ES2765483T3 - Modulación de las vías de eferocitosis para el tratamiento de una enfermedad aterosclerótica - Google Patents

Abstract

Un agente anti-CD47 para su uso en un método para tratar a un sujeto humano para la aterosclerosis, en donde al sujeto se le ha diagnosticado que tiene por lo menos un alelo de riesgo 9p21 para la aterosclerosis, en donde el alelo de riesgo 9p21 se genotipó por determinación de la presencia de una variante de SNP en 9p21 asociada con el riesgo, en donde la variante SNP se selecciona de: rs10757278; rs3217992; rs4977574; rs1333049; rs10757274; rs2383206; rs2383207; rs3217989; rs1333040; rs2383207; rs10116277; rs7044859; rs1292136; rs7865618; rs1333045; rs9632884; rs10757272; rs4977574; rs2891168; rs6475606; rs1333048; rs1333049; y rs1333045, en donde el agente anti-CD47 reduce la unión de CD47 en una célula apoptótica a SIRPα en una célula fagocítica, y en donde el agente anti-CD47 es: un anticuerpo anti-CD47, un polipéptido derivado de SIRPα, o un anticuerpo anti- SIRPa.

Description

DESCRIPCIÓN

Modulación de las vías de eferocitosis para el tratamiento de una enfermedad aterosclerótica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La enfermedad cardiovascular aterosclerótica (ASCVD) sigue siendo la causa principal de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Los pacientes con ASCVD representan un grupo heterogéneo de individuos, con una enfermedad que progresa a ritmos diferentes y en patrones claramente diferentes. A pesar de los tratamientos apropiados basados en la evidencia para pacientes con ASCVD, las tasas de recurrencia y mortalidad siguen siendo del 2-4% al año.

En general, se cree que la aterosclerosis es una enfermedad compleja que involucra múltiples vías biológicas. Las variaciones en la historia natural del proceso de la enfermedad aterosclerótica, así como la respuesta diferencial a los factores de riesgo y las variaciones en la respuesta individual a la terapia, reflejan en parte las diferencias en los antecedentes genéticos y sus intrincadas interacciones con los factores ambientales que son responsables del inicio y modificación de la enfermedad. La enfermedad aterosclerótica también está influenciada por la naturaleza compleja del propio sistema cardiovascular, donde la anatomía, la función y la biología desempeñan un papel importante tanto en la salud como en la enfermedad.

Los factores de riesgo tradicionales representan aproximadamente la mitad del riesgo de enfermedad cardiovascular en la vida de un individuo. El saldo, por lo tanto, se explica por una combinación de exposiciones ambientales no medidas y factores genéticos. La reciente aparición de la plataforma de estudio de asociación de genoma completo (GWAS) ha hecho posible investigar el componente heredable de trastornos poligénicos complejos, como la enfermedad de la arteria coronaria aterosclerótica (CAD). Usando este enfoque, se ha identificado repetidamente una región en el cromosoma 9p21.3 en Gel WAS como el locus principal para la enfermedad cardiovascular compleja (Helgadottir et al. (2007) Science 316:1491-1493; McPherson et al. (2007) Science 316:1488-1491).

Los datos disponibles sugieren que los polimorfismos asociados con el riesgo: 1) son muy comunes, con tanto como una quinta parte de la población mundial portando dos copias del alelo de riesgo (frecuencia de alelo menor -50%) (Deloukas et al. (2013) Nat Genet 45:25-33); 2) son independientes de todos los factores de riesgo establecidos, lo que sugiere un nuevo mecanismo de acción (Cunnington y Keavney (2011) Curr Atheroscler Rep 13: 93-201); 3) son responsables de hasta el 21% del riesgo atribuible de infarto de miocardio (IM); y 4) promueven el riesgo a través en un espectro de enfermedades vasculares, incluyendo CAD, apoplejía, enfermedad arterial periférica (PAD) y aneurisma aórtico abdominal (AAA) (Helgadottir et al. (2008) Nat Genet 40:217-224).

Elucidar la biología vascular del locus 9p21 se ha vuelto una prioridad para la comunidad científica. Debido a que la mayoría de los polimorfismos de un único nucleótido altamente asociados (SNP) se producen en una región no codificante del genoma, se han realizado varios estudios de locus de rasgos cuantitativos de expresión (eQTL) y desequilibrio de la expresión alélica (AEI) en un intento para identificar el gen(es) causal que están desregulados en portadores de la variante de riesgo 9p21. Aunque se ha informado de una variedad de asociaciones, ahora se ha observado una expresión reducida del gen supresor de tumores cercano, CDKN2B, en varios tejidos de los portadores del alelo de riesgo, incluido el tejido adiposo y las células circulantes (Liu et al. (2009) PLoS ONE 4: e5027; Schunkert et al. (2011) Nat Genet 43: 333-338), así como en el 'órgano final', incluida la placa aterosclerótica y las células del músculo liso vascular (SMC), (Pilbrow et al. 2012. PLoS One 7: e39574).

La placa aterosclerótica consiste en lípidos intracelulares y extracelulares acumulados, células del músculo liso, tejido conectivo y glicosaminoglicanos. La lesión detectable de aterosclerosis más temprana es la línea de grasa, que consiste en células espumosas cargadas de lípidos, que son macrófagos que han migrado como monocitos desde la circulación hacia la capa subendotelial de la íntima, que luego evoluciona hacia la placa fibrosa, que consiste en células del músculo liso intimales rodeadas de tejido conectivo y lípidos intracelulares y extracelulares.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

Se proporcionan métodos para la prevención y el tratamiento de la enfermedad de la arteria coronaria (CAD) en un sujeto, incluyendo sin limitación, métodos para prevenir o tratar la aterosclerosis. En algunas realizaciones, el sujeto es homocigoto o heterocigoto para un alelo de riesgo 9p21. En algunas de tales realizaciones, los métodos incluyen pruebas genéticas del sujeto para detectar la presencia de un alelo de riesgo 9p21. En otras de tales realizaciones, al sujeto se le ha diagnosticado anteriormente por la presencia de un alelo de riesgo 9p21, donde dichos métodos pueden incluir, sin limitación, analizar una muestra de ADN genómico del individuo para detectar la presencia de secuencias del cromosoma humano 9p21 asociado con riesgo de CAD, incluyendo SNP asociados con el locus de riesgo.

Los métodos de la invención se basan en parte en el descubrimiento de que las células del músculo liso (SMC) apoptóticas en portadores del alelo de riesgo pueden ser resistentes a la eferocitosis, lo que lleva a la retención de tales células en el núcleo necrótico de la placa aterosclerótica. En los métodos de la invención, un agente que aumenta la eferocitosis de los componentes celulares de la placa coronaria, incluyendo la eferocitosis de las células del músculo liso apoptóticas, se administra al sujeto en una dosis y durante un período de tiempo efectivo para estabilizar, prevenir o reducir la placa aterosclerótica en el individuo.

Los objetivos moleculares para aumentar la eferocitosis incluyen, sin limitación, agentes que activan o aumentan la expresión de CDKN2B o Retinoblastoma (Rb), o disminuyen la expresión de E2F4; agentes que aumentan la actividad o la expresión de calreticulina; agentes que bloquean la interacción de CD47 y SIRPa; y similares.

Otro aspecto divulgado en la presente se refiere al uso de un agente estimulante de la eferocitosis en la fabricación de un medicamento para estabilizar, prevenir o reducir la placa aterosclerótica, en donde el medicamento se administra a un individuo que tiene o está en riesgo de tener aterosclerosis.

Otro aspecto más de la presente divulgación proporciona un kit para estabilizar, prevenir o reducir la placa aterosclerótica. El kit incluye un agente estimulante de la eferocitosis, en una cantidad suficiente para estabilizar, prevenir o reducir la placa aterosclerótica. El kit también puede incluir reactivos para genotipar en el cromosoma humano 9p21, incluyendo los alelos de rs10757278 y rs1333049. El kit también puede incluir instrucciones de uso, reactivos para monitorizar la enfermedad aterosclerótica y similares.

En otras realizaciones, el agente mejora la expresión de CDKN2B en células cardiovasculares incluyendo, por ejemplo, células de músculo liso. Tales agentes pueden incluir, por ejemplo, palbociclib; 5-aza-2'-desoxicitidina en ausencia o presencia de fenilbutirato; etc.

En algunas realizaciones, el agente que aumenta la eferocitosis reduce la interacción de CD47 y SIRPa, dicho agente puede ser referido en la presente como un agente anti-CD47. En algunas realizaciones, tales agentes no interfieren con la interacción entre CD47 y la trombospondina. Los agentes anti-CD47 preferidos incluyen SIRPa soluble, por ejemplo un SIRPa soluble de alta afinidad; anticuerpos anti-CD47, anticuerpos anti-SIRPa, etc..

En algunas realizaciones, el agente imita o mejora la calreticulina. Los "miméticos" y "agonistas" de calreticulina incluyen moléculas que funcionan de manera similar a, o potencian, la CRT uniéndose y activando el receptor de LRP. Las moléculas útiles como miméticos de CRT incluyen derivados, variantes y fragmentos biológicamente activos de CRT natural. Las moléculas útiles como agonistas incluyen anticuerpos y otros agentes que actúan para mejorar la actividad profagocítica de CRT.

En otras realizaciones, se proporcionan métodos para seleccionar agentes candidatos para el tratamiento de CAD, incluyendo, sin limitación, CAD asociado con alelos de riesgo 9p21, determinando el efecto de un agente sobre un objetivo en la vía de eferocitosis, por ejemplo, CDKN2B, calreticulina, CD47, etc.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Cdkn2b regula el tamaño de la lesión aterosclerótica y el crecimiento del núcleo necrótico. (A) En comparación con los ratones de control Cdkn2b+/+■ Apo-/- (n=22), los ratones Cdkn2b~l~, ApoE-1- (n=22) desarrollaron placas ateroscleróticas del seno aórtico significativamente más grandes, como se evaluó por área positiva de Aceite Rojo O. (B) Estas lesiones mostraron un contenido reducido de a-actina de SMC y (C) núcleos necróticos más grandes, con (D) ningún aumento en la carga de macrófagos. (E) Solo se pudo detectar una tendencia hacia una tasa más alta de apoptosis en animales Cdkn2b- ApoE-/- en el punto temporal terminal. (F) Las lesiones de la arteria braquiocefálica en ratones Cdkn2b- ApoE-- mostraron varias características de vulnerabilidad de la lesión, incluyendo contenido reducido de colágeno en placas, (G) contenido de SMC y cobertura de la tapa reducidos, y (H) adelgazamiento de la tapa fibrosa que recubre el núcleo necrótico. (I) No se apreciaron diferencias en la carga de macrófagos en las lesiones braquiocefálicas entre genotipos. *=P <0,05; =P <0,03; #=P <0,01; **=P <0,001.

Figura 2. La pérdida de CDKN2B se asocia con una expresión reducida del ligando receptor de fagocitos clave, la calreticulina. El análisis de la coexpresión génica ponderado de 51 segmentos de la arteria coronaria humana reveló que CDKN2B co-localiza con CALR en (A) topología de coexpresión local con genes de eferocitosis que están regulados por disminución en muestras de arteria coronaria con lesiones ateroscleróticas en comparación con muestras sin lesiones ateroscleróticas, y (B) descubrimiento de módulo global en análisis de coexpresión génica ponderada de 20,226 transcritos. (C) CDKN2B está directamente correlacionado con la expresión de CALR en secciones de arteria coronaria. En todos los diagramas de la red la anchura del borde se corresponde con la superposición topológica entre los nodos enlazados. El color del nodo en el gráfico de red se corresponde con la asignación del módulo. El recuadro representa el módulo que contiene CDKN2B y CALR identificados mediante agrupación jerárquica de la superposición topológica entre todos los pares de transcritos. El color del nodo en el recuadro se corresponde con la expresión diferencial de los miembros del módulo en muestras de arterias coronarias con lesiones ateroscleróticas frente a aquellas sin lesiones ateroscleróticas. Por simplicidad, solo se muestran los bordes correspondientes a una superposición topológica >0,2. (D) Se observó un patrón similar in vitro, ya que las HCASMC deficientes en CDKN2B expresaron niveles más bajos de CALR que las HCASMC transfectadas con control, tanto en el valor de referencia como durante la apoptosis. (E) Los ratones Cdkn2b-/-, ApoE-/- también expresaron menos Calr que los ratones Cdkn2b+/+■ ApoE-/- tanto en el riñón como en la aorta. (F) La inmunotinción semicuantitativa confirmó la reducción de la expresión de Calr en la placa aterosclerótica de animales Cdkn2b~l~, ApoE+. (G) El análisis eQTL de 127 muestras de placa aterosclerótica de la arteria carótida humana reveló que los portadores de un alelo de riesgo 9p21 representativo ("G" en rojo, con respecto al alelo ancestral "A" en negro) tienen reducciones simultáneas en la expresión de tanto CDKN2B (panel izquierdo, *P <0,05) como CALR (panel derecho, fP <0.03).

Figura 3. La expresión de calreticulina está regulada por una cascada que incluye CDKN2B y el eje RB/E2F4. (A) EMSA reveló la unión específica de una sonda de oligonucleótidos promotora de CALR marcada con ^y-32P-ATP que contiene el sitio de unión E2F4 predicho superior (de la Tabla 1) a extractos nucleares recogidos de HCASMC. La flecha indica complejo desplazado (pista 2), que ya no se observó en una reacción de competición que contenía 100 sondas sin marcar (pista 3, punta de flecha). (B) Estudios de ChIP revelaron enriquecimiento significativo de la proteína E2F4 en el promotor CALR en HCASMC humanas in vivo. (C) Los estudios de sobreexpresión y exclusión de ARNip con ensayos de informador de promotor de luciferasa dual demostraron que la expresión de CALR depende tanto de CDKN2B como de RB. (D) La expresión de CALR se incrementó por TGF-p de una manera dependiente de la dosis en células transfectadas con control (barras grises). Las células deficientes en CDKN2B (barras negras) mostraron significativamente menos actividad informadora de CALR en el valor de referencia, y no pudieron iniciar la transcripción de CALR en respuesta a TGF-p. Se observó un patrón similar en células deficientes en RB (barras blancas). P <0,01; fP <0.03.

Figura 4. La pérdida de CDKN2B hace que las SMC apoptóticas sean 'no comestibles'. (A) Los ensayos de fagocitosis basados en citometría de flujo revelaron que las células de músculo liso deficientes en CDKN2B apoptóticas eran significativamente menos propensas a ser depuradas por los macrófagos primarios que los cuerpos apoptóticos de control (AB). (B) Las HCASMC deficientes en CDKN2B apoptóticas también fueron resistentes a la depuración eferocítica por las SMC colindantes, que se sabe que funcionan como fagocitos no profesionales en afecciones como la aterosclerosis. (C) Los ensayos de competencia de eferocitosis revelaron que los AB transfectados con control tenían más probabilidades de ser fagocitados que los AB deficientes en CDKN2B cuando se co-cultivaban con fagocitos en cantidades iguales. (D) Las imágenes de microscopía electrónica cualitativas revelaron evidencias de necrosis de SMC en placas de Ratones Cdkn2b-/-, ApoE-/-, como se indicó por las células con cromatina condensada y membranas plasmáticas alteradas (flechas negras) y lisosomas extracelulares sugerentes de ruptura celular (puntas de flecha negras). Por el contrario, las placas de ratones Cdkn2b+/+■ ApoE-/- albergaban desechos necróticos pequeños y estaban pobladas por fagocitos que habían engullido cada uno numerosos AB, lo que sugiere una depuración eferocítica más robusta (flechas blancas).

Figura 5. La biología de los macrófagos se ve perturbada por las interacciones con SMC deficientes en CDKN2B apoptótico. (A) Los macrófagos co-cultivados con siCont AB (barra gris) regularon por incremento Abca1, un gen de transporte de colesterol inverso clave, en relación al valor de referencia (barra blanca). Esta vía homeostática se mitigó significativamente cuando los macrófagos se co-cultivaron con siCDKN2B AB (barra negra). (B) La expresión aórtica de Abca1 también se redujo en los animales Cdkn2b~/~, ApoE-/- con respecto a los ratones de control Cdkn2b+/+■ ApoE-/-. (C) De manera similar, los macrófagos co-cultivados con Cdkn2b+/+ AB (barra gris) mostraron el aumento esperado en el flujo de colesterol marcado con tritio con respecto al valor de referencia (barra blanca), pero se observó una respuesta mitigada para los macrófagos co-cultivados con Cdkn2b-/- AB (barra negra). (D) Como resultado, la formación de células espumosas se aceleró cuando los macrófagos cargados con ox-LDL se co-cultivaron con Cdkn2b-- AB (barra negra) en comparación con Cdkn2b+/+ AB (barra gris). (E-F) Los macrófagos co-cultivados con siCDKN2B AB secretan menos IL-10 antiinflamatoria y más TNF-a proinflamatorio (barras negras), con respecto a los macrófagos co­ cultivados con siCont AB (barras grises).

Figura 6. El defecto dependiente de CDKN2B en eferocitosis es reversible. (A) La aplicación del péptido CALR exógeno anula la diferencia del valor de referencia en las tasas de reabsorción observadas entre los AB Cdkn2b'/- y los AB Cdkn2b+/+. El péptido de CALR exógeno también normaliza las diferencias del valor de referencia en la expresión de Abca1 (B) y la formación de células espumosas (C). Aumento original, ■ 20X. P <0,01; fP <0,03.

Figura 7. La pérdida de Cdkn2b aumenta el crecimiento del núcleo necrótico y aumenta la apoptosis temprana. (A) Ejemplos adicionales de núcleos necróticos acelulares grandes observados en ratones Cdkn2b-/- ApoE-/- con respecto a los animales de control Cdkn2b+/+- ApoE-- (tinción de H&E en la parte superior, tricromo de Masson en la parte inferior con varios aumentos). (B) Debido a que se observó muy poca apoptosis en el punto final terminal del modelo crónico proporcionado en la Figura 1, se infundieron 10 Cdkn2b+/+■ ApoE-/- y Cdkn2b'/-, ApoE-/- adicionales que solo habían recibido cuatro semanas de dieta alta en grasas con Angiotensina II por minibomba osmótica durante 72 horas antes del sacrificio para inducir inflamación vascular aguda. En este caso, Cdkn2b'1', ApoE'1' mostraron un aumento del 97% en las células positivas para TUNEL por sección con respecto a los controles, de significancia límite (P=0,06). (C) Compensación de otros genes del locus 9p21.3 en tejido aórtico de Cdkn2b-/-, ApoE'1' con respecto a los ratones de control Cdkn2b+'+, ApoE'1'. Como se ha descrito anteriormente, hay una regulación por incremento significativa de Cdkn2a en animales knockout de Cdkn2b. En los estudios actuales, no se observó diferencia en la expresión del gen pro-apoptótico p19/Arf en el punto final terminal. (D) No se observaron diferencias en los niveles de lípidos o glucosa en ayunas entre los genotipos después de 12 semanas de dieta occidental. Figura 8. Análisis bioinformático de muestras de aterosclerosis humana y evaluación de genes de eferocitosis adicionales en HCASMC. (A) Relación topológica entre CDKN2B y genes implicados en la eferocitosis en segmentos de la arteria coronaria humana. Las barras de color corresponden a la asignación del módulo. (B) Dendograma de clúster de red de coexpresión génica de segmentos de arteria coronaria humana. La adyacencia de la red se calculó a partir de la superposición topológica entre todos los pares de genes representados en el conjunto de datos de expresión. Se usó el algoritmo de corte de árbol dinámico para elegir iterativamente tamaños de clúster estables y dividir la red en módulos. (C) Correlación entre la expresión de CDKN2B y genes implicados en la eferocitosis en segmentos de la arteria coronaria humana: (a) Todas las muestras; (b) muestras sin lesiones ateroscleróticas; (c) muestras con lesiones ateroscleróticas. (D) Expresión relativa de varios genes de eferocitosis candidatos adicionales en siCDKN2B HCASMC en comparación con siCont HCASMC al inicio del estudio (D) y durante la apoptosis (E).

Figura 9. Análisis adicional del promotor CALR. (A) Los datos disponibles públicamente del explorador del genoma UCSC revelan que el promotor CALR tiene un patrón de cromatina abierto, sitios de hipersensibilidad a DNasa, un patrón de metilación de ADN AoSMC consistente y datos publicados de ChIP-seq, todos los cuales sugieren que E2F4 podría regular la expresión de CALR en SMC humanas. (B) HCASMC no transfectadas aumentó su expresión de CDKN2B en respuesta a la estimulación de TGF-p exógena en un patrón consistente con los datos del informador de luciferasa mostrados en la Figura 3. (C) secuencias oligo promotoras de CALR y cebadores ChiP empleados en los estudios EMSA y de inmunoprecipitación, respectivamente, descritos en la Figura 3. (D) Reacciones de control positivas y negativas empleadas en los experimentos de EMSA para la Figura 3.

Figura 10. CDKN2B no altera la capacidad fagocítica de la célula colindante. (A) Compuertas de control empleadas para todos los estudios de eferocitosis. (B) Aunque la pérdida de CDKN2B volvió a las células apoptóticas resistentes a la eferocitosis, la pérdida de CDKN2B en las HCASMC colindantes no apoptóticas no tuvo impacto en su capacidad fagocítica. Tener en cuenta que CDKN2B era indetectable en fagocitos 'profesionales' como los macrófagos, en cultivo. (C) Ejemplos adicionales de eferocitosis fallida in vivo en ratones Cdkn2b- / ApoE-/-. Las micrografías electrónicas revelan de nuevo una apoptosis y necrosis más frecuentes en animales Cdkn2b-/' ApoE--, con cromatina condensada e interrupción de la integridad de la membrana plasmática (flechas negras), junto con una alta carga de desechos extracelulares y AB no asociados con un macrófago adyacente (puntas de flecha negras). Por el contrario, los ratones de control Cdkn2b+/+■ ApoE-/- mostraron núcleos suavemente delineados con patrones de heterocromatina normales, mitocondrias de tamaño normal y membranas plasmáticas intactas (puntas de flecha blancas). Estas placas también mostraban rutinariamente macrófagos que habían ingerido numerosos AB, lo que sugiere eferocitosis intacta.

Figura 11. La eferocitosis puede normalizarse in vitro. El deterioro dependiente de Cdkn2b en la eferocitosis (izquierda) puede revertirse completamente con la aplicación exógena del péptido Calr (derecha).

Figura 12: Abs Anti-CD47 estimula la eferocitosis de SMC deficientes en CDKN2B. Hu5F9-G4 induce un aumento del ~72% en la fagocitosis de SMC por parte de MO.

Figura 13. Descripción general del estudio de prevención de la aterosclerosis, que muestra la línea temporal para la inyección de Ab anti-Cd47, la medición de la presión arterial y la administración de una dieta alta en grasas (arriba). La presión arterial cambia a lo largo del tiempo durante el período de tratamiento (abajo). Figura 14. La placa aterosclerótica en la aorta torácica se reduce mediante la administración de Ab anti-CD47. Las aortas torácicas de ratones tratados con Ab anti-CD47 (MIAP410) o Ab de control (IgG) se recogieron y fijaron. El área de la placa aterosclerótica (blanca) se cuantificó bajo microscopía de baja potencia de una manera ciega. El porcentaje del área del vaso aórtico cubierto por la placa aterosclerótica se cuantificó para cada animal y se muestra que se reduce significativamente en los animales que recibieron Ab anti-CD47.

Figura 15. La placa aterosclerótica en el seno aórtico se reduce mediante la administración de Ab anti-CD47. Se recogieron los senos aórticos de ratones tratados con Ab anti-CD47 (MIAP410) o Ab de control (IgG) y se seccionaron después de la fijación por perfusión. La placa aterosclerótica se tiñó con aceite-rojo-O y el área afectada (en rojo) se cuantificó bajo microscopía de baja potencia de manera ciega. El área absoluta del seno aórtico afectado por la placa aterosclerótica se cuantificó para cada animal y se muestra que se reduce significativamente en los animales que recibieron Ab anti-CD47.

Figura 16. Las tinciones inmunohistoquímicas representativas de las secciones del seno aórtico tomadas de ratones tratados con Ab anti-CD47 (MIAP410) o Ab de control (IgG) revelan que la terapia con Ab anti-CD47 no afecta al contenido de SMC, como se evalúa por tinción de alfa-SMA. El contenido de macrófagos absoluto (cuantificado por tinción para Mac-3) muestra que el contenido total de macrófagos se reduce en ratones que reciben terapia con Ab anti-CD47 (MIAP410), sin embargo, el contenido relativo no es diferente, cuando se normaliza al tamaño total de la lesión.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente divulgación se refiere a métodos de tratamiento de un sujeto para aterosclerosis, incluyendo afecciones como CAD, enfermedad arterial periférica (PAD) y enfermedad cerebrovascular, mediante la administración de un agente que aumenta la eferocitosis de los componentes celulares de la placa aterosclerótica, incluyendo la eferocitosis de las células del músculo liso apoptótico. En algunas realizaciones, el sujeto es homocigoto o heterocigoto para un alelo de riesgo 9p21. En algunas realizaciones, el agente que aumenta la eferocitosis proporciona una o más de las siguientes actividades: reduce la unión de CD47 a SIRPa; aumenta o imita la actividad de calreticulina, incluyendo la unión de calreticulina a LRP; o aumenta la expresión de CDKN2B.

La enfermedad de la arteria coronaria (CAD): es un estrechamiento o bloqueo de las arterias y vasos que proporcionan oxígeno y nutrientes al corazón. Está provocada por la aterosclerosis, una acumulación de materiales grasos en los revestimientos internos de las arterias. El bloqueo resultante restringe el flujo de sangre al corazón. Cuando el flujo sanguíneo se interrumpe completamente, el resultado es un ataque cardíaco. La CAD es la principal causa de muerte tanto para hombres como para mujeres en los Estados Unidos.

La aterosclerosis (también conocida como arteriosclerosis, enfermedad vascular ateromatosa, enfermedad oclusiva arterial) como se usa en la presente, se refiere a una enfermedad cardiovascular caracterizada por la acumulación de placa en las paredes de los vasos e inflamación vascular. La placa consiste de lípidos intracelulares y extracelulares acumulados, células del músculo liso, tejido conectivo, células inflamatorias y glicosaminoglicanos. La inflamación tiene lugar en combinación con la acumulación de lípidos en la pared del vaso, y la inflamación vascular es el sello distintivo del proceso de la enfermedad de la aterosclerosis.

El infarto de miocardio es una necrosis miocárdica isquémica resultante habitualmente de una reducción abrupta en el flujo sanguíneo coronario a un segmento de miocardio. En la gran mayoría de los pacientes con IM agudo, un trombo agudo, a menudo asociado con la ruptura de la placa, ocluye la arteria que irriga el área dañada. La rotura de la placa se produce generalmente en vasos previamente parcialmente obstruidos por una placa aterosclerótica enriquecida en células inflamatorias. La función plaquetaria alterada inducida por la disfunción endotelial y la inflamación vascular en la placa aterosclerótica contribuye presumiblemente a la trombogénesis. El infarto de miocardio puede clasificarse en IM con elevación del segmento ST y sin elevación del segmento ST (también referido como angina inestable). En ambas formas de infarto de miocardio, hay necrosis miocárdica. En el infarto de miocardio con elevación del segmento ST hay una lesión miocárdica transmural que lleva a elevaciones de ST en el electrocardiograma. En el infarto de miocardio sin elevación del segmento ST, la lesión es subendocárdica y no está asociada con la elevación del segmento ST en el electrocardiograma. El infarto de miocardio (tanto con elevación ST como sin elevación de ST) representa una forma inestable de enfermedad cardiovascular aterosclerótica. El síndrome coronario agudo abarca todas las formas de enfermedad arterial coronaria inestable. La insuficiencia cardíaca puede producirse como resultado de una disfunción miocárdica provocada por un infarto de miocardio.

La angina se refiere al dolor de pecho o molestias resultantes del flujo sanguíneo inadecuado al corazón. La angina puede ser un síntoma de enfermedad cardiovascular aterosclerótica. La angina puede clasificarse como estable, que sigue un patrón crónico regular de síntomas, a diferencia de las formas inestables de enfermedad vascular aterosclerótica. La base fisiopatológica de la enfermedad cardiovascular aterosclerótica estable también es complicada pero es biológicamente distinta de la forma inestable. Generalmente la angina estable no es necrosis de miocardio.

9p21 de riesgo. Como se usa en la presente, el término "un individuo que lleva por lo menos un factor de riesgo 9p21" se refiere a humanos en los que están presentes en el genoma uno o más alelos de riesgo en el locus 9p21. Se ha demostrado que tales individuos tienen un mayor riesgo de: infarto de miocardio de inicio temprano, aneurisma aórtico abdominal, apoplejía, enfermedad arterial periférica e infarto de miocardio/enfermedad del corazón coronaria. Este riesgo es independiente de los factores de riesgo tradicionales, como diabetes, hipertensión, colesterol y obesidad. Ver, por ejemplo, Helgadottir et al. Science. 2007; 316(5830):1491-1493; Helgadottir et al. Nat Genet. 2008; 40(2) 217-224; Palomaki et al. JAMA 2010; 303(7):648-656; y Roberts et al. Curr Opin Cardiol. 2008; 23:629-633.

El locus 9p21 está en el LD estrecho (desequilibrio de enlace), y se ha demostrado que una serie de marcadores de polimorfismos de un único nucleótido (SNP) son útiles en el diagnóstico. Los SNP representativos incluyen, sin limitación, rs10757278; rs3217992; rs4977574; rs1333049; rs10757274; rs2383206; rs2383207; Rs3217989; rs1333040; rs2383207; rs10116277; rs7044859; rs1292136; rs7865618; rs1333045; rs9632884; rs10757272; rs4977574; rs2891168; rs6475606; rs1333048; rs1333049; Rs1333045; etc.

Eferocitosis. El proceso por el cual los fagocitos profesionales y no profesionales eliminan las células apoptóticas de manera rápida y eficiente. La eferocitosis implica una serie de moléculas, que incluyen ligandos en las células apoptóticas, por ejemplo, fosfatidilserina; receptores en el eferocito; moléculas de formación de puentes ligando-receptor solubles; y las denominadas moléculas "encuéntrame" y "no me comas", por ejemplo, lisosfosfolípidos y CD47, cuya expresión por las células que están muriéndose se altera para atraer a los fagocitos cercanos. Al depurar las células apoptóticas en una etapa relativamente temprana de la muerte celular, cuando el plasma celular y las membranas de los orgánulos aún están intactos, se evita la necrosis postapoptótica o "secundaria". La prevención de la necrosis celular, a su vez, evita la liberación de moléculas intracelulares potencialmente dañinas en el medio extracelular, incluyendo moléculas que estimulan las respuestas inflamatoria, proateroesclerótica y/o autoinmune.

La eficacia de la depuración eferocítica en las lesiones ateroscleróticas desempeña un papel clave en el desarrollo de la enfermedad. Se sabe que la eferocitosis está deteriorada en la placa aterosclerótica humana. Una característica prominente de las lesiones ateroscleróticas avanzadas es el núcleo necrótico, o núcleo lipídico, que es una colección de macrófagos muertos y necróticos rodeados de células inflamatorias. Se piensa que los núcleos necróticos son una característica principal responsable de la "vulnerabilidad" de la placa, es decir, placas capaces de experimentar alteraciones y desencadenar trombosis luminal aguda. La alteración de la placa y la trombosis aguda son los eventos que desencadenan los síndromes coronarios agudos, incluyendo infarto de miocardio, angina inestable, muerte cardíaca súbita y accidente cerebrovascular.

Por "manipulación de la eferocitosis" se entiende una regulación por incremento o una regulación por disminución en la eferocitosis de una célula objetivo, por ejemplo, SMC apoptóticas, en por lo menos aproximadamente el 10%, o hasta el 20%, o el 50%, o el 70% o el 80% o hasta aproximadamente el 90% en comparación con el nivel de eferocitosis observado en ausencia de intervención.

Los términos "células fagocíticas" y "fagocitos" se usan indistintamente en la presente para referirse a una célula que es capaz de fagocitosis. Hay tres categorías principales de fagocitos: macrófagos, células mononucleares (histiocitos y monocitos); leucocitos polimorfonucleares (neutrófilos) y células dendríticas. Sin embargo, también se sabe que las células "no profesionales" participan en la eferocitosis, como las SMC colindantes en la pared de los vasos sanguíneos.

"Tratamiento", "tratando", "tratar" y similares se usan en la presente para referirse de manera general a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir total o parcialmente una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de una estabilización o cura parcial o completa de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. El "tratamiento" como se usa en la presente cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente un humano, e incluye: (a) prevenir que tenga lugar la enfermedad o síntoma en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad o síntoma pero al que todavía no se le ha diagnosticado que lo tanga; (b) inhibir el síntoma de la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar el síntoma de la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad o síntoma. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen individuos a los que ya se les ha diagnosticado que tienen CAD, por ejemplo, aterosclerosis, así como aquellos en los que se debe prevenir la enfermedad.

Los términos "receptor", "individuo", "sujeto", "huésped" y "paciente", se usan indistintamente en la presente y se refieren a cualquier sujeto mamífero para el que se desea diagnóstico, tratamiento o terapia, particularmente humanos. "Mamífero" para propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, de deporte o mascotas, como perros, caballos, gatos, vacas, ovejas, cabras, cerdos, etc. Preferiblemente, el mamífero es humano.

Una "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para efectuar resultados clínicos beneficiosos o deseados. Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones. Para los propósitos de esta invención, una cantidad eficaz de un agente anti-CD47 es una cantidad que es suficiente para paliar, mejorar, estabilizar, revertir, prevenir, ralentizar o retrasar la progresión del estado de la enfermedad, por ejemplo, aterosclerosis o placa aterosclerótica, aumentando la fagocitosis de una célula objetivo. Por ejemplo, en un modelo animal, el porcentaje de área de superficie aórtica con placa aterosclerótica puede reducirse un 25%, 50%, 75% o más con respecto a un animal tratado con control. Pueden obtenerse efectos similares con indicios apropiados para pacientes humanos incluyendo, sin limitación, proteína C reactiva [PCR] y fibrinógeno; fosfolipasa A2 asociada a lipoproteína [Lp-PLA2] y mieloperoxidasa [MPO]; marcadores inflamatorios del factor de diferenciación de crecimiento 15 [GDF-15]); rigidez arterial ambulatoria, obtención de imágenes IVUS y similares. Ver, por ejemplo Krintus et al. (2013) Crit Rev Clin Lab Sci. 11:1-17; Kollias et al. (2012) Atherosclerosis 224(2): 291-301; y Kollias et al. (2011) Int. J. Cardiovasc. Imaging 27(2):225-37.

El término "muestra" con respecto a un paciente abarca muestras de sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido sólido como un espécimen de biopsia o cultivos de tejidos o células derivadas de los mismos y la progenie de los mismos. La definición también incluye muestras que han sido manipuladas de alguna manera después de su adquisición, como por ejemplo con tratamiento con reactivos; lavado; o enriquecimiento para ciertas poblaciones celulares. La definición también incluye muestras que se han enriquecido para tipos particulares de moléculas, por ejemplo, ácidos nucleicos, polipéptidos, etc.

Los términos "unión específica", "se une específicamente" y similares, se refieren a la unión preferencial no covalente o covalente a una molécula con respecto a otras moléculas o fracciones en una solución o mezcla de reacción (por ejemplo, un anticuerpo se une específicamente a un polipéptido o epítopo particular con respecto a otros polipéptidos disponibles; unión de alta afinidad de un polipéptido SIRPa a CD47; etc.). En algunas realizaciones, la afinidad de una molécula por otra molécula a la que se une específicamente se caracteriza por una K^d (constante de disociación) de 10-5 M o menos (por ejemplo, 10-6 M o menos, 10-7 M o menos, 10-8 M o menos, 10­ 9 M o menos, 10-10 M o menos, 10-11 M o menos, 10-12 M o menos, 10-13 M o menos, 10-14 M o menos, 10-15 M o menos, o 10-16 M o menos). "Afinidad" se refiere a la fuerza de la unión, la afinidad de unión aumentada está correlacionada con una K^d inferior.

El término "miembro de unión específico" como se usa en la presente se refiere a un miembro de un par de unión específico (es decir, dos moléculas, habitualmente dos moléculas diferentes, donde una de las moléculas, por ejemplo, un primer miembro de unión específico, a través de medios no covalentes se une específicamente a la otra molécula, por ejemplo, un segundo miembro de unión específico). Los miembros de unión específicos adecuados incluyen agentes que se unen específicamente a CD47 (es decir, agentes anti-CD47), o que de otro modo bloquean la interacción entre CD47 y SIRPa, agentes que se unen a calreticulina o su receptor LRP, etc.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos también se aplican a los polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a los polímeros de aminoácidos de origen natural y a los polímeros de aminoácidos de origen no natural.

Un polipéptido "variante" significa un polipéptido biológicamente activo como se define a continuación que tiene menos de un 100% de identidad de secuencia con un polipéptido de secuencia nativa. Dichas variantes incluyen polipéptidos en los que se añaden uno o más residuos de aminoácidos en el extremo terminal N- o C-, o dentro de la secuencia nativa; se eliminan de aproximadamente uno a cuarenta residuos de aminoácidos, y opcionalmente se sustituyen por uno o más residuos de aminoácidos; y derivados de los polipéptidos anteriores, en donde un residuo de aminoácido se ha modificado covalentemente para que el producto resultante tenga un aminoácido que no se produce de manera natural. Normalmente, una variante biológicamente activa tendrá una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente un 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con un polipéptido de secuencia nativa, preferiblemente por lo menos aproximadamente un 95%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 99%. Los polipéptidos variantes pueden estar glicosilados de forma natural o no natural, es decir, el polipéptido tiene un patrón de glicosilación que difiere del patrón de glicosilación encontrado en la proteína de origen natural correspondiente. Los polipéptidos variantes pueden tener modificaciones postraduccionales que no se encuentran en la proteína natural.

Un polipéptido de "fusión" es un polipéptido que comprende un polipéptido o porción (por ejemplo, uno o más dominios) del mismo fusionado o unido al polipéptido heterólogo. Una proteína de CRT soluble de fusión, por ejemplo, compartirá por lo menos una propiedad biológica en común con un polipéptido de CRT soluble de la secuencia nativa. Los ejemplos de polipéptidos de fusión incluyen inmunoadhesinas, como se ha descrito anteriormente, que combinan una porción del polipéptido de interés con una secuencia de inmunoglobulina, y polipéptidos etiquetados con epítopo, que comprenden un polipéptido soluble de interés o una porción del mismo fusionado a un "polipéptido etiqueta". El polipéptido etiqueta tiene suficientes residuos para proporcionar un epítopo contra el cual se puede elaborar un anticuerpo, pero sigue siendo lo suficientemente corto como para no interferir con la actividad biológica del polipéptido de interés. Los polipéptidos etiqueta adecuados tienen generalmente por lo menos seis residuos de aminoácidos y habitualmente entre aproximadamente 6-60 residuos de aminoácidos.

Un "derivado funcional" de un polipéptido de secuencia nativa es un compuesto que tiene una propiedad biológica cualitativa en común con un polipéptido de secuencia nativa. Los "derivados funcionales" incluyen, pero no están limitados a, fragmentos de una secuencia nativa y derivados de un polipéptido de secuencia nativa y sus fragmentos, siempre que tengan una actividad biológica en común con un polipéptido de secuencia nativa correspondiente. El término "derivado" abarca tanto las variantes de secuencia de aminoácidos del polipéptido como las modificaciones covalentes del mismo. Por ejemplo, los derivados y la fusión de CRT soluble encuentran uso como moléculas miméticas de CRT.

Molécula pequeña: como se usa en la presente, el término "molécula pequeña" se refiere a compuestos orgánicos, ya sean de origen natural o creados artificialmente (por ejemplo, mediante síntesis química) que tienen un peso molecular relativamente bajo y que no son proteínas, polipéptidos o ácidos nucleicos. Típicamente, las moléculas pequeñas tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 1500 g/mol. Además, las moléculas pequeñas suelen tener múltiples enlaces carbono-carbono.

El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente los anticuerpos monoclonales (incluyendo los anticuerpos monoclonales de longitud completa), los anticuerpos policlonales, los anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y los fragmentos de anticuerpos siempre que muestren la actividad biológica deseada. Los "anticuerpos" (Ab) y las "inmunoglobulinas" (Ig) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos muestran especificidad de unión a un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas similares a anticuerpos que carecen de especificidad de antígeno. Los polipéptidos de este último tipo, por ejemplo, se producen a niveles bajos por el sistema linfático y a niveles aumentados por mielomas.

"Fragmento de anticuerpo" y todas las variantes gramaticales del mismo, como se usa en la presente, se definen como una porción de un anticuerpo intacto que comprende el sitio de unión al antígeno o región variable del anticuerpo intacto, en donde la porción está libre de los dominios de la cadena pesada constantes (es decir, CH2, CH3 y CH4, dependiendo del isotipo del anticuerpo) de la región Fc del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')²y Fv; diacuerpos; cualquier fragmento de anticuerpo que sea un polipéptido que tenga una estructura primaria que consista de una secuencia ininterrumpida de residuos de aminoácidos contiguos (referido en la presente como "fragmento de anticuerpo de cadena sencilla" o "polipéptido de cadena sencilla"), incluyendo sin limitación (1) moléculas de Fv de cadena sencilla (scFv) (2) polipéptidos de cadena sencilla que contienen solo un dominio variable de cadena ligera, o un fragmento del mismo que contiene las tres CDR del dominio variable de cadena ligera, sin una fracción de cadena pesada asociada (3) polipéptidos de cadena sencilla que contienen solo una región variable de la cadena pesada, o un fragmento de la misma que contiene las tres CDR de la región variable de la cadena pesada, sin una fracción de cadena ligera asociada y (4) nanocuerpos que comprenden dominios Ig individuales de especies no humanas u otros módulos de unión de dominio individuales específicos; y estructuras multiespecíficas o multivalentes formadas a partir de fragmentos de anticuerpos. En un fragmento de anticuerpo que comprende una o más cadenas pesadas, las cadenas pesadas pueden contener cualquier secuencia del dominio constante (por ejemplo, CH1 en el isotipo IgG) encontrada en una región no Fc de un anticuerpo intacto, y/o puede contener cualquier secuencia de región bisagra encontrada en un anticuerpo intacto, y/o puede contener una secuencia de cremallera de leucina fusionada o situada en la secuencia de región bisagra o la secuencia de dominio constante de las cadenas pesadas.

Como se usa en la presente, el término "epítopo" significa cualquier determinante antigénico en un antígeno al que se une el paratopo de un anticuerpo. Los determinantes epitópicos consisten habitualmente de agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activas como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y habitualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas.

El inhibidor 2 B de la quinasa dependiente de ciclina (CDKN2B) también se conoce como supresor tumoral múltiple 2 (MTS-2) o p15INK4B. El refseq de Genbank para el ARNm humano tiene el número de registro NM_004936 y el refseq de proteína tiene el número de registro NP_004927. Este gen se encuentra adyacente al gen supresor tumoral CDKN2A en una región que frecuentemente muta y se elimina en una amplia variedad de tumores.

CDKN2B forma un complejo con CDK4 o CDK6, y evita la activación de las quinasas CDK por la ciclina D, por lo que la proteína codificada funciona como un regulador del crecimiento celular que inhibe la progresión del ciclo celular G1.

En la presente se muestra que la expresión de CDKN2B disminuida asociada con los alelos de riesgo 9p21 deteriora la expresión de calreticulina, un ligando requerido para la activación de receptores de envoltura en células fagocíticas. Como resultado, los cuerpos apoptóticos deficientes en cdkn2B, por ejemplo, las células apoptóticas del músculo liso, se vuelven resistentes a la eferocitosis y las células fagocíticas no los depuran eficientemente. En la técnica se conocen los agentes que activan o regulan por incremento la expresión de CDKN2B incluyendo, por ejemplo, palbociclib (ver Toogood et al. (2005) J Med Chem. 48(7):2388-406); 5-aza-2'-desoxicitidina en ausencia o presencia de fenilbutirato (ver Lemaire et al. (2004) Leuk Lymphoma. 45(1):147-54); factores inducibles por hipoxia -1a y -2a (ver Aesoey et al. (2013) Endocr Rev, Vol. 34 (03_Meeting Abstracts): SUN-303; etc. Los agentes que activan o regulan por incremento CDKN2B pueden determinarse mediante métodos de selección conocidos en la técnica.

Calreticulina La calreticulina es una proteína multifuncional de 417 aminoácidos, con un peso molecular de 48 kDa, que se une a los iones de Ca2+, volviéndola inactiva. El Ca2+ se une con baja afinidad, pero alta capacidad, y puede liberarse en una señal. La calreticulina puede estar localizada en compartimentos de almacenamiento asociados con el retículo endoplásmico, donde se une a proteínas mal plegadas y evita que se exporten al aparato de Golgi. La calreticulina también se encuentra en el núcleo, lo que sugiere que puede tener un papel en la regulación de la transcripción. La calreticulina se une al péptido sintético KLGFFKR, que es casi idéntico a una secuencia de aminoácidos en el dominio de unión al ADN de la superfamilia de receptores nucleares. El símbolo del gen para la calreticulina es CALR, y puede accederse a las secuencias humanas en Pubmed de la siguiente manera: N° de registro de la proteína NP_004334; N° de registro de nucleótido: NM_004343.

La calreticulina en la superficie de las células apoptóticas sirve como un ligando de reconocimiento y depuración activando el receptor de internalización LRP en la superficie celular de fagocitos respondedores. La expresión superficial de calreticulina aumenta y la calreticulina se redistribuyó durante la apoptosis, posiblemente mejorando la estimulación de LRP en el fagocito.

La proteína relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad (LRP) es una proteína de 4.544 aminoácidos que contiene un único segmento transmembrana, con un alto grado de identidad de secuencia con el receptor de LDL. Se puede acceder a las secuencias genéticas humanas en Pubmed de la siguiente manera: N° de registro de nucleótido: NM_002332.2 GI: 126012561.

Los agentes que se unen específicamente a la calreticulina (CRT) son de interés como agonistas para mejorar la actividad pro-fagocítica de la CRT. Los agentes de unión a CRT útiles en los métodos de la invención incluyen análogos, derivados y fragmentos del miembro de unión específico original, por ejemplo, fragmentos Fab de anticuerpos, etc. Los "miméticos" y "agonistas" de calreticulina incluyen moléculas que funcionan de manera similar o potencian la CRT mediante la unión y activación del receptor de LRP. Las moléculas útiles como miméticos de CRT incluyen derivados, variantes y fragmentos biológicamente activos de CRT de origen natural. Las moléculas útiles como agonistas incluyen anticuerpos y otros agentes que actúan para mejorar la actividad pro-fagocítica de la CRT.

Son de interés los fragmentos de CRT soluble, particularmente fragmentos biológicamente activos y/o fragmentos correspondientes a dominios funcionales. Los fragmentos de interés tendrán típicamente por lo menos de aproximadamente 10 aa a por lo menos aproximadamente 15 aa de longitud, habitualmente por lo menos aproximadamente 50 aa de longitud, pero habitualmente no excederán de aproximadamente 142 aa de longitud, donde el fragmento tendrá una extensión de aminoácidos que es idéntica a la CRT. Se pretende que un fragmento de "por lo menos 20 aa de longitud", por ejemplo, incluya 20 o más aminoácidos contiguos de, por ejemplo, el polipéptido codificado por un ADNc para CRT. En este contexto, "aproximadamente" incluye el valor particularmente enumerado o un valor mayor o menor por varios (5, 4, 3, 2 o 1) aminoácidos.

Los ensayos in vitro para la actividad biológica de la calreticulina incluyen, por ejemplo, fagocitosis de células porcinas por macrófagos humanos, unión a LRP, etc. Un agente candidato útil como un mimético agonista de la calreticulina da como resultado una regulación por disminución de la fagocitosis en por lo menos aproximadamente un 10%, por lo menos aproximadamente un 20%, por lo menos aproximadamente un 50%, por lo menos aproximadamente un 70%, por lo menos aproximadamente un 80% o hasta aproximadamente un 90% en comparación con el nivel de fagocitosis observado en ausencia del agente candidato.

La CD47, también conocida como proteína asociada a la integrina (IAP), es un receptor de membrana de 50 kDa que tiene un dominio de IgV N-terminal extracelular, cinco dominios transmembrana y una transmembrana de cola intracelular C-terminal corta, perteneciente a la superfamilia de las inmunoglobulinas, con interacciones con integrinas, más comúnmente la integrina avp3, trombospondina-1 (TSP-1) y proteína alfa reguladora de señales (SIRPa). La secuencia de referencia para el ARNm humano tiene el número de registro de Genbank NM_001025079, y la secuencia de referencia de la proteína es NP_001768.

La interacción CD47/SIRPa lleva a una señalización bidireccional, lo que da como resultado diferentes respuestas de célula a célula, incluyendo la inhibición de la fagocitosis, la estimulación de la fusión célula-célula y la activación de células T.

Como se usa en la presente, el término "agente anti-CD47" se refiere a cualquier agente que reduce la unión de CD47 (por ejemplo, en una célula afectada) a SIRPa (por ejemplo, en una célula fagocítica). En algunas realizaciones, el agente anti-CD47 no interfiere ni se une a las regiones de CD47 que se unen a la trombospondina. En algunas realizaciones, el agente anti-CD47 no activa CD47 tras la unión. Cuando se activa CD47, se produce un proceso similar a la apoptosis (es decir, muerte celular programada) (Manna y Frazier, Cancer Research, 64, 1026­ 1036, 1 de febrero de 2004). Por tanto, en algunas realizaciones, el agente anti-CD47 no induce directamente la muerte celular de una célula que expresa CD47.

Los ejemplos no limitativos de reactivos anti-CD47 adecuados incluyen reactivos de SIRPa de alta afinidad, anticuerpos anti-SIRPa y anticuerpos anti-CD47 o fragmentos de anticuerpos. En algunas realizaciones, un agente anti-CD47 adecuado (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD47, un reactivo de SIRPa de alta afinidad, etc.) se une específicamente a CD47 para reducir la unión de CD47 a SIRPa. En algunas realizaciones, un agente anti-CD47 adecuado (por ejemplo, un anticuerpo anti-SIRPa, etc.) se une específicamente a SIRPa para reducir la unión de CD47 a SIRPa. Un agente anti-CD47 adecuado que se une a SIRPa no activa SIRPa (por ejemplo, en la célula fagocítica que expresa SIRPa).

La eficacia de un agente anti-CD47 adecuado puede analizarse analizando el agente. Un agente para su uso en los métodos de la invención regulará por incremento la fagocitosis por lo menos en un 10% (por ejemplo, por lo menos un 20%, por lo menos un 30%, por lo menos un 40%, por lo menos un 50%, por lo menos un 60%, por lo menos un 70%, por lo menos un 80%, por lo menos un 90%, por lo menos un 100%, por lo menos un 120%, por lo menos un 140%, por lo menos un 160%, por lo menos un 160% o por lo menos un 200%) en comparación con la fagocitosis en ausencia del agente. De manera similar, un ensayo in vitro para los niveles de fosforilación de tirosina de SIRPa mostrará una disminución en la fosforilación de por lo menos un 5% (por ejemplo, por lo menos un 10%, por lo menos un 15%, por lo menos un 20%, por lo menos un 30%, por lo menos un 40 %, por lo menos un 50%, por lo menos un 60%, por lo menos un 70%, por lo menos un 80%, por lo menos un 90%, o un 100%) en comparación con la fosforilación observada en ausencia del agente candidato.

En una realización de la invención, el agente anti-CD47, o una composición farmacéutica que comprende el agente, se proporciona en una cantidad eficaz para inhibir detectablemente la unión de CD47 al SIRPa presente en la superficie de las células fagocíticas. La cantidad eficaz se determina mediante una rutina de pruebas empíricas en la técnica, por ejemplo, en una muestra biológica tomada de un individuo infectado. La cantidad eficaz puede variar dependiendo de la cantidad de células a las que se dirige, la localización de las células y los factores específicos del sujeto.

Reactivo de SIRPa de alta afinidad. En algunas realizaciones, un agente anti-CD47 del asunto es un "reactivo de SIRPa de alta afinidad", que incluye polipéptidos derivados de SIRPa y análogos de los mismos. Los reactivos de SIRPa de alta afinidad se describen en la solicitud internacional PCT/US13/21937. Los reactivos de SIRPa de alta afinidad son variantes de la proteína SIRPa nativa. En algunas realizaciones, un reactivo de SIRPa de alta afinidad es soluble, donde el polipéptido carece del dominio transmembrana de SIRPa y comprende por lo menos un cambio de aminoácidos con respecto a la secuencia SIRPa de tipo salvaje, y en donde el cambio de aminoácidos aumenta la afinidad del polipéptido de SIRPa que se une a CD47, por ejemplo, disminuyendo la constante de disociación en por lo menos 10 veces, por lo menos 20 veces, por lo menos 50 veces, por lo menos 100 veces, por lo menos 500 veces o más.

Un reactivo de IRPa de alta afinidad comprende la porción de IRPa que es suficiente para unirse a CD47 a una afinidad reconocible, por ejemplo, alta afinidad, que normalmente se encuentra entre la secuencia señal y el dominio transmembrana, o un fragmento de la misma que retiene la actividad de unión. El reactivo de IRPa de alta afinidad comprenderá habitualmente por lo menos el dominio d1 de IRPa con residuos de aminoácidos modificados para aumentar la afinidad. En algunas realizaciones, una variante de IRPa de la presente invención es una proteína de fusión, por ejemplo, fusionada en marco con un segundo polipéptido. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es capaz de aumentar el tamaño de la proteína de fusión, por ejemplo, de tal manera que la proteína de fusión no se depure de la circulación rápidamente. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es parte o la totalidad de una región Fc de inmunoglobulina. En otras realizaciones, el segundo polipéptido es cualquier polipéptido adecuado que es sustancialmente similar a Fc, por ejemplo, que proporciona un tamaño aumentado, dominios de multimerización y/o unión o interacción adicional con moléculas de Ig.

Un reactivo de IRPa de alta afinidad adecuado reduce (por ejemplo, bloquea, previene, etc.) la interacción entre las proteínas nativas de IRPa y CD47. Los cambios de aminoácidos que proporcionan una afinidad aumentada están localizados en el dominio d1 y, por tanto, los reactivos de IRPa de alta afinidad comprenden un dominio d1 de SIRPa humana, con por lo menos un cambio de aminoácidos con respecto a la secuencia de tipo salvaje dentro del dominio d1. Tal reactivo de IRPa de alta afinidad comprende opcionalmente secuencias de aminoácidos adicionales, por ejemplo secuencias de anticuerpos Fc; porciones de la proteína IRPa humana de tipo salvaje distintas del dominio d1 incluyendo, sin limitación, los residuos 150 a 374 de la proteína nativa o fragmentos de los mismos, habitualmente fragmentos contiguos al dominio d1; y similares. Los reactivos de IRPa de alta afinidad pueden ser monoméricos o multiméricos, es decir, dímero, trímero, tetrámero, etc.

Anticuerpos anti-CD47. En algunas realizaciones, un agente anti-CD47 del asunto es un anticuerpo que se une específicamente a CD47 (es decir, un anticuerpo anti-CD47) y reduce la interacción entre CD47 en una célula (por ejemplo, una célula infectada) e IRPa en otra célula (por ejemplo, una célula fagocítica). En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD47 adecuado no activa CD47 tras la unión. Los ejemplos no limitativos de anticuerpos adecuados incluyen los clones B6H12, 5F9, 8B6 y C3 (por ejemplo, como se describe en la Publicación de Patente Internacional WO 201 1/143624)

Anticuerpos anti-SIRPa. En algunas realizaciones, un agente anti-CD47 del asunto es un anticuerpo que se une específicamente a IRPa (es decir, un anticuerpo anti-SIRPa) y reduce la interacción entre CD47 en una célula (por ejemplo, una célula infectada) e IRPa en otra célula (por ejemplo, una célula fagocítica). Los anticuerpos anti-SIRPa adecuados pueden unirse a IRPa sin activar o estimular la señalización a través de IRPa porque la activación de IRPa inhibiría la fagocitosis. En cambio, los anticuerpos anti-SIRPa adecuados facilitan la fagocitosis preferencial de las células infectadas sobre las células no infectadas. Las células que expresan niveles más altos de CD47 (por ejemplo, células infectadas) con respecto a otras células (células no infectadas) se fagocitarán preferentemente. Por tanto, un anticuerpo anti-SIRPa adecuado se une específicamente a IRPa sin activar/estimular una respuesta de señalización suficiente para inhibir la fagocitosis.

Los anticuerpos adecuados incluyen versiones completamente humanas, humanizadas o quiméricas de tales anticuerpos. Los anticuerpos humanizados son especialmente útiles para aplicaciones in vivo en humanos debido a su baja antigenicidad. De manera similar, los anticuerpos caninizados, felinizados, etc. son especialmente útiles para aplicaciones en perros, gatos y otras especies, respectivamente.

Métodos

Se proporcionan métodos para tratar o reducir la aterosclerosis administrando un agente a un individuo que aumenta la eferocitosis de los componentes celulares de la placa coronaria o extracardiaca, incluyendo la eferocitosis de las células apoptóticas del músculo liso. En algunas realizaciones, el individuo es homocigoto o heterocigoto para un alelo de riesgo 9p21. En algunas realizaciones, el agente que aumenta la eferocitosis proporciona una o más de las siguientes actividades: reduce la unión de CD47 a SIRPa; aumenta o imita la actividad de la calreticulina, incluyendo la unión de calreticulina a LRP; o aumenta la expresión de CDKN2B. Tales métodos incluyen administrar a un sujeto con necesidad de tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz o una dosis eficaz de un agente estimulante de la eferocitosis, incluyendo sin limitación, combinaciones del agente con otro fármaco. Son de interés los métodos de administración al sistema cardiovascular, aunque las formulaciones orales también pueden ser útiles.

Las dosis eficaces de la entidad terapéutica de la presente invención varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo la naturaleza del agente, los medios de administración, el sitio objetivo, el estado fisiológico del paciente, si el paciente es humano o un animal, otros medicamentos administrados, y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Habitualmente, el paciente es un humano, pero también pueden tratarse mamíferos no humanos, por ejemplo, animales de compañía como perros, gatos, caballos, etc., mamíferos de laboratorio como conejos, ratones, ratas, etc., y similares. Las dosificaciones de tratamiento pueden ajustarse para optimizar la seguridad y la eficacia.

En algunas realizaciones, la dosificación terapéutica puede variar de aproximadamente 0,0001 a 500 mg/kg, y más habitualmente de 0,01 a 100 mg/kg, del peso corporal del huésped. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-50 mg/kg. La dosificación puede ajustarse para el peso molecular del reactivo. Un régimen de tratamiento ejemplar implica la administración diaria, bisemanal, semanal, una vez cada dos semanas, una vez al mes, etc. En otro ejemplo, el tratamiento puede administrarse como una infusión continua. Las entidades terapéuticas de la presente invención se administran habitualmente en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosis individuales pueden ser semanales, mensuales o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares como se indica midiendo los niveles sanguíneos de la entidad terapéutica en el paciente. Alternativamente, las entidades terapéuticas de la presente invención pueden administrarse como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia varían dependiendo de la vida media del polipéptido en el paciente. Un experto en la técnica entenderá que dichas pautas se ajustarán al peso molecular del agente activo, por ejemplo, en el uso de fragmentos de polipéptidos, en el uso de conjugados de anticuerpos, en el uso de reactivos de IRPa de alta afinidad, etc. La dosificación también puede variarse para administración localizada, o para administración sistémica, por ejemplo, i.m., i.p., i.v., y similares.

Para el tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada del agente dependerá de la gravedad y el curso de la enfermedad, si el agente se administra con propósitos preventivos, terapia previa, el historial clínico del paciente y la respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico tratante. El agente se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos.

Pueden proporcionarse agentes adecuados en composiciones farmacéuticas adecuadas para uso terapéutico, por ejemplo, para tratamiento humano. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen una o más entidades terapéuticas de la presente invención o sales, ésteres o solvatos farmacéuticamente aceptables de los mismos. En algunas otras realizaciones, el uso de un agente estimulante de la eferocitosis incluye el uso en combinación con otro agente terapéutico, por ejemplo, fármacos útiles en el tratamiento de la aterosclerosis. Tales combinaciones pueden incluir, sin limitación, estatinas. Las estatinas son inhibidores de la enzima reductasa HMG-CoA. Estos agentes se describen con detalle; por ejemplo, mevastatina y compuestos relacionados como se divulga en la Patente de Estados Unidos N° 3.983.140; lovastatina (mevinolina) y compuestos relacionados como se divulga en la Patente de Estados Unidos N° 4.231.938; pravastatina y compuestos relacionados como se divulga en la Patente de Estados Unidos N° 4.346.227; simvastatina y compuestos relacionados como se divulga en las Patentes de Estados Unidos N° 4.448.784 y 4.450.171; fluvastatina y compuestos relacionados como se divulga en la Patente de Estados Unidos N° 5.354.772; atorvastatina y compuestos relacionados como se divulga en las Patentes de Estados Unidos N° 4.681.893, 5.273.995 y 5.969.156; y cerivastatina y compuestos relacionados como se divulga en las Patentes de Estados Unidos N° 5.006.530 y 5,177,080. Agentes y compuestos adicionales se divulgan en las Patentes de Estados Unidos N° 5.208.258, 5.130.306, 5.116.870, 5.049.696, RE 36.481 y RE 36.520. Las estatinas incluyen las sales y/o ésteres de las mismas.

Otros fármacos útiles en combinación incluyen, por ejemplo, fibratos como gemfibrozilo, fenofibrato, etc.; niacina; zetia; secuestrantes de ácidos biliares, por ejemplo, colestiramina, colestipol, colesevelam; lovaza, vascepa; fármacos para reducir la hipertensión, etc.

Las formulaciones terapéuticas que comprenden uno o más agentes de la invención se preparan para el almacenamiento mezclando el agente que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980).)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. La composición del agente se formulará, dosificará y administrará de manera consistente con la buena práctica médica. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el lugar de administración del agente, el método de administración, la programación de la administración, y otros factores conocidos por los practicantes médicos. La "cantidad terapéuticamente eficaz" del agente a administrar se regirá por tales consideraciones, y es la cantidad mínima necesaria para tratar o prevenir la aterosclerosis.

El agente puede administrarse por cualquier medio adecuado, incluyendo tópico, oral, parenteral, subcutáneo, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratecal o subcutánea. Además, el agente puede administrarse adecuadamente mediante infusión de pulso, particularmente con dosis decrecientes del agente.

El agente no necesita estar, pero opcionalmente está formulado con uno o más agentes que potencian la actividad, o que aumentan de otro modo el efecto terapéutico. Estos se usan generalmente en las mismas dosificaciones y con las vías de administración que se usaron anteriormente en la presente o aproximadamente del 1 al 99% de las dosificaciones empleadas hasta ahora.

Un agente se administra a menudo como una composición farmacéutica que comprende un agente terapéutico activo y otro excipiente farmacéuticamente aceptable. La forma preferida depende del modo de administración y la aplicación terapéutica pretendidos. Las composiciones también pueden incluir, dependiendo de la formulación deseada, portadores o diluyentes no tóxicos farmacéuticamente aceptables, que se definen como vehículos comúnmente usados para formular composiciones farmacéuticas para la administración animal o humana. El diluyente se selecciona para no afectar a la actividad biológica de la combinación. Ejemplos de tales diluyentes son agua destilada, solución salina fisiológica tamponada con fosfato, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica también puede incluir otros portadores, adyuvantes, o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos y similares.

En otras realizaciones más, las composiciones farmacéuticas también pueden incluir macromoléculas metabolizadas lentamente grandes, como proteínas, polisacáridos como quitosano, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos y copolímeros (como Sepharose™ funcionalizada con látex, agarosa, celulosa y similares), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y agregados lipídicos (como gotitas de aceite o liposomas).

Un portador puede llevar los agentes de varias maneras, incluyendo unión covalente, ya sea directamente o mediante un grupo conector, y asociaciones no covalentes. Los portadores de enlace covalente adecuados incluyen proteínas como albúminas, péptidos y polisacáridos como aminodextrano, cada uno de los cuales tiene múltiples sitios para la unión de fracciones. Un portador también puede llevar un agente anti-CD47 mediante asociaciones no covalentes como enlaces no covalentes o por encapsulación. La naturaleza del portador puede ser o soluble o insoluble para los propósitos de la invención. Los expertos en la técnica conocerán otros portadores adecuados para unir agentes anti-CD47, o podrán determinarlos usando experimentación rutinaria.

Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo el ácido ascórbico y la metionina; conservantes (como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y mcresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; azúcares como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales como el sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o surfactantes no iónicos como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG). Las formulaciones para ser usadas para administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

Los ingredientes activos también pueden quedar atrapados en una microcápsula preparada, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsula de gelatina y microcápsula de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se divulgan en la 16a edición de Remington's Pharmaceutical Sciences, Osol, A. Ed. (1980)

Los portadores y conectores específicos para agentes radionúclidos incluyen moléculas pequeñas radiohalogenadas y compuestos quelantes. Se puede formar un quelato de radionúclidos a partir de compuestos quelantes que incluyen aquellos que contienen átomos de nitrógeno y azufre como átomos donadores para unir el radionúclido metálico, o de óxido de metal.

Las fracciones radiográficas para su uso como fracciones de obtención de imágenes en la presente invención incluyen compuestos y quelatos con átomos relativamente grandes como oro, iridio, tecnecio, bario, talio, yodo y sus isótopos. Se prefiere que en los métodos de la invención se utilicen fracciones de obtención de imágenes radiográficas menos tóxicas, como yodo o isótopos de yodo. Tales fracciones pueden conjugarse con el agente anti-CD47 a través de un conector químico o portador quelante. Las fracciones emisoras de positrones para su uso en la presente invención incluyen 18F, que pueden conjugarse fácilmente mediante una reacción de fluoración con el agente.

Típicamente, las composiciones se preparan como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse o encapsularse en liposomas o micropartículas como polilactida, poliglicólido o copolímero para un efecto adyuvante mejorado, como se ha tratado anteriormente. Langer, Science 249: 1527, 1990 y Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119, 1997. Los agentes de esta invención pueden administrarse en forma de una inyección de depósito o preparación de implante que puede formularse de manera tal que permita una liberación sostenida o pulsátil del ingrediente activo. Las composiciones farmacéuticas se formulan generalmente como estériles, sustancialmente isotónicas y en total conformidad con todas las regulaciones de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) de la Food and Drug Administration de los Estados Unidos.

La toxicidad de los agentes puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, determinando la LD⁵⁰ (la dosis letal para el 50% de la población) o la LD¹⁰⁰ (la dosis letal para el 100% de la población). La proporción de dosis entre el efecto tóxico y el terapéutico es el índice terapéutico. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificación que no sea tóxico para su uso en humanos. La dosificación de las proteínas descritas en la presente se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la dosis eficaz con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. La formulación exacta, la vía de administración y la dosificación pueden ser elegidas por el médico individual en vista de la condición del paciente.

Selección genética

En un aspecto de la presente invención, se analiza un individuo para detectar la presencia de un alelo de riesgo 9p21 antes del tratamiento. Tales métodos comprenden un análisis de ADN genómico en un individuo para un alelo 9p21 que confiere una susceptibilidad aumentada a la aterosclerosis. Los individuos se seleccionan analizando su secuencia genómica en 9p21, por ejemplo, rs10757278 o rs1333049 u otras secuencias de SNP 9p21 representativas para detectar la presencia de un alelo predisponente, en comparación con una secuencia normal.

Se usan una serie de métodos para determinar la presencia de una variante predisponente en un individuo. El ADN genómico se aísla del individuo o individuos que se van a analizar. El ADN puede aislarse de cualquier fuente celular nucleada como sangre, hebras capilares, saliva, mucosa, biopsia, heces, etc. Los métodos que usan la amplificación por PCR pueden realizarse en el ADN de una única célula, aunque es conveniente usar por lo menos aproximadamente 10⁵ células. Cuando hay disponibles grandes cantidades de ADN, se usa directamente el ADN genómico. Alternativamente, la región de interés se clona en un vector adecuado y se cultiva en cantidad suficiente para el análisis, o se amplifica mediante técnicas convencionales. De particular interés es el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar el ADN que se encuentra entre dos cebadores específicos. El uso de la reacción en cadena de la polimerasa se describe en Saiki et al. (1985) Science 239:487, y una revisión de las técnicas actuales puede encontrarse en McPherson et al. (2000) PCR (Basics: From Background to Bench) Springer Verlag; ISBN: 0387916008. Puede incluirse un marcador detectable en la reacción de amplificación. Los marcadores adecuados incluyen fluorocromos, por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina, rojo Texas, ficoeritrina, aloficocianina, 6-carboxifluoresceína (6-FAM), 2',7'-dimetoxi-4',5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxi-2',4',7',4,7-hexaclorofluoresceína (HEX), 5-carboxifluoresceína (5-FAM) o N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), marcadores radiactivos, por ejemplo ³²P, ³⁵S, ³H; etc. El marcador puede ser un sistema de dos etapas, donde el ADN amplificado se conjuga con biotina, haptenos, etc. que tienen un compañero de unión de alta afinidad, por ejemplo avidina, anticuerpos específicos, etc. donde el compañero de unión se conjuga con un marcador detectable. El marcador puede conjugarse con uno o ambos cebadores. Alternativamente, el conjunto de nucleótidos usados en la amplificación está marcado, para incorporar el marcador en el producto de amplificación.

Los pares de cebadores se seleccionan de la secuencia genómica usando criterios convencionales para la selección. Los cebadores en un par se hibridarán con cadenas opuestas y flanquearán colectivamente la región de interés. Los cebadores hibridarán con la secuencia complementaria bajo condiciones rigurosas, y generalmente tendrán por lo menos aproximadamente 16 nt de longitud y pueden tener 20, 25 o 30 nucleótidos de longitud. Los cebadores se seleccionarán para amplificar la región específica sospechosa de contener la mutación predisponente. Típicamente, la longitud del fragmento amplificado se seleccionará para permitir la discriminación entre repeticiones de 3 a 7 unidades. Puede realizarse una amplificación multiplex en la que varios conjuntos de cebadores se combinan en el mismo tubo de reacción, para analizar múltiples exones simultáneamente. Cada cebador puede conjugarse con un marcador diferente.

La composición exacta de las secuencias del cebador no es crítica para la invención, pero deben hibridarse con las secuencias flanqueantes bajo condiciones rigurosas. Los criterios para la selección de cebadores de amplificación son como se ha tratado anteriormente. Para maximizar la resolución de las diferencias de tamaño en el locus, es preferible elegir una secuencia de cebador que esté cerca de la secuencia SNP, de tal manera que el producto de amplificación total sea por lo menos aproximadamente 30, más habitualmente por lo menos aproximadamente 50, preferiblemente por lo menos aproximadamente 100 o 200 nucleótidos de longitud, que variarán con el número de repeticiones que están presentes, a no más de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud. Se ha descubierto que el número de repeticiones es polimórfico, como se ha descrito anteriormente, generando de este modo diferencias individuales en la longitud del ADN que se encuentra entre los cebadores de amplificación. Convenientemente, se incluye un marcador detectable en la reacción de amplificación. Puede realizarse una amplificación multiplex en la cual varios conjuntos de cebadores se combinan en el mismo tubo de reacción. Esto es particularmente ventajoso cuando para el análisis hay disponibles cantidades limitadas de muestra de ADN. Convenientemente, cada uno de los conjuntos de cebadores está marcado con un fluorocromo diferente.

Después de la amplificación, los productos pueden fraccionarse por tamaño. El fraccionamiento puede realizarse mediante electroforesis en gel, particularmente desnaturalizando geles de acrilamida o agarosa. Un sistema conveniente usa geles de poliacrilamida desnaturalizantes en combinación con un secuenciador de ADN automatizado, ver Hunkapillar et al. (1991) Science 254:59-74. El secuenciador automatizado es particularmente útil con la amplificación multiplex o productos agrupados de reacciones de PCR separadas. La electroforesis capilar también puede usarse para fraccionamiento. Una revisión de la electroforesis capilar puede encontrarse en Landers, et al. (1993) BioTechniques 14:98-111. El tamaño del producto de amplificación es proporcional al número de repeticiones (n) que están presentes en el locus especificado por los cebadores. El tamaño será polimórfico en la población y es, por lo tanto, un marcador alélico para ese locus. El fragmento amplificado o clonado se secuencia alternativamente mediante varios métodos altos conocidos en la técnica.

La presencia de un alelo de riesgo predisponente es indicativa de que un individuo tiene un mayor riesgo de desarrollar aterosclerosis y puede beneficiarse del tratamiento con los métodos de la invención, aunque los métodos pueden encontrar uso adicionalmente en individuos sin un factor de riesgo genético 9p21. El diagnóstico de una predisposición a la enfermedad permite al individuo afectado buscar tratamiento temprano de posibles lesiones y evitar actividades que aumentan el riesgo de enfermedad cardiovascular.

Selección de fármacos

Los ensayos de selección identifican compuestos que modulan la expresión o la actividad de proteínas involucradas en la eferocitosis, incluyendo sin limitación, CDKN2B, calreticulina, CD47, SIRPa, etc. Un agente estimulador de la eferocitosis puede, por ejemplo, actuar como la base para la mejora de enfermedades cardiovasculares como la aterosclerosis, isquemia/reperfusión, hipertensión, reestenosis e inflamación arterial. Tales compuestos pueden incluir, pero no están limitados a, péptidos, anticuerpos o compuestos orgánicos o inorgánicos pequeños. Los métodos para la identificación de tales compuestos se describen a continuación.

Los sistemas basados en células y animales pueden actuar como modelos para enfermedad cardiovascular y son útiles en tal selección de fármacos. Los modelos basados en animales y células pueden usarse para identificar fármacos, productos farmacéuticos, terapias e intervenciones que son eficaces en el tratamiento de la enfermedad cardiovascular. Además, tales modelos animales pueden usarse para determinar la LD⁵⁰ y la ED⁵⁰ en sujetos animales, y tales datos pueden usarse para determinar la eficacia in vivo de posibles tratamientos para enfermedades cardiovasculares. Los sistemas de modelos basados en animales de enfermedad cardiovascular pueden incluir, pero no están limitados a, animales transgénicos no recombinantes y diseñados genéticamente. Los modelos animales no recombinantes, no genéticos de aterosclerosis pueden incluir, por ejemplo, modelos de cerdo, conejo o rata en los que el animal ha estado expuesto a lesiones químicas a través de suplementos dietéticos de LDL, o lesiones mecánicas a través de angioplastia con catéter con balón, por ejemplo. Adicionalmente, los modelos animales que muestran síntomas de enfermedades cardiovasculares pueden diseñarse utilizando, por ejemplo, el marcado de células del músculo liso, exclusión de CDKN2B, etc. secuencias de génicas junto con técnicas para producir animales transgénicos que son bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias génicas objetivo pueden introducirse y excluirse o sobreexpresarse en el genoma del animal de interés. Pueden usarse animales de cualquier especie incluyendo, pero no limitados a, ratones, ratas, conejos, cobayas, cerdos, microcerdos, cabras y primates no humanos, por ejemplo, babuinos, monos y chimpancés para generar modelos animales de enfermedades cardiovasculares.

Puede usarse cualquier técnica conocida en la técnica para introducir un transgén génico objetivo en animales para producir las líneas fundadoras de animales transgénicos. Tales técnicas incluyen, pero no están limitadas a, microinyección pronuclear (Hoppe, P.C. y Wagner, T.E., 1989, Patente de Estados Unidos N° 4.873.191); transferencia génica mediada por retrovirus en líneas germinales (Van der Putten et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6148-6152); direccionamiento genético en células madre embrionarias (Thompson et al., 1989, Cell 56:313-321); electroporación de embriones (Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3:1803-1814); y transferencia génica mediada por espermatozoides (Lavitrano et al., 1989, Cell 57:717-723); etc.

Los tipos celulares específicos dentro de los animales pueden analizarse y ensayarse para determinar los fenotipos celulares característicos de la enfermedad cardiovascular. En el caso de los monocitos, tales fenotipos pueden incluir, pero no están limitados a, aumentos en las tasas de captación de LDL, adhesión a las células endoteliales, transmigración, formación de células espumosas, formación de estrías grasas y producción de productos específicos de células espumosas. Además, tales fenotipos celulares pueden incluir un patrón de composición individual de un tipo de célula particular de expresión en comparación con los perfiles de expresión de composiciones individuales conocidos del tipo de célula particular en animales que muestran síntomas de enfermedad cardiovascular. La capacidad de las células del músculo liso para ser absorbidas por los fagocitos es de particular interés.

Las células que están reguladas por disminución en la actividad de CDKN2B pueden utilizarse para identificar compuestos que muestran actividad de enfermedad anti-cardiovascular. En el caso de los monocitos, tales fenotipos pueden incluir, pero no están limitados a, aumentos en las tasas de captación de LDL, adhesión a las células endoteliales, transmigración, formación de células espumosas, formación de estrías grasas, y producción por las células espumosas de factores de crecimiento como bFGF, IGF -I, VEGF, IL-1, M-CSF, TGFp, TGFa, TNFa, H^b -EGF, PDGF, IFN-^y y GM-CSF. Las tasas de transmigración, por ejemplo, pueden medirse usando un sistema in vitro para cuantificar el número de monocitos que migran a través de la monocapa endotelial y hacia la capa de colágeno del espacio subendotelial.

Los sistemas in vitro pueden diseñarse para identificar compuestos capaces de activar la eferocitosis. Tales compuestos pueden incluir, pero no están limitados a, péptidos hechos de aminoácidos de configuración D y/o L, fosfopéptidos, anticuerpos y moléculas orgánicas o inorgánicas pequeñas. El principio de los ensayos usados para identificar los compuestos que regulan por incremento CDKN2B o calreticulina implica la preparación de una mezcla de la reacción de la proteína y un compuesto de prueba en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que los dos componentes interactúen y detectar el cambio resultante en la actividad biológica deseada. Alternativamente, puede usarse un ensayo de unión simple como método de selección inicial. Estos ensayos pueden realizarse de varias maneras. Por ejemplo, un método para realizar dicho ensayo implicaría anclar una proteína o una sustancia de prueba sobre una fase sólida y detectar complejos anclados sobre la fase sólida al final de la reacción.

En un ensayo de unión, la reacción puede realizarse en una fase sólida o en fase líquida. En un ensayo en fase sólida, el componente no inmovilizado se añade a la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Después de que se ha completado la reacción, los componentes sin reaccionar se eliminan en condiciones tales que cualquier complejo formado permanecerá inmovilizado en la superficie sólida. La detección de complejos anclados en la superficie sólida puede lograrse de varias maneras. Cuando el componente previamente no inmovilizado está pre-marcado, la detección del marcador inmovilizado en la superficie indica que se formaron complejos. Cuando el componente previamente no inmovilizado no está pre-marcado, puede usarse un marcador indirecto para detectar complejos anclados en la superficie; por ejemplo, usando un anticuerpo marcado específico para el componente previamente no inmovilizado (el anticuerpo, a su vez, puede marcarse directamente o marcarse indirectamente con un anticuerpo anti-Ig marcado).

Alternativamente, puede realizarse una reacción de unión en una fase líquida, los productos de reacción separados de los componentes sin reaccionar y los complejos detectados; por ejemplo, usando un anticuerpo inmovilizado específico para el producto génico objetivo o el compuesto de prueba para anclar cualquier complejo formado en solución, y un anticuerpo marcado específico para el otro componente del posible complejo para detectar complejos anclados.

Los sistemas basados en células como los descritos anteriormente pueden usarse para identificar compuestos que actúan para mejorar los síntomas de la enfermedad cardiovascular. Por ejemplo, tales sistemas celulares pueden exponerse a un compuesto de prueba a una concentración suficiente y durante un tiempo suficiente para provocar tal mejora de los síntomas de la enfermedad cardiovascular en las células expuestas. Después de la exposición, se examinan las células para determinar si uno o más de los fenotipos celulares de la enfermedad cardiovascular han sido alterados para parecerse a un fenotipo de enfermedad no cardiovascular más normal o más salvaje.

Además, los sistemas de enfermedades basados en animales, como los descritos anteriormente, pueden usarse para identificar compuestos capaces de mejorar los síntomas de la enfermedad. Tales modelos animales pueden usarse como sustratos de prueba para la identificación de fármacos, productos farmacéuticos, terapias e intervenciones, que pueden ser eficaces en el tratamiento de enfermedades. Por ejemplo, los modelos animales pueden exponerse a un compuesto, sospechoso de mostrar una capacidad para mejorar los síntomas de la enfermedad cardiovascular, a una concentración suficiente y durante un tiempo suficiente para provocar tal mejora de los síntomas de la enfermedad en los animales expuestos. La respuesta de los animales a la exposición puede monitorizarse evaluando la reversión de los trastornos asociados con la enfermedad, por ejemplo, contando el número de placas ateroscleróticas y/o midiendo su tamaño antes y después del tratamiento.

Con respecto a la intervención, cualquier tratamiento que revierta cualquier aspecto de los síntomas de la enfermedad cardiovascular debe considerarse como candidato para la intervención terapéutica de la enfermedad humana. Las dosificaciones de los agentes de prueba pueden determinarse derivando curvas de respuesta a la dosis.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD⁵⁰ (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED⁵⁰ (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la proporción de LD⁵⁰/ED⁵⁰. Se prefieren los compuestos que muestran grandes índices terapéuticos. Aunque pueden usarse compuestos que muestran efectos secundarios tóxicos, se debe tener cuidado al diseñar un sistema de administración que dirija dichos compuestos al sitio del tejido afectado para minimizar el daño potencial a las células no infectadas y reducir, de este modo, los efectos secundarios.

Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosis para uso en humanos. La dosificación de tales compuestos reside preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluye la ED⁵⁰ con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Una dosis puede formularse en modelos animales para lograr un rango de concentración en plasma circulante que incluya el IC⁵⁰ (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición de síntomas semimáxima) como se determina en cultivo celular. Dicha información puede usarse para determinar con mayor precisión las dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alto rendimiento.

Ahora que se ha descrito completamente la invención, será evidente para un experto en la técnica que pueden hacerse varios cambios y modificaciones.

EXPERIMENTAL

Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y una descripción completas de cómo elaborar y usar la presente invención, y no se pretende que limiten el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni se pretende que representen que los siguientes experimentos sean todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio ponderado, la temperatura está en grados centígrados, y la presión es, o está cerca de, la presión atmosférica.

La presente invención se ha descrito en términos de realizaciones particulares encontradas o propuestas por el presente inventor para comprender modos preferidos para la puesta en práctica de la invención. Los expertos en la técnica apreciarán que, a la luz de la presente divulgación, pueden realizarse numerosas modificaciones y cambios en las realizaciones particulares ejemplificadas sin apartarse del alcance pretendido de la invención. Por ejemplo, debido a la redundancia de codones, pueden hacerse cambios en la secuencia de ADN subyacente sin afectar a la secuencia de proteínas. Además, debido a consideraciones de equivalencia funcional biológica, pueden hacerse cambios en la estructura de la proteína sin afectar a la acción biológica en tipo o cantidad. Se pretende que todas estas modificaciones estén incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1

CDKN2B regula la eferocitosis y la aterosclerosis

Los mecanismos por los cuales la variación genética en el locus de riesgo 9p21.3 del cromosoma promueve la enfermedad cardiovascular siguen sin estar claros. Con anterioridad, se ha informado que la pérdida de un gen candidato en este locus, Cdkn2b, promovió la apoptosis de las células del músculo liso vascular (SMC) y la progresión del aneurisma. En la presente investigamos la posible relación de estos descubrimientos con la aterogénesis, y mostramos que los ratones Cdkn2bl~, ApoE-1- desarrollan placas ateroscleróticas avanzadas compuestas de núcleos necróticos grandes. Para explicar esta observación, mostramos que la pérdida de CDKN2B deteriora la expresión de calreticulina, un ligando requerido para la activación de los receptores de reabsorción en las células fagocíticas. Como resultado, los cuerpos apoptóticos deficientes en CDKN2B se vuelven resistentes a la eferocitosis, y los macrófagos colindantes no los depuran de manera eficiente. Estas SMC no depuradas provocan una serie de respuestas paracrinas pro-aterogénicas, y están asociadas con una formación de células espumosas aumentada y la elaboración de citoquinas inflamatorias. En total, estos datos sugieren que un mecanismo por el cual la pérdida de CDKN2B promueve la aterosclerosis es aumentando el tamaño y la complejidad del núcleo necrótico cargado de lípidos a través de la eferocitosis deteriorada.

CDKN2B es un inhibidor del ciclo celular bien descrito que se pierde frecuentemente durante la transformación maligna, pero que no se había implicado anteriormente en la enfermedad vascular. Recientemente se ha informado que CDKN2B desempeña un papel en la fisiología vascular de SMC, y que los ratones knockout Cdkn2b desarrollan aneurismas avanzados relacionados con la apoptosis acelerada de SMC y el adelgazamiento medial (Leeper et al. (2013) Arterioscler Thromb Vasc Biol 33:e1-e10). Sin embargo, los mecanismos por los cuales 9p21 promueven la enfermedad coronaria siguen sin estar claros y son objeto de debate.

Resultados:

La Cdkn2b regula el tamaño de la lesión aterosclerótica y las características de vulnerabilidad de la placa in vivo. Para estudiar el efecto de Cdkn2b sobre la aterosclerosis in vivo, evaluamos un total de 44 ratones Cdkn2b-l-, ApoE-/- y Cdkn2b+/+■ ApoE-/- macho después de 12 semanas de dieta occidental alta en grasas. La carga aterosclerótica total aumentó en los animales Cdkn2b^-, ApoE-/-, medido por el área positiva de Aceite-Rojo-O (ORO) dentro del seno aórtico (aumento del 34%, P=0,001, Figura 1A). Adicionalmente, estas lesiones mostraron varias características de vulnerabilidad de la placa, incluyendo un contenido reducido de alfa actina del músculo liso (SMA) (reducción del 34,0%, P <0,02, Figura 1B) y núcleos necróticos más grandes (aumento del 37%, P <0,03, Figura 1C y Fig. 7A), sin cambios en la tinción de Mac-3 (P=0,26, Figura 1D). Se observaron descubrimientos similares en la arteria braquiocefálica, donde las lesiones de Cdkn2b-/-, ApoE-/- mostraron un contenido de colágeno disminuido (reducción del 50,2%, P<0,05, Figura 1F), contenido reducido de SMA (34,1%, P <0,02, Figura 1G) y adelgazamiento de la capa fibrosa que recubre el núcleo necrótico de la lesión (reducción del 54,2%, P < 0,04, Figura 1H). No se observó ningún cambio en el contenido de macrófagos entre los genotipos (P=0,89, Figura 11). En este punto final terminal, había muy pocas células TUNEL positivas (~0-2/sección), y no se observó diferencia en la apoptosis entre genotipos (aumento del 38,5% en células TUNEL positivas, P=0,54, Figura 1E). Por el contrario, los ratones Cdkn2b-l-, ApoE-/- infundidos con Angiotensina II durante 72 horas en un punto de temporal temprano (dieta occidental de 4 semanas) mostraron un aumento del 97% en las células apoptóticas, con respecto al control (P=0,06, Fig. 7B). La expresión compensatoria de otros genes del locus 9p21 se proporciona en la Fig. 7C. No se observaron diferencias en los niveles de glucosa o lípidos entre los genotipos (Fig. 7D).

La expresión reducida de CDKN2B está asociada con la expresión reducida del ligando del receptor de fagocitos, calreticulina, en la placa aterosclerótica de la arteria coronaria humana, SMC vasculares humanas y de aorta de ratón. Para explicar los núcleos necróticos más grandes observados en los ratones Cdkn2b-/-, ApoE-/-, evaluamos a continuación la expresión de varias moléculas pro- y anti-fagocíticas (conocidas como ligandos "cómeme" y "no me comas", respectivamente) en 51 secciones de arterias coronarias humanas con y sin lesiones ateroscleróticas. Primero evaluamos la relación entre CDKN2B y 28 genes que se han implicado anteriormente en la depuración de los desechos apoptóticos, un proceso conocido como 'eferocitosis'.

El análisis de la red de coexpresión génica ponderado reveló dos módulos de expresión génica de eferocitosis (Figura 8A) El módulo que contiene CDKN2B tuvo una expresión significativamente más baja, como se cuantificó por análisis de autogenes del módulo, en muestras con lesiones ateroscleróticas que en aquellas sin lesiones ateroscleróticas (expresión log² 0,16 frente a. 0,27, para muestras con y sin lesiones, respectivamente, P=0,00000016, Figura 2A): Luego usamos la agrupación de expresión sin tratamiento anterior de todas las 20.226 transcripciones anotadas en la matriz en 51 módulos usando análisis de coexpresión génica ponderado para identificar genes que comparten topología de coexpresión local con CDKN2B.

De los genes de eferocitosis candidatos, en el módulo de coexpresión al que se asignó CDKN2B solo se encontró calreticulina (CALR), un ligando receptor de fagocitos clave, (Figura 2B, resumen de genes y módulos global en la Tabla 1). CALR se correlacionó positivamente con la expresión de CDKN2B (rho2=0,32, P=0,02, Figura 2C), de modo que los pacientes con CDKN2B vascular deteriorado también tenían una expresión reducida de CALR, in vivo. Se observaron descubrimientos similares en SMC de arteria coronaria humana deficiente en CDKN2B (siCDKN2B) (HCASMC) al inicio del estudio y durante la apoptosis, in vitro (P <0,01 cada uno, Figura 2D y Figuras 8D-E), y en tejido aórtico y renal de Cdkn2b-/-, in vivo (P <0,01 cada uno, Figura 2E) La inmunotinción semicuantitativa confirmó la regulación por disminución de CALR en la placa aterosclerótica de ratones Cdkn2b-/-, ApoE-/- (Figura 2F).

La expresión de calreticulina está regulada por una vía que incluye CDKN2B, retinoblastoma y E2F4. Para investigar el vínculo molecular entre CDKN2B y CALR, examinamos luego el promotor de CALR para determinar los sitios de unión del factor de transcripción putativo (TF) que podrían estar relacionados con la vía de CDKN2B (Figura 9A) El E2F4, un factor de transcripción inhibidor en sentido descendente de TGF-^, CDKN2B y retinoblastoma (Rb), se identificó como un elemento regulador candidato por varios algoritmos de predicción de TF (Figura 3A). Los ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA) revelaron que el sitio de unión de E2F4 superior dentro del promotor CALR (-150 pb de TSS, Figura 9C) unía proteínas nucleares de HCASMC, in vitro (Figura 3B, flecha negra). El patrón de unión fue similar al observado en una reacción que contenía un sitio de unión de E2F4 de control positivo (Figura 9D) La especificidad de esta reacción de unión se confirmó en competencia con la sonda promotora CALR sin marcar incluida en un exceso de 100x (Figura 3B, punta de flecha negra). Los estudios posteriores de inmunoprecipitación con cromatina (ChIP) confirmaron que esta secuencia se unía específicamente al factor de transcripción E2F4 en HCASMC, in vivo, con un enriquecimiento de 3,7 veces en comparación con el control de IgG (4,6 frente a 1,2% de entrada, P <0,01, Figura 3C).

Luego, se usaron ensayos del informador de promotor de luciferasa para demostrar que la actividad del promotor de CALR era dependiente tanto de CDKN2B como de Rb, donde las células HEK que sobreexpresan estos genes mostraron una actividad del promotor de CALR aumentada (aumento de 2,7-3,4 veces, P <0,01, Figura 3D, abajo), mientras que las células HEK transfectadas con siCDKN2B mostraron una actividad promotora de CALR reducida (reducción del 37%, P <0,01, Figura 3D, parte superior). Finalmente, demostramos que la expresión de CALR podría incrementarse en respuesta al tratamiento con TGF-p de una manera dependiente de la dosis, y que esta expresión se inhibió significativamente cuando la señalización de CDKN2B o Rb se vio afectada con ARNip (Figura 3E). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que la expresión de CALR está regulada por una cascada que involucra la citoquina vascular, TGF-p, el gen candidato relacionado con 9p21, CDKN2B, y el eje Rb-E2F4.

La expresión reducida de CDKN2B vuelve a las SMC resistentes a la depuración eferocítica tanto por fagocitos profesionales como no profesionales, sin alterar la capacidad fagocítica de las SMC colindantes. Para explorar las consecuencias fisiológicas de una pérdida de CDKN2B, realizamos a continuación una serie de ensayos de eferocitosis para investigar el impacto de este gen en la 'comestibilidad' de los cuerpos apoptóticos (AB) y la capacidad eferocítica de las células fagocíticas. En estos experimentos, las células de control o deficientes en CDKN2B se marcaron con fluorescencia verde, se volvieron apoptóticas, luego se co-cultivaron con fagocitos marcados con naranja antes del análisis de citometría de flujo. Los siCDKN2B HCASMC apoptópicas se depuraron de manera menos eficiente que los HCASMC transfectadas con control apoptótico (siCont) por fagocitos profesionales y no profesionales (52,4% menos de eferocitosis por macrófagos THP-1 transformados por PMA, P <0,01, Figura 4Ay 20,0% menos de eferocitosis por HCASMC colindantes no transpoptótico no transfectado, P <0.02, Figura 4B, respectivamente). Los ensayos de competición de fagocitosis confirmaron que siCDKN2B AB tenía menos probabilidades de ser reabsorbido que siCont AB en un ensayo de cocultivo simultáneo (19,1% menos células depuradas por HPF, P <0,02,Figura 4C). Todos los ensayos se repitieron y confirmaron con células primarias de músculo liso aórtico Cdkn2b-/- y Cdkn2b+/+ y macrófagos intraperitoneales estimulados con tioglicolato.

De manera importante, excluir CDKN2B en fagocitos no profesionales (por ejemplo, HCASMC) no tuvo ningún efecto sobre su capacidad de fagocitar AB co-cultivada (P=0,95, Figuras 10A-B) Los fagocitos profesionales (por ejemplo, RAW, THP-1 transformado con PMA, y macrófagos peritoneales murinos primarios) tenían una expresión de CDKN2B indetectable in vitro al inicio del estudio o después de la estimulación con LPS. La evaluación microscópica electrónica cualitativa reveló que las placas ateroscleróticas de los animales Cdkn2b~l-, ApoE-/-mostraron varias características de eferocitosis fallida, incluyendo grandes cantidades de células que habían progresado de cuerpos apoptóticos a necróticos, así como AB no asociados con un macrófago adyacente (Figura 4D y Figura 10C). Por el contrario, las placas de los ratones Cdkn2+/+■ ApoE-/- tenían menos desechos necróticos extracelulares y mostraban un número significativo de fagocitos que habían ingerido múltiples AB, lo que sugiere una depuración eficiente de las células moribundas.

Los macrófagos expuestos a SMC deficientes en CDKN2B regulan por disminución la vía de eflujo del colesterol dependiente de ABCA-1, muestran tasas aceleradas de transformación de células espumosas y secretan citoquinas pro-aterogénicas. Debido a que se ha demostrado previamente que la pérdida de la expresión del ligando de la eferocitosis en un AB altera el comportamiento del fagocito colindante, evaluamos luego los efectos paracrinos del AB deficiente en CDKN2B en los macrófagos cocultivados. En particular, nos centramos en la capacidad de los macrófagos para regular el manejo de los lípidos y la inflamación, ya que se sabe que estos procesos están relacionados con la eferocitosis. Los macrófagos RAW cocultivados con siCont SMC de apoptosis aumentaron su expresión de la molécula de transporte inverso de colesterol clave, Abca1, en comparación con el valor de referencia (15,9 veces más, p <0,001, Figura 5A, barra gris), como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, los macrófagos expuestos a SMC deficientes en CDKN2B de apoptosis mostraron un aumento mitigado (9,7 veces, P <0,001, barra negra). Este ensayo se confirmó con células de músculo liso aórtico Cdkn2b'/- y Cdkn2b+/+ primarias y macrófagos RAW. Se observó una reducción similar en el nivel de ARNm de Abca1 en el tejido aórtico de Cdkn2b~l-, ApoE-/-, con respecto a las aortas de control (reducción del 65%, p <0,01, Figura 5B)

Para evaluar la consecuencia fisiológica de esta reducción en Abca1, realizamos estudios de eflujo de colesterol radioactivo, y descubrimos que RAW cocultivado con siCont AB aumentó significativamente su eflujo de colesterol marcado con [3H] en comparación con el valor de referencia (aumento de 4,7 veces, P <0,001, Figura 5C, barra gris), pero que este cambio se mitigó cuando las células RAW se cocultivaron con AB de siCDKN2B (aumento de 2,9 veces, P=0,02, Figura 5C, barra negra). Consecuentemente, también observamos que los macrófagos cargados de colesterol expuestos a SMC deficientes en CDKN2B eran más propensos a asumir el fenotipo de las células espumosas, como se cuantificó por el contenido total de Aceite-Rojo-O en comparación con los macrófagos cocultivados con el AB de control (aumento de 2,9 veces en Área positiva ORO entre condiciones, P=0,03, Figura 5D). Por último, la consecuencia en sentido descendente de esta eferocitosis fallida y la formación acelerada de células espumosas fue la suposición de un perfil pro-aterogénico, donde los macrófagos cocultivados con SMC deficientes en CDKN2B secretaban niveles más altos de TNF-a y niveles más bajos de la citoquina antiinflamatoria, IL-10, con respecto a los macrófagos cocultivados con SMC transfectadas con control (aumento del 14,2% y disminución del 24,4%, P <0,01 para cada uno, respectivamente, Figuras 5E-F)

Comprender cómo el locus de riesgo cardiovascular 9p21 potencia la enfermedad ha resultado desafiante. El presente estudio demuestra cómo CDKN2B, un gen que puede estar desregulado en los portadores del alelo de riesgo 9p21, contribuye a este riesgo. Estos datos muestran que CDKN2B regula la eliminación de los desechos apoptóticos y, por tanto, altera la composición y el tamaño de la placa en desarrollo.

Primero, mostramos que la pérdida de Cdkn2b está asociada con lesiones ateroscleróticas avanzadas compuestas de núcleos necróticos cargados de lípidos grandes. En segundo lugar, mostramos que las SMC apoptóticas deficientes en CDKN2B resisten la depuración fagocítica, proporcionando una explicación de la aceleración observada en el crecimiento de la placa. Mecánicamente, mostramos que el TGF-p señala a través de una cascada dependiente de Rb para iniciar una firma de reconocimiento de fagocitos, pero esa pérdida de CDKN2B deteriora la expresión del ligando receptor de fagocitos clave, la calreticulina. Finalmente, mostramos que esto contribuye a la conversación cruzada en sentido descendente patológica con los macrófagos colindantes, reduce el transporte de colesterol inverso y promueve la inflamación y la generación de células espumosas. Tomados en conjunto, estos descubrimientos proporcionan información mecanicista sobre el componente hereditario de la enfermedad cardiovascular, explican cómo el mayor impacto de GWAS promueve el riesgo independientemente de los factores de riesgo clásicos y sirve como un objetivo para nuevas terapias traslacionales dirigidas contra los trastornos ateroscleróticos.

Se ha estimado que tantas como un millón de células experimentan muerte celular programada por segundo cada día en el cuerpo humano. A pesar de la frecuencia de este evento, las células apoptóticas rara vez se observan in vivo, incluso en órganos con altas tasas de renovación basal, como la médula ósea o el timo. Esta observación se atribuye al hecho de que los cuerpos apoptóticos son depurados rápida y eficientemente por tanto los fagocitos profesionales (es decir, macrófagos) como no profesionales (es decir, células colindantes). Anteriormente considerado un evento homeostático obligado, ahora se aprecia que el proceso de 'eferocitosis' (del griego: llevar a los muertos a la tumba) se produce como resultado de una señal paracrina altamente orquestada entre el AB y su fagocito potencial. Durante la muerte celular programada, las células de apoptosis secretan ligandos quimiotácticos "encuéntrame”, regulan por incremento ligandos "cómeme" de la superficie celular, y reprimen las señales inhibidoras "cómeme". Sorprendentemente, este proceso tiene lugar de una manera "inmunológicamente silenciosa", donde la ejecución con éxito del proceso de reabsorción desencadena un perfil de citoquinas antiinflamatorias del fagocito, presumiblemente como una señal de que no se requiere más activación inmune. Por el contrario, las células apoptóticas que evaden la depuración se vuelven rápidamente necróticas secundarias e inducen una 'respuesta de peligro' inflamatoria a medida que liberan contenido intracelular tóxico y antigénico que fue secuestrado previamente. La eferocitosis deteriorada se reconoce ahora como un importante impulsor de los trastornos autoinmunes, inflamatorios y malignos, donde se piensa que la vigilancia inmune fallida resulta de un desequilibrio en las formas pro- y anti-fagocitosis en las células objetivo.

La aterosclerosis es una afección en la que la apoptosis se acelera dramáticamente. Esto se complica por el hecho de que la eferocitosis puede reducirse en casi ~20 veces a medida que se desarrolla la placa aterosclerótica humana. La razón de este defecto no está clara, pero es probable que esté relacionada en parte con la competencia por los receptores de fagocitos por LDL oxidada y/o la generación de autoanticuerpos que enmascaran ligandos importantes de la superficie celular en el cuerpo apoptótico. Además, los modelos de aterosclerosis experimentales pueden acelerarse significativamente al inhibir la expresión de ligandos 'cómeme' en ratones, y estos animales muestran lesiones con núcleos necróticos avanzados repletos de cadáveres apoptóticos. La eferocitosis deteriorada tiene probablemente importantes consecuencias clínicas en la aterogénesis, dado que la depuración retrasada de las SMC moribundas se ha relacionado con la inflamación vascular y la desestabilización de la matriz, y que los desechos necróticos residuales se localizan frecuentemente en las regiones de la lesión más susceptibles a la ruptura. El hecho de que la pérdida deCdkn2b en ratones aumente el tamaño de la placa y su núcleo lipídico a la vez que reduce el grosor y la estabilidad de la tapa fibrosa puede explicar parcialmente el vínculo simultáneo en humanos entre 9p21 y tanto la carga total de CAD como los eventos clínicos agudos, como el infarto de miocardio. La eferocitosis deteriorada también puede promover la aterosclerosis secundariamente a través del fagocito.

La evidencia emergente ha revelado que el fenotipo de la célula de apoptosis puede tener un impacto dramático sobre el comportamiento del macrófago cercano y su capacidad final para mantener la homeostasis de los lípidos. Bajo condiciones fisiológicas, los macrófagos que se han acoplado con éxito en un cuerpo apoptótico regulan por incremento las vías de exportación transmembrana en sentido descendente de LRP-1 y una variedad de receptores nucleares, presumiblemente en preparación para la inminente duplicación de su contenido intracelular. Una molécula efectora clave en esta vía es ABCA1, que promueve el eflujo inverso de colesterol y es importante para limitar la acumulación local de colesterol en la línea de grasa. En el estudio actual, los macrófagos presentados con cuerpos apoptóticos deficientes en CDKN2B no pudieron activar esta vía y no pudieron procesar los lípidos oxidados de manera eficiente. Mecánicamente, esto probablemente se produjo porque las células deficientes en CDKN2B expresan niveles bajos de CALR, que es un ligando bien descrito para el receptor de LRP-1. Como consecuencia, estos macrófagos por lo demás sanos mostraron un aumento mitigado en la expresión de ABCA1 y eran más propensos a diferenciarse en células espumosas - un proceso que se reconoce como desadaptativo y proaterosclerótico. Por tanto, mientras que la capacidad eferocítica del fagocito no se ve alterada por su expresión de CDKN2B basal (Fig. 10B), su participación final en el proceso de aterogénesis depende en gran medida de si encuentra un AB 'normal' o uno que se ha vuelto 'no comestible' debido a la falta de CDKN2B (Figura 6)

Estos datos muestran que CDKN2B media sus efectos fagocíticos a través de la calreticulina. La calreticulina es una proteína chaperona de 46 kD conservada evolutivamente que regula una variedad de funciones celulares incluyendo la homeostasis del calcio, la adhesión celular, la curación de heridas, la inmunidad, la fibrosis y la respuesta al estrés. Además, la CALR se ha implicado como uno de los principales reguladores de la eferocitosis, y es un ligando de reabsorción crítico que es absolutamente requerido para la depuración fagocítica. Durante la apoptosis, CALR se co-localiza en la superficie de AB con fosfatidilserina expuesta y activa LRP-1 en la superficie del macrófago adyacente. Curiosamente, estudios anteriores han demostrado que los ratones deficientes en esta fenocopia del receptor de CALR incluyen varios aspectos del ratón deficiente en CDKN2B, incluyendo la propensión a desarrollar grandes aneurismas aórticos y placas ateroscleróticas avanzadas cargadas de lípidos, sin diferencias en los niveles de lipoproteínas plasmáticas (revisado en Boucher y Herz (2011) Biochem Pharmacol 81:1-5). Además, CALR también se ha identificado como un regulador clave de la vigilancia tumoral y la depuración de células malignas.

Varios agentes, incluyendo los inhibidores de la reductasa HMG-Co-A (estatinas), han demostrados que aumentan la fagocitosis, pero probablemente no al nivel requerido para la restauración del procesamiento celular fisiológico. Tales esfuerzos están ahora en marcha en el campo de la oncología, con la esperanza de desencadenar la eliminación de células que han evadido el sistema reticuloendotelial. Debido a que el locus 9p21 promueve el riesgo independientemente de todos los factores de riesgo clásicos, una terapia que promueve la eferocitosis puede proporcionar un beneficio incremental más allá de los antihipertensivos, los antidiabéticos y las terapias reductoras de lípidos. Los datos disponibles actualmente sugieren que CDKN2B media específicamente su efecto a través de la vía de eflujo de salida de colesterol LRP-1, ya que la pérdida de CDKN2B en el fondo transgénico de ApoE*3Leiden (una cepa que aumenta sus niveles de lípidos sistémicos en respuesta a la activación del receptor nuclear en sentido ascendente de Abca1) no se asoció con aterosclerosis avanzada en un estudio anterior. Dado que las terapias antiateroscleróticas de primera línea como la atorvastatina, la simvastatina y la rosuvastatina pueden suprimir la vía de ABCA1, los métodos para reactivar la expresión de este gen antiaterogénico crítico podrían ser particularmente deseables en los portadores del alelo de riesgo 9p21.

Métodos:

Estudios de aterosclerosis murina. Los animales usados en este estudio incluyeron ratones Cdkn2b+/+, ApoE-/- (n=27, Jackson Laboratory) y Cdkn2-/-, ApoE-/- (n=27) macho en un fondo C57BL/6, que fueron criados por nuestro laboratorio como se ha descrito anteriormente. A las 4 semanas de edad, los animales fueron destetados e iniciados con una dieta occidental alta en grasas (21% de grasa de leche anhidra, 19% de caseína y 0,15% de colesterol, Dyets N° 101511) durante las siguientes semanas. Los animales se observaron diariamente, y en el caso de muerte súbita prematura, se realizó una necropsia para determinar la causa de la muerte. El análisis de lípidos se realizó en ratones después de un ayuno nocturno, como se ha descrito anteriormente. En resumen, el colesterol total en plasma (CHOD-PAP; Roche Diagnostics), HDL (HDL-C-plus 2a generación; Roche Diagnostics) y las concentraciones de LDL (GPO-PAP; Roche Diagnostics) se midieron usando kits enzimáticos en un analizador automatizado (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La glucosa en ayunas se midió en sangre venosa de un pinchazo de la cola usando un glucómetro Freestyle y tiras de glucosa (Abbott). A las 16 semanas de edad, se sacrificaron los ratones y se aislaron las aortas y se procesaron para su análisis. A un subconjunto de diez ratones se les implantó minibombas osmóticas subcutáneas (Alzet, Modelo 2004) después de solo cuatro semanas de dieta alta en grasas, para administrar 1,4 mg/kg/día de Angiotensina II durante 72 horas antes del sacrificio para mejorar la lesión vascular en lesiones ateroscleróticas tempranas. Todos los estudios fueron aprobados por el Panel Administrativo de la Universidad de Stanford sobre Cuidado de Animales de Laboratorio y se ajustan a la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos.

Preparación de tejido aórtico y braquiocefálico, inmunohistoquímica y cuantificación de lesiones ateroscleróticas. El área de la lesión de ateroesclerosis aórtica se determinó como se ha descrito anteriormente. Brevemente, el árbol arterial se perfundió con PBS (pH 7,3) y luego se fijó la perfusión con paraformaldehído tamponado con fosfato (3%, pH 7,3). Se expusieron el corazón y la longitud total de la bifurcación de aorta a ilíaca y se diseccionaron cuidadosamente de cualquier tejido circundante. Luego se abrieron las aortas a lo largo de la línea media ventral y se diseccionaron para liberarlas del animal y se fijaron en plano, con el lado intimal hacia arriba, sobre cera negra. Las imágenes aórticas se capturaron con una cámara digital montada en un microscopio estereoscópico Nikon y se analizaron con el software Adobe Photoshop CS5. El porcentaje del área de la lesión se calculó como el área total de la lesión dividida por el área total de la superficie. Las lesiones ateroscleróticas en el área de la válvula aórtica y la arteria braquiocefálica proximal se analizaron como se ha descrito anteriormente. Las muestras se perfundieron con PBS, se fijaron con paraformaldehído (4%), se incrustaron en OCT y se seccionaron a un grosor de 7 gM. Se recogieron tres secciones a intervalos de 100 gM de cada ratón y se tiñeron con Aceite RojoO (Sigma-Aldrich, O0625), Tricromo Masson (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), rojo Picrosiruis (Polysciences, # 24901), hematoxilina y eosina (H&E), a-actina del músculo liso (SMA, Abcam, ab5694, 1:300), Mac-3 (B^d Sciences BD 550292, 1:75), Cd-3 (Abcam, ab5690, 1: 150) y Calreticulina (Abcam, ab2907, 1:300). Los anticuerpos secundarios biotinilados seguidos de sustrato de fosfatasa de avidina-biotina-alcalina se usaron como se ha descrito anteriormente.

La apoptosis in vivo se evaluó mediante tinción para la positividad de TUNEL con el Kit de detección de muerte celular (Roche), según el protocolo. La proliferación celular se midió mediante tinción con PCNA (Abcam, ab2426, 1:500). La celularidad del vaso se midió contando manualmente núcleos de secciones teñidas con DAPI. Los controles negativos se realizaron con la omisión del anticuerpo primario. Las áreas de lesión se midieron y cuantificaron usando Adobe Photoshop. Las características de la vulnerabilidad de la placa aterosclerótica se evaluaron como se ha descrito anteriormente. Brevemente, el tamaño del núcleo necrótico se midió calculando el porcentaje de la lesión que era acelular en la tinción H&E. El grosor de la tapa se midió colocando un compás de 12 puntos en el centro del vaso sanguíneo y promediando el grosor de la tapa en cada punto a medida que cruzaba la lesión. La cobertura de la tapa SMC se midió calculando el porcentaje de la superficie de la tapa fibrosa que se tiñó positivamente para SMA-actina. Otras características estándar se evaluaron como se describe. Las muestras recogidas de varios lechos de tejido también se congelaron al instante en nitrógeno líquido para el posterior análisis de expresión génica, como se describe a continuación. La microscopía electrónica se realizó en la Cell Sciences Imaging Facility por el Stanford Electron Microscopy Core en un Jeol TEM1230.

Recogida de placa aterosclerótica humana y análisis de red de coexpresión génica. Los detalles de la recolegida de muestras, el aislamiento de ARN y la hibridación de micromatrices se han descrito previamente. Brevemente, se recogieron arterias coronarias epicárdicas por disección de corazones explantados de 22 donantes pacientes para trasplante cardíaco ortotópico. Los segmentos arteriales se identificaron como que contenían lesiones ateroscleróticas (n=38) o no (n=13) mediante inspección microscópica. El ARN se aisló de cada muestra y se hibridó a una micromatriz de expresión de genes con doble colorante personalizado (Agilent; Palo Alto, CA) que representa 20.226 transcritos identificados mediante clones desecuenciación de células vasculares estimuladas, revisión de bibliografía para genes importantes para la función cardiovascular y combinación con un conjunto de clones comerciales (Incyte). Las matrices se escanearon usando el sistema de escáner de micromatrices de Agilent G2565AA y se usó el software de extracción de características Agilent para generar relaciones log2 y valores de P para las características de la matriz. Antes del análisis de red de coexpresión génica, los identificadores del conjunto de sondas se mapearon a la construcción génica refseq de NCBI actual (hg 19) y se tomaron valores medios para sondas que coinciden con la misma ID del transcrito. Se describe el marco general para el análisis de la red de coexpresión génica ponderado.

Se calculó la correlación de Pearson por pares entre los valores de expresión génica para cada gen en el conjunto de datos para a) muestras con lesiones ateroscleróticas, b) muestras sin lesiones ateroscleróticas, c) todas las muestras. Se eligió un parámetro de umbral blando p para satisfacer el criterio de topología libre de escala en base a la maximización de R2 para un ajuste lineal con pendiente -1 a log(k) frente a log(n(k)), "reduciendo el ruido" eficazmente de correlaciones débiles. La superposición topológica entre genes se calculó de acuerdo con el método descrito por Yip y Horvath, generando una adyacencia de red basada en adyacentes de red compartidos para todos los pares de genes. Luego usamos la agrupación jerárquica de enlace medio y el algoritmo de corte de árbol dinámico, que busca iterativamente agrupaciones estables, para dividir la red de superposición topológica en módulos. Se uso la descomposición de valores singular para identificar el módulo de “autogen” (primer componente principal) que representa la varianza máxima en la expresión génica modular, y se generó la conectividad intramodular y global para cada gen sumando los pesos de borde dentro de los módulos y dentro de la red global, respectivamente.

Para el análisis dirigido de la relación topológica entre genes anotados de CDKN2B y 28 implicados en la eferocitosis CALR, MFGE8, CX3CL1, ABCA6, ICAM3, GAS6, APOH, PROS1, C1QB, ANXA1, CD47, LRP1, MBL2, SIRPA, NR1H3, PPARG, LRPAP1, TGFB1, BAI1, TIMD4, CD14, MERTK, CD36, ELMO1, DOCK1, AKT1, PANX1, GULP1), se realizó una agrupación jerárquica de enlaces media en la matriz de superposición topológica reducida que representa todos los enlaces por pares entre estos miembros del conjunto y CDKN2B.La asignación del módulo y el cálculo del autogen se realizaron como se ha descrito anteriormente. El análisis de expresión diferencial de acuerdo con la presencia o ausencia de lesión aterosclerótica se realizó mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon entre los valores de expresión de autogenes del módulo. Un valor de p de menos de 0,05 se consideró estadísticamente significativo. La visualización de la red se realizó usando Cytoscape 2.8.3 (San Diego, CA) para la matriz de superposición topológica.

Métodos de cultivo celular. Las SMC de arteria coronaria humana (HCASMC, Lonza, Walkersville, MD, pases N° 3-6) se propagaron en medio de crecimiento SmGM-2 (Lonza) que contenía 5% de FBS. Se cultivaron células monocíticas THP-1 humanas, macrófagos de riñón embrionario humano (HEK-293) y RAW 264.7 (ATCC) en medios de crecimiento DMEM que contenían FBS al 10%. Se recogieron células vasculares primarias del músculo liso de las aortas de ratones Cdkn2b+,+ y Cdkn2b-/-, como se ha descrito anteriormente. Los macrófagos activados primarios se recogieron de ratones 72 horas después de la inyección intraperitoneal de 2 ml de tioglicolato al 4%, como se ha descrito previamente. Para inducir la detención del crecimiento y la expresión de genes de diferenciación, las SMC se privaron de suero en medio basal (SmBM) durante 72 horas, de acuerdo con protocolos convencionales.

Para inducir la diferenciación de monocitos THP-1 en macrófagos adherentes, las células se trataron con PMA 100 nM durante 72 horas, como se ha descrito anteriormente. Para los experimentos de exclusión, se transfectaron SMC con 300 nM de anti-CDKN2B (siCDKN2B) o ARNip de control negativo de alto GC (siCont) (Ambion, Silencer Select, N° de catálogo 4390825 y 4390843, respectivamente) usando el sistema Amaxa Nucleofector de alta eficiencia (Lonza, protocolo U-025). La transfección con éxito (>85% de todas las células) se confirmó mediante análisis microscópico fluorescente visual y citometría de flujo de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para el control positivo marcado fluorescentemente, pmax GFP (Amaxa). Las placas se recogieron al 80% de confluencia para el análisis de ARN y proteínas o se usaron para análisis in vitro posteriores. La exclusión reproducible deCDKN2B se confirmó en SMC mediante rt-PCR cuantitativa que mostró un silenciamiento selectivo de este gen del orden del -85%. No se observó una exclusión fuera del objetivo para ninguno de los otros genes cercanos, incluidos CDKN2A, ARF o ANRIL. La apoptosis se indujo tratando HCASMC con estaurosporina 1 pM (Sigma, S5921) en medios libres de suero durante 6 horas antes del análisis o recogida y uso en experimentos de cocultivo.

Aislamiento de ARNm y transcripción inversa cuantitativa. El ARN de PCR se aisló de lisados celulares usando el mini Kit miRNeasy (Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARN se aisló de las muestras de órganos murinos usando el método Trizol (Invitrogen). El ARN se cuantificó con la máquina Nanodrop (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) Para la cuantificación de la transcripción génica, se generó ADNc con la transcriptasa inversa M-MuLV, y luego se amplificó en el ABI PRISM 7900HT con cebadores TaqMan disponibles comercialmente (Applied Biosystems, Foster City, CA) y controles internos normalizados a 18S, como se ha descrito anteriormente. A continuación se proporciona una lista de los cebadores y sondas usados en estos estudios.

Especies de cebadores: APOH Hs00979406_m1, C1QC Hs00757779_m1, ANRIL Hs01390879_m1, ARF Hs99999189_m1, CDKN2A Hs00923894_m1, CDKN2B Hs00793225_m1, CD47 Hs00179953_m1, CALR Hs00189032_m1, GAS6 Hs01090305_m1, ICAM3 Hs00233674_m1, MFGE8 Hs00170712_m1, MTAP Hs00559618_m1 humanos.

Especie: Mm00482936_m1, Cdkn2a Mm00494449_m1, Arf Mm01257348_m1, Cdkn2b Mm00483241_m1, Abca1 Mm00442646_m1 de calreticulina de ratón.

Ensayos in vitro y análisis de promotores, bioinformática in silico. La predicción del sitio de unión del factor de transcripción (TFBS) se determinó usando las siguientes herramientas bioinformáticas en línea: TRANSFAC (BIOBASE), TFSearch, PROMO y Matlnspector.

Ensayos de cambio de movilidad de gel electroforético radiactivo. Se generaron oligonucleótidos de cadena doble para los principales sitios de unión a E2F4 predichos (-150 a -134) dentro del promotor de CALR apareando los siguientes oligos de cadena sencilla: F:5' TGGCAGGGGCGGGCCCAAGGGCTG 3' y R:5' CAGCCCTTGGGCCCGCCCCTGCCA 3'. -ATP (Perkin Elmer) usando polinucleótido quinasa T4 (NEB) durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego purificado a través de columnas Sephadex G-50 Quick Spin (Roche). Después de medir la radiactividad, las reacciones se ensamblaron con 1X de tampón de unión EMSA, 1 pg de polidldC, 10 pg de extracto nuclear recogido de HCASMC, sonda 100X sin marcar (para competiciones), sonda marcada con -ATP, y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de la separación de proteínas en un gel de TBE al 4%. Los geles se secaron sobre papel Whatman usando un secador de vacío calentado y las proteínas se detectaron en una película radiográfica.

Ensayos de inmunoprecipitación de cromatina. La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) se realizó de acuerdo con el protocolo Millipore EZ-ChIP con ligeras modificaciones. Se cultivaron HCASMC en medios de crecimiento normales hasta aproximadamente un 75% de confluencia, y luego se cultivaron en ausencia de suero y suplementos durante 24 horas. Las células se fijaron en formaldehído al 1% durante 10 minutos para reticular la cromatina, seguido de inactivación con glicina durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se recogieron 2x10A7 células por condición y se prepararon lisados nucleares como se ha descrito anteriormente (70). Los extractos nucleares de cromatina reticulados se cortaron en fragmentos de aproximadamente 500 pb usando un Bioruptor (Diagenode) durante 3 ciclos de 3 minutos (30 segundos encendido, 30 segundos apagado). La cromatina cortada se aclaró por centrifugación a 4° C durante 15 minutos. Se preaclararon 1 x100A6 núcleos por condición con 20 gg de suero pre-inmune de IgG anti-conejo (Sigma) y 40 gl de Dynabeads de Proteína G (Invitrogen) durante 1 hora en una plataforma rotatoria, seguido de incubación con 2 gg de IgG de conejo o anticuerpo anti-E2F4 (C-20 SC866 Santa Cruz) durante la noche.

Las muestras de cromatina inmunoprecipitadas se incubaron luego con 60 gl de Dynabeads de Proteína G durante 2 horas a 4° C en una plataforma giratoria para capturar los complejos de proteína-ADN. Los complejos se lavaron en tampones con bajo contenido de sal, alto contenido de sal, LiCI y TE y luego se eluyeron con un tampón que contenía NaHCO3100 nM y SDS al 1%. Los enlaces cruzados de proteína-ADN se invirtieron y las muestras se trataron con RNasa A y Proteinasa K y el ADN libre se purificó usando kits de purificación por PCR Qiagen. El enriquecimiento total se midió usando cebadores diseñados en base a la secuencia del sitio de unión de E2F4 superior dentro del promotor de calreticulina (F (-199 a -181): 5' AGGTCCAATGGAAAAAGAC 3' y R (+84 a 65): 5' CAGAAACTGCTCCTTGAAGT 3'), o una región reguladora de E2F4 conocida (FGFr1 como control positivo (Devel Dynamics 2005 119), o una región de Control Negativo usando los siguientes cebadores F:5’ CCGGAAGCACTTCTCCTAGA 3’ y R:5’ AAGAGAGAGCGGAAGTGACG3’).

Se usó PCR semicuantitativa para verificar los productos ChIP mediante electroforesis en gel. La PCR cuantitativa en tiempo real (ViiA 7, Life Technologies) se realizó usando ensayos SYBR Green (Applied Biosystems) y se calculó el enriquecimiento de pliegues midiendo la delta Ct-IgG delta Ct. También se realizó el análisis de la curva de fusión para cada cebador ChIP. Los datos son representativos de por lo menos cuatro muestras de HCASMC independientes con ensayos de qPCR realizados por triplicado. Los datos se presentan como el porcentaje de ADN de entrada y como veces de enriquecimiento de la cromatina precipitada con el E2F4 Ab con respecto a la IgG de control.

Ensayos de informadores de promotores de luciferasa. Se obtuvieron constructos de GoClones de informadores de promotores LightSwitch (RenSP, S721464) de calreticulina, vectores vacíos (S790005) y Control de Cipridina TK (pTK-Cluc, SN0322S) de SwitchGear Genomics (Menlo Park, CA) y se transfectaron en células HEK usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Para los ensayos de exclusión, se cotransfectaron 5 pmol de ARNIp anti-CDKN2B o de control. Para la sobreexpresión, CDKN2B (sc319536) y el plásmido de expresión Rb (sc119971) y el vector vacío (pCMV6) se obtuvieron de Origene y se cotransfectaron 100 ng de plásmido. La actividad de luciferasa dual se midió con el sistema de ensayo dual LightSwitch después de 48 horas usando un luminómetro SpectraMax L (Molecular Devices), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunos experimentos, los medios se cambiaron a medios libres de suero después de 24 horas de transfección. Los estudios se realizaron al inicio del estudio y después de que las células se hubiesen expuesto a dosis crecientes de TGFp-1 humano recombinante (de Sigma, 0.5-10 ng/ml) durante las últimas 16 horas antes del análisis. La actividad relativa de la luciferasa (proporción de luciferasa de Renilla/Cypridina) se expresa como el cambio porcentual con respecto a los valores de referencia obtenidos de las células transfectadas con control no expuestas al tratamiento con TGF-p.

Ensayos de resistencia y capacidad de eferocitosis. Se marcaron células primarias del músculo liso aórtico generadas a partir de ratones Cdkn2b-/- y Cdkn2b+/+ con sondas fluorescentes CMTMR CellTracker naranja 20 gM (Life Technologies, C2927) durante una hora, luego se cultivaron durante la noche en medio libre de suero. Simultáneamente, se marcaron macrófagos de Cdkn2b+/+ intraperitoneales primarios con 20 gM de sonda CMFDA CellTracker verde (Life Technologies, C7025) durante una hora, luego se cultivaron durante la noche en medio estándar con suplementación de suero. Por la mañana, se indujo a las SMC para que experimentasen apoptosis durante 4 horas, luego se recogieron y se contaron manualmente. Luego se añadieron 1x105 células apoptóticas a los macrófagos cultivados y se les permitió cocultivar durante 1,5 horas adicionales. En ese punto, todas las células adherentes se tripsinizaron y se clasificaron por FACS (BD FACSCaliber, 530 nm [FL1] y >575 nm [FL4]), como en protocolos publicados previamente. Se supuso que las células que tenían doble positivo para verde (fagocito) y naranja (SMC) representaban células fagocitadas.

La tasa de eferocitosis se definió luego como el porcentaje de células positivas dobles (AB fagocitada) a células positivas para naranja/negativas para verde (AB no comido). Se hizo una comparación entre las tasas de depuración para AB de Cdkn2b'/- y Cdkn2b+/+. Este experimento se realizó como anteriormente con las siguientes permutaciones: SMC aórticas murinas primarias frente a macrófagos estimulados con tioglicolato intraperitoneal murino primario; SMC aórticas murinas primarias frente a macrófagos RAW no estimulados murinos; HCASMC transfectadas frente a células THP-1 estimuladas con PMA humano.

Finalmente, se evaluó el efecto de CDKN2B sobre la 'capacidad eferocítica' (frente a la 'resistencia eferocítica') realizando estos experimentos con fagocitos transfectados deficientes en CDKN2B y de control expuestos a AB no transfectado. En estos experimentos, la capacidad fagocítica se definió como el porcentaje de células positivas dobles (fagocitos que habían comido un AB) con células negativas para naranja/positivas para verde (fagocitos que no habían comido un AB). Todos los ensayos se repitieron en tres ocasiones con por lo menos tres repeticiones por experimento. El análisis se realizó con FloJo 7.6.3.

Ensayos de competición de eferocitosis. La confirmación de los estudios anteriores se realizó colocando en placas un número igual de siCDKN2B HCASMC apoptópicas marcadas con CellTracker verde y siCont HCASMC apoptópicas marcadas con CellTracker naranja sobre HCASMC no apoptópicas no transfectadas no marcadas en placas de cultivo de celular de 12 pocillos. Los tres tipos de células se cocultivaron durante 2 horas adicionales, y luego las células no adherentes, no fagocitadas se lavaron. Las células restantes se fijaron y se tiñeron con DAPI y se analizaron bajo un microscopio fluorescente invertido. Un investigador cegado contó manualmente 8 hpf/pocillo al azar para células eferocitosas y se registró la proporción de AB deficiente en CDKN2B fagocitado con AB transfectado con control.

Ensayos de cocultivo de fagocito-cuerpo apoptótico Ensayos de cultivo de eflujo de colesterol. Los ensayos de eflujo de colesterol se realizaron como se ha descrito anteriormente, con modificación. Los macrófagos RAW se colocaron en placas de 12 pocillos en DMEM que contenía FBS al 10% y se marcaron con colesterol [3H] (0,5 pCi/pocillo) durante 48 horas. Después de lavarlas con PBS, las células se co-cultivaron con células del músculo liso aórtico Cdkn2b-/- y Cdkn2b+I+ apoptóticas durante 1,5 horas, luego se incubaron en DMEM libre de suero durante la noche. Las células se lavaron e incubaron en 350 pl de medio libre de suero que contenía 10 pg/ml de Apolipoproteína A-1 (Sigma) como un aceptador durante 4 horas. Los medios se recogieron y centrifugaron, y la cantidad de radiactividad se determinó por contador de centelleo. El eflujo de colesterol se expresó como el porcentaje de recuentos en los medios frente a los recuentos totales de colesterol [3H] (medias más células). Se sustrajo el eflujo del valor de referencia (sin apoA-1).

Ensayos de formación de células espumosas. Se sembraron macrófagos RAW en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante la noche. En algunos experimentos, los macrófagos se trataron con 100 ng/ml de lipopolisacárido de Escherichia coli O111: B4 (LPS, Sigma). Los macrófagos se cocultivaron con células de músculo liso aórtico Cdkn2b-I- y Cdkn2b+I+ apoptóticas y 100 pg/ml de LDL oxidada de (Biomedical Technologies Inc.) durante 24 horas. Las células se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 20 minutos, se lavaron con PBS y se tiñeron con 0,5% de aceite rojo O durante 5 minutos. Después de enjuagar con isopropanol al 60% y lavar, se tomaron 8 imágenes aleatorias/pocillo con un microscopio invertido con un aumento de 20x. Se analizó el área positiva para Aceite rojo O con el software Adobe Photoshop CS5.

Ensayos de expresión de citoquinas específicas de macrófagos. Se co-cultivaron macrófagos RAW estimulados con LPS (1 pg/ml) con HCASMC apoptótico de siCDKN2B o siCont en medio libre de suero. El HCASMC no unido se eliminó lavando con PBS después de 1,5 horas, luego las células se cultivaron en DMEM libre de suero. Después de 24 horas de incubación, se recogió el sobrenadante y se evaluó el nivel de IL-10 y TNF-a secretados con ELISA (R&D Systems) desarrollados específicamente para citoquinas de origen murino.

Análisis estadístico. Los datos se presentan como media ± SEM. Los datos se sometieron a la prueba de Kolmogorov-Smirnov para determinar la distribución. Los grupos se compararon usando la prueba U de Mann-Whitney para datos no paramétricos o la prueba t de Students para datos paramétricos. Cuando se compararon múltiples grupos, los datos se analizaron mediante análisis de varianza con la prueba post de Bonferroni. Para las pruebas múltiples de datos paramétricos, un valor de P<0,05 se consideró estadísticamente significativo. Los experimentos se replicaron por lo menos por cuadruplicado y todos los análisis se realizaron de forma ciega por dos investigadores separados, a menos que se especifique lo contrario. El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism 5.

Ejemplo 2

Para comprender cómo estas perturbaciones dependientes de Cdkn2b en la biología SMC podrían extenderse a la enfermedad aterosclerótica, se generaron ratones deficientes en Cdkn2b/ApoE. Estos ratones Cdkn2b'I'IApoE'I' de ateroprona eran animales alimentados durante 12 semanas con dieta occidental alta en grasas. Según lo predicho por los datos de GWAS, se observó que los animales Cdkn2b'IYApoE'I' desarrollaron placas ateroscleróticas significativamente más grandes que los animales de control ApoE'A (aumento del 37%, P <0,01). El análisis morfométrico reveló que la diferencia en la carga de la placa se debió en gran medida a un aumento en el tamaño del núcleo necrótico cargado de lípidos.

Como se muestra en el Ejemplo 1, la pérdida de Cdkn2b deteriora la expresión de la de calreticulina SMC (Calr), un ligando de "cómeme" clave requerido para la activación de los receptores de reabsorción; reduce la "eferocitosis" (depuración fagocítica) de las SMC vasculares apoptóticas; y culmina en una aterogénesis acelerada secundaria para un aumento notable en el crecimiento del núcleo necrótico. Además, los ensayos de cocultivo revelaron que las SMC de Cdkn2b'A no depuradas inducen a los macrófagos colindantes a asumir un fenotipo ‘ tipo célula espumosa’, con una reducción asociada en las vías de eflujo de lípidos en sentido descendente del receptor Calr, Lrp-1. La reintroducción de Calr exógeno normaliza la depuración de SMC deficientes en Cdkn2b in vitro, destacando el potencial terapéutico de esta vía.

Implicación de Cdkn2b en la "eferocitosis" - la depuración fagocítica de los desechos apoptóticos: no se pudo observar un aumento en la tasa a la que se produjeron los desechos apoptóticos en este modelo de enfermedad crónica (P=NS para los ensayos TUNEL y Caspase en la semana 4 y la semana 12). Se razonó que la pérdida de Cdkn2b podría regular la tasa a la que se depuran los desechos apoptóticos en la placa aterosclerótica en desarrollo. Este proceso, conocido como "eferocitosis" (del griego que significa llevar a los muertos a la tumba), se evaluó con ensayos de fagocitosis de cocultivo basados en citometría de flujo in vitro establecidos.

Descubrimos que las SMC deficientes en Cdkn2b eran de hecho 'no comestibles' con respecto a las SMC de Cdkn2b WT, y resistieron la depuración tanto de fagocitos profesionales (es decir, macrófagos) como de fagocitos no profesionales (es decir, SMC colindantes) (reducción del 52% en la eferocitosis, P <0,03). Consecuentemente, estas células tenían más probabilidades de volverse necróticas secundariamente, explicando el aumento observado en el crecimiento del núcleo necrótico en ratones Cdkn2b-/-. La microscopía electrónica confirmó que el índice fagocítico de los macrófagos (cuantificado por el número medio de cuerpos apoptóticos ingeridos (A.B.) por fagocito) se vio afectado directamente dentro de las lesiones ateroscleróticas de ratones Cdkn2b-/-, in vivo. La pérdida de Cdkn2b deteriora potentemente la eferocitosis de SMC, provocando la acumulación de desechos apoptóticos en la placa en desarrollo.

Mapeo del mecanismo que vincula CDKN2B al ligando "cómeme" clave, la calreticulina (CALR): para explicar el mecanismo por el cual las SMC deficientes en Cdkn2b resisten la depuración fagocítica, evaluamos la expresión de moléculas pro- y anti-fagocíticas (conocidas como ligandos "cómeme" y "no me comas", respectivamente) en 51 placas ateroscleróticas coronarias humanas. Usando análisis no sesgados de la red de todo el genoma, generamos módulos de coexpresión que relacionaban los niveles de CDKN2B con la expresión de todos los genes implicados anteriormente en la eferocitosis. Usando este enfoque, descubrimos que CDKN2B estaba directamente asociado con una sola molécula de reabsorción: el ligando del receptor de fagocitos, la calreticulina (CALR). Usando datos de dos cohortes de validación separadas (n=128 sujetos adicionales), confirmamos que CALR y CDKN2B están positivamente correlacionados, de tal manera que los portadores del alelo de riesgo 9p21 han reducido la expresión de CDKN2B y CALR en la placa coronaria y carotídea. De acuerdo con estos datos humanos, los ratones Cdkn2b-/-/ApoE -/- tuvieron una reducción del 42% en la expresión de Calr lesional, con respecto a los animales de control (P <0,05). CALR es una molécula pleiotrópica que se ha implicado en la depuración fagocítica de células malignas y apoptóticas, pero que no se había asociado anteriormente con la aterosclerosis. Estos estudios vinculan definitivamente CDKN2B con la expresión de CALR en tejido vascular humano y murino in vivo, y proporcionan una explicación de cómo CDKN2B media en la eferocitosis en la aterosclerosis.

En los portadores del alelo de riesgo 9p21, CDKN2B se reduce, y esto se correlaciona con una reducción en la expresión de CALR. CALR es una molécula conservada y pleiotrópica responsable de procesos tan divergentes como el chaperón ER, la fibrosis extracelular y la homeostasis de Ca++. CALR interactúa con una variedad de receptores y se sabe que estimula la eferocitosis activando la proteína 1 relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad (LRP-1). La LRP-1 es una molécula igualmente compleja, responsable de más de 40 procesos homeostáticos conocidos, más allá de la endocitosis. De estos procesos, Lrp-1 se ha implicado específicamente en la homeostasis de los lípidos y la acumulación de células espumosas, además de su papel en la depuración fagocítica. La activación deteriorada de Lrp-1, secundaria a una deficiencia de Calr mediada por Cdkn2b, puede tener secuelas pro-ateroscleróticas más allá de la simple acumulación de desechos apoptóticos.

Cdkn2b y el vínculo con la homeostasis lipídica dependiente de Lrp-1/Abca1 en macrófagos: Lrp-1 estimula la expresión del transportador de colesterol inverso crítico, Abca1. Esta molécula es responsable del eflujo del colesterol intracelular a apoA-1, y está mutada en pacientes con enfermedad de Tánger, que están predispuestos a la formación prematura de células espumosas. Durante la eferocitosis, Abca1 está altamente regulada, presumiblemente para 'preparar' al fagocito para la inminente duplicación de su contenido de lípidos intracelulares. Abca1 también tiene importantes efectos pro-supervivencia y antiinflamatorios en los macrófagos, que pueden permitirles continuar participando en la depuración de los desechos apoptóticos en la lesión aterosclerótica en desarrollo. Como los animales con deficiencia de Cdkn2b expresan bajos niveles de Calr, esto puede llevar a una activación reducida de Lrp-1 y por lo tanto deteriorar el metabolismo del colesterol dependiente de Abca1 en macrófagos colindantes.

Hemos descubierto que los macrófagos aumentan apropiadamente su expresión de Abca1 en comparación con el valor de referencia cuando se cocultivan con SMC de control apoptóticas. Sin embargo, el aumento se atenúa cuando esos macrófagos se exponen a SMC apoptóticas deficientes en CDKN2B. A su vez, esto promueve una reducción asociada en el eflujo de colesterol, una aceleración en la formación de células espumosas, y un aumento en la elaboración de citoquinas inflamatorias por macrófagos cocultivados con A.B. deficientes en Cdkn2b con respecto a macrófagos cocultivados con A.B. de tipo salvaje. In vivo, los ratones Cdkn2b/ApoE KO también muestran una expresión de Abca1 aórtica reducida con respecto a las aortas de control. Tomados en conjunto, la presencia de SMC deficientes en Cdkn2b que han evadido la fagocitosis es suficiente para inducir una serie de procesos desadaptativos y pro-ateroscleróticos en macrófagos adyacentes, que culmina en un aumento de Abca1 reducido y una retención de lípidos aumentada.

La restauración de la eferocitosis es un enfoque importante para los portadores del alelo de riesgo 9p21, ya que se sabe que tienen la CDKN2B reducida y están predispuestos a la eferocitosis dependiente de CALR deteriorada. La aplicación del péptido Calr recombinante a A.B. de Cdkn2b-/- in vitro fue suficiente para normalizar completamente la eferocitosis con respecto a las células transfectadas con control (Figura 11), confirmando tanto la reversibilidad de este defecto como su potencial terapéutico.

La eferocitosis dependiente de Calr puede estimularse inhibiendo CD47, por ejemplo, usando nuevos péptidos de fusión de alta afinidad (que sirven como un "sumidero" de CD47). De manera similar, los anticuerpos contra CD47 y el IRPa soluble de alta afinidad pueden usarse para normalizar la señalización de Calr; restaurar la eferocitosis dependiente de Cdkn2b; e invertir el crecimiento de la placa aterosclerótica.

Se diseñó un mAb anti-CD47 humanizado ("Hu5F9-G4") (como se describe en la solicitud de patente US 2013-0142786 A1) mediante injerto de CDR de secuencias de ratón en un marco de IgG4 humano, elegido para minimizar el reclutamiento de funciones efectoras dependientes de Fc. Hu5F9-G4 muestra una unión altamente selectiva y altamente eficiente a CD47, y permite a los macrófagos fagocitar una amplia variedad de células tumorales, así como SMC deficientes en CDKN2B (Figura 12). Este agente es eficaz en ratones y puede traducirse en estudios en humanos. Se ha producido una línea celular de cGMP para la producción de Hu5F9-G4 recombinante, y tratará ratones deficientes en Cdkn2b/ApoE (para modelar la enfermedad de CV relacionada con 9p21) y ratones ApoE-/-(para modelar la enfermedad de CV de 'variedad de jardín') con control o de Hu5F9-G4 o de IgG mediante inyección IP semanal (n=15 por grupo). Los animales se sacrifican a las 12 o 24 semanas para estudiar el efecto de la eferocitosis restaurada sobre el desarrollo temprano y tardío de la placa aterosclerótica, respectivamente.

Además de estos estudios de prevención, los animales son tratados con 12 semanas de anticuerpos de Hu5F9-G4 o de IgG después de que ya hayan tenido 12 semanas de dieta alta en grasas, para evaluar el efecto de este tratamiento sobre la regresión y/o estabilización de la placa. Las diferencias relativas en la eferocitosis se cuantifican entre los grupos in vivo, con estudios de co-localización de A.B. y macrófagos dentro de la placa (para generar un "índice de fagocitosis"). El análisis de citometría de flujo se realiza para micropartículas apoptóticas circulantes en suero, que es otro método descrito para medir el deterioro sistémico en la eferocitosis.

Ejemplo 3

Ratones. Se criaron ratones apoE-/- macho (retrocruzados sobre un fondo C57BL/6) por nuestro laboratorio como se ha descrito anteriormente y se alojaron en un entorno específico libre de patógenos. Tenían disponibles a voluntad dieta de laboratorio esterilizada estándar y agua. En el día 0, los animales se iniciaron con una dieta occidental alta en grasas (21% de grasa de leche anhidra, 19% de caseína y 0,15% de colesterol, Dyets N° 101511) durante las semanas siguientes.

Infusión de angll. A los ratones (de 8 a 10 semanas de edad) se les implantaron minibombas que administraban Angll por vía subcutánea a una dosis de 1000 ng/kg-1/min-1, como se ha descrito anteriormente (ver Daugherty et al. (1999) Ann N Y Acad Sci. 892: 108-118.

Anticuerpos El anticuerpo monoclonal IgG2a de rata miap301 (véase Jiang et al. (1999) J Biol Chem. 274 (2):559-62) reacciona con CD47 de ratón. Se usó IgG de rata normal como control. El anticuerpo se inyectó en los animales a 200 pg/día i.p. con el programa que se muestra en la Figura 13.

Tejido. Los ratones anestesiados se abrieron ventralmente. Los ventrículos cardíacos izquierdos se perfundieron con solución salina tamponada con fosfato (20 ml) bajo presión fisiológica con una salida a través de las aurículas derechas cortadas. Se identificaron las regiones suprarrenales de aorta abdominal entre el último par de arterias intercostales y la rama renal derecha. Las ramas mesentérica y renal y la aorta distal a la rama renal derecha se ligaron con suturas de seda, y se recogió la aorta suprarrenal. Esta porción de aorta, que medía =5 mm de longitud, se infundió con =0,3 ml de compuesto OCT con una aguja de calibre 21 para lograr la distensión completa. También se recogieron aortas torácicas entre la arteria subclavia izquierda y el último par de arterias intercostales. Se observó la orientación de las aortas, y los tejidos se congelaron al instante.

Patología e inmunocitoquímica. Las aortas se obtuvieron a intervalos seleccionados después del inicio de las infusiones de Angll y el tratamiento con anticuerpos, y se seccionaron longitudinalmente o por secciones transversales (7 pm de grosor). Para la caracterización de las secciones transversales, las secciones aórticas se recogieron en serie desde la aorta proximal a la distal. La histología se determinó en secciones que se tomaron a intervalos de 200 pm. Para el examen longitudinal de los tejidos, también se colocaron secciones de 7 pm a intervalos de 200 pm en portaobjetos. Se realizó una tinción histológica estándar.

Se realizó tinción inmunocitoquímica para identificar macrófagos (MAC3) y músculo liso (actina anti­ músculo liso (a-SMA)). Se examinaron por lo menos 2 portaobjetos, que contenían =15 secciones de tejido, de cada animal para cada tipo de célula. Se usaron un sistema ABC basado en peroxidasa y el AEC de cromógeno rojo para detectar la reacción antígeno-anticuerpo. Los controles incluyeron anticuerpos con isotipo compatible y sueros no inmunes.

Resultados

En el día 30, la mortalidad para el grupo de IgG de control fue del 25%, 3 de 12. Todos tenían una disección aórtica. El grupo tratado con anti-CD47 tuvo una tasa de mortalidad del 16,6% (2 de 12), y un animal tuvo una disección aórtica.

El área de la placa aterosclerótica se midió como un porcentaje de la aorta torácica facial, los resultados se muestran en la Figura 14. Los animales tratados con anticuerpo anti-CD47 tenían placa reducida con respecto a los animales de control. También se calculó la aterosclerosis en el seno aórtico en base a la tinción con aceite rojo O, los resultados se muestran en la Figura 15.

En la Figura 16 se muestran los resultados de la inmunohistoquímica con Mac3 y un anticuerpo anti-SMA. En la Figura 17 se proporciona un diferencial de células sanguíneas para los animales. En la Figura 18 se muestra la proporción del peso de los tejidos seleccionados frente al peso corporal total.

Claims (11)

r e iv in d ic a c io n e s

1. Un agente anti-CD47 para su uso en un método para tratar a un sujeto humano para la aterosclerosis, en donde al sujeto se le ha diagnosticado que tiene por lo menos un alelo de riesgo 9p21 para la aterosclerosis, en donde el alelo de riesgo 9p21 se genotipó por determinación de la presencia de una variante de SNP en 9p21 asociada con el riesgo,

en donde la variante SNP se selecciona de: rs10757278; rs3217992; rs4977574; rs1333049; rs10757274; rs2383206; rs2383207; rs3217989; rs1333040; rs2383207; rs10116277; rs7044859; rs1292136; rs7865618; rs1333045; rs9632884; rs10757272; rs4977574; rs2891168; rs6475606; rs1333048; rs1333049; y rs1333045, en donde el agente anti-CD47 reduce la unión de CD47 en una célula apoptótica a SIRPa en una célula fagocítica, y en donde el agente anti-CD47 es: un anticuerpo anti-CD47, un polipéptido derivado de SIRPa, o un anticuerpo anti-SIRPa.

2. El agente anti-CD47 para el uso de la reivindicación 1, en donde el agente anti-CD47 es un anticuerpo anti-CD47.

3. El agente anti-CD47 para el uso de la reivindicación 2, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal de longitud completa.

4. El agente anti-CD47 para el uso de la reivindicación 2, en el que el anticuerpo es 5F9-hlgG4 humanizado.

5. El agente anti-CD47 para el uso de la reivindicación 2 o la reivindicación 4, en donde el anticuerpo no activa CD47 tras la unión.

6. El agente anti-CD47 para el uso de la reivindicación 1, en donde el agente anti-CD47 es un SIRPa soluble.

7. El agente anti-CD47 para el uso de la reivindicación 1, en donde el agente anti-CD47 es un reactivo de SIRPa soluble de alta afinidad que comprende por lo menos el dominio d1 de SIRPa con residuos de aminoácidos modificados para aumentar la afinidad.

8. El agente anti-CD47 para el uso de la reivindicación 7, en donde el reactivo de SIRPa soluble de alta afinidad se fusiona en marco con un segundo polipéptido.

9. El agente anti-CD47 para el uso de la reivindicación 8, en donde el segundo polipéptido es parte o la totalidad de una región Fc de inmunoglobulina.

10. El agente anti-CD47 para el uso de la reivindicación 1, en donde el agente anti-CD47 es un anticuerpo anti-SIRPa.

11. El agente anti-CD47 para el uso de la reivindicación 10, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal de longitud completa.