ES2795817T3

ES2795817T3 - Inmunoensayo para secuencias de colágeno tipo VIII

Info

Publication number: ES2795817T3
Application number: ES16756993T
Authority: ES
Inventors: Niels Hansen; Diana Leeming; Morten Karsdal
Original assignee: Nordic Bioscience AS
Current assignee: Nordic Bioscience AS
Priority date: 2015-08-18
Filing date: 2016-08-16
Publication date: 2020-11-24
Anticipated expiration: 2036-08-16
Also published as: JP6970082B2; EP3337821B1; GB201514658D0; EP3337821A1; US20180238903A1; WO2017029300A1; DK3337821T3; JP2018525400A

Abstract

Un método de inmunoensayo para detectar o cuantificar en una muestra de biofluido un epítopo C-terminal de la cadena α1 de colágeno tipo VIII comprendido en la secuencia de aminoácidos C-terminal SFSGYLLYPM-COOH, en donde dicho método comprende poner en contacto dicha muestra que comprende dicho epítopo C-terminal con un anticuerpo específicamente reactivo con un epítopo comprendido en la secuencia de aminoácidos del extremo Cterminal SFSGYLLYPM-COOH, y determinar la cantidad de unión de dicho anticuerpo, en donde dicho biofluido es suero o plasma.

Description

DESCRIPCIÓN

Inmunoensayo para secuencias de colágeno tipo VIII

La presente invención se refiere a un anticuerpo que se une a un epítopo presente en el extremo C terminal de la cadena a1 de colágeno tipo VIII y a inmunoensayos que detectan dicho epítopo.

El colágeno tipo VIII es un producto de células endoteliales, queratinocitos, mastocitos, células endoteliales microvasculares y algunas células tumorales. También está presente en una variedad de matrices extracelulares tan diversas como la esclera, la piel y el glomérulo. Aunque la función del colágeno tipo VIII es incierta, los trabajos recientes ha puesto de relieve la importancia de este colágeno en la vasculatura. Puede ser particularmente significativa su regulación por incremento en la migración de las células del músculo liso y el papel potencial en el mantenimiento del fenotipo de las células del músculo liso. Es interesante especular que este colágeno puede proporcionar un sustrato para una variedad de células y facilitar el movimiento de las células endoteliales en la angiogénesis, las células del músculo liso en la invasión intimal y los miofibroblastos en condiciones fibróticas [1]. El colágeno tipo VIII es un colágeno no fibrilar de cadena corta y es el componente principal de la membrana de Descemet (membrana basal que separa las células endoteliales corneales del estroma corneal) de las células endoteliales corneales. Es parte del endotelio de los vasos sanguíneos y está presente en las arteriolas y vénulas, y por tanto se encuentra en el corazón, el cerebro, el hígado, los pulmones, los músculos, etc., mientras que se encuentra alrededor de los condrocitos en el cartílago [1]. El gen del procolágeno a1 humano se localiza en el cromosoma 3, mientras que el gen del procolágeno a2 humano se localiza en el cromosoma 1. Cada cadena a tiene un peso molecular de aproximadamente 60 kDa [2]. Anteriormente, el colágeno tipo VIII se había descrito como un heterotrímero compuesto por dos cadenas a1 y una cadena a2 [3], pero los estudios in vitro han demostrado que también pueden formarse homotrímeros de a1 o a2 [4]. Además estos homotrímeros son resistentes a la pepsina y un estudio inmunohistoquímico demostró que no se colocalizan siempre en la córnea, el nervio óptico, la aorta y el cordón umbilical [5].

El colágeno tipo VIII es sintetizado por las células endoteliales aórticas y corneales, así como por las células endoteliales de la arteria pulmonar y las células endoteliales microvasculares. No todas las células endoteliales expresan colágeno tipo VIII, y como tal el colágeno puede estar ausente de los vasos grandes y pequeños [6]. También se ha demostrado que los mastocitos humanos producen colágeno tipo VIII en condiciones normales y patológicas, y se ha especulado que esto contribuye a la angiogénesis, la remodelación de los tejidos y la fibrosis [7]. La angiogénesis, la remodelación de los tejidos y la fibrosis son partes importantes del desarrollo y la progresión tumoral [8]. Los pulmones tienen un área de superficie grande con una membrana basal asociada y una matriz intersticial, y es bien sabido que las proteínas de la matriz como el colágeno y la elastina tipo I, III, IV y VI están elevadas en pacientes con una enfermedad pulmonar [9-13]. El colágeno tipo VIII puede estar relacionado con el cáncer ya que la angiogénesis tumoral se encuentra en la mayoría de los tumores malignos. Está indirectamente implicado en eventos tumorigénicos como la proliferación celular y metástasis debido a la dependencia del intercambio de oxígeno y nutrientes con productos de desecho tumoral [14]. Durante la angiogénesis, las células endoteliales son inducidas a proliferar y migrar, así como a activar vías de señalización que a su vez impulsan los cambios en la forma de las células y el brote angiogénico [15]. Además, los vasos sanguíneos tumorales a menudo no se vuelven inactivos debido a una remodelación alterada del tejido que lleva a angiogénesis esporádica y a la formación de vasos sanguíneos con fugas. Como con la angiogénesis, la fibrosis es un fenómeno que puede observarse en muchos tumores malignos. En el cáncer, la fibrosis también es conocida como desmoplasia. En la desmoplasia, se observa una acumulación de fibroblastos asociados a cáncer (CAF) perpetuamente activados que muestran una expresión aumentada y alterada de proteínas de la matriz extracelular (ECM), incluyendo los colágenos [16]. La desmoplasia está emergiendo como un proceso importante y activo involucrado en la iniciación y progresión tumoral y puede, entre otras cosas, promover la migración de las células cancerosas [17].

Korsching et al, [34] divulga un anticuerpo dirigido contra los aminoácidos 100-111 de COL8A1 humano con un kDa de aproximadamente 1.3.nM.

Como tal, un objetivo de la presente invención es cuantificar el colágeno tipo VIII en muestras de suero de pacientes diagnosticados con enfermedades asociadas con remodelación vascular y angiogénesis, como la fibrosis y el cáncer.

La secuencia del colágeno humano alfa-1 (VIII) se expone en la SEQ ID NO. 1. Un péptido señal 1-27 (MAVLPGPLQL LGVLLTISLS SIRLIQA) se escinde para producir la cadena de proteína alfa-1 madura 28-744. La secuencia del extremo N-terminal de la cadena de proteína alfa-1 madura es, por lo tanto, NH2-GAYYGIKPLP ..y la secuencia del extremo C-terminal es ..SFSGYLLYPM-COOH.

Ahora hemos desarrollado un anticuerpo monoclonal y un kit de ELISA dirigido al extremo C-terminal de la cadena madura Tipo VIII-a1. Nos referimos a este kit y a la reactividad medida con él aquí como 'C8-C'.

Hemos establecido que los niveles de C8-C son elevados en comparación con los controles en la fibrosis pulmonar idiopática (FPI), la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y el carcinoma de células escamosas de pulmón junto con varios tipos de cáncer.

La presente invención utiliza un anticuerpo reactivo con un epítopo C-terminal de la cadena a1 del colágeno Tipo VIII, que se une específicamente a dicho epítopo C-terminal comprendido en una secuencia de aminoácidos C-terminal. SSFGYLLYPM-COOH.

El término "anticuerpo" como se usa en la presente incluye anticuerpos policlonales y monoclonales y también fragmentos de unión específicos de anticuerpos como Fab o F(ab')2. Por tanto, dicho anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o un fragmento de un anticuerpo monoclonal que tiene afinidad de unión específica.

Preferiblemente, dicho anticuerpo no reconoce ni se une a una versión alargada de dicha secuencia de aminoácidos C-terminal que es ..SSFSGYLLYPMA-COOH.

Preferiblemente, dicho anticuerpo no reconoce ni se une (o tampoco reconoce ni se une) a una versión truncada de dicha secuencia de aminoácidos C-terminal que es ..SSFSGYLLYP-COOH.

Preferiblemente, la relación de la afinidad de dicho anticuerpo por la secuencia de aminoácidos ..SSFSGYLLYPM-COOH con la afinidad de dicho anticuerpo por la secuencia de aminoácidos alargada ..SSFSGYLLYPMA-COOH, y/o la secuencia de aminoácidos truncada ..SSFSGYLLYP-COOH, es mayor que 10 a 1.

De manera más general, la relación de la afinidad de dicho anticuerpo por la secuencia de aminoácidos ..SSFGYLLYPM-COOH con la afinidad de dicho anticuerpo por dicha secuencia de aminoácidos alargada es preferiblemente mayor que 10 a 1, preferiblemente mayor que 50 a 1, preferiblemente mayor que 100 a 1, preferiblemente mayor que 500 a 1, preferiblemente mayor que 1000 a 1, y lo más preferible mayor que 10.000 a 1. También preferiblemente, la relación de la afinidad de dicho anticuerpo por la secuencia de aminoácidos ..SSFSGYLLYPM-COOH con la afinidad de dicho anticuerpo por dicha secuencia de aminoácidos truncada es mayor que 10 a 1, preferiblemente mayor que 50 a 1, preferiblemente mayor que 100 a 1, preferiblemente mayor que 500 a 1, preferiblemente mayor que 1000 a 1, y lo más preferible mayor que 10.000 a 1.

La invención incluye un método de inmunoensayo para detectar o cuantificar en una muestra un epítopo C-terminal de la cadena a1 madura de colágeno tipo VIII, en donde dicho método comprende poner en contacto una muestra que comprende dicho epítopo terminal con un anticuerpo como se ha descrito anteriormente, y determinar el cantidad de unión de dicho anticuerpo.

La presente invención proporciona un método de inmunoensayo para detectar o cuantificar en una muestra de biofluido un epítopo C-terminal de la cadena a1 de colágeno tipo VIII comprendido en la secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal SFSGYLLYPM-COOH, en donde dicho método comprende poner en contacto dicha muestra que comprende dicho epítopo C-terminal con un anticuerpo específicamente reactivo con un epítopo comprendido en la secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal SFSGYLLYPM-COOH, y determinar la cantidad de unión de dicho anticuerpo, en donde dicho biofluido es suero o plasma.

Dicho inmunoensayo puede ser un ensayo de competición o un ensayo tipo sándwich como un radioinmunoensayo o un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).

Dicho método puede comprender además correlacionar la cantidad de dicho epítopo C-terminal o N-terminal de la cadena a1 de colágeno tipo VIII determinada por dicho método con los valores normales estándar de dicho extremo C-terminal de la cadena a1 de colágeno tipo VIII para evaluar un cambio la misma a partir de los niveles normales. Este biomarcador puede usarse para ayudar en el diagnóstico de estados de enfermedad o para proporcionar un pronóstico sobre los pacientes que probablemente sufran un deterioro más rápido de su condición, lo que puede hacer que sean pacientes más relevantes para participar en un ensayo clínico de un tratamiento relevante. Tales estados de enfermedad y/o afecciones incluyen fibrosis y cáncer. Las afecciones fibróticas incluyen (pero no están limitadas a) fibrosis pulmonar idiopática (FPI) y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), y los cánceres incluyen (pero no están limitados a) cáncer de mama, cáncer de colon, melanoma, carcinoma de células no escamosas del pulmón (NSCLC), cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, y carcinoma de pulmón de células escamosas (SCLC).

Un aspecto adicional de la divulgación proporciona un kit de ensayo para determinar la cantidad de un epítopo C-terminal de la cadena a1 de colágeno Tipo VIII, que comprende un compañero de unión inmunológica de la invención y por lo menos uno de:

- una placa de 96 pocilios recubierta con estreptavidina

- un péptido que es reactivo con dicho compañero de unión inmunológica, que puede ser un péptido biotinilado Biotin-L-SFSGYLLYPM-COOH, en el que L es un conector opcional

- un anticuerpo secundario opcionalmente biotinilado para usar en un inmunoensayo sándwich

- un péptido calibrador que comprende la secuencia C-terminal ..SSFSGYLLYPM-COOH

- un kit de marcado de anticuerpos HRP

- un kit de radiomarcado de anticuerpos

- un kit de visualización de ensayo

La invención se describirá e ilustrará adicionalmente con referencia a los dibujos acompañantes en los que:

La Figura 1 muestra resultados de una prueba de especificidad peptídica de dos anticuerpos monoclonales; La Figura 2 muestra resultados de una prueba de reactividad del anticuerpo monoclonal 13G5 en suero humano;

La Figura 3 muestra resultados de una prueba adicional de la reactividad del anticuerpo monoclonal 13G5 en suero humano; y

La Figura 4 muestra resultados de una prueba adicional de la reactividad del anticuerpo monoclonal 13G5 en suero humano.

Ejemplos

Ejemplo 1: Desarrollo de anticuerpos para el ensayo de C8-C, clon 13G5;

Usamos los últimos 10 aminoácidos de la cadena a1 de colágeno tipo VIII (735SFSGYLLYPM 744) como un péptido inmunogénico para generar anticuerpos monoclonales de epítopos específicos. Los métodos usados para el desarrollo de anticuerpos monoclonales fueron como los descritos anteriormente [18]. Brevemente, se inmunizaron ratones Balb/C de 4 a 6 semanas de edad por vía subcutánea con 200 pl de antígeno emulsionado con 50 pg del péptido inmunogénico. Se realizaron inmunizaciones consecutivas a intervalos de 2 semanas en adyuvante incompleto de Freund, hasta que se alcanzaron niveles estables de titulación de suero, y se sangraron los ratones a partir de la segunda inmunización. En cada sangrado, se detectó el título de suero y se seleccionó el ratón con el título de antisuero más alto y la mejor reactividad nativa para la fusión. El ratón seleccionado se dejó descansar durante 1 mes seguido de refuerzo intravenoso con 50 pg de péptido inmunogénico en 100 pl de solución de cloruro de sodio al 0,9% 3 días antes del aislamiento del bazo para la fusión celular.

El procedimiento de fusión se ha descrito en otra parte [19]. Brevemente, las células de bazo de ratón se fusionaron con células compañeras de fusión de mieloma SP2/0. Las células de fusión se criaron en placas de 96 pocillos y se incubaron en la incubadora de CO2. Aquí se usó una dilución limitada estándar para promover el crecimiento monoclonal. Se seleccionaron y subclonaron líneas celulares específicas para el péptido de selección y sin reactividad cruzada con el péptido alargado (SFSGYLLYPMA, Chinese Peptide Company, China). Finalmente, los anticuerpos se purificaron usando una columna de IgG.

Protocolo de ensayo de C8-C:

Las placas ELISA usadas para el desarrollo del ensayo fueron recubiertas con estreptavidina de Roche (cat.: 11940279). Todas las placas ELISA se analizaron con el lector ELISA de Molecular Devices, SpectraMax M, (CA, USA). Marcamos el anticuerpo monoclonal seleccionado con peroxidasa de rábano picante (HRP) usando el kit de marcado Lightning link HRP de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Innovabioscience, Babraham, Cambridge, Reino Unido). Se recubrió una placa de estreptavidina de 96 pocillos con péptido sintético biotinilado biotina-KKKSFSGYLLYPM (Chinese Peptide Company, China) disuelto en tampón de ensayo (Trizma 50 mM, Tween 20 0,46 mM, Rojo fenol 0,08 mM, NaCl 34 mM, Bronidox L5 al 0,36%, bSa al 1%, pH 7,4) y se incubó 30 minutos a 20° C. Se añadieron 20 pl de péptido estándar o muestras diluidas en tampón de ensayo a los pocillos apropiados. seguido de 100 pl de anticuerpo monoclonal conjugado HRP 13G5, y se incubó 20 horas a 4° C. Finalmente, se añadieron 100 pl de tetrametilbenzinidina (TMB) (Kem-En-Tec cat.4380H) y la placa se incubó 15 minutos a 20° C en la oscuridad. Todos los pasos de incubación anteriores incluyeron agitación a 300 rpm. Después de cada paso de incubación, la placa se lavó cinco veces en tampón de lavado (Tris 20 mM, NaCl 50 mM). La reacción de TMB se detuvo añadiendo 100 pl de solución de parada (H2SO4 al 1%) y se midió a 450 nm con 650 nm como referencia.

Evaluación técnica de C8-C:

El límite más bajo de detección (LLOD) se determinó a partir de 21 muestras cero (es decir, tampón) y se calculó como la media 3x desviación estándar. La variación dentro del ensayo y las variaciones entre ensayos se determinaron mediante 12 ejecuciones independientes de 8 muestras QC, y cada ejecución consistió de determinaciones dobles de las muestras. La recuperación de la dilución se determinó en 4 muestras de suero y 4 muestras de plasma EDTA y se calculó como un porcentaje de recuperación de muestras diluidas de la muestra al 100%. Los datos para la validación técnica se ven en la T abla 1.

Tabla 1. Validación técnica del ensa o C8-C

Ejemplo 2

Usando el anticuerpo monoclonal 13G5 se midió C8-C en muestras de suero de pacientes diagnosticados con EPOC (n = 13), FPI (n = 10) y cáncer de pulmón de carcinoma de células escamosas (n = 10) obtenidas de Proteogenex (Culver City, CA) y se comparó con los controles no enfermos. Los resultados se muestran en la Figura 2.

Los resultados se muestran como media ± error estándar de la media (SEM). Las diferencias entre los valores medios se compararon mediante la prueba ANOVA de una vía de Kruskal-Wallis no paramétrica. Todos los análisis estadísticos se realizaron en el software GraphPad Prism v .6 (GraphPad Software, San Diego, CA). Los valores de P menores de 0,05 se consideraron significativos.

Se descubrió que los niveles de C8-C eran elevados en todas estas afecciones clínicas.

Ejemplo 3

Se evaluó C8-C en una cohorte de EPOC más grande. Las concentraciones de C8-C se midieron en muestras de suero de pacientes diagnosticados con EPOC (n = 68) obtenidas del Hospita1Hvidovre (Hospita1Hvidovre, Dinamarca) y se compararon con los controles no enfermos (n = 20).

La Figura 3 muestra que la concentración de C8-C fue significativamente elevada en los pacientes diagnosticados con EPOC en comparación con los controles (p <0,0001).

Ejemplo 4

Usando el anticuerpo monoclonal 13G5 se midieron los niveles de C8-C en muestras de suero de pacientes diagnosticadas con cáncer de mama (n = 13), de colon (n = 7), gástrico (n = 9), melanoma (n = 7), NSCLS (n = 12), de ovario (n = 10), de páncreas (n = 5), de próstata (n = 14) y SCLC (n = 8) obtenidas de Asterand (Detroit, MI) y se compararon con controles no enfermos (n = 43). Las muestras se diluyeron 1:2 en el ensayo C8-C. Los resultados se muestran en la Figura 4.

Exposición

Hasta donde sabemos, esta es la primera divulgación que describe el desarrollo y la validación de un nuevo ELISA competitivo para la evaluación de un anticuerpo monoclonal dirigido contra el extremo C-terminal del colágeno tipo VIII. Se demostró que el ensayo era técnicamente robusto, mostrando valores bajos de LLOD, variación intra- e inter-ensayo e interferencia con una recuperación de dilución aceptable y estabilidad del analito. La alineación de secuencia del extremo C-terminal humano, de rata, de ratón y bovino de colágeno tipo VIII muestra un 100% de homología entre las especies. El anticuerpo monoclonal 13G5 es específico hacia la secuencia C-terminal SFSGYLLYPM. El ensayo no detectó el péptido alargado (un aminoácido adicional) o sin sentido indicando que el anticuerpo monoclonal es específico hacia el extremo C-terminal del colágeno tipo VIII. El ELISA competitivo de C8-C funciona para evaluaciones en matrices tanto humanas como de roedores, lo que permite una buen ciencia traslacional.

El ensayo de C8-C descrito actualmente es diferente de otros ensayos disponibles comercialmente, ya que otros ensayos comerciales de colágeno tipo VIII disponibles utilizan anticuerpos o monoclonales o policlonales para los que no se conoce el epítopo preciso. Kapoor y col. planteó anticuerpos tanto policlonales como monoclonales hacia dominios triple-helicoidales de colágeno tipo VIII a partir de fragmentos de 50 kD derivados de la membrana de Descemet [20,21]. Los fragmentos usados para la inmunización son resistentes a la pepsina pero no resistentes a las colagenasas [21]. Dentro de los tejidos hay una remodelación en curso constante, con un fino equilibrio entre la formación y la degradación de las proteínas. En enfermedades, como la fibrosis o el cáncer, hay un aumento en el recambio de tejidos y el equilibrio se desplaza hacia la formación, lo que lleva a un aumento neto de proteínas de la matriz, pero es importante tener en cuenta que la degradación de las proteínas de la matriz también aumenta. Dado esto, es altamente plausible que el colágeno de tipo VIII sea escindido por colagenasas durante la remodelación del tejido. El anticuerpo NB683-13G5 desplegado en el ensayo de C8-C tiene la ventaja de que es específico de una secuencia pequeña que consiste de solo diez aminoácidos, lo que garantiza que detecta incluso los fragmentos pequeños generados por la degradación de la proteasa. Los anticuerpos generados por Kapoor et al. y Sawada et al. reconocen un péptido bastante grande que es probable que se degrade [21,22], por lo tanto, se detecta un grupo más pequeño de colágeno tipo VIII.

Se ha demostrado que el colágeno tipo VIII está elevado después de una lesión vascular y es parte de la remodelación del tejido que tiene lugar después de la lesión [23]. Además, el colágeno tipo VIII se ha localizado en las células endoteliales durante la proliferación y cuando las células endoteliales están expuestas a factores angiogénicos puede observarse un aumento de 4-6 veces del colágeno tipo VIII [24]. Se sabe que la expresión génica del colágeno tipo VIII es elevada en el estroma asociado al tumor y se ha demostrado que es elevada en las células de carcinoma hepatocelular [25]. Hasta donde sabemos, somos los primeros en mostrar que las concentraciones de colágeno tipo VIII están elevadas en la circulación de pacientes diagnosticados con EPOC y cáncer de pulmón SCC. Está generalmente aceptado que el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) está regulado por incremento en la EPOC, mientras que es bien sabido que tiene lugar una remodelación vascular. Recientemente, se ha aceptado que la angiogénesis aumenta en pacientes con EPOC [26,27]. Para confirmar las concentraciones elevadas de C8-C observadas en pacientes con EPOC, se evaluó una cohorte más grande de pacientes con EPOC. Se descubrió que pueden verse concentraciones significativamente aumentadas de C8-C en suero de pacientes con EPOC en comparación con los controles (p <0,0001). Con más precisión, se observó un aumento de 7 veces de las concentraciones de C8-C en el suero de pacientes con EPOC en comparación con los controles.

Además, las concentraciones de colágeno tipo VIII fueron significativamente elevadas en pacientes diagnosticadas con cáncer de mama, colon, melanoma, NSCLC, ovario, páncreas, próstata y SCLC, pero no cáncer gástrico. En resumen, se observaron aumentos entre 5 y 12 veces dentro de varios tipos de cáncer, excepto el cáncer gástrico. Se ha demostrado anteriormente que la expresión de colágeno tipo VIII es elevada en los vasos sanguíneos de algunos tipos de tumores cerebrales y varios carcinomas [28]. Además, el colágeno tipo VIII es expresado por las células endoteliales y las células del músculo liso, especialmente después de una lesión vascular, y por las células tumorales. La integrina a2p1 es un receptor conocido para el colágeno tipo I-VIII [29], que según los estudios ha aumentado en las células metastásicas en comparación con las células en el tumor primario [30]. El receptor está asociado con la progresión e invasión tumoral en varios tipos de cáncer. El colágeno tipo VIII es capaz de regular la migración de las células musculares lisas (SMC) a través del receptor p1 [29], las SMC siendo actores importantes en las enfermedades fibróticas y el microambiente tumoral [31]. El cáncer gástrico fue la única forma de cáncer que no mostraba concentraciones aumentadas de C8-C en suero. La bibliografía indica que hay una remodelación de ECM en curso en el tejido gástrico de cáncer [32], pero estos datos se basan en el metabolismo de colágeno no especificado o colágeno de tipo I, III y IV. Los inventores de la presente invención no pudieron encontrar ninguna bibliografía que confirmara la presencia de colágeno tipo VIII en cánceres relacionados con el estómago o gástricos, lo que podría explicar las bajas concentraciones de C8-C en el suero de pacientes diagnosticados con cáncer gástrico.

En conclusión, los inventores de la presente invención son los primeros en desarrollar un ensayo de colágeno tipo VIII técnicamente robusto y muestran que las concentraciones de colágeno tipo VIII están significativamente elevadas en suero de pacientes diagnosticados con EPOC y varios tipos de cáncer. El anticuerpo NB683-13G5 se generó e implementó en el ELISA competitivo de C8-C y se descubrió que era específico para la parte C-terminal del colágeno tipo VIII.

En esta especificación, a menos que se indique expresamente lo contrario, la palabra 'o' se usa en el sentido de un operador que devuelve un valor verdadero cuando se cumpla una o ambas de las condiciones establecidas, en oposición al operador 'exclusivo o' que requiere que solo se cumpla una de las condiciones. La palabra 'comprende' se usa en el sentido de 'incluye' en lugar de significar 'consiste de'.

Referencias

1. Kittelberger, R., Davis, P. F., Flynn, D. W. & Greenhill, N. S. Distribution of type VIII collagen in tissues: an ¡mmunohistochemical study. Connect. Tissue Res. 24, 303-318 (1990) .

2. Ma, Z.-H., Ma, J.-H., Jia, L. & Zhao, Y.-F. Effect of enhanced expression of COL8A1 on lymphatic metastasis of hepatocellular carcinoma in mice. Exp. Ther. Med. 4, 621-626 (2012).

3. Jander, R., Korsching, E. & Rauterberg, J. Characteristics and in vivo occurrence of type VIII collagen. Eur. J. Biochem. 189, 601-607 (1990).

4. Illidge, C., Kielty, C. & Shuttleworth, A. The alphal(VIII) and alpha2(VIII) chains of type VIII collagen can form stable homotrimeric molecules. J. Biol. Chem. 273, 22091-5 (1998).

5. Greenhill, N. S., Rüger, B. M., Hasan, Q. & Davis, P. F. The alphal(VIII) and alpha2(VIII) collagen chains form two distinct homotrimeric proteins in vivo. Matrix Biol. 19, 19-28 (2000).

6. Sage H, Balian G, Vogel AM, Bornstein P. Type VIII collagen. Synthesis by normal and malignant cells in culture. Lab Invest 1984;50:219-31.

7. Rüger B, Dunbar PR, Hasan Q, Sawada H, Kittelberger R, Greenhill N, et al. Human mast cells produce type VIII collagen in vivo. Int J Exp Pathol 1994;75:397-404.

8. Lu P. Extracellular Matrix Degradation and Remodeling in Development and Disease. Cold Spring Harb Perspect Biol 2011;3.

9. Sand JMB, Knox AJ, Lange P, Sun S, Kristensen JH, Leeming DJ, et al. Accelerated extracellular matrix turnover during exacerbations of COPD. Respir Res 2015;16:69. doi:10.1186/sl2931-015-0225-3.

10. Ricard-Blum S, Dublet B, Rest M van der. Unconventional Collagens: Types VI, VII, VIII, IX, X, XII, XIV, XVI, and XIX. Oxford University Press; 2000.

11. Sand JM, Genovese F, Martinez F, Han M, Hogaboam C, Karsdal MA, et al. Serum levels of a MMP-12 generated type IV collagen fragment is elevated in COPD and IPF patients. Eur Respir J 2013;42:P838 - .

12. Willumsen N, Bager CL, Leeming DJ, Smith V, Christiansen C, Karsdal MA, et al. Serum biomarkers reflecting specific tumor tissue remodeling processes are valuable diagnostic tools for lung cancer. Cancer Med 2014;3:1136-45. doi:10.1002/cam4.303.

13. Kristensen JH, Larsen L, Dasgupta B, Brodmerkel C, Curran M, Karsdal MA, et al. Levels of circulating MMP-7 degraded elastin are elevated in pulmonary disorders. Clin Biochem 2015. doi:10.1016/j.clinbiochem.2015.07.009. 14. Nishida N, Yano H, Nishida T, Kamura T, Kojiro M. Angiogenesis in cancer. Vasc Health Risk Manag 2006;2:213-9. 15. Chung, AS. FN. The Extracellular Matrix & Angiogenesis: Role of the Extracellular Matrix in Developing Vessels and Tumor Angiogenesis. Pathways 2010:2-5.

16. Kalluri R, Zeisberg M. Fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer 2006;6:392-401. doi:10.1038/nrc1877.

17. Egeblad M, Rasch MG, Weaver VM. Dynamic interplay between the collagen scaffold and tumor evolution. Curr Opin Cell Biol 2010;22:697-706. doi:10.1016/j.ceb.2010.08.015.

18. Barascuk, N. et al. A novel assay for extracellular matrix remodeling associated with liver fibrosis: An enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) for a MMP-9 proteolytically revealed neo-epitope of type III collagen. Clin. Biochem. 43, 899-904 (2010).

19. Gefter, M. L., Margulies, D. H. & Scharff, M. D. A simple method for polyethylene glycol-promoted hybridization of mouse myeloma cells. Somatic Cell Genet. 3, 231-6 (1977).

20. Kapoor R, Bornstein P, Sage EH. Type VIII collagen from bovine Descemet's membrane: structural characterization of a triple-helical domain. Biochemistry 1986;25:3930-7.

21. Kapoor R, Sakai LY, Funk S, Roux E, Bornstein P, Sage EH. Type VIII collagen has a restricted distribution in specialized extracellular matrices. J Cell Biol 1988;107:721-30. doi:10.1083/jcb.107.2.721.

22. Sawada H, Konomi H, Hirosawa K. Characterization of the collagen in the hexagonal lattice of Descemet's

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de inmunoensayo para detectar o cuantificar en una muestra de biofluido un epítopo C-terminal de la cadena a1 de colágeno tipo VIII comprendido en la secuencia de aminoácidos C-terminal SFSGYLLYPM-COOH, en donde dicho método comprende poner en contacto dicha muestra que comprende dicho epítopo C-terminal con un anticuerpo específicamente reactivo con un epítopo comprendido en la secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal SFSGYLLYPM-COOH, y determinar la cantidad de unión de dicho anticuerpo, en donde dicho biofluido es suero o plasma.

2. Un método como se reivindica en la reivindicación 1, en donde dicho inmunoensayo es un ensayo de competición o un ensayo tipo sándwich.

3. Un método como se reivindica en la reivindicación 2, en donde dicho inmunoensayo es un radioinmunoensayo o un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas.

4. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además correlacionar la cantidad de dicho epítopo C-terminal de la cadena a1 de colágeno tipo VIII determinada por dicho método con los valores de control no enfermos de dicho epítopo C-terminal de la cadena a1 de colágeno tipo VIII para evaluar un cambio da la misa a partir de los niveles no enfermos.

5. Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.