ES2867964T3 - Cepa de microorganismos y procedimiento para la producción fermentativa exenta de antibióticos de sustancias y proteínas de bajo peso molecular - Google Patents

Cepa de microorganismos y procedimiento para la producción fermentativa exenta de antibióticos de sustancias y proteínas de bajo peso molecular Download PDF

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Abstract

Cepa de microorganismos para la producción de sustancias o proteínas de bajo peso molecular que contienen en su genoma una mutación en un gen, que provoca una auxotrofía de la cepa, así como un plásmido de producción que codifica al menos una enzima para la producción de una sustancia de bajo peso molecular o al menos una proteína recombinante, así como una copia funcional del gen, cuya desactivación cromosómica provoca la auxotrofía, caracterizada por que, en el caso de la auxotrofía, se trata de una auxotrofía no alimentable y se trata del gen pyrH con la la SEQ ID nº 1 o de un gen homólogo a pyrH, debiéndose entender por una auxotrofía no alimentable el hecho de que la auxotrofía reduzca el crecimiento de células de microorganismo o provoque la muerte de células de microorganismo, y no sea suplementable mediante adición de productos previos, intermedios y/o finales específicos del metabolismo en el medio de crecimiento, y tratándose, en el caso de genes homólogos a pyrH, de genes que codifican para una proteína con actividad de PyrH y presentan una identidad de secuencia mayor que 30 % respecto a SEQ ID nº. 1.

Description

DESCRIPCIÓN
Cepa de microorganismos y procedimiento para la producción fermentativa exenta de antibióticos de sustancias y proteínas de bajo peso molecular
La invención se refiere a una cepa de microorganismos y a un procedimiento para la producción fermentativa exenta de antibióticos de sustancias y proteínas de bajo peso molecular. La invención se expone en la parte de reivindicaciones adjunta.
La producción natural de sustancias de bajo peso molecular con ayuda de microorganismos ha aumentado en principio, y también ha crecido considerablemente en el mercado de productos farmacéuticos recombinantes (“productos biológicos”) en los últimos años. Debido a la fuerte presión de costes en la producción fermentativa, en especial para productos activos farmacéuticos a base de proteínas, se buscan continuamente procedimientos y sistemas más eficientes, y de este modo más económicos, para su producción. Como productores se pueden emplear diversos microorganismos, como bacterias, levaduras, hongos filamentosos o también células vegetales o células animales. En este caso desde el punto de vista de la rentabilidad es esencial una fermentación económica, rendimientos de producto elevados y, en el caso de proteínas, un correcto plegamiento, o bien modificación, que conduce a una proteína funcional. Debido a su muy bien estudiada genética y fisiología, al tiempo de generación corto y al fácil manejo, la enterobacteria gram-negativa Escherichia coli (E. coli) es actualmente el organismo empleado con mayor frecuencia para la producción de sustancias y proteínas de bajo peso molecular.
En principio se emplean dos microorganismos diferentes, que producen las sustancias de manera natural y aquellos que se modificaron genéticamente. Los procedimientos técnicos necesarios para la modificación genética son conocidos en el estado de la técnica desde hace tiempo. En este caso, el objetivo es introducir los genes, que son necesarios para las proteínas objetivo, o bien para la síntesis de sustancias de bajo peso molecular, en la célula huésped. Estos se transcriben por la célula huésped, se trasladan, se modifican si es necesario, y eventualmente se descargan en el medio.
La rentabilidad de un procedimiento biotecnológico depende decisivamente de los rendimientos de producto obtenidos. Estos se pueden optimizar mediante el sistema de expresión (célula huésped, elementos genéticos, etc.), los parámetros de fermentación y los medios nutrientes.
Las células huésped se pueden modificar fundamentalmente de dos maneras. De este modo, la nueva información genética se puede integrar en el genoma (hongos filamentosos, levaduras, etc.) y/o en un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmido) (procariotas, levaduras, etc.). En la integración genética de los genes en el genoma, estos se conservan convenientemente en la célula huésped también sin presión de selección. No obstante, es desfavorable que, en el caso de procariotas, solo una copia del gen está presente en el huésped, y la integración de otras copias del mismo gen para el aumento de la formación de productos a través del efecto de la dosis de gen es muy exigente debido a los resultados de recombinación específicos de la secuencia (EP 0284126 B1).
En la utilización de ADN extracromosómico, la información de la proteína objetivo en forma de un plásmido se transforma generalmente en la cepa de producción de E. coli. Ya que también aquí actúa el efecto de la dosis de gen, se desea un número lo más elevado posible de copias de plásmido por célula. Ya que, debido a la carga, tal elemento genético se pierde fácilmente de la célula tanto debido a la replicación del plásmido como también debido a la producción de la proteína objetivo, a través del cultivo total se debe ejercer una presión de selección. Como marcadores de selección se emplean por defecto genes de resistencia a antibióticos que permiten de este modo un crecimiento en presencia de antibióticos a la célula que presenta tal elemento. Por consiguiente, solo se pueden propagar las células que portan un plásmido. Ya que debido a la pérdida de plásmido también se pierde la capacidad de producción de la sustancia objetivo, o bien de la proteína objetivo, esto tiene un efecto directo sobre los rendimientos que se pueden obtener en la fermentación.
El empleo de resistencias a antibióticos como marcador de selección se ha considerado cada vez más crítico en los últimos años. Por una parte, el empleo de antibióticos es bastante caro, en especial si la resistencia se basa en una enzima que degrada antibióticos, ya que el antibiótico se debe dosificar posteriormente de manera constante. Por otra parte, el empleo ampliamente extendido en la medicina y otros campos contribuye a la propagación de los genes de resistencia a otras cepas parcialmente patógenas. Esto tiene consecuencias negativas para el tratamiento de enfermedades.
Entretanto, en el estado de la técnica también se han desarrollado sistemas de selección exentos de antibiótico. Se desarrollaron diferentes sistemas exentos de antibiótico. Estos se pueden subdividir en tres sistemas básicos diferentes. El empleo de auxotrofías, sistemas toxina-antitoxina y otros procedimientos.
Corresponden a la categoría de otros procedimientos mecanismos que no siguen ningún principio general, por ejemplo t-RNAs supresor fab I/triclosán (síntesis de FA), titración operador/represor (Peubez et al. Microbial Cell Fac, 2010, 9:65). No obstante, estos procedimientos se emplean generalmente para la síntesis de ADN y fragmentos de ADN para la terapia génica, y no están optimizados para la producción de rendimientos elevados de sustancias objetivo. En lugar de antibióticos, para la selección se emplean en parte otras sustancias, por ejemplo, triclosán, herbicidas y metales pesados, que también están sujetos, no obstante, a objeciones sanitarias. De este modo, por ejemplo, por Herrero et al. (1990, J.Bacteriol. 172, 6557-6567) se describen genes de resistencia contra herbicidas y metales pesados como marcadores de selección.
Los sistemas toxina-antitoxina (Hok-Sok, ccdA/B etc.) están constituidos por dos elementos genéticos que pueden estar codificados tanto en el plásmido, como también cromosómicamente y en el plásmido (Gerdes et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1986, 83:3116-20). En este caso, la antitoxina actúa neutralizando la toxina. En el caso de pérdida del plásmido, este mecanismo falla y la célula exenta de plásmido muere debido a la toxina codificada cromosómicamente, o bien de larga vida.
Otro método conocido para la selección es la complementación de cepas auxótrofas. En este caso, en el genoma de la cepa producción se eliminan o bien se desactivan genes que tienen funciones esenciales en el metabolismo. Correspondientemente, tales genes se denominan genes esenciales. La cepas auxótrofas producidas de este modo pueden crecer, propagarse o sobrevivir solo si la función metabólica se evita o se produce de nuevo. Esto se puede conseguir tanto mediante alimentación de correspondientes precursores o productos finales del metabolismo (aminoácidos, bases, etc.) o mediante introducción del gen que se desactivó en el genoma huésped. La patente EP 0284126 B1 cita marcadores de auxotrofía del metabolismo de aminoácidos. Ya que las auxotrofías se pueden suplementar mediante adición del producto metabólico necesario en el medio, estas cepas se pueden generar fácilmente. Las células se pueden cultivar entonces en presencia del producto metabólico también sin plásmido. Mediante transformación se introduce de nuevo en la célula la información para la síntesis de aminoácido/base, y la célula puede crecer también sin suplementación. Correspondientemente, la selección en medios mínimos se puede efectuar sin el suplemento.
Hasta el momento, en la práctica no se pudo imponer el empleo de tales auxotrofías como marcadores de selección, ya que en la fermentación industrial se emplean habitualmente medios con composición compleja. En este caso, por regla general por motivos de costes, las sustancias residuales son componente del medio de fermentación, como por ejemplo residuos de cereales (producción de etanol), maíz, (producción de almidón), patatas (obtención de almidón), o extracto de levadura. Estos sirven como fuentes tanto de carbono como también de nitrógeno. En parte, estos componentes no se definen exactamente, pero contienen aminoácidos, bases, vitaminas, etc., que se pueden absorber a partir del medio. Por lo tanto, en la fermentación industrial es difícil, si no imposible, desarrollar una presión de selección suficiente con cepas auxótrofas.
Tampoco el empleo de una auxotrofía en el metabolismo de glucosa, como se describe en el documento WO 2008/135113 A1, tiene una selectividad suficiente en los medios empleados industrialmente. Si bien los microorganismos pueden crecer especialmente bien y propagarse más rápidamente en glucosa que lo que es el caso en medios con otras fuentes de C, esta ventaja se suprime de nuevo debido a la carga más elevada debida al plásmido, o bien a la producción de la sustancia objetivo. Otras fuentes de C se encuentran disponibles en medios complejos y se emplean por las células.
Esto se considera también para el empleo del gen pyrC (dihidroorotasa) descrito en el documento WO 07039632 A1 como marcador de auxotrofía. Esta enzima se encuentra al comienzo de la síntesis de bases de pirimidina y la desactivación conduce también a la inhibición de la síntesis de nuevo. No obstante, las bases se pueden absorber y utilizar a partir del medio y no desarrollan una correspondiente presión de selección en medios industriales.
Representan excepciones auxotrofías para la timidina y D-alanina esencial, que se presentan también en componentes complejos únicamente en trazas o incluso no se presentan en los medios de fermentación (EP 0251579 A1; EP 0185512 B1). No obstante, tampoco estos sistemas son apropiados para la producción eficiente en el procedimiento de alta densidad celular, que se desea por regla general. Ya que en este procedimiento las células mueren y sufren lisis parcialmente, correspondientemente se liberan timidina y D-alanina, o bien otros aminoácidos, etc., que pueden suplementar a su vez las auxotrofías.
En total se debe determinar que, a pesar de la experiencia de años para la producción fermentativa de sustancias y proteínas de bajo peso molecular, hasta el momento no se desarrolló un sistema empleable universalmente, excepto aquel a través de sustancias costosas o cuestionables desde el punto de vista sanitario, o bien ecológico, como antibióticos. Debido a los medios de crecimiento complejos empleados en la industria, también los diferentes métodos para la selección a través de marcadores de auxotrofía han llevado a resultados insuficientes hasta la fecha.
Esto se considera en principio para microorganismos, pero en especial para cepas de producción menos robustas, como por ejemplo cepas permeables, que se utilizan en base a sus propiedades especiales (liberación de proteínas en el medio). En la utilización industrial de estas cepas a escala técnica se emplean habitualmente componentes complejos en el medio.
La utilización de medios definidos a partir de componentes purificados no es rentable para la producción de productos utilizados industrialmente por motivos de costes.
Es tarea de la invención poner a disposición una cepa de microorganismos para la producción de sustancias o proteínas de bajo peso molecular, que permanezca estable también en medios con componentes complejos y en la que el plásmido de producción no se estabilice mediante un sistema antibiótico/marcador de resistencia en la célula.
Esta tarea se soluciona mediante una cepa de microorganismos que contiene en su genoma una mutación en un gen, que provoca una auxotrofía de la cepa, así como un plásmido de producción que codifica al menos una enzima para la producción de una sustancia de bajo peso molecular o al menos una proteína recombinante, así como una copia funcional del gen, cuya desactivación cromosómica provoca la auxotrofía, caracterizada por que, en el caso de la auxotrofía, se trata de una auxotrofía no alimentable y se trata del gen pyrH o sus genes homólogos.
En el ámbito de la invención, se debe entender por una auxotrofía no alimentable el hecho de que la auxotrofía reduzca el crecimiento de células de microorganismos o provoque la muerte de las células de microorganismos, y no sea suplementable mediante adición de productos previos, intermedios y/o finales específicos del metabolismo en el medio de crecimiento.
En el sentido de la invención, se presenta un crecimiento reducido si la tasa de crecimiento de la cepa en una fermentación se reduce tras la mutación del gen en comparación con la tasa de crecimiento de la cepa antes de la mutación del gen a < 10%, preferentemente si ya no tiene lugar más crecimiento. De modo especialmente preferente, la mutación conduce a la desactivación de un gen, provoca de este modo una auxotrofía no alimentable y de este modo la muerte de la célula de microorganismo. Por consiguiente, en el genoma de una célula de la cepa de microorganismos está desactivado un gel que es esencial para una vía de metabolismo anabólica necesaria para el crecimiento o la supervivencia de las células, no pudiéndose obtener de nuevo crecimiento o supervivencia de la célula mediante adición de productos previos, intermedios y/o finales específicos del metabolismo en el medio de crecimiento.
Un gen de auxotrofía no alimentable en el sentido de la invención es un gen en el genoma de una célula de microorganismo cuya desactivación no se puede complementar mediante adición de productos previos, intermedios y/o finales específicos del metabolismo en el medio de crecimiento, y cuya desactivación conduce a una tasa de crecimiento reducida o a la muerte de la célula de microorganismo.
La mutación del gen, que provoca la auxotrofía no alimentable de la cepa, conduce preferentemente a la desactivación de este gen o a la desactivación de la actividad del producto génico codificado a través del gen.
Se describen ejemplos de genes de auxotrofía no alimentables (genes letales) en Baba et al. (2006, Mol. Syst. Biol.
2:2006.0008). Según la invención se trata de pyrH o sus genes homólogos. Según la invención se trata del gen pyrH o genes homólogos con la misma función, o bien actividad.
Además del segmento de ADN que se transcribe, un gen en el sentido de la presente invención comprende también los segmentos de ADN que participan en la regulación de este proceso de copia, es decir, los elementos reguladores del gen, como preferentemente promotores y terminadores.
Por genes homólogos se debe entender preferentemente genes que codifican para una proteína con la misma actividad que la proteína codificada por el citado gen y presentan una identidad de secuencia mayor que el 30 %, de modo especialmente preferente mayor que el 70 %, respecto a las secuencias de los citados genes en el respectivo microorganismo, conocidas por bancos de datos en cada caso.
El gen pyrH codifica para la enzima UMP-quinasa (EC: 2.7.4.22; UK, uridina monofosfato quinasa, uridilato quinasa, uridina 5‘-monofosfato (UMP) quinasa). Esta enzima activa UMP para dar UDP bajo empleo de ATP. En un paso siguiente se activa UDP por otra quinasa (UDP-quinasa) para dar UTP, que se puede emplear tanto para la síntesis de ARN como también para la síntesis de CTP (citosina trifosfato) y TTP (timidina trifosfato). CTP y TTP son a su vez componente de RNA (CTP) y DNA (dCTP y dTTP). De este modo, UMP es el origen de componentes de pirimidina de ARN y ADN. Ya que una transformación de uracilo en citosina o timidina se efectúa solo en el plano del trifosfato, una desactivación de UMP-quinasa conduce a un bloqueo completo de esta vía de síntesis.
En principio, la célula puede absorber solo los monofosfatos de las tres bases a partir del medio. Para la transformación de UMP en UTP es esencial la UMP-quinasa. De este modo, esta auxotrofía no es suplementable mediante alimentación y, por lo tanto, es independiente de la composición del medio.
El gen pyrH está caracterizado por SEQ ID n° 1. El producto génico pyrH (PyrH) está caracterizado por SEQ ID n° 2.
En el ámbito de la presente invención, los homólogos de pyrH son genes que codifican para una proteína con actividad PyrH y presentan una identidad de secuencia mayor que 30 % respecto a SEQ ID n° 1. Es especialmente preferente una identidad de secuencia mayor que 70% respecto a SEQ ID n° 1. De modo especialmente preferente se trata del gen pyrH.
Los homólogos de PyrH son proteínas con una identidad de secuencia mayor que 30 % respecto a SEQ ID n° 2, que presentan una actividad de UMP-quinasa según el número EC 2.7.4.22. De modo especialmente preferente, los homólogos de PyrH presentan una actividad de UMP-quinasa según el número EC 2.7.4.22 y una identidad de secuencia mayor que 70 % respecto a SEQ ID n° 2. De modo especialmente preferente se trata de la proteína PyrH.
La actividad de PyrH en una célula se puede determinar correspondientemente al ensayo descrito por Bucurenci et al. (1998, J. Bact. 180: 473-77).
El grado de identidad de ADN se determina mediante el programa "nucleotide blast", disponible en la página http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/. que se basa en el algoritmo de blastn. Como parámetro de algoritmo para un alineamiento de dos o más secuencias de nucleótidos se utilizaron los parámetros ajustados previamente. Los parámetros generales ajustados previamente son: secuencias objetivo máximas = 100; consultas breves = "Automatically adjust parameters for short input sequences"; umbral esperado = 10; tamaño de palabra = 28; parámetros de ajuste automático para secuencias cortas de entrada = 0. Los correspondientes parámetros de puntuación ajustados previamente son: calificaciones de coincidencia/discordancia = 1, -2; costes de espacio: lineales.
Para la comparación de secuencias proteicas se utiliza el programa "protein blast", en la página http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/. Este programa recurre al algoritmo de blastp. Como parámetro de algoritmo para un alineamiento de dos o más secuencias de nucleótidos se utilizaron los parámetros ajustados previamente. Los parámetros generales ajustados previamente son: secuencias objetivo máximas = 100; consultas breves = "Automatically adjust parameters for short input sequences"; umbral esperado = 10; tamaño de palabra = 3; parámetros de ajuste automático para secuencias cortas de entrada = 0. Los correspondientes parámetros de puntuación ajustados previamente son: matriz = BLOSUM62; costes de espacio = existencia: 11 extensión: 1; ajustes de composición = ajuste de matriz de calificación de composición condicional.
Para la producción de una cepa según la invención se introduce un plásmido sensible a la temperatura en una cepa de microorganismos apropiada, que posee una copia funcional de un gen de auxotrofía no alimentable, que se debe mutar o eliminar. A continuación, se desactiva el correspondiente gen de auxotrofía no alimentable en el genoma de la cepa. En esta cepa se sustituye a continuación el plásmido sensible a la temperatura por un plásmido de producción a temperatura no permisiva, conteniendo el plásmido de producción, que codifica al menos una enzima para la producción de una sustancia de bajo peso molecular o al menos una proteína recombinante, también una copia funcional del gen de auxotrofía no alimentable.
Mediante este procedimiento se asegura que el plásmido de producción se mantenga en la célula de manera estable durante un proceso de fermentación para la producción de compuestos de bajo peso molecular o de proteínas recombinantes, también en medios complejos. Por consiguiente, las cepas según la invención se pueden cultivar sin pérdida de plásmido en ausencia de un agente selectivo añadido, o bien de un aditivo que compensa una auxotrofía.
Como cepa de partida para la producción de una cepa según la invención, en principio es apropiada cualquier cepa de microorganismos que posea un gen, cuya desactivación conduzca a una auxotrofía no alimentable de la cepa.
En el caso de la cepa de partida para la generación de una cepa según la invención se trata preferentemente de una cepa de enterobacterias, de modo especialmente preferente de una cepa de la especie Escherichia coli.
En el caso de las cepas de E. coli son preferentes aquellas que presentan una mutación “permeable”. Se debe entender por una “mutación permeable” una mutación en un gen para un elemento estructural de la membrana celular externa o de la pared celular, seleccionado a partir del grupo de genes omp, genes tol, gen excD, gen excC, gen lpp, gen pal, genes env y genes lky, que conduce a que las células desprendan en el medio proteínas periplasmáticas de manera acrecentada (Shokri et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 60 (2003), 654-664). Preferentemente se trata de una mutación “permeable” en el gen Ipp, de modo especialmente preferente de una mutación seleccionada a partir del grupo mutación Ipp1, mutación de deleción de Ipp y mutación del resto glicina en posición 14 de la proteína Lpp (en recuento incluyendo señal peptídica), como por ejemplo la mutación Ipp-3. Una mutación lpp1 es una mutación en el gen lpp, que conduce a una sustitución del resto arginina en posición 77 por un resto cisteína, una mutación lpp3 es una mutación en el gen lpp, que conduce a una sustitución del resto glicina en posición 14 por un resto ácido aspártico. Estas mutaciones se describen detalladamente en el documento US2008254511. En el caso de la mutación lpp se trata preferentemente de una deleción de al menos un nucleótido en el propio gen lpp o en la región de promotor del gen lpp, que conduce a que las células presenten una permeabilidad elevada para proteínas periplasmáticas.
En el sentido de la presente invención, se debe entender por permeabilidad elevada el hecho de que, tras una fermentación de las células, en el medio nutriente se presente una concentración de proteínas periplasmáticas, por ejemplo, de fosfatasa alcalina, más elevada que en el caso de una fermentación de la cepa de E. coli W3110 (ATCC 27325) bajo las mismas condiciones.
En el estado de la técnica son conocidos procedimientos para la desactivación de un gen en una cepa de microorganismos. Estos se describen de manera detallada a continuación para la mutación del gen pyrH, así como sus productos génicos. Análogamente, estos procedimientos son aplicables también para otros genes, cuya desactivación provoca una auxotrofía no alimentable de una cepa de microorganismos. El plásmido sensible a la temperatura contiene un origen de replicación sensible a la temperatura y una copia funcional del gen de auxotrofía no alimentable. Este plásmido contiene además un gen marcador de selección para la selección de transformantes. En el caso del marcador de selección se trata, a modo de ejemplo, de una resistencia a antibióticos.
Un ejemplo preferente de un origen de replicación sensible a la temperatura es "oriR101 & repA101 -ts", un derivado del origen de replicación del plásmido pSC101 (Hashimoto-Gotoh et al.; Gene, 2000, 241:1:185-191), que está localizado, entre otros, en los plásmidos pKD20 y pKD46 (Datsenko und Wanner, 2000, P.N.A.S. 97: 6640-6645).
El plásmido sensible a la temperatura se introduce en la célula con una técnica de transformación conocida por el especialista, por ejemplo, método de TSS, CaCl/RbCl, electroporación.
En células que contienen el plásmido sensible a la temperatura se selecciona por medio del marcador de selección que está presente en el plásmido sensible a la temperatura, mientras que las células se incuban a temperatura permisiva para el plásmido.
Tal plásmido sensible a la temperatura se puede sustituir por el plásmido de producción, cultivándose la cepa de microorganismos tras la transformación con el plásmido de producción a una temperatura no permisiva para el plásmido sensible a la temperatura. Un intervalo de temperaturas no permisivo preferente es 37-45°C, de modo especialmente preferente 39-43°C.
El plásmido de producción se introduce en la célula con una técnica de transformación conocida por el especialista, por ejemplo, método de TSS, CaCl/RbCl, electroporación.
El cultivo de los transformantes se puede efectuar tanto en placas de agar como en cultivo líquido. En una forma de realización preferente, la cepa de microorganismos se expone a un shock térmico a 47-552C, preferentemente a 52°C, durante 30-90 min, de modo preferente 60 min, inmediatamente tras la transformación con el plásmido de producción. A continuación, se efectúa la incubación ulterior a la temperatura no permisiva citada anteriormente. De este modo, en un paso se sustituye el plásmido sensible a la temperatura por el plásmido de producción, y se genera una cepa de producción según la invención para la producción exenta de antibióticos de sustancias de bajo peso molecular o proteínas recombinantes.
Como plásmido de producción se emplea, a modo de ejemplo, uno de los siguientes vectores de expresión conocidos: pJF118EH, pKK223-3, pUC18, pBR322, pACYC184, pASK-IBA3 o pET.
Además de la copia funcional de gen de auxotrofía no alimentable, el plásmido de producción contiene uno o varios genes objetivo, así como las señales de expresión necesarias para la expresión de estos genes objetivo, como por ejemplo secuencias de promotor, operador y terminador. Los genes objetivo codifican para al menos una enzima para la producción de una sustancia de bajo peso molecular o al menos una proteína recombinante. En el caso de las sustancias de bajo peso molecular se trata de componentes básicos (bases, aminoácidos, ácidos grasos, etc.), así como metabolitos secundarios (vitaminas, antioxidantes, etc.) que puede sintetizar el organismo. Son preferentes aminoácidos, de modo especialmente preferente los aminoácidos L-cisteína y compuestos derivados de estos.
En el caso de las proteínas recombinantes se trata preferentemente de proteínas heterólogas.
Se debe entender por una proteína heteróloga una proteína que no pertenece al proteoma, es decir, la dotación de proteína natural total, del organismo huésped.
En el caso de la proteína heteróloga se trata preferentemente de una proteína eucariótica, de modo especialmente preferente una proteína que contiene uno o varios puentes disulfuro o que se presenta en su forma funcional como dímero o multímero, es decir, la proteína posee una estructura cuaternaria y está constituida por subunidades idénticas (homólogas) no idénticas (heterólogas).
Una clase preferente de proteínas, que está constituida por varias subunidades proteicas, son anticuerpos o fragmentos de anticuerpos. Son especialmente preferentes fragmentos de anticuerpos Fab.
En lo sucesivo se describe la producción de una cepa de microorganismos en la que el gen de auxotrofía no alimentable pyrH ha mutado.
Como cepas de partida para la producción de una cepa de microorganismos con una desactivación de pyrH genómica, en principio es apropiado cualquier organismo huésped que posea un gen para la UMP-quinasa PyrH.
En el estado de la técnica son conocidos procedimientos para la desactivación del gen pyrH en una cepa de microorganismos. El gen pyrH se puede desactivar, a modo de ejemplo, introduciéndose una mutación (sustitución, inserción o deleción de uno o varios nucleótidos) en los marcos de lectura del gen pyrH, que conduce a que se desactive la actividad específica de PyrH. El especialista conoce procedimientos para la generación de tales alelos pyrH. De este modo, por ejemplo, por medio del procedimiento descrito en Link et al. (1997, J. Bacteriol.
179: 6228-37), la introducción de mutaciones cromosómicas en un gen se puede efectuar a través del mecanismo de recombinación homóloga. La deleción cromosómica del gen pyrH total o de una parte de este es posible, a modo de ejemplo, con ayuda del sistema de A-Red recombinasa según el método descrito por Datsenko und Wanner (2000, Proc. Natl. Acad. Sci, USA. 97: 6640-5). Los alelos pyrH se pueden transferir a una cepa de tipo salvaje pyrH también a través de una transducción por medio de fagos P1 o conjugación a partir de una cepa con mutación pyrH, sustituyéndose el gen de tipo salvaje pyrH en el cromosoma por el correspondiente alelo pyrH.
Además, el gen pyrH de una célula se puede desactivar también mutándose al menos un elemento necesario para la regulación de la expresión (por ejemplo, promotor, potenciador, punto de unión de ribosomas) mediante sustitución, inserción o deleción de uno o varios nucleótidos. Se presenta una desactivación en el sentido de la invención si la tasa de crecimiento de las células en una fermentación se reduce a < 10% mediante la desactivación del gen en comparación con las células antes de la mutación, preferentemente si ya no tiene lugar un crecimiento. De modo especialmente preferente, la mutación conduce a la muerte de la célula de microorganismo.
Ya que la desactivación del gen pyrH conduce a una auxotrofía no alimentable, en la célula debe estar presente una copia funcional del gen pyrH ya antes de la desactivación cromosómica. Esto se puede conseguir mediante la introducción transiente de un plásmido sensible a la temperatura que contiene una copia funcional del gen pyrH.
En tales células que contienen el plásmido sensible a la temperatura se puede desactivar ahora el gen pyrH en el genoma mediante los citados métodos.
En un paso adicional, este plásmido sensible a la temperatura se sustituye por el plásmido de producción, que también contiene una copia funcional del gen pyrH. Esto se efectúa preferentemente del modo ya descrito.
En la producción de proteínas recombinantes se diferencia entre una producción citoplasmática y secretoria. Mientras que en la producción citoplasmática la proteína objetivo se acumula en el citoplasma de la célula, en la producción secretoria la proteína objetivo se transloca en el periplasma, o bien en el medio de cultivo. En el ámbito de la invención es preferente la producción secretoria. En especial es preferente la producción secretoria de la proteína objetivo en el medio de cultivo.
Para la producción secretoria de proteínas, es decir, para la translocación de la proteína del citoplasma en el periplasma, o bien el medio de cultivo, es necesario enlazar el extremo 5’ del gen de la proteína a producir en el marco con el extremo 3’ de una secuencia de señal para la exportación de proteína. A tal efecto, en principio son apropiados los genes de todas las secuencias de señal que conducen a una translocación de la proteína objetivo en el periplasma en E. coli. En E. coli son conocidas tres vías de translocación principales: la vía SEC, TAT y SRP. Son preferentes aquellas secuencias de señal que posibilitan una translocación a través del aparato SEC. En el estado de la técnica se describen diferentes secuencias de señal de tal naturaleza, por ejemplo, las secuencias de señal de los siguientes genes: phoA, ompA, pelB, ompF, ompT, lamB, malE, dsbA, proteína A de estafilococo, StII y otros (Choi and Lee, Appl. Microbiol. Biotechnol. 64 (2004), 625-635). Según la invención es preferente la secuencia de señal del gen phoA o del gen ompA de E. coli o la señal de secuencia para una ciclodextrina-glicosiltransferasa (CGTasa) de Klebsiella pneumoniae M5a1, o la secuencia derivada de esta secuencia de señal, que se da a conocer en el documento US2008076157.
El cultivo (la fermentación) de células que contienen un plásmido de producción se efectúa según procedimientos de fermentación habituales conocidos por el especialista en un biorreactor (fermentador) sin adición de antibióticos.
La invención se refiere también a un procedimiento para la producción de sustancias de bajo peso molecular o proteínas recombinantes por medio de una cepa de microorganismos, que está caracterizado por que se emplea una cepa de microorganismos según la invención y un medio de fermentación exento de antibiótico.
La fermentación tiene lugar en un biorreactor habitual, a modo de ejemplo un fermentador de columna de burbujas o un fermentador de levantamiento por aire. Es preferente un fermentador de caldera de agitación a escala técnica y, por lo tanto, con un tamaño de > 100 l.
En la fermentación se cultivan las células de la cepa según la invención en un medio líquido, controlándose de manera continua y dirigiéndose exactamente diferentes parámetros, como por ejemplo la alimentación de nutrientes, la presión parcial de oxígeno, el valor de pH y la temperatura de cultivo. El intervalo de tiempo de cultivo asciende preferentemente a 16-150 h, de modo especialmente preferente 24-72 h.
Como medios de fermentación entran en consideración todos los medios comunes conocidos por el especialista para el cultivo de microorganismos. No obstante, estos medios de fermentación están exentos de un antibiótico.
Se pueden emplear medios complejos o medios salinos mínimos, a los que se añade una proporción definida de componentes complejos, como por ejemplo peptona, triptona, extracto de levadura, melaza o Corn Steep Liquor. Preferentemente se emplea un medio con componentes de medio complejos.
Como fuente de carbono primaria para la fermentación se pueden emplear todos los azúcares, alcoholes sacáricos o ácidos orgánicos, o bien sus sales, utilizables por las células. En este caso se emplean preferentemente glucosa, lactosa o glicerina. Son especialmente preferentes glucosa y lactosa. También es posible una alimentación combinada de varias fuentes de carbono diferentes. En este caso, la fuente de carbono se puede disponer completamente en el medio de fermentación al comienzo de la fermentación o no se dispone nada o solo se dispone una parte de la fuente de carbono al comienzo, y se alimenta la fuente de carbono durante el transcurso de la fermentación. En este caso es especialmente preferente una forma de realización en la que se dispone una parte de la fuente de carbono y se alimenta una parte. De modo especialmente preferente, la fuente de carbono se dispone en una concentración de 10-30 g/l, se inicia la alimentación cuando la concentración ha descendido a menos de 5 g/l, y de este modo se configura que la concentración se mantenga por debajo de 5 g/l.
La presión parcial de oxígeno (pO2) en el cultivo se sitúa preferentemente entre 10 y 70 % de saturación. Es preferente una pO2 entre 20 y 60 %, de modo especialmente preferente, la pO2 se sitúa entre 45 y 55 % de saturación.
El valor de pH del cultivo se sitúa preferentemente entre pH 6 y pH 8. Es preferente un valor de pH entre 6,5 y 7,5, de modo especialmente preferente, el valor de pH del cultivo se sitúa entre 6,8 y 7,2.
La temperatura del cultivo se sitúa entre 15 y 45°C. Es preferente un intervalo de temperaturas entre 18 y 40°C, es especialmente preferente un intervalo de temperaturas entre 25 y 35°C, son muy especialmente preferentes 30°C.
En un enfoque preferente, en el caso de la fermentación se trata de una fermentación de alta densidad celular. Se debe entender por una fermentación de alta densidad celular una fermentación en cuyo transcurso se alcanzan pesos anhidros celulares de más de 50 g/l. Son especialmente preferentes pesos anhidros celulares de más de 70 g/l.
La Fig. 1 muestra un mapa de restricción y función del plásmido pKD46 del Ej. 2.
La Fig. 2 muestra un mapa de restricción y función del plásmido pAF-ts-pyrH producido en el Ej. 2.
La Fig. 3 muestra un mapa de restricción y función del plásmido pAF-ts-plsC producido en el Ej. 2.
La Fig. 4 muestra un mapa de restricción y función del plásmido pMT 1 empleado en el Ej. 5.
La Fig. 5 muestra un mapa de restricción y función del plásmido de expresión pcysEX-GAPDH-ORF306_tetR producido en el Ej.5.
La Fig. 6 muestra un mapa de restricción y función del plásmido de expresión pCGT_tetR producido en el Ej. 6. La Fig. 7 muestra un mapa de restricción y función del plásmido de expresión pFab-anti-lisozima_tetR producido en el Ej. 7.
La Fig.8 muestra un mapa de restricción y función del plásmido de expresión pcysEX-GAPDH-ORF306_pyrH1_tetR producido en el Ej.8.
La Fig. 9 muestra un mapa de restricción y función del plásmido de expresión pCGT_pyrH1_tetR producido en el Ej. 8.
La Fig. 10 muestra un mapa de restricción y función del plásmido de expresión pFab-anti-lisozima_pyrH1_tetR producido en el Ej. 8.
La Fig. 11 muestra un mapa de restricción y función del plásmido de expresión pcysEX-GAPDH-ORF306_plsC1_tetR producido en el Ej. 8.
La Fig. 12 muestra un mapa de restricción y función del plásmido de expresión pCGT_plsC1_tetR producido en el Ej. 8.
La Fig. 13 muestra un mapa de restricción y función del plásmido de expresión pFab-anti-lisozima_plsC1_tetR producido en el Ej. 8.
La Fig. 14 muestra un mapa de restricción y función del plásmido de producción según la invención pcysEX-GAPDH-ORF306_pyrH producido en el Ej. 9.
La Fig. 15 muestra un mapa de restricción y función del plásmido de producción según la invención pCGT_pyrH producido en el Ej. 9.
La Fig. 16 muestra un mapa de restricción y función del plásmido de producción según la invención pFab-antilisozima_pyrH producido en el Ej. 9.
La Fig. 17 muestra un mapa de restricción y función del plásmido de producción según la invención pcysEX-GAPDH-ORF306_plsC producido en el Ej. 9.
La Fig. 18 muestra un mapa de restricción y función del plásmido de producción según la invención pCGT_plsC producido en el Ej. 9.
La Fig. 19 muestra un mapa de restricción y función del plásmido de producción según la invención pFab-antilisozima_plsC producido en el Ej. 9.
Los siguientes ejemplos sirven para la explicación ulterior de la invención. Todos los procedimientos de biología molecular y microbiológicos empleados, como reacción en cadena de polimerasa (PCR), síntesis génica, aislamiento y purificación de ADN, modificación de ADN mediante enzimas de restricción, fragmento de Klenow y ligasa, transformación, transducción P1, etc., se realizaron del modo conocido por el especialista, descrito en la literatura o recomendado por los respectivos fabricantes. Los siguientes ejemplos, siempre que se refieran al gen plsC, no corresponden a la invención y sirven solo para la ilustración.
Ejemplo 1: amplificación del gen marcador (pyrH- o pIsC) con promotor propio
Se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 1,0 kg de tamaño, que codifica para el gen pyrH inclusive región de promotor nativa, con los cebadores pyrH-Ncol-fw (SEQ ID n°. 5) y pyrH-Ncol-rev (SEQ iD n°. 6). Como matriz para la reacción PCR sirvió ADN cromosómico de la cepa E. co liW3110 (ATCC 27325).
El fragmento de PRC de aproximadamente 1,0 kb de tamaño se purificó a través de una electroforesis en gel de agarosa y se aisló con el "QIAquick Gel Extraction Kit" (Qiagen GmbH, Hilden, D) según indicaciones del fabricante a partir del gel de agarosa. A continuación, se digirió y se almacenó a -20°C el fragmento de PCR purificado. Análogamente se codificó, se purificó, se digirió y se almacenó un fragmento de ADN de aproximadamente 1,0 kb de tamaño, que codifica para el gen pIsC inclusive región de promotor nativa. Para la amplificación se emplearon los cebadores plsC-Ncol-fw (SeQ ID n°. 7) y plsC-Ncol-rev (SEQ ID n°. 8).
Ejemplo 2: generación de los plásmidos pAF-ts-pyrH y pAF-ts-plsC con origen de replicación sensible a la temperatura
Como plásmido de partida para la construcción de los plásmidos pAF-ts-pyrH y pAF-ts-plsC con origen de replicación sensible a la temperatura se empleó el plásmido pKD46 (Datsenko und Wanner, 2000, P.N.A.S. 97: 6640-6645). En la Fig 1. se muestra un mapa de restricción y función del plásmido pKD46. En el punto de corte NcoI de pKD46 se clonaron los productos de PCR descritos en el Ejemplo 1 y digeridos con NcoI, que codifican para el gen pyrH o el gen plsC con promotor propio. Las preparaciones de ligación se transformaron en “células de E. coli DH5a™-T 1R" (Life Technologies GmbH), se multiplicaron en estas células y se verificó la secuencia de ADN de los plásmidos aislados por medio de secuenciación. Dos del total de los 4 posibles constructos que se generaron de este modo llevan las denominaciones pAF-ts-pyrH y pAF-ts-plsC (véase la Fig. 2 y 3).
Ejemplo 3: transformación de cepas de E. coli seleccionadas con pAF-ts-pyrH o pAF-ts-plsC
Los plásmidos pAF-ts-pyrH y pAF-ts-plsC con origen de replicación sensible a la temperatura descritos en el Ejemplo 2 se transformaron en ambas cepas de E. co liW3110 (ATCC 27325) y W3110lpp3 (descritas en el documento US2008076158 A1 como cepa "permeable") con el método de CaCl2 conocido por el especialista. La selección de las células transformadas se efectuó en placas de agar LB que contenían 100 mg/l de ampicilina. Las cepas generadas de este modo llevan las denominaciones W3110/pAF-ts-pyrH, W31101pp3/pAF-ts-pyrH, W3110/pAF-ts-plsC y W31101 pp3/pAF-ts-plsC.
Ejemplo 4: deleción del gen pyrH (desactivación de uridilatoquinasa), o bien del gen pISC (desactivación de 1-acilglicerol-3-fosfato O-aciltransferasa) en E. coli
A) Deleción del gen pyrH
El gen pyrH, que codifica en E. coli para la enzima uridilatoquinasa (PyrH), se eliminó según el “método A-Red“ desarrollado por Datsenko y Wanner en las cepas de E. coli W3110/pAF-ts-pyrH y W31101pp3/pAF-ts-pyrH (Datsenko y Wanner, 2000, P.N.A.S. 97: 6640-6645). Se amplificó un fragmento de ADN, que codifica para el gen marcador de resistencia a kanamicina (kanR) con los cebadores pyrH-fw (SEQ ID n°. 9) y pyrH-rev (SEQ ID n°. 10). El cebador pyrH-fw codifica para una secuencia constituida por 30 nucleótidos, que es homóloga al extremo 5’ del gen pyrH, y una secuencia que comprende 20 nucleótidos, que es complementaria a una secuencia de ADN que codifica uno de ambos sitios FRT (objetivo de reconocimiento FLP) en el plásmido pKD13 (Coli Genetic Stock Center (CGSC) n° 7633). El cebador pyrH-rev codifica para una secuencia constituida por 30 nucleótidos, que es homóloga al extremo 3’ del gen pyrH, y una secuencia que comprende 20 nucleótidos, que es complementaria a una secuencia de ADN, que codifica el segundo sitio FRT en el plásmido pKD13.
El producto de PCR amplificado se introdujo en las cepas de E. co liW3110/pAFts-pyrH y W3110lpp3/pAF-ts-pyrH (véase Ejemplo 3) por medio de electroporación. La selección en células con integración cromosómica del gen marcador de resistencia a kanamicina (kanR) se efectuó en placas de agar LB, que contenían 50 mg/l de kanamicina y 100 mg/l de ampicilina. La eliminación del gen marcador de resistencia a kanamicina introducido por vía cromosómica (kanR) se efectuó con la enzima FLP-recombinasa, que está codificada en el plásmido pCP20 (CGSC n° 7629). La selección en células que contenían pCP20 se efectuó en placas de agar LB que contenían 100 mg/l de ampicilina (selección en pAF-ts-pyrH) y 34 mg/l de cloranfenicol (selección en pCP20). Debido a un origen de replicación sensible a la temperatura (ori), el plásmido pCP20 se puede eliminar de nuevo una vez efectuada la transformación mediante cultivo de células de E. coli a temperatura no permisiva, es decir, elevada, por ejemplo, a 42°C.
Una primera selección sobre pérdida del plásmido pCP20 sensible a la temperatura en el caso de obtención simultánea del plásmido pAF-ts-pyrH sensible a la temperatura se efectuó en placas de agar LB que contenían 100 mg/l de ampicilina (selección sobre pAF-ts-pyrH). En el transcurso ulterior se examinaron los clones bacterianos resistentes a ampicilina seleccionados previamente sobre sensibilidad a kanamicina, es decir, la pérdida del gen marcador de kanamicina introducido por vía cromosómica, así como sobre sensibilidad a cloranfenicol, es decir, la pérdida del plásmido pCP20 sensible a la temperatura.
Solo clones sensibles a kanamicina, así como cloranfenicol, pero resistentes a ampicilina, se examinaron finalmente con los cebadores pyrH-check-for (SEQ ID n°. 11) y pyrH-check-rev (SEQ ID n°. 12) sobre la deleción cromosómica del gen pyrH. Como modelo para el examen de la deleción de pyrH cromosómica por medio de PCR sirvió ADN cromosómico de los clones resistentes a ampicilina, sensibles a cloranfenicol y kanamicina seleccionados.
Las cepas de E. coli resistentes a ampicilina generadas y examinadas de este modo, con deleción de pyrH cromosómica y expresión de pyrH codificada por plásmido, llevan las denominaciones W3110ApyrH/pAF-ts-pyrH y W3110lpp3ApyrH/pAF-ts-pyrH.
B) Deleción del gen plsC
Análogamente al gen pyrH se eliminó el gen plsC, que codifica en E. coli para la enzima 1-acilglicerol-3-fosfato-O-aciltransferasa (PlsC), en las cepas de E. co liW3110/pAF-ts-plsC y W31101pp3/pAF-ts-plsC (Datsenko y Wanner, 2000, P.N.A.S. 97: 6640-6645). Se amplificó un fragmento de ADN, que codifica para el gen marcador de resistencia a kanamicina (kanR), con los cebadores plsC-fw (SEQ ID n°. 13) y plsC-rev (SEQ ID n°. 14). El cebador plsC-fw codifica para una secuencia constituida por 30 nucleótidos que es homóloga al extremo 5’ del gen plsC y una secuencia que comprende 20 nucleótidos, que es complementaria a una secuencia de ADN, que codifica uno de ambos sitios FRT (objetivo de reconocimiento FLP) en el plásmido pKD13 (Coli Genetic Stock Center (CGSC) n° 7633). El cebador plsC codifica para una secuencia constituida por 30 nucleótidos, que es homóloga al extremo 3’ del gen plsC, y una secuencia que comprende 20 nucleótidos, que es complementaria a una secuencia de ADN, que codifica el segundo sitio FRT en el plásmido pKD13.
El producto de PCR amplificado se introdujo en las cepas de E. co liW3110/pAFts-plsC y W3110lpp3/pAF-ts-plsC (véase Ejemplo 3) por medio de electroporación. La eliminación del gen marcador de resistencia a kanamicina introducido por vía cromosómica (kanR) se efectuó de nuevo con la enzima FLP-recombinasa (codificada en el plásmido pCP20). También en este caso, la selección de las células contenidas en pCP20 se efectuó en placas de agar LB que contenían 100 mg/l de ampicilina (selección en pAF-ts-plsC) y 34 mg/l de cloranfenicol (selección en pCP20). Una primera selección sobre pérdida del plásmido pCP20 sensible a la temperatura, con obtención simultánea del plásmido pAF-ts-plsC sensible a la temperatura, se efectuó en placas de agar LB que contenían 100 mg/l de ampicilina (selección en pAF-ts-pIsC). En el transcurso ulterior se examinaron los clones bacterianos resistentes a ampicilina seleccionados previamente sobre sensibilidad a kanamicina, es decir, la pérdida del gen marcador de kanamicina introducido por vía cromosómica, así como sobre sensibilidad a cloranfenicol, es decir, la pérdida del plásmido pCP20 sensible a la temperatura. Estos clones se examinaron finalmente con los cebadores plsC-check-for (SEQ ID n°. 15) y plsC-check-rev (SEQ ID n°. 16) sobre la deleción cromosómica del gen pIsC. Como modelo para el examen de la deleción de pIsC cromosómica por medio de PCR sirvió ADN cromosómico de los clones resistentes a ampicilina, sensibles a cloranfenicol y kanamicina seleccionados.
Las cepas de E. coli resistentes a ampicilina generadas y examinadas de este modo, con deleción de pIsC cromosómica y expresión de pIsC codificada por plásmido, llevan las denominaciones W3110AplsC/pAF-ts-plsC y W3110lpp3AplsC/pAF-ts-plsC.
Ejemplo 5: generación de un plásmido de producción con gen de resistencia a antibióticos para la producción de cisteína
Como plásmidos de partida para la clonación y expresión de los genes cysEX (codifica para la variante resistente a retroalimentación de serina aciltransferasa; CysE) y orf306 (codifica para O-acetilserina / exportador de cisteína; EamA) sirvieron el plásmido base pMT1, así como el plásmido de producción pACYC184-LH-cysEX-orf306 descrito en el documento EP0885962B1.
Además del gen de resistencia a tetraciclina (tetR), pMT1 contiene aún el promotor tac, que se reprime mediante el producto génico Laclq, cuyo gen se presenta igualmente en el plásmido, y se puede activar mediante un inductor, como por ejemplo D-lactosa o isopropil-p-D-tiogalactopiranósido (IPTG).
En la Fig. 4 se muestra un mapa de restricción y función del plásmido pMT1. La secuencia del plásmido pMT1 se deposita en el protocolo de secuencia (SEQ ID n°. 17).
Para la generación de un nuevo plásmido de producción para la producción de cisteína a base de pMT1 se ligó un fragmento NcoI-BsaBI del plásmido pACYC184-LH-cysEX-orf306 (descrito en el documento EP0885962 B1), que codifica para los genes cysEX y orf306, con un fragmento NcoI-PvuII de 2458 bp de tamaño (codifica para ColE1-ori y resistencia a tetraciclina, tetR) del plásmido pMT1.
La preparación de ligación se transformó en "células de E. coli DH5a™-T 1R" (Life Technologies GmbH), se multiplicó en estas células, y la secuencia de ADN de los plásmidos aislados se verificó por medio de secuenciación. El plásmido de expresión resultante lleva la denominación pcysEX-GAPDH-ORF306_tetR (véase la Fig. 5).
Ejemplo 6: generación de un plásmido de producción con gen de resistencia a antibióticos para la producción de a-CGTase
Como plásmidos de partida para la clonación y la expresión del gen de ciclodextrina-glicosil-transferasa (CGTasa) de Klebsiella pneumoniae M5al (n° de banco génico M15264) sirvieron de nuevo el plásmido pMT1, así como el plásmido pCGT descrito en el documento US2008076158 A1. Para la generación de un nuevo plásmido de producción para la producción de CGTasa a base de pMT1 se ligó un fragmento MauBI-BsaI del plásmido pCGT, que codifica para el gen CGTase de Klebsiella pneumoniae M5a1, con un fragmento MauBI-BsaI de 4004 bp de tamaño del plásmido pMT1. Este fragmento del plásmido pMT1 de 4004 bp de tamaño codifica para el ColE1 -ori, el operador lac/tac y el gen de resistencia a tetraciclina (tetR).
La preparación de ligación se transformó en "células de E. coli DH5a™-T 1R" (Life Technologies GmbH), se multiplicó en estas células, y la secuencia de ADN de los plásmidos aislados se verificó por medio de secuenciación. El plásmido de expresión resultante lleva la denominación pCGT_tetR (véase la Fig. 6).
Ejemplo 7: generación de un plásmido de producción con gen de resistencia a antibióticos para la producción de Fab-anti-lisozima
Como plásmidos de partida para la clonación y la expresión de los genes del fragmento anti-lisozima-Fab sirvieron de nuevo el plásmido pMT1, así como el pFab-anti-lisozima descrito en el documento US20080076158 A1. Para la generación de un nuevo plásmido de producción para la producción del fragmento de anticuerpo Fab-anti-lisozima a base de pMT1 se ligó un fragmento MauBI-BsaI del plásmido Fab-anti-lisozima, que codifica para ambas cadenas, es decir, la cadena pesada (dominios Vh-Ch1) y la cadena ligera (dominios Vl-Cl) del fragmento anti-lisozima-Fab, con un fragmento MauBI-BsaI del plásmido pMT1 de 4004 bp de tamaño. Este fragmento del plásmido pMT1 de 4004 bp de tamaño codifica para el ColE1-ori, el operador lac/tac y el gen de resistencia a tetraciclina (tetR).
La preparación de ligación se transformó en "células de E. coli DH5a™-T 1R" (Life Technologies GmbH), se multiplicó en estas células, y la secuencia de ADN de los plásmidos aislados se verificó por medio de secuenciación. El plásmido de expresión resultante lleva la denominación pFab-anti-lisozima_tetR (véase la Fig. 7).
Ejemplo 8: generación de plásmidos de producción con los genes marcadores pyrHo pIsC como base para la elaboración de plásmidos de producción según la invención sin gen de resistencia a antibióticos
Como plásmidos de partida para la generación de plásmidos de producción con pyrH o pIsC como gen marcador sirvieron los plasmidos pcysEX-GAPDH-ORF306_tetR, pCGT_tetR y pFab-anti-lisozima_tetR descritos en los Ejemplos 5 a 7. Todos estos plásmidos poseen un único punto de corte de restricción Ncol (véase Figuras 5 a 7). Este punto de corte NcoI universal se utilizó para la clonación, o bien la integración de los genes pyrH o pIsC.
A tal efecto, los productos de PCR descritos en el Ejemplo 1 y cortados con la enzima de restricción NcoI se ligaron con los plásmidos pcysEX-GAPDH-ORF306_tetR, pCGT_tetR y pFab-anti-lisozima_tetR, despues de cortar estos asimismo con NcoI. Las preparaciones de ligación individuales se transformaron en "células de E. coli DH5a™-T1R" (Life Technologies GmbH), se multiplicaron en estas células y se verificó la secuencia de ADN de los plásmidos aislados por medio de secuenciación. Los constructos resultantes, según orientación del gen marcador empleado, llevan las siguientes denominaciones:
• pcysEX-GAPDH-ORF306_pyrH1_tetR (véase la Fig. 8) y pcysEX-GAPDH-ORF306_pyrH2_tetR
• pCGT_pyrH1_tetR (véase la Fig. 9) y pCGT_pyrH2_tetR
• pFab-anti-lisozima_pyrH1_tetR (véase la Fig. 10) y pFab-anti-lisozima_pyrH2_tetR
• pcysEX-GAPDH-ORF306_plsC1_tetR (véase la Fig. 11) und pcysEX-GAPDH-ORF306_plsC2_tetR
• pCGT_plsC1_tetR (véase la Fig. 12) y pCGT_plsC2_tetR
• pFab-anti-lisozima_plsC1_tetR (véase la Fig. 13) y pFab-anti-lisozima_plsC2_tetR
Para la eliminación final del gen tetR se trabajó ulteriormente con las variantes pcysEX-GAPDH-ORF306_pyrH1_tetR, pCGT_pyrH1_tetR, pFab-anti-lisozima_pyrH1_tetR, pcysEX-GAPDH-ORF306_plsC1_tetR, pCGT_plsC1_tetR y pFab-anti-lisozima_plsC1_tetR (véase la Fig. 8 a 13).
Ejemplo 9: eliminación del gen de resistencia a antibióticos tetR y transformación de los plásmidos de producción con pyrH, o bien pIsC, como gen marcador remanente en cepas de E. coli con deleción cromosómica de pyrH, o bien plsC
Como plásmidos de partida para la generación de plásmidos de producción sin el gen de resistencia a antibióticos tetR y con pyrH o plsC como gen marcador sirvierion los plásmidos pcysEX-GAPDH-ORF306_pyrH1_tetR, pCGT_pyrH1_tetR, pFab-anti-lisozima_pyrH1_tetR, pcysEX-GAPDH-ORF306_ plsC1_tetR, pCGT_plsC1_tetR y pFab-anti-lisozima_ plsC1_tetR descritos en el Ejemplo 8. La eliminación del gen de resistencia a antibióticos tetR de los plásmidos pFab-anti-lisozima_pyrH1_tetR y pFab-anti-lisozima_plsC1_tetR descritos en el Ejemplo 8 se efectuó a través de una digestión con la enzima de restricción ClaI y subsiguiente religación.
Para los plásmidos pcysEX-GAPDH-ORF306_pyrH1_tetR, o bien pcysEX-GAPDH-ORF306_plsC1_tetR, se procedió análogamente, excepto que el gen tetR se eliminó a través de una digestión parcial con ClaI, ya que en los genes estructurales cysEXy orf306 se encuentran otros dos puntos de corte ClaI (véase la Fig. 8 y 11).
En el caso de pCGT_plsC1_tetR, el gen tetR se eliminó a través de una digestión con las enzimas StuI (corta el extremo blunt) y FspI (corta el extremo blunt) del plásmido.
En el caso de pCGT_pyrH1_tetR, el gen tetR se eliminó asimismo a través de una digestión parcial con las enzimas StuI (corta el extremo blunt) y FspI (corta el extremo blunt), ya que en el gen pyrH se encuentra otro punto de corte Fspl (véase la Fig. 9).
Los respectivos fragmentos de vector lineales sin tetR se purificaron tras la digestión con enzimas de restricción a través de una electroforesis en gel de agarosa y se aislaron con el "QIAquick Gel Extraction Kit" (Qiagen GmbH, Hilden, D) según datos del fabricante a partir del gel de agarosa. A continuación se religó el respectivo fragmento de vector exento de tetR.
Las correspondientes preparaciones de ligación se transformaron con un método de CaCl2 modificado en las cepas W3110ApyrH/pAF-ts-pyrH, o bien W3110lpp3ApyrH/pAF-ts-pyrH o W3110ApyrH/pAF-ts-plsC, o bien W3110lpp3ApyrH/pAF-ts-plsC, descritas en el Ejemplo 4. Para la transformación, es decir, la introducción de los plásmidos de producción exentos de resistencia a antibióticos con pyrH o plsC como gen marcador en cepas de E. coli con correspondiente deleción cromosómica (pyrH o plsC) se procedió de la siguiente manera:
tras la adición de 5 a 20 gl de la respectiva preparación de ligación a 100 gl de células competentes con CaCl2 de las cepas W3110ApyrH/pAF-ts-pyrH y W3110lpp3ApyrH/pAF-ts-pyrH, o bien W3110AplsC/pAF-ts-plsC y W3110lpp3AplsC/pAF-ts-plsC, se incubaron las células en hielo durante 30 minutos más. Tras un choque térmico breve durante 45 segundos a 42°C se enfriaron las células 2 min en hielo. A continuación se añadieron 900 gl de medio LB a la preparación de transformación y se incubaron/regeneraron las células no como es habitual a 37°C, sino 30 a 90 min a 47°C hasta 55°C. La incubación ulterior a temperatura elevada no permisiva se efectuó entonces durante 15 a 24 h a 40-45°C sobre placas de agar LB o en medio LB líquido sin antibiótico (por ejemplo sin tetraciclina).
La fase de regeneración de 30 - 90 minutos a 47°C hasta 55°C, así como el cultivo durante 15 a 24 h a temperatura elevada, no permisiva, facilita la sustitución de plásmidos sensibles a la temperatura pAF-ts-pyrH, o bien pAF-ts-plsC, por el plásmido de producción final, exento de resistencia a antibióticos, con pyrH o plsü como nuevo gen marcador de selección.
Se obtuvieron los mejores resultados de transformación si las células transformadas se regeneraron 60 min a 52°C y a continuación se incubaron 20 h a 42°C en placas de agar LB. Una selección previa sobre pérdida del plásmido sensible a la temperatura pAF-ts-pyrH, o bien pAF-ts-plsC, con sustitución simultánea por el respectivo plásmido de producción que contiene pyrH o plsü sin gen de resistencia a tetraciclina tetR, se efectuó en primer lugar en placas de agar LB sin antibiótico.
A continuación se examinaron los clones bacterianos seleccionados previamente sobre sensibilidad a ampicilina, es decir, la pérdida del plásmido sensible a la temperatura pAF-ts-pyrH, o bien pAF-ts-plsC.
Los plásmidos de producción de clones sensibles a ampicilina que codifican pyrH o plsü se examinaron finalmente por medio de digestión con enzimas de restricción. En las Figuras 14 a 16 se representan mapas de restricción de los plásmidos de producción que codifican pyrH pcysEX-GAPDH-ORF306_pyrH, pCGT_pyrH y pFab-anti-lisozima_pyrH, respectivamente sin el gen de resistencia a antibióticos tetR. En las Figuras 17 a 19 se representan mapas de restricción de los plásmidos de producción que codifican plsü pcysEX-GAPDH-ORF306_plsC, pCGT_plsC y pFabanti-lisozima_plsC, respectivamente sin el gen de resistencia a antibióticos tetR.
Las cepas de E. coli exentas de resistencia a antibióticos generadas y examinadas de este modo, con plásmido de producción que codifica pyrH o plsü y deleción cromosómica de pyrH, o bien plsü, llevan las denominaciones:
W3110ApyrH/pcysEX-GAPDH-ORF306_pyrH
W3110lpp3ApyrH/pCGT_pyrH
W3110lpp3ApyrH/pFab-anti-lisozima_pyrH
W3110AplsC/pcysEX-GAPDH-ORF306_plSC
W3110lpp3AplsC/pCGT_plsC
W3110lpp3AplsC/pFab-anti-lisozima_plsC
Ejemplo 10: fermentación de cisteína
Cultivo previo 1:
Se inocularon 20 ml de medio LB en matraz Erlenmeyer (100 ml) con la respectiva cepa de E. co liW3110/pcysEX-GAPDH-ORF306_tetR, W3110ApyrH/pcysEX-GAPDH-ORF306_pyrH o W3110AplsC/pcysEX-GAPDH-ORF306_plsC y se incubaron durante siete horas en un agitador (150 rpm, 30°C). Para un cultivo de constructo W3110/pcysEX-GAPDH-ORF306_tetR en el sentido del estado de la técnica, es decir, con antibiótico como agente de selección, se suplementó el medio con 15 mg/L de tetraciclina.
Cultivo previo 2:
A continuación se trasladó el cultivo previo 1 completamente a 100 ml de medio SM1 (12 g/l de K2HPO4 , 3 g/l de KH2PO4, 5 g/l de (NH4)2SO4, 0,3 g/l de MgSO4 x 7 H2O, 0,015 g/l de CaCl2 x 2 H2O, 0,002 g/l de FeSO4 x 7 H2O, 1 g/l de Na3 citrato x 2 H2O, 0,1 g/l de NaCl, 1 ml/l de disolución de oligoelementos, constituida por 0,15 g/l de Na2MoO4 x 2 H2O, 2,5 g/l de H3BO3, 0,7 g/l de CoCl2 x 6 H2O, 0,25 g/l de CuSO4 x 5 H2O, 1,6 g/l de MnCl2 x 4 H2O, 0,3 g/l de ZnSO4 x 7 H2O), que estaba suplementada con 5 g/l de glucosa y 5 mg/l de vitamina B1. Los cultivos se agitaron en matraz Erlenmeyer (1 l) a 30 °C durante 17 h con 150 rpm. Tras esta incubación, la densidad óptica a 600 nm (OD600) se situaba entre 3 y 5. Para el cultivo de W3110/pcysEX-GAPDH-ORF306_tetR en el sentido del estado de la técnica, es decir, con antibiótico como medio de selección, se suplementó el medio con 15 mg/L de tetraciclina.
Cultivo principal:
La fermentación se realizó en termentadores de tipo BIOSTAT B de la firma Sartorius Stedim. Se empleó un recipiente de cultivo con 2 l de volumen total. El medio de fermentación (900 ml) contiene 15 g/l de glucosa, 10 g/l de triptona (Difco), 5 g/l de extracto de levadura (Difco), 5 g/l de (NH4)2SO4, 1,5 g/l de KH2PO4, 0,5 g/l de NaCl, 0,3 g/l de MgSO4 x 7 H2O, 0,015 g/l de CaCl2 x 2 H2O, 0,075 g/l de FeSO4 x 7 H2O, 1 g/l de Na3 citrato x 2 H2O y 1 ml de disolución de oligoelementos (véase anteriormente) y 0,005 g/l de vitamina B1. El valor de pH en el fermentador se ajustó a 6,5 al comienzo mediante bombeo de una disolución al 25 % de NH4OH. Durante la fermentación se mantuvo el valor de pH a un valor de 6,5 mediante corrección automática con NH4OH al 25 %. Para la inoculación se bombearon 100 ml de cultivo previo 2 al recipiente del fermentador. Por consiguiente, el volumen inicial ascendía aproximadamente a 1 l. Los cultivos se agitaron al comienzo con 400 rpm y se gasificaron con 2 vvm de un aire a presión purificado a través de un filtro estéril. Bajo estas condiciones iniciales, la sonda de oxígeno se había calibrado a 100 % de saturación antes de la inoculación. El valor teórico para la saturación de O2 durante la fermentación se ajustó a 50 %. Tras reducción de la saturación de O2 por debajo del valor teórico se inició una cascada de regulación para aproximar de nuevo la saturación de O2 al valor teórico. En este caso, en primer lugar se aumentó continuamente la alimentación de gas (a un máximo de 5 vvm), y a continuación se incrementó continuamente la velocidad de agitación (a un máximo de 1.500 rpm).
La fermentación se realizó a una temperatura de 30°C. Después de 2 h de tiempo de fermentación se efectuó la alimentación de una fuente de azufre en forma de una disolución madre estéril de tiosulfato sódico x 5 H2O al 60 % con una tasa de 1,5 ml por hora. Tan pronto como el contenido en glucosa en el fermentador había descendido de inicialmente 15 g/l a aproximadamente 2 g/l se efectuó una dosificación continua de una disolución de glucosa al 56 %. La tasa de alimentación se ajustó de modo que la concentración de glucosa en el fermentador ya no sobrepasaba 2 g/l en adelante.
La determinación de glucosa se realizó con un analizador de glucosa de la firma YSI (Yellow Springs, Ohio, USA). Para la fermentación del constructo W3110/pcysEX-GAPDH-ORF306_tetR en el sentido del estado de la técnica, es decir, con antibiótico como medio de selección, se suplementó el medio con 15 mg/L de tetraciclina.
El tiempo de fermentación ascendía a 48 horas. A continuación se extrajeron muestras y se determinó el contenido de L-cisteína y los derivados obtenidos de la misma en el sobrenadante de cultivo (sobre todo L-cisteína y tiazolidina) y en el precipitado (L-cistina) por separado respectivamente. Con este fin se empleó respectivamente el test colorimétrico de Gaitonde (Gaitonde, M. K. (1967), Biochem. J. 104, 627-633). La L-cistina que se encontraba en el precipitado se tuvo que disolver en primer lugar en ácido clorhídrico al 8 % antes de poderse cuantificar del mismo modo. Los valores para cisteína total indicados en la Tabla 1 corresponden a la suma de L-cisteína en el sobrenadante de cultivo y L-cistina en el precipitado. En este caso, a cada molécula de L-cistina corresponden dos moléculas de L-cisteína.
Tabla 1: contenido en cisteína total (L-cisteínasobrenadante de cultivo + L-cistinaprecipitado) en el caldo de cultivo después de 48 h y estabilidad de los plásmidos de producción
Figure imgf000014_0001
Ejemplo 11: producción secretoria de una ciclodextrina-glicosil-transferasa a escala de 101 (fermentación)
Con ayuda de un mutante Ipp de E. coli se pueden producir y secretar en el medio enzimas relevantes desde el punto de vista biotecnológico, como por ejemplo CGTasas (US2008076158 A1).
La producción secretoria de CGTasa se efectuó en fermentadores de caldera de agitación de 10 L con las cepas W3110lpp3/pCGT_tetR (control), W3110lpp3ApyrH/pCGT_pyrH y W3110lpp3ApyrH/pCGT_plsC. El fermentador cargado con 6 l de medio de fermentación Fm 4 (1,5 g/l de KH2PO4; 5 g/l de (NH4) 2SO4; 0, 5 g/l de MgSO4 x 7 H2O; 0,15 g/l de CaCl2 x 2 H2O, 0,075 g/l de FeSO4 x 7 H2O; 1 g/l de Na3 citrato x 2 H2O; 0,5 g/l de NaCl; 1 ml/1 de disolución de oligoelementos (0,15 g/l de Na2MoO4 x 2 H2O; 2,5 g/l de Na3BO3 ; 0,7 g/l de CoCl2 x 6 H2O; 0,25 g/l de CuSO4 x 5 H2O; 1,6 g/l de MnCÍ2 x 4 H2O; 0,3 g/l de ZnSÜ4 x 7 H2O); 5 mg/l de vitamina Bi ; 3 g/l de fitona; 1,5 g/l de extracto de levadura; 10 g/l de glucosa) se inoculó en proporción 1 : 10 con un cultivo previo, que se cultivó durante la noche en el mismo medio. Durante la fermentación se ajustó una temperatura de 30°C y se mantuvo constante el valor de pH a un valor de 7,0 mediante dosificación de NH4OH, o bien H3PO4. Se añadió glucosa durante la fermentación, pretendiéndose una concentración máxima de glucosa de < 10 g/l en el medio de fermentación. La inducción de la expresión se efectuó mediante adición de isopropil-p-D-tiogalactopiranósido (IPTG) hasta 0,1 mM al final de la fase de crecimiento logarítmica.
Para la fermentación del constructo W3110lpp3/pCGT_tetR en el sentido del estado de la técnica, es decir, con antibiótico como medio de selección, se suplementó el medio con 15 mg/L de tetraciclina.
Después de 72 h de fermentación se extrajeron muestras, se separaron las células mediante centrifugado del medio de fermentación y se determinó el contenido en CGTasa en el sobrenadante de fermentación, como se describe en el Ejemplo 4 del documento US2008076158A1.
En la Tabla 2 se enumeran los rendimientos de CGTasas funcionales, así como las actividades en el sobrenadante de fermentación.
Tabla 2: rendimientos de ciclodextrina-glicosiltransferasa en el sobrenadante
de fermentación después de 72 horas de fermentación
Figure imgf000015_0001
Ejemplo 12: producción secretoria, fermentativa, del fragmento de anticuerpo Fab anti-lisoxima-Fab a escala de 10 l
Con ayuda de un mutante Ipp de E. coli se pueden producir también extracelularmente fragmentos de anticuerpo Fab funcionales (US2008076158A1). En este caso, la célula debe sintetizar simultáneamente los correspondientes fragmentos de la cadena ligera que comprende los dominios Vl y Cl, y de la cadena pesada que comprende los dominios Vh y CH1, y después secretar estos en el periplasma, y finalmente en el medio de fermentación. Fuera del citoplasma se efectúa entonces el ensamblaje de ambas cadenas para dar el fragmento Fab funcional.
El presente ejemplo describe la producción de un fragmento Fab del anticuerpo de antilisozima D1.3 convenientemente caracterizado. Los plásmidos pFab-anti-lisozima_tetR, pFab-anti-lisozima_pyrH y pFab-anti-lisozima_plsC contienen, además de los genes marcadores tetR, pyrH, o bien pIsC, entre otros también los genes estructurales para e1HC y el LC del fragmento Fab en forma de un operón. En este caso, el HC en el marco está fusionado en el extremo 3‘ de la secuencia de señalización ompA (ompAss) y el LC en el marco en el extremo 3' de una secuencia de señalización de CGTasa (cgtss). La expresión del operón ompAss-HC-cgtss-LC está bajo el control del promotor tac.
La producción del fragmento anti-lisozima a escala de 10 l se efectuó análogamente al procedimiento de CGTasa descrito en el Ejemplo 11 con las cepas W3110lpp3/pFab-anti-lisozima_tetR, W3110lpp3ApyrH/pFab-antilisozima_pyrH y W3110lpp3AplsC/pFab-anti-lisozima_plsC. Para la fermentación de W3110lpp3/pFab-antilisozima_tetR de E. coli en el sentido del estado de la técnica, es decir, con antibiótico como medio de selección, se suplementó el medio con 15 mg/L de tetraciclina.
Después de 72 h de fermentación se extrajeron muestras y a continuación se separaron las células mediante centrifugado del medio de fermentación.
La purificación del fragmento anti-lisozima-Fab a partir de los sobrenadantes de fermentación se efectuó por medio de cromatografía de afinidad como se describe en Skerra (1994, Gene 141,79-84).
La cuantificación, así como la determinación de la actividad del fragmento anti-lisozima-Fab purificado se efectuó a través de un ensayo ELISA con lisozima como antígeno (Skerra, 1994, Gene 141,79-84).

Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES
    1 Cepa de microorganismos para la producción de sustancias o proteínas de bajo peso molecular que contienen en su genoma una mutación en un gen, que provoca una auxotrofía de la cepa, así como un plásmido de producción que codifica al menos una enzima para la producción de una sustancia de bajo peso molecular o al menos una proteína recombinante, así como una copia funcional del gen, cuya desactivación cromosómica provoca la auxotrofía, caracterizada por que, en el caso de la auxotrofía, se trata de una auxotrofía no alimentable y se trata del gen pyrH con la la SEQ ID n° 1 o de un gen homólogo a pyrH, debiéndose entender por una auxotrofía no alimentable el hecho de que la auxotrofía reduzca el crecimiento de células de microorganismo o provoque la muerte de células de microorganismo, y no sea suplementable mediante adición de productos previos, intermedios y/o finales específicos del metabolismo en el medio de crecimiento, y tratándose, en el caso de genes homólogos a pyrH, de genes que codifican para una proteína con actividad de PyrH y presentan una identidad de secuencia mayor que 30 % respecto a SEQ ID n°. 1.
  2. 2. - Cepa de microorganismos según la reivindicación 1, caracterizada por que la mutación del gen, que provoca la auxotrofía alimentable de la cepa, conduce a la desactivación de este gen.
  3. 3. - Cepa de microorganismos según una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada por que la mutación del gen que provoca la auxotrofía no alimentable de la cepa conduce a la desactivación de la actividad del producto génico codificado a través del gen.
  4. 4. - Procedimiento para la producción de una cepa según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que en una cepa de microorganismos, que posee el gen pyrH o un gen homólogo a pyrH, se introduce un plásmido sensible a la temperatura, que posee una copia funcional del gen pyrH o su gen homólogo, que se debe mutar o eliminar, a continuación se muta el genoma de la cepa de modo que la cepa en el gen pyrH o el gen homólogo a pyrH presenta una mutación que conduce a una auxotrofía no alimentable en la cepa, y en esta cepa se sustituye a continuación el plásmido sensible a la temperatura por un plásmido de producción a temperatura no permisiva, conteniendo el plásmido de producción al menos un gen que codifica una enzima para la producción de una sustancia de bajo peso molecular o al menos una proteína recombinante, así como una copia funcional del gen pyrH, tratándose, en el caso de genes homólogos a pyrH, de genes que codifican para una proteína con actividad de PyrH y presentan una identidad de secuencia mayor que 30 % respecto a SEQ ID n°. 1.
  5. 5. - Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado por que el plásmido sensible a la temperatura presenta un origen de replicación sensible a la temperatura.
  6. 6. - Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado por que las células, inmediatamente tras la transformación con el plásmido de producción, se exponen a un choque térmico a 47-55°C durante 30-90 min, y a continuación se efectúa la incubación ulterior a la temperatura no permisiva de 37-45°C.
  7. 7. - Procedimiento para la producción de sustancias o proteínas de bajo peso molecular por medio de una cepa de microorganismos en un medio de fermentación, que está caracterizado por que se emplea una cepa de microorganismos según una o varias de las reivindicaciones 1 a 3 y se utiliza un medio de fermentación exento de antibióticos.
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