ES2693465T3 - Diagnóstico de una enfermedad neurológica - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para diagnosticar un síndrome neurológico paraneoplásico o un adenocarcinoma, que comprende la etapa de detectar en una muestra un autoanticuerpo que se une a la subunidad alfa 3 de la ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+).

Description

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DESCRIPCION

Diagnostico de una enfermedad neurologica

La presente invencion se refiere a un procedimiento para diagnosticar un smdrome neurologico paraneoplasico (SNP) o un adenocarcinoma, que comprende la etapa de deteccion en una muestra de un autoanticuerpo que se une espedficamente a la subunidad alfa 3 de la ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+). El uso de un polipeptido que comprende la subunidad alfa 3 de la ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) o una variante de la misma que se une espedficamente a autoanticuerpos con la subunidad alfa 3 de la ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) o el diagnostico in vitro de un SNP o un adenocarcinoma, y una composicion farmaceutica que comprende dicho polipeptido para su uso como medicamento o el uso de un dispositivo de diagnostico que comprende dicho polipeptido para el diagnostico in vitro de un SNP o un adenocarcinoma o el uso de un kit de prueba que comprende dicho polipeptido para el diagnostico in vitro de un SNP o un adenocarcinoma.

El desarrollo de sistemas de diagnostico para trastornos neurologicos es un desafm continuo en la ciencia biomedica, no en gran parte porque muchos smtomas encontrados pueden ser explicados por una gran variedad de causas, incluyendo enfermedades heredadas geneticamente, drogadiccion, desnutricion, infeccion, lesion, enfermedad psiquiatrica, defectos inmunologicos y cancer. Ademas, puede ser diffcil distinguir entre los smtomas que indican la aparicion de una enfermedad que requiere que el medico tome medidas rapidas y los que se producen regularmente debido a la vejez.

La importancia de un diagnostico precoz no puede exagerarse. Muchos trastornos neurodegenerativos, principalmente las enfermedades de Alzheimer y Parkinson, no se pueden curar, pero hay medicamentos disponibles que pueden usarse para retrasar su progresion. Cuanto antes se haga el diagnostico, mayores seran las posibilidades de explotar el espectro de medicamentos disponibles para el beneficio total del paciente.

A pesar de la necesidad de un diagnostico precoz, es igualmente importante garantizar que los resultados sean lo suficientemente confiables como la base para el regimen de tratamiento elegido posteriormente para que no se diagnostique erroneamente al paciente. Por ejemplo, los pacientes que padecen el trastorno autoinmune denominado encefalopatfa de Hashimoto han sido diagnosticados repetidamente con la enfermedad de Alzheimer. A estos pacientes se les puede negar el tratamiento adecuado y continuan sufriendo, aunque es probable que la administracion de medicamentos disponibles, como la cortisona en el caso de la encefalopatfa de Hashimoto, mejore sus smtomas. Ademas, muchos medicamentos tienen efectos secundarios graves y deben prescribirse solo si el medico a cargo ha determinado, por el bien del paciente, que los beneficios superaran con creces los efectos adversos.

Los pacientes que buscan atencion medica de un neurologo frecuentemente tienen smtomas inespedficos que pueden estar asociados con una pletora de enfermedades. Por ejemplo, en un caso informado en la bibliograffa, un paciente que padece ataxia, disfagia y disartria a causa de un trastorno metabolico mitocondrial determinado geneticamente (Danielsson, O., Jonasson, J., y Landtblom, A.-M., Sensory ataxic neuropathy with dysarthria/dysphagia and ophthalmoplegia (SANDO). Two case reports. Acta Myol. Diciembre de 2011; 30 (3): 188190).

Por el contrario, se demostro que un grupo de pacientes que padecen un conjunto de smtomas que comprenden manifestaciones similares tiene una taupatfa infligida por autoanticuerpos (Sabater, L., Gaig, C., Gelpi, E., Bataller, L., Lewerenz, J., Torres-Vega, E., Contreras, A., Giometto, B., Compta, Y., Embid, C., Vilaseca, I., Iranzo, A., Santamana, J., Dalmau, J., y Graus, F., A novel non-rapid-eye movement and rapid-eye-movement parasomnia with sleep breathing disorder associated with antibodies to IgLON5: a case series, characterization of the antigen, and post-mortem study, Lancet Neurol. 2 de abril de 2014)

La ataxia y, mas generalmente, los trastornos del movimiento tambien pueden estar asociados con otros numerosos trastornos, tales como apoplejfa, tumor cerebral, esclerosis multiple, alcoholismo, farmacos recetados y recreativos, intoxicacion por radiacion, deficiencia de vitamina B12 e hipotiroidismo.

En un caso reciente, se ha observado un nuevo trastorno neurologico que se asocia con deterioro visual, ataxia, disartria, disfagia y tetraparesia espastica y adenocarcinoma. Por lo que saben los inventores, tal trastorno aun no se ha informado en la bibliograffa.

En caso de que un neurologo vea a un paciente con numerosos smtomas inespedficos, se esforzaran por reunir cualquier tipo de informacion con respecto a la causa, incluso si el diagnostico definitivo es mas alla de la factibilidad. Por ejemplo, si se puede establecer que los smtomas se explican por un trastorno neurodegenerativo, esto ayudara a descartar varios regfmenes de tratamiento contraproducentes. En consecuencia, existe una demanda considerable de ensayos para diagnosticar afecciones neurologicas asociadas con smtomas inespedficos tales como los descritos a lo largo de esta solicitud.

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El documento EP2605017 divulga secuencias marcadoras para malignoma ginecologico y su uso diagnostico.

El documento WO2010/070043 divulga biomarcadores para el diagnostico de aloinjerto renal y el estado renal.

El documento WO2008/055530 divulga la subunidad alfa 3 de ATPasa Na(+)/K(+) como un objetivo en el tratamiento de enfermedades proliferativas.

Rosewich et al. (2014). The expanding clinical and genetic spectrum of ATP1A3-related disorders, Neurology, DOI 10.1212/WNL.00000000000000212 divulga un trastorno de movimiento distonico asociado con las mutaciones de ATP1A3.

Por lo tanto, un problema que subyace a la presente invencion es proporcionar un procedimiento para diagnosticar un SNP y un adenocarcinoma.

El problema que subyace a la presente invencion se resuelve mediante el contenido de las reivindicaciones independientes y dependientes adjuntas.

En un primer aspecto, el problema subyacente de la presente invencion se resuelve mediante un procedimiento para diagnosticar SNP y un adenocarcinoma, que comprende la etapa de deteccion en una muestra de un autoanticuerpo que se une a la subunidad alfa 3 de la ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+).

En una realizacion preferida del primer aspecto, la muestra es un fluido corporal que comprende anticuerpos, preferiblemente seleccionados del grupo que comprende sangre entera, suero, LCE y saliva.

En una realizacion preferida, el polipeptido puede ser un polipeptido aislado y/o recombinante que comprende la subunidad alfa 3 de la ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) o una variante de la misma.

En una realizacion preferida del segundo aspecto, el polipeptido esta inmovilizado.

En un segundo aspecto, el problema que subyace en la presente invencion se resuelve mediante el uso de una ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) o una variante de la misma que se une espedficamente a la subunidad alfa 3 de la ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) para el diagnostico de un SNP y un adenocarcinoma, que comprende preferiblemente la etapa de deteccion de autoanticuerpos que se une a dicha ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) o una variante de la misma.

En un tercer aspecto, el problema que subyace en la presente invencion se resuelve mediante un polipeptido aislado y/o recombinante que comprende la subunidad alfa 3 de la ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) o una variante de la misma que se une espedficamente a la subunidad alfa 3 de la ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+), preferiblemente en una forma inmovilizada, para su uso en el tratamiento de un SNP o en el diagnostico in vivo de un SNP o adenocarcinoma.

En un cuarto aspecto, el problema que subyace a la presente invencion se resuelve mediante una composicion farmaceutica que comprende el polipeptido o una variante del mismo que se une espedficamente a autoanticuerpos contra la subunidad alfa 3 de la ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) para su uso como un medicamento.

En un quinto aspecto, el problema que subyace a la presente invencion se resuelve mediante el uso de un dispositivo de diagnostico que comprende dicho polipeptido para el diagnostico in vitro de un SNP o adenocarcinoma.

En un noveno aspecto, el problema que subyace a la presente invencion se resuelve mediante el uso de un kit de prueba para el diagnostico de un sNp o un adenocarcinoma, que comprende dicho polipeptido o variantes del mismo.

En una realizacion preferida del noveno aspecto, el kit de prueba comprende ademas un medio para detectar el complejo que comprende la union de autoanticuerpos al polipeptido de acuerdo con el segundo aspecto y el polipeptido de acuerdo con el segundo aspecto.

En una realizacion preferida de cualquier aspecto de la presente invencion, la enfermedad se selecciona del grupo que comprende adenocarcinoma y SNP.

En una realizacion preferida de cualquier aspecto de la presente invencion, el polipeptido se proporciona en la forma de una celula que comprende un acido nucleico que codifica dicho polipeptido o en forma de un tejido que comprende dicho polipeptido.

La presente invencion se basa en el sorprendente hallazgo por parte de los inventores de que existen

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autoanticuerpos que se unen a ATPasas asociadas a la membrana neuronal humana que estan asociadas con SNP y adenocarcinoma.

Ademas, la presente invencion se basa en el sorprendente descubrimiento de los inventores de que el surgimiento de autoanticuerpos que se unen a ATPasas asociadas a la membrana neuronal humana indica una mayor probabilidad de adenocarcinoma.

Sin desear estar ligados a esta teona, los inventores sugieren la hipotesis de que el sistema inmune del paciente ataca las ATPasas neuronales humanas en neuronas u otras celulas vitales para el sistema nervioso en el sentido de que tales celulas mueren y la transmision sinaptica se deteriora.

La presente invencion se refiere a un polipeptido que comprende una ATPasa de mairnfero, mas preferiblemente una ATPasa humana, mas preferiblemente una ATPasa neuronal de mamffero o humana o una variante de la misma, polipeptido al que se hace referencia durante toda la solicitud como a un "polipeptido de la invencion". En una realizacion preferida, dicha ATPasa es una ATPasa de Na(+)/K(+) asociada a la membrana. En una realizacion mas preferida, el polipeptido comprende la subunidad alfa 3 de la ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) codificada por el codigo P13637 de la base de datos. A lo largo de esta solicitud, cualquier codigo de la base de datos citado se refiere a la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot, mas espedficamente a la version accesible en lmea el 2 de mayo de 2014.

Sin embargo, las ensenanzas de la presente invencion no solo pueden llevarse a cabo usando polipeptidos, en particular un polipeptido que comprende la subunidad alfa 3 de la ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) codificada por el codigo P13637 de la base de datos, o acidos nucleicos que tienen secuencias exactas a las que se hace referencia explfcitamente en esta solicitud, por ejemplo, por funcion, nombre, secuencia o numero de acceso, o implfcitamente, pero tambien usando variantes de tales polipeptidos o acidos nucleicos.

En una realizacion preferida, el termino "variante", como se usa en este documento, puede referirse a al menos un fragmento de la secuencia de longitud completa que se refiere a, mas espedficamente, una o mas secuencias de aminoacidos o de acidos nucleicos que son, con relacion a la secuencia de longitud completa, truncada en uno o ambos extremos por uno o mas aminoacidos. Tal fragmento comprende o codifica un peptido que tiene al menos 6, 7, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150 o 200 aminoacidos sucesivos de la secuencia original o una variante de la misma. La longitud total de la variante puede ser de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o mas aminoacidos.

En otra realizacion preferida, el termino "variante" se refiere no solo a al menos un fragmento, sino tambien a un polipeptido o a un fragmento del mismo que comprende secuencias de aminoacidos que son al menos 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % identicos a la secuencia de aminoacidos de referencia a la que se hace referencia o al fragmento de la misma, en la que aminoacidos distintos de los esenciales para la actividad biologica, por ejemplo, la capacidad de una antfgeno para unirse a un (auto)anticuerpo, o el pliegue o estructura del polipeptido se elimina o se sustituye y/o uno o mas de tales aminoacidos esenciales se reemplazan de una manera conservadora y/o se agregan aminoacidos de modo que la actividad biologica del polipeptido se conserva. El estado de la tecnica comprende varios procedimientos que pueden usarse para alinear dos secuencias de aminoacidos o acidos nucleicos dadas y para calcular el grado de identidad, vease, por ejemplo, Arthur Lesk (2008), Introduction to Bioinformatics, Oxford University Press, 2008, 3° Edicion. En una realizacion preferida, se usa el software ClustalW (Larkin, MA, Blackshields, G, Brown, NP, Chenna, R, McGettigan, PA, McWilliam, H, Valentin, F, Wallace, IM, Wilm, A., Lopez, R, Thompson, JD, Gibson, TJ, Higgins, DG (2007). Clustal W y Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23, 2947-2948) utilizando configuraciones predeterminadas.

En una realizacion preferida, las variantes pueden, ademas, comprender modificaciones qmmicas, por ejemplo marcadores isotopicos o modificaciones covalentes tales como glicosilacion, fosforilacion, acetilacion, descarboxilacion, citrulinacion, hidroxilacion y similares. La persona experta en la tecnica esta familiarizada con los procedimientos para modificar polipeptidos. Cualquier modificacion esta disenada de tal manera que no elimina la actividad biologica de la variante.

Ademas, las variantes tambien se pueden generar por fusion con otros polipeptidos conocidos o variantes de los mismos y comprenden porciones o dominios activos, que preferiblemente tienen una identidad de secuencia de al menos 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % cuando se alinea con la porcion activa de la secuencia de referencia, en la que el termino "porcion activa", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de aminoacidos, que es menor que la secuencia de aminoacidos de longitud completa o en el caso de una secuencia de acido nucleico, codifica una secuencia de aminoacidos menor a la longitud completa, respectivamente, y/o es una variante de la secuencia natural, pero conserva al menos parte de la actividad biologica.

En una realizacion preferida, el termino "variante" de un acido nucleico comprende acidos nucleicos cuya cadena complementaria se hibrida, preferiblemente en condiciones rigurosas, con el acido nucleico de referencia o de tipo silvestre. La rigurosidad de las reacciones de hibridacion es facilmente determinable por un experto en la tecnica, y en general es un calculo emprnco que depende de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la

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concentracion de sal. En general, las sondas mas largas requieren temperatures mas altas para una hibridacion apropiada, mientras que las sondas mas cortas, menores. La hibridacion generalmente depende de la capacidad del ADN desnaturalizado para hibridarse nuevamente con cadenas complementarias presentes en un entorno por debajo de su temperatura de fusion: cuanto mayor es el grado de homologfa deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor es la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado, se deduce que las temperaturas relativas mas altas tendenan a hacer que las condiciones de reaccion sean mas rigurosas, mientras que las temperaturas mas bajas sean menos rigurosas. Para detalles adicionales y explicacion de la rigurosidad de las reacciones de hibridacion, vease Ausubel, F. M. (1995), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc. Ademas, la persona experta en la tecnica puede seguir las instrucciones dadas en el manual de Boehringer Mannheim GmbH (1993) The DIG System Users Guide for Filter Hybridization, Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Alemania y en Liebl, W, Ehrmann, M, Ludwig, W y Schleifer, KH (1991) International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 sobre como identificar secuencias de ADN por medio de hibridacion. En una realizacion preferida, se aplican condiciones rigurosas para cualquier hibridacion, es decir, la hibridacion ocurre solo si la sonda es 70 % o mas identica a la secuencia objetivo. Las sondas que tienen un menor grado de identidad con respecto a la secuencia objetivo pueden hibridarse, pero tales hnbridos son inestables y se eliminaran en una etapa de lavado en condiciones rigurosas, por ejemplo disminuyendo la concentracion de sal a 2 x SSC o, opcionalmente y posteriormente, a 0,5 x SSC, mientras que la temperatura es, en orden de preferencia creciente, aproximadamente

50 °C-68 °C, aproximadamente 52 °C-68 °C, aproximadamente 54 °C-68 °C, aproximadamente 56 °C-68 °C, aproximadamente 58 °C-68 °C, aproximadamente 60 °C-68 °C, aproximadamente 62 °C-68 °C, aproximadamente 64 °C-68 °C, aproximadamente 66 °C-68 °C. En una realizacion particularmente preferida, la temperatura es aproximadamente de 64 °C-68 °C o aproximadamente 66 °C-68 °C. Es posible ajustar la concentracion de sal a 0,2 x SSC o incluso 0,1 x SSC. Pueden aislarse secuencias de acido nucleico que tienen un grado de identidad con respecto a la secuencia de referencia o de tipo silvestre de al menos 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 %. En una realizacion preferida, el termino variante de una secuencia de acido nucleico, como se usa en este documento, se refiere a cualquier secuencia de acido nucleico que codifica la misma secuencia de aminoacidos y sus variantes tal como la secuencia de acido nucleico de referencia, en lmea con la degeneracion del codigo genetico.

La variante del polipeptido tiene actividad biologica. En una realizacion preferida, dicha actividad biologica es la capacidad de unirse espedficamente a los autoanticuerpos de la clase IgG2 que se encuentran en pacientes que padecen SNP o adenocarcinoma.

El polipeptido de la invencion, que comprende una ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+), mas espedficamente la subunidad alfa 3 de la misma, o una variante de la misma, cuando se usa para llevar a cabo las ensenanzas de la presente invencion, puede ser proporcionado en cualquier forma y con cualquier grado de purificacion, a partir de tejidos o celulas que comprenden dicho polipeptido en una forma endogena, mas preferiblemente celulas que sobreexpresan el polipeptido, lisados crudos o enriquecidos de tales celulas, hasta un polipeptido purificado y/o aislado que es esencialmente puro. En una realizacion preferida, el polipeptido es un polipeptido nativo, en el que el termino "polipeptido nativo", como se usa en este documento, se refiere a un polipeptido plegado, mas preferiblemente a un polipeptido plegado purificado a partir de tejidos o celulas, mas preferiblemente de celulas o tejidos de mamfferos, opcionalmente de tejidos o celulas no recombinantes. En otra realizacion preferida, el polipeptido es una protema recombinante, en el que el termino "recombinante", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipeptido producido usando enfoques de ingeniena genetica en cualquier etapa del proceso de produccion, por ejemplo fusionando un acido nucleico que codifica el polipeptido a un promotor fuerte para la sobreexpresion en celulas o tejidos o modificando la secuencia del propio polipeptido. La persona experta en la tecnica esta familiarizada con los procedimientos para disenar acidos nucleicos y polipeptidos codificados (por ejemplo, descritos en Sambrook, J, Fritsch, EF y Maniatis, T (1989), Molecular Cloning, CSH o en Brown TA (1986), Gene Cloning - an introduction, Chapman & Hall) y para la produccion y purificacion de polipeptidos nativos o recombinantes (por ejemplo, Handbooks "Strategies for Protein Purification", "Antibody Purification", "Purifying Challenging Proteins", "Recombinant Protein Purification", "Affinity Chromatography", "Ion Exchange Chromatography", "Gel Filtration (Size Exclusion Chromatography)", "Hydrophobic Interaction Chromatography", "Multimodal Chromatography" (2009/2010), publicado por GE Healthcare Life Sciences, y en Burgess, RR, Deutscher, MP (2009), Guide to Protein Purification). En una realizacion preferida, un polipeptido es puro si al menos 60, 70, 80, 90, 95 o 99 por ciento del polipeptido en la muestra respectiva consiste en dicho polipeptido segun se juzga mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de SDS seguido de tincion con azul de Coomassie e inspeccion visual.

51 el polipeptido de la invencion que comprende una ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) o una variante de la misma se proporciona en forma de tejido, se prefiere que el tejido sea de cerebro de mairnfero, por ejemplo, cerebro de humano, rata, primate, burro, raton, cabra, caballo, oveja, cerdo o vaca. Si dicho polipeptido se proporciona en forma de una celula no recombinante, se prefiere que la celula sea una neurona, preferiblemente una neurona del hipocampo o una celula del neuropilo de un mamffero, por ejemplo, de rata, humano, primate, burro, raton, cabra, caballo, oveja, cerdo o vaca. Si se usa un lisado celular, se prefiere que el lisado celular comprenda las membranas asociadas con la superficie de la celula. Si dicho polipeptido se proporciona en forma de una celula recombinante, se prefiere que la celula recombinante sea una celula eucariota tal como una celula de levadura, mas preferiblemente una celula de un eucariota multicelular tal como una planta, marnffero, rana o insecto, mas

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preferiblemente de un mairnfero, por ejemplo, rata, humano, primate, burro, raton, cabra, caballo, oveja, cerdo o vaca. Por ejemplo, la celula puede ser una celula HEK293 transfectada con un acido nucleico que codifica funcionalmente el polipeptido de la invencion. El experto en la materia esta familiarizado con los procedimientos para preparar, transfectar y cultivar tales celulas, por ejemplo las descritas en Phelan, MC (2001), Basic Techniques in Mammalian Cell Tissue Culture, John Wiley.

El polipeptido utilizado para llevar a cabo las ensenanzas de la invencion, incluyendo cualquier variante, se disena de forma que comprenda epftopos reconocidos por y/o que se unan espedficamente a autoanticuerpos que se unen a la subunidad alfa 3 de la ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+), o variantes de la misma, mas preferiblemente tomadas de pacientes que padecen el nuevo trastorno neurologico identificado por los inventores. En una realizacion, dicho polipeptido comprende un tramo de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o mas, preferiblemente al menos 9 pero no mas de 16, aminoacidos consecutivos de la ATPasa neuronal humana de Na+/K+. El experto en la tecnica esta familiarizado con las directrices usadas para disenar peptidos que tienen suficiente inmunogenicidad, por ejemplo, las descritas en Jackson, DC, Fitzmaurice, CJ, Brown, LE, Zeng, W (1999), Preparation and properties of totally synthetic immunogenes, Vaccine Volumen, 18, Ediciones 3-4, septiembre de 1999, Paginas 355-361; y Black, M, Trent, A, Tirrell, M y Olive, C (2010), Advances in the design and delivery of peptide subunit vaccines with a focus on Toll-like receptor agonists, Expert Rev Vaccines, febrero de 2010; 9 (2): 157-173. En pocas palabras, es deseable que el peptido cumpla con el mayor numero posible de los siguientes requisitos: (a) tener un alto grado de hidrofilicidad, (b) que comprenda uno o mas restos seleccionados del grupo que comprende aspartato, prolina, tirosina y fenilalanina, (c) que tenga, para mayor especificidad, poca o ninguna homologfa con otros peptidos o polipeptidos conocidos, (d) necesita ser suficientemente soluble y (e) que no comprenda sitios de glicosilacion o fosforilacion a menos que se requiera por razones espedficas. Alternativamente, se pueden seguir los enfoques bioinformaticos, por ejemplo, los descritos por Moreau, V, Fleury, C, Piquer, D, Nguyen, C, Novali, N, Villard, S, Laune, D, Granier, C y Molina, F (2008), PEPOP: Computational design of immunogenic peptides, BMC Bioinformatics 2008, 9: 71.

El polipeptido de la invencion, que comprende la ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) o una variante de la misma, cuando se usa de acuerdo con la presente invencion, se puede proporcionar en cualquier tipo de conformacion. Por ejemplo, el polipeptido puede ser un polipeptido esencialmente desplegado, parcialmente o completamente plegado. En una realizacion preferida, el polipeptido se pliega en el sentido de que los epftopos que son esenciales para la union al autoanticuerpo de la invencion, o la protema o variante del mismo en su totalidad, adoptan el plegamiento adoptado por la protema nativa en su entorno natural. La persona experta en la tecnica esta familiarizada con los procedimientos adecuados para determinar si un polipeptido se pliega o no y si lo hace, que la estructura que tiene, por ejemplo proteolisis limitada, espectroscopfa de RMN, espectroscopfa de CD o cristalograffa de rayos X (vease, por ejemplo Banaszak LJ (2008), Foundations of Structural Biology, Academics Press, o Teng Q. (2013), Structural Biology: Practical Applications, Springer), preferiblemente se usa espectroscopia de RMN multidimensional.

El polipeptido de la invencion puede ser una protema de fusion que comprende secuencias de aminoacidos distintas de las tomadas de ATPasas de mamfferos, en particular una etiqueta C-terminal o N-terminal, preferiblemente una etiqueta C-terminal, que es, en una realizacion preferida, como se usa en el presente documento, un motivo de secuencia adicional o polipeptido que tiene una funcion que tiene alguna funcion biologica o ffsica y puede, por ejemplo, usarse para purificar, inmovilizar, precipitar o identificar el polipeptido de la invencion. En una realizacion mas preferida, la etiqueta es una secuencia o dominio capaz de unirse espedficamente a un ligando, por ejemplo, una etiqueta seleccionada del grupo que comprende etiquetas His, tiorredoxina, protema de union a maltosa, glutation S-transferasa, una etiqueta de fluorescencia, por ejemplo del grupo que comprende protema verde fluorescente.

El polipeptido de la invencion puede ser un polipeptido inmovilizado. En una realizacion preferida, el termino "inmovilizado", como se usa en el presente documento, se refiere a una molecula unida a un veldculo solido insoluble en una solucion acuosa, mas preferiblemente a traves de un enlace covalente, interacciones electrostaticas, encapsulacion o atrapamiento, por ejemplo desnaturalizando un polipeptido globular en un gel, o mediante interacciones hidrofobas, mas preferiblemente a traves de uno o mas enlaces covalentes. Varios vehmulos adecuados, por ejemplo papel, poliestireno, metal, superficies de silicio o vidrio, canales de microfluidos, membranas, perlas tales como perlas magneticas, medios de cromatograffa en columna, biochips, geles de poliacrilamida y similares se han descrito en la bibliograffa, por ejemplo en Kim., D. y Herr, AE (2013), Protein immobilizsation techniques for microfluidic assays, Biomicrofluidics 7 (4), 041501. De esta manera, la molecula inmovilizada, junto con el vedculo insoluble, pueden separarse de una solucion acuosa de una manera directa, por ejemplo, mediante filtracion, centrifugacion o decantacion. Una molecula inmovilizada puede inmovilizarse de manera reversible o irreversible. Por ejemplo, la inmovilizacion es reversible si la molecula interactua con el portador a traves de interacciones ionicas que pueden enmascararse mediante la adicion de una alta concentracion de sal o si la molecula se une mediante un enlace covalente escindible tal como un puente disulfuro que puede escindirse mediante la adicion de reactivos que contienen tiol. Por el contrario, la inmovilizacion es irreversible si la molecula esta unida al transportador mediante un enlace covalente que no puede escindirse en solucion acuosa, por ejemplo un enlace formado por reaccion de un grupo epoxido y un grupo amina como se usa frecuentemente para acoplar cadenas laterales de lisina a columnas de afinidad. La protema puede inmovilizarse indirectamente, por ejemplo

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inmovilizando un anticuerpo u otra entidad que tenga afinidad por la molecula, seguido por la formacion de un complejo con el efecto de que el complejo molecula-anticuerpo se inmoviliza. Diversas formas de inmovilizar moleculas se describen en la bibliograffa, por ejemplo, en Kim, D, Herr y AE (2013), Protein immobilizsation techniques for microfluidic assays, Biomicrofluidics 7 (4), 041501. Ademas, varios reactivos y kits para reacciones de inmovilizacion estan disponibles comercialmente, por ejemplo, a traves de Pierce Biotechnology.

Es esencial que la muestra utilizada para el diagnostico en lmea con la presente invencion comprenda inmunoglobulinas. Tfpicamente, la muestra de un fluido corporal comprende un conjunto representativo de la totalidad de las inmunoglobulinas del sujeto. Sin embargo, la muestra, una vez provista, puede someterse a un procesamiento posterior que puede incluir fraccionamiento, centrifugacion, enriquecimiento o aislamiento de la totalidad de las inmunoglobulinas o cualquier clase de inmunoglobulina del sujeto, lo que puede afectar la distribucion relativa de las inmunoglobulinas de las diversas clases.

Los reactivos, dispositivos, procedimientos y usos descritos en esta solicitud se pueden usar para el diagnostico de una enfermedad seleccionada del grupo que comprende el smdrome neuronal paraneoplasico y el adenocarcinoma.

En una realizacion preferida, el termino "diagnostico", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier tipo de procedimiento con el objetivo de obtener informacion instrumental en la evaluacion de si un paciente sufre o es probable o mas probable que el sujeto promedio o comparativo, teniendo estos ultimos preferiblemente smtomas similares, sufran en el futuro de cierta enfermedad o trastorno en el pasado, en el momento del diagnostico o en el futuro, para descubrir como esta progresando la enfermedad o es probable que progrese en el futuro o para evaluar la capacidad de respuesta de un paciente con respecto a un determinado tratamiento, por ejemplo, la administracion de medicamentos inmunosupresores, medicamentos que ralentizan el progreso de una enfermedad neurodegenerativa o medicamentos contra el cancer. En otras palabras, el termino "diagnostico" comprende no solo diagnosticar, sino tambien pronosticar y/o controlar el curso de una enfermedad o trastorno.

En muchos casos, la mera deteccion, en otras palabras, determinar si los niveles detectables del anticuerpo estan presentes en la muestra, es suficiente para el diagnostico. Si se puede detectar el autoanticuerpo, esto sera informacion instrumental para el diagnostico clmico e indica una mayor probabilidad de que el paciente padezca una o mas enfermedades seleccionadas del grupo que comprende trastornos paraneoplasicos, trastornos neurologicos, mas preferiblemente smdrome neurologico paraneoplasico, lo mas preferiblemente un trastorno neurologico caracterizado por uno o mas smtomas, preferentemente todos los smtomas, seleccionados del grupo que comprende trastorno de movimiento mixto, disminucion aguda del rendimiento visual, disartria y disfagia, y cancer, mas preferentemente adenocarcinoma. En una realizacion, puede determinarse la concentracion relativa del anticuerpo en el suero, en comparacion con el nivel que puede encontrarse en el sujeto saludable promedio. Si bien en muchos casos puede ser suficiente determinar si los autoanticuerpos estan presentes en la muestra, el procedimiento utilizado para obtener informacion instrumental para el diagnostico puede implicar determinar si la concentracion es al menos 10, preferiblemente 20, 25, 50, 100, 200, 500, 1.000, 10.000 o 100.000 veces mayor que la concentracion encontrada en el sujeto saludable promedio.

La persona experta en la tecnica apreciara que un medico generalmente no concluye si el paciente sufre o es probable que sufra de una enfermedad, afeccion o trastornos basandose unicamente en un unico parametro de diagnostico, sino que necesita tener en cuenta otros aspectos, por ejemplo la presencia de otros autoanticuerpos, marcadores, parametros sangumeos, evaluacion clmica de los smtomas del paciente o los resultados de imagenes medicas u otros procedimientos no invasivos como la polisomnograffa, para llegar a un diagnostico concluyente. Vease Baenkler HW (2012), General aspects of autoinmune diagnostics, en Renz, H., Autoimmune diagnosis, 2012, de Gruyter, pagina 3. El valor de un agente o procedimiento de diagnostico tambien puede residir en la posibilidad de descartar una enfermedad, lo que permite el diagnostico indirecto de otra.

Por lo tanto, el termino "diagnostico" preferiblemente no implica que los procedimientos o agentes de diagnostico de acuerdo con la presente invencion sean definitivos y suficientes para finalizar el diagnostico sobre la base de una unica prueba, y mucho menos un parametro, pero pueden referirse a una contribucion a lo que se conoce como un "diagnostico diferencial", es decir, un procedimiento de diagnostico sistematico que considera la probabilidad de un intervalo de condiciones posibles sobre la base de un intervalo de parametros de diagnostico. En consecuencia, el procedimiento, el polipeptido o el uso de la invencion, opcionalmente para determinar si un paciente sufre del trastorno neurologico caracterizado por uno o mas smtomas, preferiblemente todos los smtomas, seleccionados del grupo que comprende trastorno de movimiento mixto, deterioro agudo del rendimiento visual, disartria y disfagia, o padece cancer, preferiblemente adenocarcinoma, puede comprender obtener una muestra de un paciente, preferiblemente un paciente humano, determinando si un autoanticuerpo que se une a la subunidad alfa 3 de la ATPasa neuronal humana de Na+/K+ esta presente en dicha muestra, en el que dicha determinacion se realiza poniendo en contacto la muestra con el polipeptido de la invencion y detectando si se produce la union entre dicho polipeptido y dicho autoanticuerpo, preferiblemente usando un anticuerpo secundario marcado, mas preferiblemente usando un procedimiento del grupo que comprende radioinmunoensayo, transferencia Western, transferencia de lmea, ELISA, indirecto e inmunofluorescencia, en donde dicho autoanticuerpo se une a dicho polipeptido si esta presente en la muestra, y diagnosticar que el paciente padece o tiene mas probabilidades de padecer dicho trastorno neurologico o cancer si se determina que el autoanticuerpo esta presente en la muestra.

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El termino "diagnostico" tambien puede referirse a un procedimiento o agente usado para distinguir entre dos o mas afecciones asociadas con smtomas similares o identicos, por ejemplo, ataxia causada por un defecto autoinmune y otras formas de ataxia asociadas con enfermedades neurodegenerativas, o para distinguir un subgrupo o una enfermedad espedfica de un espectro de trastornos relacionados. En una realizacion preferida, el espectro de trastornos es el smdrome neurologico paraneoplasico.

El termino "diagnostico" tambien puede referirse a un procedimiento o agente usado para distinguir entre el regimen de tratamiento mas prometedor para un paciente, preferentemente un paciente que tiene uno o mas smtomas seleccionados del grupo que comprende trastorno de movimiento mixto, disminucion aguda del rendimiento visual, disartria y disfagia o un adenocarcinoma. En otras palabras, el procedimiento o agente puede relacionarse con la seleccion de un regimen de tratamiento para un sujeto. Por ejemplo, la deteccion de autoanticuerpos puede indicar que se debe seleccionar una terapia inmunosupresora, que puede incluir administrar al paciente uno o mas farmacos inmunosupresores.

La presente invencion se refiere a un complejo que comprende un (auto)anticuerpo que se une al polipeptido de la invencion. Tal complejo puede usarse o detectarse como parte de un procedimiento para diagnosticar una enfermedad. Se puede usar una muestra lfquida que comprende anticuerpos de un sujeto para practicar el procedimiento. Tal muestra lfquida puede ser cualquier fluido corporal que comprende un conjunto representativo de anticuerpos del sujeto, preferiblemente una muestra que comprende anticuerpos de la clase de inmunoglobulina IgG del sujeto, mas preferiblemente del grupo que comprende las subclases IgGl, IgG2 e IgG4, mas preferiblemente de la subclase IgG4. Por ejemplo, una muestra puede ser fluido cerebroespinal (LCE), sangre o suero sangumeo, linfa, fluido intersticial y es preferiblemente suero o LCE, mas preferiblemente suero.

La etapa de poner en contacto una muestra lfquida que comprende anticuerpos con el polipeptido de la invencion se puede llevar a cabo incubando una forma inmovilizada de dicho polipeptido en presencia de la muestra que comprende anticuerpos bajo condiciones que son compatibles con la formacion del complejo que comprende dicho polipeptido y anticuerpo, preferiblemente un autoanticuerpo, que se une al polipeptido de la invencion. La muestra ifquida, entonces sin anticuerpos que se unen al polipeptido de la invencion se puede eliminar posteriormente, seguido de una o mas etapas de lavado. Finalmente, se puede detectar el complejo que comprende el anticuerpo y el polipeptido. En una realizacion preferida, el termino "condiciones compatibles con la formacion del complejo" son condiciones que permiten que las interacciones espedficas antfgeno-anticuerpo formen el complejo que comprende el polipeptido y el anticuerpo. En una realizacion preferida, tales condiciones pueden comprender incubar el polipeptido en una muestra diluida 1:100 en regulador PBS durante 30 minutos a 25 °C. En una realizacion preferida, el termino "autoanticuerpo", como se usa en este documento, se refiere a un anticuerpo que se une espedficamente a una molecula endogena del animal, preferiblemente mamffero, que produce dicho autoanticuerpo, en el que el nivel de dicho anticuerpo es mas preferiblemente elevado comparado con el promedio de cualquier otro anticuerpo que se una espedficamente a dicha molecula endogena. En una realizacion mas preferida, el autoanticuerpo es un autoanticuerpo que se une a la subunidad alfa 3 de la ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+). Tal autoanticuerpo puede aislarse a partir de muestras tomadas de pacientes que padecen el trastorno neurologico caracterizado por dos o mas, preferiblemente todos los smtomas seleccionados del grupo que comprende trastorno de movimiento mixto, disminucion aguda del rendimiento visual, disartria y disfagia.

En una realizacion preferida, la deteccion del complejo para el pronostico, diagnostico, procedimientos o kit de prueba de acuerdo con la presente invencion comprende el uso de un procedimiento seleccionado del grupo que comprende tecnicas de inmunodifusion, tecnicas inmunoelectroforeticas, inmunoensayos de dispersion de luz, inmunoensayos de dispersion de luz, tecnicas de aglutinacion, inmunoensayos marcados tales como los del grupo que comprende inmunoensayo radiomarcado, inmunoensayos enzimaticos, inmunoensayos de quimioluminiscencia y tecnicas de inmunofluorescencia. El experto en la tecnica esta familiarizado con estos procedimientos, que tambien se describen en el estado de la tecnica, por ejemplo en Zane, HD (2001), Immunology - Theoretical & Practical Concepts in Laboratory Medicine, WB Saunders Company, en particular en el capftulo 14.

Alternativamente, puede usarse una muestra que comprende tejido que comprende el polipeptido de la invencion en lugar de una muestra lfquida. La muestra de tejido es preferiblemente de un tejido que expresa ATPasa neuronal humana (Na+/K+) endogena. Dicha muestra, que puede estar en forma de una seccion de tejido fijada en un vehmulo, por ejemplo un portaobjetos de vidrio para analisis microscopico, puede ponerse en contacto luego con el anticuerpo de la invencion, preferiblemente autoanticuerpo, que se une al polipeptido de la invencion. El anticuerpo esta preferiblemente marcado para permitir la distincion de anticuerpos endogenos que se unen al polipeptido de la invencion, de modo que los complejos recien formados pueden detectarse y, opcionalmente, cuantificarse. Si la cantidad de complejos formados es inferior a la cantidad encontrada en una muestra tomada de un sujeto sano, el sujeto del que se ha tomado la muestra examinada es probable que padezca una enfermedad.

Cualquier dato que demuestre la presencia o ausencia del complejo que comprende el anticuerpo y el polipeptido de la invencion se puede correlacionar con los datos de referencia. Por ejemplo, la deteccion de dicho complejo indica que el paciente que proporciono la muestra analizada ha sufrido, esta sufriendo o es probable que sufra en el futuro de SNP y adenocarcinoma. Si un paciente ha sido diagnosticado previamente y se realiza nuevamente el procedimiento para obtener informacion diagnostica relevante, la cantidad de complejo detectado en ambas pruebas

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puede correlacionarse para descubrir la progresion de la enfermedad y/o el exito de un tratamiento. Por ejemplo, si se encuentra que la cantidad de complejo aumenta, se puede concluir que el trastorno esta progresando, es probable que se manifieste en el futuro y/o que cualquier tratamiento que se intente fracase.

En una realizacion preferida, se usa una microplaca, ELISA de membrana, transferencia de punto o transferencia de lmea para llevar a cabo el procedimiento de diagnostico de acuerdo con la invencion. El experto en la tecnica esta familiarizado con la configuracion experimental, que se describe en el estado de la tecnica (Raoult, D. y Dasch, GA (1989), The line blot: an immunoassay for monoclonal and other antibodies. Its application to the serotyping of gramnegative bacteria. J. Immunol. Methods, 125 (1- 2), 57-65; WO2013041540). Brevemente, los uno o mas antigenos de interes, en el caso de la presente invencion, el polipeptido de la invencion, se puede unir a un vehmulo, por ejemplo membrana de nitrocelulosa, a menudo en combinacion con antigenos y controles adicionales. El portador de nitrocelulosa se expone posteriormente a una muestra que comprende anticuerpos tales como suero diluido. Si la muestra comprende un anticuerpo que se une al antfgeno, se forma un complejo que puede detectarse, preferiblemente mediante incubacion con un anticuerpo secundario que se une a la region constante del primer anticuerpo, cuyo anticuerpo secundario comprende un marcador detectable, por ejemplo, un isotopo radioactivo, un colorante fluorescente o, en una realizacion preferida, una enzima activa fusionada o unida al anticuerpo secundario, tal como fosfatasa alcalina, que puede ensayarse facilmente usando sustratos cromogenicos seguido de un examen visual simple. Los reactivos, dispositivos y paquetes de software adecuados estan disponibles comercialmente, por ejemplo, a traves de EUROIMMUn, Lubeck, Alemania.

En otra realizacion preferida, el pronostico, el diagnostico, los procedimientos o el kit de prueba de acuerdo con las ensenanzas de la invencion contemplan el uso de inmunofluorescencia indirecta. El experto en la materia esta familiarizado con tales tecnicas y la preparacion de muestras adecuadas, que se describen en el estado de la tecnica (documento US 4.647.543; Voigt, J, Krause, C, Rohwader, E, Saschenbrecker, S, Hahn, M, Danckwardt, M, Feirer, C, Ens, K, Fechner, K, Barth, E, Martinetz, T, y Stocker, W. (2012), Automated Indirect Immunofluorescence Evaluation of Antinuclear Autoantibodies on HEp-2 Cells", Clinical and Developmental Immunology, vol. 2012, doi: 10.1155/2012/65105; Bonilla, E, Francis, L, Allam, F, et al. La microscopfa de inmunofluorescencia es superior a las perlas fluorescentes para la deteccion de reactividad de anticuerpos antinucleares en pacientes con lupus eritematoso sistemico, Clinical Immunology, volumen 124, no. 1, paginas 18-21, 2007). En resumen, un vehmulo, tal como un cubreobjetos para su uso en microscopfa, esta recubierto con celulas o secciones de tejido que comprenden el antfgeno, en el caso de la presente invencion, el polipeptido que comprende una o mas secuencias de ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) o una variante de la misma. El vehmulo que comprende el antfgeno se expone a una muestra del paciente que comprende anticuerpos tales como suero diluido. Si la muestra comprende un anticuerpo que se une al antfgeno, el complejo resultante puede detectarse, preferiblemente mediante incubacion con un anticuerpo secundario que comprende un colorante fluorescente tal como fluorescema, seguido del examen visual usando microscopfa de fluorescencia. Los reactivos, dispositivos y paquetes de software adecuados estan disponibles comercialmente, por ejemplo, a traves de EUROIMMUN, Lubeck, Alemania.

Una muestra de un paciente que padece o se sospecha que padece una enfermedad seleccionada del grupo que comprende SNP y adenocarcinoma, puede someterse a una prueba que determina unicamente si un autoanticuerpo que se une a ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) esta presente, pero se prefiere que los procedimientos de diagnostico, las pruebas, los dispositivos y similares contemplen la determinacion de la presencia de autoanticuerpos contra una diversidad de antfgenos relacionados con enfermedad autoinmune neurologica o variantes de la misma, por ejemplo Hu, Yo, Ri, CV2, PNMA1, PNMA2, DNER/Tr, ARHGAP26, ITPR1, CARPVIII, Zic4, Sox1, MAG, MP0, MBP, GAD65, anfifisina, recoverina, receptor de GABA A, receptor de GABA B, receptor de glicina, gefirina, IgLON5, DPPX, aquaporina-4, MOG, receptor de NMDA, receptores de AMPA, GRM1, GRm5, LGI1 y CASPR2. Por lo tanto, el procedimiento, uso, kit, dispositivo o similar de acuerdo con la presente invencion puede comprender dos o mas, preferiblemente tres, cuatro, cinco o mas antfgenos o variantes de los mismos seleccionados del grupo que comprende Hu, Yo, Ri, CV2, PNMA1, PNMA2, DNER/Tr, ARHGAP26, ITPR1, CARPVIII, Zic4, Sox1, MAG, MP0, MbP, GAD65, anfifisina, recoverina, receptor de GABA A, receptor de GABA B, receptor de glicina, gefirina, IgLON5, DPPX, aquaporina-4, MOG, receptor de NMDA, receptores de AMPA, GRM1, GRM5, LGI1 y CASPR2, cuyos antfgenos estan preferiblemente inmovilizados, por ejemplo, en una transferencia de lmea.

De acuerdo con las ensenanzas de la presente invencion, se proporciona un anticuerpo, preferiblemente un autoanticuerpo que se une al polipeptido de la invencion utilizado para el diagnostico de una enfermedad. El experto en la tecnica esta familiarizado con los procedimientos para purificar anticuerpos, por ejemplo los descritos en Hermanson, GT, Mallia, AK, y Smith, PK (1992), Immobilized Affinity Ligand Techniques, San Diego: Academic Press. Brevemente, un antfgeno que se une espedficamente al anticuerpo de interes, cuyo antfgeno es el polipeptido de la invencion, se inmoviliza y se usa para purificar, mediante cromatograffa de afinidad, el anticuerpo de interes de una fuente adecuada. Se puede usar como fuente una muestra lfquida que comprende anticuerpos de un paciente que padece el trastorno neurologico identificado por los inventores.

De acuerdo con la invencion, se proporciona un anticuerpo, por ejemplo un autoanticuerpo, que es capaz de unirse espedficamente al polipeptido de la invencion. En una realizacion preferida, el termino "anticuerpo", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquiera de las unidades estructurales de union basadas en inmunoglobulina,

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mas preferiblemente una que comprende al menos una cadena pesada de inmunoglobulina y una cadena ligera de inmunoglobulina, que incluye, pero no se limita a anticuerpos monoclonales y policlonales asf como variantes de un anticuerpo, en particular fragmented, cuyas unidades estructurales de union son capaces de unirse al antigeno respectivo, mas preferiblemente unirse espedficamente al mismo. En una realizacion preferida, el termino "que se une espedficamente", como se usa en el presente documento, significa que la union es mas fuerte que una reaccion de union caracterizada por una constante de disociacion de 1 x 10-5 M, mas preferiblemente 1 x 10-7 M, mas preferiblemente 1 x 10-8 M, mas preferiblemente 1 x 10-9 M, mas preferiblemente 1 x 10-10 M, mas preferiblemente 1 x 10-11 M, mas preferiblemente 1 x 10-12 M, segun se determina mediante resonancia de plasmon superficial usando un equipo Biacore a 25 °C en regulador PBS a pH 7. El anticuerpo se puede aislar o en una mezcla que comprende otros anticuerpos, polipeptidos, metabolitos, celulas y similares. En caso de que el anticuerpo sea un autoanticuerpo, puede ser parte de una preparacion de autoanticuerpo que sea heterogenea o pueda ser un autoanticuerpo homogeneo, en el que una preparacion heterogenea comprenda una pluralidad de diferentes especies de autoanticuerpos que puedan obtenerse por preparacion a partir del suero de donantes humanos, por ejemplo mediante cromatograffa de afinidad usando el antfgeno inmovilizado para purificar cualquier autoanticuerpo capaz de unirse a dicho antigeno. Preferiblemente, el anticuerpo es un autoanticuerpo, mas preferiblemente un autoanticuerpo de la clase IgG, lo mas preferiblemente del grupo de subclases que comprende IgG1, IgG2 e IgG4, en particular IgG2. En otra realizacion preferida, el anticuerpo es un anticuerpo de mairnfero, mas preferiblemente un anticuerpo de primate, mas preferiblemente un anticuerpo humano. El anticuerpo puede estar glicosilado o no glicosilado. El experto en la tecnica esta familiarizado con los procedimientos que pueden usarse para la identificacion, produccion y purificacion de anticuerpos y variantes de los mismos, por ejemplo los descritos en el documento EP 2 423 226 A2 y las referencias citadas alte El anticuerpo se puede usar como agente de diagnostico, solo o en combinacion, por ejemplo, en un complejo con el polipeptido de la invencion.

La invencion proporciona una composicion farmaceutica para su uso como un medicamento que comprende el polipeptido de la invencion, cuya composicion es preferiblemente adecuada para la administracion a un sujeto, preferiblemente un sujeto marnffero, mas preferiblemente a un ser humano. Dicha composicion farmaceutica puede comprender un vehteulo farmaceuticamente aceptable. La composicion farmaceutica puede administrarse, por ejemplo, por via oral, parenteral, mediante aspersion por inhalacion, topicamente, mediante colirio, en forma rectal, nasal, bucal, vaginal o mediante un deposito implantado, en el que el termino "parenteral", como se usa en la presente memoria, comprende tecnicas de inyeccion o infusion subcutanea, intracutanea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intralesional e intracraneal. La composicion farmaceutica puede proporcionarse en formas de dosificacion adecuadas, por ejemplo, capsulas, tabletas y suspensiones y soluciones acuosas, preferiblemente en forma esteril. Se puede usar en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad, cuyo procedimiento comprende administrar una cantidad eficaz del polipeptido de la invencion a un sujeto.

De acuerdo con la presente invencion, se puede usar un dispositivo medico o de diagnostico que comprende el (auto) anticuerpo de la invencion y/o el polipeptido de la invencion. Preferiblemente, dicho dispositivo medico o de diagnostico comprende el polipeptido de la invencion en una forma que permite ponerlo en contacto con una solucion acuosa, mas preferiblemente la muestra humana lfquida, de una manera directa. En particular, el polipeptido de la invencion que comprende se puede inmovilizar en la superficie de un vehteulo, cuyo vehteulo comprende, pero no se limita a placas de vidrio o portaobjetos, biochips, placas de microtitulacion, perlas, por ejemplo, perlas magneticas, columnas de cromatograffa, membranas o similares. Los ejemplos de dispositivos medicos incluyen transferencias de lmea, microplacas y biochips. Ademas del polipeptido de la invencion, el dispositivo medico o de diagnostico puede comprender polipeptidos adicionales, por ejemplo controles positivos o negativos u otros antfgenos conocidos que se unen a autoanticuerpos de valor diagnostico, particularmente aquellos relacionados con otras enfermedades asociadas con uno o mas smtomas seleccionados del grupo que comprende trastorno de movimiento mixto, disminucion aguda del rendimiento visual, disartria y disfagia.

Las ensenanzas de la invencion proporcionan el uso de un kit para diagnosticar SNP o adenocarcinoma. Tal kit puede comprender instrucciones que detallan como usar el kit y un medio para contactar el polipeptido de la invencion con una muestra de fluido corporal de un sujeto, preferiblemente un sujeto humano, por ejemplo una transferencia de lmea, en el que el polipeptido de la invencion se inmoviliza en la transferencia de lmea. Ademas, el kit puede comprender un control positivo, por ejemplo un lote de autoanticuerpo o anticuerpo recombinante que se sabe que se une al polipeptido de la invencion y un control negativo, por ejemplo una protema que no tiene afinidad detectable con el polipeptido de la invencion tal como albumina de suero bovino. Finalmente, dicho kit puede comprender una solucion estandar del anticuerpo o antfgeno para preparar una curva de calibracion.

En una realizacion preferida, el kit comprende un medio para detectar un anticuerpo, mas preferiblemente un autoanticuerpo, que se une al polipeptido de la invencion, preferiblemente mediante la deteccion de un complejo que comprende el polipeptido de la invencion y un anticuerpo que se une al polipeptido de la invencion. Tales medios son preferiblemente un agente que se une a dicho complejo y modifica el complejo o porta una etiqueta de manera que hace que el complejo sea detectable. Por ejemplo, dicho medio puede ser un anticuerpo marcado que se une a dicho polipeptido, en un sitio de union distinto del sitio de union reconocido por el anticuerpo primario o a una region constante del anticuerpo primario. Alternativamente, dicho medio puede ser un anticuerpo secundario que se une a la region constante del autoanticuerpo, preferiblemente un anticuerpo secundario espedfico para anticuerpos clase

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IgG de mai^ero, mas preferiblemente anticuerpos de clase IgG2 de mai^ero. Alternativamente, dicho medio puede ser un reactivo de entrecruzamiento que une qmmicamente el anticuerpo y el polipeptido de la invencion, por lo que el complejo puede identificarse debido a su mayor peso molecular, por ejemplo mediante SDS PAGE seguido de tincion de Coomassie o cromatograffa de exclusion por tamano. Se han descrito una multitud de procedimientos y medios para detectar tal complejo en el estado de la tecnica, por ejemplo en Philips, Terry, M., Analytical Techniques in Immunochemistry, 1992, Marcel Dekker, Inc.

El polipeptido de la invencion se puede proporcionar en forma de una celula que comprende y/o expresa un acido nucleico que codifica dicho polipeptido. Si se usa un acido nucleico que comprende una secuencia que codifica para el polipeptido de la invencion o una variante del mismo, dicho acido nucleico puede ser un acido nucleico no modificado. En una realizacion preferida, el acido nucleico es un acido nucleico que, como tal, no se presenta en la naturaleza y comprende, en comparacion con el acido nucleico natural, al menos una modificacion, por ejemplo un contenido isotopico o modificaciones qmmicas, por ejemplo una metilacion, modificacion de secuencia, etiqueta o similares indicativo de origen sintetico. En una realizacion preferida, el acido nucleico es un acido nucleico recombinante o parte o un acido nucleico, y es, en una realizacion mas preferida, parte de un vector, en el que puede estar funcionalmente unido a un promotor que permita la expresion, preferiblemente sobreexpresion del acido nucleico.

En una realizacion preferida, dicho acido nucleico esta dentro de una celula capaz de expresarlo en el sentido de que el polipeptido de la invencion o una variante del mismo se prepara y, mas preferiblemente, se dirige a la superficie de la celula. Dicha celula que comprende el acido nucleico que codifica el polipeptido de la invencion se puede usar de acuerdo con la presente invencion. La celula puede ser cualquier tipo de celula capaz de expresar el acido nucleico, por ejemplo, una celula procariota o eucariota. En una realizacion preferida, la celula es una celula eucariotica tal como una celula de levadura, una celula eucariota de un organismo multicelular, por ejemplo una celula de insecto, mas preferentemente una celula de mairufero, por ejemplo una celula de raton, y lo mas preferentemente una celula humana.

La persona experta en la tecnica esta familiarizada con los procedimientos usados para sintetizar, modificar y amplificar dicho acido nucleico y para transfectar celulas usando dicho acido nucleico, preferiblemente en un vector que permite el mantenimiento o la expresion transitoria o permanente de dicho acido nucleico en la celula. La persona experta en la tecnica tambien esta familiarizada con una variedad de vectores adecuados, de los cuales estan disponibles comercialmente, por ejemplo a traves de Origene. Por ejemplo, se puede usar un vector que codifica constructos de fusion con una GFP en el terminal C. La celula puede ser de origen eucariota o procariota y es preferiblemente una celula de mamffero, por ejemplo una celula HEK293, CHO o COS-7. La celula que comprende el acido nucleico que codifica el polipeptido de la invencion puede ser una celula recombinante o una celula aislada en la que el termino "aislada" significa que la celula esta enriquecida de manera que, en comparacion con el entorno del tipo silvestre de dicha celula, menos celulas de otra diferenciacion o especie o, de hecho, ninguna de esas otras celulas esta presente.

Las ensenanzas de la invencion pueden usarse no solo para un diagnostico, sino tambien para prevenir o tratar una enfermedad, mas espedficamente un procedimiento para prevenir o tratar una enfermedad, que comprende las etapas a) reducir la concentracion de autoanticuerpos que se unen al polipeptido de la invencion en la sangre del sujeto y/o b) administrar una o mas sustancias farmaceuticas inmunosupresoras, preferiblemente seleccionadas del grupo que comprende rituximab, prednisona, metilprednisolona, ciclofosfamida, micofenolato de mofetilo, inmunoglobulina intravenosa, tacrolimus, ciclosporina, metotrexato, azatioprina y/o la composicion farmaceutica de acuerdo con el presente invencion, en la que la enfermedad se selecciona preferiblemente del grupo que comprende cancer, preferiblemente adenocarcinoma, y un trastorno neurologico caracterizado por dos o mas smtomas seleccionados del grupo que comprende trastorno de movimiento mixto, disminucion aguda del rendimiento visual, disartria y disfagia.

La persona experta en la tecnica apreciara que cualquiera de las realizaciones preferidas discutidas a lo largo de esta solicitud se puede aplicar a cualquiera de los aspectos de las invenciones.

Ejemplos:

Los siguientes ejemplos demuestran que la enfermedad con trastorno neurologico asociada con uno o mas smtomas seleccionados del grupo que comprende trastorno de movimiento mixto, disminucion aguda del rendimiento visual, disartria y disfagia esta relacionada con la aparicion de autoanticuerpos contra ATPasa neuronal humana de Na(+)/K (+). Podnan detectarse en un paciente diagnosticado clmicamente que padece dicha enfermedad, mientras que no se podnan detectar tales anticuerpos en sujetos sanos o pacientes que padecen otras enfermedades neurologicas.

Estos autoanticuerpos se unen, como se muestra en la presente memoria, espedficamente como ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) asf como variantes de los mismos, mas espedficamente homologos de marnfferos tales como los de rata, raton y cerdo. Estos homologos tienen una identidad de secuencia de aproximadamente el 83 %.

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Caracterizacion del paciente

La paciente de 66 anos desarrollo por primera vez vision borrosa y ataxia en noviembre de 2012. La resonancia magnetica del cerebro revelo lesiones subcorticales de sustancia blanca. El examen del lfquido cefalorraqmdeo mostro una pleocitosis linfomonodtica (12 celulas/pl), niveles elevados de protema (104 g/l) y bandas oligoclonales. Los smtomas mejoraron despues de la terapia intravenosa con corticosteroides durante 3 dfas. Se sospechaba una enfermedad inflamatoria cronica del sistema nervioso central.

En febrero de 2013, la paciente fue readmitida con ataxia progresiva, no podfa caminar sin ayuda, los movimientos oculares eran sacadicos y la vision se reduda a 0,2 en ambos ojos. El examen del lfquido cefalorraqmdeo mostro una pleocitosis linfomonodtica (46 celulas/pl) con celulas plasmaticas, niveles elevados de protema (83,6 g/l) y bandas oligoclonales. Bajo la consideracion de un smdrome paraneoplasico, la paciente recibio inmunoglobulinas polivalentes (2 g/kg por via intravenosa durante 5 dfas). PET-CT revelo un tumor colorrectal hipermetabolico. El tumor fue completamente resecado. El analisis histopatologico mostro un adenocarcinoma ulcerativo de baja diferenciacion. El analisis histopatologico de los ganglios linfaticos no revelo metastasis.

La paciente recibio ademas inmunoglobulinas (0,4 g/kg por via intravenosa cada 4 semanas) en las que los smtomas del cerebelo eran estables y se recomendo la quimioterapia adyuvante.

En agosto de 2013, los smtomas nuevamente se deterioraron. La paciente sufna de disartria y disfagia severas, paralisis vertical de la mirada, movimientos ataxicos severos de las extremidades y tetraparesia espastica. Ella no pudo salir de su cama. La plasmaferesis se realizo 6 veces sin mejora del supuesto smdrome paraneoplasico. PET- CT mostro metastasis retroperitoneal de los ganglios linfaticos. Se realizo una biopsia con aguja guiada por TC de los ganglios linfaticos que nuevamente mostro histologicamente un adenocarcinoma de baja diferenciacion. Se inicio una quimioterapia paliativa debido al inicio del regimen estandar de FOLFIRI. La paciente fallecio en noviembre de 2013, no se realizo una autopsia.

Tratamiento serologico inicial del paciente

El tratamiento inicial se realizo en febrero de 2013. Se realizo un ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFA) de acuerdo con el protocolo de incubacion estandar para los ensayos de IFA proporcionados por EUROIMMUN. Brevemente, se incubaron portaobjetos con criosecciones de 4 pm de tejidos cerebrales de mairnferos con el suero del paciente diluido 1:10 a 1:10.000 en PBS, Tween-20 al 0,2 % (regulador de muestra) durante 30 minutos a 25 °C. Despues de un lavado a fondo con regulador de muestra, el portaobjetos se incubo con anticuerpo anti-IgG humano conjugado con fluorescema-isotiocianato (FITC, EUROIMMUN) durante 30 minutos a 25 °C. Despues de otra etapa de lavado, los portaobjetos se inspeccionaron con un microscopio de fluorescencia. El cerebelo de rata y de primate mostraron fuertes tinciones de IgG tanto de la capa granular como molecular, pero no se observo tincion de las celulas de Purkinje (Figuras 1A y 1B). Se obtuvo una tincion intensa similar en todas las capas con cerebelo de porcino, mientras que se reconocio una tincion del neuropilo en el hipocampo de rata (Figuras 1C y 1D). La incubacion de las criosecciones del cerebro entero murino y de la hipofisis, el hipotalamo, el cerebro y la medula espinal de los primates revelo una tincion del neuropilo en todas las partes del cerebro sin caractensticas distintivas. Ademas, se tineron mieloma cardfaco, nervios mienterico y submucoso intestinal y las celulas parietales gastricas (Figuras 1E y 1F).

Analisis de inmunofluorescencia monoespedfica adicional (IFA) con celulas HEK293 que expresan recombinantemente autoantfgenos neuronales conocidos (Hu, Yo, Ri, CV2, PNMA1, PNMA2, DNER/Tr, MAG, MP0, GAD65, anfifisina, recoverina, receptor de GABA B, receptor de glicina, DPPX, aquaporin-4, receptor de NMDA, receptores de AMPA, LGI1, CASPR2) resultaron negativos. El analisis de la distribucion de subclases de IgG revelo una reactividad de IgG2 exclusiva.

Se analizo un suero de seguimiento a principios de agosto de 2013 seguido de un par de suero/LCE dos semanas mas tarde. Fue el mismo patron de reactividad que en la muestra de suero inicial.

Identificacion de ATPasa Na(+)/K(+) espedfica del cerebro como el autoantfgeno objetivo

La inmunoprecipitacion soportada en fase solida se realizo usando suero de paciente diluido 1:100 o sueros de controles sanos junto con criosecciones de cerebelo de rata o de cerdo.

Los inmunoprecipitados conteman grandes cantidades de IgG cuando se uso suero del paciente mientras que generalmente eran bajos despues de la incubacion del suero de los controles sanos (Figura 2A). Junto a las inmunoglobulinas, el suero del paciente inmunoprecipitado mostro bandas de protemas correspondientes a masas moleculares de aproximadamente 100 kDa y 50 kDa en SDS-PAGE tenidas con Coomassie coloidal (Figura 2A). Estas bandas estaban ausentes en las muestras de control. Las protemas de 100 kDa se identificaron como polipeptido alfa 3 ATPasa, transportador de Na+/K+, de rratus norvegicus (UNIPROT acceso # P06687) y sus scrofa (UNIPROT acceso # D2WKD7), respectivamente. Las protemas de 50 kDa se identificaron como la subunidad beta- 1 correspondiente de rratus norvegicus (UNIPROT acceso # P07340). Un conjunto representativo de datos de

espectrometna de masas se muestra en la Figura 3. Los datos clave obtenidos se muestran en la Tabla 1.

El analisis de transferencia Western con un anticuerpo monoclonal alfa-3 anti-ATPasa Na+/K+ mostro una fuerte reaccion a 100 kDa del inmunoprecipitado obtenido con el suero del paciente, mientras que no hubo reacciones con 5 las fracciones obtenidas con tres sueros de control (Figura 2B). Cuando se uso en IFA, el anticuerpo monoclonal alfa-3 anti-ATPasa Na+/K+ produjo patrones de fluorescencia que coincidfan con los generados por el suero del paciente (Figura 2C).

Como prueba de la correcta identificacion del antfgeno, todas las muestras de pacientes disponibles se analizaron 10 mediante IFA con HEK293 que expresaban ATP1A3 solamente o junto con ATP1B1 y/o ATP1G y con controles simulados transfectados (Figura 4A). Todas las muestras produjeron patrones de tincion caractensticos en celulas que expresan ATP1A3 independientemente del tipo de fijacion (acetona o formalina al 1.825 % (p/v)). La intensidad de fluorescencia fue mas alta cuando todas las subunidades se coexpresaron y cuando se evito la fijacion con formalina. Por el contrario, la expresion individual de ATP1B1 o ATp1G o transfeccion simulada no dio como 15 resultado ninguna union de anticuerpos. La congruencia del objetivo de autoanticuerpos del paciente y ATP1A3 se demostro adicionalmente por la abolicion competitiva dependiente de la dosis del anticuerpo que se une al tejido cerebral mediante fracciones de HEK293 que contienen ATP1A3 (Figura 4B). La union del anticuerpo no se vio afectada cuando se usaron fracciones comparables que conteman ATP1B1 o ATP1G individualmente.

20 Para analizar la especificidad del sustrato ATP1A3, 34 sueros de pacientes con diversos autoanticuerpos neuronales (anti-NMDAR, anti-Hu, anti-Yo, anti-Ri, anti-AQP4, anti-LGI1, anti-CASPR2) y 50 de donantes de sangre sanos tambien fueron analizados por IFA. Ninguno de los sueros produjo un patron de inmunofluorescencia similar al del mdice de muestras del paciente en el sustrato recombinante o en los diferentes tejidos del cerebro.

Claims (14)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para diagnosticar un smdrome neurologico paraneoplasico o un adenocarcinoma, que comprende la etapa de detectar en una muestra un autoanticuerpo que se une a la subunidad alfa 3 de la ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+).
2. 2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la muestra es un fluido corporal que comprende anticuerpos, fluido corporal que se selecciona del grupo que comprende sangre entera, suero, fluido cerebroespinal y saliva.
3. 3. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende la etapa de inmovilizar y detectar un complejo que comprende un polipeptido que comprende la subunidad alfa 3 de ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) o una variante que se une espedficamente a autoanticuerpos con la subunidad alfa 3 de ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) y un autoanticuerpo con la subunidad alfa 3 de ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+).
4. 4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende las etapas de

   a) poner en contacto una muestra lfquida que comprende autoanticuerpos con una forma inmovilizada de un polipeptido que comprende la subunidad alfa 3 de ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) o una variante de la misma que se une espedficamente a autoanticuerpos con la subunidad alfa 3 de ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) bajo condiciones compatibles con la formacion de un complejo que comprende dicho polipeptido y autoanticuerpo,

   b) eliminar la muestra lfquida, seguido de una o mas etapas de lavado y

   c) detectar el complejo formado en la etapa a).
5. 5. Un uso de un polipeptido que comprende la subunidad alfa 3 de ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) o una variante de la misma que se une espedficamente a autoanticuerpos con la subunidad alfa 3 de ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) para el diagnostico in vitro de un smdrome neurologico paraneoplasico o un adenocarcinoma.
6. 6. Un polipeptido aislado y/o recombinante que comprende la subunidad alfa 3 de ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) o una variante de la misma que se une espedficamente a autoanticuerpos con la subunidad alfa 3 de ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) para su uso en el tratamiento de un smdrome neurologico paraneoplasico o el diagnostico in vivo de un smdrome neurologico paraneoplasico o adenocarcinoma.
7. 7. Una composicion farmaceutica que comprende un polipeptido que comprende la subunidad alfa 3 de ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) o una variante de la misma que se une espedficamente a autoanticuerpos con la subunidad alfa 3 de ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) para su uso como medicamento.
8. 8. Un uso de un dispositivo de diagnostico que comprende un polipeptido que comprende una subunidad alfa 3 de ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) o una variante de la misma que se une espedficamente a autoanticuerpos con la subunidad alfa 3 de la ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) para el diagnostico in vitro de un smdrome neurologico paraneoplasico o un adenocarcinoma.
9. 9. Uso de un kit de prueba que comprende un polipeptido que comprende la subunidad alfa 3 de ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) o una variante de la misma que se une espedficamente a autoanticuerpos con la subunidad alfa 3 ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) para el diagnostico in vitro de un smdrome neurologico paraneoplasico o un adenocarcinoma.
10. 10. El uso de acuerdo con la reivindicacion 9, que comprende ademas un medio para detectar el complejo que comprende un autoanticuerpo para la subunidad alfa 3 de ATPasa neuronal humana que transporta Na(+)/K(+) y el polipeptido.
11. 11. El procedimiento o uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el smdrome neurologico paraneoplasico se caracteriza por dos o mas smtomas seleccionados del grupo que comprende trastorno de movimiento mixto, disminucion aguda del rendimiento visual, disartria y disfagia.
12. 12. El procedimiento o uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el polipeptido se proporciona en forma de una celula que comprende un acido nucleico que codifica dicho polipeptido o en la forma de un tejido que comprende dicho polipeptido.
13. 13. El procedimiento o uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 y 7 a 12, en el que en el polipeptido hay un polipeptido recombinante y/o purificado.
14. 14. El procedimiento o uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el polipeptido se inmoviliza en la superficie de un vehnculo seleccionado del grupo que comprende una placa de vidrio, un portaobjetos de vidrio, un biochip, una placa de microtitulacion, una perla, una columna de cromatograffa y una membrana.

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