KR20220004072A - 뇌에 지향성을 가지는 aav 돌연변이체 - Google Patents

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토시카즈 니시에
후유코 다카시마
타츠지 에노키
준이치 미네노
요시노리 다나카
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다카라 바이오 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 서열번호 15∼서열번호 62로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 혹은 서열번호 15∼서열번호 62로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 함유시킨 아데노 관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질 돌연변이체를 코딩하는 핵산, 그 핵산을 함유하는 DNA, 그 DNA를 함유하는 세포, 및 그 세포의 제조방법을 제공한다.

Description

뇌에 지향성을 가지는 AAV 돌연변이체
본 발명은 뇌에 지향성을 가지는 아데노 관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질의 돌연변이체를 코딩하는 핵산, 당해 캡시드 단백질의 돌연변이체를 포함하는 AAV 입자 및 당해 입자를 사용하는 유전자 도입세포의 제조방법에 관한 것이다.
AAV는 2개의 오픈 리딩 프레임 rep 유전자 및 cap 유전자를 포함하는 4.7kb의 싱글 체인 DNA를 게놈으로 하는 바이러스이다. rep 유전자는 게놈 복제에 필요한 4종의 단백질(Rep78, Rep68, Rep52, 및 Rep40)을 코딩하고, cap 유전자는 바이러스 캡시드 형성을 위해서 집성하는 3종의 캡시드 단백질(VP1, VP2, VP3) 및 Assembly-Activating Protein(AAP)을 발현시킨다. 자연계에서의 AAV의 복제는 아데노 바이러스, 헤르페스 바이러스 등의 헬퍼 바이러스의 존재에 좌우된다. 헬퍼 바이러스가 존재하지 않을 경우, AAV는 그 게놈이 에피솜에 유지되거나, 또는 숙주 염색체에 포함되어 잠복 상태가 된다. 현재, 100을 넘는 AAV 혈청형 및 클레드(비특허문헌 1)가 동정되고 있지만, 특히 AAV2가 유전자 전달 벡터로서 개발이 진행되고 있다.
1989년에 AAV2를 기초로 유전자 전달 벡터 시스템이 처음으로 개발되고 있다. AAV를 기초로 한 벡터는 많은 이점을 가지는 것이 입증되고 있다. 야생형 AAV는 비병원성이소, 어느 기지의 질환과도 병원학적 관계를 가지지 않으므로, AAV를 기초로 한 벡터는 매우 안전하다고 여겨지고 있다. 부가해서, AAV는 효율이 높은 유전자 도입능을 가진다.
AAV 입자의 투여로 다양한 표적 장기, 표적 세포에 장기적으로 안정된 유전자 도입이 가능하다. 현재까지, 골격근, 간장(간세포), 심장(심근세포), 신경세포, 췌선세포(pancreatic gland cell), 췌도 세포(pancreatic islet cell)에 높은 효율로 유전자를 도입하는 것이 입증되고 있다. 추가로 AAV는 인간 임상시험에서 사용된 실적을 가진다. 한편, AAV의 캡시드 단백질을 개변해서 AAV의 세포 지향성을 변화시키는 시도나, 중화 항체에 의한 AAV 입자의 제거를 회피하는 시도가 이루어지고 있다. 예를 들면, 신경교세포, 기도 상피 세포, 관상동맥 혈관 내피세포 또는 폐 등이 특정한 장기나 세포에 지향성을 가지는 AAV 캡시드의 제작이나, 교모세포종, 흑색종, 폐암 또는 유방암 등의 종양세포에 지향성을 가지는 AAV 캡시드의 제작이 이루어져 왔다(비특허문헌 2).
Gao et al., J. Virology, Vol. 78, pp. 6381-6388, 2004 Adachi K. et al., Genen Ther. Regul., Vol. 5, pp. 31-55, 2010
본 발명의 목적은 뇌에 지향성을 가지는 AAV 캡시드 단백질 돌연변이체를 제공하고, 뇌에 효율적으로 유전자를 도입하는 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위해서 예의 노력한 결과, 서열번호 15∼서열번호 62로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 원하는 AAV 입자를 제작하고, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명을 개략적으로 설명하자면 이하에 관한 것이다.
[1] 서열번호 15∼서열번호 62로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 혹은 서열번호 15∼서열번호 62로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 함유시킨 아데노 관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질 돌연변이체를 코딩하는 핵산.
[2] 상기 [1]에서, AAV 캡시드 단백질이 AAV2 유래인 핵산.
[3] 상기 [2]에서, AAV2의 VP1의 아미노산 번호 588번과 아미노산 번호 589번 사이의 위치에 상기 펩타이드를 함유시킨 핵산.
[4] 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 핵산을 포함하는 재조합 DNA.
[5] 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 핵산 또는 상기 [4]에 기재된 재조합 DNA를 포함하는 세포.
[6]서 열번호 15∼서열번호 62로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 혹은 서열번호 15∼서열번호 62로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 함유시킨 AAV 캡시드 단백질 돌연변이체를 포함하는 AAV 입자.
[7] 상기 [6]에서, AAV 캡시드 단백질이 AAV2 유래인 AAV 입자.
[8] 상기 [7]에서, AAV2의 VP1의 아미노산 번호 588번과 아미노산 번호 589번 사이의 위치에 상기 펩타이드를 함유시킨 AAV 입자.
[9] 서열번호 15∼서열번호 62로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 혹은 서열번호 15∼서열번호 62로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열에서 1 혹은 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 함유시킨 AAV 캡시드 단백질 돌연변이체를 포함하는 AAV 입자를 세포에 접촉시키는 공정을 포함하는, 유전자 도입세포의 제조방법.
[10] 상기 [9]에서, AAV 캡시드 단백질이 AAV2 유래인 방법.
[11] 상기 [10]에서, AAV2의 VP1의 아미노산 번호 588번과 아미노산 번호 589번 사이의 위치에 상기 펩타이드를 함유시킨 방법.
본 발명에 의해, 뇌에의 유전자 도입에 유용한 유전자 도입 시스템이 제공된다. 본 발명의 AAV 입자는 뇌에 대하여 높은 세포 지향성을 가지고, 도입한 유전자를 강하게 발현시킬 수 있다.
도 1은 캡시드 단백질에 랜덤 펩타이드를 함유시키는 핵산 구축물의 제작 방법을 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 AAV 캡시드 단백질 돌연변이체의 지향성 평가의 결과를 나타낸다.
본 명세서에서 「아데노 관련 바이러스」는 파르보바이러스과, 디펜도파이러스속에 속하는, 인간을 포함하는 영장목의 동물이나 기타의 포유류에 감염하는 소형의 바이러스를 나타낸다. 이하, Adeno Associated Virus를 생략해서 AAV라고 기재한다. AAV는 엔벨로프를 가지지 않는 정이십면체의 외각(캡시드)과 그 내부에 1개의 싱글 체인 DNA를 가진다. 본 명세서에서 AAV는 야생형 바이러스 및 그 파생물을 포함하고, 특별하게 기재하는 경우를 제외하고, 모든 혈청형 및 클레드를 포함한다.
본 명세서에서 「벡터」는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 또는 폴리뉴클레오티드에 회합하고, 폴리뉴클레오티드의 세포로의 전달을 매개하기 위해서 사용할 수 있는 분자 또는 분자의 회합체를 의미한다. 예를 들면, 플라스미드 벡터나 파지 벡터 등의 벡터 DNA, 바이러스 벡터 입자, 리포솜, 및 다른 유전자 전달 비히클을 들 수 있고, 이것들은 특별하게 기재하는 경우를 제외하고 모두 벡터에 포함된다.
본 명세서에서 「캡시드 단백질」은 AAV의 게놈에 존재하는 cap 유전자에 코딩되는 단백질로, AAV의 캡시드를 구성하는 단백질을 의미한다. 야생형 AAV 게놈은 3종류의 캡시드 단백질을 코딩하고, VP1, VP2 및 VP3이 존재한다. 본 명세서에서는 VP1, VP2 및 VP3 모두가 캡시드 단백질에 포함된다.
본 명세서에서 아미노산의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가에 관해서 「수개」란 기준이 되는 아미노산 서열의 길이에 따라 다르지만, 예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개를 말한다.
(1) AAV 캡시드 단백질 돌연변이체를 코딩하는 핵산
본 발명의 핵산은 서열번호 15∼서열번호 62로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 혹은 서열번호 15∼서열번호 62로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 함유시킨 AAV 캡시드 단백질 돌연변이체를 코딩하는 핵산이다. 호적하게는, 본 발명의 핵산은 서열번호 15∼서열번호 62로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 함유시킨 AAV 캡시드 단백질 돌연변이체를 코딩하는 핵산이다. 더욱 호적하게는, 본 발명의 핵산은 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 혹은 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 함유시킨 AAV 캡시드 단백질 돌연변이체를 코딩하는 핵산이다. 상기 서열번호로 나타나는 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 그 펩타이드를 AAV 캡시드 단백질에 함유시켰을 경우에, 상기 서열번호로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 함유시킨 AAV 캡시드 단백질 돌연변이체의 세포 지향성이 유지되는 펩타이드이다. 즉, 상기 서열번호로 나타나는 아미노산 서열에서 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가되는 아미노산의 수는 상기 서열번호로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 그 펩타이드를 함유하는 AAV 캡시드 단백질 돌연변이체에 제공하는 세포 지향성이 유지되는 한 한정되지 않고, 예를 들면, 치환, 결실 및/또는 삽입의 경우, 예를 들면 1∼5개, 바람직하게는 1∼4개, 더욱 바람직하게는 1, 2 또는 3개이고, 부가의 경우, 예를 들면 1∼9개, 바람직하게는 1∼8개, 더욱 바람직하게는 1∼7개, 더욱더 바람직하게는 1∼6개, 더욱더 바람직하게는 1∼5개, 더욱더 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4개일 수도 있다.
예를 들면, 상기의 AAV 캡시드 단백질 돌연변이체에 함유시키는 펩타이드는 서열번호 15∼서열번호 62로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 또는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드일 수도 있다. 상기 서열번호로 나타나는 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 또는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는, 그 펩타이드를 AAV 캡시드 단백질에 함유시켰을 경우에, 상기 서열번호로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 함유시킨 AAV 캡시드 단백질 돌연변이체의 세포 지향성이 유지된다.
예를 들면, 상기의 AAV 캡시드 단백질 돌연변이체에 함유시키는 펩타이드는 하기의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드일 수도 있다.
식(I): X1X2GX3GWV;
식(II): X4X5X6X7GWV;
식(III): X8X9GX10X11WV;
식(IV): X12X13GX14GX15V;
식(V): X16X17GX18GWX19; 또는
식(VI): X20X21GX22REX23
상기 식에서, X1∼X23은 어느 하나의 아미노산 잔기이고, G는 글리신을 나타내고, W는 트립토판을 나타내고, V는 발린을 나타내고, R은 아르기닌을 나타내고, E는 글루탐산을 나타낸다.
호적하게는 식(I)(X1X2GX3GWV) 중, X1은 E(글루탐산), G(글리신) 또는 T(트레오닌)이고, X2는 R(아르기닌), T(트레오닌), S(세린), N (아스파라긴), E(글루탐산) 또는 D(아스파라긴산)이고, X3은 V(발린), H(히스티딘), R, M(메티오닌) 또는 L(로이신)이다. 호적하게는 식(II)(X4X5X6X7GWV) 중, X4는 A(알라닌) 또는 E이고, X5는 D, G 또는 A이고, X6은 K(리신), Q(글루타민) 또는 N이고, X7은 V 또는 L이다. 호적하게는 식(III)(X8X9GX10X11WV) 중, X8은 A, E 또는 G이고, X9는 S, D, G 또는 R이고, X10은 T, M, D 또는 V이고, X11은 R, V, S 또는 T이다. 호적하게는 식(IV)(X12X13GX14GX15V)중, X12는 D, E, G 또는 R이고, X13은 A, G, D 또는 V이고, X14는 I, H, D, F(페닐알라닌), G 또는 L이고, X15는 Y(타이로신), F, R, G 또는 V이다. 호적하게는 식(V)(X16X17GX18GWX19) 중, X16은 A, E 또는 G이고, X17은 G, R 또는 S이고, X18은 V, H 또는 D이고, X19는 T, G, K, I(이소로이신) 또는 A이다. 호적하게는 식(VI)(X20X21GX22REX23) 중, X20은 E 또는 A이고, X21은 Y 또는 H이고, X22는 F 또는 Y이고, X23은 G 또는 P(프롤린)이다.
예를 들면, 식(I)의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에는 한정하나 것은 아니지만, 서열번호 18, 20, 21, 22, 46, 55, 59 및 60으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 혹은 서열번호 18, 20, 21, 22, 46, 55, 59 및 60으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열에서 1∼3개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 포함된다. 예를 들면, 식(II)의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에는 한정하나 것은 아니지만, 서열번호 25, 29 및 32로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 혹은 서열번호 25, 29 및 32로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열에서 1∼4개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 포함된다. 예를 들면, 식(III)의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에는 한정하나 것은 아니지만, 서열번호 15, 24, 38, 48 및 54로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 혹은 서열번호 15, 24, 38, 48 및 54로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열에서 1∼4개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 포함된다. 예를 들면, 식(IV)의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에는 한정하나 것은 아니지만, 서열번호 19, 31, 35, 44, 56 및 58로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 혹은 서열번호 19, 31, 35, 44, 56 및 58로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열에서 1∼4개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 포함된다. 예를 들면, 식(V)의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에는 한정하나 것은 아니지만, 서열번호 26, 39, 42, 43, 47 및 50으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 혹은 서열번호 26, 39, 42, 43, 47 및 50으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열에서 1∼4개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 포함된다. 예를 들면, 식(VI)의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에는 한정하나 것은 아니지만, 서열번호 16 또는 17으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 혹은 서열번호 16 또는 17으로 나타나는 아미노산 서열에서 1∼4개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 포함된다.
본 발명의 핵산이 코딩하는 AAV 캡시드 단백질 돌연변이체는 1형 AAV(AAV1), 2형 AAV(AAV2), 3형 AAV(AAV3A, AAV3B 등), 4형 AAV(AAV4), 5형 AAV(AAV5), 6형 AAV(AAV6), 7형 AAV(AAV7), 8형 AAV(AAV8), 9형 AAV(AAV9), 10형 AAV(AAV10), 11형 AAV(AAV11), 트리 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 양 AAV 등, 임의의 야생형 AAV 캡시드 단백질에 상기 펩타이드를 삽입하거나, 또는 AAV 캡시드 단백질의 아미노산 서열 일부를 상기 펩타이드로 치환하는(즉, AAV 캡시드 단백질에 상기 펩타이드를 함유시킨다) 것에 의해 조제할 수 있다. 본 발명에서는 AAV2의 캡시드 단백질이 특히 호적하게 사용할 수 있다.
본 발명의 핵산이 코딩하는 AAV 캡시드 단백질 돌연변이체는 야생형의 AAV 캡시드 단백질에 상기 펩타이드가 보유되어 있는 이외에, 1∼수개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 단백질일 수 있다. 상기 「상기 펩타이드가 보유되고 있는 이외에, 1∼수개 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 단백질」은 원래의 단백질의 성질, 예를 들면, 상기 펩타이드에 의해 부여되는 AAV 캡시드 단백질 돌연변이체의 세포 지향성, 캡시드 형성능, 캡시드 단백질의 기능(예를 들면, 바이러스 게놈의 보호, 숙주 세포 침입 후의 탈각 등) 등을 유지하는 단백질이다.
또, 본 발명에서 AAV 캡시드 단백질에 함유시키는 펩타이드의 N말단 및/또는 C말단에는 스페이서 서열을 부가시킬 수도 있다. 스페이서 서열은 1∼5아미노산 잔기가 호적하다. 스페이서 서열의 아미노산은 특별하게 한정은 없지만, 예를 들면 글리신, 알라닌 및 세린으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산을 사용할 수 있다.
펩타이드를 함유시키는 AAV 캡시드 단백질은 AAV의 VP1, VP2 및 VP3 모두를 사용할 수 있다. VP1만, VP2만 또는 VP3에만 펩타이드를 함유시킬 수도 있고, VP1∼VP3의 모든 캡시드 단백질에 펩타이드를 함유시킬 수도 있따 또, VP1 및 VP2, VP2 및 VP3, VP1 및 VP3의 조합, 2종류의 캡시드 단백질에 함유시킬 수도 있다. VP1∼VP3은 AAV 게놈의 cap 유전자영 역에 코딩되어 있다. 본 발명에 1형태로서, VP1∼VP3에 공통된 영역에 펩타이드를 함유시키고, VP1∼VP3의 모두에 돌연변이를 도입할 수 있다. 또, 다른 형태로서, AAV의 cap 유전자 영역과는 별도로, VP1, VP2 또는 VP3을 코딩하는 유전자를 준비하고, 이 유전자에 돌연변이를 도입할 수 있다. 이 경우, 돌연변이를 도입한 유전자에 코딩되는 캡시드 단백질에 대응하는 야생형 캡시드 단백질이 AAV의 cap 유전자 영역으로부터 발현하지 않는 것과 같은 처치를 실시할 수도 있다.
본 발명의 핵산이 코딩하는 AAV 캡시드 단백질 돌연변이체에서 펩타이드를 함유시키는 위치는 AAV2의 VP1의 경우, 아미노산 번호 588번과 아미노산 번호 589번 사이의 위치가 바람직하다. AAV2의 VP1의 아미노산 번호 588번은 아르기닌이고, AAV2의 VP1의 아미노산 번호 589번은 글루타민이다. 또, AAV2 VP1의 아미노산 번호 588번은 AAV2의 VP2의 아미노산 번호 451번, AAV2의 VP3의 아미노산 번호 386번에 상당한다. AAV 캡시드 단백질로서 AAV2 이외의 혈청형 또는 클레드의 AAV에 유래하는 캡시드 단백질을 사용하는 경우, 바람직하게는 상기 AAV 캡시드 단백질에서의, AAV2의 VP1의 아미노산 번호 588번과 589번에 대응하는 아미노산의 사이 위치에 펩타이드를 함유시킨다. AAV2의 VP1의 아미노산 번호 588번의 아미노산에 대응하는, AAV2 이외의 혈청형 또는 클레드의 AAV의 캡시드 단백질의 아미노산을, 당업자는 용이하게 특정할 수 있다. 예를 들면, Gao들, 미국과학 아카데미 정기 간행물(Proc. Natl. Acad. Sci. USA.), 제99권, 제18호, 11854-11859쪽, 2002년에 기재되는 VP1의 아미노산 서열 얼라인먼트를 참조할 수 있다. 예를 들면, AAV2의 VP1의 아미노산 번호 588번은 AAV1에서는 589번, AAV7에서는 590번, AAV8에서는 591번이다.
본 발명의 핵산은 적절한 제어서열과 작동 가능하게 연결할 수도 있다. 제어서열에는 프로모터 서열, 폴리아데닐화 시그널, 전사 종결 서열, 상류의 조절 도메인, 복제기점, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 인핸서 등이 포함된다. 프로모터 서열에는 유도성 프로모터 서열, 구성적 프로모터 서열이 포함된다. 제어서열은 캡시드 단백질의 유래가 되는 AAV에 고유한 것일 수도, 외래성의 것일 수도 있고, 천연서열일 수도, 합성 서열일 수도 있다. 이러한, AAV 캡시드 단백질 돌연변이체를 발현 가능한 재조합 DNA도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 재조합 DNA는 인비트로, 생체 외 및 생체 내의 세포에 본 발명의 핵산을 전달하고, 당해 세포에 AAV 캡시드 단백질 돌연변이체를 발현하는 능력을 부여하는데 유용하다. 그리고 본 발명의 핵산이 전달된 세포는 AAV 입자를 제조하는데 유용하다. 당해 재조합 DNA는 특히, 동물세포, 더 바람직하게는 포유류 세포에 본 발명의 핵산을 전달 또는 도입하는데 사용할 수 있다.
본 발명에서는 벡터로서 사용되고 있는 DNA에 본 발명의 핵산을 보유시켜서 본 발명의 재조합 DNA를 제작할 수 있다. 예를 들면, 플라스미드 DNA, 파지 DNA, 트랜스포존, 코스미드 DNA, 에피소말 DNA, 바이러스 게놈을 사용할 수 있다.
(2) 본 발명의 핵산을 포함하는 세포
본 발명은 또, 본 발명의 핵산, 구체적으로는 상기 (1)의 재조합 DNA를 포함하는 숙주세포, 예를 들면 단리된 숙주세포를 제공한다. 단리된 세포는 예를 들면 인 비트로에서 유지되고 있는 세포주이다. 본 발명의 숙주세포는 이하에 설명한 바와 같이 본 발명의 AAV 입자의 제조에 유용하다. 본 발명의 숙주세포가 AAV 입자를 제조하기 위해서 사용되는 경우, 이것은 「패키징 세포」 또는 「프로듀서 세포」라고 부르는 경우가 있다. 본 발명의 숙주세포는 상기 (1)에 기재된 본 발명 재조합 DNA가 게놈에 통합될 수도 있고, AAV 캡시드 단백질 돌연변이체를 일과성으로 발현하도록 상기의 재조합 DNA가 세포 내에 보유되어 있을 수도 있다.
숙주세포로의 본 발명의 재조합 DNA 도입은 공지의 방법에 의해 실시할 수 있다. 예를 들면, 전기천공법, 칼슘인산염 침전법, 세포로의 직접적 미량 주입법, 리포솜 매개형 유전자 도입법, 고속 미립자총을 사용하는 핵산전달법 등을 사용할 수 있다. 또, 바이러스 벡터를 사용하는 경우에는, 당해 벡터에 적합한 감염법을 선택할 수 있다. 이러한 확립된 기술을 사용해서 본 발명의 재조합 DNA는 숙주세포의 염색체에 안정적으로, 또는 숙주세포의 세포질에 일과성으로 도입된다. 안정된 형질전환을 위해서, 선택마커, 예를 들면 네오마이신 내성 유전자(네오마이신 포스포트랜스페라아제를 코딩하고 있다), 하이그로마이신 B 내성 유전자(아미노글리코사이드 포스포트랜스페라아제(APH)를 코딩하고 있다) 등의 주지의 선택 마커를 본 발명의 재조합 DNA에 연결할 수 있다.
숙주세포에는 예를 들면, 마우스 세포, 및 영장류 세포(예를 들면, 인간 세포) 등을 포함하는 포유류 세포, 곤충 세포 등의 다양한 세포를 사용할 수 있다. 적당한 포유류 세포는 초대세포 및 세포주를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니고, 적당한 세포주로서 293 세포, COS 세포, HeLa 세포, Vero 세포, 3T3 마우스 섬유아 세포, C3H10T1/2 섬유아 세포, CHO 세포나 이것들의 세포로부터 파생한 세포 등을 들 수 있다.
(3) 본 발명의 핵산에 코딩되는 아미노산 서열을 함유시킨 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 입자
본 발명의 AAV 입자는 상기 (1)에 기재되는 펩타이드를 함유시킨 AAV 캡시드 단백질 돌연변이체를 포함하는 AAV 입자이다. 본 발명의 AAV 입자는, 상기(2)에 기재되는 숙주세포에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 AAV 입자는 뇌에 지향성을 가지고, 뇌로의 유전자 도입에 유용하다. 뇌에는 신경 세포와 신경교세포(마이크로글리아, 올리고덴드로사이트, 아스트로사이트)등의 뇌세포가 포함된다. 본 발명의 AAV 입자에 의해 도입된 유전자는 상기 조직, 기관 및 세포에서 강하게 발현된다.
AAV 입자는 AAV 입자의 제조에 필요한 몇 가지의 성분을 포함하는 세포를 패키징 세포로서 이용해서 제조할 수 있다. 제1 성분은 숙주세포 내에서 복제 및 AAV 입자에 패키징될 수 있는 재조합 AAV의 벡터 게놈(발현벡터라고도 불린다)이다. 재조합 AAV의 벡터 게놈은 소망하는 이종 폴리뉴클레오티드와, 그 양측에, 즉 5' 및 3'측에 각각 AAV 역방향 말단 반복(ITR) 서열이 위치한다. 소망하는 이종 폴리뉴클레오티드는 그 발현을 위한 제어서열을 가질 수 있다. ITR 서열의 염기서열은 공지이다. 예를 들면, AAV2의 ITR서열에 대해서는 Kotin R. M들, 휴먼 진세러피(gene serape)(Human Gene Therapy), 제5권, 793-801쪽, 1994년을 참조할 수 있다. 또, ITR 서열로서 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7 등, 다양한 AAV혈청형 중 어느 하나에 유래하는 ITR 서열을 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서 사용되는 ITR서열은 야생형 AAV유래의 서열일 수도 있고, 뉴클레오타이드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경되어 있을 수도 있다. ITR 서열은 Rep 단백질의 존재 하에서, 재조합 AAV의 벡터 게놈의 복제를 가능하게 하고, AAV 입자 형성 시에 캡시드 입자 내로의 통합을 가능하게 한다.
본 발명의 AAV 입자에 탑재 가능한 소망하는 이종 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 사이즈가 약 5킬로 베이스(kb) 미만이고, 예를 들면 수용자에 결손한 또는 상실된 소망하는 단백질을 코딩하는 유전자, 소망의 생물학적 또는 치료적 작용(예를 들면, 항균, 항바이러스 또는 항종양 작용)을 가지는 단백질을 코딩하는 유전자, 유해한 또는 바람직하지 않은 단백질의 생산을 저해 또는 저하되는 RNA를 코딩하는 소망의 뉴클레오타이드 서열, 항원성 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 등, 목적에 따라 적당하게 설정할 수 있다.
본 발명에 1형태로서, 재조합 AAV의 벡터 게놈은 cap 유전자 영역 및/또는rep 유전자 영역을 결하고 있고, 이 형태의 재조합 AAV 벡터 게놈이 패키징된 AAV 입자는 감염한 세포 내에서 단독으로 재차 AAV 입자에 복제되지 않는다.
AAV 입자의 제조에 필요한 제2 성분은 야생형 AAV에 코딩되어 있는 단백질을 제공하는 구축물이다. 이 구축물은 AAV 입자의 형성을 위해서 필요한 AAV 유전자 산물을 제공하는 AAV 유래의 유전자를 코딩하고 있다. 즉, 주요한 AAV ORF인 rep 유전자 영역 및 cap 유전자 영역의 코딩영역만 또는 양쪽을 포함한다. 본 발명의 AAV 입자를 제조하기 위해서, 적어도 서열목록의 서열번호 15∼서열번호 62로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 함유시킨 AAV 캡시드 단백질 돌연변이체를 코딩하는 핵산을 cap 유전자로서 사용한다. 이 돌연변이체를 발현하는 능력을 가지고 있는, 상기 (2)에 기재되는 본 발명의 숙주세포를 AAV 입자의 제조에 사용할 수 있다. AAV 입자는 다수의 캡시드 단백질로 구성되는 외각을 가지지만, 모든 캡시드 단백질이 돌연변이체일 수도 있고, 그 일부가 돌연변이체에서 나머지가 야생형의 캡시드 단백질일 수도 있다. 또, 본 발명의 AAV 입자에 포함되는 캡시드 단백질 돌연변이체는 1종류의 돌연변이체일 수도 있고, 복수 종의 돌연변이체일 수도 있다.
AAV의 rep 유전자는 rep 유전자 코딩영역에 포함되고, 복제 단백질 Rep 78, Rep 68, Rep 52 및 Rep 40을 코딩하는 유전자를 포함한다. 이것들의 Rep 발현 산물은 AAV 게놈 DNA 복제기점의 인식, 결합 및 니킹, DNA 헬리카제 활성 및 AAV 유래 프로모터의 전사 변경을 포함하는 많은 기능을 가지는 것이 나타나 있다.
AAV 입자의 제조에 필요한 제3 성분은 AAV 복제를 위한 헬퍼 바이러스 기능(악세사리 기능라고도 불린다)이다. 헬퍼 기능의 도입에는 일반적으로 아데노 바이러스가 사용되지만, 예를 들면 1형 또는 2형 단순 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스 등의 바이러스도 사용할 수 있다. 바이러스를 사용하는 경우에는 숙주세포에 바이러스를 헬퍼 바이러스로서 감염시킨다. 예를 들면, 아데노 바이러스의 초기 유전자 발현만이 AAV 입자의 패키징에 필요하므로, 후기 유전자 발현을 나타내지 않는 아데노 바이러스를 사용할 수도 있다. 후기 유전자 발현을 결손하는 아데노 바이러스 돌연변이체(예를 들면, ts100K 또는 ts149 아데노 바이러스 돌연변이체)를 사용할 수 있다. 혹은, 헬퍼 바이러스로부터 단리한 헬퍼 바이러스 기능에 필요한 핵산을 사용하고, 헬퍼 바이러스 기능을 제공하는 핵산 구축물을 제작해서 숙주세포에 도입할 수 있다. 헬퍼 바이러스 기능을 제공하는 구축물은 1종 또는 복수의 헬퍼 바이러스 기능을 제공하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드 또는 다른 바이러스의 형태로 숙주세포에 제공된다.
AAV 입자를 제조하기 위해서, 상기 (a) 제1 성분인 재조합 AAV의 벡터 게놈을 숙주세포에 도입하는 공정, (b) 제2 성분인 AAV헬퍼 기능을 제공하는 구축물을 숙주세포에 도입하는 공정, (c) 제3 성분인 헬퍼 바이러스 기능을 숙주세포에 도입하는 공정을 실시한다. 이것들의 공정은 동시에 실시될 수도 있고, 차례로 실시될 수도 있다. 공정(a)∼(c)의 순서는 어떤 순서일 수도 있다. 숙주세포에 제1∼제3 성분이 도입되는 것에　의해, rep 유전자의 발현 산물은 재조합 AAV의 벡터 게놈을 절단하고, 복제한다. 발현된 캡시드 단백질은 캡시드를 형성하고, 재조합 AAV의 벡터 게놈이 캡시드에 패키징되어 AAV 입자가 생산된다. 그리고 이 숙주세포가 AAV 캡시드 단백질 돌연변이체를 발현하는 경우, 생산된 AAV 입자의 외각에는 AAV 캡시드 단백질 돌연변이체가 포함되어 있다.
AAV 입자는 숙주세포의 배양 상청이나 그 세포 용해물로 CsCl 밀도구배 원심분리와 같은 여러가지 정제법을 사용해서 AAV 입자를 단리, 정제할 수 있다. 상기 (c)공정에 바이러스가 사용되는 경우, 예를 들면, AAV 입자와 헬퍼 바이러스를, 사이즈에 의거해서 분리하는 공정을 첨가할 수 있다. 또, 헤파린에 대한 친화성의 차이에 의거하여AAV 입자를 헬퍼 바이러스로부터 분리할 수도 있다. 또, 잔존하는 헬퍼 바이러스는 공지의 방법을 사용해서 불활성화할 수 있다. 예를 들면 아데노 바이러스는 약 60℃의 온도에서, 예를 들면 20분간 또는 그 이상 가열하는 것에 의해 불활성화할 수 있다. AAV 입자는 열에 매우 안정적이기 때문에, 이 처치는 헬퍼 바이러스로서 사용한 아데노 바이러스의 선택적 제거에 유효하다.
(4) 본 발명의 유전자 도입세포의 제조방법
상기 (3)에 의해 수득되는 본 발명의 AAV 입자는 유전자 치료나 기타의 목적으로, 소망하는 이종 폴리뉴클레오티드의 세포로의 전달을 위해서 사용된다. 일반적으로 AAV 입자는 인 비보 또는 인 비트로의 어느 하나에서 세포에 도입된다. 인 비트로에서 도입하는 경우, 생체에서 취득된 세포에 AAV 입자를 접촉시키는 것에 의해 도입한다. 이 세포를 생체에 이식할 수도 있다. 세포를 생체에 도입하는 경우에는 약학적 조성물로서 제제화하고, 근육 내, 정맥 내, 피하 및 복강 내 투여 등의 다양한 기술을 이용할 수 있다. 인 비보에서 형질 도입하는 경우에는 AAV 입자를 약학적 조성물로서 제제화하고, 일반적으로 비경구 투여한다(예를 들면, 근육 내, 피하, 종양 내, 경피, 골수강 내 등의 투여경로에 의해 투여한다). AAV 입자를 포함하는 약학적 조성물은 약제로서 허용되는 담체, 및 필요에 따라서 다른 약제, 의약품, 안정화제, 완충액, 담체, 애주번트, 희석액 등을 포함하고 있을 수도 있다.
실시예
이하, 실시예에서 본원 발명을 설명하지만, 본원 발명은 실시예에 의해 특히 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: AAV2 랜덤 펩타이드 플라스미드 라이브러리의 제작
AAV2의 게놈을 탑재한 플라스미드 벡터pAV1(ATCCNumber: 37215)을 범용 숙주(Distribution host)의 Escherichia coli HB101에서 추출했다. 추출한 플라스미드로부터 제한효소 BglII(TAKARA BIO INC.)에 의해 AAV2의 게놈 DNA (약 4.7kb)을 절단했다. 이 게놈 DNA를 pUC118 BamHI/BAP(TAKARA BIO INC.)에 삽입하고, 수득된 플라스미드 DNA를 AAV2WG/pUC118로 했다.
AAV2WG/pUC118을 제한효소 ScaI(TAKARA BIO INC.)로 처리하고, cap 유전자에 1190번째에서 2017번째의 염기를 포함하는 약 0.8kb의 단편을 얻었다. 이 단편을 pUC118 HincII/BAP(TAKARA BIO INC.)에 삽입하고, 수득된 플라스미드 DNA를 Cap-ScaI/pUC118로 했다. 다음에, PCR법을 사용해서 Cap-ScaI/pUC118의 Cap 유전자에 1759번째에서 1761번째의 염기서열 AAC(587N)를 CAG(587Q)로 변환, 1764번째와 1765번째의 염기의 사이에 스페이서로서 GGC, 스터퍼로서 CAAG, 추가로 스페이서로서 GCC의 10염기를 삽입, 1765번째에서 1773번째의 염기 CAA(589Q)GCA(590A)GCT(591A)를 CAG(589Q)GCG(590A)GCC(591A)로 변환, 이라는 일련의 개변을 실시했다(괄호 내의 문자는 아미노산 번호 및 코딩하는 아미노산을 나타낸다). 이것에 의해에 제한효소 SfiI의 인식부위가 2군데와 그 SfiI 인식부위 사이에 끼워진 스페이서, 스터퍼, 스페이서가 삽입되었다. Cap 유전자의 1756번째에서 1773번째의 변환 전후의 염기서열을 도 1에 나타내고, 변환 전의 염기서열을 서열목록의 서열번호 1에, 변환 후의 염기서열을 서열번호 2에 나타낸다. 염기서열을 변환한 후의 플라스미드 DNA를 Cap-ScaI-S4/pUC118로 했다. Cap-ScaI-S4/pUC118의 Cap 유전자 부분을 In-Fusion Cloning을 위해서 PCR법에 의해 증폭하고, 약 0.8kb의 단편을 얻고, 이것을 인서트 DNA로 했다.
AAV2WG/pUC118의 암피실린 내성 유전자 내의 제한효소 ScaI의 인식부위, 및 Rep 유전자 내에 있는 제한효소 SfiI의 인식부위를, PCR법에 의해 염기서열에 돌연변이를 도입하는 것에　의해, 이들 제한효소가 인식하지 않는 서열로 개변했다. ScaI 인식부위에 대해서는 암피실린 내성 유전자의 304번째에서 306번째의 염기서열 GAG(E)를 GAA(E)로 변환했다. 변환 전의 염기서열을 서열번호 3에, 변환 후의 염기서열을 서열번호 4에 나타낸다. SfiI의 인식부위에 대해서는 Rep 유전자에 217번째∼219번째의 염기서열 GCC(A)를 GCA(A)로 변환했다. 변환 전의 염기서열을 서열번호 5에, 변환 후의 염기서열을 서열번호 6에 나타낸다. 이렇게 해서 수득된 플라스미드 DNA를 ScaI(TAKARA BIO INC.)로 처리하고, Cap 유전자의 일부인 약 0.8kb가 결핍한 선상의 벡터를 얻었다. 이것을 In-Fusion Cloning을 위한 선상 벡터로 했다.
다음에, In-Fusion(등록상표) HD Cloning Kit(Clontech사)와 Cloning Enhancer(Clontech사)를 사용해서 상기의 선상 벡터에 인서트 DNA를 삽입하고, 방향성 클로닝을 실시했다. 이렇게 해서 수득된 플라스미드 DNA를 AAV2WG-Cap-ScaI-S4/pUC118Sx로 했다.
7아미노산의 랜덤 펩타이드를 코딩하는 염기서열을 포함하는 올리고 DNA(서열번호 7)을 인공합성에 의해 제작하고, 프라이머(서열번호 8) 및 Klenow Fragment(TAKARA BIO INC.)를 사용해서 37℃에서 3시간 반응시킴으로써 올리고 DNA로부터 더블-스트랜드 DNA를 조제했다. Nucleotide removal kit(Qiagen사)를 사용해서 정제한 더블-스트랜드 DNA를 제한효소 BglI(TAKARA BIO INC.)를 사용해서 소화했다. 이 DNA를 DNA ligation kit<MightyMix>(TAKARA BIO INC.)를 사용해서 SfiI로 소화한 AAV2WG-Cap-ScaI-S4/pUC118Sx에 삽입한 플라스미드를 AAV2WG-RPL/pUC118SX로 하고, AAV2 랜덤 펩타이드 플라스미드 라이브러리로서 사용했다.
실시예 2: AAV2 랜덤 펩타이드 바이러스 라이브러리의 제작
(1) AAV293 세포의 파종
배양한 AAV293세포(Stratagene사)를 회수 후, 10% FBS 및 2mM L-글루탐산 나트륨을 포함하는 DMEM(Sigma Corporation)에서 5×104 세포/㎖가 되도록 현탁했다. 세포배양용 T225㎠ 플라스크(Corining Incorporation)에 AAV293 세포를 포함하는 용액을 40㎖ 첨가하고, 37℃의 CO2 인큐베이터에서 72시간 배양했다.
(2) AAV293 세포로의 플라스미드 도입
실시예 1에서 얻은 AAV2WG-RPL/pUC118Sx 400ng 및 pHELP(cellbiolabs사)를 40㎍씩, 일반적인 칼슘 인산염법을 사용해서 AAV293 세포에 트랜스펙션 했다. 트랜스펙션 6시간 후, 배지를 완전하게 제거하고, 2% FBS 및 2mM L-글루탐산나 트륨을 포함하는 DMEM 40㎖를 첨가하고, 37℃의 CO2 인큐베이터에서 48시간 배양했다.
(3) AAV2 랜덤 펩타이드 바이러스 라이브러리의 회수
배양 중의 T225㎠ 플라스크에, 0.5M EDTA를 0.5㎖ 첨가해서 수분 간 정치했다. 그 후에 피펫팅으로 AAV293 세포를 박리시켜서 50㎖ 튜브에 회수하고, 300×g, 10분간 원심 후, 상청액을 제거했다. 플라스크 1장당 2㎖의 TBS(트리스 완충 생리식염수)에 세포를 재현탁 후, 에탄올/드라이아이스로 15분간, 37℃의 워터배스에서 15분간, 볼텍스 1분간의 일련의 처리를 3회 반복하고, AAV-랜덤 펩타이드 바이러스 라이브러리를 포함하는 세포 파쇄액을 회수했다. 이 용액에, TBS 1㎖당, 1M MgCl2를 5㎕, Benzonase(등록상표) 뉴클레아제(MERCK LTD.)를 최종농도 200U/㎖가 되도록 첨가하고, 37℃에 30분간 반응시켰다. 그 후에 0.5M EDTA를 TBS 1㎖당 6.5㎕첨가해서 반응을 정지시켰다. 이 세포 파쇄액을 10000rpm, 4℃, 10분간 원심 후, 상청액을 회수하고 AAV벡터 용액으로 했다.
(4) AAV벡터 용액의 PCR에 의한 역가 정량
AAV벡터 용액 2㎕에, 10×DNaseI 버퍼 2㎕, 주사용수(Otsuka Pharmaceutical co., Ltd.) 15.2㎕, DNaseI(TAKARA BIO INC.) 0.8㎕를 첨가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이션하고, 유리된 게놈 DNA나 플라스미드 DNA를 제거했다. DNaseI를 불활성화 하기 위해서 99℃, 10분간의 열처리 후, 주사용수 15㎕, 10×ProK 버퍼 [0.1M Tris-HCl(pH7.8), 0.1M EDTA, 5% SDS] 4㎕, Proteinase K(TAKARA BIO INC.) 1㎕를 첨가하고, 55℃에서 1시간 인큐베이션했다. 그 후에 Proteinase K를 불활성화 하기 위해서 95℃ 10분간 처리했다. 이 샘플에 대하여, SYBR(등록상표) Premix ExTaq2(TAKARA BIO INC.) 및 프라이머(서열번호 9 및 서열번호 10)를 사용해서 키트에 첨부된 설명서에 따라서 AAV의 역가 정량을 실시했다. 또 샘플은 주사용수ㅗ 50배 희석한 용액을 2㎕ 사용했다. 또, 표준품으로서 pAV1을 제한효소로 소화하고, 선상화한 DNA를 사용했다.
실시예 3: AAV2 랜덤 펩타이드 바이러스 라이브러리의 정제
(1) 염화세슘 밀도구배 원심분리에 의한 정제1
초원심용 40PA 튜브(HITACHI-KOKI사)에, 바닥으로부터 비중 1.5로 조제한 염화 세슘 용액을 4㎖, 비중 1.25로 조제한 염화 세슘 용액을 4㎖, 실시예 2-(4)에서 조제한 AAV벡터 용액을 28㎖의 차례로 중층하고, 초원심기 HIMAC(HITACHI-KOKI사)로 25000rpm, 16℃, 3시간 원심했다. 원심 후, 위에서부터 28㎖의 용액을 제외하고, 계속해서 위에서부터 0.7㎖씩 용액을 채취해서 1.5㎖ 튜브에 각각 회수했다. 실시예 2-(4)와 동일한 방법으로, 각 회수액에 포함되는 AAV 입자의 역가를 정량했다.
(2) 염화 세슘 밀도구배 원심분리에 의한 정제2
실시예 3-(1)에서 역가가 높았던 몇 프랙션에, 비중 1.39로 조제한 염화 세슘 용액을 첨가하고, 10.5㎖로 필업했다. 이 용액을 초원심용 13PA 튜브(HITACHI-KOKI사)에 첨가하고, 초원심기로 38000rpm, 18℃, 16시간 원심했다. 원심 후, 튜브의 위에서부터 순차적으로 0.7㎖씩 채취해서 내용액을 회수했다. 각 회수액의 AAV 입자의 역가를 실시예 2-(4)와 동일한 방법으로 정량했다.
(3) 투석에 의한 탈염
실시예 3-(2)에서 역가가 높았던 몇 프랙션을 혼합하고, Slide-A-lyzer 투석 카세트(Pierce사)에 첨가했다. 인산 완충 생리식염수(PBS) 1ℓ에 의해 4℃에서 3시간의 투석을 2회, PBS/5% 솔비톨 용액 500㎖에 의해 4℃에서 하룻밤 투석을 실시함으로써 정제 AAV용액의 탈염을 실시했다. 그 후에 용액을 회수하고, 0.22㎛ 필터(Millipore사)로 멸균 후, 사용할 때까지 -80℃로 보존했다. 또 별도, 정제 AAV 입자의 역가를 실시예 2-(4)와 동일한 방법으로 정량했다.
실시예 4: AAV2 랜덤 펩타이드 라이브러리의 스크리닝
(1) 마우스로의 미정맥 투여
실시예 3-(3)에서 수득된 정제 AAV 입자를, 1.5×1014 바이러스 게놈(VG)/kg이 되도록, BALB/c 마우스의 미정맥으로부터 투여했다. 투여 72시간 후에 뇌를 회수하고, NucleoSpin(등록상표) tissue(MACHEREY-NAGEL GmbH and Co. KG.)를 사용해서 게놈 DNA를 추출했다(라운드 1).
(2) PCR에 의한 랜덤 펩타이드 서열의 리클로닝(recloning)
실시예 4-(1)에서 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고, PrimeSTAR(등록상표)GXL DN Apolymerase(TAKARA BIO INC.)를 사용해서 랜덤 펩타이드 서열을 코딩하는 DNA를 증폭했다. 프라이머는 포워드 프라이머 1(서열번호 11) 및 리버스 프라이머 1(서열번호 12)을 사용했다. PCR을 98℃ 10초, 55℃ 15초, 68도 40초를 1사이클로 해서 30사이클 반복했다. 계속해서, 이 반응액에 1/25량을 사용해서 포워드 프라이머 2(서열번호 13) 및 리버스 프라이머 2(서열번호 14)를 사용해서 동량의 반응액을 조제했다. PCR을 98℃ 10초, 55℃ 15초, 68 ℃15초를 1사이클로 해서 30사이클 실시했다. 이 반응액으로부터 Nucleospin extract II(MACHEREY-NAGEL GmbH and Co. KG.)를 사용해서 DNA를 정제하고, 제한효소 BglI를 사용해서 절단했다. 전기영동 후, Nucleospin extract II를 사용해서 정제하고, DNAligationkit<MightyMix>을 사용해서 실시예 1에서 조제한 AAV2WG-Cap-ScaI-S4/pUC118Sx로 리클로닝(recloning)했다.
(3) AAV2 랜덤 펩타이드 바이러스 라이브러리의 제조와 정제
실시예 4-(2)에서 얻은 플라스미드를 사용하고, 실시예 2 및 실시예 3와 동일한 방법으로 AAV2 랜덤 펩타이드 바이러스 라이브러리의 제조와 AAV 입자의 정제를 실시했다.
(4) 스크리닝
실시예 4-(1)과 동일한 방법으로 스크리닝(마우스로의 AAV 입자의 투여와 뇌의 회수)을 실시하고, 게놈 DNA를 추출했다(라운드 2). 또, 추출한 게놈 DNA를 사용하여, 재차 리크리닝, 라이브러리 제조와 정제 및 스크리닝을 실시하고 게놈 DNA를 추출했다(라운드 3).
(5) 랜덤 펩타이드의 시퀀싱
각 스크리닝 단계(라운드1∼라운드 3)의 AAV랜덤 펩타이드 플라스미드 라이브러리의 시퀀싱을 실시했다. 그 중 라운드 2 및 라운드 3에 뇌에 집적한 클론이 코딩하는 펩타이드 서열과 출현 회수를 표 1 및 표 2에 나타낸다.
Figure pct00001
Figure pct00002
표1 및 표 2에 나타내는 바와 같이, 특정 펩타이드 서열을 함유하는 캡시드를 가지는 AAV가 뇌에 집적하고 있는 것을 알았다. 그 중에서도, 라운드 3에서 확인된 서열인 GSGVTWV(서열번호 15), AHGYREP(서열번호 16), EYGFREG(서열번호 17), 및 ETGHGWV(서열번호 18)는 뇌에 감염되기 쉬운 서열인 것이 시사되었다.
또, 라운드 2에서 확인된 서열과 스페이서를 포함하는 서열인, 서열번호 63∼서열번호 110이 뇌에 감염되기 쉬운 서열인 것이 시사되었다. 특히, 라운드 3에서 확인된 서열과 스페이서를 포함하는 서열인, GGSGVTWVA(서열번호 63), GAHGYREPA(서열번호 64), GEYGFREGA(서열번호 65),및 GETGHGWVA(서열번호 66)가 뇌에 감염되기 쉬운 서열인 것이 시사되었다.
실시예 5: 취득 펩타이드 서열을 가지는 AAV벡터의 지향성 평가
(1) 취득 펩타이드 서열을 가지는 pRC 헬퍼 플라스미드의 구축
실시예 4-(5)에서 수득된 펩타이드 서열(서열번호 15∼20)을 가지는 AAV2WG-Cap-ScaI-S4/pUC118Sx 클론을 제한효소 SnaBI(TAKARA BIO INC.) 및 HindIII(TAKARA BIO INC.)로 소화시켜서 얻은 단편과, pAAVRC2 벡터(CELL BIOLABS사)를 SnaBI 및 HindIII로 소화시키고 얻은 벡터 단편을, DN Aligation kit<MightyMix>(TAKARA BIO INC.)를 사용해서 연결하고, 헬퍼 플라스미드 pRC-GSGVTWV, pRC-AHGYREP, pRC-EYGFREG, pRC-ETGHGWV, pRC-GGGIGYV, 및 pRC-ERGVGWV를 얻었다.
(2) AAV2-LacZ 캡시드 돌연변이체의 제조와 정제
pAAV-LacZ(TAKARA BIO INC.), pHELP 및 실시예 5-(1)에서 조제한 pRC 헬퍼 플라스미드(pRC-GSGVTWV, pRC-AHGYREP, pRC-EYGFREG, pRC-ETGHGWV, pRC-GGGIGYV, 또는 pRC-ERGVGWV)를, PEIpro(Polyplus사)를 사용해서 T225㎠ 플라스크에 파종해 둔 293T 세포에 트랜스펙션했다. 또, 펩타이드 서열을 가지는 pR C헬퍼 플라스미드의 대신에 야생형 캡시드를 탑재한 pRC2 벡터를 트랜스펙션하고, 대조로 했다. 트랜스펙션된 293T 세포를, 37℃의 CO2 인큐베이터에서 72시간 배양했다. T225㎠ 플라스크로부터 AAV를 포함하는 상청액을 회수하고, AVB 세파로오스(GE healthcare사)을 사용해서 AAV를 어피니티 정제했다. 그 후에 한외 여과에 의해 AAV를 농축 정제함으로써AAV 정제 용액을 조제했다. 그 후에 실시예 2-(4)에 나타낸 방법으로 AAV벡터의 역가를 정량했다.
(3) AAV 정제 용액의 마우스로의 투여
실시예 5-(2)에서 얻은 AAV정제 용액을 0.22㎛ 필터 여과를 실시한 후에, 마우스 한마리당 0.5×1011 VG/마우스가 되도록, 마우스 미정맥으로부터 투여했다.
(4) 뇌 및 기타 조직으로부터의 게놈 DNA 조제 및 AAV 게놈의 정량
실시예 5-(3)에서 AAV를 투여한 마우스를, 4주일 후에 안락사시키고 각 조직을 회수했다. NucleoSpin tissue(MACHEREY-NAGEL GmbH and Co. KG.)를 사용해서 각 조직으로부터 게놈 DNA를 추출했다. 추출한 게놈 DNA를 샘플로 해서 리얼타임 PCR을 실시하고, 각 조직 중에 포함되는 AAV벡터 게놈량을 정량했다. 각 조직 중의 체 게놈 DNA 1㎍당의 AAV 게놈 DNA의 분자수를 도 2에 나타낸다.
도 2에서, GSGVTWV, AHGYREP, EYGFREG, ETGHGWV, GGGIGYV 및 ERGVGWV의 펩타이드 서열을 가지는 캡시드의 AAV벡터는 뇌로 이행되기기 쉬운 것이 나타났다. 또, 뇌 뿐만 아니라, 폐로의 지향성도 나타내는 AAV벡터도 있었다.
(산업상 이용가능성)
본 발명에 의해, 전신 투여에 의해 뇌에 지향성을 가지는 AAV 캡시드 단백질 돌연변이체, 혹은 아미노산 서열을 제공되어, 뇌에 효율적으로 유전자를 도입하는 방법이 제공된다.
서열목록 프리텍스트
SEQ ID NO:1: AAV2 capsid 586-591 coding sequence
SEQ ID NO:2: Converted AAV2 capsid coding sequence
SEQ ID NO:3: Ampicillin resistance gene before conversion
SEQ ID NO:4: Ampicillin resistance gene after conversion
SEQ ID NO:5: AAV2 rep gene before conversion
SEQ ID NO:6: AAV2 rep gene after conversion
SEQ ID NO:7: DNA sequence coding random peptide
SEQ ID NO:8: Primer for synthesizing double strand DNA
SEQ ID NO:9: Forward primer for quantitation of AAV titer
SEQ ID NO:10: Reverse primer for quantitation of AAV titer
SEQ ID NO:11: Forward primer1 for amplification of random peptide coding region
SEQ ID NO:12: Reverse primer1 for amplification of random peptide coding region
SEQ ID NO:13: Forward primer2 for amplification of random peptide coding region
SEQ ID NO:14: Reverse primer2 for amplification of random peptide coding region
SEQ ID NO:15: Peptide sequence GSGVTWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:16: Peptide sequence AHGYREP for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:17: Peptide sequence EYGFREG for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:18: Peptide sequence ETGHGWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:19: Peptide sequence GGGIGYV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:20: Peptide sequence ERGVGWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:21: Peptide sequence ENGVGWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:22: Peptide sequence GSGVGWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:23: Peptide sequence ADGITWG for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:24: Peptide sequence ADGTRWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:25: Peptide sequence ADKVGWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:26: Peptide sequence AGGVGWT for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:27: Peptide sequence AGGVTGV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:28: Peptide sequence AGNAGGM for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:29: Peptide sequence AGQLGWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:30: Peptide sequence ARGTEWE for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:31: Peptide sequence DAGHGFV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:32: Peptide sequence EANVGWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:33: Peptide sequence ECGLGEG for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:34: Peptide sequence EGEVTWL for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:35: Peptide sequence EGGDGRV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:36: Peptide sequence EGGFGEA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:37: Peptide sequence EGGG for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:38: Peptide sequence EGGMVWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:39: Peptide sequence EGGVGWT for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:40: Peptide sequence EGGVMWL for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:41: Peptide sequence EGQVTWL for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:42: Peptide sequence ERGHGWG for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:43: Peptide sequence ESGVGWK for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:44: Peptide sequence GDGFGGV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:45: Peptide sequence GDGVTWA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:46: Peptide sequence GEGRGWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:47: Peptide sequence GGGDGWI for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:48: Peptide sequence GGGDSWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:49: Peptide sequence GGGIAWVAQAAL for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:50: Peptide sequence GGGVGWA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:51: Peptide sequence GKGQVME for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:52: Peptide sequence GNGTGGG for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:53: Peptide sequence GQGGHME for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:54: Peptide sequence GRGVTWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:55: Peptide sequence GSGMGWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:56: Peptide sequence GVGGGVV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:57: Peptide sequence NDVRGRV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:58: Peptide sequence RDGLGFV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:59: Peptide sequence TDGLGWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:60: Peptide sequence TEGHGWV for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:61: Peptide sequence VAERLYG for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:62: Peptide sequence VARGAGE for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:63: Peptide sequence GGSGVTWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:64: Peptide sequence GAHGYREPA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:65: Peptide sequence GEYGFREGA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:66: Peptide sequence GETGHGWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:67: Peptide sequence GGGGIGYVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:68: Peptide sequence GERGVGWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:69: Peptide sequence GENGVGWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:70: Peptide sequence GGSGVGWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:71: Peptide sequence GADGITWGA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:72: Peptide sequence GADGTRWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:73: Peptide sequence GADKVGWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:74: Peptide sequence GAGGVGWTA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:75: Peptide sequence GAGGVTGVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:76: Peptide sequence GAGNAGGMA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:77: Peptide sequence GAGQLGWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:78: Peptide sequence GARGTEWEA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:79: Peptide sequence GDAGHGFVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:80: Peptide sequence GEANVGWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:81: Peptide sequence GECGLGEGA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:82: Peptide sequence GEGEVTWLA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:83: Peptide sequence GEGGDGRVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:84: Peptide sequence GEGGFGEAA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:85: Peptide sequence GEGGGA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:86: Peptide sequence GEGGMVWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:87: Peptide sequence GEGGVGWTA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:88: Peptide sequence GEGGVMWLA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:89: Peptide sequence GEGQVTWLA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:90: Peptide sequence GERGHGWGA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:91: Peptide sequence GESGVGWKA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:92: Peptide sequence GGDGFGGVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:93: Peptide sequence GGDGVTWAA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:94: Peptide sequence GGEGRGWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:95: Peptide sequence GGGGDGWIA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:96: Peptide sequence GGGGDSWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:97: Peptide sequence GGGGIAWVAQAALA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:98: Peptide sequence GGGGVGWAA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:99: Peptide sequence GGKGQVMEA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:100: Peptide sequence GGNGTGGGA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:101: Peptide sequence GGQGGHMEA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:102: Peptide sequence GGRGVTWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:103: Peptide sequence GGSGMGWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:104: Peptide sequence GGVGGGVVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:105: Peptide sequence GNDVRGRVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:106: Peptide sequence GRDGLGFVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:107: Peptide sequence GTDGLGWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:108: Peptide sequence GTEGHGWVA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:109: Peptide sequence GVAERLYGA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:110: Peptide sequence GVARGAGEA for AAV capsid protein mutant
SEQ ID NO:111: Peptide sequence represented by Formula I
SEQ ID NO:112: Peptide sequence represented by Formula II
SEQ ID NO:113: Peptide sequence represented by Formula III
SEQ ID NO:114: Peptide sequence represented by Formula IV
SEQ ID NO:115: Peptide sequence represented by Formula V
SEQ ID NO:116: Peptide sequence represented by Formula VI
SEQUENCE LISTING <110> TAKARA BIO INC. <120> Adeno-associated virus mutant having tropism for brain <130> 675522 <150> JP2019-82417 <151> 2019-04-24 <160> 116 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2 capsid 586-591 coding sequence <400> 1 gccaacagac aagcagct 18 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Converted AAV2 capsid coding sequence <400> 2 ggccagagag gccaaggccc aggcggcc 28 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ampicillin resistance gene before conversion <400> 3 tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaag 45 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ampicillin resistance gene after conversion <400> 4 tattctcaga atgacttggt tgaatactca ccagtcacag aaaag 45 <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2 rep gene before conversion <400> 5 gaatggcgcc gtgtgagtaa ggccccggag gcccttttct ttgtg 45 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2 rep gene after conversion <400> 6 gaatggcgcc gtgtgagtaa ggccccggag gcccttttct ttgtg 45 <210> 7 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence coding random peptide <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (27)..(28) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (30)..(31) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (33)..(34) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (36)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 7 cagtcggcca gagaggcnnk nnknnknnkn nknnknnkgc ccaggcggct gacgag 56 <210> 8 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for synthesizing double strand DNA <400> 8 ctcgtcagcc gcctgg 16 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for quantitation of AAV titer <400> 9 atcatatgcc aagtacgccc 20 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for quantitation of AAV titer <400> 10 ccaaaaccgc atcaccatg 19 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer1 for amplification of random peptide coding region <400> 11 ccaaaaccgc atcaccatg 19 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer1 for amplification of random peptide coding region <400> 12 ctgtcccgtg gagtactgtg tg 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer2 for amplification of random peptide coding region <400> 13 ctgtcccgtg gagtactgtg tg 22 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer2 for amplification of random peptide coding region <400> 14 gcccctgaag gtacacatct ctg 23 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GSGVTWV for AAV capsid protein mutant <400> 15 Gly Ser Gly Val Thr Trp Val 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence AHGYREP for AAV capsid protein mutant <400> 16 Ala His Gly Tyr Arg Glu Pro 1 5 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence EYGFREG for AAV capsid protein mutant <400> 17 Glu Tyr Gly Phe Arg Glu Gly 1 5 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence ETGHGWV for AAV capsid protein mutant <400> 18 Glu Thr Gly His Gly Trp Val 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GGGIGYV for AAV capsid protein mutant <400> 19 Gly Gly Gly Ile Gly Tyr Val 1 5 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence ERGVGWV for AAV capsid protein mutant <400> 20 Glu Arg Gly Val Gly Trp Val 1 5 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence ENGVGWV for AAV capsid protein mutant <400> 21 Glu Asn Gly Val Gly Trp Val 1 5 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GSGVGWV for AAV capsid protein mutant <400> 22 Gly Ser Gly Val Gly Trp Val 1 5 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence ADGITWG for AAV capsid protein mutant <400> 23 Ala Asp Gly Ile Thr Trp Gly 1 5 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence ADGTRWV for AAV capsid protein mutant <400> 24 Ala Asp Gly Thr Arg Trp Val 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence ADKVGWV for AAV capsid protein mutant <400> 25 Ala Asp Lys Val Gly Trp Val 1 5 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence AGGVGWT for AAV capsid protein mutant <400> 26 Ala Gly Gly Val Gly Trp Thr 1 5 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence AGGVTGV for AAV capsid protein mutant <400> 27 Ala Gly Gly Val Thr Gly Val 1 5 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence AGNAGGM for AAV capsid protein mutant <400> 28 Ala Gly Asn Ala Gly Gly Met 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence AGQLGWV for AAV capsid protein mutant <400> 29 Ala Gly Gln Leu Gly Trp Val 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence ARGTEWE for AAV capsid protein mutant <400> 30 Ala Arg Gly Thr Glu Trp Glu 1 5 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence DAGHGFV for AAV capsid protein mutant <400> 31 Asp Ala Gly His Gly Phe Val 1 5 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence EANVGWV for AAV capsid protein mutant <400> 32 Glu Ala Asn Val Gly Trp Val 1 5 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence ECGLGEG for AAV capsid protein mutant <400> 33 Glu Cys Gly Leu Gly Glu Gly 1 5 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence EGEVTWL for AAV capsid protein mutant <400> 34 Glu Gly Glu Val Thr Trp Leu 1 5 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence EGGDGRV for AAV capsid protein mutant <400> 35 Glu Gly Gly Asp Gly Arg Val 1 5 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence EGGFGEA for AAV capsid protein mutant <400> 36 Glu Gly Gly Phe Gly Glu Ala 1 5 <210> 37 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence EGGG for AAV capsid protein mutant <400> 37 Glu Gly Gly Gly 1 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence EGGMVWV for AAV capsid protein mutant <400> 38 Glu Gly Gly Met Val Trp Val 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence EGGVGWT for AAV capsid protein mutant <400> 39 Glu Gly Gly Val Gly Trp Thr 1 5 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence EGGVMWL for AAV capsid protein mutant <400> 40 Glu Gly Gly Val Met Trp Leu 1 5 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence EGQVTWL for AAV capsid protein mutant <400> 41 Glu Gly Gln Val Thr Trp Leu 1 5 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence ERGHGWG for AAV capsid protein mutant <400> 42 Glu Arg Gly His Gly Trp Gly 1 5 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence ESGVGWK for AAV capsid protein mutant <400> 43 Glu Ser Gly Val Gly Trp Lys 1 5 <210> 44 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GDGFGGV for AAV capsid protein mutant <400> 44 Gly Asp Gly Phe Gly Gly Val 1 5 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GDGVTWA for AAV capsid protein mutant <400> 45 Gly Asp Gly Val Thr Trp Ala 1 5 <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GEGRGWV for AAV capsid protein mutant <400> 46 Gly Glu Gly Arg Gly Trp Val 1 5 <210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GGGDGWI for AAV capsid protein mutant <400> 47 Gly Gly Gly Asp Gly Trp Ile 1 5 <210> 48 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GGGDSWV for AAV capsid protein mutant <400> 48 Gly Gly Gly Asp Ser Trp Val 1 5 <210> 49 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GGGIAWVAQAAL for AAV capsid protein mutant <400> 49 Gly Gly Gly Ile Ala Trp Val Ala Gln Ala Ala Leu 1 5 10 <210> 50 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GGGVGWA for AAV capsid protein mutant <400> 50 Gly Gly Gly Val Gly Trp Ala 1 5 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GKGQVME for AAV capsid protein mutant <400> 51 Gly Lys Gly Gln Val Met Glu 1 5 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GNGTGGG for AAV capsid protein mutant <400> 52 Gly Asn Gly Thr Gly Gly Gly 1 5 <210> 53 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GQGGHME for AAV capsid protein mutant <400> 53 Gly Gln Gly Gly His Met Glu 1 5 <210> 54 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GRGVTWV for AAV capsid protein mutant <400> 54 Gly Arg Gly Val Thr Trp Val 1 5 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GSGMGWV for AAV capsid protein mutant <400> 55 Gly Ser Gly Met Gly Trp Val 1 5 <210> 56 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GVGGGVV for AAV capsid protein mutant <400> 56 Gly Val Gly Gly Gly Val Val 1 5 <210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence NDVRGRV for AAV capsid protein mutant <400> 57 Asn Asp Val Arg Gly Arg Val 1 5 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence RDGLGFV for AAV capsid protein mutant <400> 58 Arg Asp Gly Leu Gly Phe Val 1 5 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence TDGLGWV for AAV capsid protein mutant <400> 59 Thr Asp Gly Leu Gly Trp Val 1 5 <210> 60 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence TEGHGWV for AAV capsid protein mutant <400> 60 Thr Glu Gly His Gly Trp Val 1 5 <210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence VAERLYG for AAV capsid protein mutant <400> 61 Val Ala Glu Arg Leu Tyr Gly 1 5 <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence VARGAGE for AAV capsid protein mutant <400> 62 Val Ala Arg Gly Ala Gly Glu 1 5 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GGSGVTWVA for AAV capsid protein mutant <400> 63 Gly Gly Ser Gly Val Thr Trp Val Ala 1 5 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GAHGYREPA for AAV capsid protein mutant <400> 64 Gly Ala His Gly Tyr Arg Glu Pro Ala 1 5 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GEYGFREGA for AAV capsid protein mutant <400> 65 Gly Glu Tyr Gly Phe Arg Glu Gly Ala 1 5 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GETGHGWVA for AAV capsid protein mutant <400> 66 Gly Glu Thr Gly His Gly Trp Val Ala 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GGGGIGYVA for AAV capsid protein mutant <400> 67 Gly Gly Gly Gly Ile Gly Tyr Val Ala 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GERGVGWVA for AAV capsid protein mutant <400> 68 Gly Glu Arg Gly Val Gly Trp Val Ala 1 5 <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GENGVGWVA for AAV capsid protein mutant <400> 69 Gly Glu Asn Gly Val Gly Trp Val Ala 1 5 <210> 70 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GGSGVGWVA for AAV capsid protein mutant <400> 70 Gly Gly Ser Gly Val Gly Trp Val Ala 1 5 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GADGITWGA for AAV capsid protein mutant <400> 71 Gly Ala Asp Gly Ile Thr Trp Gly Ala 1 5 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GADGTRWVA for AAV capsid protein mutant <400> 72 Gly Ala Asp Gly Thr Arg Trp Val Ala 1 5 <210> 73 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GADKVGWVA for AAV capsid protein mutant <400> 73 Gly Ala Asp Lys Val Gly Trp Val Ala 1 5 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GAGGVGWTA for AAV capsid protein mutant <400> 74 Gly Ala Gly Gly Val Gly Trp Thr Ala 1 5 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GAGGVTGVA for AAV capsid protein mutant <400> 75 Gly Ala Gly Gly Val Thr Gly Val Ala 1 5 <210> 76 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GAGNAGGMA for AAV capsid protein mutant <400> 76 Gly Ala Gly Asn Ala Gly Gly Met Ala 1 5 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GAGQLGWVA for AAV capsid protein mutant <400> 77 Gly Ala Gly Gln Leu Gly Trp Val Ala 1 5 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GARGTEWEA for AAV capsid protein mutant <400> 78 Gly Ala Arg Gly Thr Glu Trp Glu Ala 1 5 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GDAGHGFVA for AAV capsid protein mutant <400> 79 Gly Asp Ala Gly His Gly Phe Val Ala 1 5 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GEANVGWVA for AAV capsid protein mutant <400> 80 Gly Glu Ala Asn Val Gly Trp Val Ala 1 5 <210> 81 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GECGLGEGA for AAV capsid protein mutant <400> 81 Gly Glu Cys Gly Leu Gly Glu Gly Ala 1 5 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GEGEVTWLA for AAV capsid protein mutant <400> 82 Gly Glu Gly Glu Val Thr Trp Leu Ala 1 5 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GEGGDGRVA for AAV capsid protein mutant <400> 83 Gly Glu Gly Gly Asp Gly Arg Val Ala 1 5 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GEGGFGEAA for AAV capsid protein mutant <400> 84 Gly Glu Gly Gly Phe Gly Glu Ala Ala 1 5 <210> 85 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GEGGGA for AAV capsid protein mutant <400> 85 Gly Glu Gly Gly Gly Ala 1 5 <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GEGGMVWVA for AAV capsid protein mutant <400> 86 Gly Glu Gly Gly Met Val Trp Val Ala 1 5 <210> 87 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GEGGVGWTA for AAV capsid protein mutant <400> 87 Gly Glu Gly Gly Val Gly Trp Thr Ala 1 5 <210> 88 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GEGGVMWLA for AAV capsid protein mutant <400> 88 Gly Glu Gly Gly Val Met Trp Leu Ala 1 5 <210> 89 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GEGQVTWLA for AAV capsid protein mutant <400> 89 Gly Glu Gly Gln Val Thr Trp Leu Ala 1 5 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GERGHGWGA for AAV capsid protein mutant <400> 90 Gly Glu Arg Gly His Gly Trp Gly Ala 1 5 <210> 91 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GESGVGWKA for AAV capsid protein mutant <400> 91 Gly Glu Ser Gly Val Gly Trp Lys Ala 1 5 <210> 92 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GGDGFGGVA for AAV capsid protein mutant <400> 92 Gly Gly Asp Gly Phe Gly Gly Val Ala 1 5 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GGDGVTWAA for AAV capsid protein mutant <400> 93 Gly Gly Asp Gly Val Thr Trp Ala Ala 1 5 <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GGEGRGWVA for AAV capsid protein mutant <400> 94 Gly Gly Glu Gly Arg Gly Trp Val Ala 1 5 <210> 95 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GGGGDGWIA for AAV capsid protein mutant <400> 95 Gly Gly Gly Gly Asp Gly Trp Ile Ala 1 5 <210> 96 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GGGGDSWVA for AAV capsid protein mutant <400> 96 Gly Gly Gly Gly Asp Ser Trp Val Ala 1 5 <210> 97 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GGGGIAWVAQAALA for AAV capsid protein mutant <400> 97 Gly Gly Gly Gly Ile Ala Trp Val Ala Gln Ala Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 98 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GGGGVGWAA for AAV capsid protein mutant <400> 98 Gly Gly Gly Gly Val Gly Trp Ala Ala 1 5 <210> 99 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GGKGQVMEA for AAV capsid protein mutant <400> 99 Gly Gly Lys Gly Gln Val Met Glu Ala 1 5 <210> 100 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GGNGTGGGA for AAV capsid protein mutant <400> 100 Gly Gly Asn Gly Thr Gly Gly Gly Ala 1 5 <210> 101 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GGQGGHMEA for AAV capsid protein mutant <400> 101 Gly Gly Gln Gly Gly His Met Glu Ala 1 5 <210> 102 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GGRGVTWVA for AAV capsid protein mutant <400> 102 Gly Gly Arg Gly Val Thr Trp Val Ala 1 5 <210> 103 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GGSGMGWVA for AAV capsid protein mutant <400> 103 Gly Gly Ser Gly Met Gly Trp Val Ala 1 5 <210> 104 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GGVGGGVVA for AAV capsid protein mutant <400> 104 Gly Gly Val Gly Gly Gly Val Val Ala 1 5 <210> 105 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GNDVRGRVA for AAV capsid protein mutant <400> 105 Gly Asn Asp Val Arg Gly Arg Val Ala 1 5 <210> 106 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GRDGLGFVA for AAV capsid protein mutant <400> 106 Gly Arg Asp Gly Leu Gly Phe Val Ala 1 5 <210> 107 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GTDGLGWVA for AAV capsid protein mutant <400> 107 Gly Thr Asp Gly Leu Gly Trp Val Ala 1 5 <210> 108 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GTEGHGWVA for AAV capsid protein mutant <400> 108 Gly Thr Glu Gly His Gly Trp Val Ala 1 5 <210> 109 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GVAERLYGA for AAV capsid protein mutant <400> 109 Gly Val Ala Glu Arg Leu Tyr Gly Ala 1 5 <210> 110 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence GVARGAGEA for AAV capsid protein mutant <400> 110 Gly Val Ala Arg Gly Ala Gly Glu Ala 1 5 <210> 111 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence represented by Formula I <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Any amino acid <400> 111 Xaa Xaa Gly Xaa Gly Trp Val 1 5 <210> 112 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence represented by Formula II <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Any amino acid <400> 112 Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Trp Val 1 5 <210> 113 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence represented by Formula III <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Any amino acid <400> 113 Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Trp Val 1 5 <210> 114 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence represented by Formula IV <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Any amino acid <400> 114 Xaa Xaa Gly Xaa Gly Xaa Val 1 5 <210> 115 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence represented by Formula V <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Any amino acid <400> 115 Xaa Xaa Gly Xaa Gly Trp Xaa 1 5 <210> 116 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence represented by Formula VI <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Any amino acid <400> 116 Xaa Xaa Gly Xaa Arg Glu Xaa 1 5

Claims (11)

  1. 서열번호 15∼서열번호 62로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 혹은 서열번호 15∼서열번호 62로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 함유시킨 아데노 관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질 돌연변이체를 코딩하는 핵산.
  2. 제1 항에 있어서,
    AAV 캡시드 단백질이 AAV2 유래인 핵산.
  3. 제2 항에 있어서,
    AAV2의 VP1의 아미노산 번호 588번과 아미노산 번호 589번 사이의 위치에 상기 펩타이드를 함유시킨 핵산.
  4. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 기재된 핵산을 포함하는 재조합 DNA.
  5. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 또는 제4 항에 기재된 재조합 DNA를 포함하는 세포.
  6. 서열번호 15∼서열번호 62로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 혹은 서열번호 15∼서열번호 62로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 함유시킨 AAV 캡시드 단백질 돌연변이체를 포함하는 AAV 입자.
  7. 제6 항에 있어서,
    AAV 캡시드 단백질이 AAV2 유래인 AAV 입자.
  8. 제7 항에 있어서,
    AAV2의 VP1의 아미노산 번호 588번과 아미노산 번호 589번 사이의 위치에 상기 펩타이드를 함유시킨 AAV 입자.
  9. 서열번호 15∼서열번호 62로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 혹은 서열번호 15∼서열번호 62로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 함유시킨 AAV 캡시드 단백질 돌연변이체를 포함하는 AAV 입자를 세포에 접촉시키는 공정을 포함하는, 유전자 도입세포의 제조방법.
  10. 제9 항에 있어서,
    AAV 캡시드 단백질이 AAV2 유래인 방법.
  11. 제10 항에 있어서,
    AAV2의 VP1의 아미노산 번호 588번과 아미노산 번호 589번 사이의 위치에 상기 펩타이드를 함유시킨 방법.
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