CN106459825A - 用于从微生物生物质中回收脂质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于从微生物生物质中回收脂质的方法以及涉及使用所述回收脂质的方法生产脂质的方法。在所述方法中，使包含含有产油酵母生物质的发酵肉汤的含水悬浮液经受水热处理并通过溶剂提取从所述生物质中回收脂质。

Description

用于从微生物生物质中回收脂质的方法
技术领域
本发明涉及用于从微生物生物质中回收脂质的方法以及涉及使用该回收脂质的方法生产脂质的方法。
背景技术
已知某些微生物如细菌、真菌和酵母将有机分子转化为脂质。通过异养微生物产生的油通常称作单细胞油或微生物油，以及产生脂质的微生物称为产油微生物(oleaginous microbe)。
用于生产单细胞油的过程一般包括培养微生物、使细胞能够累积脂质、收获富含脂质的细胞以及从微生物细胞中回收脂质的步骤。基于微生物的脂质(即单细胞油)可以用作用于生产生物燃料如生物柴油、可再生柴油或生物航空燃料的原材料。
在生长介质上培养的产油微生物可以包含最高达它们的总的干物质含量的80％的脂质。用于从微生物生物质中回收脂质的方法的效率对于通过微生物的发酵的经济可行的生产是至关紧要的。用于脂质回收的方法将提供约95％的油产率以在经济上可行。而且，用于回收脂质的方法不应破坏由其提取了油的残留生物质的价值或降低提取的油的质量，其可以进一步加工或原样使用。
脂质回收过程一般包括从培养介质中收获微生物细胞、破坏微生物细胞以及回收油以得到粗微生物油和残留生物质部分的步骤。可以从湿润的生物质中回收油或在干燥提取的情况下，在回收油之前使微生物生物质脱水。残留的生物质部分由于其包含有价值的蛋白质部分可以用作动物饲料，或可以用于通过燃烧产生能量。回收脂质的方法基本上决定了残留生物质作为动物饲料的价值，因为在多个处理步骤中微生物生物质的蛋白质容易降解。
收获步骤用于从培养介质中分离微生物细胞。常规的收获技术包括过滤和离心。在回收脂质之前，也可以通过机械脱水装置在干燥步骤之前浓缩微生物生物质。
通常通过用溶剂如亚临界或超临界状态的二氧化碳或液体烃如己烷提取，从收获的微生物细胞中回收油。在用多种方法如超声处理、渗透性冲击、机械剪切力如挤出、冷压和热冲击，提取脂质之前，微生物细胞也可能被破坏。完全破坏微生物细胞的需要取决于用于提取脂质的溶剂。在不能完全破坏细胞的情况下，可以在提取中使用非极性和极性溶剂的混合物。
在干燥提取中，在溶剂提取之前干燥收获的生物质以除去尽可能多的游离水。也可以从湿润的生物质中提取脂质。在干燥提取中，在溶剂提取之前，一般干燥微生物生物质至高于90％的干物质含量。在湿润途径提取中，溶剂提取步骤中的生物质的干物质含量可以低至5％。在湿润提取的情况下，如果将其用于有附加值的应用，需要干燥得到的湿润的残留生物质部分。
传统细胞收获技术如过滤和离心通常产生干物质含量为15％至最高达40％的生物质。通过干燥可以进一步增加收获的生物质的干物质含量，然而，这消耗许多的能量。通过加热、冷冻干燥或喷雾干燥可以执行干燥(Farr,W.E.and Proctor,A.,Green VegetableOil Processing,2012,AOCS Press)。通常，具有低于30w-％的干物质含量的生物质不能认为是经济地干燥。
干燥和湿润途径提取之间的选择取决于从微生物生物质中除去过多液体的难易。如果不能将生物质机械脱水至高于30％的干物质含量，则往往优选的是湿润途径提取。如果残留的生物质的后续处理不需要进一步干燥，例如如果需通过厌氧消化或通过水热液化处理生物质，则湿润提取也是优选的。
从湿润的微生物生物质中除去水的难易取决于微生物生物质中的微生物的类型。认为丝状生物由于它们大的细胞尺寸而更容易地收获，而已知藻类生物质由于小的细胞尺寸而具有不良的过滤性。EP2450424A1中建议将湿润途径提取作为用于藻类生物质的有效脂质回收方法，如其清楚陈述的，在提取之前没有必要干燥湿润的微生物生物质。因此，EP2450424A1在提取之前没有涉及过滤和干燥步骤。此外，由于使用了丙烷(在提取步骤中需要至少20巴的压力以保持提取剂/溶剂为液态)，该文献本身引用了升高的提取压力。对于加热步骤，没有提及使用的精确压力。根据该文献的实施例显示了使用文献中公开的方法的相当低的脂质产率，且没有提到从生物质中提取的油中的氮含量。
已知存在于收获的细胞中的水降低溶剂提取的效率，因为其阻碍疏水性脂质与溶剂接触。另外，水趋向于与溶剂形成乳液，这进一步降低提取效率并使得更难以从剩余的液相中分离提取的脂质。因此，如果可以将微生物生物质机械脱水至高于30％的干物质含量，则相对于湿润提取，往往优选的是干燥提取。
之前Davies(Davies,R.1992.Scale Up of Yeast Oil Technology.IndustrialApplications of Single Cell Oils.Edited by:D.J.Kyle and C.Ratledge,AOCSPublishing)已经公开了当在干重基础上生物质的含油量超过35％时，一般用于酿造和烘焙酵母工业来收获酵母的喷嘴盘分离器(nozzle disc separator)对于收获产油酵母(oleaginous yeast)是无效的。对于具有高于干重基础上35％的含油量的产油酵母生物质，建议交叉流过滤(cross flow filtration)。然而，该收获方法具有低通量和膜积垢的缺点，这意味着需要大的膜面积。
即使将喷嘴盘分离器用于收获干重基础上含油量在35％以下的产油酵母，得到的浓缩酵母浆具有15-20％的干物质含量。普遍认为太低的用于干燥的干物质含量是不经济的。为此，对于使用喷嘴盘分离器收获的含油量低于干重基础上35％的产油酵母，常常优选的是湿润提取。
WO2011/143380公开了用于从藻类细胞中分离油的方法，在该方法中，使湿润的藻类生物质经受水热碳化处理(hydrothermal carbonization treatment)(HTC)，通过过滤从含水部分分离得到的结合油和焦(char)部分，以及通过溶剂提取从焦部分分离油。在170至225℃的温度下进行水热碳化处理。该方法具有其产生在生长阶段可以作为营养物重新使用的富含氮、磷和钾的含水部分的优点。没有报告水热碳化处理对生物质的过滤性或提取步骤的效率具有任何影响。然而，文献看起来举例说明了基于过程蒸馏颗粒(processdistiller grain)和其他原材料的方法。这类原材料不包含很多的脂质并因而将在过滤湿润生物质中不存在任何困难，其中该方法不包括过滤之前的热处理步骤。此外，为了实现脂肪酸甲酯(FAME)的高产率，需要提取干燥的焦以及含水滤液。此外，相对于例如氮或磷含量，没有参考关于重新得到的油的质量。实际上，该文献清楚地陈述了含水产物包含原始存在于生物质中的大部分的氮、磷和钾且提取水相将清楚地产生与原始生物质的氮含量相同水平(in level with)的氮含量。
也常在收获步骤中巴氏杀菌微生物生物质以杀死微生物和灭活酶，这可能另外破坏脂质结构。在US2003/014369公开的方法中，通过将生物质生长介质中的生物质加热至60-100℃的温度持续最高达90分钟进行巴氏杀菌。没有报告巴氏杀菌对随后的脱水或脂质提取步骤具有任何影响。
EP2450426涉及用于纯化已从生物材料得到的脂质材料的纯化方法。该方法包括使用至少一种极性溶剂和至少一种非极性溶剂，并表明了多种反应条件是怎样影响纯化的油中的磷和金属含量。然而，该文献没有关于提取的油的氮含量的记载且没有关于从生物质提取油的任何方法或提取期间的任何条件怎样可以影响例如提取的油中的氮含量的记载。
本发明涉及从产油酵母生物质中回收脂质以及涉及使用该回收脂质的方法生产脂质的方法。
Davies(Davies,R.1992.Scale Up of Yeast Oil Technology.IndustrialApplications of Single Cell Oils.Edited by:D.J.Kyle and C.Ratledge,AOCSPublishing)报告了当生物质中的脂质含量在干重基础上超过35％时，产油酵母细胞的不良回收率。
由于酵母生物质的软细胞结构导致的过滤膜的立即堵塞，所以用闭端(dead end)微过滤器收获产油酵母细胞是不可能的。实验还指出可以用交叉流过滤配置收获产油酵母细胞，但是过滤结果是不良的，具有收获的生物质的仅28％的干物质含量，通常认为这对于随后的干燥步骤来说太低。还发现待收获的生物质悬浮液中存在的木质纤维素材料或剩余的木质纤维素材料使膜积垢更糟糕。
因此，需要用于从产油酵母生物质中以及尤其从具有以下的高脂质含量的酵母生物质中回收脂质的有效方法：即在干重基础上超过35％、如例如在干重基础上至少约40％、或如例如在干重基础上至少约50％、如例如在干重基础上至少约60％、如例如在干重基础上至少约70％、如例如在干重基础上至少约80％。
发明内容
本发明的一个目的是提供用于从产油酵母生物质中回收脂质的有效方法。
相应地，本发明的第一方面涉及用于从产油酵母生物质中回收微生物脂质的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供包含含有产油酵母生物质的发酵肉汤的含水悬浮液，
(ii)在高于5巴的压力下在至少160℃的温度下使所述悬浮液经受水热处理1秒至360分钟，
(iii)使水热处理的悬浮液经受分离步骤以得到液体部分和酵母生物质部分，
(iv)使酵母生物质部分经受干燥步骤以得到干燥的酵母生物质部分，
(v)用液体溶剂使干燥的生物质部分经受提取步骤以产生包含微生物脂质的液体部分和包含残留的酵母生物质部分的固体部分，
(vi)从步骤(v)的液体部分中回收微生物脂质，
(vii)可选地，从步骤(v)的产物中分离残留的生物质部分。
本发明的第二目的是提供使用用于从产油酵母生物质中回收脂质的方法用产油酵母生产微生物脂质的方法。
相应地，本发明的第二方面涉及用于生产微生物脂质的方法，该方法包括：
(i)提供培养介质，
(ii)通过在培养介质中接种产油酵母提供发酵肉汤来产生产油酵母生物质，
(iii)孵育接种了所述产油酵母的所述介质使脂质能够累积，
(iv)通过根据本文所描述的用于回收微生物脂质的方法中的任一种的方法从所述产油酵母生物质中回收微生物脂质。
本发明的进一步方面涉及由本发明的方法可得到的残留生物质。
本发明的又进一步的方面涉及通过本发明的方法可得到的微生物脂质。
与现有技术相反，本发明使提取之前的水的量最小化。这具有用干燥的生物质更有效地进行提取的优点，因为已知水与脂质形成乳液，这妨碍使用有机溶剂的提取步骤并使得难以从液相/水相分离有机相。此外，通过本发明的流程，提供了更能量有效的方法，因为在干燥得到的生物质之前通过过滤除去了尽可能多的水。
本发明还涉及在不需要分离的液体部分的任何提取的情况下提取干燥的生物质。
而且，通过本发明的方法提供了高质量的油，其例如指的是提取的油的低氮含量。因为高杂质含量，如例如氮，将阻碍重新得到的油至燃料的催化过程，所以从进一步处理重新得到的油的观点看这是重要的。对于提取的油中的杂质如例如金属残留，这也是适用的。应理解低水平的例如氮的含义是指该水平低于存在于原始生物质中的氮的量。
本发明还提供了在提取期间不需要应用压力的方法并因此不涉及提取过程中的溶剂(其在正常压力(1atm)下具有低沸点)。具有低沸点温度的溶剂的一个实例是丙烷，其需要外部压力以在正常温度如约20℃至约100℃的范围内的温度下保持液态。
具体实施方式
在本发明的实施方式的描述中，为了清楚，将采用具体的专业术语。然而，本发明不旨在限于所选择的具体术语，并且应理解各具体术语包括以类似的方式操作来实现类似目的的所有技术等价物。
当描述本发明的实施方式时，没有明确描述所有可能的实施方式的组合和改变(permutation)。虽然如此，在互相不同的从属权利要求中陈述的或在不同实施方式中所描述的某些测量的唯一事实不表示不可以使用这些测量的组合来获利。本发明预见了所描述的实施方式的所有可能组合和改变。
本发明的第一方面提供了用于从产油酵母生物质中回收微生物脂质的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供包含含有产油酵母生物质的发酵肉汤的含水悬浮液，
(ii)在高于5巴的压力下在至少160℃的温度下使所述悬浮液经受水热处理1秒至360分钟，
(iii)使水热处理的悬浮液经受分离步骤以得到液体部分和酵母生物质部分，
(iv)使酵母生物质部分经受干燥步骤以得到干燥的酵母生物质部分，
(v)用液体溶剂使干燥的生物质部分经受提取步骤以产生包含微生物脂质的液体部分和包含残留的酵母生物质部分的固体部分，
(vi)从步骤(v)的液体部分中回收微生物脂质，
(vii)可选地，从步骤(v)的产物中分离残留的生物质部分。
因此，在本发明的一个方面，没有用溶剂提取步骤(iii)中得到的液体部分来得到任何油。
本发明的另一方面涉及用于生产微生物脂质的方法，该方法包括：
(a)提供培养介质，
(b)通过在培养介质中接种产油酵母来提供发酵肉汤以产生产油酵母生物质，
(c)孵育接种了所述产油酵母的所述介质使脂质能够累积，
(d)通过本文所描述的用于从产油酵母生物质中回收微生物脂质的方法从所述产油酵母生物质中回收微生物脂质。
因此，本发明的一个实施方式涉及用于生产微生物脂质的方法，该方法包括：
(a)提供培养介质，
(b)通过在培养介质中接种产油酵母以提供发酵肉汤来产生产油酵母生物质，
(c)孵育接种了所述产油酵母的所述介质使脂质能够累积，
(i)提供包含含有步骤(c)的产油酵母生物质的发酵肉汤的含水悬浮液，
(ii)在高于5巴的压力下在至少160℃的温度下使所述悬浮液经受水热处理1秒至360分钟，
(iii)使水热处理的悬浮液经受分离步骤以得到液体部分和酵母生物质部分，
(iv)使酵母生物质部分经受干燥步骤以得到干燥的酵母生物质部分，
(v)用液体溶剂使干燥的生物质部分经受提取步骤以产生包含微生物脂质的液体部分和包含残留的酵母生物质部分的固体部分，
(vi)从步骤(v)的液体部分中回收微生物脂质，
(vii)可选地，从步骤(v)的产物中分离残留的生物质部分。
在进一步的实施方式中，将包含在由步骤(iii)得到的液体部分中的营养物再循环至培养介质(a)。
本发明的进一步方面提供了通过根据本发明的方法可得到的残留生物质。
在本发明的又进一步的方面，没有用溶剂提取步骤(iii)中得到的液体部分。
本发明的发明人还发现在步骤(iv)中的干燥和/或步骤(v)中的提取之前，用水洗涤步骤(iii)中分离的酵母生物质部分是有利的。这将产生在随后将油反应成例如燃料产物之前几乎不需要或不需要进一步纯化的更高纯度的提取油。
发明人出乎意料地发现通过在高于160℃的温度下使包含产油酵母生物质的含水悬浮液经受水热处理(HTT)可以解决与收获具有高脂质含量的产油酵母生物质有关的问题。在水热处理期间，酵母生物质的密度降低且细胞组合在一起形成团块(flock)，这使得能够通过常规的过滤或离心方法有效分离液体部分。在不受任何理论约束的情况下，认为由于热处理，酵母的细胞内分子被提取至水相，这增加油份额(oil share)并降低生物质的密度。还提出水热处理改变酵母细胞的表面结构和表面电荷，这导致形成能够通过过滤分离的细胞团块。
还发现使用用于模拟从木质纤维素生物质提取糖类的强度系数(severityfactor)可以表达合适的热处理条件(温度和处理时间作为变量)。使用式(1)可以计算强度系数logR0(Pedersen,M.and A.S.Meyer(2010).Lignocellulose pretreatmentseverity-relating pH to biomatrix opening.New Biotechnology 27(6):739-750.)。
在高于5巴、如6至25巴的范围内、例如10至25巴的范围内、如10至15巴的范围内的压力下进行水热处理(步骤(ii))。可替换地，水热处理期间的压力可以是例如在约6.0巴至约20.0巴的范围内，如例如约6.0巴至约7.0巴、如例如约10.0巴至约11.0巴、如例如约13.0巴至约18巴、如例如约16巴至约19巴。
因此，可以例如根据以下分配上述压力，当反应温度是约160℃时，压力可以是例如约6.2巴至约6.8巴，或当温度是约180℃时，压力可以是例如约10.3巴至约11.0巴，或当温度是约190℃时，压力可以是例如约13.7巴至约18巴，或当温度是约200℃时，压力可以是例如约16.2巴，或当温度是约210℃时，压力可以是例如约19.6巴。
进行水热处理(步骤(ii))持续1秒至360分钟，如5分钟至240min的范围、例如10分钟至120min的范围。
在一个实施方式中，在160至180℃范围内的温度下进行水热处理(步骤(ii))持续30min至180min，如160℃下180min或180℃下30至60min。
因此，在本发明的一个实施方式中，在对应于至少约3.5、优选地至少约3.9的强度系数logR0的条件下进行水热处理。在一个进一步的实施方式中，强度系数在约3.5至约5.5的范围内，如例如约4至约4.5。一般在密闭容器中进行热处理。
发明人还出乎意料地发现通过包括在160℃以上的温度下水热处理酵母生物质和随后溶剂提取的方法回收的脂质包含非常少的量的磷和金属杂质。发现水热处理使得能够有效收获高脂质含量的微生物细胞和高产率地回收高质量微生物油。
因此，本发明涉及以下方法，其中，基于存在于生物质中的油或脂质的含量，提取的油或脂质的产率在至少约70％、如例如约至少80％、如例如约至少90％、如例如约至少95％、如例如约至少98％、如例如约100％的范围内。
发明人还发现本发明的方法能够在不大量损失微生物脂质的情况下有效地收获具有高含量的微生物脂质(如脂质含量大于35％)的产油酵母生物质。
在本发明的一个实施方式中，酵母生物质具有按细胞团(cell mass)的重量计至少20％的脂质含量。在一个优选的实施方式中，酵母生物质具有按细胞团的重量计至少30％的脂质含量。在一个更加优选的实施方式中，酵母生物质具有按细胞团的重量计的至少35％、如例如在干重基础上至少约40％、或如例如在干重基础上至少约50％、如例如在干重基础上至少约60％、如例如在干重基础上至少约70％、如例如在干重基础上至少约80％的脂质含量。
使用任何传统的溶剂如乙醇或烃可以执行脂质的提取。优选地使用己烷提取，因为其保证良好的提取产率和油质量。可以用常规的方式进行提取步骤。在本发明的一个实施方式中，使用烃溶剂，如包含低级烷烃、优选地脂肪族C2-C8烷烃的烃溶剂，进行提取步骤(v)。更加优选的是C5-C8烷烃，如例如戊烷、己烷、庚烷或辛烷。
而且，发明人出乎意料地发现在含水悬浮液包含由在包含木质纤维素水解产物的培养介质中培养产油酵母得到的发酵肉汤的情况下，水热处理增加残留生物质的量。这表示存在于发酵肉汤中的溶解的木质纤维素材料在水热处理期间转变为固态并在随后的分离步骤中与残留的生物质分离。从含水悬浮液中将溶解的木质纤维素材料回收至固体生物质部分具有增加由回收过程得到的有价值的残留生物质部分的量的优点。同时，这降低由使用木质纤维素材料或水解产物的产油酵母生产得到的废水部分的化学需氧量(chemicaloxygen demand)。
在本发明的一个优选的实施方式中，由在包含木质纤维素材料的培养介质中培养产油酵母得到发酵肉汤。在另一个优选的实施方式中，由在包含木质纤维素水解产物的培养介质中培养产油酵母得到发酵肉汤。
本发明的优点包括水热处理能够通过常规收获方式如过滤和离心从含水悬浮液中有效地收获具有高脂质含量的产油酵母生物质。有效的收获是指收获的生物质具有高干物质含量且在收获过程中没有损失油或含油细胞。结果，需要在随后的提取步骤之前通过干燥除去仅少量的水且在处理期间油不会损失。
本发明从而能够经济可行地从具有高脂质含量的产油酵母生物质中回收脂质，因为水热处理使对于干燥的需要最小化，已知其是回收过程中最耗能的步骤。
产油酵母可以是能够累积细胞间脂质的任何酵母使得当在合适的条件下培养时脂质占酵母的总生物质(每细胞干重)的至少15％(w/w)。产油酵母包括以下种属的产油酵母物种：棒孢酵母属(Clavispora)、地丝菌属(Geotrichum)、Deparyomyces、管囊酵母属(Pachysolen)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耐碱酵母属(Galactomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、白冬孢酵母属(Leucosporidium)、酿酒酵母属(Saccharomyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、Waltomyces、拟内胞霉属(Endomycopsis)、隐球酵母属(Cryptococcus)如弯曲隐球酵母属(Cryptococcuscurvatus)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)如串珠状红冬孢酵母属(Rhodosporidiumtoruloides)或Rhodosporidium fluviale、蔷薇色酵母属(Rhodotorula)如红酵母属(Rhodotorula glutinis)、耶氏酵母属(Yarrowia)如解脂耶氏酵母属(Yarrowialipolytica)、毕赤氏酵母属(Pichia)如树干毕赤氏酵母属(Pichia stipitis)、假丝酵母属(Candida)如弯曲假丝酵母属(Candida curvata)、油脂酵母属(Lipomyces)如斯氏油脂酵母属(Lipomyces starkeyi)以及丝孢酵母属(Trichosporon)如皮状丝孢酵母属(Trichosporon cutaneum)或出芽丝孢酵母属(Trichosporon pullulans)。
优选地，酵母菌株是属于假丝酵母、蔷薇色酵母、丝孢酵母、红冬孢酵母、油脂隐球酵母或酿酒酵母的那些。在本发明的一个优选的实施方式中，酵母是红冬孢酵母属、蔷薇色酵母属、油脂隐球酵母属或酿酒酵母属中的酵母。在进一步的实施方式中，通过本发明的方法使用的产油酵母是产油酵母中的两种或更多种物种的混合物。
在高于160℃的温度下的水热处理还破坏酵母细胞并能够在没有单独的细胞破坏步骤的情况下有效提取脂质。发现由水热处理的酵母生物质提取的油包含少量的磷和金属杂质，这对于随后将脂质加工成燃料组分是必要的并且这降低对于用于原微生物油的进一步纯化步骤的需要。
木质纤维素材料
术语“木质纤维素生物质”或“木质纤维素材料”意味着包括但不限于木本植物或非木本植物的草本植物或包含纤维素和/或半纤维素的其他材料：材料可以是农业残留(如麦秸、稻秸、谷壳、外壳、玉米秸、甘蔗渣、甘蔗梢(sugar cane top)和叶)、专门的能源作物(如柳枝黍(switchgrass)、芒草(Miscanthus)、芦竹(Arundo donax)、虉草(reed canarygrass)、杨柳(willow)、水风信子(water hyacinth)、能源甘蔗(energy cane)、能源高粱(energy sorghum))、木材或残留(包括锯木厂和纸浆和/或造纸厂残留或部分，如半纤维素、废弃的亚硫酸盐废液、废纤维和/或初级污泥(primary sludge))、苔藓或腐叶土或市政纸张废物。术语木质纤维素材料还包含低木质素材料、如大型藻类生物质的材料。另外，材料还包含来自工业实践的半纤维素或纤维素部分。术语木质纤维素材料包含任何种类的纤维素部分。根据本公开，可以将原材料或某些部分如来自不同来源、植物物种或工业过程的原材料的半纤维素和/或纤维素混合在一起并用于用于培养微生物生物质的原材料。一般，木质纤维素中的木质素含量高于5％。木质纤维素生物质还可以包含淀粉，例如在完整植物的情况下。
术语木质纤维素材料包含至少50wt％的木质纤维素、优选地至少60wt％的木质纤维素、更优选地至少70wt％的木质纤维素、最优选地至少80wt％的木质纤维素。通常，木质纤维素材料包含60-95wt％的木质纤维素、一般70-90wt％或80-90wt％的木质纤维素。
包含木质纤维素材料的培养介质
“包含木质纤维素材料的培养介质”是指用于培养微生物的培养介质，该介质包含木质纤维素、纤维素的片段或包含来源于蛋白质的氮化合物和金属的木质木质纤维素的水解产物、以及用于培养所述微生物必须的其他组分如氮、磷、无机盐和/或微量元素的来源、消泡剂。木质纤维素可以用作用于所述微生物的碳源，但是在培养介质中也可以具有其他功能。
水解
“水解”在此处是指将聚合糖糖化为糖低聚物和单体。一般在两个阶段中进行糖化：首先通过热化学或化学方法，然后通过使用能够水解聚合糖的酶来水解底物，即木质纤维素材料或木质纤维素。可替换地以及根据木质纤维素材料，可以通过使用热化学或化学方法或通过能够水解聚合糖的酶或这些方法的一些组合执行糖化。化学方法包括但不限于酸处理。
水解产物
术语“水解产物”或“水解材料”在此处是指已经经历水解的材料。
木质纤维素水解产物
术语“木质纤维素水解产物”在此处是指包括纤维素和/或半纤维素、低聚糖、单糖和/或二糖、乙酸、甲酸、其他有机酸、呋喃甲醛、羟基甲基呋喃甲醛、乙酰丙酸、酚化合物的木质纤维素或木质纤维素材料的水解产物、由木质素、纤维素、半纤维素和/或木质纤维素的其他组分形成的其他水解和/或降解产物、来源于蛋白质的氮化合物、金属和/或木质纤维素的非水解或部分水解的片段。
水热处理
“水热处理”或“水热加工”在此处同义地使用且是指将包含微生物生物质的含水悬浮液加热至至少160℃的温度并在高于5巴的压力下使包含所述微生物生物质的含水悬浮液经受至少160℃的温度1s至360分钟的过程。
应注意在本发明的背景下，上述方法，即热化学处理、蒸汽喷发(steamexplosion)、热水提取、自动水解、亚临界水处理、超临界水处理、强酸处理、弱酸处理、碱处理(例如石灰、氨)、有机溶剂处理(例如醇、有机酸)、机械处理、机械热处理和离子液体处理不在水热加工(或水热处理，热处理，HTT)的定义内。
强度系数
术语“强度系数(severity factor)”在此处是指参数LogR0，其是基于以下等式计算的并在温度和时间方面描述水热条件。
式(1)：
其中，R0是强度系数，T(t)是以℃计的处理温度以及t是以分钟计的处理时间。
产油微生物
术语“产油微生物”是指产生脂质的微生物。因此，产油酵母是指产生脂质的微生物。当将产生脂质的微生物用于单细胞油生产时，微生物生物质是来自单细胞油生产过程的残留生物质。
本文所涉及的以及目前使用的产油酵母可以容易地累积脂质或被遗传改性以累积脂质或改善脂质的累积。优选地，使用能够利用C6和C5糖的产油酵母。
在本发明的背景下，产油酵母是指当在合适的条件下培养时能够累积细胞间脂质使得脂质占酵母的总生物质的至少15％(w/w)(每细胞干重)的酵母。在一个优选的实施方式中，产油微生物能够累积微生物的总生物质的至少20％(w/w)(每细胞干重)。在一个更加优选的实施方式中，产油酵母能够累积酵母的总生物质的至少35％(w/w)(每细胞干重)。在又进一步的优选的实施方式中，产油酵母能够累积干重基础上至少约40％(w/w)、或如例如干重基础上至少约50％(w/w)、如例如干重基础上至少约60％(w/w)、如例如干重基础上至少约70％(w/w)、如例如干重基础上至少约80％(w/w)总生物质(每细胞干重)的脂质。
微生物脂质或脂质
在本发明的背景下，“微生物脂质”、“脂质”或“细胞内脂质”或“油产物”是指脂肪物质，其分子通常包含(作为一部分)溶解在非极性有机溶剂中但较差地溶于水中的脂肪族烃链。脂质是活细胞中的大分子的必需基团。脂质是例如脂肪、油、蜡、蜡酯、固醇、类萜、类异戊二烯、类叶红素、聚羟基烷酸酯、核酸、脂肪酸、脂肪醇、脂肪醛、脂肪酸酯、磷脂、糖脂、鞘脂和甘油酯(acylglycerol，酰基甘油)如三-甘油酯、甘油二酯或甘油单酯。本发明中优选的脂质是脂肪、油、蜡、甘油酯和脂肪酸及它们的衍生物，特别是三酰甘油酯和蜡酯。在本发明的背景下，通过在微生物中累积合成脂质(细胞内脂质)。在本发明的另一个实施方式中，通过微生物合成脂质和通过微生物分泌脂质(细胞外脂质)。
关于本发明，将单细胞油用作脂质和脂肪的同义词。
术语“甘油酯”是指甘油和脂肪酸的酯。甘油酯作为脂肪和脂肪油天然出现。甘油酯的实例包括三酰甘油酯(TAG，甘油三酯)、甘油二酯(甘油二酸酯)和甘油单酯(甘油单酸酯)。
生物质
在本发明的背景下，术语“生物质(biomass)”(或“细胞团(cell mass)”)是指源自活的有机体或非活的有机体的生物材料。“酵母生物质(yeast biomass)”因此是指源自酵母的生物质。可以由酵母的单个物种或酵母的不同物种的集合得到微生物生物质。酵母生物质可以以活的或非活的状态存在。在本发明的背景下，已经经受水热热处理(HTT)的酵母生物质是非活的状态。
残留的细胞团
在本发明的背景下，“残留的细胞团”或“残留的生物质部分”是指固体、半固体或流动材料部分，其包含由其回收细胞内脂质的微生物。
干物质
“DM”或“干重”在此处是指干物质并是当经受基本除去材料中的水(即材料完全干燥)的处理时的材料的质量的测量。
包含微生物生物质的含水悬浮液的水热处理和后续加工
可以水热加工原样(as such)来自培养的包含生物质的含水悬浮液，或可以首先浓缩悬浮液。还可以在这时调节悬浮液的pH。更酸性的pH能够更好地溶解固体材料，导致与在较高的pH下相比在更低的温度下浮起(flotation)一些酵母。尽管pH调节不影响使这些酵母可过滤所需的强度系数。在本发明的一个实施方式中，步骤(i)中的含水悬浮液的pH值低于6、优选地低于5。然而，在本发明的另一方面，不需要外部酸化使得添加酸性组分以调节或调整反应混合物的pH。
可以通过直接或间接加热进行生物质悬浮液的水热加工。在直接加热中，可以用蒸汽加热悬浮液。在间接加热中，可以通过包含悬浮液的容器的壁或通过热交换器的管或壳循环悬浮液加热悬浮液。可以在密闭的连续或间歇***中进行加热。
含水悬浮液一般具有至少3％、优选地至少10％如15至35％的干物质含量。
水热加工之后，可以通过多种方法如离心或过滤从液体中分离包含油的固体材料。在本发明的一个实施方式中，通过离心执行分离步骤(iii)或分离步骤(iii)包括离心的步骤。在另一个实施方式中，通过过滤执行分离步骤(iii)或分离步骤(iii)包括过滤的步骤。
过滤是优选的，因为使用压滤机可以得到最高达70％的固体材料的高干物质含量。在本发明的一个实施方式中，由分离步骤(iii)得到的酵母生物质部分具有至少50％、如至少60％的干物质含量。在一个优选的实施方式中，由步骤(iii)得到的酵母生物质部分具有至少65％的干物质含量。在另一个优选的实施方式中，由步骤(iii)得到的酵母生物质部分具有至少70％的干物质含量。
使用水洗涤收获的湿润生物质以进一步减少提取的油的杂质(参见实施例9)。因此，在一个实施方式中，在提取步骤(v)之前，使由水热处理步骤得到的酵母生物质部分经受水洗步骤。
在使用烃溶剂、最优选地己烷提取之前，将固体材料干燥至>90％的干物质含量。在本发明的一个实施方式中，干燥的生物质部分(步骤(iv)的)具有至少90％、优选地至少95％的干物质含量。
可以使用任何已知的干燥技术，但是选择可以影响提取的油的质量(参见实施例9)。发现通过在油提取步骤之前优化生物质的干燥可以调节提取的微生物油中的杂质的量，尤其是氮的量。在本发明的一个实施方式中，在低于100℃、优选地低于90℃的温度下进行干燥步骤(iv)。在本发明的一个实施方式中，在低于90℃、优选地低于50℃的温度下进行提取步骤(v)。在另一个实施方式中，在真空中以及在低于90℃、优选地低于70℃的生物质的温度下进行干燥步骤(iv)。在一个进一步的实施方式中，在低于90℃、优选地低于70℃的温度下进行提取步骤(v)。
在本发明的一个实施方式中，使用烃溶剂，如包含低级烷烃、优选地脂肪族C2-C8烷烃的烃溶剂，进行提取步骤(v)。
可以使用任何已知的提取技术进行提取步骤。提取过程产生原始微生物油(rawmicrobial oil)和提取出油的残留生物质，在进一步使用之前需要去溶剂。
通过本发明的方法可得到的微生物脂质
如本文提到的，发明人出乎意料地发现通过包括在160℃以上的温度下水热处理酵母生物质和随后溶剂提取的方法回收的脂质包含非常少的量的磷和金属杂质。
相应地，本发明的进一步的方面涉及通过本发明的方法可得到的微生物脂质。
发明人发现如果通过本方法得到微生物脂质，元素磷的量减少。相应地，本发明的一个实施方式涉及通过本发明的方法可得到的微生物脂质，其中，元素磷的浓度不多于20mg/kg的微生物脂质、优选地不多于10mg/kg、更加优选地不多于5mg/kg、最优选地不多于1mg元素磷/kg微生物脂质。
发明人进一步发现如果通过本方法得到微生物脂质，则元素氮的量减少。相应地，本发明的一个实施方式涉及通过本发明的方法可得到的微生物脂质，其中，元素氮的浓度不多于600mg元素氮/kg微生物脂质、更优选地不多于200mg/kg、最优选地不多于100mg元素氮/kg微生物脂质。
在一个进一步的实施方式中，微生物油中的元素铁、钠、硅、钙、镁、锰或钾的浓度不多于20mg/kg、优选地不多于10mg/kg、更加优选地不多于5mg/kg、最优选地不多于1mg/kg。例如，微生物油中的元素铁的浓度不多于20mg/kg、优选地不多于10mg/kg、更加优选地不多于5mg/kg、最优选地不多于1mg/kg。例如，微生物油中的元素钠的浓度不多于20mg/kg、优选地不多于10mg/kg、更加优选地不多于5mg/kg、最优选地不多于1mg/kg。例如，微生物油中的元素硅的浓度不多于20mg/kg、优选地不多于10mg/kg、更加优选地不多于5mg/kg、最优选地不多于1mg/kg。例如，微生物油中的元素钙的浓度不多于20mg/kg、优选地不多于10mg/kg、更加优选地不多于5mg/kg、最优选地不多于1mg/kg。例如，微生物油中的元素镁的浓度不多于20mg/kg、优选地不多于10mg/kg、更加优选地不多于5mg/kg、最优选地不多于1mg/kg。例如，微生物油中的元素锰的浓度不多于20mg/kg、优选地不多于10mg/kg、更加优选地不多于5mg/kg、最优选地不多于1mg/kg。例如，微生物油中的元素钾的浓度不多于20mg/kg、优选地不多于10mg/kg、更加优选地不多于5mg/kg、最优选地不多于1mg/kg。
又进一步的方面涉及微生物油产品。在本发明的实施方式中，微生物油产品中的元素磷的浓度不多于20mg/kg的微生物脂质、优选地不多于10mg/kg、更加优选地不多于5mg/kg、最优选地不多于1mg元素磷/kg微生物油产物。
在本发明的第二实施方式中，微生物油产物中的元素氮的浓度不多于600mg元素氮/kg微生物脂质、更优选地不多于200mg/kg、最优选地不多于100mg元素氮/kg微生物油产物。
在一个进一步的实施方式中，微生物油产物中的元素铁、钠、硅、钙、镁、锰或钾的浓度不多于20mg/kg、优选地不多于10mg/kg、更加优选地不多于5mg/kg、最优选地不多于1mg/kg。例如，微生物油产品中的元素铁的浓度不多于20mg/kg、优选地不多于10mg/kg、更加优选地不多于5mg/kg、最优选地不多于1mg/kg。例如，微生物油产品中的元素钠的浓度不多于20mg/kg、优选地不多于10mg/kg、更加优选地不多于5mg/kg、最优选地不多于1mg/kg。例如，微生物油产品中的元素硅的浓度不多于20mg/kg、优选地不多于10mg/kg、更加优选地不多于5mg/kg、最优选地不多于1mg/kg。例如，微生物油产品中的元素钙的浓度不多于20mg/kg、优选地不多于10mg/kg、更加优选地不多于5mg/kg、最优选地不多于1mg/kg。例如，微生物油产品中的元素镁的浓度不多于20mg/kg、优选地不多于10mg/kg、更加优选地不多于5mg/kg、最优选地不多于1mg/kg。例如，微生物油产品中的元素锰的浓度不多于20mg/kg、优选地不多于10mg/kg、更加优选地不多于5mg/kg、最优选地不多于1mg/kg。例如，微生物油产品中的元素钾的浓度不多于20mg/kg、优选地不多于10mg/kg、更加优选地不多于5mg/kg、最优选地不多于1mg/kg。
通过以下非限制性项目示出本发明。
项目1.一种用于从产油酵母生物质中回收微生物脂质的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供包含含有产油酵母生物质的发酵肉汤的含水悬浮液，
(ii)在高于5巴的压力下在至少160℃的温度下使所述悬浮液经受水热处理1秒至360分钟，
(iii)使水热处理的悬浮液经受分离步骤以得到液体部分和酵母生物质部分，
(iv)使酵母生物质部分经受干燥步骤以得到干燥的酵母生物质部分，
(v)用液体溶剂使干燥的生物质部分经受提取步骤以产生包含微生物脂质的液体部分和包含残留的酵母生物质部分的固体部分，
(vi)从步骤(v)的液体部分中回收微生物脂质，
(vii)可选地，从步骤(v)的产物中分离残留的生物质部分。
项目2.根据项目1的方法，其中，由在包含木质纤维素材料的培养介质中的产油酵母的培养得到发酵肉汤。
项目3.根据项目1的方法，其中，由在包含木质纤维素水解产物的培养介质中的产油酵母的培养得到发酵肉汤。
项目4.根据项目1-3中任一项的方法，其中，由分离步骤得到的酵母生物质部分具有至少50％、优选地至少60％的干物质含量。
项目5.根据项目1-4中任一项所述的方法，其中，干燥的生物质部分具有至少90％、优选地至少95％的干物质含量。
项目6.根据项目1-5中任一项的方法，其中，在密闭容器中进行热处理。
项目7.根据项目1-6中任一项的方法，其中，在对应于至少3.5、优选地至少3.9的强度系数LogR0的条件下进行水热处理。
项目8.根据项目1-7中任一项所述的方法，其中，酵母生物质具有按细胞团的重量计至少20％、优选地至少30％、最优选地至少35％的脂质含量。
项目9.根据项目1-8中任一项所述的方法，其中，在提取步骤之前，使由水热处理步骤得到的酵母生物质部分经受水洗步骤。
项目10.根据项目1-9中任一项的方法，其中，含水悬浮液具有至少3％、优选地至少10％的干物质含量。
项目11.根据项目1-10中任一项的方法，其中，酵母是红冬孢酵母属、蔷薇色酵母属、油脂酵母属、隐球酵母属或酿酒酵母属。
项目12.根据项目5-11中任一项的方法，其中，液体溶剂是烃溶剂，包括低级烷烃、优选地脂肪族C2-C8烷烃。
项目13.根据前述项目中任一项的方法，其中，通过离心执行分离(iii)或分离(iii)包括离心步骤。
项目14.根据前述项目中任一项的方法，其中，通过过滤执行分离(iii)或分离(iii)包括过滤步骤。
项目15.根据前述项目中任一项的方法，其中，在真空中并在低于90℃、优选地低于70℃的生物质温度下进行干燥步骤(iv)。
项目16.根据前述项目中任一项的方法，其中，在低于90℃、优选地低于70℃的温度下进行提取步骤(v)。
项目17.根据前述项目中任一项的方法，其中，步骤(i)中的含水悬浮液的pH值低于约6、优选地低于约5。
项目18.通过根据项目1-17中任一项的方法可得到的残留生物质。
项目19.一种用于生产微生物脂质的方法，该方法包括
(a)提供培养介质，
(b)通过在培养介质中接种产油酵母以提供发酵肉汤来产生产油酵母生物质，
(c)孵育接种了所述产油酵母的所述介质使脂质能够累积，
(d)用根据项目1-18中任一项的方法由所述产油酵母生物质回收微生物脂质。
项目20.根据项目19的方法，其中，将包含在由分离步骤得到的液体部分中的营养物再循环至培养介质。
项目21.通过根据项目1-20中任一项的方法能够得到的微生物脂质。
项目22.一种微生物油产品，其中，油包含不多于20mg/kg的元素磷、优选地不多于10mg/kg、更加优选地不多于5mg/kg、最优选地不多于1mg/kg的元素磷。
项目23.根据项目22的微生物油产品，其中，油包含不多于600mg/kg的元素氮、更优选地不多于200、最优选地不多于100mg/kg的元素氮。
项目24.根据项目22或23的微生物油产品，其中，油包含不多于20mg/kg、优选地不多于10mg/kg、更加优选地不多于5mg/kg、最优选地不多于1mg/kg的元素铁、钠、硅、钙、镁、锰或钾中的任一种。
本发明还涉及根据以下条款的具体实施方式：
条款(article)
1.一种用于从产油酵母生物质中回收微生物脂质的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供包含含有产油酵母生物质的发酵肉汤的含水悬浮液，
(ii)在高于5巴的压力下在至少160℃的温度下使所述悬浮液经受水热处理1秒至360分钟，
(iii)使水热处理的悬浮液经受分离步骤以得到液体部分和酵母生物质部分，
(iv)使酵母生物质部分经受干燥步骤以得到干燥的酵母生物质部分，
(v)用液体溶剂使干燥的生物质部分经受提取步骤以产生包含微生物脂质的液体部分和包含残留的酵母生物质部分的固体部分，
(vi)从步骤(v)的液体部分中回收微生物脂质，
(vii)可选地，从步骤(v)的产物中分离残留的生物质部分。
2.根据条款1的方法，其中，由在包含木质纤维素水解产物的培养介质中的产油酵母的培养得到发酵肉汤。
3.根据条款1或2中任一项的方法，其中，由分离步骤得到的酵母生物质部分具有至少50％、优选地至少60％的干物质含量。
4.根据条款1-3中任一项的方法，其中，干燥的生物质部分具有至少90％、优选地至少95％的干物质含量。
5.根据条款1-4中任一项的方法，其中，在对应于至少3.5、优选地至少3.9的强度系数LogR0的条件下进行水热处理。
6.根据条款1-5中任一项的方法，其中，酵母生物质具有按细胞团的重量计至少20％、优选地至少30％、最优选地至少35％的脂质含量。
7.根据条款1-6中任一项的方法，其中，含水悬浮液具有至少3％、优选地至少10％的干物质含量。
8.根据条款1-7中任一项的方法，其中，酵母是红冬孢酵母属、蔷薇色酵母属、油脂酵母属、隐球酵母属或酿酒酵母属。
9.根据前述条款中任一项的方法，其中，通过离心执行分离(iii)或分离(iii)包括离心步骤。
10.根据前述条款中任一项的方法，其中，通过过滤执行分离(iii)或分离(iii)包括过滤步骤。
11.根据前述条款中任一项的方法，其中，在真空中并在低于90℃、优选地低于70℃的生物质温度下进行干燥步骤(iv)。
12.根据前述条款中任一项的方法，其中，在低于90℃、优选地低于70℃的温度下进行提取步骤(v)。
13.根据前述条款中任一项的方法，其中，步骤(i)中的含水悬浮液的pH值低于约6、优选地低于约5。
14.通过根据条款1-13中任一项的方法可得到的残留生物质。
15.通过根据条款1-13中任一项的方法可得到的微生物脂质。
16.一种微生物油产品，包含不多于20mg/kg的元素磷、优选地不多于10mg/kg、更加优选地不多于5mg/kg、最优选地不多于1mg/kg的元素磷。
17.根据条款16的微生物油产品，其中，油包含不多于600mg/kg的元素氮、更优选地不多于200、最优选地不多于100mg/kg的元素氮。
18.一种根据条款16或17的微生物油产品，其中，油包含不多于20mg/kg、优选地不多于10mg/kg、更加优选地不多于5mg/kg、最优选地不多于1mg/kg的元素铁、钠、硅、钙、镁、锰或钾中的任一种。
实施例
通过以下非限制性实施例示出本发明。本发明可以应用于除了实施例示出的那些之外的微生物。应理解在以上说明书和实施例中给出的实施方式仅用于示出目的，且各种变化和修改可以在本发明的范围内。
实施例1
在纯糖上培养红冬孢酵母生物质用于热收获实验
在中试发酵罐(pilot fermentor)中在通风下使串珠状红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)菌株CBS 8587(或其他由公认的微生物菌种保藏中心容易获得的串珠状红冬孢酵母菌株)生长。使用葡萄糖作为碳源作为批次进料发酵进行发酵。24h批次阶段之后，在143h培养期间将葡萄糖浆定期添加到发酵罐中。用酵母提取物(8g/l)、(NH4)2SO4(3g/l)、MgCl2(2g/l)、K2HPO4(9g/l)和CaCl2(0,4g/l)以及微量矿物ZnSO4(0,0003g/l)、CuCl(0,0002g/l)和MnCl2(0,03g/l)补充生长介质。在培养结束时，生物质中的含油量是细胞的干重的46,8％。巴氏杀菌得到的生物质悬浮液并将其用于以下实施例中的热收获测试。
实施例2
在木质纤维素糖上培养红冬孢酵母生物质用于热收获实验
批号1：
在中试发酵罐中在通风下使串珠状红冬孢酵母菌株CBS 8587(或其他由公认的微生物菌种保藏中心容易获得的串珠状红冬孢酵母菌株)生长。使用木质纤维素水解产物糖浆作为碳源，作为批次进料发酵进行发酵。12h批次发酵之后，在144h培养期间定期将木质纤维素水解产物糖浆添加到发酵罐中。用酵母提取物(17g/l)、(NH4)2SO4(2,1g/l)、(NH4)2HPO4(2,1g/l)MgCl2(3,3g/l)、K2HPO4(5g/l)和CaCl2(0,2g/l)以及微量矿物ZnSO4(0,0005g/l)、CuCl(0,0003g/l)和MnCl2(0,05g/l)补充生长介质。在培养结束时，生物质中的含油量是细胞的干重的34,6％。巴氏杀菌得到的生物质悬浮液并将其用于以下实施例中的热收获测试。
批号2：
在中试发酵罐中在通风下使串珠状红冬孢酵母菌株CBS 8761(或其他由公认的微生物菌种保藏中心容易获得的串珠状红冬孢酵母菌株)生长。使用木质纤维素水解产物糖浆作为碳源，作为批次进料发酵进行发酵。在154h培养期间定期将木质纤维素水解产物糖浆添加到发酵罐中。用酵母提取物(8.3g/l)、(NH4)2SO4(1.3g/l)、(NH4)2HPO4(2.0g/l)、MgCl2(1.7g/l)、KH2PO4(1.8g/l)以及微量矿物ZnSO4(0,0005g/l)、CuCl2(0,0003g/l)和MnCl2(0,05g/l)、Na2MoO4(0.0003g/l)补充生长介质。在培养结束时，生物质中的含油量是细胞的干重的47.7％。巴氏杀菌得到的生物质悬浮液并将其用于以下实施例中的热收获测试。
实施例3
在纯糖上培养隐球酵母生物质用于热收获实验
将三个隐球酵母生物质批次用于热收获测试
批号1：
在中试发酵罐中在通风下使弯曲隐球酵母(Cryptococcus curvatus)菌株CBS5324(或其他由公认的微生物菌种保藏中心容易获得的弯曲隐球酵母菌株)生长。使用葡萄糖作为碳源作为批次进料发酵进行发酵。在119h培养期间定期将葡萄糖浆添加到发酵罐中。用酵母提取物(10g/l)、麦芽提取物(3g/l)、(NH4)2SO4(1,5g/l)、(NH4)2HPO4(1,5g/l)、MgCl2(1,8g/l)、KH2PO4(3g/l)、K2HPO4(1g/l)和CaCl2(0,4g/l)以及微量矿物ZnSO4(0,0003g/l)、CuCl(0,0002g/l)和MnCl2(0,03g/l)补充生长介质。在培养结束时，生物质中的含油量是细胞的干重的38,5％。巴氏杀菌得到的生物质悬浮液并将其用于以下实施例中的热收获测试。
批号2：
在中试发酵罐中在通风下使弯曲隐球酵母菌株CBS 5324TKK突变体40(或其他由公认的微生物菌种保藏中心容易获得的弯曲隐球酵母菌株)生长。使用葡萄糖作为碳源作为批次进料发酵进行发酵。在114h培养期间定期将葡萄糖浆添加到发酵罐中。用酵母提取物(6g/l)、(NH4)2SO4(1,8g/l)、(NH4)2HPO4(1,8g/l)、MgCl2(1,8g/l)、KH2PO4(3g/l)和CaCl2(0,3g/l)以及微量矿物ZnSO4(0,0003g/l)、CuCl(0,0002g/l)和MnCl2(0,03g/l)补充生长介质。在培养结束时，生物质中的含油量是细胞的干重的47,9％。巴氏杀菌得到的生物质悬浮液并将其用于以下实施例中的热收获测试。
批号3：
在中试发酵罐中在通风下使弯曲隐球酵母菌株CBS 5324TKK突变体40(或其他由公认的微生物菌种保藏中心容易获得的弯曲隐球酵母菌株)生长。使用葡萄糖作为碳源作为批次进料发酵进行发酵。在90h培养期间定期将葡萄糖浆添加到发酵罐中。用酵母提取物(6g/l)、(NH4)2SO4(1,8g/l)、(NH4)2HPO4(1,8g/l)、MgCl2(1,8g/l)、KH2PO4(3g/l)和CaCl2(0,3g/l)以及微量矿物ZnSO4(0,0003g/l)、CuCl(0,0002g/l)和MnCl2(0,03g/l)补充生长介质。在培养结束时，生物质中的含油量是细胞的干重的40.3％。巴氏杀菌得到的生物质悬浮液并将其用于以下实施例中的热收获测试。
实施例4
水热处理对酵母生物质的过滤性的影响
使用用于模拟从木质纤维素生物质提取糖类的强度系数表示热处理条件(温度和处理时间作为变量)。使用式(1)(Pedersen and Meyer,2010)计算强度系数logR0。
在1升压力反应器(Parr Instruments)中在不同的强度下处理含水酵母悬浮液。在搅拌(500rpm)下加热反应器并在某些强度LogR0值下取出样品。用2um过滤器测试取出的样品的过滤性(filterability)。HTT对酵母生物质悬浮液的过滤性的影响示于表1-3中。
表1.实施例1的红冬孢酵母生物质的过滤性
固体DW 5.93wt％，pH 5.75
表2.实施例2的批次1的红冬孢酵母生物质的过滤性
固体DW 3.8wt％，pH 5，9
表3.实施例3的批次1的隐球酵母生物质的过滤性
固体DW 7.09wt％，pH 5.5
基于实施例4的结果，制造包含可过滤的酵母生物质的含水悬浮液的水热处理(HTT)的所需要的强度系数取决于酵母种属以及一定程度上取决于含水悬浮液的pH值。通常，需要HTT的LogR0>3.9的强度系数来制造包含可过滤的酵母生物质的含水悬浮液。
实施例5
水热处理对微生物油的提取产率的影响。
使实施例1的红冬孢酵母悬浮液经受不同的水热处理以研究HTT强度对脂质的提取产率的影响。
首先，用Sorvall离心机在10 000rpm/20min下离心巴氏杀菌的(80℃，15min)生物质悬浮液以得到具有25％的固体干物质含量的悬浮液。将得到的固体材料干燥至98％固体干物质含量，因此生成在不使用水热处理的情况下收获的酵母生物质。这个实施例中的该生物质在表4中称为“无HTT”。
另外，使用不同的强度系数水热处理实施例1的酵母悬浮液。通过在密闭的压力反应器(1升Parr反应器，搅拌500rpm)中处理酵母生物质悬浮液针对确定的温度和时间进行该水热处理，冷却至室温。用布氏过滤器(Buchner fiter)(2um过滤器)由处理的酵母生物质悬浮液过滤生物质固体，并将分离的固体干燥至95％的固体干物质含量。
在Retch实验室研磨机中将来自各个水热处理的生物质固体研磨成粉末。在50℃下用庚烷提取研磨的固体(固体/庚烷比1:5w/w)1小时，离心以分离固体和溶剂-油相。另外用新鲜的庚烷洗涤固体，离心并将分离的溶剂-油相与来自提取步骤的溶剂-油相结合。蒸发溶剂以得到粗微生物油部分。
表4中呈现了来自原始干燥的酵母生物质(称为“无HTT”)和水热处理的生物质的提取产率。从表4可以看出，由于无效的细胞破坏，来自原始干燥生物质的油产率低。在140℃/15min下处理生物质对于破坏细胞也是不够的且油产率同样不良。在足够强的条件(logR0>3.6)下HTT之后，可以提取生物质中的所有油。
当反应温度是140℃时，压力是约5巴。当温度是160℃时，压力是6.2巴至6.8巴。当温度是180℃时，压力是10.3巴至11.0巴。当温度是210℃时，压力是19.6巴。
表4.不同的水热处理、用庚烷提取油之后来自在纯糖上生长的串珠状红冬孢酵母的油产率
水热处理 强度，LogR0 油产率(原始生物质中的油％)
无HTT 0 25％
140℃/15min 2,6 26％
160℃/3h 4,0 101％
180℃/30min 4,0 100％
180℃/1h 4,2 98％
210℃/0min 4,5 103％
*原始生物质中的油＝通过GC分析的总脂肪酸。
实施例6
水热处理对从酵母生物质中提取的油的质量的影响
由三组粗微生物油分析杂质。在第一比较实施例中，通过ICP分析从如之前的实施例5所描述的红冬孢酵母生物质中提取的粗微生物油的杂质(金属、磷)。
在第二比较实施例中，针对相同的杂质分析来自如实施例3所描述的在纯糖上生长并与实施例5中的红冬孢酵母生物质类似地水热处理的隐球酵母生物质批次1和2的粗微生物油。
在第三比较实施例中，针对杂质分析来自如实施例2所描述的在木质纤维素糖上生长并与实施例5中的红冬孢酵母生物质类似地水热处理的红冬孢酵母生物质批次1和2的粗微生物油。
从水热处理的生物质中提取的油具有与来自非水热处理的生物质的油一样良好的质量。在一些杂质(P、Ca、Mg和N)方面，从表5、6和7中呈现的分析结果可以看出，水热处理的油甚至比没有经受水热处理的微生物油更纯。对于酵母隐球酵母和红冬孢酵母两者，热收获看起来在生产具有可忽略量的金属和磷的油中是非常有效的，因此在将微生物油催化转化为燃料或化学品之前需要最少的预处理。
通过改变水热处理条件，尤其是温度，可以改变油质量。通过降低温度，更少的氮化合物引入到油中，尽管废水中的氮的含量与在较高温度下进行的热处理一样高。
表5.由水热处理的和非水热处理的实施例5的糖生长的串珠状红冬孢酵母生物质提取的微生物油之间的比较
表6.由水热处理的和非水热处理的实施例3的糖生长的弯曲隐球酵母生物质提取的微生物油之间的比较
表7.由水热处理的和非水热处理的实施例2的木质纤维素生长的串珠状红冬孢酵母生物质提取的微生物油之间的比较
实施例7
水热处理对于从酵母在木质纤维素水解产物上生长的水相中除去溶解的木质纤维素材料的影响
在不同的强度下在实验室规模中水热处理实施例2的串珠状红冬孢酵母悬浮液批次1。该加工之后，通过过滤除去固体，因此生成上清液体流股。作为第一比较情况，在没有水热处理的情况下通过离心以及在没有巴氏杀菌悬浮液(表8中的“无HTT”)的情况下从酵母悬浮液中回收液体上清液。作为第二比较情况，首先巴氏杀菌酵母悬浮液并在没有水热处理的情况下通过离心(表8中的“巴氏杀菌105C/5min”)从酵母悬浮液中回收液体上清液。
表8示出了上清液的特征是怎样被不同的加工条件改变的。在180℃/1h下水热处理酵母悬浮液中，液体上清液的上清液化学需氧量(COD)降低了21％，以及在250℃/1h下的水热处理中降低了47％。水热处理的强度越高，在处理期间存在于培养介质中的越多溶解的材料固化，并可以通过过滤通过酵母生物质回收。相反，仅巴氏杀菌从生物质中释放材料到液体，因此生成如表8所示的在名称为“初始的DW-％”行中的更多溶解的材料。
不是所有的溶解的材料转化为作为溶解的材料的一部分的可分离的固体生物质部分，且生物质还在热处理期间气化。气体的量是初始干物质的2-5％，且气体大部分由一氧化碳、二氧化碳、氧和各种烃组成。
表8.在不同的条件下水热处理之后针对分离的上清液体的分析结果
实施例8
洗涤水热处理的微生物生物质对提取的油的质量的影响
如表9所示，该实施例示出了在油提取之前水洗水热处理的酵母生物质降低油中的氮和金属的量。这非常有利地和显著地减少对于纯化的需要且甚至可以消除在将粗微生物油转化为燃料或化学品之前对预处理步骤的需要。
表9.在具有或不具有水洗的情况下由水热处理的生物质提取的酵母油之间的比较
实施例10
干燥和油提取温度对提取的油的质量的影响
发现可以通过在油提取步骤之前优化生物质的干燥(表10)和通过优化油提取温度(表11)可以调节提取的微生物油中的杂质的量，尤其是氮的量。结果示出较低的干燥和提取温度对于提取油的质量是有益的。
表10.在使用不同的干燥条件之后使用正己烷从水热处理的酵母生物质中提取的微生物油之间的比较
表11.使用正庚烷作为溶剂在不同的提取温度下从水热处理的酵母生物质中提取的微生物油之间的比较
该实施例的结果示出了通过在低于85℃的温度下干燥水热处理的生物质，可以显著降低提取的微生物油中的氮的量。还示出通过在室温下进行油提取，与在较高温度下的提取相比，提取的微生物油中的氮的量进一步降低。
实施例11
pH调节对水热收获和提取的油的质量的影响
在水热收获期间，看出悬浮液的pH自然降低，如从表12可以看出的。还可以在水热收获之前调节悬浮液的pH，这增加在加热期间变得可溶于悬浮液的生物质的量。通过一些测试的酵母生物质，在HTT之前使生物质更酸性使得酵母细胞在较短的处理时间和较低的温度下浮起(float)。尽管，该较早和较容易的浮起没有改变使这些酵母可过滤所需的强度，且因此pH调节仅在认为必需通过离心分离酵母细胞时产生优势。应注意在这种情况下，强度系数不够高以能够有效地破坏细胞，并因此油产率保持较低。
pH的调节也可以对最终的油的质量具有影响。在表13中，对于两种生物质悬浮液的水热处理的强度系数相同，但是在水热处理之前将其他生物质悬浮液的pH调节为酸性。从后面的生物质中提取的油的氮含量稍微地较高。
表12.在HTT之前生物质悬浮液(培养在糖上的串珠状红冬孢酵母)的pH调节对生物质至液相的溶解速率的影响
表13.在HTT之前生物质悬浮液(在糖上培养的弯曲隐球酵母，批次2)的pH调节对油质量的影响。

Claims (25)

1.一种用于从产油酵母生物质中回收微生物脂质的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供包含含有产油酵母生物质的发酵肉汤的含水悬浮液，
(ii)在高于5巴的压力下在至少160℃的温度下使所述悬浮液经受水热处理1秒至360分钟，
(iii)使水热处理的悬浮液经受分离步骤以得到液体部分和酵母生物质部分，
(iv)使所述酵母生物质部分经受干燥步骤以得到干燥的酵母生物质部分，
(v)用液体溶剂使所述干燥的生物质部分经受提取步骤以产生包含微生物脂质的液体部分和包含残留的酵母生物质部分的固体部分，
(vi)从步骤(v)的所述液体部分中回收微生物脂质，
(vii)可选地，从步骤(v)的产物中分离所述残留的生物质部分。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，由在包含木质纤维素水解产物的培养介质中的产油酵母的培养得到所述发酵肉汤。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中，在步骤(iv)的干燥和/或步骤(v)的提取之前，用水洗涤步骤(iii)中分离的酵母生物质部分。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，由分离步骤得到的所述酵母生物质部分具有至少50％、优选地至少60％的干物质含量。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述干燥的生物质部分具有至少90％、优选地至少95％的干物质含量。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在对应于至少3.5、优选地至少3.9的强度系数LogR0的条件下进行水热处理。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在对应于约3.5至约5.5如例如约4至约4.5的强度系数LogR0的条件下进行水热处理。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述酵母生物质具有按细胞团的重量计至少20％、优选地至少30％、最优选地至少35％、如例如至少约40％、或如例如至少约50％、如例如至少约60％、如例如至少约70％、如例如至少约80％的脂质含量。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述含水悬浮液具有至少3％、优选地至少10％的干物质含量。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，酵母是红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、蔷薇色酵母属(Rhodotorula)、油脂酵母属(Lipomyces)、隐球酵母属(Cryptococcus)或酿酒酵母属(Saccharomyces)。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，通过离心执行所述分离(iii)或所述分离(iii)包括离心步骤。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，通过过滤执行所述分离(iii)或所述分离(iii)包括过滤步骤。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在真空中并在低于90℃、优选地低于70℃的生物质温度下进行所述干燥步骤(iv)。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在低于约90℃、优选地低于约70℃、如例如低于约60℃、如例如低于约50℃、如例如低于约40℃、例如低于约30℃、如例如约20℃的温度下进行所述提取步骤(v)。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤(i)中的含水悬浮液的pH值低于约6、优选地低于约5。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法不包括步骤(iii)中的分离的液体部分的提取。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在约6至约25巴的范围内、例如约10至约25巴的范围内、如10至15巴的范围内、如例如约6.0巴至约20.0巴的范围内、如例如约6.0巴至约7.0巴、如例如约10.0巴至约11.0巴、如例如约13.0巴至约18巴、如例如约16巴至约19巴的压力下进行步骤(ii)中的水热处理。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在约180℃至约210℃、如例如约190℃或约200℃的温度范围下进行步骤(ii)的水热处理。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在根据以下的相应分布的温度和压力下进行步骤(ii)中的水热处理：当反应温度是约160℃时，压力可以是例如约6.2巴至约6.8巴，或当温度是约180℃时，压力可以是例如约10.3巴至约11.0巴，或当温度是约190℃时，压力可以是例如约13.7巴至约18巴，或当温度是约200℃时，压力可以是例如约16.2巴，或当温度是约210℃时，压力可以是例如约19.6巴。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，基于存在于所述生物质中的油或脂质的含量，提取的油或脂质的产率在至少约70％、如例如约至少80％、如例如约至少90％、如例如约至少95％、如例如约至少98％、如例如约100％的范围内。
21.通过根据权利要求1-20中任一项所述的方法能够得到的残留生物质。
22.通过根据权利要求1-20中任一项所述的方法能够得到的微生物脂质。
23.根据权利要求22所述的能够得到的微生物脂质，其中，所述脂质包含不多于600mg/kg的元素氮、更优选地不多于200、最优选地不多于100mg/kg的元素氮、如例如不多于约75mg/kg、如例如不多于约60mg/kg、如例如不多于约50mg/kg。
24.根据权利要求23所述的能够得到的微生物脂质，其中，所述脂质包含不多于20mg/kg的元素磷、优选地不多于10mg/kg、甚至更加优选地不多于5mg/kg、最优选地不多于1mg/kg的元素磷。
25.根据权利要求23或24所述的能够得到的微生物脂质，其中，所述脂质包含不多于20mg/kg、优选地不多于10mg/kg、甚至更加优选地不多于5mg/kg、最优选地不多于1mg/kg的元素铁、钠、硅、钙、镁、锰或钾中的任一种。
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