ES2828507T3 - Un autoanticuerpo novedoso diagnósticamente relevante - Google Patents

Abstract

Un procedimiento in vitro de diagnóstico de una enfermedad, preferentemente una enfermedad asociada con síntomas neurológicos, comprendiendo la etapa detectar en una muestra que comprende anticuerpos de un paciente un autoanticuerpo de unión al receptor de trifosfato de inositol tipo 1 (ITPR1) definido por el código de base de datos de Uniprot Q14643, en el que la enfermedad es un síndrome neurológico paraneoplásico preferentemente asociado con carcinoma de mama, en el que la detección del autoanticuerpo indica una probabilidad aumentada de que el paciente sufra la enfermedad.

Description

DESCRIPCIÓN

Un autoanticuerpo novedoso diagnósticamente relevante

La presente invención se refiere a un procedimiento in vitro de diagnóstico de una enfermedad de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo la etapa detectar en una muestra de un paciente un autoanticuerpo de unión al código de base de datos ITPR1 Q14643; al uso de un polipéptido que comprende los aminoácidos 1-1251 de código de base de datos ITPR1 Q14643 o una variante teniendo al menos 98 por ciento de identidad de secuencia con ITPR1 según lo definido por el código de la base de datos de Uniprot Q14643 para el diagnóstico in vitro de una enfermedad de acuerdo con la reivindicación 3, comprendiendo la etapa detectar autoanticuerpos de unión al código de base de datos ITPR1 Q14643; al uso de un autoanticuerpo, preferentemente un autoanticuerpo aislado, de unión al polipéptido del código de base de datos ITPR1 Q14643, en el que el autoanticuerpo está preferentemente en el complejo con dicho polipéptido, en el que la enfermedad es un síndrome neurológico paraneoplásico, preferentemente asociado con el carcinoma de mama, y en el que es detectado un autoanticuerpo contra ITPR1.

El desarrollo de sistemas de diagnóstico para enfermedades neurológicas es un desafío continuo en la ciencia biomédica, sobre todo porque muchos de los síntomas encontrados pueden responder a una enorme variedad de causas, que incluyen enfermedades heredadas genéticamente, abuso de drogas, desnutrición, infecciones, lesiones, enfermedades psiquiátricas, defectos inmunológicos y cáncer.

Debido a que una enfermedad neurológica rara vez es asociada con un patrón característico de síntomas clínicos, a menudo es difícil proporcionar un diagnóstico confiable basado únicamente en la observación y el examen de los pacientes afectados o su historial médico.

No es posible sobreestimar la importancia de un diagnóstico temprano. Muchos trastornos neurológicos, en forma más preponderante las enfermedades de Alzheimer y Parkinson, no tienen cura, pero hay fármacos disponibles que pueden ser usados para ralentizar su progresión. Cuanto antes sea el diagnóstico, mayores serán las posibilidades de aprovechar el espectro de fármacos disponibles para el beneficio completo del paciente.

Esto es aún más válido en el caso de enfermedades neurológicas asociadas con autoanticuerpos. En algunos casos, el vínculo entre un autoanticuerpo detectable específico y una afección es lo suficientemente fuerte como para permitir un diagnóstico inmediato.

Pero incluso si no lo es, la detección de autoanticuerpos puede indicar al médico a cargo los medios terapéuticos que pueden ser usados para mejorar la afección del paciente. Existe una variedad de inmunosupresores ampliamente usados que pueden ser usados independientemente de la naturaleza del objetivo del autoanticuerpo. Alternativamente, puede ser usada la aféresis para eliminar los autoanticuerpos de la sangre del paciente. En muchos casos, los pacientes pasaron a llevar una vida normal después de un diagnóstico y tratamiento tempranos de una enfermedad autoinmune neurológica.

Los ensayos diagnósticos basados en la detección de autoanticuerpos también pueden corroborar el diagnóstico de enfermedades diferentes de las asociadas a autoanticuerpos. Si resulta que una muestra de sangre carece de autoanticuerpos específicos, es probable que esto ayude al médico a cargo a excluir una variedad de posibilidades y así reducir el espectro de condiciones plausibles.

Los ejemplos de afecciones neurológicas que coinciden con la aparición de autoanticuerpos incluyen la neuromielitis óptica, una enfermedad caracterizada por la pérdida de la visión y la función de la médula espinal, y la encefalitis anti­ receptor de NMDA, que se asocia con disfunción autonómica, hipoventilación, ataxia cerebelosa, hemiparesia, pérdida del conocimiento o catatonia. Si bien la participación de los autoanticuerpos y la naturaleza de estas afecciones como tales eran previamente poco conocidas, muchas de estas enfermedades ahora se pueden diagnosticar y tratar de manera eficiente debido a la disponibilidad de ensayos basados en la detección de autoanticuerpos.

Por lo tanto, es fundamental el desarrollo de enfoques novedosos para distinguir las afecciones neurológicas asociadas con los autoanticuerpos de otras.

El documento US2010/035360 desvela que puede ser hallado un autoanticuerpo contra ITPR1 en sueros de pacientes que tienen síndrome de Sjogren o artritis reumatoide.

El documento WO2005/017151 desvela la expresión de una proteína mutante que consiste en el dominio de canal de un receptor IP3.

Kurien Biji T (2009) XP002737576 (Methods in Molecular Biology 2009, vol. 536, pages 201-211) desvela la purificación por afinidad de autoanticuerpos de sueros.

El documento EP 2 952 898 desvela la detección de un autoanticuerpo contra ATPasa Na(+)/K(+) neuronal humana para la detección de enfermedades neurológicas.

Un problema subyacente a la presente invención es proporcionar un agente y un procedimiento de diagnóstico de enfermedades neurológicas, distinguiendo más específicamente las enfermedades asociadas a síntomas neurológicos y la aparición de autoanticuerpos de otros tipos de enfermedades.

Otro problema subyacente a la presente invención es proporcionar un autoanticuerpo que, cuando se halla en una muestra líquida extraída de un paciente, indique que dicho paciente sufre de una enfermedad autoinmune asociada con síntomas neurológicos.

Otro problema subyacente a la presente invención es proporcionar un agente y un procedimiento de diagnóstico y tratamiento de una enfermedad autoinmune asociada con síntomas neurológicos.

El problema subyacente a la presente invención se resuelve mediante el objeto de las reivindicaciones independientes y dependientes adjuntas.

En un primer aspecto, el problema subyacente a la presente invención es resuelto mediante un procedimiento in vitro de diagnóstico de una enfermedad de acuerdo con la reivindicación 1, la enfermedad es un síndrome neurológico paraneoplásico, comprendiendo la etapa detectar en una muestra de un paciente de un autoanticuerpo de unión a ITPR1 código de base Q14643, en el que la detección del autoanticuerpo indica una mayor probabilidad de que el paciente sufra la enfermedad.

En una realización preferente, la muestra es un fluido corporal que comprende anticuerpos, preferentemente seleccionada del grupo que comprende sangre entera, suero, líquido cefalorraquídeo and saliva.

En un segundo aspecto, el problema subyacente a la presente invención es resuelto mediante el uso de un polipéptido que comprende los aminoácidos 1-1251 del ITPR1 de código de base Q14643 o una variante del mismo teniendo la capacidad de unirse específicamente a un autoanticuerpo del ITPR1 de código de base Q14643 para el diagnóstico in vitro de una enfermedad, comprendiendo la etapa detectar autoanticuerpos que se unen al ITPR1 de código de base Q14643, en el que la enfermedad es un síndrome neurológico paraneoplásico, preferentemente asociado con carcinoma de mama, en el que la variante tiene al menos 98 por ciento de identidad de secuencia con ITPR1 como se define por el código de base de datos de Uniprot Q14643.

En un tercer aspecto, el problema subyacente a la presente invención es resuelto mediante el uso de un autoanticuerpo, preferentemente un autoanticuerpo aislado, que se une al polipéptido ITPR1, en el que el autoanticuerpo está preferentemente en complejo con dicho polipéptido, para el diagnóstico in vitro de una enfermedad, en el que la enfermedad es un síndrome neurológico paraneoplásico, preferentemente asociado con carcinoma de mama, y en el que dicho autoanticuerpo contra ITPR1 es detectado.

En un cuarto aspecto, el problema subyacente a la presente invención es resuelto mediante el uso de un dispositivo médico o de diagnóstico comprendiendo un polipéptido que comprende los aminoácidos de 1-1251 de ITPR1 de código de base Q14643 o una variante del mismo teniendo la capacidad de unirse específicamente a un autoanticuerpo contra ITPR1 de código de base Q14643 para el diagnóstico in vitro de una enfermedad, en la que la enfermedad es un síndrome neurológico paraneoplásico, preferentemente asociado con carcinoma de mama, y en el que se detecta un autoanticuerpo contra ITPR1 de código de base Q14643, en el que la variante tiene al menos 98 por ciento de identidad de secuencia con ITPR1 según lo definido por el código de base de datos de Uniprot Q14643.

En una realización preferente de cualquier aspecto de la presente invención, el polipéptido es proporcionado en forma de una célula que comprende un ácido nucleico codificando dicho polipéptido o en forma de un tejido que comprende dicho polipéptido.

En una realización preferente de cualquier aspecto de la presente invención, el polipéptido es un polipéptido recombinante y/o aislado.

La presente invención se basa en el sorprendente hallazgo de los inventores de que pueden ser detectados autoanticuerpos para ITPR1 en muestras de diversos pacientes que sufren síntomas neurológicos, pero no en muestras obtenidas de sujetos sanos. La presencia de tales autoanticuerpos sugiere que la actividad y función de ITPR1 están alteradas en pacientes que tienen autoanticuerpos para ITPR1 por lo que se producen síntomas neurológicos.

La presente divulgación se refiere a un polipéptido que comprende un código de base de datos de ITPR1 humano Q14643 o variantes del mismo teniendo la capacidad de unirse específicamente a un autoanticuerpo contra ITPR1 de código de base de datos Q14643. A lo largo de la presente solicitud, cualquier código de base de datos citado se refiere a la base de datos de Uniprot, más específicamente la versión accesible en línea el 27 de octubre de 2014. D26070.1 representa una secuencia de nucleótidos que codifica ITPR1.

Receptor de trifosfato de inositol tipo 1 (ITPR1; también denominado en el estado de la técnica IP3R 1, receptor de IP3, receptor de InsP3 de tipo 1, receptor de 1,4,5-trifosfato de inositol, proteína fosfatasa 1 de tipo 1 y subunidad reguladora 94 de tipo 1 del receptor de 1,4,5-trifosfato de inositol) es un complejo de glicoproteína de membrana que actúa como un canal de Ca2+ tras la activación por el trifosfato de inositol (IP3). En los seres humanos, está codificado ^{por el gen ITPR1 (también denominado en el estado de la técnica ACV;} CLa4; ^{IP3R; IP3R1; SCA15; SCA16; SCA29;} INSP3R1; PPP1R94).

Los canales de liberación de Ca2+ intracelulares activados por IP3 están compuestos por cuatro subunidades del receptor de IP3 (N. Maeda, T. Ka wasaki, S. Nakade, N. Yokota, T. Taguchi, M. Kasai and K. Mikoshiba, (1991) J. Biol. Chem. 266, 1109-1116). Existen al menos tres tipos de receptores IP3 (ITPR1, ITPR2 e ITPR3) (T. Furuichi and K. Mikoshiba, (1995) J. Neurochem. 64, 953-960), y existen tanto como homo- y heterotetrámeros (T. Monkawa, A. Miyawaki, T. Sugiyama, H. Yoneshima, M. Yamamoto-Hino, T. Furuichi, T. Saruta, M. Hasegawa and K. Mikoshiba, (1995) J. Biol. Chem. 270, 14700-14704).

A nivel funcional, el ITPR1 puede estar dividido en cinco dominios distintos: un dominio supresor de extremo N terminal (aminoácidos 1-225), un núcleo de unión a IP3 (aminoácidos 226-578), un dominio modulador y transductor (aminoácidos 579-2275), un dominio de canal con 6 hélices transmembrana (aminoácidos 2276-2589), y finalmente un dominio de acoplamiento de extremo C terminal (aminoácidos 2590-2749) (K. Uchida, H. Miyauchi, T. Furuichi, T. Michikawa, K. Mikoshiba, Critical regions for activation gating of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor, J. Biol. Chem.

278 (2003) 16551-16560). El núcleo de unión de IP3 es una región esencial para la unión de IP3 específica (F. Yoshikawa, M. Morita, T. Monkawa, T. Michikawa, T. Furuichi and K. Mikoshiba. Mutation analysis of the ligand binding site of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor. (1996) J. Biol. Chem. 271, 18277--18284) y contiene 11 aminoácidos básicos esenciales para su actividad (Bosanac et al., 2002).

Aparte de una serie de bucles cortos entre las hélices transmembrana 1 y 2, y 3 y 4, solo un bucle más grande que ^{comprende 106 aminoácidos ubicado entre las hélices transmembrana 5 y 6 está en contacto con el lumen del} Er. Este bucle consiste en una región variable (66 aminoácidos) que contiene dos sitios de N-glicosilación seguidos de una región conservada (40 aminoácidos) que contribuye al poro del canal.

La liberación de Ca2+ inducida por IP3 es un proceso de cooperación positiva (T. Meyer, T. Wensel, and L. Stryer, Kinetics of calcium channel opening by inositol 1,4,5-trisphosphate. (1990) Biochemistry 29, 32-37.; J. Hirota, T. Michikawa, A. Miyawaki, T. Furuichi, I. Okura, and K. Mikoshiba, Kinetics of calcium release by immunoaffinity-purified inositol 1,4,5-trisphosphate receptor in reconstituted lipid vesicles. (1995) J. Biol. Chem. 270, 19046-19051; T. Michikawa, J. Hirota,S. Kawano, M. Hiraoka, M. Yamada, T. Furuichi, and K. Mikoshiba. Calmodulin mediates calciumdependent inactivation of the cerebellar type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptor. Neuron 23 (1999), 799-808), es decir, se requiere la unión de al menos dos moléculas de IP3 a un canal de receptor de IP3 tetramérico único, para la apertura del canal. ITPR1 es activado por IP3, en el que su afinidad por IP3 es menor que la de ITPR2, pero mayor que ITPR3 (C.L. Newton, G.A. Mignery, T.C. Südhof, Co- expression in vertebrate tissues and cell lines of multiple inositol 1,4,5-trisphosphate (InsP3) receptors with distinct affinities for InsP3, J. Biol. Chem. 269 (1994) 28613-28619); Missiaen et al., 1998; Miyakawa et al., 1998).

Además de IP3, el Ca2+ citosólico funciona como coagonista. Es importante destacar que el Ca2+ activa el receptor IP3 en concentraciones bajas, típicamente por debajo de 300 nM, mientras que inhibe el receptor IP3 en concentraciones más altas. (Lino, 1990; E.A. Finch, T.J. Turner, S.M. Goldin, Calcium as a coagonist of inositol 1,4,5-trisphosphateinduced calcium release, Science 252 (1991) 443-446.; Bezprozvanny et al., 1991; J.B. Parys, S.W. Sernett, S. DeLisle, P.M. Snyder, M.J. Welsh, K.P. Campbell, Isolation, characterization, and localization of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor protein in Xenopus laevis oocytes, J. Biol. Chem. 267 (1992) 18776-18782.).

El Ca2+ luminal también se considera importante, y el agotamiento de las reservas de Ca2+ lleva a una disminución de la sensibilidad del receptor IP3 (L. Missiaen, C.W. Taylor, M.J. Berridge, Spontaneous calcium release from inositol trisphosphate-sensitive calcium stores, Nature 352 (1991) 241-244; L. Missiaen, H. De Smedt, G. Droogmans, R. Casteels, Ca2+ release induced by inositol 1,4,5-trisphosphate is a steady-state phenomenon controlled by luminal Ca2+ in permeabilized cells, Nature 357 (1992) 599-602; D.L. Nunn, C.W. Taylor, Luminal Ca2+ increases the sensitivity of Ca2+ stores to inositol 1,4,5-trisphosphate, Mol. Pharmacol. 41 (1992) 115-119.; J.B. Parys, L. Missiaen, H. De Smedt, R. Casteels, Loading dependence of inositol 1,4,5-trisphosphate-induced Ca2+ release in the clonal cell line A7r5. Implications for the mechanism of quantal Ca2+ release, J. Biol. Chem. 268 (1993) 25206-25212.).

La modulación de la actividad del receptor IP3 ocurre por tres mecanismos principales: (1) el ambiente local, que incluye pH, concentración de ATP y Mg2+ y estado redox; (2) su estado de fosforilación, que depende de la actividad de muchas quinasas y fosfatasas diferentes, algunas de las cuales forman un complejo con el ITPR1; (3) proteínas reguladoras que afectan directamente la actividad del receptor IP3 de forma estimulante o inhibitoria (Mikoshiba, 2007; J.B. Parys, H. De Smedt, Inositol 1,4,5-trisphosphate and its receptors, Adv. Exp. Med. Biol. 740 (2012) 255­ 280; V. Vanderheyden, B. Devogelaere, L. Missiaen, H. De Smedt, G. Bultynck, J.B. Parys, Regulation of inositol I , 4,5-trisphosphate-induced Ca2+ release by reversible phosphorylation and dephosphorylation, Biochim. Biophys. Acta 1793 (2009) 959-970).

Las enseñanzas de la presente divulgación no solo pueden ser llevadas a cabo usando polipéptidos, en particular un polipéptido que comprende ITPR1 codificado por el código de base de datos Q14643, o ácidos nucleicos que tienen las secuencias exactas mencionadas en esta solicitud explícitamente, por ejemplo por función, nombre, secuencia o número de acceso, o implícitamente, sino también usando variantes de dichos polipéptidos o ácidos nucleicos.

El término "variante", como se usa en la presente memoria, se puede referir a al menos un fragmento de la secuencia de longitud completa a la que se hace referencia, más específicamente una o más secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos que, en relación con la secuencia de longitud completa, están truncadas en uno o ambos extremos terminales por uno o más aminoácidos. En una realización preferente, el fragmento comprende los aminoácidos 1­ 2282. El fragmento comprende los aminoácidos 1-1251 del ITPR1 de código de base Q14643.

El término "variante" se refiere no solo a al menos un fragmento, sino también a un polipéptido o un fragmento del mismo que comprende secuencias de aminoácidos que son al menos 98 o 99% idénticas a la secuencia de aminoácidos de referencia a la que se hace referencia o el fragmento de la misma, en la que los aminoácidos distintos de los esenciales para la actividad biológica, por ejemplo, la capacidad de un antígeno para unirse a un (auto) anticuerpo, o el plegado o estructura del polipéptido se suprimen o sustituyen y/o uno o más de tales aminoácidos esenciales se reemplazan de forma conservadora y/o se añaden aminoácidos de manera que se conserve la actividad biológica del polipéptido. El estado de la técnica comprende varios procedimientos que se pueden usar para alinear dos secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos dadas y para calcular el grado de identidad, ver por ejemplo, Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, Oxford University Press, 2008, 3rd edition. En una realización preferente, el software ClustalW (Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P. A., McWilliam, H., Valentin, F., Wallace, I. M., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. (2007). Clustal W y Clustal X versión 2.0. Bioinformatics, 23, 2947-2948) son usados mediante ajustes predeterminados.

Las variantes pueden comprender, además, modificaciones químicas, por ejemplo marcas isotópicas o modificaciones covalentes tales como glicosilación, fosforilación, acetilación, descarboxilación, citrulinación, hidroxilación y similares. El experto en la técnica está familiarizado con procedimientos para modificar polipéptidos. Cualquier modificación está diseñada de manera de no anular la actividad biológica de la variante.

Además, las variantes también se pueden generar mediante fusión con otros polipéptidos conocidos o variantes de los mismos y comprenden porciones o dominios activos, preferentemente con una identidad de secuencia de al menos 98 o 99% cuando se alinean con la porción activa de la secuencia de referencia, en la que el término "porción activa", como se usa en la presente memoria, se refiere a una secuencia de aminoácidos, que es menor que la secuencia de aminoácidos de longitud completa o, en el caso de una secuencia de ácido nucleico, codifica menos de la secuencia de aminoácidos de longitud completa, respectivamente, y/o es una variante de la secuencia natural, pero conserva al menos parte de la actividad biológica.

El término "variante" de un ácido nucleico comprende ácidos nucleicos cuya cadena complementaria hibrida, preferentemente en condiciones rigurosas, con el ácido nucleico de referencia o de tipo salvaje. La rigurosidad de las reacciones de hibridación la puede determinar fácilmente un experto en la técnica y, en general, es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración de sal. En general, las sondas más largas requieren temperaturas más altas para un apareamiento apropiado, mientras que las sondas más cortas menos. La hibridación generalmente depende de la capacidad del ADN desnaturalizado para volver a aparearse en cadenas complementarias presentes en un ambiente por debajo de su temperatura de fusión: cuanto mayor sea el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor será la temperatura relativa que se puede usar. Como resultado, las temperaturas relativas más altas pueden tender a causar que las condiciones de reacción sean más estrictas, mientras que las temperaturas más bajas lo harían menos. Para obtener detalles adicionales y una explicación de la rigurosidad de las reacciones de hibridación, véase Ausubel, F. M. (1995), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc. Moreover, the person skilled in the art may follow the instructions given in the manual Boehringer Mannheim GmbH (1993) The DIG System Users Guide for Filter Hybridization, Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany and in Liebl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W., and Schleifer, K. H. (1991) International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 sobre la manera de identificar secuencias de ADN mediante hibridación. Pueden ser aplicadas condiciones estrictas para cualquier hibridación, es decir, la hibridación se produce solo si la sonda es un 70% o más idéntica a la secuencia diana. Las sondas que tienen un menor grado de identidad con respecto a la secuencia diana pueden hibridar, pero tales híbridos son inestables y se eliminarán en una etapa de lavado en condiciones rigurosas, por ejemplo, al reducir la concentración de sal a 2 x SSC u opcional y posteriormente, a 0,5 x SSC, mientras que la temperatura es, en orden de preferencia creciente aproximadamente 50 °C - 68 °C, aproximadamente 52 °C - 68 °C, aproximadamente 54 °C - 68 °C, aproximadamente 56 °C - 68 °C, aproximadamente 58 °C - 68 °C, aproximadamente 60 °C - 68 °C, aproximadamente 62 °C - 68 °C, aproximadamente 64 °C -68 °C, aproximadamente 66 °C - 68 °C. En un aspecto, la temperatura es aproximadamente 64 °C - 68 °C o aproximadamente 66 °C - 68 °C. Es posible ajustar la concentración de sal a 0,2 x SSC o incluso 0,1 x SSC. Se pueden aislar secuencias de ácido nucleico que tengan un grado de identidad con respecto a la secuencia de referencia o de tipo salvaje de al menos 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%. En un aspecto, el término variante de una secuencia de ácido nucleico, como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico que codifica la misma secuencia de aminoácidos y variantes de la misma que la secuencia de ácido nucleico de referencia, en línea con la degeneración del código genético.

La variante del polipéptido tiene la capacidad de unirse específicamente a los autoanticuerpos para ITPR1 hallados en pacientes y tiene al menos un 98 por ciento de identidad de secuencia con ITPR1 según lo definido en el código de base de datos de Uniprot Q14643.

El polipéptido, que comprende ITPR1 o una variante del mismo, cuando es usado para llevar a cabo las enseñanzas de la presente invención, puede ser proporcionado en cualquier forma y en cualquier grado de purificación, a partir de tejidos o células que comprenden dicho polipéptido en una forma endógena, más preferentemente células que sobreexpresan el polipéptido, lisados brutos o enriquecidos de tales células, un polipéptido purificado y/o aislado que es esencialmente puro. En una realización preferente, el polipéptido es un polipéptido nativo, en el que el término "polipéptido nativo", como se usa en la presente memoria, se refiere a un polipéptido plegado, más preferentemente a un polipéptido plegado purificado de tejidos o células, más preferentemente de células o tejidos de mamíferos, opcionalmente de tejidos o células no recombinantes. El polipéptido puede ser una proteína recombinante, en el que el término "recombinante", como se usa en la presente memoria, se refiere a un polipéptido producido usando enfoques de ingeniería genética en cualquier etapa del proceso de producción, por ejemplo, mediante la fusión de un ácido nucleico que codifica el polipéptido con un promotor fuerte. para la sobreexpresión en células o tejidos o mediante la manipulación genética de la secuencia del polipéptido mismo. La persona experta en la técnica está familiarizada con procedimientos para manipular ácidos nucleicos y polipéptidos codificados (por ejemplo, descritos en Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning, CSH o en Brown T. A. (1986), Gene Cloning -an introduction, Chapman & Hall) y para producir y purificar polipéptidos nativos o recombinantes (por ejemplo Handbooks "Strategies for Protein Purification", "Antibody Purification", "Purifying Challenging Proteins", "Recombinant Protein Purification", "Affinity Chromatography", "Ion Exchange Chromatography", "Gel Filtration (Size Exclusion Chromatography)", "Hydrophobic Interaction Chromatography", "Multimodal Chromatography" (2009/2010), published by GE Healthcare Life Sciences, and in Burgess, R. R., Deutscher, M. P. (2009), Guide to Protein Purification). En una realización preferente, un polipéptido es puro si al menos el 60, 70, 80, 90, 95 o 99 por ciento del polipéptido en la muestra respectiva consiste en dicho polipéptido según lo juzgado por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS seguida de tinción con azul de Coomassie e inspección visual.

Si el polipéptido que comprende ITPR1 o una variante del mismo es proporcionado en forma de tejido, es preferente que el tejido sea tejido de mamífero, por ejemplo, humano, rata, primate, burro, ratón, cabra, caballo, oveja, cerdo o vaca, más preferentemente tejido cerebral. Si es usado un lisado celular, es preferente que el lisado celular comprenda las membranas asociadas con la superficie de la célula. Si dicho polipéptido es proporcionado en forma de una célula recombinante, es preferente que la célula recombinante sea una célula eucariota tal como una célula de levadura, más preferentemente una célula de un eucariota multicelular tal como una planta, mamífero, rana o insecto, con máxima preferencia de un mamífero, por ejemplo rata, ser humano, primate, burro, ratón, cabra, caballo, oveja, cerdo o vaca. Por ejemplo, la célula puede ser una célula HEK293 transfectada con un ácido nucleico que codifica funcionalmente el polipéptido. El experto en la técnica está familiarizado con los procedimientos para preparar, transfectar y cultivar tales células, por ejemplo, los descritos en Phelan, M. C. (2001), Basic Techniques in Mammalian Cell Tissue Culture, John Wiley.

El polipéptido comprende epítopos reconocidos por y/o se une específicamente a autoanticuerpos de unión a ITPR1. El experto en la técnica está familiarizado con las pautas usadas para diseñar péptidos que tengan suficiente inmunogenicidad, por ejemplo los descritos en Jackson, D. C., Fitzmaurice, C. J., Brown, L. E., Zeng, W. (1999), Preparation and properties of totally synthetic immunogenes, Vaccine Volume 18, Issues 3-4, September 1999, Pages 355-361; and Black, M., Trent, A., Tirrell, M. and Olive, C. (2010), Advances in the design and delivery of peptide subunit vaccines with a focus on Toll-like receptor agonists, Expert Rev Vaccines, 2010 February; 9(2): 157-173. En resumen, es deseable que el péptido cumpla la mayor cantidad posible de los siguientes requerimientos: (a) tiene un alto grado de hidrofilicidad, (b) comprende uno o más residuos seleccionados del grupo que comprende aspartato, prolina, tirosina y fenilalanina , (c) tiene, para mayor especificidad, escasa o nula homología con otros péptidos o polipéptidos conocidos, (d) necesita ser suficientemente soluble y (e) no comprende sitios de glicosilación o fosforilación a menos que sea necesario por motivos específicos. Alternativamente, se pueden seguir enfoques bioinformáticos, por ejemplo, los descritos por Moreau, V., Fleury, C., Piquer, D., Nguyen, C., Novali, N., Villard, S., Laune, D., Granier, C. and Molina, F. (2008), PEPOP: Computational design of immunogenic peptides, BMC Bioinformatics 2008, 9:71.

El polipéptido, que comprende ITPR1 o una variante del mismo, cuando es usado de acuerdo con la presente divulgación, puede ser proporcionado en cualquier clase de conformación. Por ejemplo, el polipéptido puede ser un polipéptido esencialmente no plegado, parcial o totalmente plegado. En un aspecto preferente, el polipéptido es plegado en el sentido de que los epítopos que son esenciales para la unión al autoanticuerpo, o la proteína o variante de la misma en su totalidad, adoptan el plegado adoptado por la proteína nativa en su ambiente natural. El experto en la técnica está familiarizado con procedimientos adecuados para determinar si un polipéptido está plegado o no y, si lo está, qué estructura tiene, por ejemplo, proteólisis limitada, espectroscopia de RMN, espectroscopia de CD o cristalografía de rayos X (ver por ejemplo Banaszak LJ (2008), Foundations of Structural Biology, Academics Press, o Teng Q. (2013), Structural Biology: Practical Applications, Springer), preferentemente es usada espectroscopia de RMN multidimensional.

El polipéptido puede ser una proteína de fusión que comprende secuencias de aminoácidos distintas de las tomadas de ITPR1, en particular una etiqueta De extremo C terminal o De extremo N terminal, preferentemente una etiqueta De extremo C terminal, que es, como se usa en la presente memoria, un motivo de secuencia adicional o polipéptido que tiene una función que tiene alguna función biológica o física y se puede usar, por ejemplo, para purificar, inmovilizar, precipitar o identificar el polipéptido. La etiqueta puede ser una secuencia o dominio capaz de unirse específicamente a un ligando, por ejemplo, una etiqueta seleccionada del grupo que comprende etiquetas His, tiorredoxina, proteína de unión a maltosa, glutatión-S-transferasa, una etiqueta de fluorescencia, por ejemplo, del grupo que comprende proteína verde fluorescente.

El polipéptido puede ser un polipéptido inmovilizado. El término "inmovilizado", como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula unida a un portador sólido insoluble en una solución acuosa, más preferentemente mediante un enlace covalente, interacciones electrostáticas, encapsulación o atrapamiento, por ejemplo, mediante desnaturalización de un polipéptido globular en un gel o mediante interacciones hidrófobas, con máxima preferencia mediante uno o más enlaces covalentes. Varios portadores adecuados, por ejemplo, superficies de papel, poliestireno, metal, silicio o vidrio, canales de microfluidos, membranas, perlas tales como perlas magnéticas, medios de cromatografía en columna, biochips, geles de poliacrilamida y similares, se han descrito en la bibliografía, por ejemplo, en Kim, D., and Herr, A. E. (2013), Protein immobilizsation techniques for microfluidic assays, Biomicrofluidics 7(4), 041501. De esta manera, la molécula inmovilizada, junto con el portador insoluble, puede ser separada de una solución acuosa en de forma sencilla, por ejemplo mediante filtración, centrifugación o decantación. Una molécula inmovilizada se puede inmovilizar de manera reversible o irreversible. Por ejemplo, la inmovilización es reversible si la molécula interactúa con el portador a través de interacciones iónicas que se pueden enmascarar mediante la adición de una alta concentración de sal o si la molécula está unida a través de un enlace covalente escindible, tal como un puente disulfuro que puede ser escindido mediante la adición de reactivos que contienen tiol. Por el contrario, la inmovilización es irreversible si la molécula está ligada al portador a través de un enlace covalente que no se puede escindir en una solución acuosa, por ejemplo, un enlace formado por la reacción de un grupo epóxido y un grupo amina como se usa frecuentemente para acoplar cadenas laterales de lisina a las columnas de afinidad. La proteína se puede inmovilizar indirectamente, por ejemplo, mediante la inmovilización de un anticuerpo u otra entidad que tenga afinidad por la molécula, seguido de la formación de un complejo a fines de inmovilizar el complejo de molécula-anticuerpo. En la bibliografía se describen varias formas de inmovilizar moléculas, por ejemplo en Kim, D., Herr, and A. E. (2013), Protein immobilization techniques for microfluidic assays, Biomicrofluidics 7(4), 041501. Además, varios reactivos y kits para las reacciones de inmovilización están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Pierce Biotechnology.

Es esencial que la muestra usada para el diagnóstico de acuerdo con la presente invención comprenda anticuerpos, también denominados inmunoglobulinas. Normalmente, la muestra de un fluido corporal comprende un conjunto representativo de la totalidad de las inmunoglobulinas del individuo. Sin embargo, la muestra, una vez proporcionada, se puede someter a un procesamiento adicional que puede incluir fraccionamiento, centrifugación, enriquecimiento o aislamiento de la totalidad de las inmunoglobulinas o cualquier clase de inmunoglobulinas del individuo, lo que puede afectar la distribución relativa de las inmunoglobulinas de las diversas clases.

La enfermedad es un síndrome neurológico paraneoplásico, por ejemplo asociado con cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, carcinoma de mama, linfoma de Hodgkin, neuroblastoma, teratoma, linfoma no Hodgkin y cánceres de vejiga.

El término "diagnóstico", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier clase de procedimiento que tiene como objetivo obtener información instrumental en la evaluación de si un paciente sufre o es probable o más probable que el sujeto promedio o comparativo, este último preferentemente tiene síntomas similares, para sufrir de una determinada enfermedad o trastorno en el pasado, en el momento del diagnóstico o en el futuro, para averiguar cómo está progresando la enfermedad o es probable que progrese en el futuro o para evaluar la capacidad de respuesta de un paciente con respecto a un determinado tratamiento, por ejemplo la administración de fármacos inmunosupresores. En otras palabras, el término "diagnóstico" comprende no solo diagnosticar, sino también pronosticar y/o controlar el curso de una enfermedad o trastorno.

En muchos casos, la mera detección, en otras palabras, determinar si en la muestra están presentes o no niveles detectables del anticuerpo, es suficiente para el diagnóstico. Si se puede detectar el autoanticuerpo, esta información será fundamental para el diagnóstico del médico e indica una mayor probabilidad de que el paciente sufra una enfermedad. En un aspecto preferente, puede ser determinada la concentración relativa del anticuerpo en el suero, en comparación con el nivel que puede ser hallado en el individuo sano promedio. Si bien en muchos casos puede ser suficiente determinar si los autoanticuerpos están o no presentes o detectables en la muestra, el procedimiento llevado a cabo para obtener información instrumental para el diagnóstico puede implicar determinar si la concentración es al menos 0,1, preferentemente 0,2, 0,5, 1,2, 5, 10, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 10000 o 100000 veces mayor que la concentración encontrada en el individuo sano promedio.

El experto en la técnica apreciará que un médico usualmente no concluye si el paciente sufre o no o es probable que sufra una enfermedad, afección o trastornos basándose solo en un parámetro único de diagnóstico, sino que debe tener en cuenta otros aspectos, por ejemplo la presencia de otros autoanticuerpos, marcadores, parámetros sanguíneos, evaluación clínica de los síntomas del paciente o los resultados de los exámenes de imágenes médicos u otros procedimientos no invasivos tales como la polisomnografía, para llegar a un diagnóstico concluyente. Véase Baenkler H. W. (2012), General aspects of autoimmune diagnostics, in Renz, H., Autoimmune diagnostics, 2012, de Gruyter, page 3. El valor de un agente o procedimiento de diagnóstico también puede residir en la posibilidad de descartar una enfermedad, de este modo permite el diagnóstico indirecto de otro. En un aspecto preferente, el significado de cualquier síntoma o enfermedad a los que se hace referencia a lo largo de esta solicitud está en línea con el conocimiento del experto en la técnica al 31 de octubre de 2014 como lo demuestran los manuales de texto y las publicaciones científicas.

Por tanto, el término "diagnóstico" preferentemente no implica que los procedimientos o agentes de diagnóstico serán definitivos y suficientes para finalizar el diagnóstico sobre la base de una prueba única, y mucho menos un parámetro, pero se puede referir a una contribución a lo que se denomina como un "diagnóstico diferencial", es decir, un procedimiento de diagnóstico sistemático que considera la probabilidad de una variedad de posibles condiciones sobre la base de una variedad de parámetros de diagnóstico. En consecuencia, el procedimiento, polipéptido o uso, opcionalmente para determinar si un paciente sufre una enfermedad, puede comprender determinar si un autoanticuerpo que se une a ITPR1 está presente en dicha muestra, en el que dicha determinación se realiza mediante el contacto de la muestra con el polipéptido y la detección de si la unión se produce entre dicho polipéptido y dicho autoanticuerpo, preferentemente usando un anticuerpo secundario marcado, más preferentemente usando un procedimiento del grupo que comprende radioinmunoensayo, transferencia de Western, transferencia en línea, ELISA, inmunofluorescencia indirecta, en el que dicho autoanticuerpo se une a dicho polipéptido si está presente en el muestra, y el diagnóstico de que el paciente sufre o tiene más probabilidades de sufrir dicho trastorno neurológico o cáncer si se determina que el autoanticuerpo está presente en la muestra.

El término "diagnóstico" también puede referirse a un procedimiento usado para distinguir entre dos o más afecciones asociadas con síntomas similares o idénticos.

El término "diagnóstico" también se puede referir a un procedimiento usado para elegir el régimen de tratamiento más prometedor para un paciente. En otras palabras, el procedimiento o agente puede estar relacionado para seleccionar un régimen de tratamiento para un sujeto. Por ejemplo, la detección de autoanticuerpos puede indicar que se va a seleccionar una terapia inmunosupresora, que puede incluir la administración al paciente de uno o más fármacos inmunosupresores.

Se puede usar una muestra líquida que comprende anticuerpos de un sujeto para practicar el procedimiento. Tal muestra líquida puede ser cualquier fluido corporal que comprende un conjunto representativo de anticuerpos del individuo, preferentemente una muestra que comprende anticuerpos de la clase de inmunoglobulina IgG del individuo, más preferentemente del grupo que comprende las subclases de IgG1, IgG2 e IgG4, más preferentemente de la subclase IgG4. Por ejemplo, una muestra puede ser líquido cefalorraquídeo (CSF), sangre o suero sanguíneo, linfa, líquido intersticial y es preferentemente suero o CSF, más preferentemente suero.

La etapa de poner en contacto una muestra líquida que comprende anticuerpos con el polipéptido se puede llevar a cabo mediante la incubación de una forma inmovilizada de dicho polipéptido en presencia de la muestra que comprende anticuerpos en condiciones que sean compatibles con la formación del complejo que comprende dicho polipéptido y un anticuerpo, preferentemente un autoanticuerpo que se une al polipéptido. La muestra líquida, posteriormente reducida en anticuerpos de unión al polipéptido, puede ser eliminada posteriormente, seguido de una o más etapas de lavado. Finalmente, se puede detectar el complejo que comprende el anticuerpo y el polipéptido. El término "condiciones compatibles con la formación del complejo" son condiciones que permiten que las interacciones específicas antígeno-anticuerpo formen el complejo que comprende el polipéptido y el anticuerpo. En un aspecto preferente, tales condiciones pueden comprender incubar el polipéptido en una muestra diluida 1: 100 en tampón PBS durante 30 minutos a 25 °C. El término "autoanticuerpo", como se usa en la presente memoria, se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a una molécula endógena del animal, preferentemente un mamífero, que produce dicho autoanticuerpo, en el que el nivel de dicho anticuerpo está más preferentemente elevado en comparación con el promedio de cualquier otro anticuerpo que se une específicamente a dicha molécula endógena. El autoanticuerpo es un autoanticuerpo que se une a ITPR1. Dicho autoanticuerpo se puede aislar de muestras tomadas de pacientes que sufren el trastorno neurológico caracterizado por dos o más, preferentemente todos los síntomas seleccionados del grupo que comprende trastorno de movimiento mixto, disminución aguda del rendimiento visual, disartria y disfagia.

En un aspecto preferente, la detección del complejo para el pronóstico, diagnóstico, procedimientos o kit de prueba comprende el uso de un procedimiento seleccionado del grupo que comprende técnicas de inmunodifusión, técnicas inmunoelectroforéticas, inmunoensayos de dispersión de luz, inmunoensayos de dispersión de luz, técnicas de aglutinación, inmunoensayos marcados, tales como los del grupo que comprende inmunoensayos radiomarcados, inmunoensayos enzimáticos, inmunoensayos de quimioluminiscencia y técnicas de inmunofluorescencia. El experto en la técnica conoce estos procedimientos, que también se describen en el estado de la técnica, por ejemplo en Zane, H. D. (2001), Immunology - Theoretical & Practical Concepts in Laboratory Medicine, W. B. Saunders Company, en particular en el Capítulo 14.

Alternativamente, puede ser usada una muestra que comprende tejido que comprenda el polipéptido en lugar de una muestra líquida. La muestra de tejido es preferentemente de un tejido que expresa ITPR1 endógeno. Tal muestra, que puede tener la forma de una sección de tejido fijada sobre un portador, por ejemplo un cubreobjetos de vidrio para análisis microscópico, después se puede poner en contacto con el anticuerpo, preferentemente autoanticuerpo, que se une al polipéptido. El anticuerpo se marca preferentemente para permitir la distinción de los anticuerpos endógenos que se unen al polipéptido, de modo que se pueden detectar los complejos recién formados y, opcionalmente, cuantificar.

Cualquier dato que demuestra la presencia o ausencia del complejo que comprende el anticuerpo y el polipéptido se puede correlacionar con datos de referencia. Por ejemplo, la detección de dicho complejo indica que el paciente que proporcionó la muestra analizada ha sufrido, está sufriendo o es probable que sufra en el futuro de una enfermedad.

Si un paciente se ha diagnosticado previamente y se vuelve a correr el procedimiento para obtener información relevante para el diagnóstico, la cantidad de complejo detectada en ambas corridas se puede correlacionar para saber sobre la progresión de la enfermedad y/o el éxito de un tratamiento. Por ejemplo, si se encuentra que la cantidad de complejo aumenta, esto sugiere que el trastorno está progresando, es probable que se manifieste en el futuro y/o que cualquier tratamiento que se ha intentado no sea exitoso.

Puede ser usada una microplaca, ELISA de membrana, transferencia de puntos o transferencia en línea para llevar a cabo el procedimiento de diagnóstico de acuerdo con la invención. El experto en la técnica está familiarizado con la configuración experimental, que se describe en el estado de la técnica (Raoult, D., and Dasch, G. A. (1989), The line blot: an immunoassay for monoclonal and other antibodies. Its application to the serotyping of gram-negative bacteria. J. Immunol. Methods, 125 (1-2), 57-65; WO2013041540). En pocas palabras, los uno o más antígenos de interés, en el caso de la presente invención el polipéptido, pueden ser unidos a un portador, por ejemplo una membrana de nitrocelulosa, a menudo en combinación con antígenos y controles adicionales. El portador de nitrocelulosa se expone posteriormente a una muestra que comprende anticuerpos tales como suero diluido. Si la muestra comprende un anticuerpo que se une al antígeno, es formado un complejo que se puede detectar, preferentemente mediante incubación con un anticuerpo secundario que se une a la región constante del primer anticuerpo, tal anticuerpo secundario comprende un marcador detectable, por ejemplo, un isótopo radiactivo. Un colorante fluorescente o, en una realización preferente, una enzima activa fusionada o unida al anticuerpo secundario, tal como fosfatasa alcalina, que se puede analizar fácilmente usando sustratos cromogénicos seguido de un simple examen visual. Los reactivos, dispositivos y paquetes de software adecuados están disponibles comercialmente, por ejemplo en EUROIMMUN, Lübeck, Germany.

El diagnóstico o los procedimientos pueden contemplar el uso de inmunofluorescencia indirecta. El experto en la técnica está familiarizado con tales técnicas y la preparación de muestras adecuadas, descritas en el estado de la técnica (US4647543; Voigt, J., Krause, C., Rohwader, E, Saschenbrecker, S., Hahn, M., Danckwardt, M., Feirer, C., Ens, K, Fechner, K, Barth, E, Martinetz, T., and Stocker, W. (2012), Automated Indirect Immunofluorescence Evaluation of Antinuclear Autoanticuerpos on HEp-2 Cells," Clinical and Developmental Immunology, vol. 2012, doi:10.1155/2012/65105; Bonilla, E., Francis, L., Allam, F., etal., Immuno-fluorescence microscopy is superior to fluorescent beads for detection of antinuclear antibody reactivity in systemic lupus erythematosus patients, Clinical Immunology, vol. 124, no. 1, pp. 18-21, 2007). En resumen, un portador, tal como un cubreobjetos para uso en microscopía, está revestido con células o secciones de tejido que comprenden el antígeno, el polipéptido puede comprender una o más secuencias de ITPR1 o una variante del mismo. El portador que comprende el antígeno se expone a una muestra de paciente que comprende anticuerpos tales como suero diluido. Si la muestra comprende un anticuerpo que se une al antígeno, el complejo resultante se puede detectar, preferentemente mediante incubación con un anticuerpo secundario que comprende un colorante fluorescente tal como fluoresceína, seguido de examen visual usando microscopía de fluorescencia. Los reactivos, dispositivos y paquetes de software adecuados están disponibles en el comercio, por ejemplo en EUROIMMUN, Lübeck, Germany.

Una muestra sometida a una prueba que determina solo si está presente un autoanticuerpo que se une a ITPR1, pero es preferente que los procedimientos, pruebas, dispositivos de diagnóstico y similares contemplen la determinación de la presencia de autoanticuerpos contra una variedad de antígenos relacionados con enfermedades autoinmunes neurológicas o variantes de las mismas, por ejemplo Hu, Yo, Ri, CV2, PNMA1, PNMA2, DNER/Tr, ^{ARHGAP26, ITPR1, CARPVIII, Zic4, Sox1, MAG, MP0, MBP,} gAd65, ^{anfifisina, recoverina, receptor de GABA A,} receptor de GABA B, receptor de glicina, gefirina, IgLON5, DPPX, acuaporina-4, MOG, receptor de NMDA, receptores ^de AmPA, ^{GRM1, GRM5, LGI1 y CASPR2. Por lo tanto, el procedimiento, uso, kit, dispositivo o similar puede} comprender dos o más, preferentemente tres, cuatro, cinco o más antígenos o variantes de los mismos seleccionados del grupo que comprende Hu, Yo, Ri, CV2, PNMA1, PNMA2, DNER/Tr, ARHGAP26, ITPR1, CARPVIII, Zic4, Sox1, MAG, MP0, MBP, GAD65, anfifisina, recoverina, receptor de GABA A, receptor de GABA B, receptor de glicina, gefirina, IgLON5, DPPX, acuaporina-4, MOG, receptor de NMDA, receptores de AMPA, GRM1, GRM5, LGI1 y CASPR2, preferentemente del grupo que comprende Yo, CDR2L, DNER/Tr, ARHGAP26, Homer 3 y CARPVIII, más preferentemente ARHGAP26, Homer 3 y CARPVIII, estos antígenos preferentemente están inmovilizados, por ejemplo en una transferencia en línea.

De acuerdo con las enseñanzas de la presente divulgación, es proporcionado un anticuerpo, preferentemente un autoanticuerpo de unión al polipéptido usado para el diagnóstico de una enfermedad. La persona experta en la técnica está familiarizada con procedimientos para purificar anticuerpos, por ejemplo los descritos en Hermanson, G. T., Mallia, A. K. and Smith, P. K. (1992), Immobilized Affinity Ligand Techniques, San Diego: Academic Press. En resumen, un antígeno unido específicamente al anticuerpo de interés, cuyo antígeno es el polipéptido, es inmovilizado y usado para purificar, mediante cromatografía de afinidad, el anticuerpo de interés de una fuente adecuada. Puede ser usada como fuente una muestra líquida que comprende anticuerpos de un paciente que sufre el trastorno neurológico identificado por los inventores.

El término "anticuerpo", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier resto de unión a base de inmunoglobulina, más preferentemente uno que comprende al menos una cadena pesada de inmunoglobulina y una cadena liviana de inmunoglobulina, que incluye, pero sin limitación, anticuerpos monoclonales y policlonales, así como variantes de un anticuerpo, en particular fragmentos, estos restos de unión son capaces de unirse al antígeno respectivo, más preferentemente unirse específicamente a este. El término "unión específica", como se usa en la presente memoria, significa que la unión es más fuerte que una reacción de unión caracterizada por una constante de disociación de 1 x 10-5 M, más preferentemente 1 x 10-7 M, más preferentemente 1 x 10-8 M, más preferentemente 1 x 10-9 M, más preferentemente 1 x 10-10 M, más preferentemente 1 x 10-11 M, más preferentemente 1 x 10-12 M, según se determina mediante resonancia de plasmón superficial usando equipo Biacore a 25 °C en tampón PBS a pH 7. El anticuerpo puede estar aislado o en una mezcla que comprende anticuerpos, polipéptidos, metabolitos, células adicionales y similares. En caso de que el anticuerpo sea un autoanticuerpo, puede ser parte de una preparación de autoanticuerpos que es heterogénea o puede ser un autoanticuerpo homogéneo, en el que una preparación heterogénea comprende una pluralidad de especies de autoanticuerpos diferentes obtenibles por preparación de sueros de donantes humanos, por ejemplo mediante cromatografía de afinidad usando el antígeno inmovilizado para purificar cualquier autoanticuerpo capaz de unirse a dicho antígeno. Preferentemente, el anticuerpo es un autoanticuerpo, más preferentemente un autoanticuerpo de la clase IgG, con máxima preferencia del grupo de subclases que comprenden IgG1, IgG2 e IgG4, en particular IgG2. En otro aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo de mamífero, más preferentemente un anticuerpo de primate, con máxima preferencia un anticuerpo humano. El anticuerpo puede estar glicosilado o no glicosilado. El experto en la técnica está familiarizado con los procedimientos que se pueden usar para la identificación, producción y purificación de anticuerpos y variantes de los mismos, por ejemplo los descritos en el documento EP 2423226 A2 y las referencias del mismo. El anticuerpo se puede usar de acuerdo con las reivindicaciones como agente de diagnóstico, por sí mismo o en combinación, por ejemplo, en complejo con el polipéptido.

Para el diagnóstico puede ser usado un dispositivo médico o de diagnóstico que comprende el (auto)anticuerpo y/o el polipéptido. Preferentemente, dicho dispositivo médico o de diagnóstico comprende el polipéptido en una forma que permite ponerlo en contacto con una solución acuosa, más preferentemente la muestra líquida humana, de una manera sencilla. En particular, el polipéptido puede ser inmovilizado sobre la superficie de un portador, tal portador comprende, pero in limitación, placas o cubreobjetos de vidrio, biochips, placas de microtitulación, perlas, por ejemplo perlas magnéticas, columnas de cromatografía, membranas o similares. Los ejemplos de dispositivos médicos incluyen transferencia en línea, microplacas y biochips. Además del polipéptido, el dispositivo médico o de diagnóstico puede comprender polipéptidos adicionales, por ejemplo controles positivos o negativos u otros antígenos conocidos que se unen a autoanticuerpos de valor diagnóstico, particularmente aquellas otras enfermedades relacionadas asociadas con uno o más síntomas idénticos o similares.

El código de base de datos de los polipéptidos Q14643 puede ser usado en forma de una célula que comprende y/o expresa un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido. Si es usado un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el polipéptido o una variante del mismo, dicho ácido nucleico puede ser un ácido nucleico no modificado. En un aspecto preferente, el ácido nucleico es un ácido nucleico que, como tal, no se encuentra en la naturaleza y comprende, en comparación con el ácido nucleico natural, al menos una modificación, por ejemplo un contenido isotópico o modificaciones químicas, por ejemplo una metilación, modificación de secuencia, marca o similar indicativo de origen sintético. En un aspecto preferente, el ácido nucleico es un ácido nucleico recombinante o una parte o un ácido nucleico y es, en una realización más preferente, parte de un vector, en el que puede estar funcionalmente unido con un promotor que permite la expresión, preferentemente sobreexpresión del ácido nucleico.

En un aspecto preferente, dicho ácido nucleico está dentro de una célula capaz de expresarlo con el fin de que el polipéptido o una variante del mismo se produzcan y, más preferentemente, estén dirigidos a la superficie de la célula. Dicha célula que comprende el ácido nucleico codificando el polipéptido puede ser usada de acuerdo con la presente invención. La célula puede ser cualquier clase de célula capaz de expresar el ácido nucleico, por ejemplo, una célula procariota o eucariota. En un aspecto preferente, la célula es una célula eucariota tal como una célula de levadura, una célula eucariota de un organismo multicelular, por ejemplo una célula de insecto, más preferentemente una célula de mamífero, por ejemplo una célula de ratón, y más preferentemente una célula humana.

El experto en la técnica está familiarizado con los procedimientos usados para sintetizar, modificar y amplificar dicho ácido nucleico y para transfectar células usando dicho ácido nucleico, preferentemente en un vector que permita el mantenimiento o expresión transitoria o permanente del ácido nucleico en la célula. El experto en la técnica también está familiarizado con una variedad de vectores adecuados, que están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Origene. Por ejemplo, se puede usar un vector que codifica los constructos de fusión con una GFP De extremo C terminal. La célula puede ser de origen eucariota o procariota y es preferentemente una célula de mamífero, por ejemplo una célula HEK293, CHO o COS-7. La célula que comprende el ácido nucleico que codifica el polipéptido puede ser una célula recombinante o una célula aislada en la que el término "aislada" significa que la célula está enriquecida de modo que, en comparación con el ambiente del tipo salvaje de dicha célula, hay menos células de otra diferenciación o especie o, en efecto, no están presentes tales otras células.

La presente invención es ilustrada con mayor detalle en las siguientes figuras y secuencias y ejemplos no limitantes.

La Fig. 1 muestra el resultado de un análisis de inmunofluorescencia indirecta (IF A) de un suero de paciente positivo que contiene autoanticuerpos contra ITPR1 con el patrón de tinción característico indicado por el autoanticuerpo.

La Fig.2A, panel superior, muestra el análisis SDS-PAGE de histoinmunoprecipitados de cerebelo de rata. Tres sueros de referencia PCA positivos inmunoprecipitados mostraron, además de las inmunoglobulinas, una banda de proteína correspondiente a una masa molecular de aproximadamente 300 kDa en SDS-PAGE teñido con coomassie coloidal. La banda estaba ausente en las muestras de control.

La Fig. 2A, panel inferior, muestra un análisis de transferencia Western con un anticuerpo policlonal anti-ITPR1 usando las mismas muestras. Ninguna banda es visible si se analizaron fracciones de sueros de control negativo.

La Fig.2B muestra los resultados de la tinción doble IF A usando el anticuerpo policlonal anti-ITPR1 además del suero índice.

La Fig. 3A muestra el análisis de los sueros y controles de los pacientes por IF A con HEK293 que expresa ITPR1 y con HEK293 transfectado de forma simulada.

La Fig. 3B muestra la abolición competitiva de la unión del anticuerpo a las células de Purkinje por las fracciones HEK293 que contienen ITPR1. La fila superior muestra la tinción IF A en ausencia y la fila inferior muestra la tinción IFA en presencia de ITPR1.

Ejemplo: Identificación de autoanticuerpos ITPR1 en sueros de pacientes que sufren de enfermedad neurológica

El siguiente ejemplo demuestra que el autoanticuerpo de ITPR1 está asociado con una enfermedad neurológica. Se pudo detectar en tres de cada 30 pacientes que tienen diversos síntomas asociados con enfermedades neurológicas, mientras que estaba ausente en el suero de 50 sujetos sanos.

1. Materiales y procedimientos

Los reactivos fueron obtenidos de Merck, Darmstadt, Germany o Sigma-Aldrich, Heidelberg, Germany, si no se especifica lo contrario.

Ensayos de inmunofluorescencia indirecta

La IFA fue realizada usando cubreobjetos con una matriz de biochip de >60 sustratos de tejido y células, que incluyen las criosecciones de tejido cerebral (cerebelo de mono, rata y cerdo, hipocampo de rata, cerebro completo de ratón) y 28 células HEK293 recombinantes que expresan por separado autoantígenos cerebrales establecidos, que incluyen Yo/CDR2, CDR2L, DNER, ARHGAP26, CARP, Homer 3, Zic4, Sox1, GRM1, y GRM5 siguiendo el manual del fabricante (Euroimmun, Lübeck, Germany). En algunos experimentos, el anticuerpo policlonal contra ITPR1 (Dianova, Hamburgo, Germany) se incubó en la primera etapa seguido de incubación con IgG-Cy3 anti-conejo (Jackson Research, Suffolk, UK). Los resultados fueron evaluados por dos observadores independientes usando un microscopio de barrido láser (LSM700, Zeiss, Jena, Germany). En experimentos de inhibición competitiva, los antígenos recombinantes se mezclaron con una muestra de suero diluida 30 minutos antes del IF A como se describe en Stocker W, Otte M, Ulrich S, Normann D, Finkbeiner H, Stocker K, et al. Autoimmunity to pancreatic juice in Crohn's disease. Results of an autoanticuerpo screening in patients with chronic inflammatory bowel disease. Scand J Gastroenterol Suppl 1987;139:41-52.

Histoinmunoprecipitación (Histo-IP)

Fue diseccionado cerebelo de rata y congelado por choque en isopentano a -160 °C. A continuación, el tejido fue crioseccionado (4 pm) con un micrótomo SM2000R (Leica Microsystems, Nussloch, Germany), colocado sobre la superficie entera de los cubreobjetos de vidrio y secado. Después fueron incubados los cubreobjetos completos con suero del paciente (diluido 1:100) a 4 °C durante 3 horas seguido de 3 etapas de lavado con PBS que contiene Tween 20 0,2% (p/v). Fueron extraídos inmunocomplejos de las secciones mediante incubación en tampón de solubilización (tris-HCl 100 mmol/L pH 7,4, cloruro de sodio 150 mmol/L, EDTA 2,5 mmol/L, desoxicolato 0,5% (p/v), Triton X-100 1% (p/v) que contiene inhibidores de proteasa) a temperatura ambiente para 30 minutos. El material desprendido fue homogeneizado y centrifugado a 16.000 xg a 4 °C durante 15 minutos. A continuación, los sobrenadantes transparentes fueron incubados con Protein G Dynabeads (ThermoFisher Scientific, Dreieich, Germany) a 4 °C durante la noche para capturar inmunocomplejos. Después las perlas fueron lavadas 3 veces con PBS y se eluyeron con PBS que contiene ditiotreitol 5 mmol/L y dodecilsulfato de sodio 1% (p/v) a 95 °C durante 10 minutos, seguido de SDS-PAGE y espectrometría de masas o transferencia Western.

SDS-PAGE y transferencia Western

Las proteínas fueron analizadas mediante SDS-PAGE usando el sistema NuPAGE (ThermoFisher Scientific). Las proteínas separadas se identificaron mediante análisis espectrométrico de masas o se electrotransfirieron a una membrana de nitrocelulosa mediante transferencia en tanque con tampón de transferencia (ThermoFisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las membranas se bloquearon con tampón de transferencia universal (Euroimmun) durante 15 min y se incubaron con suero humano o el anticuerpo policlonal contra ITPR1 en tampón de transferencia universal más durante 3 horas, seguido de 3 etapas de lavado con tampón de transferencia universal (Euroimmun), una segunda incubación durante 30 minutos con IgG-AP anti-conejo (Sigma-Aldrich), 3 etapas de lavado y tinción con sustrato NBT/BCIP (Euroimmun).

Espectrometría de masa

La preparación de la muestra por espectrometría de masas se realizó según lo informado por Koy et al. (1). A menos que se indique lo contrario, hardware, software, dianas MALDI, estándares de péptidos y reactivos de matriz fueron obtenidos de Bruker Daltonics, Bremen, Germany.

En pocas palabras, las muestras fueron reducidas con ditiotreitol y sometidas a carbamidometilación con yodoacetamida antes de SDS-PAGE. Las proteínas fueron visualizadas con Azul brillante Coomassie G-250 y escindidas y decoloradas las bandas de proteínas visibles. Tras la digestión tríptica, los péptidos fueron extraídos y sembrados con ácido a-ciano-hidroxicinámico en una diana MTP AnchorChip™ 384 TF.

Las mediciones de MALDI-TOF/TOF fueron realizadas con un sistema Smartbeam TOF/TOF200 de Autoflex III usando el software flexControl 3.0. Los espectros de MS para la huella digital de masa de péptidos (PMF) fueron registrados en modo reflector de ion positivo con 500 disparos y en un intervalo de masas de 700 Da a 4000 Da. Los espectros fueron calibrados externamente con el estándar de calibración de péptidos II disponible comercialmente, procesados con flexAnalysis 3.0 y las listas de picos fueron analizadas con BioTools 3.2.

El motor de búsqueda Mascot de Mascot Server 2.3 (Matrix Science, London, UK) fue usado para la identificación de proteínas mediante la búsqueda en la base de datos NCBI limitada a Mammalia. Los parámetros de búsqueda fueron los siguientes: la tolerancia de masa fue ajustada a 80 ppm, fue aceptado un sitio de escisión omitido y la carbamidometilación de residuos de cisteína así como la oxidación de residuos de metionina fueron establecidas como modificaciones fijas y variables, respectivamente. Para evaluar los aciertos de proteína, fue seleccionado un umbral de significación de p <0,05.

Para una confirmación adicional de los aciertos de PMF, fueron seleccionados dos péptidos de cada proteína identificada para las mediciones de MS/MS usando el mecanismo de retroalimentación WARP de BioTools. Fueron registradas masas originales y de fragmentos con 400 y 1000 disparos, respectivamente. Los espectros fueron procesados y analizados según lo descrito anteriormente con una tolerancia de masa de fragmentos de 0,7 Da.

Clonación y expresión de ITPR1 en HEK293

El ADN codificador de ITPR1 humano (Genbank # BC172648, Source BioScience LifeSciences, Nottingham, United Kingdom) fue transferido al vector de expresión pTriEx-1 (Merck). La secuencia del vector resultante es denominada SEQ ID NÚM.: 2. El receptor fue expresado en la línea celular humana HEK293 después de la transfección mediada por ExGen500 (ThermoFisher Scientific) según las instrucciones del fabricante. Para la preparación de sustratos para IF A, fueron cultivadas HEK293 en cubreobjetos estériles, transfectadas, y se dejaron expresar las proteínas recombinantes durante 48 horas. Los cubreobjetos de vidrio fueron lavados con PBS, fijados con acetona durante 10 minutos a temperatura ambiente, secados al aire, cortados en fragmentos de tamaño milimétrico (biochips) y usados como sustratos en IF A como anteriormente. Alternativamente, las células fueron transfectadas en matraces T estándar y las células fueron recogidas después de 5 días. La suspensión celular fue centrifugada a 1.500 x g, 4 °C durante 20 minutos y el sedimento resultante fue extraído con tampón de solubilización (véase con anterioridad). Los extractos fueron almacenados en alícuotas a -80 °C hasta su uso posterior.

Resultados

Caracterización de sueros de pacientes

El análisis de inmunofluorescencia indirecta de un suero de paciente positivo (en adelante, suero índice) reveló patrones característicos de inmunofluorescencia (Fig. 1).

Identificación de ITPR1 como el autoantígeno diana

En histoinmunoprecipitados de cerebelo de rata, tres sueros de referencia PCA positivos inmunoprecipitados mostraron, además de las inmunoglobulinas, una banda de proteína correspondiente a una masa molecular de aproximadamente 300 kDa en SDS-PAGE teñida con coomassie coloidal (Fig.2A, panel superior). La banda estaba ausente en las muestras de control. La proteína precipitada fue identificada como ITPR1 mediante análisis espectrométrico de masas.

El análisis de transferencia Western con un anticuerpo policlonal anti-ITPR1 mostró una fuerte reacción a 300 kDa del inmunoprecipitado obtenido con los sueros índice, mientras que no hubo reacciones con las fracciones obtenidas con los sueros de control (Fig. 2A, panel inferior). Cuando fue usado para la tinción doble en IFA, el anticuerpo policlonalclonal anti-ITPR1 produjo una superposición con los sueros índice (Fig. 2B).

Como prueba adicional de la identificación correcta del antígeno, los sueros y controles de los pacientes después fueron analizados por IFA con HEK293 que expresa ITPR1 y con HEK293 transfectado de forma simulada (Fig. 3A). Todos los sueros índice, pero ninguno de los controles, reaccionaron con las células que expresan ITPR1 de forma similar al anticuerpo anti-ITPR1. Por el contrario, la transfección simulada no produjo ninguna unión de anticuerpo. La congruencia de la diana de autoanticuerpos de los pacientes y ITPR1 se demostró adicionalmente mediante la

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento in vitro de diagnóstico de una enfermedad, preferentemente una enfermedad asociada con síntomas neurológicos, comprendiendo la etapa detectar en una muestra que comprende anticuerpos de un paciente un autoanticuerpo de unión al receptor de trifosfato de inositol tipo 1 (ITPR1) definido por el código de base de datos de Uniprot Q14643, en el que la enfermedad es un síndrome neurológico paraneoplásico preferentemente asociado con carcinoma de mama, en el que la detección del autoanticuerpo indica una probabilidad aumentada de que el paciente sufra la enfermedad.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la muestra es un fluido corporal que comprende anticuerpos, preferentemente seleccionado del grupo que comprende sangre entera, suero, líquido cefalorraquídeo.

3. Uso de un polipéptido que comprende los aminoácidos 1-1251 de ITPR1 definidos por el código de la base de datos de Uniprot Q14643 o una de sus variantes teniendo la capacidad de unirse específicamente a un autoanticuerpo contra ITPR1 según lo definido por el código de la base de datos de Uniprot Q14643 para el diagnóstico in vitro de una enfermedad, comprendiendo la etapa detectar autoanticuerpos de unión a ITPR1 según lo definido por el código de la base de datos de Uniprot Q14643, en el que la enfermedad es un síndrome neurológico paraneoplásico, preferentemente asociado con el carcinoma de mama, en el que la variante tiene al menos 98 por ciento de identidad de secuencia con ITPR1 según lo definido por el código de la base de datos de Uniprot Q14643.

4. Uso de un autoanticuerpo, preferentemente un autoanticuerpo aislado, de unión al polipéptido de ITPR1 según lo definido por el código de la base de datos de Uniprot Q14643, en el que el autoanticuerpo está preferentemente en un complejo con dicho polipéptido, para el diagnóstico in vitro de una enfermedad, en el que la enfermedad es un síndrome neurológico paraneoplásico, preferentemente asociado con el carcinoma de mama, y en el que dicho autoanticuerpo contra ITPR1 es detectado.

5. Uso de un dispositivo médico o de diagnóstico comprendiendo un polipéptido que comprende los aminoácidos 1-1251 de ITPR1 según lo definido por el código de la base de datos de Uniprot Q14643 o una de sus variantes teniendo la capacidad de unirse específicamente a un autoanticuerpo contra ITPR1 según lo definido por el código de la base de datos de Uniprot Q14643 para el diagnóstico in vitro de una enfermedad, en el que la enfermedad es un síndrome neurológico paraneoplásico, preferentemente asociado con el carcinoma de mama, y en el que es detectado un autoanticuerpo contra ITPR1 según lo definido por el código de la base de datos de Uniprot Q14643, en el que la variante tiene al menos 98 por ciento de identidad de secuencia con ITPR1 según lo definido por el código de la base de datos de Uniprot Q14643.

6. El procedimiento o uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el polipéptido es proporcionado en la forma de una célula que comprende un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido, en el que el ácido nucleico es parte de un vector, en el cual está unido funcionalmente con un promotor que permite la expresión, o en la forma de un tejido que comprende dicho polipéptido.

7. El procedimiento o uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el polipéptido es un polipéptido recombinante y/o aislado.