CN112147324A - 自身抗体的检测 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含用于特异性地捕获与来自受试者的样品中的胞裂蛋白‑3特异性地结合的抗体的工具的诊断上有用的运载体、包括本发明的运载体的试剂盒、检测方法、药物组合物、本发明的运载体在制备用于诊断疾病的试剂盒中的用途和特异性地结合胞裂蛋白‑3的分离的人抗体。

Description

自身抗体的检测

发明领域

本发明涉及包含用于特异性地捕获与来自受试者的样品中的胞裂蛋白-3(Septin-3)特异性地结合的抗体的工具的诊断上有用的运载体、包括本发明的运载体的试剂盒、检测方法、药物组合物、本发明的运载体在制备用于诊断疾病的试剂盒中的用途和特异性地结合胞裂蛋白-3的分离的人抗体。

发明背景

缓解神经***疾病是生物医学科学中的一项持续的挑战，这在较大程度上是因为极其多样的原因(包括基因遗传疾病、药物滥用、营养不良、感染、损伤、精神性疾病、免疫缺陷和癌症)可以导致所遇到的许多症状。

由于神经***疾病很少与临床症状的独特的特征性模式相关联，所以通常难以仅基于受影响的受试者的观察和检查或者其医疗史来提供对受试者是否发展神经***疾病的风险增加的可靠的评估。

早期评估的重要性怎么强调都不为过。许多神经***病症(最显著地，阿尔茨海默病和帕金森病以及多发性硬化)不能被治愈，但是可以用于减缓其进展的药物是可得的。此外，某些罕见类型的癌症与神经***症状有关。评估得越早，为了患者的充分益处而利用可获得的治疗谱并理想地预防疾病的发生的机会就越好。

这在与自身抗体相关的神经***疾病的情况下更是如此。在一些情况下，特异性的可检测的自身抗体与病况之间的关联足够强从而允许进行即时评估。如果在疾病发作前很好地检测到自身抗体，这可允许医生应用免疫抑制药物，这可阻止自身抗体与身体自身结构和分子的相互作用并预防疾病。

与自身抗体的出现相一致的神经***病况的实例包括：视神经脊髓炎(一种以视觉感知和脊髓功能的丧失为特征的疾病)和抗-NMDA受体脑炎(其与自主神经功能障碍相关)、通气不足、小脑性共济失调、轻偏瘫、意识丧失或紧张症。虽然自身抗体的参与和这些病况本身的性质以前了解得很少，但是由于基于自身抗体检测的测定的可得性，此类疾病中的许多的风险现在能够被评估和有效地处理。

因此，最重要的是开发新的方法来区分与自身抗体相关的神经***病况和非自身抗体相关的神经***病况并且评估患者发展该疾病的风险。

发明内容

本发明涉及针对胞裂蛋白-3的自身抗体和基于它们的检测的测定。就本发明人所知，在现有技术中尚未报道针对胞裂蛋白-3的自身抗体的存在，更不用说它们的有用性。许多公司已经商业化了与胞裂蛋白-3结合的重组抗体，包括Santa Cruz Biotechnology和Abcam。

作为本发明之基础的问题是提供新的试剂、装置和方法，其可以用于评估受试者是否易于发展自身免疫疾病(优选神经***或与神经***疾病或神经***症状相关的自身免疫疾病或癌症，更优选副肿瘤综合征(PNS)，并且甚至更优选地选自小脑性共济失调、纵向广泛性脊髓炎、偏头痛、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、小脑综合征、黑素瘤和癌(carcinoma)的一种或多种疾病。

作为本发明之基础的另一个问题是提供新的试剂、装置和方法，其可以用于区分自身免疫疾病(特别是神经***自身免疫疾病，更优选地选自包含PNS、小脑性共济失调、纵向广泛性脊髓炎、偏头痛、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和小脑综合征的组)和除了自身免疫疾病之外的疾病(例如与神经***症状相关的感染)，而不只是为了确定最有希望的治疗方案，更具体地，确定免疫抑制治疗是否适度，优选地最好在疾病发作之前。

作为本发明之基础的问题通过所附的独立权利要求和从属权利要求的主题而得到解决。

在第一方面，该问题通过诊断上有用的运载体来解决，所述运载体包含用于特异性地捕获与受试者样品中的胞裂蛋白-3特异性地结合的抗体的工具。

在第二方面，该问题通过试剂盒来解决，所述试剂盒包含诊断上有用的运载体，其中所述试剂盒包含校准器、洗涤缓冲液和/或用于检测IgG抗体的工具。

在第三方面，该问题通过方法来解决，所述方法包括检测受试者样品中针对胞裂蛋白-3的抗体的存在或不存在的步骤。

在第四方面，该问题通过包含胞裂蛋白-3或其变体的药物组合物来解决。

在第五方面，该问题通过本发明的运载体在制备用于诊断疾病的试剂盒中的用途来解决，其中所述疾病是神经***自身免疫疾病、复发性晕厥和/或癌症(cancer)。

在第六方面，该问题通过与胞裂蛋白-3特异性地结合的分离的人抗体来解决。

在优选实施方案中，抗体不与胞裂蛋白-1、胞裂蛋白-2、胞裂蛋白-4、胞裂蛋白-5、胞裂蛋白-6、胞裂蛋白-7、胞裂蛋白-8、胞裂蛋白-9、胞裂蛋白-10、胞裂蛋白-11和/或胞裂蛋白-12结合。

在优选实施方案中，特异性地捕获抗体的工具是重组和纯化的胞裂蛋白-3或其变体或者表达胞裂蛋白-3或其变体的真核细胞。

在本发明的优选实施方案中，特异性地捕获与胞裂蛋白-3特异性地结合的抗体的工具是(a)包含胞裂蛋白-3、胞裂蛋白-5、胞裂蛋白-6、胞裂蛋白-7和胞裂蛋白-11或所述胞裂蛋白蛋白质的变体的重组和纯化的复合物；或者(b)表达包含胞裂蛋白-3、胞裂蛋白-5、胞裂蛋白-6、胞裂蛋白-7和胞裂蛋白-11或所述胞裂蛋白蛋白质的变体的复合物的真核细胞。

在优选实施方案中，疾病是PNS，优选地与选自包含小脑性共济失调、纵向广泛性脊髓炎、偏头痛、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和/或小脑综合征的组的病况相关。在另一个优选实施方案中，疾病选自包含与小脑性共济失调、纵向广泛性脊髓炎、偏头痛、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和/或小脑综合征相关的PNS和肿瘤的组，更优选黑素瘤和/或癌。在优选实施方案中，疾病是癌症，优选地来自包含癌、肉瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、黑素瘤、生殖细胞肿瘤和白血病的组。在更优选实施方案中，癌症是黑素瘤或癌，更优选肺癌。

在一个优选的实施方案中，该疾病是复发性晕厥。如本文所用的术语“复发性晕厥”包括所有类型的晕厥，例如神经介导的晕厥(包括但不限于血管迷走神经性晕厥和情景性晕厥)，心脏介导的晕厥(包括由以下引起的晕厥：心律不齐、阻塞性心脏病变、结构性心肺疾病和其他心脏原因例如病态窦房结综合征、亚当斯-斯托克斯综合征、锁骨下窃血综合征、主动脉夹层和肺栓塞)，血压引起的晕厥(例如***性(姿势性)降压性晕厥)，中枢神经***缺血引起的晕厥(例如椎基底动脉疾病引起的晕厥)和其他原因引起的晕厥，例如运动性癫痫病介导的晕厥和热晕厥。

在优选实施方案中，使用样品实施本发明，所述样品是或包含体液，所述体液包含抗体，优选地选自包含全血、血浆、血清、脑脊液和唾液的组。

在优选实施方案中，使用选自包含以下的组的技术来检测自身抗体或复合物：免疫扩散技术，免疫电泳技术，光散射免疫测定，凝集技术，标记的免疫测定例如来自包含放射性标记的免疫测定、酶免疫测定，更优选ELISA、优选地电化学发光免疫测定和免疫荧光，优选间接免疫荧光。

在优选实施方案中，运载体选自包含以下的组：载玻片，优选用于显微镜术，生物芯片，微量滴定板，侧向流动装置，测试条，膜，优选线性斑点印迹(line blot)，色谱柱和珠，优选磁珠或荧光珠。

在优选的实施方案中，变体包含SEQ ID NO：5所示的多肽序列。

本发明基于发明人的令人惊讶的发现，即存在针对胞裂蛋白-3的自身抗体并且可以在来自许多患有神经***病况和/或癌症病况的患者的样品中检测到，但不能在从健康受试者获得的样品中检测到。

此外，本发明基于发明人的令人惊讶的发现，即新型神经***疾病和/或癌症与检测针对胞裂蛋白-3的自身抗体相关。

不希望受任何理论束缚，此类自身抗体的存在表明胞裂蛋白-3和/或下游效应子的功能在具有此类自体抗体的患者中受损，从而发生神经***症状或癌症。

胞裂蛋白-3(40.704kDa，358个氨基酸)与胞裂蛋白-1、胞裂蛋白-2、胞裂蛋白-4、胞裂蛋白-5、胞裂蛋白-6、胞裂蛋白-7、胞裂蛋白-8、胞裂蛋白-9、胞裂蛋白-10、胞裂蛋白-11和胞裂蛋白-12一起是胞裂蛋白家族的成员。这些蛋白质是形成纤维丝的细胞骨架GTP酶，其具有核苷酸结合和GTP酶活性。作为本发明自身抗体的优选靶标以及用于本发明的用途和方法的优选工具的人、小鼠、大鼠和猪的胞裂蛋白-3的序列分别如SEQ ID No.1至4所示。

多种研究表明，不同亚组的胞裂蛋白能够结合以形成具有可变组成的复合物，并且这些复合物组装成纤维丝和更高级结构。大多数胞裂蛋白在C-末端呈现这样的序列，预测其形成卷曲螺旋并且已被建议介导胞裂蛋白-胞裂蛋白相互作用，从而控制纤维丝形成。胞裂蛋白的中心核心由鸟嘌呤-核苷酸(GTP)结合结构域形成，其共享至少三个展示GTP酶的P环的保守基序。通常，已显示结合膜磷脂的多碱基区域存在于N-末端和GTP结合结构域之间的界面处。

本发明涉及包含哺乳动物、优选人多肽的多肽，其选自胞裂蛋白-3或与结合胞裂蛋白-3的自身抗体具有反应性的抗原性变体。哺乳动物胞裂蛋白-3包括来自人、猴、小鼠、大鼠、兔、豚鼠或猪，优选人的同源物。

在更优选实施方案中，胞裂蛋白-3是由SEQ ID NO.1(UniProtKB参考号：Q9UH03；由NM_145734、NM_019106、NM_145733或NM_001363845编码)编码的多肽。在整个本申请中，所引用的任何数据库代码均指Uniprot数据库，更具体地是本申请或其最早优先权申请的申请日期的版本。

本发明的教导不仅可以通过使用多肽，特别是包含例如胞裂蛋白-3的多肽的天然序列的多肽，或具有在本申请中明确地(例如通过功能、名称、序列或登录号)或隐含地提到的准确序列的核酸来实施，而且可以通过使用这样的多肽或核酸的变体来实施。

在优选实施方案中，本文所使用的术语“变体”可以是指所提到的全长序列的至少一种片段，更具体地一种或多种相对于全长序列而言在一个或两个末端处截短了一个或多个氨基酸的氨基酸或核酸序列。这样的片段包含或编码具有原始序列或其变体的至少6、7、8、10、12、15、20、25、50、75、100、150或200个连续氨基酸的肽。变体的总长度可以为至少或不超过6、7、8、9、10、11、12、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、350、400、500、750、1000或更多个氨基酸。在更优选的实施方案中，变体是包含SEQ ID NO:5所示序列的多肽。

术语“变体”不仅是指至少一种片段，而且还是指这样的多肽或其片段，所述多肽或其片段包含与所提到的参考氨基酸序列或其片段具有至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列，其中删除或置换除了对于生物学活性(例如，抗原结合(自身)抗体的能力)或者多肽的折叠或结构来说必需的那些氨基酸之外的其他氨基酸，和/或以保守的方式替换一个或多个这样的必需氨基酸和/或添加氨基酸，从而使得多肽的生物学活性得到保留。现有技术包括可以用于比对两个给定核酸或氨基酸序列并计算同一性程度的各种不同的方法，参见例如ArthurLesk(2008),Introduction to bioinformatics,Oxford University Press,2008,3^rdedition。在优选实施方案中，使用ClustalW软件(Larkin,M.A.,Blackshields,G.,Brown,N.P.,Chenna,R.,McGettigan,P.A.,McWilliam,H.,Valentin,F.,Wallace,I.M.,Wilm,A.,Lopez,R.,Thompson,J.D.,Gibson,T.J.,Higgins,D.G.(2007).Clustal W and Clustal Xversion 2.0.Bioinformatics,23,2947-2948)，其中采用缺省设置。

在优选实施方案中，所述变体是线性、非折叠的多肽，其任选为变性的。

在优选实施方案中，所述多肽和其变体还可以包含化学修饰，例如同位素标记，或者共价修饰例如糖基化、磷酸化、乙酰化、脱羧、瓜氨酸化、甲基化、羟基化等等。本领域技术人员熟悉修饰多肽的方法。对任何修饰如此地进行设计，从而使得其不消除变体的生物学活性。

此外，变体还可以通过与其他已知多肽或其变体相融合来产生，并且包含具有活性的部分或结构域，优选地，所述具有活性的部分或结构域当与参考序列的具有活性的部分进行比对时，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，其中本文所使用的术语“具有活性的部分”是指比全长氨基酸序列短的氨基酸序列，或在核酸序列的情况下编码比全长氨基酸序列短的氨基酸序列，和/或是天然序列的变体，但保留了至少一些生物学活性。

在优选实施方案中，术语核酸的“变体”包括这样的核酸，所述核酸的互补链与参考核酸或野生型核酸杂交，优选在严紧条件下杂交。杂交反应的严紧性是本领域普通技术人员可容易地确定的，并且通常是取决于探针长度、洗涤温度和盐浓度的根据经验的计算。通常，较长的探针需要较高的用于适当退火的温度，而较短的探针则需较低的温度。杂交通常取决于变性的DNA与在环境中存在的互补链在低于其解链温度的温度下再退火的能力：探针和可杂交序列之间的所希望的同源性程度越高，可以使用的相对温度就越高。因此，较高的相对温度将会倾向于使反应条件更严紧，而较低的反应温度将会更不严紧。关于杂交反应的严紧性的另外的细节和解释，参见Ausubel,F.M.(1995),Current Protocols inMolecular Biology.John Wiley&Sons,Inc。此外，本领域技术人员可以遵循在手册Boehringer Mannheim GmbH(1993)The DIG System Users Guide for FilterHybridization,Boehringer Mannheim GmbH,Mannheim,Germany中和在Liebl,W.,Ehrmann,M.,Ludwig,W.,and Schleifer,K.H.(1991)International Journal ofSystematic Bacteriology 41:255-260中所给出的关于如何借助于杂交来鉴定DNA序列的指导。在优选实施方案中，将严紧条件应用于任何杂交，即只有如果探针与靶序列具有70％或更高的同一性的情况下，杂交才出现。相对于靶序列而言具有较低的同一性程度的探针可以杂交，但此类杂交体是不稳定的并且将会在严紧条件下的洗涤步骤中被去除，例如降低盐浓度至2×SSC或，任选地和随后，至0.5×SSC，而温度为(以优选度渐增的顺序)大约50℃-68℃，大约52℃-68℃，大约54℃-68℃，大约56℃-68℃，大约58℃-68℃，大约60℃-68℃，大约62℃-68℃，大约64℃-68℃，大约66℃-68℃。在特别优选实施方案中，温度为大约64℃-68℃或大约66℃-68℃。可以调节盐浓度至0.2×SSC，或甚至0.1×SSC。可以分离出具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的相对于参考序列或野生型序列而言的同一性程度的核酸序列。在优选实施方案中，本文所使用的术语核酸序列的变体是指任何这样的核酸序列，其按照遗传密码的简并性而编码与参考核酸序列所编码的相同的氨基酸序列及其变体。

该多肽的变体具有生物学活性。在优选实施方案中，这样的生物学活性是与结合胞裂蛋白-3的自身抗体特异性地结合的能力，如在患有与这样的自身抗体相关，优选与神经***疾病或病况例如PNS相关的自身免疫疾病的患者中发现的。例如，可以通过确定目标变体是否与来自患者样品的自身抗体(所述自身抗体结合野生型胞裂蛋白-3)结合来检查胞裂蛋白-3的变体是否具有这样的生物学活性，优选如本申请实验部分中所述的使用大鼠海马或小脑的间接免疫荧光所确定的。

在优选实施方案中，胞裂蛋白-3的变体是缺乏相应天然存在的野生型蛋白质的C末端的至少21、至少20、至少15、至少10、至少5、至少4、至少3、至少2或1个氨基酸的哺乳动物胞裂蛋白-3。在更优选实施方案中，胞裂蛋白-3的变体是根据SEQ ID No.1的人胞裂蛋白-3的氨基酸1至337或通过序列比对确定的任何其他哺乳动物物种的相应序列。在更优选的实施方案中，变体是包含SEQ ID NO:5所示序列的多肽。

当用于实施本发明的教导时，根据本发明的任何多肽可以以任何形式和以任何纯化程度来提供，从以内源形式包含所述多肽的液体样品、组织或细胞，更优选地，过表达所述多肽的细胞，此类细胞的粗制的或经富集的裂解物，直至经纯化的和/或分离的多肽，其任选地是基本上纯的。在优选实施方案中，所述多肽是天然多肽，其中本文所使用的术语“天然多肽”是指经折叠的多肽，更优选是指从组织或细胞中，更优选从哺乳动物细胞或组织中，任选地从非重组的组织或细胞中纯化出的经折叠的多肽。在另一优选实施方案中，所述多肽是重组的蛋白质，其中本文所使用的术语“重组的”是指通过使用基因工程方法在生产过程的任何阶段而产生的多肽，例如通过将编码所述多肽的核酸与用于在细胞或组织中过表达的强启动子相融合或者通过改造所述多肽本身的序列。本领域技术人员熟悉用于改造核酸和所编码的多肽的方法(例如，在Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989),Molecular Cloning,CSH中或在Brown T.A.(1986),Gene Cloning–anintroduction,Chapman&Hall中所描述的)和用于产生和纯化天然或重组多肽的方法(例如，由GE Healthcare Life Sciences公开的手册“Strategies for ProteinPurification”,“Antibody Purification”,“Purifying Challenging Proteins”(2009/2010)，其在Burgess,R.R.,Deutscher,M.P.(2009),Guide to Protein Purification中)。在优选实施方案中，如果在各自样品中至少60％、70％、80％、90％、95％或99％的多肽由所述多肽组成，如通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳以及随后的考马斯蓝染色和可视化检定所判断的，则多肽是纯的。

如果本发明的多肽以组织的形式来提供，那么优选的是，所述组织为哺乳动物组织，例如人、大鼠、灵长类、驴、小鼠、山羊、马、绵羊、猪或奶牛，更优选脑组织，最优选小脑。如果使用细胞裂解物，那么优选的是，所述细胞裂解物包含与细胞表面相关的膜或者实际上是膜中富集的级分。如果所述多肽以重组细胞的形式来提供，那么优选的是，所述重组细胞为真核细胞例如酵母细胞，更优选来自多细胞真核生物例如植物、哺乳动物、蛙或昆虫，最优选来自哺乳动物例如大鼠、人、灵长类、驴、小鼠、山羊、马、绵羊、猪或奶牛的细胞。

用于实施本发明教导的多肽(包括任何变体)优选设计为使得其包含至少一个表位，所述表位由与胞裂蛋白-3结合的自身抗体识别和/或特异性地结合与胞裂蛋白-3结合的自身抗体。与除了针对胞裂蛋白-3的自身抗体以外的抗体相比，任何表位更优选是仅由这种自身抗体识别的表位。在一个实施方案中，此类多肽包含分别来自胞裂蛋白-3的6、7、8、9、10、11、12、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个、优选至少9个但不超过16个连续氨基酸。本领域技术人员熟悉用于设计具有足够的免疫原性的肽的指导方针，例如在Jackson,D.C.,Fitzmaurice,C.J.,Brown,L.E.,Zeng,W.(1999),

Preparation and properties of totally synthetic immunogenes,Vaccine,第18卷,第3-4期,1999年9月,第355-361页；和Black,M.,Trent,A.,Tirrell,M.和Olive,C.(2010),Advances in the design and delivery of peptide subunit vaccines with afocus on Toll-like receptor agonists,Expert Rev Vaccines,2010年2月,9(2):157-173中所描述的那些。简而言之，期望的是，肽尽可能多地满足下列要求：(a)它具有高的亲水性程度；(b)它包含选自包含天冬氨酸、脯氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的组的一个或多个残基；(c)为了更高的特异性，它与其他已知的肽或多肽不具有同源性或具有很低的同源性；(d)它需要是足够可溶的；和(e)它不包含糖基化或磷酸化位点，除非由于特殊原因而需要。或者，可以遵循生物信息学方法，例如由Moreau,V.,Fleury,C.,Piquer,D.,Nguyen,C.,Novali,N.,Villard,S.,Laune,D.,Granier,C.和Molina,F.(2008),PEPOP:Computationaldesign of immunogenic peptides,BMC Bioinformatics 2008,9:71所描述的那些。

当根据本发明使用时，可以以任何种类的构象提供本发明多肽。例如，所述多肽可以是基本上未折叠的、部分折叠的或完全折叠的多肽。在优选实施方案中，所述多肽在这样的意义上进行折叠，即对于与本发明的自身抗体的结合来说必需的表位，或者该蛋白质或其变体以其整体，采取由天然蛋白质在其天然环境中所采取的折叠。本领域技术人员熟悉适合于测定多肽是否是折叠的，和如果是折叠的，那么它具有哪种结构的方法，例如有限蛋白酶解、核磁共振波谱、圆二色光谱或X射线晶体学(参见例如Banaszak L.J.(2008),Foundations of Structural Biology,Academics Press；或Teng Q.(2013),StructuralBiology:Practical Applications,Springer)，优选地，使用圆二色光谱。

本发明的多肽可以是融合蛋白，其包含除了取自胞裂蛋白-3的那些之外的其他氨基酸序列，特别是C-末端或N-末端标签，优选C-末端标签，其在优选实施方案中如本文所使用的为具有功能的额外的序列基元或多肽，其具有一些生物学或物理功能和可以例如用于纯化、固定化、沉淀或鉴定本发明的多肽。在更优选实施方案中，所述标签是能够与配体特异性地结合的序列或结构域，例如选自包含以下的组：His标签、硫氧还蛋白、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶的标签、荧光标签，其例如选自包含绿色荧光蛋白的组。

本发明的多肽可以是经固定化的多肽。在优选实施方案中，本文所使用的术语“经固定化的”是指结合至在水溶液中不可溶的固体载体的分子，更优选通过共价键、静电相互作用、包囊或包载(例如通过使球状多肽在凝胶中变性)，或通过疏水相互作用，最优选通过一个或多个共价键。各种不同的合适载体，例如纸、聚苯乙烯、金属、硅或玻璃表面、微流控通道、膜、珠粒例如磁珠、柱色谱法介质、生物芯片、聚丙烯酰胺凝胶等等，已在文献中进行了描述，例如在Kim,D.和Herr,A.E.(2013),Protein immobilization techniques formicrofluidic assays,Biomicrofluidics 7(4),041501中。如此，可以以直截了当的方式将经固定化的分子连同不可溶的载体一起与水溶液分开，例如通过过滤、离心或滗析。经固定化的分子可以是以可逆或不可逆的方式进行固定化的。例如，如果分子与载体通过可以经由添加高浓度的盐而掩蔽的离子相互作用来进行相互作用，或如果分子通过可裂开的共价键例如二硫桥(其可以通过添加含巯基的试剂来进行裂开)进行结合，那么固定化是可逆的。相反地，如果分子通过不能在水溶液中裂开的共价键(例如，通过经常用于将赖氨酸侧链偶联至亲和柱的环氧化物基团和胺基团的反应而形成的键)而拴系至载体，那么固定化是不可逆的。蛋白质可以间接地进行固定化，例如通过使抗体或其他对于该分子具有亲和力的实体固定化，随后是复合物的形成，以致于分子-抗体复合物被固定化。各种不同的用于使分子固定化的方式描述在文献中，例如在Kim,D.,Herr和A.E.(2013),Proteinimmobilizsation techniques for microfluidic assays,Biomicrofluidics7(4),041501中。另外，各种不同的用于固定化反应的试剂和试剂盒是商购可得的，例如购自Pierce Biotechnology。

必要的是，用于检测根据本发明的自身抗体的溶液或样品包含抗体，其也称为免疫球蛋白。典型地，体液样品包含代表性的一全套受试者的免疫球蛋白。但是，一旦提供了，可以使样品或溶液经历进一步的加工，其可以包括分级分离、离心、富集或分离受试者的全体免疫球蛋白或任何免疫球蛋白类别，这可以影响各种不同类别的免疫球蛋白的相对分布。

在本申请全文中所描述的试剂、装置、方法和用途可以用于鉴定患病风险增加的受试者。在优选实施方案中，所述疾病为神经***疾病。在更优选实施方案中，本文所使用的术语“神经***疾病”是指任何与神经***的缺陷相关的疾病，在另一优选实施方案中，如本文所用，术语“PNS”(副肿瘤性神经综合征的缩写)是指由于存在肿瘤而间接引起的全身性病症，例如由于物质如通常不产生的激素或细胞因子的产生释放通过肿瘤起源的细胞或以增加的浓度产生或产生和释放生物活性细胞。这种全身性病症可以通过包括小脑性共济失调、纵向广泛性脊髓炎、偏头痛、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)或小脑综合征的多种病况揭示。PNS的任何表现都表明应该彻底检查患者是否存在肿瘤，尽管肿瘤可能太小而无法检测。

在许多情况下，单纯的检测(换言之，确定是否存在可检测水平的抗体)对于评估来说是足够的。如果能够检测到自身抗体，那么这将是对于临床医师来说有帮助的信息，并且指明了患者将罹患疾病的增加的可能性。在优选实施方案中，如果可以使用选自包含免疫沉淀、间接免疫荧光、ELISA或线性斑点印迹的组、优选间接免疫荧光的一种或多种方法检测自身抗体，则该自身抗体被认为是可检测的。在优选实施方案中，可以测定相比于在平均健康受试者中可以发现的水平而言的在血清中抗体的相对浓度。尽管在许多情况下测定自身抗体在样品中是否存在或可检测可以是足够的，但是为了获得对于诊断来说有帮助的信息而实施的方法可以包括测定浓度是否是在平均健康受试者中所发现的浓度的至少2倍，优选5、10、20、25、50、100、200、500、1000、10000或100000倍。在优选实施方案中，使用选自包含半定量免疫沉淀、半定量间接免疫荧光、ELISA或半定量线性斑点印迹的组的一种或多种方法，优选ELISA测定自身抗体的相对浓度。实验细节在本申请的实验部分中描述，或者如在本申请的优先权日期可获得的教科书或实践手册中所述。

本领域技术人员将会意识到，临床医师通常并不仅仅基于单一的参数来对患者受试者是否将可能罹患疾病、病况或病症作出结论，而是需要考虑其他方面，例如其他自身抗体、标志物的存在、血液参数、任何症状的临床评估或者医学成像或其他非侵入性方法(例如，多导睡眠描记法)。参见Baenkler H.W.(2012),General aspects of autoimmunediagnostics,Renz,H.,Autoimmune diagnostics,2012,de Gruyter，第3页。根据本发明的试剂或方法的价值也可以在于可能排除一种疾病的发展。在优选实施方案中，贯穿本申请提及的任何症状或疾病的含义与本领域技术人员理解的一致，如本申请的申请日或优选最早的优先权日，如由教科书和科学出版物证明的。

本发明的方法、多肽或用途(其任选地用于确定是否可能发展疾病)可以包括：获得包含抗体的样品或溶液，优选地从人患者，测定是否存在与胞裂蛋白-3结合的自身抗体，其中所述测定通过下述方式来进行，使样品与本发明的多肽相接触并检测在所述多肽和所述自身抗体之间是否出现结合，优选通过使用经标记的二抗来进行检测，其中所述自身抗体如果存在于样品中则与所述多肽相结合；和如果测定到自身抗体存在于样品或溶液中，则将患者评估为更可能罹患所述疾病。

本发明涉及包含与本发明的多肽相结合的抗体(优选地，自身抗体)的复合物。作为用于鉴定发展疾病的风险升高的受试者的方法的一部分，可以使用或检测这样的复合物。如果待检测针对胞裂蛋白-3的自身抗体，来自受试者的包含抗体的液体样品可以用于实施所述方法。这样的液体样品可以是任何来自受试者的包含具有代表性的一组抗体的体液，优选来自受试者的包含免疫球蛋白类别的抗体的样品，所述免疫球蛋白类别选自包含IgG、IgA和IgM类别抗体的组，优选IgG，更优选IgG1和IgG2，更优选IgG1。例如，样品可以是脑脊液(CSF)、血液或血清、淋巴、组织液，优选是血清或CSF，更优选是血清。它优选是离体样品。

使包含抗体的液体样品或溶液与本发明的多肽相接触的步骤可以通过下述方式来进行：在包含抗体的样品或溶液存在下，在与包含各自多肽和结合本发明多肽的抗体(优选自身抗体)的复合物形成相容的条件下，孵育固定化形式的所述多肽。随后，可以移除在那时耗尽了与本发明的多肽相结合的抗体的液体样品或溶液，接着是一个或多个洗涤步骤。最后，可以检测包含所述抗体和所述多肽的复合物。在优选实施方案中，术语“与复合物形成相容的条件”是这样的条件，其允许特异性的抗原-抗体相互作用从而建立包含所述多肽和所述抗体的复合物。在优选实施方案中，此类条件可以包括将所述多肽在于PBS缓冲液中以1:100稀释的样品中在25℃下孵育30分钟。在优选实施方案中，本文所使用的术语“自身抗体”是指与产生所述自身抗体的动物(优选哺乳动物)的内源性分子特异性地结合的抗体，其中此类抗体的水平更优选相比于任何与此类内源性分子特异性地结合的其他抗体的平均值而言是升高的。在最优选实施方案中，所述自身抗体为与胞裂蛋白-3相结合的自身抗体。

根据本发明的方法优选为体外方法。

在优选实施方案中，用于根据本发明的预后、评估、鉴定、方法或测试试剂盒的复合物的检测包括使用选自包含以下的组的方法：免疫扩散技术，免疫电泳技术，光散射免疫测定，凝集技术，标记免疫测定例如选自包含放射性标记免疫测定、酶免疫测定、优选ELISA、化学发光免疫测定和免疫荧光、优选间接免疫荧光技术的组的那些。本领域技术人员熟悉这些方法，其也描述在现有技术中，例如在Zane,H.D.(2001),Immunology–Theoretical&Practical Concepts in Laboratory Medicine,W.B.Saunders Company中，在第14章中。

备选地，可以使用除了液体样品之外的包括包含本发明多肽的组织的样品。所述组织样品优选来自表达内源性的胞裂蛋白-3的组织，优选以与相应生物体、优选人体中的平均组织相比增加的水平表达所述多肽。然后，可以使这样的样品(其可以以固定在载体例如用于显微分析的载玻片上的组织切片的形式)与结合本发明多肽的本发明抗体(优选自身抗体)相接触。优选地，对所述抗体进行标记以允许与结合本发明多肽的内源性抗体相区分，从而使得可以对新形成的复合物进行检测，和任选地进行定量。如果所形成的复合物的量低于在取自健康受试者的样品中所发现的量，那么受检查样品所取自的受试者可能罹患疾病。

可以将任何证明包含抗体和本发明多肽的复合物存在或不存在的数据与参考数据相关联。例如，检测到所述复合物指示，提供所分析样品的患者在未来可能罹患疾病。如果患者正在被治疗并且再次运行用于获得在诊断上有关的信息的方法，那么可以将在这两次运行中检测到的复合物的量相关联以获悉有关疾病进展和/或治疗成功的信息。

在另一优选实施方案中，按照本发明教导的预后、评估、鉴定、方法或测试试剂盒考虑使用间接免疫荧光。本领域技术人员熟悉此类技术和合适样品的制备，其描述在现有技术(US4647543；Voigt,J.,Krause,C.,

E,Saschenbrecker,S.,Hahn,M.,Danckwardt,M.,Feirer,C.,Ens,K,Fechner,K,Barth,E,Martinetz,T.和

W.(2012),Automated Indirect Immunofluorescence Evaluation of AntinuclearAutoantibodies on HEp-2 Cells,”Clinical and Developmental Immunology,vol.2012,doi:10.1155/2012/65105；Bonilla,E.,Francis,L.,Allam,F.et al.,Immuno-fluorescence microscopy is superior to fluorescent beads for detection ofantinuclear antibody reactivity in systemic lupus erythematosus patients,Clinical Immunology,vol.124,no.1,pp.18–21,2007)中。合适的试剂、装置和软件包是商购可得的，例如购自EUROIMMUN,Lübeck,Germany。

可以对样品进行测试以仅确定是否存在与胞裂蛋白-3结合的自身抗体，但是优选方法、测试、装置等考虑确定是否存在针对一种或多种其他多肽的自身抗体，优选与神经***自身免疫疾病相关，优选地选自包含以下的组，更优选地来自以下的组的全部：Hu、Yo、Ri、CV2、PNMA1、PNMA2、DNER/Tr、ARHGAP26、ITPR1、ATP1A3、NBC1、神经软骨蛋白、CARPVIII、Zic4、Sox1、Ma、MAG、MP0、MBP、GAD65、双载蛋白、恢复蛋白、GABA A受体(EP13189172.3)、GABA B受体(EP2483417)、甘氨酸受体、桥蛋白(gephyrin)、IgLON5(US2016/0349275)、DPPX(US2015/0247847)、水孔蛋白-4、MOG、NMDA受体、AMPA受体、GRM1、GRM5、LGI1、VGCC和mGluR1和CASPR2，该抗原优选是经固定化的，例如固定在医学装置例如线性斑点印迹上。已经在现有技术中描述了可以另外检测针对相关标志物神经软骨蛋白(EP15001186)、ITPR1(EP14003703.7)、NBC1(EP14003958.7)、ATP1A3(也称为人神经元Na(+)/K(+)ATP酶的α3亚基(EP14171561.5))、Flotillin1/2(EP3101424)、NSF、STX1B和VAMP2(EP17001205.8)和RGS8(EP17000666.2)的一种或多种(优选全部的)自身抗体。

根据本发明的教导，提供与本发明的多肽相结合的抗体、优选自身抗体用于评估或鉴定。本领域技术人员熟悉用于纯化抗体的方法，例如在Hermanson,G.T.,Mallia,A.K.和Smith,P.K.(1992),Immobilized Affinity Ligand Techniques,San Diego:AcademicPress中所描述的那些方法。简而言之，将与目的抗体(其抗原是本发明的多肽)特异性地结合的抗原固定化，并用于经由亲和色谱来从适当的来源中纯化出目的抗体。来自罹患由发明人所鉴定的神经***病症的患者的包含抗体的液体样品可以用作来源。

根据本发明，提供能够与胞裂蛋白-3特异性地结合的抗体，例如自身抗体。反之亦然，胞裂蛋白-3的变体特异性地结合与胞裂蛋白-3特异性地结合的自身抗体。在优选实施方案中，本文所使用的术语“抗体”是指任何基于免疫球蛋白的结合部分，更优选包含至少一个免疫球蛋白重链和至少一个免疫球蛋白轻链的结合部分，其包括但不限于单克隆和多克隆抗体以及抗体的变体，特别是片段，所述结合部分能够与各自的抗原相结合，更优选与之特异性地结合。在优选实施方案中，本文所使用的术语“特异性地结合”或“特异性地捕获”表示，所述结合比以1×10^-5M，更优选1×10^-7M，更优选1×10^-8M，更优选1×10^-9M，更优选1×10^-10M，更优选1×10^-11M，更优选1×10^-12M的解离常数为特征的结合反应更强，所述解离常数通过使用Biacore设备在25℃下在pH 7的PBS缓冲液中通过表面等离子体共振来测定。所述抗体可以是自身抗体制备物的一部分，所述自身抗体制备物是异源的或可以是同源的自身抗体，其中异源制备物包含许多不同的自身抗体种类，如通过从人供者血清进行制备而可获得的，例如通过使用经固定化的抗原进行亲和层析以纯化任何能够与所述抗原相结合的自身抗体。所述抗体可以是经糖基化的或非糖基化的。本领域技术人员熟悉可以用于鉴定、产生和纯化抗体及其变体的方法，例如在EP 2 423 226A2以及其中的参考文献之中所描述的那些方法。

本发明提供了用于分离与胞裂蛋白-3结合的自身抗体的方法，其包括下列步骤：a)使包含该抗体的样品与本发明的多肽相接触，从而形成复合物，b)分离在步骤a)中形成的复合物，c)解离在步骤b)中分离的复合物，和d)将该抗体与本发明的多肽分开。可以将来自罹患由发明人所鉴定的新的神经***病症的患者的样品用作抗体的来源。合适的方法描述在现有技术中，例如在由GE Healthcare Life Sciences公开的手册“Affinitychromatography”、“Strategies for Protein Purification”和“AntibodyPurification”(2009/2010)中，和在Philips,Terry,M.,Analytical techniques inimmunochemistry,1992,Marcel Dekker,Inc中。

本发明提供了包含本发明的多肽的药物组合物，所述组合物优选适合于向受试者，优选哺乳动物受试者，更优选人进行施用。这样的药物组合物可以包含药学上可接受的载体。所述药物组合物可以例如经口服途径、经肠胃外途径、通过吸入喷雾剂、经局部途径、通过滴眼剂、经直肠途径、经鼻途径、经颊途径、经***途径或经由植入型储器进行施用，其中本文所使用的术语“经肠胃外途径”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、损伤内和颅内注射或输注技术。所述药物组合物可以以合适的剂型来提供，例如胶囊、片剂以及水性悬浮液和溶液，优选以无菌的形式。它可以在治疗疾病的方法中进行使用，所述方法包括向受试者施用有效量的本发明的多肽。在优选实施方案中，本发明提供了包含本发明的多肽的疫苗，其任选地包含辅助试剂例如佐剂或缓冲液；和本发明的多肽用于制备疫苗的用途。

在本发明的范围内，提供了包含优选包被有用于检测本发明(自身)抗体和/或本发明多肽的试剂的医疗装置。优选地，这样的医疗装置包含本发明的多肽，其形式允许以直接的方式使其与水溶液、更优选液体人样品接触。特别地，包含的本发明的多肽可以固定在载体的表面上，所述载体优选选自包含以下的组：玻璃板或载玻片，生物芯片，微量滴定板，珠，例如磁珠，血液成分分离(apharesis)装置，色谱柱，膜等。示例性医学装置包括线性斑点印迹，微量滴定板，显微镜用载玻片，珠，优选磁珠，和生物芯片。除了本发明的多肽之外，医疗或诊断装置可以包含另外的多肽，例如阳性或阴性对照，例如包含或不包含与目标多肽结合的抗体的样品，或与诊断价值的自身抗体结合的已知的其他抗原，特别是涉及与一种或多种相同或类似症状相关的其他疾病的那些。

本发明的教导提供了试剂盒，其优选用于鉴定发展疾病的风险增加的受试者。这样的试剂盒可以包含详细说明如何使用该试剂盒的说明书，和用于使本发明的多肽与来自受试者(优选人受试者)的体液样品相接触的工具，例如线性斑点印迹，其中本发明的多肽被固定化在线性斑点印迹上。进一步地，所述试剂盒可以包含阳性对照，例如一批已知与本发明的多肽相结合的自身抗体或重组抗体；和阴性对照，例如与本发明的多肽不具有可检测的亲和力的蛋白质例如牛血清白蛋白。最后，这样的试剂盒可以包含用于制备校准曲线的结合胞裂蛋白-3的抗体的标准溶液。

在优选实施方案中，所述试剂盒包含用于检测与本发明的多肽相结合的自身抗体的工具，所述检测优选通过检测包含本发明的多肽和与本发明的多肽相结合的抗体的复合物来进行。这样的工具优选是这样的试剂，所述试剂与所述复合物相结合并且修饰该复合物或者携带标记从而使得该复合物可检测。例如，所述工具可以是经标记的抗体，其在除了被一抗所识别的结合位点之外的其他结合位点处与所述多肽相结合或者与一抗的恒定区相结合。备选地，所述工具可以是与所述自身抗体的恒定区相结合的二抗，优选对于哺乳动物IgG类抗体来说特异的二抗。更优选地，所述经标记的二抗特异性地结合人IgG。许多用于检测此类复合物的方法和工具在现有技术中已有描述，例如在Philips,Terry,M.,Analytical techniques in immunochemistry,1992,Marcel Dekker,Inc中。

胞裂蛋白-3或其变体可以以包含和/或表达编码所述多肽的核酸的细胞的形式来产生或提供。如果使用包含编码本发明的多肽或其变体的序列的核酸，那么这样的核酸可以是未修饰的核酸。在优选实施方案中，所述核酸为这样的核酸，其本身不在自然界中出现，并且相比于天然核酸而言包含至少一个修饰，例如同位素内容物或化学修饰，例如甲基化、序列修饰、标记等，其指示了合成来源。在优选实施方案中，所述核酸为重组核酸或核酸的一部分，和在更优选实施方案中，为载体的一部分，在所述载体中它可以与允许所述核酸表达(优选过表达)的启动子功能性地相连接。本领域技术人员熟悉各种各样的合适的载体，其是商购可得的，例如购自Origene。例如，可以使用编码具有C-末端GFP的融合构建体的载体。所述细胞可以是真核或原核细胞，优选真核细胞，例如酵母细胞，和更优选为哺乳动物细胞，更优选人细胞例如HEK293细胞。哺乳动物细胞的实例包括HEK293、CHO或COS-7细胞。包含编码本发明的多肽的核酸的细胞可以是重组细胞或分离的细胞，其中术语“分离的”表示，所述细胞是经富集的，从而使得相比于所述细胞的野生型的环境而言，存在很少的其他分化或种类的细胞或者实际上不存在这样的其他细胞。

在优选实施方案中，根据本发明的医疗装置，优选适用于显微镜检查的载玻片，包含选自以下组中的一种或多种，优选所有试剂，所述组包括表达(优选地过表达)胞裂蛋白-3或其变体的第一真核细胞，优选表达内源性胞裂蛋白-3的真核生物(优选哺乳动物)组织，如大鼠或灵长类动物小脑，与第一真核细胞是相同类型的细胞，但不表达或不过表达胞裂蛋白-3的第二真核细胞。第一和第二真核细胞是衍生自分离的细胞系如HEK293的培养的细胞。优选地，第一和第二细胞各自用共享相同主链的载体(vector)转染，其中用于转染第一细胞的载体包含编码胞裂蛋白-3或其变体的核酸，并且用于转染第二细胞的载体不包含胞裂蛋白-3或其变体。第二细胞可以用作阴性对照。试剂可以在医疗装置上在空间上分开，使得它们可以独立地评估，而来自一种试剂的抗原不会污染另一种试剂。在更优选实施方案中，第一和/或第二细胞是固定的细胞，例如使用甲醇或丙酮进行固定。在现有技术中描述了用于固定细胞的方案。作为另外的试剂，可以提供优选地用荧光染料标记的经标记的二抗。试剂和医疗装置可以是试剂盒的一部分。

在优选实施方案中，使用微量滴定板、膜、印迹如斑点印迹或线性斑点印迹来实施根据本发明的诊断方法。本领域技术人员熟悉线性斑点印迹的实验设置，其在现有技术中描述(Raoult，D.和Dasch，G.A.(1989)，The line blot：an immunoassay for monoclonaland other antibodies.Its application to the serotyping of gram-negativebacteria.J.Immunol.Methods,125(1-2),57-65；WO2013041540)。如果医疗装置是线性斑点印迹，它可以包含固定化在膜上的胞裂蛋白-3或其变体，优选为测试条的形状。膜可以包含一种或多种另外的抗原，其在空间上与胞裂蛋白-3分开。膜可以包含指示添加样品例如血液样品的对照条带，和/或指示添加二抗的对照条带。试剂盒可包含任何组分，优选地来自包括线性斑点印迹、二抗和洗涤溶液的组的全部。

在另一个优选实施方案中，医疗装置是包括至少8个孔的微量滴定板。至少一个孔直接或间接涂敷有胞裂蛋白-3或其变体。提供至少3种、优选4种、更优选5种校准物，其包含以确定浓度的针对胞裂蛋白-3的抗体，并且可以用于设定用于半定量分析的校准曲线。可以提供包含酶活性标记的二抗。试剂盒可包含任何组分，优选地来自包含微量滴定板、校准物、洗涤溶液和二抗的组的全部。

在另一个优选实施方案中，医疗装置是直接或间接涂敷有胞裂蛋白-3或其变体的珠。珠可以选自包含磁珠和荧光珠的组。可以提供包含能够化学发光或发荧光的标记的二抗。可以提供包含针对胞裂蛋白-3的抗体的阳性对照。可以提供至少3个、优选4个、更优选5个校准物，其包含以确定浓度的针对胞裂蛋白-3的抗体，并且可以用于建立用于半定量分析的校准曲线。如果标记能够产生化学发光，则可以提供包含化学发光反应所需的其他组分的溶液。例如，如果标记是酶，则溶液包含底物。如果标记是能够产生化学发光的化合物，例如吖啶酯，则在溶液中提供反应所需的其他化合物。试剂盒可包含任何组分，优选来自包含珠、二抗、校准物、洗涤溶液和包含其他组分的溶液的组的全部。

本发明的教导可以不仅用于评估或鉴定，而且还用于预防或治疗疾病，更特别地，用于预防或治疗疾病的方法，其包括下列步骤：a)降低在受试者血液中与本发明的多肽相结合的自身抗体的浓度，和/或b)施用一种或多种免疫抑制药学物质，其优选选自包含以下的组：利妥昔单抗、波尼松、甲波尼龙、环磷酰胺、吗替麦考酚酯、静脉内免疫球蛋白、他克莫司、环孢菌素、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤，和/或药物组合物。

在优选实施方案中，本发明提供了用于检测针对胞裂蛋白-3的自身抗体的试剂或者与该抗体结合的试剂，或者检测编码胞裂蛋白-3或变体的核酸或者与编码胞裂蛋白-3的核酸特异性地杂交的核酸的试剂，或者包含所述核酸的载体或细胞在用于制备用于诊断疾病的试剂盒中的用途。

在优选实施方案中，根据本发明的任何方法或用途可用于体外测试医学装置的效率，所述医学装置设计用于从患者血液中去除自身抗体，其中所述测试是对患者血液以外的液体进行的。在与患者一起使用医疗装置后，可以检查其去除自身抗体的能力，通过装置运行包含针对胞裂蛋白-3的抗体的溶液，然后使用根据本发明的方法来确认更少或没有抗体在已通过装置的溶液中，即显示装置仍具有从溶液中去除抗体的能力。备选地，从包含大量装置的批次中，可以测试少量装置以在质量控制的意义上确认或测试整批的质量，其中样品或溶液可包含已知浓度的针对胞裂蛋白-3的抗体。

在另一个优选实施方案中，所述方法可以用于确认抗体检测测定的可靠性，并且可以涉及在溶液中检测针对胞裂蛋白-3的抗体，该溶液体不是来自患者的样品，但是已知包含针对胞裂蛋白-3的抗体，优选以已知的浓度包含针对胞裂蛋白-3的抗体。备选地，溶液可以是不包含抗体的阴性对照以检查背景。这种方法可以与诊断方法并行、之后或之前进行。在优选实施方案中，根据本发明的任何方法或用途可用于产生自身抗体谱，优选用于检测哺乳动物、优选人的疾病。在优选实施方案中，任何方法或用途可以用于检测来自神经***疾病患者的样品中的疾病相关标志物。

在优选实施方案中，根据本发明的任何方法或用途可以用于鉴定处于患有或发展神经***疾病和/或肿瘤的风险的受试者。

附图简要说明

图1显示了使用大鼠海马和大鼠小脑的透化冷冻切片，从代表性阳性患者的血清进行间接免疫荧光测定的结果。观察到分子层的粒状染色。

图2显示了使用患者血清从匀浆的大鼠小脑对胞裂蛋白-3的免疫沉淀，然后使用与胞裂蛋白-3相结合的商业化重组抗体进行考马斯染色的SDS PAGE(A)或蛋白质印迹(B)。

图3显示了表达所示蛋白质的HEK293细胞和使用患者血清的免疫荧光结果。使用模拟转染的HEK293细胞和对照血清未观察到背景荧光信号。

图4显示了使用患者血清对大鼠小脑、灵长类动物小脑和大鼠海马的免疫荧光结果(A)。通过与含有胞裂蛋白-3的HEK293裂解物预孵育能够消除荧光信号(B)。

图5显示了细菌表达的蛋白质(胞裂蛋白-3-His和没有his标签的胞裂蛋白-5、胞裂蛋白-6、胞裂蛋白-7和胞裂蛋白-11通过IMAC通过his标签纯化)用于在间接ELISA中形成固相用于检测人IgG抗体。纯化的抗原的SDS-PAGE分析揭示了几个蛋白质条带(A)。可以通过质谱法鉴定所有重组表达的蛋白质(胞裂蛋白-3-His、胞裂蛋白-5、胞裂蛋白-6、胞裂蛋白-7和胞裂蛋白-11)。(B)用重组胞裂蛋白-3以及共表达的胞裂蛋白-3、胞裂蛋白-5、胞裂蛋白-6、胞裂蛋白-7和胞裂蛋白-11和20份健康对照血清在RC-IFA中呈阳性的2个患者血清的ELISA结果。血清的阳性数目和总数在图下方给出。

图6显示了用1:1,000(A1)或1:500稀释(A2-4)的抗胞裂蛋白-3的兔商品抗体和对照兔血清(B1-4)孵育的小鼠小脑(A1，B1)和患者癌症标本(A2-4，B2-4)的免疫组织化学染色。(A2，B2)黑素瘤，患者1；(A3，B3)***转移，患者1；(A4，B4)***转移，患者3。放大倍数×200。

图7显示了五名患者(P1-P5)的汇总表，其血清显示出针对胞裂蛋白-3的反应性。

图8显示了用HEK293细胞表达的全长胞裂蛋白-3-His(aa 1-358)或细菌表达的His-GST-胞裂蛋白-3片段(aa 1-62、51-261、205-358)和患者血清2(PS2)或对照血清(CS1、2)进行的蛋白质印迹。

图9显示了分别患有偏头痛、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和复发性晕厥的患者名单，其血清显示出针对胞裂蛋白-3的免疫反应性。进一步显示了能够检测胞裂蛋白复合物或单独的胞裂蛋白-3的最大血清稀释液。

本发明申请包括一系列序列，更具体地：

SEQ ID No.1(人胞裂蛋白-3)

MSKGLPETRTDAAMSELVPEPRPKPAVPMKPMSINSNLLGYIGIDTIIEQMRKKTMKTGFDFNIMVVGQSGLGKSTLVNTLFKSQVSRKASSWNREEKIPKTVEIKAIGHVIEEGGVKMKLTVIDTPGFGDQINNENCWEPIEKYINEQYEKFLKEEVNIARKKRIPDTRVHCCLYFISPTGHSLRPLDLEFMKHLSKVVNIIPVIAKADTMTLEEKSEFKQRVRKELEVNGIEFYPQKEFDEDLEDKTENDKIRQESMPFAVVGSDKEYQVNGKRVLGRKTPWGIIEVENLNHCEFALLRDFVIRTHLQDLKEVTHNIHYETYRAKRLNDNGGLPPGEGLLGTVLPPVPATPCPTAE

SEQ ID No.2(小鼠胞裂蛋白-3)

MSKGLPEARTDAAMSELVPEPRPKPAVPMKPVSINSNLLGYIGIDTIIEQMRKKTMKTGFDFNIMVVGQSGLGKSTLVNTLFKSQVSRKASSWNREEKIPKTVEIKAIGHVIEEGGVKMKLTVIDTPGFGDQINNENCWEPIEKYINEQYEKFLKEEVNIARKKRIPDTRVHCCLYFISPTGHSLRPLDLEFMKHLSKVVNIIPVIAKADTMTLEEKSEFKQRVRKELEVNGIEFYPQKEFDEDLEDKTENDKIRQESMPFAVVGSDKEYQVNGKRVLGRKTPWGIIEVENLNHCEFALLRDFVIRTHLQDLKEVTHNIHYETYRAKRLNDNGGLPPVSVDTEESHDSNP

SEQ ID No.3(大鼠胞裂蛋白-3)

MSKGLPEARTDTAMSELVPEPRPKPAVPMKPVSINSNLLGCIGIDTIIEQMRKKTMKTGFDFNIMVVGQSGLGKSTLVNTLFKSQVSRKASSWNREEKIPKTVEIKAIGHVIEEGGVKMKLTVIDTPGFGDQINNENCWEPIEKYINEQYEKFLKEEVNIARKKRIPDTRVHCCLYFISPTGHSLRPLDLEFMKHLSKVVNVIPVIAKADTMTLEEKSEFKQRVRKELEVNGIEFYPQKEFDEDLEDKTENDKIRQESMPFAVVGSDKEYQVNGKRVLGRKTPWGIIEVENLNHCEFALLRDFVIRTHLQDLKEVTHNIHYETYRAKRLNDNGGLPPGEGLLGTVLPPVPATPCPTAE

SEQ ID No.4(猪胞裂蛋白-3)

MSKGLPEARTDTAMSELVPEPRPKPAVPMKPVSINSSLLGYIGIDTIIEQMRKKTMKTGFDFNIMVVGQSGLGKSTLVNTLFKSQVSRKASSWNREEKIPKTVEIKAIGHVIEEGGVKMKLTVIDTPGFGDQINNENCWEPIEKYINEQYEKFLKEEVNIARKKRIPDTRVHCCLYFISPTGHSLRPLDLEFMKHLSKVVNIIPVIAKADTMTLEEKSEFKQRVRKELEVNGIEFYPQKEFDEDLEDKTENDKIRQESMPFAVVGSDKEYQVNGKRVLGRKTPWGIIEVENLNHCEFALLRDFVIRTHLQDLKEVTHNIHYETYRAKRLNDNGGLPPCFEAVSGCGSLLPTAARRI

SEQ ID NO 5(人胞裂蛋白-3 1-62aa)

MSKGLPETRTDAAMSELVPEPRPKPAVPMKPMSINSNLLGYI GIDTIIEQMRKKTMKTGFD

通过以下非限制性实施例进一步说明本发明，可以从这些实施例中取得本发明的其它特征、实施方案、方面和优点。

实施例

概要

方法：对两个患有神经***病况的患者(P1-P2)进行血清学调查。为此，来自两个患者的血清通过间接免疫荧光测定(IFA)和免疫印迹进行全面的自身抗体筛选。用小脑裂解物进行免疫沉淀接着进行质谱(MS)用来鉴定自身抗原，其通过用针对各自靶抗原的单特异性动物抗体的蛋白质印迹(WB)以及通过HEK293细胞中的重组表达和使用免疫测定中的重组蛋白来进行验证。此外，针对抗胞裂蛋白-3抗体筛选具有与患者1和2相似的染色模式但没有已知自身抗体反应性的3个血清(P3-P5)以及阴性对照血清。胞裂蛋白-3-His与没有His标签的胞裂蛋白-5、胞裂蛋白-6、胞裂蛋白-7和胞裂蛋白-11共表达。使用抗胞裂蛋白-3阳性患者血清和健康对照在ELISA中分析纯化的蛋白质。

结果：来自P1至P5的血清的IFA筛选揭示了与在大鼠小脑和海马中分子层的IgG反应性。在大鼠海马上，外分子层比内分子层的染色更深。在大鼠小脑上，除了分子层的颗粒染色，也观察到颗粒层的疙瘩染色，而浦肯野细胞是阴性。此外，在一组30种重组表达的已建立的神经自身抗原中未发现IgG反应性。通过考马斯染色的SDS-PAGE接着进行MALDI-TOF质谱检测，P1至P2的血清与胞裂蛋白-3、胞裂蛋白-5、胞裂蛋白-6、胞裂蛋白-7和胞裂蛋白-11发生免疫沉淀。当使用抗胞裂蛋白-3的单特异性动物抗体通过蛋白质印迹分析免疫沉淀物时，抗胞裂蛋白-3显示出与P1至P3的免疫沉淀物的反应性，而在3个对照血清的免疫沉淀物中没有反应性。而且，在P1至P2的血清中以及在具有对大鼠小脑和大鼠海马的相似染色模式的3个另外的患者血清(P3和P5)中，可以通过RC-IFA用重组蛋白检测到抗胞裂蛋白-3抗体。用神经组织(n＝150)筛选在IIFT中没有特定反应的健康对照血清揭示了一个抗胞裂蛋白复合物阳性样品。使用重组地表达胞裂蛋白-3-His+胞裂蛋白-5、胞裂蛋白-6、胞裂蛋白-7、胞裂蛋白-11(ΔHis)的ELISA证实了通过RC-IFA得到的结果。

来自四名具有抗胞裂蛋白-3自身抗体的患者的临床数据可用。P1患有与小脑性共济失调相关的恶性黑素瘤，P3患有与小脑综合征相关的小细胞肺癌(SCLC)，而P4患有纵向广泛性脊髓炎。P5患有小脑性共济失调，无肿瘤相关性。

患者

对照组包括150个健康供体。

间接免疫荧光测定(IFA)

使用具有脑组织冰冻切片(大鼠的海马、大鼠的小脑)的生物芯片阵列的载玻片与分别表达30种不同的脑抗原的重组HEK293细胞组合进行IFA，所述30种不同的脑抗原为Hu、Yo、Ri、CV2、PNMA2、ITPR1、Homer 3、CARP VIII、ARHGAP26、ZIC4、DNER/Tr、GAD65、GAD67、双载蛋白、恢复蛋白、GABA_B受体、甘氨酸受体、DPPX、IgLON5、谷氨酸受体(类型NMDA、AMPA、mGluR1、mGluR5、GLURD2)、LGI1、CASPR2、AQP4(M1和M23)、MOG、ATP1A3、NCDN(EUROIMMUN,FA111a-1003-51,FA 1112-1003-50,FA-1128-1003-50,FA112d-1003-1,FA 112m-1003-50,FA1151-1003-50,Miske R,Hahn S,Rosenkranz T,Müller M,Dettmann IM,Mindorf S,Denno Y,Brakopp S,Scharf M,Teegen B,Probst C,Melzer N,Meinck HM,Terborg C,

W,Komorowski L.,2016,Autoantibodies against glutamate receptorδ2after allogenic stem cell transplantation.Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm.,3(4):e255；Scharf M,Miske R,Heidenreich F,Giess R,Landwehr P,

IM,Begemann N,Denno Y,Tiede S,

C,Schlumberger W,Unger M,Teegen B,

W,Probst C,Komorowski L,2015,Neuronal Na+/K+ATPase is anautoantibody target in paraneoplastic neurologic syndrome,Neurology；84(16):1673-9；Miske R,Gross CC,Scharf M,Golombeck KS,Hartwig M,Bhatia U,Schulte-Mecklenbeck A,

K,Strippel C,L,Synofzik M,Lohmann H,Dettmann IM,Deppe M,Mindorf S,Warnecke T,Denno Y,Teegen B,Probst C,Brakopp S,WandingerKP,Wiendl H,

W,Meuth SG,Komorowski L,Melzer N,2016,Neurochondrin is aneuronal target antigen in autoimmune cerebellar degeneration,NeurolNeuroimmunol Neuroinflamm；4(1):e307))。将每个生物芯片镶嵌体(biochip mosaic)与70μL经PBS稀释的样品在室温下孵育30分钟，用PBS-吐温洗涤并浸入PBS-吐温中5分钟。在第二步中，应用Alexa488标记的山羊抗人IgG(Jackson Research,Suffolk,UnitedKingdom)或异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗人IgG(EUROIMMUN MedizinischeLabordiagnostika AG,Lübeck)并在室温孵育30分钟。用PBS-吐温冲洗再次洗涤载玻片，然后浸入PBS-吐温中5分钟。将载玻片埋在PBS缓冲的含甘油的DABCO(每个视野约20μL)中并通过荧光显微镜检查。包括阳性和阴性对照。与未转染的细胞和对照样品直接比较，根据转染细胞的荧光强度将样品分类为阳性或阴性。终点效价是指能够显示可见荧光的最后稀释度。

由两个独立观察员使用EUROStar II显微镜(EUROIMMUN MedizinischeLabordiagnostika AG,Lübeck,Germany)评估结果。如果没有另外指定，从Merck,Darmstadt,Germany和Sigma-Aldrich,Heidelberg,Germany获得试剂。

免疫印迹

免疫沉淀的小脑裂解物与含有25mmol/L二硫苏糖醇的NuPage LDS样品缓冲液(ThermoFisher Scientific,Schwerte,Germany)在70℃孵育10分钟，然后进行SDS-PAGE(NuPAGE,ThermoFisher Scientific,Schwerte,Germany)。根据制造商的说明，通过用转移缓冲液(ThermoFisher Scientific)进行槽印迹将分离的蛋白质电转移到硝酸纤维素膜上。用Universal Blot Buffer plus(EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG,Lübeck)封闭膜15分钟，并与针对胞裂蛋白-3的单特异性兔抗体(Sigma Aldrich,HPA003548,1:20,000)在Universal Blot Buffer plus中孵育3小时，然后用Universal Blot Buffer(EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG，Lübeck)进行3次洗涤步骤，用抗人IgG-AP(EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG，Lübeck，1:10)或抗兔IgG-AP(1:2,000)在Universal Blot Buffer plus中进行30分钟的第二次孵育，3次洗涤步骤，并用NBT/BCIP底物(EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG，Lübeck)染色。如果没有另外指定，试剂从Merck,Darmstadt,Germany or Sigma-Aldrich,Heidelberg,Germany获得。

抗原的鉴定

解剖大鼠和猪的小脑并在液氮中快速冷冻。用Miccra D-8(Roth,Karlsruhe,Germany)和手动匀浆器(Sartorius,

Germany)在含有蛋白酶抑制剂(Complete mini,Roche Diagnostics,Penzberg,Germany)的增溶缓冲液(100mmol/Ltris-HCl pH 7.4、150mmol/L氯化钠、2.5mmol/L乙二胺四乙酸、0.5％(w/v)脱氧胆酸钠、1％(w/v)Triton X-100)中将组织在4℃下匀浆。将组织裂解物在4℃下以21,000×g离心15分钟，并将澄清上清液与患者血清(1:16.7稀释)在4℃一起孵育过夜。然后将样品与蛋白GDynabeads(ThermoFisher Scientific,Dreieich,Germany)在4℃孵育3小时以捕获免疫复合物。珠粒用PBS洗涤3次，并用含有25mmol/L二硫苏糖醇的NuPage LDS样品缓冲液(ThermoFisher Scientific,Schwerte,Germany)在70℃洗脱10分钟。用59mM碘乙酰胺(Bio-Rad,Hamburg,Germany)进行脲甲基化(carbamidomethylation)，然后进行SDS-PAGE(NuPAGE,ThermoFisher Scientific,Schwerte,Germany)。用考马斯亮蓝(G-250)(Merck)使分离的蛋白质可视化，并通过质谱分析对其进行鉴定。

质谱

从考马斯亮蓝G-250染色凝胶中切下可见的蛋白条带。脱色和胰蛋白酶消化后，提取肽并用α-氰基-4-羟基肉桂酸点样到MTP AnchorChip^TM384TF靶体上。

使用flexControl 3.4软件，使用Autoflex III smartbeam TOF/TOF200***进行MALDI-TOF/TOF测量。以质量范围为600Da-4,000Da和以用4,000-10,000个轰击(shot)的正离子反射器模式记录肽质量指纹图谱(PMF)的质谱图。质谱用商购可得的PeptideCalibration Standard II进行外部校准，用flexAnalysis 3.4进行处理，峰值列表用BioTools 3.2进行分析。

Mascot检索引擎Mascot Server 2.3(Matrix Science，London，UK)用于通过对NCBI或SwissProt数据库限于哺乳动物(Mammalia)进行检索来进行蛋白质鉴定。检索参数如下：质量容忍度设定为80ppm，接受一个错过的切割位点，并且半胱氨酸残基的脲甲基化以及甲硫氨酸残基的氧化分别设定为固定和可变修饰。为了评估蛋白质命中，选择p<0.05的显著性阈值。

为了进一步确认PMF命中，使用BioTools的WARP反馈机制选择每个鉴定蛋白质的2至5个肽用于MS/MS测量。分别用400和1000个轰击记录母体和碎片质量。用0.7Da的碎片质量容忍度如上所述处理和分析质谱。

在HEK293细胞中重组表达胞裂蛋白蛋白

将胞裂蛋白蛋白克隆到哺乳动物表达载体pTriEx-1(Merck,Darmstadt,Germany)中，并将对应的胞裂蛋白蛋白在在人细胞系HEK293中瞬时表达，然后根据制造商(BiomolGmbH,Hamburg,Germany)的说明进行PEI介导的转染(Exgene 500)。

对于免疫荧光底物的产生，将细胞在盖玻片上生长并在转染后两天丙酮固定。

对于其他目的，细胞在转染后5天收获并通过高压进行裂解。将裂解物以等分储存在-80℃以备进一步使用。

纯化：

通过在镍快速运行(ABT)上固定化的金属亲和层析来纯化胞裂蛋白-3-His。通过根据制造商(Invitrogen)的手册使用NuPAGE***的SDS-PAGE并通过质谱法进行蛋白质分析。除了胞裂蛋白-3-His之外，还可以检测到共表达的没有组氨酸标签的胞裂蛋白-5、胞裂蛋白-6、胞裂蛋白-7和胞裂蛋白-11。

患者自身抗体的表征

使用大鼠小脑和海马经通透的冰冻切片进行的血清P1至P5的间接免疫荧光测定(IFA)显示分子层的颗粒染色(图1)。使用表达30种神经自身抗原的重组HEK293细胞进行进一步的单特异性分析，所述30种神经自身抗原为Hu、Yo、Ri、CV2、PNMA2、SOX1、ITPR1、Homer3、CARP VIII、ARHGAP26、ZIC4、DNER/Tr、GAD65、GAD67、双载蛋白、恢复蛋白、GABAB受体、甘氨酸受体、DPPX、IgLON5、谷氨酸受体(类型NMDA、AMPA、mGluR1、mGluR5、GLURD2)、LGI1、CASPR2、AQP4(M1和M23)、MOG、ATP1A3和NCDN。没有观察到特异反应性。

鉴定胞裂蛋白为靶神经元自身抗原

用P1和P2获得的来自匀浆的大鼠和猴小脑的免疫沉淀物进行SDS-PAGE分析。在考马斯染色的SDS-PAGE中，可以检测到40-50kDa的特定条带(图2A)。使用MALDI-TOF MS，蛋白质条带被鉴定为胞裂蛋白-3、胞裂蛋白-5、胞裂蛋白-6、胞裂蛋白-7和胞裂蛋白-11(UNIPROT登录号Q9WU34、Q9JJM9、NP_001166900.1、Q9WVC0、B3GNI6)。作为正确的抗原鉴定的证据，免疫沉淀物通过使用针对神经元特异性胞裂蛋白-3的抗体的蛋白质印迹来测试。如40-50kDa的特定条带所示(图2B)，患者血清的免疫沉淀物含有胞裂蛋白-3，其在对照血清的免疫沉淀物中不存在。此外，使用表达胞裂蛋白-3(SEQ ID No.1)或共表达胞裂蛋白-3、胞裂蛋白-5、胞裂蛋白-6、胞裂蛋白-7和胞裂蛋白-11的转染的HEK293细胞通过IFA测试患者的样品。患者血清与单独表达胞裂蛋白-3的细胞以及共表达胞裂蛋白-3、胞裂蛋白-5、胞裂蛋白-6、胞裂蛋白-7和胞裂蛋白-11的细胞发生反应(图3A)。相反，模拟转染的细胞没有表现出任何特异性抗体结合(图3B)。当胞裂蛋白-5、胞裂蛋白-6、胞裂蛋白-7或胞裂蛋白-11单独表达时，患者血清(P1至P3)未显示任何抗体结合。用患者血清通过RC-IFA分析胞裂蛋白共表达的其他组合：胞裂蛋白-3、胞裂蛋白-5、胞裂蛋白-6、胞裂蛋白-7；胞裂蛋白-3、胞裂蛋白-5、胞裂蛋白-7、胞裂蛋白-11；胞裂蛋白-5、胞裂蛋白-6、胞裂蛋白-7、胞裂蛋白-11；胞裂蛋白-3、胞裂蛋白-5、胞裂蛋白-7；胞裂蛋白-5、胞裂蛋白-6、胞裂蛋白-7；胞裂蛋白-3、胞裂蛋白-7、胞裂蛋白-11。三个患者(P1-P3)血清显示与共表达没有胞裂蛋白-3的组合的细胞有减少的反应甚至没有反应。这些结果表明神经元特异性胞裂蛋白-3的重要性。

通过用含有胞裂蛋白-3(SEQ ID No.1)的HEK293裂解物预孵育可消除患者自身抗体对组织的反应(图4)。当使用来自模拟转染的HEK293细胞的可比部分时，抗体结合不受影响。

抗胞裂蛋白-3自身抗体的特异性

通过IFA与患者样品平行分析多至150份健康对照血清，使用HEK293-胞裂蛋白-3或HEK293-胞裂蛋白-3、胞裂蛋白-5、胞裂蛋白-6、胞裂蛋白-7、胞裂蛋白-11或其他组合。150份健康对照血清中只有一份显示以1:100稀释的HEK293-胞裂蛋白-3、胞裂蛋白-5、胞裂蛋白-6、胞裂蛋白-7、胞裂蛋白-11细胞的阳性反应。

用重组胞裂蛋白检测自身抗体的免疫测定

将96孔板(Nunc，Germany)用100μl溶于PBS的浓度为2.5μg/ml的重组蛋白在25℃包被2小时，用洗涤缓冲液(在PBS中的0.05％[wt/vol]吐温20)洗涤3次，然后用封闭缓冲液(在PBS中的0.1％[wt/vol]酪蛋白)封闭1小时。通过与1:2,000稀释的鼠单克隆抗六组氨酸标签抗体(Sigma-Aldrich，Germany)一起孵育来证实抗原固定化的成功。将实验血清样品在样品缓冲液(在PBS中的1％[wt/vol]酪蛋白、0.05％[wt/vol]吐温20)中1:100稀释，并在室温孵育30分钟。洗涤三次后，通过与样品缓冲液中1:16,000稀释的抗小鼠IgG-HRP缀合物(Jackson Research，UK)或未稀释的抗人IgG-POD(Euroimmun，Germany)孵育30分钟，如上所述洗涤，并与四甲基联苯胺(TMB)底物(Euroimmun，Germany)孵育15分钟，检测结合的抗体。所有孵育步骤均在室温进行。使用自动分光光度计(Tecan，Germany)读取450nm处的光密度(OD)。

使用胞裂蛋白-3-His+没有His标签的胞裂蛋白-5、胞裂蛋白-6、胞裂蛋白-7、胞裂蛋白-11通过ELISA分析3个患者血清(P1、P2和P4)和20份健康对照血清，通过IMAC通过胞裂蛋白-3–His进行纯化(图5)。所有分析的患者血清均显示阳性反应，而所有对照血清均为阴性。结果证实了从RC-IFA获得的结果。此外，使用纯化的胞裂蛋白-3-His作为抗原，患者血清在ELISA(P2、P3)和蛋白质印迹(P1-3)实验中显示阳性反应。

患者肿瘤标本的组织病理学

将来自患者组织的***固定的石蜡包埋的黑素瘤(P1)和***转移(P1和P3)进行切片(4μm)。作为抗体功能性的对照，将小鼠小脑组织进行切片。将切片置于载玻片上，脱石蜡，再水化，并使用Target Retrieval Solution(pH9，3-in-1，Dako，Hamburg，Germany)根据供应商的说明进行热诱导表位修复(heat-induced epitope-retrieval)。随后，在室温用含有0.05％吐温20的Tris缓冲盐水(TBS)洗涤载玻片。用Serum-free ProteinBlock(Thermo Fisher Scientific，Schwerte，Germany)进行封闭10分钟。将多克隆兔抗胞裂蛋白-3(HPA003548，Sigma-Aldrich，Taufkirchen，Germany)在Dako抗体稀释剂中以1:500或1:1,1000稀释，然后施加30分钟。作为阴性对照，使用兔疫球蛋白级分(X0936，Dako，Hamburg，Germany)。使用Bond Polymer Refine Detection***(Leica Biosystems，Wetzlar，Germany)根据制造商的说明进行孵育。10分钟后停止3,3-二氨基联苯胺(DAB；Leica Biosystems，Wetzlar，Germany)显影。苏木精(Leica Biosystems，Wetzlar，Germany)用于复染。用Neo-Mount(无水封片剂(VWR，Darmstadt，Germany))将载玻片封片。

用抗胞裂蛋白-3抗体孵育小鼠小脑切片显示出与用大鼠小脑进行间接免疫荧光测定中索引患者血清所观察到的相同模式(图6的A1)。患者肿瘤标本的孵育显示在所有三个分析的组织中具有高表达胞裂蛋白-3的区域(图6的A2-A4)。因此，非常能够推定这两名患者的副肿瘤性神经元综合征(PNS)。

图7显示了五名患者(P1-P5)的汇总表，其血清显示出对胞裂蛋白-3的反应性。

患者自身抗体识别的胞裂蛋白-3表位的表征

对于表位作图，将如上所述裂解的表达全长胞裂蛋白-3-His的HEK239细胞或在pET24d载体(Merck，Germany)中表达的His-GST-胞裂蛋白-3片段(aa 1-62、51-261、205-358)的大肠杆菌与含有25mmol/L二硫苏糖醇的NuPage LDS样品缓冲液(ThermoFisherScientific，Germany)在70℃孵育10分钟。如上所述将裂解物进行免疫印迹。简而言之，将膜与抗His小鼠单克隆抗体(Merck，Germany，1:2000)、患者血清或对照血清(1:200)在Universal Blot Buffer plus中孵育3小时，并与抗小鼠IgG-AP(JacksonImmunoResearch，UK，1:2000)或抗人IgG-AP(1:10)在Universal Blot Buffer plus中孵育30分钟。

胞裂蛋白-3全长蛋白和N末端胞裂蛋白-3片段(aa 1-62)被患者血清(P2)识别，但未被对照血清(CS1和CS2)识别(图8)，表明患者的自身抗体识别位于胞裂蛋白-3前62个氨基酸中的表位。通过阳性抗His标签反应证实了所有片段的存在。

具有针对胞裂蛋白-3的自身抗体的其他临床特征患者

图9公开了其他血清，其显示分别针对源自患有偏头痛、肌萎缩性侧索硬化(ALS)和复发性晕厥的患者的胞裂蛋白-3的免疫反应性。

序列表

<110> 欧蒙医学诊断技术有限公司

<120> 自身抗体的检测

<130> 18PP179CN

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 358

<212> PRT

<213> 智人（Homo Sapiens）

<400> 1

Met Ser Lys Gly Leu Pro Glu Thr Arg Thr Asp Ala Ala Met Ser Glu

1 5 10 15

Leu Val Pro Glu Pro Arg Pro Lys Pro Ala Val Pro Met Lys Pro Met

20 25 30

Ser Ile Asn Ser Asn Leu Leu Gly Tyr Ile Gly Ile Asp Thr Ile Ile

35 40 45

Glu Gln Met Arg Lys Lys Thr Met Lys Thr Gly Phe Asp Phe Asn Ile

50 55 60

Met Val Val Gly Gln Ser Gly Leu Gly Lys Ser Thr Leu Val Asn Thr

65 70 75 80

Leu Phe Lys Ser Gln Val Ser Arg Lys Ala Ser Ser Trp Asn Arg Glu

85 90 95

Glu Lys Ile Pro Lys Thr Val Glu Ile Lys Ala Ile Gly His Val Ile

100 105 110

Glu Glu Gly Gly Val Lys Met Lys Leu Thr Val Ile Asp Thr Pro Gly

115 120 125

Phe Gly Asp Gln Ile Asn Asn Glu Asn Cys Trp Glu Pro Ile Glu Lys

130 135 140

Tyr Ile Asn Glu Gln Tyr Glu Lys Phe Leu Lys Glu Glu Val Asn Ile

145 150 155 160

Ala Arg Lys Lys Arg Ile Pro Asp Thr Arg Val His Cys Cys Leu Tyr

165 170 175

Phe Ile Ser Pro Thr Gly His Ser Leu Arg Pro Leu Asp Leu Glu Phe

180 185 190

Met Lys His Leu Ser Lys Val Val Asn Ile Ile Pro Val Ile Ala Lys

195 200 205

Ala Asp Thr Met Thr Leu Glu Glu Lys Ser Glu Phe Lys Gln Arg Val

210 215 220

Arg Lys Glu Leu Glu Val Asn Gly Ile Glu Phe Tyr Pro Gln Lys Glu

225 230 235 240

Phe Asp Glu Asp Leu Glu Asp Lys Thr Glu Asn Asp Lys Ile Arg Gln

245 250 255

Glu Ser Met Pro Phe Ala Val Val Gly Ser Asp Lys Glu Tyr Gln Val

260 265 270

Asn Gly Lys Arg Val Leu Gly Arg Lys Thr Pro Trp Gly Ile Ile Glu

275 280 285

Val Glu Asn Leu Asn His Cys Glu Phe Ala Leu Leu Arg Asp Phe Val

290 295 300

Ile Arg Thr His Leu Gln Asp Leu Lys Glu Val Thr His Asn Ile His

305 310 315 320

Tyr Glu Thr Tyr Arg Ala Lys Arg Leu Asn Asp Asn Gly Gly Leu Pro

325 330 335

Pro Gly Glu Gly Leu Leu Gly Thr Val Leu Pro Pro Val Pro Ala Thr

340 345 350

Pro Cys Pro Thr Ala Glu

355

<210> 2

<211> 350

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 2

Met Ser Lys Gly Leu Pro Glu Ala Arg Thr Asp Ala Ala Met Ser Glu

1 5 10 15

Leu Val Pro Glu Pro Arg Pro Lys Pro Ala Val Pro Met Lys Pro Val

20 25 30

Ser Ile Asn Ser Asn Leu Leu Gly Tyr Ile Gly Ile Asp Thr Ile Ile

35 40 45

Glu Gln Met Arg Lys Lys Thr Met Lys Thr Gly Phe Asp Phe Asn Ile

50 55 60

Met Val Val Gly Gln Ser Gly Leu Gly Lys Ser Thr Leu Val Asn Thr

65 70 75 80

Leu Phe Lys Ser Gln Val Ser Arg Lys Ala Ser Ser Trp Asn Arg Glu

85 90 95

Glu Lys Ile Pro Lys Thr Val Glu Ile Lys Ala Ile Gly His Val Ile

100 105 110

Glu Glu Gly Gly Val Lys Met Lys Leu Thr Val Ile Asp Thr Pro Gly

115 120 125

Phe Gly Asp Gln Ile Asn Asn Glu Asn Cys Trp Glu Pro Ile Glu Lys

130 135 140

Tyr Ile Asn Glu Gln Tyr Glu Lys Phe Leu Lys Glu Glu Val Asn Ile

145 150 155 160

Ala Arg Lys Lys Arg Ile Pro Asp Thr Arg Val His Cys Cys Leu Tyr

165 170 175

Phe Ile Ser Pro Thr Gly His Ser Leu Arg Pro Leu Asp Leu Glu Phe

180 185 190

Met Lys His Leu Ser Lys Val Val Asn Ile Ile Pro Val Ile Ala Lys

195 200 205

Ala Asp Thr Met Thr Leu Glu Glu Lys Ser Glu Phe Lys Gln Arg Val

210 215 220

Arg Lys Glu Leu Glu Val Asn Gly Ile Glu Phe Tyr Pro Gln Lys Glu

225 230 235 240

Phe Asp Glu Asp Leu Glu Asp Lys Thr Glu Asn Asp Lys Ile Arg Gln

245 250 255

Glu Ser Met Pro Phe Ala Val Val Gly Ser Asp Lys Glu Tyr Gln Val

260 265 270

Asn Gly Lys Arg Val Leu Gly Arg Lys Thr Pro Trp Gly Ile Ile Glu

275 280 285

Val Glu Asn Leu Asn His Cys Glu Phe Ala Leu Leu Arg Asp Phe Val

290 295 300

Ile Arg Thr His Leu Gln Asp Leu Lys Glu Val Thr His Asn Ile His

305 310 315 320

Tyr Glu Thr Tyr Arg Ala Lys Arg Leu Asn Asp Asn Gly Gly Leu Pro

325 330 335

Pro Val Ser Val Asp Thr Glu Glu Ser His Asp Ser Asn Pro

340 345 350

<210> 3

<211> 358

<212> PRT

<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）

<400> 3

Met Ser Lys Gly Leu Pro Glu Ala Arg Thr Asp Thr Ala Met Ser Glu

1 5 10 15

Leu Val Pro Glu Pro Arg Pro Lys Pro Ala Val Pro Met Lys Pro Val

20 25 30

Ser Ile Asn Ser Asn Leu Leu Gly Cys Ile Gly Ile Asp Thr Ile Ile

35 40 45

Glu Gln Met Arg Lys Lys Thr Met Lys Thr Gly Phe Asp Phe Asn Ile

50 55 60

Met Val Val Gly Gln Ser Gly Leu Gly Lys Ser Thr Leu Val Asn Thr

65 70 75 80

Leu Phe Lys Ser Gln Val Ser Arg Lys Ala Ser Ser Trp Asn Arg Glu

85 90 95

Glu Lys Ile Pro Lys Thr Val Glu Ile Lys Ala Ile Gly His Val Ile

100 105 110

Glu Glu Gly Gly Val Lys Met Lys Leu Thr Val Ile Asp Thr Pro Gly

115 120 125

Phe Gly Asp Gln Ile Asn Asn Glu Asn Cys Trp Glu Pro Ile Glu Lys

130 135 140

Tyr Ile Asn Glu Gln Tyr Glu Lys Phe Leu Lys Glu Glu Val Asn Ile

145 150 155 160

Ala Arg Lys Lys Arg Ile Pro Asp Thr Arg Val His Cys Cys Leu Tyr

165 170 175

Phe Ile Ser Pro Thr Gly His Ser Leu Arg Pro Leu Asp Leu Glu Phe

180 185 190

Met Lys His Leu Ser Lys Val Val Asn Val Ile Pro Val Ile Ala Lys

195 200 205

Ala Asp Thr Met Thr Leu Glu Glu Lys Ser Glu Phe Lys Gln Arg Val

210 215 220

Arg Lys Glu Leu Glu Val Asn Gly Ile Glu Phe Tyr Pro Gln Lys Glu

225 230 235 240

Phe Asp Glu Asp Leu Glu Asp Lys Thr Glu Asn Asp Lys Ile Arg Gln

245 250 255

Glu Ser Met Pro Phe Ala Val Val Gly Ser Asp Lys Glu Tyr Gln Val

260 265 270

Asn Gly Lys Arg Val Leu Gly Arg Lys Thr Pro Trp Gly Ile Ile Glu

275 280 285

Val Glu Asn Leu Asn His Cys Glu Phe Ala Leu Leu Arg Asp Phe Val

290 295 300

Ile Arg Thr His Leu Gln Asp Leu Lys Glu Val Thr His Asn Ile His

305 310 315 320

Tyr Glu Thr Tyr Arg Ala Lys Arg Leu Asn Asp Asn Gly Gly Leu Pro

325 330 335

Pro Gly Glu Gly Leu Leu Gly Thr Val Leu Pro Pro Val Pro Ala Thr

340 345 350

Pro Cys Pro Thr Ala Glu

355

<210> 4

<211> 356

<212> PRT

<213> 野猪（Sus scrofa）

<400> 4

Met Ser Lys Gly Leu Pro Glu Ala Arg Thr Asp Thr Ala Met Ser Glu

1 5 10 15

Leu Val Pro Glu Pro Arg Pro Lys Pro Ala Val Pro Met Lys Pro Val

20 25 30

Ser Ile Asn Ser Ser Leu Leu Gly Tyr Ile Gly Ile Asp Thr Ile Ile

35 40 45

Glu Gln Met Arg Lys Lys Thr Met Lys Thr Gly Phe Asp Phe Asn Ile

50 55 60

Met Val Val Gly Gln Ser Gly Leu Gly Lys Ser Thr Leu Val Asn Thr

65 70 75 80

Leu Phe Lys Ser Gln Val Ser Arg Lys Ala Ser Ser Trp Asn Arg Glu

85 90 95

Glu Lys Ile Pro Lys Thr Val Glu Ile Lys Ala Ile Gly His Val Ile

100 105 110

Glu Glu Gly Gly Val Lys Met Lys Leu Thr Val Ile Asp Thr Pro Gly

115 120 125

Phe Gly Asp Gln Ile Asn Asn Glu Asn Cys Trp Glu Pro Ile Glu Lys

130 135 140

Tyr Ile Asn Glu Gln Tyr Glu Lys Phe Leu Lys Glu Glu Val Asn Ile

145 150 155 160

Ala Arg Lys Lys Arg Ile Pro Asp Thr Arg Val His Cys Cys Leu Tyr

165 170 175

Phe Ile Ser Pro Thr Gly His Ser Leu Arg Pro Leu Asp Leu Glu Phe

180 185 190

Met Lys His Leu Ser Lys Val Val Asn Ile Ile Pro Val Ile Ala Lys

195 200 205

Ala Asp Thr Met Thr Leu Glu Glu Lys Ser Glu Phe Lys Gln Arg Val

210 215 220

Arg Lys Glu Leu Glu Val Asn Gly Ile Glu Phe Tyr Pro Gln Lys Glu

225 230 235 240

Phe Asp Glu Asp Leu Glu Asp Lys Thr Glu Asn Asp Lys Ile Arg Gln

245 250 255

Glu Ser Met Pro Phe Ala Val Val Gly Ser Asp Lys Glu Tyr Gln Val

260 265 270

Asn Gly Lys Arg Val Leu Gly Arg Lys Thr Pro Trp Gly Ile Ile Glu

275 280 285

Val Glu Asn Leu Asn His Cys Glu Phe Ala Leu Leu Arg Asp Phe Val

290 295 300

Ile Arg Thr His Leu Gln Asp Leu Lys Glu Val Thr His Asn Ile His

305 310 315 320

Tyr Glu Thr Tyr Arg Ala Lys Arg Leu Asn Asp Asn Gly Gly Leu Pro

325 330 335

Pro Cys Phe Glu Ala Val Ser Gly Cys Gly Ser Leu Leu Pro Thr Ala

340 345 350

Ala Arg Arg Ile

355

<210> 5

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人胞裂蛋白-3 1-61 aa

<400> 5

Met Ser Lys Gly Leu Pro Glu Thr Arg Thr Asp Ala Ala Met Ser Glu

1 5 10 15

Leu Val Pro Glu Pro Arg Pro Lys Pro Ala Val Pro Met Lys Pro Met

20 25 30

Ser Ile Asn Ser Asn Leu Leu Gly Tyr Ile Gly Ile Asp Thr Ile Ile

35 40 45

Glu Gln Met Arg Lys Lys Thr Met Lys Thr Gly Phe Asp

50 55 60

Claims (15)

1.诊断上有用的运载体，其包含用于特异性地捕获与来自受试者的样品中的胞裂蛋白-3特异性地结合的抗体的工具。

2.根据权利要求1的运载体，其中抗体不与胞裂蛋白-1、胞裂蛋白-2、胞裂蛋白-4、胞裂蛋白-5、胞裂蛋白-6、胞裂蛋白-7、胞裂蛋白-8、胞裂蛋白-9、胞裂蛋白-10、胞裂蛋白-11和/或胞裂蛋白-12相结合。

3.根据权利要求1或2的运载体，其中运载体选自包括珠、测试条、微量滴定板、印迹、玻璃表面、载玻片和膜的组。

4.根据权利要求1至3的运载体，其中用于特异性地捕获抗体的工具是

a)重组和纯化的胞裂蛋白-3或其变体；或者

b)表达胞裂蛋白-3或其变体的真核细胞。

5.试剂盒，其包括根据权利要求1至4中任一项的诊断上有用的运载体，其中试剂盒包括校准物、洗涤缓冲液和/或用于检测IgG抗体的工具。

6.方法，其包括检测来自受试者的样品中针对胞裂蛋白-3的抗体的存在或不存在的步骤。

7.药物组合物，其包含胞裂蛋白-3或其变体。

8.根据权利要求1至4中任一项的运载体在制备用于诊断疾病的试剂盒中的用途，其中疾病是神经***自身免疫疾病、复发性晕厥和/或癌症。

9.根据权利要求8的用途，其中疾病是副肿瘤综合征。

10.根据权利要求8的用途，其中神经***自身免疫疾病是小脑性共济失调、纵向广泛性脊髓炎、偏头痛、肌萎缩性侧索硬化(ALS)或小脑综合征。

11.根据权利要求8的用途，其中癌症是黑素瘤或癌。

12.分离的人抗体，其特异性地结合胞裂蛋白-3。

13.根据权利要求1的运载体、根据权利要求6的方法和根据权利要求12的抗体，其中胞裂蛋白-3是人胞裂蛋白-3。

14.根据权利要求1的运载体、根据权利要求6的方法和根据权利要求12的抗体，其中胞裂蛋白-3与一种或多种胞裂蛋白多肽组合。

15.根据权利要求4的运载体或根据权利要求7的药物组合物，其中变体包含SEQ IDNO：5所示的多肽序列。

Images