

Datos de entrada

[0091] Se recibieron datos de secuencia sin procesar para cada ejecución:

- 200000 - 400000 lecturas

- puntuaciones de calidad de llamada de bases

Recorte y etiquetado

[0092] Estos datos de secuencia se analizan para detectar la presencia de sitios de reconocimiento de Keygene (Keygene Recognition Sites o KRS) al principio y al final de la lectura. Estas secuencias de KRS consisten en un adaptador de AFLP y una secuencia de etiqueta de muestra y son específicas para una determinada combinación de cebador de AFLP en una determinada muestra. Las secuencias de KRS se identifican mediante BLAST y se recortan y se restauran los sitios de restricción. Las lecturas están marcadas con una etiqueta para identificar el origen de KRS. Las secuencias recortadas se seleccionan en longitud (mínimo de 33 nt) para participar en el procesamiento posterior.

Agrupamiento y ensamblaje

[0093] Se realiza un análisis con MegaBlast de todas las lecturas seleccionadas por tamaño y recortadas para obtener grupos de secuencias homólogas. Consecutivamente, todos los agrupamientos se ensamblan con CAP3 para obtener contigs ensamblados. En ambos pasos se identifican lecturas de secuencias únicas que no coinciden con ninguna otra lectura. Estas lecturas se marcan como singletons.

[0094] En la Figura 4A se muestra el proceso que lleva a cabo los pasos descritos anteriormente Extracción de polimorfismos y evaluación de la calidad

[0095] Los contigs resultantes del análisis de ensamblaje forman la base de la detección de polimorfismos. Cada "desajuste" en el alineamiento de cada conglomerado es un polimorfismo potencial. Se definen criterios de selección para obtener una puntuación de calidad:

- número de lecturas por contig

- frecuencia de "alelos" por muestra

- presencia de una secuencia homopolimérica

- presencia de polimorfismos vecinos

[0096] Los SNP y los indels con una puntuación de calidad superior al umbral se identifican como polimorfismos putativos. Para la extracción de SSR se utiliza la herramienta MISA (MIcroSAtellite identification) (http://pgrc.ipkgatersleben.de/misa). Esta herramienta identifica di-, tri-, tetranucleótidos y motivos SSR compuestos con criterios predefinidos y resume las ocurrencias de estos SSR.

[0097] El proceso de asignación de calidad y minería de polimorfismo se muestra en la Figura 4B RESULTADOS

[0098] En la siguiente tabla se resumen los resultados del análisis combinado de secuencias obtenidas de 2454 tandas de secuencias para las muestras de pimiento combinadas y 2 tandas para las muestras de maíz combinadas.

* ambas con selección frente a SNP vecinos, secuencia flanqueante de al menos 12 pb y que no aparecen en secuencias de homopolímeros mayores de 3 nucleótidos.

Ejemplo 3. Validación de SNP mediante amplificación por PCR y secuenciación de Sanger

[0099] Con el fin de validar el supuesto SNP A/G identificado en el ejemplo 1, se diseñó un ensayo de sitio marcado con secuencia (STS) para este SNP utilizando cebadores de PCR flanqueantes. Las secuencias del cebador de PCR fueron las siguientes:

Cebador_1.2f: 5'- AAACCCAAACTCCCCCAATC-3', [SEQ ID 33] y

Cebador_1.2r: 5'- AGCGGAT AACAATTT CACACAGGACAT CAGT AGT CACACTGGT A CAAAAATAGAGCAAAACAGTAGTG -3'[SEQ ID 34]

[0100] Obsérvese que el cebador 1.2r contenía un sitio de unión del cebador de secuencia M13 y un relleno de longitud en su extremo 5'. La amplificación por PCR se llevó a cabo utilizando como plantilla los productos de amplificación AFLP A/+CA de PSP11 y PI210234 preparados como se describe en el ejemplo 4. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: Para 1 reacción de PCR se mezclaron los siguientes componentes:

5 |_il de mezcla AFLP diluida 1/10 (aprox. 10 ng/pl)

5 |_il 1 pmol/pl de cebador 1.2f (diluido directamente a partir de una solución madre de 500 pM)

5 pl 1 pmol/pl de cebador 1.2r (diluido directamente a partir de una solución madre de 500 pM)

5 pl de mezcla de PCR - 2 pl de tampón de PCR 10 x

- 1 pl de dNTP 5 mM

- 1,5 pl de MgCl 25 mM²

- 0,5 pl de H² O

5 pl de mezcla de - 0,5 pl de tampón de PCR 10 x (Applied Biosystems)

enzimas - 0,1 |_il 5U/|_il de ADN polimerasa AmpliTaq (Applied Biosystems)

- 4,4 pl de H² O

[0101] Se utilizó el siguiente perfil de PCR:

Ciclo 1 2'; 94 °C

Ciclo 2-34 20"; 94 °C

30"; 56 °C

2'30"; 72 °C

Ciclo 35 7'; 72 °C

^ ; 4 °C

[0102] Los productos de la PCR se clonaron en el vector pCR2.1 (kit de clonación TA Cloning kit; Invitrogen) utilizando el método de clonación TA y se transformaron en células de E. coli competentes INVaF'. Las transformantes se sometieron a un cribado azul/blanco. Se seleccionaron tres transformantes blancas independientes para PSP11 y PI-201234 y se cultivaron durante la noche en medio selectivo líquido para el aislamiento de plásmidos.

[0103] Los plásmidos se aislaron utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN). Posteriormente, los insertos de estos plásmidos se secuenciaron según el protocolo siguiente y se resolvieron en el MegaBACE 1000 (Amersham). Las secuencias obtenidas se inspeccionaron en cuanto a la presencia del alelo SNP. Dos plásmidos independientes que contenían el inserto PI-201234 y un plásmido que contenía el inserto PSP11 contenían la secuencia consenso esperada que flanqueaba el SNP. La secuencia derivada del fragmento PSP11 contenía el alelo A esperado (subrayado) y la secuencia derivada del fragmento PI-201234 contenía el alelo G esperado (doble subrayado):

PSP11 (secuencia 1): (5-3')

AAACCC AAACT CCCCC AATCG ATTT CAAACCT AG AACAATGTT GGTTTTGGTG CTAACTTC AACCCCACTACTGTTTTGCTCTATTTTTGT [SEQ ID 35]

PI-201234 (secuencia 1): (5'-3') AAACCCAAACTCCCCCAATCGATTTCAAACCTAGAACAGTGTTGGTTTTGGTGCTAACTTC AACCCCACTACTGTTTTGCTCTATTTTTG [SEQ ID 36]

PI-201234 (secuencia 2): (5'-3') AAACCCAAACTCCCCCAATCGATTTCAAACCTAGAACAGTGTTGGTTTTGGTGCTAACTTC AACCCCACT ACT GTTTT G CTCT ATTTTT G [SEQ ID 37]

[0104] Este resultado indica que el SNP A/G putativo del pimiento representa un verdadero polimorfismo genético detectable mediante el ensayo STS diseñado.

REFERENCIAS

[0105]

1. Zabeau,M. and Vos,P. (1993) Selective restriction fragment amplification; a general method for DNA fingerprinting. EP 0534858-A1, B1, B2; US patent 6045994.

2. Vos,P., Hogers,R., Bleeker,M., Reijans,M., van de Lee,T., Hornes,M., Frijters,A., Pot,J., Peleman,J., Kuiper,M. et al. (1995) AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucl. Acids Res., 21,4407-4414.

3. M. van der Meulen, J. Buntjer, M. J. T. van Eijk, P. Vos, and R. van Schaik. (2002). Highly automated AFLP^ fingerprint analysis on the MegaBACE capillary sequencer. Plant, Animal and Microbial Genome X, San Diego, CA, January 12-16, P228, pp. 135.

4. Margulies et al., 2005. Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactions. Nature advanced online publication 03959, August 1.

5. R.W. Michelmore, I. Paran, and R.V. Kesseli. (1991). Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations. Proc. Natl. Acad. Sci EE. UU. 88(21):9828-32.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Método de alto rendimiento para el descubrimiento, la detección y el genotipado de un marcador genético en al menos una muestra, que comprende los pasos de:

(a) proporcionar ADN de la al menos una muestra;

(b) restringir el ADN con al menos una endonucleasa de restricción para producir fragmentos de restricción;

(c) ligar adaptadores a los fragmentos de restricción para producir fragmentos de restricción ligados a un adaptador;

(d) amplificar los fragmentos de restricción ligados a un adaptador con un par de cebadores, en el que al menos uno de los cebadores es complementario a al menos parte del adaptador para producir una biblioteca de fragmentos de restricción ligados a un adaptador amplificados;

(e) someter la biblioteca a una secuenciación de alto rendimiento;

(f) alinear las secuencias de los fragmentos de restricción ligados a un adaptador amplificados, en donde las secuencias que están alineadas se han secuenciado al menos 6 veces;

(g) identificar el marcador genético comparando las secuencias alineadas; y

(h) determinar el genotipo del marcador genético en las secuencias.

2. Método según la reivindicación 1, en el que al menos uno de los cebadores del paso (d) contiene una etiqueta de identificación 5', preferiblemente en el extremo 5' del cebador.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, en el que al menos un adaptador comprende una secuencia de identificación única.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ADN de múltiples muestras se proporciona en el paso a) y en el que el marcador genético se determina en múltiples muestras.

5. Método según la reivindicación 4, en el que las bibliotecas derivadas de múltiples muestras se agrupan después de d) y antes del paso e).

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el marcador genético es un marcador de polimorfismo de longitud de fragmento amplificado o un marcador de polimorfismo de un único nucleótido.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la secuenciación de alto rendimiento es un método en tiempo real, preferiblemente al menos uno de entre secuenciación con polimerasa, secuenciación con exonucleasa y secuenciación con nanoporos.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la secuenciación de alto rendimiento comprende los pasos de:

- hibridar los fragmentos ligados con el adaptador a microesferas, donde cada microesfera se híbrida con un solo fragmento;

- emulsionar las microesferas en microrreactores de agua en aceite, donde cada microrreactor de agua en aceite comprende una sola microesfera;

- realizar una PCR en emulsión para amplificar los fragmentos ligados a un adaptador en la superficie de las microesferas;

- seleccionar o enriquecer las microesferas que contienen los fragmentos ligados a un adaptador amplificados;

- cargar las microesferas en pocillos, cada uno de los cuales comprende una única microesfera; y - generar una señal de pirofosfato.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el ADN proviene de una fuente seleccionada del grupo que consiste en ADN genómico, ARN, ADNc, cromosoma artificial bacteriano y cromosoma artificial de levadura.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que se detecta un genotipo dominante o codominante del marcador genético.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la genotipificación se usa para el descubrimiento de marcadores vinculados a rasgos o fenotipos y/o para el diagnóstico genotípico.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que las secuencias alineadas se comparan dentro de una biblioteca y/o entre las bibliotecas.

13. Método según la reivindicación 12, en el que las secuencias alineadas se normalizan entre muestras.