JP5612778B2 - 結核菌群の免疫学的検出方法及び検出用キット - Google Patents
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Description
本発明は、結核菌群を含む生体試料に、所定の温度にて加熱処理を施し、菌体外に分泌させた結核菌群特異的分泌蛋白質を免疫学的に検出することにより、培養操作を行うことなく生体試料から直接に簡便かつ迅速に行えるようにした安全性の高い結核菌群の免疫学的検出方法及び検出用キットに関する。
現在、日本国内では年間数千人が、世界規模では年間数百万人が結核により死亡しているといわれており、重要度の高い感染症の1つである。日本国内においては、結核菌感染が疑われた場合、感染症法に基づき入院措置がとられ、医師は結核患者であると診断したときは直ちに届け出なければならず、迅速な対応が求められている。
ヒトに対し病原性を示す抗酸菌としては、結核菌群に属するマイコバクテリウムツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis、ヒト型菌）、マイコバクテリウムボビス（Mycobacterium bovis、ウシ型菌）、マイコバクテリウムミクロチ（Mycobacterium microti、ネズミ型菌）、マイコバクテリウムアフリカナム（Mycobacterium africanum、アフリカ型菌）が知られており、非結核性抗酸菌としてはマイコバクテリウムアビウム（Mycobacterium avium）、マイコバクテリウムカンサシ（Mycobacterium kansassi）、マイコバクテリウムマリナム（Mycobacterium marinum）等が知られている。
ヒトに感染する結核菌群は主にマイコバクテリウムツベルクローシスであり、稀にマイコバクテリウムボビスによる感染がある。近年、非結核性抗酸菌のうち、マイコバクテリウムアビウムによる感染が増加している。両者の臨床症状は類似しており、原因微生物の同定は治療方針を決める上でも重要である。
したがって、結核菌感染であるか、非結核性抗酸菌感染であるか、鑑別して検出することは、患者への負担を減らし、適切な治療を早期に施す上でも重要である。また別の側面によれば、公衆衛生上、第三者への二次感染を防ぐ目的からも鑑別検出は重要である。
従来より結核菌群の検出方法として培養による検出方法が行われている。培養法は被生体試料を液体培地もしくは固形培地のいずれかに接種し、生育した菌体を検出することにより行われている。前者は、被生体試料の培養期間は短縮されるが、作業時における二次感染の危険性が高く、高度に安全な施設および装置が必要とされる。後者では検出結果が判明するまでに２か月程度の長期間が必要とされている。結核菌群の培養は安全性の高い環境で、かつ、安全性の高い装置を使用し、二次感染を防止するため細心の注意を払い実施する必要がある。
生体試料を培養した後の培養物からの結核菌群の同定法としては、簡便な方法として培地中に分泌された結核菌群特異的蛋白質を免疫学的に測定することにより検出する方法が知られている。
特開平11-108931号公報では、結核症患者より採取された生体試料を固形培地もしくは液体培地に接種し、数日から数週間の培養の後、培地中に分泌された結核菌群に特異的な分泌蛋白質であるMPB64を免疫学的に検出することにより、結核菌群の存在を検出する方法が知られている。従来の方法と比較して、培養後速やかに結核菌群の同定検出が可能となり、作業時における二次感染の恐れも低減されるとしている。
しかしながら、この方法では生体試料中の結核菌群を培養し、その培養物を試料としているため、検出及び同定までにはほぼ培養日数と同程度の時間がかかり、多大な労力と費用がかかる。
なお、上記特開平11-108931号公報に記載されるように、MPB64はマイコバクテリウムボビスBCG （M.bovis BCG）が産生し、菌体外に分泌する結核菌群特異的分泌蛋白質であり、MPT64はマイコバクテリウムツベルクローシスが産生し、菌体外に分泌する結核菌群特異的分泌蛋白質であるが、MPB64とMPT64は同一の物質であることが知られている。
特開2002-62299号公報では、生体試料中の結核菌群を培養することなく、結核菌群特異的分泌蛋白質であるMPT64を免疫学的測定法により検出することができるとしている。本方法によれば、生体試料として喀痰等を処理することにより生体試料中に含まれるMPT64を検出することにより結核菌群の存在を検出する。
しかしながら、この方法では生体試料中に結核菌群が存在していたとしても、結核菌群がMPB64を菌体外に分泌し、かつ、生体試料中にMPB64が存在していなければ検出することはできない。また分泌されていたとしても、MPT64の存在量が少ない場合には、多量の生体試料を必要としかつ操作も煩雑となり、被験者及び検査を実施する者の負担が増大する。また同時に結核菌群感染を見逃す恐れも生じ、公衆衛生上問題である。
国際公開第2009/084481号では、生体試料中のMPB64をMPB64の特定のエピトープに対する抗体を用いて特異的に検出することにより、結核菌による感染の診断を従来よりも高い精度で迅速かつ安全に行う方法が開示されている。本方法によれば、適用する試料として、少量の液体培地を用いて生体試料を結核菌群菌体が実質的に増殖するに至らない時間だけ培養した培養物を適用できるとしている。
しかしながら、この方法においても、培地中により多くのMPB64を蓄積させるために、増殖前の菌体からMPB64の分泌を促進させる方法が望まれる。
上記のように従来の方法では、結核菌群の検出に長時間を要し、また多大な労力と費用を必要とするため、結核の確定診断および早期の治療開始を行うことができず、さらに迅速な方法が望まれていた。また生体試料からの直接検出においても、生体試料中にMPT64が存在していない、もしくは非常に少ない場合には検出することができず、結果的に結核菌群感染を見逃す恐れがあり、より確実な検出法が必要とされている。本発明は、簡便かつ迅速で、より確実性の高い結核菌群検出法を提供するにより、前記課題を解決することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、結核菌群を含む生体試料に加熱処理を施すことにより、菌体外にMPB64等の結核菌群特異的分泌蛋白質が分泌され、この分泌された蛋白質を検出することにより、上記課題が解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明の一局面によれば、結核菌群を含む生体試料に加熱処理を施すことにより菌体外に分泌させた結核菌群特異的蛋白質を免疫学的測定に供することからなる結核菌群検出方法が提供される。また、本発明の他の局面によれば、前記方法を実施する結核菌群検出用キットとして、結核菌群を含む生体試料を加熱処理する処理容器と、該加熱処理により分泌させた結核菌群特異的分泌蛋白質を検出するための免疫学的測定装置とを少なくとも含んでなる、結核菌群検出用キットが提供される。該キットは、さらに試料処理剤及び／又は溶媒を含んでもよい。本発明の検出法及びキットによれば、迅速かつ簡便に結核菌群の検出ができる。また、本発明のさらに別の局面によれば、結核菌群を含む生体試料に加熱処理を施すことを含む、結核菌群特異的蛋白質を菌体外へ分泌させる方法が提供される。
本発明に用いる生体試料としては、結核菌群が存在し得るものであれば、特に制限は無いが、例えば、喀痰、胸水、気管支分泌液、胃液、血液、髄液、尿、便などが挙げられ、好ましくは菌濃度が高いことから喀痰が用いられる。また、呼吸器における検査を行った際に採取した気管支洗浄液、気管支または肺から採取された組織片なども生体試料として使用できる。これらの生体試料は、１種単独で用いても、２種以上混合して用いても良い。
生体試料の加熱処理は、感染性の高い結核菌群を含む生体試料を処理することから、生体試料は密封できる容器内に入れ、容器全体を加熱処理して行うことが好ましい。さらに、作業者の安全を確保する観点から、加熱処理の操作は安全キャビネット内で行うことが好ましい。加熱処理に用いる容器は、密封した状態を保つことができ、所定の加熱温度に耐えることができれば特に制限は無く、処理する生体試料に応じて適宜選択することができる。また、処理後の生体試料を、免疫学的測定に供する際に容器内から容易に排出できるように、容器開口部にフィルター付き滴下ノズルを装着してもよい。フィルター付き滴下ノズルを用いることにより、処理後の生体試料中に含まれる変性成分等の固形物を除去し、更には生体試料を簡便に免疫学的測定装置に滴下することができるため好ましい。
生体試料はその性状に応じ、試料処理剤により溶解させる等の処理を施した上で加熱処理に供しても良い。例えば、喀痰を試料とした場合は、加熱処理の効率を向上させるために喀痰の粘性を低下させるアルカリ性物質、還元性物質、プロテアーゼ、糖、界面活性剤、蛋白質変性剤等により溶解処理することも可能である。特にアルカリ性物質の水酸化ナトリウムと還元性物質のN-アセチル-L-システインを併用した処理が簡便であり好適に用いられる。
また別の態様によれば、生体試料は溶媒に分散もしくは溶解させ加熱処理に供することもできる。例えば、溶媒としては、生体試料中の結核菌群を生存させたまま保持できるものであれば足り、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液やミドルブルック7H9などの抗酸菌分離培養に用いられる液体培地を用いることができる。特に加熱処理時に結核菌群の活性を損なうことなく菌体外に蛋白質を分泌させる必要があること、また処理後の試料をそのまま免疫学的測定に供することができることから、液体培地が好適に用いられる。また、前記試料処理剤により溶解させた生体試料を溶媒に再分散させても良い。
生体試料の加熱温度は、生体試料もしくは溶媒中に結核菌群から菌体外に蛋白質を分泌させることができる温度であれば良く、好ましくは40℃〜60℃の範囲、より好ましくは40℃〜55℃の範囲である。特に効果的に分泌が促進される温度は45℃〜50℃の範囲である。
生体試料の処理時間は、前記処理温度にて保持し、菌体外に結核菌群特異的分泌蛋白質を検出可能な量だけ分泌させるのに十分な時間であれば良い。処理時間は、好ましくは15分以上、より好ましくは15分以上2.5時間以下、さらにより好ましくは15分以上1.5時間以下であり、最も好適には30分以上1時間以下である。
加熱処理を施した試料には、そのまま加熱温度を上げることにより、結核菌群の不活化処理を施しても良い。結核菌群を不活化する温度に制限は無いが、100℃にて処理することが好ましい。試料中に含まれる結核菌群を不活化することにより、二次感染の恐れなく安全に免疫学的測定を実施することが可能となる。
加熱処理に用いる加熱装置としては、前述の温度を一定に保つことが出来る機器であれば特に制限は無く、恒温槽、ヒーターブロック、インキュベーター等が使用できる。小型の加熱装置であれば、安全キャビネット内で全ての結核菌検出操作を完了させることができるため、特に好ましい。
本発明によれば、生体試料に加熱処理を施し結核菌群特異的蛋白質を菌体外に分泌させることが可能となるので、処理後の生体試料を用いることにより、結核菌群の存在を免疫学的測定等により検出することが容易になる。
本発明において菌体外に分泌される結核菌群特異的蛋白質は菌体外に分泌されるものであれば特に制限は無い。結核菌群が菌体外に分泌する蛋白質としては、例えば、MPT64、MPB64、MPB70、ESAT-6、CFP-10等多くの蛋白質が挙げられる。これらの蛋白質のうち、本発明で用いる免疫学的測定において結核菌群の存在を示す指標として用いられる蛋白質として好適なものは、菌体外に大量かつ短時間に分泌される蛋白質である。例えば、MPB64即ちMPT64は、本発明における生体試料の加熱処理を受けた場合、培養をせずとも、すなわち、菌体が増殖する以前に菌体外に大量に分泌もしくは放出される。かかる観点から、結核菌群の存在を検出する対象としてMPB64即ちMPT64を用いることが好ましい。菌体外に分泌されたMPB64即ちMPT64を免疫学的に測定することにより結核菌群の存否が判定できる。
この検出法における免疫学的測定としては、特に限定されるものではないが、結核菌群特異的分泌蛋白質に対する第一の抗体と第二の抗体とを用いたサンドイッチ式免疫測定、とりわけELISA（Enzyme-linked Immunosorbent assay）もしくはイムノクロマトグラフィー測定が好ましい。上記第一の抗体及び第二の抗体は、結核菌群特異的分泌蛋白質を検出可能であれば、同一の抗体であっても、異なる抗体であってもよい。
この免疫学的測定としては、生体試料の加熱処理により菌体外に分泌されたMPB64を免疫学的に検出することができるものであれば良く、イムノクロマトグラフィー測定法が好ましく、抗MPB64モノクローナル抗体を用いたイムノクロマトグラフィー測定法が特に好ましい。MPB64検出用イムノクロマトグラフィー測定法は、特開平11-108931号公報記載の方法に準拠して容易に実施できる。さらには、MPB64即ちMPT64検出用の市販のイムノクロマトグラフィー測定装置であるキャピリア（登録商標）TB（タウンズ社製）が使用できる。
下記の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
参考例１ （供試菌液の調製）
ミドルブルック7H9ブロスベース（Difco社製） 4.7gをTween80 0.5gを含む蒸留水900mlに溶解させた。オートクレーブにて121℃、10分間高圧滅菌した。冷却後、ADC Enrichment（albumin-dextrose-catalase）100mlを無菌的に加え、ミドルブルック7H9液体培地を調製した。
M.bovis BCG Tokyo株（以下、BCG株と称する）を上記にて作製した液体培地に接種し、定法により培養を実施した。マクファーランドNo.1相当の濁度が得られるまで培養を実施した。得られた菌液を遠心分離し、菌体を回収した。回収した菌体に対し、前述のミドルブルック7H9液体培地を加え、再懸濁させた後、更に遠心分離にて菌体を回収した。本操作を3回繰り返し、菌体を洗浄し菌体に付着した結核菌群分泌蛋白質を除去した。洗浄操作を行った後の上清100μLをMPB64検出用イムノクロマトグラフィー測定装置であるキャピリア（登録商標）TB（タウンズ社製）に供した結果、本品は陰性を示し上清中には分泌されたMPB64が存在しないことを確認した。
ミドルブルック7H9ブロスベース（Difco社製） 4.7gをTween80 0.5gを含む蒸留水900mlに溶解させた。オートクレーブにて121℃、10分間高圧滅菌した。冷却後、ADC Enrichment（albumin-dextrose-catalase）100mlを無菌的に加え、ミドルブルック7H9液体培地を調製した。
M.bovis BCG Tokyo株（以下、BCG株と称する）を上記にて作製した液体培地に接種し、定法により培養を実施した。マクファーランドNo.1相当の濁度が得られるまで培養を実施した。得られた菌液を遠心分離し、菌体を回収した。回収した菌体に対し、前述のミドルブルック7H9液体培地を加え、再懸濁させた後、更に遠心分離にて菌体を回収した。本操作を3回繰り返し、菌体を洗浄し菌体に付着した結核菌群分泌蛋白質を除去した。洗浄操作を行った後の上清100μLをMPB64検出用イムノクロマトグラフィー測定装置であるキャピリア（登録商標）TB（タウンズ社製）に供した結果、本品は陰性を示し上清中には分泌されたMPB64が存在しないことを確認した。
実施例１ （加熱処理温度の至適条件の検討）
参考例1にて調製したマクファーランドNo.1相当の濁度の菌液を、吸光度530nmにて、O.D.0.1に調製し、試験用菌液（菌数として10の7乗個相当）を調製した。更に試験用菌液を液体培地にて希釈し、10倍希釈菌液（菌数として10の6乗個相当）および100倍希釈菌液（菌数として10の5乗個相当）を調製した。それぞれの調製菌液を、200μlずつプラスチック製チューブ（核酸増幅用チューブ）に分注し、温度調節が可能な核酸増幅装置用ヒートブロックにて加熱処理を実施した。加熱温度として、35℃から75℃まで5℃間隔の温度を設定し30分間の加熱処理を実施した。一般的な培養温度である35℃における試料を対照とした。処理後、各試料から100μlを採取し、参考例1と同様にキャピリア（登録商標）TB（タウンズ社製）に供し、MPB64の存在を検出した。判定部の吸光度をイムノクロマトリーダー（大塚電子製）にて測定した。
参考例1にて調製したマクファーランドNo.1相当の濁度の菌液を、吸光度530nmにて、O.D.0.1に調製し、試験用菌液（菌数として10の7乗個相当）を調製した。更に試験用菌液を液体培地にて希釈し、10倍希釈菌液（菌数として10の6乗個相当）および100倍希釈菌液（菌数として10の5乗個相当）を調製した。それぞれの調製菌液を、200μlずつプラスチック製チューブ（核酸増幅用チューブ）に分注し、温度調節が可能な核酸増幅装置用ヒートブロックにて加熱処理を実施した。加熱温度として、35℃から75℃まで5℃間隔の温度を設定し30分間の加熱処理を実施した。一般的な培養温度である35℃における試料を対照とした。処理後、各試料から100μlを採取し、参考例1と同様にキャピリア（登録商標）TB（タウンズ社製）に供し、MPB64の存在を検出した。判定部の吸光度をイムノクロマトリーダー（大塚電子製）にて測定した。
この結果を図1に示す。図1の縦軸はキャピリア（登録商標）TB（タウンズ社製）における呈色強度（吸光度）の測定値を示し、横軸は加熱温度を示す。吸光度と処理温度の関係において、試験用菌液（菌数として10の7乗個相当）の結果を実線で、10倍希釈菌液（菌数として10の6乗個相当）および100倍希釈菌液（菌数として10の5乗個相当）の結果を破線および長破線でそれぞれ示した。
この結果より、供試した試料全てにおいて、40℃から60℃において吸光度が上昇する結果となり、特に45℃から50℃において顕著な上昇が確認された。このことは菌体に対し加熱処理を施すことにより、菌体外にMPB64の分泌が促された結果を示している。対照となる一般的な培養条件である35℃において吸光度の上昇が見られないことから、室温もしくは同等の条件下にて保持しただけでは、何ら菌体外にMPB64が分泌されないことが明らかとなった。一方、MPB64の分泌が確認された40℃から60℃の温度域よりも高温域では吸光度の上昇は確認されなかった。したがって60℃以上の温度域においてはMPB64の分泌が行われないことが示された。
よって、この結果より、菌体試料に対して40℃から60℃の加熱処理、特に45℃から50℃の加熱処理を施すことにより、菌体外にMPB64の分泌が顕著に促され、免疫学的測定法での検出率が顕著に上昇することが確認された。
この結果より、供試した試料全てにおいて、40℃から60℃において吸光度が上昇する結果となり、特に45℃から50℃において顕著な上昇が確認された。このことは菌体に対し加熱処理を施すことにより、菌体外にMPB64の分泌が促された結果を示している。対照となる一般的な培養条件である35℃において吸光度の上昇が見られないことから、室温もしくは同等の条件下にて保持しただけでは、何ら菌体外にMPB64が分泌されないことが明らかとなった。一方、MPB64の分泌が確認された40℃から60℃の温度域よりも高温域では吸光度の上昇は確認されなかった。したがって60℃以上の温度域においてはMPB64の分泌が行われないことが示された。
よって、この結果より、菌体試料に対して40℃から60℃の加熱処理、特に45℃から50℃の加熱処理を施すことにより、菌体外にMPB64の分泌が顕著に促され、免疫学的測定法での検出率が顕著に上昇することが確認された。
実施例２ （加熱処理温度の至適条件の検討）
参考例1にて調製したマクファーランドNo.1相当の濁度の菌液を、吸光度530nmにて、O.D.0.1に調製し、試験用菌液（菌数として10の7乗個相当）を調製した。調製菌液を、200μlずつプラスチック製チューブ（核酸増幅用チューブ）に分注し、温度調節が可能な核酸増幅装置用ヒートブロックにて加熱処理を実施した。加熱温度は35℃、40℃から64℃まで2℃間隔の１３点の温度、高温域として70℃および80℃の２点の温度を設定し、60分間の加熱処理を実施した。一般的な培養温度である35℃における試料を対照とした。処理後、各試料から100μlを採取し、参考例1と同様にキャピリア（登録商標）TB（タウンズ社製）に供し、MPB64の存在を検出した。判定は判定部に集積した標識物質の呈色強度を肉眼で観察して行った。呈色強度は赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、±（微弱な着色）、＋（明確な着色）、＋＋（より明確な着色）、＋＋＋（顕著な着色）の５段階に区分して判定した。判定結果を表１に示した。
参考例1にて調製したマクファーランドNo.1相当の濁度の菌液を、吸光度530nmにて、O.D.0.1に調製し、試験用菌液（菌数として10の7乗個相当）を調製した。調製菌液を、200μlずつプラスチック製チューブ（核酸増幅用チューブ）に分注し、温度調節が可能な核酸増幅装置用ヒートブロックにて加熱処理を実施した。加熱温度は35℃、40℃から64℃まで2℃間隔の１３点の温度、高温域として70℃および80℃の２点の温度を設定し、60分間の加熱処理を実施した。一般的な培養温度である35℃における試料を対照とした。処理後、各試料から100μlを採取し、参考例1と同様にキャピリア（登録商標）TB（タウンズ社製）に供し、MPB64の存在を検出した。判定は判定部に集積した標識物質の呈色強度を肉眼で観察して行った。呈色強度は赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、±（微弱な着色）、＋（明確な着色）、＋＋（より明確な着色）、＋＋＋（顕著な着色）の５段階に区分して判定した。判定結果を表１に示した。
表１の結果より40℃から60℃において呈色強度が上昇する結果となり、特に44℃から52℃において顕著な上昇が確認された。このことは実施例1と同様に菌体に対し加熱処理を施すことにより、菌体外にMPB64の分泌が促された結果を示している。対照となる一般的な培養条件である35℃において吸光度の上昇が見られないことから、室温もしくは同等の条件下にて保持しただけでは、何ら菌体外にMPB64が分泌されないことが明らかとなった。一方、62℃以上の温度、70℃および80℃の高温域では吸光度の上昇は確認されなかった。したがって60℃以上の温度域においてはMPB64の分泌が行われないことが示された。
よって、この結果より、菌体試料に対して40℃から60℃の加熱処理、特に45℃から50℃の加熱処理を施すことにより、菌体外にMPB64の分泌が顕著に促され、免疫学的測定法での検出率が顕著に上昇することが確認された。
よって、この結果より、菌体試料に対して40℃から60℃の加熱処理、特に45℃から50℃の加熱処理を施すことにより、菌体外にMPB64の分泌が顕著に促され、免疫学的測定法での検出率が顕著に上昇することが確認された。
実施例３ （加熱処理時間の至適条件の検討）
参考例1にて調製したマクファーランドNo.1相当の濁度の菌液を、吸光度530nmにて、O.D.0.1に調製し、試験用菌液（菌数として10の7乗個相当）を調製した。調製菌液を、200μlずつプラスチック製チューブに分注し、温度調節が可能な核酸増幅装置用ヒートブロックにて加熱処理を実施した。加熱温度として、35℃から75℃まで5℃間隔にて加熱操作を実施した。処理時間として、0分、15分、30分及び60分を設定し処理を実施した。処理後、各試料から100μlを採取し、実施例1と同様にキャピリア（登録商標）TB（タウンズ社製）に供し、判定部の吸光度をイムノクロマトリーダー（大塚電子製）にて測定した。
参考例1にて調製したマクファーランドNo.1相当の濁度の菌液を、吸光度530nmにて、O.D.0.1に調製し、試験用菌液（菌数として10の7乗個相当）を調製した。調製菌液を、200μlずつプラスチック製チューブに分注し、温度調節が可能な核酸増幅装置用ヒートブロックにて加熱処理を実施した。加熱温度として、35℃から75℃まで5℃間隔にて加熱操作を実施した。処理時間として、0分、15分、30分及び60分を設定し処理を実施した。処理後、各試料から100μlを採取し、実施例1と同様にキャピリア（登録商標）TB（タウンズ社製）に供し、判定部の吸光度をイムノクロマトリーダー（大塚電子製）にて測定した。
この結果を図2に示す。図2の縦軸はキャピリア（登録商標）TB（タウンズ社製）における呈色強度（吸光度）の測定値を示し、横軸は加熱温度を示す。吸光度と処理温度の関係において、処理時間15分の試料を破線で、処理時間30分の試料および60分の試料を実線および長破線で示した。
この結果より、処理時間15分、30分および60分の全ての試料において、45℃から50℃において顕著な上昇が確認され、処理時間における差は見られなかった。60分の加熱時間においても他の試料との間には顕著な差は確認されなかった。よって、少なくとも15分の加熱処理時間により菌体外へMPB64の分泌が促進する効果が確認された。
この結果より、処理時間15分、30分および60分の全ての試料において、45℃から50℃において顕著な上昇が確認され、処理時間における差は見られなかった。60分の加熱時間においても他の試料との間には顕著な差は確認されなかった。よって、少なくとも15分の加熱処理時間により菌体外へMPB64の分泌が促進する効果が確認された。
実施例４ （加熱処理時間の至適条件の検討）
参考例1にて調製したマクファーランドNo.1相当の濁度の菌液を、吸光度530nmにて、O.D.0.01に調製し、試験用菌液（菌数として10の6乗個相当）を調製した。調製菌液を200μlずつプラスチック製チューブに分注し、温度調節が可能な核酸増幅装置用ヒートブロックを用い、50℃にて加熱処理を実施した。処理時間として、0分、15分、30分、45分、60分、75分、120分および150分を設定し処理を実施した。対照として同供試菌液を室温にて加熱処理を施すことなく放置した。処理後、各試料から100μlを採取し、実施例1と同様にキャピリア（登録商標）TB（タウンズ社製）に供し、集積した標識物質の呈色強度を肉眼で観察した。呈色強度は赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、±（微弱な着色）、＋（明確な着色）、＋＋（より明確な着色）、＋＋＋（顕著な着色）の５段階に区分して判定した。判定結果を表２に示した。
参考例1にて調製したマクファーランドNo.1相当の濁度の菌液を、吸光度530nmにて、O.D.0.01に調製し、試験用菌液（菌数として10の6乗個相当）を調製した。調製菌液を200μlずつプラスチック製チューブに分注し、温度調節が可能な核酸増幅装置用ヒートブロックを用い、50℃にて加熱処理を実施した。処理時間として、0分、15分、30分、45分、60分、75分、120分および150分を設定し処理を実施した。対照として同供試菌液を室温にて加熱処理を施すことなく放置した。処理後、各試料から100μlを採取し、実施例1と同様にキャピリア（登録商標）TB（タウンズ社製）に供し、集積した標識物質の呈色強度を肉眼で観察した。呈色強度は赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、±（微弱な着色）、＋（明確な着色）、＋＋（より明確な着色）、＋＋＋（顕著な着色）の５段階に区分して判定した。判定結果を表２に示した。
表２の結果より、加熱処理を施していない対照試料および加熱時間0分の試料では判定部における呈色は確認されなかった。15分の加熱処理により菌体外へのMPB64の分泌による呈色が確認され、60分の加熱処理試料では顕著な呈色が確認された。更に150分まで加熱処理を施したが呈色強度の上昇は確認されず、60分の加熱処理試料と同等の顕著な呈色が確認された。以上の結果より少なくとも15分の加熱処理により菌体外へのMPB64の分泌促進効果が確認され、60分で最大となることが確認された。
実施例５ （溶媒の検討）
生体試料を処理する溶媒としてTween80を含むリン酸緩衝液又はミドルブルック7H9液体培地を用い、参考例1にて調製したマクファーランドNo.1相当の濁度の菌液を、菌数として10の7乗個相当、10の6乗個相当および10の5乗個相当を含む菌液に調製し、被験試料とした。それぞれの被験試料をプラスチック製チューブに200μl分注した。その後ヒートブロックにて、50℃、30分間の加熱処理を施した後、当該試料から100μlを採取し、実施例1と同様にキャピリア（登録商標）TB（タウンズ社製）に供し判定した。判定は判定部に集積した標識物質の呈色強度を肉眼で観察して行った。呈色強度は赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、±（微弱な着色）、＋（明確な着色）、＋＋（より明確な着色）、＋＋＋（顕著な着色）の５段階に区分して判定した。判定結果を表３に示した。
生体試料を処理する溶媒としてTween80を含むリン酸緩衝液又はミドルブルック7H9液体培地を用い、参考例1にて調製したマクファーランドNo.1相当の濁度の菌液を、菌数として10の7乗個相当、10の6乗個相当および10の5乗個相当を含む菌液に調製し、被験試料とした。それぞれの被験試料をプラスチック製チューブに200μl分注した。その後ヒートブロックにて、50℃、30分間の加熱処理を施した後、当該試料から100μlを採取し、実施例1と同様にキャピリア（登録商標）TB（タウンズ社製）に供し判定した。判定は判定部に集積した標識物質の呈色強度を肉眼で観察して行った。呈色強度は赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、±（微弱な着色）、＋（明確な着色）、＋＋（より明確な着色）、＋＋＋（顕著な着色）の５段階に区分して判定した。判定結果を表３に示した。
表３の結果より、溶媒としてTween80含有リン酸緩衝液およびミドルブルック7H9液体培地の何れを用いた場合であっても、菌体外に分泌されたMPB64を検出することが可能であることがわかる。したがって、溶媒の組成の違いによる免疫学的測定における差は確認されなかった。
実施例６ （喀痰試料からの検出）
参考例1にて調製したマクファーランドNo.1相当の濁度の菌液を、結核菌感染陰性が確認されている喀痰に添加し、菌数として10の7乗個相当を含む疑似陽性喀痰試料を調製し、プラスチック製チューブに分注した。この喀痰試料に対し、N-アセチル-L-システインと水酸化ナトリウム水溶液を等量加え、室温にて15分間静置し溶解させた。その後ヒートブロックにて、50℃、30分間の加熱処理を施した後、当該試料から100μlを採取し、実施例1と同様にキャピリア（登録商標）TB（タウンズ社製）に供し判定した。対照として同様に処理した喀痰試料を加熱処理することなく30分間室温にて静置し判定に供した。判定は判定部に集積した標識物質の呈色強度を肉眼で観察して行った。呈色強度は赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、±（微弱な着色）、＋（明確な着色）、＋＋（より明確な着色）、＋＋＋（顕著な着色）の５段階に区分して判定した。判定結果を表４に示した。
参考例1にて調製したマクファーランドNo.1相当の濁度の菌液を、結核菌感染陰性が確認されている喀痰に添加し、菌数として10の7乗個相当を含む疑似陽性喀痰試料を調製し、プラスチック製チューブに分注した。この喀痰試料に対し、N-アセチル-L-システインと水酸化ナトリウム水溶液を等量加え、室温にて15分間静置し溶解させた。その後ヒートブロックにて、50℃、30分間の加熱処理を施した後、当該試料から100μlを採取し、実施例1と同様にキャピリア（登録商標）TB（タウンズ社製）に供し判定した。対照として同様に処理した喀痰試料を加熱処理することなく30分間室温にて静置し判定に供した。判定は判定部に集積した標識物質の呈色強度を肉眼で観察して行った。呈色強度は赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、±（微弱な着色）、＋（明確な着色）、＋＋（より明確な着色）、＋＋＋（顕著な着色）の５段階に区分して判定した。判定結果を表４に示した。
その結果、加熱処理を施した試料においては明らかな判定部の呈色が確認され、試料中のMPB64の存在が確認された。一方、対照試料においては一部の試料において、わずかな判定部の呈色が見られたが、加熱処理を施した試料との差は明白であった。よって、喀痰試料中においても加熱処理を施すことでMPB64の分泌が促されることが確認され、生体試料から迅速かつ簡便に結核菌群の検出ができることが示された。
本発明は、結核菌群を含む生体試料を、所定の温度にて加熱処理を施し、菌体外に分泌させた結核菌群特異的分泌蛋白質を免疫学的測定することにより、培養操作を行うことなく生体試料から直接に簡便かつ迅速に行うことが出来る結核菌群検出方法及びキットを提供するものであり、結核菌の検出のみならず、結核の適切な診断及び治療を行うために有用である。
Claims (13)
- 結核菌群を含む生体試料に40℃〜60℃にて加熱処理を施すことにより菌体外に分泌させた結核菌群特異的蛋白質を免疫学的測定に供することからなる結核菌群検出方法。
- 生体試料の加熱処理が40℃〜55℃にて施されることを特徴とする請求項１に記載の結核菌群検出方法。
- 生体試料の加熱処理を少なくとも15分間実施することを特徴とする請求項1又は２に記載の結核菌群検出方法。
- 生体試料の加熱処理を15分以上2.5時間以下の間で実施することを特徴とする請求項３に記載の結核菌群検出方法。
- 生体試料が、喀痰、気管支分泌液、胸水、胃液、血液、髄液、尿、便、気管支洗浄液、および、気管支または肺から採取された組織片からなる群より選ばれた少なくとも１つであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか1項に記載の結核菌群検出方法。
- 生体試料が喀痰であることを特徴とする請求項５に記載の結核菌群検出方法。
- 生体試料を試料処理剤により溶解させた後に加熱処理を施すことを特徴とする請求項１〜６のいずれか1項に記載の結核菌群検出方法。
- 試料処理剤により溶解させた生体試料を溶媒に分散または溶解させた後に加熱処理を施すことを特徴とする請求項７に記載の結核菌群検出方法。
- 免疫学的測定は、結核菌群特異的分泌蛋白質に対する第一の抗体と第二の抗体とを用いたサンドイッチ式免疫測定からなる、請求項１〜８のいずれか1項に記載の結核菌群検出方法。
- 免疫学的測定は、イムノクロマトグラフィー測定法であることを特徴とする請求項９に記載の結核菌群検出方法。
- 免疫学的測定は、ELISAであることを特徴とする請求項９に記載の結核菌群検出方法。
- 結核菌群特異的分泌蛋白質がMPB64又はMPT64である、請求項９〜１１のいずれか1項に記載の結核菌群検出方法。
- 結核菌群を含む生体試料に40℃〜60℃にて加熱処理を施すことを含む、結核菌群特異的蛋白質を菌体外へ分泌させる方法。
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