JPH10507758A - アデノウイルスおよび免疫抑制剤同時反復投与を伴う遺伝子治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 遺伝子治療処置を宿主に実施する一つの方法であって、（ａ）宿主に同時に（ｉ）治療薬をコード化する少なくとも１個のＤＮＡ配列を含むアデノウイルスベクターおよび（ii）免疫抑制剤を投与し、（ｂ）前記アデノウイルスベクターおよび前記免疫抑制剤の投与を中断し、また（ｃ）アデノウイルスベクターおよび免疫抑制剤の投与を少なくとも１回反復する段階よりなることを特徴とする方法。アデノウイルスベクターおよび免疫抑制剤の投与を反復して行う治療のコースは治療薬をコード化する少なくとも１個のＤＮＡ配列の発現を持続あるいは増加させる。

Description

【発明の詳細な説明】 アデノウイルスおよび免疫抑制剤同時反復投与を伴う遺伝子治療 この出願は１９９５年６月７日受理された出願番号０８／４７８，４８２号を 部分継承するものであり、後者は１９９４年１０月１９日受理された出願番号０ ８／３２５，６７９号を部分継承するものであり、これらの開示は引用例として 組み込まれている。 この発明は遺伝子送達手段としてのアデノウイルスの使用を含む遺伝子治療に 関する。より詳細には、この発明はアデノウイルスおよび免疫抑制剤の同時反復 投与を伴う遺伝子治療に関し、それにより遺伝子治療処置の効率はアデノウイル スに対する免疫応答の抑制を通じて高められる。 発明の背景 アデノウイルスゲノムは約３６キロ塩基対の線形二本鎖ＤＮＡ分子である。ウ イルスゲノムの各端は逆方向末端反復（つまりＩＴＲ）として知られる短い配列 を持ち、これはウイルス複製に必要である。アデノウイルスのよく特徴付けられ た分子遺伝的特徴が、それに遺伝子転移のための有利なベクターを与える。ウイ ルスゲノムの部分は外部起源のＤＮＡで置換することができる。加えて組換えア デノウイルスは構造的に安定である。 アデノウイルスは細胞内への生体内での遺伝子転移に非常に 効率的であり、かくして望ましい遺伝子を真核細胞内に導入するための送達手段 として使用されこれによりアデノウイルスはこのような遺伝子を真核細胞に細胞 レセプターと結合することにより送達する。しかしアデノウイルス遺伝子転移に はいくつかの制約があり、それはアデノウイルスベクター粒子、つまりベクター 粒子の分解産物あるいは形質導入細胞のどちらかに向けられる宿主応答に部分的 に帰因するものである。これらの宿主応答は非特異的応答および特異的免疫応答 を含む。非特異的応答は炎症性および非炎症性変化を含む。後者の一例は宿主の 細胞遺伝子発現の変化である。特異的免疫応答は各種の細胞応答および体液抗体 応答を含む。細胞応答はＴヘルパーリンパ球、Ｔサプレッサーリンパ球、細胞毒 Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、およびナチュラルキラー細胞により送達されるものを含 む。 遺伝子転移で送達されたアデノウイルスベクターの高い効率にも拘らず、遺伝 子転移で送達されるアデノウイルスベクターの一過性性質は、アデノウイルスベ クターの反復投与が必要であることを示唆している。しかしコットンラットの最 近の研究は、アデノウイルスベクターに向けられた宿主免疫応答が反復投与後遺 伝子転移および発現の効率減少と相関することを示した。イエイ、他、遺伝子治 療 、１巻：１９２−２００ページ（１９９４年）。 スミス、他、自然遺伝学、５巻、３９７−４０２ページ（１９９３年）は、ヒ ト因子IX遺伝子を含むアデノウイルスベクターのマウスへの投与を開示する。こ のような投与は血友病Ｂ患者に治療効果のあるヒト因子IXの肝臓形質導入および 血漿 水準に効率を改善した。しかしヒト因子IX水準は注入９週後にはゆっくり基線ま で下がり、第２ベクター注入によっても回復しなかった。スミス、他はまた、ア デノウイルスに対する中和抗体がアデノウイルスの反復投与の成功を遮断するこ とも発見した。 コザルスキー、他、生物化学ジャーナル、２６９巻、１８号、１３６９５−１ ３７０２ページ（１９９４年５月６日号）は、ラビットに対するＬＤＬレセプタ ーをコード化するＤＮＡを含むアデノウイルスベクターの注入を開示する。ＬＤ Ｌレセプター遺伝子の安定した発現がラビット内で７日から１０日見出され、検 出できない水準に３週間で減少した。アデノウイルスに対する中和抗体の成長が 完全に効力のなくなる第２回目の用量で生じた。 カッス−アイスラー、他、遺伝子治療、１巻、３９５−４０２ページ（１９９ ４年）は、Ｔ細胞応答がそれだけに帰因するものではないがアデノウイルスから の成人の発現の限定された継続に寄与することを示唆する。この著者は更にシク ロスポリンＡがベクターに対する体液応答を遮断するのに効果的ではないことも 示している。 ファング、他、細胞生化学ジャーナル、補巻２１Ａ、Ｃ６−１０９、３６３ペ ージ（１９９５年）は免疫抑制剤であるシクロスポリンＡで処置された犬におけ るアデノウイルスベクターの再注入の試みを開示する。この再注入の試みは不成 功であった。 ヤング、他、全米科学アカデミー紀要、９１巻、４４０７− ４４１１ページ（１９９４年５月）はＥ１ａおよびＥ１ｂ領域の欠失した組換え アデノウイルスを説明する。このようなウイルスは更に移植遺伝子を含む。この アデノウイルスは、望ましい移植遺伝子を発現する組換えウイルスゲノムを内蔵 する動物宿主細胞に投与される。しかしウイルス遺伝子の発現は低い水準に止ま る。ウイルス特異的細胞免疫応答は遺伝子修飾細胞の破壊に導くように刺激され 、これにより移植遺伝子の発現の継続を限定する。 前記の研究は有効なベクターの再投与を妨げ発現の有効性を限定するアデノウ イルスベクターに対する宿主免疫応答を阻止し遮断する方法の必要性を明確に立 証する。しかしそれはこれをどのようにして達成するかについては記述していな い。 従ってこの発明の目的は、アデノウイルスベクターに対する免疫応答の抑制を 通じて、アデノウイルスベクターの反復投与による遺伝子転移の持続有効性、お よび転移遺伝子の持続発現を提供することにある。 図面の簡単な説明 この発明はここで図面と関連して説明され、ここで、 図１はプラスミドｐＨＲの構築の図形である。 図２はアデノウイルスＩＴＲ、包膜シグナル、ラウス肉腫ウイルスプロモータ ー、アデノウイルス三部分リーダー配列、および結合配列を含む発現ベクター構 築の図形である。 図３はプラスミドｐＡｖＳ６構築の図形である。 図４はプラスミドｐＡｖＳ６の地図である。 図５はプラスミドｐＢＱ４．７の地図である。 図６はプラスミドｐＡｖＳ６−ＣＦＴＲの地図である。 図７はアデノウイルスベクターＡｖ１Ｌｕｃ１およびＡｖ１Ｃｆ２の図形であ る。 図８はプラスミドｐＧＥＭ−１ｕｃの地図である。 図９はプラスミドｐＡｖＳ６−ｌｕｃの地図である。 図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃはベクター投与３日後のＡｖ１Ｃｆ２投与に応 答する肺の組織的外観を描く。 図１１Ａおよび１１ＢはＡｖ１Ｃｆ２投与３日および４２日後の肺洗浄細胞で のデキサメタゾン投与の効果を示すグラフである。 図１２はデキサメタゾンで処置され、あるいは処置されなかったＡｖ１Ｃｆ２ 感染ラットからの肺洗浄サンプルの抗アデノウイルス抗体力価のグラフである。 図１３はＡｖ１Ｃｆ２で感染４２日後のラットにおけるＣＴＬ応答のグラフで ある。 図１４はデキサメタゾンで処置され、あるいは処置されなかったもので、次い でＡｖ１Ｌｕｃ１で感染されたＡｖ１Ｃｆ２感染ラットにおけるルシフェラーゼ 酵素活性のグラフである。 図１５はプラスミドｐＡｖ１Ｈ９ＦＲの地図である。 図１６はアデノウイルスベクターＡｖ１Ｈ９Ｆ２の図形である。 図１７はＡｖ１Ｈ９Ｆ２を与えられ、免疫抑制剤デオキシスペルグアリン、シ クロホスファミド、あるいはデキサメタゾンの一つで処置あるいは処置されずま た５週早く Ａｖ１ＬａｃＺ４を投与されあるいは投与されなかったマウスにおける血漿ヒト 因子IXのグラフである。 図１８は１−１０³から１×１０⁸ｐｆｕのＡｖ１ＬａｃＺ４を受け入れ、次い で５週後Ａｖ１Ｈ９ＦＲの投与を受けたマウスにおける血漿因子IX水準（ｎｇ／ ｍｌ）のグラフである。 図１９はＡｖ１ＬａｃＺ４を与えられ、免疫抑制剤を与えられなかったかある いはデオキシスペルグアリン、シクロホスファミドあるいはデキサメタゾンで処 置されたマウスにおける中和抗体力価のグラフである。 図２０はＡｖ１ＬａｃＺ４を与えられ、かつ免疫抑制剤を与えられなかったか あるいはシクロホスファミドを与えられ、次いでシクロホスファミド処置あるい は処置なしでＡｖ１Ｈ９Ｆ２を投与され、更に次いでＡｖ１ＡＬＡＰＨ８１を投 与されたマウスにおける血漿因子ＶＩＩＩ水準のグラフである。また、 図２１はＡｖ１ＬａｃＺ４およびデオキシスペルグアリン０ｍｇ／ｋｇ、５ｍ ｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、あるいは３３ｍｇ／ｋｇを受け、 次いでＡｖ１Ｈ９Ｆ２を投与されたマウスにおける血漿因子IX水準（ｎｇ／ｍｌ ）のグラフである。 発明の詳細な説明 この発明の一つの見地に従って、遺伝子治療処置を宿主で実施する一つの方法 が提供される。この方法は宿主に（ｉ）少なくとも１個のＤＮＡ配列を含むアデ ノウイルスベクター、および（ii）免疫抑制剤を投与することよりなる。アデノ ウイルス ベクターおよび免疫抑制剤の投与のコースは次いで停止される。免疫抑制剤とア デノウイルスベクターの投与は次いで少なくとも１回反復される。アデノウイル スベクターは宿主に治療効果を生じるのに有効な量で投与される。免疫抑制剤は 体液およびもしくはベクターに対する細胞免疫応答およびもしくはベクターを含 む細胞を阻止あるいは抑制するのに有効な量で投与される。 ここで使用される「ＤＮＡ配列」という用語は一般にポリデオキシリボヌクレ オチド分子を引用し、より詳細には隣接するペントースの３′および５′炭素の 間のホスホジエステル結合により１個から他へと結合する線状シリーズのデオキ シボヌクレオチドを引用する。 出願人が発見したのは、免疫抑制剤がアデノウイルスベクターと併用して投与 され、また次いでベクターの投与が反復される時には、アデノウイルスベクター およびもしくはベクターで形質導入された細胞に対する（体液抗体応答などのよ うな）免疫応答の抑制を通じてアデノウイルス媒介遺伝子転移の生体内反復の効 率向上が達成され、これにより転移遺伝子の発現増加を達成できるということで あった。 使用されるアデノウイルスベクターは、一つの実施例において基本的に完全ア デノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターである。シェンク、他、微生 物免疫学の今日の主題 、１１１巻（３号）：１−３９ページ（１９８４年）。代 替的には、アデノウイルスベクターは少なくともアデノウイルスゲノムの一部が 欠失している修飾アデノウイルスベクターであ る。 も一つの実施例において、アデノウイルスベクターはアデノウイルス５′ＩＴ Ｒ、アデノウイルス３′ＩＴＲ、アデノウイルス包膜シグナル、治療薬をコード 化する少なくとも１個のＤＮＡ配列、治療薬をコード化する少なくとも１個のＤ ＮＡ配列を制御するプロモーターよりなる。このベクターは大多数のアデノウイ ルスＥ１およびＥ３ＤＮＡ配列を欠失しているが、すべてのＥ２およびＥ４ＤＮ Ａ配列、およびアデノウイルス主要後期プロモーターにより加速されるアデノウ イルスタンパク質をコード化するＤＮＡ配列を欠失していない。 一つの実施例において、ベクターは更にＥ２およびＥ４ＤＮＡ配列よりなるグ ループから選択される少なくとも１個のＤＮＡ配列の少なくとも一部を欠失して いる。 も一つの実施例において、ベクターはアデノウイルスＥ１およびＥ３ＤＮＡ配 列の少なくとも大多数を欠失し、またＥ２およびＥ４ＤＮＡ配列の他の部分を欠 失している。 更にも一つの実施例において、７２キロダルトン結合タンパク質をコード化す るＥ２ａ領域における遺伝子は、３２℃で活性である温度感受性タンパク質を生 産するために突然変異され、この温度でウイルス粒子が生産される。この温度感 受性突然変異体は以下の文献に記述されている：エンシンジャー、他、ウイルス 学ジャーナル 、１０巻、３２８−３３９ページ（１９７２年）；ヴァン・デア・ フリート、他、ウイルス学ジャーナル、１５巻、３４８−３５４ページ（１９７ ５年）；エングルハート、他、全米科学アカデミー紀要、９１ 巻、６１９６−６２００ページ（１９９４年６月）；ヤング、他、自然遺伝学、 ７巻、３６２−３６９ページ（１９９４年７月）。 望ましい実施例において、このようなベクターは標準方法に従って５′末端か ら始まる「臨界左端要素（critical left end elements）」を含むシャトルプラ スミドをまず構築することにより構築され、この臨界左端要素はアデノウイルス ５′ＩＴＲ、アデノウイルス包膜シグナル、およびＥ１ａエンハンサー配列を含 み、またこのシャトルプラスミドはプロモーター（アデノウイルスプロモーター あるいは外部プロモーターであってもよい）；多重クローニング部位（前記記載 のもの）；ポリＡシグナル；アデノウイルスゲノムの分接に対応するＤＮＡ分接 をも含む。ベクターはまた三部分リーダー配列も含む。アデノウイルスゲノムに 対応するＤＮＡ分接は修飾あるいは突然変異アデノウイルスとの相同的組換えの 基質として役立ち、このような配列は、例えばゲノムの３３２９塩基から６２４ ６塩基までのアデノウイルス５ゲノムの分接を包含する。このプラスミドはまた 選択的マーカーおよび複製起点を含む。複製起点は細胞複製起点であってもよい 。このようなシャトルプラスミドの代表的な例は、図４で示されるｐＡｖＳ６を 含む。凝固因子をコード化する望ましいＤＮＡ配列は、次いで多重クローニング 部位に挿入され、プラスミドベクターを生産する。 この構築物は次いでアデノウイルスベクターを生産するために使用される。相 同的組換えが少なくとも大多数のＥ１および Ｅ３アデノウイルスＤＮＡ配列が欠失している修飾あるいは突然変異アデノウイ ルスを用いて実施される。このような相同的組換えはリン酸カルシウム沈殿によ りプラスミドベクターおよび修飾アデノウイルスを２９３細胞のようなヘルパー 細胞系に同時形質移入することを通して実施される。このような相同的組換えに 際して、ＮｏｔＩ部位および相同的組換え断片の間のシャトルプラスミドから誘 導されるＤＮＡ配列、および相同的組換え断片および３′ＩＴＲの間のアデノウ イルスを欠失したＥ１およびＥ３から誘導されるＤＮＡを含むアデノウイルスベ クターが形成される。 一つの実施例において、相同的組換え断片はアデノウイルス５（ＡＴＣＣ Ｖ Ｒ−５）ゲノムのヌクレオチド３３２９から６２４６でオーバーラップする。 このような相同的組換えを通じて、アデノウイルス５′ＩＴＲ、アデノウイル ス包膜シグナル、Ｅ１ａエンハンサー配列、プロモーター、治療薬をコード化す る少なくとも１個のＤＮＡ配列、Ｅ１およびＥ３アデノウイルスＤＮＡ配列の少 なくとも大多数を欠失しているアデノウイルスＤＮＡ、およびアデノウイルス３ ′ＩＴＲを含む一つのベクターが形成される。このベクターは次いでＥ１ａおよ びＥ１ｂＤＮＡ配列を含みウイルス複製に必要である２９３ヘルパー細胞系（Ａ ＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）などのようなヘルパー細胞系に形質移入され感染性 アデノウイルス粒子を生成する。形質移入は電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿 、顕微注射、あるいはプロテオリポソームを通じて生じる。 前記記載のベクターは治療薬をコード化する少なくとも１個のＤＮＡ配列のク ローニングベクターへの挿入を容易にするために多重クローニング部位を含む。 一般に多重クローニング部位は、「希有」制限酵素部位；すなわち約１０，００ ０塩基対毎に１個から約１００，０００塩基対毎に１個の頻度での真核細胞に見 出される部位を含む。この発明に従っての適切なベクターはかくして標準方法に より多重クローニング部位における適切なクローニング部位でクローニングベク ターを切断し、次いで治療薬をコード化するＤＮＡ配列をクローニングベクター に結合することにより形成される。 前記記載のアデノウイルスベクターは少なくとも１個の治療薬をコード化する 少なくとも１個のＤＮＡ配列を含む。「治療」という用語は一般的な意味で使用 され、治療薬、予防薬および置換薬を含む。 アデノウイルスベクターに挿入される治療薬をコード化するＤＮＡ配列は、必 ずしもそれに限定されないが、以下のものを含む：ＴＮＦ−αなどの腫瘍壊死因 子（ＴＮＦ）遺伝子；インターフェロンα、インターフェロンβ、およびインタ ーフェロンγなどののインターフェロンをコード化する遺伝子；ＩＬ−１、ＩＬ −１β、およびインターロイキン２から１４までのようなインターロイキンをコ ード化する遺伝子；ＧＭ−ＣＳＦをコード化する遺伝子；アデノシンデアミナー ゼ、すなわちＡＤＡをコード化する遺伝子；Ｍｎ−ＳＯＤ、カタラーゼ、ＣｕＺ ｎＳＯＤ、細胞外スーパーオキシドジスムターゼおよびグルタチオンレダクター ゼなどの抗酸化剤をコード化する 遺伝子；リンパ球の成長因子であるリンホカインなどの細胞成長因子をコード化 する遺伝子；上皮成長因子（ＥＧＦ）およびクラチノサイト成長因子（ＫＧＦ） などの成長因子をコード化する遺伝子；溶触ＣＤ４をコード化する遺伝子；因子 VIII；因子IX；フォン・ビレブランド因子；Ｔ細胞レセプター；コレステロール 輸送および代謝に伴うＬＤＬレセプター、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＣ、ＡｐｏＡＩおよ びその他の遺伝子；α１アンチトリプシン（α１ＡＴ）遺伝子、オルニチントラ ンスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）遺伝子、ＣＦＴＲ遺伝子、肺界面活性タンパク質 遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、インシュリン遺伝子、ウイルスチミジンキ ナーゼ遺伝子など、単純性ヘルペスチミジンキナーゼ、サイトメガロウイルスチ ミジンキナーゼ遺伝子および水痘−帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子な どのネガチブ選択マーカーあるいは「自殺」遺伝子；抗体の抗原結合領域のＦｃ レセプターおよびＢ型肝炎および非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの複製を妨げるアンチ センス配列のようなウイルス複製を妨げるアンチセンス配列；組織プラスミノー ゲン活性化因子（ｔＰＡ）；尿プラスミノーゲン活性化因子（ウロキナーゼ）； ヒルジン；酸化窒素シンターゼ、血管活性化ペプチド；および血管形成ペプチド 。 治療薬をコード化するＤＮＡ配列は適切なプロモーターの制御下にある。使用 される適切なプロモーターは、必ずしもそれに限定されないが以下のものを含む ：アデノウイルス主要後期プロモーターなどのアデノウイルスプロモーター；あ るいはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどの非相同 プロモーター；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭＴＶプロモー ター、メタロチオネインプロモーターなどの誘導プロモーター；熱ショックプロ モーター；アルブミンプロモーター；およびＡｐｏＡＩプロモーター。選択肢と して、治療薬をコード化するＤＮＡ配列はその天然プロモーターの制御下にある 。しかしこの発明の範囲は特異的外部遺伝子あるいはプロモーターに限定される ものでないことは理解されねばならない。 使用される免疫抑制剤は（ｉ）アデノウイルスベクターに対する体液（抗体） 応答、（ii）例えばアデノウイルスベクターを含む細胞に対するＴ細胞応答など の細胞免疫応答、あるいは（iii）ベクターに対しまたベクターを含む細胞に対 する非特異的な炎症応答、を妨げるものを含む。ベクターおよびもしくはベクタ ーを含む細胞に対する体液およびもしくはＴ細胞およびもしくは非特異的炎症応 答を妨げることにより、免疫抑制剤の投与は宿主に治療効果を生み出すためにベ クターの効果的な再投与を可能にする。望ましくは、アデノウイルスベクターの 反復投与が望まれる場合には、免疫抑制剤はアデノウイルスベクターに対する体 液抗体応答を妨げる免疫抑制剤である。望ましくは、持続性の長いあるいは高水 準の発現が望まれる場合には、免疫抑制剤は細胞あるいは非特異的消炎応答を妨 げあるいは抑制するものである。 生体内アデノウイルスベクター投与に対する宿主免疫応答は、（ｉ）ベクター の用量、（ii）投与のルート、（iii）複製の水準（複製が生じる場合）、（iv ）組換えベクターに含まれ る移植遺伝子の性質、（ｖ）宿主の遺伝子学的および生理学的特性、および（vi ）これまでに投与したアデノウイルスベクターに対する前もって存在する免疫応 答の存在と水準、と関連して変化する。 一般に、宿主の応答は投与されるベクターの用量に依存する。重要なことは、 特異的宿主応答の大きさは、ベクター投与のルートに依存する。例えば、静脈内 投与は呼吸器系ルートを経て与えられるベクターの同一の量のものよりもより高 い宿主抗体応答を産み出す。 アデノウイルスベクターに対する異なった宿主応答は、全部ではないにしても 大抵のこれらの異なった因子機構が関連し大いに相互依存的ではあるけれども、 異なった消炎および免疫エフェクター機構により生じる。かくして例えば、体液 抗体形成はある種のＴヘルパーリンパ球支援に非常によく依存している。またあ る種の細胞伝達細胞毒性は抗体形成、例えばオプソニン化マクロファージ細胞殺 害に依存する。 移植遺伝子発現の持続に影響を与える２種の主要な宿主応答は、消炎応答およ び細胞免疫応答である。 消炎はベクターの投与に続いて生じる最初の宿主応答である。サイトカインの 放出は続く消炎細胞の流入を非常によく伴う。このようなサイトカインはＩＬ− １、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＴＮＦを含むことが多い。 生体内アデノウイルスベクター投与に続いて見られる消炎量は与えられるベク ター用量の増加で増加する。容量の増加は少ない量の用量によるものよりも移植 遺伝子の発現のより急速な 減少へと向かわせる。 形質導入細胞に向けられるＣＴＬ応答は移植遺伝子発現の持続を減少させるの に重要であると見做されている。ＣＴＬはＣＴＬを誘発する細胞による低い水準 のアデノウイルス遺伝子発現に向けられるものと考えられている。 宿主に対し反復してアデノウイルスベクターを投与する能力に影響する主要な 宿主応答は体液抗体応答である。それは口腔、静脈内、腹腔内、および肺内を含 む各種ルートにより投与されるアデノウイルスを展開する。一般に、達成される 抗体応答の水準は投与されるベクターの用量によく依存する。抗体応答はまたベ クター投与のルートにも依存する。静脈内ベクター投与はベクターの一定用量に 対する肺投与よりもより高い抗体水準を産み出す。対照的に、野生型アデノウイ ルスは生体内ウイルス複製により与えられたウイルスの量に係りなく高い抗体水 準を誘出する。アデノウイルスベクター投与を成功裡に繰返す能力は存在する抗 アデノウイルスベクター抗体を循環させる水準と逆相関である。 アデノウイルスベクターに対する宿主免疫応答の薬理的調節は、消炎剤、細胞 免疫修飾因子、および体液抗体免疫修飾因子の使用を伴う。 消炎剤はステロイド、シクロホスフェミド、およびアゾチオフリンを含む。 ステロイドは潜在的な消炎特性を持つ。デキサメタゾンなどのステロイドが非 経口で投与されると肺ルートを経たベクターの生体内投与に続き移植遺伝子の発 現の持続時間を長くする。 ステロイドはまたリンパ球の機能を遮断する。かくしてデキサメタゾンは肺ベク ター投与後に観察されるＣＴＬ応答を減少させる。デキサメタゾンはまた少なく とも部分的にはアデノウイルスベクター投与に対する宿主抗体応答を遮断する。 免疫システムの細胞成分に向けられる抗体は細胞免疫応答を減少させる。例え ば抗Ｔ細胞レセプター抗体（例えば抗ＣＤ４および抗ＣＤ３抗体など）の投与は 移植遺伝子の発現を引き延ばす。ＣＴＬＡ４免疫グロブリンはも一つの例である 。抗ＣＤ４抗体はＴヘルパーリンパ球に対して向けられ、その機能を減少させる 。主として細胞免疫応答に向けられる他の作用薬はシクロスポリンＡなどのシク ロスポリン、ＦＫ５０６などのラパマイシン結合タンパク質配位子、デキサメタ ゾンなどのステロイドを含む。 体液抗体応答に影響を与える作用薬は一般にＢリンパ球（Ｂ細胞）を生産する 抗体に、あるいはＢ細胞抗体生産を高水準に誘発させることの原因となるＴ細胞 に向けられる。 アデノウイルスベクターに対する体液抗体応答を妨げる免疫抑制剤の例は、必 ずしもそれに限定されないが、デオキシスペルグアリン、すなわち以下の構造を 持つＤＳＧを含む： ここで使用される「デオキシスペルグアリン」および「ＤＳＧ」という用語は デオキシスペルグアリンすなわちＤＳＧおよびその誘導体もしくは類似体、つま りデオキシ スペルグアリン塩を意味し、必ずしもそれに限定されないがそのトリヒドロクロ リド、および免疫抑制活性を持つ、他のいずれかの類似体を含む。このような化 合物は米国特許番号４，５２５，２９９、４，８４７，２９９、５，１６２，５ ８１および５，１９６，４５３に詳細に記述されている。 一つの実施例において、体液抗体応答を妨げる免疫抑制剤はステロイドである 。使用されるステロイドは必ずしもそれに限定されないが、デキサメタゾン、お よび例えばコルチコステロイドなどのいずれかの副腎皮質ホルモン、ヒドロコル チゾン、プレドニソロン、およびメチルプレドニソロンを含む。 も一つの実施例において、体液抗体反応を妨げる抑制剤は例えばシクロスポリ ンＡなどのシクロスポリンである。使用される体液抗体反応を妨げる他の抑制剤 は、必ずしもそれに限定されないが、以下のもを含む：アザチオプリン、シクロ ホスファミド、ブレキナール、レフルノミド、ミコフェノレート・モフェティル （mycophenolate mofetil）、抗ＤＣ４０抗体配位子抗体、シクロホスファミン 、ラパマイシン、抗ＣＤ４抗体、ＣＴＬＡ−４免疫グロブリン、インターロイキ ン１２、インターフェロンγ；ビアラー、他、全米科学アカデミー紀要、８７巻 、９２３１−９２３５ページ（１９９０年）、デュモント、他、免疫学ジャーナ ル、１４４巻、１４１８−１４２４ページ（１９９０年）、およびビアラー、他 、サイエンス、２５０巻、５５６−５５９ページ（１９９０年）に記載されてい るように、例えばＦＫ５０６などのラパマイシン結 合タンパク質（ＦＥＢＰ）配位子、抗リンパ球機能抗原１（ＬＦＡ−１）抗体、 および抗Ｔ細胞レセプター抗体。 外部抗原に対する体液免疫応答を妨げ、抑制し、あるいは除去する化合物（例 えばデオキシスペルグアリン、シクロホスファミド、ブレキナール、レフルノミ ド、ミコフェノレート・モフェティル、抗ＣＤ４０抗体、あるいは抗ＣＤ４０配 位子抗体など）がアデノウイルス投与の少し前、およびもしくは投与の間、およ びもしくは投与の少し後に投与される場合には、このような化合物が宿主内で抗 アデノウイルス中和抗体の生産を妨げるということも出願人は発見した。 この発明の範囲内で、免疫抑制剤が前記記載の１個以上の免疫応答を妨げるこ とは理解されねばならない。しかしまた、この発明の範囲はいずれかの特異的な 免疫抑制剤に限定されるものではないことも理解されねばならない。 この発明の範囲内で、免疫抑制剤の組合せが使用されることも考慮されねばな らない。 アデノウイルスベクターおよび免疫抑制剤は一般に宿主に治療効果をもたらす のに有効な量で同時投与され、一方ベクターあるいはベクターで形質導入された 細胞に対し免疫応答を妨げる。ここで使用される「同時」という用語は、アデノ ウイルスベクターの投与と免疫抑制剤の投与がほぼ同じ時間、つまりそれぞれの 短い時間枠内で開始され、またアデノウイルスの投与と免疫抑制剤の投与が治療 の一体の分割できないコースの部分であることを意味している。かくして例えば 、アデノウイルスベクターが投与されるほぼ同じ時間に免疫抑制剤が投与され る。すなわち免疫抑制剤の投与がアデノウイルスベクターの投与の少し（例えば 約２４時間）前、あるいは投与の間、もしくは投与の少し（例えば２４時間）後 に開始される。一般に免疫抑制剤はその薬剤に設定された標準用量スケジュール に従い、一般には１４日を越えない、また望ましくは１１日を越えない、より望 ましくは８日を越えない期間投与される。かくして免疫抑制剤の長期の投与はア デノウイルスの反復投与を可能にするには必要ではない。 免疫抑制剤の投与コースの終結に当り、アデノウイルスベクターおよび免疫抑 制剤の投与コースはある一定期間中止される。アデノウイルスベクターおよび免 疫抑制剤投与コースの間の期間、およびアデノウイルスベクターおよび免疫抑制 剤の投与コース回数は、患者の年令、体重、および性、治療される疾病あるいは 疾患、および治療される疾病あるいは疾患の発病度を含む各種の因子に依存する 。 前記免疫抑制剤投与コースがアデノウイルスベクターの各投与で反復されるこ とは理解されねばならない。 一つの実施例において、アデノウイルスベクターは各投与に際してキログラム 当り１プラーク形成単位から約１０¹⁴プラーク形成単位まで、望ましくは約１０⁶ プラーク形成単位から約１０¹³プラーク形成単位まで、より望ましくは約１０⁸ プラーク形成単位から約１０¹⁰プラーク形成単位までの量で投与される。宿主は ヒトあるいは非ヒト動物宿主である。 アデノウイルスベクターは全身あるいは局所投与される。全身投与の例は、必 ずしもそれに限定されないが、静脈内投与 （例えば門静脈注射あるいは末梢静脈注射）、筋肉内投与、腹腔内投与、鼻腔内 投与、あるいはカプセル口腔投与を含む。 免疫抑制剤は望ましい免疫抑制効果を宿主に生み出すのに有効な量で投与され る。免疫抑制剤は各投与時にデキサメタゾンが使用される場合には約１ｍｇ／ｋ ｇから約１５ｍｇ／ｋｇまでの量で、あるいは他のステロイドでは同量で投与さ れる。デオキシスペルグアリンが使用される場合には、デオキシスペルグアリン は約１ｍｇ／ｋｇから約３３ｍｇ／ｋｇ、望ましくは約３ｍｇ／ｋｇから約７ｍ ｇ／ｋｇまでの量で投与される。シクロホスファミドが使用される場合には、シ クロホスファミドは約５ｍｇ／ｋｇから約３００ｍｇ／ｋｇ、望ましくは約５０ ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまでの量で投与される。 アデノウイルスベクター粒子および免疫抑制剤それぞれは患者への投与に適し た薬理的許容可能担体と併用して投与される。担体は例えば食塩水などの液状担 体である。アデノウイルスベクター粒子は例えばマイクロキャリアビーズなどの 固形担体、あるいは例えばポリオールなどの持続性薬剤送達材料と併用して投与 される。 アデノウイルス粒子により形質導入される細胞は必ずしもそれに限定されない が以下のものを含む：肺、気道、あるいは歯槽上皮細胞；白血球、顆粒細胞、単 核細胞、マクロファージ、リンパ球（Ｔリンパ球およびＢリンパ球を含む）、全 能幹細胞、および腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ細胞）などの一次有核血球などの 一次細胞；骨髄細胞；内皮細胞；活性内皮細胞；上皮細胞；ケラチノサイト；幹 細胞；肝細胞前駆体細胞を含む肝 細胞；繊維芽細胞；間葉細胞；中皮細胞；実質細胞；血管平滑筋細胞；脳細胞お よび他の神経細胞；腸管細胞；腸幹細胞；および筋芽細胞。 一つの実施例において、アデノウイルス粒子は血球に指向し、これによりその アデノウイルスベクター粒子は血球を遺伝子で感染させ、これが直接間接的に血 球の治療効果を高める。血球により運ばれる遺伝子は、血友病の治療に有効な凝 固因子をコード化する遺伝子のような通常はそれがもっていない治療効果を血球 に発揮させるいずれの遺伝子であってもよい。遺伝子は、治療効果を持つ１個も しくはそれ以上の産物をコード化できる。適切な遺伝子の例は、ＣＦＴＲ遺伝子 をコード化するもの；ＴＮＦなどのサイトカイン、インターロイキン（インター ロイキン１−１４）、インターフェロン（α、β、γ−インターフェロン）、Ｔ 細胞レセプタータンパク質および免疫グロブリンなどの抗体の抗原結合領域のた めのＦｃレセプターを含む。適切な遺伝子の他の例は、エイズの治療に使用され る融解ＣＤ４をコード化する遺伝子およびα抗トリプシン欠損症により生じる気 腫の治療に有用なα−抗トリプシンをコード化する遺伝子を含む。 形質導入された細胞は、必ずしもそれに限定されないが、膵嚢胞性繊維症、ア デノシンデアミナーゼ欠損症、鎌状細胞貧血、地中海貧血、血友病、糖尿病、α −抗トリプシン欠損症、アルツハイマー病などの脳疾患、成長疾患および心臓病 など他の疾病、例えばコレステロールが代謝され免疫システムを欠くような変化 により生じたものを含む。 も一つの実施例において、アデノウイルスベクター粒子は肝細胞に形質導入し 、このアデノウイルスベクター粒子は後天性あるいは遺伝性肝細胞（肝臓）欠損 の予防および治療に有用なポリペプチドあるいはタンパク質をコード化する遺伝 子を含む。例えばそれらは低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプターの遺伝性 欠損を中和し、およびもしくは先天性アンモニア過剰血症に生じる後天性オルニ チントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症を中和するのに使用することがで きる。 も一つの実施例において、アデノウイルス粒子は肝細胞に形質導入し、これに よりアデノウイルス粒子はウイルス感染から生成する疾病などの後天性感染疾病 を治療するのに使用される治療薬をコード化する遺伝子を含む。例えば感染性ア デノウイルス粒子はウイルス性肝炎、とりわけＢ型肝炎あるいは非Ａ非Ｂ型肝炎 を治療するのに使用することができる。例えばアンチセンス遺伝子をコード化す る遺伝子を含む感染性アデノウイルス粒子はウイルス複製を阻害するために肝細 胞を感染するのに使用される。この場合、逆あるいは反対方向で構造的肝炎遺伝 子を含むベクターを含む感染性アデノウイルス粒子は肝細胞に導入され、肝炎ウ イルスあるいはそのＲＮＡ転写物を不活性化できるアンチセンス遺伝子を感染肝 細胞内で生産する。選択肢として、肝細胞は例えば肝炎ウイルスに耐性を与える αインターフェロンなどのタンパク質をコード化する遺伝子を含む感染性アデノ ウイルス粒子で感染される。 このベクター粒子はまたホジキンリンパ腫の治療に使用することができる。感 染性アデノウイルスベクター粒子はホジキン リンパ腫の新生細胞を標的とする。更にアデノウイルスベクター粒子は単純性ヘ ルペスチミジンキナーゼなどの負の選択マーカーあるいは「自殺遺伝子」を含む 。アデノウイルスは生体内で患者に投与され、これによりウイルスはホジキンリ ンパ腫の新生細胞に感染する。アデノウイルスが患者に投与された後、患者はガ ンシクロビルあるいはアシクロビルなどの相互作用薬を与えられ、これによりア デノウイルスで感染した新生ホジキンリンパ腫細胞は殺される。 更にベクターはＣＦＴＲ遺伝子を含むように構築することができる。このベク ターは次いで膵嚢胞性繊維症の患者の肺欠損症の治療に有効な量で上皮に投与さ れる。も一つの実施例において、機能タンパク質を含むベクターがそのようなタ ンパク質の欠損症を治療するために気道上皮に送達される。このような機能タン パク質は抗酸化剤、α−１抗トリプシン、ＣＦＴＲ、肺界面タンパク質、サイト カイン、およびＥＧＦならびにＫＧＦなどの成長因子を含み、また重症複合型免 疫不全治療のためのアデノシンデアミナーゼ、クリスマス病治療のためのフォン ・ビレブランド因子、およびゴーシェ病治療のためのβ−グルクロニダーゼを含 む。更に抗癌剤あるいは消炎剤をコード化する遺伝子を含むベクターは肺癌ある いは炎症性肺疾患治療のために患者の肺に投与される。 実施例 この発明はこれから以下の実施例と関連して説明される。しかしこの発明の範 囲はそれにより限定されるものではない。 実施例１ Ａｖ１Ｃｆ２およびＡｖ１ＬｕＣ１の構築 Ａ．ｐＡｖＳ６の構築 アデノウイルス構築シャトルプラスミドｐＡｖＳ６がクローニング技術に基づ くポリメラーゼ連鎖反応を含む標準クローニング技術を用いていくつかの段階を 経て構築された。まず２９１３塩基対Ｂｇ１ＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ断片がＡｄ− ｄ１３２７から除去され、平滑断片としてピーブルースクリプト（pBluscript） ＩＩ Ｋｓ（カリホルニア、ラホーラ、ストラータジェン）のＸｈｏＩ部位に挿 入された。 Ａｄ−ｄ１３２７は、塩基対２８５９１から３０４７４（あるいはアデノウイ ルス５ゲノムの地図単位７８．５から８４．７）を含みＥ３領域に位置を求める Ｘｂａ Ｉ断片が除去されていることを除いてアデノウイルス５と同一である。 Ａｄ−ｄ１３２７でのＥ３欠失はＡｄ−ｄ１３２４でのＥ３欠失と類似しており 、後者はジンマッパーヤ他、細胞、３１：５４３（１９８３年）に記載されてい る。完全アデノウイルス５ゲノムはジェンバンク、アクセス番号Ｍ７３２６０で 登録されており、このウイルスはアメリカ合衆国、メリーランド、ロックビル、 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションからアクセス番号ＶＲ−５で利 用できる。 Ａｄ−ｄ１３２７はアデノウイルス５（Ａｄ５）から決まった方法で構築され た。この方法は以下のように簡単に略述され、またこれまでにもジョーンズおよ びシェンク、細胞、１３：１８１−１８８（１９７８年）に記述されている。Ａ ｄ５ ＤＮＡはビリオンのタンパク質分解消化により 分離され、Ｘｂａ Ｉ制限エンドヌクレアーゼで部分的に切断される。Ｘｂａ Ｉ断片は次いで断片の混合物として連結反応により再集合される。これは配列２ ８５９１塩基対から３０４７４塩基対を除く点を除いてＡｄ５に類似する配列を 用いてある連結ゲノムを生じる。このＤＮＡは次いで適当な細胞（例えばＫＢ細 胞、ヒーラ細胞、２９３細胞）に形質移入され、プラーク形成を可能にするため 軟寒天で覆われる。個々のプラークは次いで分離され、増幅され、１８７８塩基 対Ｅ３領域Ｘｂａ Ｉ断片の欠除をスクリーンされる。 この断片の配向は、ＢｇｌＩＩ部位がピーブルースクリプトＩＩ ＫＳのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ部位にもっとも近くなり、またＨｉｎｄＩＩＩ部位がピー ブルースクリプトＩＩ ＫＳのＴ３ ＲＮＡポリメラーゼ部位にもっとも近くな るような形であった。 第２に、ＩＴＲ、包膜シグナル、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、アデノウ イルス三部分リーダー（ＴＰＬ）配列及び連結配列がＰＣＲ増幅を用いて結集さ れた（図２）。ＩＴＲおよび包膜シグナル（Ａｄ−ｄ１３２７の配列１−３９２ ［ジェンバンク、アクセス番号Ｍ７３２６０のＡｄ５からの配列と同一のもの］ ここで引用例として組み込まれている）はＮｏｔＩあるいはＡｓｃＩ制限部位を 含むプライマーを用いてＡｄ−ｄ１３２７と一緒に増幅された（増幅１）。ラウ ス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーターはＡｓｃＩ部位およびＳｆｉＩ部位を含むプ ライマーを用いてプラスミドｐＲＣ／ＲＳＶ（配列２０９から６０５；カリホル ニア、サンジエゴ、インバイトロゲン）か ら増幅された（増幅２）。増幅１および２からのＤＮＡ製品は、ＮｏｔＩプライ マーおよびＳｆｉＩプライマーのみを用いて「オーバーラップ」ＰＣＲ法を使用 して結合された（増幅３）（ホートン他、バイオテクニクス、８：５２８−５３ ５（１９９０年））。反応１および２からの各当初ＤＮＡ増幅製品のＡｓｃＩ含 有末端の間の相補性は増幅の間にこれら２個の片の結合を可能にした。次いでＴ ＰＬは、それぞれＳｆｉＩおよびＸｂａＩ部位を含むプライマーを用いてＡｄ− ｄ１３２７で１６時間感染させた２９３細胞（ＡＴＣＣアクセス番号ＣＲＬ１５ ７３）から分離されｍＲＮＡから作られるｃＤＮＡから増幅された（増幅４）（ Ａｄ−ｄ１３２７の配列６０４９から９７３０［ジェンバンク、アクセス番号Ｍ ７３２６０のＡｄ５類似配列と同一のもの］）。増幅反応３および４からのＤＮ Ａ断片は次いでＮｏｔＩおよびＸｂａＩプライマーと共にＰＣＲを用いて結合さ れ（増幅５）、かくして完全遺伝子ブロックを生成した。 第３として、ＩＴＲ−包膜シグナル−ＴＰＬ断片が次いで精製され、ＮｏｔＩ およびＸｂａＩで切断され、ＮｏｔＩ、ＸｂａＩ切断ＰＨＲプラスミドに挿入さ れた。このプラスミドはｐＡｖＳ６Ａと名付けられその配向は断片のＮｏｔＩ部 位がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ部位の次に位置するものであった（図３）。 第４に、ＳＶ４０初期ポリＡシグナルがＨｐａＩ−ＢａｍＨＩ断片としてＳＶ ４０ ＤＮＡから除去され、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理されプラスミドｐ ＡｖＳ６ａのＳａｌＩ部位 に挿入され、ｐＡｖＳ６が生成された（図３および４）。 Ｂ．Ａｖ１Ｃｆ２およびＡｖ１Ｌｕｃｌの構築 Ａｖ１Ｃｆ２（図７）（イエイ他、遺伝子治療、１：１９２−２００（１９９ ４年））、Ｅ１欠失（１．１８地図単位から９．２地図単位）、Ｅ３欠失（７８ ．５地図単位から８４．７地図単位）アデノウイルスベクターが、正常ヒトＣＦ ＴＲｃＤＮＡコード化配列断片をｐＡｖＳ６のＥｃｏＲＩ部位に挿入することに より、ＣＦＴＲコーディング配列の５′末端がアデノウイルス５三部分リーダー にもっとも近くなるようにすることによりまず構築された。ＣＦＴＲ ｃＤＮＡ はＰｓｔＩ断片（ヌクレオチド７５から４７２５：ナンバリングについてはジェ ンバンク、アクセス番号Ｍ２８６８８を参照）としてプラスミドｐＢＱ４．７（ 図５）（カナダ、トロント、病気の子供病院、Ｌ．Ｃ．ツーイにより提供された もの）から除去され、平滑断片として挿入された。生成するプラスミド、ｐＡｖ Ｓ６−ＣＦＴＲ（図６）はＫｐｎＩで線形化され、トラップネル、先端薬物送達 レビュー、１２：１８５−１９９（１９９３年）で記述されているように２９３ 細胞内のＡｄ−ｄ１３２７の巨大（３５キロベース）ＣｌａＩ断片で組み換えら れ、ＡｖｌＣｆ２を形成した（図７）。 二重プラーク精製後、クローン分離株の同定は前に記載されているようにサザ ン分析、ＣＦＴＲの免疫沈殿により確認された（トルストシェフ、他、第９回名 古屋癌処置国際シンポジウム紀要、日本、名古屋１９９３年９月１７−１８日（ 刊行））。 Ａｖ１Ｌｕｃｌ（図７）（イエイ他、遺伝子治療、１巻、１９２−２００ペー ジ（１９９４年））は、それがホタルルシフェラーゼ遺伝子（ジェンバンク、ア クセス番号Ｍ１５０７７）を発現することを除けばＡｃｌＣｆ２のゲノム体制お よび配列と同一のアデノウイルスレポーターベクターである。 ホタルルシフェラーゼ遺伝子はｐＧＥＭ−ｌｕｃ（図８、プロメガ）から得ら れた。ｐＧＥＭ−ｌｕｃはホタルルシフェラーゼ遺伝子を接合（スプライシング ）するためにＳｔｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化された。 ホタルルシフェラーゼ遺伝子はｐＡｖＳ６のＥｃｏＲＶ部位に挿入され、ホタ ルルシフェラーゼコード化配列の５′末端はアデノウイルス５三部分リーダーに もっとも近くなった。生成するプラスミド、ｐＡｖＳ６−Ｌｃｕｌ（図９）はＫ ｐｎＩで線形化され、前記記載の通りＡｄ−ｄ１３２７の巨大（３５キロベース ）ＣｌａＩ断片で組換えられた。クローン分離株は次いで前記記載の通り同定さ れた。 二つのウイルスベクターは増殖され、ＣｓＣｌ配向での二重巻付けにより精製 され、ローゼンフェルド他、細胞、６８：１４３−１５５（１９９２年）で記述 されている通りに２９３細胞内で滴定された。 実施例２ 同時断続的ステロイド投与でのアデノウイルス媒介遺伝子転移 コットンラット（体重約１５０ｇ）が各グループ９ラット の４グループに分けられた。１日当り２ｍｇ／ｋｇの量の腹腔内注射によるデキ サメタゾンの同時投与のある場合とない場合で、ＡｖｌＣｆ２がコットンラット の肺に低用量（１０⁸ｐｆｕ）あるいは高用量（１０¹⁰ｐｆｕ）で鼻腔内吸入で 投与され、ベクター投与の開始１日前から１０日後まで与えられた。対照グルー プのラットは前記記載のデキサメタゾンの同時投与のある場合およびない場合で ＡｖｌＣｆ２の代りにＰＢＳを与えられた。 ベクター投与の３日後および４２日後に、各グループからの３匹のラットがＡ ｖｌＣｆ２ベクターの宿主応答を評価された。宿主応答の評価は肺組織病理学外 観、全肺洗浄細胞充実性、肺洗浄抗アデノウイルス生産、および細胞毒Ｔリンパ 球（ＣＴＬ）応答を含んでいた。 肺組織病理学の評価はイエイ他、ヒト遺伝子治療、５巻、７３１−７４４ペー ジ（１９９４年）記載の通りに行われた。肺は除去され、４℃で一晩パラホルム アルデヒド０．２５％（ｗｔ／ｖｏｌ．）、グルタルアルデヒド０．２５％（ｗ ｔ／ｖｏｌ．）に固定され、パラフィンに包埋され、６μｍ部分がヘマトキシリ ンおよびエオシンで染色された。 アデノウイルス感染３日後、免疫抑制治療薬を毎日投与あるいは投与されなか ったＡｖｌＣｆ２注射に対する応答によるコットンラットの肺の組織学的外観が 図１０Ａ、１０Ｂ、および１０Ｃで示される。図１０Ａはアデノウイルスではな くＰＢＳを受けた対照ラットの肺の一部である。図１０Ｂは免疫抑制治療薬なし でＡｖｌＣｆ２を受けたラットの肺の一部であ る。図１０Ｃはデキサメタゾンを毎日投与されてＡｖｌＣｆ２を受けたラットの 肺の一部である。すべての部分は１００倍拡大されている。図１０Ａ、１０Ｂ、 および１０Ｃで見られるように、対照ラットおよびアデノウイルスに感染された が免疫抑制治療薬を受けなかったラットと比較して、アデノウイルスおよび免疫 抑制治療薬を受けたラットでは肺実質炎症は少なかった。 肺洗浄液はＰＢＳ４．０ｍｌを用いて肺洗浄により収集され、全細胞数は血球 計の計数で決定され、あるいは細胞は光学顕微による好中球の割合を細胞遠心分 離調製で評価された。 図１１ＡはＰＢＳを受けた対照ラットと比較した感染３日後のＡｖｌＣｆ２で 感染したラットからの肺洗浄細胞計数のグラフである。対照ラットはデキサメタ ゾンを受けたあるいはデキサメタゾンを受けなかったかのいずれかであった。図 １１ＢはＰＢＳを受けた対照ラットと比較した感染４２日後のＡｖｌＣｆ２で感 染したラットからの肺洗浄細胞計数のグラフである。ラットはデキサメタゾンを 受けたあるいは免疫抑制治療薬を受けなかったかのいずれかであった。 図１１Ａで見られるように、炎症の頂上であるベクター投与３日後で、デキサ メタゾンは全肺洗浄細胞充実性で表される）非特異的宿主細胞炎症応答を著しく 減少させた。 肺洗浄抗アデノウイルス生産はエリザ検定で測定され以下の通り行われた。 １×１０¹¹ｐｆｕ／ｍｌでＡｖｌＬａｃＺ４、１０μｌ（イエイ、他、ヒト遺 伝子治療 、５巻、７３１−７４４ページ、 （１９９４年））が０．５ｍｌエッペンドルフ管の二重蒸留水９０μｌに加えら れた。管はアデノウイルスを殺すために３０分紫外線を照射され、タンパク質濃 度がバイオラッドキット（Bio-Rad Kit）を用いて測定された。０．１Ｍの炭酸 ナトリウム（ｐＨ９．６）８ｍｌが、ウエル当り５０μｌ当りアデノウイルス抗 原１０μｇ／４ｍすなわち１２５ｎｇのタンパク質産出を提供するために加えら れた。 抗原５０μｌが次いで９６ウエルマイクロタイタ平板（インミュロン２）の各 ウエルに加えられた。また平板は３７℃で１時間、あるいは室温で２時間、もし くは４℃で一晩保温された。平板は次いで２回ＰＢＳあるいは二重蒸留水で洗浄 された。 遮断緩衝液（ＰＢＳに１％のＢＳＡ）３００μｌが各ウエルに加えられ、平板 は１時間室温で保温された。平板は次いで二重蒸留水で洗浄された。 遮断薬が次いでバックグラウンドウエルに加えられた。抗体サンプル（すなわ ち前記記載の通り調製された肺洗浄サンプル）５０μｌが次いで１／４から始ま り１／８１９２で終る連続２倍の希釈で被覆ウエルに加えられた。未感染コット ンラットから得た血清の負の対照サンプル５０μｌが同じ連続希釈のも一つの被 覆ウエルに加えられた。この平板は２時間室温で保温され、０．０５％トウィー ン２０／ＰＢＳ３００μｌが加えられた。平板は５分室温で保温され、空にされ 、０．０５％トウィーン２０／ＰＢＳ３００μｌが再び加えられた。平板は再び 室温で５分保温され、また空にされた。平板は次いで二重蒸 留水あるいはＰＢＳで洗浄された。 ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ハムスターＩｇＧ（１０μｇ／１０μｌ）が、１ ｍｇ／ｍｌの作業液（１：１，０００希釈）を作るためにＢＳＡ１０ｍｌおよび ＰＢＳに加えられた。この溶液１００μｌが次いで各ウエルに加えられ、平板は 室温で２時間保温された。平板は次いで５回０．０１％トウィーン２０／ＰＢＳ ３００μｌで洗浄された。平板は次いで空にされ乾燥された。 テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質１００μｌが各ウエルに室温で加えら れ、色が直ちに展開した。青色がエリザ読み取り機でＯＤ₆₅₀での読み取りでモ ニターされた。ＴＭＢ停止溶液１００μｌを各ウエルに加えることによりＯＤ_{65 0} が０．５から０．６になった時に反応が停止された。ＯＤ₄₅₀が次いで反応停止 ５分後および１時間後に読み取られた。抗体力価はバックグラウンドＯＤより０ ．１大きいＯＤ値を与える希釈の逆数である。選択肢として、抗体力価は非特異 的バックグラウンドを上回る３標準偏差として決定される。ベクター投与３日お よび４２日後の各グループのラットに対して抗体力価で表現される平均結果は図 １２で示される。図１２で示されるように、デキサメタゾンを与えられたラット はデキサメタゾンを与えられなかったラットと比較してベクター投与４２日後に 抗体力価の減少を示した。 ＣＴＬ検定がベクター投与４２日後に実施された。 感作細胞が１００感染多重度でコットンラット肺繊維芽細胞をＡｄ−ｄ１３２ ７で感染させることにより用意された。細胞 は３日保温され、ＦＡＣＳによりヘキソン発現を検査された。細胞は次いでＰＢ Ｓ／ＥＤＴＡで洗浄され、トリプシンと接触され、洗浄され、回転され、ＲＰＭ Ｉ培地１ｍｌで再懸濁された。細胞は次いでＤＮＡを不活性化するために５，０ ００ラドで¹³Ｃｓで照射された。 脾臓が次いで未感染（対照）ラットおよび感染４２日後のアデノウイルス感染 ラットから分離された。脾臓は無菌ＨＢＳＳおよび氷で保存された。ＨＢＳＳ１ ０ｍｌが次いで５０ｍｌ管で２５／２７ゲージ針で各脾臓に注射された。脾臓は つぶされ、細胞濾過器を使って５０ｍｌ管に濾過された。この量は次いでＲＰＭ Ｉプラス１０％ＦＣＳで４０ｍｌにされた。管は１，５００ｒｐｍで１０分回転 された。赤血球が次いでＡＣＫ溶離緩衝液２．１ｍｌを加えて溶離され、液は１ 分以内で渦動された。この量はＲＰＭＩ−１０で５０ｍｌにされた。管は次いで １，５００ｒｐｍで１０分回転された。細胞ペレットは次いで再懸濁され、細胞 は１：１０溶液で計数された。脾臓細胞は次いで感作細胞と共に脾臓細胞と感作 細胞の比率がＲＰＭＩ内で４：１になるように平板に移された。脾臓細胞と感作 細胞は３７℃でインターロイキン−２、２０−５０単位／ｍｌの存在下で保温さ れた。インターロイキン−２は毎日５−６日にわたり加えられた。 標的細胞が３×１０⁶コットンラット肺繊維芽細胞をＡｄ−ｄ１３２７で１０ ０感染多重度で１時間感染させて用意された。培養培地が細胞に加えられ、５０ μＣｉより大きな量で⁵¹Ｃｒが１８時間加えられた。 標的細胞はコットンラット繊維芽細胞をＥＤＴＡ／ＰＢＳで洗浄して収穫され 、次いでトリプシン消化された。細胞は次いで洗浄され、回転され、培養培地５ ｍｌで再懸濁され、その計数された。細胞は１０⁵細胞／ｍｌに再懸濁され、１ ０⁴細胞／０．１ｍｌウエルがＣＴＬ検定のため使用された。 エフェクター細胞（すなわち時々Ｅｓ細胞として引用される脾臓細胞と感作細 胞を組合せたもの）は１．５００ｒｐｍで１０分４℃で回転された。細胞はＨＢ ＳＳ−１０、２ｍｌで再懸濁され、フィコール・ハイパック（Ficoll Hypaque） にのせられ、１，５００ｒｐｍで１０分回転された。最上部部分（４ｍｌ）が収 穫され、培養培地５ｍｌが加えられた。この材料は回転され、細胞ペレットは蓄 えられ、培養培地１ｍｌで再懸濁された。エフェクター細胞はエフェクター細胞 ５０μｌをトリパンブルー５０μｌで混合して計数された。 エフェクター細胞は次いでエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）の比率が３．１２５ 、６．２５、１２．５、２５、５０、および１００になるように、１０⁴標的細 胞を含むウエルに加えられた。細胞は次いで５００ｒｐｍで５分回転された。細 胞は次いで３７℃で４時間保温された。細胞は次いで回転され、上澄み１００μ ｌがウォーラックガンマカウンターを用いて⁵¹Ｃｒ放出を測定された。（デキサ メタゾン処理を受けたものおよびそうでないものの）感染ラットから、および２ 匹の未感染対照ラットから採取された脾臓におけるＣＴＬ応答の平均結果が図１ ３で示される。 図１３で示されるように、低いＣＴＬ応答がデキサメタゾン で処理された感染ラットから得られた脾臓から得られた。 ベクター投与の４２日後、各グループの残る３匹のラットはＡｖ１Ｌｕｃｌの 鼻腔内肺投与を２×１０⁹ｐｆｕの用量で受けた。もともとＰＢＳを受けた残る 対照ラットもまたＡｖ１Ｌｕｃｌを２×１０⁹ｐｆｕの用量で受けた。肺洗浄抗 アデノウイルス抗体生産は前記記載の方法に従ってＡｖ１Ｌｕｃｌ投与の３日後 に評価され、その結果は図１２で示される。図１２で示されるように、もともと ＡｖｌＣｆ２の１０¹⁰ｐｆｕを受け、またデキサメタゾンで処置されたラットは デキサメタゾンを受けなかったラットと比べて抗体力価の減少を示した。 ホタルルシフェラーゼ遺伝子の転移および発現の効率は、イエイ他、遺伝子治 療、１巻、１９２−２００ページ（１９９４年）に記載された通り、投与３日後 に直接肺内ルシフェラーゼ酵素活性を通常の光測定による光単位（１ｕ）で定量 化することにより評価された。結果は図１４で示される。図１４で示されるよう に、各ドットは１匹のラットのルシフェラーゼ酵素活性を表し、クロスバーは各 グループの平均値を表す。反復アデノウイルス媒介遺伝子転移の効率は、最初の アデノウイルス投与の時点でデキサメタゾンを受けなかったラットに比べてＡｖ ｌＣｆ２およびデキサメタゾンを受けたラットの方がはるかに高かった（それぞ れ１１，７８６±３５２３ ｌｕ対６２２±１９２ ｌｕ）。Ａｖ１Ｌｕｃｌか らの遺伝子転移の効率もまたもともとデキサメタゾンと一緒にＰＢＳを受けた対 照グループよりも高かった。 実施例３ アデノウイルスベクターの有効な反復投与を可能にするＤＳＧあるいは高用量 シクロホスファミドを用いる体液免疫応答の抑制 この実施例は実験時に生後５乃至６週のＣ５７ＢＬ／６オスマウス（インディ アナ、インディアナポリス、ハーラン・スプレイグ・ドーリー）に対しアデノウ イルスベクターＡｖｌＬａｃＺ４およびＡｖ１Ｈ９Ｆ２の静脈内投与について述 べる。ＡｖｌＬａｃＺ４は核標的βガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）を含む アデノウイルスベクターであり、１９９５年４月１３日公開されたＰＣＴ出願番 号ＷＯ９５／０９６５４に記述されている。Ａｖ１Ｈ９Ｆ２はアデノウイルスシ ャトルプラスミドベクターｐＡｖｌＨ９ＦＲ（回１５）の誘導体から構築され、 これはヒト因子IX ＤＮＡを含み、１９９４年１２月２２日公開されたＰＣＴ出 願番号ＷＯ９４／２９４７１に記述されている。 Ａｖ１Ｈ９Ｆ２を構築するために、シャトルプラスミドｐＡｖｌＨ９ＦＲが制 限酵素Ｓｆｉ１で消化され、ＤＮＡ末端はＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平 滑にされ、またＤＮＡ分子は連結反応により再循環された。コンピテントＤＨ５ 細胞は形質転換されアンピシリン耐性クローンは増幅され、ミニプレップＤＮＡ の制限酵素消化によりスクリーンされた。正のクローンが同定され、生成するシ ャトルプラスミドはｐＡｖＳ１７Ｈ９Ｆとして引用された。 続いて２９３細胞がｐＡｖＳ１７Ｈ９ＦおよびＣ１ａＩ消化 Ａｄ−ｄ１３２７の巨大ＤＮＡ断片と一緒に同時形質移入された。組換えアデノ ウイルスベクタープラークが採取され、拡張され、エリザにより因子IXの発現を スクリーンされた。正のクローンは同定され増幅され、かくしてベクターＡｖ１ Ｈ９Ｆ２を生成した。このベクターの左端の図形は図１６で示される。Ａｖ１Ｈ ９Ｆ２は三部分リーダー、つまりＴＰＬの最初の所で１塩基対を欠失し、これが 有効にＡＴＧをＣＴＧに変化させる。ベクターの構造は制限酵素診断法、および ＲＳＶプロモーターと因子IX ｃＤＮＡの３′未翻訳領域の間の領域のＤＮＡ配 列分析により実証された。 １５匹のマウスが３３ｍｇ／ｋｇのデオキシスペルグアリンＤＳＧ（日本、東 京、日本化薬工業）を用いて、１日１回ベクター投与の１日前から全体で８日腹 腔内投与で免疫抑制された。減圧凍結乾燥ＤＳＧ１００ｍｇを含む小びんが２５ ｍｇ／ｍｌ溶液を産出するため注射グレード水３．８ｍｌで溶かされ、これはア リコートされ、−２０℃で乾燥された。毎日、免疫抑制直前に、アリコートは室 温で解凍され、０．７ｍｌが２．５ｍｇ／ｍｌ溶液を産出するためにハンクス平 衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）６．３ｍｌと混合された。マウスは１度ＤＳＧの最初の 用量投与直前に重量測定された。６匹のマウスは免疫抑制養生の第２日に尾部血 管注射でＡｖ１１ａｃＺ４、１×１０⁸ｐｆｕを受け５週後にＡｖｌＨ９Ｆ２、 １×１０⁸ｐｆｕを受けた。別の６匹のマウスは免疫抑制の５週後にＡｖｌＨ９ Ｆ２のみを受けた。３匹のマウスは免疫抑制されたが、アデノウイルスベクター は受けなかった。 ６匹のマウスが低用量（１００ｍｇ／ｋｇ）のシクロホスファミド（シグマ） で免疫抑制され、１５匹のマウスが高用量（３００ｍｇ／ｋｇ）で処置された。 動物はアデノウイルスベクター投与の１日前にシクロホスファミドの腹腔内単一 投与を受けた。低用量のシクロホスファミドで処置された６匹すべてのマウスは 更にシクロホスファミド（投与）１日後Ａｖ１１ａｃＺ４、１×１０⁸ｐｆｕを また５週後ＡｖｌＨ９Ｆ２、１×１０⁸ｐｆｕを受けた。高用量のシクロホスフ ァミドで免疫抑制された６匹のマウスは翌日Ａｖ１１ａｃＺ４、１×１０⁸ｐｆ ｕを、また５週後にＡｖｌＨ９Ｆ２、１×１０⁸ｐｆｕを受けた。別の６匹はＡ ｖ１１ａｃＺ４は受けずＡｖｌＨ９Ｆ２を受けた。最後に３匹のマウスは免疫抑 制されたが、アデノウイルスベクターは受けなかった。 １２匹のマウスは１日１回ベクター投与の１日前から８日間腹腔内経由でデキ サメタゾン（ニューヨーク、シャーリー、アメリカン・リエイジェント・ラボラ トリーズ、インコーポレイテッド）５ｍｇ／ｋｇで免疫抑制された。この内６匹 のマウスはデキサメタゾン処置の２日目にＡｖ１１ａｃＺ４、１×１０⁸ｐｆｕ を、また５週後にＡｖｌＨ９Ｆ２、１×１０⁸ｐｆｕを受ける。５匹の免疫抑制 されたマウスはＡｖｌＨ９Ｆ２のみを受け、１匹はベクターを受けなかった。 Ａｖ１１ａｃＺ４投与の５週後、但しＡｖｌＨ９Ｆ２の投与の前に、血漿がい くつかのマウスから調製され、抗アデノウ イルス中和抗体を分析された。中和抗体は免疫抑制なしでＡｖ１１ａｃＺ４を受 けるマウスの血漿内で検出されたが、ベクターおよびＤＳＧあるいは高用量のシ クロホスファミドのいずれかを受けたマウスは中和抗体を検出しなかった。対照 的に、低用量のシクロホスファミドあるいはデキサメタゾンで免疫抑制されたマ ウスは中和抗体を展開した。 ２０匹のマウスにおける中和抗体力価は以下の表Ｉで与えられる。表Ｉで示さ れるように、ＤＳＧはデオキシスペルグアリン、Ｃｙはシクロホスファミド、お よびＤｅｘはデキサメタゾンである。 ＡｖｌＨ９Ｆ２投与１週後、血漿が調製されヒト因子IXの水準を決定するため にエリザで分析された。この結果は図１７で示される。免疫抑制なしでＡｖ１１ ａｃＺ４を受け、次いで５週後ＡｖｌＨ９Ｆ２を受けたマウスはヒト因子IXを発 現しなかった。免疫抑制剤もＡｖ１１ａｃＺ４も受けなかったがＡｖｌＨ９Ｆ２ で処置されたマウスは平均で９．２μｇ／ｍｌを発現した。Ａｖ１１ａｃＺ４送 達時にＤＳＧで免疫抑制され、次いでＡｖｌＨ９Ｆ２を受けたマウスは平均で６ ．６μｇ／ｍｌを発現した。ＤＳＧで免疫抑制されしかしＡｖ１１ａｃＺ４は受 けず、次いでＡｖｌＨ９Ｆ２で処置されたマウスは５．２μｇ／ｍｌの平均水準 を有していた。最後にＤＳＧで処置されしかしいずれのベクターも受けなかった マウスは、ヒト因子IXを発現しなかった。 Ａｖ１１ａｃＺ４投与の時点で低用量のシクロホスファミドで免疫抑制された マウスは、ＡｖｌＨ９Ｆ２送達後ヒト因子IXを発現しなかった。高用量のシクロ ホスファミドで処置されたがＡｖ１１ａｃＺ４を投与されなかったマウスは、Ａ ｖｌＨ９Ｆ２送達１週後平均８μｇ／ｍｌを発現した。Ａｖ１１ａｃＺ４処置時 点で高用量のシクロホスファミドで免疫抑制されたマウスは、ＡｖｌＨ９Ｆ２処 置後平均１５．４μｇ／ｍｌのヒト因子IXを発現した。シクロホスファミドで処 置されたがいずれのアデノウイルスベクターでも処置されなかったマウスはヒト 因子IXを発現しなかった。 デキサメタゾンで免疫抑制されたがＡｖ１１ａｃＺ４では処置されなかったマ ウスは、ＡｖｌＨ９Ｆ２投与１週後平均 ５．５μｇ／ｍｌのヒト因子IXを発現した。しかし免疫抑制時点でＡｖ１１ａｃ Ｚ４を受けたマウスはＡｖｌＨ９Ｆ２送達後に因子IXを発現しなかった。免疫抑 制されたがいずれのベクターをも処置されなかったマウスはヒト因子IXを発現し なかった。 実施例４ 反復投与を可能に死するアデノウイルスベクターに対する体液免疫応答の抑制 この実施例は実施例３に含まれるデータを推敲し敷衍したものである。この実 施例では下記の材料および方法が採用される。 アデノウイルスベクター Ａｖ１ＬａｃＺ４およびＡｖｌＨ９Ｆ２は実施例３で記述された。ＡｖｌＨ９ ＦＲは２９３細胞をｐＡｖｌＨ９ＦＲ（図１５）およびＣｌａＩ消化Ａｄ−ｄ１ ３２７から得る巨大ＤＮＡ断片と共に同時形質移入された。組換えアデノウイル スベクタープラークが採取され、拡張され、エリザにより因子IXの発現をスクリ ーンされた。正のクローンが同定され、増幅され、かくしてベクターＡｖｌＨ９ ＦＲを生成した。ＡｖｌＨ９Ｆ２と同様に、このベクターは中心切形第１イント ロンおよびヒト因子IX遺伝子からの完全５′および３′未翻訳領域を含んでいる 。中心切形第１イントロンおよび３′未翻訳領域はジャラット、他、ＥＭＢＯ Ｊ． 、９巻、３２９５−３３０１ページ（１９９０年）に記載されたものと基本 的には同じ配列である。 ＡｖｌＡＬＡＰＨ８１はアデノウイルスベクターであり、それはマウスアルブ ミンプロモーターから発現されたＢ領域欠失ヒト因子VIII ｃＤＮＡを含み、公 開ＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２９４７１に記述されている。 すべてのベクター株はＥ１ａ配列の定量ＰＣＲ分析で決定された通り１０⁶野 生型アデノウイルス内で１個以下を含んでいた。 免疫抑制剤 デオキシスペルグアリン（日本、東京、日本化薬工業株式会社製造）は、ニュ ージャージー、プリンストン、ブリストル−マイヤーズ−スクイブからの贈り物 である。１００ｍｇガラスビンのデオキシスペルグアリンは水で溶かされて最終 濃度２５ｍｇ／ｍｌとなり、アリコートされ、−７０℃で凍結された。凍結株は 室温で解凍され、注射の前にハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で希釈された。 デオキシスペルグアリンは器官移植で現在臨床試験されている免疫抑制剤であ る。これは抗原特異的Ｂ細胞に対して有力で長期の効果を持ち、タンパク質抗原 と同時投与されると特異的抗体の生産を効果的に妨げることが示された（アレー ガー、他、移植、５７巻、１７８６−１７９４ページ（１９９４年）；テッパー 、ニューヨーク科学アカデミー年報、１２３−１３２ページ（１９９３年）；タ フバソン、他、移植紀要、２６巻、３０２９−３０３９ページ（１９９４年）） 。ＤＳＧの作用モードは分子レベルでは完全には理解されていない。それはＢ細 胞およびＴ細胞の分化に干渉し、かつ 抗原処理に干渉することをデータは示唆している。ＤＳＧがｋ軽鎖発現を阻害し 、従ってプレＢ細胞表面でＩｇＭ発現を遮断したことを最近の研究が示した（テ ッパー、１９９３年）。更にデータはＤＳＧがＮＦｋＢの核転移を阻害したこと を示し、それはＤＳＧがＢ細胞およびＴ細胞の分化を阻害する機構であり得るこ とを示した。最後にＤＳＧがＨｓｃ７０、熱ショックタンパク質と結合すること が示された（テッパー、１９９３年）。熱ショックタンパク質はタンパク質折り たたみ、分子付添い、ＭＨＣ分子のペプチド負荷、および抗原プレゼンテーショ ンを伴う。従ってＤＳＧのＨｓｃ７０への結合は抗原プレゼンテーションに対す る影響を説明するものとなる。 シクロホスファミド（Ｃｙ）はシグマから入手され、ＨＢＳＳに溶解された。 デキサメタゾン（Ｄｅｘ）溶液はニューヨーク、シャーリー、アメリカン・リエ ージェント・ラボラトリーズ・インコーポレイテッドから得られ、注射の前にＨ ＢＳＳで希釈された。３種すべての免疫抑制剤は、以下に示される用量に従って 腹腔内に送達された。 動物の処置 Ｃ５７ＢＬ／６マウスはハーラン・スプレイグ・ドーリー（インディアナ、イ ンディアナポリス）から得られた。アデノウイルスベクターはベクター株の適当 量をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）０．５ｍｌで希釈した後尾部血管注射を 経て投与された。テキストに示された時点で、血液が眼窩後部叢から得られた。 血漿サンプル調製のために、クエン酸ナトリウムが 直ちに０．３８％（ｗ／ｖ）の最終濃度に加えられた。血清サンプルを調製する ために、血液は凝固させられた。サンプルは５分エッペンドルフ・マイクロフュ ージで遠心分離され、その後血漿あるいは血清は収集され、アリコートされ、凍 結された。 ヒト因子VIIIエリザ ヒト因子VIIIの血漿水準はコネリー、他、ヒト遺伝子治療、第６巻、１８５− １９３ページ（１９９５年）に記述された通り、エリザにより決定された。Ｂ領 域欠失ヒト因子VIIIを含むマウス血漿サンプルを用いる感受性の限界は３乃至６ ｎｇ／ｍｌであった。マウス血漿サンプルは検定前に１：５で希釈されたので、 実際の検出限界は１５乃至３０ｎｇ／ｍｌであった。 ヒト因子IXエリザ ヒト因子IXの血漿水準はエリザにより決定された。アサーラクロムIX：Ａｇエ リザキットはアメリカン・バイオプロダクツ・カンパニー（ニュージャージ、パ ーシッパニイ）から購入され、メーカーの指示に従って行われた。感受性の限界 は１．６ｎｇ／ｍｌであった。 抗アデノウイルス抗体検定 マウス血漿あるいは血清サンプルは５５℃、３０分で熱不活性化され、次いで 改良最少必須培地（メリーランド、ロックビル、バイオフルイズ）プラス２％の ＦＢＳ（ＩＭＥＭ／２％ＦＢＳ）で１：２で始まる二部分の段階で熱不活性化さ れた。５５μｌの各サンプルが１０μｌのＡｖｌｌａｃＺ４（４×１０⁵ｐｆｕ を含むもの）で混合され、１時間３７ ℃で保温され、ほぼ密集の２９３細胞の９６ウエル平板（４×１０⁴細胞／ウエ ル）に加えられた。組織培養恒温器で６０分後、ウイルスは各ウエルから吸引さ れＩＭＥＭ／１０％ＦＢＳ、１５０μｌで置換された。翌日細胞は固定され、こ れまでに記述されているようにβガラクトシダーゼ発現のために染色された（ス ミス、他、自然遺伝学、５巻、３９７−４０２ページ（１９９３年））。不活性 抗体の不存在下ではすべての細胞は青に染色した。各サンプルの不活性化抗体の 力価は細胞の２５％以下が青に染色される最高希釈の逆数として報告された。 結果 アデノウイルスベクターに対する体液免疫応答の用量依存性 アデノウイルスベクターの反復投与を検討したこれまでの研究はベクターの相 対的に高用量を採用しており、これは免疫応答の強度を最大にするものと期待さ れた（スミス、他、１９９３年；コザルスキー、他、生物科学ジャーナル、２６ ９巻、１３６９５−１３７０２ページ（１９９４年）；ケイ、他、全米科学アカ デミー紀要 、９１巻、２３５３−２３５７ページ（１９９４年）；イエイ、他、遺伝子治療 、１９２−２００ページ（１９９４年）；ヤング、他、ウイルス学ジ ャーナル 、６９巻、２００４−２０１５ページ（１９９５年）；デイ、他、全米 科学アカデミー紀要 、９２巻、１４０１−１４０５ページ（１９９５年）；バー 、他、遺伝子治療、２巻、１５１−１５５ページ（１９９５年））。 中和抗体の生産および反復投与の遮断が接種されるベクター の用量に依存するかどうかを決定するために、各種の用量のアデノウイルスベク ターＡｖｌｌａｃＺ４が尾部血管を経てＣ５７ＢＬ／６マウスに投与された。ベ クター接種材料は単一ｌｏｇ増分で１×１０³ｐｆｕから１×１０⁸ｐｆｕまで変 動した。ベクター送達３４日後、抗アデノウイルス中和抗体の血清水準がベクタ ーを１×１０⁵ｐｆｕあるいはそれ以上を受けたマウスで測定された（図１８） 。マイナス記号はコホート内のマウスのいずれにも抗体を検出できなかったこと を示す。１×１０⁸ｐｆｕのベクターを受けたマウスに対応するプラス記号は５ 匹のマウスの内３匹が８の抗体力価を持ち、一方２匹は抗体力価を検出できなか ったことを示す。かくして１×１０⁸ｐｆｕを受けた５匹のマウスの内の３匹は ４×１０⁵ｐｆｕのＡｖｌＬａｃＺ４を中和するのに十分な抗アデノウイルス抗 体の水準を有し、一方２匹のマウスは検出できない水準にあった。ベクターの低 用量を受けたマウスはいずれもこの相対的に過酷な中和検定を用いても抗体を検 出できなかった。 ＡｖｌｌａｃＺ４投与３５日後に、各マウスはヒト因子IXをコード化するアデ ノウイルベクターであるＡｖｌＨ９ＦＲを２×１０⁸ｐｆｕ受けた。１週間後ヒ ト因子IXの血漿水準はエリザで測定された（図１８）。平均で約２μｇ／ｍｌの 因子IXがＡｖｌｌａｃＺ４を受けなかったか、あるいは第１ベクター１×１０⁵ ｐｆｕまでを受けたマウスで検出された。因子IXは更に１×１０⁶ｐｆｕおよび １×１０⁷ｐｆｕを受けたマウスで水準は減少したけれども直ちに検出され た。ＡｖｌｌａｃＺ４、１×１０⁸ｐｆｕを受けたマウスはＡｖｌＨ９ＦＲ投与 後殆ど僅かしかあるいは全然ヒト因子IXを産出しなかった。かくして有効な遺伝 子転移および発現は最初のベクター用量があるしきい値水準以下であるという条 件下で第２ベクター投与で達成することができる。これらのデータはＣ５７ＢＬ ／６マウス内の静脈内送達のために、この値が１０⁷および１０⁸ｐｆｕであるこ とを示している。 一過性免疫抑制はベクター再投与の効率を増加させる 一過性免疫抑制がアデノウイルスベクターの再投与を可能にするかどうかを決 定するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスがＡｖｌｌａｃＺ４の１×１０⁸ｐｆｕを 投与する時にデオキシスペルグアリン（ＤＳＧ）、シクロホスファミド（Ｃｙ） 、あるいはデキサメタゾン（Ｄｅｘ）のいずれかを用いて免疫抑制された。前に 示されたように、この用量は有効な第２送達を完全に妨げた。マウスは毎日ＤＳ Ｇを３３ｍｇ／ｋｇ注射され、それはベクター送達１日前から開始され更に７日 続けられた。デキサメタゾンは同じ時間コースで５ｍｇ／ｋｇの用量で送達され た。シクロホスファミドはベクター送達の１日前１回１００ｍｇ／ｋｇあるいは ３００ｍｇ／ｋｇのいずれかを投与された。対照マウスは免疫抑制なしでＡｖｌ ｌａｃＺ４を受け、あるいは最初のベクター送達なしで免疫抑制された。 ベクター投与の５週後、抗アデノウイルス中和抗体の血漿水準が測定された（ 図１９）。ＤＳＧあるいはシクロホスファミド３００ｍｇ／ｋｇで免疫抑制され たマウスは中和抗体を検出しなかったが、ＡｖｌｌａｃＺ４を受けた他のすべて のマウス は中和抗体を生成した。第１ベクター注射３５日後、マウスはＡｖｌＨ９Ｆ２、 １×１０⁸ｐｆｕを受けた。ＡｖｌＨ９Ｆ２注射１週後、血漿サンプルが調製さ れ、ヒト因子IXの水準がエリザで測定された（図１７）。ＤＳＧあるいはシクロ ホスファミド３００ｍｇ／ｋｇで免疫抑制されたマウスは第１ベクターで処置さ れなかったマウスの水準とほぼ同じ水準でヒト因子IXを発現した。Ａｖｌｌａｃ Ｚ４投与の時点で免疫抑制されなかったマウスの血漿ではヒト因子IXは検出され なかった。これらの研究で使用された条件下で、デキサメタゾンあるいはシクロ ホスファミド１００ｍｇ／ｋｇでの免疫抑制は反復注射の際に因子IXの発現を可 能とするには有効ではなかった。かくして第２ベクター注射での遺伝子導入発現 を達成する能力はＤＳＧあるいは高用量シクロホスファミド処置による中和抗体 の抑制と相関していた。 第２ベクターＡｖｌＨ９Ｆ２投与時に、シクロホスファミドあるいはデキサメ タゾンで免疫抑制された各コホートのマウスの半分は第１ベクター送達と同じ処 方を用いて再び免疫抑制された。５週後、抗アデノウイルス中和抗体の血漿水準 が測定された。シクロホスファミド３００ｍｇ／ｋｇで免疫抑制されたマウスは 中和抗体を検出しなかったが、一方シクロホスファミド１００ｍｇ／ｋｇあるい はデキサメタゾン５ｍｇ／ｋｇで免疫抑制されたマウスは測定可能な応答を示し た（データは示されていない）。ＡｖｌＨ９Ｆ２注射３５日後、因子VIIIベクタ ー、ＡｖｌＡＬＡＰＨ８１の１×１０⁹ｐｆｕがシクロホスファミド３００ｍｇ ／ｋｇで免疫抑制されたマウスに投与され た。更に因子VIIIベクターが免疫抑制されずにＡｖｌｌａｃＺ４およびＡｖｌＨ ９Ｆ２を受けた対照マウスおよびまた投薬されていないマウスにも投与された。 １週後、ヒト因子VIIIの血漿水準がエリザで測定された（図２０）。ＡｖｌＡＬ ＡＰＨ８１ベクターのみを受けた対照マウス、および２個の事前ベクター注射時 点にシクロホスファミド３００ｍｇ／ｋｇで免疫抑制されたマウスはヒト因子VI IIを発現した。ＡｖｌｌａｃＺ４およびＡｖｌＨ９Ｆ２を免疫抑制なしで受けた マウス、およびＡｖｌｌａｃＺ４伝達時点で免疫抑制のみを受けたマウスはヒト 因子VIIIを発現しなかった。 ＤＳＧは臨床関連用量時に有効な反復投与を許容する ＤＳＧあるいはシクロホスファミドのいずれかの高用量がアデノウイルスベク ターの再投与を許容したが、臨床関連用量のシクロホスファミドおよびデキサメ タゾンは有効でなかったことを先の実験は示した。次の目標は低用量のＤＳＧが 有効であるかどうかを決定することであった。最初の実験で使用されたＤＳＧの 用量（３３ｍｇ／ｋｇ）はマウスにおいて最大許容用量に近く、器官移植でヒト 臨床実験で使用される５−７ｍｇ／ｋｇに比べて著しく高い（鈴木、他、ニュー ヨーク科学アカデミー年報 、６９６巻、２６３−２６９ページ（１９９３年）； ジンドール、他、シナイ山医学ジャーナル、６１巻、５１−５６ページ（１９９ ４年））。低用量がベクター再投与を許容するのにまた有効であるかどうかを決 定するために、マウスはＡｖｌｌａｃＺ４の１×１０⁸ｐｆｕの投与時点でＤＳ Ｇ５、１０、２０、および３３ｍｇ／ｋｇで免疫抑 制された。免疫抑制はベクター送達の１日前に開始し全体で８日継続された。ベ クター送達の日に、アデノウイルスの注射後にＤＳＧは与えられたが、それは抗 原の後に投与された時にＤＳＧがもっとも有効であったためであった（高原、他 、移植、５３巻、９１４−９１８ページ（１９９２年））。 ３５日後各マウスはＡｖｌＨ９Ｆ２、１×１０⁸ｐｆｕを受けた。ＡｖｌＨ９ Ｆ２投与１週後、ヒト因子IX血漿水準はエリザで測定された（図２１）。Ａｖｌ ｌａｃＺ４で事前免疫されなかった対照マウスは平均９μｇ／ｍｌのヒト因子IX を発現した。ＡｖｌｌａｃＺ４は受けたが免疫抑制されなかった他の対照マウス はＡｖｌＨ９Ｆ２投与後ヒト因子IXを発現しなかった。３３ｍｇ／ｋｇのＤＳＧ で免疫抑制された１匹のマウスは１２μｇ／ｍｌのヒト因子IXを発現した。２０ ｍｇ／ｋｇのＤＳＧで免疫抑制された６匹のマウスの内の５匹は平均３．０μｇ ／ｍｌのヒト因子IXを発現し、１匹のマウスは何も発現しなかった。１０ｍｇ／ ｋｇの用量で免疫抑制されたマウスは３０ｎｇ／ｍｌから８μｇ／ｍｌまでにわ たる広範囲のヒト因子IXを発現した。５ｍｇ／ｋｇで免疫抑制された３匹のマウ スはヒト因子IXを発現せず、一方他の３匹のマウスは２乃至７μｇ／ｍｌにわた る水準を発現した。ＡｖｌｌａｃＺ４投与の時点で免疫抑制されなかったマウス はヒト因子IXを発現しなかった。 討議 データが示す所によると、多重静脈内投与および生成する遺伝子導入発現はベ クター送達の時点で短いコースの免疫抑制で 処理された免疫能動物で達成することができる。この観察は重要である。という のはアデノウイルスベクターに対し向けられる体液免疫応答は再投与を妨げると いうことを最近のいくつかの研究が示しているからである（スミス、他、１９９ ３年；ケイ、他、１９９４年；イエイ、他、１９９４年；ヤング、他、１９９５ 年）。ベクターを再投与できないことはアデノウイルスベクターの臨床利用に重 要な障害を提供した。というのは有効な再投与は慢性疾病の遺伝子治療にこれら ベクターの臨床適用が間違いなく必要とされるからである。 免疫抑制の不在の下で発現および反復用量投与を得ることの失敗はアデノウイ ルス中和抗体と相関する。そのような抗体が十分に再投与を遮断する証拠はヤン グ他、１９９５年に提供され、彼はベクターで事前処理されたマウスから投薬さ れていないマウスへの血清の受身送達が肝臓におけるベクター媒介遺伝子発現を 妨げることができることを示した。反復投与を妨げる免疫システムの役割もまた ベクターの反復投与が免疫不全マウスに有効であるという観察から示された（ヤ ング、他、１９９５年；デイ、他、１９９５年；バー、他、遺伝子治療、２巻、 １５１−１５５ページ（１９９５年））。この結果は、ＡｖｌＡＬＡＰＨ８１、 ５×１０⁸ｐｆｕ送達５週後の重症複合型免疫不全症マウス（scid mice）へのＡ ｖｌＨ９Ｆ２の有効な投与を例示することにより確認された（データは示されて いない）。 アデノウイルス投与に対する体液応答を記述するこれまでの報告書は相対的に 高ベクター用量を使用していたので、我々は 当初のベクター用量と有効な反復遺伝子転移を達成する能力との間に関係を評価 した。その結果は免疫応答の大きさがベクターの当初の量に依存しており、この 用量がしきい値以下であるとすると、第２投与が可能であることを示していた。 この水準が僅か１乃至２桁臨床関連ベクター用量以下に過ぎなかったという結論 は更にベクター送達の時点での免疫抑制が再投与を許容するということを示唆し ていた。 抗アデノウイルス中和抗体力価が尾部血管経由でベクター単一投与の後にマウ スの中で少なくとも１０ケ月保持されることを出願人は観察した。力価の長期の 保持は、形質導入細胞において、進行中のアデノウイルスバックボーン遺伝子発 現が低水準にあるということに帰因している。バックボーン遺伝子発現を減少し あるいは除去するように設計されたベクターはより弱い遺伝子応答を引き出し、 従って再投与を成功させるための免疫抑制の必要を少なくさせる。 ＤＳＧの一つの重要な性質は、それが免疫システムの一般的な抑制を生み出さ ず、それが薬剤処置の時点で提示される特異的抗原に対する応答の選択的欠除に 帰着するということである。ベクター送達に続く７日間にわたるＤＳＧの免疫抑 制はベクターに対する体液応答を効果的に阻害し、効果的な第２投与を可能にし たことを我々は発見した。ＤＳＧを用いる最初の実験は３３ｍｇ／ｋｇという高 用量を採用したが、これはマウスにおける最大許容用量に近くまたヒト実験で使 用される用量の数倍高い量である。同じ８日コースにわたり投与され、内７日が ベクター処置後になる時、低用量のＤＳＧはまたベクターの 反復投与を可能とするのに有効であった。因子IX発現の水準でより大きな個々の 変化が減量された用量で見られ、もっとも試験された最低の用量（５ｍｇ／ｋｇ ）でも著しい因子IX発現が６匹の動物の内３匹で見られた。 ベクター注射の１日前３００ｍｇ／ｋｇの用量で投与されたシクロホスファミ ドもまた体液応答を遮断するのに有効であり因子IXアデノウイルスベクターを用 いた完全に有効な第２回注射を可能にした。更にベクターをコード化する因子VI IIを用いた第３回注射もまた、前の２個のベクター投与でそれぞれシクロホスフ ァミドの単一用量の前に置かれた場合に完全に有効であった。シクロホスファミ ドはホジキン病および他の白血病の治療で抗癌剤として臨床的に使用される。そ れはまた因子VIIIタンパク質置換治療で阻害体を進化させる血友病患者治療に免 疫抑制剤として使用される（エイルドート、血液学アメリカンジャーナル、４７ 巻、２０８−２１７ページ（１９９４年）；ニルソン、他、ニューイングランド 医学ジャーナル 、３１８巻、９４７−９５０ページ（１９８８年））。マウスで 再投与を成功裡に得るために使用される用量がヒトで一般に使用されるものより もかなり高いが、一方より低い臨床的に受け入れられる用量がヒトに有効である かどうかは確証すべきものとして残っている。器官移植セッティングの経験から 示唆される一つの可能性は、免疫抑制剤の組合せが毒性がより少なくて免疫シス テムのより有力な抑制を産みだすであろうということである。例えばシクロホス ファミドはデキサメタゾンと併用されると低用量で有効である。必要とされる免 疫抑制の度合が治療 を実施するのに必要となるベクターの用量に依存することも可能である。この研 究で使用されたＡｖｌＨ９Ｆ２の用量、１×１０⁸ｐｆｕは５−１０μｇ／ｍｌ のヒト因子IXの血漿水準を生み出し、これは血友病患者を治療する水準を２０− ５０倍上回っていた。高水準で導入遺伝子産物を発現し比較的低い用量で投与す ることのできるＡｖｌＨ９Ｆ２などのベクターは免疫刺激の範囲および必要とさ れる免疫抑制の度合を必ず減少させるものとなる。 要約すると、全身投与アデノウイルスベクターの有効な反復性送達は短期間の 免疫抑制で達成できることを出願人は示してきた。重要なことは、これはヒトで の使用が認められるかあるいは臨床試験をされているかの薬剤を用いて達成でき るということである。 この明細書において引用されたすべての特許、公開情報（公開特許出願を含む ）、およびデータベースアクセス番号、ならびに受託アクセス番号の開示は、あ たかも各個別特許、公開情報、およびデータベースアクセス番号、ならびに受託 アクセス番号が特異的かつ個別に引用例として組込まれるように指示されたかの ように引用例としてここに特異的に組込まれる。 しかしこの発明の範囲は前記の特異的な実施例に限定されるものではない。こ の発明は特に記載されたもの以外にも実施することができ、しかも以下にある特 許請求の範囲内にある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 45/00 ＡＢＣ Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者 マクレランド，アラン アメリカ合衆国，20882 メリーランド, ゲイザーズバーグ，ウッドフィールド ロ ード 23709 (72)発明者 カレコ，マイケル アメリカ合衆国，20854 メリーランド, ロックビル，ハースストーン コート ８ (72)発明者 スミス，セオドア アメリカ合衆国，20854 メリーランド, ジャーマンタウン，クラブ ヒル ドライ ブ 20165

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．遺伝子治療処置を宿主に実施する一つの方法であって （ａ）宿主に（ｉ）治療薬をコード化する少なくとも１個のＤＮＡ配列を含む アデノウイルスベクターおよび（ii）免疫抑制剤を投与し、 （ｂ）前記アデノウイルスベクターおよび前記免疫抑制剤の投与を中断し、 （ｃ）段階（ａ）の治療薬をコード化する少なくとも１個のＤＮＡ配列を含む 前記アデノウイルスベクターおよび前記免疫抑制剤の投与のコースを少なくとも １回反復し、前記アデノウイルスベクターは治療効果を前記宿主に生み出すのに 有効な量で投与され、また前記免疫抑制剤は前記宿主の前記アデノウイルスベク ターに対する免疫応答を妨げあるいは抑制するのに有効な量で投与される、 という段階よりなることを特徴とする方法。 ２．請求の範囲第１項記載の方法であって、ここで前記免疫抑制剤がステロイド であることを特徴とする方法。 ３．請求の範囲第２項記載の方法であって、ここで前記ステロイドがデキサメタ ゾンであることを特徴とする方法。 ４．請求の範囲第１項記載の方法であって、ここで前記免疫抑制剤がシクロスポ リンＡであることを特徴とする方法。 ５．請求の範囲第１項記載の方法であって、ここで前記アデノウイルスベクター が約１ｐｆｕから約１０¹⁴ｐｆｕまでの量で各回投与されることを特徴とする方 法。 ６．請求の範囲第３項記載の方法であって、ここで前記デキサ メタゾンが約１ｍｇ／ｋｇから約１５ｍｇ／ｋｇまでの量で各回投与されること を特徴とする方法。 ７．請求の範囲第６項記載の方法であって、ここで前記デキサメタゾンが約２ｍ ｇ／ｋｇでの量で各回投与されることを特徴とする方法。 ８．請求の範囲第５項記載の方法であって、ここで前記アデノウイルスベクター が約１０⁶ｐｆｕから約１０¹³ｐｆｕまでの量で各回投与されることを特徴とす る方法。 ９．請求の範囲第８項記載の方法であって、ここで前記アデノウイルスベクター が約１０⁸ｐｆｕから約１０¹⁰ｐｆｕまでの量で各回投与されることを特徴とす る方法。 １０．請求の範囲第１項記載の方法であって、ここで前記免疫抑制剤がデオキシ スペルグアリンであることを特徴とする方法。 １１．請求の範囲第１０項記載の方法であって、ここで前記デオキシスペルグア リンが約１ｍｇ／ｋｇから約３３ｍｇ／ｋｇまでの量で各回投与されることを特 徴とする方法。 １２．請求の範囲第１項記載の方法であって、ここで前記免疫抑制剤がシクロホ スファミドであることを特徴とする方法。 １３．請求の範囲第１２項記載の方法であって、ここで前記シクロホスファミド が約５ｍｇ／ｋｇから約３００ｍｇ／ｋｇまでの量で各回投与されることを特徴 とする方法。 １４．請求の範囲第１項記載の方法であって、ここで前記デオキシスペルグアリ ンが約３ｍｇ／ｋｇから約７ｍｇ／ｋｇまでの量で各回投与されることを特徴と する方法。 １５．請求の範囲第１３項記載の方法であって、ここで前記シクロホスファミド が約５０ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまでの量で各回投与されることを特 徴とする方法。 １６．請求の範囲第１項記載の方法であって、ここで前記免疫抑制剤が１４日を 越えない期間で投与されることを特徴とする方法。 １７．請求の範囲第１６項記載の方法であって、ここで前記免疫抑制剤が１１日 を越えない期間で投与されることを特徴とする方法。 １８．請求の範囲第１７項記載の方法であって、ここで前記免疫抑制剤が８日を 越えない期間で投与されることを特徴とする方法。 １９．請求の範囲第１項記載の方法であって、ここで前記免疫抑制剤の前記投与 が前記アデノウイルスベクターの投与の約２４時間前に開始されることを特徴と する方法。 ２０．請求の範囲第１項記載の方法であって、ここで前記免疫抑制剤の前記投与 が前記アデノウイルスベクターの投与と同時に開始されることを特徴とする方法 。 ２１．請求の範囲第１項記載の方法であって、ここで前記免疫抑制剤の前記投与 が前記アデノウイルスベクターの投与の約２４時間後に開始されることを特徴と する方法。