ES2846675T3 - Actividad antimicrobiana, antibacteriana y que inhibe la germinación de esporas de compuestos extraídos de aguacate - Google Patents
Actividad antimicrobiana, antibacteriana y que inhibe la germinación de esporas de compuestos extraídos de aguacate Download PDFInfo
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Abstract
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Description
DESCRIPCIÓN
Actividad antimicrobiana, antibacteriana y que inhibe la germinación de esporas de compuestos extraídos de aguacate
Antecedentes de la invención
1. Campo técnico
Algunas definiciones técnicas relevantes para la invención incluyen “bacterias que no forman esporas”, que es un término conocido usado para las bacterias patógenas y de deterioro que no pueden formar esporas bacterianas y pueden destruirse o controlarse mediante un tratamiento térmico, almacenamiento anaerobio refrigerado, sustancias antibacterianas y otros métodos conocidos en la técnica usados solos o en combinación. Otro término relevante es “bacterias que forman esporas”, que incluye bacterias patógenas y de deterioro capaces de formar estructuras muy resistentes denominadas esporas bacterianas (también denominadas endosporas) que no se destruyen o controlan necesariamente mediante los métodos comunes conocidos en la técnica para el control de bacterias que no forman esporas y requieren tratamientos específicos para su inhibición y/o inactivación. Además, ambos tipos de bacterias pueden existir en la naturaleza en un “estado vegetativo” también denominadas células viables; sin embargo, las bacterias que forman esporas también pueden existir en un “estado de esporas” que es más resistente a los tratamientos químicos y físicos para su inactivación. En el campo de las tecnologías alimentarias, existen estados bacterianos adicionales para las bacterias que forman esporas que se crean de manera artificial mediante la aplicación de calor denominadas “esporas sometidas a choque térmico” y/o presión “esporas sometidas a choque por presión”. Los estados artificiales generados en la industria alimentaria dan como resultado una resistencia aún mayor de las esporas a su inactivación por medios químicos y físicos y en algunos sistemas alimentarios deben controlarse para inhibir su germinación en la forma vegetativa de las bacterias que forman esporas y el posterior deterioro del alimento y/o la producción de toxinas.
Esta invención se refiere a las técnicas farmacéutica y alimentaria. En particular, se refiere a un método para inhibir las células vegetativas, la germinación de esporas y el crecimiento de bacterias grampositivas mediante el uso de compuestos químicos presentes de manera natural en Persea americana, tal como se define en las reivindicaciones.
La invención también se refiere a las técnicas médicas. En particular, se refiere a un método para inhibir el crecimiento de bacterias patógenas que forman esporas en el cuerpo, incluyendo el tracto gastrointestinal de un vertebrado humano o no humano mediante el uso de un extracto antimicrobiano que comprende los compuestos tal como se definen en las reivindicaciones con especificidad para este tipo de bacterias.
Se conoce en la disciplina del procesamiento de alimentos que los productos alimenticios con valores de pH > 4,6 (conocidos comúnmente en la industria alimentaria como alimentos de baja acidez) pueden experimentar la germinación y el crecimiento de bacterias que forman esporas. De particular interés para la industria alimentaria es el uso de aditivos alimentarios capaces de inhibir la germinación de esporas y el crecimiento celular vegetativo de microorganismos patógenos que forman esporas tales como Clostridium botulinum, Clostridium perfringens y Bacillus cereus, entre otros. En los entornos alimentarios apropiados, tales como recipientes cerrados o condiciones anaerobias generadas dentro de la matriz alimentaria, las esporas de estos microorganismos patógenos pueden germinar y crecer hasta un número dañino de células bacterianas y, en algunos casos, pueden producir toxinas que ponen en peligro la salud humana. Particularmente, las cepas proteolíticas y no proteolíticas de Clostridium botulinum son una preocupación importante para la industria alimentaria debido a la posible germinación de sus esporas bacterianas en los alimentos y la producción de potentes neurotoxinas. Los nitritos son los aditivos alimentarios más usados comúnmente en la industria alimentaria para retardar/inhibir el crecimiento de bacterias patógenas que forman esporas en alimentos refrigerados de baja acidez. Sin embargo, existe un interés de los consumidores y de la industria desde hace mucho tiempo en reducir la utilización de aditivos alimentarios sintéticos, particularmente compuestos de nitrito. Otros aditivos alimentarios que se han usado para los mismos fines incluyen nisina (Rayman, 1981), péptidos recombinantes (Tang et al., 2008), 5-aminosalicilatos (Lin y Pimentel, 2001) y arginato de etil lauroílo (Beltran et al., 2011). De manera adicional, existen patentes y artículos anteriores relacionados con compuestos antimicrobianos de origen natural que actúan contra las células vegetativas bacterianas. Se ha informado que muchas fuentes naturales contienen compuestos antimicrobianos principalmente lipófilos, aunque algunos compuestos hidrófilos también han mostrado actividad. Los informes de compuestos antimicrobianos de esta naturaleza están disponibles en la bibliografía.
La invención también se refiere a un importante problema de salud pública que es la capacidad de las especies patógenas, especialmente la Listeria monocytogenes grampositiva, de crecer a temperaturas de refrigeración comercial a las que se almacenan normalmente los alimentos procesados antes del consumo final. Listeria monocytogenes es una bacteria patógena que no forma esporas de especial interés para las carnes listas para el consumo y los productos lácteos; ya que tales alimentos no se calientan frecuentemente por el usuario antes de su consumo. Se sabe en la técnica que el consumo de alimentos contaminados con Listeria monocytogenes aumenta el riesgo de infección, especialmente entre lactantes, ancianos, mujeres embarazadas y cualquier individuo inmunodeprimido.
Para los fines de esta invención, un agente esporocida es una sustancia con la capacidad de destruir al menos algunos tipos de esporas bacterianas mientras que un agente esporostático es una sustancia que tiene la capacidad de inhibir el crecimiento y la reproducción de al menos algunos tipos de esporas bacterianas. Los inhibidores de la germinación de esporas incluyen agentes esporicidas y esporostáticos.
Además, salvo que se indique lo contrario, se pretende que las representaciones de los compuestos descritos a continuación abarquen todas las formas estereoisoméricas de los mismos, que incluyen las formas (R) y (S), y las formas cis (Z) y trans (E) de los compuestos, en la medida en que estén dentro del alcance definido para los compuestos y usos de los mismos en las reivindicaciones. Para los fines de esta invención, la forma trans (E) puede incluir un alqueno terminal que tiene la fórmula -CH = CH2 (véase, por ejemplo, el (2R, 16E)-1-acetoxi-2-hidroxi-4-oxononadeca-16,18-dieno a continuación).
2. Descripción de la técnica relacionada
Jensen en 1951 (patente estadounidense 2.550.254) obtuvo un extracto de acetona a partir de semilla de aguacate (Persea gratissima) que tenía actividad antibacteriana contra células vegetativas de Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Aspergillus glaucus, Penicillium notatum y Achromobacterperolens. Este extracto se encontró que era inactivo contra Esherichia coli, Pseudomonas fluorescens y Penicilliun camemberti. El mismo autor en 1953 (patente canadiense 494.110) se refiere a semilla de aguacate (Persea americana) como otra fuente natural que podría usarse para obtener un extracto con actividad antimicrobiana. Valeri y Gimeno (1954) extrajeron semillas de aguacate con éter de petróleo y notificaron que la cera bruta resultante presentaba crecimiento inhibido de Micrococcus pyogenes y Sarcina lutea, pero no crecimiento de B. subtilis o de E. coli. La técnica anterior indica que las semillas de aguacate contienen compuestos antimicrobianos pero la bioactividad bioespecífica del extracto contra microorganismos particulares depende claramente del método de extracción, que al final influye en la composición química del extracto.
En la técnica relacionada, se han aislado algunos compuestos de extractos de semillas de aguacate y se han sometido a prueba para inhibir el crecimiento de determinados microorganismos (bacterias, levaduras y hongos). Kashman et al. (1969) aislaron y esclarecieron la estructura de ocho compuestos a partir de un extracto de hexano de frutos y semillas de aguacate y se prepararon varios derivados del mismo, obteniendo mayores rendimientos a partir de las semillas que a partir del fruto. Todos los compuestos presentados por Kashman (1969) pertenecen al mismo grupo de compuestos alifáticos de cadena larga, con un extremo que es insaturado y el otro altamente oxigenado. Curiosamente, los autores dividieron los compuestos en pares que se diferenciaban sólo por tener un doble o triple enlace en el extremo de la cadena. El aislamiento de estos compuestos fue con el objetivo de realizar una caracterización química y no para obtener componentes bioactivos (no aislamiento guiado por bioactividad). Luego se realizaron estudios adicionales para evaluar su actividad antimicrobiana contra Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Salmonella typhi, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae (ATCC 7752 y S 288C) (Néeman et al. 1970). Solo seis de los doce compuestos alifáticos de cadena larga sometidos a prueba demostraron efectos inhibidores contra algunos de los microorganismos, pero sólo 1, 2, 4-trihidroxi-n-hepadeca-16-eno fue capaz de inhibir el crecimiento de todos los microorganismos incluidos en su estudio en una prueba antimicrobiana de inhibición en discos que usó 0,05 mg del compuesto. Los autores concluyeron que cuando los grupos hidroxilo de la parte oxidada del compuesto se acetilaron total o parcialmente, la actividad antibacteriana se debilitó en gran medida (Néeman et al. 1970). Por tanto, las acetogeninas, que son la forma acetilada de los compuestos alifáticos de cadena larga mencionados anteriormente, no inhibieron el crecimiento de los microorganismos mencionados anteriormente. Baratta et al. (1998) realizaron más recientemente un estudio para evaluar las propiedades antimicrobianas y antioxidantes de un extracto de aceites esenciales de plantas, incluyendo el laurel (Laurus nobilis) forman la familia Lauraceae pero no incluyeron el género Persea.
Recientemente, Ugbogu y Akukwe (2009) informaron sobre los efectos antimicrobianos de los aceites de semillas de Persea gratissima, Gaerth F, entre otros aceites de semillas vegetales, contra aislados clínicos de bacterias que no forman esporas que incluían Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermis. Los autores informaron el uso potencial de aceites de semillas de Persea en el tratamiento de heridas. Chia y Dykes (2010) también prepararon extractos etanólicos del epicarpio y semilla de Persea Americana Mill. vars. Hass, Shepard y Fuerte. Informaron que a concentraciones entre 104,2-416,7 |ig/ml, el extracto mostró actividades antimicrobianas contra el crecimiento de células vegetativas de bacterias tanto grampositivas como gramnegativas; los autores también prepararon un extracto acuoso que sólo inhibía el crecimiento de Listeria monocytogenes (93,8-375 |ig/ml) y Staphylococcus epidermis (354,2 |ig/ml). La actividad contra el género Clostridium o Bacillus no fue evaluado para el extracto etanólico o acuoso. Rodríguez-Carpena et al. (2011), en un intento por aislar moléculas con actividades antibacterianas, prepararon extractos de la cáscara, pulpa y semilla de dos variedades cultivadas de aguacate (Persea Americana Mill.) usando tres disolventes diferentes que incluían acetato de etilo, acetona (70%) y metanol (70%). Los autores sometieron a prueba las propiedades antibacterianas de los extractos frente a un panel de células vegetativas de bacterias que no forman esporas y que forman esporas, concluyendo que su actividad antibacteriana era moderada y se atribuía a la presencia de compuestos fenólicos en sus extractos. Por tanto, los estudios citados anteriormente no realizaron con éxito el aislamiento o la identificación química de los componentes posiblemente responsables de las bioactividades observadas o sometieron a prueba esporas bacterianas, esporas sometidas a choque térmico o esporas sometidas a choque por presión.
Asimismo, otros autores han sometido a prueba las propiedades antimicrobianas de la planta de aguacate, contra microorganismos distintos de las bacterias. Prusky et al. (1982) describieron la presencia de 1-acetoxi-2-hidroxi-4-oxoheneicosa-12,15-dieno (persina) en la cáscara de frutos de aguacate inmaduros y atribuyeron a la molécula la actividad antimicrobiana contra Colletotrichum gloeosporioides, un hongo que provoca antracnosis, un problema conocido que se encuentra durante el almacenamiento de frutos de aguacate. El compuesto se aisló mediante cromatografía en capa fina a partir de un extracto etanólico repartido con diclorometano. Este compuesto fue posteriormente denominado “persina” (Oelrichs et al., 1995), y fue confirmado por otros autores como el constituyente del aguacate con mayor actividad inhibidora contra el crecimiento vegetativo de los hongos Colletotrichum gloeosporioides sometido a prueba in vitro (Sivanathan y Adikaram, 1989; Domergue et al., 2000), y con la capacidad para inhibir la germinación de sus esporas de hongos y el alargamiento del tubo germinal (Prusky et al., 1991a). La persina inhibió completamente la germinación de las esporas de los hongos a 790 |ig/ml y la concentración de este compuesto en las cáscaras se redujo considerablemente durante la maduración (Prusky et al., 1982). Un monoeno con estructura similar, 1-acetoxi-2,4-dihidroxi-n-heptadeca-16-eno, también demostró bioactividad contra Colletotrichum gloeosporioides pero era 3 veces menor que el de persina. Curiosamente, una mezcla 1:1 de ambos compuestos antifúngicos mostró actividad sinérgica y aumentó el porcentaje de alargamiento inhibido del tubo germinal de conidios germinados (Prusky et al., 1991b). También se ha demostrado que otros compuestos tales como 1-acetoxi-2-hidroxi-4-oxo-heneicosa-5,12,15-trieno (Domergue et al., 2000) tienen bioactividad antifúngica. Este último compuesto se ha denominado “persenona A” (Kim et al., 2000a), sin embargo ninguno de los aislamientos se ha realizado basándose en su bioactividad o con el objetivo de descubrir nuevos compuestos o mezclas con bioactividad aumentada. La mayoría de las publicaciones de la técnica anterior se han centrado en encontrar moléculas para prevenir el daño tras la recogida.
Otras bioactividades que se han informado para las acetogeninas incluían propiedades insecticidas, antitumorales y antihelmínticas. La persina ha demostrado tener actividad insecticida, inhibiendo la alimentación larvaria de larvas de gusano de seda Bombyx mori L., a una concentración en la dieta artificial de 200 |ig/g o mayor (Chang et al., 1975; Murakoshi et al., 1976). Más recientemente, Rodríguez-Saona et al. (1997) demostraron los efectos de la persina en Spodoptera exigua, un insecto alimentador generalista, que no se alimenta de aguacates, pero es una de las principales plagas de muchas hortalizas. Se observaron efectos inhibidores tanto para el crecimiento como para la alimentación larvarios a concentraciones de 200 |ig/g y 400 |ig/g de dieta, respectivamente.
La persina también se identificó como el principio activo presente en las hojas de aguacate que induce la necrosis de la glándula mamaria lactante de ratones a una tasa de dosis de 60-100 mg/kg, en dosis superiores a 100 mg/kg puede producirse necrosis de las fibras miocárdicas de ratones y puede estar presente hidrotórax en animales gravemente afectados (Oelrichs et al., 1995). Derivado de este efecto, este compuesto y otros obtenidos de hojas de aguacate se patentaron como tratamiento para el cáncer de ovario y mama en mamíferos (Seawright et al., 2000). Los compuestos se administraron por vía oral hasta 100 mg/kg de peso corporal del mamífero que va a tratarse, pero preferiblemente en varios días consecutivos a una concentración de 20-40 mg/kg de peso corporal para evitar los efectos tóxicos previamente informados. Tal como se señaló anteriormente, la concentración de estos compuestos en la pulpa de aguacate se reduce considerablemente durante la maduración a valores inferiores a 1500 |ig/g (Kobiler et al, 1993); por tanto, un humano de 60 kg debe consumir diariamente más de 0,8 kg de pulpa de aguacate para alcanzar el efecto anticancerígeno e incluso una concentración mayor para alcanzar los efectos citotóxicos. La dosis terapéutica anual propuesta para el tratamiento del cáncer es 160 veces mayor que el consumo real anual per cápita de aguacate en los Estados Unidos (1,8 kg o 4,1 libras) informado por Pollack et al (2010) Se encontró que la persenona A, y su análogo 1-acetoxi-2-hidroxi-5-nonadecen-4-ona (persenona B), junto con persina, inhiben la generación de superóxido (O2‘) y óxido nítrico (NO) en cultivos celulares, actividades que los autores asociaron con usos terapéuticos como agentes quimiopreventivos del cáncer en órganos relacionados con la inflamación (Kim et al., 2000a, 2000b y 2000c). Los resultados in vitro demostraron que tienen una actividad igual o mejor que el DHA (ácido docosahexaenoico), un inhibidor natural de la generación de NO. Los valores de CI50 estaban en el intervalo de 1,2-3,5 |iM para acetogeninas y 4,5 |iM para DHA (Kim et al., 2000a). Además, la 1-acetoxi-2,4-dihidroxi-n-heptadeca-16-eno, la persina y la persenona A mostraron inhibición de la actividad de la acetil CoA carboxilasa (ACC), en el intervalo de valores CI50 de 4,0 a 9,4 |iM (Hashimura, 2001). Los autores concluyeron que dado que ACC participa en la biosíntesis de ácidos grasos, esos compuestos tienen un uso potencial como supresores de la acumulación de grasa para evitar la obesidad.
La mayoría de los métodos de extracción de derivados de ácidos grasos de cadena larga requieren una etapa previa para recuperar el aceite o el uso de disolventes orgánicos como el hexano. El método de extracción de los compuestos antimicrobianos identificados utilizado por Kashman, Neeman y Lifshitz (1969) usó hexano a temperaturas de ebullición. Broutin et al. en 2003 (patente estadounidense 6.582.688 B1) desarrollaron un método para obtener un extracto de aceite de fruto de aguacate enriquecido en determinada clase de compuestos alifáticos de cadena larga, tales como compuestos lipídicos de furano y alcoholes grasos polihidroxilados. Los autores reivindicaron que pueden usarse diferentes composiciones de estos compuestos apolares en diferentes aplicaciones terapéuticas, cosméticas y alimentarias. Sin embargo, la composición química del extracto obtenido mediante su proceso o el contenido de la(s) molécula(s) activa(s) no se especificó para su uso como agente antimicrobiano. Considerando la toxicidad de algunos de los compuestos que podrían estar presentes en un extracto bruto, es extremadamente importante definir la concentración mínima requerida para lograr los efectos deseados (véanse las publicaciones de solicitudes de patentes estadounidenses 2006-0099323 y 2009-0163590).
Incluso si se ha demostrado que algunas acetogeninas tienen actividad antimicrobiana contra células vegetativas de bacterias, la técnica preliminar no muestra ningún informe sobre el aislamiento guiado por bioensayo de los compuestos antimicrobianos de aguacate (Persea americana) contra microorganismos, particularmente formas esporuladas. La presente divulgación proporciona una serie de etapas para un procedimiento para obtener compuestos aislados y/o una composición que concentra los compuestos antibacterianos que se producen de manera natural en Persea americana que inhiben el crecimiento de estados vegetativos y esporulados de bacterias que forman esporas. El aislamiento de compuestos basándose en la inhibición de microorganismos esporulados no forma parte de la enseñanza de la técnica anterior. Más importante aún, también se divulga el efecto sinérgico de los compuestos específicos tal como se define en las reivindicaciones en mezclas parcialmente purificadas. Los inventores encontraron intrigante que los extractos parcialmente purificados y/o las mezclas de compuestos aislados posean propiedades que inhiben la germinación de esporas, tales como propiedades esporostáticas y/o esporocidas, y en algunos casos incluso mejores efectos que los compuestos aislados solos. La identidad química y la especificidad de los compuestos activos contra los microorganismos que forman esporas nunca se ha informado previamente ni las estabilidades al calor o la presión de los compuestos bioactivos en condiciones de procesamiento comercialmente aplicables.
Maseko (2006) propuso un método simple para producir un derivado de ácido graso no acetilado denominado (2R, 4R)-1,2,4-trihidroxiheptadeca-16-eno usando ácido (S)-málico como una fuente económica del fragmento de triol. y la reacción de Grignard para lograr el alargamiento de la cadena alifática. Este precursor podría usarse para la síntesis de la mayoría de las acetogeninas en el aceite de aguacate. Esta molécula se produjo como patrón analítico en Masenko (2006) y en la técnica anterior Néeman et al. (1970) habían demostrado el potencial del compuesto como agente antimicrobiano contra Staphylococcus spp., Una bacteria que no forma esporas. Ninguno de los autores citados sometió a prueba ninguna propiedad antimicrobiana específica contra bacterias que forman esporas ni un método para producir acetogeninas con este efecto particular.
En referencia al estado de la técnica sobre sustancias antimicrobianas que van a usarse para el control específico de las células vegetativas de Listeria monocytogenes en alimentos refrigerados, la patente estadounidense n.° 5.217.950 sugirió el uso de composiciones de nisina como bactericidas para bacterias grampositivas. Las patentes estadounidenses 5.573.797, 5.593.800 y 5.573.801 divulgan composiciones antibacterianas que incluyen una combinación de una bacteriocina derivada de Streptococcus o Pediococcus o un agente antibacteriano equivalente sintético en combinación con un agente quelante. La patente estadounidense n.° 5.458.876 sugiere la combinación de un antibiótico (tal como nisina) con lisozima como antibacteriano. En este caso, la lisozima rompe la pared celular y debilita la integridad estructural de la célula diana de modo que el agente antibacteriano se vuelve más eficaz para dañar o destruir la célula bacteriana. En particular, esta combinación demuestra ser eficaz para mejorar la eficacia antibacteriana de la nisina contra Listeria monocytogenes, produciendo una reducción significativa, aunque no una eliminación completa, de Listeria a niveles de uso seguros y adecuados. La patente estadounidense n.° 6.620.446B2, describe una composición antibacteriana para el control de bacterias grampositivas en aplicaciones alimentarias que puede usarse como componente o aplicarse a la superficie de un alimento. Esta composición incluye nisina y/o lisozima y ácidos de lúpulo beta para reducir o eliminar la bacterias de deterioro o patógenas grampositivas y, muy especialmente, todas las cepas del patógeno dañino Listeria monocytogenes. Perumalla y Hettiarachchy (2011) informaron que el extracto de té verde y el extracto de semilla de uva (compuestos polifenólicos y ricos en proantocianidina) tenían actividades antimicrobianas contra los principales patógenos transmitidos por los alimentos como Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Escherichia coli O157: H7 y Campylobacter jejuni. Además, han demostrado sinergia en la actividad antimicrobiana cuando se usan en combinación con ácidos orgánicos (málico, ácido tartárico, ácidos benzoicos, etc.), bacteriocinas como la nisina o agentes quelantes como EDTA en diversos sistemas modelo, incluyendo productos frescos (frutas y hortalizas), crudos y productos cárnicos y de aves de corral listos para el consumo.
Hashimura H. et al., (Biosci. Biotechnol. Biochem., 65(7), 1656-1658, 2001) se refiere a los inhibidores de la acetil-CoA carboxilasa de los frutos de aguacate.
La disertación de tesis de María del Refugio Ramos-Jerz, publicada en 2007, Cuvillier Verlag, Gottingen, (TU) Braunschweigr, Univ., Diss., 978-3-86727-389-3 se refiere al análisis fitoquímico de semillas de aguacate.
Idris S. et al. (Bajopas volumen 2 (1), 2009, 173-176) se refiere al cribado fitoquímico preliminar y la actividad antimicrobiana de extractos de semillas de aguacate.
Rodríguez-Saona C. et al. (Nat. Prod. 1998, 61, 1168-1170) se refiere al aislamiento, la identificación y la actividad biológica de la isopersina, un compuesto de las células del aceite de idioblastos de aguacate.
Raymond Chia y Dykes (Pharmaceutical Biology, 2010, 48(7), 753-756) se refieren a la actividad antimicrobiana del epicarpio bruto y extractos de semillas de la fruta de aguacate natural de tres variedades cultivadas.
Dadas las dificultades asociadas con la obtención de extractos con actividades antibacterianas, antimicrobianas o que inhiben la germinación de esporas adecuadas, el desarrollo de resistencia por parte de bacterias, microbios y esporas a compuestos y composiciones antibacterianos, antimicrobianos y que inhiben la germinación de esporas conocidos, y el deseo de productos alimenticios y medicamentos de origen natural, todavía existe la necesidad en la técnica de
compuestos y composiciones antibacterianos, antimicrobianos o esporicidas adicionales obtenidos preferiblemente de fuentes económicamente viables tales como subproductos y desechos del procesamiento de plantas.
Breve sumario de la invención
Se describen extractos de Persea americana (aguacate) ricos en acetogeninas a partir de las cuales las moléculas aisladas, tal como se definen en las reivindicaciones y forman parte de la invención, pueden usarse como como agentes antimicrobianos, antibacterianos o que inhiben la germinación de esporas. El extracto enriquecido con acetogenina presenta actividad inhibidora de la germinación de esporas, tal como actividad esporicida y/o esporostática contra esporas bacterianas nativas de Clostridium botulinum (cepas proteolíticas y no proteólicas), Clostridium difficile y Clostridium sporogenes, y Bacillus spp. entre otras bacterias patógenas y no patógenas. También se descubrió que el extracto rico en acetogeninas o sus moléculas aisladas también presentan actividad inhibidora de la germinación de esporas, tal como actividad esporicida o esporostática contra esporas de bacterias de choque térmico y/o de choque por presión y, por tanto, puede usarse en alimentos, cosméticos y composiciones farmacéuticas para inhibir su crecimiento. También se descubrió que el extracto enriquecido es eficaz como agente antimicrobiano para inhibir el crecimiento de células viables de otras bacterias grampositivas que no forman esporas, tales como Listeria monocytogenes, en combinación con condiciones refrigeradas.
En particular, la presente invención se refiere a:
Un compuesto de fórmula:
Un producto seleccionado de un producto alimenticio, un producto cosmético y una composición antibacteriana, antimicrobiana o esporicida que comprende un compuesto de la invención.
Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la invención y uno o más componentes farmacéuticamente aceptables para su uso en un método de terapia para proporcionar un efecto antimicrobiano o antibacteriano en un paciente.
Un compuesto de fórmula (I):
en la que
R2 es hidrógeno o un grupo protector hidroxilo; y
R3 es un grupo alquenilo con al menos dos dobles enlaces carbono-carbono con configuración trans (E),
y opcionalmente fórmula (II)
R1 es hidrógeno o acetilo;
R2 y R4 son hidrógeno o un grupo protector hidroxilo; y
R3 es un grupo alquenilo con al menos un doble enlace carbono-carbono;
para su uso en un método de terapia para inhibirla germinación de esporas bacterianas en un paciente.
Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la invención y uno o más componentes farmacéuticamente aceptables para su uso en un método de terapia para inhibirla germinación de esporas bacterianas en un paciente.
Un método no terapéutico para inhibir la germinación de esporas bacterianas sobre o en un producto alimenticio, producto cosmético, composición farmacéutica, superficie o composición que favorece el crecimiento de bacterias, comprendiendo dicho método:
proporcionar un compuesto inhibidor de fórmula (I):
en la que
R1 es hidrógeno o acetilo;
R2 es hidrógeno o un grupo protector hidroxilo; y
R3 es un grupo alquenilo con al menos dos dobles enlaces carbono-carbono con configuración trans (E);
y opcionalmente fórmula (II)
en la que
R1 es hidrógeno o acetilo;
R2 y R4 son hidrógeno o un grupo protector hidroxilo; y
R3 es un grupo alquenilo con al menos un doble enlace carbono-carbono;
aplicar el compuesto inhibidor sobre o en el producto alimenticio, producto cosmético, composición farmacéutica, superficie o composición que favorece el crecimiento de bacterias para inhibir la germinación de esporas bacterianas sobre o en el producto alimenticio, producto cosmético, composición farmacéutica, superficie o composición que favorece el crecimiento de bacterias.
Un método no terapéutico para proporcionar un efecto antimicrobiano o antibacteriano sobre o en un producto alimenticio, producto cosmético, composición farmacéutica, superficie o composición que favorece el crecimiento de bacterias, comprendiendo dicho método:
proporcionar un compuesto inhibidor, en el que el compuesto inhibidor es un compuesto de la invención;
aplicar el compuesto inhibidor sobre o en el producto alimenticio, producto cosmético, composición farmacéutica, superficie o composición que favorece el crecimiento de bacterias para proporcionar un efecto antimicrobiano o antibacteriano sobre o en el producto alimenticio, producto cosmético, composición farmacéutica, superficie o composición que favorece el crecimiento de bacterias.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Diagrama de extracción primaria de los compuestos presentes en la semilla de aguacate usados para evaluar sus actividades antimicrobianas contra células vegetativas, esporas nativas y esporas de bacterias grampositivas sometidas a choque térmico.
Figura 2. Efecto del tipo de disolvente de extracción sobre las actividades antimicrobianas de extractos de hueso de aguacate brutos contra el crecimiento de células vegetativas, esporas nativas y esporas sometidas a choque térmico de Clostridium sporogenes (ATCC 7955). Los extractos se sometieron a prueba a una concentración final de 12,5 |ig de sólidos. Los datos representan el promedio de tres repeticiones ± el error estándar de la media.
Figura 3. Efecto de la agitación sobre la extracción de compuestos antimicrobianos de extractos de hueso de aguacate usando hexano y evaluación de sus actividades antimicrobianas contra el crecimiento de células vegetativas, esporas nativas y esporas sometidas a choque térmico de Clostridium sporogenes (ATCC 7955). Los extractos se sometieron a prueba a una concentración final de 12,5 |ig de sólidos. Los datos representan el promedio de tres repeticiones ± el error estándar de la media. Los valores con la misma letra no son significativamente diferentes (prueba LSD, p <0,05).
Figura 4. Comparaciones del efecto del tiempo de extracción usando acetona o etanol en lugar de hexano para obtener compuestos bioactivos a partir de hueso de aguacate que inhiben el crecimiento de células vegetativas de C. sporogenes (ATCC 7955). Los extractos se sometieron a prueba a una concentración final de 12,5 |ig de sólidos. Los datos representan el promedio de tres repeticiones ± el error estándar de la media. Los valores con la misma letra no son significativamente diferentes (prueba LSD, p <0,05).
Figura 5. Comparaciones del efecto del tiempo de extracción usando acetona o etanol en lugar de hexano para obtener compuestos bioactivos a partir de hueso de aguacate que inhiben el crecimiento de células vegetativas de C. sporogenes (ATCC 7955). Los extractos se sometieron a prueba a una concentración final de 12,5 |ig de sólidos. Los datos representan el promedio de tres repeticiones ± el error estándar de la media. Los valores con la misma letra no son significativamente diferentes (prueba LSD, p <0,05).
Figura 6. Comparaciones del efecto del tiempo de extracción usando acetona o etanol en lugar de hexano para obtener compuestos bioactivos a partir de hueso de aguacate que inhiben el crecimiento de esporas sometidas a choque térmico de C. sporogenes (ATCC 7955). Los extractos se sometieron a prueba a una concentración final de 12,5 |ig de sólidos. Los datos representan el promedio de tres repeticiones ± el error estándar de la media. Los valores con la misma letra no son significativamente diferentes (prueba LSD, p <0,05).
Figura 7. A) Diagrama de extracción primaria de los compuestos presentes en semillas de aguacate usando acetona y su posterior reparto en un sistema de heptano:metanol para obtener las fracciones F001 y F002, en cada fase respectivamente, usadas posteriormente para evaluar sus actividades antimicrobianas frente a células vegetativas, esporas nativas y esporas sometidas a choque térmico de bacterias grampositivas. B) Diagrama de extracción y reparto simultáneos para los compuestos presentes en semillas de aguacate usando un sistema de heptano:metanol para obtener las fracciones F003 y F004, respectivamente, usadas posteriormente para evaluar sus actividades antimicrobianas contra células vegetativas, esporas nativas y esporas sometidas a choque térmico de bacterias grampositivas.
Figura 8. Evaluación de las actividades antimicrobianas contra el crecimiento de células vegetativas, esporas nativas y esporas sometidas a choque térmico de Clostridium sporogenes (ATCC 7955) de los extractos F001-F004 obtenidos tal como se describe en la figura 7. Los extractos se sometieron a prueba a una concentración final de 12,5 |ig de sólidos. Los datos representan el promedio de tres repeticiones ± el error estándar de la media. Los valores con la misma letra no son significativamente diferentes (prueba LSD, p <0,05).
Figura 9. Evaluación de las actividades antimicrobianas contra el crecimiento de células vegetativas, esporas nativas y esporas sometidas a choque térmico de Clostridium sporogenes (ATCC 7955), de las fases superior e inferior de un sistema bifásico (acetato de etilo:agua) usado como un segunda reparto de la fase inferior F002 (metanol) obtenida tal como se describe en la figura 7A. Los extractos se sometieron a prueba a una concentración final de 12,5 |ig de sólidos. Los datos representan el promedio de tres repeticiones ± el error estándar de la media. Los valores con la misma letra no son significativamente diferentes (prueba LSD, p <0,05). (La letra c indica un valor de cero cm para la zona de inhibición del disco, por tanto, no hay altura de barra vertical en el gráfico).
Figura 10. Evaluación de las actividades antimicrobianas contra el crecimiento de células vegetativas, esporas nativas y esporas sometidas a choque térmico de Clostridium sporogenes (ATCC 7955), de las fases superior e inferior de un sistema bifásico (hexano:metanol) usado para el reparto del extracto bruto acetónico obtenido tal como se describe en el ejemplo 1. Los extractos se sometieron a prueba a una concentración final de 12,5 |ig de sólidos. Los datos representan el promedio de tres repeticiones ± el error estándar de la media. Los valores con la misma letra no son significativamente diferentes (prueba LSD, p <0,05).
Figura 11. Evaluación de las actividades antimicrobianas contra el crecimiento de células vegetativas, esporas nativas
y esporas sometidas a choque térmico de Clostridium sporogenes (ATCC 7955), de los compuestos insaponificables del extracto bruto de acetona obtenido tal como se describe en el ejemplo 1, y los compuestos insaponificables de la fase superior del sistema bifásico (hexano:metanol) usados para el reparto del extracto bruto acetónico tal como se describe en el ejemplo 5. Los extractos se sometieron a prueba a una concentración final de 12,5 |ig de sólidos. Los datos representan el promedio de tres repeticiones ± el error estándar de la media. Los valores con la misma letra no son significativamente diferentes (prueba LSD, p <0,05). (La letra d indica un valor de cero cm para la zona de inhibición del disco, por tanto, no hay altura de barra vertical en el gráfico).
Figura 12. Evaluación de las actividades antimicrobianas contra el crecimiento de células vegetativas y esporas sometidas a choque térmico de Clostridium sporogenes (ATCC 7955), de las fracciones obtenidas por cromatografía de reparto centrífuga rápida de fase inversa (RP-FCPC) de la fase superior (heptano) del sistema bifásico (heptano:metanol) usado para el reparto del extracto bruto acetónico tal como se describe en el ejemplo 5. El sistema de disolventes usado para lograr la RP-FCPC fue heptano:metanol (1:1) y se usó metanol como fase móvil. Las fracciones se sometieron a prueba a una concentración final de 12,5 |ig de sólidos.
Figura 13. Evaluación de las actividades antimicrobianas contra el crecimiento de células vegetativas, esporas nativas y esporas sometidas a choque térmico de Clostridium sporogenes (ATCC 7955), de las fracciones obtenidas por cromatografía de reparto centrífuga rápida en fase normal (NP-FCPC) de la fase superior (heptano) del sistema bifásico (heptano:metanol) usado para el reparto del extracto bruto acetónico tal como se describe en el ejemplo 5. El sistema de disolventes usado para conseguir la NP-FCPC fue heptano:metanol (1:1) y se usó heptano como fase móvil. Las fracciones se sometieron a prueba una concentración final de 12,5 |ig de sólidos.
Figura 14. Evaluación de las actividades antimicrobianas contra el crecimiento de células vegetativas de S. aureus y B. subtilis, de las fracciones obtenidas mediante cromatografía de reparto centrífuga rápida en fase normal (NP-FCPC) de la fase superior (heptano) del sistema bifásico (heptano:metanol) usado para el reparto del extracto bruto acetónico tal como se describe en el ejemplo 5. El sistema de disolventes usado para conseguir la NP-CPC fue heptano:metanol (1:1) y se usó heptano como fase móvil. Las fracciones se sometieron a prueba a una concentración final de 12,5 |ig de sólidos.
Figura 15. Efecto de los tratamientos de temperatura (25-100°C/60 min) de las fases superiores de hexano y acetato de etilo obtenidas tal como se describe en el ejemplo 5, sobre la actividad inhibidora del crecimiento de células vegetativas de Clostridium sporogenes (ATCC 7955).
Figura 16. Efecto de los tratamientos de temperatura (25-100°C/60 min) de las fases superiores de hexano y acetato de etilo obtenidas tal como se describe en el ejemplo 5, sobre la actividad inhibidora del crecimiento de células de esporas nativas de Clostridium sporogenes (ATCc 7955).
Figura 17. Cambio progresivo en los perfiles cromatográficos de las fracciones presentes en el conjunto activo, obtenido tal como se describe en el ejemplo 10, a medida que aumenta su coeficiente de reparto (Kd). Las fracciones se analizaron mediante cromatografía líquida de alta resolución y un detector por red de diodos ajustado a 220 nm. Los números representan los picos comunes presentes en las diferentes fracciones.
Figura 18. Concentración de los compuestos activos presentes en el conjunto de fracciones activas descrito en el ejemplo 10.
Descripción detallada
La presente divulgación proporciona una serie de etapas para obtener un extracto que concentra compuestos antimicrobianos, antibacterianos o que inhiben la germinación de esporas que se producen de manera natural a partir de Persea Americana (aguacate) para proporcionar un efecto antimicrobiano, antibacteriano o que inhibe la germinación de esporas.
En un aspecto de la divulgación, el extracto es de las semillas o del mesocarpio carnoso, que es la parte comestible del fruto del aguacate.
En un aspecto de la divulgación, la extracción de tejidos de aguacate (las semillas o mesocarpio) se logra mediante la extracción con disolventes polares y disolventes apolares.
En una realización de este aspecto de la divulgación hay un procedimiento para preparar concentrados de compuestos antimicrobianos, antibacterianos o que inhiben la germinación de esporas que se producen de manera natural a partir de Persea sp., que incluyen, pero no se limitan a americana y gratissima, (aguacate) para proporcionar un efecto antimicrobiano, antibacteriano o que inhibe la germinación de esporas, que incluye, pero no se limita al crecimiento de células vegetativas y esporas de bacterias grampositivas, que comprende
(a) una extracción con un disolvente polar de las semillas u otros tejidos de la planta de aguacate (tal como el mesocarpio (seco o carnoso) y/o las hojas);
(b) seguido por un procedimiento de purificación que enriquece las acetogeninas del extracto de aguacate con disolvente polar o directamente de las semillas trituradas u otros tejidos de la planta de aguacate;
o
(a1) una extracción con un disolvente apolar de las semillas u otros tejidos de la planta de aguacate (tal como el mesocarpio (seco o carnoso) y/o las hojas);
(b1) seguido por un procedimiento de purificación que enriquece las acetogeninas del extracto de aguacate con disolvente apolar o directamente de las semillas trituradas u otros tejidos de la planta de aguacate (tal como el mesocarpio (seco o carnoso) y/o las hojas).
En una realización de este aspecto de la divulgación, el disolvente polar para la extracción o purificación incluye independientemente (solo o mezclas), pero no se limita a alcohol C1-C4 (por ejemplo, metanol, etanol, isopropanol, butanol), dimetilsulfóxido, tetrahidrofurano, acetona, acetonitrilo, o mezclas de los mismos.
En una realización de este aspecto de la divulgación, el disolvente apolar para la extracción o purificación incluye independientemente (solo o mezclas), pero no se limita a, hexanos, heptanos, etil éter, acetato de etilo, éter de petróleo, cloroformo, tolueno, metil terc-butil éter, metil isobutil cetona, o mezclas de los mismos.
Otro aspecto de la divulgación es un procedimiento de purificación que enriquece las acetogeninas del extracto de disolvente polar o apolar.
En una realización de la divulgación, la purificación comprende un sistema de reparto de dos fases. En una realización adicional de esta invención, el sistema de reparto de dos fases usa disolventes polares (uno o combinaciones) que incluyen, pero no se limitan a agua, alcohol C1-C4 (por ejemplo, metanol, etanol, isopropanol, butanol), dimetilsulfóxido, tetrahidrofurano, acetona, acetonitrilo y disolventes apolares (uno o combinaciones) tal como, pero sin limitarse a, hexanos, heptanos, etil éter, acetato de etilo, éter de petróleo, cloroformo, tolueno, metil terc-butil éter, metil isobutil cetona y mezclas de los mismos. Véase, por ejemplo, Alain P. Foucault, L. Chevolot. Counter-current chromatography: instrumentation, solvent selection and some recent applications to natural product purification. J. Chromatogr. A 808 (1998) 3-22.
En otra realización de la divulgación, el sistema de disolventes para el sistema de reparto de dos fases incluye, pero no se limita a, metanol: heptano y/o agua:hexano y/o agua:butanol y/o metil terc-butil éter:acetonitrilo:agua, y/o heptanos:acetato de etilo:acetonitrilo, heptanos:acetato de etilo:metanol:agua (en diferentes razones) solo o en paralelo para enriquecer la actividad en una de las fases.
Otra realización del procedimiento de purificación es una separación por reparto que comprende cromatografía de reparto centrífuga rápida o de alto rendimiento (FCPC o HPCPC) o cromatografía en contracorriente (CCC) para separar los compuestos basándose en su correspondiente coeficiente de reparto con el objetivo de reducir y/o eliminar los contaminantes obtenidos durante la extracción. Véase, por ejemplo, Alain P. Foucalt. Centrifugal Partition Chromatography, Chromatographic Sciences Series, vol. 68, Marcel-Dekker (1995). El procedimiento de purificación mediante CPC puede aumentar la concentración de compuestos antimicrobianos que se producen de manera natural a partir de aguacates (más de 4 veces), que inhiben el crecimiento de células vegetativas y esporas de bacterias grampositivas, para proporcionar al menos de 1,2 a 2 veces o más propiedades antibacterianas en comparación con un extracto bruto de acetona de semillas de aguacate evaluado a la misma concentración de sólidos (2,5 mg/ml).
En otro aspecto de la divulgación, el procedimiento de extracción y purificación opcionalmente no da como resultado la saponificación de los compuestos enriquecidos o aislados. En otra realización de este aspecto de la invención, el procedimiento de extracción y purificación opcionalmente no da como resultado la saponificación de los compuestos enriquecidos o aislados.
Los extractos de la divulgación contienen compuestos con m/z en el intervalo de 329 a 381 o al menos una de las siguientes acetogeninas: persenona A, persenona B o el recientemente descubierto (2R,5E,16£)-1-acetoxi-2-hidroxi-4-oxo-nonadeca-5,16-dieno o el también recientemente descubierto (2R, 16£)-1-acetoxi-2-hidroxi-4-oxo-nonadeca-16,18-dieno que puede purificarse a partir de Persea americana o sintetizados químicamente para enriquecer la bioactividad.
Un aspecto de la invención es un compuesto de fórmula (I)
en la que
R1 es hidrógeno o acetilo;
R2 es hidrógeno o un grupo protector hidroxilo; y
R3 es un grupo alquenilo con al menos dos dobles enlaces carbono-carbono con configuración trans (E) para su uso en los métodos tal como se definen en las reivindicaciones.
El grupo protector hidroxilo puede ser cualquier grupo protector hidroxilo conocido, por ejemplo, los descritos en Greene y Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis (tercera edición), Wiley-Interscience (1999). Tal como se indicó anteriormente, los compuestos de fórmula (I) incluyen todas las formas estereoisoméricas que incluyen las formas (R) y (S) y las formas cis (Z) y trans (E) de los compuestos. Para los fines de esta invención, la forma trans (E) puede incluir un alqueno terminal que tiene la fórmula -CH= CH2 (véase, por ejemplo, (2R, 16£)-1-acetoxi-2-hidroxi-4-oxononadeca-16,18-dieno a continuación).
Una realización de este aspecto de la invención son compuestos de fórmula (I) en los que,
R1 es hidrógeno o acetilo;
R2 es hidrógeno o un grupo protector hidroxilo; y
R3 es un grupo alquenilo C5-C22con configuración trans en dos dobles enlaces carbono-carbono.
Otra realización de este aspecto de la invención son compuestos de fórmula (I) en los que,
R1 es hidrógeno o acetilo;
R2 es hidrógeno; y
R3 es un grupo alquenilo C5-C22 con dos dobles enlaces carbono-carbono con configuración trans.
Otra realización de este aspecto de la invención son compuestos de fórmula (I) en los que,
R1 es acetilo;
R2 es hidrógeno; y
R3 es un grupo alquenilo que se compone de 12 a 18 átomos de C, con dos dobles enlaces carbono-carbono con configuración trans; y el carbono que se une a OR2 está en la configuración (R).
Otra realización de este aspecto de la invención son compuestos de fórmula (I) en los que, existe un doble enlace en la posición C-16 y C-17 del compuesto.
Otra realización de la invención son compuestos que tienen la fórmula
(2R, 16£)-1-acetoxi-2-hidroxi-4-oxo-nonadeca-16,18-dieno
o
(2R, 5E, 16E)-1-acetoxi-2-hidroxi-4-oxo-nonadeca-5,16-dieno
Los compuestos de fórmula (I) pueden sintetizarse haciendo reaccionar haluro dimetil-1,3-dioxolano-etilmagnesio (por ejemplo, cloruro o bromuro) con un reactivo de fórmula R3COX en el que R3 es tal como se definió anteriormente y X es un haluro y formando posteriormente un diol a partir del anillo de dioxolano usando los procedimientos descritos en Bull et al. (1994).
Alternativamente, los compuestos de fórmula (I) pueden sintetizarse obteniendo un ácido graso insaturado y convirtiéndolo en su correspondiente metil cetona y luego haciendo reaccionar la correspondiente metil cetona con 2-acetoxiacetaldehído usando los procedimientos descritos en MacLeod et al. (1995).
Se pretende que los métodos de formación de los compuestos de fórmula (I) sean de naturaleza ilustrativa y no se pretende que abarquen todos los medios posibles de preparación de los compuestos.
Los compuestos tal como se definen en las reivindicaciones pueden usarse en alimentos o composiciones que favorecen el crecimiento de bacterias, solos o en combinación con otras sustancias antimicrobianas comúnmente conocidas en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, compuestos de nitrito, nisina, bacteriocinas, arginato de etil lauroílo, aceites esenciales, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y derivados de ácido ascórbico, derivados de ácido benzoico, entre otros para mejorar las actividades antimicrobianas contra el crecimiento de los estados vegetativos y esporulados de bacterias. El extracto de aguacate o los compuestos o extractos derivados del mismo inhiben el crecimiento formas vegetativas y esporuladas de bacterias. Pueden formularse en forma sólida, con portadores, excipientes, agentes encapsulantes y otros componentes de la formulación para mejorar la aplicación y estabilidad de los componentes bioactivos.
Los compuestos y composiciones de la invención, tal como se definen en las reivindicaciones, se preparan de modo que pueden administrarse por vía oral, dérmica, parenteral, nasal, oftálmica, ótica, sublingual, rectal o vaginal. La administración dérmica incluye aplicación tópica o administración transdérmica. La administración parenteral incluye inyecciones intravenosas, intraarticulares, intramusculares y subcutáneas, así como el uso de técnicas de infusión. Uno o más compuestos de la invención pueden estar presentes en asociación con uno o más componentes farmacéuticamente aceptables no tóxicos para formar la composición. Estas composiciones pueden prepararse aplicando técnicas conocidas en la técnica tal como tal como las que se enseñan en Remington - The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición (2005), Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11a edición (2005) y Ansel's Parmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (8a edición), editado por Allen et al., Lippincott Williams &Wilkins, (2005).
Otro aspecto de la invención son productos alimenticios que comprenden los compuestos de la invención, tal como se definen en las reivindicaciones, que incluyen, pero no se limitan a pescado, crustáceos, sustitutos de pescado, sustitutos de crustáceos, carne, sustitutos de carne, productos de aves de corral, hortalizas, verduras, salsas, emulsiones, bebidas, zumos, vinos, cervezas, productos lácteos, productos a base de huevo, mermeladas, jaleas, productos a base de cereales, productos de panadería y productos de pastelería.
Otro aspecto de la invención son productos cosméticos que comprenden los compuestos de la invención, tal como se definen en las reivindicaciones, que incluyen, pero no se limitan a productos tales como cremas, geles, polvos, lociones, protectores solares, pintalabios, gel de ducha, extractos de plantas medicinales y formulaciones que favorecen el crecimiento de bacterias.
Otro aspecto de la invención son productos con una superficie que comprenden los compuestos de la invención, tal como se definen en las reivindicaciones, que incluyen, pero no se limitan a encimeras, puertas, ventanas, mangos, equipo quirúrgico, utensilios médicos, superficies de contacto que pueden contaminar humanos, animales, etc.
Otro aspecto de la invención es el uso de los compuestos de la invención o composiciones que comprenden los mismos, tal como se definen en las reivindicaciones, para proporcionar un efecto antibacteriano, antimicrobiano o esporicida a un paciente que lo necesita.
Otro aspecto de la invención es el uso de los compuestos de la invención o composiciones que comprenden los mismos, tal como se definen en las reivindicaciones, para proporcionar un efecto antibacteriano, antimicrobiano o esporicida a una composición alimenticia o cosmética.
Otro aspecto de la invención es el uso de los compuestos de la invención o composiciones que comprenden los mismos, tal como se definen en las reivindicaciones, para proporcionar un efecto antibacteriano, antimicrobiano o esporicida a una superficie. El efecto puede producirse exponiendo la superficie a los extractos o compuestos aislados de la invención o laminando o incorporando los extractos o compuestos aislados de la invención sobre la propia superficie.
El efecto antimicrobiano, antibacteriano y/o esporicida puede aplicarse a microorganismos, bacterias u otros microorganismos que forman esporas a partir de los géneros que incluyen, pero no se limitan a Clostridium, Bacillus,
Alicyclobacillus y Listeria.
El efecto antimicrobiano, antibacteriano y/o esporicida puede aplicarse a microorganismos, bacterias o esporas de la lista de especies que incluye, pero no se limita a Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus lichniformis, Alicyclobacillus acidoterrestris, Alicyclobacillus acidiphilus, Listeria monocytogenes.
Los compuestos de la invención tal como se representaron anteriormente en la fórmula (I) requieren que el grupo R3 tenga al menos dos dobles enlaces carbono-carbono con configuración trans (E).
Otros compuestos conocidos derivados de aguacate que poseen efectos antimicrobianos, pero no forman parte de la invención, incluyen:
(5E)-1-acetoxi-2-hidroxi-5-nonadecen-4-ona (persenona B)
o
Además, para los fines de proporcionar un efecto antimicrobiano, antibacteriano y/o esporicida, el compuesto de fórmula (I) puede usarse solo o en combinación con los compuestos de fórmula (II) representada a continuación:
en la que
R1 es hidrógeno o acetilo;
R2 y R4 son hidrógeno o un grupo protector hidroxilo; y
R3 es un grupo alquenilo con al menos un doble enlace carbono-carbono.
Una realización de este aspecto de la invención es la combinación de compuestos de fórmula (I) con los compuestos de fórmula (II) en la que para los compuestos de fórmula (II):
R1 es hidrógeno o acetilo;
R2 y R4 son hidrógeno o un grupo protector hidroxilo; y
R3 es un grupo alquenilo C5-C22 con un doble enlace carbono-carbono con configuración cis y/o trans.
Otra realización de este aspecto de la invención es en la que para los compuestos de fórmula (II):
R1 es hidrógeno o acetilo;
R2 y R4 son hidrógeno; y
R3 es un grupo alquenilo C5-C22 con dos dobles enlaces carbono-carbono con configuración trans.
Otra realización de este aspecto de la invención es en la que para los compuestos de fórmula (II):
R1 es acetilo;
R2 y R4 son hidrógeno; y
R3 es un grupo alquenilo que se compone de desde 12 hasta 18 átomos de C, con un doble enlace carbono-carbono con configuración trans; y el carbono que se une a R2 y R4 está en la configuración (S).
Otra realización de este aspecto de la invención es en la que para los compuestos de fórmula (II), existe un doble enlace en la posición C-16yC-17 del compuesto.
Otra realización de este aspecto de la invención es el uso de compuestos de fórmula (I) definidos anteriormente en combinación con el compuesto de fórmula (II) representado a continuación:
(2S, 4S)-1-acetoxi-2,4-dihidroxi-n-heptadeca-16-eno
Los compuestos de fórmula (II) pueden sintetizarse a través de la reducción de cetona a partir de los compuestos de fórmula (I) o sintetizarse haciendo reaccionar dimetil-1,3-dioxolano-4-etanal con un compuesto de R3MgX en el que R3 es tal como se definió anteriormente y X es un haluro, usando los procedimientos divulgados por Sugiyama et al. (1982).
Los efectos antibacterianos, antimicrobianos o espostáticos/esporicidas son al menos tan efectivos como otros agentes antibacterianos, antimicrobianos o espostáticos/esporicidas conocidos tales como LAE (éster etílico de lauramida de monoclorhidrato de arginina), nitritos o nisina (un péptido policíclico con 34 aminoácidos). El uso de los extractos o compuestos aislados de la invención que son un producto natural o se derivan fácilmente a partir de los mismos es ventajoso sobre otros agentes conocidos que no son productos naturales o no se obtienen fácilmente. El uso de productos no naturales tiene ramificaciones especialmente cuando se elaboran productos alimenticios o cosméticos que pueden requerir aprobación regulatoria para su uso.
La invención se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitativos que ilustran adicionalmente la invención, y no pretenden, ni deben interpretarse, como que limitan el alcance de la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Actividad antimicrobiana y esporicida de extractos de acetona y hexano de semillas de aguacate Se trituraron semillas de aguacate usando un molino coloidal para obtener partículas con un radio promedio de 0,5 2 mm. Se mezclaron las semillas de aguacate trituradas (50 g) con o bien acetona o bien hexano en una razón de material con respecto a disolvente de 1:2 (p/v). Se almacenaron las mezclas durante 24 h a 25°C para obtener un extracto bruto de semillas de aguacate. Se separaron las semillas del extracto por medio de filtración a vacío. Se evaporaron los extractos brutos a vacío hasta sequedad usando un evaporador rotatorio (35°C, 22 inHg) y se pesó la materia seca obtenida y se volvió a disolver en acetona hasta una concentración final de 2,5 mg/ml. Se usaron las muestras ajustadas para pruebas antimicrobianas y esporicidas (véase la figura 1).
Para las evaluaciones antibacterianas, se transfirieron disoluciones ajustadas (5 |il) a discos estériles de 6 mm de diámetro elaborados con papel de filtro Whatman n.° 1, de manera que después de la evaporación del disolvente cada disco contenía 12,5 |ig de sólidos del extracto de semillas de aguacate enriquecido. Se trataron los controles experimentales en las mismas condiciones que los extractos e incluían discos de control negativo que contenían 5 |il de acetona, y para los discos de control positivo se añadieron 5 |il de una disolución de nisina (30 mg/ml en agua estéril) para proporcionar una concentración residual de 150 |ig de nisina en cada disco. Se dejaron todos los discos de prueba durante aproximadamente 1-2 h en un armario de seguridad para productos biológicos para evaporar el disolvente. Se prepararon suspensiones de una densidad óptica de aproximadamente 0,1 (a 600 nm) que contenían aproximadamente de 1 a 2 x 108 UFC/ml de células vegetativas, esporas nativas aisladas o esporas sometidas a choque térmico aisladas de Clostridium sporogenes (ATCC 7955) tal como se describe en los protocolos oficiales de Health Canada (Food Directorate, 2010). Se transfirieron alícuotas de las suspensiones (100 |il) a placas de Petri que contenían 15 ml de medio sólido (medio TPGY) y se esparcieron uniformemente con una varilla de plástico estéril. Se colocaron cuatro discos, conteniendo cada uno 12,5 |ig del extracto de prueba, y dos discos más (un blanco de disolvente y un control positivo de nisina) en cada placa y se incubaron a 37°C en condiciones anaerobias. Se midió el diámetro de las zonas de inhibición (cm) alrededor de los discos después de 36 h.
Los extractos de acetona y hexano de semillas de aguacate mostraron actividad antimicrobiana significativa contra células bacterianas vegetativas, así como esporas nativas y sometidas a choque térmico de las bacterias que forman esporas Clostridium sporogenes (véase la figura 2). No se observaron diferencias significativas entre la actividad de extractos de acetona y hexano, excepto para esporas sometidas a choque térmico en las que el extracto de hexano mostró alrededor del 20% más de actividad esporicida que el extracto de acetona. Ambos extractos de acetona y hexano de semillas de aguacate presentaron mayores actividades antibacterianas que el control positivo (nisina, 150 |ig). Los tratamientos con control positivo (nisina) dieron zonas de inhibición de 1,3, 1,0 y 0,9 cm para células bacterianas vegetativas, esporas y esporas sometidas a choque térmico, respectivamente.
Las semillas de aguacate usadas para obtener los extractos brutos, una vez trituradas, pueden almacenarse a temperaturas por debajo de 25°C en presencia o ausencia de oxígeno durante al menos 14 días sin afectar a la actividad antibacteriana contra bacterias que forman esporas. Por tanto, las semillas de aguacate pueden almacenarse enteras o como harina antes de la preparación de los extractos enriquecidos en compuestos bioactivos.
Ejemplo 2- Actividad específica de extractos de semilla de aguacate contra células vegetativas y esporas bacterianas de choque térmico de bacterias que forman esporas en comparación con otras fuentes vegetales.
La eficacia de la presente invención puede observarse mediante la preparación de extractos antibacterianos brutos de núcleo de semilla de mango, que se ha informado en la técnica anterior que presenta actividad antibacteriana contra células vegetativas de bacterias que forman esporas (Kabuki et al., 2000).
Se prepararon los extractos brutos de aguacate (Persea americana) y núcleo de mango (Mangifera indica) tal como se describe en el ejemplo 1 y sus actividades antibacterianas sometidas a prueba contra el crecimiento de células vegetativas y esporas sometidas a choque térmico de C. sporogenes (véase la tabla 1).
Tabla 1. Actividades antibacterianas de extractos de semilla de aguacate y núcleo de mango contra células vegetativas y esporas sometidas a choque térmico de Clostridium sporogenes (ATCC 7955).
Contrariamente a lo esperado, solo los extractos de semilla de aguacate presentaron actividad contra las dos fases fisiológicas bacterianas sometidas a prueba en el presente documento, células vegetativas y esporas sometidas a choque térmico. Los extractos de núcleo de mango presentaron actividad antibacteriana contra las células vegetativas de bacterias que forman esporas, pero no contra el crecimiento de esporas bacterianas o esporas sometidas a choque térmico.
Por tanto, el presente ejemplo demuestra que la naturaleza química de los compuestos fitoquímicos del aguacate es particularmente útil para la inhibición del crecimiento de células vegetativas, esporas y esporas sometidas a choque térmico de bacterias que forman esporas.
Ejemplo 3 - Efecto de la agitación sobre las actividades antimicrobianas de extractos brutos de acetona y hexano de semillas de aguacate
De manera similar al ejemplo 1, se trituraron semillas de aguacate usando un molino coloidal obteniendo partículas con un diámetro promedio de 0,5-2 mm. Se mezclaron las semillas de aguacate trituradas (50 g) con hexano en una razón de material con respecto a disolvente de 1:2 (m/v). Se agitaron las mezclas o se remojaron a 200 rpm durante 24 h a 25°C para obtener un extracto bruto de semillas de aguacate. Se evaporaron los extractos brutos hasta sequedad usando un evaporador rotatorio (35°C, 22 inHg) y se pesó la materia seca obtenida.
Como en el ejemplo 1, se volvió a disolver la materia seca en acetona hasta una concentración final de 2,5 mg/ml para las evaluaciones antibacterianas. Se usó Clostridium sporogenes (ATCC 7955) como microorganismo de prueba ya que es un microorganismo sustituto conocido de Clostridium botulinum. Las actividades antimicrobianas contra las células bacterianas vegetativas, así como las esporas nativas y sometidas a choque térmico se llevaron a cabo tal como se describe en el ejemplo 1.
Se observó un efecto significativo del tratamiento con agitación sobre las propiedades antimicrobianas del extracto de hexano de semilla de aguacate contra células bacterianas vegetativas, esporas nativas y esporas sometidas a choque térmico (figura 3). Los extractos obtenidos sin agitación presentaron una mayor actividad antibacteriana en comparación con los obtenidos con agitación, aunque los rendimientos de masa seca extraída son mayores al agitar. A través del ejemplo puede observarse que la agitación potencia la extracción de otros compuestos no antimicrobianos presentes en la semilla de aguacate, diluyendo así la concentración de compuestos con actividad antibacteriana. Por tanto, el extracto de semilla de aguacate antibacteriano debe obtenerse mediante maceración, preferentemente sin agitación.
Debido a la dilución de los compuestos, el extracto obtenido con agitación dio zonas de inhibición similares o menores que el control positivo (nisina, 150 |ig) que mostró 1,3, 1 y 0,9 cm para células vegetativas, esporas y esporas sometidas a choque térmico, respectivamente.
Ejemplo 4 - Efecto del tiempo de extracción y el tipo de disolvente de extracción (acetona, etanol y hexano) sobre las propiedades antimicrobianas de extractos brutos de semillas de aguacate.
Se trituraron semillas de aguacate usando un molino coloidal obteniendo partículas con un radio promedio de 0,5 2 mm. Se mezclaron los huesos de aguacate triturados (50 g) con o bien acetona o bien etanol o bien hexano en una razón de material con respecto a disolvente de 1:2 (m/v). Se agitaron las mezclas a 200 rpm 24 h a 35°C para obtener extractos brutos de semillas de aguacate. Se muestrearon alícuotas de cada extracto bruto en tiempos de 0,5, 5 y 24 h durante la extracción. Se evaporaron los extractos brutos obtenidos a diferentes tiempos de extracción hasta sequedad usando un evaporador rotatorio (35°C, 22 inHg) y se pesó la materia seca obtenida.
Se volvió a disolver la materia seca en acetona hasta una concentración final de 2,5 mg/ml. Se usó Clostridium sporogenes (ATCC 7955) como microorganismo de prueba en los ensayos antimicrobianos. Se realizaron actividades antibacterianas contra células vegetativas, esporas nativas y esporas sometidas a choque térmico (usando la determinación de la zona de inhibición del disco) tal como se describe en el ejemplo 1.
Las actividades antimicrobianas de los extractos de hexano contra las células bacterianas vegetativas, las esporas y las esporas sometidas a choque térmico se consideraron como una inhibición del 100% para fines de comparación con otros disolventes (acetona y etanol) en el mismo intervalo de tiempo. Los resultados de la actividad antibacteriana contra las células vegetativas se muestran en la figura 4 e indicó que un extracto etanólico obtenido después de un tiempo de extracción de 30 minutos tenía exactamente la misma actividad que el obtenido con hexano en las mismas condiciones. En cambio a un tiempo de extracción de 30 min con acetona el extracto presentó solo el 70% de la
actividad antimicrobiana observada para el extracto de hexano, valor que alcanzó un máximo de actividad antimicrobiana del 80% de la actividad observada en el extracto de hexano después de un tiempo de extracción de 5 h. Por tanto, este ejemplo demuestra que, dado que la acetona y el etanol son disolventes polares, aumentar el tiempo de extracción en las condiciones sometidas a prueba diluyó la concentración de compuestos bioactivos y/o saturó la disolución. Adicionalmente y al contrario de lo esperado, la naturaleza de los compuestos antibacterianos contra las células vegetativas de las bacterias que forman esporas permite una mejor recuperación usando etanol que acetona (figura 4).
Los resultados de las propiedades antimicrobianas de los extractos contra las esporas nativas se presentan en la figura 5; e indicó que los aumentos en los tiempos de extracción (0,5 - 24 h) no presentaron ninguna diferencia usando o bien el disolvente acetona o el etanol como disolventes de extracción. El etanol también fue más selectivo para la extracción de los compuestos con propiedades antibacterianas contra las esporas nativas.
Los resultados de las actividades antimicrobianas de los diferentes extractos contra el crecimiento de esporas sometidas a choque térmico se presentan en la figura 6, e indicó una tendencia diferente, a los 30 min de extracciones ambos solventes (acetona y etanol) fueron igualmente eficientes para la extracción de las moléculas antibacterianas. Sin embargo, cuando se usó acetona como disolvente con el tiempo, se observó una disminución significativa de las concentraciones de moléculas antibacterianas en los extractos que varió desde el 100% hasta menos del 80% de inhibición bacteriana para tiempos de extracción de 0,5 a 5 h, respectivamente, y luego la actividad permaneció constante. El etanol no se saturó tan fácilmente durante el tiempo de extracción con los compuestos de interés como lo hizo el extracto de acetona y por tanto, para este disolvente, no se observaron diferencias para los tiempos de extracción entre 0,5 y 5 horas. Por tanto, el presente ejemplo demuestra que el etanol fue tan eficaz como el hexano para la extracción de compuestos antimicrobianos con actividades inhibidoras contra el crecimiento de células vegetativas, esporas nativas y esporas sometidas a choque térmico de bacterias que forman de esporas.
Ejemplo 5 - Comparación del fraccionamiento de un extracto de acetona de semillas de aguacate frente a semillas de aguacate trituradas en un sistema de disolventes no miscibles bifásico de heptano:metanol
Para el presente ejemplo, se obtuvo un extracto bruto de acetona de semilla de aguacate tal como se describe en el ejemplo 1, y se evaporó hasta sequedad. Se añadió directamente el extracto bruto de acetona seco obtenido a partir de 50 g de semillas de aguacate trituradas a un embudo de separación que contenía un sistema de dos disolventes no miscibles compuesto por 100 ml de heptano (fase superior F002) y 100 ml de metanol (fase inferior F001) para permitir el reparto de compuestos polares y apolares contenidos en el extracto (figura 7A).
Para fines de comparación, se preparó un segundo sistema bifásico con 50 g de semillas de aguacate trituradas directamente añadido al otro sistema de disolventes no miscibles también compuesto por 100 ml de heptano (fase superior) y 100 ml de metanol (fase inferior). Se agitó la mezcla a 200 rpm durante 24 horas a 35°C para extraer y repartir de manera selectiva los compuestos presentes en la semilla en una etapa. Posteriormente, se separó la semilla del extracto mediante filtración a vacío. Se dejaron formar las fases superior (F003) e inferior (F004) de este sistema en un embudo de separación y se recogieron por separado figura 7B.
Se evaporaron las diferentes fases descritas anteriormente (F001 - F004) hasta sequedad de manera individual en un evaporador rotatorio (35°C, 22 inHg) y se pesó la materia seca obtenida.
Se volvieron a disolver las fracciones secas en acetona hasta una concentración final de 2,5 mg/ml para la evaluación posterior de sus actividades antibacterianas contra Clostridium sporogenes (ATCC 7955). Se llevaron a cabo las actividades antibacterianas contra las células vegetativas, las esporas nativas y las esporas sometidas a choque térmico (determinación de la zona de inhibición del disco) tal como se describe en el ejemplo 1.
Los resultados de las zonas de inhibición del disco para esporas sometidas a choque térmico indicaron que una extracción directa de semillas de aguacate trituradas con los dos disolventes no miscibles reduce la cantidad de contaminantes que pueden migrar a la fase superior y que diluirían el efecto de los compuestos activos (figura 8), por tanto, ilustra que es una mejor opción para un aislamiento en una etapa de compuestos que inhiben la germinación de esporas. Sin embargo, basándose en los resultados antibacterianos para la inhibición de células vegetativas, ambos procedimientos dieron como resultado resultados similares sin beneficios particulares de uno sobre el otro.
Por tanto, el presente ejemplo demuestra que las sustancias antibacterianas se enriquecieron en las fases superiores de los sistemas bifásicos de heptano:metanol en las dos evaluaciones realizadas de extracción directa de la semilla triturada y el reparto de un extracto de acetona de semillas de aguacate seco. Sin embargo, también se observó actividad residual en las fases inferiores (F002 y F004), lo que indica que las fases superiores se saturaron con compuestos activos o que los compuestos presentaban solubilidad parcial en las fases inferiores de ambos sistemas. Por tanto, se estableció una extracción posterior volviendo a extraer los sólidos evaporados recuperados de la fase de metanol inferior F002; los sistemas de extracción posteriores (segundos dos sistemas de disolventes no miscibles) usados para recuperar los compuestos antibacterianos restantes se formaron por acetato de etilo (100 ml) y agua (100 ml). Las actividades antibacterianas de las fases de acetato de etilo y agua se muestran en la figura 9. Estos segundos dos sistemas de disolventes no miscibles fueron más polares que los primeros usados y no se encontró actividad
antibacteriana residual en las fases inferiores (principalmente agua).
Para completar adicionalmente el ejemplo, también se evaluaron otros dos sistemas de disolventes no miscibles adicionales como alternativas, al sistema de heptano:metanol descrito anteriormente, para el reparto de los extractos secos de acetona de semillas de aguacate y obtener formulaciones enriquecidas en moléculas bioactivas. Mediante el uso de un sistema bifásico de hexano y metanol, también se recuperaron los compuestos antibacterianos en la fase superior de hexano figura 10. Sin embargo, el sistema bifásico de heptano:metanol demostró ser más efectivo para la recuperación de compuestos en la fase superior ya que presentó menor migración a la fase inferior. Se realizaron pruebas adicionales mediante el uso de sistemas acuosos bifásicos usando agua, sal y etanol para aislar los compuestos antibacterianos de los extractos brutos de etanol y se recuperaron los compuestos deseados en la fase superior que consiste principalmente en etanol.
Ejemplo 6 - Efecto de la saponificación sobre las actividades antimicrobianas de extractos de acetona y hexano de semillas de aguacate
Se repartieron los extractos crudos de acetona de semillas de aguacate con hexano y metanol tal como se describe en el ejemplo 5. Se separaron las fases y se evaporó la fase superior rica en hexano, que contenía compuestos menos polares, hasta sequedad usando un evaporador rotatorio (35°C, 22 inHg). Según Broutin et al (2003), la saponificación es una etapa necesaria para obtener una fracción bioactiva que contenga alcoholes alifáticos o terpénicos, esteroles, tocoferoles, carotenoides y xantófilas que permanecen en la porción insaponificable y no son solubles en agua. Sin embargo, este ejemplo demuestra que los compuestos antibacterianos de la presente invención no podrían obtenerse de la misma manera, lo que indica una naturaleza química diferente.
Se llevó a cabo la saponificación del extracto bruto de acetona y la fracción de fase superior de hexano repartida según Broutin et al (2003), con algunas modificaciones, para recuperar la parte insaponificable y extraer de manera selectiva los lípidos de furano y alcoholes grasos polihidroxilados presentes en ellos. Por separado, se mezclaron 5 g de cada extracto con 2,5 ml de hidróxido de potasio 12 N y 10 ml de etanol y luego se dejaron reposar durante 4 horas. Luego se transfirió la mezcla hidroalcohólica a un embudo de separación y se añadieron 17,5 ml de agua, seguido por la adición de 17,5 ml de dicloroetano. Se agitó la mezcla durante 30 s y luego se dejó que se separara en dos fases. Se recuperó la fase orgánica (fase inferior). Se repitió esta operación 6 veces y se combinaron las fases orgánicas y se lavaron con agua. Se evaporó el dicloroetano hasta sequedad en un evaporador rotatorio (35°C, 22 inHg) y se pesó la materia seca obtenida.
Se volvió a disolver la materia seca en acetona hasta una concentración final de 2,5 mg/ml. Se realizaron las pruebas de actividad antimicrobiana y esporicida (determinación de la zona de inhibición del disco) tal como se describe en el ejemplo 1, se usó Clostridium sporogenes (ATCC 7955) como microorganismo de prueba. Tal como se muestra en la figura 11, sólo los compuestos insaponificables extraídos del extracto bruto de acetona mostraron inhibición del disco en las esporas, lo que indica que repartir un extracto de acetona con hexano y metanol elimina los compuestos insaponificables. Curiosamente, esta parte insaponificable del extracto bruto de acetona tuvo una actividad más baja que el extracto bruto de acetona no tratado con álcali (figura 2) particularmente en sus actividades inhibidoras contra las esporas bacterianas.
Los compuestos insaponificables en el extracto bruto de acetona tenía una mayor especificidad para células vegetativas que para esporas. El reparto con hexano-metanol redujo la actividad de los compuestos insaponificables contra las células vegetativas lo que indica que algunos de estos compuestos podrían migrar a la fase alcohólica durante el reparto.
Cuando las propiedades antibacterianas de las fases superior de hexano e inferior de metanol, en las que se repartió la materia insaponificable del extracto bruto de acetona, se compararon con las actividades para acetona en bruto los extractos de hexano descritos en el ejemplo 1 fueron significativamente menores para ambas fases. Por tanto, los resultados indicaron que los compuestos activos son sensibles a los tratamientos alcalinos o que algunas características químicas deseables se modifican o eliminan durante el tratamiento de saponificación y las etapas de reparto posteriores. Por tanto, no debe considerarse una etapa de saponificación con el objetivo del aislamiento o el aumento de la actividad antimicrobiana y esporicida para obtener el extracto de semillas de aguacate activo.
Ejemplo 7 - Cromatografía de reparto de un extracto de acetona de semillas de aguacate.
Se obtuvo extracto bruto de acetona de semilla de aguacate y se evaporó hasta sequedad tal como se describe en el ejemplo 1, luego se repartió en un sistema bifásico de heptano:metanol tal como se describe en el ejemplo 5. Se evaporó la fase superior rica en heptano (F001), que contenía menos compuestos polares hasta sequedad usando un evaporador rotatorio (35°C, 22 inHg) y luego se inyectó a un cromatógrafo centrífugo rápido de reparto FCPC® Bench Scale con una columna 1000 ml para fraccionar los compuestos químicos usando heptano y metanol. Se bombeó el heptano en la columna y sirvió como fase estacionaria (740 ml). Luego se bombeó el metanol (fase móvil) en la columna a una velocidad de flujo de 10 ml/min. Se fijó el rotor a 800 rpm. Se inyectó el extracto concentrado (65 ml), obtenido a partir de la fase superior evaporada del sistema bifásico de heptano:metanol en la que se repartió el extracto de acetona de semillas de aguacate, en el FCPC después de que el sistema hubiera alcanzado el equilibrio
hidrodinámico. Se usó metanol para eluir las fracciones durante los primeros 170 min, y después de ese tiempo se usó heptano como fase móvil durante 100 min. Se recogió el efluente de la salida de la columna en tubos de ensayo usando un colector de fracciones ajustado a 10 ml para cada tubo. Se recogió una alícuota de 1 ml de cada fracción para las pruebas de actividad antibacteriana y esporostática/esporicida. Se evaporaron las alícuotas hasta sequedad usando un concentrador Speed Vac, se registraron los pesos de los sólidos de cada fracción y se formaron 70 conjuntos de fracciones consecutivas que tenían una concentración final por conjunto de 2,5 mg/ml. Se evaluaron las propiedades antibacterianas de cada conjunto contra células vegetativas, esporas nativas y esporas sometidas a choque térmico de Clostridium sporogenes tal como se describe en el ejemplo 1. Se evaporó el volumen restante de cada fracción (9 ml), hasta sequedad usando un concentrador Speed Vac, se almacenaron a 80°C y se usaron adicionalmente para las evaluaciones de identificación química.
Tal como puede observarse en la figura 12, la actividad antibacteriana estaba presente en las fracciones con coeficientes de reparto (Kd) inferiores a 0,5 (más específicamente entre valores de Kd de desde 0,19 hasta 0,35) lo que indica que los compuestos activos eran al menos 2 veces más solubles en heptano que en metanol. También hubo una ligera diferencia en la actividad de esas fracciones contra las células vegetativas en comparación con las esporas, ya que los inhibidores del crecimiento de las células vegetativas se extendieron más en fracciones más polares.
El reparto del extracto mediante FCPC aumentó las actividades antibacterianas deseadas (zonas de inhibición de hasta 3 cm de diámetro) en comparación con los experimentos previos con extractos menos puros, lo que indica claramente la necesidad de eliminar otros compuestos fitoquímicos que podrían estar diluyendo la concentración de los compuestos antibacterianos (figura 12). Las actividades antibacterianas de algunas fracciones de FCPC aumentaron al menos en un 50% en comparación con los datos observados en la figura 2 para los extractos brutos de hexano y acetona de semillas de aguacate. Los resultados mostrados en la figura 12 también demuestran, como en la figura 8, que los compuestos activos tienen más afinidad por la fase heptano que por la fase metanólica.
Para caracterizar adicionalmente las actividades antibacterianas de las fracciones con la mayor actividad, era importante determinar su concentración inhibidora mínima (CIM), definida como la concentración más baja de un compuesto antimicrobiano que inhibirá el crecimiento visible de un microorganismo después de la incubación durante la noche. En comparación con la nisina, las fracciones obtenidas mediante FCPC con un Kd de 0,3 y 0,4, mostraron una CIM más baja para las células vegetativas que para las esporas nativas o esporas sometidas a choque térmico de C. sporogenes (tabla 2). La fracción con Kd de 0,4 fue casi 2 veces más activa que la nisina para la inhibición del crecimiento de esporas, pero la fracción con Kd de 0,3 fue aproximadamente 15 veces más activa que la nisina. Pero en el caso de las esporas sometidas a choque térmico, las diferencias entre la nisina y las fracciones con Kd de 0,4 fueron menos pronunciadas, pero aún presentaron las propiedades inhibidoras deseadas contra la germinación de las esporas.
Tabla 2. Concentración inhibidora mínima (CIM) para las fracciones obtenidas mediante cromatografía de reparto centrífuga rápida de fase inversa (RF-FCPC) de los sólidos recuperados de la fase superior (heptano) del sistema bifásico (heptano:metanol) usado para repartir un extracto bruto acetónico de aguacate tal como se describe en el ejemplo 5.
*La nisina se sometió a prueba usando disoluciones madre iniciales a 50 mg/ml y para fracciones de aguacate a 2,5 mg/ml.
Tal como se muestra en el presente ejemplo, el mismo extracto repartido mediante FCPC en las condiciones descritas anteriormente (fase inversa) también pueden repartirse usando heptano como fase móvil (fase normal) y los resultados de la separación cromatográfica siguieron el mismo comportamiento basándose en las actividades antibacterianas (figura 13). Por tanto, las primeras fracciones obtenidas mediante FCPC tuvieron mejor actividad que las últimas (más polares) y en la figura 13 se muestra que la actividad antibacteriana permaneció presente hasta que el coeficiente de
reparto alcanzó 7,2, lo que indica que otros compuestos que son más de 7,2 veces más solubles en heptanos que el metanol no inhiben el crecimiento de células vegetativas o esporas de C. sporogenes.
Ejemplo 8 - Cromatografía de reparto de extracto de acetona de semillas de aguacate para obtener fracciones con actividades inhibidoras contra otros microorganismos además de C. sporogenes.
Se obtuvo el extracto bruto de acetona de semilla de aguacate y se evaporó hasta sequedad tal como se describe en el ejemplo 1, luego se repartió en un sistema bifásico de heptano:metanol tal como se describe en el ejemplo 5. Se evaporó la fase superior rica en heptano, que contenía menos compuestos polares hasta sequedad usando un evaporador rotatorio (35°C, 22 inHg) y luego se inyectó en un cromatógrafo centrífugo rápido de reparto FCPC® usando las condiciones de fase normal descritas en el ejemplo 7.
Las fracciones obtenidas de FCPC en fase normal, luego se usaron para evaluar sus actividades antimicrobianas frente al crecimiento de células vegetativas de S. aureus y B. subtilis. Tal como puede observarse en la figura 14, compuestos diferentes a los que inhiben C. esporogenes y con muy baja polaridad están inhibiendo el crecimiento de células vegetativas de S. aureus y B. subtilis debido a que se observaron zonas de inhibición del disco para estos microorganismos cuando los discos fueron inoculados con fracciones de coeficiente de partición superior a 7, contrastando con los resultados de la inhibición de C. sporogenes mostrados en el ejemplo 7.
La tabla 3, resume los resultados antimicrobianos de experimentos previos obtenidos a partir de la evaluación de los extractos brutos del ejemplo 1, los extractos repartidos tal como se describe en el Ejemplo 5, y las fracciones insaponificables del ejemplo 6. Tal como puede observarse, curiosamente, no mostraron ningún efecto inhibidor sobre el crecimiento de S. aureus y zonas de inhibición del disco muy bajas cuando se sometieron a prueba contra B. subtillis en comparación con los efectos inhibidores más fuertes observados para las fracciones de CPC enriquecidas mostradas en la figura 14.
Tabla 3. Evaluación de las actividades antimicrobianas frente al crecimiento de células vegetativas de S. aureus y B. subtilis de diferentes extractos brutos
Ejemplo 9 - Efecto de la alta presión y temperatura sobre la estabilidad de la actividad antimicrobiana
Se obtuvo un extracto bruto de acetona a partir de hueso de aguacate y se evaporó hasta sequedad tal como se describe en el ejemplo 1. Luego se repartieron los sólidos de aguacate extraídos con acetona en un sistema bifásico de hexano-metanol tal como se describe en el ejemplo 5, seguido por un segundo sistema de reparto de acetato de etilo:agua usado para recuperar completamente los compuestos activos presentes en la fase de fase inferior (metanol) del primer sistema de reparto (también descrito en el ejemplo 5). Se recuperaron el hexano y las fases del acetato de etilo por separado y se evaporaron hasta sequedad usando un evaporador rotatorio (35°C, 22 inHg). Luego se cargaron ambas fase en viales y se expusieron a tratamientos de alta presión hidrostática (HHP) de 300 MPa y 600 MPa (43,511 y 87,022 psi, respectivamente), durante 3 y 6 minutos. No se observó una diferencia significativa en las propiedades antibacterianas de los extractos después de los tratamientos de alta presión, lo que indica que los compuestos responsables de las propiedades antimicrobianas observadas son estables a las tratamientos de HHP.
También se sometió a prueba la estabilidad térmica de los compuestos activos a temperaturas que oscilaron desde 25 hasta 100°C durante 60 min. Los compuestos con actividad contra el crecimiento de células vegetativas de C. sporogenes eran los menos sensibles al tratamiento térmico (figura 15) que los responsables de las propiedades inhibidoras contra el crecimiento de esporas nativas (figura 16). Tal como puede observarse en la figura 15 las propiedades inhibidoras contra las células vegetativas disminuyeron en un 20 y 23,5%, después de un tratamiento de
100°C durante 60 minutos de los extractos de acetato de etilo y hexano, respectivamente, y en referencia a las propiedades inhibidoras de los extractos de control no calentados mantenidos a 25°C.
Las esporas sometidas a choque térmico fueron más resistentes a la acción de los extractos brutos de acetato de etilo y hexano tratados térmicamente; las propiedades inhibidoras contra esporas sometidas a choque térmico disminuyeron en un 50%, después de la exposición de los extractos a 100°C durante 60 minutos, y en referencia a las propiedades inhibidoras observadas para los extractos de control mantenidos a 25°C.
Ejemplo 10 - Identificación de los principales compuestos encontrados en las fracciones bioactivas
Las fracciones con las zonas de inhibición del disco más altas (figura 12), obtenidas mediante el uso de cromatografía de reparto centrífuga rápida de fase inversa (RP-FCPC), y que tenían un Kd entre 0,19-0,35, se mezclaron juntas para formar un “conjunto de fracciones activas”, tal como se describe en el ejemplo 7. Inicialmente se ajustaron las fracciones (13) a la misma concentración de 192,3 mg/ml y se tomaron volúmenes iguales de cada una de ellas (100 |il) y se ajustaron con etanol a una concentración final de 50 mg/ml.
La figura 17 muestra el cambio progresivo en los perfiles cromatográficos de las fracciones presentes en el conjunto activo, a medida que aumenta su Kd. Se ajustaron alícuotas evaporadas de fracciones individuales a 1 mg/ml con metanol de calidad HPLC y se inyectaron 2 |il. La columna usada fue una columna Zorbax Extanded-C18 (100 x 3 mm d.i., 3,5 |im). Las fases móviles incluían agua al 100% como fase A y metanol al 100% como fase B. El gradiente de disolventes usado se describe en la tabla 4, bombeado a una velocidad de flujo de 0,38 ml/min y un tiempo de equilibrado posterior de 6 min. Se ajustó el detector a una longitud de onda de 220 nm.
Tabla 4. Gradiente de disolventes usado para lograr la separación cromatográfica de las fracciones recogidas después de la cromatografía de reparto centrífuga rápida (A= agua y B= metanol).
El cromatógrafo típico obtenido para el conjunto activo de compuestos antimicrobianos de aguacate se muestra en la figura 17. Los números indicados en el cromatograma representan los picos comunes que absorben a 220 nm, etiquetados como compuestos 1 a 11, y la información sobre su masa y fórmula molecular se presenta en la tabla 5. Algunos de estos compuestos se han descrito previamente en tejidos de aguacate, sin embargo, algunos de ellos se divulgan en el presente documento como nuevos compuestos químicos desde que fueron descubiertos por los inventores en las fracciones antimicrobianas. En la mayoría de las fracciones bioactivas, compuestos tales como 1, 2, 4 y 11 estaban en concentraciones más bajas en comparación con los compuestos 7 y 9 (figura 17).
Tabla 5. Caracterización química de los compuestos encontrados en las fracciones antimicrobianas.
aNombre común, cuando sea aplicable
Ejemplo 11 - Evaluación de la actividad esporostática y esporicida de una fracción enriquecida en compuestos antimicrobianos.
Para demostrar que el conjunto de fracciones activas descrito en el ejemplo 10 (coeficiente de reparto 0,19-0,35) tenía actividad esporostática o esporicida, fue necesario determinar sus concentraciones inhibidoras mínimas (CIM) y concentraciones bactericidas mínimas (CBM). En términos generales, CIM se define como la concentración más baja de un compuesto antimicrobiano que inhibirá el crecimiento visible de un microorganismo después de la incubación durante la noche. Mientras que la CBM es la concentración más baja del compuesto antimicrobiano que evitará el crecimiento de un microorganismo después del subcultivo en un medio de agar recién preparado libre del agente antibiótico o antimicrobiano. Se sometió a prueba el conjunto de las fracciones activas a concentraciones que oscilaban desde 0,005 hasta 2,5 mg/ml y se usó nisina como control.
La tabla 6 muestra que el conjunto de fracciones activas fue mucho mejor que la nisina como inhibidor del crecimiento de esporas de C. sporogenes ya que su CIM es casi una décima parte de la obtenida para la nisina. Según Smola (2007), si la razón CBM/CIM < 4, el compuesto puede considerarse esporicida y si la razón CBM/CIM> 4, solo es esporostático. En este ejemplo, tanto la nisina como el conjunto de fracciones activas de aguacate presentaron un efecto esporicida.
Tabla 6. Concentración inhibidora mínima (CIM), concentración bactericida mínima (CBM) y razón CBM/CIM, para nisina y el conjunto de fracciones activas aisladas a partir de semilla de aguacate, contra el crecimiento de esporas sometidas a choque térmico de C. sporogenes.
a Razones de las CBM/CIM < 4 indican actividad esporicida. Las razones de las CBM/CIM > 4 indican actividad esporostática.
Ejemplo 12 - Actividades antimicrobianas de compuestos químicos aislados a partir de fracciones bioactivas
En este ejemplo, se sometieron a prueba las actividades antimicrobianas de los mismos compuestos aislados descritos en el ejemplo 10 (tabla 5) contra el crecimiento de células vegetativas y esporas sometidas a choque térmico de C. sporogenes, y en células vegetativas de S. aureus, P. aeuroginosa, E. coli. y B. subtilis tal como se describió previamente en el ejemplo 1, y a una concentración de 0,5 mg/ml. Tal como puede observarse en la tabla 7, el compuesto 6 (pico 6) y la persenona B (pico 9A) demostraron mayores propiedades antimicrobianas cuando se sometieron a prueba contra C. sporogenes, seguido por persenona A (pico 7). Además, de todos los compuestos bioactivos, solo la persina (pico 9B) mostró una actividad más baja que la nisina, aunque la nisina, un compuesto antimicrobiano conocido, se sometió a prueba a una concentración 100 veces mayor. Dado que se ha informado que la persina es capaz de inhibir la germinación de las esporas de hongos (Prusky et al., 1982), y en el presente experimento parece tener la actividad más baja, puede suponerse que el otro compuesto bioactivo tendría una actividad más alta contra las esporas de hongos.
Tabla 7. Evaluación de las actividades antimicrobianas de los compuestos aislados activos de la figura 17 contra el crecimiento de células vegetativas y esporas sometidas a choque térmico de Clostridium sporogenes (ATCC 7955).
Zona de inhibición del disco (cm) Número de pico Nombre común Células vegetativas Esporas sometidas a choque térmico Compuesto 3 1,1 1,0 Compuesto 5 1,0 1,1 Compuesto 6 1,9 1,7 Compuesto 7 Persenona A 1,6 1,5
1,7
Compuesto 9B Persina 1,0 0,6
Control negativo 0,0 0,0
Control positivo
(nisina a 50 mg/ml) 1,1 1,0
Es importante señalar que, para la sorpresa de los inventores, todos los compuestos que muestran la mayor actividad contra las células vegetativas y las esporas sometidas a choque térmico de C. sporogenes (compuesto 6, persenona B y persenona A mencionado de mayor a menor actividad antimicrobiana informada en la tabla 7) contenía un doble enlace C5-C6 (véase la tabla 8). Además, si se comparan las estructuras de la persina (compuesto 9B) y la persenona A (compuesto 7), la única diferencia es la falta del doble enlace C5-C6 en la persina (compuesto 9B), y en este ejemplo se demuestra que su actividad antimicrobiana se redujo en un 37,5%. Además, la única diferencia estructural entre la persenona B (compuesto 9A) y el compuesto 6 es que el último también presenta un doble enlace C16-C17, pero sus actividades inhibidoras fueron las mismas. Esta observación también apoyó el hallazgo de que un doble C5-C6 es una característica estructural deseable para mejorar las actividades antimicrobianas de los compuestos descritos en el presente documento, y que el doble enlace C16-C17 también es una característica estructural preferida, ya que es la única insaturación presente. en el compuesto 3, y tuvo mayor actividad que la persina (compuesto 9B) que contiene dos insaturaciones y ninguna entre C16-C17.
Tabla 8. Estructuras químicas y nombres comunes de los compuestos responsables de las actividades antimicrobianas de semilla de aguacate.
Los compuestos más antibacterianos contra C. sporogenes (compuesto 6, persenona B y persenona A) no mostraron actividad inhibidora contra S. aureus, P. aeuroginosa o E. coli (tabla 9), pero el compuesto 6 también presentó las mayores actividades inhibidoras contra el crecimiento de B. subtillis, seguido de la persenona A. Dado que el compuesto 6 es un compuesto recién descubierto que no se informó anteriormente como constituyente del aguacate, no hay informes previos de su actividad antimicrobiana o de cualquier otra actividad biológica. La persenona A se había informado previamente como antifúngica, pero según los resultados de la tabla 7, su actividad antibacteriana es específica de las bacterias grampositivas que forman esporas. El conjunto de fracciones activas obtenido tal como se describe en el ejemplo 10, y que presentaba propiedades antibacterianas contra C. esporogenes en el ejemplo 10, en el presente ejemplo sólo dio como resultado propiedades inhibidoras contra las bacterias que forman esporas B. subtilis.
Tabla 9. Zonas de inhibición del disco de los compuestos bioactivos y el conjunto de fracciones activas para células vegetativas y B. Subtillis, S. aureus, P. aeuroginosa y E. coli
Se determinaron las CIM para el compuesto 6, persenona B (compuesto 9A) y persenona A (compuesto 7) frente a la germinación de esporas sometidas a choque térmico de C. sporogenes tal como se describe en el ejemplo 11. Tal como puede observarse en la tabla 10, los tres compuestos tenían valores de CIM 15-30 veces más bajos que la nisina, lo que demuestra su eficacia contra las esporas bacterianas. La CIM para el conjunto de fracciones activas fue de 19,5 ^g/ml (ejemplo 11) y se redujo hasta 7,8 |ag/ml para la persenona A y la persenona B cuando se aislaron, pero las propiedades antimicrobianas de la persenona B dentro del conjunto no correspondieron a su concentración más baja, ya que contenía menos |ag de ese compuesto, pero cuando se combinó con las otras moléculas bioactivas, su actividad parece estar potenciada. Curiosamente, los compuestos aislados presentaron solo actividad esporostática contra C. sporogenes y no mostraron la bioactividad esporicida que se observó para el conjunto de fracciones activas (tabla 6).
Tabla 10. Concentraciones inhibidoras mínimas (CIM), para nisina, compuesto 6, persenona B y A, contra esporas sometidas a choque térmico de C. sporogenes.
Ejemplo 13 - Actividades antibacterianas de extractos de semilla de aguacate combinados con temperaturas de refrigeración para el control de Listeria monocvtogenes.
El conjunto de fracciones activas descrito en el ejemplo 10 también presenta efectos antibacterianos contra las células vegetativas en frío extremo de bacterias grampositivas capaces de crecer en condiciones refrigeradas, tales como Listeria monocytogenes. A la temperatura óptima de crecimiento de 37°C para Listeria monocytogenes el extracto del conjunto de aguacate enriquecido en acetogeninas bioactivas no fue particularmente útil para la inhibición del crecimiento de células vegetativas del organismo sometido a prueba (tabla 11). Al contrario de lo esperado, se encontró que el extracto del conjunto de semillas de aguacate fue particularmente útil para inhibir el crecimiento de Listeria
monocytogenes en condiciones refrigeradas. Además, en la tabla 12 se ilustra que cuando las actividades antibacterianas de las acetogeninas de aguacate aisladas en la presente invención, se sometieron a prueba frente al crecimiento de células vegetativas de Listeria monocytogenes, los compuestos que presentan la característica deseable de un doble enlace entre C5 y C6 pueden usarse para el control de Listeria monocytogenes en alimentos y matrices biológicas almacenados en condiciones refrigeradas.
Tabla 11. Actividades antibacterianas de extractos de semilla de aguacate combinados con bajas temperaturas de almacenamiento frente al crecimiento de células vegetativas de Listeria monocytogenes.
Tabla 12. Actividades antibacterianas de los compuestos de aguacate aislados combinados con refrigeración contra el crecimiento de células vegetativas de Listeria monocytogenes.
Ejemplo 14- Cuantificación de los compuestos antimicrobianos en extractos de aguacate enriquecidos
La concentración de los compuestos antibacterianos presentes en el conjunto de fracciones activas descritas en la tabla 7 (ejemplo 10) se presenta en la figura 18. La persenona A representa el 36,32% del peso seco del conjunto de fracciones activas, la persenona B era sólo el 0,20% y el compuesto 6 representa la cantidad más baja (0,05%). Parece que los otros componentes de la mezcla no afectan la actividad inhibidora de la persenona A y, por tanto, puede que no sea necesaria una purificación adicional.
La tabla 13 muestra que existe una concentración muy similar de los compuestos más bioactivos contra C. esporogenes (compuesto 6, persenona B y persenona A) en pulpa y semilla de aguacate fresco, siendo la persenona A la más concentrada. La información de este ejemplo es relevante porque si los compuestos bioactivos también están
presentes en la pulpa, pueden obtenerse fácilmente de otras partes de la fruta. El presente ejemplo también demuestra que los humanos están expuestos a las moléculas bioactivas, al comer la fruta, en las concentraciones necesarias para alcanzar sus propiedades antibacterianas; estableciendo así su potencial comercial en las técnicas alimentaria, médica y cosmética.
Tabla 13. Concentraciones de compuesto 6, persenona B y persenona A en pulpa y semilla de aguacate fresco (ug/g de peso en fresco).
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Claims (26)
2. Producto seleccionado de un producto alimenticio, un producto cosmético y una composición antibacteriana, antimicrobiana o esporicida que comprende un compuesto según la reivindicación 1.
3. Producto según la reivindicación 2, en el que el producto alimenticio se selecciona del grupo que consiste en pescado, crustáceos, sustitutos de pescado, sustitutos de crustáceos, carne, sustitutos de carne, productos de aves de corral, hortalizas, verduras, salsas, emulsiones, bebidas, zumos, vinos, cervezas, productos lácteos, productos a base de huevo, mermeladas, jaleas, productos a base de cereales, productos de panadería, productos de pastelería, y combinaciones de los mismos,
en el que el producto cosmético se selecciona del grupo que consiste en cremas, geles, polvos, lociones, protectores solares, pintalabios, gel de ducha, extractos de plantas medicinales, formulaciones que favorecen el crecimiento de bacterias, y combinaciones de los mismos y/o
en el que la composición o el producto alimenticio comprende además:
una sustancia antimicrobiana seleccionada del grupo que consiste en compuestos de nitrito, nisina, bacteriocinas, arginato de etil lauroílo, compuestos de ácido etilendiamintetraacético, compuestos de ácido ascórbico y compuestos de ácido benzoico.
4. Compuesto según la reivindicación 1, para su uso en un método de terapia para proporcionar un efecto antimicrobiano o antibacteriano en un paciente.
5. Composición farmacéutica que comprende un compuesto según la reivindicación 1 y uno o más componentes farmacéuticamente aceptables para su uso en un método de terapia para proporcionar un efecto antimicrobiano o antibacteriano en un paciente.
6. Compuesto de fórmula (I):
en la que
R1 es hidrógeno o acetilo;
R2 es hidrógeno o un grupo protector hidroxilo; y
R3 es un grupo alquenilo con al menos dos dobles enlaces carbono-carbono con configuración trans (E), y opcionalmente fórmula (II)
en la que
R1 es hidrógeno o acetilo;
R2 y R4 son hidrógeno o un grupo protector hidroxilo; y
R3 es un grupo alquenilo con al menos un doble enlace carbono-carbono;
para su uso en un método de terapia para inhibir la germinación de esporas bacterianas en un paciente.
7. Composición farmacéutica que comprende un compuesto según la reivindicación 6
y uno o más componentes farmacéuticamente aceptables para su uso en un método de terapia para inhibir la germinación de esporas bacterianas en un paciente.
8. Compuesto para su uso según la reivindicación 6, o composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 7, o producto según la reivindicación 2, en los que el compuesto inhibidor es el compuesto según la reivindicación 1.
9. Compuesto para su uso según la reivindicación 6, o composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 7, o producto según la reivindicación 2, en los que las esporas bacterianas se seleccionan del grupo que consiste en Clostridium, Bacillus, Alicyclobacillus, y combinaciones de los mismos.
10. Compuesto para su uso según la reivindicación 4, o composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 5, en los que los microbios se seleccionan del grupo que consiste en Clostridium, Listeria, Bacillus, y combinaciones de los mismos.
11. Compuesto para su uso según la reivindicación 4, o composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 5, en los que los microbios se seleccionan del grupo que consiste en Clostridium sporogenes, Listeria monocytogenes, Bacillus subtilis, y combinaciones de los mismos.
12. Compuesto para su uso según la reivindicación 6, o composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 7, o compuesto para su uso según la reivindicación 4, o composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 5, en los que el compuesto puede administrarse por vía oral, dérmica, parenteral, nasal, oftálmica, óptica, sublingual, rectal, gástrica, vaginal, o usando combinaciones de las mismas.
13. Método no terapéutico para inhibir la germinación de esporas bacterianas sobre o en un producto alimenticio, producto cosmético, composición farmacéutica, superficie o composición que favorece el crecimiento de bacterias, comprendiendo dicho método:
proporcionar un compuesto inhibidor de fórmula (I):
en la que
R1 es hidrógeno o acetilo;
R2 es hidrógeno o un grupo protector hidroxilo; y
R3 es un grupo alquenilo con al menos dos dobles enlaces carbono-carbono con configuración trans (E); y opcionalmente fórmula (II)
en la que
R1 es hidrógeno o acetilo;
R2 y R4 son hidrógeno o un grupo protector hidroxilo; y
R3 es un grupo alquenilo con al menos un doble enlace carbono-carbono;
aplicar el compuesto inhibidor sobre o en el producto alimenticio, producto cosmético, composición farmacéutica, superficie o composición que favorece el crecimiento de bacterias para inhibir la germinación de esporas bacterianas sobre o en el producto alimenticio, producto cosmético, composición farmacéutica, superficie o composición que favorece el crecimiento de bacterias.
14. Método según la reivindicación 13, en el que
R1 es hidrógeno o acetilo;
R2 es hidrógeno o un grupo protector hidroxilo; y
R3 es un grupo alquenilo C5-C22 con una configuración trans en dos dobles enlaces carbono-carbono.
15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14, en el que
R1 es hidrógeno o acetilo;
R2 es hidrógeno; y
R3 es un grupo alquenilo C5-C22 con dos dobles enlaces carbono-carbono con configuración trans.
16. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14, en el que
R1 es acetilo;
R2 es hidrógeno; y
R3 es un grupo alquenilo que se compone de 12 a 18 átomos de C, con dos dobles enlaces carbono-carbono con configuración trans; y el carbono que se une a OR2 está en la configuración (R).
17. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que existe un doble enlace en la posición C-16 y C-17 del compuesto.
18. Método según la reivindicación 13, en el que el compuesto inhibidor es el compuesto según la reivindicación 1.
19. Método según la reivindicación 13, en el que las esporas bacterianas se seleccionan del grupo que consiste en Clostridium, Bacillus, Alicydobacillus, y combinaciones de los mismos.
20. Método no terapéutico para proporcionar un efecto antimicrobiano o antibacteriano sobre o en un producto alimenticio, producto cosmético, composición farmacéutica, superficie o composición que favorece el crecimiento de bacterias, comprendiendo dicho método:
proporcionar un compuesto inhibidor en el que el compuesto inhibidor es el compuesto según la reivindicación 1;
aplicar el compuesto inhibidor sobre o en el producto alimenticio, producto cosmético, composición farmacéutica, superficie o composición que favorece el crecimiento de bacterias para proporcionar un efecto antimicrobiano o antibacteriano sobre o en el producto alimenticio, producto cosmético, composición farmacéutica, superficie o composición que favorece el crecimiento de bacterias.
21. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 20, en el que la superficie se selecciona del grupo que consiste en encimeras, puertas, ventanas, mangos, equipo quirúrgico, utensilios médicos, superficies de contacto que pueden contaminar los humanos o animales, y combinaciones de los mismos.
22. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 20, en el que el producto alimenticio se selecciona del grupo que consiste en pescado, crustáceos, sustitutos de pescado, sustitutos de crustáceos, carne, sustitutos de carne, productos de aves de corral, hortalizas, verduras, salsas, emulsiones, bebidas, zumos, vinos, cervezas, productos lácteos, productos a base de huevo, mermeladas, jaleas, productos a base de cereales, productos de panadería, productos de pastelería, y combinaciones de los mismos.
23. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 20, en el que el producto cosmético se selecciona del grupo que consiste en cremas, geles, polvos, lociones, protectores solares, pintalabios, gel de ducha, extractos de plantas medicinales, formulaciones que favorecen el crecimiento de bacterias, y combinaciones de los mismos.
24. Método según la reivindicación 20, en el que los microbios se seleccionan del grupo que consiste en Clostridium, Listeria, Bacillus, y combinaciones de los mismos.
25. Método según la reivindicación 20, en el que los microbios se seleccionan del grupo que consiste en Clostridium sporogenes, Listeria monocytogenes, Bacillus subtilis, y combinaciones de los mismos.
26. Método según la reivindicación 13 o método según la reivindicación 20, en el que el producto alimenticio o la composición que favorece el crecimiento de bacterias comprende además:
una sustancia antimicrobiana seleccionada del grupo que consiste en compuestos de nitrito, nisina, bacteriocinas, arginato de etil lauroílo, compuestos de ácido etilendiamintetraacético, compuestos de ácido ascórbico y compuestos de ácido benzoico.
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