CN117561445A - Ⅰ型胶原c末端肽的免疫学分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的技术问题在于提供即使不需要特殊的设施也能够分析ICTP的、使用单克隆抗体的免疫学分析方法及包含单克隆抗体的试剂盒。通过免疫学分析方法,能够解决所述技术问题,所述免疫学分析方法是生物体样品中的Ⅰ型胶原C末端肽的免疫学分析方法,其包含:使所述Ⅰ型胶原C末端肽与以GFDFSFLP(SEQ ID NO.1)所示的氨基酸序列作为表位进行识别的单克隆抗体接触。
Description
技术领域
本发明涉及Ⅰ型胶原C末端肽(type-I collagen c-terminal telopeptide)的免疫学分析方法。此外,本发明涉及用于分析Ⅰ型胶原C末端肽的分析试剂盒。本发明还涉及识别Ⅰ型胶原C末端肽中的特定表位的单克隆抗体。
背景技术
Ⅰ型胶原C末端肽(以下有时称为ICTP)是在作为骨基质的主成分的I型胶原的分解过程中产生的肽。ICTP是I型胶原被MMP(基质金属蛋白酶,matri x metalloproteinase)切断而产生的。
ICTP是骨吸收标记之一。血中的ICTP浓度在恶性肿瘤、特别是乳腺癌、***癌或肺癌的骨转移病例中,与未见骨转移的病例相比,显示出显著的高值。认为这是因为,由于在恶性肿瘤发生骨转移的环境下高表达的MMP,通过由破骨细胞引起的胶原蛋白分子的分解,ICTP产生进展。因此,认为血中的ICTP浓度作为恶性肿瘤的骨转移的诊断辅助或治疗效果的指标有用。
作为ICTP的测定试剂,利用了吡啶酚(Pyridinoline)ICTP(FUJIREBIO株式会社)。然而,该测定试剂采用使用了多克隆抗体的放射免疫分析。因此,为了使用该测定试剂,需要用于处理放射性同位素的特殊设施。因此,期望开发即使不需要特殊的设施也能够分析ICTP的方法和试剂。
专利文献1中记载了使用ICTP中的序列作为抗原来制备抗ICTP多克隆抗体。并且,记载了使用该抗ICTP多克隆抗体分析ICTP。然而,未公开能够测定ICTP的单克隆抗体及使用单克隆抗体的分析方法。单克隆抗体通常比多克隆抗体更特异,对与被检测物质的结构类似的物质的交叉反应性低。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特表H8-509294号公报
发明内容
发明所要解决的技术问题
本发明的技术问题在于提供即使不需要特殊的设施也能够分析ICTP的、使用单克隆抗体的方法以及包含单克隆抗体的试剂盒。
解决技术问题的技术手段
本发明人等为了解决所述技术问题进行了深入研究。并且发现,通过使用以GFDFSFLP(SEQ ID NO.1)所示的氨基酸序列作为表位进行识别的单克隆抗体,能够解决所述技术问题,从而完成了本发明。
具体地,本发明如下:
<1>一种免疫学分析方法,其是生物体样品中的Ⅰ型胶原C末端肽的免疫学分析方法,其中,所述免疫学分析方法包含:使所述Ⅰ型胶原C末端肽与以GFDFSFLP(SEQ ID NO.1)所示的氨基酸序列作为表位进行识别的单克隆抗体接触。
<2>根据<1>所述的免疫学分析方法,其中,所述单克隆抗体不以FDFSF LP(SEQ IDNO.2)所示的氨基酸序列作为表位进行识别。
<3>根据<1>或<2>所述的免疫学分析方法,其中,在所述单克隆抗体上直接或间接地结合有标记物质。
<4>根据<3>所述的免疫学分析方法,其中,所述标记物质为金属络合物、酶、不溶性粒子或金属胶体。
<5>根据<3>或<4>所述的免疫学分析方法,其还包含:对来自所述标记物质的信号进行测定的步骤。
<6>根据<1>~<5>中任一项所述的免疫学分析方法,其中,所述生物体样品为血液、血浆或血清。
<7>根据<1>~<6>中任一项所述的免疫学分析方法,其中,所述生物体样品是患有乳腺癌、***癌或肺癌,并且癌发生了骨转移的对象的生物体样品。
<8>根据<1>~<7>中任一项所述的免疫学分析方法,其为电化学发光免疫测定法、胶乳免疫比浊法、免疫层析法或ELISA。
<9>根据<1>~<8>中任一项所述的免疫学分析方法,其中,所述生物体样品以0.1ng/mL~1μg/mL的浓度包含Ⅰ型胶原C末端肽。
<10>根据<5>~<9>中任一项所述的免疫学分析方法,其还包含:将所述信号与阈值进行比较的步骤。
<11>一种分析试剂盒,其为生物体样品中的Ⅰ型胶原C末端肽的分析试剂盒,其中,所述分析试剂盒包含:以GFDFSFLP(SEQ ID NO.1)所示的氨基酸序列作为表位进行识别的单克隆抗体。
<12>根据<11>所述的分析试剂盒,其中,所述单克隆抗体不以FDFSFLP(SEQ IDNO.2)所示的氨基酸序列作为表位进行识别。
<13>根据<11>或<12>所述的分析试剂盒,其中,所述生物体样品为血液、血浆或血清。
<14>根据<11>~<13>中任一项所述的分析试剂盒,其中,所述生物体样品是患有乳腺癌、***癌或肺癌,并且发生了骨转移的患者的生物体样品。
<15>根据<11>~<14>中任一项所述的分析试剂盒,其用于电化学发光免疫测定法、胶乳免疫比浊法、免疫层析法或ELISA。
<16>根据<11>~<15>中任一项所述的分析试剂盒,其中,所述生物体样品以0.1ng/mL~1μg/mL的浓度包含Ⅰ型胶原C末端肽。
<17>一种单克隆抗体,其以GFDFSFLP(SEQ ID NO.1)所示的氨基酸序列作为表位进行识别。
<18>根据<17>所述的单克隆抗体,其不以FDFSFLP(SEQ ID NO.2)所示的氨基酸序列作为表位进行识别。
发明效果
根据本发明,能够提供即使不需要特殊的设施也能够分析ICTP的、使用单克隆抗体的免疫学分析方法和包含单克隆抗体的试剂盒。
附图说明
[图1]是表示用作免疫原的肽的氨基酸序列的图。
[图2]是表示用于表位分析的多个肽各自的氨基酸序列的示意图。
[图3]是表示取得的各单克隆抗体对合成肽的反应性的图(N末端侧)。
[图4]是表示取得的各单克隆抗体对合成肽的反应性的图(C末端侧)。
[图5]是表示取得的各单克隆抗体的表位序列与用作免疫原的肽的氨基酸序列的关系的示意图。
[图6]是表示基于竞争ELISA的、S25206抗体与生物体样品(癌症骨转移患者血清)的反应性的试验结果的图表。
[图7]是表示基于竞争ELISA的、S25207抗体与生物体样品(癌症骨转移患者血清)的反应性的试验结果的图表。
[图8]是表示使用S25207抗体的免疫学分析方法与作为原研药的吡啶酚ICTP试剂的相关性的评价结果的图。
具体实施方式
1.生物体样品中的Ⅰ型胶原C末端肽的免疫学分析方法
(生物体样品)
作为本发明中的“生物体样品”,”主要可举出来自生物体(生物)的固体组织和体液,优选使用体液。本发明中的生物体样品更优选为血液、血清、血浆、尿、唾液、痰、泪液、耳漏或***液,进一步优选为血液、血清或血浆。血液、血清或血浆可以是患有乳腺癌、***癌或肺癌的对象的血液、血清或血浆。血液、血清或血浆可以是患有乳腺癌、***癌或肺癌,并且癌发生了骨转移的对象的血液、血清或血浆。
在本说明书中,“骨转移”是指在骨以外产生的癌转移至骨。
采集生物体样品的对象包含人或动物(例如猴、狗、猫、小鼠、豚鼠、大鼠和仓鼠),优选为人。生物体样品可以是来自对象的生物体样品本身,也可以是对采集的生物体样品进行通常进行的稀释、浓缩等处理后的生物体样品。需要说明的是,进行来自本发明中使用的对象的生物体样品的采集、制备的人可以是与进行本发明的免疫学分析方法的人相同的人,也可以是不同的人。此外,本发明中使用的生物体样品可以是在实施本发明时采集或制备的生物体样品,也可以是预先采集或制备并保存的生物体样品。
(Ⅰ型胶原C末端肽)
Ⅰ型胶原C末端肽(以下有时称为ICTP)是在作为骨基质的主成分的I型胶原的分解过程中产生的肽。I型胶原由两条α1链(I型)和一条α2链(I型)聚集而形成。α1链或α2链的N末端或C末端的末端肽通过吡啶酚或脱氧吡啶酚交联,形成胶原纤维的结构。如果通过骨吸收而使I型胶原分解,则末端肽部分在交联的状态下作为片段游离于血中。另一方面,含有C末端部分的吡啶酚交联片段被称为Ⅰ型胶原C末端肽。
ICTP是骨吸收标记之一。血中的ICTP浓度在恶性肿瘤、特别是乳腺癌、***癌或肺癌的骨转移病例中,与未见骨转移的病例相比,显示出显著的高值。因此,认为作为恶性肿瘤的骨转移的诊断辅助或治疗效果的指标有用。
(单克隆抗体)
本说明书中,“单克隆抗体”是指由来自单一的抗体产生细胞的克隆得到的抗体或抗体分子。即,在本说明书中,只要能够得到本发明的效果,“单克隆抗体”包含具有该单克隆抗体的功能的片段。例如,作为具有单克隆抗体的功能的片段,可举出包含单克隆抗体通过酶的消化而得到的该单克隆抗体的Fab部分的功能性片段、包含通过基因重组而制备的该单克隆抗体的Fab部分的功能性片段、以及包含利用噬菌体展示法而制备的scFv的功能性片段等。
本说明书中的“单克隆抗体”例如为IgG、IgE、IgM、IgD或IgA等。
(SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列)
本发明的免疫学分析方法中使用的单克隆抗体是以GFDFSFLP(SEQ ID NO.1)所示的氨基酸序列作为表位进行识别的单克隆抗体(以下,有时称为本发明的单克隆抗体)。本发明的单克隆抗体优选为特异性地识别GFDFSFLP(SEQ ID NO.1)所示的氨基酸序列的单克隆抗体。“特异性地识别GFDFSFLP(SEQ ID NO.1)所示的氨基酸序列”是指实质上不与具有GFDFSFLP(SEQ ID NO.1)以外的氨基酸序列的肽片段结合或反应。此时,“具有GFDFSFLP(SEQ ID NO.1)以外的氨基酸序列的肽片段”包含:氨基酸序列的一部分与GFDFSF LP(SEQID NO.1)重复的肽片段(例如FDFSFLP(SEQ ID NO.2))。
本发明的单克隆抗体优选不以FDFSFLP(SEQ ID NO.2)所示的氨基酸序列作为表位进行识别。因此,本发明的单克隆抗体优选实质上不与由FDFSF LP(SEQ ID NO.2)所示的氨基酸序列构成的肽片段结合。
本发明的单克隆抗体更优选均不以FDFSFLP(SEQ ID NO.2)和SAGFDF SFL(SEQ IDNO.3)所示的氨基酸序列作为表位进行识别。因此,本发明的单克隆抗体更优选实质上均不与由FDFSFLP(SEQ ID NO.2)或SAGFDFSFL(SE Q ID NO.3)所示的氨基酸序列构成的肽片段结合。
本发明的单克隆抗体可以是S25207抗体或S25210抗体。本发明的单克隆抗体可以是S25207抗体。
本发明人等发现,通过使用本发明的单克隆抗体,可以测定血中的ICTP的浓度。
此外,本发明人等发现,该单克隆抗体均不以GFDFSFLP(SEQ ID NO.1)的N末端侧的最初的氨基酸即“G”除外的、FDFSFLP(SEQ ID NO.2)所示的氨基酸序列、以及不具有末端的氨基酸即“P”而在N末端侧添加了“SAG”的SAGFDFSFL(SEQ ID NO.3)作为表位进行识别。
此外,本发明人等发现,在使用以氨基酸序列与GFDFSFLP(SEQ ID NO.1)重复的SAGFDFS(SEQ ID NO.4)所示的氨基酸序列作为表位进行识别的单克隆抗体的情况下,无法测定血中的ICTP浓度。
令人惊讶的是,识别的氨基酸序列稍微偏离会显著影响单克隆抗体对血中ICTP的浓度的测定能力。不受理论限制,SEQ ID NO:1附近的氨基酸序列的立体结构和特征序列可能影响单克隆抗体的识别。
本说明书中,单克隆抗体与特定的物质或氨基酸序列“反应”、“识别”、及“结合”以相同含义使用。单克隆抗体是否与抗原(化合物)“反应”的确认可以通过抗原固相化ELISA、竞争ELISA或夹心ELISA等进行。此外,可通过利用了表面等离子体共振(surface plasmonresonance)的原理的方法(SPR法)等来进行。SPR法可以使用以Biacore(注册商标)的名称市售的装置、传感器、试剂类来进行。
例如,进行与后述的实施例的表位分析中的竞争ELISA同样的操作时,与未添加肽的对照相比,将信号为70%以下(优选60%以下、更优选50%以下)的情况评价为单克隆抗体将添加的肽的氨基酸序列作为表位进行识别。
(单克隆抗体的制备方法)
本发明的单克隆抗体可以通过将作为抗原(免疫原)的包含SEQ ID NO.1的ICTP的肽片段、优选由SAGFDFSFLFLPQPPQEKAHDGGRC(SEQ ID NO.5)所示的序列构成的肽片段溶解于磷酸缓冲生理盐水等溶剂中,将该溶液施用于非人动物进行免疫来制备。通过在动物内代谢,结果可以施用由SEQ ID NO.5所示的序列构成的肽片段。根据需要在上述溶液中添加适当的佐剂后,可以使用乳液(emulsion)进行免疫。作为佐剂,除了油包水型乳剂、水包油包水型乳剂、水包油型乳剂、脂质体、氢氧化铝凝胶等通用的佐剂以外,还可以使用来自生物体成分的蛋白质或肽性物质等。例如,可以适宜使用弗氏不完全佐剂或弗氏完全佐剂等。佐剂的施用途径、施用量、施用时期没有特别限定,优选以能够增强免疫抗原的动物所期望的免疫应答的方式适当选择。
用于免疫的动物的种类也没有特别限定,可以优选使用哺乳动物,例如小鼠、大鼠、牛、兔、山羊、绵羊、羊驼、小鼠或大鼠,更优选使用小鼠或大鼠。动物的免疫按照一般的方法进行即可,例如可以通过将抗原的溶液、优选与佐剂的混合物注射到动物的皮下、皮内、静脉或腹腔内来进行。免疫应答通常根据被免疫的动物的种类和***而不同,因此免疫时间表优选根据所使用的动物适当设定。抗原施用优选在最初的免疫后反复进行几次。
为了得到本发明的单克隆抗体,可以继续进行以下操作,但不限于此。单克隆抗体本身的制备方法是本领域公知的,并且是通用的,因此本领域技术人员可以使用所述抗原来制备本发明的单克隆抗体(参见例如Antibodies,ALaboratory Manual(Cold SpringHarbor Laboratory Press,(1988)第6章等)。
最终免疫后,从免疫的动物摘出作为抗体产生细胞的脾脏细胞或***细胞,与具有高增殖能力的骨髓瘤来源的细胞株进行细胞融合,由此可以制备杂交瘤。细胞融合优选使用抗体产生能力(质·量)高的细胞,此外,更优选骨髓瘤来源的细胞株与融合的抗体产生细胞所来源的动物具有适合性。细胞融合可以按照该领域中公知的方法进行。例如,可以采用聚乙二醇法、使用仙台病毒的方法或利用电流的方法等。得到的杂交瘤可以按照本领域通用的条件进行增殖。可以确认所产生的抗体的性质并且选择所期望的杂交瘤。杂交瘤的克隆可以通过例如极限稀释法、软琼脂法等公知的方法进行。
克隆步骤后,可以使用ELISA、RIA法或荧光抗体法等方法测定所产生的单克隆抗体与由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列构成的肽片段的结合能力。也可以用同样的方法对不与由SEQ ID NO.2或3所示的氨基酸序列构成的肽片段结合进行评价。通过这些操作,可以确认所选择的杂交瘤是否产生具有所期望性质的单克隆抗体。
通过大量培养如上所述筛选得到的杂交瘤,可以制造具有所需特性的单克隆抗体。大量培养的方法没有特别限定,例如可举出:将杂交瘤在适当的培养基中培养而使单克隆抗体在培养基中产生的方法;以及向哺乳动物的腹腔内注射杂交瘤而使其增殖、在腹水中产生单克隆抗体的方法等。
作为本发明的单克隆抗体,除了抗体分子整体以外,还可以使用具有抗原抗体反应活性的单克隆抗体的片段。除了经过如上所述对动物的免疫步骤而得到的抗体以外,还可以使用利用基因重组技术得到的单克隆抗体,例如嵌合抗体、人源化抗体等。作为单克隆抗体的片段,优选功能性的片段,例如可举出F(ab′)2、Fab′、scFv等。这些片段可以通过将如上所述得到的单克隆抗体用蛋白质分解酶(例如胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等)处理、或者克隆该抗体的DNA并使其在使用大肠杆菌、酵母的培养体系中表达来制备。
本发明的免疫学分析方法中,也可以使用以GFDFSFLP(SEQ ID NO.1)所示的氨基酸序列以外的ICTP中的氨基酸序列作为表位进行识别的单克隆抗体(以下,有时称为识别其他氨基酸序列的单克隆抗体)。对于这样的识别其他氨基酸序列的单克隆抗体,本领域技术人员可以通过对所述单克隆抗体的制备方法施加必要的修饰而容易地制备。必要的修饰例如可列举以下。
·用具有ICTP中的GFDFSFLP(SEQ ID NO.1)所示的氨基酸序列以外的氨基酸序列的肽片段进行免疫;以及
·测定与由想要结合的氨基酸序列构成的肽片段的结合能力。
在构建后述的夹心体系的情况下,识别其他氨基酸序列的单克隆抗体考虑夹心体系的测定原理,优选为将不与GFDFSFLP(SEQ ID NO.1)重复的氨基酸序列作为表位进行识别的单克隆抗体。
也可以使用识别其他氨基酸序列的单克隆抗体在免疫学分析方法中构建夹心体系。夹心体系是指通过用识别不同表位的2种抗体夹持被检测物质而得到高特异性和灵敏度的方法。
在夹心体系中,将一种抗体用作固相抗体,并且将另一种抗体用作标记抗体。本说明书中,固相抗体是指在固相上固相化的单克隆抗体。本说明书中,标记抗体是指在测定来自标记物质的信号时,用后述的本领域技术人员公知惯用的标记物质直接或间接地进行了标记的单克隆抗体。
构建夹心体系时,优选两种单克隆抗体中的至少一种为固相抗体,至少一种为标记抗体。
例如,可以通过使单克隆抗体物理吸附或者化学键合(可以介由适当的间隔物)于固相来制造固相抗体。作为固相,可以使用包含聚苯乙烯树脂等高分子基材、玻璃等无机基材、纤维素、琼脂糖等多糖类基材等的固相。固相的形状没有特别限定,可以选择板状(例如微孔板、膜)、珠或粒子状(例如胶乳粒子、磁性粒子)、筒状(例如试管)等任意的形状。
通过使用能够与本发明的免疫学分析方法中使用的单克隆抗体直接结合的标记抗体(二次抗体),也可以测定与ICTP结合的抗体的量。本说明书中,将与本发明的单克隆抗体或识别其他氨基酸序列的单克隆抗体结合且结合有标记物质的抗体称为二次抗体。也可以使用该二次抗体,使标记物质与本发明的免疫学分析方法中使用的单克隆抗体间接结合。
可以测定标记物质发出的信号的强度,测定生物体样品中的ICTP的量。作为用于制造标记抗体的标记物质,例如可举出金属络合物、酶、不溶性粒子、荧光物质、化学发光物质、生物素、抗生物素蛋白、放射性同位素、金胶体粒子或着色胶乳。作为标记物质与单克隆抗体的结合法,可以使用本领域技术人员能够利用的戊二醛法、马来酰亚胺法、吡啶基二硫化物法或高碘酸法。固相抗体和标记抗体的种类以及它们的制造方法不限于上述的例子。例如,在使用辣根·过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(ALP)等酶作为标记物质的情况下,可以使用该酶的特异性基质(酶为HRP的情况下,例如使用O-苯二胺(OPD)或3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB),为ALP的情况下,使用对硝基苯基·磷酸酯等)测定酶活性。使用生物素作为标记物质时,也可以用生物素标记单克隆抗体,使以酶、色素或荧光标记(优选HRP)标记的抗生物素蛋白或链霉亲和素反应。在本发明的免疫学分析方法中,优选使用生物素或HRP作为标记物质。
在本说明书中,有时将使抗原、抗体物理性或化学性地担载于固相或进行了担载的状态表述为“固定化”或“固相化。”此外,术语“分析”、“检测”或“测定”包括ICTP存在的证明和ICTP的定量。
本发明的免疫学分析方法中,也可以仅使用与1种ICTP结合的单克隆抗体、即本发明的单克隆抗体。作为这样的分析方法,可举出包含以下那样的步骤(1)~(4)的竞争ELISA。
(1)将ICTP或包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的肽片段固定于微孔板等固相;
(2)将待分析的生物体样品添加于微孔板;
(3)将经酶标记的本发明的单克隆抗体添加于微孔板;
(4)添加所述酶的基质,测定来自酶反应的信号。
若生物体样品中的ICTP与固定于固相的ICTP之间产生竞争,则信号的强度降低。
本发明的免疫学分析方法中,也可以使用2种单克隆抗体。2种单克隆抗体是本发明的单克隆抗体和识别ICTP中的其他氨基酸序列的单克隆抗体。使用2种单克隆抗体时,将本发明的单克隆抗体称为第一单克隆抗体。将识别ICTP中的其他氨基酸序列的单克隆抗体称为第二单克隆抗体。2种单克隆抗体中,至少1个为固相抗体,并且,至少1个为标记抗体。此时,本发明的免疫学分析方法中,可以包含以下的步骤(1)~(3)。
(1)使生物体样品和第一或第二单克隆抗体接触,形成第一复合体的步骤;
(2)使所述第一复合体和与所述步骤(A)不同的第一或第二单克隆抗体接触,形成第二复合体的步骤;
(3)测定来自标记物质的信号的步骤。
第二复合体中含有标记物质。信号的测定可以根据标记物质采用本领域技术人员公知的测定方法。
在使用所述1种或2种单克隆抗体的情况下,在本发明的免疫学分析方法中,根据需要,可以包含对生物体样品进行预处理的步骤和/或将得到的信号的强度与第一阈值进行比较的步骤。第一阈值可考虑灵敏度以及特异性而适当设定。
第一阈值可以是范围。“第一阈值为范围”是指在所示的范围之间存在具体的阈值,通过判定测定值是大于还是小于该具体的阈值来判断有无疾病。例如,第一阈值为3ng/mL~6ng/mL的范围时,具体阈值为4ng/mL~6ng/mL时,具体阈值可以为4.5ng/mL、5ng/mL、5.5ng/mL等。
此外,也可以如后述的“范围阈值”那样,通过判定是否进入或不进入数值范围、例如4ng/mL~6ng/mL,来判断有无疾病。
第一阈值的下限例如可以为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、4.5ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL或100ng/mL。第一阈值的上限可以为100ng/mL以下、50ng/mL以下、25ng/mL、10ng/mL、9ng/mL、8ng/mL、7ng/mL、6ng/mL、5ng/mL、4.5ng/mL、4ng/mL、3ng/mL、2ng/mL、1ng/mL或0.5ng/mL。具体的第一阈值的范围为0.1ng/mL~100ng/mL、0.5ng/mL~50ng/mL、1ng/mL~10ng/mL、3ng/mL~6ng/mL、4ng/mL~5ng/mL。
第一阈值可以是具体的数值。作为具体数值,可以为4ng/mL、4.1ng/mL、4.2ng/mL、4.3ng/mL、4.4ng/mL、4.5ng/mL、4.6ng/mL、4.7ng/mL、4.8ng/mL、4.9/mL、5ng/mL、5.1ng/mL、5.2ng/mL、5.3ng/mL、5.4ng/mL、5.5ng/mL、5.6ng/mL、5.7ng/mL、5.8ng/mL或5.9ng/mL。
在本发明的免疫学分析方法中,可以包含:当信号的强度低于(高于)第一阈值时,判断为乳腺癌、***癌或肺癌发生了骨转移的步骤;或者当信号的强度高于(低于)第一阈值时,判断为乳腺癌、***癌或肺癌没有发生骨转移的步骤。
本发明的免疫学分析方法可以基于信号的测定值来判定特定的药物(例如抗肿瘤剂等)在乳腺癌、***癌或肺癌患者中的治疗效果。此时,本发明的免疫学分析方法除了上述步骤以外,还可以包含以下的步骤。
对对象施用特定的药物(例如抗肿瘤剂等)的步骤、和/或
将信号的强度与第二阈值进行比较的步骤,
在该情况下,第二阈值可以考虑灵敏度和特异性而适当设定,也可以是对对象施用特定的药物(例如,抗肿瘤剂等)之前所述对象中的ICTP的测定值。
在本发明的免疫学分析方法中,可以包含:在信号的强度低于(高于)第二阈值的情况下,判定为特定的药物(例如,抗肿瘤剂等)具有治疗效果的步骤;或者在信号的强度高于(低于)第二阈值的情况下,判定为特定的药物(例如,抗肿瘤剂等)没有治疗效果的步骤。
作为所述的抗肿瘤剂,可举出双磷酸盐、抗RANKL抗体(地诺单抗)、RANKL的拮抗剂(骨保护素)和TGF-β激酶抑制剂(galunisertib)等。
在所述的治疗效果的判定中,也可以每隔数日或数周进行测定,监测治疗效果。
第一阈值和第二阈值可以分别采用“范围阈值”的形式。“范围阈值”不是测定值与具体的一个数值的大小的比较,而是根据测定值是否进入该范围或者是否未进入该范围来判断有无疾病。
(免疫学分析方法)
作为本发明的免疫学分析方法,可举出电化学发光免疫测定法(ECL法)、酶免疫测定法(ELISA)、胶乳免疫比浊法(LTIA法)、化学发光免疫测定法、免疫层析法和荧光抗体法,但不限于这些。本发明的免疫学分析方法优选为电化学发光免疫测定法、ELISA、胶乳免疫比浊法或免疫层析法。
本发明的免疫学分析方法可以是体内或体外免疫学分析方法。此外,为了增强灵敏度,也可以使用敏化剂。
本发明的免疫学分析方法能够分析在生物体样品中以0.1ng/mL~1μg/mL、0.2ng/mL~500ng/mL、0.3ng/mL~200ng/mL、0.5ng/mL~150ng/mL、1ng/mL~120ng/mL或1ng/mL~100ng/mL的浓度包含的ICTP。
在本发明的免疫学分析方法中,将本发明的单克隆抗体和生物体样品或Ⅰ型胶原C末端肽添加到测定体系中的顺序只要能够得到本发明的效果就没有限定。即,可以在添加生物体样品或Ⅰ型胶原C末端肽之前、在添加生物体样品或Ⅰ型胶原C末端肽的同时、或者在添加生物体样品或Ⅰ型胶原C末端肽之后将本发明的单克隆抗体添加到测定体系中。
以下,对采用的每个免疫学分析方法说明测定的步骤和原理。下述仅例示本发明的一实施方式中的测定的步骤及原理,并不对本发明的范围进行任何限定。
需要说明的是,在下述的各个免疫学分析方法中,单克隆抗体向固相固定化的方法、单克隆抗体与标记物质的结合方法、标记物质的种类等具体方法包括前述的方法,可以没有限制地使用本领域技术人员公知的方法。
在以下的例子中,使用第一单克隆抗体作为固相抗体,使用第二单克隆抗体作为标记抗体,但只要能够得到本发明的效果,也可以采用相反的构成。即,可以使用第一单克隆抗体作为标记抗体,使用第二单克隆抗体作为固相抗体。
(电化学发光免疫测定法)
电化学发光免疫测定法是指通过通电使标记物质发光,通过检测其发光量来测定被检测物质的量的方法。电化学发光免疫测定法中,作为标记物质,可以使用钌络合物。在固相(微孔板等)上设置电极,在该电极上产生自由基,由此使钌络合物成为激发状态而发光。然后,可检测该钌络合物的发光量。
使用第一单克隆抗体作为固相抗体、使用第二单克隆抗体作为标记抗体、使用磁性粒子作为固相、并且使用钌络合物作为标记物质时的测定步骤和原理如下所述。
(1)当使固定化有固相抗体的磁性粒子与生物体样品接触时,生物体样品中的ICTP与固相抗体结合。
(2)若在清洗磁性粒子后接触标记抗体,则标记抗体与结合于磁性粒子的ICTP结合。
(3)清洗磁性粒子后,若通电,则根据与ICTP结合的标记抗体的量而发光。通过测定该发光量,能够准确地测定生物体样品中的被检测物质的量。
(ELISA)
在免疫学分析方法中,使用酶标记的ELISA也能够简便且迅速地测定靶标,因此优选。在本说明书中,ELISA是指利用针对所述被检测物质的抗体或抗原捕捉样品中所含的作为被检测物质的抗原或抗体后,利用酶反应进行检测的方法。夹心ELISA时,可以使用第一单克隆抗体作为固相抗体,也可以使用第二单克隆抗体作为固相抗体。固相优选板(免疫板)。作为标记,可以使用HRP或ALP。作为本发明的免疫学分析方法,使用夹心ELISA时的测定步骤和原理如下。
(1)在固定化有固相抗体的固相添加生物体样品使其反应时,生物体样品中的ICTP与固相抗体结合,在固相上形成固相抗体-ICTP复合体。
(2)将识别标记的其他表位的标记抗体添加到固相上使其反应时,标记抗体与上述捕获的ICTP结合,与上述固相抗体-ICTP复合体形成夹心。
(3)清洗后,与酶的基质反应、使其显色,测定吸光度。
可以根据测定的标记物质的量测定生物体样品中的ICTP的量。
夹心ELISA法中,也可以使用二次抗体。通过使用二次抗体,反应被扩增,能够提高检测灵敏度。在使用二次抗体的情况下,可以采用以下的步骤(1)~(4)。
(1)作为一次抗体的第一单克隆抗体、
(2)固定化有第二单克隆抗体的固相、
(3)用酶(HRP或ALP等)进行了标记的针对第一单克隆抗体的抗体(二次抗体)、
(4)酶的基质(OPD、TMB或对硝基苯基·磷酸酯等)。
首先,在固定化有第二单克隆抗体的固相添加适当处理并稀释的生物体样品后进行孵育,除去生物体样品并进行清洗。接着,添加一次抗体进行孵育和清洗,进一步添加酶标记的二次抗体进行孵育。然后,添加基质使其显色。然后,通过使用酶标仪等测定显色,能够测定ICTP的量。
也可以采用作为竞争法的竞争ELISA。竞争法是指通过使生物体样品中的被检测物质与固定化于固相的竞争物质竞争来分析生物体样品中的被检测物质的方法。具体而言,可采用以下的步骤(1)~(4)。
(1)将ICTP或包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的肽片段固定于微孔板等固相;
(2)将待分析的生物体样品添加于微孔板;
(3)将经酶标记的本发明的单克隆抗体添加于微孔板;
(4)添加所述酶的基质,测定来自酶反应的信号。
也可以使用生物素。可以使用HRP等标记的链霉亲和素与该生物素结合。然后,可以测定通过添加OPD作为基质而产生的显色信号。
(胶乳免疫比浊法)
胶乳免疫比浊法是利用了结合于胶乳表面的抗体和被检测物质(抗原)的凝集的免疫学分析方法。作为胶乳粒子,只要是体外诊断药通常使用的胶乳粒子就没有特别限制。凝集反应测定时的胶乳粒子的浓度、胶乳粒子的平均粒径等可以根据灵敏度或性能适当设定。作为本发明的免疫学分析方法,使用胶乳免疫比浊法时的测定步骤和原理如下所述。
(1)使第一单克隆抗体和第二单克隆抗体与胶乳粒子结合而与生物体样品接触。
(2)生物体样品中的ICTP与第一单克隆抗体和第二单克隆抗体结合,抗体结合胶乳粒子凝集。
(3)对生物体样品照射近红外光,进行吸光度的测定或散射光的测定。基于测定值,可求出抗原的浓度。
作为本发明的免疫学分析方法,使用胶乳免疫比浊法时,胶乳为固相,且作为标记物质发挥作用。即,第一单克隆抗体和第二单克隆抗体均与固相和标记物质各自结合。
(免疫层析法)
免疫层析法是利用结合于被检测物质的标记抗体或标记抗体在膜上流动的性质的免疫学分析方法。测定一般的免疫层析法中的被检测物质的原理如下。
将针对作为被检测物质的抗原的抗体固定化在作为层析介质的不溶性膜载体上,制作作为固定相的检测部。然后,将作为偶联物(检测试剂)的通过能够与上述被检测物质结合的抗体而致敏的标记物质用作流动相。使被检测物质与作为流动相的偶联物特异性反应,进而在作为固定相的检测部中,使与偶联物结合的被检测物质与固定化于检测部的抗体特异性反应。
作为本发明的免疫学分析方法,采用免疫层析法时的测定步骤和原理如下所述。
(1)使用于供给生物体样品的样品供给部与生物体样品接触。
(2)生物体样品中的ICTP与偶联物接触,形成第一复合体。偶联物是在标记物质上结合有第一或第二单克隆抗体的偶联物。
(3)所述第一复合体与固定于检测部的第二或第一单克隆抗体接触,形成第二复合体。
(4)通过测定来自偶联物中所含的标记物质的信号的强度,确认所述第二复合体的形成。
作为标记物质,可举出金胶体粒子、铂胶体粒子、彩色胶乳粒子和磁性粒子等。对于这些标记物质的种类和粒径,本领域技术人员可以根据所期望的灵敏度适当调整。
2.生物体样品中的ICTP的分析试剂盒
本发明的生物体样品中的ICTP的分析试剂盒(以下,有时简称为本发明的分析试剂盒)包含本发明的单克隆抗体。
本发明的ICTP的分析试剂盒可以是仅包含本发明的单克隆抗体的用于竞争法、优选竞争ELISA的分析试剂盒。
本发明的分析试剂盒中,也可以使用2种单克隆抗体。2种单克隆抗体是是指本发明的单克隆抗体和识别其他氨基酸序列的单克隆抗体。一者可以是标记抗体,另一者可以是固相抗体。这种情况下,2种单克隆抗体可以放入各自的容器中。
作为本发明的分析试剂盒,可举出用于实施电化学发光免疫测定法、ELISA、胶乳免疫比浊法、化学发光免疫测定法、免疫层析法及荧光抗体法的分析试剂盒,但并不限定于这些。本发明的分析试剂盒优选为用于实施电化学发光免疫测定法、ELISA、胶乳免疫比浊法或免疫层析法的分析试剂盒。
本发明的分析试剂盒可以是用于分析体内或体外的样品的分析试剂盒。
本发明的分析试剂盒中,除此以外,还可以包含标准抗原物质、精度管理用抗原样品等其他检查试剂、检体稀释液和/或使用说明书等。本领域技术人员能够适当调整包含抗体的试剂等的浓度。
以下,按所采用的免疫学分析方法说明试剂盒中所含的试剂。在以下的例子中,使用第一单克隆抗体作为固相抗体,使用第二单克隆抗体作为标记抗体,但只要能够得到本发明的效果,也可以采用相反的构成。
使用电化学发光免疫测定法时,本发明的分析试剂盒可以包含以下(A)和(B)。
(A)标记试剂,其包含第二单克隆抗体与电化学发光物质(例如,钌络合物等)的偶联物;
(B)第一单克隆抗体,其与ICTP结合。
例如,在使用磁性粒子作为固相的试剂盒中,向固定化有与ICTP结合的第一单克隆抗体的磁性粒子添加生物体样品使其反应后,除去生物体样品并进行清洗。接着,添加偶联物使其反应。清洗磁性粒子后,施加电能使其发光。接着,通过测定标记物质的发光量,能够分析ICTP。
使用夹心ELISA时,本发明的分析试剂盒可以包含以下(A)和(B)。
(A)标记试剂,其包含第二单克隆抗体与酶(HRP或ALP等)的结合体;
(B)固定化有第一单克隆抗体的固相。
在这样的试剂盒中,首先,在固定化有第一单克隆抗体的固相添加生物体样品后进行孵育,除去生物体样品并进行清洗。接着,添加标记试剂后进行孵育,加入基质使其显色。通过使用酶标仪等测定显色,能够分析ICTP。
在夹心ELISA中,也可以使用二次抗体。通过使用二次抗体,反应被扩增,能够提高检测灵敏度。使用二次抗体时,本发明的分析试剂盒可以包含以下(A)~(D)。
(A)作为一次抗体的第二单克隆抗体
(B)固定化有第一单克隆抗体的固相
(C)用酶(HRP或ALP等)进行了的标记的针对第二单克隆抗体的抗体(二次抗体)
(D)酶的基质(OPD、TMB或对硝基苯基·磷酸酯等)
在这样的试剂盒中,首先,在固定化有第一单克隆抗体的固相上添加适当处理并稀释的生物体样品后进行孵育,除去生物体样品并进行清洗。然后加入一次抗体进行孵育和清洗。进一步添加酶标记的二次抗体进行孵育。然后,加入基质使其显色。通过使用酶标仪等测定显色,能够分析ICTP。
固相和第一单克隆抗体在分析试剂盒中可以分别包含。此时,进行分析的人将第一单克隆抗体固定化于固相。
在竞争ELISA的情况下,本发明的分析试剂盒可以包含以下(A)和(B)。
(A)固定化有ICTP或包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的肽片段的固相
(B)经酶标记的本发明的单克隆抗体
固相和ICTP或包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的肽片段可以在分析试剂盒中分别包含。此时,进行分析的人将ICTP或包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的肽片段固定化于固相。
也可以使用生物素。生物素可以与用HRP等进行了标记的链霉亲和素结合。作为基质,还可以包含OPD。
在使用胶乳免疫比浊法的情况下,本发明的分析试剂盒可以包含结合有第一单克隆抗体的胶乳粒子和结合有第二单克隆抗体的胶乳粒子。作为本发明的分析试剂盒,使用胶乳免疫比浊法用的试剂盒时,胶乳为固相,且为标记物质。因此,第一单克隆抗体和第二单克隆抗体均与固相和标记物质各自结合。
在使用免疫层析法的情况下,本发明的分析试剂盒可以是将免疫层析法用测试条收纳、搭载于适当的容器(壳体)的形态。免疫层析法用测试条可以由具有样品供给部的样品垫、作为层析介质的不溶性膜载体和配置于所述不溶性膜载体的下游侧端部的吸收垫构成。可以在不溶性膜载体上配置固定化有第一单克隆抗体的检测部,在样品垫与不溶性膜载体之间配置配置有偶联物的偶联物垫。可以在样品垫或不溶性膜载体上包含偶联物。此外,作为免疫层析法的构成,可以适当采用例如国际公开第2018/012517或国际公开第2016/031892中记载的构成。
作为标记物质,可举出金胶体粒子、铂胶体粒子、彩色胶乳粒子和磁性粒子等。这些标记物质的种类和粒径只要是本领域技术人员就可以适当调整。
以上,分为发明的观点(aspect)进行了说明,但各个观点所记载的事项、语句的定义以及实施方式也能够应用于其他方式。
接着列举实施例对本发明进行具体说明,但这些并不限定本发明的范围。此外,只要没有特别说明,%是指质量%。
实施例
《实施例1单克隆抗体的制备》
1-1使用的试剂等
·免疫原和抗原
·合成肽(IC01:SAGFDFSFLPQPPQEKAHDGGRC(SEQ ID NO.5)):蛋白精制工业
·合成肽(IC08:SAGFDFSFLPQPPQC(SEQ ID NO.6)):蛋白精制工业
·合成肽(IC09:CSAGFDFSFLPQPPQ(SEQ ID NO.7)):蛋白精制工业
·SM(PEG)2,100mg:Thermo,22102
·牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum):Sigma,A7906-10G
·重组人转铁蛋白(Transferrin,Human,recombinant):Wako,201-1808
·Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette(MWCO:10k):Thermo,66380
·SDS-PAGE
蛋白质转录试剂盒:COSMO BIO(株式会社),423536
·Sample Treatment for Tris SDS:COSMO BIO,423420
·Protein Multi Color Stable:Bio Dynamics Laboratory,DM660
·Multi Gel II mini 4/20(13W):COSMO BIO,414879
·TaKaRa CBB Protein Safe Stain(G250):TAKARABIO,T9320A
·封闭液、清洗液、基质溶解液、其它试剂类:依据现有处方
·各种ELISA
·96孔ELISA用微孔板:NUNC 442404
·山羊抗小鼠IgG(H+L)PAb-HRP:SouthernBiotech,1031-05,Lot F0415-NB76H
·山羊抗大鼠IgG(H+L)PAb-HRP:SouthernBiotech,3050-05,Lot G8212-PK14L
·抗人CTXI小鼠MAb:Cloud Clone,MAA665Hu21
·清洗液、封闭试剂、OPD显色液、停止液等:依据现有处方
·检体
·使用用吡啶酚ICTP(FUJIREBIO(Orion Diagnostica))赋值的癌症骨转移患者血清。
·ICTP测定试剂
·吡啶酚ICTP:FUJIREBIO(Orion Diagnostica)
1-2免疫原的制备
将使用的免疫原肽的氨基酸序列示于图1。合成肽与载体蛋白质的交联使用SM(PEG)2linker。以PBS为溶剂配制10mg/mL载体蛋白(BSA,HTF)溶液。添加60当量以上的SM(PEG)2linker,在室温下用旋转器搅拌30分钟。反应后,将溶液相对于500mL/样品(sample)的PBS透析2次(4℃,1st 4h,2nd过夜(overnight))。载体-linker的60当量肽溶于100μLPBS。在载体-linker溶液100μL中添加等量的肽溶液。在室温下用旋转器搅拌30分钟。反应后,将溶液相对于500mL/样品的PBS透析2次(4℃,1st 4h,2nd过夜(overnight))。
1-3抗体制备
将肽偶联物IC01-(PEG)2-HTF作为免疫原。对于这些免疫原,初次免疫与弗氏完全佐剂(Difco Laboratories)、第二次免疫以后与弗氏不完全佐剂(Dif co Laboratories)以1:1混合使用。相对于Balb/c,初次免疫使用50μg、第二次免疫以后使用20μg、最终免疫使用50μg(用PBS稀释)的免疫原量,每隔一周继续皮下免疫。实施3次免疫后通过抗原固相化ELISA评价血中抗体效价。对于能够确认充分的效价上升的个体,在解剖的1~3天前以用PBS稀释的免疫原进行腹腔免疫。之后,回收脾脏细胞、肠骨***细胞及鼠颈部***细胞,通过电融合法与骨髓瘤细胞SP2/0融合。融合细胞在96孔板中培养。从融合开始7或8天后回收培养上清液后,实施以下所示的利用抗原固相化ELISA的筛选。选择与IC01-(PEG)2-BSA显示反应性、且与Cys-(PEG)2-BSA不显示反应性的株。此外,在筛选前一天进行培养基更换。
1-4初次筛选(抗原固相化ELISA)
(1)在ELISA用96孔板中分注IC01-(PEG)2-BSA和Cys-(PEG)2-BSA(1μg/mL inPBS)(50μL/孔),在室温下静置2小时。
(2)3次清洗后(400μL/孔),分注(100μL/孔)封闭液,在室温下静置1小时或在4℃下静置整夜。
(3)去除封闭液后,分注(50μL/孔)细胞培养上清液(2倍稀释)、抗血清(1000及10000倍稀释),在室温下静置1小时。
(4)3次清洗后,分注(50μL/孔)山羊抗小鼠IgG(H+L)PAb-HRP(9500倍稀释),在室温下静置1小时。
(5)3次清洗后,分注(50μL/孔)OPD显色液,在室温下静置10分钟。
(6)分注(50μL/孔)停止液,反应停止后,用酶标仪测定(Abs.492nm)。
(7)其结果,选拔S25206抗体、S25207抗体、S25209抗体和S25210抗体。
1-5表位分析
通过使用图2所示的肽的竞争ELISA,进行获得抗体的表位分析。
(1)在ELISA用96孔板中分注IC01-(PEG)2-BSA(10ng/mL in PBS)(50μL/孔),在室温下静置2小时。
(2)3次清洗后(400μL/孔),分注(100μL/孔)封闭液,在室温下静置1小时或在4℃下静置整夜。
(3)除去封闭液后,分注(25μL/孔)使用PBS稀释后的各种肽(S25207抗体时:1000ng/mL,S25210抗体:200ng/mL,S25206抗体:2ng/mL,S25209抗体:313ng/mL),进一步从其上分注(25μL/孔)纯化后的本公司抗体(S25207抗体:50ng/mL,S25210抗体:10ng/mL,S25206抗体:9ng/mL,S25209抗体:14ng/mL),在室温下静置1小时。
(4)3次清洗后,分注(50μL/孔)山羊抗小鼠IgG(H+L)PAb-HRP(9500倍稀释),在室温下静置1小时。
(5)3次清洗后,分注(50μL/孔)OPD显色液,在室温下静置10分钟。
(6)分注(50μL/孔)停止液,反应停止后,用酶标仪测定(Abs.492nm)。
1-6表位分析的结果
使用各种肽调查获得抗体作为表位进行识别的氨基酸序列的N末端侧的结果示于图3。关于S25206抗体和S25209抗体,肽IC13显示反应性,另一方面,肽IC34、IC33和IC36显示反应性低。因此,认为这些抗体的表位的N末端侧为S。
关于S25207抗体和S25210抗体,肽IC13、IC34和IC35显示反应性,另一方面,肽IC36显示反应性低。因此,认为这些抗体的表位的N末端侧为G。
同样地,将调查获得抗体作为表位进行识别的氨基酸序列的C末端侧的结果示于图4。关于S25206抗体和S25209抗体,肽IC31、IC14、IC32和IC13显示反应性,另一方面,肽IC15显示反应性低。因此,认为这些抗体的表位的C末端侧为S。
关于S25207抗体和S25210抗体,肽IC13显示反应性,另一方面,肽IC15、IC31、IC14和IC32显示反应性低。因此,认为这些抗体的表位的C末端侧为P。
根据以上,认为S25206抗体和S25209抗体的表位为SAGFDFS(SEQ ID NO.4)、S25207抗体和S25210抗体的表位为GFDFSFLP(SEQ ID NO.1)(图5)。
《实施例2利用竞争ELISA的与检体的反应性评价》
实施例1得到的识别不同表位的两种单克隆抗体中,S25206抗体和S25207抗体用于实验。
2-1竞争ELISA的操作
(1)IC01-(PEG)2-BSA(100ng/mL in PBS)分注(50μL/孔)到板中,在室温下静置2小时。
(2)3次清洗后(400μL/孔),分注(100μL/孔)封闭液,在室温下静置1小时。
(3)除去封闭液后,分注(25μL/孔)癌症骨转移患者血清(5、10倍稀释,bl ank),进一步从其上分注(25μL/孔)纯化后的本公司抗体(10ng/mL in 1%BSA/PBST),在室温下静置1小时。
(4)3次清洗后,分注(50μL/孔)山羊抗小鼠IgG(H+L)PAb-HRP(9500倍稀释),在室温下静置1小时。
(5)3次清洗后,分注(50μL/孔)OPD显色液,在室温下静置10分钟。
(6)分注(50μL/孔)停止液,反应停止后,用酶标仪测定(Abs.492nm)。
2-2竞争ELISA的结果
对于S25206抗体和S25207抗体,使用ICTP测定值为低值的检体(2.2ng/mL)和高值的检体(76.8ng/mL),通过竞争ELISA评价是否与检体中的ICTP浓度依赖性地反应。S25206抗体结果见图6。S25207抗体结果见图7。
其结果,在S25207抗体中,确认了在高值检体和低值检体中具有浓度依赖性的反应性。在S25206抗体中,在高值检体和低值检体中不能确认浓度依赖性的反应性。因此表明,S25207抗体与癌症骨转移患者血清中的ICTP结合。
《实施例3使用了有前景的抗体S25207抗体的基于竞争ELISA的相关性评价》
关于S25207抗体,通过竞争ELISA测定21个检体,调查与原研药的相关性。
3-1竞争ELISA的操作
(1)IC01-(PEG)2-BSA(100ng/mL in PBS)分注(50μL/孔)到板中,在室温下静置2小时。
(2)3次清洗后(400μL/孔),分注(100μL/孔)封闭液,在室温下静置1小时。
(3)去除封闭液后,分注(25μL/孔)原研药标准品(4倍稀释,blank)和癌症骨转移患者血清(4倍稀释,blank)。进一步从其上分注(25μL/孔)8ng/mL的生物素化S25207抗体,在室温下静置1小时(作为非特异性抑制剂,使用0.1mg/mL小鼠IgG)。
(4)3次清洗后(400μL/孔),分注(50μL/孔)0.2μg/mL的HRP-链霉亲和素,在室温下静置30分钟。
(5)3次清洗后(400μL/孔),分注(50μL/孔)OPD显色液,在室温下静置10分钟。
(6)分注(50μL/孔)停止液,反应停止后,用酶标仪测定Abs.492nm。
3-2竞争ELISA的结果
由原研药标准品的测定值制作标准曲线,基于得到的回归方程算出检体的ICTP本公司测定值。其结果,得到与原研药吡啶酚ICTP试剂的良好的相关性(相关系数r=0.983)(图8)。
工业实用性
根据本发明,能够提供即使不需要特殊的设施也能够分析ICTP的、使用单克隆抗体的免疫学分析方法和包含单克隆抗体的试剂盒。
保藏编号
[对保藏生物材料的提及]
(1)产生抗体编号S25207的杂交瘤S25207
一保藏该生物材料的保藏机构的名称及地址
独立行政法人制品评价技术基础机构
日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8(邮政编码292-0818)
二生物材料保藏于一的保藏机构的日期
2021年3月11日
三二的保藏机构对保藏所赋予的保藏编号
NITE BP-03431。
序列表
<110> 积水医疗株式会社
<120> Ⅰ型胶原C末端肽的免疫学分析方法
<130> 21P00345
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Gly Phe Asp Phe Ser Phe Leu Pro
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Phe Asp Phe Ser Phe Leu Pro
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Ser Ala Gly Phe Asp Phe Ser Phe Leu
1 5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Ser Ala Gly Phe Asp Phe Ser
1 5
<210> 5
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽片段
<400> 5
Ser Ala Gly Phe Asp Phe Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln Pro Pro Gln
1 5 10 15
Glu Lys Ala His Asp Gly Gly Arg Cys
20 25
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽片段
<400> 6
Ser Ala Gly Phe Asp Phe Ser Phe Leu Pro Gln Pro Pro Gln Cys
1 5 10 15
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽片段
<400> 7
Cys Ser Ala Gly Phe Asp Phe Ser Phe Leu Pro Gln Pro Pro Gln
1 5 10 15
<210> 8
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 部分ICTP序列
<400> 8
Ser Ala Gly Phe Asp Phe Ser Phe Leu Pro Gln Pro Pro Gln Glu Lys
1 5 10 15
Ala His Asp Gly Gly Arg Tyr Tyr Arg Ala
20 25
<210> 9
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICTP中的部分序列
<400> 9
Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Ser Ala Gly Phe Asp Phe Ser Phe
1 5 10 15
Leu Pro Gln Pro Pro Gln Glu Lys Ala His Asp Gly Gly Arg Tyr Tyr
20 25 30
Arg Ala
PCT/RO/134表
Claims (15)
1.一种免疫学分析方法,其是生物体样品中的Ⅰ型胶原C末端肽的免疫学分析方法,其中,所述免疫学分析方法包含:
使所述Ⅰ型胶原C末端肽与以GFDFSFLP(SEQ ID NO.1)所示的氨基酸序列作为表位进行识别的单克隆抗体接触。
2.根据权利要求1所述的免疫学分析方法,其中,
所述单克隆抗体不以FDFSFLP(SEQ ID NO.2)所示的氨基酸序列作为表位进行识别。
3.根据权利要求1或2所述的免疫学分析方法,其中,
在所述单克隆抗体上直接或间接地结合有标记物质。
4.根据权利要求3所述的免疫学分析方法,其中,
所述标记物质为金属络合物、酶、不溶性粒子或金属胶体。
5.根据权利要求3或4所述的免疫学分析方法,其还包含:
对来自所述标记物质的信号进行测定的步骤。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的免疫学分析方法,其中,
所述生物体样品为血液、血浆或血清。
7.根据权利要求1~6中任一项所述的免疫学分析方法,其中,
所述生物体样品是患有乳腺癌、***癌或肺癌,并且癌发生了骨转移的对象的生物体样品。
8.根据权利要求1~7中任一项所述的免疫学分析方法,其为电化学发光免疫测定法、胶乳免疫比浊法、免疫层析法或ELISA。
9.一种分析试剂盒,其为生物体样品中的Ⅰ型胶原C末端肽的分析试剂盒,其中,所述分析试剂盒包含:
以GFDFSFLP(SEQ ID NO.1)所示的氨基酸序列作为表位进行识别的单克隆抗体。
10.根据权利要求9所述的分析试剂盒,其中,
所述单克隆抗体不以FDFSFLP(SEQ ID NO.2)所示的氨基酸序列作为表位进行识别。
11.根据权利要求9或10所述的分析试剂盒,其中,
所述生物体样品为血液、血浆或血清。
12.根据权利要求9~11中任一项所述的分析试剂盒,其中,
所述生物体样品是患有乳腺癌、***癌或肺癌,并且发生了骨转移的患者的生物体样品。
13.根据权利要求9~12中任一项所述的分析试剂盒,其用于电化学发光免疫测定法、胶乳免疫比浊法、免疫层析法或ELISA。
14.一种单克隆抗体,其以GFDFSFLP(SEQ ID NO.1)所示的氨基酸序列作为表位进行识别。
15.根据权利要求14所述的单克隆抗体,其不以FDFSFLP(SEQ ID NO.2)所示的氨基酸序列作为表位进行识别。
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