ES2878549T3 - Adenovirus oncolítico para su uso en el tratamiento del cáncer cerebral - Google Patents

Abstract

Un adenovirus oncolítico para su uso en uno o más de: (i) un procedimiento para lograr una reducción superior al 25% de la carga tumoral al tratar un glioma en un paciente humano sin que se produzca un evento adverso resultante de dicho adenovirus oncolítico que sea suficiente para causar la terminación de dicho tratamiento; (ii) un procedimiento para lograr una sobrevida libre de progresión de seis meses al tratar un glioma en un paciente humano sin que se produzca un evento adverso resultante de dicho adenovirus oncolítico que sea suficiente para causar la terminación de dicho tratamiento; y (iii) un procedimiento para lograr la necrosis del tumor al tratar un glioma en un paciente humano sin producir un evento adverso resultante de dicho adenovirus oncolítico que sea suficiente para causar la terminación de dicho tratamiento, en el que el procedimiento comprende el contacto del glioma, en el paciente humano identificado con el glioma, con el adenovirus oncolítico, y donde el adenovirus oncolítico es un adenovirus oncolítico con el polipéptido E1A que no puede unirse a Rb, y comprende una proteína de fibra con un aminoácido RGD insertado en el dominio HI.

Description

DESCRIPCIÓN

Adenovirus oncolítico para su uso en el tratamiento del cáncer cerebral

Antecedentes de la invención

A. Campo de la invención

La invención se refiere en general al campo de la medicina y la oncología. Más concretamente, se trata de composiciones y procedimientos para tratar gliomas en un paciente utilizando adenovirus oncolíticos.

B. Descripción de la técnica relacionada

El desarrollo del cáncer se entiende como la culminación de procesos biológicos complejos y de múltiples etapas, que se producen por la acumulación de alteraciones genéticas. Muchas de estas alteraciones, si no todas, afectan a genes específicos que controlan el crecimiento celular. Estos genes se dividen normalmente en dos categorías: protooncogenes y genes supresores de tumores. Las mutaciones en los genes de ambas clases suelen conferir una ventaja de crecimiento a la célula que contiene el material genético alterado.

La función de los genes supresores de tumores, a diferencia de los protooncogenes, es antagonizar la proliferación celular. Cuando se inactiva un gen supresor de tumores, por ejemplo, por una mutación puntual o una deleción, se altera la maquinaria reguladora de la célula para controlar el crecimiento. Las mutaciones y/o la pérdida de función en el gen supresor de tumores del retinoblastoma se han asociado a la formación de tumores. En algunos casos, los tumores cerebrales son metástasis en el cerebro de un tumor primario fuera del sistema nervioso central (SNC). Los tumores cerebrales derivados de metástasis suelen ser más comunes que los tumores primarios del cerebro. Los tumores primarios más comunes que hacen metástasis en el cerebro son los de pulmón, mama, melanoma y riñón. Estas metástasis cerebrales suelen estar en múltiples localizaciones, pero también pueden producirse metástasis solitarias.

La terapia génica es un tratamiento prometedor para los tumores cerebrales, incluidos los gliomas, porque las terapias convencionales suelen fallar y son tóxicas. Además, la identificación de las anomalías genéticas que contribuyen a los tumores malignos está proporcionando información genética molecular crucial para ayudar al diseño de terapias génicas. Las anomalías genéticas indicadas en la progresión de los tumores incluyen la inactivación de genes supresores de tumores y la sobreexpresión de numerosos factores de crecimiento y oncogenes. El tratamiento de los tumores puede llevarse a cabo mediante el suministro de un polinucleótido que codifique un polipéptido terapéutico u otra terapia que se dirija a las mutaciones y a las fisiologías aberrantes resultantes de los tumores. Son estas mutaciones y la fisiología aberrante lo que distingue a las células tumorales de las normales. Un virus selectivo de tumores sería una herramienta prometedora para la terapia génica. Los recientes avances en el conocimiento de cómo se replican los virus se han utilizado para diseñar virus oncolíticos selectivos para los tumores. En los gliomas, tres tipos de virus han demostrado ser útiles en modelos animales: reovirus que pueden replicarse selectivamente en tumores con una vía ras activada (Coffey et al., 1998); virus del herpes simple genéticamente alterados (Martuza et al., 1991; Mineta et al., 1995; Andreanski et al., 1997), incluidos los que pueden activarse por la diferente expresión de las proteínas en las células normales y cancerosas (Chase et al ., 1998); y adenovirus mutantes que no pueden expresar la proteína E1B55kDa y que se utilizan para tratar los tumores con mutación de p53 (Bischof et al., 1996; Heise et al., 1997; Freytag et al., 1998; Kirn et al., 1998). En conjunto, estos informes confirman la importancia de los virus oncolíticos como agentes anticancerígenos. En los tres sistemas, el objetivo es la propagación intratumoral del virus y la capacidad de eliminar selectivamente las células cancerosas. Los adenovirus modificados genéticamente que se dirigen a vías celulares en puntos clave tienen efectos anticancerígenos potentes y selectivos en los gliomas.

El direccionamiento a la vía de Rb tiene una notable relevancia para el tratamiento de los gliomas porque las anormalidades de la vía p16/Rb/E2F están presentes en la mayoría de los gliomas (Fueyo et al., 1998a; Gomez-Manzano et al., 1998). Dirigirse a esta vía mediante la sustitución de la actividad supresora de tumores perdida a través de la transferencia de los genes p16 y Rb ha producido efectos citostáticos (Fueyo et al., 1998a; Gómez-Manzano et al., 1998). La transferencia de E2F-1 produjo un potente efecto anticancerígeno, ya que E2F-1 exógeno de tipo salvaje indujo la apoptosis e inhibió el crecimiento del tumor in vivo (Fueyo et al., 1998b). Sin embargo, el tratamiento de los tumores de glioma humano con las construcciones de adenovirus existentes no puede afectar a partes significativas del tumor, principalmente porque los vectores adenovirales deficientes en la replicación son incapaces de replicarse e infectar otras células, transfiriendo así el ácido nucleico exógeno a un número suficiente de células cancerosas (Puumalainen et al., 1998). Aunque dirigir la vía p16/Rb/E2F produce un efecto anticancerígeno in vitro, esta imperfección del sistema de vectores limita el efecto terapéutico del gen in vivo.

Existe una necesidad continua de tratamientos adicionales para el cáncer, particularmente para los tumores cerebrales, incluyendo la creación de virus oncolíticos adicionales que sean capaces de replicarse en células específicas. Otros tratamientos incluyen un adenovirus con capacidad terapéutica o con capacidad de seguimiento in vivo.

Sumario de la invención

Así, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un adenovirus oncolítico para su uso en uno o más de: (i) un procedimiento para lograr una reducción superior al 25% de la carga tumoral al tratar un glioma en un paciente humano sin producir un evento adverso resultante de dicho adenovirus oncolítico que sea suficiente para causar la terminación de dicho tratamiento; (ii) un procedimiento para lograr una sobrevida libre de progresión de seis meses al tratar un glioma en un paciente humano sin producir un evento adverso resultante de dicho adenovirus oncolítico que sea suficiente para causar la terminación de dicho tratamiento; y (iii) un procedimiento para lograr la necrosis del tumor cuando se trata un glioma en un paciente humano sin producir un evento adverso resultante de dicho adenovirus oncolítico que sea suficiente para causar la terminación de dicho tratamiento, donde el procedimiento comprende contactar el glioma en el paciente humano identificado con el glioma, con el adenovirus oncolítico, y en el que el adenovirus oncolítico es un adenovirus oncolítico con el polipéptido E1A que no puede unirse a Rb, y comprende una proteína de fibra con un aminoácido RGD insertado en el dominio HI. Opcionalmente, se observan dos o más de los puntos (i)-(iii) o los tres puntos (i)-(iii). El sujeto también puede presentar una respuesta autoinmune contra dicho glioma. La respuesta tumoral puede incluir unos bordes tumorales menos definidos, tal y como se determina en la MRI (imagen por resonancia magnética) con contraste.

El adenovirus oncolítico puede ser un adenovirus A24. Un procedimiento de identificación de un paciente que tiene un glioma puede comprender la obtención de imágenes del tumor, y dicho procedimiento puede comprender además la obtención de una biopsia de dicho tumor después de la identificación de un paciente que tiene un glioma y antes del tratamiento con el adenovirus oncolítico. El glioma puede ser un astrocitoma, un oligodendroglioma, un glioma anaplásico, un glioblastoma, un ependimoma, un meningioma, un tumor de la región pineal, un tumor del plexo coroideo un tumor neuroepitelial, un tumor embrionario, un tumor neuroblástico periférico, un tumor de los nervios craneales, un tumor del sistema hemopoyético, un tumor de células germinales o un tumor de la región selar. El glioma puede ser recurrente, y/o el glioma puede no haber respondido a una o más terapias primarias contra el glioma.

El glioma puede ser extirpable o no extirpable. El glioma puede ser extirpado tras dicho tratamiento. El lecho tumoral posterior a la extirpación puede ser tratado con dicho adenovirus oncolítico. El adenovirus puede entrar en contacto con el glioma mediante la administración del adenovirus por vía intracraneal en el paciente. La administración puede comprender una inyección intratumoral, puede comprender múltiples inyecciones, tal como cuando se implanta un catéter posterior a la extirpación en dicho paciente y dicho adenovirus oncolítico se administra a través de dicho catéter. El adenovirus oncolítico puede administrarse mediante una infusión lenta durante un periodo mínimo de 10 minutos con una aguja. El adenovirus oncolítico puede ser administrado en forma estereotáctica en más de un sitio de un glioma en dicho paciente. La dosis puede ser de aproximadamente 103 a aproximadamente 1015 partículas virales, de aproximadamente 105 a aproximadamente 1012 partículas virales administradas al paciente, o de aproximadamente 107 a aproximadamente 1010 partículas virales administradas al paciente. El tratamiento puede comprender la dosificación de 1 x 107, 3 x 107, 1 * 108, 3 x 108, 1 x 109, 3 x 109, 1 x incluyendo un incremento escalonado en la dosis.

El procedimiento puede comprender además la administración al paciente de una segunda terapia, en la que la segunda terapia es una terapia antiangiogénica, quimioterapia, inmunoterapia, cirugía, radioterapia, agentes inmunosupresores o terapia génica con un polinucleótido terapéutico. La segunda terapia puede administrarse al paciente antes de la administración de la composición que comprende el adenovirus oncolítico, administrarse al paciente al mismo tiempo que la administración de la composición que comprende el adenovirus oncolítico, o administrarse al paciente después de la administración de la composición que comprende el adenovirus oncolítico.

La quimioterapia puede comprender un agente alquilante, un inhibidor mitótico, un antibiótico o un antimetabolito. La segunda terapia puede comprender, en particular, radioterapia y temozolomida.

El sujeto puede seleccionarse además en función de la presencia de una respuesta Th1. La respuesta Th1 puede caracterizarse por un aumento del interferón-gamma (IFN-y) específico del antígeno, la IL-12 y los anticuerpos fijadores del complemento.

En otra realización, se proporciona un adenovirus oncolítico para su uso en uno o más de: (i) un procedimiento para tratar un glioma en un paciente humano y lograr un beneficio clínico en el 30% de dichos pacientes, con un beneficio clínico definido por respondedores completos respondedores parciales más enfermedad estable; (ii) un procedimiento para tratar un glioma en un paciente humano y lograr una sobrevida libre de progresión del 25% a los seis meses; y (iii) un procedimiento para tratar un glioma en un paciente humano y lograr una mediana de sobrevida de 12 meses para los respondedores, con respondedores definidos por respondedores completos respondedores parciales, donde el procedimiento comprende contactar los gliomas de una población de los pacientes humanos que han sido identificados con glioma con el adenovirus oncolítico, y donde el adenovirus oncolítico es un adenovirus oncolítico con el polipéptido E1A que no puede unirse a Rb, y comprende una proteína de fibra con un aminoácido

RGD insertado en el dominio HI.

El adenovirus oncolítico puede ser un adenovirus A24. La etapa (a) puede comprender la obtención de imágenes del tumor, y dicho procedimiento puede comprender además la obtención de una biopsia de dicho tumor después de la etapa (a) y antes de la etapa (b). El glioma puede ser un astrocitoma, un oligodendroglioma, un glioma anaplásico, un glioblastoma, un ependimoma, un meningioma, un tumor de la región pineal, un tumor del plexo coroideo, un tumor neuroepitelial, un tumor embrionario, un tumor neuroblástico periférico, un tumor de los nervios craneales, un

tumor del sistema hemopoyético, un tumor de células germinales o un tumor de la región selar. El glioma puede ser recurrente, y/o el glioma puede no haber respondido a una o más terapias primarias contra el glioma.

El glioma puede ser extirpable o no extirpable. El glioma puede ser extirpado tras dicho tratamiento. El lecho tumoral posterior a la extirpación puede ser tratado con dicho adenovirus oncolítico. El adenovirus puede entrar en contacto con el glioma mediante la administración del adenovirus por vía intracraneal en el paciente. La administración puede comprender una inyección intratumoral, puede comprender múltiples inyecciones, como cuando se implanta un catéter posterior a la extirpación en dicho paciente y dicho adenovirus oncolítico se administra a través de dicho catéter. El adenovirus oncolítico puede administrarse mediante una infusión lenta durante un periodo mínimo de 10 minutos con una aguja. El adenovirus oncolítico puede ser administrado en forma estereotáctica en más de un sitio de un glioma en dicho paciente. La dosis puede ser de aproximadamente 103 a aproximadamente 1015 partículas virales, de aproximadamente 105 a aproximadamente 1012 partículas virales administradas al paciente, o de aproximadamente 107 a aproximadamente 1010 partículas virales administradas al paciente.

El procedimiento puede comprender además la administración al paciente de una segunda terapia, en la que la segunda terapia es una terapia antiangiogénica, quimioterapia, inmunoterapia, cirugía, radioterapia, agentes inmunosupresores o terapia génica con un polinucleótido terapéutico. La segunda terapia puede administrarse al paciente antes de la administración de la composición que comprende el adenovirus oncolítico, administrarse al paciente al mismo tiempo que la administración de la composición que comprende el adenovirus oncolítico, o administrarse al paciente después de la administración de la composición que comprende el adenovirus oncolítico. La quimioterapia puede comprender un agente alquilante, un inhibidor mitótico, un antibiótico o un antimetabolito. El sujeto puede seleccionarse además en función de la presencia de una respuesta Th1. La respuesta Th1 puede caracterizarse por un aumento del interferón-gamma (IFN-y) específico del antígeno, la IL-12 y los anticuerpos fijadores del complemento.

Las realizaciones analizadas en el contexto de un procedimiento y/o composición de la invención pueden emplearse con respecto a cualquier otro procedimiento o composición descritos en el presente documento. Por lo tanto, una realización perteneciente a un procedimiento puede aplicarse también a otros procedimientos de la invención.

El término "aproximadamente" se refiere a la imprecisión de la determinación de las cantidades y medidas de virus, proteínas u otras, y pretende incluir al menos una desviación estándar de error para cualquier ensayo, medida o cuantificación particular.

"Un" o "una", tal como se utilizan aquí en la especificación, pueden significar uno o más de uno. Como se utiliza aquí en la(s) reivindicación(es), cuando se usa junto con la palabra "que comprende", las palabras "un" o "una" pueden significar uno o más de uno.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican realizaciones preferentes de la invención, se dan sólo a modo de ilustración, ya que varios cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención se harán evidentes para los expertos en la materia a partir de esta descripción detallada.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación y se incluyen para demostrar ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las realizaciones específicas presentadas en el presente documento:

FIGS. 1A-D. Imágenes de contraste axial: El sujeto fue tratado con DNX-2401 tras una primera recidiva, no habiendo respondido a la cirugía, la radioterapia, la Temozolomida y un ciclo de Dasatinib. Actualmente no hay evidencia de enfermedad 32 meses después del tratamiento con una respuesta completa a la terapia DNX-2401 (según los criterios de McDonald). (FIG. 1A) Pretratamiento, (FIG. 1B) 2 meses, (FIG. 1C) 8 meses, (FIG. 2D) 23 meses. Flecha: Un tumor. Obsérvese la aparente progresión en la FIG. 1B causada por la inflamación, no por el crecimiento del tumor. El tumor sigue respondiendo (FIG. 1C), que se hace más pequeña y aparece fibrilar. Obsérvese la ausencia de tumor en la FIG. 1D. La pequeña región que realza por debajo del surco es un quiste (flecha).

FIG. 2. Imágenes de contraste axial: El sujeto fue tratado con DNX-2401 en la tercera recidiva tras no haber respondido a la cirugía previa, radioterapia, temozolomida y bevacizumab. Obsérvese el aspecto lobular del tumor 2 meses después del tratamiento con Delta-24-RGD (panel izquierdo), que continúa con la evidencia de desintegración ("burbujas de jabón") a los 6 meses (panel derecho). El tumor se resecó a los 6 meses y se analizó. El informe patológico independiente indicaba que el tumor era mayoritariamente necrótico y el resto estaba infiltrado por células inmunitarias con predominio de células T (izquierda 2 meses, derecha 6 meses).

FIG. 3. Imágenes de contraste coronales (derecha): El sujeto fue tratado en el brazo A del ensayo con DNX-2401 en la primera recidiva tras no haber respondido a la cirugía previa, radioterapia y temozolomida. Imagen izquierda 1 mes, imagen derecha 10 meses después del tratamiento con DNX-2401. El volumen del tumor se redujo en un 82% a los 10 meses

FIG. 4. Imágenes de contraste axial (derecha): El sujeto fue tratado en el brazo A del ensayo con DNX-2401 en la primera recidiva tras no haber respondido a la cirugía previa, radioterapia y temozolomida.

FIG. 5. Imágenes T2/FLAIR: El sujeto fue tratado en el brazo A del ensayo con DNX-2401 en la primera recidiva tras no haber respondido a la cirugía previa, radioterapia y temozolomida. Las imágenes demuestran una profunda mejora con una resolución prácticamente completa de la señal FLAIR.

FIG. 6. Secciones a través de un tumor humano resecado de un paciente de la fase 1, brazo B. La tinción de la proteína Ad hexon muestra una clara evidencia de la propagación del virus y de los efectos antiglioma a las 2 semanas del tratamiento con DNX-2401. A, necrosis inducida por el virus; B, células tumorales infectadas; C, células tumorales no infectadas.

FIG. 7. Secciones a través de un tumor humano resecado de un paciente de la fase 1, brazo B. Tinción para la presencia de células T como se muestra. Obsérvese la infiltración de células T predominantemente CD8. H&E, hematoxilina/eosina; CD3, marcador específico de células T normalmente presente en linfocitos T en reposo y activos; CD4, marcador de células T expresado en un linfocito T ayudante/inductor; CD8, marcador de células T normalmente presente en el subconjunto de células T citotóxicas/supresoras.

FIG.8. Diseño del ensayo clínico de fase I.

FIG.9. Plan de incremento escalonado del estudio en la dosis clínico.

FIG. 10. Criterios de respuesta.

Descripción de las realizaciones ilustrativas

Los tumores malignos que son intrínsecamente resistentes a las terapias convencionales son retos terapéuticos importantes. Estos tumores malignos incluyen, entre otros, los gliomas malignos, que son los tumores cerebrales primarios más abundantes, con una incidencia anual de 6,4 casos por cada 100.000 (CBTRUS, 2002-2003). Estos tumores neurológicamente devastadores son el subtipo más común de tumores cerebrales primarios y son uno de los cánceres humanos más mortales. En el cáncer más agresivo, la manifestación del glioblastoma multiforme (GBM), la duración media de la sobrevida de los pacientes oscila entre 9 y 12 meses, a pesar de los máximos esfuerzos de tratamiento (Hess et al., 1999). El glioma maligno, una enfermedad prototípica, es inherentemente resistente a los regímenes de tratamiento actuales (Shapiro y Shapiro, 1998). De hecho, en aproximadamente 1/3 de los pacientes con GBM el tumor seguirá creciendo a pesar del tratamiento con radiación y quimioterapia. La mediana de sobrevida, incluso con un tratamiento agresivo que incluya cirugía, radiación y quimioterapia, es inferior a 1 año (Schiffer, 1998). Dado que se dispone de pocas opciones de tratamiento buenas para muchos de estos tumores refractarios, es esencial la exploración de enfoques terapéuticos novedosos e innovadores.

Un procedimiento potencial para mejorar el tratamiento se basa en el concepto de que los virus de origen natural pueden ser diseñados para producir un efecto oncolítico en las células tumorales (Wildner, 2001; Jacotat, 1967; Kirn, 2001; Geoerger et al., 2002; Yan et al., 2003; Vile et al., 2002). En el caso de los adenovirus, las deleciones específicas dentro de su genoma adenoviral pueden atenuar su capacidad de replicarse dentro de las células quiescentes normales, mientras que conservan la capacidad de replicarse en las células tumorales. Uno de estos adenovirus de replicación condicional, el A24, ha sido descrito por Fueyo et al. (2000), véase también Publicación de Patente Estadounidense No. 20030138405 y Patentes Estadounidenses 8.168.168 y 6.824.771). El adenovirus A24 deriva del adenovirus tipo 5 (Ad-5) y contiene una deleción de 24 pares de bases dentro de la porción CR2 del gen E1A. Se han demostrado efectos antitumorales significativos del ^a 24 en sistemas de cultivo celular y en modelos de xenoinjerto de glioma maligno.

Los adenovirus oncolíticos incluyen los adenovirus de replicación condicional (CRAD), tal como el Delta 24, que tienen varias propiedades que los hacen candidatos para su uso como agentes bioterapéuticos. Una de estas propiedades es la capacidad de replicarse en una célula o tejido permisivo, lo que amplifica la dosis original de entrada del virus oncolítico y ayuda a que el agente se extienda a las células tumorales adyacentes proporcionando un efecto antitumoral directo.

I. ADENOVIRUS ONCOLÍTICO A24

Se han demostrado los efectos oncolíticos in vitro e in vivo del adenovirus A24. En general, el adenovirus es un virus de ADN lineal de doble cadena de 36 kb (Grunhaus y Horwitz, 1992). La infección adenoviral de las células huésped hace que el ADN adenoviral se mantenga de forma episódica, lo que reduce la genotoxicidad potencial asociada a los vectores integradores. Además, los adenovirus son estructuralmente estables y no se ha detectado ninguna reordenación del genoma tras una amplificación exhaustiva. Los adenovirus pueden infectar prácticamente todas las células epiteliales, independientemente de la fase de su ciclo celular. Hasta ahora, la infección por adenovirus sólo parece estar relacionada con enfermedades leves, como la enfermedad respiratoria aguda en humanos.

Una forma particular del virus A24 es DNX-2401 (DNATrix, Houston TX) es un vector de adenovirus (AdV) de replicación condicional tipo 5 para la administración intratumoral que contiene una deleción de 24 pb (pb 923-946; el dominio de unión a Rb) en el gen E1A y la inserción de un motivo de unión a la integrina RGD (péptido 4C: Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys; SEQ ID NO: 1) en el bucle HI de la fibra Ad. El DNX-2401 puede utilizar ciertas integrinas de la superficie celular para entrar en las células tumorales.

DNX-2401 entra en las células tanto a través del receptor normal del adenovirus (CAR) como de las integrinas de unión a RGD que normalmente se expresan sólo en las células tumorales y en la neovasculatura. Se trata de una mejora significativa con respecto a la generación anterior de adenovirus que tenían que depender del receptor CAR para su actividad. Este péptido RGD-4C (CDCRGDCFC; SEQ ID NO: 1) ha demostrado unirse con gran afinidad a las integrinas de unión RGD (aVp3 y aVp5) presentes en la superficie de muchos tipos de células, incluidas las tumorales. Es importante destacar que se ha demostrado que las integrinas de unión a RGD se expresan en la vasculatura del tumor y en las células del glioma, pero no en el cerebro normal, lo que proporciona una base para la infección selectiva y en gran medida del glioblastoma por DNX-2401.

Una vez dentro de la célula, la replicación del DNX-2401 está restringida a las células con defectos en la vía Rb, la vía principal de control de la división celular. Dado que prácticamente todas las células tumorales, incluido el >90% de los glioblastomas, son defectuosas en la vía Rb/p16 y ya están en el ciclo celular, el DNX-2401 se replica en estas células tumorales y las elimina de forma selectiva y eficaz. Este alto grado de selectividad se consigue mediante la supresión del dominio de unión a Rb de 24 pb normalmente presente en la proteína E1 del virus. Una de las principales funciones de esta región es permitir la replicación del adenovirus en células sanas que tienen una función Rb normal. La supresión de esta región hace que el DNX-2401 sólo pueda replicarse en células tumorales con defectos en la vía de Rb.

A. Mecanismo del virus oncolítico A24

Un aumento dramático de la proliferación celular que es característico de la transformación de glioma de bajo grado a grado intermedio está en gran parte relacionado con la desregulación de la vía p16/Rb/E2F (Fueyo et al., 2000; Fueyo et al., 1998; Chintala, 1997). Lo más convincente es la falta de solapamiento mutacional que se observa entre los distintos miembros de esta vía, lo que argumenta que podría lograrse un importante avance terapéutico en el tratamiento de estos tumores dirigiéndose específicamente a la vía de Rb (Kyritsis y Yung, 1996; Fueyo et al., 1999). La alteración del estado de Rb probablemente proporcionará oportunidades para utilizar agentes que actúen exclusivamente en las células tumorales deficientes en Rb (Fueyo et al., 1999). La mayoría de las células cerebrales humanas normales suelen ser quiescentes. Las células del sistema nervioso central (SNC) rara vez se dividen, y estas células se activan específicamente para dividirse de forma limitada. Se han desarrollado estrictos controles reguladores que limitan estrictamente la división celular. La vía p16/Rb/E2F es una vía importante para mantener el estado de no división de las células totalmente diferenciadas o regula negativamente la progresión del ciclo celular de las células normales en división.

El adenovirus humano normalmente infecta células humanas, que son quiescentes (no se dividen) o en división (células normales o cancerosas). Tras la introducción de este virus en una célula humana (infección viral), el ADN del adenovirus se transcribe inmediatamente mediante la síntesis de la proteína adenoviral E1A. La región CR2 de la proteína E1A interactúa específicamente con la proteína Rb y conduce a la liberación de E2F, forzando la entrada de la célula en la fase S (la fase de síntesis del ADN) del ciclo celular y manteniendo la célula en el ciclo de división. Esta serie de eventos hace que la célula huésped sea utilizada exclusivamente para expresar las proteínas codificadas por el virus. La producción activa de partículas adenovirales depende de esta capacidad de conducir a las células a un modo activo de replicación, una característica crítica de los virus oncolíticos. Como consecuencia de sus características biológicas, las células tumorales proporcionan un entorno de replicación que favorece dicha actividad. Las mutaciones en secuencias críticas del genoma viral hacen que el adenovirus no pueda unirse a las proteínas supresoras de tumores e inactivarlas. Estos adenovirus modificados son capaces de replicarse exclusivamente en células que carecen de un gen supresor tumoral objetivo funcional (sólo en células tumorales).

Así, la expresión de una proteína E1A con una deleción de 24 pares de bases en la región CR2 impide que la proteína se una a Rb y la inactive. Este adenovirus atenuado E1A-mutante es incapaz de replicarse dentro de las células quiescentes normales que tienen una vía Rb funcionalmente activa. Por el contrario, las células tumorales son permisivas a la replicación viral, que a su vez invade y lisa eficazmente las células de glioma humano tanto in vitro como in vivo.

El potencial oncolítico del A24 es dramático en comparación con otros adenovirus condicionalmente deficientes en replicación, como el Onyx-015. Los efectos de a 24 en un modelo de tumor de glioma intracraneal de ratón xenoinjertado se muestran en la FIG. 2. En este caso, la curva que representa a RA55 lleva la deleción en la región E1B como en Onyx-015. El adenovirus oncolítico no tiene el mismo grado de potencia que el A24 a dosis comparables utilizadas (en este caso 1 x 108 pfu). También se muestra el control negativo A24 que se inactiva con la exposición ultravioleta. Los efectos antitumorales de A24 se han demostrado en varias líneas celulares tumorales humanas y en modelos de xenoinjertos animales con defectos conocidos de la vía p16/Rb/E2F. La replicación permisiva de A24 en líneas celulares con defectos de p16/Rb/E2F contrasta con la replicación altamente atenuada en astrocitos normales y fibroblastos quiescentes normales. Además, la actividad de este virus se atenúa cuando se introduce en células tumorales en las que se ha restaurado funcionalmente Rb mediante técnicas de transfección estable o transitoria.

Varios factores favorecen el uso de adenovirus oncolíticos para el tratamiento de tumores cerebrales. En primer lugar, los gliomas no hacen metástasis y, por lo tanto, un enfoque local eficaz debería ser suficiente para curar la enfermedad. En segundo lugar, cada glioma alberga varias poblaciones de células que expresan diferentes anomalías genéticas (Sidransky et al., 1992; Collins y James, 1993; Furnari et al., 1995; Kyritsis et al., 1996). Así, el espectro de tumores sensibles a la transferencia de un solo gen a las células cancerosas puede ser limitado. En tercer lugar, los adenovirus con capacidad de replicación pueden infectar y destruir las células cancerosas detenidas en G0. Dado que los gliomas incluyen invariablemente células no cicladoras, esta propiedad es importante. Por último, la vía pl6-Rb es anormal en la mayoría de los gliomas (Hamel et al., 1993; Henson etal., 1994; Hirvonen etal., 1994; Jen et al., 1994; Schmidt et al., 1994; Costello et al., 1996; Fueyo et al., 1996b; Kyritsis etal., 1996; Ueki et al., 1996; Costello et al., 1997), por lo que la estrategia A24 es apropiada para la mayoría de estos tumores. Aunque la pérdida de la función del gen supresor de tumores del retinoblastoma se ha asociado a las causas de varios tipos de tumores y no se limita al tratamiento de los gliomas.

En otras realizaciones de la invención, una mutación E1A (por ejemplo, una mutación A24 en E1A) pued e utilizarse en combinación con mutaciones en la región E1B del mismo adenovirus, produciendo así un adenovirus doblemente mutante. En ciertas realizaciones de la invención, un adenovirus puede comprender una mutación A24 y una deleción en la región E1B que impide la expresión o la función de la proteína E1B55kD. Se ha demostrado que la proteína E1B55kD se une a p53 y lo inactiva. La mutación de la región E1B puede incluir una supresión de las secuencias de adenovirus de 2426 pb a 3328 pb del número de acceso del banco de genes NC_001406, que se incorpora aquí por referencia.

En ciertas realizaciones de la invención, se puede utilizar un adenovirus oncolítico como vector de expresión de adenovirus. Por "vector de expresión de adenovirus" se entiende aquellos vectores que contienen secuencias de adenovirus suficientes para (a) soportar el empaquetamiento del vector y (b) expresar un polinucleótido que ha sido clonado en él. La posición de inserción de un polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo de interés dentro de las secuencias de adenovirus no es crítica para la invención. El polinucleótido que codifica el polipéptido de interés puede insertarse en lugar de la región E3 eliminada en los vectores de sustitución E3 descritos por Karlsson et al., (1986) u otra región que no sea esencial para la replicación viral en la célula diana. Los procedimientos tradicionales para la generación de partículas adenovirales son la cotransfección seguida de la posterior recombinación in vivo de un plásmido lanzadera y un plásmido adenoviral auxiliar en células 293 o 911 (Introgene, Países Bajos).

B. Direccionamiento de las integrinas en la superficie de las células neoplásicas

Las modificaciones del adenovirus oncolítico descritas en el presente documento pueden realizarse para mejorar la capacidad del adenovirus oncolítico para tratar el cáncer. La presente invención también incluye cualquier modificación del adenovirus oncolítico que mejore la capacidad del adenovirus para dirigirse a las células neoplásicas. Se incluyen modificaciones del genoma del adenovirus oncolítico para mejorar la capacidad del adenovirus de infectar y replicarse en las células cancerosas mediante la alteración de las moléculas de unión al receptor.

Los receptores de la superficie celular son candidatos atractivos para la terapia dirigida del cáncer. La ausencia o la presencia de niveles bajos del receptor del coxsackievirus y del adenovirus (CAR) en varios tipos de tumores pueden limitar la eficacia del adenovirus oncolítico. Se pueden añadir varios motivos peptídicos al pomo de la fibra, por ejemplo un motivo RGD (las secuencias RGD imitan los ligandos normales de las integrinas de la superficie celular), un motivo Tat, un motivo de polilisina, un motivo NGR, un motivo CTT, un motivo CNGRL, un motivo CPRECES o un motivo strept-tag (Rouslahti y Rajotte, 2000). Se puede insertar un motivo en el bucle HI de la proteína de fibra del adenovirus. La modificación de la cápside permite la infección de las células diana sin necesidad de CAR. Esto permite una mayor replicación, una infección más eficiente y una mayor lisis de las células tumorales (Suzuki et al., 2001). También pueden añadirse secuencias peptídicas que se unen a receptores específicos del glioma humano, como el EGFR o el uPR. Los receptores específicos que se encuentran exclusiva o preferentemente en la superficie de las células cancerosas pueden utilizarse como objetivo para la unión e infección adenoviral, como el EGFRvIII.

II. VÍA DE RB

Rb es un gen supresor de tumores cuya pérdida de función está asociada a la formación de tumores. La proteína del retinoblastoma o Rb, como se utiliza aquí, se refiere al polipéptido codificado por el gen del retinoblastoma (Rb). El gen del retinoblastoma está localizado en 13ql4 en los seres humanos y codifica una proteína de aproximadamente 110 kiloDaltons (kD). Rb no fosforilada inhibe la proliferación celular mediante el secuestro de factores de transcripción (por ejemplo, E2F) y la detención de las células en Gi del ciclo celular. Los factores de transcripción se liberan de Rb cuando éste se fosforila. La unión de E1A a Rb provoca la liberación del factor transcripcional de forma muy similar a la fosforilación. Varias oncoproteínas virales tienen como objetivo la inactivación de Rb para facilitar la replicación viral. Estas proteínas incluyen el adenovirus E1A, el antígeno T grande del SV40 y el virus del papiloma E7.

La proteína E1A es uno de los primeros polipéptidos específicos del virus que se sintetizan tras la infección adenoviral y es necesaria para que se produzca la replicación viral (Dyson y Harlow, 1992; Flint y Shenk, 1997). La interacción de la proteína Rb y la proteína E1A da lugar a la liberación del E2F de los complejos celulares E2F-Rb preexistentes. El E2F queda entonces libre para activar la transcripción de los promotores E2 del adenovirus y de los genes regulados por el E2F de una célula infectada. La activación transcripcional de estos genes celulares ayuda a su vez a crear un entorno adecuado para la síntesis de ADN viral en células que, de otro modo, estarían en reposo (Nevins, 1992). Dos segmentos de E1A son importantes para la unión de Rb; uno incluye los aminoácidos 30-60 y el otro los aminoácidos 120-127 (Whyte et al., 1988; Whyte et al., 1989). La supresión de cualquiera de estas regiones impide la formación de complejos ElA/Rb detectables in vitro e in vivo (Whyte et al., 1989).

Un adenovirus que contiene una mutación Delta 24 produce una proteína E1A que no puede unirse a Rb, lo que hace que una célula infectada permanezca en G0. Por lo tanto, una vía Rb mutante y una E1A mutante, junto con la activación de E2F son necesarias para la transcripción adenoviral de A24.

La vía del retinoblastoma (Rb), tal como se utiliza aquí, se refiere a la interacción de un grupo de proteínas reguladoras que interactúan con Rb u otras proteínas que interactúan con Rb en la regulación de la proliferación celular (para una revisión ver Kaelin, 1999). Las proteínas dentro de la vía de Rb incluyen, pero no se limitan a, Rb, la familia de factores de transcripción E2F, DRTF, RIZ286, MyoD287, cAb1288, MDM2289, hBRG1/hBRM, pl6, p107, pl30, c-Abl tirosina quinasa y proteínas con motivos conservados LXCXE, ciclina E-cdk 2 y ciclina D-cdk 4/6. La fosforilación de Rb libera E2F, que se une a Rb no fosforilada. El E2F estimula la transcripción y la actividad de la ciclina E, lo que provoca una mayor fosforilación de Rb. Rb no fosforilada actúa como supresor de tumores al unirse a proteínas reguladoras que aumentan la replicaitón del ADN, tal como E2F (The Genetic Basis of Human Cancer, Vogelstein and Kinzler eds., 1998).

La vía defectuosa del retinoblastoma, como se utiliza en el presente documento, se refiere a la inactivación, la mutación o la supresión de Rb o a la incapacidad de las proteínas reguladoras aguas arriba o aguas abajo que interactúan con Rb para regular la proliferación celular debido a una mutación o modificación de una o más proteínas, actividades proteicas o interacciones proteína-proteína. Las mutaciones que causan una vía de Rb defectuosa incluyen, pero no se limitan a mutaciones inactivadoras en Rb, proteínas INK4 y CIP/KIP y mutaciones activadoras en los genes de las ciclinas, tal como ciclina D/cdk 4, 6 y ciclina E, cdk 2. Las mutaciones en uno u otro elemento de la vía reguladora de Rb, incluyendo p16, ciclina D, cdk4, E2F o la propia Rb, pueden estar mutadas en casi el 100% de los tumores humanos (The Genetic Basis of Human Cancer, 1998). Los tumores asociados a Rb incluyen gliomas, sarcomas, tumores de pulmón, mama, ovario, cuello uterino, páncreas, estómago, colon, piel, laringe, vejiga y próstata.

III. PROCEDIMIENTOS PARA EL TRATAMIENTO DE CÁNCERES CEREBRALES

La presente invención se refiere al tratamiento de tumores cerebrales, incluidas las células tumorales con una vía de Rb interrumpida. Se contempla que una amplia variedad de tumores cerebrales pueden ser tratados utilizando los procedimientos y composiciones de la invención, incluyendo glioblastoma, astrocitoma anaplásico y gliosarcoma. El término "glioma" se refiere a un tumor originado en la neuroglía del cerebro o la médula espinal. Los gliomas derivan de tipos de células gliales como los astrocitos y los oligodendrocitos, por lo que los gliomas incluyen astrocitomas y oligodendrogliomas, así como gliomas anaplásicos, glioblastomas y ependimomas. Los astrocitomas y los ependimomas pueden aparecer en todas las áreas del cerebro y la médula espinal, tanto en niños como en adultos. Los oligodendrogliomas suelen aparecer en los hemisferios cerebrales de los adultos. Los gliomas representan el 75% de los tumores cerebrales en pediatría y el 45% de los tumores cerebrales en adultos. Los porcentajes restantes de tumores cerebrales son meningiomas, ependimomas, tumores de la región pineal, tumores del plexo coroideo, tumores neuroepiteliales, tumores embrionarios, tumores neuroblásticos periféricos, tumores de los nervios craneales, tumores del sistema hemopoyético, tumores de células germinales y tumores de la región selar.

A los efectos de este documento, los criterios de respuesta y progresión (todas las respuestas duraderas durante al menos 4 semanas) se definen como esos términos fueron adoptados por la Organización Mundial de la Salud y adaptados para los tumores cerebrales, utilizando los criterios de Macdonald (Macdonald et al., 1990), y se determinan utilizando las mediciones bidimensionales de las lesiones que realzan el contraste (reducción en el diámetro transversal más largo de una lesión en una resonancia magnética):

• Respuesta completa: desaparición de todas las lesiones y ausencia de esteroides por encima de la dosis fisiológica;

• Respuesta parcial: > 50% de contracción y esteroides estables o disminuidos;

• Enfermedad estable: <50% de encogimiento;

• Progresión: nueva lesión, progresión inequívoca de las lesiones no índice, crecimiento de > 25% de las lesiones índice, o claro deterioro clínico en ausencia de progresión radiológica.

El glioblastoma es un devastador glioma maligno primario de alto grado resistente a las terapias convencionales. Las intervenciones actuales, tal como la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia, prolongan la mediana de sobrevida global a aproximadamente 14,6 meses. Muchos de los nuevos compuestos, incluso cuando se han probado en combinación, no han conseguido mejorar la sobrevida global o conducir a una respuesta clínica útil. Existe una profunda necesidad médica insatisfecha de un nuevo modo de ataque a estos tumores que pueda influir en el curso de la enfermedad.

Los gliomas malignos de alto grado son tumores altamente vasculares e infiltrantes, por lo que tienden a recurrir a pesar de la extirpación quirúrgica. Las opciones de tratamiento son limitadas tanto para la enfermedad recién diagnosticada como para la recurrente, y son especialmente limitadas para los pacientes que tienen tumores que no son accesibles quirúrgicamente. Además, aunque el 80% o más de las recidivas del glioblastoma se producen en la misma zona que el tumor original, a menudo se descarta la radioterapia adicional por motivos de toxicidad. Temozolomida está aprobado para el tratamiento del glioblastoma recién diagnosticado y del astrocitoma anaplásico recurrente, y bevaciumab ha sido aprobado más recientemente para el tratamiento del glioblastoma recurrente. Estos fármacos se administran por vía sistémica y deben administrarse en régimen de dosis múltiples. La temozolomida se utiliza con mayor eficacia como adyuvante de la cirugía o la radioterapia. En cambio, el bevacizumab suele administrarse solo para la enfermedad recurrente, o de forma experimental, en combinación con quimioterapias existentes como el irinotecán.

Los avances en la comprensión de la biología tumoral han permitido identificar una serie de vías de señalización y procesos clave de la tumorigénesis. Sin embargo, debido a la redundancia de las vías y la señalización alternativa, la inhibición de una sola diana puede ser insuficiente para inhibir sustancialmente el crecimiento del tumor, y puede ser necesaria una combinación de varios agentes.

Actualmente, hay numerosos agentes antiangiogénicos que se están considerando en la práctica clínica. Debido a su aprobación acelerada por parte de la FDA, el fármaco antiangiogénico que más se investiga en pacientes con tumores cerebrales es bevacizumab (Avastin®), que es un anticuerpo monoclonal humanizado que interrumpe la vía del VEGF, induce una disminución del tamaño de los vasos del tumor y da lugar a una red vascular más normalizada que tiene una permeabilidad reducida. Este compuesto se ha utilizado ya en varios estudios como agente único y combinado, en entornos iniciales y recurrentes.

La mayoría de los estudios actuales de fase N/III en curso han pasado a utilizar inhibidores de la quinasa o la integrina de moléculas pequeñas, tal como enzastaurina, cediranib, pazopanib, sorafenib, sunitinib y cilengitida. Los regímenes terapéuticos pueden incluir una combinación de estas terapias, a menudo implican la prescripción simultánea de tratamientos no antiangiogénicos, y pueden administrarse tanto a pacientes con enfermedad recién diagnosticada como recurrente. Los resultados iniciales sugieren que, si bien varios de estos agentes pueden prolongar modestamente PFS (sobrevida libre de progresión) de 6 meses, aún no se han demostrado los posibles beneficios a largo plazo y el impacto en la sobrevida.

El glioblastoma multiforme es el tumor cerebral primario maligno más frecuente en adultos. Más de la mitad de estos tumores presentan anomalías en los genes implicados en el control del ciclo celular. A menudo hay una deleción en CDKN2A o una pérdida de expresión del gen del retinoblastoma. Otros tipos de tumores cerebrales son astrocitomas, oligodendrogliomas, ependimomas, meduloblastomas, meningiomas y schwannomas.

En muchos contextos, no es necesario que la célula sea eliminada o inducida a sufrir la muerte celular o "apoptosis". Más bien, para lograr un tratamiento significativo, todo lo que se requiere es que el crecimiento del tumor se frene en cierta medida. Puede ser que se bloquee completamente el crecimiento de la célula o que se logre cierta regresión del tumor. También se contemplan términos clínicos tal como "remisión" y "reducción de la carga tumoral", dado su uso habitual.

El término "beneficio terapéutico" se refiere a cualquier cosa que promueva o mejore el bienestar del sujeto con respecto al tratamiento médico de su afección, que incluye el tratamiento del pre-cáncer, cáncer y enfermedades hiperproliferativas. Una lista de ejemplos no exhaustivos de esto incluye la extensión de la vida del sujeto por cualquier período de tiempo, la disminución o el retraso del desarrollo neoplásico de la enfermedad, la disminución de la hiperproliferación, la reducción del crecimiento del tumor, el retraso de las metástasis, la reducción de la tasa de proliferación de las células cancerosas o de las células tumorales, y la disminución del dolor del sujeto que puede atribuirse a la afección del sujeto.

A. Terapias adenovirales

Los expertos en la materia conocen bien cómo aplicar la administración adenoviral a situaciones in vivo y ex vivo. En el caso de los vectores virales, se suele preparar un stock de vectores virales. Dependiendo del tipo de virus y del título alcanzable, se administrarán al paciente de 1 a 100, de 10 a 50, de 100 a 1000, o hasta 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, 1 x 1011, 1 x 1012 o 1 x 1013 partículas infecciosas en una composición aceptable para uso farmacéutico como se analiza a continuación.

Se contemplan varias vías para varios tipos de tumores. Cuando se puede identificar una masa tumoral discreta, o un tumor sólido, se pueden adoptar diversos enfoques directos, locales y regionales. Por ejemplo, el tumor puede inyectarse directamente con el adenovirus. Un lecho tumoral puede ser tratado antes, durante o después de la extirpación y/o de otro(s) tratamiento(s). Después de la extirpación o de otro(s) tratamiento(s), en general se administra el adenovirus mediante un catéter que tiene acceso al tumor o al sitio de tumor residual después de la cirugía. Se puede utilizar la vasculatura tumoral para introducir el vector en el tumor inyectando una vena o arteria de soporte. También se puede utilizar una vía de suministro de sangre más distal.

El procedimiento de tratamiento del cáncer incluye el tratamiento de un tumor así como el tratamiento de la región cercana o alrededor del tumor. En esta aplicación, el término "sitio de tumor residual" indica un área que es adyacente a un tumor. Esta zona puede incluir las cavidades corporales en las que se encuentra el tumor, así como las células y el tejido que se encuentran junto al tumor.

B. Formulaciones y vías de administración a los pacientes

Cuando se contemplen aplicaciones clínicas, será necesario preparar composiciones farmacéuticas en una forma apropiada para la aplicación prevista. Por lo general, esto implicará la preparación de composiciones que estén esencialmente libres de pirógenos, así como de otras impurezas que puedan ser perjudiciales para los seres humanos o los animales.

Las composiciones activas de la presente invención pueden incluir preparados farmacéuticos clásicos. Por lo general, se desea emplear sales y tampones apropiados para que los vectores de suministro sean estables y permitan su captación por parte de las células diana. Las composiciones acuosas de la presente invención comprenden una cantidad efectiva del vector a las células, disuelta o dispersada en un vehículo o medio acuoso aceptable para uso farmacéutico. Estas composiciones también se denominan inóculos. La frase "aceptable para uso farmacéutico o farmacológico" se refiere a entidades y composiciones moleculares que no producen reacciones adversas, alérgicas o de otro tipo cuando se administran a un animal o a un ser humano. Como se utiliza en el presente documento, el "vehículo aceptable para uso farmacéutico" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares. El uso de tales medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Salvo en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con la presente invención, se contempla su uso en composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar a las composiciones principios activos suplementarios.

La administración de estas composiciones de acuerdo con la presente invención se realizará por una vía apropiada, pero está particularmente dirigida a la administración intracraneal/intratumoral. La administración puede ser por inyección o infusión, véase Kruse et al. (1994), que se incorporan específicamente por referencia, para los procedimientos de realizar la administración intracraneal. Dichas composiciones se administrarían normalmente como composiciones aceptables para uso farmacéutico.

Una cantidad eficaz del agente terapéutico se determina en función del objetivo previsto, por ejemplo, la eliminación de las células tumorales. El término "dosis unitaria" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas para su uso en un sujeto, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de la composición terapéutica calculada para producir las respuestas deseadas, analizada anteriormente, en asociación con su administración, es decir, la vía y el régimen de tratamiento apropiados. La cantidad a administrar, tanto en función del número de tratamientos como de la dosis unitaria, depende del sujeto a tratar, del estado del mismo y de la protección deseada. Las cantidades precisas de la composición terapéutica también dependen del criterio del profesional y son propias de cada persona. Los virus modificados de la presente invención pueden administrarse directamente a los animales o, alternativamente, administrarse a células que posteriormente se administran a los animales.

Como se utiliza en el presente documento, el término administración in vitro se refiere a las manipulaciones realizadas en células extraídas de un animal, incluyendo, pero sin limitarse a, células en cultivo. El término administración ex vivo se refiere a las células que han sido manipuladas in vitro y que posteriormente se administran a un animal vivo. El término administración in vivo incluye todas las manipulaciones realizadas en células dentro de un animal. En ciertos aspectos de la presente invención, las composiciones pueden administrarse in vitro, ex vivo o in vivo. Un ejemplo de administración in vivo incluye la inyección directa de tumores con las presentes composiciones por administración intracraneal para matar selectivamente las células tumorales.

La inyección intratumoral o la inyección en la vasculatura del tumor se contemplan específicamente para tumores discretos, sólidos y accesibles, incluyendo el tumor expuesto durante la cirugía. Para los tumores de 1,5 a 5 cm de diámetro, el volumen de inyección será de 1 a 3 cc, preferentemente 3 cc. Para los tumores de más de 5 cm de diámetro, el volumen de inyección será de 4 a 10 cc, preferentemente 5 cc. Las inyecciones múltiples administradas como dosis única comprenden volúmenes de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,5 ml, preferentemente 0,2 ml. Las partículas virales pueden ponerse en contacto ventajosamente administrando múltiples inyecciones en el tumor, espaciadas a intervalos de aproximadamente 1 cm.

En el caso de una intervención quirúrgica, la presente invención puede utilizarse de forma preoperatoria, para hacer que un tumor inoperable sea objeto de extirpación. Alternativamente, la presente invención puede utilizarse en el momento de la cirugía, y/o posteriormente, para tratar la enfermedad residual o metastásica. Por ejemplo, un lecho tumoral resecado puede ser inyectado o perfundido con una formulación que comprende el adenovirus. La perfusión puede continuar después de la extirpación, por ejemplo, dejando un catéter implantado en el sitio de la cirugía. También se prevé un tratamiento postquirúrgico periódico.

La administración continua, preferentemente a través de un cateterismo, también puede aplicarse cuando sea apropiado, por ejemplo, cuando se extirpa un tumor y se trata el lecho tumoral para eliminar la enfermedad residual y microscópica. Dicha perfusión continua puede tener lugar durante un período de aproximadamente 1-2 horas, a aproximadamente 2-6 horas, a aproximadamente 6-12 horas, a aproximadamente 12-24 horas, a aproximadamente 1-2 días, a aproximadamente 1-2 semanas o más después del inicio del tratamiento. En general, la dosis de la composición terapéutica a través de la perfusión continua será equivalente a la administrada mediante una o varias inyecciones, ajustada a lo largo de un período de tiempo durante el cual se produce la perfusión.

Los regímenes de tratamiento también pueden variar, y a menudo dependen del tipo de tumor, ubicación del tumor, progresión de la enfermedad y la salud y edad del paciente. Evidentemente, ciertos tipos de tumores requerirán un tratamiento más agresivo, mientras que, al mismo tiempo, ciertos pacientes no pueden tolerar protocolos más exigentes. El clínico será el más indicado para tomar estas decisiones en base a la eficacia y la toxicidad conocidas (si las hay) de las formulaciones terapéuticas.

Las soluciones de los compuestos activos como base libre o sales aceptables para uso farmacológico pueden prepararse en agua convenientemente mezclada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también pueden prepararse en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estos preparados contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

Las composiciones terapéuticas de la presente invención se administran ventajosamente en forma de composiciones inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para la solución en, o la suspensión en, líquido antes de la inyección. Estos preparados también pueden estar emulsionados. Una composición típica para tal fin comprende un vehículo aceptable para uso farmacéutico. Por ejemplo, la composición puede contener 10 mg, 25 mg, 50 mg o hasta unos 100 mg de albúmina sérica humana por mililitro de solución salina tamponada con fosfato. Otros vehículos aceptables para uso farmacéutico incluyen soluciones acuosas, excipientes no tóxicos, incluyendo sales, conservantes, tampones y similares. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal y ésteres orgánicos inyectables tal como etiloleato. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, soluciones salinas, vehículos parenterales tal como cloruro de sodio o dextrosa de Ringer. Los vehículos intravenosos incluyen reposición de fluidos y nutrientes. Los conservantes incluyen agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes. El pH y la concentración exacta de los distintos componentes de la composición farmacéutica se ajustan según parámetros bien conocidos. Cuando la vía es tópica, la forma puede ser una crema, una pomada o un ungüento.

C. Terapia combinada

La resistencia de las células tumorales a diversas terapias representa un problema importante en la oncología clínica. Uno de los objetivos de la investigación actual sobre el cáncer es encontrar formas de mejorar la eficacia de la quimioterapia y la radioterapia, así como de otras terapias convencionales contra el cáncer. Una de ellas es la combinación de estas terapias tradicionales con la terapia con adenovirus oncolíticos. La terapia tradicional para tratar los cánceres puede incluir la extirpación de todo o parte del órgano afectado, irradiación de haz externo, fotocoagulación con arco de xenón y láser de argón, crioterapia, inmunoterapia y quimioterapia. La elección del tratamiento depende de múltiples factores, tales como, 1) enfermedad multifocal o unifocal, 2) sitio y tamaño del tumor, 3) metástasis de la enfermedad, 4) edad del paciente o 5) hallazgos histopatológicos (The Genetic Basis of Human Cancer, 1998).

En el contexto de la presente invención, se contempla que la terapia adenoviral podría utilizarse junto con agentes anticancerígenos, incluida la intervención quimioterapéutica o radioterapéutica, así como las técnicas de radiodiagnóstico. También puede resultar eficaz combinar la terapia con virus oncolíticos con la inmunoterapia. Una célula "diana" que entra en contacto con un virus oncolítico mutante y, opcionalmente, con al menos otro agente, puede matar células, inhibir el crecimiento celular, inhibir la metástasis, inhibir la angiogénesis o revertir o reducir de otro modo un fenotipo hiperproliferativo de las células diana. Estas composiciones se proporcionarían en una cantidad combinada eficaz para matar o inhibir la proliferación de la célula diana. Este proceso puede implicar el contacto de las células con el constructo de expresión y el/los agente(s) o factor(es) en el mismo o en diferentes momentos. Esto puede conseguirse poniendo en contacto la célula con una única composición o formulación farmacológica que incluya ambos agentes, o poniendo en contacto la célula con dos composiciones o formulaciones distintas, en las que una composición incluye el adenvirus oncolítico y la otra incluye el segundo agente.

La terapia adenoviral oncolítica también puede combinarse con la inmunosupresión. La inmunosupresión puede realizarse como se describe en el documento WO 96/12406). Algunos ejemplos de agentes inmunosupresores son ciclosporina, FK506, ciclofosfamida y metotrexato.

Alternativamente, un tratamiento con adenovirus oncolítico puede preceder o seguir al segundo agente o tratamiento en intervalos que van desde minutos hasta semanas. En las realizaciones en las que el segundo agente y el adenovirus oncolítico se aplican por separado a la célula, uno se aseguraría en general de que no transcurriera un período de tiempo significativo entre el momento de cada adminsitración, de manera que el segundo agente y el adenovirus oncolítico aún pudieran ejercer un efecto combinado ventajoso en la célula. En estos casos, se contempla que se contacte con la célula con ambas modalidades con un intervalo de 12-24 horas y, más preferentemente, con un intervalo de 6-12 horas, siendo preferente un tiempo de retraso de sólo 12 horas. Sin embargo, en algunas situaciones, puede ser conveniente prolongar significativamente el período de tratamiento, cuando transcurren desde varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7) hasta varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) entre las respectivas administraciones.

También es concebible que se desee más de una administración del adenovirus oncolítico y/o del segundo agente. Pueden emplearse varias combinaciones, en las que el adenovirus oncolítico es "A" y el otro agente es "B", como se ejemplifica a continuación:

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B

A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A B/A/B/A B/A/B/B/A

A/A/B B/A/A A/B/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B

Se contemplan otras combinaciones. Una vez más, para lograr la muerte de las células, ambos agentes se administran a una célula en una cantidad combinada eficaz para matar la célula.

Los agentes o factores adecuados para su uso en una terapia combinada son cualquier agente antiangiogénico y/o cualquier compuesto químico o procedimiento de tratamiento con actividad anticancerosa; por lo tanto, el término "agente anticanceroso" que se utiliza a lo largo de esta solicitud se refiere a un agente con actividad anticancerosa. Estos compuestos o procedimientos incluyen agentes alquilantes, inhibidores de la topoisomerasa I, inhibidores de la topoisomerasa II, antimetabolitos del ^a Rⁿ/ADN, antimetabolitos del ADN, agentes antimitóticos, así como agentes que dañan el ADN, que inducen daños en el ADN cuando se aplican a una célula.

Ejemplos de fármacos y pro-fármacos de quimioterapia incluyen, CPT11, temozolomida, compuestos de platina y pro-fármacos tal como 5-FC. Los ejemplos de agentes alquilantes incluyen, entre otros, cloroambucil, cis-platino, ciclodisona, flurodopan, metil CCNU, piperazinediona, teroxirona. Los inhibidores de la topoisomerasa I abarcan compuestos como la camptotecina y sus derivados, así como la morfolinodoxorrubicina. Doxorrubicina, pirazoloacridina, mitoxantrona y rubidazona son ejemplos de inhibidores de la topoisomerasa II. Los antimetabolitos del ARN/ADN incluyen L-alanosina, 5-fluoraouracilo, derivados de aminopterina, metotrexato y pirazofurina; mientras que el grupo de antimetabolitos del ADN abarca, por ejemplo, ara-C, guanozol, hidroxiurea y tiopurina. Los agentes antimitóticos típicos son colchicina, rizoxina, taxol y sulfato de vinblastina. Otros agentes y factores son las radiaciones y las ondas que inducen daños en el ADN, tal como la irradiación ^y, rayos X, irradiación UV, microondas, emisiones electrónicas, etc. Una variedad de agentes anticancerígenos, también descritos como "agentes quimioterapéuticos", funcionan para inducir daños en el ADN, todos los cuales están destinados a ser utilizados en los procedimientos de tratamiento combinados aquí divulgados. Los agentes quimioterapéuticos contemplados para su uso incluyen, por ejemplo, adriamicina, bleomicina, 5-fluorouracilo (5-FU), etopósido (VP-16), camptotecina, actinomicina-D, mitomicina C, cisplatino (CDDP), podofilotoxina, verapamilo e incluso peróxido de hidrógeno. La invención también abarca el uso de una combinación de uno o más agentes dañinos para el ADN, ya sea a base de radiación o compuestos reales, como el uso de rayos X con cisplatino o el uso de cisplatino con etopósido.

En el tratamiento del pre-cáncer o cáncer según la invención, se pondría en contacto las células de una lesión precancerosa o las células tumorales con un agente además del adenovirus oncolítico. Esto puede lograrse irradiando el sitio del tumor localizado con radiaciones tal como rayos X, luz ultravioleta, rayos y o incluso microondas. Alternativamente, las células pueden ponerse en contacto con el agente administrando al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprenda un compuesto tal como adriamicina, bleomicina, 5-fluorouracilo, etopósido, camptotecina, actinomicina-D, mitomicina C, podofilotoxina, verapamilo o, más preferentemente, cisplatino. El agente puede prepararse y utilizarse como una composición terapéutica combinada, o kit, combinándolo con un adenovirus oncolítico.

Se prevé que los agentes que reticulan directamente los ácidos nucleicos, específicamente el ADN, faciliten el daño al ADN, lo que conduce a una combinación sinérgica y antineoplásica con un adenovirus oncolítico. Pueden utilizarse agentes de cisplatino, tal como cisplatino, y otros agentes alquilantes del ADN. El cisplatino se ha utilizado ampliamente para tratar el cáncer, con dosis eficaces utilizadas en las aplicaciones clínicas de 20 mg/m2 durante 5 días cada tres semanas para un total de tres cursos. El cisplatino no se absorbe por vía oral y, por lo tanto, debe administrarse por inyección intravenosa, subcutánea, intratumoral o intraperitoneal. Bleomicina y mitomicina C son otros agentes anticancerígenos que se administran por inyección intravenosa, subcutánea, intratumoral o intraperitoneal. Una dosis típica de bleomicina es de 10 mg/m2, mientras que dicha dosis para mitomicina C es de 20 mg/m2.

Los agentes que dañan el ADN también incluyen compuestos que interfieren con la replicación del ADN, la mitosis y la segregación cromosómica. Dichos compuestos quimioterapéuticos incluyen adriamicina, también conocida como doxorrubicina, etopósido, verapamilo, podofilotoxina y otros similares. Ampliamente utilizados en el ámbito clínico para el tratamiento de neoplasias, estos compuestos se administran mediante inyecciones en bolo por vía intravenosa a dosis que van desde 25-75 mg/m2 a intervalos de 21 días para la adriamicina, hasta 35-50 mg/m2 para el etopósido por vía intravenosa o el doble de la dosis intravenosa por vía oral.

Los agentes que interrumpen la síntesis y la fidelidad de los precursores y subunidades del ácido nucleico también provocan daños en el ADN. Por ello, se han desarrollado varios precursores de ácidos nucleicos. Resultan especialmente útiles los agentes que han sido sometidos a extensas pruebas y que están fácilmente disponibles. Así, agentes como 5-fluorouracilo (5-FU), son utilizados preferentemente por el tejido neoplásico, lo que hace que este agente sea especialmente útil para dirigirse a las células neoplásicas. Aunque es bastante tóxico, 5-FU, es aplicable en una amplia gama de vehículos, incluyendo el tópico, sin embargo la administración intravenosa con dosis que van de 3 a 15 mg/kg/día es comúnmente utilizada o como alternativa 5-FC puede ser administrado y convertido en un tejido o célula diana.

Otros factores que causan daños en el ADN y que se han utilizado ampliamente incluyen los comúnmente conocidos como rayos ^y, rayos X, y/o la administración dirigida de radioisótopos a las células tumorales. También se contemplan otras formas de factores dañinos para el ADN, tal como microondas e irradiación UV. Lo más probable es que todos estos factores afecten a una amplia gama de daños en el ADN, en los precursores del ADN, en la replicación y reparación del ADN y en el ensamblaje y mantenimiento de los cromosomas. Los intervalos de dosis de los rayos X van desde dosis diarias de 50 a 200 roentgens durante periodos de tiempo prolongados (3 a 4 semanas), hasta dosis únicas de 2000 a 6000 roentgens. Los intervalos de dosis de los radioisótopos varían mucho y dependen de la vida media del isótopo, de la potencia y el tipo de radiación emitida y de la captación por parte de las células neoplásicas.

La inmunoterapia puede utilizarse como parte de una terapia combinada, junto con la terapia mediada por el virus oncolítico mutante. El enfoque general de la terapia combinada se analiza a continuación. Por lo general, la célula tumoral debe llevar algún marcador que sea susceptible de ser dirigido, es decir, que no esté presente en la mayoría de las demás células. Existen muchos marcadores tumorales y cualquiera de ellos puede ser adecuado para ser dirigido en el contexto de la presente invención. Los marcadores tumorales más comunes son el antígeno carcinoembrionario, antígeno específico de la próstata, antígeno urinario asociado al tumor, antígeno fetal, tirosinasa (p97), gp68, TAG-72, HMFG, antígeno sialil Lewis, MucA, MucB, PLAP, receptor de estrógenos, receptor de laminina, erb B y p155. Los anticuerpos específicos para CAR, integrinas u otras moléculas de la superficie celular, pueden utilizarse para identificar las células que el adenovirus podría infectar bien. CAR es una proteína receptora de adenovirus. La base pentón del adenovirus media en la adhesión viral a los receptores de integrina y en la internalización de la partícula.

El artesano experto se dirige a "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15a edición, 1980. La dosis variará necesariamente en función del estado del sujeto tratado. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis adecuada para cada sujeto. Además, para su administración en humanos, los preparados deben cumplir con las normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza exigidas por las normas de la Oficina de Biológicos de la FDA.

Además de combinar las terapias con adenovirus oncolíticos con quimioterapia y radioterapia, también se contempla que la combinación con otras terapias génicas será ventajosa. Por ejemplo, la focalización de un adenovirus oncolítico en combinación con la focalización de p53 al mismo tiempo puede producir un tratamiento anticanceroso mejorado. Cualquier gen o ácido nucleico relacionado con los tumores que codifique un polipéptido puede dirigirse de esta manera, por ejemplo, p21, Rb, APC, DCC, NF-1, NF-2, BCRA2, p16, FHIT, WT-1, MEN-I, MEN-II, BRCA1, VHL, FCC, MCC, ras, myc, neu, raf, erb, src, fms, jun, trk, ret, gsp, hst, bcl y abl.

Las terapias antiangiogénicas también pueden combinarse ventajosamente con las terapias con adenovirus oncolíticos aquí divulgadas. En concreto, Bevacizumab (Avastin®), Genentech/Roche) es un inhibidor de la angiogénesis, un fármaco que frena el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. Está autorizado para tratar varios tipos de cáncer, incluido el colorrectal, el de pulmón, el de mama (fuera de EE.UU.), el glioblastoma (EE.UU. y Japón), el de riñón y el de ovario. Bevacizumab es un anticuerpo monoclonal humanizado que inhibe el factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A). VEGF-A es una señal química que estimula la angiogénesis en diversas enfermedades, especialmente en el cáncer. Bevacizumab fue el primer inhibidor de la angiogénesis disponible clínicamente en Estados Unidos.

Se contempla además que las terapias descritas anteriormente pueden ser implementadas en combinación con todos los tipos de cirugía. Aproximadamente el 60% de las personas con cáncer se someterán a algún tipo de cirugía, que incluye la cirugía preventiva, de diagnóstico o estadificación, curativa y paliativa. Estos tipos de cirugía pueden utilizarse junto con otras terapias, tal como terapias con adenovirus oncolíticos.

La cirugía curativa incluye la extirpación en la que todo o parte del tejido canceroso es físicamente retirado, extirpado y/o destruido. La extirpación de un tumor se refiere a la extirpación física de al menos una parte del mismo. Además de la extirpación del tumor, el tratamiento mediante cirugía incluye cirugía láser, criocirugía, electrocirugía y cirugía controlada por microscopio (cirugía de Mohs). Se contempla además que la presente invención puede utilizarse junto con la extirpación de cánceres superficiales, precánceres o cantidades incidentales de tejido normal.

Tras la escisión de una parte o de la totalidad de las células cancerosas, del tejido o del tumor, se puede formar una cavidad en el cuerpo. El tratamiento puede realizarse mediante perfusión, inyección directa, administración sistémica o aplicación local de la zona con una terapia anticancerosa adicional. Dicho tratamiento puede repetirse, por ejemplo, cada 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, o cada 1, 2, 3, 4 y 5 semanas o cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses. Estos tratamientos también pueden ser de diferentes dosis. Además, en los tratamientos que incluyen más de un tipo de tratamiento (es decir, constructo, agente anticanceroso y cirugía), el tiempo entre dichos tipos de tratamiento puede estar separado por aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, o por aproximadamente 24 horas; con un intervalo de 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días; con un intervalo de 1, 2, 3, 4 o 5 semanas; y con un intervalo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses, o más.

También debe señalarse que cualquiera de las terapias anteriores puede resultar útil por sí misma. A este respecto, la referencia a los quimioterapéuticos y a la terapia con virus oncolíticos no mutantes en combinación también debe interpretarse como que estos enfoques pueden emplearse por separado.

IV. PROCEDIMIENTOS DE CRIBADO

Con el adenovirus A24 y otros adenovirus mutantes que son incapaces de unirse a Rb, es necesario que la vía de Rb sea defectuosa para que la célula transcriba y traduzca las proteínas virales. Se requiere que la vía de Rb sea defectuosa en el sentido de que no sea capaz de reprimir la actividad activadora de la transcripción de E2F. E2F activa la transcripción de los genes celulares y del ADN adenoviral si no se reprime su actividad. Ejemplos de formas en las que E2F podría escapar a la represión incluyen, pero no se limitan a, que Rb no sea capaz de unirse a E2F (es decir, que E1A se una a Rb), la sobreexpresión de E2F, menos Rb que E2F y situaciones en las que Rb permanece fosforilada.

Además, los presentes inventores han observado que la identificación de una respuesta inmunitaria polarizada Th1 en los sujetos es predictiva del éxito del tratamiento con los adenovirus oncolíticos de la presente invención. Además, la presencia de la respuesta Th2 puede ser un indicador de falta de respuesta. Un marcador Th1 particular es IL-12p70. Además, se pueden evaluar los niveles altos de anticuerpos contra antígenos asociados al tumor, tal como NLRP4, y si se encuentran predicen la respuesta a la terapia viral oncolítica.

Los marcadores Th1 incluyen IL-1p, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, IFN-^y, TNF-a, TNF-p, GMCSF, caspasa 3 escindida, neopterina y p2-microglobuina. Los marcadores de superficie Th1 incluyen las cadenas p1 y a de receptores CXCR3, CCR5, CCR1 e IL-12. Los marcadores Th2 incluyen IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, TGFp y STAT3 fosforilado. Los marcadores de superficie Th2 incluyen CXCR4, CCR3, CCR4, CCR7, CCR8, receptor de IL-1 y CD30. Los antígenos asociados a los tumores incluyen BRAF, CABYR, CRISP3, CSAG3, CTAG2, DHFR, FTHL17, GAGE1, LDHC, MAGEA1, MAGEA3, MAGEA4, MAGEB6, MAPK1, MICA, MUC1, NLPR4, NYES01, P53, PBK, PRAME, SOX2, SPANXA1, SSX2, SSX4, SSX5, TSGA10, TSSK6, TULP2, XAGE2 y ZNF165. En particular, se examinan 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o los 8 de CABYR, MAGEA1, MAGEA3, MAGEB6, NLPR4, NYES01, PBK y ZNF165.

Los anticuerpos pueden utilizarse para detectar proteínas adenovirales (por ejemplo, E1A), Rb y otras proteínas de la vía de Rb, la respuesta Th1, la respuesta Th2 o los antígenos asociados al tumor. En ciertos aspectos de la invención, se pueden producir uno o más anticuerpos que sean inmunorreactivos con múltiples antígenos. Estos anticuerpos pueden utilizarse en diversas aplicaciones diagnósticas o terapéuticas, descritas a continuación.

Como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo" pretende referirse ampliamente a cualquier agente de unión inmunológica tal como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. En general, son preferentes las IgG y/o las IgM porque son los anticuerpos más comunes en la situación fisiológica y porque son los más fáciles de fabricar en un laboratorio. Los medios para preparar y caracterizar anticuerpos también son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988).

Ciertas realizaciones de la invención proporcionan anticuerpos contra antígenos y proteínas traducidas, polipéptidos y péptidos que se unen a al menos un agente para formar un conjugado de anticuerpos. Para aumentar la eficacia de las moléculas de anticuerpos como agentes diagnósticos o terapéuticos, es convencional enlazar o unir covalentemente o formar un complejo con al menos una molécula o fracción deseada. Una molécula informadora se define como cualquier resto que puede ser detectado mediante un ensayo. Ejemplos no limitantes de moléculas informadoras que se han conjugado con anticuerpos incluyen enzimas, radiomarcadores, haptenos, marcadores fluorescentes, moléculas fosforescentes, moléculas quimioluminiscentes, cromóforos, moléculas luminiscentes, moléculas de fotoafinidad, partículas coloreadas o ligandos, tal como biotina.

Ciertos ejemplos de conjugados de anticuerpos son aquellos conjugados en los que el anticuerpo está unido a un marcador detectable. Los "marcadores detectables" son compuestos y/o elementos que pueden detectarse debido a sus propiedades funcionales específicas, y/o a sus características químicas, cuyo uso permite detectar el anticuerpo al que están unidas, y/o cuantificarlo posteriormente si se desea.

La expresión de Rb o de genes adenovirales en una población de células puede determinarse mediante un análisis western blot utilizando anticuerpos como sondas para las proteínas adenovirales. El nivel de proteínas víricas detectado indicaría si se está produciendo la expresión de proteínas víricas en la célula.

Pueden emplearse procedimientos de inmunodetección para detectar componentes biológicos tal como proteínas, polipéptidos o péptidos implicados en la replicación adenoviral o en las vías celulares de Rb o p53. Algunos procedimientos de inmunodetección son el ensayo inmunoenzimático (ELISA), el radioinmunoensayo (RIA), el ensayo inmunoradiométrico, el fluoroinmunoensayo, el ensayo quimioluminiscente, el ensayo bioluminiscente y el Western blot, por mencionar algunos. Las etapas de varios procedimientos útiles de inmunodetección se han descrito en la literatura científica, como, por ejemplo, Doolittle y Ben-Zeev (1999); Gulbis y Galand (1993); De Jager et al. (1993); Nakamura et al. (1987).

En cuanto a la detección de antígenos, la muestra biológica analizada puede ser cualquier muestra que se sospeche que contiene un antígeno, tal como, por ejemplo, una sección o muestra de tejido, un extracto de tejido homogeneizado, una célula, un orgánulo, formas separadas y/o purificadas de cualquiera de las composiciones que contienen antígenos mencionadas anteriormente, o incluso cualquier fluido biológico que entre en contacto con la célula o el tejido, incluida la sangre y/o el suero, aunque se prefieren las muestras o extractos de tejido.

En general, la detección de la formación de inmunocomplejos es bien conocida en la técnica y puede lograrse mediante la aplicación de numerosos enfoques. Estos procedimientos se basan en general en la detección de una etiqueta o marcador, como cualquiera de los marcadores radiactivos, fluorescentes, biológicos y enzimáticos. Entre las Patentes Estadounidenses relativas al uso de dichos marcadores se encuentran la 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 y 4.366.241). Por supuesto, se pueden encontrar ventajas adicionales mediante el uso de un ligando de unión secundario, tal como un segundo anticuerpo y/o una disposición de unión de ligando de biotina/avidina, como se conoce en la técnica.

Se puede realizar una biopsia de un tumor y las pruebas mencionadas anteriormente para determinar la presencia o ausencia de células de glioma, ya sea antes, durante o después del tratamiento. Un ejemplo de protocolo de biopsia es el siguiente. La biopsia estereotáctica consiste en la introducción precisa de una sonda metálica en el tumor cerebral, cortando un pequeño trozo del mismo y extrayéndolo para poder examinarlo al microscopio. El paciente es trasladado a la sala de exploración por MRI o cAt (tomografía computarizada), y el marco se fija al cuero cabelludo bajo anestesia local. Las "clavijas" del marco se sujetan a la mesa exterior del cráneo para una fijación rígida (el marco no se moverá ni podrá moverse desde ese punto hacia adelante hasta la finalización de la biopsia). Se obtiene la exploración (MRI o CT). El neurocirujano examina la exploración y determina la trayectoria o el camino más seguro hacia el objetivo. Esto significa evitar las estructuras críticas. Se determinan las coordenadas espaciales del objetivo y se elige la trayectoria óptima. La biopsia se realiza bajo anestesia general. Se realiza una pequeña incisión sobre el punto de entrada y se perfora un pequeño agujero a través del cráneo. Se perfora la "duramadre" y se introduce lentamente la sonda de biopsia en el objetivo. La muestra de la biopsia se retira y se coloca en líquido conservante para su examen al microscopio. A menudo, el patólogo está presente en la sala de biopsia para poder determinar rápidamente el éxito de la biopsia.

V. EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferentes de la invención. Los expertos en la técnica deberían apreciar que las técnicas divulgadas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por los inventores que funcionan bien en la práctica de la invención y, por lo tanto, se puede considerar que constituyen modos preferentes para su práctica. Sin embargo, los expertos en la materia deberían, a la luz de la presente divulgación, apreciar que se pueden hacer muchos cambios en las realizaciones específicas que se divulgan y seguir obteniendo un resultado igual o similar. Más específicamente, será aparente que ciertos agentes que están relacionados tanto química como fisiológicamente pueden ser sustituidos por los agentes descritos en el presente documento, mientras que los mismos o similares resultados se lograrían.

EJEMPLO 1 - PROCEDIMIENTOS

Se inició un estudio de fase 1, de incremento escalonado en la dosis, en dos partes, de DNX-2401 para el glioma de alto grado bajo un IND patrocinado por el investigador en MD Anderson Cancer Center de Houston, Texas. Para poder participar en el estudio, los pacientes debían tener un glioma maligno de alto grado comprobado histológicamente. El grupo A del estudio evaluó la inyección intratumoral directa de una dosis única de DNX-2401 en una zona de crecimiento de un glioma recurrente confirmado por biopsia, mientras que el grupo B evaluó la inyección de una dosis dividida del virus en el lecho de extirpación tras la escisión del glioma. La dosis inicial para ambos grupos del estudio fue de 107 (por ejemplo, 1 x 107) partículas virales (vp), con un plan para incrementar en forma escalonada la dosis en incrementos de medio logaritmo hasta 310 vp. Los objetivos principales del estudio eran determinar la seguridad, la tolerabilidad, la viabilidad y el efecto biológico de la inyección de DNX-2401 en tumores cerebrales humanos in situ.

Los pacientes del Grupo A recibieron una inyección intratumoral directa a través de una aguja y se sometieron a un incremento escalonado en la dosis estándar por cohorte. Los tumores pueden ser o no extirpables quirúrgicamente. Los niveles de dosis asignados fueron: 1 x 107, 3 x 107, 1 x 108, 3 x 108, 1 x 109, 3 x 109, 1 x 1010 y 3 x 1010 partículas virales (vp). Los pacientes fueron observados durante 28 días después de la inyección del virus antes de que los pacientes de la siguiente cohorte fueran inscritos y tratados.

El grupo B sólo incluyó pacientes con tumores extirpables. Los pacientes del grupo B recibieron una inyección intratumoral directa a través de un catéter implantado de forma permanente en el centro del tumor y, a continuación, se sometieron a un incremento escalonado en la dosis estándar por cohorte (es decir, niveles de dosis de 1 x 107, 3 x 107, 1 x 108, 3 x 108, 1 x 109, 3 x 109, 1 x 1010 y 3 x 1010 partículas virales (vp)). El incremento escalonado en la dosis para el grupo B fue similar a la del grupo A, excepto que el grupo B se retrasó respecto al grupo A en un nivel de dosis. Los pacientes del Grupo A no se incluyeron en el Grupo B. Tras 14 días de observación, el tumor se resecó en bloque con el catéter colocado para proporcionar muestras biológicas para los análisis patológicos y moleculares. Tras la extirpación del tumor, se inyectó DNX-2401 adicional en el tumor residual que rodeaba la cavidad de extirpaciónfes decir, inyección intramural en el lecho tumoral).

El grupo A completó la inscripción de 25 sujetos en septiembre de 2012. La dosis máxima alcanzada fue de 3 x 1010 vp, como estaba previsto. La inscripción en el grupo B, que evaluó el DNX-2401 como complemento de la cirugía, se inició más tarde y en él se inscribieron 12 sujetos con la dosis máxima de 3 x108 vp. El seguimiento se programó a intervalos mensuales durante 4 meses, cada 2 meses durante 2 años, y cada 4 meses de por vida a partir de entonces para ambos grupos de tratamiento. Los pacientes fueron y serán monitorizados para detectar toxicidad y síntomas, y evaluados mediante imágenes de resonancia magnética (MRI), punción lumbar y otras pruebas según los estándares clínicos de atención durante la duración del estudio.

EJEMPLO 2 - RESULTADOS

Las evaluaciones del estudio para ambos grupos de tratamiento se realizaron en intervalos de tiempo regulares como se indica en el programa de evaluaciones. Los datos se registraron en formularios electrónicos de informe de casos según las normas del MD Anderson y se supervisaron intrainstitucionalmente a través de la oficina de IND de MD Anderson aproximadamente cada 4 semanas. Los datos presentados no están auditados y deben considerarse preliminares en este momento.

Alcance de la exposición. La máxima exposición al virus para un paciente del grupo A consistió en 3 x 1010 vp tras la administración intratumoral (4 pacientes). Se administró una dosis máxima de 6 x 108 vp a tres pacientes del grupo B.

Tabla 1 - Exposición

Tabla 2 - Disposición de pacientes

Se inscribieron un total de 37 pacientes, con 25 pacientes tratados en el grupo A (administración intratumoral de DNX-2401) y 12 pacientes tratados en el grupo B (administración intratumoral/intramural de DNX-2401). A fecha de marzo de 2013, dos de los 25 pacientes tratados en el grupo A y uno de los 12 pacientes tratados en el grupo B siguen en el estudio y son seguidos según el protocolo.

De los 37 inscritos, 29 pacientes tenían glioblastoma confirmado histológicamente, siete tenían astrocitoma anaplásico y un paciente tenía gliosarcoma. Al entrar en el estudio, 27 pacientes habían experimentado una primera recidiva y en 10 pacientes la recidiva del tumor se había producido dos veces. En cuanto al deterioro funcional, se informó de una puntuación de Karnofsky de 90-100 en 28 pacientes (20 pacientes del grupo A y ocho del grupo B) y de una puntuación de Karnofsky de 70-80 en nueve pacientes (cinco del grupo A y cuatro del grupo B).

Grupo A (25 inscritos). Todos los pacientes que tenían un tumor medible y completaron un tratamiento de dosis única se consideraron evaluables para la respuesta (N=25). Los pacientes con glioma de alto grado recurrente confirmado histopatológicamente recibían un tratamiento previo intensivo de la enfermedad en el momento de la inscripción en el estudio. Todos los pacientes habían recibido radioterapia con temozolomida concomitante.

Todos los pacientes (que pueden o no ser accesibles quirúrgicamente) completaron el tratamiento con éxito (N=25) hasta una dosis de 3 x 1010 vp. Aunque se trata de un estudio de incremento escalonado en la dosis que abarca cuatro órdenes de magnitud, todos los pacientes se incluyeron en el análisis de eficacia. Se observó una respuesta completa (CR) en 4 (16%) pacientes, una respuesta parcial (PR) en 2 (8%), una enfermedad estable (SD) en 7 (28%) y una enfermedad progresiva (PD) en 12 (48%). Se observó un beneficio clínico (CR+PR+SD) en 13 (52%) de los pacientes. La dosis más baja a la que se observó una respuesta (CR) según los criterios de RANO fue a 1 x 108 vp (cohorte 3). Este paciente fue declarado con respuesta completa y está vivo y en estudio a los 38 meses después del tratamiento con DNX-2401. La segunda CR fue en la cohorte 7 con una dosis de 1e10 vp.

Todos los pacientes se incluyeron en un análisis de PFS (sobrevida libre de progresión) y OS (sobrevida global). Un total de 7 (28%) pacientes lograron al menos 6 meses de sobrevida libre de progresión (PFS-6). La mediana de la OS para todos los sujetos fue de 8 meses y 1 año. La OS fue del 32%, con 1 paciente vivo (5,5 meses) que aún no ha alcanzado la marca de sobrevida de un año. La mediana de la OS de los respondedores (CR+PR) fue de 14 meses. Seis patentes (24%, 2 CR, 1 PR, 3 SD) permanecen vivas en marzo de 2013, 5 de las cuales han sobrevivido más de un año al tratamiento.

Grupo B (12 inscritos). Los pacientes con glioma de alto grado recurrente confirmado histopatológicamente recibieron un tratamiento previo importante en el momento de la inscripción. Todos los pacientes habían recibido radioterapia con temozolomida concomitante.

Todos los pacientes completaron el tratamiento con éxito (N=12) hasta una dosis de 3 x 108 vp (para una exposición total de 6 x 108 vp administrados fraccionadamente en los días 0 y 14). Tres pacientes (25%) tenían enfermedad medible tras la extirpación 14 días después de la inyección intratumoral, y 9 (75%) pacientes no tenían enfermedad medible como resultado de la cirugía. De los 3 pacientes con enfermedad medible, se logró una respuesta parcial (RP) en 1 y una enfermedad estable (SD) en 2 pacientes. De los 9 pacientes (75%) sin enfermedad medible, 5 (56%) pacientes presentaban una enfermedad estable (SD), que se determinó por la ausencia de recidiva. El beneficio clínico (CR+PR+SD) para todos los pacientes del brazo B fue del 66%. En general, al menos 3 (25%) pacientes estaban libres de progresión a los 6 meses. Siete (58%) de los pacientes siguen vivos en marzo de 2013.

Mecanismo de respuesta tumoral. Las principales ventajas de la administración única de DNX-2401 como monoterapia para el glioma de alto grado recurrente incluyen

• Respuesta antitumoral persistente con cambios característicos en MRI

• Efectos secundarios tóxicos mínimos, si es que los hay, lo que mejora la calidad de vida del paciente

• No excluye el uso de otros agentes o tratamientos anticancerosos en combinación

• Potencial de respuesta antitumoral completa

La respuesta del tumor a la terapia parece ir acompañada de cambios de firma en la MRI de contraste. Estos incluyen cambios tempranos y globales en el patrón de contraste ("racimo de uvas"), seguidos en algunos casos por la aparición de un patrón de "hilo" o lo que se asemeja a "burbujas de jabón" Varios meses después del tratamiento con DNX-2401, varios tumores parecen progresar y tienen bordes menos definidos. Ahora se piensa que esto es causado por la inflamación, como la que se observa con otros productos de inmunoterapia. A continuación, el tumor se transformará en un tumor más definido y de menor tamaño que, en algunos casos, se convertirá en una respuesta completa.

La evidencia de que los cambios característicos en la MRI observados durante este ensayo están relacionados con la respuesta se deriva, en parte, de los informes de patología de los tumores resecados quirúrgicamente. Dos tumores fueron resecados varios meses después del tratamiento con DNX-2401 en respuesta a lo que parecía ser una progresión del tumor. En ambos casos, los patólogos informaron de que los tumores estaban destruidos en más de un 80% ("necrosis relacionada con el tratamiento") y que el tumor restante estaba infiltrado por una mezcla de células inmunitarias (que posteriormente se demostró que eran predominantemente células T CD8). Esto nos sugiere que la infección por DNX-2401 puede estar desencadenando una respuesta inmunitaria antitumoral eficaz o desestabilizando el tumor. Si este hallazgo se confirma, podría explicar la persistencia de los efectos antigliomatosos observados (mediante exploraciones por MRI y/o extirpación posterior al tratamiento) en los tumores de varios sujetos tras una única inyección de DNX-2401.

La respuesta antitumoral al tratamiento es un criterio de valoración especialmente importante en esta enfermedad, ya que el desplazamiento del tejido cerebral normal debido al rápido crecimiento del tumor acaba provocando una discapacidad grave y la muerte. En general, existe una gran necesidad insatisfecha de una nueva modalidad de ataque al gliobastoma que, con una morbilidad mínima, pueda tener un impacto positivo en el curso de la enfermedad. Como nuevo agente asociado a menos efectos adversos, al tiempo que disminuye el riesgo de resistencia a los fármacos y la toxicidad fuera del objetivo, DNX-2401 tiene el potencial de ser más seguro y eficaz que las terapias actuales para el gliobastoma recurrente. Además, parece superar incluso la eficacia de Avastin®, que alcanzó una tasa de respuesta objetiva del 25,9% (22/85). Veintidós pacientes lograron una remisión parcial, con una duración media de la respuesta de 4,2 meses.

Biomarcadores e inmunidad antitumoral. La experiencia adquirida durante el ensayo clínico de fase I ha revelado una interesante correlación entre los pacientes que respondieron a la terapia oncolítica del DNX-2401 y los que no lo hicieron. Esta correlación se basó en los ensayos de suero para los anticuerpos contra los antígenos relacionados con el cáncer (CRA). Dado que los antígenos CRA no están presentes en el tejido normal y son "activados" por los cánceres a medida que progresan, son informativos sobre la naturaleza de la enfermedad dentro del cáncer.

Los inventores analizaron a los pacientes que entraban en el ensayo clínico de fase I para detectar la presencia o ausencia de anticuerpos contra 31 ACR distintos. Buscaron específicamente a los pacientes que expresaban anticuerpos para estos antígenos antes de recibir DNX-2401 y también a los pacientes que desarrollaron anticuerpos después del tratamiento. Sorprendentemente, los pacientes con tumores que tuvieron una respuesta radiográfica a DNX-2401 tuvieron una respuesta de anticuerpos humoral baja o nula al conjunto definido de antígenos tumorales

La falta de una respuesta de anticuerpos sugirió que la respuesta a la terapia con DNX-2401 puede basarse en una respuesta inmunitaria celular frente a la humoral. Por ello, los inventores observaron el perfil de citoquinas de los respondedores frente a los no respondedores con la expectativa de que los respondedores fuertes mostrarían más una polarización Th1 (células T8 citotóxicas) y los no respondedores mostrarían un perfil más consistente con un perfil Th2 (productor de anticuerpos). En general, la respuesta Th1 se caracteriza por un aumento del interferóngamma (IFN-y) específico del antígeno, la IL-12 y los anticuerpos fijadores del complemento, mientras que el fenotipo Th2 se caracteriza por la producción de ⁱL-4, IL-5, IL-10 y un aumento de los anticuerpos IgE, IgA y, en general, IgG. Esta expectativa fue confirmada por la expresión de citoquinas (mediante ensayos ELISA semicuantitativos de MSD).

La medición de anticuerpos en el suero de los pacientes tiene varias ventajas en comparación con otras clases de biomarcadores más convencionales. En primer lugar, el suero es un tejido fácilmente accesible que requiere un muestreo relativamente no invasivo. En segundo lugar, los anticuerpos proporcionan una respuesta amplificada y su abundancia relativa permite la alerta temprana o la detección de pequeños cambios. En tercer lugar, no se requiere una biopsia de tejido, que es invasiva, desagradable para el paciente y, dependiendo de la accesibilidad del tumor, suele contener una mezcla de varios tipos de células.

Seguridad. Hasta la fecha, no se han producido toxicidades inesperadas asociadas a la administración de DNX-2401 para tumores cerebrales. Los efectos adversos han sido en general de leves a moderados y no relacionados con el virus tras ambos tipos de administración (es decir, intratumoral e intramural). Ningún paciente interrumpió el estudio debido a un evento adverso, y el análisis del suero, la saliva y la orina de los pacientes no ha demostrado la eliminación del virus. Todos los EAE de muerte se consideraron no relacionados con DNX-2401. Este perfil de seguridad es significativo, ya que Avastin® puede causar una toxicidad grave en los pacientes. Ninguno de estos pacientes experimentó ningún evento adverso relacionado con el fármaco y, por tanto, no hay absolutamente ninguna preocupación por la seguridad o la toxicidad del DNX-2401 en la actualidad.

Los datos de seguridad de dos estudios clínicos adicionales realizados con DNX-2401 respaldan la seguridad observada en el estudio clínico del cerebro. 21 mujeres con neoplasias ginecológicas recibieron diariamente x3 días en dosis que oscilaban entre le9 vp y 1e12 vp/día en un cáncer ginecológico (Kimball et al., 2010; ClinicalTrials.gov Identifier: NCT00562003). Además, se trataron 12 pacientes con glioma de alto grado y los investigadores han informado de que la infusión del virus es factible y segura en el tumor y el cerebro circundante. Los eventos adversos fueron temporales y los eventos adversos graves no se relacionaron con el virus (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01582516).

Muchas de las terapias actuales contra el cáncer están limitadas en su uso debido a la severa toxicidad para los pacientes. Por ejemplo, más del 99% de los pacientes inscritos en el AVF3708g que recibieron bevacizumab informaron de que experimentaron eventos adversos, como fatiga, cefaleas, hipertensión, sangrado/hemorragia y eventos tromboembólicos venosos/arteriales. Otros eventos serios fueron complicaciones en la cicatrización de las heridas, proteinuria y perforación gastrointestinal. Basándose en los datos históricos de toxicidad de los tratamientos contra el cáncer, la ausencia de eventos adversos observados con DNX-2401 es inesperada y sorprendente.

Ejemplos de resultados específicos de los pacientes. Tres pacientes, que sólo han recibido tratamiento para el glioblastoma con DNX-2401, han continuado con el seguimiento. A continuación se ofrecen los detalles.

Paciente #12. Se diagnosticó al paciente No. 12 (mujer blanca de 56 años) que fue sometido a extirpación tumoral y posterior tratamiento con quimioterapia consistente en temozolomida y dasatinib, y radioterapia. Se inscribió en el Grupo A (administración intratumoral de DNX-2401) y se aleatorizó a la Cohorte 3. Recibió 4 inyecciones intratumorales/1 ml de DNX-2401 a una dosis total de 1 * 108 partículas virales (vp). Clínicamente, el paciente ha evolucionado muy bien. Todos los síntomas neurológicos se resolvieron posteriormente durante los primeros 6 meses. Tuvo un ligero aumento del tamaño global de la lesión cerebral que tenía la apariencia de una pseudoprogresión/inflamación; sin embargo, esto fue seguido por una reducción continua del tumor. Durante el estudio, no había experimentado ningún evento adverso serio (SAE). Todos los EA se han considerado no relacionados con DNX-2401 con la excepción de la linfocitopenia que se consideró poco probable que estuviera relacionada y fuera secundaria a la temozolomida. A los 32 meses, el paciente está actualmente vivo y en seguimiento de sobrevida. La última MRI sólo reveló cicatrización y contracción del cerebro circundante, lo que se consideró una respuesta completa sólo al tratamiento con el virus. El paciente sigue evolucionando bien y se le hace un seguimiento cada 4 meses. Se siente bien y dice que camina 60 minutos al día y hace jardinería, actividades que no podía realizar antes de recibir DNX-2401.

Paciente #33. El paciente #33 (mujer blanca de 40 años) fue sometido a una extirpación del tumor primario identificando un gliobastoma. Recibió quimioterapia con temozolomida y radioterapia. Se inscribió en el Grupo A (administración intratumoral de DNX-2401) y se aleatorizó a la Cohorte 7. Recibió 4 inyecciones intratumorales/ml de DNX-2401 a una dosis total de 1 x 1010 vp. Le fue bien durante el mes inmediatamente posterior a la inyección, y los síntomas neurológicos se resolvieron, especialmente la afasia expresiva y las convulsiones parciales complejas. Además, la masa que realza el contraste, así como la anomalía FLAIR en las exploraciones seriadas de MR, prácticamente habían desaparecido. El paciente no ha experimentado ningún evento adverso serio durante el estudio. En general, el paciente parece haber tenido una respuesta completa según los criterios de McDonald. Desde la administración de DNX-2401, el paciente está actualmente vivo y se encuentra bien. Hasta la fecha, está libre de síntomas neurológicos 16 meses después de la inyección de DNX-2401.

Paciente #42. El paciente 42 (mujer blanca) fue sometido a una extirpación del tumor primario que confirmó un glioblastoma. Recibió radioterapia y también 4 cursos de quimioterapia como sigue: temozolomida, memantina temozolomida de nuevo, y macitentan. Se inscribió en el Grupo B (administración intratumoral/intramural de DNX-2401) y se aleatorizó a la Cohorte 4. Recibió una inyección intratumoral/ml de DNX-2401 a una dosis total de 3 x 108 vp, seguida de 10 inyecciones intramurales/1 ml de DNX-2401 a una dosis total de 3 x 108 vp. Tras la extirpación, no había enfermedad medible. Durante su participación en el estudio no ha experimentado ningún evento adverso serio. El paciente está actualmente vivo y se encuentra bien.

Un experto en la materia aprecia fácilmente que la presente invención está bien adaptada para llevar a cabo los objetivos y obtener los fines y ventajas mencionados, así como los inherentes a los mismos. Los procedimientos, procedimientos y técnicas descritos en el presente documento son actualmente representativos de las realizaciones preferentes y pretenden ser ejemplares y no pretenden ser limitaciones del alcance.

VI. Referencias

Patente Estadounidense 3.817.837

Patente Estadounidense 3.850.752

Patente Estadounidense 3.939.350

Patente Estadounidense 3.996.345

Patente Estadounidense 4.275.149

Patente Estadounidense 4.277.437

Patente Estadounidense 4.366.241

Patente Estadounidense 8.168.168

Patente Estadounidense 6.824.771

Solicitud de Patente Estadounidense 20030138405

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un adenovirus oncolítico para su uso en uno o más de:

(i) un procedimiento para lograr una reducción superior al 25% de la carga tumoral al tratar un glioma en un paciente humano sin que se produzca un evento adverso resultante de dicho adenovirus oncolítico que sea suficiente para causar la terminación de dicho tratamiento;

(ii) un procedimiento para lograr una sobrevida libre de progresión de seis meses al tratar un glioma en un paciente humano sin que se produzca un evento adverso resultante de dicho adenovirus oncolítico que sea suficiente para causar la terminación de dicho tratamiento; y (iii) un procedimiento para lograr la necrosis del tumor al tratar un glioma en un paciente humano sin producir un evento adverso resultante de dicho adenovirus oncolítico que sea suficiente para causar la terminación de dicho tratamiento,

en el que el procedimiento comprende el contacto del glioma, en el paciente humano identificado con el glioma, con el adenovirus oncolítico, y donde el adenovirus oncolítico es un adenovirus oncolítico con el polipéptido E1A que no puede unirse a Rb, y comprende una proteína de fibra con un aminoácido RGD insertado en el dominio HI.

2. El adenovirus oncolítico para su uso en un procedimiento de la reivindicación 1, en el que el adenovirus oncolítico es un adenovirus A24.

3. El adenovirus oncolítico para su uso en un procedimiento de la reivindicación 1, en el que se identifica que el paciente tiene un glioma mediante un procedimiento que comprende la obtención de imágenes del tumor, y dicho procedimiento comprende además la obtención de una biopsia de dicho tumor después de la obtención de imágenes y antes del tratamiento con el adenovirus oncolítico.

4. El adenovirus oncolítico para su uso en un procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho glioma es:

(a) extirpable, preferentemente en el que el procedimiento comprende la extirpación del glioma tras el tratamiento con el adenovirus oncolítico, y más preferentemente en el que un lecho tumoral posterior a la extirpación se trata con dicho adenovirus oncolítico, y aún más preferentemente en el que se implanta un catéter posterior a la extirpación en dicho paciente y dicho adenovirus oncolítico se administra a través de dicho catéter;

(b) no extirpable, y preferentemente en el que el procedimiento comprende la extirpación del glioma tras el tratamiento con el adenovirus oncolítico.

5. El adenovirus oncolítico para su uso en un procedimiento de la reivindicación 1, en el que el glioma se pone en contacto con el adenovirus mediante la administración del adenovirus por vía intracraneal en el paciente, por ejemplo, en el que la administración comprende la inyección intratumoral y, opcionalmente, en el que se realizan múltiples inyecciones intratumorales.

6. El adenovirus oncolítico para su uso en un procedimiento de la reivindicación 1, en el que el glioma es un astrocitoma, un oligodendroglioma, un glioma anaplásico, un glioblastoma, un ependimoma, un meningioma, un tumor de la región pineal, un tumor del plexo coroideo un tumor neuroepitelial, un tumor embrionario, un tumor neuroblástico periférico, un tumor de los nervios craneales, un tumor del sistema hemopoyético, un tumor de células germinales o un tumor de la región selar, y preferentemente en el que el glioma es un glioblastoma.

7. El adenovirus oncolítico para su uso en un procedimiento de la reivindicación 1, en el que se administra el adenovirus oncolítico:

a) mediante infusión lenta durante un período mínimo de 10 minutos con una aguja; o

(b) estereotácticamente en más de un sitio de un glioma en dicho paciente.

8. El adenovirus oncolítico para su uso en un procedimiento de la reivindicación 1, en el que el procedimiento comprende además administrar al paciente una segunda terapia, en el que la segunda terapia es una terapia antiangiogénica, quimioterapia, inmunoterapia, cirugía, radioterapia, agentes inmunosupresores o terapia génica con un polinucleótido terapéutico, y opcionalmente:

(a) en el que la segunda terapia se administra al paciente antes de la administración de la composición que comprende el adenovirus oncolítico;

(b) en el que la segunda terapia se administra al paciente al mismo tiempo que la administración de la composición que comprende el adenovirus oncolítico;

(c) en el que la segunda terapia se administra al paciente después de la administración de la composición que comprende el adenovirus oncolítico; o

d) en el que la quimioterapia comprende un agente alquilante, un inhibidor mitótico, un antibiótico o un antimetabolito.

9. El adenovirus oncolítico para su uso en un procedimiento de la reivindicación 1, en el que se administran al paciente de aproximadamente 103 a aproximadamente 1015 partículas virales, opcionalmente de aproximadamente 105 a aproximadamente 1012 partículas virales o de aproximadamente 107 a aproximadamente 1010 partículas virales.

10. El adenovirus oncolítico para su uso en un procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho sujeto se selecciona además en función de la presencia de una respuesta Th1, y opcionalmente en el que dicha respuesta Th1 se caracteriza por un aumento de interferón-gamma (IFN-y) específico del antígeno, IL-12 y anticuerpos fijadores del complemento.

11. El adenovirus oncolítico para su uso en un procedimiento de la reivindicación 1, para uso en 2 o más de los procedimientos i)-iii).

12. El adenovirus oncolítico para su uso en un procedimiento de la reivindicación 1, para uso en los 3 procedimientos i)-iii).

13. El adenovirus oncolítico para su uso en un procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho glioma es recurrente.

14. El adenovirus oncolítico para su uso en un procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho glioma no ha respondido a una o más terapias primarias de glioma.

15. Un adenovirus oncolítico para su uso en uno o más de:

(i) un procedimiento para tratar un glioma en una población de pacientes humanos y lograr un beneficio clínico en el 30% de dichos pacientes, con un beneficio clínico definido por respondedores completos respondedores parciales más enfermedad estable;

(ii) un procedimiento para tratar un glioma en una población de pacientes humanos y lograr una sobrevida libre de progresión del 25% a los seis meses; y

(ii) un procedimiento para tratar un glioma en una población de pacientes humanos y lograr una mediana de sobrevida de 12 meses para los respondedores, con respondedores definidos por respondedores completos respondedores parciales,

en el que el procedimiento comprende poner en contacto los gliomas de una población de pacientes humanos que han sido identificados con glioma con el adenovirus oncolítico, y en el que el adenovirus oncolítico es un adenovirus oncolítico con el polipéptido E1A que no puede unirse a Rb, y comprende una proteína de fibra con un aminoácido RGD insertado en el dominio HI.