ES2799404T3 - Polipéptidos de CD44 aislados y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Un polipéptido aislado que consiste en la SEQ ID NO: 1.

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptidos de CD44 aislados y usos de los mismos

Campo y antecedentes de la invención

La presente invención, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a un polipéptido aislado de CD44 y, más particularmente, pero no exclusivamente, a un polipéptido aislado de CD44vRA y su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias.

CD44 es una molécula de adhesión de superficie celular implicada en múltiples funciones celulares, incluyendo las interacciones célula-célula y célula-matriz, la migración celular, la muerte celular programada (apoptosis) o, contrariamente, la supervivencia y proliferación celular.

CD44 es el principal receptor de superficie celular para el ácido hialurónico (AH), pero también se ha demostrado que se une a proteínas tales como los colágenos, fibronectina, fibrinógeno, laminina, adresina vascular mucosa y osteopontina. CD44 es esencial para el reclutamiento de linfocitos circulantes en el sitio de inflamación y se detecta una pronunciada acumulación de CD44, y a veces de ácido hialurónico, en zonas de migración celular y proliferación celular intensivas, como en la cicatrización de heridas, remodelación de tejidos, inflamación, morfogénesis y carcinogénesis.

La secuencia genómica de CD44 de ratón y humana incluye 5 exones constantes en el extremo 5' y 5 exones constantes en el extremo 3'. El gen de CD44 del ratón incluye 10 exones variantes en el centro de la molécula, designados V¹-V¹⁰, dando como resultado un total de 20 exones. El gen de CD44 humana comprende solo 9 de estos 10 exones variantes (V²-V¹⁰), comprendiendo así un total de 19 exones. El corte y empalme alternativo diferencial de V²-V¹⁰ genera muchas isoformas de CD44 que expresan diversas combinaciones de exones variantes (designado exón Vx, x = 1-10), que se insertan en el dominio proximal a la membrana y constituyen la región variable de la molécula. Estas moléculas se designan variantes de CD44 (CD44v). Hasta la fecha se conocen unas cuantas isoformas de CD44.

CD44s, que no contiene ningún exón variante, es la forma más ubicua y se expresa en la mayoría de los tipos celulares [Ponta, H., et al. Nat Rev Mol Cell Biol. enero de 2003;4(1):33-45]. Las proteínas variantes CD44, en las que están incluidos uno o más de los 10 exones variantes, se describen principalmente en asociación con cáncer y enfermedades autoinmunitarias, tal como la artritis reumatoide y la esclerosis múltiple [véase, por ejemplo, Naor et al. Adv. Cancer Res.,71,241-319,1997; y Naor et al. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 39, 527-579, 2002].

Las células inflamatorias articulares de pacientes con artritis reumatoide (AR) presentan una secuencia de una variante de CD44 con corte y empalme alternativo denominada CD44vRA. CD44vRA humana contiene la misma secuencia que la de la isoforma CD44v3-v10 de queratinocitos con una adición de una alanina adicional en la unión del corte y empalme entre el exón variante 4 y el exón variante 5, que no interfiere con el marco de lectura. Los ratones con artritis inducida por colágeno (AIC) contienen en el mismo sitio una secuencia similar que también incluye la alanina. La secuencia de CD44vRA se expresa en células sinoviales inflamatorias articulares de pacientes con AR y pacientes con artropatía psoriásica (AP), pero no en queratinocitos ni en leucocitos de sangre periférica (los LSP) de donantes sanos. Adicionalmente, mientras que las células inflamatorias articulares de pacientes con AR expresan CD44vRA, los LSP de los mismos pacientes y las células del líquido sinovial de los pacientes con artrosis apenas expresan esta variante, demostrando la exclusividad de esta isoforma. (Nedvetzki et al., J Clin Invest 111:1211-1220, 2003; Golan et al., J Autoimm 28:99-113, 2007).

Se ha informado que la administración de anticuerpos anti-CD44, proteínas, péptidos o derivados de CD44 pueden utilizarse para tratar diversas enfermedades autoinmunitarias (por ejemplo, Naor et al., Adv. Cancer Res., 71, 241­ 319, 1997; Naor et al., Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 39, 527-579, 2002; Turley EA y Naor D. Front Biosci. 17:1775-1794, 2012). Además, se sugirieron previamente anticuerpos monoclonales anti-CD44vRA y péptidos derivados de CD44vRA (Golan et al., Autoimm 28:99-113, 2007, publicaciones de solicitud internacional N.°: WO2010/058396, WO 2005/007700; WO 2003/014160, WO 2000/075312; Patente de Estados Unidos N.°: US 7.534.605 y US 8.193.311; y la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos N.°: US 20060019340).

Sumario de la invención

De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un polipéptido aislado que consiste en un aminoácido de la SEQ ID NO 1. Además, se divulgan péptidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 2 y 3.

De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un polipéptido modificado con protección terminal aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-3, en donde el polipéptido modificado comprende una actividad antinflamatoria.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la protección terminal comprende una protección terminal del extremo N.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la protección terminal del extremo N comprende un acetilo. De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la protección terminal comprende una protección terminal del extremo C.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la protección terminal del extremo C comprende una amida. De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el polipéptido consiste en una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el polipéptido es como se expone en la SEQ ID NO: 1.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el polipéptido modificado con protección terminal consiste en la SEQ ID NO: 4.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, se proporciona una composición de materia que comprende el polipéptido aislado y una fracción no proteinácea unida al polipéptido aislado, en donde el polipéptido de fusión aislado comprende una actividad antinflamatoria.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, se proporciona un polipéptido de fusión aislado que comprende el polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos unida de forma C y/o N terminal, en donde la secuencia de aminoácidos C terminal es una secuencia de aminoácidos de CD44vRA no contigua con el polipéptido de fusión aislado; y en donde el polipéptido de fusión comprende una actividad antinflamatoria.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, lo unido es por unión covalente.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la actividad antinflamatoria no depende de vacunación ni de tolerancia mucosa.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el polipéptido aislado o la composición de materia es capaz de unirse a una proteína seleccionada del grupo que consiste en amiloide sérico A, Transtirretina y apolipoproteína B. De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende como agente activo el polipéptido aislado o la composición de materia; y un transportador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, se proporciona un método de tratamiento de una enfermedad inflamatoria en un sujeto que lo necesite, el método comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido aislado, de la composición de materia o de la composición farmacéutica, tratando de este modo la enfermedad inflamatoria en el sujeto.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, se proporciona un uso del polipéptido aislado, de la composición de materia o de la composición farmacéutica, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la administración comprende la administración oral.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la composición se formula para la administración oral.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la enfermedad inflamatoria implica células que expresan CD44vRA.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, artropatía psoriásica, enfermedad de Alzheimer, cáncer y enfermedad cardiovascular.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la enfermedad inflamatoria es artritis reumatoide.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido aislado.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, se proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido aislado.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, se proporciona un método de determinación de la potencia de un lote del polipéptido aislado, de la composición de materia o de la composición farmacéutica, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto un lote del polipéptido aislado, de la composición de materia o de la composición farmacéutica con fibroblastos obtenidos de una articulación inflamatoria de un paciente con artritis reumatoide; y

(b) determinar la supervivencia de los fibroblastos después de un tiempo de incubación predeterminado, para determinar la potencia del lote.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el método comprende sintetizar el polipéptido aislado, la composición de materia o la composición farmacéutica con una modificación antes de la puesta en contacto.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la supervivencia reducida de los fibroblastos después de la puesta en contacto es indicativa de que el lote es potente.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el método comprende comparar la supervivencia de las células con la supervivencia de las células después de la puesta en contacto con un lote patrón de referencia del polipéptido aislado, de la composición de materia o de la composición farmacéutica, para determinar la potencia relativa del lote.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el método se efectúa in vitro o ex vivo.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y/o científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comprende habitualmente un experto en la materia a la que pertenece la invención. Aunque en la práctica o en las pruebas de las realizaciones de la invención pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, a continuación se describen métodos y/o materiales ejemplares. En caso de conflicto, la memoria descriptiva de la patente, incluidas las definiciones, prevalecerá. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser necesariamente limitantes.

Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos

Algunas realizaciones de la invención se describen en el presente documento, solo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos. Con referencia concreta ahora a los dibujos en detalle, se enfatiza que los detalles que se muestran son a modo de ejemplo y con fines de análisis ilustrativo de realizaciones de la invención. En este sentido, la descripción tomada junto con los dibujos hace evidente a los expertos en la materia cómo pueden ponerse en práctica las realizaciones de la invención.

En los dibujos:

La FIG. 1 muestra un análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas (CLEM) que demuestra el % de estabilidad del péptido RA de 5 meros (SEQ ID NO: 1) después del almacenamiento a las temperaturas indicadas; suponiendo que el almacenamiento a -20 °C represente el 100 % de estabilidad.

Las FIG. 2A-C son gráficos que demuestran que el péptido RA de 9 meros (SEQ ID NO: 3) reduce la inflamación articular en ratones con artritis inducida por colágeno (AIC) en un contexto de DBA/1. Las Figuras muestran hinchazón de la pata después de la inyección del péptido de 9 meros a una dosis de 25 mg (Figura 2A), 100 mg (Figura 2B) o 150 mg (Figura 2C) en los puntos de tiempo indicados (marcados con puntas de flecha). Se inyectó PBS como control. El eje y representa A de inflamación de la pata, que indica la diferencia (en mm) entre el ancho de la pata en cada uno de los puntos de tiempo de medición y el ancho de la pata al inicio de la enfermedad (tiempo 0). Los resultados se expresan como medias 6 ET; el número de ratones de cada grupo (n) se indica en los recuadros de cada Figura; *P < 0,05.

Las FIG. 3A-C demuestran que el tratamiento con el péptido RA de 5 meros (SEQ ID NO: 1) puede restablecer la histología normal de la articulación inflamada en ratones con AIC en el contexto de C57BL/6. Las Figuras 3A y 3B son fotomicrografías representativas de cortes de la articulación de las extremidades posteriores teñidas con H y E de ratones tratados con control de PBS (Figura 3A) o péptido RA de 5 meros (Figura 3B). La Figura 3C es un gráfico que resume la puntuación inflamatoria promedio evaluada mediante el examen histológico de secciones de la articulación de las extremidades posteriores teñidas con H y E de ratones tratados con PBS de control (n = 7) o péptido RA de 5 meros (n = 7), en donde 0 indica que no hay infiltración y 4 indica una gran infiltración. p <0,0001. La FIG. 4 es un gráfico que demuestra que los péptidos Ra protegidos de 7 y 9 meros (las SEQ ID NO: 5-6) reducen la inflamación articular en ratones con AIC en el contexto de DBA/1. La Figura muestra la hinchazón de la pata después de la inyección de los péptidos a una dosis de 200 mg en los puntos de tiempo indicados (marcados con flechas). Se inyectó PBS como control. El eje y representa A de inflamación de la pata, que indica la diferencia (en mm) entre el ancho de la pata en cada uno de los puntos de tiempo de medición y el ancho de la pata al inicio de la enfermedad (tiempo 0). Los resultados se expresan como medias 6 ET; el número de ratones de cada grupo (n) se indica en los recuadros de cada Figura; * P < 0,05, ** p < 0,01.

Las FIG. 5A-B son gráficos que demuestran que el péptido RA protegido de 5 meros (SEQ ID NO: 4) reduce la inflamación articular en ratones con AIC en un contexto de DBA/1. Las Figuras muestran la hinchazón de la pata después de la inyección del péptido a una dosis de 200 mg en los puntos de tiempo indicados (marcados con flechas). Se inyectaron como control PBS (Figuras 5A y 5B) o dexametasona (Dex) (Figura 5A). El eje y representa A de inflamación de la pata, que indica la diferencia (en mm) entre el ancho de la pata en cada uno de los puntos de tiempo de medición y el ancho de la pata al inicio de la enfermedad (tiempo 0). Los resultados se expresan como medias 6 ET; el número de ratones de cada grupo (n) se indica en los recuadros de cada Figura; * P < 0,05, **p<0,01.

La FIG. 6 es un gráfico que demuestran que el péptido RA protegido de 5 meros (SEQ ID NO: 4) reduce la inflamación articular en ratones con AIC en un contexto de C57BL. Las Figuras muestran hinchazón de la pata después de la inyección del péptido a una dosis de 70 mg durante 10 días consecutivos después del inicio de la enfermedad. Se inyectó PBS como control. El eje y representa A de inflamación de la pata, que indica la diferencia (en mm) entre el ancho de la pata en cada uno de los puntos de tiempo de medición y el ancho de la pata al inicio de la enfermedad (tiempo 0). Los resultados se expresan como medias 6 ET; * P < 0,006.

Las FIG. 7A-C son gráficos que demuestran que el péptido RA protegido de 7 meros, que incluye la secuencia central MTADV (SEQ ID NO: 5), reduce la inflamación articular en ratones con AIC en un contexto de DBA/1, mientras que el péptido protegido de 7 meros central desordenado no específico (SEQ ID NO: 7) no tiene ningún efecto sobre la inflamación articular. Las Figuras muestran hinchazón de la pata después de la inyección de los péptidos a una dosis de 200 mg en los puntos de tiempo indicados (marcados con flechas). Se inyectó PBS como control. El eje y representa la hinchazón de la pata en mm (Figuras 7A y 7C) o A de hinchazón de la pata (Figura 7B), que indica la diferencia entre el ancho de la pata en cada uno de los puntos de tiempo de medición y el ancho de la pata al inicio de la enfermedad (tiempo 0, Figura 7B). Los resultados se expresan como medias 6 ET; el número de ratones de cada grupo (n) se indica en los recuadros de cada Figura; *P< 0,05, **p< 0,005.

La FIG. 8 es un gráfico de barras que muestra los porcentajes de patas traseras sanas en ratones con AIC después de la inyección de péptido RA protegido de 7 meros (SEQ ID NO: 5) o de péptido de 7 meros desordenado no específico (SEQ ID NO: 7) de acuerdo con el método experimental descrito en la Tabla 6. Se inyectó PBS como control.

Las FIG. 9A-B son gráficos que demuestran que una dosis de 70 mg por inyección es la dosis óptima para inhibir la inflamación articular en ratones con AIC en el contexto de C57BL/6 mediante el péptido RA protegido de 5 meros (SEQ ID NO: 4). Las Figuras muestran hinchazón de la pata después de la inyección del péptido a una dosis de 70, 200 y 600 mg (Figura 9A) o de 10, 25 y 70 mg (Figura 9B) durante 10 días consecutivos después del inicio de la enfermedad. Se inyectó PBS como control. El eje y representa A de inflamación de la pata, que indica la diferencia entre el ancho de la pata en cada uno de los puntos de tiempo de medición y el ancho de la pata al inicio de la enfermedad (tiempo 0). Los resultados se expresan como medias 6 ET; el número de ratones de cada grupo (n) se indica en los recuadros de cada gráfico; * P se indica en cada gráfico.

La FIG. 10 muestra gráficos que demuestran el efecto del péptido RA de 5 meros (SEQ ID NO: 1) sobre la respuesta de hipersensibilidad de tipo retardada (DTH) en ratones C57BL/6. El eje y representa la diferencia de grosor entre las orejas derecha e izquierda el día 7. El tratamiento con PBS y anti-TNFa sirvió como control positivo y negativo, respectivamente. Los resultados se expresan como medias 6 ET. El protocolo de DTH comprendía sensibilización con oxazolona el día 0; suscitación (exposición) en el oído con oxazolona el día 6; y medición del grosor del oído el día 7. Se inyectó PBS o péptido desde el día -1 hasta el día 7.

La FIG. 11 es un gráfico que muestra la ausencia de anticuerpos neutralizantes antipéptido específicos en el suero de ratones tratados con el péptido de 5 meros (SEQ ID NO:1), según lo determinado mediante ELISA. Se recubrieron placas de ELISA con el péptido de 5 meros o con colágeno e IgG de ratón, que sirvieron como controles positivos. Se añadieron a los pocillos de la placa sueros de ratones tratados con el péptido de 5 meros o con PBS. Los sueros de ratones sin tratamiento previo y de ratones tratados con PBS sirvieron como controles negativos. La FIG. 12 es una representación esquemática del procedimiento utilizado para la identificación de las proteínas diana del péptido de 5 meros.

La FIG. 13 es un gráfico que muestra la eliminación farmacocinética del péptido RA de 5 meros (SEQ ID NO: 1) en el suero de ratones después de una única inyección del péptido.

La FIG. 14 es un gráfico que demuestra el efecto in vitro del péptido RA de 5 meros (SEQ ID NO: 1) sobre la supervivencia de fibroblastos aislados de la articulación inflamatoria de un paciente con AR, según lo determinado mediante un ensayo de MTT.

La FIG. 15 es un gráfico que demuestra que el amiloide sérico A (SAA) impide el efecto in vitro del péptido RA de 5 meros (SEQ ID NO: 1) sobre la supervivencia de fibroblastos aislados de la articulación inflamatoria de un paciente con AR, según lo determinado mediante un ensayo de MTT. La lactoalbúmina (LA) se utilizó como control no específico. El péptido de 5 meros se añadió en una concentración constante (25 mg/ml); el eje x indica la concentración de SAA y LA.

La FIG. 16 es un gráfico que demuestra el efecto in vitro del péptido RA de 5 meros (SEQ ID NO: 1) sobre la supervivencia de fibroblastos aislados de la articulación inflamatoria de un paciente con AR en comparación con el péptido RA protegido de 5 meros (SEQ ID NO: 4), según lo determinado mediante un ensayo de MTT.

Descripción de realizaciones específicas de la invención

La presente invención, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a un polipéptido aislado de CD44 y, más particularmente, pero no exclusivamente, a un polipéptido aislado de CD44vRA y su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias.

Antes de explicar al menos una realización de la invención en detalle, ha de comprenderse que la invención no está limitada necesariamente en su aplicación a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ejemplificados mediante los Ejemplos. La invención es susceptible de otras realizaciones o de ponerse en práctica o de llevarse a cabo de diversas maneras.

CD44 es una molécula de adhesión de superficie celular implicada en múltiples funciones celulares, incluyendo las interacciones célula-célula y célula-matriz, la migración celular, la muerte celular programada o, contrariamente, la supervivencia y proliferación celular. La secuencia genómica de CD44 humana incluye 5 exones constantes en el extremo 5' y 5 exones constantes en el extremo 3', así como 9 exones variantes comprendidos entre ellos. Hasta la fecha se conocen muchas variantes de corte y empalme de CD44. Las CD44 (SEQ ID NO: 9), que no contienen ningún exón variante, son la forma más ubicua y se expresan en la mayoría de los tipos celulares. Las células inflamatorias articulares de pacientes con artritis psoriásica (AP), artritis reumatoide (AR), presentan una secuencia de la variante de CD44 con corte y empalme alternativo designada CD44vRA (SEQ ID NO: 11), no expresada en queratinocitos ni en leucocitos de sangre periférica (LSP) de donantes sanos.

Mientras reducen la presente invención a la práctica, los presentes inventores han descubierto ahora que péptidos de tan solo 5 meros que comprenden una secuencia MTADV resultante de la inclusión de alanina en la unión del corte y empalme entre el exón variante 4 y el exón variante 5 de CD44vRA son capaces de inhibir la inflamación articular en un modelo de AIC de ratón (el análogo en ratón de AR humana). Sin pretender quedar ligados a teoría alguna, se cree que los polipéptidos de algunas realizaciones de la invención suscitan su actividad al competir con el ligando natural de CD44vRA.

Como se ilustra a continuación y en la sección de ejemplos, que sigue, los presentes inventores han sintetizado péptidos de 5, 7 y 9 meros (las SEQ ID NO: 1-3, también indicado en el presente documento como "péptidos RA") y los péptidos respectivos con restos protectores de acetilo y amida, en los extremos amino y carboxilo terminales de los péptidos, respectivamente (las SEQ ID NO: 4-6, también indicados en el presente documento como "péptidos RA protegidos"). Los péptidos comprenden aminoácidos hidrófobos, no tienen sitios proteolíticos y son estables a temperatura ambiente y a 4 °C durante al menos 22 semanas (Ejemplo 1, Figura 1). Los péptidos RA y los péptidos RA protegidos sintetizados pudieron reducir la inflamación articular in vivo en un modelo de ratón de AIC (Ejemplos 2­ 4, Figuras 2A-B, 3A-C; 4, 5-A-B, 6, 8 y 9A-B). Además, los péptidos no suscitaron la generación de anticuerpos neutralizantes específicos antipéptido ni afectaron la respuesta inmunitaria general según se evaluó mediante la respuesta de hipersensibilidad retardada (DTH, forma siglada de delayed hypersensitivity) (Ejemplo 5-6, Figuras 10­ 11). Cabe destacar que, un péptido protegido de 7 meros desordenado no específico (SEQ ID NO: 7) no tuvo efecto sobre la inflamación articular en el modelo de ratón de AIC (Ejemplo 3, Figuras 7A-B y 8). El análisis por espectrometría de masas reveló adicionalmente pocas proteínas diana potenciales de los péptidos RA, a saber, amiloide sérico A, Transtirretina y Apolipoproteína B (Ejemplo 7, Figura 12). Además, los inventores han desarrollado un nuevo ensayo in vitro para probar la actividad de los péptidos RA y los péptidos RA protegidos (Ejemplo 9, Figuras 14-16).

En consecuencia, las presentes enseñanzas sugieren el uso de composiciones que comprenden los péptidos RA y RA protegidos en el tratamiento de enfermedades inflamatorias.

Por lo tanto, de acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un polipéptido aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

De acuerdo con realizaciones específicas, el polipéptido es como se expone en la SEQ ID NO: 1.

De acuerdo con una divulgación específica, el polipéptido es como se expone en la SEQ ID NO: 2.

De acuerdo con una divulgación específica, el polipéptido es como se expone en la SEQ ID NO: 3.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un polipéptido modificado con protección terminal aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, en donde dicho polipéptido modificado comprende una actividad antinflamatoria.

De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de aminoácidos polipeptídica del polipéptido modificado con protección terminal consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición de materia que comprende el polipéptido aislado y una fracción no proteinácea unida al polipéptido aislado, en donde el polipéptido de fusión aislado comprende una actividad antinflamatoria.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un polipéptido de fusión aislado que comprende el polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos unida de forma C y/o N terminal, en donde dicha secuencia de aminoácidos C terminal es una secuencia de aminoácidos de CD44vRA no contigua con dicho polipéptido de fusión aislado; y en donde dicho polipéptido de fusión comprende una actividad antinflamatoria.

Los términos "péptido" y "polipéptido" que se usan indistintamente en el presente documento abarcan péptidos nativos (productos de degradación, péptidos sintetizados sintéticamente o péptidos recombinantes) y peptidomiméticos (normalmente, péptidos sintetizados sintéticamente), así como peptoides y semipeptoides que son análogos de péptidos, que puede tener, por ejemplo, modificaciones que hacen que los péptidos sean más estables mientras están en un cuerpo, más capaces de penetrar en las células mejorando la eliminación, la biodistribución y/o la farmacocinética. Dichas modificaciones incluyen, pero sin limitación, la modificación del extremo N, la modificación del extremo C, la modificación de enlaces peptídicos, modificaciones de la estructura principal y la modificación de restos. Los métodos de preparación de compuestos peptidomiméticos son bien conocidos en la técnica y se especifican, por ejemplo, en Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Capítulo 17,2, F. Choplin Pergamon Press (1992), que se incorpora por referencia como si se expusiera por completo en el presente documento. A continuación se proporcionan más detalles a este respecto.

Los enlaces peptídicos (-CO-NH-) dentro del péptido pueden estar sustituidos, por ejemplo, por enlaces amida N-metilados (-N(CH3)-CO-), enlaces éster (-C(=O)-O-), enlaces cetometileno (-CO-CH2-), enlaces sulfinilmetileno (-S(=O)-CH2-), enlaces a-aza (-NH-N(R)-CO-), en donde R es cualquier alquilo (por ejemplo, metilo), enlaces amina (-CH2-NH-), enlaces sulfuro (-CH2-S-), enlaces etileno (-CH2-CH2-), enlaces hidroxietileno (-CH(OH)-CH2-), enlaces tioamida (-CS-NH-), dobles enlaces olefínicos (-CH=CH-), dobles enlaces olefínicos fluorados (-CF=CH-), enlaces retroamida (-NH-CO-), derivados peptídicos (-N(R)-CH2-CO-), en donde R es la cadena lateral "normal", presente de manera natural en el átomo de carbono.

Estas modificaciones pueden estar presentes en cualquiera de los enlaces a lo largo de la cadena peptídica e incluso en varios enlaces (por ejemplo, 2-3) al mismo tiempo.

Los aminoácidos aromáticos naturales, Trp, Tyr y Phe, puede estar sustituido por aminoácidos aromáticos no naturales tal como el ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico (Tic), naftilalanina, derivados de Phe con el anillo metilado, derivados halogenados de Phe u O-metil-Tyr.

Los péptidos de algunas realizaciones de la invención también pueden incluir uno o más aminoácidos modificados o uno o más monómeros no aminoácidos (por ejemplo, ácidos grasos, hidratos de carbono complejos, etc.).

Se entiende que el término "aminoácido" o "aminoácidos" incluye los 20 aminoácidos de origen natural; esos aminoácidos a menudo se modifican postraduccionalmente in vivo, entre ellos, por ejemplo, hidroxiprolina, fosfoserina y fosfotreonina; y otros aminoácidos inusuales que incluyen, pero sin limitación, acido 2-aminoadípico, hidroxilisina, isodesmosina, norvalina, norleucina y ornitina. Adicionalmente, el término "aminoácido" incluye los D- y L-aminoácidos (estereoisómeros).

Las siguientes tablas 1 y 2 enumeran los aminoácidos de origen natural (Tabla 1) y los aminoácidos no convencionales o modificados (por ejemplo, sintéticos, Tabla 2), que pueden utilizarse con algunas realizaciones de la invención.

Tabla 1

continuación

Tabla 2

(continuación)

(continuación)

Los aminoácidos de los polipéptidos de la presente invención pueden sustituirse de forma conservativa o no conservativa.

La expresión "sustitución conservativa", como se usa en el presente documento, se refiere al reemplazo de un aminoácido presente en la secuencia nativa del péptido por un aminoácido de origen natural o no natural, o un peptidomimético que tiene propiedades estéricas similares. Cuando la cadena lateral del aminoácido nativo a reemplazar es polar o hidrófoba, la sustitución conservativa debería ser por un aminoácido de origen natural, un aminoácido no de origen natural o por una fracción de peptidomimético que también sea polar o hidrófobo (además de tener las mismas propiedades estéricas que la cadena lateral del aminoácido reemplazado).

Como los aminoácidos de origen natural se agrupan normalmente de acuerdo con sus propiedades, las sustituciones conservativas por aminoácidos de origen natural pueden determinarse fácilmente teniendo en cuenta el hecho de que, en conformidad con la invención, el reemplazo de aminoácidos cargados por aminoácidos no cargados estéricamente similares se consideran sustituciones conservativas.

Para producir sustituciones conservativas por aminoácidos no de origen natural, también es posible utilizar análogos de aminoácidos (aminoácidos sintéticos) bien conocidos en la técnica. Un peptidomimético del aminoácido de origen natural está bien documentado en la bibliografía conocida por experto.

Cuando afecta a sustituciones conservativas, el aminoácido sustituyente debe tener el mismo grupo funcional o uno similar en la cadena lateral que el aminoácido original.

La frase "sustituciones no conservativas", como se usa en el presente documento, se refiere al reemplazo del aminoácido presente en la secuencia original por otro aminoácido de origen natural o no natural, que tiene distintas propiedades electroquímicas y/o estéricas. Por lo tanto, la cadena lateral del aminoácido sustituyente puede ser significativamente más grande (o más pequeña) que la cadena lateral del aminoácido nativo sustituido y/o puede tener grupos funcionales con propiedades electrónicas significativamente distintas de las del aminoácido sustituido. Los ejemplos de sustituciones no conservativas de este tipo incluyen la sustitución de alanina por fenilalanina o ciclohexilmetilglicina, glicina por isoleucina, o ácido aspártico por -NH-CH[(-CH²)⁵-COOH]-CO-. Las sustituciones no conservativas que entran dentro del alcance de la presente invención son las que aún constituyen un péptido que tiene propiedades neuroprotectoras.

Los péptidos de algunas realizaciones de la invención se utilizan preferentemente en forma lineal, aunque se apreciará que en los casos en que la ciclación no interfiera gravemente con las características del péptido, también se pueden utilizar formas cíclicas del péptido.

Dado que los presentes péptidos se utilizan preferentemente en tratamientos que precisan que los péptidos estén en forma soluble, los péptidos de algunas realizaciones de la invención incluyen preferentemente uno o más aminoácidos polares no naturales o naturales, incluyendo, pero sin limitación, serina y treonina, que son capaces de aumentar la solubilidad del péptido debido a su cadena lateral que contiene hidroxilo.

Como se ha mencionado, los términos N y C de los péptidos de la presente invención pueden estar protegidos por grupos funcionales. Los grupos funcionales adecuados se describen en Green y Wuts, "Protecting Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, Capítulos 5 y 7, 1991, cuyas enseñanzas se incorporan en el presente documento por referencia. Por lo tanto, el polipéptido puede modificarse en el extremo N (amina) y/o el extremo C (carboxilo) del mismo, para producir un péptido modificado con protección terminal.

Como se usa en el presente documento, las frases "polipéptido modificado con protección terminal" y "polipéptido protegido", que se usan indistintamente en el presente documento, se refieren a un polipéptido que se ha modificado en el extremo N (amina) y/o el extremo C (carboxilo) del mismo. La modificación con protección terminal se refiere a la unión de una fracción química al extremo del polipéptido, para formar una caperuza. Dicha fracción química se denomina en el presente documento fracción de protección terminal y normalmente también se denomina en el presente y en la técnica, indistintamente, fracción o grupo protector de péptidos. Los grupos protectores hidroxilo incluyen, pero sin limitación, ésteres, carbonatos y grupos protectores carbamato. Los grupos protectores amina incluyen, pero sin limitación, grupos protectores alcoxi y ariloxicarbonilo. Los grupos protectores de ácido carboxílico incluyen, pero sin limitación, ésteres alifáticos, bencílicos y arílicos.

La frase "fracción de protección terminal", como se usa en el presente documento, se refiere a una fracción que, cuando se une al extremo del péptido, modifica los extremos N y/o C terminales del péptido. La modificación de protección terminal normalmente da como resultado el enmascaramiento de la carga del extremo del péptido y/o la modificación de las características químicas del mismo, tales como, hidrofobicidad, hidrofilidad, reactividad, solubilidad y similares. Al seleccionar la naturaleza de la modificación con protección terminal, la hidrofobicidad/hidrofilicidad, así como la solubilidad del péptido, pueden controlarse finamente. De acuerdo con realizaciones específicas, los grupos protectores facilitan el transporte del péptido unido al mismo hacia una célula. Estas fracciones pueden escindirse in vivo, ya sea por hidrólisis o enzimáticamente, dentro de la célula.

De acuerdo con realizaciones específicas, la modificación con protección terminal no compromete la actividad biológica (es decir, la actividad antinflamatoria) del polipéptido. Se pueden encontrar ejemplos de fracciones adecuadas para la modificación con protección terminal del péptido, por ejemplo, en Green et al., "Protective Groups in Organic Chemistry", (Wiley, 2.a edición sup., 1991) y Harrison et al., "Compendium of Synthetic Organic Methods", Vol. 1-8 (John Wiley and Sons, 1971-1996).

De acuerdo con realizaciones específicas, la protección terminal comprende una protección terminal del extremo N.

Los ejemplos representativos de fracciones de protección terminal del extremo N-terminal incluyen, pero sin limitación, grupos formilo, acetilo (también indicado en el presente documento como "Ac"), trifluoroacetilo, bencilo, benciloxicarbonilo (también indicado en el presente documento como "Cbz"), terc-butoxicarbonilo (también indicado en el presente documento como "Boc"), trimetilsililo (también indicado como "TMS"), 2-trimetilsilil-etanosulfonilo (también indicado como "SES"), tritilo y tritilo sustituido, aliloxicarbonilo, 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (también indicado en el presente documento como "Fmoc"), y nitro-veratriloxicarbonilo ("NVOC").

De acuerdo con realizaciones específicas, la protección terminal del extremo N comprende un acetilo.

De acuerdo con realizaciones específicas, la protección terminal comprende una protección terminal del extremo C.

Los ejemplos representativos de fracciones de protección terminal del extremo C-terminal son normalmente fracciones que conducen a la acilación del grupo carboxi en el extremo C e incluyen, pero sin limitación, bencil y tritil éteres, así como alquil éteres, tetrahidropiranil éteres, trialquilsilil éteres, alil éteres, monometoxitritilo y dimetoxitritilo. Alternativamente, el grupo -COOH de la protección terminal del extremo C puede estar modificado a un grupo amida.

De acuerdo con realizaciones específicas, la protección terminal del extremo C comprende una amida.

Otras modificaciones con protección terminal de péptidos incluyen el reemplazo de una amina y/o carboxilo por una fracción distinta, tal como hidroxilo, tiol, haluro, alquilo, arilo, alcoxi, ariloxi y similares.

De acuerdo con realizaciones específicas, el péptido se modifica solo en el extremo N o el extremo C del mismo.

De acuerdo con otras realizaciones específicas, el péptido se modifica en el extremo N y el extremo C.

De acuerdo con realizaciones específicas, el péptido se modifica en el extremo N con un acetilo y en el extremo C con una amida.

De acuerdo con realizaciones específicas, el polipéptido modificado con protección terminal se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4-6.

La presente invención proporciona adicionalmente conjugados de polipéptido y polipéptidos de fusión que comprenden péptidos, análogos y derivados de acuerdo con la invención.

Por lo tanto, como se ha mencionado, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un polipéptido de fusión aislado que comprende el polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos unida de forma C y/o N terminal, en donde dicha secuencia de aminoácidos C terminal es una secuencia de aminoácidos de CD44vRA no contigua con dicho polipéptido de fusión aislado; y en donde dicho polipéptido de fusión comprende una actividad antinflamatoria.

Como se usa en el presente documento, la frase "secuencia de aminoácidos de CD44vRA no contigua" se refiere a un polipéptido de fusión que no comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 directamente unida en su extremo C a una secuencia de aminoácidos de CD44vRA que comienza en las coordenadas 306, 308 o 308, respectivamente, de la SEQ ID NO: 11.

De acuerdo con realizaciones específicas, el polipéptido aislado y la secuencia de aminoácidos unida están unidos covalentemente, directamente o a través de un espaciador o un enlazador que puede ser un enlazador sintético o de aminoácidos.

Como se usa en el presente documento, el término "CD44" se refiere a la proteína de superficie celular que se expresa en un gran número de tipos celulares de mamífero y que está codificada por el gen de CD44. De acuerdo con una realización específica, el CD44 es el gen de CD44 humano. La isoforma normal, designada CD44, que comprende los exones 1-5 y 16-20, se expresa en la mayoría de los tipos celulares y se expone en los números de referencia de GeneBank NM_000610 y NP_000601 (las SEQ ID NO: 8 y 9).

Como se usa en el presente documento, el término "CD44vRA" (SEQ ID NO: 10 y 11) se refiere a una variante de CD44 que se expresa en sitios de inflamación, por ejemplo, en células de líquido sinovial de pacientes con AR pero no en los LSP de individuos sanos. La variante CD44vRA es una secuencia de origen natural que se produce presumiblemente por corte y empalme alternativo del transcrito primario del gen CD44 conocido, que está presente en las células en sitios inflamatorios (por ejemplo, en las articulaciones de pacientes con AR) y no surge del truncamiento o mutación del gen de CD44 conocido. Esta secuencia variante de CD44vRA comprende los exones 1­ 5, 15-17 y 19 de la parte constante del gen de CD44, así como los exones 7-14 (v3-v10) de la región variable del gen. La secuencia codificante variante comprende tres bases adicionales (CAG) que se transcriben desde el extremo del intrón que une el Exón v4 y el Exón v5, y se insertan en el extremo 5' del Exón v5. Esta secuencia CAG adicional da como resultado la inserción de un nuevo codón para el aminoácido alanina en la posición 303 de la SEQ ID NO: 11 al tiempo que se deja intacto el marco de lectura.

Los términos "CD44" y "CD44vRA", también se refieren a los homólogos de CD44 y CD44vRA que presentan la actividad deseada (por ejemplo, migración celular y/o interacciones célula-célula y célula-matriz). Dichos homólogos pueden ser, por ejemplo, al menos el 80 %, al menos el 81 %, al menos el 82 %, al menos el 83 %, al menos el 84 %, al menos el 85 %, al menos el 86 %, al menos el 87 %, al menos el 88 %, al menos el 89 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99% o el 100% idénticos u homólogos al polipéptido de las SEQ ID NO: 9 y 11, o el 80 %, al menos el 81 %, al menos el 82 %, al menos el 83 %, al menos el 84 %, al menos el 85 %, al menos el 86 %, al menos el 87 %, al menos el 88 %, al menos el 89 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % idénticos a la secuencia polinucleotídica que los codifica.

El homólogo también se puede referir a un ortólogo, a una variante de deleción, inserción o sustitución, incluyendo una sustitución de aminoácidos, siempre y cuando conserve la actividad.

La identidad de secuencia u homología se puede determinar utilizando cualquier algoritmo de alineamiento de secuencias de proteínas o ácido nucleicos tal como Blast, ClustalW y MUSCLE.

De acuerdo con otras realizaciones específicas de la invención, el péptido está unido a una fracción no proteinácea.

De acuerdo con realizaciones específicas, el polipéptido aislado y la fracción no proteinácea unida están unidos covalentemente, directamente o a través de un espaciador o un enlazador.

La frase "fracción no proteinácea", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que no incluye aminoácidos unidos a un péptido que está unida al péptido descrito anteriormente. De acuerdo con una realización específica, la fracción no proteinácea es no tóxica. Los ejemplos de fracciones no proteináceas que pueden utilizarse de acuerdo con las presentes enseñanzas incluyen, pero sin limitación a un fármaco, un producto químico, una molécula pequeña, un polinucleótido, una fracción detectable, polietilenglicol (PEG), polivinilpirrolidona (PVP), poli(estireno anhídrido maleico) (SMA) y copolímero de divinil éter y anhídrido maleico (DIVEMA). De acuerdo con realizaciones específicas de la invención, la fracción no proteinácea comprende polietilenglicol (PEG).

Dicha molécula es altamente estable (resistente a la actividad proteolítica in vivo probablemente debido al impedimento estérico conferido por la fracción no proteinácea) y puede producirse utilizando métodos comunes de síntesis en fase sólida que son económicos y altamente eficaces, como se describe adicionalmente a continuación en el presente documento. Sin embargo, se apreciará que aún se pueden utilizar técnicas recombinantes, por lo que el producto peptídico recombinante se somete a modificación in vitro (por ejemplo, PEGilación, como se describe adicionalmente a continuación en el presente documento).

La bioconjugación de la secuencia de aminoácidos del polipéptido con PEG (es decir, PEGilación) puede efectuarse utilizando derivados de PEG tales como ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) de ácidos carboxílicos del PEG, monometoxiPEG²-NHS, succinimidil éster de PEG carboximetilado (SCM-PEG), derivados de carbonato de benzotriazol de PEG, glicidil éteres de PEG, PEG carbonatos de p-nitrofenilo (PEG-NPC, tal como metoxi PEG-NPC), aldehídos de PEG, PEG-ortopiridil-disulfuro, PEG activados con carbonildimidazol, PEG-tiol, PEG-maleimida. Dichos derivados de PEG están disponibles en el mercado en diversos pesos moleculares [Véase, por ejemplo, Catalog, Polyethylene Glycol and Derivatives, 2000 (Shearwater Polymers, Inc., Huntsvlle, Ala.)]. Si se desea, muchos de los derivados anteriores están disponibles en forma monofuncional monometoxiPEG (mPEG). En general, el PEG añadido al polipéptido de la presente invención debería variar de un peso molecular (PM) de varios cientos de Dalton a aproximadamente 100 kDa (por ejemplo, entre 3-30 kDa). Se puede utilizar PEG de un PM más grande, pero puede dar como resultado cierta pérdida de rendimiento de los polipéptidos PEGilados. Además, se debe observar la pureza de las moléculas de PEG más grandes, ya que puede ser difícil obtener un PEG de PM más grande con una pureza tan alta como la que se puede obtener para PEG de PM más bajo. Es preferible utilizar PEG de al menos el 85 % de pureza, y más preferentemente de al menos el 90 % de pureza, el 95 % de pureza o mayor. La PEGilación de moléculas se discute adicionalmente en, por ejemplo, Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press San Diego, Calif. (1996), en el Capítulo 15 y en Zalipsky et al., "Succinimidyl Carbonates of Polyethylene Glycol", en Dunn y Ottenbrite, eds., Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, American Chemical Society, Washington, D.C. (1991).

Convenientemente, El PEG se puede unir a una posición elegida en el polipéptido mediante mutagénesis dirigida, siempre que se conserve la actividad del conjugado. Una diana para la PEGilación podría ser cualquier resto de cisteína en el extremo N o el extremo C de la secuencia peptídica. Adicionalmente, o de manera alternativa, se pueden añadir otros restos de cisteína a la secuencia de aminoácidos del polipéptido (por ejemplo, en el extremo N o el extremo C), para servir como diana para la PEGilación. Puede realizarse análisis informático para seleccionar una posición preferente para la mutagénesis sin comprometer la actividad.

Pueden emplearse diversas químicas de conjugación de PEG activado, tal como PEG-maleimida, PEG-vinilsulfona (VS), PEG-acrilato (AC), disulfuro de PEG-ortopiridilo. Los métodos de preparación de moléculas de PEG activadas son conocidos en la técnica. Por ejemplo, el p EG-VS se puede preparar en argón haciendo reaccionar una solución de diclorometano (DCM) del PEGOH con NaH, y después con di-vinilsulfona (relaciones molares: OH 1: NaH 5: divinilsulfona 50, a 0,2 gramos de PEG/ml de DCM). El PEG-AC se fabrica en argón haciendo reaccionar una solución DCM del PEG-OH con cloruro de acriloílo y trietilamina (relaciones molares: OH 1: cloruro de acriloílo 1,5: trietilamina 2, a 0,2 gramos de PEG/ml de DCM). Dichos grupos químicos pueden unirse a moléculas de PEG linealizadas de 2 brazos, 4 brazos u 8 brazos.

Las moléculas conjugadas resultantes (por ejemplo, polipéptido PEGilado o conjugado con PVP) se separan, purifican y califican utilizando, por ejemplo, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) así como ensayos biológicos.

De acuerdo con la divulgación específica, la porción de péptido CD44vRA de los polipéptidos de la invención distintas de las del listado que consiste en la SEQ ID NO: 1 son de 5-100, 5-50 o 5-40, o 5-20, 5-15, 5 -10, 5-9, 5-7 aminoácidos de longitud.

De acuerdo con realizaciones específicas, la porción peptídica de los polipéptidos de la invención no comprende una secuencia de aminoácidos de CD44vRA distinta de las enumeradas que consisten en la SEQ ID NO: 1.

Los péptidos y las composiciones de materia de la presente invención pueden unirse (covalentemente o no covalentemente) a un agente de penetración.

Como se usa en el presente documento, la frase "agente de penetración" se refiere a un agente que potencia la translocación de cualquiera de los péptidos o composición de materia unidos a través de una membrana celular.

De acuerdo con una realización, el agente de penetración es un péptido y está unido al polipéptido (ya sea directamente o no directamente) a través de un enlace peptídico.

Normalmente, los agentes de penetración peptídicos tienen una composición de aminoácidos que contiene una gran abundancia relativa de aminoácidos cargados positivamente tales como lisina o arginina, o tienen secuencias que contienen un patrón alterno de aminoácidos polares/cargados y aminoácidos no polares, hidrófobos.

De acuerdo con realizaciones específicas, el polipéptido se proporciona en una formulación adecuada para la penetración celular, que potencia el suministro intracelular del polipéptido como se describe adicionalmente más adelante en el presente documento.

A modo de ejemplo no limitante, las secuencias peptídicas de penetración celular (PPC) pueden utilizarse para potenciar la penetración intracelular; sin embargo, la divulgación no es tan limitada y se puede utilizar cualquier agente de penetración adecuado, como saben los expertos en la materia.

Los péptidos de penetración celular (los PPC) son péptidos cortos (<40 aminoácidos), con la capacidad de acceder al interior de casi cualquier célula. Son altamente catiónicos y habitualmente ricos en los aminoácidos arginina y lisina. Tienen la propiedad excepcional de llevar a las células una amplia diversidad de cargas conjugadas covalentemente y no covalentemente, tales como proteínas, oligonucleótidos e incluso liposomas de 200 nm. Por lo tanto, de acuerdo con una realización ejemplar adicional, los PPC pueden utilizarse para transportar el polipéptido o la composición de materia al interior de las células.

El TAT (activador de la transcripción del VIH-1), pAntp (también llamado penetratina, homeodominio del factor de transcripción Antennapedia de Drosophila) y VP22 (del virus del herpes simple) son ejemplos de PPC que pueden entrar en las células de una manera no tóxica y eficaz, y pueden ser adecuados para su uso con algunas realizaciones de la invención. Se pueden encontrar protocolos para producir conjugados de PPC-cargas y para infectar células con tales conjugados, por ejemplo, en L Theodore et al. [The Journal of Neuroscience, (1995) 15(11): 7158-7167], Fawell S, et al. [Proc Natl Acad Sci USA, (1994) 91:664-668] y Jing Bian et al. [Circulation Research (2007) 100: 1626-1633].

Los polipéptidos de algunas realizaciones de la invención pueden sintetizarse mediante cualquier técnica que los expertos en la técnica de síntesis de péptidos conozcan, incluyendo técnicas en fase sólida y recombinantes.

Cualquiera de los polipéptidos proteináceos descritos en el presente documento puede estar codificado por un polinucleótido. Estos polinucleótidos pueden utilizarse como agentes terapéuticos en sí o en la producción recombinante del agente.

Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la presente invención.

Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido aislado.

Dicha construcción o sistema de ácido nucleico incluye al menos un elemento regulador que actúa en cis para dirigir la expresión de la secuencia de ácido nucleico. Las secuencias reguladoras que actúan en cis incluyen las que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos, así como las que dirigen la expresión inducible de la secuencia de nucleótidos solo bajo determinadas condiciones. Por lo tanto, por ejemplo, en la construcción de ácido nucleico se incluye una secuencia promotora para dirigir en la célula la transcripción de la secuencia polinucleotídica de una manera constitutiva o inducible.

Los polipéptidos aislados y las composiciones de materia de la presente invención están dotados de actividad antinflamatoria.

Como se usa en el presente documento, la frase "actividad antinflamatoria" se refiere a la prevención y/o la reducción de respuestas inflamatorias agudas y/o crónicas, y/o la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad relacionada con inflamación. Los ensayos para calificar una actividad antinflamatoria incluyen, pero sin limitación, los descritos a continuación en la sección de Ejemplos, que utilizan modelos in vitro e in vivo para afecciones inflamatorias (por ejemplo, RA). Los ejemplos no limitantes incluyen hinchazón de la pata in vivo en un modelo de ratón de AIC (véase, por ejemplo, Nedvetzki, etal., (2004) PNAS 101, 18081-18086), examen histológico de secciones articulares obtenidas de ratones con AIC y la viabilidad celular in vitro de fibroblastos obtenidos del líquido sinovial de un paciente con AR, como se describe adicionalmente más adelante en el presente documento.

De acuerdo con realizaciones específicas, la actividad antinflamatoria no depende de vacunación ni de tolerancia mucosa.

De acuerdo con realizaciones específicas, el polipéptido aislado de la composición de materia no afecta la respuesta inmunitaria en general, como puede evaluarse mediante un ensayo de hipersensibilidad de tipo retardada (DTH) como se describe en Weiss et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 285-290; y en el Ejemplo 5 en la sección de Ejemplos a continuación.

De acuerdo con realizaciones específicas, el polipéptido aislado o la composición de materia es capaz de unirse a una proteína seleccionada del grupo que consiste en amiloide sérico A, Transtirretina y apolipoproteína B.

Como se usa en el presente documento, el término "amiloide sérico A" o "SAA" se refiere al producto polinucleotídico y de expresión, por ejemplo, el polipéptido de los genes de SAA1, SAA2 y SAA4. SAA1 también se conoce como amiloide sérico AI, m Gc I 11216, PIG4, SAA y proteína 4 inducible por proteína tumoral p53 (TP53I4). De acuerdo con realizaciones específicas, el SAA1 se refiere al SAA1 humano, tal como se proporciona en los siguientes números de GeneBank NM_199161 y NM_000331, y número de Uniprot: P0DJI8 (las Se Q ID NO: 12-14). De acuerdo con realizaciones específicas, el SAA1 se refiere al SAA1 de ratón, tal como se proporciona en el siguiente número de GeneBank NM 009117 (SEQ ID NO: 15). SAA2 también se conoce como amiloide sérico A2 y SAA. De acuerdo con realizaciones específicas, el SAA2 se refiere al SAA2 humano, tal como se proporciona en los siguientes números de GeneBank NM_001127380 y NM_030754, y número de Uniprot P0DJI8 (las SEQ ID NO: 16-18). De acuerdo con realizaciones específicas, el SAA2 se refiere al SAA2 de ratón, tal como se proporciona en los siguientes números de GeneBank NM_011314 (SEQ ID NO: 19). De acuerdo con realizaciones específicas, el SAA4 se refiere al SAA4 humano, tal como se proporciona en el siguiente número de GeneBank NM_006512 y número de Uniprot P35542 (las SEQ ID NO: 20-21).

De acuerdo con realizaciones específicas, el término "SAA" se refiere a los genes de SAA1 y SAA2, que pertenecen a la familia de proteínas de fase aguda del amiloide sérico A.

Como se usa en el presente documento, el término "transtirretina", se refiere al producto polinucleotídico y de expresión, por ejemplo, el polipéptido del gen TTR, que es un transportador de proteínas de la hormona tiroidea tiroxina y el retinol. De acuerdo con realizaciones específicas, la transtirretina se refiere a la transtirretina humana, tal como se proporciona en los siguientes números de GeneBank NP_000362 y NM_000371 (las SEQ ID NO: 22-23). De acuerdo con otras realizaciones específicas, la transtirretina se refiere a la transtirretina de ratón, tal como se proporciona en los siguientes números de GeneBank NP_038725 y NM_013697 (las SEQ ID NO: 24-25).

Como se usa en el presente documento, la expresión "apolipoproteína B", se refiere al producto polinucleotídico y de expresión, por ejemplo, el polipéptido del gen APOB. De acuerdo con realizaciones específicas, la apolipoproteína B se refiere a la apolipoproteína B humana, tal como se proporciona en los siguientes números de GeneBank NP_000375 y NM_000384 (las s Eq ID NO: 26-27). De acuerdo con otras realizaciones específicas, la apolipoproteína B se refiere a la apolipoproteína B de ratón, tal como se proporciona en los siguientes números de GeneBank NP_033823 y NM_009693 (las SEQ ID NO: 28-29).

En virtud de su actividad antinflamatoria, los polipéptidos y composiciones de materia de la presente invención pueden utilizarse para tratar enfermedades que dependen de CD44vRA (actividad o expresión) para su inicio o progresión, tal como para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, tal como la artritis reumatoide (AR).

Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un método de tratamiento de una enfermedad inflamatoria en un sujeto que lo necesite, el método comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido aislado, de la composición de materia o de la composición farmacéutica, tratando de este modo la enfermedad inflamatoria en el sujeto.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un uso del polipéptido aislado, la composición de materia o de la composición farmacéutica, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria.

Como se usa en el presente documento, la expresión "que tratar" se refiere a que inhibe, que previene o que detiene el desarrollo de una patología (enfermedad, trastorno o afección, por ejemplo, inflamación, por ejemplo, AR) y/o que provoca la reducción, remisión, o regresión de una patología. Los expertos en la materia entenderán que pueden utilizarse diversas metodologías y ensayos para evaluar el desarrollo de una patología y, de manera similar, pueden utilizarse diversas metodologías y ensayos para evaluar la reducción, remisión o regresión de una patología.

De acuerdo con realizaciones específicas, el término "que tratar" se refiere a la mejoría de los síntomas asociados con una AR y enfermedades relacionadas, a la disminución de la gravedad o la cura de las enfermedades, o a la prevención de la aparición de las enfermedades, la prevención de la manifestación de síntomas asociados con la enfermedad antes de que aparezcan, la ralentización de la progresión de la enfermedad o del deterioro de los síntomas asociados con ella, la potenciación del inicio del período de remisión, la ralentización del daño irreversible provocado en la fase crónica progresiva de la enfermedad, el retraso del inicio de dicha fase progresiva, la mejorar de la tasa de supervivencia o una recuperación más rápida, o una combinación de dos o más de los anteriores.

Como se usa en el presente documento, la frase "sujeto que lo necesite" se refiere a un sujeto mamífero macho o hembra (por ejemplo, un ser humano) al que se le diagnostica una enfermedad inflamatoria o está en riesgo de desarrollar una enfermedad inflamatoria. Se contemplan también los usos veterinarios. El sujeto puede ser de cualquier edad, incluso la neonatal, de lactante, juvenil, adolescente, adulta y de adulto mayor.

Los métodos para determinar la inflamación en un sujeto son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, determinar en una muestra de sangre del sujeto la velocidad de sedimentación globular (VSG); la viscosidad plasmática; los niveles de proteína C-reactiva (PCR); los niveles de determinadas citocinas inflamatorias tales como IL6 y TNFa; y la determinación de un índice de inflamación tal como el uso de mediciones de fibrinógeno y hematocrito o hemoglobina.

De acuerdo con realizaciones específicas, la enfermedad inflamatoria implica células que expresan CD44vRA. Los ejemplos no limitantes de ensayos que pueden evaluar la expresión de CD44vRA en las células incluyen citometría de flujo e inmunocitoquímica.

Los ejemplos de enfermedades inflamatorias (también denominadas en el presente documento inflamación o afección inflamatoria) incluyen, pero sin limitación, enfermedad inflamatoria crónica y enfermedad inflamatoria aguda.

Los ejemplos de enfermedad inflamatoria incluyen, pero sin limitación, enfermedades inflamatorias asociadas con hipersensibilidad, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades infecciosas, enfermedades de rechazo de injertos, enfermedades alérgicas y cancerosas.

Enfermedades inflamatorias asociadas con hipersensibilidad

Los ejemplos de hipersensibilidad incluyen, pero sin limitación, hipersensibilidad de tipo I, hipersensibilidad de tipo II, hipersensibilidad de tipo III, hipersensibilidad de tipo IV, hipersensibilidad inmediata, hipersensibilidad mediada por anticuerpos, hipersensibilidad mediada por inmunocomplejos, hipersensibilidad mediada por linfocitos T y DTH.

La hipersensibilidad inmediata o de tipo I, tal como el asma.

La hipersensibilidad de tipo II incluye, pero sin limitación, enfermedades reumáticas, enfermedades reumáticas autoinmunitarias, artritis reumatoide (Krenn V. et al., Histol Histopathol julio de 2000;15(3):791), artropatía psoriásica (AP), espondilitis, espondilitis anquilosante (Jan Voswinkel et al., Arthritis Res 2001; 3 (3): 189), enfermedades sistémicas, enfermedades sistémicas autoinmunitarias, lupus eritematoso sistémico (Erikson J. et al., Immunol Res 1998;17 (1-2): 49), esclerosis, esclerosis sistémica (Renaudineau Y. et al., Clin Diagn Lab Immunol. marzo de 1999;6 (2):156); Chan OT. et al., Immunol Rev junio de 1999;169:107), enfermedades glandulares, enfermedades glandulares autoinmunitarias, enfermedades pancreáticas autoinmunitarias, diabetes, diabetes de tipo I (Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract octubre de 1996;34 Supl:S125), enfermedades tiroideas, enfermedades tiroideas autoinmunitarias, enfermedad de Graves (Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am junio de 2000; 29 (2): 339), tiroiditis, tiroiditis autoinmunitaria espontánea (Braley-Mullen H. y Yu S, J Immunol 15 de diciembre de 2000;165 (12):7262), tiroiditis de Hashimoto (Toyoda N. et al., Nippon Rinsho agosto de 1999; 57 (8):1810), mixedema, mixedema idiopático (Mitsuma T. Nippon Rinsho. agosto de 1999;57 (8):1759); enfermedades reproductivas autoinmunitarias, enfermedades ováricas, autoinmunidad ovárica (Garza KM. et al., J Reprod Immunol febrero de 1998;37 (2):87), infertilidad autoinmunitaria anti-espermatozoides (Diekman AB. et al., Am J Reprod Immunol. marzo de 2000;43 (3):134), pérdida fetal repetida (Tincani A. et al., Lupus 1998;7 Supl. 2:S107-9), enfermedades neurodegenerativas, enfermedades neurológicas, enfermedades neurológicas autoinmunitarias, esclerosis múltiple (Cross AH. et al., J Neuroimmunol 1 enero de 2001;112 (1-2):1), enfermedad de Alzheimer (Oron L. et al., J Neural Transm Supl. 1997;49:77), miastenia grave (Infante AJ. y Kraig E, Int Rev Immunol 1999; 18 (1-2):83), neuropatías motoras (Kornberg AJ. J Clin Neurosci. mayo de 2000;7 (3):191), síndrome de Guillain-Barre, neuropatías y neuropatías autoinmunitarias (Kusunoki S. Am J Med Sci. abril de 2000;319 (4):234), enfermedades miasténicas, síndrome miasténico de Lambert-Eaton (Takamori M. Am J Med Sci. abril de 2000;319 (4):204), enfermedades neurológicas paraneoplásicas, atrofia cerebelosa, atrofia cerebelosa paraneoplásica, síndrome del hombre rígido no paraneoplásico, atrofias cerebelosas, atrofias cerebelosas progresivas, encefalitis, encefalitis de Rasmussen, esclerosis lateral amiotrófica, corea de Sydeham, síndrome de Gilíes de la Tourette, poliendocrinopatías, poliendocrinopatías autoinmunitarias (Antoine JC. y Honnorat J. Rev Neurol (París) enero de 2000;156 (1):23); neuropatías, neuropatías disinmunitarias (Nobile-Orazio E. et al., Electroencephalogr Clin Neurophysiol Supl. 1999;50:419); neuromiotonía, neuromiotonía adquirida, artrogriposis múltiple congénita (Vincent A. et al., Ann NY Acad Sci. 13 de mayo de 1998;841:482), enfermedades cardiovasculares, enfermedades cardiovasculares autoinmunitarias, ateroesclerosis (Matsuura E. et al., Lupus. 1998;7 Supl. 2:S135), infarto de miocardio (Vaarala O. Lupus. 1998;7 Supl. 2:S132), trombosis (Tincani A. et al., Lupus 1998;7 Supl. 2:S107-9), granulomatosis, granulomatosis de Wegener, arteritis, arteritis de Takayasu y síndrome de Kawasaki (Praprotnik S. et al., Wien Klin Wochenschr 25 de agosto de 2000;112 (15-16):660); enfermedad autoinmunitaria anti-factor VIII (Lacroix-Desmazes S. et al., Semin Thromb Hemost.2000;26 (2):157); vasculitis, vasculitis necrosante de vasos pequeños, poliangeítis microscópica, síndrome de Churg y Strauss, glomerulonefritis, glomerulonefritis necrosante focal pauci-inmunitaria, glomerulonefritis con semilunas (Noel LH. Ann Med Interne (Paris) mayo de 2000;151 (3):178); síndrome antifosfolipídico (Flamholz R. et al., J Clin Apheresis 1999; 14 (4): 171); insuficiencia cardíaca, anticuerpos para adrenorreceptores beta de tipo agonista en insuficiencia cardíaca (Wallukat G. et al., Am J Cardiol. junio de 1999 17;83 (12A):75H), púrpura tromobocitopénica (Moccia F. Ann Ital Med Int. abril-junio de 1999;14 (2):114); anemia hemolítica, anemia hemolítica autoinmunitaria (Efremov DG. et al., Leuk Lymphoma enero de 1998; 28 (3-4):285), enfermedades gastrointestinales, enfermedades autoinmunitarias del tracto gastrointestinal, enfermedades intestinales, enfermedad inflamatoria intestinal crónica (Garcia Herola A. et al., Gastroentero1 Hepatol. enero de 2000;23 (1):16), enfermedad celíaca (Landau YE. y Shoenfeld Y. Harefuah 16 de enero de 2000; 138 (2):122), enfermedades autoinmunitarias de la musculatura, miositis, miositis autoinmunitaria, síndrome de Sjogren (Feist E. et al., Int Arch Allergy Immunol septiembre de 2000;123 (1):92); enfermedad autoinmune del músculo liso (Zauli D. et al., Biomed Pharmacother enero de 1999;53 (5-6):234), enfermedades hepáticas, enfermedades hepáticas autoinmunitarias, hepatitis autoinmunitaria (Manns MP. J Hepatol agosto de 2000; 33 (2):326) y cirrosis biliar primaria (Strassburg CP. et al., Eur J Gastroenterol Hepatol. junio de 1999; 11 (6):595).

La hipersensibilidad mediada por linfocitos T o de tipo IV, incluye, pero sin limitación, enfermedades reumáticas, artritis reumatoide (Tisch R, McDevitt HO. Proc Natl Acad Sci U S A 18 de enero de 1994; 91 (2):437), enfermedades sistémicas, enfermedades sistémicas autoinmunitarias, lupus eritematoso sistémico (Datta SK., Lupus 1998; 7 (9):591), enfermedades glandulares, enfermedades glandulares autoinmunitarias, enfermedades pancreáticas, enfermedades pancreáticas autoinmunitarias, diabetes de tipo 1 (Castano L. y Eisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol.

8:647); enfermedades tiroideas, enfermedades tiroideas autoinmunitarias, enfermedad de Graves (Sakata S. et al., Mol Cell Endocrinol marzo de 1993;92 (1):77); enfermedades ováricas (Garza KM. et al., J Reprod Immunol febrero de 1998;37 (2):87), prostatitis, prostatitis autoinmunitaria (Alexander RB. et al., Urology diciembre de 1997;50 (6):893), síndrome poliglandular, síndrome poliglandular autoinmunitario, síndrome poliglandular autoinmunitario de tipo I (Hara T. et al., Blood. 1 de marzo de 1991 ;77 (5):1127), enfermedades neurológicas, enfermedades autoinmunitarias neurológicas, esclerosis múltiple, neuritis, neuritis óptica (Soderstrom M. et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry mayo de 1994;57 (5):544), miastenia grave (Oshima M. et al., Eur J Immunol diciembre de 1990;20 (12):2563), síndrome del hombre rígido (Hiemstra HS. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 27 de marzo 2001;98 (7):3988), enfermedades cardiovasculares, autoinmunidad cardíaca en la enfermedad de Chagas (Cunha-Neto E. et al., J Clin Invest 15 de octubre de 1996;98 (8):1709), púrpura trombocitopénica autoinmunitaria (Semple JW. et al., Blood 15 de mayo de 1996;87 (10):4245), autoinmunidad anti-linfocitos T (Caporossi AP. et al., Viral Immunol 1998;11 (1):9), anemia hemolítica (Sallah S. et al., Ann Hematol marzo de 1997 Mar;74 (3):139), enfermedades hepáticas, enfermedades hepáticas autoinmunitarias, hepatitis, hepatitis activa crónica (Franco A. et al., Clin Immunol Immunopathol marzo de 1990;54 (3):382), cirrosis biliar, cirrosis biliar primaria (Jones DE. Clin Sci (Colch) noviembre de 1996; 91 (5):551), enfermedades nefríticas, enfermedades nefríticas autoinmunitarias, nefritis, nefritis intersticial (Kelly CJ. J Am Soc Nephrol agosto de 1990; 1 (2):140), enfermedad del tejido conjuntivo, enfermedades del oído, enfermedades autoinmunitarias del tejido conjuntivo, enfermedad autoinmunitaria del oído (Yoo TJ. et al., Cell Immunol agosto de 1994; 157 (1):249), enfermedad del oído interno (Gloddek B. et al., Ann NY Acad Sci 29 de diciembre de 1997; 830:266), enfermedades de la piel, enfermedades cutáneas, enfermedades dérmicas, enfermedades cutáneas ampollosas, pénfigo vulgar, penfigoide ampolloso y pénfigo foliáceo. Debe tenerse en cuenta que varias enfermedades similares se pueden clasificar en distintas clases de hipersensibilidad, debido a la heterogeneidad de estas enfermedades.

Los ejemplos de hipersensibilidad de tipo retardada incluyen, pero sin limitación, dermatitis de contacto y erupción asociada a fármacos.

Los ejemplos de tipos de hipersensibilidad mediada por linfocitos T incluyen, pero sin limitación, a linfocitos T auxiliares y linfocitos T citotóxicos.

Los ejemplos de hipersensibilidad mediada por linfocitos T auxiliares incluyen, pero sin limitación, hipersensibilidad mediada por linfocitos T^h1 e hipersensibilidad mediada por linfocitos T^h2.

Enfermedades autoinmunitarias

Incluyen, pero sin limitación, enfermedades cardiovasculares, enfermedades reumáticas, enfermedades glandulares, gastroenteropatías, enfermedades cutáneas, enfermedades hepáticas, enfermedades neurológicas, enfermedades musculares, enfermedades nefríticas, enfermedades relacionadas con la reproducción, enfermedades del tejido conjuntivo y enfermedades sistémicas.

Los ejemplos de enfermedades cardiovasculares autoinmunitarias incluyen, pero sin limitación, ateroesclerosis (Matsuura E. et al., Lupus. 1998;7 Supl. 2:S135), infarto de miocardio (Vaarala O. Lupus. 1998;7 Supl. 2:S132), trombosis (Tincani A. et al., Lupus 1998;7 Supl. 2:S 107-9), granulomatosis de Wegener, arteritis de Takayasu, síndrome de Kawasaki (Praprotnik S. et al., Wien Klin Wochenschr 25 de agosto de 2000;112 (15-16):660), enfermedad autoinmunitaria anti-factor VIII (Lacroix-Desmazes S. et al., Semin Thromb Hemost.2000;26 (2):157), vasculitis necrosante de vasos pequeños, poliangeítis microscópica, síndrome de Churg y Strauss, glomerulonefritis necrosante focal pauci-inmunitaria y con semilunas (Noel LH. Ann Med Interne (Paris) mayo de 2000;151 (3):178), síndrome antifosfolipídico (Flamholz R. et al., J Clin Apheresis 1999;14 (4):171), insuficiencia cardiaca inducida por anticuerpos (Wallukat G. et al., Am J Cardiol. 17 de junio de 1999;83 (12A):75H), púrpura tromobocitopénica (Moccia F. Ann Ital Med Int. abril-junio de 1999;14 (2): 114); Semple JW. et al., Blood 15 de mayo de 1996;87 (10):4245), anemia hemolítica autoinmunitaria (Efremov DG. et al., Leuk Lymphoma enero de 1998; 28 (3-4):285; Sallah S. et al., Ann Hematol marzo de 1997;74 (3): 139), autoinmunidad cardíaca en la enfermedad de Chagas (Cunha-Neto E. et al., J Clin Invest 15 de octubre de 1996;98 (8):1709) y autoinmunidad anti-linfocitos T (Caporossi AP. et al., Viral Immunol 1998;11 (1):9).

Los ejemplos de enfermedades reumáticas autoinmunitarias incluyen, pero sin limitación, artritis reumatoide (Krenn V. et al., Histol Histopathol julio de 2000;15(3):791; Tisch R, McDevitt h O. Proc Natl Acad Sci units S A 18 de enero de 1994;91 (2):437) y espondilitis anquilosante (Jan Voswinkel et al., Arthritis Res 2001; 3 (3): 189).

Los ejemplos de enfermedades glandulares autoinmunitarias incluyen, pero sin limitación, enfermedad pancreática, diabetes de tipo I, enfermedad de tiroides, enfermedad de Graves, tiroiditis, tiroiditis autoinmunitaria espontánea, tiroiditis de Hashimoto, mixedema idiopático, autoinmunidad ovárica, infertilidad autoinmunitaria anti-espermatozoides, prostatitis autoinmunitaria y síndrome poliglandular autoinmunitario de tipo I. Las enfermedades incluyen, pero sin limitación, enfermedades autoinmunitarias del páncreas, diabetes de tipo 1 (Castano L. y Eisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol. 8:647; Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract octubre de 1996;34 Supl:S125), enfermedades tiroideas autoinmunitarias, enfermedad de Graves (Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am junio de 2000; 29 (2): 339; Sakata S. et al., Mol Cell Endocrinol marzo de 1993;92 (1):77), tiroiditis autoinmunitaria espontánea (Braley-Mullen H. y Yu S, J Immunol 15 de diciembre de 2000;165 (12):7262), tiroiditis de Hashimoto (Toyoda N. et al., Nippon Rinsho agosto de 1999; 57 (8):1810), mixedema idiopático (Mitsuma T. Nippon Rinsho. agosto de 1999; 57 (8):1759), autoinmunidad ovárica (Garza KM. et al., J Reprod Immunol febrero de 1998;37 (2):87), infertilidad autoinmunitaria anti-espermatozoides (Diekman AB. et al., Am J Reprod Immunol. marzo de 2000;43 (3):134), prostatitis autoinmunitaria (Alexander RB. et al., Urology diciembre de 1997;50 (6):893) y síndrome poliglandular autoinmunitario de Tipo I (Hara T. et al., Blood. 1 de marzo de 1991;77 (5):1127).

Los ejemplos de enfermedades gastrointestinales autoinmunitarias incluyen, pero sin limitación, enfermedades inflamatorias intestinales crónicas (Garcia Herola A. et al., Gastroentero1 Hepatol. enero de 2000; 23 (1):16), enfermedad celíaca (Landau YE. y Shoenfeld Y. Harefuah 16 de enero 2000; 138 (2):122), colitis, ileítis y enfermedad de Crohn.

Los ejemplos de enfermedades cutáneas autoinmunitarias incluyen, pero sin limitación, enfermedades cutáneas ampollosas autoinmunitarias, tales como, pero sin limitación, pénfigo vulgar, penfigoide ampolloso y pénfigo foliáceo.

Los ejemplos de enfermedades hepáticas autoinmunitarias incluyen, pero sin limitación, hepatitis, hepatitis activa crónica autoinmunitaria (Franco A. et al., Clin Immunol Immunopathol marzo de 1990; 54 (3):382), cirrosis biliar primaria (Jones DE. Clin Sci (Colch) noviembre de 1996; 91 (5):551; Strassburg CP. et al., Eur J Gastroentero1Hepatol. junio de 1999; 11 (6):595) y hepatitis autoinmunitaria (Manns MP. J Hepatol agosto de 2000; 33 (2):326).

Los ejemplos de enfermedades neurológicas autoinmunitarias incluyen, pero sin limitación, esclerosis múltiple (Cross AH. et al., J Neuroimmunol 1 enero de 2001 ;112 (1-2):1), enfermedad de Alzheimer (Oron L. et al., J Neural Transm Supl. 1997;49:77), miastenia grave (Infante AJ. y Kraig E, Int Rev Immunol (1999) 18(1-2):83; Oshima M. et al., Eur J Immunol (1990) 20(12):2563), neuropatías, neuropatías motoras (Kornberg AJ. J Clin Neurosci. (2000) 7(3):191); síndrome de Guillain-Barre y neuropatías autoinmunitarias (Kusunoki S. Am J Med Sci. (2000) 319(4):234), miastenia, síndrome miasténico de Lambert-Eaton (Takamori M. Am J Med Sci. (2000) 319(4):204); enfermedades neurológicas paraneoplásicas, atrofia cerebelosa, atrofia cerebelosa paraneoplásica y síndrome del hombre rígido (Hiemstra HS. et al., Proc Natl Acad Sci units S A (2001)98(7):3988); síndrome del hombre rígido no paraneoplásico, atrofias cerebelosas progresivas, encefalitis, encefalitis de Rasmussen, esclerosis lateral amiotrófica, corea de Sydeham, síndrome de Gilles de la Tourette y poliendocrinopatías autoinmunitarias (Antoine JC. y Honnorat J. Rev Neurol (París) enero de 2000;156 (1):23); neuropatías disinmunitarias (Nobile-Orazio E. et al., Electroencephalogr Clin Neurophysiol Supl. 1999;50:419); neuromiotonía adquirida, artrogriposis múltiple congénita (Vincent A. et al., Ann NY Acad Sci. 13 de mayo de 1998;841:482), neuritis, neuritis óptica (Soderstrom M. et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry mayo de 1994;57 (5):544) y enfermedad neurodegenerativa.

Los ejemplos de enfermedades musculares autoinmunitarias incluyen, pero sin limitación, miositis, miositis autoinmunitaria y síndrome de Sjoegren primario (Feist E. et al., Int Arch Allergy Immunol septiembre de 2000;123 (1):92) y enfermedad autoinmunitaria del músculo liso (Zauli D. et al., Biomed Pharmacother enero de 1999 Jun;53 (5-6):234).

Los ejemplos de enfermedades nefríticas autoinmunitarias incluyen, pero sin limitación, nefritis y nefritis intersticial autoinmunitaria (Kelly CJ. J Am Soc Nephrol agosto de 1990; 1 (2):140).

Los ejemplos de enfermedades autoinmunitarias relacionadas con la reproducción incluyen, pero sin limitación, muerte fetal de repetición (Tincani A. et al., Lupus 1998; 7 Supl. 2:S107-9).

Los ejemplos de enfermedades del tejido conjuntivo autoinmunitarias incluyen, pero sin limitación, enfermedades del oído, enfermedades autoinmunitarias del oído (Yoo TJ. et al., Cell Immunol agosto de 1994; 157 (1):249) y enfermedades autoinmunitarias del oído interno (Gloddek B. et al., Ann NY Acad Sci 29 de diciembre de 1997; 830:266).

Los ejemplos de enfermedades sistémicas autoinmunitarias incluyen, pero sin limitación, lupus eritematoso sistémico (Erikson J. et al., Immunol Res 1998;17 (1-2):49) y esclerosis sistémica (Renaudineau Y. et al., Clin Diagn Lab Immunol. marzo de 1999;6 (2):156); Chan OT. et al., Immunol Rev junio de 1999; 169:107).

Enfermedades infecciosas

Los ejemplos de enfermedades infecciosas incluyen, pero sin limitación, enfermedades infecciosas crónicas, enfermedades infecciosas subagudas, enfermedades infecciosas agudas, enfermedades víricas, enfermedades bacterianas, enfermedades por protozoos, enfermedades parasitarias, enfermedades fúngicas, enfermedades por micoplasma y enfermedades por priones.

Enfermedades de rechazo de injertos

Los ejemplos de enfermedades asociadas con el trasplante de un injerto incluyen, pero sin limitación, rechazo de injertos, rechazo crónico de injertos, rechazo subagudo de injertos, rechazo hiperagudo de injertos, rechazo agudo de injertos y enfermedad de injerto contra el hospedador.

Enfermedades alérgicas

Los ejemplos de enfermedades alérgicas incluyen, pero sin limitación, asma, habones, urticaria, alergia al polen, alergia a los ácaros del polvo, alergia al veneno, alergia a los cosméticos, alergia al látex, alergia química, alergia a fármacos, alergia a las picaduras de insectos, alergia a la caspa animal, alergia a las plantas urticantes, alergia a la hiedra venenosa y alergia alimentaria.

Enfermedades cancerosas

Los ejemplos de cáncer incluyen, pero sin limitación, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos particulares de enfermedades cancerosas, pero sin limitación: leucemia mieloide tal como la leucemia mielógena crónica. Leucemia mielógena aguda con maduración, leucemia promielocítica aguda, leucemia no linfocítica aguda con aumento de basófilos, leucemia monocítica aguda. leucemia mielomonocítica aguda con eosinofilia; linfoma maligno, tal como de Burkitt y no de Hodgkin; leucemia linfocítica, tal como la leucemia linfoblástica aguda. Leucemia linfocítica crónica; enfermedades mieloproliferativas, tales como tumores sólidos de meningioma benigno, tumores mixtos de la glándula salival, adenomas de colon; adenocarcinomas, tal como el cáncer de pulmón microcítico, de riñón, de útero, de próstata, de vejiga, de ovario, de colon, sarcomas, liposarcoma, mixoide, sarcoma sinovial, rabdomiosarcoma (alveolar), condrosarcoma mixoide extraesquelético, tumor de Ewing; otros incluyen disgerminoma testicular y ovárico, retinoblastoma, tumor de Wilms, neuroblastoma, melanoma maligno, mesotelioma, de mama, de piel, de próstata y de ovario.

De acuerdo con realizaciones específicas, la enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide (AR), artropatía psoriásica, enfermedad de Alzheimer, cáncer y enfermedad cardiovascular.

De acuerdo con otras realizaciones específicas, la enfermedad inflamatoria comprende AR.

Como se usa en el presente documento, la frase "artritis reumatoide (AR)" se refiere a una enfermedad autoinmunitaria que afecta principalmente a las articulaciones. La AR incluye, pero con limitación, AR adulta, artritis idiopática juvenil, Ar juvenil y artritis crónica juvenil. La AR se puede diagnosticar de acuerdo con los criterios de la American Rheumatoid Association para la clasificación de la artritis reumatoide o con cualquier criterio similar, e incluye la AR activa (AR activa diagnosticada durante al menos 8 semanas pero no más de cuatro años) e incipiente (poliartritis que no cumplen plenamente los criterios para un diagnóstico de AR, en asociación con la presencia de biomarcadores pronósticos específicos de AR, tales como anti-CCP y epítopo compartido.

Los ejemplos de síntomas parámetro clínicos de AR que se pueden controlar para indicar una mejoría durante el tratamiento con los polipéptidos aislados y la composición de materia de la invención son:

• Rigidez matutina durante al menos una hora y presente durante al menos seis semanas;

• Hinchazón de tres o más articulaciones durante al menos seis semanas;

• Hinchazón de articulaciones de la muñeca, metacarpofalángicas o interfalángicas proximales durante al menos seis semanas

• Hinchazón simétrica de las articulaciones;

• Cambios en la radiografía de la mano que incluyen erosiones o descalcificación ósea inequívoca;

• nódulos subcutáneos reumatoides; y

• factores reumatoides

Los parámetros adicionales que pueden utilizarse en seres humanos para evaluar la mejora de la AR pueden estar de acuerdo con el American College of Rheumatology (ACR) e incluir, por ejemplo, los criterios de mejora ACR, ACR20, ACR50 y ACR70, que representan el porcentaje de mejora de la actividad de la enfermedad (el 20, 50 o 70 %) por la reducción de determinados síntomas de la AR. Por lo tanto, por ejemplo, ACR20 se refiere a pacientes que logran una mejora del 20 % en los recuentos de articulaciones sensibles e hinchadas y una mejora del 20 % en tres de las cinco medidas restantes del conjunto básico de los ACR.

Como los presentes inventores descubrieron 3 posibles proteínas diana de los polipéptidos aislados y también han demostrado que la adición de una de estas proteínas (es decir, SAA) puede impedir la actividad in vitro del polipéptido (véanse los Ejemplos 7 y 9 y la Figura 15 en la sección de Ejemplos a continuación), la presente invención contempla el uso de un tratamiento combinado que comprende los polipéptidos aislados o las composiciones de materia de la presente invención e inhibidores del amiloide sérico A (sAa ), la transtirretina y/o las apolipoproteínas B.

Por lo tanto, de acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método de tratamiento de una enfermedad inflamatoria en un sujeto que lo necesite, comprendiendo el método:

(a) administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido aislado o la composición de materia de algunas realizaciones de la presente invención; y

(b) administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de una proteína seleccionada del grupo que consiste en amiloide sérico A (SAa ), transtirretina y apolipoproteínas B,

tratando de este modo la enfermedad inflamatoria en el sujeto.

De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un uso del polipéptido aislado o la composición de materia de algunas realizaciones de la presente invención y un inhibidor de una proteína seleccionada del grupo que consiste en amiloide sérico A (SAA), transtirretina y apolipoproteína B para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un artículo de fabricación o un kit identificado para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria, que comprende un material de empaquetamiento que empaqueta los polipéptidos aislados o la composición de materia de algunas realizaciones de la presente invención, y un inhibidor para una proteína seleccionada del grupo que consiste en SAA, transtirretina y apolipoproteínas B.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método de tratamiento de una enfermedad inflamatoria en un sujeto que lo necesite, comprendiendo el método:

(a) administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, en donde dicho polipéptido comprende una actividad antinflamatoria; y

(b) administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de una proteína seleccionada del grupo que consiste en amiloide sérico A (SAa ), transtirretina y apolipoproteínas B,

tratando de este modo la enfermedad inflamatoria en el sujeto.

De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un uso de un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 1, en donde dicho polipéptido comprende una actividad antinflamatoria; y un inhibidor de una proteína seleccionada del grupo que consiste en amiloide sérico A (SAA), transtirretina y apolipoproteína B para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un artículo de fabricación o un kit identificado para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria, que comprende un material de empaquetamiento que empaqueta el polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO:1, en donde dicho polipéptido comprende una actividad antinflamatoria; y un inhibidor para una proteína seleccionada del grupo que consiste en SAA, transtirretina y apolipoproteínas B.

Como se usa en el presente documento, el término "inhibidor" se refiere a un agente que regula a la baja la expresión y/o la actividad de una proteína (por ejemplo, SAA, transtirretina y apolipoproteína B) a nivel genómico (por ejemplo, recombinación homóloga y endonucleasas específicas de sitio) y/o el nivel de transcripción utilizando una diversidad de moléculas que interfieren con la transcripción y/o la traducción (por ejemplo, agentes de silenciamiento del ARN, por ejemplo, ARNip, ARNhc, micro-ARNA) o sobre el nivel de proteínas (por ejemplo, aptámeros, moléculas pequeñas y péptidos inhibidores, antagonistas, enzimas que escinden el polipéptido, anticuerpos y similares).

Los ejemplos no limitantes incluyen un anticuerpo que inhibe SAA tal como anti seroalbúmina A, una interferencia por ARN dirigida al ARNm de SAA (véase, por ejemplo, la solicitud de publicación internacional N.°: WO 2006071691), un oligonucleótido antisentido dirigido a la apolipoproteína B, tal como, pero sin limitación, Mipomersen (ISIS-301012, KYNAMRO™), Triazolonas como inhibidores de la síntesis de apolipoproteína B (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° US 6197972) y un inhibidor de la secreción de apolipoproteína B (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud EP N.° EP 1099438).

De acuerdo con una realización específica, la etapa (a) se efectúa antes de la etapa (b).

De acuerdo con otra realización específica, la etapa (a) se efectúa después de la etapa (b).

De acuerdo con aún otra realización específica, la etapa (a) se efectúa conjuntamente con la etapa (b).

Se pueden administrar múltiples rondas de administración de acuerdo con los métodos de la presente invención y múltiples dosis del polipéptido aislado o la composición de materia y el inhibidor. De acuerdo con realizaciones específicas, la etapa (a) se efectúa múltiples veces. Por lo tanto, de acuerdo con realizaciones específicas, la administración del inhibidor se efectúa después de al menos una administración del polipéptido aislado o la composición de materia. De acuerdo con realizaciones específicas, la etapa (B) se efectúa múltiples veces. Por lo tanto, de acuerdo con realizaciones específicas, la administración del polipéptido aislado o la composición de materia de la presente invención se efectúa después de al menos una administración del inhibidor. De acuerdo con realizaciones específicas, la administración del polipéptido aislado o la composición de materia de la presente invención se efectúa en un orden secuencial con la administración del inhibidor.

El polipéptido aislado o la composición de materia y el inhibidor pueden envasarse en el mismo recipiente o en recipientes distintos; cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.

De acuerdo con realizaciones específicas, el polipéptido aislado o la composición de materia y el inhibidor están en formulaciones separadas.

De acuerdo con otras realizaciones específicas, el polipéptido aislado o la composición de materia y el inhibidor están en una coformulación.

Los polipéptidos aislados, las composiciones de materia y los inhibidores de la presente invención pueden proporcionarse al sujeto de por sí o como parte de una composición farmacéutica donde se encuentran mezclados con un transportador farmacéuticamente aceptable.

Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende como agente activo el polipéptido aislado o la composición de materia; y un transportador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Como se usa en el presente documento, una "composición farmacéutica" se refiere a una preparación de uno o más de los principios activos descritos en el presente documento con otros componentes químicos tales como transportadores y excipientes fisiológicamente adecuados. El fin de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo.

En el presente documento la expresión "principio activo" se refiere al polipéptido o composición de materia que comprende el polipéptido responsable del efecto biológico.

En los sucesivo en el presente documento, las frases "transportador fisiológicamente aceptable" y "vehículo farmacéuticamente aceptable", que pueden utilizarse indistintamente, se refieren a un transportador o un diluyente que no provoca irritación significativa a un organismo y no anula la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado. Se incluye un adyuvante en estas expresiones.

En el presente documento, el término "excipiente" se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar adicionalmente la administración de un principio activo. Los ejemplos, sin limitación, de excipientes, incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.

Pueden encontrarse técnicas para la formulación y administración de fármacos en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición, que se incorpora en el presente documento por referencia.

Las vías adecuadas de administración pueden, por ejemplo, incluir el suministro oral, tópico, intradérmico, rectal, transmucoso, especialmente transnasal, intestinal o parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas e intramedulares, así como inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intracardiacas, por ejemplo, en la cavidad ventricular derecha o izquierda, en la arteria coronaria primitiva, intravenosa, intraperitoneal, intranasal o intraocular.

De acuerdo con realizaciones específicas, la vía de administración es la administración oral.

De acuerdo con otras realizaciones específicas, la vía de administración es en la piel. Los métodos de administración de un agente activo en una piel son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, inyecciones intradérmicas, geles, aerosoles líquidos y parches que comprenden el agente activo y que se aplican sobre la superficie de la piel.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la administración del agente activo en la piel del sujeto se realiza por vía tópica (en la piel).

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la administración del agente activo en la piel del sujeto se realiza de forma no invasiva, por ejemplo, utilizando un gel, un aerosol líquido o un parche (por ejemplo, un parche de tipo depósito y parche de tipo matriz) que comprenda el principio activo, que se aplican sobre la piel del sujeto.

Cabe señalar que, para aumentar el suministro del agente activo a la piel, el agente activo puede formularse con diversos vehículos diseñados para aumentar el suministro a la epidermis o las capas de la dermis. Dichos vehículos incluyen, pero sin limitación, liposomas, dendrímeros, niosoma, transferosoma, microemulsión y nanopartículas lipídicas sólidas.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la administración se realiza mediante una inyección intradérmica.

Los enfoques convencionales para el suministro de fármacos al sistema nervioso central (SNC) incluyen: estrategias neuroquirúrgicas (por ejemplo, inyección intracerebral o infusión intracerebroventricular); manipulación molecular del agente (por ejemplo, producción de una proteína de fusión quimérica que comprende un péptido de transporte que tiene una afinidad por una molécula de superficie celular endotelial en combinación con un agente que en sí mismo es incapaz de cruzar la BHE) en un intento de aprovechar una de las rutas de transporte endógenas de la BHE; estrategias farmacológicas diseñadas para aumentar la solubilidad en lípidos de un agente (por ejemplo, conjugación de agentes hidrosolubles con transportadores lipídicos o de colesterol); y la alteración transitoria de la integridad de la BHE mediante alteración hiperosmótica (que es el resultado de la infusión de una solución de manitol en la arteria carótida o del uso de un agente biológicamente activo tal como un péptido de angiotensina). Sin embargo, cada una de estas estrategias tiene limitaciones, tales como los riesgos intrínsecos asociados con un procedimiento quirúrgico invasivo, una limitación de tamaño impuesta por una limitación intrínseca a los sistemas de transporte endógeno, efectos secundarios biológicos potencialmente indeseables asociados con la administración sistémica de una molécula quimérica compuesta por un motivo transportador que podría estar activo fuera del SNC y el posible riesgo de daño cerebral dentro de las regiones del cerebro donde se altera la BHE, lo que lo convierte en un método de suministro deficiente.

Alternativamente, se puede administrar la composición farmacéutica de una manera local en lugar de sistémica, por ejemplo, mediante inyección de la composición farmacéutica directamente en una región de tejido de un paciente, tal como una inyección local en la articulación. Los métodos de administración de un agente activo en la articulación son conocidos en la técnica e incluyen la inyección intrarticular, en donde se inserta una aguja hipodérmica en la articulación para administrar de este modo el agente activo en el espacio intrarticular de la articulación intrarticular.

Como se describe, los polipéptidos y las composiciones de materia de la invención pueden utilizarse para tratar, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer. Los enfoques convencionales para el suministro de fármacos al sistema nervioso central (SNC) incluyen: estrategias neuroquirúrgicas (por ejemplo, intrahipocampo (IH), intracraneal (IC), inyección intracerebral, inyección intracerebroventricular (ICV) o infusión o administración intratecal); manipulación molecular del agente (por ejemplo, producción de una proteína de fusión quimérica que comprende un péptido de transporte que tiene una afinidad por una molécula de superficie celular endotelial en combinación con un agente que en sí mismo es incapaz de cruzar la BHE) en un intento de aprovechar una de las rutas de transporte endógenas de la BHE; estrategias farmacológicas diseñadas para aumentar la solubilidad en lípidos de un agente (por ejemplo, conjugación de agentes hidrosolubles con transportadores lipídicos o de colesterol); y la alteración transitoria de la integridad de la BHE mediante alteración hiperosmótica (que es el resultado de la infusión de una solución de manitol en la arteria carótida o del uso de un agente biológicamente activo tal como un péptido de angiotensina). Sin embargo, cada una de estas estrategias tiene limitaciones, tales como los riesgos intrínsecos asociados con un procedimiento quirúrgico invasivo, una limitación de tamaño impuesta por una limitación intrínseca a los sistemas de transporte endógeno, efectos secundarios biológicos potencialmente indeseables asociados con la administración sistémica de una molécula quimérica compuesta por un motivo transportador que podría estar activo fuera del SNC y el posible riesgo de daño cerebral dentro de las regiones del cerebro donde se altera la BHE, lo que lo convierte en un método de suministro deficiente.

Las composiciones farmacéuticas de algunas realizaciones de la invención pueden fabricarse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante procedimiento convencionales de mezclado, disolución, granulación, preparación de grageas, levigación, emulsificación, encapsulación, atrapamiento o liofilización.

Las composiciones farmacéuticas para su uso en conformidad con algunas realizaciones de la invención pueden formularse, así, de manera convencional utilizando uno o más transportadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares, que facilitan el procesamiento de los principios activos en preparaciones que puedan utilizarse farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida.

Para la inyección, los principios activos de la composición farmacéutica pueden formularse en soluciones acuosas, preferentemente, en tampones fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hank, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. Para administración transmucosa, se utilizan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a permear. Dichos penetrantes son conocidos en general en la técnica.

Para administración oral, la composición farmacéutica puede formularse fácilmente combinando el compuesto activo con transportadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Dichos transportadores permiten que la composición farmacéutica se formule como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y similares, para la ingesta oral por un paciente. Pueden prepararse preparaciones farmacológicas para el uso oral utilizando un excipiente sólido, opcionalmente moliendo la mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir auxiliares adecuados si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Son excipientes adecuados, en particular, cargas tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa, tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carbometilcelulosa de sodio; y/o polímeros fisiológicamente aceptables tales como polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes disgregantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal de los mismos, tal como alginato de sodio.

De acuerdo con realizaciones específicas, la composición farmacéutica se formula para su administración oral.

Los núcleos de grageas se proporcionan con recubrimientos adecuados. Para este fin, pueden utilizarse soluciones concentradas de azúcar que opcionalmente pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol, dióxido de titanio, soluciones de laca y disolventes orgánicos o mezclas de disolventes adecuados. Se pueden añadir colorantes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de grageas para la identificación o para caracterizar distintas combinaciones de dosis de compuestos activos.

Las composiciones farmacéuticas que pueden utilizarse por vía oral incluyen cápsulas de ajuste por presión fabricadas de gelatina así como cápsulas blandas, selladas, fabricadas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste por presión pueden contener los principios activos en mezcla con una carga tal como lactosa, aglutinantes tales como almidones, lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los principios activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizantes. Todas las formulaciones para administración oral deben estar en dosificaciones adecuadas para la vía de administración elegida.

Para la administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas para chupar formuladas de forma convencional.

Para la administración mediante inhalación nasal, los principios activos para su uso de acuerdo con algunas realizaciones de la invención se suministran convenientemente en forma de una presentación de pulverización en aerosol de un envase presurizado o un nebulizador con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano o dióxido de carbono. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina, para su uso en un dosificador pueden formularse conteniendo una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuada, tal como lactosa o almidón.

La composición farmacéutica descrita en el presente documento puede formularse para administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección en embolada o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multidosis con, opcionalmente, un conservante añadido. Las composiciones pueden ser suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y pueden comprender agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.

Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de la preparación activa en forma hidrosoluble. Adicionalmente, pueden prepararse suspensiones de los principios activos como suspensiones para inyección de base oleosa o acuosa apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo o ésteres de ácidos grasos sintéticos tales como etil oleato, triglicéridos o liposomas. Las suspensiones acuosas de inyección pueden contener sustancias, que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que aumenten la solubilidad de los principios activos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.

Como alternativa, el principio activo puede estar en forma de polvo para la constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, una solución estéril a base de agua sin pirógenos, antes de su uso.

La composición farmacéutica de algunas realizaciones de la invención también puede formularse en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, utilizando, por ejemplo, bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

La composición farmacéutica de algunas realizaciones de la invención también puede formularse para liberación sostenida para proporcionar una semivida sérica elevada. Los expertos en la materia conocen muy bien dichos sistemas de liberación sostenida e incluyen, por ejemplo, microcápsulas y nanopartículas. De acuerdo con realizaciones específicas, el sistema de administración de microesferas biodegradables ProLease para proteínas y péptidos (Tracy, 1998, Biotechnol. Prog. 14, 108; Johnson et al., 1996, Nature Med. 2, 795; Herbert et al., 1998, Pharmaceut. Res. 15, 357) es un polvo seco compuesto de microesferas poliméricas biodegradables que contienen la proteína en una matriz polimérica que puede formularse como una formulación seca con o sin otros agentes.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en el contexto de algunas realizaciones de la invención incluyen composiciones en donde los principios activos están contenidos en una cantidad eficaz para lograr el fin pretendido. De manera más específica, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad de principios activos eficaces para prevenir, aliviar o mejorar síntomas de un trastorno (por ejemplo, la AR) o prolongar la supervivencia del sujeto que se esté tratando.

La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de la capacidad de los expertos en la materia, especialmente a la luz de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento.

Para cualquier preparación utilizada en los métodos de la invención, la cantidad o dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular e in vitro. Por ejemplo, puede formularse una dosis en modelos animales para conseguir una concentración o un título deseado. Dicha información se puede utilizar para determinar de forma más precisa las dosis útiles en seres humanos.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de los principios activos descritos en el presente documento pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales in vitro, en cultivos celulares o en animales de laboratorio. Los datos obtenidos de estos ensayos in vitro y de cultivo celular y estudios animales pueden utilizarse en la formulación de un intervalo de dosificación para su uso en el ser humano. La dosificación puede variar dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. El médico individual puede elegir la formulación, la vía de administración y la dosificación exactas en vista de la afección del paciente. (Véase, por ejemplo, Fingl, et al., 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", C. 1 pág. 1).

La cantidad y el intervalo de dosificación pueden ajustarse individualmente para proporcionar niveles del principio activo que sean suficientes para inducir o suprimir el efecto biológico (concentración eficaz mínima, CEM). La CEM variará para cada preparación, pero puede estimarse a partir de datos in vitro. Las dosificaciones necesarias para lograr la CEM dependerán de las características individuales y de la vía de administración. Pueden utilizarse ensayos de detección para determinar las concentraciones plasmáticas.

Las dosis mostradas en el presente documento con respecto al modelo animal en ratón se pueden convertir para el tratamiento en otras especies, tales como seres humanos y otros animales a los que se les haya diagnosticado la enfermedad inflamatoria. Se muestra una Tabla de conversión aprobada por la FDA en Reagan-Shaw S., et al., FASEB J. 22:659-661 (2007).

La dosis equivalente humana se calcula de la siguiente manera: DEH (mg/kg) = Dosis animal (mg/kg) multiplicada por (K^m animal/K^m humano).

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el polipéptido aislado o la composición de materia se proporciona en una cantidad equivalente a un intervalo de aproximadamente 2,5 - 40 mg/kg/día en ratones, incluyendo cualquier subintervalo intermedio y los valores intermedios.

De acuerdo con realizaciones específicas, el polipéptido aislado o la composición de materia se proporciona en una cantidad equivalente a aproximadamente 3,5 mg/kg/día en ratones.

Dependiendo de la gravedad y el grado de respuesta de la afección a tratar, la dosificación puede ser de una única administración o una pluralidad de administraciones, durando el ciclo de tratamiento de varios días a varias semanas, o hasta que se efectúe la curación o se logre la disminución de la patología.

La cantidad de una composición a administrar será, por supuesto, dependiente del sujeto que se esté tratando, la gravedad de la afección, la forma de administración, el criterio del médico que la receta, etc.

Las composiciones de algunas realizaciones de la invención pueden, si se desea, presentarse en un envase o dispositivo dosificador, tal como un kit aprobado por la FDA, que puede contener una o más formas farmacéuticas unitarias que contienen el principio activo. El envase puede, por ejemplo, comprender papel metálico o de plástico, tal como un envase de tipo blíster. El envase o dispositivo dosificador puede estar acompañado de instrucciones para la administración. El envase o dosificador también puede estar acompañado de una nota asociada con el recipiente en una forma prescrita por un organismo público que regule la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos, reflejando dicha nota la aprobación por parte del organismo de la forma de las composiciones o la administración humana o veterinaria. Dicha nota, por ejemplo, puede ser un etiquetado aprobado por la Administración de alimentos y fármacos de los Estados Unidos para fármacos con receta o de un prospecto de producto aprobado. Además, pueden prepararse composiciones que comprenden una preparación de la invención formulada en un transportador farmacéutico compatible, colocarse en un recipiente adecuado y consignarse para el tratamiento de una afección indicada, como se ha detallado anteriormente de manera adicional.

Se apreciará que los agentes terapéuticos de la presente invención se pueden proporcionar al individuo con agentes activos adicionales para lograr un efecto terapéutico mejorado en comparación con el tratamiento con cada agente por sí solo. En tal terapia, se toman medidas (por ejemplo, la dosificación y la selección del agente complementario) para los efectos secundarios adversos que pueden estar asociados con las terapias de combinación.

La administración de dicha terapia de combinación puede ser simultánea, tal como en una única cápsula que tenga una relación fija de estos agentes activos, o en múltiples cápsulas para cada agente.

Por lo tanto, los agentes de la presente invención pueden administrarse solos con otro régimen terapéutico establecido o experimental para tratar enfermedades inflamatorias, tales como fármacos antinflamatorios no esteroideos (AINE), fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (FARME), corticoesteroides, analgésicos, medicamentos para la fibromialgia, agentes quimioterapéuticos y otros regímenes de tratamiento que son bien conocidos en la técnica.

Como se ha mencionado, los presentes inventores han desarrollado un nuevo ensayo in vitro para probar la actividad de los péptidos y las composiciones de materia de la presente invención. El ensayo se basa en la constatación de que los péptidos RA pueden reducir la supervivencia de los fibroblastos aislados del líquido sinovial de un paciente con AR. Por lo tanto, este ensayo se puede utilizar para comparar la variación de lote a lote de los péptidos y composiciones de materia de péptidos fabricados de la presente invención, para calificar la actividad antiinflamatoria, así como para analizar, por ejemplo, la estabilidad de los péptidos y las composiciones de materia de la presente invención después de la exposición a condiciones ambientales tales como la temperatura de almacenamiento, las modificaciones de los péptidos y las formulaciones.

Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un método de determinación de la potencia de un lote del polipéptido aislado, la composición de materia o la composición farmacéutica de algunas realizaciones de la presente invención, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto un lote del polipéptido aislado, de la composición de materia o de la composición farmacéutica con fibroblastos obtenidos de una articulación inflamatoria de un paciente con artritis reumatoide; y

(b) determinar la supervivencia de dichos fibroblastos después de un tiempo de incubación predeterminado, para determinar la potencia del lote.

De acuerdo con realizaciones específicas, el método comprende sintetizar el polipéptido aislado, la composición de materia o la composición farmacéutica con una modificación. Dicha modificación puede ser cualquiera de las modificaciones presentadas anteriormente.

De acuerdo con realizaciones específicas, el método se efectúa in vitro o ex vivo.

Como se usa en el presente documento, el término "potencia" se refiere a la medida de la actividad biológica del producto (es decir; el polipéptido aislado o la composición de materia), basándose en el atributo del producto que está vinculado a las propiedades biológicas de interés (es decir; supervivencia reducida de fibroblastos obtenidos de un paciente con AR).

Como se usa en el presente documento, el término "lote" se refiere a una cantidad específica de un fármaco que se pretende que tenga un carácter y una calidad uniformes, dentro de los límites especificados, y que normalmente se produce de acuerdo con una sola orden de fabricación durante el mismo ciclo de fabricación. Por lo tanto, las presentes enseñanzas pueden utilizarse en el control de calidad de los procedimientos de fabricación, para la evaluación de la actividad biológica de los polipéptidos aislados, la composición de materia o las composiciones farmacéuticas como parte de la certificación del lote.

De acuerdo con realizaciones específicas, el término "lote" también se refiere a una cantidad del fármaco expuesto a caracterización de estabilidad y/o a modificaciones del péptido y de formulación.

Como se usa en el presente documento, el término "fibroblastos" se refiere a una célula de tejido conjuntivo que sintetiza la matriz extracelular y el colágeno, y se obtiene de un líquido sinovial de un paciente con AR. Los fibroblastos utilizados de acuerdo con el método pueden ser un cultivo primario aislado directamente de un paciente con AR o líneas celulares obtenidas de fibroblastos, tales como las líneas celulares disponibles en el mercado SW 982, PCS-201-010 y ACS-1023, que se pueden obtener de la ATCC.

Los métodos de obtención de líquido sinovial de un sujeto son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, biopsia, tal como biopsia articular y aspiración articular. Normalmente, los procedimientos de obtención de biopsias de tejidos o líquidos se describen en detalle en el Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) healthatoz (dot)com/healthatoz/Atoz/search.asp.

En concreto, una aspiración articular, también conocida como artrocentesis, se refiere a la extracción de líquido del espacio alrededor de una articulación con una aguja y una jeringa. Esto generalmente se realiza con anestesia local para aliviar la hinchazón o para obtener líquido para el análisis para diagnosticar un trastorno y/o un problema articulares. La aspiración articular generalmente se realiza en la rodilla; sin embargo, el líquido también se puede extraer de otras articulaciones, tales como la cadera, el tobillo, el hombro, el codo o la muñeca.

Una biopsia articular se refiere a una biopsia articular o sinovial. En el procedimiento, se toma una muestra del revestimiento de la articulación o de la membrana, o del líquido sinovial. Brevemente, el procedimiento lo realiza un cirujano en un centro médico. Hay varios enfoques disponibles para realizar esta biopsia: tal como a través de una incisión en la articulación; con un artroscopio insertado en la articulación; o, más habitualmente, mediante la inserción de un instrumento afilado a través de la piel. La muestra se puede tomar de cualquier articulación, normalmente la articulación examinada es la rodilla. Se empuja un instrumento afilado (trocar) hacia el espacio articular. Se inserta en la articulación una aguja con una jeringa acoplada para extraer líquido para el análisis de laboratorio. El cirujano puede instilar compuestos analgésicos en la articulación y a lo largo del recorrido de la aguja antes de retirarla. Se inserta el trocar y luego la aguja de biopsia, y se toman las muestras de ensayo. Después de tomar la muestra, se retiran tanto el trocar como la aguja de biopsia.

Independientemente del procedimiento empleado, una vez que se obtiene la muestra biológica, los fibroblastos puede aislarse adicionalmente. El enriquecimiento de las poblaciones de fibroblastos puede obtenerse por métodos muy conocidos en la técnica, e incluyen los divulgados en, por ejemplo, Bendersky et al., J lmmunol.;188:4349-59, 2012, separación magnética de células y clasificación de células por citometría de flujo.

Por lo tanto, por ejemplo, los fibroblastos pueden aislarse cultivando células adherentes de líquido sinovial en pocillos de plástico, en medio DMEM complementado durante aproximadamente 48 horas, seguido de la eliminación de todas las células no adherentes. Las células adherentes que comprenden fibroblastos presentan normalmente una morfología fibroblástica y expresan CD90, bajos niveles de la integrina CD49a, son negativo para marcadores de superficie de macrófagos (CD14), linfocitos T (CD3) y linfocitos B (CD20) (según se determina, por ejemplo, mediante citometría de flujo), y se tiñe positivamente para colágeno de tipo I, determinado por tinción con rojo sirio.

El cultivo primario de fibroblastos comprende, de acuerdo con realizaciones específicas, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o más de fibroblastos.

Después de la preparación de los fibroblastos, se incuba una cantidad predeterminada de células en placas de cultivo de tejidos (por ejemplo; placas de 12, 24, 96, 384 pocillos) con el medio de cultivo apropiado y se estimulan con una cantidad predeterminada del polipéptido aislado, la composición de materia o la composición farmacéutica analizada. La selección del medio está dentro de las aptitudes de los expertos en la materia. Por lo tanto, por ejemplo, se puede utilizar como medio de cultivo RPMI o DMEM (se puede obtener, por ejemplo, de Sigma-Aldrich o Biological Industries, Beit Haemek, Israel). El medio puede complementarse con L-glutamina, aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio, solución de antibióticos/antimicóticos, 2-mercaptoetanol y suero.

La selección de la cantidad predeterminada de células incubadas para el análisis in vitro que dará como resultado un efecto detectable en la supervivencia celular está dentro de las aptitudes de los expertos en la materia. Por lo tanto, por ejemplo, la concentración de células puede ser de 1x104/ml a 5x106/ml; 1x104/ml a 1x106/ml; 5x104/ml a 5x106/ml; 1x105/ml a 5x106/ml; o 1x105/ml a 1x106/ml.

De acuerdo con realizaciones específicas, la concentración de células es de 2x10s / ml.

La selección de la concentración del péptido o la composición de materia utilizada para el análisis in vitro que dará como resultado un efecto detectable en la supervivencia celular está dentro de las aptitudes de los expertos en la materia. Preferentemente, la concentración utilizada debe estar dentro del intervalo lineal del parámetro de estimulación seleccionado. Por lo tanto, por ejemplo, la concentración puede ser de 1 mg / ml a 30 mg I ml; de 1 mg / ml a 20 mg / ml; de 5 mg / ml a 30 mg / ml; o de 5 mg / ml a 20 mg / ml.

El número de concentraciones analizadas puede ser de al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 5, al menos 6, 1-10, 2-10, 3-10, 5-10, 1-5, 2-5 y 3-5 concentraciones distintas.

El número de repeticiones de muestras para cada concentración analizada puede ser de 2, 3, 4, 5 o 6 repeticiones.

Después de un tiempo de incubación predeterminado, se determina la supervivencia de los fibroblastos. Los métodos específicos de control de la supervivencia celular son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, la prueba MTT, que se basa en la capacidad selectiva de las células vivas para reducir la sal amarilla m Tt (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazolil-2)-2,5-difeniltetrazolio) (se puede obtener, por ejemplo, de Sigma, Aldrich) a un precipitado de formazán insoluble azul púrpura; ensayos de apoptosis tales como el ensayo TUNEL (se puede obtener, por ejemplo, de Roche); y el ensayo de anexina V [por ejemplo, el kit ApoAlert® Annexin V Apoptosis Kit (Clontech Laboratories, Inc., CA, EE.UU.)].

El tiempo de incubación puede variar y la determinación del tiempo de incubación que dará como resultado un efecto detectable en la supervivencia celular está dentro de las aptitudes de los expertos en la materia. De acuerdo con una realización específica, el tiempo de incubación es de 12 horas a 96 horas. De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el tiempo de incubación es de 12 a 72 horas; de 12 a 48 horas; de 12 a 24 horas; de 24 a 96 horas, de 24 a 72 horas o de 24 a 48 horas. De acuerdo con realizaciones específicas de la invención, el tiempo de incubación es de 24-48 horas.

De acuerdo con realizaciones específicas, la supervivencia reducida de los fibroblastos después de dicha puesta en contacto es indicativa de que el lote es potente.

De acuerdo con realizaciones específicas, el ensayo puede incluir adicionalmente muestras de control positivo y negativo. El control positivo del ensayo puede incluir agentes que inducen la muerte celular no específica de fibroblastos, por ejemplo, ascorbato (véase, por ejemplo, Schmidt et al., J Biomed Mater Res. abril de 1993; 27(4):521-30).

El control negativo del ensayo puede incluir agentes que impiden la actividad biológica del polipéptido o la composición de materia analizados, tal como SAA (se puede obtener, por ejemplo, de PeproTech).

De acuerdo con realizaciones específicas, el método comprende comparar la supervivencia de las células con la supervivencia de las células después de la puesta en contacto con un lote patrón de referencia del polipéptido aislado, la composición de materia o de la composición farmacéutica, para determinar la potencia relativa del lote.

Como se usa en el presente documento, la expresión "potencia relativa" se refiere a una medida cualitativa de la potencia de un lote del polipéptido aislado, la composición de materia o de la composición farmacéutica, de forma relativa a una referencia patrón (RS, forma siglada de standard reference) del polipéptido aislado, la composición de materia o de la composición farmacéutica, que tiene una potencia conocida.

De acuerdo con realizaciones específicas, la potencia de un lote del polipéptido aislado, la composición de materia o de la composición farmacéutica, se determina de forma relativa a la potencia conocida de un patrón de referencia (RS).

Como se usa en el presente documento, la frase "patrón de referencia" o "RS" se refiere a un polipéptido aislado, composición de materia o composición farmacéutica normalizado, que se usa como base de medición para el polipéptido aislado, composición de materia o composición farmacéutica. El RS proporciona un nivel calibrado de efecto biológico frente al que las nuevas preparaciones del polipéptido aislado, la composición de materia o la composición farmacéutica pueden compararse.

De acuerdo con una realización específica, el RS se caracteriza por una potencia y calidad óptimas de un componente activo que es eficaz en el tratamiento de la enfermedad (por ejemplo, la RA).

El cálculo de la potencia y la potencia relativa son conocidos en la técnica. De acuerdo con realizaciones específicas, la potencia relativa se calcula utilizando un programa informático adecuado para ensayos biológicos, tal como el programa informático de análisis de líneas paralelas, por ejemplo, PLA (Stegmann Systems GmbH) y programa informático de análisis de datos Gen5 (BioTek).

La implementación del método y/o sistema de realizaciones de la invención puede implicar realizar o completar tareas seleccionadas de forma manual, automáticamente, o una combinación de los mismos. Además, de acuerdo con la instrumentación y el equipo reales de las realizaciones del método y/o el sistema de la invención, podrían implementarse varias tareas seleccionadas mediante hardware, mediante programas informáticos o mediante firmware, o por una combinación de los mismos utilizando un sistema operativo.

Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" se refiere a ± el 10 %.

Las expresiones "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "que tiene" y sus conjugaciones significan "que incluye, pero sin limitación".

La expresión "que consiste en" significa "que incluye y se limita a".

La expresión "que consiste esencialmente en" significa que la composición, método o estructura puede incluir ingredientes, etapas y/o partes adicionales, pero solo si los ingredientes, etapas y/o partes adicionales no modifican materialmente las características básicas y nuevas de la composición, método o estructura reivindicado.

Como se usa en el presente documento, la forma singular "un", "una", "el" y "la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente otra cosa. Por ejemplo, la expresión "un compuesto" o "al menos un compuesto" puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos.

A lo largo de la presente solicitud, pueden presentarse diversas realizaciones de la presente invención en un formato de intervalo. Ha de comprenderse que la descripción en formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad, y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la invención. Por consiguiente, debe considerarse que la descripción de un intervalo ha divulgado específicamente todos los subintervalos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, debe considerarse que la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 ha divulgado específicamente subintervalos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1,2,3, 4, 5 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.

Siempre que se indique un intervalo numérico en el presente documento, se pretende incluir cualquier número citado (fraccionario o entero) dentro del intervalo indicado. Las frases "que varía/varía entre" un primer número indicador y un segundo número indicador y "que varía/varía de" un primer número indicador "a" un segundo número indicador se usan indistintamente en el presente documento y se pretende que incluyan los números indicadores primero y segundo, y todos los números fraccionarios y enteros entre ellos.

Como se usa en el presente documento, el término "método" se refiere a maneras, medios, técnicas y procedimientos para lograr una tarea dada, incluyendo, pero sin limitación, las maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos o desarrollados fácilmente a partir de maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos por profesionales de la técnica química, farmacológica, biológica, bioquímica y médica.

Cuando se hace referencia a listados de secuencias particulares, ha de comprenderse que tal referencia también abarca las secuencias que corresponden sustancialmente a su secuencia complementaria que incluye variaciones de secuencia menores, que son el resultado de, por ejemplo, errores de secuenciación, errores de clonación u otras modificaciones que dan como resultado la sustitución de bases, la deleción de bases o la adición de bases, siempre que la frecuencia de tales variaciones sea inferior a 1 en 50 nucleótidos, como alternativa, menos de 1 en 100 nucleótidos, como alternativa, menos de 1 en 200 nucleótidos, como alternativa, menos de 1 en 500 nucleótidos, como alternativa, menos de 1 en 1000 nucleótidos, como alternativa, menos de 1 en 5.000 nucleótidos, como alternativa, menos de 1 en 10.000 nucleótidos.

Se aprecia que determinadas características de la invención, que, por claridad, se describen en el contexto de realizaciones separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una única realización. Contrariamente, diversas características de la divulgación que, por brevedad, se describen en el contexto de una única realización, también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación adecuada, o como sea adecuado en cualquier otra realización descrita de la invención. Determinadas características descritas en el contexto de diversas realizaciones no han de considerarse características esenciales de esas realizaciones, a menos que la realización no funcione sin esos elementos.

Diversas realizaciones y aspectos de la presente invención como se han delineado anteriormente en el presente documento y como se reivindica más adelante en la sección de reivindicaciones encuentran sustento experimental en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Se hace referencia ahora a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores ilustran algunas realizaciones de la invención de una manera no limitante.

Generalmente, la nomenclatura utilizada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Dichas técnicas se explican minuciosamente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes l-lll Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, Nueva York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vol. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); las metodologías como se exponen en las Patentes de Estados Unidos N.° 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volúmenes l-lll Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" por Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), tercera edición; "Current Protocols in Immunology" Volúmenes l-lll Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8a edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen ampliamente en la bibliografía científica y de patentes, véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D. y Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D. y Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); los cuales se incorporan por referencia como si se expusieran por completo en el presente documento. Se proporcionan otras referencias generales a lo largo del presente documento. Se cree que los procedimientos de los mismos son bien conocidos en la técnica y se proporcionan para la comodidad del lector. Toda la información allí contenida se incorpora aquí por referencia.

EJEMPLO 1

SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE PÉPTIDOS

Materiales y métodos

Síntesis de péptidos de 5, 7 y 9 meros - Los péptidos de 5, 7 y 9 meros [MTADV (SEQ ID NO: 1), MTADVDR (SEQ ID NO: 2) y TRm Ta DVDR (Se Q ID NO: 3)], - 3, los péptidos de 5, 7 y 9 meros con extremos N acilado y C amidado [Ac-MTADV-NH2 (SEQ ID NO: 4), Ac-MTADVDR-NH² (SEQ ID NO: 5) y Ac-TRMTADVDR-NH² (SEQ ID NO: 6)], y el péptido de 7 meros desordenado [Ac-TMDVADR-NH² (SEQ ID NO: 7)], se sintetizaron en Sigma Israel, utilizando síntesis en fase sólida de química fmoc. Se alcanzó una pureza del 95 al 97 %.

Cromatografía líquida-espectrometría de masas (CLEM) - La estabilidad, farmacocinética (PK) y las proteínas diana del péptido fueron evaluadas mediante CLEM.

Preparación de muestras para espectrometría de masas: Las perlas con proteínas unidas se redujeron con DTT 2,8 mM (60 °C durante 30 min) y se modificaron con yodoacetamida 8,8 mM (a temperatura ambiente durante 30 min en condiciones de oscuridad) en urea 8 M y bicarbonato de amonio 400 mM. Las proteínas se digirieron en urea 2 M, bicarbonato de amonio 25 mM con tripsina modificada (Promega) en una relación de enzima:sustrato de 1:50, durante una noche a 37 °C. Los péptidos trípticos se desalaron utilizando puntas C18 (Harvard), se secaron y se resuspendieron en mediciones de espectrometría de masa con ácido fórmico al 0,1 %. Los péptidos trípticos resultantes se analizaron por LC-MS/m S utilizando un espectrómetro de masas OrbitrapXL (Thermo-Fisher) equipado con HPLC capilar (Eksigent). En concreto, los péptidos se cargaron en una columna trap C18 (0,35 mm, LC-Packings) conectada en línea a una columna capilar casera (DI de 75 micrómetros) empaquetada con Reprosil C18-Aqua (Dr Maisch GmbH, Alemania) y se resolvió utilizando gradientes lineales de acetonitrilo 5 a 40 %, 94 minutos, seguidos de 12 minutos con acetonitrilo al 95 % en presencia de ácido fórmico al 0,1 % en agua a caudales de 0,25 ml/min. La espectrometría de masas se realizó en un modo positivo utilizando una exploración de MS repetidamente completa (resolución 60000) seguida de disociación inducida por colisión (CID). Los siete primeros (péptidos cargados >1, 350­ 2000 M/Z) se seleccionaron para la fragmentación a partir de cada espectro de masas completo.

Análisis de datos: La espectrometría de masas se analizó utilizando el programa informático Discoverer versión 1.4, contra la base de datos uniprot de ser humano y contra las bases de datos señuelo (para determinar la tasa de descubrimientos falsos (TDF), utilizando los motores de búsqueda Sequest y Mascot. Alta confianza se refiere a una TDF de 0,01.

La semicuantificación se realizó calculando el área del pico de cada péptido. El área de la proteína es el promedio de los tres péptidos más intensos de cada proteína.

Resultados

Se demostró que la inclusión de alanina en la unión del corte y empalme entre el exón variante 4 y el exón variante 5 de la variante CD44vRA, que conduce a la presencia de la secuencia MTADV en lugar de la secuencia MTDV original, confiere la actividad patológica de CD44vRA (Nedvetzki et al., J Clin Invest 111:1211-1220,2003).

Los presentes inventores han sintetizado péptidos de 5, 7 y 9 meros (denominados en el presente documento péptidos RA) que incluían la secuencia MTADV. El péptido RA de 5 meros comprende una secuencia de aminoácidos hidrófoba relativa, así como un bajo peso molecular (menos de 700 Dalton). Por lo tanto, puede penetrar fácilmente en los tejidos y, en consecuencia, puede utilizarse en aplicaciones tópicas y administración oral.

El análisis proteolítico de los péptidos RA no demostró sitios proteolíticos (datos no mostrados), indicando que los péptidos son al menos relativamente estables. El análisis de cuantificación por espectrometría de masas indicó una estabilidad casi idéntica del péptido de 5 meros (SEQ ID NO: 1) tras el almacenamiento en solución salina a 4 °C, a temperatura ambiente o a -20 °C durante 22 semanas (Figura 1). Suponiendo que el almacenamiento a -20 °C presente el 100 % de estabilidad, estos resultados demuestran que el péptido de 5 meros es estable durante al menos 22 semanas a temperatura ambiente y 4 °C.

EJEMPLO 2

LOS PEPTIDOS RA DE 5 Y 9 MEROS PUEDEN REDUCIR LA INFLAMACIÓN ARTICULAR EN EL MODELO DE ARTRITIS INDUCIDA POR COLÁGENO (AIC) DE RATÓN

Materiales y métodos

Ratones- La artritis inducida por colágeno (AIC) se generó en ratones DBA/1 o C57BL mediante inyección de colágeno de tipo II como se describe en Nedvetzki et al., PNAS 101, 18081-18086, 2004.

Protocolo de tratamiento Se administró PBS o el péptido RA de 9 meros (SEQ ID NO: 3) i.p. a ratones con AIC a una dosis de 25 mg, 100 mg o 150 mg por inyección, 4 veces en 6 días (véase la Tabla 3 a continuación). se administraron PBS (n = 7) o péptido RA de 5 meros (SEQ ID NO: 1, n = 7) i.p. a ratones con AIC a una dosis de 70 mg por inyección en un contexto de C57BL/6 durante 10 días consecutivos. En todos los grupos, la primera inyección se proporcionó al inicio de la enfermedad, según lo determinado por la hinchazón de la pata.

Evaluación de la inflamación articular La inflamación se evaluó mediante la respuesta de hinchazón de la pata. La hinchazón de la pata se midió mediante un microcalibrador. La inflamación de la pata en el intervalo de 2,1-2,3 mm se consideró "inicio de la enfermedad" y el punto de partida para la inyección de los péptidos. Los ratones que mostraron una hinchazón de la pata superior a 2,3 mm se excluyeron del experimento. Todas las mediciones se realizaron con ocultación (para detalles adicionales véase Nedvetzki, et al., (2004) PNAS 101, 18081-18086).

Histología - Los ratones se sacrificaron el día 11 (un día después del cese del tratamiento) y las extremidades posteriores se aislaron y se fijaron durante una noche con paraformaldehído al 4 % a temperatura ambiente (para detalles adicionales véase Nedvetzki et al. (2004) PNAS 101,18081-18086). Después de la fijación, se prepararon cortes de la articulación diartrodial, se tiñó con hematoxilina y eosina (H y E) y un patólogo realizó una evaluación con ocultación. Puntuación de infiltración articular: 0 = sin infiltración; 4 = gran infiltración.

Análisis estadístico - El análisis estadístico para cada punto de medición se realizó mediante la prueba t de Student para valores independientes.

T l : Di ñ x rim n l - r l i Fi r 2A-

Resultados

El modelo de ratón de artritis inducida por colágeno (AIC) es el análogo en ratón de la artritis reumatoide humana (AR).

Para evaluar el efecto de los péptidos RA generados sobre la inflamación articular en el modelo de AIC de ratón, se administraron distintas dosificaciones del péptido RA de 9 meros (SEQ ID NO: 3) a ratones con AIC en un contexto de DBA/1, desde el inicio de la enfermedad; y la inflamación articular se evaluó determinando la hinchazón de la pata. Como se muestra en la Figura 2A-B, los ratones que recibieron 25 y 100 mg del péptido RA de 9 meros (SEQ ID NO: 3) no mostraron diferencias significativas en la respuesta de hinchazón de la pata en comparación con los ratones a los que se administró PBS, lo que implica la falta de un efecto terapéutico significativo. En cambio, los ratones que recibieron 150 mg del péptido RA de 9 meros (SEQ ID NO: 3) demostraron una reducción significativa en la hinchazón de la pata (Figura 2C).

La evaluación histológica de los cortes de las extremidades posteriores tomadas de ratones con AIC en el contexto de C57BL/6 después del tratamiento con el control de PBS reveló una gran infiltración de células inflamatorias mononucleares en la cápsula articular, hipertrofia sinovial extensa y estrechamiento severo del espacio articular, que estaba lleno de células reactivas. Además, se observó erosión severa del cartílago articular y el hueso subcondral, con destrucción de la matriz del cartílago. La matriz de cartílago restante también estaba fuertemente infiltrada. Tomados en conjunto, la puntuación de infiltración articular promedio en los ratones tratados con PBS = aproximadamente 4 (Figuras 3A y 3C).

Por el contrario, la evaluación histológica de los cortes de extremidades posteriores tomados de ratones con AIC después del tratamiento con el péptido RA de 5 meros (SEQ ID NO: 1) reveló una infiltración de células mononucleares inflamatorias inexistente a leve en la cápsula articular, con hipertrofia sinovial leve o nula. Se observó infiltrado inflamatorio en una minoría de las muestras. El espacio articular esta conservado, con pocas células reactivas, si las había. Además, no se observó erosión severa del cartílago articular y el hueso subcondral, y la matriz del cartílago en general se encontraba conservada. Adicionalmente, algunas de las muestras eran indistinguibles de los ratones no afectados (datos no mostrados). Tomados en conjunto, la puntuación de infiltración articular promedio en los ratones tratados con péptido RA de 5 meros = aproximadamente 1 (Figuras 3A y 3C).

En general, la puntuación de inflamación articular del grupo de control tratado con PBS fue significativamente mayor (P<0,0001) que la del grupo tratado con péptido RA de 5 meros (SEQ ID NO: 1), lo que indica que el tratamiento con el péptido puede restablecer muy bien la histología normal de la articulación inflamada.

Tomados en conjunto, el tratamiento con los péptidos RA de 5 y 9 meros (las SEQ ID NO: 1 y 3) inhibe la inflamación articular en el modelo de ratón con AIC.

Sin quedar ligado a teoría alguna, se sugiere que una interacción entre un ligando desconocido de CD44vRA y CD44vRA crea un cambio conformacional de la glucoproteína CD44vRA. Este nuevo epítopo permite la unión de FGF-2 al sulfato de heparina del producto del exón v3 que reside en la misma molécula. El FGF-2 unido se orienta para interactuar con células endoteliales o fibroblastos que expresan el receptor de FGF 1, dando como resultado su proliferación y la exageración de la actividad inflamatoria (Nedvetzki et al., J Clin Invest 111:1211-1220, 2003). El péptido RA puede competir con CD44 de superficie celular en la interacción con el ligando desconocido, dando como resultado el bloqueo de la cascada inflamatoria inducida por FGF-2 descrita por Nedvetzki et al. (J Clin Invest 111:1211-1220, 2003).

EJEMPLO 3

LOS PÉPTIDOS RA PROTEGIDOS DE 5, 7 Y 9 MEROS PUEDEN REDUCIR LA INFLAMACIÓN ARTICULAR EN EL MODELO DE AIC DE RATÓN

Materiales y métodos

Ratones - Como se describe en el Ejemplo 2 anterior.

Protocolo de tratamiento - PBS, o los péptidos analizados [Ac-TRMTADVDR-NH2 (SEQ ID NO: 6), Ac-MTADVDR-NH2 (SEQ ID NO: 5), Ac-MTADV-NH (SEQ ID NO: 4) y Ac-TMDVADR-NH desordenado (SEQ ID NO: 7)] a dosis de 70 o 200 mg por inyección se administraron i.p. a ratones con AIC/ 1 en un contexto de DBA durante 9-10 días consecutivos (véanse las siguientes Tablas 4-7). Como control no específico, se administró a varios ratones dexametasona (Dex) i.p. a una dosis de 50 mg, siguiendo el mismo protocolo. En todos los grupos, la primera inyección se proporcionó al inicio de la enfermedad, según lo determinado por la hinchazón de la pata.

Evaluación de la inflamación articular- Como se describe en el Ejemplo 2 anterior. La hinchazón de la pata de menos de 2 mm se consideró saludable.

Análisis estadístico - Como se describe en el Ejemplo 2 anterior.

T l 4: Di ñ x rim n l Fi r 4

T l A: Di ñ x rim n l Fi r A

T l B: Di ñ x rim n l Fi r B

T l : Di ñ x rim n l Fi r

T l 7: Di ñ x rim n l Fi r 7A-

Resultados

En la siguiente etapa se sintetizaron los péptidos RA de 9, 7 y 5 meros con restos de protección, a saber, restos acetilo y amida en los extremos amino y carboxilo terminales de los péptidos [Ac-TRMTADVDR-NH² (SEQ ID NO: 6), Ac-MTADVDR-NH² (SEQ ID NO: 5) y Ac-MTADV-NH² (SEQ ID NO: 4), indicado en el presente documento como péptido RA protegido de 9, 7 y 5 meros, respectivamente]. Estos restos de protección conservan la fase natural del péptido en el ratón experimental y estabilizan el péptido. Se evaluó la capacidad de los péptidos protegidos para reducir la inflamación articular en ratones DBA/1 después de su inyección al inicio de la AIC. Todas las mediciones se realizaron con ocultación.

Como se puede ver en las Figuras 4 y 5A-B, la inyección de todos los péptidos RA protegidos a una dosis de 200 mg por inyección inhibió significativamente la inflamación articular en los ratones AIC en el fondo DBA, en comparación con los ratones tratados con PBS. Como también es evidente en la Figura 5A, la administración de dexametasona también disminuyó la hinchazón de la almohadilla plantar, posiblemente generando un efecto antinflamatorio no específico de este esteroide. El péptido protegido de 5 meros (SEQ ID NO: 4) también tuvo la capacidad de inhibir significativamente la inflamación articular en los ratones con AIC en el contexto de C57BL/6 cuando se administró a una dosis de 70 mg por inyección (Figura 6). Todas las mediciones se realizaron con ocultación.

En la etapa siguiente, se evaluó el efecto de un péptido RA desordenado sobre la inflamación articular. Con este fin, el efecto del péptido RA protegido de 7 meros (Ac-MTADVDR-NH² , SEQ ID NO: 5) se comparó con el efecto de un péptido protegido desordenado de 7 meros (Ac-TMDVADR-NH² , SEQ ID NO: 7). Como se muestra en la Figura 7A-C, el péptido protegido de 7 meros desordenado no específico no tuvo efecto sobre la hinchazón de la almohadilla plantar. Todas las mediciones se realizaron con ocultación.

Los resultados mostrados en las Figuras 7A-C también se evaluaron determinando el porcentaje de patas sanas en cada grupo. Por tanto, la evaluación de las patas traseras de los ratones DBA/1 con AIC (Figura 8), que refleja la gravedad de la enfermedad, mostró que más del 60 % de las patas traseras en ratones con AIC tratados con el péptido RA protegido de 7 meros permanecieron sanas. En comparación, los porcentajes de patas traseras que se mantuvieron sanas en los otros grupos analizados fueron del 15 % en el grupo tratado con PBS y del 33 % en el grupo con péptido de 7 meros desordenado.

Tomados en conjunto, los péptidos RA protegidos de 5, 7 y 9 meros (las SEQ ID NO: 4-6) inhiben la inflamación de las articulaciones tras la inyección a ratones con AIC, tanto en un contexto de DBA como de C57BL/6, mientras que el péptido protegido de 7 meros desordenado no específico (SEQ ID NO: 7) no tiene ningún efecto sobre la inflamación articular. La acetilación y la amidación no afectaron la actividad de los péptidos RA (datos no mostrados); sin embargo, se espera que mejoren la estabilidad y la farmacocinética del péptido RA.

EJEMPLO 4

70 mg POR INYECCIÓN ES LA DOSIS ÓPTIMA DEL PÉPTIDO RA PROTEGIDO DE 5 MEROS PARA LA REDUCCIÓN DE LA INFLAMACIÓN ARTICULAR EN EL MODELO DE AIC DE RATÓN

Materiales y métodos

Ratones - Como se describe en el Ejemplo 2 anterior.

Protocolo de tratamiento - se administró PBS o el péptido analizado [Ac-MTADV-NH² (SEQ ID NO: 4)] a dosis de 10, 25, 70, 200 o 600 mg por inyección i.p. a ratones con AIC durante 10 días consecutivos (véanse las siguientes Tablas 8-9). En todos los grupos, la primera inyección se proporcionó al inicio de la enfermedad, según lo determinado por la hinchazón de la pata.

Evaluación de la inflamación articular- Como se describe en el Ejemplo 2 anterior. Las mediciones se efectuaron con ocultación.

Análisis estadístico - Como se describe en el Ejemplo 2 anterior.

T l : Di ñ x rim n l Fi r A

continuación

T l : Di ñ x rim n l Fi r B

Resultados

Para evaluar la dosis terapéutica antinflamatoria óptima del péptido RA de 5 meros, se administraron varias dosis distintas del péptido protegido (SEQ ID NO: 4) a ratones con AIC en el contexto C57BL/6 y se determinó la inflamación de las articulaciones mediante mediciones de la hinchazón de la almohadilla plantar (mediciones electrónicas automáticas del volumen de la almohadilla plantar, basadas en la observación de Arquímedes). Como se puede observar en la Figura 9A, la inyección de 70, 200 o 600 mg por inyección del péptido RA protegido de 5 meros (SEQ ID NO: 4) redujo la inflamación articular en comparación con el control de PBS; sin embargo, una dosis de 70 mg del péptido generó el efecto antinflamatorio más estadísticamente significativo. Además, como se muestra en la Figura 9B, una inyección de 10 y de 25 mg por inyección del péptido RA protegido de 5 meros (SEQ ID NO: 4) no indujo un efecto antinflamatorio significativo.

Tomados en conjunto, los datos indican que una dosis de 70 mg por inyección es la dosis óptima y la más baja para la inhibición de la AIC mediante el péptido RA protegido de 5 meros (SEQ ID NO: 4).

EJEMPLO 5

EL PÉPTIDO RA DE 5 MEROS NO INHIBE la DTH EN EL MODELO DE AIC DE RATÓN

Materiales y métodos

Modelo DTH - Se pintó el abdomen de ratones C57BL/6 con solución de oxazolona (sensibilización). El día 6, se pintó la oreja derecha de cada ratón con el mismo hapteno, oxazolona (suscitación), para generar una respuesta de hipersensibilidad de tipo retardada (DTH). Las diferencias de grosor entre las orejas derecha e izquierda, que indican desarrollo de DTH, se determinaron mediante un microcalibrador 24 horas después. La inducción de DTH indica una respuesta inmunitaria normal. Para detalles adicionales, véase Weiss et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 285-290.

Protocolo de tratamiento - Se administró PBS y péptido de 5 meros (SEQ ID NO: 1) a una dosis de 200 mg un día antes de la sensibilización y a continuación todos los días durante el período de sensibilización (7 días). Para la comparación se utilizó un anticuerpo anti-TNF (Herrring et al., (2002) Infect Immun 70, 2959-64), para demostrar el efecto no específico.

Análisis estadístico - Como se describe en el Ejemplo 2 anterior.

Resultados

Para evaluar la influencia de los péptidos RA sobre la respuesta inmunitaria en general, se evaluó el efecto del péptido RA de 5 meros (SEQ ID NO: 1) sobre la respuesta de hipersensibilidad de tipo retardada (DTH) en un modelo de DTH generada en ratones C57BL/6. La DTH refleja una inflamación aguda, lo que caracteriza una respuesta inmunitaria contra microorganismos. Los resultados indican que la inyección del péptido RA de 5 meros no afectó a la respuesta DTH, y los ratones tratados con el péptido presentaron la misma respuesta de DTH que los ratones de control tratados con PBS, a lo largo de todo el período de ensayo de 7 días (Figura 10). En comparación, los ratones tratados con anticuerpo anti-TNFa presentaron una respuesta inhibida de DTH, que fue significativa en comparación con los ratones de control.

EJEMPLO 6

EL PEPTIDO DE 5 MEROS NO GENERA ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES EN EL MODELO DE AIC DE RATÓN

Materiales y métodos

Ratones - Como se describe en el Ejemplo 2 anterior.

Protocolo de tratamiento - se administró PBS o péptido RA de 5 meros (SEQ ID NO: 1) i.p. a ratones con AIC a una dosis de 70 mg por inyección en un contexto de C57BL/6 durante 10 días consecutivos. En todos los grupos, la primera inyección se proporcionó al inicio de la enfermedad, según lo determinado por la hinchazón de la pata.

ELISA - Se recubrieron placas de ELISA de 96 pocillos con péptido RA de 5 meros (SEQ ID NO: 1), con colágeno o con inmunoglobulina (control positivo). Se añadió a las placas recubiertas suero de ratones con AIC tratados con PBS o con el péptido RA de 5 meros, y se detectó la presencia de anticuerpos neutralizantes contra colágeno o péptido RA con anti-inmunoglobulina sistema de detección. Los pocillos de las placas se recubrieron con péptido 1 mg/ml o con proteína. Se añadió suero de ratón a los pocillos de la placa durante 15 horas a temperatura fría. El sistema de detección incluyó HRP-anti-IgG de ratón y sustrato TMB (Bako). Las placas se analizaron utilizando un lector de ELISA a una longitud de onda de 450 nm.

Análisis estadístico - Como se describe en el Ejemplo 2 anterior.

Resultados

Para determinar si el tratamiento con los péptidos RA induce la producción de anticuerpos neutralizantes específicos que pueden reducir o incluso bloquear el efecto antinflamatorio del péptido, se determinó la abundancia de anticuerpos antipéptido de 5 meros en el suero utilizando un ensayo de ELISA. Como se muestra en la Figura 11, después del tratamiento con el péptido no se detectaron anticuerpos neutralizantes contra el péptido RA de 5 meros (SEQ ID NO: 1) en el suero de ratones con AIC. Al contrario, como el modelo de AIC de ratón se genera mediante inyección de colágeno, los anticuerpos anti-colágeno específicos fueron claramente evidentes en el suero de los ratones con AIC.

EJEMPLO 7

EL AMILOIDE SÉRICO A, LA TRANSTIRRETINA Y LA APOLIPOPROTEINA B SON POSIBLES PROTEÍNAS DIANA DEL PEPTIDO DE 5 MEROS

Materiales y métodos

Separación de proteína (o proteínas) diana del péptido- Se extrajo líquido sinovial de la articulación de un paciente con artritis reumatoide (AR). El líquido sinovial se diluyó 1:1 con p Bs y se centrifugó a 1.200 rpm. El sedimento celular se sometió a tampón de lisis que contenía inhibidores de proteasas. El lisado celular se incubó con un péptido de 5 meros biotinilado (Sigma) o con PBS durante 12 horas a 4 °C, con agitación. Se añadieron perlas de estreptavidina Sepharose (Sephdex) al extracto celular tratado con péptido de 5 meros biotinilado o al extracto celular tratado con PBS durante una hora adicional a 4 °C, con agitación. Las perlas unidas al péptido y las perlas de control se separaron mediante centrifugación, se lavaron exhaustivamente y se enviaron para el análisis por espectrometría de masas, véase la Figura 12. Las mediciones y análisis de espectrometría de masas (EM) se realizaron en el Smoler Proteomic Research Center en Technion en Haifa.

Resultados

El análisis por espectrometría de masas de las proteínas de lisados celulares extraídos de células de líquido sinovial de un paciente con AR que se unieron al péptido de 5 meros (SEQ ID NO: 1) identificó al amiloide sérico A (SAA), La transtirretina y la apolipoproteína B como posibles proteínas diana del péptido RA de 5 meros (SEQ ID NO: 1). Se sabe que las proteínas indicadas están implicadas en la patología de la AR, pero también en las patologías de la enfermedad de Alzheimer, cáncer y enfermedades cardiovasculares.

EJEMPLO 8

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido aislado que consiste en la SEQ ID NO: 1.

2. Un polipéptido modificado con protección terminal aislado que consiste en la SEQ ID NO: 1, en donde dicho polipéptido modificado comprende una actividad antinflamatoria.

3. El polipéptido modificado con protección terminal de la reivindicación 2, en donde dicha protección terminal comprende una protección terminal del extremo N.

4. El polipéptido modificado con protección terminal de la reivindicación 3, en donde dicha protección terminal del extremo N comprende un acetilo.

5. El polipéptido modificado con protección terminal de una cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en donde dicha protección terminal comprende una protección terminal del extremo C.

6. El polipéptido modificado con protección terminal de la reivindicación 5, en donde dicha protección terminal del extremo C comprende una amida.

7. El polipéptido modificado con protección terminal de la reivindicación 2 como se expone en la SEQ ID NO: 4.

8. Una composición de materia que comprende el polipéptido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 7 y una fracción no proteinácea unida a dicho polipéptido aislado.

9. El polipéptido aislado o la composición de materia de una cualquiera de las reivindicaciones 2-6 y 8, en donde dicha actividad antinflamatoria no depende de vacunación o de tolerancia mucosa o en donde el péptido es capaz de unirse a una proteína seleccionada del grupo que consiste en amiloide sérico A, Transtirretina y apolipoproteína B.

10. El polipéptido aislado o la composición de materia de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria.

11. El polipéptido aislado o la composición de la reivindicación 10, en donde dicha enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, artropatía psoriásica, enfermedad de Alzheimer, cáncer y enfermedad cardiovascular.

12. El polipéptido aislado o la composición de la reivindicación 10, en donde dicha enfermedad inflamatoria es artritis reumatoide.

13. El polipéptido aislado o la composición de la reivindicación 10, en donde dicha enfermedad inflamatoria es esclerosis múltiple.

14. El polipéptido aislado o la composición de la reivindicación 10, en donde dicha enfermedad inflamatoria es enfermedad gastrointestinal.

15. El polipéptido aislado o la composición de la reivindicación 10, en donde dicha enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en enfermedad inflamatoria intestinal crónica, enfermedad celíaca, colitis, ileítis y enfermedad de Crohn.