ES2856076T3 - Proteínas de unión a calicreína plasmática y usos de las mismas en el tratamiento de angioedema hereditario - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que se une a calicreína plasmática activa para su uso en un método de tratamiento de angioedema hereditario (HAE), comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita el anticuerpo en una cantidad eficaz de aproximadamente 300 mg cada dos semanas o cada cuatro semanas; en el que el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 3 y una región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 4, en el que el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de unión a calicreína plasmática y usos de las mismas en el tratamiento de angioedema hereditario

Antecedentes

La calicreína plasmática es un componente de serina proteasa del sistema de contacto y una posible diana de fármacos para diferentes enfermedades inflamatorias, cardiovasculares, infecciosas (septicemia) y oncológicas (Sainz I.M. et al., Thromb Haemost 98, 77-83, 2007). El sistema de contacto se activa por el factor XIIa tras exposición a superficies exógenas o cargadas negativamente o superficies celulares endoteliales por policarboxipeptidasas (Sainz I.M. et al., Thromb Haemost 98, 77-83, 2007). La activación de la calicreína plasmática amplifica la coagulación intrínseca por medio de su activación de retroalimentación del factor XII y potencia la inflamación por medio de la producción de la bradicinina nonapeptídica proinflamatoria. Como cininogenasa primaria en la circulación, la calicreína plasmática es responsable en gran medida de la generación de bradicinina en la vasculatura. Una deficiencia genética en la proteína inhibidora de C1 (C1-INH), el inhibidor natural principal de la calicreína plasmática, da lugar a angioedema hereditario (HAE). Los pacientes con HAE padecen ataques agudos de edema doloroso después de precipitarse por activadores desconocidos (Zuraw B.L. et al., N Engl J Med 359, 1027-1036, 2008).

El documento WO 2011/085103 describe proteínas de unión a calicreína plasmática y métodos de uso de dichas proteínas.

Sumario

La invención proporciona un anticuerpo que se une a calicreína plasmática activa para su uso en un método de tratamiento de angioedema hereditario (HAE), comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita el anticuerpo en una cantidad eficaz de aproximadamente 300 mg cada dos semanas o cada cuatro semanas;

en el que el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO:3 y una región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO:4, en el que el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa.

La presente divulgación se basa, en parte, en los resultados inesperados derivados de estudios farmacocinéticos y modelado farmacocinético, que muestran que dosis de un anticuerpo que se une a la forma activa de calicreína plasmática humana (por ejemplo, de 100 mg a 300 mg) que mantiene la concentración en plasma del anticuerpo por encima de 80 nM sería suficiente para mostrar efecto beneficioso (por ejemplo, profiláctico) en el tratamiento de angioedema hereditario. Además, administrar DX-2930 a la cantidad de 100 mg cada 2 semanas o a la cantidad de 300 mg cada 4 semanas, mantendría una concentración en plasma constante del fármaco por encima de 80 nM y administrar DX-2930 a la cantidad de 300 mg cada 2 semanas mantendría una concentración en plasma constante del fármaco por encima de 200 nM.

La presente divulgación también se basa, en parte, en el descubrimiento inesperado de que un anticuerpo que se une a la forma activa de calicreína plasmática humana mostraba efectos terapéuticos superiores en el tratamiento de angioedema hereditario (HAE) a diversas dosis (0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1 mg/kg o 3 mg/kg) sin evidencias de toxicidad limitante de la dosis a dosis únicas de hasta 3,0 mg/km. Los resultados farmacocinéticos demostraron que DX-2930 tiene exposición lineal dependiente de la dosis y una semivida de eliminación media de 17 a 20 días entre grupos de dosis, después de una sola inyección a sujetos sanos.

Los resultados farmacodinámicos de dos ensayos exploratorios de biomarcador diferentes confirmaron la inhibición de calicreína plasmática ex vivo de una manera dependiente de la dosis y el tiempo.

Por consiguiente, un aspecto de la presente divulgación encarna un método de tratamiento de HAE (por ejemplo, tipo I, II o III), comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita un anticuerpo que se une a la forma activa de pKal en una cantidad eficaz (por ejemplo, de 100 mg a 400 mg o de 100 a 300 mg) de modo que la concentración en plasma del anticuerpo en el sujeto esté por encima de aproximadamente 80 nM. En algunos casos, el anticuerpo (por ejemplo, DX-2930) se administra a 100 mg cada dos semanas. En algunos casos, el anticuerpo (por ejemplo, DX-2930) se administra a 300 mg cada 2 semanas o cada 4 semanas.

Otro aspecto de la presente divulgación encarna un método de tratamiento de HAE (por ejemplo, tipo I, II o III), comprendiendo el método (a) administrar a un sujeto que lo necesita un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de unión a antígeno del mismo) que se une a calicreína plasmática activa a una primera dosificación; (b) medir la concentración en plasma del anticuerpo en el sujeto; y (c) administrar al sujeto el anticuerpo a una segunda dosificación si la concentración en plasma del anticuerpo es menor de aproximadamente 80 nM. En algunos casos, la primera dosificación, la segunda dosificación o ambas son de 100 mg a 400 mg o de 100 mg a 300 mg (por ejemplo, 100 mg o 300 mg de DX-2930). En algunos casos, la segunda dosificación es mayor que la primera dosificación.

Por consiguiente, un aspecto de la presente divulgación encarna un método de tratamiento de HAE (por ejemplo, tipo I, II o III), comprendiendo el método: administrar una sola dosis de un anticuerpo aislado a un sujeto que lo necesita, en el que el anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de unión a antígeno del mismo) se une a calicreína plasmática activa (por ejemplo, no se une a precalicreína). Opcionalmente, el método comprende además controlar el nivel de creatina fosfocinasa en el sujeto antes y después del tratamiento. En algunos casos, la dosis única de cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento es 0,1-3 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1 mg/kg o 3 mg/kg).

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método de tratamiento de HAE hereditario, comprendiendo el método: administrar a un sujeto que lo necesita una pluralidad de dosis de un anticuerpo aislado (por ejemplo, un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de unión a antígeno del mismo) que se une a calicreína plasmática activa (por ejemplo, un anticuerpo que se une a la calicreína plasmática activa humana, pero no a precalicreína humana), en el que cada una de las dos dosis consecutivas están separadas en al menos 2 semanas (por ejemplo, separadas en 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o 6 semanas). En algunos casos, al menos una dosis de la pluralidad de dosis es de 0,1-3 mg/kg. Por ejemplo, cada una de las dosis de la pluralidad de dosis es de 3 mg/kg. En algunos ejemplos, el anticuerpo se administra mensualmente (por ejemplo, cada 28 días) durante, por ejemplo, 6 meses.

En otro aspecto más, la presente divulgación encarna un método de tratamiento de HAE, comprendiendo el método: (i) administrar a un sujeto que lo necesita una o más dosis de un anticuerpo aislado (por ejemplo, un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de unión a antígeno del mismo) que se une a calicreína plasmática activa (por ejemplo, un anticuerpo que se une a calicreína plasmática activa humana, pero no a precalicreína humana), (ii) medir el nivel de inhibición de calicreína plasmática por el anticuerpo en el sujeto después de la ultima dosis y (iii) administrar al sujeto una dosis adicional del anticuerpo si el nivel de inhibición es menor que un nivel terapéutico mínimo. En algunos casos, la una o más dosis son de 0,1-3 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1 mg/kg o 3 mg/kg para cada una de las dosis). En un ejemplo, el nivel terapéutico mínimo representa una concentración en suero o plasma del anticuerpo menor de aproximadamente 80 nM.

En cualquiera de los métodos descritos en este documento, el anticuerpo anticalicreína puede ser un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a calicreína plasmática activa y no se une a precalicreína.

En algunos casos de uno cualquiera de los métodos descritos en este documento, el anticuerpo se une al mismo epítopo que DX-2930 o compite contra DX-2930 por la unión a la calicreína plasmática activa. En algunos casos, el anticuerpo comprende las mismas CDR de la cadena pesada que DX-2930, las mismas CDR de la cadena ligera que DX-2930 o ambas. En algunos casos, el anticuerpo es DX-2930, que es un anticuerpo IgG de longitud completa como se describe en este documento, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

En algunos casos de uno cualquiera de los métodos descritos en este documento, el anticuerpo puede administrarse por administración subcutánea. En algunos casos, el sujeto es un paciente humano que padece, es sospechoso de tener o está en riesgo de ataque de HAE. Por ejemplo, el método descrito en este documento es para tratamiento profiláctico de HAE.

En algunos casos de uno cualquiera de los métodos descritos en este documento, el método comprende además controlar el nivel de creatina fosfocinasa en el sujeto antes y después del tratamiento, o durante el ciclo de tratamiento. Si se observa elevación de creatina fosfocinasa, las dosis del anticuerpo (por ejemplo, DX-2930) puede reducirse o puede terminarse el tratamiento.

En otro aspecto más, la presente divulgación proporciona un método para determinar una dosificación óptima (por ejemplo, una dosificación profiláctica óptima) de tratamiento de angioedema hereditario (HAE) en un sujeto, comprendiendo el método (a) administrar (por ejemplo, por vía subcutánea) a un sujeto que lo necesita cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento que se une a calicreína plasmática activa (por ejemplo, DX-2930 o un fragmento de unión a antígeno del mismo) a una dosificación inicial; (b) medir la concentración en plasma del anticuerpo en el sujeto; y (c) aumentar la dosificación del anticuerpo si la concentración en plasma del anticuerpo es menor de aproximadamente 80 nM; en el que una dosificación que mantiene la concentración en plasma del anticuerpo por encima de aproximadamente 80 nM se elige como dosificación de profilaxis óptima para el sujeto. En algunos casos, el sujeto es un paciente humano que no muestra síntomas de HAE en el momento en que se administra el anticuerpo. En algunos casos, la dosificación inicial es de aproximadamente 100 mg a 400 mg o de 100 mg a 300 mg (por ejemplo, de 100 mg a 300 mg de DX-2930).

El método descrito anteriormente puede comprender además controlar el nivel de creatina fosfocinasa en el sujeto antes y después del tratamiento, o durante el ciclo de tratamiento. Además, el método puede comprender además reducir la dosificación del anticuerpo o terminar el tratamiento si se observa elevación de la creatina fosfocinasa.

En cualquiera de los métodos descritos en este documento, la concentración en plasma del anticuerpo puede medirse por un ensayo de actividad de calicreína plasmática o un inmunoensayo.

También están dentro del alcance de la presente divulgación (a) composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento de HAE o determinación de la dosificación óptima de un agente para tratar HAE, comprendiendo la composición farmacéutica cualquiera de los anticuerpos anticalicreína descritos en este documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable, y (b) uso de la composición farmacéutica para fabricar un medicamento para el tratamiento de HAE. El uso de los anticuerpos para los propósitos pretendidos podría realizarse en las condiciones de dosificación que se describen en este documento.

Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en la descripción a continuación. Otras características o ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de los siguientes dibujos y descripción detallada de varias realizaciones, y también a partir de las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un gráfico que muestra la concentración de DX-2930 media después de administración subcutánea (SC) a sujetos sanos. Se presentan diagramas de concentración-tiempo para cada cohorte de dosis en una escala logarítmica. Las barras de error son las desviaciones típicas. Los perfiles demuestran una exposición lineal dependiente de la dosis. Las fases de eliminación paralelas entre los grupos de dosis son coherentes con un anticuerpo de buen comportamiento con cinética independiente de la dosis en que todas las dosis se comportan de una manera uniforme.

La figura 2 es un gráfico que representa las concentraciones en plasma previstas después de dosificación repetida con 3 mg/kg de DX-2930 mediante administración subcutánea cada 28 días en sujetos sanos.

La figura 3 es un gráfico que representa los principios generales del uso de un medicamento para la profilaxis de una afección patológica.

La figura 4 es un gráfico que representa los principios generales del uso de DX-2930 para la profilaxis de HAE.

La figura 5 es un gráfico que representa la actividad inhibidora comparativa de DX-2930 y ecalantida contra pKal in vitro.

La figura 6 es un gráfico que representa hipótesis alternativas con respecto a una necesidad de mantener continuamente una concentración en plasma de DX-2930 en o por encima de 80 nM para el tratamiento y/o profilaxis de HAE. Como alternativa, la concentración en plasma de DX-2930 requerida puede ser menor o mayor de 80 nM para el tratamiento y/o profilaxis de HAE.

La figura 7 es un gráfico que demuestra que se obtuvieron niveles de fármaco en plasma en o por encima de 80 nM después de la administración de una sola dosis de 3 mg/kg de DX-2930.

La figura 8 es un gráfico que representa el modelado farmacocinético (PK) de la dosificación crónica de DX-2930 a 3 mg/kg suministrado por vía subcutánea cada 28 días en sujetos sanos.

La figura 9 es un gráfico que representa un efecto farmacodinámico (PK) de DX-2930 a 3 mg/kg SC cada 28 días en sujetos sanos.

La figura 10 es un gráfico que representa datos farmacodinámicos (PD) y farmacocinéticos (PK) después de una sola dosis (3 mg/kg) de DX-2930. Los datos PD se representaron como el porcentaje relativo de inhibición de la actividad de pKal a lo largo del tiempo. Los datos PK se representaron como la concentración de DX-2930 en plasma (nM) a lo largo del tiempo. *: valor de P < 0,05 para 3 mg/kg en el día 5 frente a al placebo.

La figura 11 es un gráfico que representa la actividad farmacodinámica (PD) de DX-2930 frente a un sustrato biológico natural (escisión de HMWK medida como generación de HMWK de 2 cadenas).

La figura 12 es un gráfico que representa la bioactividad mantenida de DX-2930 a lo largo del tiempo después de una sola administración de 3 mg/kg de DX-2930. *: valor de P < 0,05 para 3 mg/kg y en el día 28 frente a una dosis previa.

Descripción detallada

Definiciones

Por conveniencia, antes de una mayor descripción de la presente invención, se definen aquí determinados términos empleados en la memoria descriptiva, los ejemplos y las reivindicaciones adjuntas. Otros términos se definen según aparecen en la memoria descriptiva.

Las formas singulares "un/o", "una" y "el/la" incluyen referencias plurales salvo que el contexto indique claramente lo contrario.

El término "anticuerpo" se refiere a una proteína que incluye al menos un dominio variable de inmunoglobulina (región variable) o secuencia del dominio variable de inmunoglobulina (región variable). Por ejemplo, un anticuerpo puede incluir una región variable de la cadena pesada (H) (abreviada en este documento como VH o HV) y una región variable de la cadena ligera (L) (abreviada en este documento como VL o LV). En otro ejemplo, un anticuerpo incluye dos regiones variables de la cadena pesada (H) y dos regiones variables de la cadena ligera (L). el término "anticuerpo" abarca fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fab o sFab, F(ab')2, fragmentos Fd, fragmentos Fv, scFv y fragmentos de anticuerpos de dominio (dAb) (de Wildt et al., Eur J Immunol. 1996; 26(3):629-39)), así como anticuerpos completos. Un anticuerpo puede tener las características estructurales de IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (así como subtipos de las mismas). Los anticuerpos pueden ser de cualquier fuente, pero se prefieren los de primate (seres humanos y primates no humanos) y primatizados.

Las regiones VH y VL pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas "regiones determinantes de la complementariedad" ("CDR"), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas "regiones flanqueantes" ("FR"). La extensión de la región flanqueante y las CDR se ha definido (véase, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, publicación NIH n.° 91-3242, y Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917). En este documento se usan las definiciones de Kabat. Cada VH y VL está compuesta típicamente de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Como se usa en este documento, una "secuencia del dominio variable de inmunoglobulina" se refiere a una secuencia de aminoácidos que puede formar la estructura de un dominio variable de inmunoglobulina de modo que una o más regiones CDR estén colocadas en una conformación adecuada para un sitio de unión a antígeno. Por ejemplo, la secuencia puede incluir la totalidad o parte de la secuencia de aminoácidos de un dominio variable de origen natural. Por ejemplo, la secuencia puede omitir uno, dos o más aminoácidos N o C terminales, aminoácidos internos, puede incluir una o más inserciones o aminoácidos terminales adicionales, o puede incluir otras alteraciones. Un polipéptido que incluye una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina puede asociarse con otra secuencia del dominio variable de inmunoglobulina para formar un sitio de unión a antígeno, por ejemplo, una estructura que interactúa preferentemente con calicreína plasmática.

La cadena VH o VL del anticuerpo puede incluir además la totalidad o parte de una región constante de la cadena pesada o ligera, para formar de este modo una cadena de inmunoglobulina pesada o ligera, respectivamente. en una realización, el anticuerpo es un tetrámero de dos cadenas de inmunoglobulina pesadas y dos cadenas de inmunoglobulina ligeras, en el que las cadenas de inmunoglobulina pesadas y ligeras están interconectadas por, por ejemplo, enlaces disulfuro. En las IgG, la región constante de la cadena pesada incluye tres dominios de inmunoglobulina, CH1, CH2 y CH3. La región constante de la cadena ligera incluye un dominio CL. La región variable de las cadenas pesadas y ligeras contiene un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos típicamente median la unión del anticuerpo a tejidos hospedadores o factores, incluyendo diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema clásico del complemento. Las cadenas ligeras de la inmunoglobulina pueden ser de tipos kappa o lambda. En una realización, el anticuerpo está glucosilado. Un anticuerpo puede ser funcional para la citotoxicidad dependiente de anticuerpos y/o la citotoxicidad mediada por el complemento.

Una o más regiones de un anticuerpo pueden ser humanas o eficazmente humanas. Por ejemplo, una o más de las regiones variables pueden ser humanas o eficazmente humanas. Por ejemplo, una o más de las CDR pueden ser humanas, por ejemplo, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2 y/o LC CDR3. Cada una de las CDR de la cadena ligera (LC) y/o la cadena pesada (HC) puede ser humana. HC CDR3 puede ser humana. Una o más de las regiones flanqueantes pueden ser humanas, por ejemplo, FR1, FR2, FR3 y/o FR4 de la HC y/o LC. Por ejemplo, la región Fc puede ser humana. En una realización, todas las regiones flanqueantes son humanas, por ejemplo, derivan de una célula somática humana, por ejemplo, una célula hematopoyética que produce inmunoglobulinas o una célula no hematopoyética. En una realización, las secuencias humanas son secuencias de la línea germinal, por ejemplo, codificadas con un ácido nucleico de la línea germinal. En una realización, los residuos flanqueantes (FR) de un Fab seleccionado pueden convertirse en el tipo de aminoácido del residuo correspondiente en el gen de la línea germinal de primate más similar, especialmente el gen de la línea germinal humana. Una o más de las regiones constantes pueden ser humanas o eficazmente humanas. Por ejemplo, al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 98 o un 100 % de un dominio variable de inmunoglobulina, la región constante, los dominios constantes (CH1, CH2, CH3 y/o CL1) o el anticuerpo completo puede ser humano o eficazmente humano.

La totalidad o parte de un anticuerpo puede estar codificada por un gen de inmunoglobulina o un segmento del mismo. Genes de inmunoglobulina humana ejemplares incluyen los genes de la región constante kappa, lambda, alfa (IgA1 e IgA2), gamma (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), delta, épsilon y mu, así como los muchos genes de la región variable de inmunoglobulina. Las "cadenas ligeras" de inmunoglobulina de longitud completa (de aproximadamente 25 KDa o de aproximadamente 214 aminoácidos) están codificadas por un gen de la región variable en el extremo NH2 (aproximadamente 110 aminoácidos) y un gen de la región constante kappa o lambda del extremo COOH. Las "cadenas pesadas" de inmunoglobulina de longitud completa (de aproximadamente 50 KDa o de aproximadamente 446 aminoácidos), están codificadas asimismo por un gen de la región variable (aproximadamente 116 aminoácidos) y uno de los otros genes de la región constante mencionados anteriormente, por ejemplo, gamma (que codifica aproximadamente 330 aminoácidos). La longitud de HC humana varía considerablemente porque HC CDR3 varía de aproximadamente 3 residuos aminoacídicos a más de 35 residuos aminoacídicos.

La expresión "fragmento de unión a antígeno) de un anticuerpo de longitud completa se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo de longitud completa que retienen la capacidad de unirse específicamente a una diana de interés. Ejemplos de fragmentos de unión incluidos dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo de longitud completa y que retienen funcionalidad incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, mediante un conector sintético que posibilita que se preparen como una sola cadena proteínica en que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes conocidas como Fv monocatenario (scFv). (Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.25260203, 4946778 y 4881 175; Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883.

Los fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse usando cualquier técnica apropiada incluyendo técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia. La expresión "anticuerpo monoespecífico" se refiere a un anticuerpo que presenta una sola especificidad de unión y afinidad por una diana particular, por ejemplo, epítopo. Esta expresión incluye un "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpos monoclonales" que, como se usa en este documento, se refiere a una preparación de anticuerpos o fragmentos de los mismos de una sola composición molecular, independientemente de la manera en que se generó el anticuerpo.

Los anticuerpos se hacen "de la línea germinal" invirtiendo uno o más aminoácidos que no son de la línea germinal en las regiones flanqueantes a los aminoácidos de la línea germinal correspondientes del anticuerpo, siempre que se retengan sustancialmente las propiedades de unión.

La constante de inhibición (Ki) proporciona una medida de la potencia inhibidora; es la concentración de inhibidor requerida para reducir la actividad enzimática a la mitad y no depende de las concentraciones de enzima o sustrato. La Ki aparente (Ki,ap) se obtiene a diferentes concentraciones de sustrato midiendo el efecto inhibidor de diferentes concentraciones de inhibidor (por ejemplo, proteína de unión inhibidora) sobre el grado de la reacción (por ejemplo, actividad enzimática); ajustando el cambio en la constante de velocidad de seudoprimer orden como una función de la concentración de inhibidor a la ecuación de Morrison (ecuación 1) produce una estimación del valor de Ki aparente. La Ki se obtiene de la ordenada en el origen extraída de un análisis de regresión lineal de un diagrama de Ki,ap frente a la concentración de sustrato.

Ecuación 1

Donde v = velocidad medida; V⁰ = velocidad en ausencia de inhibidor; K^i,ap = constante de inhibición aparente; I = concentración de inhibidor total; y E = concentración de enzima total.

Como se usa en este documento, "afinidad de unión" se refiere a la constante de asociación aparente o K^A . La K^A es el recíproco de la constante de disociación (K^D). Un anticuerpo de unión puede tener, por ejemplo, una afinidad de unión de al menos 10⁵ , 10⁶ , 10⁷ , 10⁸ , 10⁹ , 10¹⁰ y 10¹¹ M^-1 por una molécula diana particular, por ejemplo, calicreína plasmática. Una unión de afinidad mayor de un anticuerpo de unión a una primera diana con respecto a una segunda diana puede indicarse por una K^a mayor (o un valor numérico de K^d más pequeño) para la unión de la primera diana que la K^A (o valor numérico de K^D) para la unión a la segunda diana. En dichos casos, el anticuerpo de unión tiene especificidad por la primera diana (por ejemplo, una proteína en una primera conformación o mimético de la misma) con respecto a la segunda diana (por ejemplo, la misma proteína en una segunda conformación o mimético de la misma; o una segunda proteína). Las diferencias en la afinidad de unión (por ejemplo, para la especificidad u otras comparaciones) pueden ser de al menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 37,5, 50, 70, 80, 91, 100, 500, 1000, 10000 o 10⁵ veces.

La afinidad de unión puede determinarse por una diversidad de métodos incluyendo diálisis en equilibrio, unión en equilibrio, filtración en gel, ELISA, resonancia de plasmones superficiales o espectroscopia (por ejemplo, usando un ensayo de fluorescencia). Las condiciones ejemplares para evaluar la afinidad de unión son en tampón HBS-P (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, tensioactivo P20 al 0,005 % (v/v)). Estas técnicas pueden usarse para medir la concentración de proteína de unión unida y libre como una función de la concentración de la proteína de unión (o diana). La concentración de la proteína de unión unida ([unida]) está relacionada con la concentración de proteína de unión libre ([libre]) y la concentración de sitios de unión para la proteína de unión en la diana donde (N) es el número de sitios de unión por molécula diana mediante la siguiente ecuación:

[unida] = N ■ [libre]/(1 /K^a) [libre]).

No siempre es necesario hacer una determinación exacta de K^a , no obstante, como a veces es suficiente obtener una medición cuantitativa de la afinidad, por ejemplo, determinada usando un método tal como ELISA o análisis FACS, es proporcional a K^a y, por tanto, puede usarse para comparaciones, tal como determinar si una afinidad mayor es, por ejemplo, 2 veces mayor para obtener una medición cuantitativa de la afinidad, o para obtener una deducción de la afinidad, por ejemplo, por la actividad en un ensayo funcional, por ejemplo, un ensayo in vitro o in vivo.

La expresión "anticuerpo de unión" (o "proteína de unión" usadas indistintamente en este documento) se refiere a un anticuerpo que puede interactuar con una molécula diana. Esta expresión se usa indistintamente con "ligando". Un "anticuerpo de unión a calicreína plasmática" se refiere a un anticuerpo que puede interactuar con (por ejemplo, unirse a) calicreína plasmática e incluye, en particular, anticuerpos que interactúan preferente o específicamente con y/o inhiben la calicreína plasmática. Un anticuerpo inhibe la calicreína plasmática si provoca una disminución en la actividad de calicreína plasmática en comparación con la actividad de calicreína plasmática en ausencia del anticuerpo y en las mismas condiciones.

Una "sustitución conservativa de aminoácido" es una en que el residuo aminoacídico se remplaza con un residuo aminoacídico que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica familias de residuos aminoacídicos que tienen cadenas laterales similares. Esta familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales con ramificación beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

Es posible que uno o más residuos aminoacídicos flanqueantes y/o CDR de una proteína de unión incluyan una o más mutaciones (por ejemplo, sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas o sustituciones de aminoácidos no esenciales), inserciones o eliminaciones) con respecto a una proteína de unión descrita en este documento. Una proteína de unión a calicreína plasmática puede tener mutaciones (por ejemplo, sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas o sustituciones de aminoácidos no esenciales), inserciones o eliminaciones) (por ejemplo, al menos una, dos, tres o cuatro y/o menos de 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 mutaciones) con respecto a una proteína de unión descrita en este documento, por ejemplo, mutaciones que no tienen un efecto sustancial sobre la función de la proteína. Las mutaciones pueden estar presentes en regiones flanqueantes, CDR y/o regiones constantes. En algunas realizaciones, las mutaciones están presentes en una región flanqueante. En algunas realizaciones, las mutaciones están presentes en una CDR. En algunas realizaciones, las mutaciones están presentes en una región constante. Que una sustitución particular se tolere o no, es decir, no afecte de manera adversa a las propiedades biológicas, tales como la actividad de unión, puede predecirse, por ejemplo, evaluando si la mutación es conservativa o por el método de Bowie, et al. (1990) Science 247:1306-1310.

Una región variable de inmunoglobulina (eficazmente humana) es una región variable de inmunoglobulina que incluye un número suficiente de posiciones aminoacídicas flanqueantes humanas de modo que la región variable de inmunoglobulina no provoque una respuesta inmunógena en un ser humano normal. Un anticuerpo "eficazmente humano" es un anticuerpo que incluye un número suficiente de posiciones aminoacídicas humanas de modo que el anticuerpo no provoque una respuesta inmunógena en un ser humano normal.

Un "epítopo" ser refiere al sitio en un compuesto diana que se une por una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo tal como un Fab o anticuerpo de longitud completa). En el caso donde el compuesto diana es una proteína, el sitio puede estar completamente compuesto de componentes aminoacídicos, completamente compuesto de modificaciones químicas de aminoácidos de la proteína (por ejemplo, restos glucosilo) o compuesto de combinaciones de los mismos. Los epítopos solapantes incluyen al menos un residuo aminoacídico común, grupo glucosilo, grupo fosfato, grupo sulfato u otro elemento molecular.

Un primer anticuerpo de unión "se une al mismo epítopo" que un segundo anticuerpo de unión si el primer anticuerpo de unión se une al mismo sitio en un compuesto diana que en el que se une el segundo anticuerpo de unión, o se une a un sitio que solapa (por ejemplo, solapamiento de un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %, por ejemplo, en términos de secuencia de aminoácidos u otro elemento molecular (por ejemplo, grupo glucosilo, grupo fosfato o grupo sulfato)) con el sitio en que se une el segundo anticuerpo de unión.

Un primer anticuerpo de unión "compite por la unión" con un segundo anticuerpo de unión si la unión del primer anticuerpo de unión a su epítopo disminuye (por ejemplo, en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % o más) la cantidad del segundo anticuerpo de unión que se une a su epítopo. La competición puede ser directa (por ejemplo, el primer anticuerpo de unión se une a un epítopo que es igual que, o solapa con, el epítopo unido por el segundo anticuerpo de unión) o indirecta (por ejemplo, la unión del primer anticuerpo de unión a su epítopo provoca un cambio estérico en el compuesto diana que disminuye la capacidad del segundo anticuerpo de unión de unirse a su epítopo).

Los cálculos de "homología" o "identidad de secuencia" entre dos secuencias (los términos se usan indistintamente en este documento) se realizan de la siguiente manera. Las secuencias se alinean con fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en uno o ambos de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o nucleótidos para una alineación óptima y pueden descartarse secuencias no homólogas con fines de comparación). La alineación óptima se determina como la mejor puntuación usando el programa GAP del paquete de programa informático GCG con una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización por hueco de 12, una penalización por ampliación de hueco de 4 y una penalización por hueco con desplazamiento del marco de lectura de 5. Los residuos aminoacídicos o nucleótidos en las posiciones aminoacídicas o posiciones nucleotídicas correspondientes se comparan entonces. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo aminoacídico o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se usa en este documento, la "identidad" de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a "homología" de aminoácido o ácido nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias.

En una realización preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada con fines de comparación es de al menos un 30 %, preferiblemente al menos un 40 %, más preferiblemente al menos un 50 %, incluso más preferiblemente al menos un 60 % e incluso más preferiblemente al menos un 70 %, 80 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 % o 100 % de la longitud de la secuencia de referencia. Por ejemplo, la secuencia de referencia puede ser la longitud de la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina.

Una región variable de inmunoglobulina "humanizada" es una región variable de inmunoglobulina que se modifica para que incluya un número suficiente de posiciones aminoacídicas flanqueantes humanas de modo que la región variable de inmunoglobulina no provoque una respuesta inmunógena en un ser humano normal. Descripciones de inmunoglobulinas "humanizadas" incluyen, por ejemplo, los documentos U.S. 6407213 y U.S. 5693762.

Un anticuerpo "aislado" se refiere a un anticuerpo al que se le elimina al menos un 90 % de al menos un componente de una muestra natural de la que puede obtenerse el anticuerpo aislado. Los anticuerpos pueden ser "de al menos " un determinado grado de pureza si la especie o población de especie de interés es al menos un 5, 10, 25, 50, 75, 80, 90, 92, 95, 98 o 99 % pura en una base ponderal.

Un "paciente", "sujeto" u "hospedador" (estos términos se usan indistintamente) a tratarse por el presente método puede significar un ser humano o animal no humano.

Las expresiones "precalicreína" y "precalicreína plasmática" se usan indistintamente en este documento y se refieren a la forma de cimógeno de calicreína plasmática activa, que también se conoce como precalicreína.

Como se usa en este documento, la expresión "sustancialmente idéntica" (o "sustancialmente homóloga") se usa en este documento para hacer referencia a una primera secuencia de aminoácidos o ácido nucleico que contiene un número suficiente de residuos aminoacídicos o nucleótidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, con una cadena lateral similar, por ejemplo, sustituciones aminoacídicas conservadas) con respecto a una segunda secuencia de aminoácidos o ácido nucleico de modo que la primera y segunda secuencia de aminoácidos o ácido nucleico tenga (o codifique proteínas que tengan) actividades similares, por ejemplo, una actividad de unión, una preferencia de unión o una actividad biológica. En el caso de anticuerpos, el segundo anticuerpo tiene la misma especificidad y tiene al menos un 50 %, al menos un 25 % o al menos un 10 % de la afinidad con respecto al mismo antígeno.

Secuencias similares u homólogas (por ejemplo, al menos aproximadamente un 85 % de identidad de secuencia) con las secuencias divulgadas en este documento también son parte de esta solicitud. En algunas realizaciones, la identidad de secuencia puede ser de aproximadamente un 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor. En algunas realizaciones, un anticuerpo de unión a calicreína plasmática puede tener aproximadamente un 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor identidad de secuencia con un anticuerpo descrito en este documento. En algunas realizaciones, un anticuerpo de unión a calicreína plasmática puede tener aproximadamente un 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor identidad de secuencia en las regiones flanqueantes de HC y/o LC (por ejemplo, HC y/o LC FR 1, 2, 3 y/o 4) con un anticuerpo descrito en este documento (por ejemplo, DX-2930). En algunas realizaciones, un anticuerpo de unión a calicreína plasmática puede tener aproximadamente un 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor identidad de secuencia en las CDR de HC y/o lC (por ejemplo, HC y/o LC CDR1, 2 y/o 3) con un anticuerpo descrito en este documento (por ejemplo, DX-2930). En algunas realizaciones, un anticuerpo de unión a calicreína plasmática puede tener aproximadamente un 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor identidad de secuencia en la región constante (por ejemplo, CH1, CH2, CH3 y/o CL1) con un anticuerpo descrito en este documento (por ejemplo, DX-2930).

Además, existe identidad sustancial cuando los segmentos de ácido nucleico hibridan en condiciones de hibridación selectiva (por ejemplo, condiciones de hibridación altamente rigurosas), con el complemento de la hebra. Los ácidos nucleicos pueden estar presenten en células completas, en un lisado celular o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura.

La significación estadística puede determinarse por cualquier método conocido en la técnica. Ensayos estadísticos ejemplares incluyen: ensayo de la T de Students, ensayo no paramétrico de Mann Whitney y ensayo estadístico no paramétrico de Wilcoxon. Algunas relaciones estadísticamente significativas tienen un valor de P de menos de 0,05 o 0,02. Proteínas de unión particulares puede mostrar una diferencia, por ejemplo, en la especificidad o unión que sea estadísticamente significativa (por ejemplo, valor de P < 0,05 o 0,02). Los términos "inducir", "inhibir", "potenciar", "elevar", "aumentar", "disminuir" o similares, por ejemplo, que indican diferencias cualitativas o cuantitativas distinguibles entre dos estados, pueden referirse a una diferencia, por ejemplo, una diferencia estadísticamente significativa, entre los dos estados.

Una "dosificación terapéuticamente eficaz" preferiblemente modula un parámetro medible, por ejemplo, actividad de calicreína plasmática, en un grado estadísticamente significativo o al menos aproximadamente un 20 %, más preferiblemente en al menos aproximadamente un 40 %, incluso más preferiblemente en al menos aproximadamente un 60 % y aún más preferiblemente en al menos aproximadamente un 80 % con respecto a sujetos no tratados. La capacidad de un compuesto de modular un parámetro medible, por ejemplo, un parámetro asociado a enfermedad, puede evaluarse en un sistema de modelo animal predictivo de la eficacia en trastornos y afecciones humanas. Como alternativa, esta propiedad de una composición puede evaluarse examinando la capacidad del compuesto de modular un parámetro in vitro.

El término "tratar", como se usa en este documento, se refiere a la aplicación o administración de una composición que incluye uno o más agentes activos a un sujeto, que tiene una enfermedad alérgica, un síntoma de la enfermedad alérgica o una predisposición a la enfermedad alérgica, con el fin de curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, mejorar, corregir o influir en la enfermedad, los síntomas de la enfermedad o la predisposición a la enfermedad. "Tratamiento profiláctico", también conocido como "tratamiento preventivo", se refiere a un tratamiento que tiene como objetivo proteger a una persona de, o reducir el riesgo de una enfermedad a la que ha estado expuesto, o puede estar expuesto.

El término "prevenir" una enfermedad en un sujeto se refiere a someter al sujeto a un tratamiento farmacéutico, por ejemplo, la administración de un fármaco, de modo que se prevenga al menos un síntoma de la enfermedad, es decir, se administra antes de la manifestación clínica de la afección indeseada (por ejemplo, enfermedad u otro estado indeseado del animal hospedador) de modo que proteja al hospedador contra el desarrollo de la afección indeseada. "Prevenir" una enfermedad también puede denominarse "profilaxis" o "tratamiento profiláctico".

Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profiláctico deseado. Típicamente, como se usa una dosis profiláctica en sujetos antes de o en una fase inicial de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.

Anticuerpos de unión a calicreína plasmática

Los anticuerpos de unión a calicreína plasmática para su uso en los métodos descritos en este documento pueden ser de longitud completa (por ejemplo, una IgG (por ejemplo, una IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (por ejemplo, IgA1, IgA2), IgD e IgE) o puede incluir solamente un fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2 o scFv. El anticuerpo de unión puede incluir inmunoglobulinas de dos cadenas pesadas e inmunoglobulinas de dos cadenas ligeras, o puede ser un anticuerpo monocatenario. Los anticuerpos de unión a calicreína plasmática pueden ser proteínas recombinantes tales como anticuerpos humanizados, con CDR injertadas, quiméricos, desinmunizados o generados in vitro, y opcionalmente pueden incluir regiones constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En una realización, el anticuerpo de unión a calicreína plasmática es un anticuerpo monoclonal.

En un aspecto, la divulgación encarna un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo aislado) que se une a calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína murina) e incluye al menos una región variable de inmunoglobulina. Por ejemplo, el anticuerpo incluye una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de cadena pesada (HC) y/o una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de cadena ligera (LC). En una realización, el anticuerpo se une a e inhibe la calicreína plasmática, por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína murina.

El anticuerpo puede incluir una o más de las siguientes características: (a) una CDR humana o región flanqueante humana; (b) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina HC comprende una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR que son al menos un 85, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idénticas a una CDR de un dominio variable HC descrito en este documento; (c) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina LC comprende una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR que son al menos un 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idénticas a una CDR de un dominio variable LC descrito en este documento; (d) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina LC es al menos un 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idéntica a un dominio variable LC descrito en este documento (por ejemplo, globalmente o en las regiones flanqueantes o CDR); (e) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina HC es al menos un 85, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idéntica a un dominio variable HC descrito en este documento (por ejemplo, globalmente o en las regiones flanqueantes o CDR); (f) el anticuerpo se une a un epítopo unido por un anticuerpo descrito en este documento, o compite por la unión con un anticuerpo descrito en este documento; (g) una CDR de primate o región flanqueante de primate; (h) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina HC comprende una CDR1 que difiere en al menos un aminoácido, pero en no más de 2 o 3 aminoácidos de la CDR1 de un dominio variable HC descrito en este documento; (i) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina HC comprende una CDR2 que difiere en al menos un aminoácido, pero en no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos de la CDR2 de un dominio variable HC descrito en este documento; (j) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina HC comprende una CDR3 que difiere en al menos un aminoácido, pero en no más de 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos de la CDR3 de un dominio variable HC descrito en este documento; (k) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina LC comprende una CDR1 que difiere en al menos un aminoácido, pero en no más de 2, 3, 4 o 5 aminoácidos de la CDR1 de un dominio variable LC descrito en este documento; (l) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina LC comprende una CDR2 que difiere en al menos un aminoácido, pero en no más de 2, 3 o 4 aminoácidos de la CDR2 de un dominio variable LC descrito en este documento; (m) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina LC comprende una CDR3 que difiere en al menos un aminoácido, pero en no más de 2, 3, 4 o 5 aminoácidos de la CDR3 de un dominio variable LC descrito en este documento; (n) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina LC difiere en al menos un aminoácido, pero en no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de un dominio variable LC descrito en este documento (por ejemplo, globalmente o en las regiones flanqueantes o CDR); y (o) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina HC difiere en al menos un aminoácido, pero en no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de un dominio variable HC descrito en este documento (por ejemplo, globalmente o en las regiones flanqueantes o CDR).

La proteína de unión a calicreína plasmática puede ser un anticuerpo aislado (por ejemplo, al menos un 70, 80, 90, 95 o 99 % libre de otras proteínas). En algunas realizaciones, el anticuerpo de unión a calicreína plasmática o composición del mismo se aísla de fragmentos de escisión de anticuerpo (por ejemplo, DX-2930) que son inactivos o parcialmente activos (por ejemplo, se unen a calicreína plasmática con una Ki,ap de 5000 nM o mayor) en comparación con el anticuerpo de unión a calicreína plasmática. Por ejemplo, el anticuerpo de unión a calicreína plasmática está al menos un 70 % libre de dichos fragmentos de escisión de anticuerpo; en otras realizaciones, el anticuerpo de unión está al menos un 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % o incluso un 100 % libre de fragmentos de escisión de anticuerpo que son inactivos o parcialmente activos.

El anticuerpo de unión a calicreína plasmática adicionalmente puede inhibir la calicreína plasmática, por ejemplo, calicreína plasmática humana.

En algunas realizaciones, el anticuerpo de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína murina).

En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une en o cerca del sitio activo del dominio catalítico de calicreína plasmática, o un fragmento del mismo, o se une a un epítopo que solapa con el sitio activo de calicreína plasmática.

En algunos aspectos, el anticuerpo se une al mismo epítopo o compite por la unión con un anticuerpo descrito en este documento.

El anticuerpo puede unirse a calicreína plasmática, por ejemplo, calicreína plasmática humana, con una afinidad de unión de al menos 10⁵ , 10⁶ , 10⁷ , 10⁸ , 10⁹ , 10¹⁰ y 10¹¹ M^-1. En una realización, el anticuerpo se une a calicreína plasmática humana con una K^dis más lenta que 1 x 10^-3, 5 x 10^-4 s^-1 o 1 x 10^-4 s^-1. En una realización, el anticuerpo se une a calicreína plasmática humana con una K^as más rápida que 1 x 10², 1 x 10³ o 5 x 10³ M^-1s^-1. En una realización, el anticuerpo se une a calicreína plasmática, pero no se une a calicreína de los tejidos y/o precalicreína plasmática (por ejemplo, el anticuerpo se une a calicreína de los tejidos y/o precalicreína plasmática de manera menos eficaz (por ejemplo, 5, 10, 50, 100 o 1000 veces menos o nada en absoluto, por ejemplo, en comparación con un control negativo) de lo que se une a calicreína plasmática.

En una realización, el anticuerpo inhibe la actividad de calicreína plasmática humana, por ejemplo, con una Ki de menos de 10^-5, 10^-6, 10^-7, 10^-8, 10^-9 y 10^-10 M. El anticuerpo puede tener, por ejemplo, una CI⁵⁰ de menos de 100 nM, 10 nM, 1, 0,5, o 0,2 nM. Por ejemplo, el anticuerpo puede modular la actividad de calicreína plasmática, así como la producción de factor XIla (por ejemplo, a partir de factor XII) y/o bradicinina (por ejemplo, a partir de cininógeno de alto peso molecular (HMWK)). El anticuerpo puede inhibir la actividad de calicreína plasmática y/o la producción de factor XIIa (por ejemplo, a partir de factor XII) y/o bradicinina (por ejemplo, a partir de cininógeno de alto peso molecular (HMWK)). La afinidad del anticuerpo por calicreína plasmática humana puede caracterizarse por una K^d de menos de 100 nm, menos de 10 nM, menos de 5 nM, menos de 1 nM, menos de 0,5 nM. En una realización, el anticuerpo inhibe la calicreína plasmática, pero no inhibe la calicreína de los tejidos (por ejemplo, el anticuerpo inhibe la calicreína de los tejidos de manera menos eficaz (por ejemplo, 5, 10, 50, 100 o 1000 veces menos o nada en absoluto, por ejemplo, en comparación con un control negativo) de lo que inhibe la calicreína plasmática.

En algunas realizaciones, el anticuerpo tiene una constante de inhibición aparente (K^i,ap) de menos de 1000, 500, 100, 5, 1, 0,5 o 0,2 nM.

Los anticuerpos de unión a calicreína plasmática pueden tener sus secuencias de dominio variable HC y LC incluidas en un solo polipéptido (por ejemplo, scFv) o en diferentes polipéptidos (por ejemplo, IgG o Fab).

En una realización, las secuencias de dominio variable HC y LC son componentes de la misma cadena polipeptídica. En otra, las secuencias de dominio variable HC y LC son componentes de diferentes cadenas polipeptídicas. Por ejemplo, el anticuerpo es una IgG, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. El anticuerpo puede ser un Fab soluble. En otras implementaciones, el anticuerpo incluye un Fab2', scFv, minicuerpo, fusión de scFv::Fc, fusión de Fab::HSA, fusión de HSA::Fab, fusión de Fab::HSA::Fab u otra molécula que comprenda el sitio de combinación con el antígeno de una de las proteínas de unión de este documento. Las regiones VH y VL de estos Fab pueden proporcionarse como IgG, Fab, Fab2, Fab2', scFv, Fab PEGilado, scFv PEGilado, Fab2 PEGilado, VH::CH1::HSA+LC, HSA::VH::CH1+LC, LC::Hs A VH::CH1, HSA::LC VH::CH1 u otra construcción apropiada.

En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo humano o humanizado o es no inmunógeno en un ser humano. Por ejemplo, el anticuerpo incluye una o más regiones flanqueantes de anticuerpo humano, por ejemplo, todas las regiones flanqueantes humanas, o regiones flanqueantes al menos un 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % idénticas a las regiones flanqueantes humanas. En una realización, el anticuerpo incluye un dominio Fc humano, o un dominio Fc que es al menos un 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc humano.

En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo de primate o primatizado o es no inmunógeno en un ser humano. Por ejemplo, el anticuerpo incluye una o más regiones flanqueantes de anticuerpo de primate, por ejemplo, todas las regiones flanqueantes de primate, o regiones flanqueantes al menos un 85, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % idénticas a regiones flanqueantes de primate. En una realización, el anticuerpo incluye un dominio Fc de primate o un dominio Fc que es al menos un 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc de primate. "Primate" incluye seres humanos (Homo sapiens), chimpancés (Pan troglodytes y Pan paniscus (bonobos)), gorilas (Gorilla gorilla), gibones, monos, lémures, aye-ayes (Daubentonia madagascariensis) y tarseros.

En algunas realizaciones, la afinidad del anticuerpo de primate por calicreína plasmática humana se caracteriza por una K^d de menos de 1000, 500, 100, 10, 5, 1, 0,5 nM, por ejemplo, de menos de 10 nM, menos de 1 nM o menos de 0,5 nM.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo no incluye secuencias de ratones o conejos (por ejemplo, no es un anticuerpo murino o de conejo).

En algunos casos, el anticuerpo usado en los métodos descritos en este documento puede ser DX-2930 como se describe en este documento o una variante funcional del mismo, o un anticuerpo que se une al mismo epítopo que DX-2930 o compite contra DX-2930 por la unión a calicreína plasmática activa.

En un ejemplo, una variante funcional de DX-2930 comprende las mismas regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que DX-2930. En otro ejemplo, las variantes funcionales de DX-2930 pueden contener una o más mutaciones (por ejemplo, sustituciones conservativas) en las FR de la V^h o la V^l en comparación con las de V^h y V^L de DX-2930. Preferiblemente, dichas mutaciones no se producen en residuos que se ha predicho que interactuarán con una o más de las CDR, que pueden determinarse por tecnología rutinaria. En otros casos, las variantes funcionales descritas en este documento contienen una o más mutaciones (por ejemplo, 1,2 o 3) dentro de una o más de las regiones CDR de DX-2930. Preferiblemente, dichas variantes funcionales retienen las mismas regiones/residuos responsables de la unión al antígeno que el precursor. En otros casos más, una variante funcional de DX-2930 puede comprender una cadena V^h que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 85 % (por ejemplo, 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) idéntica a la de la V^h de DX-2930 y/o una cadena V^l que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 85 % (por ejemplo, 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) idéntica a la de la V^l de DX-2930. Estas variantes pueden unirse a la forma activa de calicreína plasmática y, preferiblemente, no se unen a precalicreína.

El "porcentaje de identidad" de dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Karlin y Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990, modificado como en Karlin y Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993. Dicho algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990. Pueden realizarse búsquedas de proteínas en BLAST con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas proteínicas de interés. Cuando existen huecos entre dos secuencias, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST).

Preparación de anticuerpos

Los anticuerpos que pueden unirse a PKal como se describe en este documento pueden prepararse por cualquier método conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York.

En algunas realizaciones, pueden prepararse anticuerpos específicos para un antígeno diana (por ejemplo, una PKal humana o el dominio catalítico de la misma) por la tecnología de hibridoma convencional. El antígeno diana de longitud completa o un fragmento del mismo, opcionalmente acoplado a una proteína transportadora tal como KLH, puede usarse para inmunizar un animal hospedador para generar anticuerpos que se unen a ese antígeno. La vía y pauta de inmunización del animal hospedador son en general conformes con técnicas establecidas y convencionales para la estimulación y producción de anticuerpos, como se describe adicionalmente en este documento. Se conocen técnicas generales para la producción de anticuerpos de ratón, humanizados y humanos en la técnica y se describen en este documento. Se contempla que pueden manipularse cualquier sujeto mamífero incluyendo seres humanos o células productoras de anticuerpos de los mismos para que sirvan como base para la producción de líneas celulares de hibridoma de mamífero, incluyendo humanas. Típicamente, el animal hospedador se inocula por vía intraperitoneal, intramuscular, oral, subcutánea, intraplantar y/o intradérmica con una cantidad de inmunógeno, incluyendo como se describe en este documento.

Los hibridomas pueden prepararse a partir de los linfocitos y células de mieloma inmortalizadas usando la técnica general de hibridación de células somáticas de Kohler, B. y Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497 o modificada por Buck, D. W., etal., In Vitro, 18:377-381 (1982). Pueden usarse líneas de mieloma disponibles incluyendo, aunque sin limitación, X63-Ag8.653 y las del Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., EE. UU. en la hibridación. En general, la técnica implica fusionar células de mieloma y células linfoides usando un fusógeno tal como polietilenglicol, o por medios eléctricos bien conocidos por los expertos en la materia. Después de la fusión, las células se separan del medio de fusión y se cultivan en un medio de cultivo selectivo, tal como medio de hipoxantinaaminopterina-timidina (HAT), para eliminar las células precursoras no hibridadas. Cualquiera de los medios descritos en este documento, complementado con o sin suero, puede usarse para cultivar hibridomas que secreten anticuerpos monoclonales. Como otra alternativa a la técnica de fusión celular, pueden usarse linfocitos B inmortalizados con EBV para producir los anticuerpos monoclonales anti-PKal descritos en este documento. Los hibridomas se expanden y subclonan, si se desea, y se ensayan los sobrenadantes para la actividad antiinmunógeno por procedimientos de inmunoensayo convencionales (por ejemplo, radioinmunoensayo, inmunoensayo enzimático o inmunoensayo de fluorescencia).

Hibridomas que pueden usarse como fuente de anticuerpos abarcan todos los derivados, células de la descendencia de los hibridomas precursores que producen anticuerpos monoclonales que pueden interferir con la actividad de PKal. Los hibridomas que producen dichos anticuerpos pueden cultivarse in vitro o in vivo usando procedimientos conocidos. Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse del medio de cultivo o líquidos corporales, por procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como precipitación con sulfato de amonio, electroforesis en gel, diálisis, cromatografía y ultrafiltración, si se desea. La actividad indeseada, si está presente, puede eliminarse, por ejemplo, procesando la preparación sobre absorbentes realizados del inmunógeno fijado a una fase sólida y eluyendo o liberando los anticuerpos deseados del inmunógeno. La inmunización de un animal hospedador con un antígeno diana o un fragmento que contiene la secuencia de aminoácidos diana conjugada con una proteína que es inmunógena en la especie a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, seroalbúmina, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja usando un agente bifuncional o de derivatización, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl o R1N=C=NR, donde R y R1 son diferentes grupos alquilo, puede producir una población de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales).

Si se desea, un anticuerpo (monoclonal o policlonal) de interés (por ejemplo, producido por un hibridoma) puede secuenciarse y después la secuencia polinucleotídica puede clonarse en un vector para la expresión o propagación. La secuencia que codifica el anticuerpo de interés puede mantenerse en el vector en una célula hospedadora y la célula hospedadora entonces puede expandirse y congelarse para su uso futuro. En una alternativa, la secuencia polinucleotídica puede usarse para manipulación genética para "humanizar" el anticuerpo o para mejorar la afinidad (maduración de la afinidad) u otras características del anticuerpo. Por ejemplo, la región constante puede manipularse para que se parezca más a las regiones constantes humanas para evitar la respuesta inmunitaria si se usa el anticuerpo en ensayos clínicos y tratamientos en seres humanos. Puede ser deseable manipular genéticamente la secuencia del anticuerpo para obtener mayor afinidad por el antígeno diana y mayor eficacia en la inhibición de la actividad de PKal. Será evidente para los expertos en la materia que puede hacerse uno o más cambios polinucleotídicos en el anticuerpo y mantener aún su especificidad de unión por el antígeno diana.

En otras realizaciones, pueden obtenerse anticuerpos completamente humanos usando ratones disponibles en el mercado que se han manipulado para que expresen proteínas de inmunoglobulina humana específicas. Los animales transgénicos que están diseñados para producir una respuesta inmunitaria más deseable (por ejemplo, anticuerpos completamente humanos) o más robusta también pueden usarse para la generación de anticuerpos humanizados o humanos. Ejemplos de dicha tecnología son XenomouseRTM de Amgen, Inc. (Fremont, Calif.) y HuMAb-MouseRTM y TC Mouse™ de Medarex, Inc. (Princeton, N.J.). En otra alternativa, los anticuerpos pueden prepararse de manera recombinante por presentación en fagos o tecnología de levaduras. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.25565332; 5580717; 5733743 y 6265 150; y Winter et al., (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:433-455. Como alternativa, puede usarse la tecnología de presentación en fagos (McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-553) para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro, a partir de repertorios de genes del dominio variable (V) de inmunoglobulina de donadores no inmunizados.

Los fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo intacto (anticuerpo de longitud completa) pueden prepararse mediante métodos rutinarios. Por ejemplo, pueden producirse fragmentos F(ab')2 por digestión con pepsina de una molécula de anticuerpo, y fragmentos Fab que pueden generarse reduciendo los puentes disulfuro de fragmentos F(ab')2.

Pueden producirse anticuerpos genomanipulados, tales como anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos monocatenarios y anticuerpos biespecíficos, mediante, por ejemplo, tecnología recombinante convencional. En un ejemplo, el ADN que codifica un anticuerpo monoclonal específico para un antígeno diana pueden aislarse fácilmente y secuenciarse usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que pueden unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven como fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en uno o más vectores de expresión, que después se transfectan en células hospedadoras tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen de otro modo la proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. Véase, por ejemplo, la publicación PCT n.° WO 87/04462. El ADN entonces puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante de los dominios constantes de la cadena pesada y ligera humana en el lugar de las secuencias murinas homólogas, Morrison et al., (1984) Proc. Nat. Acad. Sci.

81:6851, o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulina la totalidad o parte de la secuencia codificante de un polipéptido que no es de inmunoglobulina. De esa manera, pueden prepararse anticuerpos genomanipulados, tales como anticuerpos "quiméricos" o "híbridos"; que tienen la especificidad de unión de un antígeno diana.

Las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851; Neuberger et al. (1984) Nature 312, 604; y Takeda et al. (1984) Nature 314:452.

Los métodos para construir anticuerpos humanizados también son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989). En un ejemplo, las regiones variables de Vh y VL de un anticuerpo no humano precursor se someten a análisis de modelado molecular tridimensional siguiendo métodos conocidos en la técnica. A continuación, los residuos aminoacídicos flanqueantes que se ha predicho que son importantes para la formación de las estructuras CDR correctas se identifican usando el mismo análisis de modelado molecular. En paralelo, las cadenas VH y VL humanas que tienen secuencias de aminoácidos que son homólogas a las del anticuerpo no humano precursor se identifican a partir de cualquier base de datos de genes de anticuerpo usando las secuencias VH y VL precursoras como consultas de búsqueda. Entonces se seleccionan genes aceptadores humanos de VH y VL.

Las regiones CDR dentro de los genes aceptadores humanos seleccionados pueden remplazarse con las regiones CDR del anticuerpo no humano precursor o variantes funcionales del mismo. Cuando es necesario, los residuos dentro de las regiones flanqueantes de la cadena precursora que se ha predicho que son importantes en la interacción con las regiones CDR (véase la descripción anterior) pueden usarse para sustituir los residuos correspondientes en los genes aceptadores humanos.

Un anticuerpo monocatenario puede prepararse mediante tecnología recombinante ligando una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de la cadena pesada y una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de la cadena ligera. Preferiblemente, se incorpora un conector flexible entre las dos regiones variables. Como alternativa, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (patentes de Estados Unidos n.° 4946778 y 4704692) pueden adaptarse para producir una colección de scFv en fagos o levaduras y pueden identificarse los clones de scFv específicos para PKal de la colección siguiendo procedimientos rutinarios. Los clones positivos pueden someterse a cribado adicional para identificar los que inhiben la actividad de PKal.

Los anticuerpos obtenidos siguiendo un método conocido en la técnica y descrito en este documento pueden caracterizarse usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un método es identificar el epítopo al que se une el antígeno, o "cartografiado de epítopos". Hay muchos métodos conocidos en la técnica para cartografiar y caracterizar la ubicación de epítopos en proteínas, incluyendo resolver la estructura cristalina de un complejo de anticuerpo-antígeno, ensayos de competición, ensayos de expresión de fragmentos génicos y ensayos basados en péptidos sintéticos, como se describe, por ejemplo, en el capítulo 11 de Harlow y Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999. En un ejemplo adicional, puede usarse cartografiado de epítopos para determinar la secuencia a la que se une un anticuerpo. El epítopo puede ser un epítopo lineal, es decir, contenido en un solo tramo de aminoácidos, o un epítopo conformacional formado por una interacción tridimensional de aminoácidos que no están contenidos necesariamente en un solo tramo (secuencia lineal de estructura primaria). Pueden aislarse o sintetizarse (por ejemplo, de manera recombinante) péptidos de longitudes variables (por ejemplo, al menos 4-6 aminoácidos de longitud) y usarse para ensayos de unión con un anticuerpo. En otro ejemplo, el epítopo al que se une el anticuerpo puede determinarse en un cribado sistemático usando péptidos solapantes derivados de la secuencia antigénica diana y determinando la unión por el anticuerpo. De acuerdo con los ensayos de expresión de fragmentos génicos, el marco abierto de lectura que codifica el antígeno diana se fragmenta aleatoriamente o mediante construcciones genéticas específicas y se determina la reactividad de los fragmentos expresados del antígeno con el anticuerpo a ensayar. Los fragmentos génicos pueden producirse, por ejemplo, por PCR y después transcribirse y traducirse en proteína in vitro, en presencia de aminoácidos radioactivos. La unión del anticuerpo a los fragmentos antigénicos marcados radioactivamente se determina entonces por inmunoprecipitación y electroforesis en gel. Determinados epítopos también pueden identificarse usando colecciones grandes de secuencias peptídicas aleatorias presentadas en la superficie de partículas fágicas (colecciones en fagos). Como alternativa, puede ensayarse una colección definida de fragmentos peptídicos solapantes para la unión al anticuerpo de ensayo en ensayos de unión simples. En un ejemplo adicional, puede realizarse mutagénesis de un dominio de unión a antígeno, experimentos de intercambio de dominios y mutagénesis por barrido de alanina para identificar residuos requeridos, suficientes y/o necesarios para la unión al epítopo. Por ejemplo, pueden realizarse experimentos de intercambio de dominios usando un mutante de un antígeno diana en que se han remplazado (intercambiado) diversos fragmentos del polipéptido PKal con secuencias de una proteína muy relacionada, pero antigénicamente distinta (tal como otro miembro de la familia de proteínas de neurotrofina). Evaluando la unión del anticuerpo al PKal mutante (por ejemplo, aquellos mutantes descritos en el ejemplo 2 a continuación), puede evaluarse la importancia del fragmento antigénico particular para la unión al antígeno.

Como alternativa, pueden realizarse ensayos de competición usando otros anticuerpos que se sabe que se unen al mismo antígeno para determinar si un anticuerpo se une al mismo epítopo que los otros anticuerpos. Los ensayos de competición son bien conocidos por los expertos en la materia.

Cualquiera de los métodos adecuados conocidos en la técnica, por ejemplo, los métodos de cartografiado de epítopos como se describe en este documento, puede aplicarse para determinar si el anticuerpo anti-PKal se une a uno o más de los residuos/segmentos específicos en PKal como se describe en este documento. Además, la interacción del anticuerpo con uno o más de esos residuos definidos en PKal puede determinarse por tecnología rutinaria. Por ejemplo, puede determinarse una estructura cristalina siguiendo el método divulgado en el ejemplo 1 a continuación y las distancias entre los residuos en PKal y uno o más residuos en el anticuerpo puede determinarse en consecuencia. Basándose en dicha distancia, puede determinarse si un residuo específico en PKal interactúa con uno o más residuos en el anticuerpo. Además, pueden aplicarse métodos adecuados, tales como ensayos de competición y ensayos de mutagénesis de diana para determinar la unión preferente de un anticuerpo anti-PKal candidato a PKal en comparación con otra diana tal como PKal mutante.

Como alternativa, los anticuerpos anti-PKal pueden identificarse a partir de colecciones de anticuerpos, tales como colecciones de presentación siguiendo métodos conocidos en la técnica.

Una vez se identifica un anticuerpo anti-PKal usando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica y se confirma que es un anticuerpo adecuado para su uso en el tratamiento descrito en este documento, dicho anticuerpo puede producirse mediante métodos convencionales de ácido nucleico recombinante.

En general, una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína se clona en un vector de expresión de ácido nucleico. Por supuesto, si la proteína incluye múltiples cadenas polipeptídicas, cada cadena puede clonarse en un vector de expresión, por ejemplo, el mismo vector o diferentes vectores, que se expresan en la misma célula o diferentes células.

Algunos anticuerpos, por ejemplo, Fab, pueden producirse en células bacterianas, por ejemplo, células de E. coli (véase, por ejemplo, Nadkarni, A. et al., 2007 Protein Expr Purif 52(1 ):219-29). Por ejemplo, si el Fab está codificado por secuencias en un vector de presentación en fagos que incluye un codón de parada suprimible entre la entidad de presentación y una proteína del bacteriófago (o fragmento de la misma), el ácido nucleico del vector puede transferirse a una célula bacteriana que no puede suprimir un codón de parada. En este caso, el Fab no se fusiona a la proteína del gen III y se secreta en el periplasma y/o el medio.

También pueden producirse anticuerpos en células eucariotas. En una realización, los anticuerpos (por ejemplo, scFv) se expresan en una célula de levadura tal como Pichia (véase, por ejemplo, Powers et al., 2001, J. Immunol. Methods.

251:123-35; Schoonooghe S. et al., 2009 BMC Biotechnol. 9:70; Abdel-Salam, HA. et al., 2001 Appl Microbiol Biotechnol 56(1-2):157-64; Takahashi K. et al., 2000 Biosci Biotechnol Biochem 64(10):2138-44; Edqvist, J. et al., 1991 J Biotechnol 20(3):291-300), Hanseula o Saccharomyces. Un experto en la materia puede optimizar la producción de anticuerpos en levaduras optimizando, por ejemplo, las condiciones de oxígeno (véase, por ejemplo, Baumann K., et al. 2010 BMC Syst. Biol.4:141), la osmolaridad (véase, por ejemplo, Dragosits, M. et al., 2010 BMC Genomics 11:207), la temperatura (véase, por ejemplo, Dragosits, M. et al., 2009 J Proteome Res. 8(3):1380-92), las condiciones de fermentación (véase, por ejemplo, Ning, D. et al. 2005 J. Biochem. and Mol. Biol. 38(3): 294-299), la cepa de levadura (véase, por ejemplo, Kozyr, AV et al. 2004 Mol Biol (Mosk) 38(6):1067-75; Horwitz, AH. et al., 1988 Proc Natl Acad Sci U S A 85(22):8678-82; Bowdish, K. et al. 1991 J Biol Chem 266(18):11901 -8), la sobreexpresión de proteínas que potencian la producción de anticuerpos (véase, por ejemplo, Gasser, B. et al., 2006 Biotechol. Bioeng. 94(2):353-61), el nivel de acidez del cultivo (véase, por ejemplo, Kobayashi H., et al., 1997 Fe MS Microbiol Lett 152(2):235-42), las concentraciones de sustratos y/o iones (véase, por ejemplo, Ko JH. et al., 2996 Appl Biochem Biotechnol 60(1):41 -8). Además, pueden usarse sistemas de levadura para producir anticuerpos con una semivida ampliada (véase, por ejemplo, Smith, BJ. et al. 2001 Bioconjug Chem 12(5)750-756).

En una realización preferida, se producen anticuerpos en células de mamífero. Las células hospedadoras de mamífero preferidas para expresar los anticuerpos clonales o fragmentos de unión a antígeno de los mismos incluyen células de ovario de hámster chino (células CHO) (incluyendo células CHO dhfr-, descritas en Urlaub y Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas con un marcador de selección por DHFR, por ejemplo, como se describe en Kaufman y Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601 621), líneas de células linfocíticas, por ejemplo, células de mieloma NS0 y células SP2, células COS, células HEK293T (J. Immunol. Methods (2004) 289(1-2):65-80) y una célula de un animal transgénico, por ejemplo, un mamífero transgénico. Por ejemplo, la célula es una célula epitelial de mamífero.

En algunas realizaciones, los anticuerpos de unión a calicreína plasmática se producen en un sistema basado en plantas o sin células (véase, por ejemplo, Galeffi, P., et al., 2006 J Transl Med 4:39).

Además de la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de inmunoglobulina diversificado, los vectores de expresión recombinantes pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células hospedadoras (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores de selección. El gen marcador de selección facilita la selección de células hospedadoras en que el vector se ha introducido (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 4399216, 4634665 y 5179017). Por ejemplo, típicamente el gen marcador de selección confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedadora en que se ha introducido el vector. Los genes marcadores de selección preferidos incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en células hospedadoras dhfr- con selección/amplificación por metotrexato) y el gen neo (para selección por G418).

En un sistema ejemplar para expresión recombinante de un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se introduce un vector de expresión recombinante que codifican tanto la cadena pesada del anticuerpo como la cadena ligera del anticuerpo en células CHO dhfr- mediante transfección mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes de la cadena pesada y ligera del anticuerpo están unidos de manera funcional cada uno para potenciar/promover los elementos reguladores (por ejemplo, derivados de SV40, CMV, adenovirus y similares, tal como un potenciador de CMV/elemento regulador promotor de AdMLP o un potenciador de SV40/elemento regulador promotor de AdMLP) para dirigir niveles altos de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también porta un gen DHFR, que permite la selección de células CHO que se han transfectado con el vector usando selección/amplificación por metotrexato. Las células hospedadoras transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo y se recupera anticuerpo intacto del medio de cultivo. Se usan técnicas convencionales de biología molecular para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células hospedadoras, seleccionar transformantes, cultivar las células hospedadoras y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo. Por ejemplo, algunos anticuerpos pueden aislarse por cromatografía de afinidad con una matriz acoplada a Proteína A o Proteína G.

Para anticuerpos que incluyen un dominio Fc, el sistema de producción de anticuerpos puede producir anticuerpos en que la región Fc está glucosilada. Por ejemplo, el dominio Fc de moléculas IgG se glucosila en asparagina 297 en el dominio CH2. Esta asparagina es el sitio para modificación con oligosacáridos de tipo biantenario. Se ha demostrado que esta glucosilación es necesaria para las funciones efectoras mediadas por receptores de Fcg y C1q del complemento (Burton y Woof, 1992, Adv. Immunol. 51:1-84; Jefferis et al., 1998, Immunol. Rev. 163:59-76). En una realización, el dominio Fc se produce en un vector de expresión de mamífero que glucosila apropiadamente el residuo correspondiente a asparagina 297. El dominio Fc también puede incluir otras modificaciones postraduccionales eucariotas.

También pueden producirse anticuerpos mediante un animal transgénico. Por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5849992 describe un método de expresión de un anticuerpo en la glándula mamaria de un mamífero transgénico. Se construye un transgén que incluye un promotor específico de leche y ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo de interés y una secuencia señal para la selección. La leche producida por hembras de dichos mamíferos transgénicos incluye, secretado en la misma, el anticuerpo de interés. El anticuerpo puede purificarse de la leche o, para algunas aplicaciones, usarse directamente.

Composiciones farmacéuticas

Uno o más de los anticuerpos descritos en este documento pueden estar presentes en una composición, por ejemplo, una composición farmacéuticamente aceptable o composición farmacéutica. El anticuerpo de unión a calicreína plasmática puede formularse junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunos casos, hay de 100 mg a 300 mg de un anticuerpo descrito en este documento (por ejemplo, DX-2930 a una dosificación de 100 mg o 300 mg) presentes en una composición opcionalmente con un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, una composición farmacéuticamente aceptable o composición farmacéutica.

Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. Preferiblemente, el vehículo es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, medular o epidérmica (por ejemplo, por inyección o infusión), aunque también se contemplan vehículos adecuados para inhalación y administración intranasal.

Una sal farmacéuticamente aceptable es una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto y no confiere ningún efecto toxicológico indeseado (véase, por ejemplo, Berge, S.M., et al., 1977, J. Pharm. Sci. 66:1-19). Ejemplos de dichas sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de base. Las sales de adición de ácido incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos atóxicos, tales como ácido clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fósforo y similares, así como de ácidos orgánicos atóxicos tales como ácidos mono- y dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos fenilsustituidos, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos, y similares. Las sales de adición de base incluyen las derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas atóxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares.

Las composiciones pueden estar en una diversidad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas farmacéuticas líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma puede depender del modo pretendido de administración y aplicación terapéutica. Muchas composiciones están en forma de soluciones inyectables o infundibles, tales como composiciones similares a las usadas para administración de anticuerpos a seres humanos. Un modo ejemplar de administración es parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular). En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática se administra por infusión o inyección intravenosa. En otra realización preferida, la proteína de unión a calicreína plasmática se administra por inyección intramuscular o subcutánea. En otra realización preferida, la proteína de unión a calicreína plasmática se administra por inyección intraperitoneal.

Las expresiones "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral", como se usan en este documento, significan modos de administración distintos de administración enteral y tópica, habitualmente por inyección, e incluyen, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbitaria, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intramedular, epidural e intraesternal.

La composición puede formularse como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando la proteína de unión en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. En general, se preparan dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y secado por congelación que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente filtrada a esterilidad de los mismos. La fluidez apropiada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede conseguirse incluyendo en la composición un agente que retarda la absorción, por ejemplo, sales monoestearato y gelatina.

Un anticuerpo de unión a calicreína plasmática puede administrarse mediante una diversidad de métodos, incluyendo inyección o infusión intravenosa. Por ejemplo, para algunas aplicaciones terapéuticas, la proteína de unión a calicreína plasmática puede administrarse por infusión intravenosa a una tasa de menos de 30, 20, 10, 5 o 1 mg/min para alcanzar una dosis de aproximadamente 1 a 100 mg/m2 o de 7 a 25 mg/m2. La vía y/o modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. En determinadas realizaciones, el compuesto activo puede prepararse con un vehículo que protegerá el compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres y poli(ácido láctico). Están disponibles muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., 1978, Marcel Dekker, Inc., Nueva York.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse con dispositivos médicos. Por ejemplo, en una realización, una composición farmacéutica divulgada en este documento puede administrarse con un dispositivo, por ejemplo, un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, una bomba o implante.

En determinadas realizaciones, una proteína de unión a calicreína plasmática puede formularse para garantizar la distribución apropiada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BBB) excluye muchos compuestos muy hidrófilos. Para garantizar que los compuestos terapéuticos divulgados en este documento cruzan la BBB (si se desea), pueden formularse, por ejemplo, en liposomas. Para métodos de fabricación de liposomas, véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 4522811; 5374548; y 5399331. Los liposomas pueden comprender uno o más motivos que se transportan selectivamente a células u órganos específicos, por tanto, potencian el suministro dirigido de fármacos (véase, por ejemplo, V.V. Ranade, 1989, J. Clin. Pharmacol. 29:685).

Las pautas posológicas se ajustan para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse una sola inyección intravenosa rápida, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis pueden reducirse o aumentar proporcionalmente según indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma farmacéutica unitaria para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. Forma farmacéutica unitaria, como se usa en este documento, se refiere a unidades físicamente diferenciadas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas farmacéuticas unitarias puede estar regida por y ser directamente dependiente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a conseguir, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de formulación magistral de dicho compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.

Un intervalo no limitante ejemplar para una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un anticuerpo descrito en este documento es 0,1-20 mg/kg, más preferiblemente 1-10 mg/kg. Un anticuerpo anticalicreína plasmática puede administrarse, por ejemplo, por infusión intravenosa, por ejemplo, a una tasa de menos de 30, 20, 10, 5 o 1 mg/min para alcanzar una dosis de aproximadamente 1 a 100 mg/m2 o de aproximadamente 5 a 30 mg/m2. Los valores de dosificación pueden variar con el tipo y gravedad de la afección a aliviar. Para un sujeto particular, pueden ajustar pautas posológicas específicas a lo largo del tiempo de acuerdo con la necesidad del individuo y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones.

En algunos casos, la cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un anticuerpo descrito en este documento (por ejemplo, DX-2930) es de 30 a 400 mg, de 30 a 300 mg, de 30 a 250 mg, de 30 a 200 mg, de 30 a 150 mg, de 30 a 100 mg, de 30 a 50 mg, de 50 a 400 mg, de 50 a 300 mg, de 50 a 250 mg, de 50 a 200 mg, de 50 a 150 mg, de 50 a 100 mg, de 100 a 400 mg, de 100 a 300 mg, de 100 a 250 mg, de 100 a 200 mg, de 100 a 150 mg, de 150 a 400 mg, de 150 a 300 mg, de 150 a 250 mg, de 150 a 200 mg, de 200 a 400 mg, de 200 a 300 mg, de 200 a 250 mg, de 250 a 400 mg, de 250 a 300 mg o de 300 a 400 mg, o cualquier número entero intermedio. En algunos casos, la cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz es de 30 a 300 mg. En algunos casos, la cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz es 300 mg o más. En algunos casos, la cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz es 400 mg o más. En algunos casos, la cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz es de 100 a 300 mg (100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg o 300 mg).

En algunos casos, la cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un anticuerpo descrito en este documento (por ejemplo, DX-2930) es 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 110 mg, 120 mg, 130 mg, 140 mg, 150 mg, 160 mg, 170 mg, 180 mg, 190 mg, 200 mg, 210 mg, 220 mg, 230 mg, 240 mg, 250 mg, 260 mg, 270 mg, 280 mg, 290 mg, 300 mg, 310 mg, 320 mg, 330 mg, 340 mg, 350 mg, 360 mg, 370 mg, 380 mg, 390 mg o 400 mg. En algunos casos, la cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz es 30 mg, 100 mg o 300 mg. En algunos casos, la cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz es 100 mg o 300 mg. En algunos casos, la cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz es 100 mg. En algunos casos, la cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz es 300 mg.

En algunas realizaciones, la cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz se administra al menos dos veces, al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos seis veces, al menos siete veces, al menos ocho veces, al menos nueve veces, al menos diez veces o más. En algunos casos, la cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz se administra diariamente, en días alternos, cada tres días, cada cuatro días, cada cinco días, cada seis días, cada semana, en semanas alternas, cada tres semanas, cada cuatro semanas, cada cinco semanas, cada seis semanas, cada siete semanas, cada ocho semanas o más. En algunos casos, la cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz es 100 mg o 300 mg y la cantidad se administra cada dos semanas o cada cuatro semanas. En algunos casos, la cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz es 100 mg y esta cantidad del anticuerpo se administra cada dos semanas. En algunas realizaciones, la cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz es 300 mg y esta cantidad del anticuerpo se administra cada dos semanas o cada cuatro semanas. En algunas realizaciones, la cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz es 300 mg y esta cantidad del anticuerpo se administra cada dos semanas. En algunas realizaciones, la cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz es 300 mg y la cantidad se administra cada cuatro semanas.

En algunas realizaciones, la cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz es una cantidad que mantiene una concentración en plasma o suero del anticuerpo por encima de aproximadamente 80 nM (por ejemplo, por encima de 100 nm, por encima de 150 nM o por encima de 200 nM). En algunas realizaciones, la cantidad del anticuerpo es eficaz en mantener la concentración en plasma o suero del anticuerpo en el intervalo de aproximadamente 80-300 nM, por ejemplo, 80-100 nM, 80-120 nM, 80-150 nM, 100-150 nM, 100-200 nM, 150-200 nM o 200-300 nM. La concentración en plasma o suero puede medirse usando un ensayo adecuado, por ejemplo, un ensayo de actividad de calicreína plasmática tal como los descritos en este documento, un inmunoensayo tal como un ensayo ELISA o el ensayo de transferencia de Western para determinar cininógeno escindido como se describe en este documento, o por espectrometría de masas.

Las composiciones farmacéuticas divulgadas en este documento pueden incluir una "cantidad terapéuticamente eficaz" o una "cantidad profilácticamente eficaz" de una proteína de unión a calicreína plasmática divulgada en este documento.

Kits

Uno o más anticuerpos de unión a calicreína plasmática descritos en este documento pueden proporcionarse en un kit, por ejemplo, como un componente de un kit. Por ejemplo, el kit incluye (a) un anticuerpo de unión a calicreína plasmática, por ejemplo, una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que incluye un anticuerpo de unión a calicreína plasmática y, opcionalmente, (b) material informativo. El material informativo puede ser descriptivo, instructivo, publicitario u otro material que se refiera a un método descrito en este documento y/o el uso de un anticuerpo de unión a calicreína plasmática, por ejemplo, para un método descrito en este documento. En algunos casos, el kit comprende una o más dosis de un anticuerpo de unión a calicreína plasmática, por ejemplo, DX-2930. En algunos casos, la una o más dosis son 100 mg o 300 mg.

El material informativo del kit no está limitado en cuanto a su forma. En un caso, el material informativo puede incluir información acerca de la producción del compuesto, el peso molecular del compuesto, la concentración, la fecha de caducidad, información del lote o sitio de producción y similares. En un caso, el material informativo se refiere al uso del anticuerpo para tratar, prevenir o diagnosticar trastornos y afecciones, por ejemplo, una enfermedad o afección asociada con calicreína plasmática.

En un caso, el material informativo puede incluir instrucciones para administrar un anticuerpo de unión a calicreína plasmática de una manera adecuada para realizar los métodos descritos en este documento, por ejemplo, en una dosis, forma farmacéutica, modo de administración o pauta posológica adecuados (por ejemplo, una dosis, forma farmacéutica, pauta posológica o modo de administración descritos en este documento). En otro caso, el material informativo puede incluir instrucciones para administrar un anticuerpo de unión a calicreína plasmática a un sujeto adecuado, por ejemplo, un ser humano, por ejemplo, un ser humano que tiene, o está en riesgo de, una enfermedad o afección asociada con calicreína plasmática. Por ejemplo, el material puede incluir instrucciones para administrar una proteína de unión a calicreína plasmática a un paciente con un trastorno o afección descrito en este documento, por ejemplo, una enfermedad asociada con calicreína plasmática, por ejemplo, de acuerdo con una pauta posológica descrita en este documento. El material informativo de los kits no está limitado en cuanto a su forma. En muchos casos, el material informativo, por ejemplo, instrucciones, se proporciona en forma impresa, pero también puede estar en otros formatos, tal como material legible por ordenador.

Un anticuerpo de unión a calicreína plasmática puede proporcionarse en cualquier forma, por ejemplo, forma líquida, seca o liofilizada. Se prefiere que el anticuerpo de unión a calicreína plasmática sea sustancialmente puro y/o estéril. Cuando se proporciona un anticuerpo de unión a calicreína plasmática en una solución líquida, la solución líquida preferiblemente es una solución acuosa, prefiriéndose una solución acuosa estéril. Cuando se proporciona un anticuerpo de unión a calicreína plasmática como una forma seca, la reconstitución en general es mediante la adición de un disolvente adecuado. El disolvente, por ejemplo, agua estéril o tampón, puede proporcionarse opcionalmente en el kit.

El kit puede incluir uno o más recipientes para la composición que contiene un anticuerpo de unión a calicreína plasmática. En algunos casos, el kit contiene recipientes separados, divisores o compartimientos para la composición y el material informativo. Por ejemplo, la composición puede estar contenida en un frasco, vial o jeringa, y el material informativo puede estar contenido asociado con el recipiente. En otros casos, los elementos separados del kit están contenidos dentro de un solo recipiente indiviso. Por ejemplo, la composición está contenida en un frasco, vial o jeringa que tiene fijado en el mismo el material informativo en forma de una etiqueta. En algunos casos, el kit incluye una pluralidad (por ejemplo, un paquete) de recipientes individuales, conteniendo, cada uno, una o más formas farmacéuticas unitarias (por ejemplo, una forma farmacéutica descrita en este documento) de un anticuerpo de unión a calicreína plasmática. Por ejemplo, el kit incluye una pluralidad de jeringas, ampollas, envases de papel aluminio o envases alveolados, que contienen, cada uno, una sola dosis unitaria de un anticuerpo de unión a calicreína plasmática. Los recipientes de los kits pueden ser herméticos, resistentes al agua (por ejemplo, impermeables a cambios en la humedad o a la evaporación) y/u opacos a la luz.

El kit opcionalmente incluye un dispositivo adecuado para la administración de la composición, por ejemplo, una jeringa, o cualquier dispositivo de suministro de ese tipo. En un caso, el dispositivo es un dispositivo implantable que dosifica dosis medidas del anticuerpo. La divulgación también encarna un método para proporcionar un kit, por ejemplo, combinando componentes descritos en este documento.

Tratamiento

En algunos aspectos, la divulgación proporciona el uso de anticuerpos que se unen a calicreína plasmática activa (por ejemplo, calicreína plasmática activa humana) en el tratamiento de HAE. Los anticuerpos adecuados para su uso en el tratamiento descrito en este documento incluyen DX-2930 o una variante funcional del mismo como se describe en este documento, un anticuerpo que se une al mismo epítopo que DX-2930 o un anticuerpo que compite contra DX-2930 por la unión a calicreína plasmática activa humana.

Angioedema hereditario

El angioedema hereditario (HAE), también se conoce como "edema de Quincke", deficiencia de inhibidor de esterasa C1, deficiencia de inhibidor de C1 y edema angioneurótico hereditario (HANE). E1HAE se caracteriza por episodios recurrentes de tumefacción intensa (angioedema), que puede afectar, por ejemplo, a las extremidades, la cara, los genitales, el tubo gastrointestinal y las vías respiratorias. Los síntomas de HAE incluyen, por ejemplo, tumefacción en los brazos, las piernas, los labios, los ojos, la lengua y/o la garganta; bloqueo de las vías respiratorias que puede implicar tumefacción de la garganta y ronquera repentina; episodios repetidos de cólicos abdominales sin causa obvia; y/o tumefacción de los intestinos, que puede ser intensa y puede dar lugar a cólicos abdominales, vómitos, deshidratación, diarrea, dolor y/o choque. Aproximadamente un tercio de los individuos con HAE desarrollan un exantema no pruriginoso denominado eritema marginado durante un ataque.

La tumefacción de las vías respiratorias puede ser potencialmente mortal y provoca la muerte en algunos pacientes. Las tasas de mortalidad se estiman en un 15-33 %. El HAE da lugar a aproximadamente 15000-30000 visitas a urgencias al año.

Los traumatismos o las agresiones, por ejemplo, procedimientos dentales, enfermedades (por ejemplo, enfermedades víricas tales como catarros y gripe), la menstruación y la cirugía pueden activar un ataque de angioedema. Para prevenir los ataques agudos de HAE, los pacientes pueden intentar evitar estímulos específicos que hayan causado previamente ataques. Sin embargo, en muchos casos, se produce un ataque sin un activador conocido. Típicamente, los síntomas de HAE aparecen por primera vez en la infancia y empeoran durante la pubertad. De promedio, los individuos sin tratar tienen un ataque cada 1 a 2 semanas, y la mayoría de los episodios duran de aproximadamente 3 a 4 días (ghr.nlm.nih.gov/condition/hereditary-angioedema). La frecuencia y duración de los ataques varían enormemente entre personas con angioedema hereditario, incluso entre personas en la misma familia.

Hay tres tipos de HAE, conocidos como tipos I, II y III, que pueden tratarse todos ellos por los métodos descritos en este documento. Se estima que el HAE afecta a 1 de cada 50000 personas, que el tipo I representa aproximadamente un 85 por ciento de los casos, el tipo II representa aproximadamente un 15 por ciento de los casos y el tipo III es muy infrecuente. El tipo III es la forma más recientemente descrita y originalmente se creía que se producía solamente en mujeres, pero se han identificado familias con hombres afectados.

El HAE se hereda en un patrón dominante autosómico, de modo que una persona afectada puede heredar la mutación de un progenitor afectado. También se pueden producirse mutaciones nuevas y, por tanto, e1HAE también puede producirse en personas sin antecedentes del trastorno en su familia. Se estima que un 20-25 % de los casos son el resultado de una nueva mutación espontánea.

Mutaciones en el gen SERPING1 provocan angioedema hereditario de tipo I y tipo II. El gen SERPING1 proporciona instrucciones para generar la proteína inhibidora de C1, que es importante para controlar la inflamación. El inhibidor de C1 bloquea la actividad de determinadas proteínas que promueven la inflamación. Mutaciones que provocan angioedema hereditario de tipo I dan lugar a niveles reducidos de inhibidor de C1 en la sangre. Por el contrario, mutaciones que provocan el tipo II dan como resultado la producción de un inhibidor de C1 que funciona de manera anómala. Sin los niveles apropiados de inhibidor de C1 funcional, se generan cantidades excesivas de bradicinina. La bradicinina promueva la inflamación aumentando la filtración de líquido a través de las paredes de los vasos sanguíneos en tejidos corporales. La acumulación excesiva de líquidos en tejidos corporales provoca los episodios de tumefacción observados en individuos con angioedema hereditario de tipo I y de tipo II.

Mutaciones en el gen F12 están asociadas con algunos casos de angioedema hereditario de tipo III. El gen F12 proporciona instrucciones para generar el factor de coagulación XII. Además de desempeñar una función crucial en la coagulación sanguínea (coagulación), el factor XII también es un estimulador importante de la inflamación y está implicado en la producción de bradicinina. Determinadas mutaciones en el gen F12 provocan la producción de factor XII con actividad aumentada. Como resultado, se genera más bradicinina y las paredes de los vasos sanguíneos se vuelven más permeables, lo que da lugar a episodios de tumefacción. La causa de otros casos de angioedema hereditario de tipo III sigue siendo desconocida. Mutaciones en uno o más genes aún sin identificar pueden ser responsables del trastorno en otros casos.

El HAE se puede presentar de forma similar a otras formas de angioedema resultante de alergias u otras afecciones médicas, pero difiere significativamente en la causa y el tratamiento. Cuando el angioedema hereditario se diagnostica incorrectamente como alergia, muy habitualmente se trata con antihistamínicos, esteroides y/o epinefrina, que típicamente son ineficaces en HAE, aunque la epinefrina puede usarse para reacciones potencialmente mortales. Los diagnósticos incorrectos también han provocado cirugías exploratorias innecesarias de pacientes con tumefacción abdominal y, en algunos pacientes con HAE, el dolor abdominal se ha diagnosticado incorrectamente como psicosomático.

Los tratamientos con inhibidor de C1, así como otros tratamientos para HAE, se describen en Kaplan, A.P., J Allergy Clin Immunol, 2010, 126(5):918-925.

Se proporciona tratamiento agudo de los ataques de HAE para detener la progresión del edema lo más rápido posible. Concentrado de inhibidor de C1 de sangre de donadores, que se administra por vía intravenosa, es un tratamiento agudo; sin embargo, este tratamiento no está disponible en muchos países. En situaciones de urgencia donde no está disponible concentrado de inhibidor de C1, puede usarse plasma congelado reciente (FFP) como alternativa, ya que también contiene inhibidor de C1.

Se ha usado inhibidor de C1 purificado, derivado de sangre humana, en Europa desde 1979. Ahora están disponibles varios tratamientos de inhibidor de C1 en Estados Unidos y ahora están disponibles dos productos inhibidores de C1 en Canadá. Berinert P (CSL Behring), que está pasteurizado, se aprobó por la F.D.A. en 2009 para ataques agudos. Cinryze (ViroPharma), que está nanofiltrado, se aprobó por la F.D.A. en 2008 para profilaxis. Rhucin (Pharming) es un inhibidor de C1 recombinante en desarrollo que no conlleva el riesgo de transmisión de enfermedades infecciosas debidas a patógenos humanos de transmisión hemática.

El tratamiento de un ataque de HAE agudo puede incluir medicaciones para aliviar el dolor y/o líquidos IV.

Otras modalidades de tratamiento pueden estimular la síntesis de inhibidor de C1, o reducir el consumo de inhibidor de C1. Las medicaciones de andrógenos, tales como danazol, pueden reducir la frecuencia y gravead de los ataques estimulando la producción de inhibidor de C1.

Helicobacter pylori puede activar ataques abdominales. Los antibióticos para tratar H. pylori disminuirán los ataques abdominales.

Tratamientos más nuevos atacan la cascada de contacto. Ecalantida (KALBITOR®, DX-88, Dyax) inhibe la calicreína plasmática y se ha aprobado en Estados Unidos. Icatibant (FIRAZYR®, Shire) inhibe el receptor de bradicinina B2 receptor, y se ha aprobado en Europa y Estados Unidos.

El diagnóstico de HAE puede basarse en, por ejemplo, los antecedentes familiares y/o análisis de sangre. Los hallazgos de laboratorio asociados con HAE de tipos I, II y III se describen, por ejemplo, en Kaplan, A.P., J Allergy Clin Immunol, 2010, 126(5):918-925. En HAE de tipo I, el nivel de inhibidor de C1 está disminuido, como el nivel de C4, mientras que el nivel de C1q es normal. En HAE de tipo II, el nivel de inhibidor de C1 es normal o está aumentado; sin embargo, la función del inhibidor de C1 es anómala. El nivel de C4 está disminuido y el nivel de C1q es normal. En el tipo III, los niveles de inhibidor de C1, C4 y C1q pueden ser todos normales.

Los síntomas de HAE pueden evaluarse, por ejemplo, usando cuestionarios, por ejemplo, cuestionarios que se completan por los pacientes, los médicos o miembros de la familia. Dichos cuestionarios son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, escalas analógicas visuales. Véase, por ejemplo, McMillan, C.V. etal. Patient. 2012; 5(2):113-26.

Tratamiento de HAE con anticuerpos anti-PKal

La divulgación proporciona métodos de tratamiento (por ejemplo, mejorar, estabilizar o eliminar uno o más síntomas) de angioedema hereditario (HAE) administrando un anticuerpo descrito en este documento (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo descrito en este documento) a un sujeto que tiene o se sospecha que tiene HAE, por ejemplo, de acuerdo con una pauta posológica descrita en este documento. Además, se proporcionan métodos de tratamiento de HAE administrando un anticuerpo descrito en este documento (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo descrito en este documento), por ejemplo, de acuerdo con una pauta posológica descrita en este documento, o en combinación con un segundo tratamiento, por ejemplo, con otro agente, por ejemplo, descrito en este documento. La divulgación también proporciona métodos de prevención de HAE o un síntoma del mismo administrando un anticuerpo descrito en este documento (por ejemplo, una cantidad profilácticamente eficaz de un anticuerpo descrito en este documento) a un sujeto en riesgo de desarrollar HAE (por ejemplo, un sujeto que tiene un miembro de la familia con HAE o una predisposición genética al mismo), por ejemplo, de acuerdo con una pauta posológica descrita en este documento. En algunos ejemplos, el sujeto puede ser un paciente humano que no tiene síntomas de HAE en el momento del tratamiento.

Los anticuerpos que se unen a calicreína plasmática, por ejemplo, como se describe en este documento, tienen utilidades terapéuticas y profilácticas, particularmente en sujetos humanos. Estos anticuerpos se administran a un sujeto para tratar, prevenir y/o diagnosticar una diversidad de trastornos y afecciones incluyendo, por ejemplo, una enfermedad asociada con calicreína plasmática, o incluso a células en cultivo, por ejemplo, in vitro o ex vivo. Por ejemplo, estas proteínas de unión pueden usarse para modificar los efectos de la calicreína plasmática liberada de células en cultivo (Lilla et al., J. Biol Chem. 284(20):13792-13803 (2009)). El tratamiento incluye administrar una cantidad eficaz para aliviar, mitigar, alterar, remediar, mejorar, corregir o influir en el trastorno, los síntomas del trastorno o la predisposición al trastorno. El tratamiento también puede retardar la aparición, por ejemplo, evitar la aparición o evitar el deterioro de una enfermedad o afección.

También se describen métodos de administración de anticuerpos de unión a calicreína y otros agentes en "Pharmaceutical Compositions". Las dosificaciones adecuadas de las moléculas usadas pueden depender de la edad y peso del sujeto y el fármaco particular usado. El anticuerpo puede usarse como agente competitivo para inhibir, reducir una interacción indeseable, por ejemplo, entre calicreína plasmática y su sustrato (por ejemplo, factor XII o HMWK). La dosis del anticuerpo puede ser la cantidad suficiente para bloquear un 90 %, 95 %, 99 % o 99,9 % de la actividad de calicreína plasmática en el paciente, especialmente en el sitio de enfermedad. Esto puede requerir 0,1, 1,0, 3,0, 6,0 o 10,0 mg/kg. Para una IgG que tiene una masa molecular de 150000 g/mol (dos sitios de unión), estas dosis corresponden a aproximadamente 18 nM, 180 nM, 540 nM, 1,08 pM y 1,8 pM de sitios de unión para un volumen de sangre de 5 l.

En una realización, los anticuerpos se usan para inhibir una actividad (por ejemplo, inhibir al menos una actividad de calicreína plasmática, por ejemplo, reducir la producción de factor XIla y/o bradicinina) de calicreína plasmática, por ejemplo, in vivo. Las proteínas de unión pueden usarse en sí mismas o conjugarse con un agente, por ejemplo, un fármaco citotóxico, enzima citotoxina o radioisótopo.

Los anticuerpos pueden usarse directamente in vivo para eliminar células que expresan el antígeno mediante citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) natural o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Los anticuerpos descritos en este documento pueden incluir dominio efector de unión al complemento, tal como las partes Fc de IgG1, -2 o -3 o partes correspondientes de IgM que se unen al complemento. En una realización, una población de células diana se trata ex vivo con un anticuerpo descrito en este documento y células efectoras apropiadas. El tratamiento puede complementarse mediante la adición de complemento o suero que contiene complemento. Además, puede mejorarse la fagocitosis de células diana recubiertas con un anticuerpo descrito en este documento por unión a proteínas del complemento. En otra realización, células diana recubiertas con el anticuerpo que incluye un dominio efecto de unión al complemento se lisan por el complemento.

Se describen métodos de administración de anticuerpos de unión a calicreína plasmática en "composiciones farmacéuticas". Las dosificaciones adecuadas de las moléculas usadas dependerán de la edad y peso del sujeto y el fármaco particular usado. Los anticuerpos pueden usarse como agentes competitivos para inhibir o reducir una interacción indeseable, por ejemplo, entre un agente natural o patológico y la calicreína plasmática.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo, como se describe en este documento, puede administrarse a un sujeto que tiene, se sospecha que tiene o está en riesgo de HAE, tratando de ese modo (por ejemplo, mejorando o corrigiendo un síntoma o rasgo característico de un trastorno, ralentizando, estabilizando y/o deteniendo la progresión de la enfermedad) el trastorno.

El anticuerpo descrito en este documento puede administrarse en una cantidad terapéuticamente eficaz. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo es la cantidad que es eficaz, tras administración de una sola dosis o múltiples dosis a un sujeto, en el tratamiento de un sujeto, por ejemplo, cura, alivio, mitigación o mejora de al menos un síntoma de un trastorno en un sujeto hasta un grado más allá de los esperado en ausencia de dicho tratamiento.

Las pautas posológicas pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse una sola inyección intravenosa rápida, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma farmacéutica unitaria para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. Forma farmacéutica unitaria, como se usa en este documento, se refiere a unidades físicamente diferenciadas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido.

En algunas realizaciones, el anticuerpo (por ejemplo, DX-2930) se administra como una sola dosis, por ejemplo, a 0,1 hasta 3 mg/kg. En otros casos, se administra mediante múltiples dosis tal como una vez cada 1-4 semanas, por ejemplo, bisemanalmente o mediante administración mensual (por ejemplo, cada 28 días). Cada una de las múltiples dosis puede variar de 0,1 a 3 mg/kg. En algunos casos, a un paciente se le pueden dar múltiples dosis una vez cada 1-4 semanas, por ejemplo, bisemanalmente o mensualmente, durante un periodo adecuado de tiempo, y después seguido de tratamiento de mantenimiento mensual o bimensual a la misma dosis o menor.

En algunas realizaciones, el paciente puede controlarse para los efectos secundarios (por ejemplo, elevación de los niveles de creatina fosfatasa) y/o los niveles de inhibición de pKal por el anticuerpo (por ejemplo, concentración en suero o plasma del anticuerpo o el nivel de actividad de pKal) antes y después del tratamiento o durante el ciclo de tratamiento. Si se observa efecto adverso, la dosis del anticuerpo podría reducirse o podría terminarse el tratamiento. Si el nivel de inhibición está por debajo de un nivel terapéutico mínimo, podría administrarse dosis adicionales del anticuerpo al paciente.

En algunas realizaciones, la concentración en plasma o suero del anticuerpo (por ejemplo, DX-2930) puede medirse durante el ciclo de tratamiento (por ejemplo, después de la dosificación inicial) para evaluar la eficacia del tratamiento. Si la concentración en plasma o suero del anticuerpo es menor de aproximadamente 80 nM, puede necesitarse una dosificación de seguimiento, que puede ser igual o mayor que la dosificación inicial. La concentración en plasma o suero del anticuerpo puede medirse determinando el nivel de proteína del anticuerpo en una muestra de plasma o suero obtenida del sujeto, por ejemplo, mediante un inmunoensayo o ensayo de EM. La concentración en plasma o suero del anticuerpo también puede medirse determinando el nivel inhibidor de pKal en una muestra de plasma o suero obtenida de un sujeto tratado con el anticuerpo. Dichos ensayos pueden incluir el ensayo de sustrato sintético o el ensayo de transferencia de Western para medir cininógeno escindido como se describe en este documento.

Como alternativa o adicionalmente, el nivel en plasma o suero de creatina cinasa puede controlarse durante el ciclo de tratamiento. Si el nivel en plasma o suero de creatina cinasa se encuentra elevado durante el tratamiento, puede reducirse la dosificación del anticuerpo o puede terminarse el tratamiento.

En algunas realizaciones, una dosificación óptima (por ejemplo, dosificación profiláctica óptima o dosificación terapéutica óptima) de un anticuerpo anti-pKal como se describe en este documento (por ejemplo, DX-2930 o un fragmento de unión a antígeno del mismo) puede determinarse de la siguiente manera. El anticuerpo se administra a un sujeto que necesita el tratamiento a una dosis inicial. Se mide la concentración en plasma del anticuerpo en el sujeto. Si la concentración en plasma es menor de 80 nM, se aumenta la dosis del anticuerpo en una administración posterior. Una dosificación del anticuerpo que mantenga la concentración en plasma del anticuerpo por encima de aproximadamente 80 nM puede elegirse como dosificación óptima para el sujeto. El nivel de cretina fosfocinasa del sujeto puede controlarse durante el ciclo de tratamiento y la dosificación óptima para ese sujeto puede ajustarse adicionalmente basándose en el nivel de cretina fosfocinasa, por ejemplo, la dosificación del anticuerpo podría reducirse si se observa elevación de cretina fosfocinasa durante el tratamiento.

Politerapias

Un anticuerpo anticalicreína plasmática descrito en este documento puede administrarse en combinación con uno o más de los otros tratamientos para tratar una enfermedad o afección asociada con la actividad de calicreína plasmática, por ejemplo, una enfermedad o afección descrita en este documento. Por ejemplo, puede usarse un anticuerpo de unión a calicreína plasmática terapéutica o profilácticamente con cirugía, otro Fab o IgG anticalicreína plasmática (por ejemplo, otro Fab o IgG descrito en este documento), otro inhibidor de calicreína plasmática, un inhibidor peptídico o inhibidor micromolecular. Ejemplos de inhibidores de calicreína plasmática que pueden usarse en politerapia con anticuerpos de unión a calicreína plasmática descritos en este documento incluyen inhibidores de calicreína plasmática descritos en, por ejemplo, el documento WO 95/21601 o el documento WO 2003/103475.

Uno o más inhibidores de calicreína plasmática pueden usarse en combinación con uno o más anticuerpos de unión a calicreína plasmática descritos en este documento. Por ejemplo, la combinación puede provocar que se necesite una dosis menor del inhibidor, de modo que se reducen los efectos secundarios.

Un anticuerpo de unión a calicreína plasmática descrito en este documento puede administrarse en combinación con uno o más tratamientos actuales para tratar HAE. Por ejemplo, anticuerpo DX-2930 o una variante funcional del mismo como se describe en este documento puede usarse conjuntamente con un segundo agente terapéutico anti-HAE tal como ecalantida, un inhibidor de esterasa C1 (por ejemplo, CINRYZE™), aprotinina (TRASYLOL®) y/o un inhibidor del receptor de bradicinina B2 (por ejemplo, icatibant (FIRAZYR®)).

El término "combinación" se refiere al uso de los dos o más agentes o tratamientos para tratar al mismo paciente, en el que el uso o acción de los agentes o tratamientos solapan en el tiempo. Los agentes o tratamientos pueden administrarse al mismo tiempo (por ejemplo, como una sola formulación que se administra a un paciente o como dos formulaciones separadas administradas simultáneamente) o secuencialmente en cualquier orden. Las administraciones secuenciales son administraciones que se dan en diferentes momentos. El tiempo entre la administración de un agente y otro agente puede ser minutos, horas, días o semanas. El uso de un anticuerpo de unión a calicreína plasmática descrito en este documento también puede usarse para reducir la dosificación de otro tratamiento, por ejemplo, para reducir los efectos secundarios asociados con otro agente que se está administrando. Por consiguiente, una combinación puede incluir administrar un segundo agente a una dosificación al menos un 10, 20, 30 o 50 % menor que la que se usaría en ausencia del anticuerpo de unión a calicreína plasmática.

Una politerapia puede incluir la administración de un agente que reduce los efectos secundarios de otros tratamientos. El agente puede ser un agente que reduce los efectos secundarios de un tratamiento de enfermedad asociada con calicreína plasmática.

Sin mayor desarrollo, se cree que un experto en la materia, basándose en la descripción anterior, puede utilizar la presente invención hasta su máxima extensión. Las siguientes realizaciones específicas, por lo tanto, deben interpretarse como simplemente ilustrativas, y no limitativas del resto de la divulgación en modo alguno.

Ejemplos

Ejemplo 1: Estudio de una sola dosis ascendente de DX-2930 en voluntarios sanos

Se realizó un estudio de una sola dosis ascendente en voluntarios sanos usando las siguientes dosis de DX-2930: 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1 mg/kg y 3 mg/kg. Los datos para cada voluntario se obtienen y analizan para determinar la seguridad de cada dosis. La secuencias completas y variables de la cadena pesada y ligera para DX-2930 se proporcionan a continuación, con las secuencias señal en cursiva. Las CDR están en negrita y subrayadas.

Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de DX-2930 (451 aminoácidos, 49439,02 Da) MGWSCILFLVA TA TGAHSEV QLLE S GGGL V QPGGSLRL S C A AS GF TF SHYIMM WVROAPGKGLEWVSGIYSSGGIT VYADS VKGRFTISRDN SKNTLYLOMN SL RAEDT A V Y Y C A Y RRIG VPRKDEFDIW GO GTM VT V S S AS TKGP S VFPL AP S SK S T S GGT AALGCL VKD YFPEP VT V S WN S GALT S GVHTFP A VLQ S S GL Y SL S S V V T VP S S SLGTQT YICN VNHKP SNTK VDKRVEPK S CDKTHT CPPCP APELLGGP S YFLFPPKPKDTLMISRTPEYT C YYYD V SHEDPEYKFNW YYDGYEYHNAKTKP REEQ YN ST YRVV S VLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALP APIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

(SEQ ID NO: 1)

Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de DX-2930 (213 aminoácidos, 23419,08 Da) MGWSCILFLVA TA 7GA//SDIOMTOSPSTLSASVGDRVTITCRASO SISSW LAWY OOKPGKAPKLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLOPDDFATYYCOO YNTYWTF GQGTK VEIKRT VAAP S VFIFPP SDEQLKSGT AS VV CLLNNF YPREA K V Q W K VDNALQ S GN S QE S VTEQD SKD STYSLSSTLTL SK AD YEKHK V Y ACE VTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 2)

Secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada de DX-2930 EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSHYIMMWVROAPGKGLEWVSGI YSSGGITVY A P S V K G RFTISRDN SKNTLYLOMN SLRAEDTAVYY C AY RRIG VPRRDEFDIWGOGTMVTVSS (SEQ ID NO: 3)

Secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera de DX-2930 DIOMTOSPSTLSASVGDRVTITCRASO SISSW LAW YOOKPGKAPKLLIYKAST LESGVPSRF SGSGSGTEFTLTIS SLQPDDF ATYY CQQYNTYWTF GQGTK VEIK

(SEQ ID NO: 4)

Tabla 1. CDR para DX-2930.

Diseño del estudio en fase 1a

Este estudio fue aleatorizado, con doble enmascaramiento y controlado con placebo. Se administraron por vía subcutánea dosis individuales y ascendentes de DX-2930 a sujetos sanos. Los participantes se asignaron aleatoriamente a una de cuatro cohortes de sujetos, cada una correspondiente a una sola dosis (0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1 mg/kg o 3 mg/kg). Cada cohorte contenía seis sujetos tratados con fármaco activo y dos sujetos tratados con placebo. Todos los sujetos se controlaron durante 16 semanas después de completarse la pauta posológica.

Resultados de seguridad

DX-2930 se toleró bien, sin evidencia de toxicidad limitante de la dosis, a dosis individuales de hasta 3,0 mg/kg. Por tanto, este estudio no produjo evidencia de ninguna señal de seguridad clínicamente significativa relacionada con DX-2930.

Los resultados de laboratorio clínico no demostraron desequilibrio clínicamente significativo entre DX-2930 y placebo para ningún acontecimiento adverso. Los acontecimientos adversos más normalmente presentados incluyen cefalea (un 25 % de sujetos tratados con DX-2930 y un 25 % de sujetos tratados con placebo). Ningún acontecimiento adverso fue grave y todos los acontecimientos adversos se resolvieron.

El análisis de signos vitales, exámenes físicos y electrocardiogramas (ECG) demostró una infección respiratoria superior en un sujeto que recibió una dosis de 0,1 mg/kg, sin embargo, el investigador informó de que la infección era leve y no relacionada con el tratamiento. Por lo demás, no hubo anomalías observadas con los signos vitales, los exámenes físicos y los electrocardiogramas (ECG) de los sujetos del estudio.

El ensayo de anticuerpo antifármaco no produjo evidencia de serocon versión.

Solamente dos sujetos AA grave se presentaron como relacionados con el tratamiento por el investigador que desconocía el tratamiento. Se observó elevación de creatina fosfocinasa de 902 U/l [intervalo de referencia: 21-215 U/l] en un sujeto al que se dosificó 0,1 mg/kg de DX-2930 (un 4,2 % de todos los sujetos tratados con DX-2930). Se observó elevación de creatina fosfocinasa de 1967 U/l [intervalo de referencia: 32-294 U/l] en un sujeto al que se dosificó placebo (un 12,5 % de todos los sujetos tratados con placebo). Los resultados no demostraron anomalía de laboratorio asociada con ningún otro AA o hallazgo que pudiera indicar importancia clínica. No hubo reacciones en el sitio de la inyección en ningún sujeto.

Tabla 2: Resumen de datos de seguridad de estudio en fase 1a

Resultados farmacodinámicos (PD) y farmacocinéticos (PK)

La tabla 3 proporciona las estimaciones de parámetros farmacocinéticos para cada cohorte de dosis. Los valores de C^max media y ABC^última muestran una dependencia estricta y lineal de la dosis coherente con un anticuerpo de buen comportamiento. Los fármacos con semividas largas posibilitan pautas posológicas infrecuentes para conseguir niveles en sangre constantes y estables. DX-2930 demostró una semivida prolongada coherente de casi tres semanas por todos los grupos de dosis.

Un candidato terapéutico para la profilaxis de HAE debe tener una semivida larga y un perfil farmacocinético predecible para posibilitar la dosificación infrecuente y un fundamento lógico y técnico de dosificación. DX-2930 proporciona un perfil farmacocinético coherente, posibilitando de ese modo una determinación de una pauta posológica para proporcionar beneficio terapéutico significativo a pacientes con HAE.

Tabla 3

Los parámetros farmacocinéticos (PK) de DX-2930 se evaluaron después de una sola dosis en sujetos sanos. Después de una sola dosis de 3 mg/kg, se obtuvieron concentraciones en plasma del fármaco que excedían el nivel objetivo de 80 nM. Niveles de fármaco de aproximadamente o mayores de 80 nM se mantuvieron durante aproximadamente 10 días (figura 7). Los niveles de fármacos seguirán acumulándose tras administración repetida del fármaco hasta que se alcance un estado constante. Incluso después de solamente una sola dosis de DX-2930, se obtuvieron niveles de fármaco que excedían el objetivo de 80 nM y se mantuvieron durante un periodo prolongado de tiempo. Los datos PK de este estudio apoyan la viabilidad de una estrategia de dosificación para obtener concentraciones en plasma del fármaco por encima del nivel objetivo de 80 nM y para mantenerlas continuamente después. Además, pueden conseguirse niveles de fármaco mayores más allá de 80 nM si es necesario para obtener inhibición suficiente de calicreína plasmática pertinente para la profilaxis de HAE.

Se realizó evaluación farmacodinámica (PD) de DX-2930. Para caracterizar adicionalmente DX-2930, se realizaron ensayos de biomarcadores exploratorios ex vivo en muestras de plasma de sujetos para evaluar el perfil farmacodinámico de la molécula. Se realizaron dos ensayos independientes, un ensayo de actividad de calicreína plasmática usando un sustrato fluorógeno artificial y un ensayo de transferencia de Western que mide la escisión de cininógeno, el sustrato natural de calicreína plasmática a partir del que se genera bradicinina.

Estos ensayos son semicuantitativos. Por lo tanto, los datos puntuales deben interpretarse con respecto a otros datos puntuales dentro de ese experimento y no compararse entre los ensayos o con otros sistemas de ensayo. Estos ensayos se realizan en plasma de sujeto normal con niveles normales de inhibidor de C1. En consecuencia, los sujetos sanos usados en estos ensayos de biomarcadores no desarrollan ataques de HAE. El objetivo de estas evaluaciones de biomarcadores fue confirmar que DX-2930 en plasma de sujetos dosificados tiene actividad inhibidora contra calicreína plasmática. Igual de importante, estos estudios se realizaron para evaluar si los resultados farmacodinámicos corroboraban el perfil PK observado.

La figura 9 representa los efectos farmacodinámicos de DX-2930. El plasma de sujetos tratados con fármaco del estudio se activó ex vivo para inducir la ruta del sistema de contacto y de ese modo estimular la generación y actividad de calicreína plasmática. La actividad de pKal se midió mediante un ensayo fluorógeno. Se presentan los datos de los grupos de 1 y 3 mg/kg. La inhibición de calicreína plasmática fue claramente evidente, particularmente en los grupos de dosis de 1 y 3 mg/kg. No se observó inhibición apreciable en los grupos de 0,1 mg/kg o de placebo. La inhibición observada fue tanto dependiente de la dosis como dependiente del tiempo y confirma la actividad inhibidora de DX-2930. El efecto PD de DX-2930 corrobora los datos PK para DX-2930.

Uso terapéutico de DX-2930

Para profilaxis eficaz, un requisito para la eficacia es que la diana del fármaco pertinente se inhiba a un nivel por encima de la cantidad requerida mínima en una base continua. Huecos en la cobertura de inhibición se tienen que minimizar o evitar totalmente. Cuando el nivel de inhibición cae por debajo del nivel requerido mínimo, el individuo es biológicamente vulnerable para la activación del proceso patológico y puede situarse en riesgo clínicamente para el episodio de enfermedad.

El HAE no está exento de los principios ampliamente establecidos de profilaxis. En HAE, la calicreína plasmática representa una diana de fármaco validada que es crucial para la patogenia de los ataques de angioedema. Prevenir los ataques de HAE puede requerir que la inhibición de la calicreína plasmática se mantenga continuamente por encima del nivel terapéutico mínimo. Huecos en la cobertura a lo largo del tiempo tienen que minimizarse para evitar periodos de vulnerabilidad. Esta necesidad se enfatiza más por el fenómeno de un bucle de retroalimentación positiva que se especula que desempeña una función importante en los ataques de HAE. Tras el inicio de esta cascada, la activación de calicreína plasmática da lugar a activación de factor XII que, a su vez, dirige la generación de más calicreína plasmática.

La inhibición de calicreína plasmática por DX-2930 y ecalantida, un agente terapéutico conocido aprobado en Estados Unidos para tratamiento agudo de los ataques de HAE, se comparó en un ensayo in vitro. En este sistema, se expuso

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que se une a calicreína plasmática activa para su uso en un método de tratamiento de angioedema hereditario (HAE), comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita el anticuerpo en una cantidad eficaz de aproximadamente 300 mg cada dos semanas o cada cuatro semanas;

en el que el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 3 y una región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 4, en el que el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa.

2. El anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una secuencia de la cadena pesada de

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYIMMWVRQAPGKGLEWVSGIYS SGGITVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCAYRRIGVPRRDEFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG y una secuencia de la cadena ligera de DIQMTQSPSTLSASVGDRYTITCRASQSISSWLA WYQQKPGKAPKLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDF AT YY C QQ YNTYWTF GQGTKVEIKRT V AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT EQD SKD ST Y SL S STLTL SKAD YEKHK VY ACE VTHQGL S SP VTKSFNRGEC.

3. El anticuerpo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el sujeto es un paciente humano que tiene, se sospecha que tiene o está en riesgo de HAE, opcionalmente en el que el anticuerpo se administra para tratamiento profiláctico.

4. El anticuerpo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la cantidad del anticuerpo es eficaz en mantener la concentración en plasma o suero del anticuerpo en el intervalo de aproximadamente 80-300 nM.

5. El anticuerpo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además medir la concentración en plasma del anticuerpo por ensayo de actividad de calicreína plasmática, un inmunoensayo o espectrometría de masas.

6. El anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la concentración en plasma del anticuerpo se mide por un ensayo de actividad de calicreína plasmática o un inmunoensayo.

7. El anticuerpo para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además controlar el nivel de creatina fosfocinasa en el sujeto antes y después del tratamiento, o en el que se administran múltiples dosis, controlar el nivel de creatina fosfocinasa durante el ciclo de tratamiento, opcionalmente que comprende además reducir la dosis del anticuerpo o terminar el tratamiento si se observa elevación de creatina fosfocinasa.

8. El anticuerpo para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la administración es administración subcutánea.

9. El anticuerpo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el anticuerpo tiene una CI50 de menos de 100 nM.

10. El anticuerpo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el anticuerpo modula la actividad de calicreína plasmática, así como la producción de factor XI Ia y/o bradicinina.

11. El anticuerpo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el anticuerpo es una IgG.