ES2745720T5 - Vectors for the transformation of Mycoplasma hyopneumoniae, transformed strains of M. hyopneumoniae, and use thereof - Google Patents

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Description

DESCRIPCIÓNDESCRIPTION

Vectores para la transformación de Mycoplasma hyopneumoniae, cepas transformadas de M. hyopneumoniae, y uso de los mismosVectors for the transformation of Mycoplasma hyopneumoniae, transformed strains of M. hyopneumoniae, and use thereof

Campo técnicotechnical field

La presente invención está enmarcada en el campo del desarrollo de métodos y herramientas para la manipulación genética de Mycoplasma hyopneumoniae con el fin de preparar cepas mutantes transformadas de dicha especie bacteriana que puedan emplearse como vacunas frente a enfermedades porcinas.The present invention is framed in the field of development of methods and tools for the genetic manipulation of Mycoplasma hyopneumoniae in order to prepare transformed mutant strains of said bacterial species that can be used as vaccines against swine diseases.

Técnica antecedentebackground technique

En el campo veterinario, las enfermedades provocadas por microorganismos tales como bacterias, virus o parásitos provocan graves pérdidas económicas debido a la muerte de los animales, o a un bajo rendimiento en los procesos de crecimiento y engorde.In the veterinary field, diseases caused by microorganisms such as bacteria, viruses or parasites cause serious economic losses due to the death of the animals, or poor performance in the growth and fattening processes.

Una de las formas de proteger a los animales frente a futuras infecciones consiste en la administración de vacunas para generar una respuesta inmunológica en los mismos.One of the ways to protect animals against future infections is the administration of vaccines to generate an immune response in them.

Las vacunas a base de microorganismos inactivados o microorganismos vivos atenuados han sido la base inmunológica principal para el control y la erradicación de la gran mayoría de enfermedades infecciosas hasta nuestros días.Vaccines based on inactivated microorganisms or live attenuated microorganisms have been the main immunological basis for the control and eradication of the vast majority of infectious diseases to this day.

Sin embargo, a pesar de los buenos resultados obtenidos con estos tipos de vacunas, presentan problemas tales como la posible inversión a la virulencia de las vacunas atenuadas, la incapacidad de diferenciar animales vacunados de los animales infectados o la dificultad de conseguir una vacuna eficaz para todas las enfermedades. El desarrollo de herramientas para la manipulación genética de microorganismos ha permitido habitualmente la preparación de vacunas más eficaces que las mencionadas anteriormente, tales como son, por ejemplo, las vacunas de subunidades, las vacunas vivas o inactivadas modificadas genéticamente, las vacunas marcadoras (DIVA, forma siglada del inglés Differentiating infected from vaccinated animals: que diferencian entre animales vacunados e infectados) o vacunas de ADN.However, despite the good results obtained with these types of vaccines, they present problems such as the possible inversion of the virulence of attenuated vaccines, the inability to differentiate vaccinated animals from infected animals, or the difficulty of obtaining an effective vaccine for all diseases. The development of tools for the genetic manipulation of microorganisms has usually allowed the preparation of more effective vaccines than those mentioned above, such as, for example, subunit vaccines, genetically modified live or inactivated vaccines, marker vaccines (DIVA, Abbreviated form of English Differentiating infected from vaccinated animals: that differentiate between vaccinated and infected animals) or DNA vaccines.

No obstante, no todos los microorganismos que provocan enfermedades en el sector veterinario se pueden manipular genéticamente con la misma facilidad.However, not all disease-causing microorganisms in the veterinary field can be genetically manipulated with the same ease.

Entre los microorganismos que más problemas plantean para su manipulación genética se encuentran los micoplasmas.Among the microorganisms that pose the most problems for their genetic manipulation are mycoplasmas.

Los micoplasmas pertenecen a la clase Mollicutes, un amplio grupo de microorganismos estrechamente emparentados con las bacterias grampositivas.Mycoplasmas belong to the class Mollicutes, a large group of microorganisms closely related to Gram-positive bacteria.

Los micoplasmas tienen genomas circulares pequeños, con tamaños generalmente inferiores a las 1.000 kb, con número de genes que está comprendido entre 500 y 1000.Mycoplasmas have small circular genomes, generally less than 1,000 kb in size, with a number of genes between 500 and 1,000.

Este grupo de bacterias también carece de muchas de las rutas metabólicas que se encuentran habitualmente en todos los organismos vivos, probablemente fruto de su adaptación a un estilo de vida parasitario. Esto hace que los micoplasmas sean microorganismos con requisitos especiales de cultivo, muy difíciles de cultivar tanto en medio líquido como en medio sólido.This group of bacteria also lacks many of the metabolic pathways commonly found in all living organisms, probably as a result of their adaptation to a parasitic lifestyle. This makes mycoplasmas microorganisms with special culture requirements, very difficult to grow both in liquid and solid media.

Entre los micoplasmas se encuentra Mycoplasma hyopneumoniae (en lo sucesivo en el presente documento, "Mhyo"), que es una bacteria responsable de grandes pérdidas económicas en la industria porcina. Aunque la mayoría de las infecciones por Mhyo no son graves, los animales infectados con Mhyo son susceptibles a infecciones secundarias del sistema respiratorio, que pueden reducir la tasa de aumento diario de peso o incluso causar la muerte.Mycoplasmas include Mycoplasma hyopneumoniae (hereinafter "Mhyo"), which is a bacterium responsible for large economic losses in the swine industry. Although most Mhyo infections are not serious, Mhyo -infected animals are susceptible to secondary infections of the respiratory system, which can reduce the rate of daily weight gain or even cause death.

Mhyo es el agente causal de la neumonía enzoótica porcina (en lo sucesivo en el presente documento "NEP"), una enfermedad respiratoria crónica muy extendida a nivel mundial. La enfermedad se caracteriza por una elevada morbilidad y una baja mortalidad. La prevalencia de la NEP es especialmente alta en cerdos de engorde y la gravedad de los signos clínicos depende de la cepa de Mhyo causante de la infección, de las condiciones ambientales, del estado sanitario de los animales y de la aparición de infecciones secundarias debidas a otros agentes patógenos. En algunos casos, la NEP cursa de modo subclínico sin signos clínicos evidentes. En los casos en los que no aparecen complicaciones, los animales muestran tos crónica no productiva asociada a una tasa reducida de aumento diario de peso, con la consiguiente reducción de la eficiencia de conversión alimenticia. Cuando se producen infecciones secundarias, los signos clínicos se hacen más evidentes, presentándose síntomas respiratorios agudos y pirexia, que incluso pueden ocasionar la muerte del animal. No obstante, incluso en ausencia de complicaciones por infecciones secundarias, la NEP provoca graves pérdidas económicas debido a la baja tasa de conversión alimenticia y los costes derivados de la medicación. Una vez instaurada en una granja, la enfermedad se transmite horizontalmente a otros animales mediante los aerosoles generados por la tos y verticalmente desde las hembras reproductoras a los lechones. Mhyo is the causative agent of swine enzootic pneumonia (hereinafter "NEP"), a chronic respiratory disease widespread worldwide. The disease is characterized by high morbidity and low mortality. The prevalence of PEN is especially high in fattening pigs and the severity of the clinical signs depends on the strain of Mhyo causing the infection, the environmental conditions, the health status of the animals and the appearance of secondary infections due to other pathogens. In some cases, PEN occurs subclinically without obvious clinical signs. In cases where there are no complications, animals show chronic non-productive cough associated with a reduced rate of daily weight gain, with a consequent reduction in feed conversion efficiency. When secondary infections occur, the clinical signs become more evident, presenting symptoms acute respiratory and pyrexia, which can even cause the death of the animal. However, even in the absence of complications from secondary infections, NEP causes serious economic losses due to the low feed conversion rate and the costs derived from medication. Once established on a farm, the disease is transmitted horizontally to other animals through aerosols generated by coughing and vertically from breeding females to piglets.

Además de un cultivo problemático, la manipulación genética de los micoplasmas está dificultada por el escaso número de herramientas disponibles.In addition to problematic cultivation, the genetic manipulation of mycoplasmas is hampered by the limited number of tools available.

En el estado de la técnica se han descrito las dificultades de la manipulación genética de los micoplasmas, en particular de Mhyo. In the state of the art, the difficulties of genetic manipulation of mycoplasmas, in particular Mhyo, have been described.

En el artículo de Minion et al., The Genome Sequence of Mycoplasma hyopneumoniae Strain 232, the Agent of Swine Mycoplasmosis, J. Bacteriol., 2004, 186(21), 7123-7133, se describe la secuencia del genoma de la cepa 232 de Mhyo. El autor manifiesta que Mhyo es un microorganismo con requisitos especiales de cultivo y que existe una falta de herramientas y protocolos para transformarlo.In the article by Minion et al., The Genome Sequence of Mycoplasma hyopneumoniae Strain 232, the Agent of Swine Mycoplasmosis, J. Bacteriol., 2004, 186(21), 7123-7133, the genome sequence of strain 232 is described. from Mhyo. The author states that Mhyo is a microorganism with special culture requirements and that there is a lack of tools and protocols to transform it.

En el marco del estudio de las modificaciones que se producen en Mhyo cuando se somete a un cambio de temperatura, en el artículo de Madsen et al., Transcriptional Profiling of Mycoplasma hyopneumoniae during Heat Shock Using Microarrays, Infect. Immun., 2006, 74(1), 160-166, los autores manifiestan que, a pesar de la gran importancia que tiene Mhyo para la producción porcina, ha habido pocos estudios sobre los mecanismos moleculares potenciales de su patogénesis en respuesta a los cambios ambientales, y que esto es debido probablemente a su dificultad de crecimiento y a que se trata de un microorganismo resistente a la manipulación genética.Within the framework of the study of the changes that occur in Mhyo when subjected to a change in temperature, in the article by Madsen et al., Transcriptional Profiling of Mycoplasma hyopneumoniae during Heat Shock Using Microarrays, Infect. Immun., 2006, 74(1), 160-166, the authors state that, despite the great importance of Mhyo for pig production, there have been few studies on the potential molecular mechanisms of its pathogenesis in response to changes environmental conditions, and that this is probably due to its difficulty to grow and to the fact that it is a microorganism that is resistant to genetic manipulation.

En el artículo de Pich et al., Comparative analysis of antibiotic resistance gene markers in Mycoplasma genitalium: application to studies of the minimal gene complement, Microbiology, 2006, 152, 519-527, se describe la modificación genética de Mycoplasma genitalium con diferentes plásmidos por electroporación, pero no se hace referencia a Mhyo. In the article by Pich et al., Comparative analysis of antibiotic resistance gene markers in Mycoplasma genitalium: application to studies of the minimal gene complement, Microbiology, 2006, 152, 519-527, the genetic modification of Mycoplasma genitalium with different plasmids is described. by electroporation, but no reference to Mhyo is made.

En la Tesis de B. Machado, Construgao de vetor oriC de Mycoplasma hyopneumoniae - uma ferramenta para estudos genéticos do agente da Pneumonia Enzoótica Suína, Porto Alegre, 2007, se describe la transformación de la cepa 7448 de Mhyo con el plásmido replicativo pOSTM mediante electroporación. Para la construcción de este plásmido, se introdujeron en el vector pUC18 la región oriC de Mhyo y el casete de expresión que contiene el gen de resistencia a tetraciclina (tetM), controlado por el gen promotor de Spiroplasma citri. Si bien la parte experimental muestra la incorporación del plásmido mediante PCR y la resistencia al antibiótico conferida por dicho vector, en este trabajo no se aportan resultados concluyentes que demuestren que se hubiese producido realmente la incorporación del plásmido pOSTM en Mhyo de forma estable, ya que no se describe el aislamiento de los plásmidos de las cepas transformantes resistentes a la tetraciclina. Además, también se describe que las cepas transformantes tuvieron dificultades para crecer después de dos pases en un medio de selección. En consecuencia, estos resultados ponen de manifiesto que usando la transformación divulgada en el documento no se pudo introducir de forma estable una secuencia exógena de ADN en una cepa de Mhyo, ya que no se puede recuperar después de múltiples generaciones de la bacteria transformada.In the Thesis of B. Machado, Construction of the oriC vector of Mycoplasma hyopneumoniae - a tool for genetic studies of the agent of Enzootic Suine Pneumonia, Porto Alegre, 2007, the transformation of Mhyo strain 7448 with the replicative plasmid pOSTM by electroporation is described. . For the construction of this plasmid, the Mhyo oriC region and the expression cassette containing the tetracycline resistance gene (tetM), controlled by the Spiroplasma citri promoter gene, were introduced into the vector pUC18. Although the experimental part shows the incorporation of the plasmid by PCR and the resistance to the antibiotic conferred by said vector, this work does not provide conclusive results that demonstrate that the incorporation of the pOSTM plasmid in Mhyo had actually occurred in a stable manner, since isolation of plasmids from tetracycline-resistant transformant strains is not disclosed. In addition, it is also described that the transformant strains had difficulties to grow after two passages in selection medium. Consequently, these results show that using the transformation disclosed in the document, an exogenous DNA sequence could not be stably introduced into a Mhyo strain, since it cannot be recovered after multiple generations of the transformed bacterium.

A pesar de esta divulgación del año 2007, en estudios posteriores no se ha demostrado que se haya podido resolver el problema de la modificación genética de Mhyo. Despite this 2007 disclosure, subsequent studies have not shown that the problem of Mhyo's genetic modification could have been solved.

En el informe de M. Calcutt sobre el proyecto Development of genetic manipulation protocols for Mycoplasma hyopneumoiae clade of animal pathogens, University of Missouri, correspondiente al período 01.10.2009 a 30.09.2010 (descargado de la página de internet http://www.reeis.usda.gov/web/ crisprojectpages/220630.html, recuperado el 16.02.2012), se describe que los objetivos del proyecto residen en el desarrollo de una metodología para la manipulación genética de Mhyo. También se describe que se pretendía electrotransformar Mhyo con plásmidos que incluían el gen de resistencia a la tetraciclina. Sin embargo, los resultados procedentes del análisis de ADN realizado sobre las bacterias transformantes no fueron positivos, y condujeron a los autores a considerar que no se había producido la transformación. Tampoco se describen resultados sobre la expresión de dicho gen de resistencia.In the report by M. Calcutt on the project Development of genetic manipulation protocols for Mycoplasma hyopneumoiae clade of animal pathogens, University of Missouri, corresponding to the period 10.01.2009 to 09.30.2010 (downloaded from the website http://www. reeis.usda.gov/web/crisprojectpages/220630.html, retrieved on 02.16.2012), it is described that the objectives of the project reside in the development of a methodology for the genetic manipulation of Mhyo. It is also disclosed that it was intended to electrotransform Mhyo with plasmids that included the tetracycline resistance gene. However, the results from the DNA analysis performed on the transforming bacteria were not positive, leading the authors to consider that transformation had not occurred. Neither are results described on the expression of said resistance gene.

En el artículo de Browning et al., Developing attenuated vaccines to control mycoplasmoses, Microbiology Australia, 2011, 121-122, se describe el desarrollo de vacunas que contienen cepas de Mycoplasma sensibles a la temperatura que no crecen a la temperatura corporal del hospedador. Dichas cepas se obtuvieron por mutación química a partir de cepas de tipo silvestre. Los autores manifiestan que la manipulación genética dirigida en Mhyo y M. synoviae sigue siendo un reto y que no se había conseguido en dichas especies. La solicitud de patente internacional WO-A-2010/132932, del mismo grupo de trabajo, también se refiere a cepas de Mhyo sensibles a la temperatura.The article by Browning et al., Developing attenuated vaccines to control mycoplasmoses, Microbiology Australia, 2011, 121-122, describes the development of vaccines containing temperature-sensitive Mycoplasma strains that do not grow at host body temperature. Said strains were obtained by chemical mutation from wild-type strains. The authors state that targeted genetic manipulation in Mhyo and M. synoviae remains a challenge and has not been achieved in these species. International patent application WO-A-2010/132932, from the same working group, also refers to temperature-sensitive Mhyo strains.

En el artículo de Maboni et al., Mycoplasma hyopneumoniae Transcription Unit Organization: Genome Survey and Prediction, DNA Research, 2011, 18, 413-422, se realizó una revisión comparativa del genoma de tres cepas de Mhyo (7448, J y 232) con la finalidad de identificar marcos abiertos de lectura. Los autores manifiestan que, a pesar del desarrollo de la transformación artificial y de otras herramientas genéticas para algunas especies de Mycoplasma, estas metodologías todavía están pendientes de ser desarrolladas para Mhyo. In the article by Maboni et al., Mycoplasma hyopneumoniae Transcription Unit Organization: Genome Survey and Prediction, DNA Research, 2011, 18, 413-422, a comparative review of the genome of three Mhyo strains (7448, J and 232) was performed in order to identify open reading frames. The authors state that despite the development of artificial transformation and other genetic tools for some Mycoplasma species, these methodologies have yet to be developed for Mhyo.

Por lo tanto, en el estado de la técnica no se han descrito métodos para la transformación de Mhyo, aunque ha habido diversos intentos infructuosos para llevarla a cabo.Therefore, no methods for Mhyo transformation have been described in the state of the art, although there have been several unsuccessful attempts to carry it out.

Subsiste pues la necesidad de proporcionar un método para preparar cepas mutantes de Mhyo por medio de herramientas de ingeniería genética, y así proporcionar cepas mutantes adecuadas para la preparación de composiciones vacunales frente a la neumonía enzoótica porcina y, finalmente, en combinación con otros componentes antigénicos, para la prevención y/o tratamiento de otras enfermedades porcinas.Therefore, there remains a need to provide a method for preparing mutant strains of Mhyo by means of genetic engineering tools, and thus provide suitable mutant strains for the preparation of vaccine compositions against swine enzootic pneumonia and, finally, in combination with other antigenic components. , for the prevention and/or treatment of other swine diseases.

Divulgación de la invenciónDisclosure of the invention

El objeto de la presente invención es un método para preparar cepas mutantes de Mhyo. The object of the present invention is a method for preparing mutant strains of Mhyo.

Otro objeto de la invención es un vector plasmídico replicativo que se usa en dicho método.Another object of the invention is a replicative plasmid vector that is used in said method.

Otro objeto de la invención es el uso de dicho vector para preparar cepas mutantes de Mhyo. Another object of the invention is the use of said vector to prepare mutant strains of Mhyo.

Otro objeto de la invención es una cepa mutante de Mhyo obtenible mediante dicho método.Another object of the invention is a mutant strain of Mhyo obtainable by said method.

Otro objeto de la invención es una cepa mutante de Mhyo que comprende una secuencia exógena de ADN. Otro objeto de la invención es una cepa mutante de Mhyo que comprende el vector de la invención.Another object of the invention is a mutant strain of Mhyo comprising an exogenous DNA sequence. Another object of the invention is a mutant strain of Mhyo comprising the vector of the invention.

Otro objeto de la invención es una cepa de Mhyo transformada con el vector de la invención.Another object of the invention is a Mhyo strain transformed with the vector of the invention.

Otro objeto de la invención es la utilización de dicha cepa mutante como hospedador de expresión.Another object of the invention is the use of said mutant strain as an expression host.

Otro objeto de la invención es una vacuna que comprende dicha cepa mutante.Another object of the invention is a vaccine comprising said mutant strain.

Otro objeto de la invención es la utilización de la cepa mutante de Mhyo de la invención para la preparación de una vacuna.Another object of the invention is the use of the Mhyo mutant strain of the invention for the preparation of a vaccine.

Otro objeto de la invención es un kit de vacunación que comprende dicha cepa mutante.Another object of the invention is a vaccination kit comprising said mutant strain.

Los autores de la presente invención han desarrollado un método para preparar cepas mutantes de Mhyo con el que, sorprendentemente, se pueden introducir de forma estable secuencias exógenas de ADN en el citoplasma de una cepa de Mhyo, y se expresa el contenido de esas secuencias,The authors of the present invention have developed a method for preparing mutant strains of Mhyo with which, surprisingly, foreign DNA sequences can be stably introduced into the cytoplasm of a Mhyo strain, and the content of these sequences is expressed,

Por la expresión "una secuencia de ADN exógena introducida de forma estable en el citoplasma de una cepa de Mhyo" se entiende que dicha secuencia no se pierde a lo largo de las sucesivas generaciones de la bacteria que se ha transformado con dicha secuencia exógena. Esta estabilidad implica que la secuencia exógena de ADN puede replicar en el interior de la bacteria transformada y en sus descendientes y que se puede recuperar después de múltiples generaciones de la bacteria transformada.By the expression "an exogenous DNA sequence stably introduced into the cytoplasm of a Mhyo strain" it is understood that said sequence is not lost throughout the successive generations of the bacterium that has been transformed with said exogenous sequence. This stability implies that the exogenous DNA sequence can replicate within the transformed bacterium and its descendants and that it can be recovered after multiple generations of the transformed bacterium.

Con el método desarrollado se abre la puerta a modificar, por primera vez mediante herramientas de ingeniería genética, cepas de Mhyo. With the method developed, the door is opened to modify, for the first time using genetic engineering tools, strains of Mhyo.

Con dicho método se pueden preparar cepas mutantes de Mhyo que incluyen secuencias exógenas de ADN. Dichas cepas mutantes pueden presentar distintas características tales como, por ejemplo, expresar una proteína específica, o presentar un menor grado de virulencia con respecto a la cepa parental silvestre.With such a method, mutant strains of Mhyo can be prepared which include exogenous DNA sequences. Said mutant strains may present different characteristics such as, for example, expressing a specific protein, or presenting a lower degree of virulence with respect to the wild parent strain.

Dichas cepas mutantes se pueden emplear como vacunas, por ejemplo, vacunas vivas atenuadas, vacunas inactivadas, vacunas marcadoras, las cuales permiten diferenciar animales vacunados de animales infectados, o vacunas polivalentes frente a la neumonía enzoótica porcina y otra enfermedad adicional que puede afectar a los cerdos, tales como, por ejemplo, las infecciones provocadas por circovirus porcino de tipo 2 (CVP2).Said mutant strains can be used as vaccines, for example, live attenuated vaccines, inactivated vaccines, marker vaccines, which make it possible to differentiate vaccinated animals from infected animals, or polyvalent vaccines against swine enzootic pneumonia and another additional disease that can affect pigs. pigs, such as, for example, infections caused by porcine circovirus type 2 (CVP2).

El procedimiento de la invención ha permitido modificar genéticamente Mhyo por primera vez de forma estable, y con ello se ha conseguido, entre otras cosas, el uso de estas cepas transformadas como vector de expresión de secuencias exógenas de ADN como, por ejemplo, secuencias de nucleótidos que codifican proteínas de interés terapéutico o preventivo tales como la secuencia de la cápside del virus CVP2, entre otras. Mediante la tecnología divulgada en la presente invención, se han diseñado y preparado nuevos candidatos vacunales, que además son polivalentes ya que se pueden utilizar para prevenir diferentes enfermedades mediante la administración de una única cepa modificada con el procedimiento de la invención.The procedure of the invention has made it possible to genetically modify Mhyo for the first time in a stable manner, and with this has been achieved, among other things, the use of these transformed strains as a vector for the expression of exogenous DNA sequences, such as DNA sequences, for example. nucleotides that encode proteins of therapeutic or preventive interest such as the sequence of the capsid of the CVP2 virus, among others. Through the technology disclosed in the present invention, new vaccine candidates have been designed and prepared, which are also polyvalent since they can be used to prevent different diseases through the administration of a only strain modified with the procedure of the invention.

En la presente descripción y en las reivindicaciones, las formas en singular "un", "una" y "el" o "la" incluyen la referencia en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.In the present description and in the claims, the singular forms "a", "an" and "the" or "the" include reference to the plural unless the context clearly indicates otherwise.

Así mismo, en el contexto de la invención el término "secuencia" se refiere a una secuencia de ADN, excepto cuando se indica explícitamente que se refiere a una secuencia de aminoácidos.Likewise, in the context of the invention the term "sequence" refers to a DNA sequence, except when it is explicitly indicated that it refers to an amino acid sequence.

Descripción de los dibujosDescription of the drawings

Figura 1Figure 1

En la figura 1 se muestra un diagrama de los plásmidos replicativos utilizados para modificar genéticamente Mhyo y conseguir la producción de proteínas recombinantes o transcritos antisentido. Se encuentran indicados mediante flechas los promotores, los genes y los sitios para enzimas de restricción usados durante las operaciones de clonación.A diagram of the replicative plasmids used to engineer Mhyo to achieve the production of recombinant proteins or antisense transcripts is shown in Figure 1. Promoters, genes, and restriction enzyme sites used during cloning operations are indicated by arrows.

El plásmido pOG contiene los elementos necesarios para que este vector pueda replicar en Mhyo a la vez que permite la selección de las células portadoras de dicho plásmido. Este plásmido tiene la región oriC de Mhyo (bases 2096 a 4043) y el gen marcador de resistencia a gentamicina (aac, bases 1 a 1816) bajo el control del promotor del gen de la proteína P97 de Mhyo (pp97, bases 1823 a 2087).The pOG plasmid contains the necessary elements for this vector to be able to replicate in Mhyo while allowing the selection of cells carrying said plasmid. This plasmid has the Mhyo oriC region (bases 2096 to 4043) and the gentamicin resistance marker gene ( aac, bases 1 to 1816) under the control of the Mhyo P97 protein gene promoter ( pp97, bases 1823 to 2087 ).

El plásmido pOGCRE procede directamente del plásmido pOG y además contiene el gen cre del fago P1 (bases 1 a 1032) bajo el control del promotor pp97 (bases 1039-1303).Plasmid pOGCRE is derived directly from plasmid pOG and additionally contains the P1 phage cre gene (bases 1 to 1032) under the control of the pp97 promoter (bases 1039-1303).

A diferencia de los plásmidos anteriores, el plásmido pOGA159 contiene el gen de resistencia a tetraciclina (tetM, bases 945 a 2883) bajo control del promotor pp97 (bases 674-938). La región oriC de Mhyo está situada entre las bases 2901-4848. Finalmente, contiene un segmento del genoma de Mhyo correspondiente al extremo 5' del gen tlyA (a159, bases 4855 a 4980) orientado de forma inversa y bajo el control del promotor pp97 (bases 4996­ 5260).Unlike the previous plasmids, plasmid pOGA159 contains the tetracycline resistance gene ( tetM, bases 945 to 2883) under the control of the pp97 promoter (bases 674-938). The Mhyo oriC region is located between bases 2901-4848. Finally, it contains a segment of the Mhyo genome corresponding to the 5' end of the tlyA gene ( a159, bases 4855 to 4980) oriented inversely and under the control of the pp97 promoter (bases 4996 5260).

Figura 2Figure 2

En la figura 2 se muestra un diagrama de los plásmidos replicativos utilizados para modificar genéticamente Mhyo y conseguir la producción de diferentes versiones recombinantes de la proteína de la cápside del virus CVP2. Se encuentran indicados mediante flechas los promotores, los genes y los sitios para enzimas de restricción usados durante las operaciones de clonación.Figure 2 shows a diagram of the replicative plasmids used to genetically modify Mhyo and achieve the production of different recombinant versions of the CVP2 virus capsid protein. Promoters, genes, and restriction enzyme sites used during cloning operations are indicated by arrows.

El plásmido pOGC contiene exactamente los mismos elementos que el plásmido pOG (Figura 1) y además incluye una copia adicional del promotor pp97 (bases 7654-7918), que controla la expresión del gen sintético que codifica la cápside de circovirus incluido en la ORF2V2 (bases 6946-7647) de la cápside del virus CVP2. Este plásmido permite la expresión de la proteína de la cápside de CVP2 en el citoplasma de la célula portadora. El plásmido pOGL contiene exactamente los mismos elementos que el plásmido pOG (Figura 1) y además incluye la secuencia promotora del gen de la proteína P46 de Mhyo (pp46: bases 8918-9181), que controla la expresión de una fusión del gen de la proteína de la cápside del virus CVP2 (ORF2) dentro del gen que codifica la proteína de membrana P46 de Mhyo (bases 8642-8917 y 6946-7930). Este plásmido produce una proteína híbrida que se caracteriza porque los aminoácidos 1 a 92 provienen del extremo N-terminal de la proteína P46, los aminoácidos 95 a 327 corresponden a la proteína de la cápside del virus CVP2 y los aminoácidos 330-656 provienen del extremo C-terminal de la proteína P46 de Mhyo. The pOGC plasmid contains exactly the same elements as the pOG plasmid (Figure 1) and also includes an additional copy of the pp97 promoter (bases 7654-7918), which controls the expression of the synthetic gene encoding the circovirus capsid included in ORF2V2 ( bases 6946-7647) of the CVP2 virus capsid. This plasmid allows the expression of the CVP2 capsid protein in the cytoplasm of the carrier cell. The pOGL plasmid contains exactly the same elements as the pOG plasmid (Figure 1) and additionally includes the promoter sequence of the Mhyo P46 protein gene (pp46: bases 8918-9181), which controls the expression of a fusion of the pOGL gene. CVP2 virus capsid protein (ORF2) within the gene encoding the Mhyo membrane protein P46 (bases 8642-8917 and 6946-7930). This plasmid produces a hybrid protein characterized in that amino acids 1 to 92 come from the N-terminus of the P46 protein, amino acids 95 to 327 correspond to the CVP2 virus capsid protein, and amino acids 330-656 come from the end. C-terminus of the Mhyo protein P46.

El plásmido pOGT contiene exactamente los mismos elementos que el plásmido pOG (Figura 1) y además incluye la secuencia promotora pp46 (bases 8905-9169), que controla la expresión de una fusión del gen de la proteína de la cápside del virus CVP2 (ORF2) en el extremo 3' del gen que codifica la proteína de membrana P46 de Mhyo (bases 7648-8904). Este plásmido produce una proteína híbrida que se caracteriza porque los aminoácidos 1 a 419 provienen de la proteína p46 y los aminoácidos 420 a 652 corresponden a la proteína de la cápside del virus CVP2, versión ORf2 (bases 6946-7647).The pOGT plasmid contains exactly the same elements as the pOG plasmid (Figure 1) and also includes the pp46 promoter sequence (bases 8905-9169), which controls the expression of a CVP2 virus capsid protein (ORF2) gene fusion. ) at the 3' end of the gene encoding the Mhyo membrane protein P46 (bases 7648-8904). This plasmid produces a hybrid protein characterized in that amino acids 1 to 419 come from the p46 protein and amino acids 420 to 652 correspond to the CVP2 virus capsid protein, ORf2 version (bases 6946-7647).

Figura 3 (no es parte de la invención)Figure 3 (not part of the invention)

En la figura 3 se muestra un diagrama de los plásmidos portadores de minitransposones utilizados para obtener inserciones en el cromosoma de Mhyo. Se encuentran indicados mediante flechas los promotores, genes, dianas de enzimas de restricción usadas para la construcción de los plásmidos y otras secuencias de ADN importantes. El plásmido pTC3 contiene los elementos necesarios para la obtención de cepas de Mhyo que portan inserciones de transposón. Este plásmido se ha construido sobre el esqueleto del plásmido pMTn4001. El primer elemento de este plásmido es el promotor pp97 (bases 7-271), que controla la expresión de la transposasa del plásmido pMTn4001 (bases 284-1261). Las bases 1461-1486 y 3774-3799 corresponden a las repeticiones invertidas y se encuentran indicadas en el esquema como IRI e iRo , respectivamente. El último elemento de este plásmido corresponde al gen marcador de resistencia a tetraciclina (bases 1761-3692), que también se encuentra bajo el control del promotor de la proteína P97 de Mhyo (1502-1766).A diagram of the minitransposon-carrying plasmids used to obtain Mhyo chromosome insertions is shown in Figure 3. Promoters, genes, restriction enzyme targets used for construction of the plasmids, and other important DNA sequences are indicated by arrows. The pTC3 plasmid contains the necessary elements to obtain Mhyo strains that carry transposon insertions. This plasmid has been built on the backbone of plasmid pMTn4001. The first element of this plasmid is the pp97 promoter (bases 7-271), which controls the expression of transposase from plasmid pMTn4001 (bases 284-1261). Bases 1461-1486 and 3774-3799 correspond to the inverted repeats and are indicated in the scheme as IRI and iR o , respectively. The last element of this plasmid corresponds to the tetracycline resistance marker gene (bases 1761-3692), which is also under the control of the Mhyo P97 protein promoter (1502-1766).

El plásmido pTC366 procede directamente del plásmido pTC3, y contiene las secuencias de lox66 (sustrato de la recombinasa Cre, bases 1485-1518 y 3762-3795) flanqueando el gen marcador de resistencia a tetraciclina TetM (bases 1791-3722).Plasmid pTC366 is derived directly from plasmid pTC3, and contains the lox66 sequences (Cre recombinase substrate, bases 1485-1518 and 3762-3795) flanking the tetracycline resistance marker gene TetM (bases 1791-3722).

El plásmido pTC3C procede directamente del plásmido pTC366, y contiene el gen que codifica la proteína de la cápside del virus CVP2 ORF2V2 (bases 4078-4779) del virus CVP2, bajo control del promotor pp97 (bases 38084071). Este plásmido promueve la síntesis de la proteína recombinante correspondiente a la proteína de la cápside de CVP2 en el citoplasma de la cepa de Mhyo transformada por dicho plásmido.Plasmid pTC3C is derived directly from plasmid pTC366, and contains the gene encoding the CVP2 virus capsid protein ORF2V2 (bases 4078-4779) of the CVP2 virus, under the control of the pp97 promoter (bases 4078-4779). 38084071). This plasmid promotes the synthesis of the recombinant protein corresponding to the CVP2 capsid protein in the cytoplasm of the Mhyo strain transformed by said plasmid.

El plásmido pTC3L procede directamente del plásmido pTC366, y contiene una fusión del gen de la proteína de la cápside del virus CVP2 (ORF2) dentro del gen que codifica la proteína de membrana P46 de Mhyo (bases 4347-5045 y 4066-4340 y 5052-6036, respectivamente), bajo el control del promotor pp46 (bases 3801-4065). Este plásmido estimula la síntesis de una proteína híbrida que se caracteriza porque los aminoácidos 1 a 92 provienen del extremo N-terminal de la proteína P46, los aminoácidos 95 a 327 corresponden a la proteína de la cápside del virus CVP2 y los aminoácidos 330-656 provienen del extremo C-terminal de la proteína P46 de Mhyo. Plasmid pTC3L is derived directly from plasmid pTC366, and contains a fusion of the CVP2 virus capsid protein ( ORF2) gene into the gene encoding the Mhyo P46 membrane protein (bases 4347-5045 and 4066-4340 and 5052 -6036, respectively), under the control of the pp46 promoter (bases 3801-4065). This plasmid stimulates the synthesis of a hybrid protein characterized in that amino acids 1 to 92 come from the N-terminal end of the P46 protein, amino acids 95 to 327 correspond to the CVP2 virus capsid protein, and amino acids 330-656 come from the C-terminus of the Mhyo protein P46.

El plásmido pTC3T procede directamente del plásmido pTC366, y contiene una fusión entre el gen de la proteína de la cápside del virus CVP2 (ORF2) y el gen que codifica la proteína de membrana P46 de Mhyo (bases 5322­ 6031 y 4065-5321, respectivamente), bajo el control del promotor del gen que codifica la proteína P46 de Mhyo (bases 3801-4065). Este plásmido estimula la síntesis de una proteína híbrida que se caracteriza porque los aminoácidos 1 a 419 provienen de la proteína P46 y los aminoácidos 420 a 652 corresponden a la proteína de la cápside del virus CVP2.Plasmid pTC3T is derived directly from plasmid pTC366, and contains a fusion between the CVP2 virus capsid protein gene ( ORF2) and the gene encoding the Mhyo P46 membrane protein (bases 5322-6031 and 4065-5321, respectively). ), under the control of the promoter of the gene encoding the Mhyo P46 protein (bases 3801-4065). This plasmid stimulates the synthesis of a hybrid protein characterized in that amino acids 1 to 419 come from the P46 protein and amino acids 420 to 652 correspond to the CVP2 virus capsid protein.

Figura 4Figure 4

En la figura 4 se muestra la estabilidad de los plásmidos replicativos y su utilidad en la producción de proteínas recombinantes.Figure 4 shows the stability of replicative plasmids and their usefulness in the production of recombinant proteins.

Esta figura está dividida en 3 paneles. En el panel A se muestra una electroforesis en gel de agarosa al 0,7 % a la que se le ha aplicado un voltaje de 6 V/cm durante 2 horas. En el carril M se encuentra el marcador de peso molecular 1kb plus ladder (Invitrogen). En el carril 1 se encuentra el plásmido pOG aislado a partir E. coli Xl1-blue y digerido con la enzima de restricción ScaI. En el carril 2 se encuentra un extracto de ADN total de la cepa 232POGc9 de Mhyo digerido con la enzima de restricción ScaI. Las bandas esperadas del plásmido pOG digerido con la enzima de restricción ScaI son de 3564 pb, 2225 pb y 1143 pb (Figura 4, Panel A). Mediante la comparación con el marcador de peso molecular y las bandas del plásmido aislado de E. coli Xl1-blue se confirma que el plásmido pOG se propaga de forma estable en la cepa 232POGc9. A la izquierda de la figura se encuentran indicadas las longitudes de los diferentes fragmentos del marcador de ADN de interés.This figure is divided into 3 panels. Panel A shows a 0.7% agarose gel electrophoresis to which a voltage of 6 V/cm has been applied for 2 hours. In lane M is the 1kb plus ladder molecular weight marker (Invitrogen). In lane 1 is the pOG plasmid isolated from E. coli Xl1-blue and digested with the restriction enzyme ScaI. In lane 2 is a total DNA extract of Mhyo strain 232POGc9 digested with the restriction enzyme ScaI. The expected bands of plasmid pOG digested with the restriction enzyme ScaI are 3564 bp, 2225 bp and 1143 bp (Figure 4, Panel A). Comparison with the molecular weight marker and the bands of the plasmid isolated from E. coli Xl1-blue confirms that the pOG plasmid is propagated stably in strain 232POGc9. On the left of the figure are indicated the lengths of the different fragments of the DNA marker of interest.

En el panel B se muestra una transferencia tipo Western de una electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida con muestras proteicas de diferentes cepas de Mhyo detectadas mediante un anticuerpo policlonal específico de la recombinasa Cre del bacteriófago P1. En el carril 1 se muestra un extracto proteico de la cepa 232POGCREc1, donde se observa la banda esperada de 39 kDa. En el carril 2 se muestra un extracto de la cepa 232 donde no se observa ninguna banda y en el carril M se encuentra el marcador de peso molecular Precision Plus Protein Dual Xtra (Biorad). A la derecha de la figura se muestran en kDa los pesos moleculares de interés. Estos resultados indican que el plásmido pOGCRE es capaz de producir la proteína Cre una vez transformado en la cepa 232 de Mhyo. Panel B shows a Western blot of denaturing polyacrylamide gel electrophoresis with protein samples from different Mhyo strains detected by a polyclonal antibody specific for bacteriophage P1 Cre recombinase. In lane 1, a protein extract of the 232POGCREc1 strain is shown, where the expected band of 39 kDa is observed. Lane 2 shows an extract of strain 232 where no band is observed and lane M shows the Precision Plus Protein Dual Xtra (Biorad) molecular weight marker. To the right of the figure the molecular weights of interest are shown in kDa. These results indicate that the pOGCRE plasmid is capable of producing the Cre protein once transformed into Mhyo strain 232.

En el panel C se muestra una electroforesis en gel de agarosa en la que se analizan muestras de DNA de la cepa parental 6314 de Mhyo (carril 1) y de la cepa 6314pOGAc4, producto de la transformación de la cepa 6314 con el plásmido pOGA159 (carril 2). Las flechas indican la posición de las dos conformaciones adoptadas por el plásmido pOGA159 en la cepa mutante transformada de Mhyo. Panel C shows an agarose gel electrophoresis in which DNA samples of the parental Mhyo strain 6314 (lane 1) and strain 6314pOGAc4, product of the transformation of strain 6314 with plasmid pOGA159 ( lane 2). The arrows indicate the position of the two conformations adopted by plasmid pOGA159 in the transformed Mhyo mutant strain.

Figura 5 (no es parte de la invención)Figure 5 (not part of the invention)

En la figura 5 se muestra la recuperación de cepas de Mhyo portadoras de inserciones por transposón y la utilidad de las mismas en la producción de proteínas recombinantes.Figure 5 shows the recovery of Mhyo strains carrying transposon insertions and their usefulness in the production of recombinant proteins.

Esta figura está dividida en 3 paneles. El panel A (carriles M y 1 a 4) muestra una electroforesis en gel de agarosa al 0,7 % a la que se le ha aplicado un voltaje de 6 V/cm durante 2 horas, mientras que en la parte derecha del panel A (carriles 5 a 8) se muestra una transferencia tipo Southern de este mismo gel sobre una membrana de nylon. Las bandas observadas en la transferencia tipo Southern corresponden a las bandas reconocidas por una sonda diseñada frente a la secuencia de TetM bajo el control del promotor de la proteína P97 de Mhyo. En el carril M se encuentra el marcador de peso molecular 1 kb Plus Ladder (Invitrogen). Los carriles 1 y 5 corresponden a una extracción de ADN total proveniente de la cepa 232TC3hlyC digerido con la enzima de restricción EcoRI. Los carriles 2 y 6 corresponden a una extracción de ADN total proveniente de la cepa 232 digerida con la enzima de restricción EcoRI. Los carriles 3 y 7 corresponden a una extracción de ADN total de la cepa 232TC3hlyC digerida con la enzima de restricción EcoRV. Los carriles 4 y 8 corresponden a una extracción de ADN total de la cepa 232 digerida con EcoRV. La banda de 6,3 kb en el carril 5 y la banda de 2 kb en el carril 7 demuestran la presencia del transposón que contiene la resistencia TetM bajo el promotor de la proteína P97 en el genoma de Mhyo, mientras que la ausencia de estas bandas en los carriles 6 y 8 corroboran estos resultados.This figure is divided into 3 panels. Panel A (lanes M and 1 to 4) shows a 0.7% agarose gel electrophoresis to which a voltage of 6 V/cm has been applied for 2 hours, while on the right side of panel A (lanes 5 to 8) a Southern blot of this same gel onto a nylon membrane is shown. The bands observed in the Southern blot correspond to the bands recognized by a probe designed against the TetM sequence under the control of the Mhyo P97 protein promoter. In lane M is the 1 kb Plus Ladder molecular weight marker (Invitrogen). Lanes 1 and 5 correspond to an extraction of total DNA from the 232TC3hlyC strain digested with the EcoRI restriction enzyme. Lanes 2 and 6 correspond to a total DNA extraction from strain 232 digested with the EcoRI restriction enzyme. Lanes 3 and 7 correspond to a total DNA extraction of the 232TC3hlyC strain digested with the restriction enzyme EcoRV. Lanes 4 and 8 correspond to a total DNA extraction from strain 232 digested with EcoRV. The 6.3 kb band in lane 5 and the 2 kb band in lane 7 demonstrate the presence of the TetM resistance-containing transposon under the P97 protein promoter in the Mhyo genome, whereas the absence of these bands in lanes 6 and 8 corroborate these results.

En el panel B se muestran los resultados de un ensayo de ELISA realizado con el kit INGEZIM PCV DAS (Ingenasa, España) con diferentes muestras proteicas de Mhyo. En la columna izquierda de la tabla se encuentra indicada la dilución utilizada en cada uno de los ensayos, mientras que en la fila superior se muestra la cepa analizada. Los resultados numéricos son los valores de la lectura de absorbancia a una longitud de onda de 450 nm normalizada por la cantidad de proteína introducida en cada pocillo. Todas las cepas de Mhyo transformadas con los vectores pTC3C, pTC3L y pTC3T presentan una absorbancia claramente superior a la del control negativo, lo que indica que en cada una de estas cepas tiene lugar la expresión de la proteína recombinante de la cápside de CVP2. Panel B shows the results of an ELISA assay performed with the INGEZIM PCV DAS kit (Ingenasa, Spain) with different Mhyo protein samples. The dilution used in each of the assays is indicated in the left column of the table, while the strain analyzed is shown in the upper row. The numerical results are the values of the absorbance reading at a wavelength of 450 nm normalized by the amount of protein introduced into each well. All Mhyo strains transformed with the pTC3C, pTC3L and pTC3T vectors show a clearly higher absorbance than the negative control, indicating that expression of the recombinant CVP2 capsid protein occurs in each of these strains.

En el panel C se muestra una transferencia tipo Western de una electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida con muestras proteicas de diferentes cepas de Mhyo detectadas mediante un anticuerpo monoclonal específico de la proteína de la cápside de CVP2. El carril 1 contiene un extracto proteico de la cepa 232Cc6 dónde se observa la banda esperada de 28 kDa. El carril 2 contiene un extracto proteico de la cepa 232 donde no se observa ninguna banda. El carril 3 contiene una muestra proteica de la cápside de CVP2 suministrada como control positivo en el kit INGEZIM PCV DAS (Ingenasa, España), donde se observa la banda de 28 kDa esperada. El carril 4 contiene un extracto proteico de la cepa 6314 donde no se observa ninguna banda, mientras que en el carril 5 se encuentra el extracto proteico de la cepa 6314Cc1 donde se observa la banda esperada de 28 kDa, aunque con una intensidad más débil que las de los carriles 1 y 3. Estos resultados indican que tanto en la cepa 6314 como la 232, la inserción del transposón presente en el plásmido pTC3C en el genoma de Mhyo induce la expresión de la proteína de la cápside de CVP2, codificada por ORF2v2. Panel C shows a Western blot of a denaturing polyacrylamide gel electrophoresis with protein samples from different Mhyo strains detected by a monoclonal antibody specific for the CVP2 capsid protein. Lane 1 contains a protein extract of the 232Cc6 strain where the expected band of 28 kDa is observed. Lane 2 contains a protein extract of strain 232 where no band is observed. Lane 3 contains a protein sample of the CVP2 capsid supplied as a positive control in the INGEZIM PCV DAS kit (Ingenasa, Spain), where the expected 28 kDa band is observed. Lane 4 contains a protein extract from strain 6314 where no band is observed, while lane 5 contains the protein extract from strain 6314Cc1 where the expected 28 kDa band is observed, although with a weaker intensity than those of lanes 1 and 3. These results indicate that in both strains 6314 and 232, the insertion of the transposon present in the pTC3C plasmid in the Mhyo genome induces the expression of the CVP2 capsid protein, encoded by ORF2v2. .

Figura 6 (no es parte de la invención)Figure 6 (not part of the invention)

En la figura 6 se muestra la respuesta serológica frente a Mhyo obtenida con las vacunas experimentales, grupos 1 a 4 del Ejemplo 7.1. Los grupos 5 y 6 corresponden respectivamente al grupo control no vacunado, pero sí infectado y al grupo control no vacunado y no infectado.Figure 6 shows the serological response against Mhyo obtained with the experimental vaccines, groups 1 to 4 of Example 7.1. Groups 5 and 6 correspond respectively to the unvaccinated but infected control group and the unvaccinated and uninfected control group.

En el eje de abscisas se encuentra el día del estudio en el que se efectuó el análisis, y en el de ordenadas se representa la relación S/P (formas sigladas de sample/positive, muestra/positivo) expresada en % medida por ELISA, como indicador de la respuesta de anticuerpos IgG frente a Mhyo. The abscissa axis shows the day of the study on which the analysis was performed, and the ordinate axis represents the S/P ratio (abbreviated forms of sample/positive, sample/positive) expressed in % measured by ELISA, as an indicator of the IgG antibody response against Mhyo.

El asterisco indica que la diferencia con relación al grupo control no vacunado, pero sí infectado, es estadísticamente significativa (p<0,05, de acuerdo con la prueba de la U de Mann-Whitney).The asterisk indicates that the difference in relation to the non-vaccinated but infected control group is statistically significant (p<0.05, according to the Mann-Whitney U test).

Figura 7 (no es parte de la invención)Figure 7 (not part of the invention)

En la figura 7 se muestra la respuesta serológica a circovirus porcino (CVP2) obtenida con las vacunas experimentales, grupos 1 a 4 del Ejemplo 7.1. Los grupos 5 y 6 corresponden respectivamente al grupo control no vacunado, pero sí infectado y al grupo control no vacunado y no infectado.Figure 7 shows the serological response to porcine circovirus (CVP2) obtained with the experimental vaccines, groups 1 to 4 of Example 7.1. Groups 5 and 6 correspond respectively to the unvaccinated but infected control group and the unvaccinated and uninfected control group.

En el eje de abscisas se encuentra el día del estudio en el que se efectuó el análisis, y en el de ordenadas se representa la relación S/P (muestra/positivo) expresada en % medida por ELISA, como indicador de la respuesta de anticuerpos IgG frente a CVP2.The abscissa axis shows the day of the study on which the analysis was carried out, and the ordinate represents the S/P ratio (sample/positive) expressed as a % measured by ELISA, as an indicator of the antibody response. IgG against CVP2.

El asterisco indica que la diferencia con relación al grupo control no vacunado, pero sí infectado, es estadísticamente significativa (p<0,05, de acuerdo con la prueba de ANOVA unidireccional).The asterisk indicates that the difference in relation to the non-vaccinated but infected control group is statistically significant (p<0.05, according to the one-way ANOVA test).

Figura 8 (no es parte de la invención)Figure 8 (not part of the invention)

En la figura 8 se muestra la carga vírica en suero en los grupos de tratamiento 1 a 4, y en los grupos control 5 y 6 del Ejemplo 7.1.The serum viral load in treatment groups 1 to 4, and in control groups 5 and 6 of Example 7.1 is shown in Figure 8.

En el eje de abscisas se encuentra el día del estudio en el que se efectuó el análisis, y en el de ordenadas se representa el log-10 de la carga vírica de circovirus porcino de tipo 2 (CVP2) en suero expresada en copias/ml. El asterisco indica que la diferencia con relación al grupo control (no vacunado e infectado) es estadísticamente significativa (p<0,05, de acuerdo con la prueba de la U de Mann-Whitney).The abscissa axis shows the day of the study on which the analysis was carried out, and the ordinate axis represents the log -10 of the viral load of porcine circovirus type 2 (PVC2) in serum expressed in copies/ml . The asterisk indicates that the difference in relation to the control group (unvaccinated and infected) is statistically significant (p<0.05, according to the Mann-Whitney U test).

Figura 9Figure 9

En la figura 9 se muestra la respuesta serológica a la infección por Mhyo de acuerdo con el Ejemplo 8.2. El grupo 1 corresponde a los animales infectados con la cepa mutante del Ejemplo 4.8, el grupo 2 a los animales infectados con la cepa parental silvestre y el grupo 3 es el grupo control no infectado.The serological response to Mhyo infection according to Example 8.2 is shown in Figure 9. Group 1 corresponds to the animals infected with the mutant strain of Example 4.8, group 2 to the animals infected with the wild-type parental strain and group 3 is the uninfected control group.

En el eje de abscisas se encuentra el día del estudio en el que se efectuó el análisis, y en el de ordenadas se representa la relación S/P (muestra/positivo) expresada en % medida por ELISA, como indicador de la respuesta de anticuerpos IgG frente a Mhyo. The abscissa axis shows the day of the study on which the analysis was carried out, and the ordinate represents the S/P ratio (sample/positive) expressed as a % measured by ELISA, as an indicator of the antibody response. IgG against Mhyo.

El asterisco indica que la diferencia con relación al grupo infectado con la cepa parental de tipo silvestre es estadísticamente significativa (p<0,05, de acuerdo con la prueba de ANOVA unidireccional).The asterisk indicates that the difference from the group infected with the wild-type parent strain is statistically significant (p<0.05, according to the one-way ANOVA test).

Figura 10Figure 10

En la figura 10 se muestra el porcentaje de animales positivos para Mhyo por PCR del Ejemplo 8.2. El grupo 1 corresponde a los animales infectados con la cepa mutante del Ejemplo 4.8, el grupo 2 a los animales infectados con la cepa parental de tipo silvestre y el grupo 3 es el grupo control no infectado.Figure 10 shows the percentage of animals positive for Mhyo by PCR of Example 8.2. Group 1 corresponds to animals infected with the mutant strain of Example 4.8, group 2 to animals infected with the wild-type parental strain and group 3 is the uninfected control group.

En el eje de abscisas se encuentra el día del estudio en el que se efectuó el análisis así como el tipo de muestra analizada (nasal o bronquial), y en el de ordenadas se representa el porcentaje de animales positivos por PCR. El asterisco indica que la diferencia con relación al grupo infectado con la cepa parental de tipo silvestre es estadísticamente significativa (p<0,05, de acuerdo con la prueba exacta de Fisher).The abscissa axis shows the day of the study on which the analysis was carried out, as well as the type of sample analyzed (nasal or bronchial), and the ordinate axis represents the percentage of animals positive by PCR. The asterisk indicates that the difference from the group infected with the wild-type parent strain is statistically significant (p<0.05, according to Fisher's exact test).

Figura 11Figure 11

En la figura 11 se muestra la superficie media de pulmón afectada por lesiones atribuibles a una infección por Mhyo de acuerdo con el ensayo del Ejemplo 8.2. El grupo 1 corresponde a los animales infectados con la cepa mutante del Ejemplo 4.8, el grupo 2 a los animales infectados con la cepa parental de tipo silvestre y el grupo 3 es el grupo control no infectado.Figure 11 shows the mean lung area affected by lesions attributable to Mhyo infection according to the test of Example 8.2. Group 1 corresponds to animals infected with the mutant strain of Example 4.8, group 2 to animals infected with the wild-type parental strain and group 3 is the uninfected control group.

En el eje de ordenadas se representa el valor medio de la superficie del pulmón afectada.The mean value of the affected lung area is represented on the ordinate axis.

El asterisco indica que la diferencia con relación al grupo infectado con la cepa parental de tipo silvestre es estadísticamente significativa (p<0,05, de acuerdo con la prueba de la U de Mann-Whitney).The asterisk indicates that the difference from the group infected with the wild-type parent strain is statistically significant (p<0.05, according to the Mann-Whitney U test).

Figura 12 (no es parte de la invención)Figure 12 (not part of the invention)

En la figura 12 se muestra la carga vírica en suero determinada en el grupo de tratamiento 1, y en los grupos control 2 y 3 del Ejemplo 7.2.Shown in Figure 12 is the serum viral load determined in treatment group 1, and in control groups 2 and 3 of Example 7.2.

En el eje de abscisas se encuentra el día posinfección en el que se efectuó el análisis, y en el de ordenadas se representa el log10 de la carga vírica de circovirus porcino de tipo 2 (CVP2) en suero expresada en copias/ml determinada mediante PCR cuantitativa.The abscissa axis shows the post-infection day on which the analysis was carried out, and the ordinate axis represents the log 10 viral load of porcine circovirus type 2 (PVC2) in serum expressed in copies/ml determined by Quantitative PCR.

Figura 13 (no es parte de la invención)Figure 13 (not part of the invention)

En la figura 13 se muestra el porcentaje de animales que presentaban viremia por CVP2 en el grupo de tratamiento 1, y en los grupos control 2 y 3 del Ejemplo 7.2.Figure 13 shows the percentage of animals that presented viremia by CVP2 in treatment group 1, and in control groups 2 and 3 of Example 7.2.

En el eje de abscisas se encuentra el día posinfección en el que se efectuó el análisis, y en el de ordenadas se representa el porcentaje de animales positivos.The abscissa axis shows the post-infection day on which the analysis was carried out, and the ordinate axis represents the percentage of positive animals.

Figura 14 (no es parte de la invención)Figure 14 (not part of the invention)

En la figura 14 se muestra la mediana de superficie de pulmón afectada por lesiones compatibles con Mhyo expresada en porcentaje para el grupo de tratamiento 1, y para los grupos control 2 y 3 del Ejemplo 7.2, a los 28 días posinfección.Figure 14 shows the median surface area of the lung affected by lesions compatible with Mhyo expressed as a percentage for treatment group 1, and for control groups 2 and 3 of Example 7.2, at 28 days post-infection.

En el eje de abscisas se encuentra el grupo y en el de ordenadas está la mediana de superficie de pulmón afectada por lesiones compatibles con Mhyo. The group is on the abscissa axis and the median lung area affected by lesions compatible with Mhyo is on the ordinate axis.

Descripción detallada de la invenciónDetailed description of the invention

La presente invención proporciona las siguientes realizaciones como se definen en los puntos 1-15 a continuación: 1. - Un método para preparar una cepa mutante de Mycoplasma hyopneumoniae, caracterizado porque comprende la etapa de transformar una cepa de M. hyopneumoniae mediante el uso de un vector portador que comprende al menos una secuencia exógena de ADN, estando la secuencia bajo el control de una secuencia de ADN de una región promotora de M. hyopneumoniae, The present invention provides the following embodiments as defined in points 1-15 below: 1. - A method for preparing a mutant strain of Mycoplasma hyopneumoniae, characterized in that it comprises the step of transforming a strain of M. hyopneumoniae by using a carrier vector comprising at least one exogenous DNA sequence, the sequence being under the control of a DNA sequence of a promoter region of M. hyopneumoniae,

donde el vector portador es un vector plasmídico replicativo que comprende:where the carrier vector is a replicative plasmid vector comprising:

1) una secuencia de ADN que comprende la región oriC de una cepa de Mycoplasma sp., que es Mycoplasma hyopneumoniae, y1) a DNA sequence comprising the oriC region of a strain of Mycoplasma sp., which is Mycoplasma hyopneumoniae, and

2) una secuencia exógena de ADN que comprende un gen marcador, y opcionalmente, una secuencia exógena de ADN adicional, que está bajo el control de una secuencia de ADN de una región promotora de Mhyo, 2) an exogenous DNA sequence comprising a marker gene, and optionally, an additional exogenous DNA sequence, which is under the control of a Mhyo promoter region DNA sequence,

donde la región promotora de Mhyo corresponde a un segmento de ADN que comprende entre 50 pares de bases y 300 pares de bases ubicadas en el lado 5' del gen de una proteína de Mhyo seleccionada del grupo formado por las proteínas P36, P46, P65, P76, P97, P102, P146 y P216,where the Mhyo promoter region corresponds to a DNA segment between 50 base pairs and 300 base pairs located on the 5' side of the gene of a Mhyo protein selected from the group consisting of proteins P36, P46, P65, P76, P97, P102, P146 and P216,

donde la región promotora de Mhyo inicia o activa la transcripción de una secuencia de ADN de Mhyo, y donde la secuencia exógena de ADN se introduce de forma estable en el citosol de la cepa de Mhyo. where the Mhyo promoter region initiates or activates the transcription of a Mhyo DNA sequence, and where the exogenous DNA sequence is stably introduced into the cytosol of the Mhyo strain.

2. - El método de acuerdo con el punto 1, caracterizado porque la secuencia exógena de ADN se selecciona del grupo que comprende un gen de resistencia a un antibiótico, un gen que codifica una recombinasa, un fragmento de ADN de Mhyo, un gen que codifica un componente antigénico de un microorganismo que provoca enfermedades porcinas y combinaciones de los mismos.2. - The method according to point 1, characterized in that the exogenous DNA sequence is selected from the group comprising an antibiotic resistance gene, a gene encoding a recombinase, a Mhyo DNA fragment, a gene that encodes an antigenic component of a microorganism that causes swine diseases and combinations thereof.

3. - El método de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 o 2, caracterizado porque la secuencia exógena de ADN adicional se selecciona del grupo formado por la secuencia de ADN que codifica la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 (CVP2) y la secuencia de ADN que codifica una proteína que comprende la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 (CVP2) que porta adicionalmente los aminoácidos MetSerGlySer en el extremo N-terminal de dicha proteína, seleccionándose dicha secuencia exógena de ADN adicional que codifica la proteína de la cápside de CVP2 del grupo formado por la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 5.3. - The method according to any one of points 1 or 2, characterized in that the additional exogenous DNA sequence is selected from the group formed by the DNA sequence encoding the capsid protein of porcine circovirus type 2 (CVP2 ) and the DNA sequence encoding a protein comprising the porcine circovirus type 2 (CVP2) capsid protein additionally carrying the MetSerGlySer amino acids at the N-terminus of said protein, said additional exogenous DNA sequence being selected encodes the CVP2 capsid protein from the group consisting of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5.

4. - El método de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 3, caracterizado porque la región promotora de Mhyo comprende la región promotora del gen de una proteína de Mhyo seleccionada del grupo formado por las proteínas P46 y P97.4. - The method according to any one of points 1 to 3, characterized in that the promoter region of Mhyo comprises the promoter region of the gene of a Mhyo protein selected from the group formed by the P46 and P97 proteins.

5. - El método de acuerdo con el punto 4, caracterizado porque la región promotora de Mhyo comprende la región promotora del gen de la proteína P46 de Mhyo. 5. - The method according to point 4, characterized in that the Mhyo promoter region comprises the promoter region of the Mhyo P46 protein gene.

6. - El método de acuerdo con el punto 4, caracterizado porque la región promotora de Mhyo comprende la región promotora del gen de la proteína P97 de Mhyo. 6. - The method according to point 4, characterized in that the Mhyo promoter region comprises the promoter region of the Mhyo P97 protein gene.

7. - Un vector plasmídico replicativo, caracterizado porque comprende:7. - A replicative plasmid vector, characterized in that it comprises:

1) una secuencia de ADN que comprende la región oriC de una cepa de Mycoplasma sp., que es Mycoplasma hyopneumoniae, y1) a DNA sequence comprising the oriC region of a strain of Mycoplasma sp., which is Mycoplasma hyopneumoniae, and

2) una secuencia exógena de ADN que comprende un gen marcador y, opcionalmente, una secuencia exógena de ADN adicional que está bajo el control de una secuencia de ADN de una región promotora de Mhyo, 2) an exogenous DNA sequence comprising a marker gene and, optionally, an additional exogenous DNA sequence that is under the control of a Mhyo promoter region DNA sequence,

donde la región promotora de Mhyo corresponde a un segmento de ADN que comprende entre 50 pares de bases y 300 pares de bases ubicadas en el lado 5' del gen de una proteína de Mhyo seleccionada del grupo formado por las proteínas P36, P46, P65, P76, P97, P102, P146 y P216,where the Mhyo promoter region corresponds to a DNA segment between 50 base pairs and 300 base pairs located on the 5' side of the gene of a Mhyo protein selected from the group consisting of proteins P36, P46, P65, P76, P97, P102, P146 and P216,

donde la región promotora de Mhyo inicia o promueve la transcripción de una secuencia de ADN de Mhyo. 8. - El vector plasmídico replicativo de acuerdo con el punto 7, caracterizado porque la secuencia exógena de ADN adicional se selecciona del grupo formado por la secuencia que codifica la proteína de la cápside del circovirus porcino tipo 2 (CVP2) y la secuencia que codifica la proteína que comprende la proteína de la cápside del circovirus porcino tipo 2 (CVP2) que porta adicionalmente los aminoácidos MetSerGlySer en el extremo N-terminal de dicha proteína, seleccionándose dicha secuencia de ADN que codifica la proteína de la cápside del CVP2 del grupo formado por la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.wherein the Mhyo promoter region initiates or promotes the transcription of a Mhyo DNA sequence. 8. - The replicative plasmid vector according to point 7, characterized in that the additional exogenous DNA sequence is selected from the group formed by the sequence that encodes the capsid protein of porcine circovirus type 2 (CVP2) and the sequence that encodes the protein comprising the porcine circovirus type 2 (CVP2) capsid protein additionally carrying the MetSerGlySer amino acids at the N-terminus of said protein, said DNA sequence encoding the CVP2 capsid protein being selected from the group formed by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5.

9. - El vector plasmídico replicativo de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 7 u 8, caracterizado porque la región promotora de Mhyo comprende la región promotora del gen de una proteína de Mhyo seleccionada del grupo formado por las proteínas P46 y P97.9. - The replicative plasmid vector according to any one of points 7 or 8, characterized in that the Mhyo promoter region comprises the gene promoter region of a Mhyo protein selected from the group formed by the P46 and P97 proteins.

10. - Una cepa mutante de Mhyo, caracterizada porque comprende el vector plasmídico replicativo de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 7 a 9.10. - A Mhyo mutant strain, characterized in that it comprises the replicative plasmid vector according to any one of points 7 to 9.

11. - Una vacuna para proteger a los cerdos frente a la neumonía enzoótica porcina provocada por Mhyo, y opcionalmente frente a otra enfermedad o afecciones patológicas adicionales que afectan a los cerdos, que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de la cepa mutante de Mhyo como se define en el punto 10.11. - A vaccine to protect pigs against swine enzootic pneumonia caused by Mhyo, and optionally against other disease or additional pathological conditions affecting pigs, comprising an immunologically effective amount of the Mhyo mutant strain as described defined in point 10.

12. - La vacuna de acuerdo con el punto 11, caracterizado porque la otra enfermedad o afecciones patológicas adicionales que afectan a los cerdos están provocadas por un microorganismo, que se selecciona del grupo formado por Actinobacillus sp., Brachyspira sp., Pasteurella multocida, Salmonella sp., Streptococcus sp., Isospora sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Leptospira sp., Staphylococcus sp., Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Clostridium sp., Mycoplasma sp., Lawsonia intracellularis, Escherichia coli, virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino, virus de la gripe porcina, virus de la gastroenteritis transmisible, parvovirus porcino, virus de la encefalomiocarditis, coronavirus, rotavirus, circovirus porcino, agente del síndrome del fallo del desarrollo peridestete porcino, virus de la peste porcina clásica, virus de la peste porcina africana, calicivirus y torque teno virus (TTV).12. - The vaccine according to point 11, characterized in that the other disease or additional pathological conditions that affect pigs are caused by a microorganism, which is selected from the group formed by Actinobacillus sp., Brachyspira sp., Pasteurella multocida, Salmonella sp., Streptococcus sp., Isospora sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Leptospira sp., Staphylococcus sp., Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Clostridium sp., Mycoplasma sp., Lawsonia intracellularis, Escherichia coli, porcine reproductive and respiratory syndrome virus , swine influenza virus, transmissible gastroenteritis virus , porcine parvovirus, encephalomyocarditis virus, coronavirus, rotavirus, porcine circovirus, porcine periweaning failure syndrome agent, classical swine fever virus, swine fever virus africana, calicivirus and torque tenovirus (TTV).

13. - La vacuna de acuerdo con el punto 12, caracterizada porque la otra enfermedad o las afecciones patológicas adicionales que afectan a los cerdos están provocadas por circovirus porcino.13. - The vaccine according to point 12, characterized in that the other disease or additional pathological conditions that affect pigs are caused by porcine circovirus.

14. - La vacuna de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 11 a 13, caracterizada porque comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente un adyuvante.14. - The vaccine according to any one of points 11 to 13, characterized in that it also comprises a pharmaceutically acceptable vehicle, and optionally an adjuvant.

15. - Un kit de vacunación para vacunar cerdos frente a una infección o enfermedad provocada por Mhyo, y opcionalmente frente a otra enfermedad o afecciones patológicas provocadas por microorganismos que afectan a los cerdos, que comprende un recipiente que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de la cepa mutante como se define en el punto 10.15. - A vaccination kit for vaccinating pigs against an infection or disease caused by Mhyo, and optionally against another disease or pathological conditions caused by microorganisms that affect pigs, comprising a container comprising an immunologically effective amount of the mutant strain as defined in item 10.

La materia objeto divulgada en el presente documento referente a vectores de transposón no forma parte de la invención, que se define por las reivindicaciones adjuntas.The subject matter disclosed herein relating to transposon vectors does not form part of the invention, which is defined by the appended claims.

En el presente documento se divulga un método para preparar una cepa mutante de Mycoplasma hyopneumoniae que comprende la etapa de transformar una cepa de M. hyopneumoniae mediante el uso de un vector portador que comprende al menos una secuencia exógena de ADN, estando la secuencia bajo el control de una secuencia de ADN que tiene un grado de identidad al menos del 80 % con una región promotora de M. hyopneumoniae. This document discloses a method for preparing a mutant strain of Mycoplasma hyopneumoniae comprising the step of transforming a strain of M. hyopneumoniae by using a carrier vector comprising at least one exogenous DNA sequence, the sequence being under the control of control of a DNA sequence having a degree of identity of at least 80% with a promoter region of M. hyopneumoniae.

Mediante el método divulgado en el presente documento se puede obtener una cepa mutante de Mhyo que incorpora, de forma estable, en el citosol una secuencia exógena de ADN y que expresa el contenido de dicha secuencia.By means of the method disclosed in the present document, it is possible to obtain a mutant strain of Mhyo that stably incorporates an exogenous DNA sequence into the cytosol and that expresses the content of said sequence.

El método puede adicionalmente comprender adicionalmente etapas que son típicas en los métodos para preparar cepas mutantes de bacterias, que son bien conocidos por el experto en la materia, y que no resultan esenciales para dicho método.The method may further comprise steps that are typical in methods for preparing mutant strains of bacteria, which are well known to the person skilled in the art, and which are not essential for said method.

Así, el método comprende adicionalmente las etapas de:Thus, the method additionally comprises the steps of:

a) construir un vector antes de la transferencia del vector a la bacteria en la etapa de transformación, y b) seleccionar las bacterias mutantes que se han transformado con la secuencia exógena de ADN después de la etapa de transformación.a) constructing a vector before transfer of the vector to the bacterium in the transformation step, and b) selecting the mutant bacteria that have been transformed with the exogenous DNA sequence after the transformation step.

La eficacia del método divulgado en el presente documento se determina mediante el aislamiento y la caracterización de las secuencias de ADN presentes en las cepas transformadas, así como, por ejemplo, mediante la comprobación de características genotípicas o fenotípicas de la cepa mutante o bien mediante la comprobación de la producción de las proteínas recombinantes por las mismas, tal como se describe más adelante en la sección de ejemplos.The efficacy of the method disclosed herein is determined by isolating and characterizing the DNA sequences present in the transformed strains, as well as, for example, by checking the genotypic or phenotypic characteristics of the mutant strain or by checking the production of recombinant proteins by them, as described below in the examples section.

Mediante el vector portador utilizado en el método de la invención se puede obtener una cepa mutante de Mhyo que incorpora, de forma estable, una secuencia exógena de ADN en el citosol y que expresa el contenido de dicha secuencia.By means of the carrier vector used in the method of the invention, it is possible to obtain a mutant strain of Mhyo that stably incorporates an exogenous DNA sequence into the cytosol and that expresses the content of said sequence.

El vector portador es un vector plasmídico replicativo.The carrier vector is a replicating plasmid vector.

En el contexto de la invención se entiende por "vector plasmídico replicativo" o "plásmido replicativo" un vector que porta secuencias de ADN que se replica como un elemento episómico en la bacteria hospedadora, donde un elemento episómico es una unidad extracromosómica autoreplicativa.In the context of the invention, "replicative plasmid vector" or "replicative plasmid" is understood to mean a vector carrying DNA sequences that replicates as an episomal element in the host bacterium, where an episomal element is a self-replicating extrachromosomal unit.

En el contexto de la invención, un vector plasmídico replicativo es el que permite incorporar de forma estable una secuencia exógena de ADN en el citosol de una bacteria Mhyo y, opcionalmente, expresar un ARN o una proteína codificada por dicha secuencia en el citosol de la bacteria.In the context of the invention, a replicative plasmid vector is one that allows the stably incorporation of an exogenous DNA sequence into the cytosol of a Mhyo bacterium and, optionally, the expression of an RNA or a protein encoded by said sequence in the cytosol of the bacterium.

Secuencia exógena de ADNexogenous DNA sequence

En el contexto de la invención, se entiende por "secuencia exógena de ADN" un fragmento de ADN que se introduce de forma estable en el citosol de la cepa de Mhyo. In the context of the invention, "exogenous DNA sequence" is understood to mean a DNA fragment that is stably introduced into the cytosol of the Mhyo strain.

Se ha descubierto que mediante el método de la invención se puede introducir de forma estable una secuencia exógena de ADN en una cepa de Mhyo, ya que dicha secuencia no se pierde a lo largo de las sucesivas generaciones de la bacteria que se ha transformado con dicha secuencia exógena. Esta estabilidad implica que la secuencia exógena de ADN puede replicarse en el interior de la bacteria transformada y en sus descendientes, y que se puede recuperar después de múltiples generaciones de la bacteria transformada.It has been discovered that by means of the method of the invention an exogenous DNA sequence can be stably introduced into a Mhyo strain, since said sequence is not lost throughout the successive generations of the bacterium that has been transformed with said exogenous sequence. This stability implies that the exogenous DNA sequence can be replicated within the transformed bacterium and its descendants, and that it can be recovered after multiple generations of the transformed bacterium.

La secuencia exógena de ADN puede ser muy diversa y tiene una definición amplia, como se expone a continuación.The exogenous DNA sequence can be very diverse and has a broad definition, as discussed below.

En el contexto de la invención, dicha secuencia puede ser, por ejemplo, un gen marcador. Habitualmente, el vector que comprende la secuencia exógena de ADN comprende dicho marcador para poder seleccionar fácilmente las cepas mutantes que se han transformado. Dicho marcador genético puede ser, por ejemplo, un gen de resistencia a un antibiótico. Estos pueden incluir, por ejemplo, el gen TetM, que confiere resistencia a la tetraciclina procedente del plásmido pIVT-1, descrito en Dybvig et al., J. Bacteriol, 2000, 182, 4343-4347, o el gen aac(6)-aph(2"), que confiere resistencia a antibióticos del tipo aminoglucósido tal como la gentamicina, por ejemplo, y que se encuentra descrito en Chow et al., Antimicrob. Agents Chemother., 2001, 45/10), 2691-2694. Preferentemente el gen de selección fenotípica es el gen TetM. In the context of the invention, said sequence can be, for example, a marker gene. Usually, the vector comprising the exogenous DNA sequence comprises said marker in order to be able to easily select the mutant strains that have been transformed. Said genetic marker can be, for example, a gene for resistance to an antibiotic. These may include, for example, the TetM gene, which confers tetracycline resistance from the pIVT-1 plasmid, described in Dybvig et al., J. Bacteriol, 2000, 182, 4343-4347, or the aac gene ( 6) -aph ( 2"), which confers resistance to antibiotics of the aminoglycoside type such as gentamicin, for example, and which is described in Chow et al., Antimicrob. Agents Chemother., 2001, 45/10), 2691-2694 Preferably the phenotypic selection gene is the TetM gene.

La secuencia exógena de ADN también puede ser un gen que codifica proteínas recombinantes tales como, por ejemplo, la recombinasa Cre del bacteriófago P1.The exogenous DNA sequence may also be a gene encoding recombinant proteins such as, for example, the Cre recombinase of bacteriophage P1.

La secuencia exógena de ADN también puede ser un gen que codifica una proteína recombinante de interés terapéutico o preventivo. Dicha proteína puede estar relacionada con factores de virulencia o determinantes antigénicos de microorganismos causantes de enfermedades en los cerdos, y es capaz de inducir o de contribuir a la inducción de una respuesta protectora frente a enfermedades o afecciones patológicas que pueden afectar a los cerdos. Preferentemente la secuencia exógena de ADN codifica una proteína recombinante que induce una respuesta protectora frente a enfermedades o afecciones patológicas que afectan a los cerdos provocadas por los microorganismos del grupo formado por Actinobacillus sp., Brachyspira sp., Pasteurella multocida, Salmonella sp., Streptococcus sp., Isospora sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Leptospira sp., Staphylococcus sp., Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Clostridium sp., Mycoplasma sp., Lawsonia intracellularis, Escherichia coli, virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino, virus de la gripe porcina, virus de la gastroenteritis transmisible, parvovirus porcino, virus de la encefalomiocarditis, coronavirus, rotavirus, el agente del síndrome del fallo del desarrollo peridestete porcino, virus de la peste porcina clásica, virus de la peste porcina africana, calicivirus, torque teno virus (TTV) y circovirus porcino. Entre ellos, por ejemplo, el gen que codifica la glucoproteína 5 (gp5) del virus respiratorio y reproductivo porcino (PRRS), el gen que codifica la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 (CVP2), el gen que codifica la glucoproteína E (gpE) del virus de la peste porcina clásica, el gen que codifica la proteína sp1 del parvovirus porcino (PVP), el gen que codifica la toxina de Pasteurella multocida, el gen que codifica la dermonecrotoxina de Bordetella bronchiseptica, los genes que codifican las toxinas de Clostridium spp, Escherichia coli o Actinobacillus pleuropneumoniae. Preferentemente, dicha proteína induce una respuesta protectora frente a las enfermedades mencionadas.The exogenous DNA sequence can also be a gene encoding a recombinant protein of therapeutic or preventive interest. Said protein may be related to virulence factors or antigenic determinants of disease-causing microorganisms in pigs, and is capable of inducing or contributing to the induction of a protective response against diseases or pathological conditions that may affect pigs. Preferably, the exogenous DNA sequence encodes a recombinant protein that induces a protective response against diseases or pathological conditions that affect pigs caused by microorganisms from the group formed by Actinobacillus sp., Brachyspira sp., Pasteurella multocida, Salmonella sp., Streptococcus sp., Isospora sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Leptospira sp., Staphylococcus sp., Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Clostridium sp., Mycoplasma sp., Lawsonia intracellularis, Escherichia coli, porcine reproductive and respiratory syndrome virus, influenza virus swine, transmissible gastroenteritis virus, porcine parvovirus, encephalomyocarditis virus, coronavirus, rotavirus, the agent of porcine peri-weaning failure syndrome, classical swine fever virus, african swine fever virus, calicivirus, torque teno virus (TTV) and porcine circovirus. These include, for example, the gene encoding porcine reproductive and respiratory virus (PRRS) glycoprotein 5 (gp5), the gene encoding porcine circovirus type 2 (CVP2) capsid protein, the gene encoding glycoprotein E (gpE) from classical swine fever virus, the gene encoding porcine parvovirus (PVP) sp1 protein, the gene encoding Pasteurella multocida toxin, the gene encoding dermonecrotoxin from Bordetella bronchiseptica, genes that they encode the toxins of Clostridium spp, Escherichia coli or Actinobacillus pleuropneumoniae. Preferably, said protein induces a protective response against the mentioned diseases.

También se considera como secuencia exógena de ADN un fragmento de ADN procedente de Mhyo, opcionalmente reordenado o recombinado con otros fragmentos de ADN. Ejemplos de esta secuencia exógena de ADN son, por ejemplo, el origen de replicación oriC de Mhyo, una secuencia de ARN antisentido o el gen que codifica la proteína P97 o P46 de Mhyo, para aumentar la tasa de transcripción y traducción de dicho gen.Also considered as an exogenous DNA sequence is a DNA fragment from Mhyo, optionally rearranged or recombined with other DNA fragments. Examples of this exogenous DNA sequence are, for example, the Mhyo oriC origin of replication , an antisense RNA sequence, or the gene encoding the Mhyo P97 or P46 protein, to increase the rate of transcription and translation of said gene.

Preferentemente la secuencia exógena de ADN se selecciona del grupo que comprende un gen de resistencia a un antibiótico, un gen que codifica una recombinasa, un fragmento de a Dn procedente de Mhyo, fragmento que preferentemente ha sido reordenado o ha recombinado con uno o varios fragmentos de ADN, un gen que codifica un componente antigénico de un microorganismo causante de enfermedades porcinas, y combinaciones de los mismos; más preferentemente es un gen marcador que confiere resistencia a un antibiótico, un gen que codifica un componente antigénico de un microorganismo causante de enfermedades porcinas, o combinaciones de los mismos; y aún más preferentemente es un gen de resistencia a un antibiótico combinado con un gen que codifica un componente antigénico de un microorganismo causante de enfermedades porcinas, preferentemente un gen que codifica la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 (CVP2) y, opcionalmente, combinado con un gen que codifica una proteína de membrana de Mhyo, preferentemente la proteína P46 de Mhyo. Preferably, the exogenous DNA sequence is selected from the group comprising a gene for resistance to an antibiotic, a gene that encodes a recombinase, a fragment of a D n from Mhyo, a fragment that has preferably been rearranged or has recombined with one or more DNA fragments, a gene encoding an antigenic component of a swine disease-causing microorganism, and combinations thereof; more preferably it is a marker gene that confers resistance to an antibiotic, a gene that encodes an antigenic component of a microorganism causing swine diseases, or combinations thereof; and even more preferably it is a gene for resistance to an antibiotic combined with a gene that encodes an antigenic component of a microorganism that causes porcine diseases, preferably a gene that encodes the capsid protein of porcine circovirus type 2 (CVP2) and, optionally, combined with a gene encoding a Mhyo membrane protein, preferably the Mhyo P46 protein.

Región promotora de Mhyo Mhyo Promoting Region

En el contexto de la invención, se entiende por "región promotora de Mhyo" una secuencia de ADN característica de Mhyo que inicia o promueve la transcripción de una secuencia de ADN de Mhyo. In the context of the invention, " Mhyo promoter region" is understood to mean a characteristic Mhyo DNA sequence that initiates or promotes the transcription of a Mhyo DNA sequence.

La secuencia de ADN que inicia o promueve la transcripción de la secuencia exógena de ADN tiene un grado de identidad al menos del 80 %, preferentemente al menos del 85 %, más preferentemente al menos del 90 %, aún más preferentemente al menos del 95 %, más preferentemente al menos del 99 %, y aún más preferentemente del 100 % con una región promotora de Mhyo. The DNA sequence that initiates or promotes transcription of the exogenous DNA sequence has a degree of identity of at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95% , more preferably at least 99%, and even more preferably 100% with a Mhyo promoter region.

Preferentemente, la secuencia de ADN que inicia o promueve la transcripción de la secuencia exógena de ADN tiene un grado de identidad del 100 % con una región promotora de Mhyo. Preferably, the DNA sequence that initiates or promotes transcription of the foreign DNA sequence has a degree of identity of 100% to a Mhyo promoter region.

Se entiende por región promotora una secuencia que, una vez identificada por la holoenzima de la ARN polimerasa, induce la síntesis de un ARN mensajero (transcrito) en la dirección de su extremo 3'. Normalmente se traduce este transcrito y produce una proteína con una función concreta, o bien da lugar a un ARN que interviene en la síntesis de proteínas o en la regulación de dicha actividad transcripcional.By promoter region is meant a sequence which, once identified by the RNA polymerase holoenzyme, induces the synthesis of a messenger RNA (transcribed) in the direction of its 3' end. Normally this transcript is translated and produces a protein with a specific function, or it gives rise to an RNA that is involved in protein synthesis or in the regulation of said transcriptional activity.

El experto en la materia conoce el significado de la expresión "una región promotora" y que puede identificarla por métodos convencionales.The person skilled in the art knows the meaning of the expression "a promoter region" and can identify it by conventional methods.

La región promotora de Mhyo corresponde a un segmento de ADN que comprende preferentemente al menos 50 pares de bases, preferentemente al menos 100 pares de bases, más preferentemente al menos 200 pares de bases, y aún más preferentemente entre 200 y 300 pares de bases, situados en el lado 5' de secuencias codificantes bien establecidas de Mhyo. The Mhyo promoter region corresponds to a DNA segment preferably comprising at least 50 base pairs, preferably at least 100 base pairs, more preferably at least 200 base pairs, and even more preferably between 200 and 300 base pairs, located on the 5' side of well-established Mhyo coding sequences.

Como se describe en el presente documento, la secuencia de ADN que se usa como promotor en el método y en el vector portador de la invención tiene un grado de identidad del 100% con una región promotora de Mhyo, que comprende al menos 50 pares de bases.As described herein, the DNA sequence that is used as a promoter in the method and in the carrier vector of the invention has a degree of identity of 100% to a promoter region of Mhyo, comprising at least 50 pairs of bases.

Más específicamente, la secuencia de ADN que se usa como promotor en el método y en el vector portador de la invención tiene un grado de identidad del 100 % con una región promotora de Mhyo, que comprende entre 200 y 300 pares de bases.More specifically, the DNA sequence that is used as a promoter in the method and in the carrier vector of the invention has a degree of identity of 100% with a promoter region of Mhyo, comprising between 200 and 300 base pairs.

En el contexto de la invención, se entiende por "secuencias codificantes bien establecidas" aquellas secuencias de ADN que codifican proteínas de Mhyo o bien regiones transcripcionalmente activas del genoma de Mhyo, que dan lugar, por ejemplo, a un ARN que interviene en la síntesis de proteínas o en la regulación de la actividad transcripcional. Estas secuencias incluyen, por ejemplo, las proteínas de superficie P46, P65, P97 y P102, descritas en Minion et al., J. Bacteriol., 2004, 186(21), 7123-7133; las adhesinas P76, P146, P216 o la proteína de membrana P95, descritas en Vasconcelos et al., J. Bacteriol., 2005, 187(16), 5568-5577, o la proteína citosólica P36 descrita en Caron et al., J. Clin. Microbiol., 2000, 38(4), 1390-1396, o ARN ribosómico.In the context of the invention, "well-established coding sequences" are understood to mean those DNA sequences that encode Mhyo proteins or transcriptionally active regions of the Mhyo genome, which give rise, for example, to an RNA that is involved in the synthesis of proteins or in the regulation of transcriptional activity. These sequences include, for example, the surface proteins P46, P65, P97 and P102, described in Minion et al., J. Bacteriol., 2004, 186(21), 7123-7133; the adhesins P76, P146, P216 or the membrane protein P95, described in Vasconcelos et al., J. Bacteriol., 2005, 187(16), 5568-5577, or the cytosolic protein P36 described in Caron et al., J .clin. Microbiol., 2000, 38(4), 1390-1396, or ribosomal RNA.

Como se describe en el presente documento, la región promotora de Mhyo puede comprender la región promotora del gen de una proteína de Mhyo seleccionada del grupo formado por las proteínas P36, P46, P65, P76, P97, P102, P146 y P216, más preferentemente las proteínas P46 y P97, aún más preferentemente se selecciona del grupo que comprende la región promotora del gen mhj_0194 de la cepa J de Mhyo, que codifica la proteína P97 y que corresponde a la secuencia de ADN comprendida entre las bases 214293 y 214557 de la cepa J de Mhyo (s Eq ID NO: 1), y la región promotora del gen mhj_0511 de la cepa J de Mhyo (SEQ ID NO: 2), que codifica la proteína P46 y que corresponde a la secuencia de ADN comprendida entre las bases 656451 y 656713 de la cepa J de Mhyo depositada en la base de datos GenBank con el número AE017243 y descrita en Vasconcelos et al., mencionado anteriormente. As described herein, the Mhyo promoter region may comprise the gene promoter region of a Mhyo protein selected from the group consisting of the P36, P46, P65, P76, P97, P102, P146 and P216 proteins, more preferably the P46 and P97 proteins, even more preferably it is selected from the group comprising the promoter region of the mhj_0194 gene of the Mhyo J strain, which encodes the P97 protein and which corresponds to the DNA sequence between bases 214293 and 214557 of the Mhyo J strain (s Eq ID NO: 1), and the promoter region of the mhj_0511 gene from Mhyo J strain (SEQ ID NO: 2), which encodes the P46 protein and corresponds to the DNA sequence between the bases 656451 and 656713 of the Mhyo strain J deposited in the GenBank database under the number AE017243 and described in Vasconcelos et al., mentioned above.

La región promotora de Mhyo, que controla las secuencias exógenas, puede ser la misma para todas las secuencias o puede ser distinta. Preferentemente es la misma.The Mhyo promoter region, which controls the foreign sequences, may be the same for all sequences, or it may be different. Preferably it is the same.

Un experto en la materia puede identificar fácilmente una secuencia de ADN promotora seleccionando una secuencia de ADN que tiene un grado de identidad al menos del 80 %, más preferentemente al menos del 90 %, más preferentemente al menos del 95 %, aún más preferentemente al menos del 99 % y aún más preferentemente del 100% con una región promotora de Mhyo, que comprende preferentemente al menos 50 pares de bases, preferentemente al menos 100 pares de bases, más preferentemente al menos 200 pares de bases y aún más preferentemente entre 200 y 300 pares de bases, situados en el lado 5' de secuencias codificantes bien establecidas de Mhyo, y llevar a cabo el método de la invención. Los métodos para identificar una secuencia de ADN promotora se describen, por ejemplo, en el manual de Sambrook y Russell, Molecular Cloning 3a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Nueva York (2001).A person skilled in the art can easily identify a promoter DNA sequence by selecting a DNA sequence that has a degree of identity of at least 80%, more preferably at least 90%, more preferably at least 95%, even more preferably at less than 99% and even more preferably 100% with a Mhyo promoter region, preferably comprising at least 50 base pairs, preferably at least 100 base pairs, more preferably at least 200 base pairs and even more preferably between 200 and 300 base pairs, located on the 5' side of well-established Mhyo coding sequences, and carrying out the method of the invention. Methods for identifying a promoter DNA sequence are described, for example, in the manual by Sambrook and Russell, Molecular Cloning 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York (2001).

Vector plasmídico replicativoReplicative plasmid vector

Es un objeto de la invención un vector plasmídico replicativo que comprende:An object of the invention is a replicative plasmid vector comprising:

1) una secuencia de ADN que comprende la región oriC de una cepa de Mycoplasma sp., y1) a DNA sequence comprising the oriC region of a Mycoplasma sp. strain, and

2) una secuencia exógena de ADN que comprende un gen marcador, y, opcionalmente, una secuencia exógena de ADN adicional, que están bajo control de una secuencia de ADN que tiene un grado de identidad al menos del 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % con una región promotora de Mhyo. 2) an exogenous DNA sequence comprising a marker gene, and, optionally, an additional exogenous DNA sequence, which are under control of a DNA sequence having a degree of identity of at least 80%, 90%, 95% , 99% or 100% with a Mhyo promoter region.

Como se describe en el presente documento, la secuencia de ADN que inicia o promueve la transcripción de la secuencia exógena de a Dn puede comprender entre 200 y 300 pares de bases y tiene un grado de identidad del 100 % con una región promotora de Mhyo. As described herein, the DNA sequence that initiates or promotes the transcription of the exogenous sequence of a D n can be between 200 and 300 base pairs and has a degree of identity of 100% to a promoter region of Mhyo .

En el plásmido replicativo de la invención se usa preferentemente una región promotora de Mhyo seleccionada del grupo que comprende la región promotora del gen de la proteína P97 de Mhyo, y la región promotora del gen de la proteína P46 de Mhyo, preferentemente la región promotora de Mhyo comprende la región promotora del gen de la proteína P97 de Mhyo, o alternativamente la región promotora del gen de la proteína P46 de Mhyo, mencionados anteriormente.In the replicative plasmid of the invention, a Mhyo promoter region selected from the group comprising the Mhyo P97 protein gene promoter region, and the Mhyo P46 protein gene promoter region is preferably used, preferably the Mhyo promoter region. Mhyo comprises the promoter region of the Mhyo P97 protein gene, or alternatively the promoter region of the Mhyo P46 protein gene, mentioned above.

La región promotora de Mhyo, que controla secuencias comprendidas en el plásmido replicativo, puede ser la misma para todas las secuencias o puede ser distinta. Preferentemente es la misma secuencia.The Mhyo promoter region, which controls sequences comprised in the replicative plasmid, may be the same for all sequences, or it may be different. Preferably it is the same sequence.

La región oriC permite al fragmento de ADN introducido replicar como un elemento episómico y mantener este fragmento de a Dn de forma estable en la descendencia de la célula transformada, preferentemente manteniendo las condiciones de selección fenotípica.The oriC region allows the introduced DNA fragment to replicate as an episomal element and to maintain this a D n fragment stably in the offspring of the transformed cell, preferably maintaining phenotypic selection conditions.

En el vector plasmídico replicativo de la invención, la región oriC es la región oriC es de una cepa de Mycoplasma sp.In the replicative plasmid vector of the invention, the oriC region is the oriC region is from a strain of Mycoplasma sp.

En el contexto de la invención, se entiende por Mycoplasma sp. cualquier bacteria del género Mycoplasma, tales como, por ejemplo, M. pneumoniae, M. hyopneumoniae, M. hominis, M. genitalium, M. pulmonis, M. capricolum, M. mycoides, M. ovipneumoniae, M. haemofelis, M. gallisepticum, M. laboratorium o M. bovis, entre otras.In the context of the invention, Mycoplasma sp. any bacterium of the genus Mycoplasma, such as, for example , M. pneumoniae, M. hyopneumoniae, M. hominis, M. genitalium, M. pulmonis, M. capricolum, M. mycoides, M. ovipneumoniae, M. haemofelis, M. gallisepticum, M. laboratorium or M. bovis, among others.

Preferentemente, la región oriC pertenece a una cepa de Mhyo, más preferentemente pertenece a la cepa J y más preferentemente comprende la secuencia de ADN comprendida entre las bases 897262 y 1802 de la cepa J de Mhyo. Preferably, the oriC region belongs to a Mhyo strain, more preferably it belongs to the J strain, and most preferably it comprises the DNA sequence comprised between bases 897262 and 1802 of the Mhyo J strain.

El gen marcador, también denominado gen de selección fenotípica, permite seleccionar los clones que han incorporado el plásmido con la secuencia exógena de ADN, tal como se explica anteriormente.The marker gene, also called the phenotypic selection gene, makes it possible to select the clones that have incorporated the plasmid with the exogenous DNA sequence, as explained above.

Preferentemente, el vector comprende una secuencia exógena de ADN adicional. Mediante dicha secuencia exógena de ADN adicional se pueden obtener cepas mutantes de Mhyo que pueden utilizarse para preparar vacunas monovalentes o polivalentes, opcionalmente vacunas marcadoras, y también pueden expresar herramientas genéticas útiles para la posterior modificación de dichos mutantes tales como, por ejemplo, la recombinasa Cre del fago P1, la recombinasa FLP de Saccharomyces cerevisiae, la proteína represora de la tetraciclina (TetR), o puede bloquear completa o parcialmente la traducción de un gen específico de Mhyo. Preferably, the vector comprises an additional foreign DNA sequence. Through said additional exogenous DNA sequence, Mhyo mutant strains can be obtained that can be used to prepare monovalent or polyvalent vaccines, optionally marker vaccines, and can also express useful genetic tools for the subsequent modification of said mutants, such as, for example, recombinase. Phage P1 Cre, Saccharomyces cerevisiae FLP recombinase, tetracycline repressor protein (TetR), or can completely or partially block translation of a Mhyo-specific gene.

Las secuencias exógenas de ADN adicionales que se pueden incorporar al plásmido replicativo incluyen, por ejemplo, el gen cre ORF, que codifica la recombinasa Cre del fago P1.Additional exogenous DNA sequences that can be incorporated into the replicative plasmid include, for example, the cre ORF gene, which encodes the P1 phage Cre recombinase.

La recombinasa Cre tiene la capacidad de separar regiones de ADN flanqueadas por secuencias del tipo loxP. De este modo, por ejemplo, si el plásmido replicativo incluye el gen cre ORF, y un gen de resistencia a un antibiótico flanqueado por secuencias del tipo loxP, por ejemplo, lox66, cuando se expresa la recombinasa Cre, se elimina la resistencia al antibiótico por parte de la bacteria transformada. En otras palabras, en etapas posteriores se puede eliminar el gen marcador. Este hecho resulta importante en el caso de preparar cepas mutantes de Mhyo transformadas que presentan una virulencia atenuada y que se usan para la preparación de vacunas vivas, en las cuáles la presencia de un gen de resistencia a un antibiótico no es una característica conveniente.The Cre recombinase has the ability to cleave regions of DNA flanked by loxP-like sequences. Thus, for example, if the replicative plasmid includes the cre ORF gene, and an antibiotic resistance gene flanked by loxP-like sequences, eg, lox66, when Cre recombinase is expressed, the resistance to the antibiotic on the part of the transformed bacterium. In other words, at later stages the marker gene can be removed. This fact is important in the case of preparing transformed Mhyo mutant strains that have attenuated virulence and are used for the preparation of live vaccines, in which the presence of an antibiotic resistance gene is not a desirable characteristic.

Preferentemente, el plásmido replicativo comprende además una secuencia exógena de ADN adicional que codifica una proteína recombinante de interés terapéutico o preventivo. Dicha proteína puede estar relacionada con factores de virulencia o determinantes antigénicos de microorganismos causantes de enfermedades en los cerdos, y es capaz de inducir o de contribuir a la inducción de una respuesta protectora frente a enfermedades o afecciones patológicas que pueden afectar a los cerdos provocadas por los microorganismos descritos anteriormente.Preferably, the replicative plasmid also comprises an additional exogenous DNA sequence that encodes a recombinant protein of therapeutic or preventive interest. Said protein may be related to virulence factors or antigenic determinants of disease-causing microorganisms in pigs, and is capable of inducing or contributing to the induction of a protective response against diseases or pathological conditions that may affect pigs caused by the microorganisms described above.

Preferentemente, el plásmido replicativo comprende al menos dos veces la secuencia exógena de ADN adicional que codifica la proteína recombinante de interés terapéutico o preventivo, preferentemente la comprende dos veces, y más preferentemente dos o tres veces. De este modo se introducen varias copias de la secuencia exógena de ADN adicional con lo que se incrementa el rendimiento de expresión de dicha proteína. La región promotora de Mhyo, que controla las secuencias comprendidas en el plásmido replicativo, puede ser la misma para todas las secuencias o puede ser distinta.Preferably, the replicative plasmid comprises at least twice the additional exogenous DNA sequence encoding the recombinant protein of therapeutic or preventive interest, preferably twice, and more preferably two or three times. In this way, several copies of the additional exogenous DNA sequence are introduced, thereby increasing the expression yield of said protein. The Mhyo promoter region, which controls the sequences comprised in the replicative plasmid, may be the same for all sequences, or it may be different.

Más preferentemente, la secuencia exógena de ADN adicional se selecciona del grupo formado por la secuencia que codifica la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 (CVP2) y la secuencia exógena de ADN que codifica una proteína que comprende la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 (CVP2), que porta adicionalmente los aminoácidos MetSerGlySer en el extremo N-terminal de dicha proteína, donde dicha proteína de la cápside se encuentra descrita en la base de datos GenBank con el número de referencia AAC61864 (SEQ ID NO: 6).More preferably, the additional foreign DNA sequence is selected from the group consisting of the sequence encoding the capsid protein of porcine circovirus type 2 (CVP2) and the foreign DNA sequence encoding a protein comprising the capsid protein. of porcine circovirus type 2 (CVP2), which additionally carries the MetSerGlySer amino acids at the N-terminal end of said protein, where said capsid protein is described in the GenBank database under the reference number AAC61864 (SEQ ID NO 6).

Incluso más preferentemente, la secuencia exógena de ADN adicional codifica la proteína de la cápside de CVP2 utilizando el codón más frecuente en el genoma de Mhyo para cada uno de los aminoácidos correspondientes a dicha proteína seleccionada del grupo formado por la SeQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.Even more preferably, the additional exogenous DNA sequence encodes the CVP2 capsid protein using the most frequent codon in the Mhyo genome for each of the amino acids corresponding to said protein selected from the group consisting of S and Q ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5.

La SEQ ID NO: 3 tiene 699 pares de bases, la SEQ ID NO: 4 tiene 702 pares de bases y la SEQ ID NO: 5 tiene 992 pares de bases, una secuencia de ADN con una longitud sustancialmente mayor a las otras dos, porque también incorpora la región promotora del gen de la proteína P97, correspondiente a la secuencia de ADN comprendida entre las bases 214293 y 214557 de la cepa J de Mhyo, para así simplificar las etapas de clonación. En la presente descripción la SEQ ID NO: 5 también se denomina ORF2v2.SEQ ID NO: 3 is 699 base pairs long, SEQ ID NO: 4 is 702 base pairs long and SEQ ID NO: 5 is 992 base pairs long, a DNA sequence substantially longer than the other two, because it also incorporates the promoter region of the P97 protein gene, corresponding to the DNA sequence between bases 214293 and 214557 of the Mhyo J strain, in order to simplify the cloning steps. In the present description SEQ ID NO: 5 is also referred to as ORF2v2.

Preferentemente, la secuencia exógena de ADN adicional comprende el gen de la proteína de la cápside del virus CVP2 (ORF2) fusionado a la última base codificante del gen de una proteína de membrana de Mhyo, preferentemente, la proteína de membrana de Mhyo se selecciona del grupo que consiste en la proteína P46 y la proteína P97, más preferentemente es la proteína P46, más preferentemente bajo el control del promotor de los genes de las proteínas P46 o P97 de Mhyo, y aún más preferentemente bajo el promotor del gen de la proteína P46 de Mhyo. Preferably, the additional exogenous DNA sequence comprises the CVP2 virus capsid protein (ORF2) gene fused to the last coding base of the gene for a Mhyo membrane protein, preferably the Mhyo membrane protein is selected from group consisting of the P46 protein and the P97 protein, more preferably the P46 protein, more preferably under the control of the Mhyo P46 or P97 protein gene promoter, and even more preferably under the protein gene promoter Mhyo's P46.

En el caso de la proteína P46, la fusión tiene lugar en el extremo 3' del gen que codifica dicha proteína de membrana (bases 7648-8904). Este plásmido dirige la síntesis de una proteína híbrida que se caracteriza porque los aminoácidos 1 a 419 provienen de la proteína P46 y los aminoácidos 420 a 652 corresponden a la proteína de la cápside del virus CVp2, versión ORF2 (bases 6946-7647).In the case of the P46 protein, the fusion takes place at the 3' end of the gene encoding said membrane protein (bases 7648-8904). This plasmid directs the synthesis of a hybrid protein characterized in that amino acids 1 to 419 come from the P46 protein and amino acids 420 to 652 correspond to the CVp2 virus capsid protein, ORF2 version (bases 6946-7647).

Preferentemente, la secuencia exógena de ADN adicional comprende el gen que codifica la proteína de la cápside de CVP2 insertado en la secuencia de ADN que codifica un bucle de una proteína de membrana de Mhyo, preferentemente la proteína de membrana de Mhyo se selecciona del grupo que consiste en la proteína P46 y la proteína P97, más preferentemente es la proteína P46, más preferentemente bajo el control del promotor de los genes de las proteínas P46 o P97 de Mhyo, y aún más preferentemente bajo el promotor del gen de la proteína P46 de Mhyo. Preferably, the additional exogenous DNA sequence comprises the gene encoding the CVP2 capsid protein inserted into the DNA sequence encoding a loop of a Mhyo membrane protein, preferably the Mhyo membrane protein is selected from the group that consists of the P46 protein and the P97 protein, more preferably it is the P46 protein, more preferably under the control of the Mhyo P46 or P97 protein gene promoter, and even more preferably under the Mhyo P46 protein gene promoter. Mhyo.

En el caso de la proteína P46, el plásmido dirige la síntesis una proteína híbrida que se caracteriza porque los aminoácidos 1 a 92 provienen del extremo N-terminal de la proteína P46, los aminoácidos 95 a 327 corresponden a la proteína de la cápside del virus CVP2 y los aminoácidos 330-656 provienen del extremo C-terminal de la proteína P46 de Mhyo. In the case of the P46 protein, the plasmid directs the synthesis of a hybrid protein characterized in that amino acids 1 to 92 come from the N-terminal end of the P46 protein, amino acids 95 to 327 correspond to the virus capsid protein CVP2 and amino acids 330-656 come from the C-terminus of the Mhyo P46 protein.

Los bucles se identifican en las secuencias de aminoácidos mediante métodos bien conocidos por el experto en la materia, con los que es posible predecir su ubicación con una eficacia razonable.The loops are identified in the amino acid sequences by methods well known to those skilled in the art, with which it is possible to predict their location with reasonable efficiency.

Dichos bucles presentan, en general, una elevada flexibilidad y toleran bien la inserción de secuencias aminoacídicas procedentes de otras proteínas. Además, al quedar expuestos en la superficie de las bacterias, posibilitan la generación de una buena respuesta inmunogénica. Said loops generally have high flexibility and tolerate the insertion of amino acid sequences from other proteins well. In addition, by being exposed on the surface of the bacteria, they make it possible to generate a good immunogenic response.

Preferentemente, el plásmido replicativo comprende una secuencia exógena de ADN adicional que es un gen de Mhyo orientado de forma inversa respecto a la región promotora de Mhyo, preferentemente el gen de Mhyo codifica un factor de virulencia de Mhyo, preferentemente bajo el control del promotor de la proteína P46 o la P97 de Mhyo, y aún más preferentemente bajo el promotor de la proteína P46 de Mhyo. Preferably, the replicative plasmid comprises an additional exogenous DNA sequence that is a Mhyo gene oriented inversely to the Mhyo promoter region, preferably the Mhyo gene encodes a Mhyo virulence factor, preferably under the control of the Mhyo promoter. the Mhyo P46 or P97 protein, and even more preferably under the Mhyo P46 protein promoter.

Dicha secuencia de ADN es capaz de producir un ARN antisentido que puede bloquear la traducción de dicho gen de Mhyo. En el caso de que se trate de un gen que codifica un factor de virulencia de Mhyo, la transformación puede reducir el grado de virulencia del microorganismo.Said DNA sequence is capable of producing an antisense RNA that can block the translation of said Mhyo gene. In the case of a gene encoding a Mhyo virulence factor, the transformation can reduce the degree of virulence of the microorganism.

Más preferentemente, el plásmido replicativo comprende la secuencia comprendida entre las bases 194.535 y 194.654 del genoma de la cepa J de Mhyo orientada de forma inversa respecto a la región promotora de Mhyo. Dicha secuencia produce un ARN antisentido que puede bloquear la traducción del gen tlyA de dicha cepa, que corresponde a una hemolisina de Mhyo. More preferably, the replicative plasmid comprises the sequence between bases 194,535 and 194,654 of the Mhyo J strain genome oriented inversely with respect to the Mhyo promoter region. Said sequence produces an antisense RNA that can block the translation of the tlyA gene of said strain, which corresponds to a Mhyo hemolysin.

En los Ejemplos se describe la preparación de los plásmidos pOG, pOGCRE, pOGA159, pOGC, pOGL y pOGT. El primero incorpora el gen aac(6)- aph(2") que confiere resistencia a la gentamicina. El plásmido pOGCRE incorpora además el gen ORF cre, que codifica la recombinasa Cre del fago P1; el plásmido pOGA159 incorpora una secuencia inhibidora de la traducción del gen de la hemolisina a159 de Mhyo; mientras que los plásmidos pOGC, pOGL y pOGT incorporan además genes codificantes para diferentes versiones proteicas de la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 (CVP2).The Examples describe the preparation of plasmids pOG, pOGCRE, pOGA159, pOGC, pOGL and pOGT. The first incorporates the aac ( 6)- aph ( 2") gene that confers resistance to gentamicin. The pOGCRE plasmid also incorporates the cre ORF gene, which encodes the P1 phage Cre recombinase; the pOGA159 plasmid incorporates an inhibitory sequence of the translation of the Mhyo hemolysin a159 gene, while the plasmids pOGC, pOGL and pOGT also incorporate genes encoding different protein versions of the porcine circovirus type 2 (CVP2) capsid protein.

Vectores de transposón (no forma parte de la invención)Transposon vectors (not part of the invention)

En el presente documento se divulga un vector de transposón, específicamente un plásmido, que comprende:Disclosed herein is a transposon vector, specifically a plasmid, comprising:

1) una secuencia de ADN que codifica una transposasa,1) a DNA sequence encoding a transposase,

2) una secuencia exógena de ADN que comprende un gen marcador y,2) an exogenous DNA sequence comprising a marker gene and,

3) opcionalmente, una secuencia exógena de ADN adicional,3) optionally, an additional exogenous DNA sequence,

donde la secuencia de ADN que codifica una transposasa y al menos una de las secuencias exógenas de ADN están bajo control de una secuencia de ADN que tiene un grado de identidad al menos del 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % con una región promotora de Mhyo. where the DNA sequence encoding a transposase and at least one of the foreign DNA sequences are under the control of a DNA sequence having a degree of identity of at least 80%, 85%, 90%, 95%, 99% or 100% with a Mhyo promoter region.

La secuencia de ADN que inicia o promueve la transcripción de las secuencias de ADN puede comprender entre 200 y 300 pares de bases y tiene un grado de identidad del 100 % con una región promotora de Mhyo. The DNA sequence that initiates or promotes transcription DNA sequences can be between 200 and 300 base pairs and have a degree of identity of 100% to a Mhyo promoter region.

El gen que codifica una transposasa contiene una secuencia de ADN que codifica una enzima que se une a una secuencia concreta en el transposón y cataliza el movimiento de dicho transposón a otra parte del genoma. La selección del gen que codifica una transposasa no es crítica. Los genes que codifican una transposasa incluyen el transposón TN4001T incorporado en el plásmido pIVT-1, mencionado anteriormente, o el transposón Tn916 incorporado en el plásmido pAM120, descrito en, por ejemplo, Cao et al., J. Bacteriol., 1994, 176(14), 4459-4462. El gen marcador o gen de selección fenotípica puede ser un gen de resistencia a un antibiótico, tal como, por ejemplo, el gen TetM o el gen aac(6)-aph(2"), mencionados anteriormente. Preferentemente el gen de selección fenotípica es el gen TetM. The gene encoding a transposase contains a DNA sequence encoding an enzyme that binds to a particular sequence on the transposon and catalyzes the movement of that transposon to another part of the genome. Selection of the gene encoding a transposase is not critical. Genes encoding a transposase include the TN4001T transposon incorporated into the pIVT-1 plasmid, mentioned above, or the Tn916 transposon incorporated into the pAM120 plasmid, described in, for example, Cao et al., J. Bacteriol., 1994, 176 (14), 4459-4462. The marker gene or phenotypic selection gene may be an antibiotic resistance gene, such as, for example, the TetM gene or the aac ( 6)-aph ( 2") gene, mentioned above. Preferably the phenotypic selection gene is the TetM gene.

El gen marcador se encuentra flanqueado por dos repeticiones invertidas, tales como las del transposón presente en el plásmido pIVT-1, mencionado anteriormente. Dichas secuencias son reconocidas por la transposasa, y sin las mismas el gen de selección fenotípica no podría movilizarse al cromosoma bacteriano y la modificación genética no se llevaría a cabo. Al integrarse en el genoma, la modificación genética se mantendrá de forma estable en las siguientes generaciones de la célula transformada.The marker gene is flanked by two inverted repeats, such as those of the transposon present in the pIVT-1 plasmid, mentioned above. Said sequences are recognized by transposase, and without them the phenotypic selection gene could not be mobilized to the bacterial chromosome and the genetic modification would not take place. By integrating into the genome, the genetic modification will be stable in subsequent generations of the transformed cell.

Preferentemente las repeticiones invertidas tienen las secuencias SEQ ID NO: 7 para IRO y la SEQ ID NO: 8 para IRI.Preferably the inverted repeats have the sequences SEQ ID NO: 7 for IRO and SEQ ID NO: 8 for IRI.

En el vector de transposón se puede usar una región promotora de Mhyo seleccionada del grupo que comprende la región promotora del gen de la proteína P97 de Mhyo, y la región promotora del gen de la proteína P46 de Mhyo, como se describe anteriormente. La región promotora de Mhyo puede comprender la región promotora del gen de la proteína P97 de Mhyo, o alternativamente la región promotora del gen de la proteína P46 de Mhyo. A Mhyo promoter region selected from the group consisting of the Mhyo P97 protein gene promoter region, and the Mhyo P46 protein gene promoter region may be used in the transposon vector, as described above. The Mhyo promoter region may comprise the promoter region of the Mhyo P97 protein gene, or alternatively the promoter region of the Mhyo P46 protein gene.

La región promotora de Mhyo, que controla las secuencias comprendidas en el vector de transposón, puede ser la misma para todas las secuencias o puede ser distinta. Preferentemente es la misma.The Mhyo promoter region, which controls the sequences comprised in the transposon vector, may be the same for all sequences, or it may be different. Preferably it is the same.

De forma similar a lo explicado en el caso de un plásmido replicativo, el vector de transposón puede comprender además una secuencia exógena de ADN adicional que codifica una proteína recombinante de interés. Dicha proteína es capaz de inducir o de contribuir a la inducción de una respuesta protectora frente a enfermedades o afecciones patológicas que pueden afectar a los cerdos.In a similar way to that explained in the case of a replicative plasmid, the transposon vector can also comprise an additional exogenous DNA sequence that encodes a recombinant protein of interest. Bliss protein is capable of inducing or contributing to the induction of a protective response against diseases or pathological conditions that can affect pigs.

El vector de transposón puede comprender al menos dos veces la secuencia exógena de ADN adicional que codifica la proteína recombinante de interés terapéutico o preventivo, preferentemente dos veces, y más preferentemente dos o tres veces. De este modo se introducen varias copias de la secuencia exógena de ADN adicional y se aumenta el rendimiento de expresión de la proteína. La región promotora de Mhyo, que controla las secuencias comprendidas en el vector de transposón, puede ser la misma para todas las secuencias o puede ser distinta.The transposon vector can comprise at least twice the additional exogenous DNA sequence encoding the recombinant protein of therapeutic or preventive interest, preferably twice, and more preferably two or three times. In this way, several copies of the additional exogenous DNA sequence are introduced and the expression yield of the protein is increased. The Mhyo promoter region, which controls the sequences comprised in the transposon vector, may be the same for all sequences, or it may be different.

La secuencia exógena de ADN adicional puede seleccionarse de la secuencia que codifica la proteína de la cápside del circovirus porcino (CVP2) y una secuencia exógena de ADN que codifica una proteína que comprende la proteína de la cápside del circovirus porcino (CVP2), que porta adicionalmente los aminoácidos MetSerGlySer en el extremo N-terminal de dicha proteína, donde la proteína de la cápside del circovirus porcino (CVP2) se describe en la base de datos GenBank con el número de referencia AAC61864 (SEQ ID NO: 6).The additional foreign DNA sequence may be selected from the sequence encoding porcine circovirus capsid protein (CVP2) and a foreign DNA sequence encoding a protein comprising porcine circovirus capsid protein (CVP2), which carries additionally the MetSerGlySer amino acids at the N-terminal end of said protein, where the porcine circovirus capsid protein (CVP2) is described in the GenBank database under the reference number AAC61864 (SEQ ID NO: 6).

Preferentemente, la secuencia exógena de ADN adicional codifica la proteína de la cápside de CVP2 utilizando el codón más frecuente en el genoma de Mhyo para cada uno de los aminoácidos correspondientes a dicha proteína seleccionada entre el grupo formado por la s Eq ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID nO: 5, donde cada una de las secuencias de ADN está bajo control de una región promotora de Mhyo. Se usa más preferentemente la SEQ ID NO: 5, que ya incluye la región promotora del gen que codifica la proteína P97 de Mhyo. Preferably, the additional exogenous DNA sequence encodes the CVP2 capsid protein using the most frequent codon in the Mhyo genome for each of the amino acids corresponding to said protein selected from the group formed by s Eq ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, where each of the DNA sequences is under control of a Mhyo promoter region. More preferably SEQ ID NO: 5 is used, which already includes the promoter region of the gene encoding the Mhyo P97 protein.

Preferentemente, la secuencia exógena de ADN adicional comprende la secuencia de ADN que codifica la proteína de la cápside de CVP2 fusionada a la última base codificante del gen de una proteína de membrana de Mhyo, preferentemente la proteína de membrana se selecciona del grupo que consiste en la proteína P46 y la proteína P97, más preferentemente es la proteína P46. La cepa transformada con este plásmido expresa la proteína de Mhyo en la que inmediatamente después de su último aminoácido se encuentran los aminoácidos correspondientes a la proteína de la cápside de CVP2, es decir, expresa una proteína híbrida formada por la proteína P46 o P97 de Mhyo y la proteína de la cápside de CVP2. Teniendo en cuenta que es una proteína de membrana, la cepa de Mhyo transformada con dicho plásmido expresa la fusión de ambas proteínas en la membrana de la bacteria. La proteína de la cápside de CVP2 se selecciona del grupo formado por la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, más preferentemente es la SEQ ID NO: 4. Preferentemente la región promotora de Mhyo es la región promotora del gen que codifica la proteína P46 o la P97 de Mhyo, y aún más preferentemente el promotor de la proteína P46 de Mhyo. Preferentemente, la secuencia de ADN adicional comprende el gen que codifica la proteína de la cápside de CVP2 insertado en la secuencia de ADN que codifica un bucle de una proteína de membrana de Mhyo, preferentemente la proteína de membrana se selecciona del grupo que consiste en la proteína P46 y la proteína P97, más preferentemente es la proteína P46. La cepa transformada con este plásmido expresa la proteína de la cápside de CVP2 insertada entre la proteína P46 o P97 de Mhyo, es decir, expresa una proteína híbrida formada por la proteína P46 o P97 de Mhyo y la proteína de la cápside de CVP2. La proteína de la cápside de CVP2 se selecciona del grupo formado por la SEQ ID NO: 3, SEQ ID nO: 4 y SEQ ID NO: 5, más preferentemente es la SEQ ID NO: 3.Preferably, the additional exogenous DNA sequence comprises the DNA sequence encoding the CVP2 capsid protein fused to the last coding base of the gene for a Mhyo membrane protein, preferably the membrane protein is selected from the group consisting of the P46 protein and the P97 protein, more preferably it is the P46 protein. The strain transformed with this plasmid expresses the Mhyo protein in which the amino acids corresponding to the CVP2 capsid protein are found immediately after its last amino acid, that is, it expresses a hybrid protein formed by the Mhyo P46 or P97 protein. and the CVP2 capsid protein. Taking into account that it is a membrane protein, the Mhyo strain transformed with said plasmid expresses the fusion of both proteins in the bacterial membrane. The CVP2 capsid protein is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, more preferably it is SEQ ID NO: 4. Preferably the Mhyo promoter region is the promoter region of the gene encoding the Mhyo P46 or P97 protein, and even more preferably the Mhyo P46 protein promoter. Preferably, the additional DNA sequence comprises the gene encoding the CVP2 capsid protein inserted into the DNA sequence encoding a loop of a Mhyo membrane protein, preferably the membrane protein is selected from the group consisting of P46 protein and P97 protein, more preferably it is the P46 protein. The strain transformed with this plasmid expresses the CVP2 capsid protein inserted between the Mhyo P46 or P97 protein, that is, it expresses a hybrid protein formed by the Mhyo P46 or P97 protein and the CVP2 capsid protein. The CVP2 capsid protein is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4 and SEQ ID NO: 5, more preferably it is SEQ ID NO: 3.

Preferentemente, la proteína de la cápside de CVP2 se encuentra insertada entre los aminoácidos 92 y 93 de la proteína P46.Preferably, the CVP2 capsid protein is inserted between amino acids 92 and 93 of the P46 protein.

Los siguientes vectores de transposón, en particular plásmidos, son especialmente preferentes:The following transposon vectors, in particular plasmids, are especially preferred:

1) Un vector que comprende la secuencia de ADN que codifica una transposasa, preferentemente el transposón TN4001T, una secuencia de ADN que codifica un gen marcador, preferentemente el gen tetM, opcionalmente flanqueada por secuencias tipo loxP, y una secuencia de ADN que codifica la proteína de la cápside de CVP2, preferentemente definida por la SEQ ID NO: 5, donde cada una de las secuencias de ADN están bajo control de una región promotora de Mhyo seleccionada entre la región promotora de la proteína P97 o de la proteína P46 de Mhyo, preferentemente la región promotora de la proteína P97. Un ejemplo de este tipo de plásmido es el denominado pTC3C, y descrito en el apartado de Ejemplos.1) A vector comprising the DNA sequence encoding a transposase, preferably the TN4001T transposon, a DNA sequence encoding a marker gene, preferably the tetM gene, optionally flanked by loxP-like sequences, and a DNA sequence encoding the CVP2 capsid protein, preferably defined by SEQ ID NO: 5, wherein each of the DNA sequences is under control of a Mhyo promoter region selected from the Mhyo P97 protein or P46 protein promoter region , preferably the promoter region of the P97 protein. An example of this type of plasmid is called pTC3C, and described in the Examples section.

2) Un vector que comprende la secuencia de ADN que codifica una transposasa, preferentemente el transposón TN4001T, una secuencia de ADN que codifica un gen marcador, preferentemente el gen tetM, opcionalmente flanqueada por secuencias loxP, y una secuencia de ADN que codifica la proteína de la cápside de CVP2, preferentemente definida por la SEQ ID NO: 4, que se encuentra fusionada a la última base codificante del gen de una proteína de membrana de Mhyo, preferentemente la proteína de membrana se selecciona del grupo que consiste en la proteína P46 y la proteína P97, más preferentemente es la proteína P46, donde cada una de las secuencias de ADN están bajo el control de una región promotora de Mhyo seleccionada entre la región promotora de la proteína P97 o de la P46 de Mhyo, preferentemente la región promotora de la proteína P46. Un ejemplo de este tipo de plásmido es el denominado pTC3T, y descrito en el apartado de Ejemplos.2) A vector comprising the DNA sequence encoding a transposase, preferably the TN4001T transposon, a DNA sequence encoding a marker gene, preferably the tetM gene, optionally flanked by loxP sequences, and a DNA sequence encoding the protein of the CVP2 capsid, preferably defined by SEQ ID NO: 4, which is fused to the last coding base of the gene for a Mhyo membrane protein, preferably the membrane protein is selected from the group consisting of the P46 protein and the P97 protein, more preferably the P46 protein, where each of the DNA sequences is under the control of a Mhyo promoter region selected from the Mhyo P97 or P46 protein promoter region , preferably the promoter region of the P46 protein. An example of this type of plasmid is the one called pTC3T, and described in the Examples section.

3) Un vector que comprende la secuencia de ADN que codifica una transposasa, preferentemente el transposón TN4001T, una secuencia de ADN que codifica un gen marcador, preferentemente el gen tetM, opcionalmente flanqueada por secuencias tipo loxP, y una secuencia de ADN que codifica la proteína de la cápside de CVP2, preferentemente definida por la SEQ ID NO: 3, que se encuentra fusionada en un bucle de una proteína de membrana de Mhyo, preferentemente la proteína de membrana se selecciona del grupo que consiste en la proteína P46 y la proteína P97, más preferentemente es la proteína P46, preferentemente insertada entre los aminoácidos 92 y 93 de la proteína p46, donde cada una de las secuencias de ADN están bajo control de una región promotora de Mhyo seleccionada entre la región promotora de la proteína P97 o de la proteína P46 de Mhyo, preferentemente la región promotora de la proteína P46. Un ejemplo de este tipo de plásmido es el denominado pTC3L, y descrito en el apartado de Ejemplos.3) A vector comprising the DNA sequence encoding a transposase, preferably the TN4001T transposon, a DNA sequence encoding a marker gene, preferably the tetM gene, optionally flanked by loxP-like sequences, and a DNA sequence encoding the CVP2 capsid protein, preferably defined by SEQ ID NO: 3, which is fused into a loop of a CVP2 protein Mhyo membrane, preferably the membrane protein is selected from the group consisting of the P46 protein and the P97 protein, more preferably it is the P46 protein, preferably inserted between amino acids 92 and 93 of the p46 protein, where each of the sequences of DNA are under control of a Mhyo promoter region selected from the Mhyo P97 protein or P46 protein promoter region, preferably the P46 protein promoter region. An example of this type of plasmid is called pTC3L, and described in the Examples section.

En estos tres vectores preferentes, el grupo de secuencias exógenas de ADN, a excepción de las secuencias codificantes para la transposasa, se encuentra flanqueado por dos repeticiones invertidas que permiten la incorporación de dicho grupo al genoma de la bacteria de Mhyo a transformar. Preferentemente, las repeticiones invertidas tienen las secuencias SEQ ID NO: 7 para IRO y SEQ ID NO: 8 para IRI.In these three preferred vectors, the group of exogenous DNA sequences, with the exception of the transposase coding sequences, is flanked by two inverted repeats that allow the incorporation of said group into the genome of the Mhyo bacterium to be transformed. Preferably, the inverted repeats have the sequences SEQ ID NO: 7 for IRO and SEQ ID NO: 8 for IRI.

Otro objeto de la invención es el uso del vector plasmídico replicativo para preparar una cepa mutante de Mhyo. Cepa de Mhyo Another object of the invention is the use of the replicative plasmid vector to prepare a mutant strain of Mhyo. Mhyo Strain

En el método de la invención puede emplearse cualquier cepa de Mhyo, es decir, la cepa se puede seleccionar, entre otras, de cepas de campo, cepas de Colección (por ejemplo, la cepa J o la cepa 232) o cepas modificadas genéticamente.Any strain of Mhyo can be used in the method of the invention, that is, the strain can be selected, among others, from field strains, Collection strains (for example, J strain or 232 strain) or genetically modified strains.

La cepa de Mhyo adecuada para aplicar el método de la invención se puede aislar de casos clínicos o subclínicos, de acuerdo con los métodos habituales usados por el experto en la materia, o se puede seleccionar de las cepas que están depositadas en Colecciones de Cultivos Tipo. En los casos clínicos la cepa presenta la patología propia de la NEP, mientras que en los casos subclínicos la cepa se encuentra colonizando las mucosas del animal, pero no presenta patología. La cepa de Mhyo que se puede usar para aplicar el método de la invención puede presentar diversos grados de virulencia. En el método de la invención se usa preferentemente una cepa virulenta o una cepa que exprese los principales determinantes inmunogénicos de Mhyo. Las cepas que se pueden usar en el método de la invención incluyen la cepa 232, cuyo genoma se describe en el artículo de Minion et al., J. Bacteriol., 2004, 186(21), 7123-7133 y se recogió en la base de datos GenBank con el número AE017332; la cepa J, cuyo genoma se describe en el artículo de Vasconcelos et al., J. Bacteriol., 2005, 187(16), 5568-5577, y se recogió en la base de datos GenBank con el número AE017243, o una cepa de tipo silvestre tal como 6314, que corresponde a un aislado virulento de Mhyo que pertenece a Laboratorios Hipra, S.A. (Amer- Girona-España).The Mhyo strain suitable for applying the method of the invention can be isolated from clinical or subclinical cases, according to the usual methods used by the person skilled in the art, or it can be selected from the strains that are deposited in Type Culture Collections. . In clinical cases, the strain presents the pathology characteristic of NEP, while in subclinical cases the strain is colonizing the animal's mucous membranes, but does not present pathology. The Mhyo strain that can be used to apply the method of the invention can exhibit varying degrees of virulence. A virulent strain or a strain expressing the main immunogenic determinants of Mhyo is preferably used in the method of the invention. Strains that can be used in the method of the invention include strain 232, the genome of which is described in the article by Minion et al., J. Bacteriol., 2004, 186(21), 7123-7133 and was collected in the GenBank database number AE017332; the J strain, whose genome is described in the article by Vasconcelos et al., J. Bacteriol., 2005, 187(16), 5568-5577, and was collected in the GenBank database under the number AE017243, or a strain of wild type such as 6314, which corresponds to a virulent isolate of Mhyo belonging to Laboratorios Hipra, SA (Amer-Girona-Spain).

Transformación de la cepaStrain transformation

En el contexto de la invención, la expresión "transformar una cepa de Mhyo" tiene el significado habitual que entiende un experto en biología molecular, y se refiere a un método mediante el cual una bacteria, en este caso una bacteria Mhyo, incorpora una secuencia exógena de ADN y dicha secuencia realiza una función específica.In the context of the invention, the expression "transforming a Mhyo strain" has the usual meaning understood by an expert in molecular biology, and refers to a method by which a bacterium, in this case a Mhyo bacterium, incorporates a sequence exogenous DNA and that sequence performs a specific function.

Las funciones que puede realizar la secuencia exógena de ADN incorporada en la bacteria de Mhyo incluyen, por ejemplo, la transcripción de un ARN, la expresión de una proteína, la recombinación con otras secuencias de ADN o la interrupción de la secuencia codificante de un gen en el genoma del organismo hospedador.The functions that the foreign DNA sequence incorporated into the Mhyo bacterium can perform include, for example, the transcription of an RNA, the expression of a protein, the recombination with other DNA sequences or the interruption of the coding sequence of a gene. in the genome of the host organism.

El método de transformación es uno de los tres métodos por medio de los cuáles se puede introducir una secuencia exógena de ADN en una bacteria. Los otros dos son la conjugación, que consiste en la transferencia de material genético entre dos bacterias en contacto directo, y la transducción, que consiste en la inyección de una secuencia exógena de ADN en la bacteria mediante un virus bacteriófago.The transformation method is one of three methods by which an exogenous DNA sequence can be introduced into a bacterium. The other two are conjugation, which consists of the transfer of genetic material between two bacteria in direct contact, and transduction, which consists of the injection of an exogenous DNA sequence into the bacterium by means of a bacteriophage virus.

En el método de la invención, la transformación de una bacteria se puede llevar a cabo mediante tratamientos bioquímicos conocidos por el experto en la materia tales como, por ejemplo, la incubación de las bacterias en presencia de una sal que contiene iones divalentes tales como, por ejemplo, el cloruro cálcico o el fosfato cálcico, la exposición a una mezcla de polietilenglicol, la incubación en presencia de alcohol polivinílico, el uso de liposomas en los que la secuencia exógena de ADN se encuentra recubierta con un lípido, la transfección mediada por el dietilaminoetildextrano, o mediante tratamientos físicos como la electroporación, también denominada electrotransformación, o la biolística.In the method of the invention, the transformation of a bacterium can be carried out by means of biochemical treatments known to those skilled in the art, such as, for example, incubating the bacteria in the presence of a salt containing divalent ions such as, for example, calcium chloride or calcium phosphate, exposure to a polyethylene glycol mixture, incubation in the presence of polyvinyl alcohol, use of liposomes in which the foreign DNA sequence is coated with a lipid, transfection mediated by diethylaminoethyldextran, or through physical treatments such as electroporation, also called electrotransformation, or biolistics.

En el método de la invención, la bacteria se transforma preferentemente incubando las bacterias en presencia de una sal que contiene iones divalentes, por exposición a una mezcla de polietilenglicol, o sometiéndola a electroporación; y más preferentemente se lleva a cabo por electroporación.In the method of the invention, the bacterium is preferably transformed by incubating the bacteria in the presence of a salt containing divalent ions, by exposure to a polyethylene glycol mixture, or by subjecting it to electroporation; and more preferably it is carried out by electroporation.

La electroporación es un método bien conocido por el experto en la materia, cuyo protocolo experimental se describe, por ejemplo, en el manual Sambrook y Russell, mencionado anteriormente.Electroporation is a method well known to a person skilled in the art, whose experimental protocol is described, for example, in the Sambrook and Russell manual, mentioned above.

En el proceso de electroporación, una suspensión de las bacterias en un tampón de electroporación que comprende el vector portador de la secuencia exógena de ADN se somete a un pulso eléctrico que provoca un cambio en la estructura de la membrana de la bacteria para facilitar la entrada de dicha secuencia al interior de la misma. In the electroporation process, a suspension of bacteria in an electroporation buffer comprising the vector carrying the exogenous DNA sequence is subjected to an electrical pulse that causes a change in the structure of the bacterial membrane to facilitate entry. of said sequence within it.

El tampón de electroporación puede ser, por ejemplo, un tampón de pH 7,2 formado por sacarosa y ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperacinaetanosulfónico (HEPES), si bien se puede usar cualquier tampón adecuado para electroporación, bien conocido por el experto en la materia, tales como los descritos en el manual de Sambrook y Russell, mencionado anteriormente.The electroporation buffer can be, for example, a pH 7.2 buffer made up of sucrose and 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), although any well-known suitable electroporation buffer can be used. by the person skilled in the art, such as those described in the Sambrook and Russell manual, mentioned above.

El vector portador, que porta la secuencia exógena de ADN, se usa generalmente a una concentración comprendida entre 0,1 y 5 pg/ml, preferentemente entre 0,5 y 2 pg/ml. Como vehículo de dicho vector portador se usa habitualmente un tampón de electroporación.The carrier vector, which carries the exogenous DNA sequence, is generally used at a concentration between 0.1 and 5 pg/ml, preferably between 0.5 and 2 pg/ml. As a vehicle for said carrier vector, an electroporation buffer is usually used.

La suspensión de bacterias comprende generalmente entre 106 y 1012ufc/ml.The suspension of bacteria generally comprises between 106 and 1012 cfu/ml.

La electroporación se puede realizar generalmente a un voltaje comprendido entre 1 y 3 kV, una resistencia comprendida entre 75 y 300 Q y una capacitancia comprendida entre 10 y 40 pF. En el método de la invención, la electroporación se realiza preferentemente a un voltaje comprendido entre 2 y 3 kV, una resistencia comprendida entre 100 y 175 Q, y una capacitancia comprendida entre 20 y 30 pF.Electroporation can generally be carried out at a voltage between 1 and 3 kV, a resistance between 75 and 300 Q and a capacitance between 10 and 40 pF. In the method of the invention, the electroporation is preferably carried out at a voltage between 2 and 3 kV, a resistance between 100 and 175 Q, and a capacitance between 20 and 30 pF.

Preferentemente, antes de realizar la electroporación, la suspensión de bacterias Mhyo se somete a una incubación en un tampón de electroporación con un agente quelante de iones divalentes. Si bien dicha etapa no resulta fundamental en el método de la invención, se ha observado que la misma aumenta significativamente la eficacia de la transformación.Preferably, before carrying out the electroporation, the suspension of Mhyo bacteria is subjected to an incubation in an electroporation buffer with a divalent ion chelating agent. Although said step is not essential in the method of the invention, it has been observed that it significantly increases the efficiency of the transformation.

Los agentes quelantes que pueden usarse para dicha incubación incluyen, por ejemplo, ácidos aminocarboxílicos tales como el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), el ácido nitrilotriacético (NTA), el ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) o sus sales alcalinas; ácidos hidroxicarboxílicos tales como el ácido cítrico, el ácido glucónico o sus sales alcalinas; ácidos fosfónicos, tales como el ácido 2-aminoetilfosfónico, el ácido 1-hidroxietiliden-1,1-difosfónico (HEDP), el ácido amino tris(metilenfosfónico) (ATMP), el ácido etilendiamina tetra(metilenfosfónico) (EDTMP) o sus sales alcalinas. Preferentemente, el agente quelante es EDTA.Chelating agents that can be used for such incubation include, for example, aminocarboxylic acids such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), nitrilotriacetic acid (NTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) or their alkaline salts; hydroxycarboxylic acids such as citric acid, gluconic acid or their alkaline salts; phosphonic acids, such as 2-aminoethylphosphonic acid, 1-hydroxyethylidene-1,1-diphosphonic acid (HEDP), amino tris(methylenephosphonic) acid (ATMP), ethylenediamine tetra(methylenephosphonic) acid (EDTMP) or their salts alkaline. Preferably the chelating agent is EDTA.

Una vez realizada la electroporación, es decir, una vez emitido el pulso eléctrico, preferentemente la suspensión de bacterias se incuba con una cantidad adicional del vector portador que comprende la secuencia exógena de ADN. Habitualmente, se usa la misma cantidad de vector portador que se añade antes de efectuar el pulso eléctrico. Dicha incubación se realiza incubando la suspensión de bacterias y el vector portador con hielo durante un período inferior aproximadamente a 1 hora, y a continuación manteniéndola durante un período comprendido entre 2 y 5 horas a una temperatura de 37 °C y en una atmósfera con un 5 % de anhídrido carbónico.Once the electroporation has been carried out, that is to say, once the electrical pulse has been emitted, the bacterial suspension is preferably incubated with an additional quantity of the carrier vector comprising the exogenous DNA sequence. Typically, the same amount of carrier vector is used as is added before the electrical pulse is performed. Said incubation is carried out by incubating the suspension of bacteria and the carrier vector with ice for a period of less than approximately 1 hour, and then maintaining it for a period of between 2 and 5 hours at a temperature of 37 °C and in an atmosphere with a 5 % carbon dioxide.

Más preferentemente, antes de realizar la electroporación, la suspensión de bacterias Mhyo se somete a una incubación en un tampón de electroporación con un agente quelante de iones divalentes, y después de la electroporación, la suspensión de bacterias se incuba con una cantidad adicional del vector portador que comprende la secuencia exógena de ADN.More preferably, prior to electroporation, the Mhyo bacteria suspension is incubated in an electroporation buffer with a divalent ion chelating agent, and after electroporation, the bacteria suspension is incubated with an additional amount of vector. carrier comprising the exogenous DNA sequence.

Como se describe en el presente documento, la transformación puede llevarse a cabo mediante el uso de un vector plasmídico replicativo.As described herein, transformation can be accomplished through the use of a replicative plasmid vector.

Por lo tanto, la transformación de la cepa de Mhyo de acuerdo con el método de la invención permite obtener una cepa de Mhyo que comprende al menos una secuencia exógena de ADN en un vector extracromosómico (o elemento episómico) que replica de forma autónoma y estable en Mhyo, si la transformación se ha realizado mediante vectores plasmídicos replicativos.Therefore, the transformation of the Mhyo strain according to the method of the invention makes it possible to obtain a Mhyo strain comprising at least one exogenous DNA sequence in an extrachromosomal vector (or episomal element) that replicates autonomously and stably. in Mhyo, if the transformation has been carried out using replicative plasmid vectors.

Obtención de cepas mutantesObtaining mutant strains

Es un objeto de la invención una cepa mutante de Mhyo obtenible mediante el método de la invención.An object of the invention is a mutant strain of Mhyo obtainable by the method of the invention.

Otro objeto de la invención es una cepa mutante de Mhyo que comprende al menos una secuencia exógena de ADN incorporada de forma estable en el citosol de la misma. Preferentemente la secuencia exógena de ADN puede estar controlada por una secuencia de ADN que tiene un grado de identidad al menos del 80 %, preferentemente al menos del 85 %, más preferentemente al menos del 90 %, aún más preferentemente al menos del 95 %, más preferentemente al menos del 99 % y aún más preferentemente del 100 % con una región promotora de Mhyo. La secuencia exógena de ADN está comprendida en el vector plasmídico replicativo de la invención.Another object of the invention is a mutant strain of Mhyo comprising at least one exogenous DNA sequence stably incorporated into its cytosol. Preferably the exogenous DNA sequence may be controlled by a DNA sequence having a degree of identity of at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 90%, still more preferably at least 95%, more preferably at least 99% and even more preferably 100% with a Mhyo promoter region. The exogenous DNA sequence is comprised in the replicative plasmid vector of the invention.

La secuencia exógena de ADN puede estar comprendida entre las repeticiones de secuencia invertidas IRI e IRO del vector de transposón de la presente divulgación (no forma parte de la invención).The exogenous DNA sequence may be comprised between the IRI and IRO inverted sequence repeats of the transposon vector of the present disclosure (not part of the invention).

La cepa mutante de Mhyo de la invención comprende el vector plasmídico replicativo de la invención. Cuando se usa un vector plasmídico replicativo, la cepa mutante de Mhyo comprende dicho vector en el citosol de la misma. En el caso de usar un vector de transposón, la cepa mutante de Mhyo incorpora una parte substancial del vector, que es la parte que se encuentra comprendida entre las repeticiones de secuencias invertidas IRI e IRO, y que comprende al menos una secuencia exógena de ADN.The Mhyo mutant strain of the invention comprises the replicative plasmid vector of the invention. When is it used a replicating plasmid vector, the Mhyo mutant strain comprises said vector in the cytosol thereof. In the case of using a transposon vector, the Mhyo mutant strain incorporates a substantial part of the vector, which is the part that is found between the IRI and IRO inverted sequence repeats, and that comprises at least one exogenous DNA sequence. .

Otro objeto de la invención es una cepa de Mhyo transformada con el vector portador de la invención.Another object of the invention is a strain of Mhyo transformed with the carrier vector of the invention.

En el contexto de la invención se entiende por "cepa mutante de Mycoplasma hyopneumoniae" una cepa de Mhyo que se ha modificado genéticamente mediante la utilización de herramientas de ingeniería genética.In the context of the invention, " Mycoplasma hyopneumoniae mutant strain" is understood to mean a Mhyo strain that has been genetically modified using genetic engineering tools.

Mediante el método de la invención se puede obtener una cepa mutante de Mhyo que incorpora de forma estable una secuencia exógena de ADN que es funcional en dicha cepa mutante.By means of the method of the invention, a Mhyo mutant strain can be obtained that stably incorporates an exogenous DNA sequence that is functional in said mutant strain.

En el contexto de la invención, se entiende que una secuencia exógena de ADN es funcional en una cepa mutante de Mhyo cuando, por ejemplo, expresa la proteína codificada por dicha secuencia, transcribe un ARN o modifica genéticamente dicha cepa.In the context of the invention, it is understood that an exogenous DNA sequence is functional in a Mhyo mutant strain when, for example, it expresses the protein encoded by said sequence, transcribes an RNA or genetically modifies said strain.

En el método de la invención para obtener cepas de Mhyo transformadas, el material de partida es preferentemente un cultivo de Mhyo en fase de crecimiento exponencial.In the method of the invention to obtain transformed Mhyo strains, the starting material is preferably a Mhyo culture in exponential growth phase.

Dicho cultivo se obtiene preferentemente usando un medio de cultivo que comprende medio FriisHS (suero de caballo, extracto de levadura, infusión de caldo de corazón, solución salina equilibrada de Hank y caldo PPLO (del inglés, Pleuro-Pneumonia Like Organisms, organismo de tipo pleuroneumonía)).Said culture is preferably obtained using a culture medium comprising FriisHS medium (horse serum, yeast extract, heart broth infusion, Hank's balanced salt solution and PPLO broth ( Pleuro-Pneumonia Like Organisms). pleuropneumonia)).

El cultivo se mantiene preferentemente entre 48 y 144 horas a una temperatura de aproximadamente 37 °C con agitación entre 100 y 200 rpm hasta llegar a la fase de crecimiento exponencial.The culture is preferably kept between 48 and 144 hours at a temperature of approximately 37 °C with agitation between 100 and 200 rpm until reaching the exponential growth phase.

A continuación, se aíslan las bacterias, preferentemente por centrifugación, y se someten al método de transformación.The bacteria are then isolated, preferably by centrifugation, and subjected to the transformation method.

Tras la transformación, la suspensión de bacterias se extiende preferentemente en placas de medio FriisHS complementado con agar y el antibiótico de selección deseado.After transformation, the bacterial suspension is preferably plated on FriisHS medium supplemented with agar and the desired selection antibiotic.

Las colonias transformadas que muestran resistencia al antibiótico del medio se pueden recuperar después de 2 o 3 semanas de incubación a una temperatura de 37 °C y en una atmósfera con un 5 % de anhídrido carbónico. A continuación, dichas colonias transformadas se inoculan preferentemente en medio FriisHS complementado con el antibiótico de selección, y tras aproximadamente 10 o 20 días se procede al estudio del genotipo y/o fenotipo de los mutantes obtenidos, mediante la obtención de sus extractos proteicos o de ADN genómico, por métodos bien conocidos por el experto en la materia.Transformed colonies showing resistance to the antibiotic in the medium can be recovered after 2-3 weeks of incubation at 37°C and 5% carbon dioxide atmosphere. Next, these transformed colonies are preferably inoculated in FriisHS medium supplemented with the selection antibiotic, and after approximately 10 or 20 days the genotype and/or phenotype of the mutants obtained is studied, by obtaining their protein extracts or Genomic DNA, by methods well known to the person skilled in the art.

Mediante el método de la invención se pueden obtener cepas mutantes de Mhyo transformadas que expresan una proteína recombinante.By means of the method of the invention, transformed Mhyo mutant strains that express a recombinant protein can be obtained.

Preferentemente, la cepa mutante de Mhyo de la invención expresa el contenido codificado por la secuencia exógena de ADN, por ejemplo, una proteína. La secuencia exógena de ADN puede ser, por ejemplo, la proteína de la cápside del circovirus (CVP2), o una proteína de Mhyo, por ejemplo, la proteína P46, para conseguir una sobreexpresión de la misma. Las cepas 232Cc6, 6314Cc1, 232Lc2 y 232Tc2, divulgadas adicionalmente en el presente documento, incorporan la secuencia exógena de ADN en el genoma de la bacteria.Preferably, the Mhyo mutant strain of the invention expresses the content encoded by the exogenous DNA sequence, eg a protein. The exogenous DNA sequence can be, for example, the circovirus capsid protein (CVP2), or a Mhyo protein, for example, the P46 protein, to achieve overexpression thereof. Strains 232Cc6, 6314Cc1, 232Lc2 and 232Tc2, further disclosed herein, incorporate the exogenous DNA sequence into the genome of the bacteria.

En el presente documento se divulga la cepa mutante de Mhyo depositada por Laboratorios Hipra, S.A. (Amer, Girona, España) en Leibniz-Institut DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, InhoffenstralJe 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania) con el número de referencia DSM 26027 el 29 de mayo de 2012. Dicha cepa, denominada 232Cc6, incorpora el transposón presente en el plásmido pTC3C en la cepa 232 de Mhyo. Esta cepa expresa la proteína de la cápside de CVP2 en el citoplasma y en unas cantidades que pueden detectarse por transferencia tipo Western y ensayo de ELISA.This document discloses the Mhyo mutant strain deposited by Laboratorios Hipra, SA (Amer, Girona, Spain) at the Leibniz-Institut DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, InhoffenstralJe 7 B, 38124 Braunschweig, Germany) with the number reference DSM 26027 on May 29, 2012. Said strain, designated 232Cc6, incorporates the transposon present in the pTC3C plasmid in Mhyo strain 232. This strain expresses the CVP2 capsid protein in the cytoplasm and in amounts that can be detected by Western blotting and ELISA assay.

En el presente documento se divulga la cepa mutante de Mhyo depositada por Laboratorios Hipra, S.A. (Amer, Girona, España) en Leibniz-Institut DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, InhoffenstralJe 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania) con el número de referencia DSM 26020 el 29 de mayo de 2012. Dicha cepa, denominada 6314Cc1, incorpora el transposón presente en el plásmido pTC3C en la cepa de tipo silvestre 6314 de Mhyo. Esta cepa expresa la proteína de la cápside de CVP2 en el citoplasma y en unas cantidades que pueden detectarse por transferencia tipo Western y ensayo de ELISA.This document discloses the Mhyo mutant strain deposited by Laboratorios Hipra, SA (Amer, Girona, Spain) at the Leibniz-Institut DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, InhoffenstralJe 7 B, 38124 Braunschweig, Germany) with the number from DSM reference 26020 on May 29, 2012. Said strain, designated 6314Cc1, incorporates the transposon present in the pTC3C plasmid in the wild-type strain 6314 from Mhyo. This strain expresses the CVP2 capsid protein in the cytoplasm and in amounts that can be detected by Western blotting and ELISA assay.

En el presente documento se divulga la cepa mutante de Mhyo depositada por Laboratorios Hipra S.A. (Amer, Girona, España) en Leibniz-Institut DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, InhoffenstralJe 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania) con el número de referencia DSM 26033 el 29 de mayo de 2012. Dicha cepa, denominada 232Lc2, incorpora el transposón presente en el plásmido pTC3L en la cepa de tipo silvestre 232 de Mhyo. Esta cepa expresa la proteína de la cápside de CVP2 en unas cantidades que pueden detectarse por ensayo de ELISA.This document discloses the Mhyo mutant strain deposited by Laboratorios Hipra SA (Amer, Girona, Spain) at the Leibniz-Institut DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, InhoffenstralJe 7 B, 38124 Braunschweig, Germany) with the number of reference DSM 26033 on May 29, 2012. Said strain, designated 232Lc2, incorporates the transposon present in the pTC3L plasmid in the wild-type strain 232 of Mhyo. This strain expresses the CVP2 capsid protein in amounts that can be detected by ELISA assay.

En el presente documento se divulga la cepa mutante de Mhyo depositada por Laboratorios Hipra, S.A. (Amer, Girona, España) en Leibniz-Institut DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, InhoffenstralJe 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania) con el número de referencia DSM 26034 el 29 de mayo de 2012. Dicha cepa, denominada 232Tc2, incorpora el transposón presente en el plásmido pTC3T en la cepa de tipo silvestre 232 de Mhyo. Esta cepa expresa la proteína de la cápside de CVP2 en unas cantidades que pueden detectarse por ensayo de ELISA.This document discloses the Mhyo mutant strain deposited by Laboratorios Hipra, SA (Amer, Girona, Spain) at the Leibniz-Institut DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, InhoffenstralJe 7 B, 38124 Braunschweig, Germany) with the number reference DSM 26034 on May 29, 2012. Said strain, designated 232Tc2, incorporates the transposon present in the plasmid pTC3T in the wild-type strain 232 of Mhyo. This strain expresses the CVP2 capsid protein in amounts that can be detected by ELISA assay.

Las cepas siguientes también expresan la proteína codificada por la secuencia exógena de ADN, en este caso incorporada en el citosol de la bacteria como un elemento episómico:The following strains also express the protein encoded by the foreign DNA sequence, in this case incorporated into the cytosol of the bacterium as an episomal element:

- la cepa de Mhyo transformada 232POGc9 que incorpora el plásmido replicativo pOG en la cepa de tipo silvestre 232 de Mhyo. Dicha incorporación se ha detectado por digestión del ADN total de esta cepa de Mhyo con enzimas de restricción y analizando los fragmentos resultantes por electroforesis de gel de agarosa.- the transformed Mhyo strain 232POGc9 incorporating the replicative plasmid pOG into the wild type Mhyo strain 232. Said incorporation has been detected by digestion of the total DNA of this Mhyo strain with restriction enzymes and analyzing the resulting fragments by agarose gel electrophoresis.

- la cepa de Mhyo transformada 232POGCREc1 que incorpora el plásmido replicativo pOGCRE en la cepa de tipo silvestre 232 de Mhyo. La expresión de la recombinasa Cre se detecta mediante transferencia tipo Western e inmunodetección.- the transformed Mhyo strain 232POGCREc1 incorporating the replicative plasmid pOGCRE into the wild type Mhyo strain 232. Cre recombinase expression is detected by Western blotting and immunodetection.

En el presente documento se divulgan adicionalmente cepas mutantes de Mhyo en las que la secuencia exógena de ADN incorporada por transposición produce un ARN antisentido que puede bloquear la traducción de un gen responsable de la virulencia de dicha cepa, por ejemplo, un gen que corresponde a una hemolisina de Mhyo. Further disclosed herein are mutant strains of Mhyo in which the exogenous DNA sequence incorporated by shuffling produces an antisense RNA that can block the translation of a gene responsible for the virulence of said strain, for example, a gene corresponding to a Mhyo hemolysin.

Preferentemente, la cepa mutante de Mhyo incorpora una secuencia exógena de ADN en el genoma o en el citosol de modo que dicha cepa produce un ARN antisentido con respecto a un gen responsable de la virulencia de dicha cepa.Preferably, the Mhyo mutant strain incorporates an exogenous DNA sequence into the genome or cytosol such that said strain produces an antisense RNA to a gene responsible for the virulence of said strain.

En el presente documento se divulgan adicionalmente cepas mutantes de Mhyo en las que la secuencia exógena de ADN incorporada por transposición en el genoma de la cepa, interrumpe un gen que codifica un factor de virulencia de Mhyo, y presentan una virulencia atenuada.Further disclosed herein are Mhyo mutant strains in which the exogenous DNA sequence transposed into the strain's genome, disrupts a gene encoding a Mhyo virulence factor, and exhibits attenuated virulence.

Además se divulga en el presente documento una cepa mutante de Mhyo que incorpora una secuencia exógena de ADN que interrumpe un gen que codifica un factor de virulencia de Mhyo, por ejemplo una hemolisina. Un ejemplo es la cepa denominada 232TC3hlyC.Further disclosed herein is a Mhyo mutant strain incorporating an exogenous DNA sequence that disrupts a gene encoding a Mhyo virulence factor, for example a hemolysin. An example is the strain designated 232TC3hlyC.

Las cepas mutantes que portan un gen interrumpido que codifica un factor de virulencia de Mhyo se pueden seleccionar mediante métodos bien conocidos por el experto en la materia, tal como es la secuenciación del genoma de dichos mutantes.The mutant strains that carry an interrupted gene encoding a Mhyo virulence factor can be selected by methods well known to those skilled in the art, such as genome sequencing of said mutants.

En el presente documento se divulga la cepa mutante de Mhyo depositada por Laboratorios Hipra, S.A. (Amer, Girona, España) en Leibniz-Institut DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, InhoffenstralJe 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania) con el número de referencia DSM 26049 el 29 de mayo de 2012. Dicha cepa, denominada 232TC3hlyC, incorpora el transposón presente en el plásmido TC3 en la cepa de tipo silvestre 232 de Mhyo. Esta cepa presenta una interrupción del ORF que codifica el factor de virulencia hlyC de Mhyo, por lo que es buena candidata para utilizarse como una cepa vacunal atenuada. La inserción en el genoma se detecta mediante transferencia tipo Southern y por secuenciación directa.This document discloses the Mhyo mutant strain deposited by Laboratorios Hipra, SA (Amer, Girona, Spain) at the Leibniz-Institut DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, InhoffenstralJe 7 B, 38124 Braunschweig, Germany) with the number from DSM reference 26049 on May 29, 2012. This strain, named 232TC3hlyC, incorporates the transposon present on the TC3 plasmid in the wild-type strain 232 from Mhyo. This strain presents an interruption of the ORF encoding the Mhyo hlyC virulence factor, making it a good candidate for use as an attenuated vaccine strain. The insertion into the genome is detected by Southern blotting and by direct sequencing.

A partir de la información contenida en la presente descripción, el experto en la materia puede preparar otras cepas de Mhyo usando el método de la invención y seleccionando otras secuencias exógenas de ADN distintas a las descritas específicamente.From the information contained in the present description, the person skilled in the art can prepare other Mhyo strains using the method of the invention and selecting other exogenous DNA sequences other than those specifically described.

Es un objeto de la invención la utilización de una cepa mutante de Mhyo que comprende una secuencia exógena de ADN en el citosol como hospedador para su expresión. La secuencia exógena de ADN puede codificar proteínas recombinantes o para otras secuencias de interés tal como se ha explicado en la presente descripción.An object of the invention is the use of a Mhyo mutant strain comprising an exogenous DNA sequence in the cytosol as a host for its expression. The exogenous DNA sequence can code for recombinant proteins or for other sequences of interest as explained in the present description.

Se puede observar que mediante el método de la invención se pueden obtener cepas mutantes de Mhyo con características muy diversas, de modo que el experto en la materia tiene a su disposición un método para modificar genéticamente cepas de Mhyo y obtener cepas que presenten diversas funcionalidades.It can be seen that by means of the method of the invention mutant strains of Mhyo with highly diverse characteristics can be obtained, so that the person skilled in the art has at his disposal a method for genetically modifying Mhyo strains and obtaining strains that present various functionalities.

Los ejemplos 5 y 6 muestran que las cepas mutantes de Mhyo obtenidas de acuerdo con el método divulgado sorprendentemente incorporan de forma estable la secuencia exógena de ADN incluida en el vector portador y expresan el contenido de la misma tal como, por ejemplo, mediante la producción de proteínas recombinantes. La cepa obtenida mediante el método de la invención puede atenuarse o inactivarse mediante procedimientos convencionales bien conocidos por el experto en la materia. De este modo puede usarse para la preparación de vacunas. Preferentemente, se usa en forma inactivada.Examples 5 and 6 show that the Mhyo mutant strains obtained according to the disclosed method surprisingly stably incorporate the included exogenous DNA sequence into the carrier vector and express the content thereof such as, for example, by producing of recombinant proteins. The strain obtained by the method of the invention can be attenuated or inactivated by procedures conventional ones well known to the person skilled in the art. Thus it can be used for the preparation of vaccines. Preferably, it is used in inactivated form.

Mediante el método de la invención se obtienen nuevas cepas de Mhyo, hasta ahora no divulgadas. Sus características permiten preparar nuevas vacunas frente a Mhyo y al mismo tiempo, frente a otros patógenos del cerdo. Es decir, las cepas mutantes de la invención permiten preparar vacunas polivalentes mediante el uso de una única cepa transformada de acuerdo con el método de la invención.By means of the method of the invention, new strains of Mhyo, hitherto undisclosed, are obtained. Its characteristics allow the preparation of new vaccines against Mhyo and, at the same time, against other pig pathogens. That is, the mutant strains of the invention make it possible to prepare polyvalent vaccines by using a single strain transformed according to the method of the invention.

VacunasVaccines

Es un objeto de la invención una vacuna para la protección de cerdos frente a la neumonía enzoótica porcina provocada por Mhyo, y opcionalmente frente a otra enfermedad o afecciones patológicas provocadas por microorganismos que afectan a los cerdos, que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de la cepa mutante de Mhyo de la invención.An object of the invention is a vaccine for the protection of pigs against swine enzootic pneumonia caused by Mhyo, and optionally against other disease or pathological conditions caused by microorganisms that affect pigs, comprising an immunologically effective amount of the strain Mhyo mutant of the invention.

Preferentemente, la vacuna comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, un agente adyuvante.Preferably, the vaccine comprises a pharmaceutically acceptable carrier and, optionally, an adjuvant agent.

En la vacuna de la invención la cepa se encuentra en forma inactivada o atenuada, preferentemente inactivada. Una vacuna inactivada se puede obtener mediante la inactivación de un patógeno, en este caso una bacteria, habitualmente mediante el uso de calor, compuestos químicos tales como formaldehído, BEI (etileneimina binaria) o tensioactivos, de fuerza mecánica usando un homogeneizador, etc. La inactivación del agente patógeno puede conducir al mantenimiento de la estructura del mismo, pero sin capacidad de replicarse, o a la destrucción o disgregación de la estructura. En el contexto de la invención, la expresión "vacuna inactivada" incluye una composición que comprende las bacterias inactivadas, pero que mantienen su estructura, así como una composición en la que la estructura de las bacterias se ha destruido o disgregado.In the vaccine of the invention, the strain is in an inactivated or attenuated form, preferably inactivated. An inactivated vaccine can be obtained by inactivating a pathogen, in this case a bacterium, usually by using heat, chemical compounds such as formaldehyde, BEI (binary ethyleneimine) or surfactants, mechanical force using a homogenizer, etc. The inactivation of the pathogenic agent can lead to the maintenance of its structure, but without the ability to replicate, or to the destruction or disintegration of the structure. In the context of the invention, the expression "inactivated vaccine" includes a composition that comprises the inactivated bacteria, but which maintain their structure, as well as a composition in which the structure of the bacteria has been destroyed or disintegrated.

Otro objeto de la invención es el uso de la cepa mutante de Mhyo de la invención para la preparación de una vacuna frente a la neumonía enzoótica porcina provocada por Mhyo, y opcionalmente frente a otra enfermedad o afecciones patológicas adicionales que afectan a los cerdos.Another object of the invention is the use of the Mhyo mutant strain of the invention for the preparation of a vaccine against swine enzootic pneumonia caused by Mhyo, and optionally against other diseases or additional pathological conditions affecting pigs.

La expresión "inmunológicamente eficaz" significa que la cantidad de bacterias administradas en el proceso de vacunación es suficiente para inducir en el hospedador una respuesta inmunológica eficaz frente a una infección por formas virulentas de Mhyo y, en el caso en que la cepa de Mhyo transformada exprese una proteína recombinante que es capaz de inducir o de contribuir a la inducción de una respuesta protectora frente a enfermedades o afecciones patológicas que pueden afectar a los cerdos, también es suficiente para inducir en el hospedador una respuesta inmunológica eficaz frente a una infección provocada por dicho microorganismo.The expression "immunologically effective" means that the quantity of bacteria administered in the vaccination process is sufficient to induce an effective immunological response in the host against an infection by virulent forms of Mhyo and, in the case in which the transformed Mhyo strain expresses a recombinant protein that is capable of inducing or contributing to the induction of a protective response against diseases or pathological conditions that can affect pigs, it is also sufficient to induce in the host an effective immune response against an infection caused by said microorganism.

Preferentemente, la vacuna está dirigida a conferir protección a cerdos frente a enfermedades o afecciones patológicas tales como, por ejemplo, las provocadas por los microorganismos Actinobacillus sp., Brachyspira sp., Pasteurella multocida, Salmonella sp., Streptococcus sp., Isospora sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Leptospira sp., Staphylococcus sp., Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Clostridium sp., Mycoplasma sp., Lawsonia intracellularis, Escherichia coli, virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino, virus de la gripe porcina, virus de la gastroenteritis transmisible, parvovirus porcino, virus de la encefalomiocarditis, coronavirus, rotavirus, circovirus porcino, el agente del síndrome del fallo del desarrollo peridestete porcino, virus de la peste porcina clásica, virus de la peste porcina africana, calicivirus y torque teno virus (TTV).Preferably, the vaccine is intended to confer protection to pigs against diseases or pathological conditions such as, for example, those caused by the microorganisms Actinobacillus sp., Brachyspira sp., Pasteurella multocida, Salmonella sp., Streptococcus sp., Isospora sp. , Erysipelothrix rhusiopathiae, Leptospira sp., Staphylococcus sp., Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Clostridium sp., Mycoplasma sp. , Lawsonia intracellularis, Escherichia coli, porcine reproductive and respiratory syndrome virus, swine influenza virus, gastroenteritis virus transmissible, porcine parvovirus, encephalomyocarditis virus, coronavirus, rotavirus, porcine circovirus, the agent of porcine periweaning failure syndrome, classical swine fever virus, African swine fever virus, calicivirus, and torque tenovirus (TTV) .

Más preferentemente, la enfermedad adicional es la conocida como EACVP (enfermedades asociadas a circovirus porcino) provocada por circovirus porcino (CVP2), ya sea se presente como único agente o con la presencia de otros patógenos o microorganismos asociados.More preferably, the additional disease is the one known as EACVP (diseases associated with porcine circovirus) caused by porcine circovirus (CVP2), whether it occurs as the only agent or with the presence of other associated pathogens or microorganisms.

La vacuna de la invención también puede combinarse, en un único recipiente o en recipientes distintos, con una vacuna o composición antigénica adicional. Preferentemente, la vacuna o composición antigénica adicional está dirigida a conferir protección a cerdos frente a enfermedades o afecciones patológicas tales como, por ejemplo, las provocadas por los microorganismos Actinobacillus sp., Brachyspira sp., Pasteurella multocida, Salmonella sp., Streptococcus sp., Isospora sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Leptospira sp., Staphylococcus sp., Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Clostridium sp., Mycoplasma sp., Lawsonia intracellularis, Escherichia coli, virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino, virus de la gripe porcina, virus de la gastroenteritis transmisible, parvovirus porcino, virus de la encefalomiocarditis, coronavirus, rotavirus, circovirus porcino, el agente del síndrome del fallo del desarrollo peridestete porcino, virus de la peste porcina clásica, virus de la peste porcina africana, calicivirus y torque teno virus (TTV).The vaccine of the invention may also be combined, in a single container or in separate containers, with an additional vaccine or antigenic composition. Preferably, the additional vaccine or antigenic composition is intended to confer protection to pigs against diseases or pathological conditions such as, for example, those caused by the microorganisms Actinobacillus sp., Brachyspira sp., Pasteurella multocida, Salmonella sp., Streptococcus sp. , Isospora sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Leptospira sp., Staphylococcus sp., Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Clostridium sp., Mycoplasma sp., Lawsonia intracellularis, Escherichia coli, porcine reproductive and respiratory syndrome virus, swine influenza virus, transmissible gastroenteritis virus, porcine parvovirus, encephalomyocarditis virus, coronavirus, rotavirus, porcine circovirus, the agent of porcine periweaning failure syndrome, classical swine fever virus, African swine fever virus, calicivirus and torque teno virus (TVT).

La vacuna de la invención comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de bacterias de una cepa inactivada o viva de Mhyo que se puede obtener de acuerdo con el método descrito en la presente invención. The vaccine of the invention comprises an immunologically effective amount of bacteria of an inactivated or live strain of Mhyo obtainable according to the method described in the present invention.

Es conocido que la dosis a emplear depende de la edad y del peso del animal a vacunar y de la vía de administración.It is known that the dose to be used depends on the age and weight of the animal to be vaccinated and the route of administration.

Generalmente, las dosis adecuadas se encuentran comprendidas en el intervalo de entre 103 y 1010 unidades de cambio de color (ucc), preferentemente entre 106 y 1010 ucc, y más preferentemente entre 108 y 109 ucc.Generally, suitable doses are in the range of 103 to 1010 color change units (ucc), preferably 106 to 1010 ucc, and most preferably 108 to 109 ucc.

Los animales pueden vacunarse en cualquier tiempo adecuado. Preferentemente, se administra una dosis de la vacuna de la invención entre la primera y las 12 semanas de edad, y más preferentemente la vacuna se administra comenzando a las 3 semanas de edad. En casos concretos puede ser necesaria la administración de dosis complementarias para conseguir una protección satisfactoria. En estas circunstancias se administra preferentemente una segunda dosis entre 1 y 5 semanas después de la primera dosis, más preferentemente después de 3 semanas desde la primera dosis. Preferentemente, la vacuna es una vacuna de administración única.Animals can be vaccinated at any suitable time. Preferably, a dose of the vaccine of the invention is administered between 1 and 12 weeks of age, and more preferably the vaccine is administered beginning at 3 weeks of age. In specific cases it may be necessary to administer additional doses to achieve satisfactory protection. Under these circumstances a second dose is preferably administered between 1 and 5 weeks after the first dose, more preferably after 3 weeks from the first dose. Preferably, the vaccine is a single administration vaccine.

La vacuna de la invención está destinada a la especie porcina, incluyendo entre otros cerdos, verracos, cerdas y lechones, de cualquier edad o en cualquier fase de su ciclo productivo; preferentemente está destinada a cerdos en fase de engorde y más preferentemente a cerdos de 1 a 12 semanas de vida.The vaccine of the invention is intended for the porcine species, including, among other things, pigs, boars, sows and piglets, of any age or in any phase of their productive cycle; It is preferably intended for pigs in the fattening phase and more preferably for pigs from 1 to 12 weeks of age.

La vacuna puede administrarse por vía intranasal, intradérmica, mucosa o submucosa, subcutánea, mediante aerosol, intramuscular u oral. Preferentemente se administra por vía intradérmica o intramuscular.The vaccine can be administered intranasally, intradermally, mucosally or submucosally, subcutaneously, by aerosol, intramuscularly, or orally. It is preferably administered intradermally or intramuscularly.

Dicha vacuna puede prepararse de acuerdo con los métodos habituales empleados por el experto en la materia para la preparación de formulaciones farmacéuticas adecuadas para las diferentes formas de administración, tal como se describe por ejemplo en el manual Remington The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición, Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, 2000 [ISBN: 0-683-306472].Said vaccine can be prepared according to the usual methods used by the person skilled in the art for the preparation of suitable pharmaceutical formulations for the different forms of administration, as described, for example, in the manual Remington The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition. , Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2000 [ISBN: 0-683-306472].

Normalmente, las vacunas se preparan como vacunas para inyección en forma de soluciones, emulsiones o suspensiones líquidas. También se pueden preparar en una forma sólida adecuada para disolverla o suspenderla en un vehículo líquido antes de la inyección.Typically, vaccines are prepared as injection vaccines in the form of liquid solutions, emulsions or suspensions. They can also be prepared in a solid form suitable for dissolving or suspending in a liquid vehicle prior to injection.

El volumen típico de una dosis de una vacuna inyectable se encuentra entre 0,1 ml y 5 ml, preferentemente entre 0,15 ml y 3 ml, y más preferentemente entre 0,2 ml y 2 ml. Habitualmente, en la administración por vía intradérmica, se usan entre 0,1 ml y 0,5 ml, preferentemente entre 0,15 ml y 0,4 ml, y más preferentemente 0,2 ml. En la administración intramuscular, generalmente se usan entre 0,5 ml y 5 ml, preferentemente entre 1 ml y 3 ml, y más preferentemente entre 1 ml y 2 ml.The typical volume of a dose of an injectable vaccine is between 0.1 ml and 5 ml, preferably between 0.15 ml and 3 ml, and more preferably between 0.2 ml and 2 ml. Usually, in intradermal administration, 0.1 ml to 0.5 ml is used, preferably 0.15 ml to 0.4 ml, and more preferably 0.2 ml. In intramuscular administration, generally between 0.5 ml and 5 ml are used, preferably between 1 ml and 3 ml, and more preferably between 1 ml and 2 ml.

Para inmunizar un animal con la vacuna de la invención, la cepa mutante de Mhyo habitualmente se mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable.To immunize an animal with the vaccine of the invention, the Mhyo mutant strain is usually mixed with a pharmaceutically acceptable carrier.

Entre los vehículos líquidos que se pueden emplear para preparar la vacuna se encuentra, por ejemplo, el agua, la solución salina con una concentración fisiológica de sal o el líquido de cultivo en el que se cultivan las bacterias. Adicionalmente, si se desea, el vehículo puede contener sustancias auxiliares o excipientes farmacéuticamente aceptables tales como, por ejemplo, agentes humectantes, agentes dispersantes, agentes emulsionantes, agentes tampón (por ejemplo, el tampón fosfato), agentes estabilizantes tales como hidratos de carbono (por ejemplo, glucosa, sacarosa, manitol, sorbitol, almidón o dextranos) o proteínas (por ejemplo, albúmina, caseína, suero bovino o leche desnatada).Liquid vehicles that can be used to prepare the vaccine include, for example, water, saline with a physiological concentration of salt, or culture fluid in which the bacteria are grown. Additionally, if desired, the carrier may contain pharmaceutically acceptable auxiliary substances or excipients such as, for example, wetting agents, dispersing agents, emulsifying agents, buffering agents (for example, phosphate buffer), stabilizing agents such as carbohydrates ( eg glucose, sucrose, mannitol, sorbitol, starch or dextrans) or proteins (eg albumin, casein, bovine serum or skim milk).

Las características físicoquímicas de los excipientes, así como el nombre de los productos comerciales bajo los que se comercializan, se pueden encontrar en el libro R.C. Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4a edición, Pharmaceutical Press, Londres, 2003 [ISBN: 0-85369-472-9].The physicochemical characteristics of the excipients, as well as the name of the commercial products under which they are marketed, can be found in the book RC Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4th edition, Pharmaceutical Press, London, 2003 [ISBN: 0-85369-472-9].

Opcionalmente, también se pueden incorporar adyuvantes a la vacuna para potenciar la eficacia de la misma. Preferentemente, la vacuna de la invención comprende además un adyuvante.Optionally, adjuvants can also be incorporated into the vaccine to enhance the efficacy of the vaccine. Preferably, the vaccine of the invention further comprises an adjuvant.

Los adyuvantes son estimulantes inespecíficos del sistema inmunitario, que aumentan la respuesta inmunológica del hospedador frente al patógeno invasor. Ejemplos de adyuvantes son: hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, óxido de aluminio, vitamina E, escualeno, aceite vegetal, saponinas, ginseng, cimosano, glucanos, dimetilaminoetildextrano, dextranos, polímeros no iónicos en bloque, poliacrilato (carbómero), adyuvante de Freund completo, adyuvante de Freund incompleto, muramildipéptidos, emulsiones del tipo A/G, G/A, A/GA, y mezclas de los mismos.Adjuvants are non-specific stimulants of the immune system, which increase the host's immune response against the invading pathogen. Examples of adjuvants are: aluminum hydroxide, aluminum phosphate, aluminum oxide, vitamin E, squalene, vegetable oil, saponins, ginseng, cymosan, glucans, dimethylaminoethyldextran, dextrans, nonionic block polymers, polyacrylate (carbomer), adjuvant of Freund's complete, Freund's incomplete adjuvant, muramyldipeptides, emulsions of the type A/G, G/A, A/GA, and mixtures thereof.

Preferentemente, la vacuna es una vacuna de inyección y comprende la cepa mutante de la invención inactivada por un tensioactivo no iónico. Preferentemente, se usa un tensioactivo no iónico seleccionado del grupo formado por alquilfenoles etoxilados, esteres de sorbitán etoxilados, alcoholes grasos etoxilados, ácidos grasos etoxilados, alcanolamidas de ácidos grasos, alcanolamidas de ácidos grasos etoxiladas, aminas grasas etoxiladas, óxidos de aminas grasas, óxidos de amidoaminas grasas, glicéridos de ácidos grasos, ésteres de sacarosa, alquilpoliglicósidos, copolímeros de óxido de etileno y óxido de propileno, y alcoholes grasos etoxilados y propoxilados; más preferentemente se selecciona de alquilfenoles etoxilados y ésteres de sorbitán etoxilados, y aún más preferentemente es un alquilfenol etoxilado tal como, por ejemplo, Triton® X-100, comercializado por la compañía Dow.Preferably, the vaccine is an injection vaccine and comprises the mutant strain of the invention inactivated by a nonionic surfactant. Preferably, a nonionic surfactant selected from the group consisting of ethoxylated alkylphenols, ethoxylated sorbitan esters, ethoxylated fatty alcohols, ethoxylated fatty acids, fatty acid alkanolamides, ethoxylated fatty acid alkanolamides, ethoxylated fatty amines, fatty amine oxides, oxides is used. of fatty amidoamines, fatty acid glycerides, sucrose esters, alkyl polyglycosides, ethylene oxide and propylene oxide copolymers, and ethoxylated and propoxylated fatty alcohols; more preferably it is selected from ethoxylated alkylphenols and ethoxylated sorbitan esters, and even more preferably it is an ethoxylated alkylphenol such as, for example, Triton® X-100, marketed by the Dow company.

Más preferentemente, la vacuna es una vacuna de inyección y comprende la cepa mutante de la invención inactivada por un tensioactivo no iónico y como adyuvante una emulsión del tipo A/G/A tal como, por ejemplo, el producto Montanide® ISA 201, comercializado por la compañía SEPPIC (Francia).More preferably, the vaccine is an injection vaccine and comprises the mutant strain of the invention inactivated by a nonionic surfactant and an emulsion of the A/G/A type as adjuvant, such as, for example, the product Montanide® ISA 201, marketed by the company SEPPIC (France).

Preferentemente, la vacuna puede comprender la cepa de la invención en forma liofilizada. El proceso de liofilización se lleva a cabo mediante métodos bien conocidos por el experto en la materia.Preferably, the vaccine can comprise the strain of the invention in lyophilized form. The lyophilization process is carried out using methods well known to those skilled in the art.

Kit de vacunaciónvaccination kit

El objeto de la presente invención también incluye un kit de vacunación para vacunar cerdos frente a una infección o enfermedad provocada por Mhyo y, opcionalmente, frente a otra enfermedad o afecciones patológicas provocadas por microorganismos que afectan a los cerdos.The object of the present invention also includes a vaccination kit for vaccinating pigs against an infection or disease caused by Mhyo and, optionally, against other diseases or pathological conditions caused by microorganisms that affect pigs.

Dicho kit de vacunación comprende un recipiente que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de la cepa mutante de la invención o una vacuna de la invención.Said vaccination kit comprises a container comprising an immunologically effective amount of the mutant strain of the invention or a vaccine of the invention.

El kit de vacunación divulgado en el presente documento puede comprender una combinación de la vacuna de la invención con una composición antigénica adicional, que se encuentran contenidos en un único recipiente o en recipientes distintos. Dicha composición antigénica adicional está dirigida a conferir protección a cerdos frente a enfermedades o afecciones patológicas tales como las mencionadas anteriormente en la sección Vacunas.The vaccination kit disclosed herein may comprise a combination of the vaccine of the invention with an additional antigenic composition, which are contained in a single container or in separate containers. Said additional antigenic composition is directed to confer protection to pigs against diseases or pathological conditions such as those mentioned above in the Vaccines section.

La aplicación industrial de la invención se desprende claramente de la descripción. Debe destacarse que la NEP es una enfermedad respiratoria crónica de distribución mundial responsable de grandes pérdidas económicas en la industria porcina y que la posibilidad de modificar genéticamente de forma dirigida y estable cepas de Mhyo permite la preparación de vacunas con unas propiedades superiores a las bacterinas convencionales. Mediante el método de la invención se pueden preparar, por ejemplo, cepas mutantes de Mhyo atenuadas, cepas mutantes que sobreexpresan un factor de virulencia específico, cepas que inhiben un factor de virulencia específico o cepas que expresen además componentes antigénicos de microorganismos responsables de enfermedades que afectan a los cerdos, que resultan adecuadas para la preparación de vacunas eficaces frente a la NEP y frente a otras patologías porcinas.The industrial application of the invention is clear from the description. It should be noted that NEP is a chronic respiratory disease with worldwide distribution responsible for large economic losses in the swine industry and that the possibility of genetically modifying Mhyo strains in a directed and stable manner allows the preparation of vaccines with properties superior to conventional bacterins. . By means of the method of the invention, it is possible to prepare, for example, attenuated Mhyo mutant strains, mutant strains that overexpress a specific virulence factor, strains that inhibit a specific virulence factor or strains that also express antigenic components of microorganisms responsible for diseases that affect pigs, which are suitable for the preparation of effective vaccines against NEP and other swine pathologies.

La modificación genética dirigida de Mhyo de forma estable y dirigida por primera vez, ha permitido a los inventores, entre otras cosas, poder utilizar estas cepas transformadas como vector de expresión de secuencias exógenas de ADN, como por ejemplo secuencias nucleotídicas que codifican proteínas de interés terapéutico o preventivo, tales como la proteína de la cápside de CVP2, entre otras. Mediante la tecnología divulgada en la presente invención, se han diseñado y preparado nuevos candidatos vacunales polivalentes que pueden utilizarse para prevenir diferentes enfermedades al mismo tiempo mediante la administración de una única cepa.The targeted genetic modification of Mhyo in a stable and directed manner for the first time, has allowed the inventors, among other things, to be able to use these transformed strains as a vector for the expression of exogenous DNA sequences, such as nucleotide sequences encoding proteins of interest. therapeutic or preventive, such as the CVP2 capsid protein, among others. Through the technology disclosed in the present invention, new polyvalent vaccine candidates have been designed and prepared that can be used to prevent different diseases at the same time by administering a single strain.

Ensayo para la producción de proteínas recombinantes por parte de cepas transformadas de Mhyo de acuerdo con el método de la invenciónAssay for the production of recombinant proteins by transformed strains of Mhyo according to the method of the invention

Para identificar la presencia de la proteína expresada por la secuencia exógena de ADN en las cepas mutantes de Mhyo de la invención, se puede emplear el método de ELISA.To identify the presence of the expressed protein by the exogenous DNA sequence in the Mhyo mutant strains of the invention, the ELISA method can be used.

En particular, para detectar la presencia de la proteína de la cápside de CVP2 y cuantificarla en las cepas de Mhyo obtenidas, se utilizó un kit comercial que permite detectar y estimar de forma aproximada la cantidad de dicho antígeno mediante inmunodetección en placa (ELISA).In particular, to detect the presence of the CVP2 capsid protein and quantify it in the Mhyo strains obtained, a commercial kit was used that allows the detection and approximate estimate of the amount of said antigen by plate immunodetection (ELISA).

Los extractos proteicos se obtuvieron después de concentrarlos en cultivos en fase exponencial de cada cepa y de lisar las células obtenidas.The protein extracts were obtained after concentrating them in exponential phase cultures of each strain and lysing the cells obtained.

Los resultados fueron positivos, lo que indicó que en todas las cepas y plásmidos ensayados se expresan las proteínas codificadas por ORF2 u ORF2v2 en mayor o menor cantidad (Figura 5B).The results were positive, indicating that in all the strains and plasmids tested, the proteins encoded by ORF2 or ORF2v2 are expressed in greater or lesser amounts (Figure 5B).

Las cepas con la versión procedente del plásmido pTC3C también se analizaron mediante electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida y transferencia tipo Western (Figura 5C). Se detectaron bandas del mismo peso molecular que la proteína de la cápside de CVP2.Strains with the version derived from the pTC3C plasmid were also analyzed by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis and Western blotting (Figure 5C). Bands of the same molecular weight as the CVP2 capsid protein were detected.

Se puede observar que en los geles de electroforesis no aparecieron bandas de degradación proteolítica, un problema que surge de forma habitual en la expresión recombinante de proteínas. It can be seen that no proteolytic degradation bands appeared in the electrophoresis gels, a problem that commonly arises in recombinant protein expression.

A tal fin, la proteína de la cápside de CVP2 expresada de forma recombinante en Mhyo puede ser un buen antígeno para la formulación de una vacuna polivalente. Así mismo, Mhyo resulta ser un buen hospedador para la producción recombinante de proteínas.To this end, the CVP2 capsid protein expressed recombinantly in Mhyo may be a good antigen for the formulation of a polyvalent vaccine. Likewise, Mhyo turns out to be a good host for the recombinant production of proteins.

Ensayos de vacunaciónVaccination trials

Se probó la eficacia de las vacunas que contenían cepas mutantes de Mhyo divulgadas en el presente documento, donde dichas cepas comprendían la secuencia exógena de ADN que codifica la proteína de la cápside de CVP2 en el genoma de la bacteria, y expresaban dicha proteína en el citosol de la bacteria.Vaccines containing mutant strains of Mhyo disclosed herein were tested for efficacy, where said strains comprised the exogenous DNA sequence encoding the CVP2 capsid protein in the genome of the bacterium, and expressed said protein in the bacterium. cytosol of the bacterium.

A tal fin, se probaron vacunas que contenían las cepas 6314Cc1 o 232Cc6, y los animales se vacunaron con una única dosis o se revacunaron con una segunda dosis, como se describe en la sección Ejemplos.To this end, vaccines containing the 6314Cc1 or 232Cc6 strains were tested, and the animals were vaccinated with a single dose or boosted with a second dose, as described in the Examples section.

Adicionalmente, se incorporaron al estudio dos grupos de animales: un grupo no vacunado e infectado (grupo 5), y un grupo no vacunado y no infectado (grupo 6).Additionally, two groups of animals were incorporated into the study: a non-vaccinated and infected group (group 5), and a non-vaccinated and non-infected group (group 6).

Las respuestas que se valoraron fueron: la respuesta inmunológica frente a Mhyo, la respuesta inmunológica frente a CVP2 y la carga de ADN vírico de CVP2 en el suero de los animales.The responses that were assessed were: the immune response against Mhyo, the immune response against CVP2 and the CVP2 viral DNA load in the serum of the animals.

Al observar los resultados de los ensayos de vacunación realizados con las vacunas que comprenden cepas mutantes de Mhyo obtenidas de acuerdo con el método mostrados en las Figuras, 6, 7 y 8, se puede concluir que las cepas de Mhyo transformadas que expresan la proteína de la cápside de CVP2, generan una respuesta inmunológica significativa frente a Mhyo y, sorprendentemente, también frente a CVP2, reduciendo significativamente la carga vírica de CVP2 de modo que se pueden emplear en vacunas frente a infecciones provocadas por Mhyo y por CVP2 al mismo tiempo.Observing the results of the vaccination trials carried out with the vaccines comprising Mhyo mutant strains obtained according to the method shown in Figures 6, 7 and 8, it can be concluded that the transformed Mhyo strains expressing the Mhyo protein the CVP2 capsid, generate a significant immune response against Mhyo and, surprisingly, also against CVP2, significantly reducing the viral load of CVP2 so that they can be used in vaccines against infections caused by Mhyo and CVP2 at the same time.

También se probó una vacuna que contiene una cepa mutante de Mhyo divulgada en el presente documento, frente a una infección por CVP2 y Mhyo, donde tal cepa comprendía la secuencia exógena de ADN que codifica la proteína de la cápside de CVP2 en el genoma de la bacteria y expresaba tal proteína en el citosol de la bacteria.A vaccine containing a Mhyo mutant strain disclosed herein was also tested against CVP2 and Mhyo infection, where such strain comprised the exogenous DNA sequence encoding the CVP2 capsid protein in the genome of the bacteria and expressed such a protein in the cytosol of the bacteria.

Se probó una vacuna que contenía la cepa 6314Cc1, los animales se vacunaron con una única dosis y se expusieron a un aislado de CVP2 y a una cepa patogénica de Mhyo, como se describe en los Ejemplos.A vaccine containing the 6314Cc1 strain was tested, animals were vaccinated with a single dose and challenged with a CVP2 isolate and a pathogenic Mhyo strain, as described in the Examples.

Adicionalmente, se incorporaron al estudio dos grupos de animales: un grupo no vacunado e infectado (grupo 2), y un grupo no vacunado y no infectado (grupo 3).Additionally, two groups of animals were incorporated into the study: a non-vaccinated and infected group (group 2), and a non-vaccinated and non-infected group (group 3).

Las respuestas que se valoraron fueron: la respuesta inmunológica frente a Mhyo, la respuesta inmunológica frente a CVP2, la carga de ADN vírico de CVP2 en el suero de los animales y las lesiones compatibles con Mhyo en los pulmones de los animales.The responses that were assessed were: the immune response against Mhyo, the immune response against CVP2, the CVP2 viral DNA load in the serum of the animals and the lesions compatible with Mhyo in the lungs of the animals.

Se observó que la cepa de Mhyo modificada genéticamente de acuerdo con un método divulgado en el presente documento, que expresa la proteína de la cápside de CVP2, genera una reducción significativa de la carga de ADN vírico de CVP2 y de las lesiones compatibles con Mhyo en los pulmones de los animales en comparación con los animales no vacunados. Mhyo strain genetically modified according to a method disclosed herein, expressing CVP2 capsid protein, was found to generate a significant reduction in CVP2 viral DNA load and Mhyo -compatible lesions in the lungs of the animals compared to non-vaccinated animals.

También se probó una vacuna que contenía una cepa mutante de Mhyo obtenida de acuerdo con el método de la invención, donde dicha cepas comprendía un vector plasmídico replicativo que comprendía la secuencia exógena de ADN que codifica la proteína de la cápside de CVP2, y expresaba tal proteína en el citosol de la bacteria. Igualmente que en los ensayos anteriores, se observó que la cepa de Mhyo modificada genéticamente de acuerdo con el método de la invención mediante plásmidos replicativos, que expresa la proteína de la cápside de CVP2, genera una reducción significativa de la carga vírica de CVP2.A vaccine containing a mutant strain of Mhyo obtained according to the method of the invention was also tested, wherein said strains comprised a replicative plasmid vector comprising the exogenous DNA sequence encoding the CVP2 capsid protein, and expressed such protein in the cytosol of the bacterium. As in the previous tests, it was observed that the Mhyo strain genetically modified according to the method of the invention by means of replicative plasmids, which expresses the CVP2 capsid protein, generates a significant reduction in the CVP2 viral load.

Análisis del grado de atenuación de las cepas mutantesAnalysis of the degree of attenuation of the mutant strains

Los mutantes obtenidos divulgados en el presente documento incluían la cepa 232TC3hlyC, que contenía el plásmido pTC3 incorporado por transposición en la región del genoma que codifica un factor de virulencia de Mhyo: la hemolisina C, codificada por el gen hlyC. The obtained mutants disclosed herein included strain 232TC3hlyC, which contained the plasmid pTC3 transposed into the region of the genome encoding a Mhyo virulence factor: hemolysin C, encoded by the hlyC gene.

Para valorar el grado de atenuación de dicha cepa, se seleccionaron cerdos de 8 semanas de edad y se distribuyeron en dos grupos de 8 animales por grupo. El primer grupo se infectó por vía intratraqueal con una dosis de la cepa 232TC3hlyC y el segundo grupo con una dosis de la cepa de tipo silvestre de Mhyo antes de ser modificada, la cepa 232 de Mhyo. To assess the degree of attenuation of said strain, 8-week-old pigs were selected and divided into two groups of 8 animals per group. The first group was infected intratracheally with one dose of the 232TC3hlyC strain and the second group with one dose of the Mhyo wild-type strain before being modified, the Mhyo 232 strain.

A los 28 días de la infección, los animales se sacrificaron y se observó que en la zona nasal no se había producido colonización en ninguno de los dos grupos de animales, mientras que el 25 % de los animales del grupo infectado con la cepa de tipo silvestre presentaba colonización en los bronquios. 28 days after the infection, the animals were sacrificed and it was observed that no colonization had occurred in the nasal area in either of the two groups of animals, while 25% of the animals in the group infected with the type strain Wild colonized in the bronchi.

Ninguno de los animales infectados con la cepa de Mhyo transformada presentó colonización en los bronquios. Por lo tanto, la cepa de Mhyo transformada 232TC3hlyC presenta una atenuación con relación a la cepa parental de tipo silvestre, y como tal puede utilizarse como una candidata vacunal en una vacuna viva atenuada.None of the animals infected with the transformed Mhyo strain presented colonization in the bronchi. Therefore, the transformed Mhyo strain 232TC3hlyC is attenuated relative to the wild-type parent strain, and as such can be used as a vaccine candidate in a live attenuated vaccine.

Mediante el método de la invención se obtuvo la cepa mutante de Mhyo 6314POGAc4. Dicha cepa mutante inhibe la expresión del gen de la hemolisina 159 de Mhyo, ya que la secuencia exógena de ADN incorporada mediante un plásmido replicativo (pOGA159) produjo un ARN antisentido correspondiente a un gen que codifica una hemolisina de Mhyo. Cuando los animales se infectaron con esta cepa, se observó que presentaba una atenuación con respecto a la cepa parental de tipo silvestre. Dicha cepa mutante se caracterizaba por una capacidad reducida para colonizar las vías respiratorias altas y bajas, así como por una capacidad reducida para provocar lesiones características de NEP.By means of the method of the invention, the mutant strain of Mhyo 6314POGAc4 was obtained. Said mutant strain inhibits the expression of the Mhyo hemolysin 159 gene, since the exogenous DNA sequence incorporated via a replicative plasmid (pOGA159) produced an antisense RNA corresponding to a gene encoding a Mhyo hemolysin. When animals were infected with this strain, it was found to be attenuated relative to the wild-type parent strain. Said mutant strain was characterized by a reduced ability to colonize the upper and lower respiratory tract, as well as a reduced ability to cause lesions characteristic of PEN.

Los siguientes Ejemplos 1, 2, 4.6 a 4.8, 5 y 8.2 se exponen para proporcionar al experto en la materia una explicación suficientemente clara y completa de la presente invención, pero no deben ser considerados como limitantes de los aspectos esenciales del objeto de la misma expuestos en las secciones anteriores de la presente descripción.The following Examples 1, 2, 4.6 to 4.8, 5 and 8.2 are presented to provide the person skilled in the art with a sufficiently clear and complete explanation of the present invention, but they should not be considered as limiting the essential aspects of the object thereof. set forth in the preceding sections of this description.

Ejemplosexamples

Las técnicas y métodos de ADN recombinante aplicados a continuación están descritos detalladamente en los manuales de Sambrook y Russell, Molecular Cloning 3a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Nueva York (2001) y de Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1998).The recombinant DNA techniques and methods applied below are described in detail in the manuals by Sambrook and Russell, Molecular Cloning 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York (2001) and by Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1998).

La cepa de E. coli XL1-blue (Stratagene) se ha utilizado como hospedadora de los vectores basados en los plásmidos pMTn4001 o pBluescript II SK.The E. coli strain XL1-blue (Stratagene) has been used as a host for vectors based on the pMTn4001 or pBluescript II SK plasmids.

Todas las secuencias de ADN descritas en las construcciones de los plásmidos que se describen en esta sección provienen de la secuencia depositada con número AE017243 en la base de datos GenBank, siempre que no se indique lo contrario. Esta secuencia genómica corresponde a la de la cepa J de Mhyo descrita por Vasconcelos et al., J. Bacteriol., 2005, 187(16), 5568-5577.All the DNA sequences described in the plasmid constructions described in this section come from the sequence deposited with number AE017243 in the GenBank database, unless otherwise indicated. This genomic sequence corresponds to that of the Mhyo J strain described by Vasconcelos et al., J. Bacteriol., 2005, 187(16), 5568-5577.

Todas las secuencias oligonucleotídicas descritas a continuación están escritas en sentido 5' a 3' a menos que se indique lo contrario. En todas las reacciones de PCR se utilizó la termopolimerasa Phusion (Finnzymes), que tiene actividad de corrección de errores.All oligonucleotide sequences described below are written in the 5' to 3' sense unless otherwise indicated. Phusion thermopolymerase (Finnzymes), which has error-correcting activity, was used in all PCR reactions.

Las secuencias oligonucleotídicas que aparecen subrayadas indican la presencia de un sitio para enzima de restricción que se especifica en el nombre de cada una de las secuencias.Oligonucleotide sequences that appear underlined indicate the presence of a restriction enzyme site that is specified in the name of each of the sequences.

Ejemplo 1.- Elección de una cepa de Mhyo Example 1.- Choice of a Mhyo strain

Las cepas de tipo silvestre de Mhyo utilizadas han sido la 6314, que corresponde a un aislado virulento de Mhyo de Laboratorios Hipra S.A. (Amer-Girona-España) y la 232 procedente de lowa State University (Ames-Iowa-EE.UU.). Ejemplo 2.- Construcción de plásmidos replicativosThe wild-type strains of Mhyo used have been 6314, which corresponds to a virulent isolate of Mhyo from Laboratorios Hipra SA (Amer-Girona-Spain) and 232 from Iowa State University (Ames-Iowa-USA). . Example 2.- Construction of replicative plasmids

Ejemplo 2.1.- Construcción del plásmido replicativo pOGExample 2.1.- Construction of the replicative plasmid pOG

Para obtener un plásmido replicativo en Mhyo se introdujo en un plásmido pBluescript II SK la región oriC de Mhyo amplificada mediante PCR. Para esta amplificación se utilizaron los oligonucleótidos 5OriCNotI (ATG CGC g Gc CGC TTA TTT ATC AGA AAC AGT TAG) (SEQ ID NO: 9) y 3OriCXbaI (AGT CGG GCC CAG CTT GCG CAT CAT TGG ATG ATG GAT TC) (SEQ ID NO: 10) y como molde se usó ADN genómico de la cepa J de Mhyo. El fragmento de 1,96 kb obtenido se digirió posteriormente con las enzimas de restricción NotI y XbaI. Por otra parte, se amplificó por PCR el gen de resistencia a gentamicina (aac(6’)-aph(2") mediante los oligonucleótidos 5GmORF (ACT GGG ATC CAT GAA TAT AGT TGA AA ATG) (SEQ ID NO: 11) y 3GmApa (GGA TGG GCC CAG CTT GCG CAT CAT TGG) (SEQ ID NO: 12), y usando el plásmido pIV-T como molde. El producto de PCR de 1,8 kb se digirió posteriormente con las enzimas de restricción correspondientes. La región promotora del gen de la proteína P97 se amplificó por PCR mediante los oligonucleótidos 5'p97XbaI (G ATC TCT AGA TCG AGG AAG ACT GAT TAG AAA TTT AGA ACT) (SEQ ID NO: 13) y 3'p97BamHI (GAT CGG ATC CAC TCA TAT TTT AAA CCT CAA TTA T) (SEQ ID NO: 14) usando ADN de la cepa J de Mhyo como molde. El producto de PCR (266 pb) se digirió posteriormente con las enzimas de restricción correspondientes. Finalmente, los tres fragmentos obtenidos se ligaron en el plásmido pBluescript II SK previamente digerido con las enzimas de restricción XbaI y BamHI, y la mezcla de ligación se transformó en células de Escherichia coli XL1-blue. Entre las colonias resultantes de la transformación se identificaron las portadoras de la construcción deseada mediante análisis de patrones de restricción y secuenciación. To obtain a replicative plasmid in Mhyo , the PCR-amplified Mhyo oriC region was introduced into a pBluescript II SK plasmid. For this amplification, the oligonucleotides 5OriCNotI (ATG CGC g Gc CGC TTA TTT ATC AGA AAC AGT TAG) (SEQ ID NO: 9) and 3OriCXbaI (AGT CGG GCC CAG CTT GCG CAT CAT TGG ATG ATG GAT TC) (SEQ ID NO) were used. : 10) and genomic DNA of Mhyo strain J was used as a template. The 1.96 kb fragment obtained was subsequently digested with the restriction enzymes NotI and XbaI. On the other hand, the gentamicin resistance gene ( aac ( 6')-aph ( 2") was amplified by PCR using the oligonucleotides 5GmORF (ACT GGG ATC CAT GAA TAT AGT TGA AA ATG) (SEQ ID NO: 11) and 3GmApa (GGA TGG GCC CAG CTT GCG CAT CAT TGG) (SEQ ID NO: 12), and using the plasmid pIV-T as template.The 1.8 kb PCR product was subsequently digested with the corresponding restriction enzymes. The promoter region of the P97 protein gene was amplified by PCR using the oligonucleotides 5'p97XbaI (G ATC TCT AGA TCG AGG AAG ACT GAT TAG AAA TTT AGA ACT) (SEQ ID NO: 13) and 3'p97BamHI (GAT CGG ATC CAC TCA TAT TTT AAA CCT CAA TTA T) (SEQ ID NO: 14) using Mhyo strain J DNA as a template. The PCR product (266 bp) was subsequently digested with the corresponding restriction enzymes. Finally, the three fragments obtained were ligated into the pBluescript II SK plasmid previously digested with the restriction enzymes XbaI and BamHI, and the ligation mixture was transformed into Escherichia coli XL1-blue cells. Among the colonies resulting from the transformation, carriers of the desired construct were identified by restriction pattern analysis and sequencing.

Se seleccionó uno de los clones positivos para las etapas posteriores y se lo nombró pOG (Figura 1).One of the positive clones was selected for the subsequent steps and named pOG (Figure 1).

Ejemplo 2.2.- Construcción del plásmido replicativo pOGCREExample 2.2.- Construction of the replicative plasmid pOGCRE

El plásmido replicativo pOGCRE se obtuvo digiriendo el plásmido pOG con las enzimas de restricción BamHI y ApaI, y recuperando un fragmento de 5,1 kb. Por otra parte, el gen de resistencia a gentamicina (aac(6')-aph(2") se amplificó mediante PCR a partir del plásmido pIV-T utilizando los oligonucleótidos 5GmORF y 3GmORFSpeI (ACT GAC TAG TAG CTT GCG CAT Ca T TGG) (SEQ ID NO: 15) obteniéndose un fragmento de 1,8 kb que se digirió posteriormente con las enzimas de restricción BamHI y SpeI. El gen correspondiente a la recombinasa Cre se amplificó mediante PCR utilizando como molde el plásmido pSH62 (Euroscarf) y los oligonucleótidos 5CreBglII (ATG CAG ATC TAT GTC CAA TTT ACT GAC CGT ACA CCA AAA TTT G) (SEQ ID NO: 16) y 3CreApaI (ATG CGG GCC CTTA ATC GCC ATC TTC CAG CAG GCG CAC) (SEQ ID NO: 17). El producto de PCR (1,0 kb) se escindió con las enzimas BglII y ApaI. Por último, el plásmido pOG se digirió nuevamente, esta vez con las enzimas de restricción BamHI y XbaI, y se recuperó una banda de 266 pb correspondiente al promotor del gen de la proteína P97. Los cuatro fragmentos obtenidos se ligaron mediante T4 ADN ligasa y la reacción de ligación se transformó en células de E. coli XL1-blue. Entre las colonias resultantes de la transformación se identificaron las portadoras de la construcción deseada mediante análisis de patrones de restricción. Se seleccionó uno de los clones positivos para las etapas posteriores y se los nombró pOGCRE (Figura 1).The replicative plasmid pOGCRE was obtained by digesting plasmid pOG with the restriction enzymes BamHI and ApaI, and recovering a 5.1 kb fragment. On the other hand, the gentamicin resistance gene ( aac ( 6')-aph ( 2") was amplified by PCR from the pIV-T plasmid using the oligonucleotides 5GmORF and 3GmORFSpeI (ACT GAC TAG TAG CTT GCG CAT C to T TGG) (SEQ ID NO: 15) obtaining a 1.8 kb fragment that was subsequently digested with the restriction enzymes BamHI and Spe I. The gene corresponding to the Cre recombinase was amplified by PCR using the plasmid pSH62 (Euroscarf) as a template. and the oligonucleotides 5CreBglII (ATG CAG ATC TAT GTC CAA TTT ACT GAC CGT ACA CCA AAA TTT G) (SEQ ID NO: 16) and 3CreApaI (ATG CGG GCC CTTA ATC GCC ATC TTC CAG CAG GCG CAC) (SEQ ID NO: 17 The PCR product (1.0 kb) was cleaved with the enzymes BglII and ApaI Finally, the pOG plasmid was digested again, this time with the restriction enzymes BamHI and XbaI, and a band of 266 bp was recovered. corresponding to the promoter of the P97 protein gene.The four fragments obtained were ligated by T4 DNA ligase and the ligation reaction was transformed into E. coli XL1-blue cells. Among the colonies resulting from the transformation, carriers of the desired construct were identified by restriction pattern analysis. One of the positive clones was selected for the subsequent steps and named pOGCRE (Figure 1).

Ejemplo 2.3.- Construcción del plásmido replicativo pOGCExample 2.3.- Construction of the replicative plasmid pOGC

Para obtener el plásmido pOGC, el plásmido pBluescript II SK se digirió con la enzima NotI y una vez purificado se desfosforiló con la enzima fosfatasa alcalina. En paralelo, se obtuvo un fragmento de 992 pb por digestión del gen sintético ORF2v2 (SEQ ID NO: 5) con las enzimas de restricción SpeI y NotI. Utilizando como molde el plásmido pOGCRE se amplificó un segmento de ADN con los oligonucleótidos 3gmORFSpeI y 5OriCNotI mediante PCR, y una vez purificados se digirió el producto de PCR con las enzimas SpeI y NotI. Los tres fragmentos obtenidos se ligaron mediante T4 ADN ligasa y la reacción de ligación se transformó en células de E. coli XL1-blue. Los clones positivos se identificaron mediante mapeo de restricción y secuenciación (Figura 2).To obtain the pOGC plasmid, the pBluescript II SK plasmid was digested with the NotI enzyme and once purified, it was dephosphorylated with the alkaline phosphatase enzyme. In parallel, a 992 bp fragment was obtained by digestion of the synthetic ORF2v2 gene (SEQ ID NO: 5) with the restriction enzymes SpeI and NotI. Using the plasmid pOGCRE as a template, a segment of DNA was amplified with the oligonucleotides 3gmORFSpeI and 5OriCNotI by PCR, and once purified, the PCR product was digested with the enzymes SpeI and NotI. The three obtained fragments were ligated by T4 DNA ligase and the ligation reaction was transformed into E. coli XL1-blue cells. Positive clones were identified by restriction mapping and sequencing (Figure 2).

Ejemplo 2.4.- Construcción del plásmido replicativo pOGLExample 2.4.- Construction of the replicative plasmid pOGL

Para obtener el plásmido pOGL, el plásmido pOGC se digirió con las enzimas NotI y SpeI y se recuperaron las bandas de 2,8 kb y de 4 kb. El fragmento de a Dn correspondiente a la banda de 2,8 kb se desfosforiló con fosfatasa alcalina. En paralelo, se obtuvo un fragmento de 2,25 kb por digestión del plásmido pTC3L (véase el Ejemplo 3.4) con las enzimas de restricción SpeI y NotI. Los tres fragmentos obtenidos se ligaron mediante T4 ADN ligasa y la reacción de ligación se transformó en células de E. coli XL1-blue. Los clones positivos se identificaron mediante mapeo de restricción y secuenciación (Figura 2).To obtain plasmid pOGL, plasmid pOGC was digested with NotI and SpeI enzymes and the 2.8 kb and 4 kb bands were recovered. The aDn fragment corresponding to the 2.8 kb band was dephosphorylated with alkaline phosphatase. In parallel, a 2.25 kb fragment was obtained by digestion of the plasmid pTC3L (see Example 3.4) with the restriction enzymes SpeI and NotI. The three obtained fragments were ligated by T4 DNA ligase and the ligation reaction was transformed into E. coli XL1-blue cells. Positive clones were identified by restriction mapping and sequencing (Figure 2).

Ejemplo 2.5.- Construcción del plásmido replicativo pOGTExample 2.5.- Construction of the replicative plasmid pOGT

Para obtener el plásmido pOGT, el plásmido pOGC se digirió con las enzimas NotI y SpeI y se recuperaron las bandas de 2,8 kb y de 4 kb. El fragmento de ADN correspondiente a la banda de 2,8 kb se desfosforiló con fosfatasa alcalina. En paralelo, se obtuvo un fragmento de 2,23 kb de la digestión del plásmido pTC3T (véase el Ejemplo 3.5) con las enzimas de restricción SpeI y NotI. Los tres fragmentos obtenidos se ligaron mediante T4 ADN ligasa y la reacción de ligación se transformó en células de E. coli XL1-blue. Los clones positivos se identificaron mediante mapeo de restricción y secuenciación (Figura 2).To obtain plasmid pOGT, plasmid pOGC was digested with NotI and SpeI enzymes and the 2.8 kb and 4 kb bands were recovered. The DNA fragment corresponding to the 2.8 kb band was dephosphorylated with alkaline phosphatase. In parallel, a 2.23 kb fragment was obtained from the digestion of plasmid pTC3T (see Example 3.5) with the restriction enzymes SpeI and NotI. The three obtained fragments were ligated by T4 DNA ligase and the ligation reaction was transformed into E. coli XL1-blue cells. Positive clones were identified by restriction mapping and sequencing (Figure 2).

Ejemplo 2.6.- Construcción del plásmido replicativo pOGA159Example 2.6.- Construction of the replicative plasmid pOGA159

El plásmido replicativo pOGA159 se construyó en dos etapas de clonación consecutivas. Mediante una reacción de PCR con los oligonucleótidos 5'p97ApaI y 3TetMClaI (TGT TAT CGA TACC GTC GAT GCA CCT CGA GCT AAG TTA TTT TAT TG) (SEQ ID NO: 18) y utilizando como molde el plásmido pMTn4001, se amplificó un fragmento de 2,2 kb correspondiente al promotor del gen de la proteína P97. Este producto de PCR se digirió con las enzimas de restricción ClaI y ApaI. Por otro lado, y utilizando como molde el plásmido pOG, se amplificó un fragmento de 1,9 kb con los oligonucleótidos 5OriCClaI (AGA CAT CGA AAG CTT GAT TAT GCT GAT TGC ATT CTT TCA ATT TG) (SEQ ID NO: 19) y 5OriCEcoRI (AGA GGA AT CC GAT TTA TTT ATC AGA AAC AGT TAG TCT TTT CC) (SEQ ID NO: 20) correspondiente al oriC de Mhyo. Este producto de PCR se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y ClaI. Posteriormente se amplificó mediante PCR un fragmento de 316 pb correspondiente al promotor del gen de la proteína P97, con los oligonucleótidos 5XbaIpp97 (AGA CTC TAG Aa C TAG tGg ATC CCC CGG GCC CCT CGA GGA AGA CTG ATT AGA AAT TTA G) (SEQ ID NO: 21) y 3EcoRIpp97 (AGA CGA ATT CGA ATT CCT GCA GGG ATC CAC TCA TAT TTT AAA CCT C) (SEQ ID NO: 22). Una vez purificado, este fragmento se digirió con las enzimas EcoRI y BamHI. La última etapa de este primer procedimiento de clonación consistió en digerir el plásmido pBluescript II SK con las enzimas de restricción XbaI y ApaI. Estos 4 fragmentos de ADN se ligaron mediante T4 ADN ligasa y la reacción de ligación se transformó en células de E. coli XL1-blue. Entre las colonias resultantes de la transformación se identificaron las colonias portadoras de la construcción deseada mediante análisis de patrones de restricción. El nuevo plásmido así obtenido se digirió con la enzima de restricción EcoRI. Por último se amplificó por PCR el ADN diseñado para el silenciamiento, con los oligonucleótidos 5ahlycEcoRI (CAT CGA ATT CAC GAA TTA GTG ATT CTG CCT TTT C) (SEQ ID NO: 23) y 3ahlycEcoRI (CAT CGA ATT CAT TAA AGT TGA TTC GGT GTT TAA TC) (SEQ ID NO: 24). Una vez digerido con la enzima de restricción EcoRI y desfosforilado mediante fosfatasa alcalina, los fragmentos de ADN obtenidos se ligaron mediante T4 ADN ligasa y la reacción de ligación se transformó en células de E. coli XL1-blue. Entre las colonias resultantes de la transformación se identificaron las colonias portadoras de la construcción deseada mediante secuenciación (Figura 1).The replicative plasmid pOGA159 was constructed in two consecutive cloning steps. By means of a PCR reaction with the oligonucleotides 5'p97ApaI and 3TetMClaI (TGT TAT CGA TACC GTC GAT GCA CCT CGA GCT AAG TTA TTT TAT TG) (SEQ ID NO: 18) and using the plasmid pMTn4001 as template, a fragment of 2.2 kb corresponding to the promoter of the P97 protein gene. This PCR product was digested with the restriction enzymes ClaI and ApaI. On the other hand, and using the pOG plasmid as a template, a 1.9 kb fragment was amplified with the oligonucleotides 5OriCClaI (AGA CAT CGA AAG CTT GAT TAT GCT GAT TGC ATT CTT TCA ATT TG) (SEQ ID NO: 19) and 5OriCEcoRI (AGA GGA AT CC GAT TTA TTT ATC AGA AAC AGT TAG TCT TTT CC) (SEQ ID NO: 20) corresponding to the oriC of Mhyo. This PCR product was digested with the restriction enzymes EcoRI and ClaI. Subsequently, a 316 bp fragment corresponding to the promoter of the P97 protein gene was amplified by PCR, with the oligonucleotides 5XbaIpp97 (AGA CTC TAG A a C TAG t G g ATC CCC CGG GCC CCT CGA GGA AGA CTG ATT AGA AAT TTA G) (SEQ ID NO: 21) and 3EcoRIpp97 (AGA CGA ATT CGA ATT CCT GCA GGG ATC CAC TCA TAT TTT AAA CCT C) (SEQ ID NO: 22). Once purified, this fragment was digested with EcoRI and BamHI enzymes. The last stage of this first cloning procedure consisted in digesting the plasmid pBluescript II SK with the restriction enzymes XbaI and ApaI. These 4 DNA fragments were ligated by T4 DNA ligase and the ligation reaction was transformed into E. coli XL1-blue cells. Among the colonies resulting from the transformation, colonies carrying the desired construct were identified by restriction pattern analysis. The new plasmid thus obtained was digested with the restriction enzyme EcoRI. By Finally, the DNA designed for silencing was amplified by PCR, with the oligonucleotides 5ahlycEcoRI (CAT CGA ATT CAC GAA TTA GTG ATT CTG CCT TTT C) (SEQ ID NO: 23) and 3ahlycEcoRI (CAT CGA ATT CAT TAA AGT TGA TTC GGT GTT TAA TC) (SEQ ID NO: 24). Once digested with the restriction enzyme EcoRI and dephosphorylated by alkaline phosphatase, the obtained DNA fragments were ligated by T4 DNA ligase and the ligation reaction was transformed into E. coli XL1-blue cells. Among the colonies resulting from the transformation, the colonies carrying the desired construct were identified by sequencing (Figure 1).

Ejemplo 3.- Construcción de plásmidos para la transformación por transposiciónExample 3.- Construction of plasmids for transformation by shuffling

Ejemplo 3.1.- Construcción del plásmido pTC3 para la transformación por transposición (no es parte de la invención)Example 3.1.- Construction of the plasmid pTC3 for transformation by rearrangement (not part of the invention)

El plásmido pMTn4001 (Pich et al., Microbiology 152:519-527 (2006)) se amplificó por PCR con los oligonucleótidos 5pMTn4001PstI (CAT GCT GCA GCC CGG GGG ATC CAC TAG TTC TAG AG) (SEQ ID NO: 25) y 3pMTn4001 (GTA CCC AAT TCG CCC TAT AGT GAG TCG) (SEQ ID NO: 26). El oligonucleótido 3pMTn4001 se fosforiló en su extremo 5'. El producto de esta reacción de PCR (2,98 kb) se digirió con la enzima de restricción PstI. Por otra parte, el promotor del gen de la proteína P97 se amplifico mediante PCR con los oligonucleótidos 5'p97 (TCG AGG AAG ACT GAT TAG AAA TTT AGA ACT) (SEQ ID NO: 27) y 3'p97BamHI utilizando como molde ADN de la cepa J de Mhyo. Este producto de PCR (280 pb) se digirió con la enzima de restricción BamHI y se desfosforiló con fosfatasa alcalina. El mismo promotor también se amplificó mediante una segunda pareja de oligonucleótidos: 5'p97ApaI (GAT CGG GCC CTC GAG GAA GAC TGA TTA GAA ATT TAG AAC T) (SEQ ID NO: 28) y 3'p97BamHI, y digirió con las enzimas de restricción Apal y BamHI. El gen de la transposasa se amplificó mediante PCR utilizando como molde el plásmido pMTn4001 y los oligonucleótidos 5'TnpBamHI (GAT CGG At C CAT GAC CCA AGT ACA TTT TAC ACT GAA AAG) (SEQ ID NO: 29) y 3'TnpApaI (GAT CCT CGA GGG GGG GCC CTT TTA CAC AAT TAT ACG GAC) (SEQ ID NO: 30). La banda de 978 pb obtenida se digirió posteriormente con las enzimas de restricción BamHI y Apal. Por último, el fragmento correspondiente a la resistencia a tetraciclina tetM se amplificó a partir del plásmido pMTnTetM438 (Pich et al., Microbiology 152:519-527 (2006)) utilizando los oligonucleótidos 5'TetMBamHI (GAT CGG ATC CAT GAA AAT TAT TAA TAT TGG AGT T) (SEQ ID NO: 31) y 3' TetMPstI (GAT CGC TGC AGG AAT TCG ATA TCA AGC TTA TCG ATA CCG TCG ATG CAC CT) (SEQ ID NO: 32). El fragmento de 1,9 kb obtenido se digirió con las enzimas de restricción Sall y BamHI y se desfosforiló con fosfatasa alcalina. Los cinco fragmentos resultantes se ligaron mediante T4 ADN ligasa y la reacción de ligación se transformó en células de E. coli XL1-blue. Entre las colonias resultantes de la transformación se identificaron las colonias portadoras de la construcción deseada mediante análisis de patrones de restricción y secuenciación. Se seleccionó uno de los clones positivos para las etapas posteriores y se lo nombró pTC3 (Figura 3).Plasmid pMTn4001 (Pich et al., Microbiology 152:519-527 (2006)) was amplified by PCR with the oligonucleotides 5pMTn4001PstI (CAT GCT GCA GCC CGG GGG ATC CAC TAG TTC TAG AG) (SEQ ID NO: 25) and 3pMTn4001 (GTA CCC AAT TCG CCC TAT AGT GAG TCG) (SEQ ID NO: 26). Oligonucleotide 3pMTn4001 was phosphorylated at its 5' end. The product of this PCR reaction (2.98 kb) was digested with the restriction enzyme PstI. On the other hand, the promoter of the P97 protein gene was amplified by PCR with the oligonucleotides 5'p97 (TCG AGG AAG ACT GAT TAG AAA TTT AGA ACT) (SEQ ID NO: 27) and 3'p97BamHI using DNA from Mhyo strain J. This PCR product (280 bp) was digested with the restriction enzyme BamHI and dephosphorylated with alkaline phosphatase. The same promoter was also amplified by a second pair of oligonucleotides: 5'p97ApaI (GAT CGG GCC CTC GAG GAA GAC TGA TTA GAA ATT TAG AAC T) (SEQ ID NO: 28) and 3'p97BamHI, and digested with the enzymes of Apal and BamHI restriction. The transposase gene was amplified by PCR using the plasmid pMTn4001 as a template and the oligonucleotides 5'TnpBamHI (GAT CGG A t C CAT GAC CCA AGT ACA TTT TAC ACT GAA AAG) (SEQ ID NO: 29) and 3'TnpApaI ( GAT CCT CGA GGG GGG GCC CTT TTA CAC AAT TAT ACG GAC) (SEQ ID NO: 30). The 978 bp band obtained was subsequently digested with the restriction enzymes BamHI and Apal. Finally, the fragment corresponding to tetracycline resistance tetM was amplified from the plasmid pMTnTetM438 (Pich et al., Microbiology 152:519-527 (2006)) using the oligonucleotides 5'TetMBamHI (GAT CGG ATC CAT GAA AAT TAT TAA TAT TGG AGT T) (SEQ ID NO: 31) and 3' TetMPstI (GAT CGC TGC AGG AAT TCG ATA TCA AGC TTA TCG ATA CCG TCG ATG CAC CT) (SEQ ID NO: 32). The obtained 1.9 kb fragment was digested with the restriction enzymes Sall and BamHI and dephosphorylated with alkaline phosphatase. The resulting five fragments were ligated by T4 DNA ligase and the ligation reaction was transformed into E. coli XL1-blue cells. Among the colonies resulting from the transformation, colonies carrying the desired construct were identified by restriction pattern analysis and sequencing. One of the positive clones was selected for the subsequent steps and named pTC3 (Figure 3).

Ejemplo 3.2.- Construcción del plásmido pTC366 para la transformación por transposición (no es parte de la invención)Example 3.2.- Construction of plasmid pTC366 for transformation by rearrangement (not part of the invention)

Este plásmido procede directamente de pTC3 por la inclusión de dos secuencias lox66 de 34 pb (ATA ACT TCG TAT AGC ATA CAT TAT ACG AAC GGT A) (s Eq ID NO: 33) flanqueando el gen de resistencia a tetraciclina. Para tal fin, la secuencia del gen TetMp97 de resistencia a tetraciclina del plásmido TC3 se amplificó por PCR con los oligonucleótidos 5loxp66Tetp97 (GAT TAA GGG CCC ATA ACT TCG TAT AGG ATA CTT TAT ACG AAG TTA TGT CGA CCC CCT CGA GGA AGA CTG) (SEQ ID NO: 34) y 3loxp66Tetp97 (GGG ACT AGT TAC GGT TCG TAT AAT GTA TGC TAT ACG AAG TTA TCT GCA GGA TAT CAA GCT TAT CGA TAC CGT CG) (SEQ ID NO: 35) obteniéndose un fragmento de PCR de 2,2 kb que se digirió con las enzimas de restricción ApaI y SpeI. En paralelo, el plásmido TC3 se digirió con las mismas enzimas de restricción y se recuperó la banda de 4,4 kb. Los dos fragmentos se ligaron utilizando T4 ADN ligasa y la mezcla de ligación se transformó en células de E. coli XL1-blue. Entre las colonias resultantes de la transformación se identificó por secuenciación un clon positivo que había incorporado la secuencias lox66 correctamente y que se denominó pTC366 (Figura 3).This plasmid is derived directly from pTC3 by the inclusion of two 34 bp lox66 sequences (ATA ACT TCG TAT AGC ATA CAT TAT ACG AAC GGT A) ( s E q ID NO: 33) flanking the tetracycline resistance gene. For this purpose, the sequence of the tetracycline resistance gene TetMp97 from plasmid TC3 was amplified by PCR with the oligonucleotides 5loxp66Tetp97 (GAT TAA GGG CCC ATA ACT TCG TAT AGG ATA CTT TAT ACG AAG TTA TGT CGA CCC CCT CGA GGA AGA CTG) ( SEQ ID NO: 34) and 3loxp66Tetp97 (GGG ACT AGT TAC GGT TCG TAT AAT GTA TGC TAT ACG AAG TTA TCT GCA GGA TAT CAA GCT TAT CGA TAC CGT CG) (SEQ ID NO: 35) obtaining a PCR fragment of 2, 2 kb that was digested with the restriction enzymes ApaI and SpeI. In parallel, the TC3 plasmid was digested with the same restriction enzymes and the 4.4 kb band was recovered. The two fragments were ligated using T4 DNA ligase and the ligation mixture was transformed into E. coli XL1-blue cells. Among the colonies resulting from the transformation, a positive clone that had correctly incorporated the lox66 sequences was identified by sequencing and was named pTC366 (Figure 3).

Ejemplo 3.3.- Construcción del plásmido pTC3C para la transformación por transposición (no es parte de la invención)Example 3.3.- Construction of the plasmid pTC3C for transformation by rearrangement (not part of the invention)

Para obtener el plásmido pTC3C, el plásmido pTC366 se digirió con las enzimas SpeI y WotI. En este plásmido se clonó un fragmento de 992 pb procedente de la digestión el gen sintético ORF2v2 (SEQ ID NO: 5) con las mismas enzimas de restricción. Los clones positivos se identificaron mediante mapeo de restricción (Figura 3).To obtain plasmid pTC3C, plasmid pTC366 was digested with SpeI and WotI enzymes. A 992 bp fragment from the digestion of the synthetic ORF2v2 gene (SEQ ID NO: 5) with the same restriction enzymes was cloned into this plasmid. Positive clones were identified by restriction mapping (Figure 3).

Ejemplo 3.4.- Construcción del plásmido pTC3L para la transformación por transposición (no es parte de la invención)Example 3.4.- Construction of the plasmid pTC3L for transformation by rearrangement (not part of the invention)

Mediante una reacción de PCR con los oligonucleótidos P46CtFdHindIII (GTG TAA GCT TAA AAA CCA GGA TGC ACA AAA TAA C) (SEQ ID NO: 36) y P46CtRv-NotI (TGT TGC GGC CGC TTT AGG CAT CAG GAT TAT CAA C) (SEQ ID NO: 37) y utilizando como molde ADN genómico de la cepa 232, se amplificó un fragmento de 1,0 kb correspondiente al extremo 3' del gen de la proteína P46. Este producto de PCR se digirió con las enzimas de restricción HindIII y WotI. Por otro lado, y utilizando como molde el mismo ADN genómico, se amplificó un fragmento de 276 pb con los oligonucleótidos P46NtFdSpeI (AGA CAC TAG TTT GAA TTT GTA TTT TCC ATA ATC) (SEQ ID NO: 38) y P46NtRvBamHI (AGA GGG ATC CTG TAA TTG TTG AAG TTG CTG CCT) (SEQ ID NO: 39). Este fragmento, que corresponde al promotor y al extremo 5' del gen de la proteína P46 se digirió posteriormente con las enzimas de restricción SpeI y BamHI. Por último, y utilizando como molde el plásmido pTC3C junto a los oligonucleótidos CircRv-NotI (TGT TGC GGC CGC TTA TGG TTC TAA TGG TGG ATC) (SEQ ID NO: 40) y Circ2Fd-BamHI (GTG TGG ATC CAT GAC ATA TCC AAG AAG AAG AT) (SEQ ID NO: 41) se amplificó el gen correspondiente a la proteína de la cápside de CVP2. Este fragmento de ADN de 712 pb se digirió a continuación con las enzimas de restricción NotI y BamHI. Todos los fragmentos obtenidos se clonaron en el plásmido pTC366 previamente digerido con las enzimas SpeI y NotI. Los clones positivos se identificaron mediante mapeo de restricción (Figura 3).By means of a PCR reaction with the oligonucleotides P46CtFdHindIII (GTG TAA GCT TAA AAA CCA GGA TGC ACA AAA TAA C) (SEQ ID NO: 36) and P46CtRv-NotI (TGT TGC GGC CGC TTT AGG CAT CAG GAT TAT CAA C) (SEQ ID NO: 37) and using strain 232 genomic DNA as a template, a 1.0 kb fragment corresponding to the 3' end of the P46 protein gene was amplified. This PCR product was digested with the restriction enzymes HindIII and WotI. On the other hand, and using the same genomic DNA as a template, a 276 bp fragment was amplified with the oligonucleotides P46NtFdSpeI (AGA CAC TAG TTT GAA TTT GTA TTT TCC ATA ATC) (SEQ ID NO: 38) and P46NtRvBamHI (AGA GGG ATC CTG TAA TTG TTG AAG TTG CTG CCT) (SEQ ID NO: 39). This The fragment, which corresponds to the promoter and the 5' end of the P46 protein gene, was subsequently digested with the restriction enzymes SpeI and BamHI. Finally, and using the plasmid pTC3C as template together with the oligonucleotides CircRv-NotI (TGT TGC GGC CGC TTA TGG TTC TAA TGG TGG ATC) (SEQ ID NO: 40) and Circ2Fd-BamHI (GTG TGG ATC CAT GAC ATA TCC AAG AAG AAG AT) (SEQ ID NO: 41) the gene corresponding to the CVP2 capsid protein was amplified. This 712 bp DNA fragment was then digested with the restriction enzymes NotI and BamHI. All the fragments obtained were cloned in the plasmid pTC366 previously digested with the enzymes SpeI and NotI. Positive clones were identified by restriction mapping (Figure 3).

Ejemplo 3.5.- Construcción del plásmido pTC3T para la transformación por transposición (no es parte de la invención)Example 3.5.- Construction of the plasmid pTC3T for transformation by rearrangement (not part of the invention)

En este ejemplo, se utilizaron los oligonucleótidos P46NtFdSpeI y P46CIRCRv (ATC TTC TTC TTG GAT ATG TCA TGG CAT CAG GAT TAT CAA CAT TA) (SEQ ID NO: 42) para la amplificación por PCR de la región promotora y el extremo 5' de la región codificante del gen de la proteína P46 a partir de ADN genómico de la cepa 232. La banda obtenida de 1,25 kb se escindió con la enzima de restricción SpeI. En paralelo se realizó una segunda reacción de PCR con los oligonucleótidos P46CIRCFd (TAA TGT TGA TAA TCC TGA TGC CAT GAC ATA TCC AAG AAG AAG AT) (SEQ ID NO: 43) y CircRv-NotI sobre pTC3C, obteniendo un fragmento de ADN de 732 pb. Mediante una reacción de PCR recombinante en la que se utilizaron como molde los fragmentos anteriores y los oligonucleótidos P46NtFdSpeI y CircRv-NotI, se obtuvo un fragmento de 2,2 kb. Este fragmento se digirió con las enzimas de restricción SpeI y NotI, y se ligó con el plásmido pTC366 previamente digerido con las enzimas SpeI y NotI. Los clones positivos se identificaron mediante mapeo de restricción y secuenciación (Figura 3)In this example, the oligonucleotides P46NtFdSpeI and P46CIRCRv (ATC TTC TTC TTG GAT ATG TCA TGG CAT CAG GAT TAT CAA CAT TA) (SEQ ID NO: 42) were used for PCR amplification of the promoter region and 5' end of the coding region of the P46 protein gene from strain 232 genomic DNA. The 1.25 kb band obtained was excised with the restriction enzyme SpeI. In parallel, a second PCR reaction was performed with the oligonucleotides P46CIRCFd (TAA TGT TGA TAA TCC TGA TGC CAT GAC ATA TCC AAG AAG AAG AT) (SEQ ID NO: 43) and CircRv-NotI on pTC3C, obtaining a DNA fragment of 732 bp. By means of a recombinant PCR reaction in which the previous fragments and the oligonucleotides P46NtFdSpeI and CircRv-NotI were used as a template, a 2.2 kb fragment was obtained. This fragment was digested with the restriction enzymes SpeI and NotI, and ligated with the plasmid pTC366 previously digested with the enzymes SpeI and NotI. Positive clones were identified by restriction mapping and sequencing (Figure 3)

Ejemplo 4.- Obtención de bacterias transformantesExample 4.- Obtaining transforming bacteria

Todos los productos y reactivos utilizados en este método se esterilizaron mediante autoclavado, filtración o irradiación. El material de partida fue un cultivo de Mhyo en fase de crecimiento exponencial. Esta fase de crecimiento se obtiene preferentemente utilizando una dilución 1/100 del inóculo y dejando crecer el cultivo durante unas 48-144 horas en medio FriisHS (suero de caballo irradiado al 20% (v/v), extracto de levadura al 2,4% (v/v), rojo de fenol al 0,1 % (v/v), "solución salina equilibrada de Hanks" al 0,4%, "infusión de caldo de corazón" al 0,058 % (p/v), PPLO 0,054 % (p/v) y ampicilina a una concentración final de 100 pg/ml). Una vez obtenidos unos 40 ml de cultivo de Mhyo en fase estacionaria se pipeteó 10 veces el contenido de los matraces de cultivo para separar las células y después se filtró el cultivo con un filtro de 0,45 pm para acabar de separar las mismas. Posteriormente, las células se centrifugaron durante 20 minutos a 20.000xg, se resuspendieron en tampón de electroporación (Sacarosa 272 mM, Hepes 200 mM pH 7,2) complementado con EDTA 1 mM y se incubaron en hielo durante 10 minutos. Pasados los 10 minutos de incubación con EDTA se repitió la centrifugación a 20.000xg durante 20 minutos y las células se resuspendieron en un volumen de entre 100 y 300 pl de tampón de electroporación. En una cubeta de electroporación de 0,2 cm se añadieron 20 pg de plásmido, previamente disuelto en tampón de electroporación a una concentración de entre 0,5 y 2 pg.ml'1 y la suspensión de células hasta un volumen final de 100 pl. En el momento de realizar la electroporación, las variables del electroporador se ajustaron a un voltaje de 2,5 kV, una resistencia entre 100 y 175 Q y capacitancia de 25 pF. Los valores típicos obtenidos de "constante de tiempo" fueron de entre 2,3 y 3 ms. Una vez emitido el pulso eléctrico se añadieron 900 pl de medio FriisFBS (exactamente la misma formulación que el medio FriisHS, pero sustituyendo el suero de caballo por suero bovino fetal) y 20 pg adicionales de plásmido. La suspensión resultante se incubó durante 20 minutos en hielo y posteriormente 3 horas a 37 °C y CO2 al 5 %. Después de 3 horas, la suspensión obtenida se distribuyó (unos 200 pl por placa) en placas de FriisHS complementado con agar de bajo punto de fusión al 0,7 % (p/v) y el antibiótico de selección deseado (tetraciclina 0,5 pg/ml y/o gentamicina 10 pg/ml).All products and reagents used in this method were sterilized by autoclaving, filtration, or irradiation. The starting material was a culture of Mhyo in exponential growth phase. This growth phase is preferably obtained using a 1/100 dilution of the inoculum and allowing the culture to grow for about 48-144 hours in FriisHS medium (20% (v/v) irradiated horse serum), 2.4% (v/v) yeast extract % (v/v), Phenol Red 0.1% (v/v), "Hanks Balanced Salt Solution" 0.4%, "Heart Broth Infusion" 0.058% (w/v), PPLO 0.054% (w/v) and ampicillin at a final concentration of 100 pg/ml). Once about 40 ml of Mhyo culture had been obtained in the stationary phase, the contents of the culture flasks were pipetted 10 times to separate the cells and then the culture was filtered through a 0.45 pm filter to finish separating them. Subsequently, the cells were centrifuged for 20 minutes at 20,000 xg, resuspended in electroporation buffer (272 mM Sucrose, 200 mM Hepes pH 7.2) supplemented with 1 mM EDTA and incubated on ice for 10 minutes. After 10 minutes of incubation with EDTA, centrifugation was repeated at 20,000xg for 20 minutes and the cells were resuspended in a volume of between 100 and 300 µl of electroporation buffer. In a 0.2 cm electroporation cuvette, 20 pg of plasmid were added, previously dissolved in electroporation buffer at a concentration between 0.5 and 2 pg.ml'1 and the cell suspension up to a final volume of 100 pl. . At the time of performing the electroporation, the electroporator variables were set to a voltage of 2.5 kV, a resistance between 100 and 175 Q, and a capacitance of 25 pF. Typical "time constant" values obtained were between 2.3 and 3 ms. After the electrical pulse was emitted, 900 µl of FriisFBS medium (exactly the same formulation as FriisHS medium, but substituting fetal bovine serum for horse serum) and an additional 20 µg of plasmid were added. The resulting suspension was incubated for 20 minutes on ice and later for 3 hours at 37 °C and 5% CO 2 . After 3 hours, the obtained suspension was distributed (about 200 µl per plate) on FriisHS plates supplemented with 0.7% (w/v) low melting point agar and the desired selection antibiotic (0.5 tetracycline pg/ml and/or gentamicin 10 pg/ml).

Al cabo de 2 o 3 semanas de incubación a 37 °C y CO2 al 5 % se recuperaron las colonias transformantes en las placas de Friis HS y se inocularon en matraces de 50 ml que contenían 10 ml de medio FriisHS complementado con el antibiótico selectivo a las concentraciones indicadas anteriormente. Una vez que el medio cambió de color (entre 10 y 20 días después de una incubación a 37 °C y 150 rpm) se realizaron estudios genotípicos y/o fenotípicos de los mutantes obtenidos, mediante la obtención de extractos proteicos o de los ADN genómicos como cualquier experto en la materia conoce.After 2 or 3 weeks of incubation at 37 °C and 5% CO2, the transformant colonies were recovered on the Friis HS plates and inoculated into 50 ml flasks containing 10 ml of FriisHS medium supplemented with the selective antibiotic at the concentrations listed above. Once the medium changed color (between 10 and 20 days after incubation at 37 °C and 150 rpm), genotypic and/or phenotypic studies of the mutants obtained were performed by obtaining protein extracts or genomic DNA. as any expert in the field knows.

Ejemplos 4.1. a 4.8. - Obtención de cepas mutantes de Mhyo transformadas (los Ejemplos 4.1 a 4.5 no son parte de la invención)Examples 4.1. to 4.8. - Obtaining transformed Mhyo mutant strains (Examples 4.1 to 4.5 are not part of the invention)

Siguiendo sustancialmente el método descrito en el Ejemplo 4, se prepararon las cepas mutantes de Mhyo transformadas que se muestran en la Tabla I, usando los plásmidos que también se enumeran en la misma tabla. Substantially following the method described in Example 4, the transformed Mhyo mutant strains shown in Table I were prepared using the plasmids also listed in the same table.

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Las cepas mutantes mostradas en la tabla se seleccionaron de los diferentes mutantes que se obtuvieron en la transformación llevada a cabo como se describe en el presente documento. Estas cepas se utilizaron en diferentes ensayos de vacunación y de grado de atenuación.The mutant strains shown in the table were selected from the different mutants that were obtained in the transformation carried out as described herein. These strains were used in different vaccination and degree of attenuation trials.

Ejemplo 5.-Análisis de las cepas mutantes obtenidas por transformación con plásmidos replicativos Ejemplo 5.1.-Análisis de las cepas mutantes obtenidas por transformación con el plásmido replicativo pOG Se empleó la cepa transformada en el Ejemplo 4.6, 232POGc9, para confirmar la presencia del plásmido en las células recuperadas de la transformación de las placas de agar de Friis y cultivadas en medio FriisHS con gentamicina 10 pg/ml.Example 5.-Analysis of the mutant strains obtained by transformation with replicative plasmids Example 5.1.-Analysis of the mutant strains obtained by transformation with the replicative plasmid pOG The strain transformed in Example 4.6, 232POGc9, was used to confirm the presence of the plasmid in cells recovered from transformation on Friis agar plates and grown in FriisHS medium with 10 pg/ml gentamicin.

Para tal fin, se realizó una extracción del ADN total de las mismas. El ADN obtenido se digirió con la enzima de restricción Seal, que en este caso da lugar a la aparición de bandas fácilmente distinguibles en un gel de agarosa (Figura 4A).For this purpose, an extraction of the total DNA of the same was carried out. The DNA obtained was digested with the restriction enzyme Seal, which in this case gives rise to the appearance of easily distinguishable bands on an agarose gel (Figure 4A).

La aparición de las bandas correspondientes al plásmido que destacan claramente sobre el fondo de ADN genómico, indica que el clon analizado contiene el plásmido y que este replica de forma estable para dar lugar a 25­ 30 copias de plásmido por célula.The appearance of the bands corresponding to the plasmid that stand out clearly against the background of genomic DNA indicates that the analyzed clone contains the plasmid and that it replicates stably to give rise to 25-30 plasmid copies per cell.

El análisis de los resultados demuestra que los plásmidos replicativos de la invención se propagan de forma estable a la descendencia de las bacterias transformadas.Analysis of the results demonstrates that the replicative plasmids of the invention propagate stably to the progeny of the transformed bacteria.

Ejemplo 5.2.- Análisis de las cepas mutantes obtenidas por transformación con el plásmido replicativo pOGCREExample 5.2.- Analysis of the mutant strains obtained by transformation with the replicative plasmid pOGCRE

La cepa transformada en el Ejemplo 4.7, 232POGCREc1, incluye el gen que codifica la proteína Cre.The strain transformed in Example 4.7, 232POGCREc1, includes the gene encoding the Cre protein.

Para comprobar si la introducción de genes heterólogos mediante plásmidos replicativos daba lugar a la expresión de las proteínas correspondientes en Mhyo de forma detectable, se analizó una extracción proteica total de los clones recuperados en los ensayos de transformación con el plásmido pOGCRE mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante y posteriormente se realizó una transferencia tipo Western para detectar por métodos inmunológicos la presencia de la recombinasa Cre (Figura 4B).To test whether the introduction of heterologous genes via replicative plasmids resulted in the expression of the corresponding proteins in Mhyo in a detectable manner, a total protein extraction of the clones recovered in the transformation assays was analyzed with the pOGCRE plasmid by gel electrophoresis. denaturing polyacrylamide and subsequently a Western blot was performed to detect the presence of Cre recombinase by immunological methods (Figure 4B).

En este caso, la proteína Cre se detectó únicamente en la cepa que se había transformado con el plásmido pOGCRE, demostrando de esta manera la utilidad de los plásmidos replicativos para la expresión heteróloga de proteínas en Mhyo. In this case, the Cre protein was detected only in the strain that had been transformed with the pOGCRE plasmid, thus demonstrating the utility of replicative plasmids for heterologous protein expression in Mhyo.

Ejemplo 5.3.- Análisis de las cepas mutantes obtenidas por transformación con el plásmido replicativo pOGA159Example 5.3.- Analysis of the mutant strains obtained by transformation with the replicative plasmid pOGA159

La cepa transformada en el Ejemplo 4.8, 6314pOGAc4, se empleó para confirmar la presencia del plásmido en las células recuperadas de la transformación de las placas de agar de Friis y cultivadas en medio FriisHS con tetraciclina a 0,5 pg/ml.The strain transformed in Example 4.8, 6314pOGAc4, was used to confirm the presence of the plasmid in cells recovered from Friis agar plate transformation and grown in FriisHS medium with 0.5 pg/ml tetracycline.

Para este fin, se purificó ADN total de las células. El ADN obtenido se analizó mediante un gel de agarosa, que en este caso da como resultado la aparición de bandas fácilmente distinguibles cuando se las compara con una preparación de DNA obtenida a partir de la cepa parental 6314 (Figura 4C). For this purpose, total DNA was purified from the cells. The DNA obtained was analyzed by means of an agarose gel, which in this case results in the appearance of easily distinguishable bands when compared with a DNA preparation obtained from the parental strain 6314 (Figure 4C).

empo .- n ss e as cepas mu an es o en as por rans ormac n me an e ransposc n no es pare de la invención)me .- n ss e as cepas mu an es o en as por rans ormac n me an e ransposc n is not part of the invention)

Ejemplo 6.1.- Análisis de las cepas mutantes obtenidas por transformación mediante transposición del plásmido pTC3Example 6.1.- Analysis of the mutant strains obtained by transformation by transposition of the pTC3 plasmid

Se analizaron distintos clones transformantes obtenidos por electroporación con el plásmido TC3, tanto por transferencia tipo Southern como por secuenciación directa del ADN genómico, para demostrar que los mutantes resistentes a tetraciclina eran el resultado de la presencia de una inserción de transposón en el cromosoma bacteriano.Different transformant clones obtained by electroporation with the TC3 plasmid were analyzed, both by Southern blotting and by direct genomic DNA sequencing, to demonstrate that the tetracycline-resistant mutants were the result of the presence of a transposon insertion in the bacterial chromosome.

Para asegurar que todos los clones obtenidos portaban una única inserción de transposón y que estas inserciones no se volvían a movilizar después de varias generaciones, se realizó una transferencia tipo Southern del ADN genómico de un clon obtenido mediante el plásmido pTC3 nombrado 232TC3hlyC. Este clon se nombró así ya que los resultados de secuenciación indicaron que el transposón se había insertado en la secuencia codificante del gen hlyC (base 843448 del genoma de la cepa 232, GenBank AE017332.1). Para tal fin, se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y EcoRV tanto el ADN genómico de la cepa 232 como el de la cepa 232TC3hlyC. Se separaron los fragmentos resultantes en un gel de agarosa al 0,7 % y se transfirió a una membrana de nylon. Se generó una sonda con los oligonucleótidos SondaTet-5 (ATG AGT GGA TCC ATG AAA ATT ATT AAT ATT G) (SEQ ID NO: 44) y SondaTet-3 (CTA AGT TAT TTT ATT GAA CAT ATA TCG TAC TTT ATC) (SEQ ID NO: 45), mediante una reacción de PCR con dUTP marcado con digoxigenina utilizando como molde el plásmido pTC3. La sonda reconoce la secuencia del gen TetM de resistencia a tetraciclina, de forma que en la transferencia tipo Southern se detectaron las regiones del genoma donde se había producido la inserción del transposón (Figura 5A). El número y el tamaño de las bandas coincidían con los esperados teóricamente, indicando que los mutantes obtenidos por este método y tales vectores presentan una única copia de la inserción de transposón y que dicha inserción se mantiene estable después de varias generaciones.To ensure that all clones obtained carried a single transposon insert and that these inserts did not remobilize after several generations, a Southern blot of the genomic DNA of a clone obtained using the pTC3 plasmid named 232TC3hlyC was performed. This clone was so named because sequencing results indicated that the transposon had inserted into the coding sequence of the hlyC gene (genome base 843448 of strain 232, GenBank AE017332.1). For this purpose, both the genomic DNA of strain 232 and that of strain 232TC3hlyC were digested with the restriction enzymes EcoRI and EcoRV. The resulting fragments were separated on a 0.7% agarose gel and transferred to a nylon membrane. A probe was generated with the oligonucleotides SondaTet-5 (ATG AGT GGA TCC ATG AAA ATT ATT AAT ATT G) (SEQ ID NO: 44) and SondaTet-3 (CTA AGT TAT TTT ATT GAA CAT ATA TCG TAC TTT ATC) (SEQ ID NO: 45), by means of a PCR reaction with dUTP labeled with digoxigenin using the plasmid pTC3 as template. The probe recognizes the sequence of the TetM gene for resistance to tetracycline, so that in the Southern blot the regions of the genome where the transposon insertion had occurred were detected (Figure 5A). The number and size of the bands coincided with those expected theoretically, indicating that the mutants obtained by this method and such vectors present a single copy of the transposon insertion and that said insertion remains stable after several generations.

Ejemplo 6.2.- Análisis de las cepas mutantes obtenidas por transformación mediante transposición de los plásmidos pTC3C, pTC3L y pTC3TExample 6.2.- Analysis of the mutant strains obtained by transformation by transposition of the plasmids pTC3C, pTC3L and pTC3T

Se seleccionaron varios mutantes originados por cada transposón y se nombraron 6314Cc1, 232Cc6, 232Lc2, 232Tc2. Como se ha mencionado anteriormente se seleccionaron dos mutantes con el plásmido diseñado para expresión citosólica (uno para la cepa 6314, el 6314Cc1 y otro para la cepa 232, el 232Cc6) mientras que las versiones diseñadas para emplazarse en membrana sólo se han ejemplificado en la cepa 232, tal como el mutante procedente del plásmido pTC3L, el 232Lc2 y el mutante procedente del pTC3T, el 232Tc2.Several mutants originating from each transposon were selected and named 6314Cc1, 232Cc6, 232Lc2, 232Tc2. As previously mentioned, two mutants with the plasmid designed for cytosolic expression were selected (one for strain 6314, 6314Cc1 and another for strain 232, 232Cc6) while versions designed for membrane emplacement have only been exemplified in the strain 232, such as the mutant from plasmid pTC3L, 232Lc2, and the mutant from pTC3T, 232Tc2.

Los puntos de inserción de los transposones de las versiones citosólicas (pTC3C) en el cromosoma bacteriano se determinaron por secuenciación directa del ADN genómico. Con respecto al genoma de la cepa 232 (GenBank AE017332.1), el transposón en el clon 6314Cc1 se insertó en la base 224547 mientras que el transposón en el clon 232Cc6 se insertó en la base 569253.The transposon insertion points of the cytosolic versions (pTC3C) in the bacterial chromosome were determined by direct sequencing of genomic DNA. Regarding the 232 strain genome (GenBank AE017332.1), the transposon in clone 6314Cc1 inserted at base 224547 while the transposon in clone 232Cc6 inserted at base 569253.

Para identificar la presencia de la proteína de la cápside de CVP2 y cuantificarla en las cepas de Mhyo obtenidas (232Lc2, 232Cc6, 232Tc2 y 6314Cc1), se utilizó un kit comercial (Ingenasa) que permite detectar y cuantificar dicho antígeno mediante inmunodetección en placa (ELISA). Los extractos proteicos se obtuvieron después de concentrar 100x los cultivos en fase exponencial de cada cepa y lisando las células obtenidas en PBS y Triton® X-100 a una concentración final del 0,1 % (v/v). Los resultados fueron positivos, indicando que todas las cepas y plásmidos probados expresan las proteínas codificadas por ORF2 u ORF2v2 en mayor o menor cantidad (Figura 5B).To identify the presence of the CVP2 capsid protein and quantify it in the Mhyo strains obtained (232Lc2, 232Cc6, 232Tc2 and 6314Cc1), a commercial kit (Ingenasa) was used to detect and quantify said antigen by plate immunodetection ( ELISA). The protein extracts were obtained after concentrating 100x the exponential phase cultures of each strain and lysing the cells obtained in PBS and Triton® X-100 at a final concentration of 0.1% (v/v). The results were positive, indicating that all strains and plasmids tested express the proteins encoded by ORF2 or ORF2v2 in greater or lesser amounts (Figure 5B).

Las cepas con la versión procedente del plásmido pTC3C también se analizaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida y transferencia tipo Western (Figura 5C). Se detectaron bandas del mismo peso molecular que la proteína de la cápside de CVP2. De forma interesante, no apareció una banda de degradación proteolítica, un problema común en la expresión recombinante de proteínas. Todo ello sugiere que la proteína de cápside de CVP2 expresada de forma recombinante en Mhyo puede ser un buen antígeno para la formulación de una vacuna polivalente. Así mismo, se confirma que Mhyo es un buen hospedador para la expresión de proteínas recombinantes.Strains with the version derived from the pTC3C plasmid were also analyzed by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis and Western blotting (Figure 5C). Bands of the same molecular weight as the CVP2 capsid protein were detected. Interestingly, a band of proteolytic degradation, a common problem in recombinant protein expression, did not appear. All this suggests that the CVP2 capsid protein expressed recombinantly in Mhyo may be a good antigen for the formulation of a polyvalent vaccine. Likewise, it is confirmed that Mhyo is a good host for the expression of recombinant proteins.

Ejemplo 7.- Ensayos de vacunación (no es parte de la invención)Example 7.- Vaccination tests (not part of the invention)

Ejemplo 7.1.- Vacunación y exposición a CVP2Example 7.1.- Vaccination and exposure to CVP2

Se analizó la eficacia de vacunas que contenían cepas de Mhyo transformadas preparadas como se describe en el presente documento, donde dichas cepas expresaban la proteína de la cápside del circovirus CVP2 en su citosol, y los animales se expusieron a una cepa patógena de CVP2.Vaccines containing transformed Mhyo strains prepared as described herein were tested for efficacy, wherein said strains expressed CVP2 circovirus capsid protein in their cytosol, and animals were challenged with a pathogenic strain of CVP2.

Las respuestas que se valoraron fueron la respuesta inmunológica frente a Mhyo y frente a CVP2 determinadas mediante ELISA, y la carga de ADN vírico de CVP2 en el suero de los animales.The responses that were assessed were the immunological response against Mhyo and against CVP2 determined by ELISA, and the CVP2 viral DNA load in the serum of the animals.

Para la prueba se seleccionaron 72 cerdos de 28 días de edad, que se distribuyeron al azar en 6 grupos de 12 animales cada grupo. For the test, 72 28-day-old pigs were selected, which were randomly distributed into 6 groups of 12 animals each group.

Dicha eficacia se analizó de acuerdo con un diseño factorial 22 con cuatro grupos de animales, en el cual los factores a valorar eran las cepas de Mhyo transformadas y el régimen de vacunación. Para este fin, se probaron vacunas que contenían las cepas 6314Cc1 o 232Cc6, y los animales se vacunaron siguiendo un régimen de dosis única o de revacunación con una dosis adicional.Said efficacy was analyzed according to a 22 factorial design with four groups of animals, in which the factors to be assessed were the transformed Mhyo strains and the vaccination regimen. For this purpose, vaccines containing the 6314Cc1 or 232Cc6 strains were tested, and the animals were vaccinated following a single dose regimen or boosted with an additional dose.

Los grupos de ensayo realizados se muestran en la Tabla II:The test groups carried out are shown in Table II:

TablaBoard

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Adicionalmente, se incorporaron al estudio dos grupos de animales: un grupo no vacunado, pero sí infectado (grupo 5), y un grupo no vacunado y no infectado (grupo 6).Additionally, two groups of animals were incorporated into the study: a non-vaccinated but infected group (group 5), and a non-vaccinated and non-infected group (group 6).

Las vacunas comprendían las cepas mutantes de Mhyo inactivadas mediante un tensioactivo no iónico y una emulsión del tipo A/G/A como adyuvante, y se administraron por vía intramuscular en el cuello del animal.The vaccines comprised the Mhyo mutant strains inactivated by a non-ionic surfactant and an A/G/A type emulsion as adjuvant, and were administered intramuscularly in the neck of the animal.

El régimen de vacunación consistió en administrar una dosis de 2 ml de vacuna en el día 0 del estudio a todos los animales que no formaban parte de los grupos de control, y se revacunó a la mitad de los animales a los 14 días de la primera dosis.The vaccination regimen consisted of administering a 2 ml dose of vaccine on day 0 of the study to all animals that were not part of the control groups, and half of the animals were revaccinated 14 days after the first dose. dose.

Los animales de los grupos 5 y 6 recibieron 2 ml de PBS como placebo tanto el primer día como a los 14 días. Para preparar los antígenos para las vacunas, las cepas de Mhyo transformadas se cultivaron en medio Friis con tetraciclina 0,5 pg/ml a una temperatura de 37 °C, en agitación entre 100 y 200 rpm hasta que se observó un cambio de color debido a un cambio en el pH del medio de cultivo.Animals in groups 5 and 6 received 2 ml of PBS as placebo both on the first day and after 14 days. To prepare the antigens for the vaccines, the transformed Mhyo strains were grown in Friis medium with 0.5 pg/ml tetracycline at a temperature of 37 °C, shaking at 100 to 200 rpm until a color change was observed due to to a change in the pH of the culture medium.

Los cultivos se centrifugaron y se lavaron dos veces con PBS para obtener un cultivo concentrado 30 veces. El antígeno correspondiente a la cepa de Mhyo transformada 6314Cc1 presentó un título de 9,2 unidades de cambio de color/ml (UCC/ml logi0) y el antígeno correspondiente a la cepa de Mhyo transformada 232Cc6 presentó un título de 9,45 UCC/ml logi0. La producción de la proteína de la cápside de CVp2 se confirmó mediante ELISA (Ingezim PCV DAS, Ingenasa, España). La proteína total de cada antígeno fue respectivamente de 373 mg/l y 350,2 mg/l, determinado por el método del Azul de Coomassie.The cultures were centrifuged and washed twice with PBS to obtain a 30-fold concentrated culture. The antigen corresponding to the transformed Mhyo strain 6314Cc1 presented a titer of 9.2 color change units/ml (UCC/ml logi 0 ) and the antigen corresponding to the transformed Mhyo strain 232Cc6 presented a titer of 9.45 UCC. /ml log 0 . The production of the CVp2 capsid protein was confirmed by ELISA (Ingezim PCV DAS, Ingenasa, Spain). The total protein of each antigen was respectively 373 mg/l and 350.2 mg/l, determined by the Coomassie Blue method.

Los antígenos se inactivaron con un tensioactivo no iónico y se usó como adyuvante una emulsión del tipo A/G/A tal como, por ejemplo, el producto Montanide® ISA 201 (SEPPIC, Francia), en una proporción 50:50 peso/peso.The antigens were inactivated with a non-ionic surfactant and an A/G/A type emulsion was used as adjuvant, such as, for example, the product Montanide® ISA 201 (SEPPIC, France), in a 50:50 weight/weight ratio. .

Se recogieron muestras de sangre de los animales el día antes de la vacunación (día -1), el día 13 (el día anterior a la revacunación), el día 27 (anterior a la infección) y a los días 7, 14, y 21 después de la infección, que corresponden respectivamente a los días 35, 42 y 49 del estudio.Blood samples were collected from the animals on the day before vaccination (day -1), on day 13 (the day before revaccination), on day 27 (before infection), and on days 7, 14, and 21. after infection, corresponding respectively to days 35, 42 and 49 of the study.

Se obtuvo suero para determinar la respuesta inmunológica frente a CVP2 mediante el kit CVP2 Antibody ELISA test (Biocheck, Países Bajos) y frente a Mhyo mediante CIVTEST SUIS Myo (Hipra, Girona-Amer, España), y también para el análisis de viremia por CVP2.Serum was obtained to determine the immune response against CVP2 using the CVP2 Antibody ELISA test kit (Biocheck, The Netherlands) and against Mhyo using CIVTEST SUIS Myo (Hipra, Girona-Amer, Spain), and also for the analysis of viremia by CVP2.

Las muestras de suero se obtuvieron los días -1, 13 y 27 y se analizaron por PCR convencional, tal como se describe en, por ejemplo, Quintana et al., Veterinary Record, 2001, 149, 357-361, ya que se esperaba que fuesen negativos, mientras que las muestras recogidas los días 7 y 14 después de la infección se analizaron por PCR cuantitativa, como se describe en, por ejemplo, Olvera et al., J. Virol. Meth., 2004, 117, 75-80.Serum samples were obtained on days -1, 13 and 27 and analyzed by standard PCR, as described in, for example, Quintana et al., Veterinary Record, 2001, 149, 357-361, as it was expected that were negative, whereas samples collected on days 7 and 14 post-infection were analyzed by quantitative PCR, as described in, for example, Olvera et al., J. Virol. Meth., 2004, 117, 75-80.

Los animales de los grupos 1 a 5 se infectaron por vía intranasal con 2 ml (5,66 DICC50/ml log™) de una cepa de tipo silvestre virulenta de cVp2 (CVP2 Sp-107-54-13, Fort et al., Vet. Immunol. Immunopathol., 2010, 137, 226-234) 28 días después de la administración de la primera dosis de la vacuna. Los animales del grupo 6 recibieron 2 ml de PBS por vía intranasal como placebo. Los animales fueron sacrificados el día 49 del estudio, esto es, 21 días después de la infección.Animals in groups 1 to 5 were infected intranasally with 2 ml (5.66 CCID 50 /ml log™) of a virulent wild-type strain of cVp2 (CVP2 Sp-107-54-13, Fort et al. , Vet. Immunol. Immunopathol., 2010, 137, 226-234) 28 days after the administration of the first dose of the vaccine. Animals in group 6 received 2 ml of PBS intranasally as a placebo. The animals were sacrificed on day 49 of the study, that is, 21 days after infection.

Durante el ensayo de infección-vacunación aleatorizado y con enmascaramiento completo, los animales se instalaron en habitaciones con nivel 3 de bioseguridad. El grupo 6 se colocó en una habitación separada para evitar infecciones cruzadas y, por tanto, fue el único grupo que permaneció sin enmascaramiento para el personal encargado del cuidado de los animales. During the fully blinded, randomized infection-vaccination trial, animals were housed in biosafety level 3 rooms. Group 6 was placed in a separate room to avoid cross-infection and was therefore the only group that remained unmasked for animal care personnel.

Teniendo en cuenta que los animales presentaban anticuerpos maternos frente a CVP2, los grupos se trataron en bloques con relación a este parámetro, para evitar diferencias iniciales entre los grupos.Taking into account that the animals presented maternal antibodies against CVP2, the groups were treated in blocks in relation to this parameter, to avoid initial differences between the groups.

El parámetro principal para la evaluación de la eficacia de la infección por CVP2 fue la reducción de la viremia por CVP2 determinada por PCR cuantitativa.The main parameter for the evaluation of the efficacy of CVP2 infection was the reduction of CVP2 viremia determined by quantitative PCR.

El parámetro principal para determinar la eficacia con relación a Mhyo, fue la seroconversión analizada por ELISA. La respuesta serológica frente a Mhyo se muestra en la Figura 6. Las cuatro vacunas experimentales promovieron una seroconversión significativa en comparación con los grupos no vacunados (grupos 5 y 6) a partir del día 13 del estudio en adelante.The main parameter to determine the efficacy in relation to Mhyo, was the seroconversion analyzed by ELISA. The serological response against Mhyo is shown in Figure 6. All four experimental vaccines promoted significant seroconversion compared to the unvaccinated groups (groups 5 and 6) from study day 13 onwards.

Después de la infección por CVP2, los grupos vacunados mostraron en el día 14 después de la infección una respuesta inmunológica mayor con relación al grupo no vacunado, pero sí infectado y, con excepción del grupo 4, también en el día 21 después de la infección.After CVP2 infection, the vaccinated groups showed a greater immune response on day 14 post-infection compared to the non-vaccinated but infected group and, with the exception of group 4, also on day 21 post-infection. .

El grupo no vacunado y no infectado presentó la disminución normal de los anticuerpos maternos frente a CVP2, con una diferencia significativa con el grupo no vacunado e infectado en el día 21 después de la infección.The non-vaccinated and non-infected group presented the normal decrease in maternal antibodies against CVP2, with a significant difference with the non-vaccinated and infected group on day 21 after infection.

No se observaron signos clínicos asociados a las infecciones por CVP2. Normalmente, los modelos de prueba de CVP2 son modelos subclínicos, y el parámetro clave para determinar la eficacia de la vacuna es la reducción de la viremia.No clinical signs associated with CVP2 infections were observed. Typically, CVP2 test models are subclinical models, and the key parameter to determine vaccine efficacy is reduction in viremia.

Todos los animales fueron negativos con respecto a CVP2, de acuerdo con el análisis realizado por PCR convencional antes de la infección. La Figura 8 muestra las copias genómicas de CVP2 que se cuantificaron en tiempo real por PCR a los 7 y a los 14 días después de la infección. No se detectaron copias genómicas de CVP2 en las muestras de suero del grupo no vacunado y no infectado.All animals were negative with respect to CVP2, according to the analysis carried out by conventional PCR before infection. Figure 8 shows the genomic copies of CVP2 that were quantified in real time by PCR at 7 and 14 days post infection. No genomic copies of CVP2 were detected in the serum samples from the non-vaccinated and non-infected group.

El día 14 después de la infección la viremia por CVP2 fue significativamente inferior en los grupos vacunados en comparación con el grupo no vacunado, pero sí infectado.On day 14 after infection, CVP2 viremia was significantly lower in the vaccinated groups compared to the non-vaccinated but infected group.

Los resultados de este estudio indican que las cepas de Mhyo transformadas por los medios como se describe en el presente documento y que expresan la proteína de la cápside de CVP2 generan al mismo tiempo una respuesta inmunológica significativa frente a Mhyo y a circovirus porcino de tipo 2 (CVP2).The results of this study indicate that Mhyo strains transformed by the media as described herein and expressing the CVP2 capsid protein simultaneously generate a significant immune response against Mhyo and porcine circovirus type 2 ( CVP2).

La respuesta inmunológica diferencial frente a CVP2 en los animales vacunados fue clara en el día 14 después de la infección, una vez que la infección por CVP2 se había establecido, tal como se deduce de la viremia por CVP2 que se observa en el grupo no vacunado e infectado (grupo 5).The differential immune response against CVP2 in vaccinated animals was clear on day 14 post-infection, once CVP2 infection had been established, as inferred from CVP2 viremia observed in the non-vaccinated group. and infected (group 5).

La presencia de anticuerpos maternos frente a CVP2 impidió la evaluación de la inmunogenicidad de la vacuna en ausencia de una infección experimental, a diferencia de lo que sucedió con Mhyo. The presence of maternal antibodies against CVP2 prevented the evaluation of the immunogenicity of the vaccine in the absence of an experimental infection, unlike what happened with Mhyo.

Al no poderse reproducir en un modelo experimental los signos clínicos correspondientes a lesiones macroscópicas debidas a la infección por CVP2, el resultado de la infección por CVP2 fue valorado en términos de viremia por PCR cuantitativa y la eficacia de la vacuna se demostró mediante la reducción de la viremia. Esta reducción se observó para las cuatro vacunas de prueba a los 14 días después de la infección, una vez que la viremia alcanza su nivel más alto.As the clinical signs corresponding to macroscopic lesions due to CVP2 infection could not be reproduced in an experimental model, the result of CVP2 infection was assessed in terms of viraemia by quantitative PCR and the efficacy of the vaccine was demonstrated by the reduction of the viraemia. This reduction was observed for all four test vaccines at 14 days post-infection, once viraemia reached its highest level.

Por lo tanto, las cepas de Mhyo transformadas que expresan la proteína de la cápside de CVP2 se pueden usar en vacunas frente a infecciones provocadas por Mhyo y por circovirus porcino de tipo 2 (CVP2) al mismo tiempo.Therefore, transformed Mhyo strains expressing the CVP2 capsid protein can be used in vaccines against Mhyo and porcine circovirus type 2 (CVP2) infections at the same time.

Ejemplo 7.2.- Vacunación e infección con CVP2 y Mhyo Example 7.2.- Vaccination and infection with CVP2 and Mhyo

Se analizó la eficacia de una vacuna que contenía una cepa de Mhyo transformada preparada como se describe en el presente documento, donde dicha cepa expresaba la proteína de la cápside del circovirus CVP2 en su citosol. Los animales se expusieron a cepas patógenas de CVP2 y Mhyo. The efficacy of a vaccine containing a transformed Mhyo strain prepared as described herein, wherein said strain expressed the CVP2 circovirus capsid protein in its cytosol, was tested. Animals were challenged with pathogenic strains of CVP2 and Mhyo.

Las respuestas que se valoraron fueron la carga de ADN vírico de CVP2 en el suero de los animales, el número de animales con viremia por CVP2 y las lesiones compatibles con Mhyo en los pulmones de los animales.Responses assessed were the CVP2 viral DNA load in the animals' sera, the number of animals with CVP2 viraemia, and Mhyo- compatible lesions in the lungs of the animals.

Para la prueba se seleccionaron 36 cerdos de 28 días de edad, que se distribuyeron al azar en 3 grupos de 12 animales cada uno.For the test, 36 28-day-old pigs were selected, which were randomly distributed into 3 groups of 12 animals each.

Dicha eficacia se analizó con una vacuna que contenía la cepa 6314Cc1. Los animales del grupo 1 se vacunaron siguiendo un régimen de dosis única. Adicionalmente, se incorporaron al estudio dos grupos de animales: un grupo no vacunado, pero sí infectado (grupo 2), y un grupo no vacunado y no infectado (grupo 3). Said efficacy was analyzed with a vaccine containing the 6314Cc1 strain. Animals in group 1 were vaccinated following a single dose regimen. Additionally, two groups of animals were incorporated into the study: a group not vaccinated, but infected (group 2), and a group not vaccinated and not infected (group 3).

La vacuna comprendía la cepa mutante de Mhyo inactivada mediante un tensioactivo no iónico y una emulsión del tipo A/G/A como adyuvante, y se administró por vía intramuscular en el cuello de los animales.The vaccine comprised the Mhyo mutant strain inactivated by a non-ionic surfactant and an A/G/A type emulsion as adjuvant, and was administered intramuscularly in the neck of the animals.

El régimen de vacunación consistió en la administración de una dosis de 2 ml de vacuna en el día 0 del estudio a todos los animales que no formaban parte de los grupos de control.The vaccination regimen consisted of the administration of a 2 ml dose of vaccine on day 0 of the study to all animals that were not part of the control groups.

Los animales de los grupos 2 y 3 recibieron 2 ml de PBS como placebo.Animals in groups 2 and 3 received 2 ml of PBS as placebo.

Para preparar los antígenos de la vacuna, la cepa de Mhyo transformada se cultivó en medio Friis con tetraciclina 0,5 |jg/ml a una temperatura de 37 °C y en agitación entre 100 y 200 rpm hasta que se observó un cambio de color debido a un cambio en el pH del medio de cultivo.To prepare the vaccine antigens, the transformed Mhyo strain was grown in Friis medium with tetracycline 0.5 |g/ml at a temperature of 37 °C and shaking between 100 and 200 rpm until a color change was observed. due to a change in the pH of the culture medium.

Los cultivos se centrifugaron y se resuspendieron en PBS para obtener un cultivo concentrado 25 veces. El antígeno correspondiente a la cepa de Mhyo transformada 6314Cc1 tenía un título de 9,325 unidades de cambio de color/ml (UCC/ml logi0). La producción de la proteína de la cápside de CVP2 se confirmó mediante ELISA (Ingezim PCV DAS, Ingenasa, España).The cultures were centrifuged and resuspended in PBS to obtain a 25-fold concentrated culture. The antigen corresponding to the transformed Mhyo strain 6314Cc1 had a titer of 9.325 color change units/ml (UCC/ml log 0 ). The production of the CVP2 capsid protein was confirmed by ELISA (Ingezim PCV DAS, Ingenasa, Spain).

Los antígenos se inactivaron con un tensioactivo no iónico y como adyuvante se usó una emulsión del tipo A/G/A, por ejemplo el producto Montanide® ISA 201 (SEPPIC, Francia), en una proporción 50:50 en peso/peso.The antigens were inactivated with a non-ionic surfactant and an A/G/A type emulsion was used as adjuvant, for example the product Montanide® ISA 201 (SEPPIC, France), in a 50:50 weight/weight ratio.

Se recogieron muestras de sangre de los animales el día antes de la vacunación (día -1), a los días 13, 21 y 27 después de la vacunación, y a los días 7, 14, 21 y 28 después de la infección, que corresponden respectivamente a los días 35, 42, 49 y 56 del estudio.Blood samples were collected from the animals the day before vaccination (day -1), at days 13, 21 and 27 after vaccination, and at days 7, 14, 21 and 28 after infection, which correspond to respectively at days 35, 42, 49 and 56 of the study.

Se obtuvo suero para determinar la viremia por CVP2 utilizando PCR cuantitativa, como se describe en, por ejemplo, Olvera et al., citado anteriormente.Serum to determine CVP2 viremia was obtained using quantitative PCR, as described in, for example, Olvera et al., supra.

Los animales de los grupos 1 y 2 se infectaron por vía intranasal con 2 ml/animal (5,33 DICC50/ml log1ü) de una cepa de tipo silvestre virulenta de CVP2 (CVP2 Sp-107-54-13, Fort et al., Vet. Immunol. Immunopathol., 2010, 137, 226­ 234) y con 10 ml/animal por vía intratraqueal con la cepa patógena de Mhyo 3371 (7,325 UCC/ml log1ü) a los 28 días después de la administración de la vacuna. Los animales del grupo 3 recibieron 2 ml de PBS por vía intranasal y 10 ml de PBS/animal por vía intratraqueal como placebo. Los animales se sacrificaron el día 56 del estudio, es decir, 28 días después de la infección, momento en el que se valoró la presencia de lesiones compatibles con Mhyo en los pulmones de los animales.Animals in groups 1 and 2 were infected intranasally with 2 ml/animal (5.33 CCID 50 /ml log 1 µ) of a virulent wild-type strain of CVP2 (CVP2 Sp-107-54-13, Fort et al., Vet. Immunol. Immunopathol., 2010, 137, 226 234) and with 10 ml/animal intratracheally with the pathogenic strain of Mhyo 3371 (7,325 UCC/ml log 1 ü) 28 days after the vaccine administration. Animals in group 3 received 2 ml PBS intranasally and 10 ml PBS/animal intratracheally as placebo. The animals were sacrificed on day 56 of the study, that is, 28 days after infection, at which time the presence of lesions compatible with Mhyo in the lungs of the animals was assessed.

Durante el ensayo de infección-vacunación aleatorizado y con enmascaramiento completo, los animales se instalaron en habitaciones con el nivel 3 de bioseguridad. El grupo 3 se instaló en una habitación separada para evitar infecciones cruzadas y, por lo tanto, fue el único grupo que permaneció sin enmascaramiento para el personal encargado del cuidado de los animales.During the fully blinded, randomized infection-vaccination trial, animals were housed in biosafety level 3 rooms. Group 3 was set up in a separate room to avoid cross-infection and was therefore the only group that remained unmasked for animal care personnel.

Teniendo en cuenta que los animales tenían anticuerpos maternos anti- CVP2, los grupos se trataron en bloques con relación a este parámetro, para evitar diferencias iniciales entre los grupos.Taking into account that the animals had maternal anti-CVP2 antibodies, the groups were treated in blocks regarding this parameter, to avoid initial differences between the groups.

El parámetro principal para la evaluación de la eficacia de la infección por CVP2 fue la reducción de la viremia por CVP2 determinada por PCR cuantitativa. El parámetro principal para determinar la eficacia con respecto a Mhyo fue la superficie pulmonar afectada por lesiones compatibles con Mhyo. The main parameter for the evaluation of the efficacy of CVP2 infection was the reduction of CVP2 viremia determined by quantitative PCR. The primary parameter to determine efficacy with respect to Mhyo was the lung surface area affected by lesions consistent with Mhyo.

Todos los animales fueron negativos con respecto a CVP2 de acuerdo con el análisis realizado por PCR convencional antes de la infección experimental. La Figura 12 muestra las copias genómicas de CVP2 que se cuantificaron en tiempo real por PCR a los 7, 14, 21 y 28 días después de la infección. No se detectaron copias genómicas de CVP2 en las muestras de suero del grupo no vacunado y no infectado. Los días 14 y 21 después de la infección, la viremia por CVP2 fue significativamente inferior en el grupo vacunado en comparación con el grupo no vacunado, pero sí infectado.All animals were negative for CVP2 according to analysis performed by standard PCR prior to experimental infection. Figure 12 shows the genomic copies of CVP2 that were quantified in real time by PCR at 7, 14, 21 and 28 days post infection. No genomic copies of CVP2 were detected in the serum samples from the non-vaccinated and non-infected group. On days 14 and 21 after infection, CVP2 viremia was significantly lower in the vaccinated group compared to the non-vaccinated but infected group.

En la figura 13 se muestran los mismos resultados expresados como porcentaje de animales con viremia (positivos en la PCR cuantitativa).Figure 13 shows the same results expressed as the percentage of animals with viraemia (positive in quantitative PCR).

En la figura 14 se muestra la mediana del porcentaje de superficie pulmonar afectada por lesiones compatibles con Mhyo. Se observó que la superficie pulmonar afectada en los animales vacunados era significativamente inferior a la de los animales no vacunados, pero sí infectados (grupo 2).Figure 14 shows the median percentage of lung surface affected by lesions consistent with Mhyo. It was observed that the affected lung surface in the vaccinated animals was significantly lower than that of the unvaccinated, but infected animals (group 2).

Los resultados de este estudio permitieron concluir que la cepa de Mhyo genéticamente modificada como se describe en el presente documento y que expresaba la proteína de la cápside de CVP2 generó al mismo tiempo una reducción significativa de la viremia por CVP2 y de las lesiones compatibles con Mhyo, en comparación con los animales no vacunados. The results of this study allowed us to conclude that the Mhyo strain genetically modified as described herein and expressing the CVP2 capsid protein simultaneously generated a significant reduction in CVP2 viraemia and Mhyo -compatible lesions. , compared to non-vaccinated animals.

En consecuencia, las cepas de Mhyo transformadas que expresan la proteína de la cápside de CVP2 pueden utilizarse en vacunas frente a infecciones provocadas por Mhyo y por circovirus porcino de tipo 2 (CVP2) al mismo tiempo.Consequently, transformed Mhyo strains expressing the CVP2 capsid protein can be used in vaccines against Mhyo and porcine circovirus type 2 (CVP2) infections at the same time.

Ejemplo 8.- Pruebas del grado de atenuación de las cepas mutantes transformadasExample 8.- Tests for the degree of attenuation of the transformed mutant strains

Ejemplo 8.1.- Análisis del grado de atenuación de una cepa mutante transformada que porta la inserción de transposón en el gen de la hemolisina C de Mhyo (no es parte de la invención)Example 8.1.- Analysis of the degree of attenuation of a transformed mutant strain that carries the transposon insertion in the Mhyo hemolysin C gene (not part of the invention)

En este ensayo se determinó el grado de atenuación de una cepa mutante de Mhyo obtenida por transposición mediante la valoración de la capacidad de dicha cepa para colonizar las vías respiratorias altas y bajas de un cerdo. La cepa mutante probada, 232TC3hlyC, obtenida en el Ejemplo 4.5, presenta la inserción de transposón en el gen de la hemolisina C de Mhyo (hlyC). In this assay, the degree of attenuation of a Mhyo mutant strain obtained by transposition was determined by assessing the ability of said strain to colonize the upper and lower respiratory tracts of a pig. The mutant strain tested, 232TC3hlyC, obtained in Example 4.5, has the transposon insertion in the Mhyo hemolysin C gene ( hlyC).

Se seleccionaron cerdos de 8 semanas de edad, se distribuyeron al azar en 2 grupos de 8 animales cada uno, y cada grupo se mantuvo en habitaciones separadas para evitar infecciones cruzadas.8-week-old pigs were selected, randomly divided into 2 groups of 8 animals each, and each group was kept in separate rooms to avoid cross-infection.

Los animales se sedaron antes de ser sometidos a la infección. Un grupo de animales se infectó por vía intratraqueal en el día 0, con 10 ml de la cepa mutante 232TC3hlyC, y el otro grupo con 10 ml de la cepa parental 232 de Mhyo. Los inóculos tenían un título de 7 UCC/ml log 10. Los animales se sacrificaron en el día 28 del estudio.Animals were sedated before being subjected to infection. One group of animals was infected intratracheally on day 0, with 10 ml of the 232TC3hlyC mutant strain, and the other group with 10 ml of the Mhyo parental strain 232. The inocula had a titer of 7 UCC/ml log 10 . Animals were sacrificed on day 28 of the study.

Se recogieron muestras nasales los días -1 (día anterior a la infección), 8, 15, 21 y 28 para realizar un análisis de Mhyo por PCR anidada.Nasal swabs were collected on days -1 (day prior to infection), 8, 15, 21, and 28 for Mhyo analysis by nested PCR.

Se recogieron muestras bronquiales el día 28 de los animales sacrificados para realizar un análisis de Mhyo también por PCR anidada.Bronchial samples were collected on day 28 from euthanized animals for Mhyo analysis also by nested PCR.

No se detectaron animales que portaran ADN genómico de Mhyo en las muestras nasales recogidas durante todo el tiempo que duró el estudio. Sin embargo, la cepa de tipo silvestre 232 de Mhyo se detectó en el 25 % de las muestras bronquiales de los animales, mientras que para la cepa mutante transformada fue del 0 %.No animals carrying Mhyo genomic DNA were detected in nasal swabs collected during the entire study period. However, the Mhyo 232 wild-type strain was detected in 25% of the bronchial samples from the animals, while for the transformed mutant strain it was 0%.

Este resultado sugiere que la cepa mutante 232TC3hlyC muestra un comportamiento atenuado en comparación con la cepa parental de la que proviene, con relación a la colonización de las vías respiratorias bajas; por lo tanto puede utilizarse como candidata atenuada en una vacuna frente a Mhyo. This result suggests that the 232TC3hlyC mutant strain shows attenuated behavior compared to the parental strain from which it comes, in relation to colonization of the lower respiratory tract; therefore it can be used as an attenuated candidate in a vaccine against Mhyo.

Ejemplo 8.2.- Análisis del grado de atenuación de una cepa mutante transformada que presenta inhibición de la expresión del gen de la hemolisina 159 de Mhyo Example 8.2.- Analysis of the degree of attenuation of a transformed mutant strain that presents inhibition of the expression of the Mhyo hemolysin 159 gene

En otra prueba se determinó el grado de atenuación de la cepa 6314POGAc4, obtenida en el Ejemplo 4.8, que presenta inhibición de la expresión del gen de la hemolisina 159 de Mhyo. In another test, the degree of attenuation of strain 6314POGAc4, obtained in Example 4.8, which shows inhibition of the expression of the Mhyo hemolysin 159 gene, was determined.

Se seleccionaron cerdos de 8 semanas de edad, se distribuyeron al azar en 3 grupos de 8 animales cada uno y se mantuvieron en habitaciones separadas para evitar infecciones cruzadas.Pigs of 8 weeks of age were selected, randomly distributed into 3 groups of 8 animals each and kept in separate rooms to avoid cross-infection.

El día 0 de la prueba, a los animales del grupo 1 se le inoculó por vía intratraqueal 10 ml de la cepa 6314POGAc4 con una concentración de 8 UCC/ml log™, y a los animales del grupo 2 se les administró la misma cantidad de la cepa parental de tipo silvestre 6314. Los animales se sedaron antes de ser sometidos a la infección. El grupo 3 fue el grupo control no infectado. Los animales se sacrificaron el día 28 del estudio.On day 0 of the test, the animals of group 1 were inoculated intratracheally with 10 ml of the 6314POGAc4 strain with a concentration of 8 UCC/ml log™, and the animals of group 2 were administered the same amount of the wild-type parent strain 6314. Animals were sedated prior to being challenged. Group 3 was the uninfected control group. Animals were sacrificed on day 28 of the study.

Se recogieron muestras de sangre el día anterior a la infección (día -1) y en los días 15 y 28. Se analizó la serología de Mhyo mediante el CIVTEST SUIS Mhyo (Hipra-Amer-Girona-España). Se recogieron muestras nasales los días -1, 8, 15, 21 y 28 para realizar un análisis de Mhyo por PCR anidada.Blood samples were collected the day before infection (day -1) and on days 15 and 28. Mhyo serology was analyzed using the CIVTEST SUIS Mhyo (Hipra-Amer-Girona-Spain). Nasal swabs were collected on days -1, 8, 15, 21, and 28 for analysis of Mhyo by nested PCR.

Se recogieron muestras bronquiales el día 28 de los animales sacrificados para realizar un análisis de Mhyo también por PCR anidada.Bronchial samples were collected on day 28 from euthanized animals for Mhyo analysis also by nested PCR.

Se puntuaron las lesiones pulmonares macroscópicas de bronconeumonía catarral compatible con una infección por Mhyo. Cada lóbulo pulmonar se puntuó entre 0 y 5 de acuerdo con la proporción de tejido con lesiones provocadas por Mhyo. Gross lung lesions of catarrhal bronchopneumonia consistent with Mhyo infection were scored. Each lung lobe was scored between 0 and 5 according to the proportion of tissue with Mhyo-induced lesions.

La contribución de cada lóbulo pulmonar a la superficie total del pulmón afectada se calculó aplicando el método descrito en Christensen et al., Diseases of the respiratory system. En: Diseases of Swine. 8a Edición. Straw B.E., D'Allaire S., Mengeling W.L. y Taylor D.J. lowa State University Press, Ames (IA) 1999, página 914. The contribution of each lung lobe to the total affected lung area was calculated using the method described in Christensen et al., Diseases of the respiratory system. In: Diseases of Swine. 8th Edition. Straw BE, D'Allaire S., Mengeling WL and Taylor DJ Lowa State University Press, Ames (IA) 1999, page 914.

Claims (1)

REIVINDICACIONES 1. Un método para preparar una cepa mutante de Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo), caracterizado porque comprende la etapa de transformar una cepa de M. hyopneumoniae mediante el uso de un vector portador que comprende al menos una secuencia exógena de ADN, estando la secuencia bajo el control de una secuencia de ADN de una región promotora de M. hyopneumoniae, 1. A method for preparing a mutant strain of Mycoplasma hyopneumoniae ( Mhyo), characterized in that it comprises the step of transforming a strain of M. hyopneumoniae by using a carrier vector that comprises at least one exogenous DNA sequence, the sequence being under control of a DNA sequence of a promoter region of M. hyopneumoniae, donde el vector portador es un vector plasmídico replicativo que comprende:where the carrier vector is a replicative plasmid vector comprising: 1) una secuencia de ADN que comprende la región oriC de una cepa de Mycoplasma sp., la cual es Mycoplasma hyopneumoniae, y1) a DNA sequence comprising the oriC region of a strain of Mycoplasma sp., which is Mycoplasma hyopneumoniae, and 2) una secuencia exógena de ADN que comprende un gen marcador y, opcionalmente, una secuencia exógena de ADN adicional, que están bajo control de una secuencia de ADN de una región promotora de Mhyo, donde la región promotora de Mhyo corresponde a un segmento de ADN que comprende entre 50 pares de bases y 300 pares de bases ubicadas en el lado 5' del gen de una proteína de Mhyo seleccionada del grupo formado por las proteínas P36, P46, P65, P76, P97, P102, P146 y P216,2) an exogenous DNA sequence comprising a marker gene and, optionally, an additional exogenous DNA sequence, which are under control of a Mhyo promoter region DNA sequence, wherein the Mhyo promoter region corresponds to a segment of DNA comprising between 50 base pairs and 300 base pairs located on the 5' side of the gene of a Mhyo protein selected from the group consisting of the P36, P46, P65, P76, P97, P102, P146 and P216 proteins, donde la región promotora de Mhyo inicia o promueve la transcripción de una secuencia de ADN de Mhyo, y donde la secuencia exógena de ADN se introduce de forma estable en el citosol de la cepa de Mhyo. where the Mhyo promoter region initiates or promotes the transcription of a Mhyo DNA sequence, and where the exogenous DNA sequence is stably introduced into the cytosol of the Mhyo strain. 2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia exógena de ADN se selecciona del grupo que comprende un gen de resistencia a un antibiótico, un gen que codifica una recombinasa, un fragmento de ADN procedente de Mhyo, un gen que codifica un componente antigénico de un microorganismo que provoca enfermedades porcinas, y combinaciones de los mismos.2. The method according to claim 1, characterized in that the exogenous DNA sequence is selected from the group comprising an antibiotic resistance gene, a gene encoding a recombinase, a DNA fragment from Mhyo, a gene that encodes an antigenic component of a microorganism that causes swine diseases, and combinations thereof. 3. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque la secuencia exógena de ADN adicional se selecciona del grupo formado por la secuencia de ADN que codifica la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 (CVP2) y la secuencia de ADN que codifica una proteína que comprende la proteína de la cápside del circovirus porcino de tipo 2 (CVP2) que porta adicionalmente los aminoácidos MetSerGlySer en el extremo N-terminal de dicha proteína, codificando dicha secuencia exógena de ADN adicional la proteína de la cápside de CVP2 que se selecciona del grupo formado por la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.The method according to any one of claims 1 or 2, characterized in that the additional exogenous DNA sequence is selected from the group consisting of the DNA sequence encoding the porcine circovirus type 2 (CVP2) capsid protein. and the DNA sequence encoding a protein comprising the porcine circovirus type 2 (CVP2) capsid protein additionally carrying the MetSerGlySer amino acids at the N-terminus of said protein, said additional exogenous DNA sequence encoding the protein of the CVP2 capsid that is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5. 4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la región promotora de Mhyo comprende la región promotora del gen de una proteína de Mhyo seleccionada del grupo formado por las proteínas P46 y P97.The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the Mhyo promoter region comprises the gene promoter region of a Mhyo protein selected from the group formed by the P46 and P97 proteins. 5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque la región promotora de Mhyo comprende la región promotora del gen de la proteína P46 de Mhyo. The method according to claim 4, characterized in that the Mhyo promoter region comprises the promoter region of the Mhyo P46 protein gene. 6. El método de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque la región promotora de Mhyo comprende la región promotora del gen de la proteína P97 de Mhyo. The method according to claim 4, characterized in that the Mhyo promoter region comprises the promoter region of the Mhyo P97 protein gene. 7. Un vector plasmídico replicativo, caracterizado porque comprende:7. A replicative plasmid vector, characterized in that it comprises: 1) una secuencia de ADN que comprende la región oriC de una cepa de Mycoplasma sp., que es Mycoplasma hyopneumoniae, y1) a DNA sequence comprising the oriC region of a strain of Mycoplasma sp., which is Mycoplasma hyopneumoniae, and 2) una secuencia exógena de ADN que comprende un gen marcador y, opcionalmente, una secuencia exógena de ADN adicional que está bajo el control de una secuencia de ADN de una región promotora de Mhyo, donde la región promotora de Mhyo corresponde a un segmento de ADN que comprende entre 50 pares de bases y 300 pares de bases ubicadas en el lado 5' del gen de una proteína de Mhyo seleccionada del grupo formado por las proteínas P36, P46, P65, P76, P97, P102, P146 y P216, y2) an exogenous DNA sequence comprising a marker gene and, optionally, an additional exogenous DNA sequence that is under the control of a Mhyo promoter region DNA sequence, wherein the Mhyo promoter region corresponds to a segment of DNA comprising between 50 base pairs and 300 base pairs located on the 5' side of the gene of a Mhyo protein selected from the group consisting of the P36, P46, P65, P76, P97, P102, P146 and P216 proteins, and donde la región promotora de Mhyo inicia o promueve la transcripción de una secuencia de ADN de Mhyo. 8. El vector plasmídico replicativo de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque la secuencia exógena de ADN adicional se selecciona del grupo formado por la secuencia que codifica la proteína de la cápside del circovirus porcino tipo 2 (CVP2) y la secuencia que codifica una proteína que comprende la proteína de la cápside del circovirus porcino tipo 2 (CVP2) que porta adicionalmente los aminoácidos MetSerGlySer en el extremo N-terminal de dicha proteína, seleccionándose dicha secuencia de ADN que codifica la proteína de la cápside del CVP2 del grupo formado por la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.wherein the Mhyo promoter region initiates or promotes the transcription of a Mhyo DNA sequence. 8. The replicative plasmid vector according to claim 7, characterized in that the additional exogenous DNA sequence is selected from the group formed by the sequence that encodes the capsid protein of porcine circovirus type 2 (CVP2) and the sequence that encodes a protein comprising the porcine circovirus type 2 (CVP2) capsid protein additionally carrying the MetSerGlySer amino acids at the N-terminus of said protein, said DNA sequence encoding the CVP2 capsid protein being selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5. 9. El vector plasmídico replicativo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque la región promotora de Mhyo comprende la región promotora del gen de una proteína de Mhyo seleccionada del grupo formado por las proteínas P46 y P97.9. The replicative plasmid vector according to any one of claims 7 or 8, characterized in that the promoter region of Mhyo comprises the promoter region of the gene of a Mhyo protein selected from the group formed by the P46 and P97 proteins. 10. Una cepa mutante de Mhyo, caracterizada porque comprende el vector plasmídico replicativo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.10. A mutant strain of Mhyo, characterized in that it comprises the replicative plasmid vector according to any one of claims 7 to 9. 11. Una vacuna para proteger a los cerdos frente a la neumonía enzoótica porcina provocada por Mhyo, y opcionalmente frente a otra enfermedad o afecciones patológicas adicionales que afectan a los cerdos, que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de la cepa mutante de Mhyo como se define en la reivindicación 10.11. A vaccine to protect pigs against Mhyo enzootic swine pneumonia, and optionally against additional other disease or pathological conditions affecting pigs, comprising an immunologically effective amount of the Mhyo mutant strain as defined in claim 10. 12. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizada porque la otra enfermedad o las afecciones patológicas adicionales que afectan a los cerdos están provocadas por un microorganismo, que se selecciona del grupo formado por Actinobacillus sp., Brachyspira sp., Pasteurella multocida, Salmonella sp., Streptococcus sp., Isospora sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Leptospira sp., Staphylococcus sp., Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Clostridium sp., Mycoplasma sp., Lawsonia intracellularis, Escherichia coli, virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino, virus de la gripe porcina, virus de la gastroenteritis transmisible, parvovirus porcino, virus de la encefalomiocarditis, coronavirus, rotavirus, circovirus porcino, agente del síndrome del fallo del desarrollo peridestete porcino, virus de la peste porcina clásica, virus de la peste porcina africana, calicivirus y torque teno virus (TTV).12. The vaccine according to claim 11, characterized in that the other disease or additional pathological conditions that affect pigs are caused by a microorganism, which is selected from the group consisting of Actinobacillus sp., Brachyspira sp., Pasteurella multocida, Salmonella sp., Streptococcus sp., Isospora sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Leptospira sp., Staphylococcus sp., Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Clostridium sp., Mycoplasma sp., Lawsonia intracellularis, Escherichia coli, porcine reproductive and respiratory syndrome virus , swine influenza virus, transmissible gastroenteritis virus, porcine parvovirus, encephalomyocarditis virus, coronavirus, rotavirus, porcine circovirus, porcine periweaning failure syndrome agent, classical swine fever virus, swine fever virus africana, calicivirus and torque tenovirus (TTV). 13. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizada porque la otra enfermedad o las afecciones patológicas adicionales que afectan a los cerdos están provocadas por circovirus porcino.The vaccine according to claim 12, characterized in that the other disease or additional pathological conditions affecting pigs are caused by porcine circovirus. 14. La vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizada porque comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente un adyuvante.14. The vaccine according to any one of claims 11 to 13, characterized in that it further comprises a pharmaceutically acceptable vehicle, and optionally an adjuvant. 15. Un kit de vacunación para vacunar cerdos frente a una infección o enfermedad provocada por Mhyo y opcionalmente frente a otra enfermedad o afecciones patológicas provocadas por microorganismos que afectan a los cerdos, que comprende un recipiente que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de la cepa mutante como se define en la reivindicación 10. 15. A vaccination kit for vaccinating pigs against an infection or disease caused by Mhyo and optionally against another disease or pathological conditions caused by microorganisms affecting pigs, comprising a container comprising an immunologically effective amount of the mutant strain as defined in claim 10.
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