JP2013514079A - 制限酵素に基づく全ゲノムシーケンシング - Google Patents
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Abstract
【選択図】図4
Description
本願明細書で使用する場合、「ペアエンドシーケンシング」は、高スループットシーケンシングに基づく、特に、IlluminaおよびRocheによって現在販売されているプラットフォームに基づく方法である。Illuminaは、鋳型の両末端のシーケンシングを可能にし、これによりペアエンドリードを生成するアップグレードとして、既存のシーケンサーにインストールすることができるハードウェアモジュール(PE Module)をリリースした。本発明に係る方法においては、特にSolexa技術を使用するペアエンドシーケンシングを使用することが、特に好ましい。ペアエンドシーケンシングの例は、例えば米国特許出願公開大20060292611号明細書に、およびRocheからの刊行物(454シーケンシング)に記載されている。
(a)タグ化された、アダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片のエンドシーケンシングに基づいてクローンバンクの(配列に基づく)物理地図を準備することであって、当該制限酵素切断断片は、少なくとも1つの制限酵素を使用して生成されたものである、ことと、
(b)次の工程を含むサブメソッドを準備することと、
(i)このDNA試料のアダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片を準備すること、
(ii)任意に、このアダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片を断片化すること、
(iii)任意に、アダプターを工程(ii)の断片にライゲーションすること、および
(iv)工程(iii)の断片の配列の少なくとも一部分を決定すること、
(c)工程(b)で得られる配列情報を工程(a)の物理地図と組み合わせることと、
(d)ドラフトゲノム配列を生成することと
を含み、工程(b)(i)における制限酵素切断断片は、工程(a)の物理地図の生成で使用される少なくとも1つの制限酵素の認識配列の少なくとも一部分と同一である認識配列を含有する少なくとも1つの制限酵素を用いて生成される。
(a)人工染色体(例えばBAC、YAC)クローンバンクを準備する工程であって、各人工染色体クローンは、試料ゲノム由来のDNAを含有する、工程と、
(b)この人工染色体ライブラリー由来のクローンをプールへとプールする工程と、
(c)制限酵素を使用して、各プールについての断片の組を準備する工程と、
(d)アダプターをこの断片にライゲーションする工程と、
(e)このアダプターの少なくとも一部分および当該断片の一部分の配列を決定する工程と、
(f)この断片を対応するクローンに割り当てる工程と、
(g)このクローンをクローン−コンティグへと順序付け、これにより当該試料ゲノムの物理地図を生成する工程と
を含む。
従って、本発明の方法の第1の変法では、物理地図は、断片配列と一緒に(同時に、並行して、またはその後に)決定される。
(a)複数のクローンを含むクローンバンクを準備する工程であって、各クローンは、試料ゲノム(もしくは試料ゲノムの一部分)由来のDNAを含有する工程と、
(b)このクローンを当該クローンバンクからプールへとプールする工程と、
(c)少なくとも1つの制限酵素を使用して各プールについての断片を準備する工程と、
(d)第1のアダプターを当該断片にライゲーションする工程と、
(e)断片化された、アダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片を与え、および、任意に、ランダムな断片末端をポリッシングするために、工程(d)のアダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片を断片化する工程と、
(f)第1および第2のアダプターを含有する、アダプターとライゲーションされた断片化された制限酵素切断断片を与えるために第2のアダプターを(ポリッシングされた)断片化された制限酵素切断断片にライゲーションする工程と、
(g)任意に、第1のプライマーおよび第2のプライマーを用いて工程(f)のアダプターとライゲーションされた断片化された制限酵素切断断片を増幅する工程であって、これにより増幅産物を生成する工程と、
(i)第1のアダプターの少なくとも一部分および/もしくは第1のアダプターに隣接した断片の一部分の配列ならびに/または第2のアダプターの少なくとも一部分および/もしくは第2のアダプターに隣接した断片の一部分の配列を決定する工程と、
(j)このシーケンシングされた、第1のアダプターの一部分および/もしくは第1のアダプターに隣接した断片の一部分ならびに/または第2のアダプターの一部分および/もしくは第2のアダプターに隣接した断片の一部分に基づいて、当該断片を対応するクローンに割り当てる工程と、
(k)このクローンをクローン−コンティグへと順序付けし、これにより当該試料ゲノムの物理地図を生成する工程と、
(l)第2のアダプターの少なくとも一部分および/もしくは第2のアダプターに隣接した断片の一部分の断片配列を対応するクローンに割り当てる工程と、
(m)工程(h)の断片配列を上記物理地図へアンカリングする工程と、
(n)ドラフトゲノム配列を生成する工程と
を含む。
本発明の方法のさらなる実施形態では、本発明の方法の工程(b)のサブメソッドは、以下の工程を含む:
(a)制限酵素切断断片を得るための、少なくとも1つの制限エンドヌクレアーゼを用いた標的DNA(ゲノムDNAまたは人工染色体DNA)の断片化、
(b)第1のアダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片を得るための、当該制限酵素切断断片の末端への第1のアダプターのライゲーション、
(c)ランダムに断片化された第1のアダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片を得るための、第1のアダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片のランダムな断片化、
(d)任意に、アダプターを含有する断片化された、アダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片の選択、
(e)第1のアダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片の断片化された末端への、第2のアダプターのライゲーション、
(f)任意に、(親和性標識された)増幅された断片を得るための、工程(b)のアダプターに向けられたプライマーおよび工程(e)の第2のアダプターに向けられた(親和性標識された)プライマーを使用する増幅、
(g)任意に、第2のアダプターの存在に基づく、工程(f)で得られるこの(親和性標識された)増幅された断片の選択、
(h)第1のアダプターの少なくとも一部分の配列および/もしくは第1のアダプターに隣接した断片の配列の一部分ならびに/または第2のアダプターの少なくとも一部分の配列および/もしくは第2のアダプターに隣接した断片の配列の一部分の決定。
(a)制限酵素切断断片を得るための、少なくとも1つの制限エンドヌクレアーゼを用いた標的DNA(ゲノムDNAまたは人工染色体DNA)の断片化、
(b)第1のアダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片を得るための、当該制限酵素切断断片の末端への第1のアダプターのライゲーション、
(c)ランダムに断片化された第1のアダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片を得るための、第1のアダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片のランダムな断片化、
(d)任意に、アダプターを含有する断片化された、アダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片の選択、
(e)第1のアダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片の断片化された末端への、第2のアダプターのライゲーション、
(f)任意に、(親和性標識された)増幅された断片を得るための、工程(b)のアダプターに向けられたプライマーおよび工程(e)の第2のアダプターに向けられた(親和性標識された)プライマーを使用する増幅、
(g)任意に、第2のアダプターの存在に基づく、工程(f)で得られる(親和性標識された)増幅された断片の選択、
(h)第1のアダプターの少なくとも一部分の配列および/もしくは第1のアダプターに隣接した断片の配列の一部分ならびに/または第2のアダプターの少なくとも一部分の配列および/もしくは第2のアダプターに隣接した断片の配列の一部分の決定。
本発明の方法のさらなる実施形態では、本発明の方法の工程(b)のサブメソッドは、以下の工程を含む:
(a)制限酵素切断断片を得るための、標的DNAの制限酵素消化、
(b)IIs−アダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片を与えるための、タイプIIs制限エンドヌクレアーゼについての認識配列を含有するIIs−アダプターのライゲーション、
(c)断片化されたIIs−アダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片を得るための、当該IIs−アダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片の断片化、
(d)環状化産物を得るための、当該断片化されたIIs−アダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片の環状化、
(e)タイプIIsで消化された断片を与えるための、環状化産物のタイプIIs制限酵素消化、
(f)アダプターとライゲーションされたタイプIIsで消化された断片を与えるための、タイプIIsで消化された断片への第1のアダプターのライゲーション、
(g)第1のアダプターとライゲーションされたタイプIIsで消化された断片の断片化、
(h)第1および第2のアダプターとライゲーションされたタイプIIsで消化された断片を与えるための、第1のアダプターとライゲーションされたタイプIIsで消化された断片への第2のアダプターのライゲーション、
(i)これらの断片および/またはアダプターの少なくとも一部分の配列を決定すること。
(a)制限酵素切断断片を得るための、標的DNAの制限酵素消化、
(b)IIs−アダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片を与えるための、タイプIIs制限エンドヌクレアーゼについての認識配列を含有するIIs−アダプターのライゲーション、
(c)断片化されたIIs−アダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片を得るための、IIs−アダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片の断片化、
(d)環状化産物を得るための、当該断片化されたIIs−アダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片の環状化、
(e)タイプIIsで消化された断片を与えるための、環状化産物のタイプIIs制限酵素消化、
(f)アダプターとライゲーションされたタイプIIsで消化された断片を与えるための、当該タイプIIsで消化された断片への第1のアダプターのライゲーション、
(g)第1のアダプターとライゲーションされたタイプIIsで消化された断片の断片化、
(h)第1および第2のアダプターとライゲーションされたタイプIIsで消化された断片を与えるための、第1のアダプターとライゲーションされたタイプIIsで消化された断片への第2のアダプターのライゲーション、
(i)これらの断片および/またはアダプターの少なくとも一部分の配列を決定すること。
酵素部位にリンクされるGAペアエンドリードのアセンブリを通した、BACプールに対する成功裏のWGPSを実証するために、メロンBACライブラリー スーパープール24をスーパープール24のWGPデータと一緒に準備した。
このアプローチは以下の工程を含む:
− 単独の酵素(EcoRI)を使用する(個々の)BACプールDNAの消化。
− P5増幅、配列プライマー1およびプール特異的な識別子配列を含有するプール特異的なEcoRI適合性のアダプターのライゲーション。
− (例えばIllumina Genome Analyzerの1つのレーンでシーケンシングされることになるスーパープール由来のRL産物の任意のプーリング。これは、それまでのライゲーション工程で使用される異なるプール特異的な識別子の最大値次第である)
− アダプターとライゲーションされた産物の、100〜1000bpのサイズ範囲を有する産物への断片化。
断片化された、アダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片を末端ポリッシングし、1つのA−ntを、断片化された末端に付加する。
− 小さすぎる断片を取り除くために、1:1.8の試料:ビーズ比を用いて、Ampure精製を実施する。これにより、100nt未満の断片が除去されることになろう。
− P7増幅および配列プライマー2配列を含有する3’−Tオーバーハングを含有するアダプターをライゲーションする。
− あらゆる残りのアダプターを除去するために、1:1.3の試料:ビーズ比を使用してAmpure精製を実施する。
− 部分的に一本鎖のアダプターを埋め込む(filling)ことによって、完全に二本鎖の断片を生成するために、埋め込み(fill−in)反応を実施する。あるいは、P5およびP7プライマーを使用する増幅を実施することができる。
− Qiagen PCR精製カラムを使用して最終の試料を精製する。
− Nanodropを使用して濃度を測定し、Agilent BioAnalyzerによる分析を通して断片のサイズ分布を決定する。
− Illumina GenomeAnalyzer IIを使用して、ペアエンド36ntシーケンシングプロトコルを使用して、生成したライブラリーをシーケンシングする。
− 得られたシーケンシングデータを、標準的なIllumina Softwareパイプライン v1.6を使用して、処理する。
− 処理した配列データをエクスポートし、WGPパイプラインについておよびペアエンドリードのアセンブリについてのインプットとして使用する。
2.1 物理地図生成のためのデコンボリューション
データの処理後、プールの中の1タグあたりの平均リード数は約450であった。これは、通常のWGPにおける値よりもおよそ7倍高かった。この大きいデータセットを使用して、標準的なWGPパイプラインを使用して9039個のタグをデコンボリューションすることができた。通例のWGPデータセットでは、使用したBACプールの中で13571個のタグがデコンボリューションされた。上記9039個のデコンボリューションされたタグのうちのおよそ71%は、通例のWGPデータセットの中にも存在した。より低いデコンボリューションは、きわめて大規模なシーケンシングおよびより低い品質のシーケンシングランに割り当てられる。両方とも、エラーを含み(これは、複数の座標を得るタグの数を上昇させる)、それゆえデコンボリューションされないリードの数を増加させる。デコンボリューションされたタグは、2.2 工程5で生成されて選択されるコンティグを配置するために使用されるであろうWGP地図を生成するために、使用されることになる。
このアプローチは6工程を含む。
単独のBACを特定するために、工程2.2で生成した配列データから、9039個のタグをデコンボリューションした。これらのタグのうちで、71%は、使用したプールについてのもとのWGPタグリストでも見出された。工程2.2で生成されたすべてのリードは、それらの第1のリードに基づいてビニングし、そのあとに、各ビン(bin)に対して個別にアセンブリを実施した。Phrapソフトウェアを用いると、アセンブリは合計15938個のコンティグを生じ、そのうちで14905個(=94%)が予想される制限酵素部位で始まっていた。生成したこれらのコンティグの平均長さは約545ntであった。アセンブリングされたコンティグの品質をチェックするために、サブセットを、ランダムシーケンシングアプローチを使用して生成したメロンゲノム配列に対してBLAST解析にかけた。BLAST解析の結果を図8に示す。この図は、生成したWGPSコンティグ(760nt)がゲノム配列コンティグと100%マッチするということを示す。このマッチは、高有意性を有する唯一のヒットであった。
酵素結合の配列情報をメロンのWGP地図にリンクすることを通した、メロンのゲノムDNAに対するSDSESを実証するために、メロンBACライブラリー スーパープール24をスーパープール24のWGPデータと一緒に準備した。
このアプローチは以下の工程を含む:
1− 葉緑体およびミトコンドリアから得られる配列データの量を減らすために、核DNAを単離する。これは、任意の工程であるが、使用できるアウトプットを増やすことになろう。
2− 単独の酵素(EcoRI)を使用するメロンゲノムDNAの消化。この酵素は、WGP地図の生成で使用した酵素と同じ酵素であることが好ましい。異なる酵素が使用されることになる場合、その異なる酵素は、WGPで使用した酵素と同じヌクレオチド(GAATTC)を認識するべきである(これが好ましい)。
3− 増幅および配列プライマーを含有する酵素(EcoRI)適合性のアダプターのライゲーション。
4− 少なくとも400bp、最大で1000bpのサイズ範囲を有する産物への、アダプターとライゲーションされた産物の断片化。低いほうの断片長さは変わる可能性があるが、少なくとも、得ることができるシーケンシングリード長よりも高くあるべきである。断片化は、ネブライゼーションまたは超音波処理(Covaris)を使用して実施することができる。
5− 精製した断片のサイズ分布および濃度を、高感度DNAチップ(サイズ分布)およびnanodrop測定(濃度)を使用するAgilent Bioanalyzerでの解析を通して決定する。
6− GS−FLXシーケンシングについてライブラリー調製プロトコルで使用したAMpure手順を使用して、サイズ選択を使用して小さい断片(<400nt)を取り除く。サイズ選択後、nanodropで試料の濃度を測定する。
7− 精製した断片を末端ポリッシングする。
8− ストレプトアビジンをコーティングした磁気ビーズ上に断片を捕捉することを通して、ポリッシングした産物を(任意に)精製する。これは、使用するライゲーションしたEcoRIアダプターが5’−ビオチン修飾を含有するとき、可能である。
9− 繋合を防止するために、1つのAを、断片のポリッシングされたランダム末端に付加する。
10− 増幅および配列プライマー2配列を含有するT字型のアダプターをライゲーションする。
11− 増幅を実施して、完全に二本鎖の断片、および増幅された試料(これは、1本のDNA鎖の5’末端にビオチン修飾を含有する)を生成する。
12− 上記のプロトコルを使用して、増幅産物を、ストレプトアビジンをコーティングした磁気ビーズ(Dynal)に結合する。
13− 断片の標識していない鎖をビーズから溶出し、(次世代の)シーケンシング技術を使用するシーケンシングのために使用する。
上記で調製した試料を、Roche GS−FLX titaniumシーケンサーを使用してシーケンシングする。General Sequencing Signal処理ツールを使用して、粗配列データを処理する。これは、クオリティおよびライブラリー調製で使用したアダプター配列の存在に関して配列のリードをトリミングするであろう。フィルタリング後、380bpの平均リード長を有する930,618個のリードが残った。これは、354Mbpの配列情報に相当する。Fasta(fna)および対応するクオリティ(.qual)ファイルを、粗配列ファイル(.sff)から抽出する。このfasta、クオリティおよび粗配列のファイルを、後述するバイオインフォーマティクス処理工程を使用して処理する。
− (修飾された)制限酵素認識部位で始まらないすべてのリードの除去。この実施例では、EcoRIを使用する。これは、CAATTCで始まらないリードが取り除かれるということを意味する。代替の酵素を使用する場合、フィルタリングは、異なる認識部位を使用して実施する必要があるだろう。
− シーケンシングライブラリーの調製について使用した酵素についての内部認識部位を含有するすべてのリードを取り除く。これらのリードはキメラであってもよい。この実施例では、内部GAATTCを含有するすべてのリードが取り除かれる。
− 残りのリードでは、修飾された制限酵素(EcoRI)部位(CAATTC)が回復される。この回復(または、調整されたトリミングポイントが調整される)は、生成したコンティグとWGSおよび/またはWGPデータとの統合を容易にするであろう。
− アセンブリングされたコンティグを、シーケンシングライブラリー調製において使用した酵素、すなわちこの実施例ではEcoRIについての内部制限酵素部位の存在についてスクリーニングする。内部部位を有するコンティグは、それらの内部配列に基づいた、そして配列のリードの出発点にある制限酵素部位に隣接している配列には基づかない、アセンブリングされた可能性があるリードである。
内部制限酵素部位を有しないコンティグを、アセンブリングされていないリードとともに、新しいfastaファイルへと合わせる。
平均コンティグ長さは約500bpである。
表7は、SDSES配列の組全体をメロンのフィルタリングされたWGPタグリストにリンクすることの結果を提示する。全SDSESデータセットは、上記の再アセンブリングを通して得られたコンティグコンティグ(contigcontigs)およびシングレットコンティグ(singletcontigs)ならびに第1の配列アセンブリラウンドの後に残るシングルトンリードを含む。一般に、フィルタリングされたメロンWGPタグのうちの約80%を、少なくとも1つのSDSES配列(コンティグまたはシングルトン)にリンクすることができると結論することができる。シングルトンにおいては、多くの「タグ」が高頻度で発生しているということをも認められる。認められた最高値は1193である。これらが葉緑体/ミトコンドリアに起因するのかまたは反復配列に起因するのかは不明である。
Claims (10)
- DNA試料から配列情報を生成する方法であって、
(a)タグ化された、アダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片のエンドシーケンシングに基づいてクローンバンクの(配列に基づく)物理地図を準備することであって、前記制限酵素切断断片は、少なくとも1つの制限酵素を使用して生成されたものである工程と、
(b)次の工程を含むサブメソッドを準備する工程と、
(i)前記DNA試料のアダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片を準備する工程、
(ii)任意に、前記アダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片を断片化する工程、
(iii)任意に、アダプターを工程(ii)の断片にライゲーションする工程、
(iv)工程(iii)の断片の配列の少なくとも一部分を決定する工程、
(c)工程(b)で得られる配列情報を工程(a)の物理地図と組み合わせる工程と、
(d)ドラフトゲノム配列を生成する工程と
を含み、工程(b)(i)における制限酵素切断断片は、工程(a)の物理地図の生成で使用される前記少なくとも1つの制限酵素の認識配列の少なくとも一部分と同一である認識配列を含有する少なくとも1つの制限酵素を用いて生成される、方法。 - 前記少なくとも1つの制限酵素はレアカッターである、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)および(b)(i)の少なくとも1つの制限酵素はイソ制限酵素である、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)の少なくとも1つの制限酵素の認識部位は、工程(b)(i)の少なくとも1つの制限酵素の前記認識配列と同一であるセクションを含有する、請求項1に記載の方法。
- 以下の工程:
(a)複数のクローンを含むクローンバンクを準備する工程であって、各クローンは、試料ゲノム(もしくは前記試料ゲノムの一部分)由来のDNAを含有する工程と、
(b)前記クローンを前記クローンバンクからプールへとプールする工程と、
(c)少なくとも1つの制限酵素を使用して各プールについての断片を準備する工程と、
(d)第1のアダプターを前記断片にライゲーションする工程と、
(e)断片化された、アダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片を与え、および、任意に、ランダムな断片末端をポリッシングするために、工程(d)のアダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片を断片化する工程と、
(f)第1および第2のアダプターを含有する、アダプターとライゲーションされた断片化された制限酵素切断断片を与えるために、第2のアダプターを前記(ポリッシングされた)断片化された制限酵素切断断片にライゲーションする工程と、
(g)任意に、第1のプライマーおよび第2のプライマーを用いて工程(f)のアダプターとライゲーションされた断片化された制限酵素切断断片を増幅し、これにより増幅産物を生成する工程と、
(i)前記第1のアダプターの少なくとも一部分および/もしくは前記第1のアダプターに隣接した断片の配列の一部分ならびに/または前記第2のアダプターの少なくとも一部分および/もしくは前記第2のアダプターに隣接した断片の一部分の配列を決定する工程と、
(j)シーケンシングされた、前記第1のアダプターの一部分および/もしくは前記第1のアダプターに隣接した断片の一部分ならびに/または前記第2のアダプターの一部分および/もしくは前記第2のアダプターに隣接した断片の一部分に基づいて、前記断片を対応するクローンに割り当てる工程と、
(k)前記クローンをクローン−コンティグへと順序付けし、これにより前記試料ゲノムの物理地図を生成する工程と、
(l)前記第2のアダプターの少なくとも一部分および/もしくは前記第2のアダプターに隣接した断片の一部分の断片配列を対応するクローンに割り当てる工程と、
(m)工程(h)の断片配列を前記物理地図へアンカリングする工程と、
(n)ドラフトゲノム配列を生成する工程と
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記サブメソッドは、SDSESおよびSDPESからなる群から選択され、
I. SDSESは、
(a)制限酵素切断断片を得るための、少なくとも1つの制限エンドヌクレアーゼを用いた標的DNA(ゲノムDNAまたは人工染色体DNA)の断片化、
(b)第1のアダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片を得るための、前記制限酵素切断断片の末端への第1のアダプターのライゲーション、
(c)ランダムに断片化された第1のアダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片を得るための、前記第1のアダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片のランダムな断片化、
(d)任意に、アダプターを含有する前記断片化された、アダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片の選択、
(e)前記第1のアダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片の断片化された末端への、第2のアダプターのライゲーション、
(f)任意に、(親和性標識された)増幅された断片を得るための、工程(b)のアダプターに向けられたプライマーおよび工程(e)の第2のアダプターに向けられた(親和性標識された)プライマーを使用する増幅、
(g)任意に、前記第2のアダプターの存在に基づく、工程(f)で得られる(親和性標識された)増幅された断片の選択、
(h)前記第1のアダプターの少なくとも一部分の配列および/もしくは前記第1のアダプターに隣接した断片の配列の一部分ならびに/または前記第2のアダプターの少なくとも一部分の配列および/もしくは前記第2のアダプターに隣接した断片の配列の一部分の決定
の工程を含み、
II.SDPESは、
(a)制限酵素切断断片を得るための、標的DNAの制限酵素消化、
(b)IIs−アダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片を与えるための、タイプIIs制限エンドヌクレアーゼについての認識配列を含有するIIs−アダプターのライゲーション、
(c)断片化されたIIs−アダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片を得るための、前記IIs−アダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片の断片化、
(d)環状化産物を得るための、前記断片化されたIIs−アダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片の環状化、
(e)タイプIIsで消化された断片を与えるための、環状化産物のタイプIIs制限酵素消化、
(f)アダプターとライゲーションされたタイプIIsで消化された断片を与えるための、前記タイプIIsで消化された断片への第1のアダプターのライゲーション、
(g)前記第1のアダプターとライゲーションされたタイプIIsで消化された断片の断片化、
(h)第1および第2のアダプターとライゲーションされたタイプIIsで消化された断片を与えるための、前記第1のアダプターとライゲーションされたタイプIIsで消化された断片への第2のアダプターのライゲーション、
(i)前記断片および/またはアダプターの少なくとも一部分の配列を決定すること
の工程を含む、請求項1に記載の方法。 - 標的DNAの配列情報を生成する方法であって、
(a)制限酵素切断断片を得るための、少なくとも1つの制限エンドヌクレアーゼを用いた標的DNA(ゲノムDNAまたは人工染色体DNA)の断片化、
(b)第1のアダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片を得るための、前記制限酵素切断断片の末端への第1のアダプターのライゲーション、
(c)ランダムに断片化された第1のアダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片を得るための、前記第1のアダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片のランダムな断片化、
(d)任意に、アダプターを含有する前記断片化された、アダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片の選択、
(e)前記第1のアダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片の断片化された末端への、第2のアダプターのライゲーション、
(f)任意に、(親和性標識された)増幅された断片を得るための、工程(b)のアダプターに向けられたプライマーおよび工程(e)の第2のアダプターに向けられた(親和性標識された)プライマーを使用する増幅、
(g)任意に、前記第2のアダプターの存在に基づく、工程(f)で得られる(親和性標識された)増幅された断片の選択、
(h)前記第1のアダプターの少なくとも一部分の配列および/もしくは前記第1のアダプターに隣接した断片の配列の一部分ならびに/または前記第2のアダプターの少なくとも一部分の配列および/もしくは前記第2のアダプターに隣接した断片の配列の一部分の決定
の工程を含む、方法。 - 標的DNAの配列情報を生成する方法であって、
(a)制限酵素切断断片を得るための、標的DNAの制限酵素消化、
(b)IIs−アダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片を与えるための、タイプIIs制限エンドヌクレアーゼについての認識配列を含有するIIs−アダプターのライゲーション、
(c)断片化されたIIs−アダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片を得るための、前記IIs−アダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片の断片化、
(d)環状化産物を得るための、前記断片化されたIIs−アダプターとライゲーションされた制限酵素切断断片の環状化、
(e)タイプIIsで消化された断片を与えるための、環状化産物のタイプIIs制限酵素消化、
(f)アダプターとライゲーションされたタイプIIsで消化された断片を与えるための、前記タイプIIsで消化された断片への第1のアダプターのライゲーション、
(g)前記第1のアダプターとライゲーションされたタイプIIsで消化された断片の断片化、
(h)第1および第2のアダプターとライゲーションされたタイプIIsで消化された断片を与えるための、前記第1のアダプターとライゲーションされたタイプIIsで消化された断片への第2のアダプターのライゲーション、
(i)前記断片および/またはアダプターの少なくとも一部分の配列を決定すること
の工程を含む、方法。 - 前記シーケンシング工程は、ペアエンドシーケンシングを使用して実施される、請求項5から請求項8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記シーケンシング工程は、シングルエンドシーケンシングを使用して実施される、請求項5から請求項8のいずれか1項に記載の方法。
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