JP6325077B2 - 核酸を抽出するための組成物および方法 - Google Patents
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Description
一実施形態では、本発明は、細胞原料から核酸を抽出する方法であって、細胞原料と、単一段階で細胞材料を溶解して核酸を抽出することができる抽出水溶液とを接触させることを含む方法を対象とする。一実施形態では、抽出水溶液は、1つ以上のアミンモノマーおよび1つ以上のアミドから選択される窒素含有溶媒を含む。一実施形態では、抽出水溶液は、アミンモノマーおよびアミドを含む。別の実施形態では、抽出水溶液は、第1級アミンモノマーを含む。一実施形態では、アミンモノマーは、2,2’−(エチレンジオキシ)ビス(エチルアミン)(EDBE)である。一実施形態では、アミンモノマーは、1,3−ジアミノプロパンである。一実施形態では、アミンモノマー(anime monomer)は、3−アミノ−1−プロパノールである。一実施形態では、2つ以上のアミンモノマーが同時に使用される。一実施形態では、アミンモノマーは、2,2’−エチレンジオキシ(eththylenedioxy))ビス(エチルアミン)(EDBE)、1,3−ジアミノプロパン(DAP)、2−アミノ−1−ブタノール(AB)、2−(2−アミノエトキシ)エタノール(AEE)、2−アミノ−6−メチルヘプタン(AMH)、2−アミノ−2−メチル−1−プロパノール(AMP)、アミノ−2−プロパノール(A2P)、1,5−ジアミノ−2−メチルペンタン(DMP)および3−アミノ−1−プロパノール(3A1P)の1つ以上から選択される。一実施形態では、抽出水溶液中のアミンモノマーの濃度は、約15%から約50%である。一実施形態では、抽出水溶液中のアミンモノマーの濃度は、約20%から約45%である。一実施形態では、抽出水溶液中のアミンモノマーの濃度は、約45%から約50%である。一実施形態では、抽出水溶液は、カオトロープをさらに含む。一実施形態では、カオトロープは、尿素、グアニジンチオシアネート(GITC)、エタノールおよびブタノールからなる群から選択される。一実施形態では、前記抽出水溶液中のカオトロープは、約4Mから約5Mである。一実施形態では、前記抽出水溶液中のカオトロープは、約4.5Mから約5Mである。一実施形態では、抽出水溶液は、界面活性剤およびアルコールの1つ以上をさらに含む。適切な界面活性剤としては、Tween(R)、ポリソルベート、デオキシコレート、デオキシコール酸ナトリウムおよびドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、NP−40およびTriton(R)X−100が挙げられる。適切なアルコールとしては、エタノール、ブタノールが挙げられる。一実施形態では、界面活性剤の濃度は、約1%から約15%または約8%から約15%である。一実施形態では、界面活性剤の濃度は、約10%から約15%である。一実施形態では、界面活性剤の濃度は、約12%から約15%である。一実施形態では、アルコールの濃度は、約15%から約25%である。一実施形態では、アルコールの濃度は、約10%から約40%である。一実施形態では、アルコールの濃度は、約20%から約35%である。一実施形態では、アルコールの濃度は、約20%から約25%である。一実施形態では、アルコールの濃度は、約23%から約25%である。別の実施形態では、細胞原料は、組織、動物組織、哺乳類組織、ヒト組織、ヒト腫瘍組織、ウイルスを含有するヒト組織、固定ヒト組織、動物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、ウイルスを含有するヒト細胞、細菌、マイコバクテリア、真菌、酵母および植物組織または植物細胞、細胞を含有する血液、細胞を含有する痰からなる群から選択される。
一実施形態では、本発明は、固定組織細胞原料から核酸を抽出する方法であって、細胞原料と、単一段階で細胞材料を溶解して核酸を抽出することができる抽出水溶液とを接触させることを含む方法を対象とする。一実施形態では、固定細胞原料は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織である。一実施形態では、抽出水溶液は、1つ以上のアミンモノマーおよび1つ以上のアミドから選択される窒素含有溶媒を含む。一実施形態では、抽出水溶液は、アミンモノマーおよびアミドを含む。別の実施形態では、抽出水溶液は、第1級アミンモノマーを含む。一実施形態では、アミンモノマーは、2,2’−(エチレンジオキシ)ビス(エチルアミン)(EDBE)である。一実施形態では、アミンモノマーは、1,3−ジアミノプロパンである。一実施形態では、アミンモノマー(anime monomer)は、3−アミノ−1−プロパノールである。一実施形態では、2つ以上のアミンモノマーが同時に使用される。一実施形態では、アミンモノマーは、2,2’−エチレンジオキシ(eththylenedioxy))ビス(エチルアミン)(EDBE)、1,3−ジアミノプロパン(DAP)、2−アミノ−1−ブタノール(AB)、2−(2−アミノエトキシ)エタノール(AEE)、2−アミノ−6−メチルヘプタン(AMH)、2−アミノ−2−メチル−1−プロパノール(AMP)、アミノ−2−プロパノール(A2P)、1,5−ジアミノ−2−メチルペンタン(DMP)および3−アミノ−1−プロパノール(3A1P)の1つ以上から選択される。一実施形態では、抽出水溶液中のアミンモノマーの濃度は、約15%から約50%である。一実施形態では、抽出水溶液中のアミンモノマーの濃度は、約20%から約45%である。一実施形態では、抽出水溶液中のアミンモノマーの濃度は、約45%から約50%である。一実施形態では、抽出水溶液は、カオトロープをさらに含む。一実施形態では、カオトロープは、尿素、グアニジンチオシアネート(GITC)、エタノールおよびブタノールからなる群から選択される。一実施形態では、前記抽出水溶液中のカオトロープは、約4Mから約5Mである。一実施形態では、前記抽出水溶液中のカオトロープは、約4.5Mから約5Mである。一実施形態では、抽出水溶液は、界面活性剤およびアルコールの1つ以上をさらに含む。適切な界面活性剤としては、Tween(R)、ポリソルベート、デオキシコレート、デオキシコール酸ナトリウムおよびドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、NP−40およびTriton(R)X−100が挙げられる。適切なアルコールとしては、エタノール、ブタノールが挙げられる。一実施形態では、界面活性剤の濃度は、約1%から約15%または約8%から約15%である。一実施形態では、界面活性剤の濃度は、約10%から約15%である。一実施形態では、界面活性剤の濃度は、約10%から約40%である。一実施形態では、アルコールの濃度は、約20%から約35%である。一実施形態では、アルコールの濃度は、約20%から約25%である。一実施形態では、アルコールの濃度は、約23%から約25%である。
一実施形態では、本発明は、細菌細胞原料から核酸を抽出する方法であって、細胞原料と、単一段階で細胞材料を溶解して核酸を抽出することができる抽出水溶液とを接触させることを含む方法を対象とする。一実施形態では、細菌細胞原料は、マイコバクテリア細胞である。別の実施形態では、細菌細胞原料は、マイコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium Tuberculosis)である。別の実施形態では、細菌は、ヒトの痰中に見られる。別の実施形態では、細菌は、単一段階で不活性化される。一実施形態では、抽出水溶液は、1つ以上のアミンモノマーおよび1つ以上のアミドから選択される窒素含有溶媒を含む。一実施形態では、抽出水溶液は、アミンモノマーおよびアミドを含む。別の実施形態では、抽出水溶液は、第1級アミンモノマーを含む。一実施形態では、アミンモノマーは、2,2’−(エチレンジオキシ)ビス(エチルアミン)(EDBE)である。一実施形態では、アミンモノマーは、1,3−ジアミノプロパンである。一実施形態では、アミンモノマー(anime monomer)は、3−アミノ−1−プロパノールである。一実施形態では、2つ以上のアミンモノマーが同時に使用される。一実施形態では、アミンモノマーは、2,2’−エチレンジオキシ(eththylenedioxy))ビス(エチルアミン)(EDBE)、1,3−ジアミノプロパン(DAP)、2−アミノ−1−ブタノール(AB)、2−(2−アミノエトキシ)エタノール(AEE)、2−アミノ−6−メチルヘプタン(AMH)、2−アミノ−2−メチル−1−プロパノール(AMP)、アミノ−2−プロパノール(A2P)、1,5−ジアミノ−2−メチルペンタン(DMP)および3−アミノ−1−プロパノール(3A1P)の1つ以上から選択される。一実施形態では、抽出水溶液中のアミンモノマーの濃度は、約15%から約50%である。一実施形態では、抽出水溶液中のアミンモノマーの濃度は、約20%から約45%である。一実施形態では、抽出水溶液中のアミンモノマーの濃度は、約45%から約50%である。一実施形態では、抽出水溶液は、カオトロープをさらに含む。一実施形態では、カオトロープは、尿素、グアニジンチオシアネート(GITC)、エタノールおよびブタノールからなる群から選択される。一実施形態では、前記抽出水溶液中のカオトロープは、約4Mから約5Mである。一実施形態では、前記抽出水溶液中のカオトロープは、約4.5Mから約5Mである。一実施形態では、抽出水溶液は、界面活性剤およびアルコールの1つ以上をさらに含む。適切な界面活性剤としては、Tween(R)、ポリソルベート、デオキシコレート、デオキシコール酸ナトリウムおよびドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、NP−40およびTriton(R)X−100が挙げられる。適切なアルコールとしては、エタノール、ブタノールが挙げられる。一実施形態では、界面活性剤の濃度は、約1%から約15%または約8%から約15%である。一実施形態では、界面活性剤の濃度は、約10%から約15%である。一実施形態では、界面活性剤の濃度は、約10%から約40%である。一実施形態では、アルコールの濃度は、約20%から約35%である。一実施形態では、アルコールの濃度は、約20%から約25%である。一実施形態では、アルコールの濃度は、約23%から約25%である。
一実施形態では、酵母細胞原料から核酸を抽出する方法であって、細胞原料と、単一段階で細胞材料を溶解して核酸を抽出することができる抽出水溶液とを接触させることを含む方法を対象とする。一実施形態では、抽出水溶液は、1つ以上のアミンモノマーおよび1つ以上のアミドから選択される窒素含有溶媒を含む。一実施形態では、抽出水溶液は、アミンモノマーおよびアミドを含む。別の実施形態では、抽出水溶液は、第1級アミンモノマーを含む。一実施形態では、アミンモノマーは、2,2’−(エチレンジオキシ)ビス(エチルアミン)(EDBE)である。一実施形態では、アミンモノマーは、1,3−ジアミノプロパンである。一実施形態では、アミンモノマー(anime monomer)は、3−アミノ−1−プロパノールである。一実施形態では、2つ以上のアミンモノマーが同時に使用される。一実施形態では、アミンモノマーは、2,2’−エチレンジオキシ(eththylenedioxy))ビス(エチルアミン)(EDBE)、1,3−ジアミノプロパン(DAP)、2−アミノ−1−ブタノール(AB)、2−(2−アミノエトキシ)エタノール(AEE)、2−アミノ−6−メチルヘプタン(AMH)、2−アミノ−2−メチル−1−プロパノール(AMP)、アミノ−2−プロパノール(A2P)、1,5−ジアミノ−2−メチルペンタン(DMP)および3−アミノ−1−プロパノール(3A1P)の1つ以上から選択される。一実施形態では、抽出水溶液中のアミンモノマーの濃度は、約15%から約50%である。一実施形態では、抽出水溶液中のアミンモノマーの濃度は、約20%から約45%である。一実施形態では、抽出水溶液中のアミンモノマーの濃度は、約45%から約50%である。一実施形態では、抽出水溶液は、カオトロープをさらに含む。一実施形態では、カオトロープは、尿素、グアニジンチオシアネート(GITC)、エタノールおよびブタノールからなる群から選択される。一実施形態では、前記抽出水溶液中のカオトロープは、約4Mから約5Mである。一実施形態では、前記抽出水溶液中のカオトロープは、約4.5Mから約5Mである。一実施形態では、抽出水溶液は、界面活性剤およびアルコールの1つ以上をさらに含む。適切な界面活性剤としては、Tween(R)、ポリソルベート、デオキシコレート、デオキシコール酸ナトリウムおよびドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、NP−40およびTriton(R)X−100が挙げられる。適切なアルコールとしては、エタノール、ブタノールが挙げられる。一実施形態では、界面活性剤の濃度は、約1%から約15%または約8%から約15%である。一実施形態では、界面活性剤の濃度は、約10%から約15%である。一実施形態では、界面活性剤の濃度は、約10%から約40%である。一実施形態では、アルコールの濃度は、約20%から約35%である。一実施形態では、アルコールの濃度は、約20%から約25%である。一実施形態では、アルコールの濃度は、約23%から約25%である。
一実施形態では、本発明は、FISHアッセイ細胞原料から核酸を抽出する方法であって、細胞原料と、単一段階で細胞材料を溶解して核酸を抽出することができる抽出水溶液とを接触させることを含む方法を対象とする。一実施形態では、抽出水溶液は、1つ以上のアミンモノマーおよび1つ以上のアミドから選択される窒素含有溶媒を含む。一実施形態では、抽出水溶液は、アミンモノマーおよびアミドを含む。別の実施形態では、抽出水溶液は、第1級アミンモノマーを含む。一実施形態では、アミンモノマーは、2,2’−(エチレンジオキシ)ビス(エチルアミン)(EDBE)である。一実施形態では、アミンモノマーは、1,3−ジアミノプロパンである。一実施形態では、アミンモノマー(anime monomer)は、3−アミノ−1−プロパノールである。一実施形態では、アミンモノマーは、2,2’−エチレンジオキシ(eththylenedioxy))ビス(エチルアミン)(EDBE)、1,3−ジアミノプロパン(DAP)、2−アミノ−1−ブタノール(AB)、2−(2−アミノエトキシ)エタノール(AEE)、2−アミノ−6−メチルヘプタン(AMH)、2−アミノ−2−メチル−1−プロパノール(AMP)、アミノ−2−プロパノール(A2P)、1,5−ジアミノ−2−メチルペンタン(DMP)および3−アミノ−1−プロパノール(3A1P)の1つ以上から選択される。一実施形態では、2つ以上のアミンモノマーが同時に使用される。一実施形態では、抽出水溶液中のアミンモノマーの濃度は、約15%から約50%である。一実施形態では、抽出水溶液中のアミンモノマーの濃度は、約20%から約45%である。一実施形態では、抽出水溶液中のアミンモノマーの濃度は、約45%から約50%である。一実施形態では、抽出水溶液は、カオトロープをさらに含む。一実施形態では、カオトロープは、尿素、グアニジンチオシアネート(GITC)、エタノールおよびブタノールからなる群から選択される。一実施形態では、前記抽出水溶液中のカオトロープは、約4Mから約5Mである。一実施形態では、前記抽出水溶液中のカオトロープは、約4.5Mから約5Mである。一実施形態では、抽出水溶液は、界面活性剤およびアルコールの1つ以上をさらに含む。適切な界面活性剤としては、Tween(R)、ポリソルベート、デオキシコレート、デオキシコール酸ナトリウムおよびドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、NP−40およびTriton(R)X−100が挙げられる。適切なアルコールとしては、エタノール、ブタノールが挙げられる。一実施形態では、界面活性剤の濃度は、約1%から約15%または約8%から約15%である。一実施形態では、界面活性剤の濃度は、約10%から約15%である。一実施形態では、界面活性剤の濃度は、約10%から約40%である。一実施形態では、アルコールの濃度は、約20%から約35%である。一実施形態では、アルコールの濃度は、約20%から約25%である。一実施形態では、アルコールの濃度は、約23%から約25%である。
本発明の概念は、試料からDNAを放出させて固体支持体(例えば、シリカ含有表面)上に捕捉する単一段階溶解緩衝液を使用して、例えばホルムアルデヒド固定パラフィン包埋(FFPE)組織から核酸を容易に濃縮、精製もしくは単離し得るか、または細胞原料(例えば、固定組織)からDNAを放出させるために試料の脱パラフィン処理も、試料の酵素消化も必要とせずに、別の方法で濃縮もしくは単離し得ることである。当業者であれば、本発明の手順が、FFPEではない試料(例えば限定されないが、細菌、酵母、組織など)から核酸を抽出、精製、単離および濃縮するのにも適切であると理解するであろう。
第2の溶媒1,3−ジアミノプロパン(diaminoproane)を使用して、本発明の概念をさらに調査した。上記のように抽出を実施したが、2つの反復試験試料のみを各溶解緩衝液について行った。第1の溶解緩衝液はLB−EtOH緩衝液であり、第2の溶解緩衝液は、20%1,3−ジアミノプロパン(DP、CAS番号109−76−2)を含有するLB−EtOHであった。FFPE切片は、上記で使用したのと同じ組織試料由来のものであった。インキュベーション、抽出およびアッセイ条件は、上記と同じであった。アッセイの増幅曲線を図3に示す。図3は、LB−EtOH溶解緩衝液およびLB−EtOH−ジアミノプロパン溶解緩衝液で抽出した試料間の明確な差異を示している。サイクル閾値の計算は、この2つの溶解緩衝液間において2CT超の差異があることを示しているが、これは、1,3−ジアミノプロパン含有溶解緩衝液で抽出したDNAの量が4倍超増加しているということである。図4は、図3に示されているデータに関する一元ANOVA試験の平均を示す。
上記で使用した溶媒に存在するアミン基がFFPE試料からのDNA抽出に影響を与えるかを決定するために、水酸化アンモニウムの溶解緩衝液への追加を使用して、本発明をさらに調査した。上記のように抽出を実施したが、試験した第2の溶解緩衝液は、約0.6%水酸化アンモニウム(NH4OH)を含有していた。200マイクロリットルの濃水酸化アンモニウム(28から30%)を10mlのLB−EtOHに追加することによって、これを作製した。上記と同じ試料材料を含有する5つの反復試験試料を、各抽出緩衝液と共に使用した。上記のようにBRAFアッセイを用いて、溶出液を2回反復でアッセイした。アッセイの増幅曲線を図5に示す。図5は、LB−EtOH溶解緩衝液およびLB−EtOH−NH4OH緩衝液で抽出した試料間の差異を示している。サイクル閾値の計算は、この2つの溶解緩衝液間において1.4CT超の差異があることを示しているが、これは、NH4OH含有溶解緩衝液で抽出したDNAの量が2倍超増加しているということである。図6は、図5に示されているデータに関する一元ANOVA試験の平均を示す。NH4OH含有溶解緩衝液で抽出したDNAの増加は、他の2つの溶媒で抽出したものほど大きくないと思われるが、アンモニウムイオンまたはアミン基の存在が、FFPE試料からのDNA抽出に重要であることを示している。
全血からのカンジダ・アルビカンス(C.albicans)の抽出例。
痰からのマイコバクテリウム・ツベルクロシス(M.tuberculosis)(MTB)のEDBE抽出。
細胞材料からの核酸抽出に適切なアミンモノマーの同定。幾つかのさらなるアミンモノマーが、限定されないが、新鮮材料、固定材料およびFFPE材料を含む細胞原料からの核酸(例えば、DNA、RNAなど)の抽出に適切であると同定した。試験したアミンモノマーは、EDBE溶媒よりも低有害性であり、EDBEと類似の特性を有すると思われたので選択した。全血からの酵母(カンジダ・アルビカンス(C.albicans))およびスタフィロコッカス・アウレウス(S.aureus)DNAの抽出において溶媒が機能するかを決定するために、最初のスクリーニングを行った。CASA(カンジダ・アルビカンス(C.albicans)およびスタフィロコッカス・アウレウス(S.aureus)試料の混合物;以下を参照のこと)を対照として使用した。EDBEは、FFPE材料から、および列挙されている全血中の標的からDNAを抽出することができた。本実施例では、以下に列挙されている7つのアミンモノマーを試験し、EDBEによる抽出と比較した。
FFPE試料の3−アミノ−1−プロパノール(3A1P)抽出。3種類の試料を試験した。CRC(結腸直腸癌)、黒色腫および肺組織。Qiagen(Valencia,CA)およびPromega(Madison,WI)から入手可能な当技術分野で公知のFFPE抽出システムと試料を比較した。パラフィンブロックの試料切片(厚さ5ミクロン、ガラススライド上にマウントせず)を連続して切り取り、断面のばらつきを抑えるために、試料の3つに1つを同じ抽出条件で試験した。本発明の方法(3A1P抽出)に関するこの実験の溶解条件は、以下の通りである。溶解条件:60%溶解緩衝液(LB);20%EtOHおよび20%3A1P、総量1.5ml。インキュベーションを78℃および94℃で30分間から4時間の期間にわたって試験した。溶解インキュベーションの後、MMP(25μl)を試料に追加した。捕捉時間は、室温(RT)で10分間であった。MMPを0.5mlのLBおよび33%EtOHで2分間にわたって室温(RT)で1回洗浄し、続いて、70%EtOHで2分間にわたってそれぞれ室温(RT)で2回洗浄した。試料を5分間乾燥し、100μlのDI水で10分間にわたって70℃で溶出した。QiagenおよびPromegaのプロトコールで処理した試料を製造業者の指示に従って処理した。PCRをBRAF−Eの検出に使用した。BRAF−Eアッセイは、FAMを有する遺伝子およびCYC5を有する正常遺伝子における変異を検出する。Ct値(当業者に公知であるように、これは、PCR反応における標的の濃度の相対的指標である。)を決定した。CRC試料のCtデータを図11に示し、ΔCt(dCt:対照と試験試料との間のCt値の変化)を図12に示す。dCtについては、13未満の値は、試験腫瘍マーカーについて陽性であるとみなす。データから分かるように、本発明のアミン抽出法は、従来技術のQiagenおよびPromegaの方法よりも優秀ではないにしても、少なくとも同程度に優れているが、必要な操作工程はより少なく、処理時間はより速い。より詳細には、2つのシグナルのサイクル閾値(CT値)を図11に示す。サイクル閾値は、シグナルがバックグラウンドよりも有意に高いPCR反応のサイクル数を指す。アッセイにおける標的の量が多いほど、より少ないサイクル数でシグナルが生成され得るので、より小さい数字は標的の量がより多いことを示す。この図は、結腸直腸癌組織由来のFFPE材料の2つの別個のブロック(C9およびC13)からの結果を示す。これらのブロックから連続切片を作製し、これらの番号によって表される別個の切片を3つの異なる方法で抽出した。FAMシグナルは青色の棒であり、CY5シグナルは赤色の棒である。Qiagen処理切片からのシグナルは、淡青色および淡赤色の棒によって表されており、Qiaと表示されている。Promega処理切片からのシグナルは、濃青色および濃赤色の棒によって表されており、CSCと表示されている。これらの方法は両方とも、FFPE組織からDNAを単離するのにプロテアーゼ消化を使用する。Abbottアミン溶媒システムからのシグナルは、明青色および明赤色の棒によって表されている。グラフから分かるように、Abbott抽出からのシグナルは、他の2つの方法で得られたものと同程度である。図12は、図11におけるFAMシグナルとCY5シグナルとの間の差異を示す。このdCT値は、抽出した組織が癌性であるか否かの決定を助けるのに使用される。13未満の差異は、試料における変異遺伝子の量が比較的多く(より低いCT値)、試料が癌性であり得ることを示す。それぞれQiagen、PromegaおよびAbbottの方法について、3つの異なる方法は、淡緑色、濃緑色および明緑色の棒によって示されている。C9試料およびC13試料の両方において、Abbottの方法は、他の2つの方法と同程度のdCT値をもたらす。
本発明の組成物および方法の多用途性は、従来技術の手順を超える改善を提供する。例えば、スライドにマウントされた検体の場合、従来技術の手順では、ガラススライドから試料を剥離する必要がある。この工程は、操作者のミスの影響を受ける。必要な剥離には時間がかかり、鋭利器具を使用し、二次混入の可能性が高い。本発明の組成物および方法は、スライドから試料を剥離することなく、スライドからDNAを直接抽出することを可能にする。さらに、切片のばらつきに起因するアッセイのばらつき(即ち、試料切片間のばらつきに起因する「ヒットまたはミス」)の可能性を軽減するために、または低レベルの標的の検出を助けるために、複数のスライドを一緒に処理することができる。複数のスライドを保持するために設計された受け入れ容器(RV)において、スライドを処理することができる。試料中のDNAは、ガラススライドよりも大きいMMP親和性を有する(これは、異なる種類のガラスおよび/または過剰に追加したMMPの結果であり得る。)。図17は、B型肝炎ウイルス対照に関する本発明の組成物および方法による処理の結果のグラフを示し、図18は、溶解インキュベーション手順中にMMPを追加した同じ手順を示す。プロトコールのこの時点でMMPを追加すると、DNAがMMP上に捕捉される。***FFPEスライドに対して行った実験は、この手順の有効性を証明している。LB−EtOH−3A1PまたはLB−3A1Pのいずれかで試料を抽出し、インキュベーション後にEtOHを追加した。また、MMPの有無の下で試料をインキュベートした。各条件について、インキュベーションを90℃で2時間および20分間行った。図19は、EtOHの有無の下で溶解インキュベーション中にMMPを追加すると、dRn値によって示されているように、DNAがMMPに結合したことを示している。dRnは、標準化応答の差を表しており、Multianalyze4(Abbott Molecular in−house software program,Abbott Park,II。当業者に公知であるように、また、www.gene−quantification.de/hkg.htmlなどのウェブサイトにおける教示によって明らかであるように、他の適切なプログラムは市販されている。)と称されるプログラムを使用してベースラインを設定した後の、PCR反応からの蛍光シグナルの値である。CT値は、dRnが、このdRnの特定の閾値と交差する地点から生成される。
本実施例では、複数のスライドを同時に処理した。同じ反応容器中で、1から4つのスライドを処理した。4つ未満のスライドを処理した条件では、空のスライドをプレースホルダーとして使用した。複数のスライドの同時処理は、低コピー数の標的を検出するのに役立ち得る。図20は、1から4つのスライドを同時に処理した結果を示す。処理スライドの各増加と共に、検出が改善された。***組織FFPEおよびPathVysion−Aプローブチェックノーマルスライド(Abbott Laboratories,Abbott Park,II)の両方を試験した。図21は、データの一元ANOVA分析を示す。
本実施例では、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)分析のために事前に処理したスライドを、本発明の組成物および方法で処理する。結果は、FISH分析のために事前に処理したスライドから核酸が抽出されること、および単離されたDNAが、FISH処理スライドからの抽出後におけるさらなる分析に適切であることを示している。
マイコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)(MTB)からの核酸抽出。3A1P溶解組成物による溶解は、痰を溶解し、MTBから核酸を抽出するであろう。さらに、この組成物は、標的MTBを不活性化するのに使用され得る。理論によって本発明を限定するものではないが、本発明の3A1P溶解組成物の高pHは、標的MTBの不活性化に関与し得ると考えられる。
Claims (30)
- 細胞原料から核酸を抽出する方法であって、
a)i)細胞原料及びii)1つ以上のアミンモノマーを含む抽出水溶液を提供する工程と、ここで、前記アミンモノマーは、2,2’−(エチレンジオキシ)ビス(エチルアミン)(EDBE)、1,3−ジアミノプロパン及び3−アミノ−1−プロパノールからなる群から選択される第1級アミンモノマーであり、前記抽出水溶液中のアミンモノマーの濃度は、約30〜50%である;
b)前記細胞原料と前記抽出水溶液とを接触させ、細胞材料を溶解して核酸を抽出する工程と
を含む、方法。 - アミンモノマーが、2,2’−(エチレンジオキシ)ビス(エチルアミン)(EDBE)である、請求項1に記載の方法。
- アミンモノマーが、1,3−ジアミノプロパンである、請求項1に記載の方法。
- アミンモノマーが、3−アミノ−1−プロパノールである、請求項1に記載の方法。
- 抽出水溶液が、カオトロープをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- カオトロープが、尿素、グアニジンチオシアネート(GITC)、エタノール及びブタノールからなる群の1つ以上から選択される、請求項5に記載の方法。
- 抽出水溶液が、界面活性剤及びアルコールの1つ以上をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 界面活性剤が、Tween(R)、ポリソルベート、デオキシコレート、デオキシコール酸ナトリウム及びドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、NP−40及びTriton(R)X−100からなる群の1つ以上から選択される、請求項7に記載の方法。
- 界面活性剤の濃度が、約8%から約15%である、請求項8に記載の方法。
- アルコールが、エタノール及びブタノールからなる群の1つ以上から選択される、請求項7に記載の方法。
- アルコールの濃度が約15%から約25%である、請求項10に記載の方法。
- 抽出水溶液中のカオトロープの濃度が、約4Mから約5Mである、請求項5に記載の方法。
- 細胞原料が、生細胞原料及び固定細胞原料から選択される、請求項1に記載の方法。
- 生細胞原料が、単細胞懸濁液を含む、請求項13に記載の方法。
- 細胞懸濁液が細菌を含む、請求項14に記載の方法。
- 細菌がマイコバクテリアである、請求項15に記載の方法。
- 細胞懸濁液が酵母を含む、請求項13に記載の方法。
- 抽出水溶液が酵素フリーである、請求項1に記載の方法。
- 抽出水溶液がプロテアーゼフリーである、請求項1に記載の方法。
- 固定細胞原料がホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)材料を含む、請求項13に記載の方法。
- 細胞原料から核酸を抽出するのに適切な抽出水溶液を含む組成物であって、1つ以上のアミンモノマー;1つ以上のカオトロピック試薬、1つ以上の界面活性剤及び1つ以上の有機溶媒を含み、前記アミンモノマーは、2,2’−(エチレンジオキシ)ビス(エチルアミン)(EDBE)、1,3−ジアミノプロパン及び3−アミノ−1−プロパノールからなる群から選択される第1級アミンモノマーであり、前記抽出水溶液中のアミンモノマーの濃度は、約30〜50%である、組成物。
- アミンモノマーが、2,2’−(エチレンジオキシ)ビス(エチルアミン)(EDBE)である、請求項21に記載の組成物。
- アミンモノマーが、1,3−ジアミノプロパンである、請求項21に記載の組成物。
- アミンモノマーが、3−アミノ−1−プロパノールである、請求項21に記載の組成物。
- カオトロープが、尿素、グアニジンチオシアネート(GITC)、エタノール及びブタノールからなる群の1つ以上から選択される、請求項21に記載の組成物。
- 界面活性剤が、Tween(R)、ポリソルベート、デオキシコレート、デオキシコール酸ナトリウム及びドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、NP−40及びTriton(R)X−100からなる群の1つ以上から選択される、請求項21に記載の組成物。
- 界面活性剤の濃度が約8%から約15%である、請求項26に記載の組成物。
- 有機溶媒がアルコールであり、前記アルコールが、エタノール及びブタノールからなる群の1つ以上から選択される、請求項21に記載の組成物。
- アルコールの濃度が約15%から約25%である、請求項28に記載の組成物。
- 抽出水溶液中のカオトロープの濃度が、約4Mから約5Mである、請求項25に記載の組成物。
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