KR102640730B1 - Novel vector for producing recombinant antigens related with porcine wasting disease and vaccine composition using the same - Google Patents
Novel vector for producing recombinant antigens related with porcine wasting disease and vaccine composition using the same Download PDFInfo
- Publication number
- KR102640730B1 KR102640730B1 KR1020230100515A KR20230100515A KR102640730B1 KR 102640730 B1 KR102640730 B1 KR 102640730B1 KR 1020230100515 A KR1020230100515 A KR 1020230100515A KR 20230100515 A KR20230100515 A KR 20230100515A KR 102640730 B1 KR102640730 B1 KR 102640730B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- delete delete
- vector
- group
- porcine
- pcv2d
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 99
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 64
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 63
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 63
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 53
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 22
- 208000010399 Wasting Syndrome Diseases 0.000 title claims description 11
- 241001673669 Porcine circovirus 2 Species 0.000 claims abstract description 55
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 claims abstract description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 241000202938 Mycoplasma hyorhinis Species 0.000 claims abstract description 9
- 241000202347 Porcine circovirus Species 0.000 claims abstract description 8
- 208000001572 Mycoplasma Pneumonia Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 201000008235 Mycoplasma pneumoniae pneumonia Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 241001670114 Porcine circovirus type 2-D Species 0.000 claims abstract 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 24
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 16
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 13
- 241000204045 Mycoplasma hyopneumoniae Species 0.000 claims description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 7
- 206010034674 peritonitis Diseases 0.000 claims description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 68
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 57
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 54
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 27
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 24
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 22
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 17
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 17
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 16
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 16
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 15
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 15
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 15
- 101100438229 Solanum tuberosum PCM4 gene Proteins 0.000 description 14
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 13
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 238000013461 design Methods 0.000 description 10
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 9
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 9
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 8
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 6
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 6
- 208000028489 postweaning multisystemic wasting syndrome Diseases 0.000 description 6
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 206010058556 Serositis Diseases 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 4
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 4
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 108010011170 Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly Proteins 0.000 description 3
- 241001533384 Circovirus Species 0.000 description 3
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 3
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 101710108331 Bifunctional oligoribonuclease and PAP phosphatase NrnA Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 2
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710189078 Helicase Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 208000029523 Interstitial Lung disease Diseases 0.000 description 2
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 2
- 238000012313 Kruskal-Wallis test Methods 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101710134502 Mgp-operon protein 3 Proteins 0.000 description 2
- 206010036141 Polyserositis Diseases 0.000 description 2
- 241000702619 Porcine parvovirus Species 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 2
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 2
- 210000003123 bronchiole Anatomy 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 101150069487 p65 gene Proteins 0.000 description 2
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 239000007160 ty medium Substances 0.000 description 2
- 208000016261 weight loss Diseases 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N (3-hexadecanoyloxy-2-hydroxypropyl) 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010068996 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase Proteins 0.000 description 1
- 208000035742 Air-borne transmission Diseases 0.000 description 1
- 101100437895 Alternaria brassicicola bsc3 gene Proteins 0.000 description 1
- 201000004813 Bronchopneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000589562 Brucella Species 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 208000005753 Circoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N D-alpha-tocopherylacetate Chemical compound CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 101710116034 Immunity protein Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000005119 Necrotizing Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 101150073872 ORF3 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 101100226891 Phomopsis amygdali PaP450-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011869 Shapiro-Wilk test Methods 0.000 description 1
- 101100038645 Streptomyces griseus rppA gene Proteins 0.000 description 1
- 102000008233 Toll-Like Receptor 4 Human genes 0.000 description 1
- 108010060804 Toll-Like Receptor 4 Proteins 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000005557 airborne transmission Effects 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 101150060238 bls gene Proteins 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002385 cottonseed oil Substances 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- ZAKOWWREFLAJOT-UHFFFAOYSA-N d-alpha-Tocopheryl acetate Natural products CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- -1 etc.) Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 201000007192 granulomatous hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 208000010758 granulomatous inflammation Diseases 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 208000018555 lymphatic system disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012543 microbiological analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 201000008383 nephritis Diseases 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000003950 pathogenic mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 210000002955 secretory cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 101150003509 tag gene Proteins 0.000 description 1
- 229940042585 tocopherol acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/0241—Mollicutes, e.g. Mycoplasma, Erysipelothrix
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/30—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycoplasmatales, e.g. Pleuropneumonia-like organisms [PPLO]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/22—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a Strep-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
- C07K2319/43—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a FLAG-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/10011—Circoviridae
- C12N2750/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Mycology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
본 발명은 최근 국내에 유행하는 돼지 써코바이러스 2d형 항원 및 과거부터 현재까지 질병을 일으키고 있는 돼지 써코바이러스 2a형 항원, 돼지 써코바이러스 2형의 세포성면역 재조합 단백질 및 돼지 마이코플라즈마폐렴을 일으키는 Mycoplasma hyopneuminiae의 p65 재조합단백질을 동시에 생산 가능한 벡터 및 상기 벡터로 제조된 4종의 항원, Mycoplasma hyopneuminiae 사균체, 및 Mycoplasma hyorhinis사균체를 포함하는 PCV2 및 마이코플라즈마에 대한 백신 및 이의 제작방법과 이의 용도에 관한 것이다. The present invention relates to the porcine circovirus type 2d antigen, which is recently prevalent in Korea, the porcine circovirus type 2a antigen, which has caused diseases from the past to the present, the cellular immune recombinant protein of porcine circovirus type 2, and Mycoplasma hyopneuminiae, which causes porcine mycoplasma pneumonia. It relates to a vector capable of simultaneously producing the p65 recombinant protein, four types of antigens produced with the vector, a vaccine against PCV2 and mycoplasma containing dead cells of Mycoplasma hyopneuminiae, and dead cells of Mycoplasma hyorhinis, and a method of producing the same and its use. .
Description
본 발명은 돼지 소모성 질병을 일으키는 써코바이러스 2d 및 2a 유전형 바이러스에 대한 재조합 VLP 항원, 돼지 써코바이러스 2형에 대한 세포성면역 단백질 및 돼지 유행성폐렴균의 표면 단백질을 포함하는 4종 단백질을 동시에 발현시킬 수 있는 항원 제조용 벡터 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 상기 항원 제조용 벡터로 제조된 4종의 항원 및 마이코플라즈마 2종의 사균체를 혼합한 돼지 소모성 질병의 예방 및 치료용 백신 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.The present invention can simultaneously express four types of proteins, including recombinant VLP antigens for circovirus 2d and 2a genotype viruses that cause porcine wasting disease, cellular immunity proteins for porcine circovirus type 2, and surface proteins of porcine epidemic pneumococci. It relates to a vector for producing an antigen and a method for producing the same. In addition, it relates to a vaccine composition for the prevention and treatment of porcine wasting disease, which is a mixture of four types of antigens and two types of mycoplasma dead cells prepared with the above antigen production vector, and a method for producing the same.
돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2: PCV2)은 Circoviridea (과), Circovirus (속)에 속하는 작고 외피가 없는 Circular single-stranded DNA 바이러스로 3개의 주요 ORFs (open reading frames)를 가지고 있다. Porcine circovirus type 2 (PCV2) is a small, non-enveloped, circular single-stranded DNA virus belonging to the Circoviridea (family) Circovirus (genus) and has three major ORFs (open reading frames).
PCV2 질병은 점진적인 체중감소, 호흡곤란, 빈혈, 설사 그리고 황달 등의 임상증상을 특징으로 하며 급성 발생의 경우 폐사율이 10%정도이나 심한 경우에는 50%까지 이른다. 부검소견으로는 림프절 종대, 육아종성 간염, 신장염, 간질성 폐렴 등이 관찰된다. PCV2는 이유자돈의 전신성 소모성 증후군(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS), 돼지 피부염 및 신증 증후군(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome), 돼지 호흡기 복합 감염증(Porcine respiratory disease complex) 및 번식장애와 관련되어 있다. 또한 이러한 질병과 증후군은 전 세계 양돈 산업 경제에 부정적인 영향을 미치며, 미국과 아시아에서는 돼지 써코바이러스 관련 질병(Porcine circovirus associated disease, PCVAD), 유럽에서는 돼지 써코바이러스 질병(Porcine circovirus disease, PCVD)으로 언급되고 있다. PCV2 disease is characterized by clinical symptoms such as gradual weight loss, difficulty breathing, anemia, diarrhea, and jaundice. In acute cases, the mortality rate is about 10%, but in severe cases it can reach 50%. Autopsy findings include lymphadenopathy, granulomatous hepatitis, nephritis, and interstitial pneumonia. PCV2 is associated with postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS), porcine dermatitis and nephropathy syndrome, porcine respiratory disease complex, and reproductive disorders in weaned piglets. Additionally, these diseases and syndromes have a negative impact on the global swine industry economy and are referred to as Porcine circovirus associated disease (PCVAD) in the United States and Asia and Porcine circovirus disease (PCVD) in Europe. It is becoming.
PCV2는 PCVAD의 1차적인 원인체로 주목받고 있으며, PCV2의 단독감염시에는 경미한 PMWS 증상을 나타내었으나 돼지 파보바이러스(porcine parvovirus, PPV)나 돼지 생식기 호흡기증후군 바이러스(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)를 PCV2와 동시감염 시켰을 때는 심각한 이유자돈의 전신성소모성증후군 (Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)과 거의 유사한 증상을 재현시킬 수 있음이 보고 되었으며, PCV2는 PMWS 외에도 증식성 괴사성 폐렴(proliferating and necrotizing pneumonia), 모돈의 유산 및 폐사증후군(sow abortion and mortality syndrome), 돼지 피부염 및 신증 증후군(porcine dermatitis and nephropathy syndrome)등 다양한 질병과의 연관성이 제기되고 있어, PCV2의 병원성에 대한 다양한 발병기전에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. PCV2 is attracting attention as the primary causative agent of PCVAD, and although PCV2 infection alone showed mild PMWS symptoms, porcine parvovirus (PPV) or porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) It has been reported that when co-infected with PCV2, symptoms almost similar to severe postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in weaned piglets can be reproduced. In addition to PMWS, PCV2 causes proliferating and necrotizing pneumonia, As associations with various diseases such as sow abortion and mortality syndrome and porcine dermatitis and nephropathy syndrome have been raised, research on various pathogenic mechanisms of PCV2 is being actively conducted. It's going on.
PCV2는 현재 8개의 주요 유전자형(PCV2a 내지 2h)으로 나뉘며, 이 중에서 PCV2d, PCV2a 및 PCV2b 유전형이 주요 병원성을 유발하고 있다. 한국과 미국 돼지에서 최근 주로 발생하는 병원성 유전형 타입은 PCV2d이며, 2010년부터 PCV2a도 지속적으로 병원성을 유발하고 있다. PCV2 is currently divided into eight major genotypes (PCV2a to 2h), of which PCV2d, PCV2a, and PCV2b genotypes cause major pathogenicity. The pathogenic genotype most commonly occurring recently in Korean and American pigs is PCV2d, and PCV2a has also continued to cause pathogenicity since 2010.
돼지마이코플라즈마성폐렴 (Mycoplasmal pneumoniae of swine: MPS)은 돼지에서 만성 호흡기성 유행성 폐렴으로 Mycoplasma hyopneumoniea (Mhp)에 의해 감염되며 돼지에 발생되는 세균성 호흡기 질병 가운데 가장 많이 볼 수 있는 질병이다. 양돈 사업이 발달된 국가에서 약 35∼50% 정도가 마이코플라즈마성 폐렴의 병변을 보이는 것으로 조사되었다. Mhp에 감염된 돼지는 지속적인 마른기침, 성장지연, 사료효율 저하, 면역억제 등의 특징을 보이며, 높은 발병률과 전이율을 보이는 반면, 폐사율은 매우 낮아 농가에 많은 경제적 피해를 끼치고 있다. 모든 연령에 걸쳐 발병을 보이며, 2차 감염에 대한 감수성을 증가시켜 다른 세균이나 바이러스와의 복합감염의 형태를 나타내고 있다. Mhp의 감염경로는 감염돈에 의한 공기 전파나, 감염된 동거돈에 의한 접촉감염으로 모돈 감염 시 자돈에게 쉽게 전파되고, 감염된 이유자돈이 농장에 새로 들어와 기존 농장을 감염시키는 경우가 전체 감염의 약 80% 정도를 차지하는 것으로 보고되었다. Mhp는 독자적으로 성장과 증식을 할 수 있는 가장 작은 세균으로 크기는 약 0.2∼0.5㎛이며, 종 특이성이 높고, 성장속도가 매우 느려 균의 분리동정 및 취급이 매우 까다로운 것으로 알려져 있다. Mycoplasmal pneumoniae of swine (MPS) is a chronic respiratory epidemic pneumonia in pigs caused by Mycoplasma hyopneumoniea (Mhp) and is the most common bacterial respiratory disease in pigs. In countries with developed pig farming, approximately 35 to 50% of pigs were found to have mycoplasmic pneumonia. Pigs infected with Mhp show characteristics such as persistent dry cough, growth retardation, reduced feed efficiency, and immunosuppression, and have a high incidence and metastasis rate, while the mortality rate is very low, causing a lot of economic damage to farms. It occurs at all ages, increases susceptibility to secondary infections, and presents a form of complex infection with other bacteria or viruses. The route of infection of Mhp is easily spread to piglets when sow is infected through airborne transmission by infected pigs or contact infection by infected cohabiting pigs. Approximately 80% of all infections occur when infected weaned piglets enter the farm and infect existing farms. It has been reported to account for approximately Mhp is the smallest bacterium that can grow and proliferate independently, with a size of approximately 0.2-0.5㎛, and is known to have high species specificity and a very slow growth rate, making isolation, identification and handling of the bacterium very difficult.
Mycoplasma hyorhinis (Mhr)는 Mhp와 유사하게 상기도에 colony를 형성하고, 감염된 돼지의 비강 및 편도선에 증식된다. 또한 Mhr은 돼지에서 다발성 장막염 원인균으로 알려져 있으나, 호흡기 질환의 징후를 보이는 돼지의 폐렴 병변에서도 자주 발견된다. Mhr은 호흡기를 통해 노출된 돼지에서 경미한 기관지 폐렴 또는 간질성 폐렴을 유발한다. Mhr의 감염은 Mhp와 마찬가지로 양돈사업의 경제적 손실로 이어지며, 양돈장에 위협이 되고 있다. PCV2와 M. hyorhinis 사이의 감염에 대한 상호작용은 Mhr 단독으로 감염된 돼지보다 더 심각한 폐 병변을 유도한다.Mycoplasma hyorhinis (Mhr), similar to Mhp, forms colonies in the upper respiratory tract and proliferates in the nasal cavity and tonsils of infected pigs. In addition, Mhr is known as the causative agent of polyserositis in pigs, but is also frequently found in pneumonia lesions in pigs showing signs of respiratory disease. Mhr causes mild bronchopneumonia or interstitial pneumonia in pigs exposed through the respiratory tract. Like Mhp, infection with Mhr leads to economic losses in the pig farming business and poses a threat to pig farms. The interaction between PCV2 and M. hyorhinis for infection leads to more severe lung lesions than pigs infected with Mhr alone.
본 발명자들은 돼지 써코바이러스 2형, 돼지 마이코플라즈마성 유행성 폐렴 및 복막염 질병으로 인하여 꾸준히 큰 피해를 입고 있는 농가에 대한 경제적 손실을 방지하고자 본 백신을 개발하게 되었다.The present inventors developed this vaccine to prevent economic losses to farmers who are continuously suffering great damage due to porcine circovirus type 2, porcine mycoplasma epidemic pneumonia and peritonitis diseases.
본 발명은 PCV2d, PCV2a, Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp)의 표면단백질 및 PCV2 세포성면역 펩타이드를 동시에 생산 가능한 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.The purpose of the present invention is to provide a vector capable of simultaneously producing PCV2d, PCV2a, surface proteins of Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp), and PCV2 cellular immune peptide.
또한 본 발명은 상기 벡터로 생산된 4종의 재조합 항원, Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp) 사균체 및 Mycoplasma hyorhinis (Mhr) 사균체를 동시에 포함하는 백신 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.Additionally, the present invention aims to provide a vaccine containing four types of recombinant antigens, Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp) dead cells and Mycoplasma hyorhinis (Mhr) dead cells simultaneously, produced using the above vector, and a method for producing the same.
본 발명은 또한 상기 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 돼지 써코바이러스 질병, 마이코플라즈마성 유행성 폐렴 및 마이코플라즈마성 복막염의 예방 및 치료 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for preventing and treating porcine circovirus disease, mycoplasmic epidemic pneumonia, and mycoplasmic peritonitis, comprising the step of administering the vaccine composition.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 벡터에 서열번호 22의 염기서열을 갖는 T7 terminator 및 서열번호 23의 염기서열을 갖는 multiple cloning site (MCS)를 삽입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터의 제조방법을 제공한다.The present invention is a vector comprising the step of inserting a T7 terminator with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22 and a multiple cloning site (MCS) with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 into a vector with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. Provides a manufacturing method.
일 실시태양에서, 상기 벡터는 서열번호 2의 염기서열을 가질 수 있다.In one embodiment, the vector may have the base sequence of SEQ ID NO: 2.
본 발명은 서열번호 2의 염기서열을 갖는 벡터에서 His tag를 HA tag, Strep tag 및 FLAG tag로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 변환시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터의 제조방법을 제공한다.The present invention provides a method for producing a vector comprising the step of converting the His tag in a vector having the base sequence of SEQ ID NO: 2 into one or more selected from the group consisting of HA tag, Strep tag, and FLAG tag.
일 실시태양에서, 상기 His tag는 서열번호 24의 염기서열을 가질 수 있다.In one embodiment, the His tag may have the base sequence of SEQ ID NO: 24.
일 실시태양에서, 상기 HA tag, Strep tag 및 FLAG tag는 각각 서열번호 3 내지 5의 염기서열을 가질 수 있다.In one embodiment, the HA tag, Strep tag, and FLAG tag may each have base sequences of SEQ ID NOs: 3 to 5.
일 실시태양에서, 상기 벡터는 서열번호 6 내지 8의 염기서열 중 하나를 가질 수 있다.In one embodiment, the vector may have one of the base sequences of SEQ ID NOs: 6 to 8.
본 발명은 서열번호 2, 및 6 내지 8의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 벡터에 서열번호 9 내지 13의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 벡터의 제조방법을 제공한다.The present invention is characterized in that it includes the step of introducing at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 9 to 13 into a vector selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2 and base sequences 6 to 8. Manufacturing method is provided.
일 실시태양에서, 상기 벡터는 서열번호 14의 염기서열을 가질 수 있다.In one embodiment, the vector may have the base sequence of SEQ ID NO: 14.
일 실시태양에서, 상기 제조방법은 서열번호 6의 염기서열을 갖는 벡터에 서열번호 10의 염기서열을 도입하는 단계를 포함할 수 있다.In one embodiment, the production method may include introducing the base sequence of SEQ ID NO: 10 into a vector having the base sequence of SEQ ID NO: 6.
일 실시태양에서, 상기 벡터는 서열번호 15의 염기서열을 가질 수 있다.In one embodiment, the vector may have the base sequence of SEQ ID NO: 15.
일 실시태양에서, 상기 제조방법은 서열번호 7의 염기서열을 갖는 벡터에 서열번호 11의 염기서열을 도입하는 단계를 포함할 수 있다.In one embodiment, the production method may include introducing the base sequence of SEQ ID NO: 11 into a vector having the base sequence of SEQ ID NO: 7.
일 실시태양에서, 상기 벡터는 서열번호 16의 염기서열을 가질 수 있다.In one embodiment, the vector may have the base sequence of SEQ ID NO: 16.
일 실시태양에서, 상기 제조방법은 서열번호 16의 염기서열을 갖는 벡터에 서열번호 12의 염기서열을 도입하는 단계를 포함할 수 있다.In one embodiment, the production method may include introducing the base sequence of SEQ ID NO: 12 into a vector having the base sequence of SEQ ID NO: 16.
일 실시태양에서, 상기 벡터는 서열번호 17의 염기서열을 가질 수 있다.In one embodiment, the vector may have the base sequence of SEQ ID NO: 17.
일 실시태양에서, 상기 제조방법은 서열번호 8의 염기서열을 갖는 벡터에 서열번호 13의 염기서열을 도입하는 단계를 포함할 수 있다.In one embodiment, the production method may include introducing the base sequence of SEQ ID NO: 13 into a vector having the base sequence of SEQ ID NO: 8.
일 실시태양에서, 상기 벡터는 서열번호 18의 염기서열을 가질 수 있다.In one embodiment, the vector may have the base sequence of SEQ ID NO: 18.
일 실시태양에서, 상기 벡터는 돼지 소모성 질병 관련 재조합 항원을 제조하기 위한 것을 특징으로 할 수 있다.In one embodiment, the vector may be used to produce a recombinant antigen related to swine wasting disease.
본 발명은 서열번호 15의 염기서열을 갖는 벡터에서 PCV2a 염기서열을 수득하는 단계; 및 서열번호 14의 염기서열을 갖는 벡터에 상기 PCV2a 염기서열을 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 벡터의 제조 방법을 제공한다.The present invention includes the steps of obtaining the PCV2a base sequence from a vector having the base sequence of SEQ ID NO: 15; and introducing the PCV2a base sequence into a vector having the base sequence of SEQ ID NO: 14.
일 실시태양에서, 상기 벡터는 서열번호 19의 염기서열을 갖고, PCV2a 및 PCV2d을 수득할 수 있다.In one embodiment, the vector has the base sequence of SEQ ID NO: 19, and PCV2a and PCV2d can be obtained.
본 발명은 서열번호 17의 염기서열을 갖는 벡터에서 T_ BLS 염기서열을 수득하는 단계; 및 서열번호 19의 염기서열을 갖는 벡터에 상기 T_ BLS 염기서열을 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 벡터의 제조 방법을 제공한다.The present invention includes the steps of obtaining a T_BLS base sequence from a vector having the base sequence of SEQ ID NO: 17; and introducing the T_BLS base sequence into a vector having the base sequence of SEQ ID NO: 19.
일 실시태양에서, 상기 벡터는 서열번호 20의 염기서열을 갖고, PCV2a, PCV2d 및 T_ BLS을 수득할 수 있다.In one embodiment, the vector has the base sequence of SEQ ID NO: 20 and can obtain PCV2a, PCV2d, and T_BLS.
본 발명은 서열번호 18의 염기서열을 갖는 벡터에서 p65 염기서열을 수득하는 단계; 및 서열번호 20의 염기서열을 갖는 벡터에 상기 p65 염기서열을 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 벡터의 제조 방법을 제공한다.The present invention includes the steps of obtaining a p65 base sequence from a vector having the base sequence of SEQ ID NO: 18; and introducing the p65 base sequence into a vector having the base sequence of SEQ ID NO: 20.
일 실시태양에서, 상기 벡터는 서열번호 21의 염기서열을 갖고, PCV2a, PCV2d, T_ BLS 및 p65을 수득할 수 있다.In one embodiment, the vector has the base sequence of SEQ ID NO: 21 and can obtain PCV2a, PCV2d, T_ BLS, and p65.
본 발명은 서열번호 2, 6 내지 8, 및 14 내지 21 중 어느 하나의 염기서열을 포함하는, 돼지 소모성 질병 관련 재조합 항원 제조용 벡터를 제공한다.The present invention provides a vector for producing a recombinant antigen related to swine wasting disease, comprising any one of the base sequences of SEQ ID NOs: 2, 6 to 8, and 14 to 21.
일 실시태양에서, 상기 벡터는 서열번호 19 내지 21 중 어느 하나의 염기서열을 포함할 수 있다.In one embodiment, the vector may include any one nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 19 to 21.
일 실시태양에서, 상기 벡터는 PCV2a 및 PCV2d를 제조할 수 있다.In one embodiment, the vector is capable of producing PCV2a and PCV2d.
일 실시태양에서, 상기 벡터는 서열번호 21의 염기서열을 포함할 수 있다.In one embodiment, the vector may include the base sequence of SEQ ID NO: 21.
일 실시태양에서, 상기 벡터는 PCV2a, PCV2d, T_ BLS 및 p65를 제조할 수 있다.In one embodiment, the vector is capable of producing PCV2a, PCV2d, T_BLS and p65.
본 발명은 상기 벡터로 제조된 멀티밸런트 펩타이드 (multivalent peptide)를 제공한다.The present invention provides a multivalent peptide produced using the above vector.
일 실시태양에서, 상기 멀티밸런트 펩타이드는 PCV2a, PCV2d, T_ BLS 및 p65로 이루어진 군에서 선택된 2 이상일 수 있다.In one embodiment, the multivalent peptide may be two or more selected from the group consisting of PCV2a, PCV2d, T_BLS, and p65.
본 발명은 상기 멀티밸런트 펩타이드를 포함하는 돼지 소모성 질병의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.The present invention provides a vaccine composition for preventing or treating porcine wasting disease, comprising the multivalent peptide.
일 실시태양에서, 상기 백신 조성물은 Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp) 균체 및 불활화 Mycoplasma hyorhinis(Mhr) 균체 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.In one embodiment, the vaccine composition may further include one or more of Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp) cells and inactivated Mycoplasma hyorhinis (Mhr) cells.
일 실시태양에서, 상기 백신 조성물은 면역증강제를 추가로 포함할 수 있다.In one embodiment, the vaccine composition may further include an adjuvant.
일 실시태양에서, 상기 백신 조성물은 돼지 써코바이러스 2형 감염증, 마이코플라즈마 폐렴 또는 마이코플라즈마 복막염을 예방 또는 치료할 수 있다.In one embodiment, the vaccine composition can prevent or treat porcine circovirus type 2 infection, mycoplasma pneumonia, or mycoplasma peritonitis.
본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 대장균을 제공한다.The present invention provides E. coli transformed with the above vector.
본 발명은 국내에서 발생하고 있는 돼지 써코바이러스 감염증 및 마이코플라즈마성 돼지 유행성폐렴 및 마이코플라즈마성 복막염에 대한 PCV2 항원, Mhp 항원 및 PCV2 세포성면역 펩타이드를 동시에 생산 가능한 벡터를 제조하고, 상기 벡터로 제조된 재조합 항원과 2종의 불활화 마이코플라즈마 균체를 혼합하여 백신을 제작하는 것에 관한 것이다. The present invention prepares a vector capable of simultaneously producing PCV2 antigen, Mhp antigen, and PCV2 cellular immune peptide for porcine circovirus infection, mycoplasmic porcine epidemic pneumonia, and mycoplasmic peritonitis occurring in Korea, and manufactures the vector using the vector. This relates to producing a vaccine by mixing a recombinant antigen and two types of inactivated mycoplasma cells.
상기의 제조방법으로 제조된 본 발명의 백신은 접종에 따른 세포성 및 체액성 면역반응을 유발시켰고, 야외 병원성 원인균에 대해 혈중 내 바이러스 혈증 감소 및 비강 내 마이코플라즈마 분포가 대조군에 비해 낮은 수준으로 유지되며, 또한 조직 내에서 심각한 병변을 유발하지 않는 것으로 확인되었다. The vaccine of the present invention manufactured by the above manufacturing method induced cellular and humoral immune responses upon inoculation, reduced viremia in the blood against field pathogenic bacteria, and maintained mycoplasma distribution in the nasal cavity at a lower level compared to the control group. It was also confirmed that it does not cause serious lesions within the tissue.
따라서, 본 발명의 백신은 돼지 써코바이러스 2형 감염증, 마이코플라즈마성 유행성폐렴 및 마이코플라즈마성 복막염에 대한 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.Therefore, the vaccine of the present invention can be usefully used for the prevention and treatment of porcine circovirus type 2 infection, mycoplasmic epidemic pneumonia, and mycoplasmic peritonitis.
도 1은 pHis-CS plasmid의 modified MCS cassette 구조를 나타낸 모식도이다.
도 2는 PCM 4B plasmid의 제작 과정에 대한 모식도이다.
도 3은 PCM 4B plasmid로 형질전환된 대장균에서 생산된 항원들의 western blot 실험 결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 5종의 백신 접종 후 시간 경과에 따른 PCV2 항체가 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 5종의 백신 접종 후 시간 경과에 따른 p65 항체가 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 2종의 백신 접종 후 시간 경과에 따른 IFN-γ 분비세포 수 변화를 나타낸 그래프이다 .Figure 1 is a schematic diagram showing the modified MCS cassette structure of pHis-CS plasmid.
Figure 2 is a schematic diagram of the production process of PCM 4B plasmid.
Figure 3 is a photograph showing the results of a western blot experiment of antigens produced in E. coli transformed with PCM 4B plasmid.
Figure 4 is a graph showing changes in PCV2 antibody titers over time after vaccination with five types of vaccines.
Figure 5 is a graph showing changes in p65 antibody titers over time after vaccination with five types of vaccines.
Figure 6 is a graph showing the change in the number of IFN-γ secreting cells over time after vaccination with two types of vaccines.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시태양 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시태양 및 실시예에 한정되지 않는다.Hereinafter, with reference to the attached drawings, embodiments and examples of the present invention will be described in detail so that those skilled in the art can easily implement the present invention. However, the present application may be implemented in various forms and is not limited to the embodiments and examples described herein.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.Throughout the specification of the present application, when a part "includes" a certain component, this means that it may further include other components rather than excluding other components unless specifically stated to the contrary.
본 발명에 사용된 용어 "PCV2"는 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2: PCV2)를 의미하며, Circoviridea (과), Circovirus (속)에 속하는 Circular single-stranded DNA 바이러스로 3개의 주요 ORFs(open reading frames)를 가지고 있으며, 점진적인 체중감소, 호흡곤란, 빈혈, 설사 및 황달 등의 임상증상을 특징으로 하는 PCV2 질병을 유발한다. The term "PCV2" used in the present invention refers to porcine circovirus type 2 (PCV2), a circular single-stranded DNA virus belonging to the Circoviridea (family) and Circovirus (genus), with three major ORFs ( It has open reading frames) and causes PCV2 disease, which is characterized by clinical symptoms such as gradual weight loss, dyspnea, anemia, diarrhea, and jaundice.
본 발명에 사용된 용어 "PCV2a"는 상기 PCV2의 주요 유전형 중 하나를 의미하며, 병원성을 가지고 있다. PCV2a 유전형의 바이러스는 2000년 초기부터 국내 돼지써코감염증의 주요 원인 유전자형으로 2007~2010년 PCV2a형에 대한 백신 사용 이후 감소하는 추세를 보이지만 여전히 현재까지 한국에서 낮은 빈도로 발생되고 있는 유전형의 바이러스이다. The term “PCV2a” used in the present invention refers to one of the major genotypes of PCV2 and is pathogenic. The PCV2a genotype virus has been the main causative genotype of porcine circulatory infection in Korea since the early 2000s, and although it has shown a decreasing trend since the use of vaccines against the PCV2a type from 2007 to 2010, it is still a genotype virus that occurs at low frequency in Korea.
본 발명에 사용된 용어 "PCV2d"는 상기 PCV2의 주요 유전형 중 하나를 의미하며, 병원성을 가지고 있다. PCV2d 유전형의 바이러스는 2007~2010년 PCV2a 유전형에 대한 백신 사용 이후 상대적을 PCV2a 유전형에 대한 질병이 감소된 반면 PCV2d 유전형에 대한 질병이 증가하는 추세로 최근 돼지써코감염증의 약 80% 이상이 PCV2d 유전형으로 확인되고 있다. The term “PCV2d” used in the present invention refers to one of the major genotypes of PCV2 and is pathogenic. Since the use of vaccines against the PCV2a genotype from 2007 to 2010, diseases against the PCV2d genotype have decreased, while diseases against the PCV2d genotype have been increasing. Recently, more than 80% of porcine circulatory infections have been attributed to the PCV2d genotype. It is being confirmed.
본 발명에 사용된 용어 "Mycoplasma hyopneumoniea"는 돼지마이코플라즈마성폐렴 (Mycoplasmal pneumoniae of swine: MPS)을 유발하는 세균으로, 돼지에서 만성 호흡기성 유행성 폐렴을 유발하며, "Mhp"로 지칭되기도 한다.The term "Mycoplasma hyopneumoniea" used in the present invention refers to a bacterium that causes Mycoplasmal pneumoniae of swine (MPS), which causes chronic respiratory epidemic pneumonia in pigs, and is also referred to as "Mhp".
본 발명에 사용된 용어 "Mycoplasma hyorhinis"는 Mhp와 유사하게 상기도에 colony를 형성하고, 감염된 돼지의 비강 및 편도선에 증식하는 세균이며, 돼지에서 다발성 장막염 및 관절염의 원인균으로 알려져 있으나, 호흡기 질환의 징후를 보이는 돼지의 병변에서도 자주 발견된다. The term "Mycoplasma hyorhinis" used in the present invention is a bacterium that forms colonies in the upper respiratory tract, similar to Mhp, and proliferates in the nasal cavity and tonsils of infected pigs. It is known as the causative agent of polyserositis and arthritis in pigs, but is also known as the cause of respiratory diseases. It is also frequently found in lesions of symptomatic pigs.
본 발명에 사용된 용어 "T세포 에피토프"는 PCV2 바이러스의 orf1 및 orf3 단백질 내 세포성면역과 관련된 단백질이며, "T cell epitope"로 지칭되기도 한다.The term “T cell epitope” used in the present invention is a protein related to cellular immunity within the orf1 and orf3 proteins of the PCV2 virus, and is also referred to as a “T cell epitope.”
본 발명에 사용된 용어 "BLS"는 Brucella lumazine synthase 단백질로서 면역시스템에서 Toll-like receptor 4를 자극하여 세포성면역 체계를 자극하는 면역증강물질로 보고되고 있다. The term "BLS" used in the present invention refers to the Brucella lumazine synthase protein and is reported to be an immune enhancing substance that stimulates the cellular immune system by stimulating Toll-like receptor 4 in the immune system.
본 발명에 사용된 용어 "T_BLS"는 PCV2 바이러스의 세포성면역 자극을 일으키는 orf1 및 orf3 단백질 일부와 BLS 단백질을 결합 단백질로서 PCV2에 대한 세포성면역 반응을 개선하기 위해 제작된 단백질이다. The term "T_BLS" used in the present invention is a protein that binds the BLS protein and parts of the orf1 and orf3 proteins that stimulate the cellular immunity of the PCV2 virus, and is a protein produced to improve the cellular immune response to PCV2.
본 발명에 사용된 용어 "벡터"는 숙주 세포 내에 1개 이상의 관심 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달할 수 있는, 바람직하게는 이를 발현시킬 수 있는 구축물을 의미할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜 내에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 특정 진핵 세포, 예를 들어 생산자 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.The term “vector” used in the present invention may refer to a construct capable of delivering, preferably expressing, one or more gene(s) or sequence(s) of interest into a host cell. For example, viral vectors, naked DNA or RNA expression vectors, plasmid, cosmid or phage vectors, DNA or RNA expression vectors associated with cationic condensing agents, DNA or RNA expression vectors encapsulated in liposomes, and certain eukaryotic cells. , including, but not limited to, producer cells.
본 발명의 백신 조성물은 임의의 적절한, 약학적으로 허용되는 제제로 제조될 수 있다. 예컨대 즉석 투여 용액 또는 현탁액 형태이거나, 투여 전 희석에 적절한 농축된 원액이거나, 또는 재구성 가능한 형태 예컨대 동결건조, 냉동 건조, 또는 냉동 제제 형태로 제조될 수 있다.The vaccine composition of the present invention may be prepared in any suitable, pharmaceutically acceptable formulation. For example, it may be in the form of a ready-to-administer solution or suspension, as a concentrated stock solution suitable for dilution prior to administration, or in a reconstituted form such as lyophilized, freeze-dried, or frozen preparations.
본 발명의 백신 조성물은 항원 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 항원 보조제는 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는 하나 이상의 물질로, 예를 들어, 완전 프로인트(Freund), 불완전 프로인트, 사포닌, 겔 성상의 알루미늄 보조제, 표면 활성 물질(예: 리소레시틴, 플루론 글리콜, 다중 음이온, 펩티드, 오일 또는 탄화수소 에멀젼 등), 식물성 오일(면실유, 땅콩유, 옥수수유 등), 비타민 E 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The vaccine composition of the present invention may further include an antigen adjuvant. An antigen adjuvant is one or more substances that enhance the immune response to an antigen, for example, complete Freund's, incomplete Freund's, saponin, gel-like aluminum adjuvant, surface-active substances (e.g., lysolecithin, pluronic It may be one or more selected from the group consisting of glycol, polyanion, peptide, oil or hydrocarbon emulsion, etc.), vegetable oil (cottonseed oil, peanut oil, corn oil, etc.), and vitamin E acetate, but is not limited thereto.
본 발명에 사용된 용어 "면역 반응"은 체액성 면역 반응, 세포성 면역 반응 또는 이들을 모두 포함하는 의미이다.As used herein, the term “immune response” refers to a humoral immune response, a cellular immune response, or both.
본 발명에 사용된 용어 "예방"은 조성물의 투여에 의해 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"는 조성물의 투여에 의해 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.As used in the present invention, the term "prevention" refers to any act of suppressing or delaying the onset of a disease by administering a composition, and "treatment" refers to improving or beneficially improving the symptoms of an individual suspected of having a disease or developing a disease by administering a composition. It means any action that changes.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.The present invention will be described in more detail through examples below. However, the examples below are for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the present invention.
[제조예 1][Production Example 1]
pHis-CS plasmid 제작Production of pHis-CS plasmid
하기 표 1의 서열번호 1의 염기서열을 갖는 pHis-parallel 1 plasmid (GenBank; AF097413)를 기반으로 하여, 2종 이상의 다양한 단백질 발현을 위해 신규한 plasmid를 합성하였고, 이를 "pHis-CS plasmid"로 명명하였다. Based on the pHis-parallel 1 plasmid (GenBank; AF097413) with the base sequence of SEQ ID No. 1 in Table 1 below, a new plasmid was synthesized for the expression of two or more various proteins, and it was named “pHis-CS plasmid”. It was named.
상기 pHis-CS plasmid의 서열은 하기 표 1의 서열번호 2의 서열을 갖는 것을 염기서열 분석을 통해 염기서열을 확인하였다. The base sequence of the pHis-CS plasmid was confirmed through base sequence analysis to have the sequence of SEQ ID No. 2 in Table 1 below.
상기 pHis-CS plasmid는 하기의 방법으로 제작하였다. 구체적으로, 기존 pHis-parallel 1 plasmid의 유전자에 다수의 항원 유전자를 삽입하기 위해 도 1에 나타낸 바와 같이, 기존 T7 terminator 앞부분에 상기 표 1에 나타낸 새로운 T7 terminator 서열 및 새로운 multiple cloning site (MCS)를 삽입하였다.The pHis-CS plasmid was produced by the following method. Specifically, as shown in Figure 1, in order to insert multiple antigen genes into the genes of the existing pHis-parallel 1 plasmid, a new T7 terminator sequence and a new multiple cloning site (MCS) shown in Table 1 above are added in front of the existing T7 terminator. inserted.
2종 이상의 다양한 단백질 발현을 위해서는 도 1에 제시된 NdeI에서 NotI 제한효소 부위까지 단백질 발현 유전자를 삽입한 후 다가(multivalent)의 단백질 발현을 위해 다른 단백질 발현 유전자(T7 promoter, 발현하고자 하는 유전자 그리고 T7 terminator 유전자 염기서열)를 이용하여 도 1에 제시된 KpnI 부터 XhoI 까지의 특정 제한효소 부위에 적합하게 in-fusion cloning 방법으로 제작한다. 예를 들어 In-Fusion Primer Design Tool(https://takara.teselagen.com/#/DesignPag)을 이용하여 in-fusion에 적합한 primer를 제작한 후, In-Fusion HD cloning kit를 이용하여 제시된 protodol에 따라 cloning을 실시하며, 2종 이상의 단백질을 발현하기 위해서는 추가 제작된 제한효소 부위(KpnI ~ XhoI 사이)에 순차적으로 적합한 primer를 제작한 후 2종 이상의 단백질 발현을 위한 유전자를 in-fusion 클로닝 할 수 있다. To express two or more diverse proteins, insert a protein expression gene from the NdeI to NotI restriction enzyme sites shown in Figure 1, and then insert another protein expression gene (T7 promoter, the gene to be expressed, and T7 terminator for multivalent protein expression). Gene base sequence) is used to produce an in-fusion cloning method suitable for specific restriction enzyme sites from KpnI to XhoI shown in Figure 1. For example, after creating a primer suitable for in-fusion using the In-Fusion Primer Design Tool ( https://takara.teselagen.com/#/DesignPag ), use the In-Fusion HD cloning kit to copy the suggested protodol. Cloning is performed accordingly, and in order to express two or more proteins, primers suitable for the additional restriction enzyme sites (between KpnI and there is.
[제조예 2][Production Example 2]
peptide tag가 치환된 plasmid 제작Production of plasmid with substituted peptide tag
제조예 1에서 제작된 pHis-CS plasmid의 His tag 염기서열을 다른 tag 서열로 치환하기 위해, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, HA (서열번호 3), Strep (서열번호 4) 및 FLAG (서열번호 5) tag의 유전자를 합성하였다. In order to replace the His tag base sequence of the pHis-CS plasmid produced in Preparation Example 1 with another tag sequence, HA (SEQ ID NO: 3), Strep (SEQ ID NO: 4), and FLAG (SEQ ID NO: 5) The tag gene was synthesized.
pHis-CS plasmid에서 His tag 염기서열이 각각 HA, Strep 및 FLAG tag로 치환된 플라스미스를 pHA-VT3, pStrep-VT4 및 pFLAG-VT1 plasmid라 명명하였다.In the pHis-CS plasmid, plasmids in which the His tag sequences were replaced with HA, Strep, and FLAG tags, respectively, were named pHA-VT3, pStrep-VT4, and pFLAG-VT1 plasmids.
상기 pHA-VT3 plasmid는 하기의 방법으로 제조하였다. pHis-CS plasmid에 제한효소인 NdeI 및 BamHI를 처리하여 pHis-CS plasmid를 선형화한 후, In-Fusion Primer Design Tool 로 primer를 제작한 후 PCR로 수득한 HA tag PCR product와 상기 선형화된 플라스미드를 사용하여 in-fusion cloning을 실시하였고, 최종적으로 pHA-VT3 플라스미드를 수득하였다.The pHA-VT3 plasmid was prepared by the following method. After linearizing the pHis-CS plasmid by treating it with restriction enzymes NdeI and BamHI, primers were prepared using the In-Fusion Primer Design Tool, and the HA tag PCR product obtained by PCR and the linearized plasmid were used. In-fusion cloning was performed, and finally pHA-VT3 plasmid was obtained.
상기 pStrep-VT4 plasmid는 하기의 방법으로 제조하였다. pHis-CS plasmid에 제한효소인 NdeI과 NcoI를 처리하여 pHis-CS plasmid를 선형화한 후, In-Fusion Primer Design Tool 로 primer를 제작한 후 PCR로 수득한 Strep tag PCR product와 상기 선형화된 플라스미드를 사용하여 in-fusion cloning을 실시하였고, 최종적으로 pStrep-VT4 플라스미드를 수득하였다.The pStrep-VT4 plasmid was prepared by the following method. After linearizing the pHis-CS plasmid by treating it with restriction enzymes NdeI and NcoI, primers were prepared using the In-Fusion Primer Design Tool, and the Strep tag PCR product obtained by PCR and the linearized plasmid were used. In-fusion cloning was performed, and pStrep-VT4 plasmid was finally obtained.
상기 pFLAG-VT1 plasmid는 하기의 방법으로 제조하였다. pHis-CS plasmid에 제한효소인 NdeI 및 BamHI를 처리하여 pHis-CS plasmid를 선형화한 후, In-Fusion Primer Design Tool 로 primer를 제작한 후 PCR로 수득한 FLAG tag PCR product와 상기 선형화된 플라스미드를 사용하여 in-fusion cloning을 실시하였고, 최종적으로 pFLAG-VT1 플라스미드를 수득하였다.The pFLAG-VT1 plasmid was prepared by the following method. After linearizing the pHis-CS plasmid by treating it with restriction enzymes NdeI and BamHI, primers were prepared using the In-Fusion Primer Design Tool, and the FLAG tag PCR product obtained by PCR and the linearized plasmid were used. In-fusion cloning was performed, and pFLAG-VT1 plasmid was finally obtained.
[제조예 3][Production Example 3]
pHis-VT2-PCV2d, pHA-VT3-PCV2a, pStrep-VT4-T_BLS 및 pFLAG-VT1-p65 plasmid 제작Construction of pHis-VT2-PCV2d, pHA-VT3-PCV2a, pStrep-VT4-T_BLS and pFLAG-VT1-p65 plasmids
pHis-VT2-PCV2d, pHA-VT3-PCV2a, pStrep-VT4-T_BLS 및 pFLAG-VT1-p65 plasmid를 제작하기 위하여, 코돈옵티마이저로 하기 표 4의 염기서열을 갖는 PCV2d orf2, PCV2a orf2, T-cell epitope peptide, BLS 및 p65의 유전자를 디자인한 후 합성하였다.To construct pHis-VT2-PCV2d, pHA-VT3-PCV2a, pStrep-VT4-T_BLS and pFLAG-VT1-p65 plasmids, Using a codon optimizer, genes for PCV2d orf2, PCV2a orf2, T-cell epitope peptide, BLS, and p65 with the base sequences shown in Table 4 below were designed and synthesized.
먼저, pHis-VT2-PCV2d plasmid를 하기의 방법으로 제작하였다. pHis-CS plasmid에 제한효소 BamHI과 NotI를 처리하여 선형화한 후, 합성한 PCV2d 유전자를 infusion primer design tool과 infusion cloning kit(In-fusion® HD cloning kit, TaKaRa)를 사용하여 프로토콜에 따라 선형화된 pHis-CS plasmid에 in-fusion하여 pHis-VT2-PCV2d plasmid (서열번호 14)를 제작하였다. First, pHis-VT2-PCV2d plasmid was produced by the following method. After linearizing the pHis-CS plasmid by treating it with restriction enzymes BamHI and NotI, the synthesized PCV2d gene was linearized according to the protocol using an infusion primer design tool and an infusion cloning kit (In-fusion® HD cloning kit, TaKaRa). -The pHis-VT2-PCV2d plasmid (SEQ ID NO: 14) was created by in-fusion with CS plasmid.
pHA-VT3 plasmid도 제한효소 BamHI과 NotI를 처리하여 선형화한 후, 합성한 PCV2a 유전자를 infusion primer design tool과 infusion cloning kit(In-fusion® HD cloning kit, TaKaRa)를 사용하여 상기 키트의 제조사 프로토콜대로 선형화된 pHA-VT3 plasmid에 in-fusion하여 pHA-VT3-PCV2a plasmid (서열번호 15)를 제작하였다. After linearizing the pHA-VT3 plasmid by treating it with restriction enzymes BamHI and NotI, the synthesized PCV2a gene was cloned using an infusion primer design tool and an infusion cloning kit (In-fusion® HD cloning kit, TaKaRa) according to the kit manufacturer's protocol. pHA-VT3-PCV2a plasmid (SEQ ID NO: 15) was produced by in-fusion with the linearized pHA-VT3 plasmid.
T_cell epitope peptide 염기서열의 말단에 linker (GGGSGGGS) 및 BamHI 제한효소의 인식서열인 GGATCC을 포함하게 디자인한 후, 상기 링커 및 인식서열이 포함된 T_cell epitope peptide 염기를 제작하였다. After designing the T_cell epitope peptide sequence to include a linker (GGGSGGGS) and the recognition sequence of BamHI restriction enzyme GGATCC at the end, a T_cell epitope peptide containing the linker and recognition sequence was produced.
pStrep-VT4 plasmid를 제한효소 NcoI으로 선형화한 후, 링커 및 인식서열이 포함된 상기 T_cell epitope 염기를 infusion primer design tool과 infusion cloning kit(In-fusion® HD cloning kit, TaKaRa)를 사용하여 상기 키트의 제조사 프로토콜대로 선형화된 pStrep-VT4 plasmid에 in-fusion하여 pStrep-VT4-T_cell epitope plasmid (서열번호 16)를 제작하였다. After linearizing the pStrep-VT4 plasmid with the restriction enzyme NcoI, the T_cell epitope base containing the linker and recognition sequence was cloned from the kit using an infusion primer design tool and an infusion cloning kit (In-fusion® HD cloning kit, TaKaRa). pStrep-VT4-T_cell epitope plasmid (SEQ ID NO: 16) was created by in-fusion with the linearized pStrep-VT4 plasmid according to the manufacturer's protocol.
이후 pStrep-VT4-T_cell_epitope plasmid를 제한효소 BamHI과 NotI으로 선형화한 후, 합성한 BLS 유전자를 infusion primer design tool과 infusion cloning kit(In-fusion® HD cloning kit, TaKaRa)를 사용하여 상기 키트의 제조사 프로토콜대로 선형화된 pStrep-VT4-T_cell_epitope plasmid에 in-fusion하여 pStrep-VT4-T_BLS plasmid (서열번호 17)를 제작하였다. Afterwards, the pStrep-VT4-T_cell_epitope plasmid was linearized with restriction enzymes BamHI and NotI, and then the synthesized BLS gene was used according to the manufacturer's protocol of the kit using the infusion primer design tool and infusion cloning kit (In-fusion® HD cloning kit, TaKaRa). pStrep-VT4-T_BLS plasmid (SEQ ID NO: 17) was created by in-fusion with the linearized pStrep-VT4-T_cell_epitope plasmid as described.
pFLAG-VT1 plasmid를 제한효소 BamHI과 NotI으로 선형화한 후, 합성한 p65 유전자를 Infusion primer design tool과 infusion cloning kit(In-fusion® HD cloning kit, TaKaRa)를 사용하여 상기 키트의 제조사 프로토콜대로 선형화된 pFLAG-VT1 plasmid에 in-fusion하여 pFLAG-VT1-p65 plasmid (서열번호 18)를 제작하였다.After linearizing the pFLAG-VT1 plasmid with restriction enzymes BamHI and NotI, the synthesized p65 gene was linearized using the Infusion primer design tool and infusion cloning kit (In-fusion® HD cloning kit, TaKaRa) according to the kit manufacturer's protocol. pFLAG-VT1-p65 plasmid (SEQ ID NO: 18) was created by in-fusion with pFLAG-VT1 plasmid.
상기 제작된 플라스미드를 하기 표 5에 나타내었다.The prepared plasmids are shown in Table 5 below.
[제조예 4][Production Example 4]
2가 내지 4가 플라스미드 제작Production of bivalent to quadrivalent plasmids
클로닝을 위해 pHis-VT2-PCV2d plasmid(서열번호 14)를 Kpnl 제한효소로 처리하여 pHis-VT2-PCV2d plasmid를 선형화하였다. 이후, pHA-VT3-PCV2a plasmid 내의 T7 promoter, PCV2a 유전자 및 T7 terminator 유전자를 포함한 영역에 대한 in-fusion primer를 제작하고 PCR을 진행하여 상기 영역의 PCR product를 수득하였다. 최종적으로, 상기 선형화된 pHis-VT2-PCV2d plasmid와 상기 pHA-VT3-PCV2a plasmid 일부 영역의 PCR product를 사용하여 in-fusion cloning을 실시하여 2종의 단백질을 각각 발현하는 PCM4 2B plasmid (서열번호 19)를 제작하였다.For cloning, the pHis-VT2-PCV2d plasmid (SEQ ID NO: 14) was treated with Kpnl restriction enzyme to linearize the pHis-VT2-PCV2d plasmid. Afterwards, in-fusion primers were prepared for the region containing the T7 promoter, PCV2a gene, and T7 terminator gene in the pHA-VT3-PCV2a plasmid, and PCR was performed to obtain the PCR product of the region. Finally, in-fusion cloning was performed using the linearized pHis-VT2-PCV2d plasmid and the PCR product of a partial region of the pHA-VT3-PCV2a plasmid to generate PCM4 2B plasmid (SEQ ID NO: 19) expressing two types of proteins, respectively. ) was produced.
이후, 클로닝을 진행하기 위해 PCM4 2B plasmid를 Sacl 제한효소로 처리하여 PCM4 2B plasmid를 선형화하였다. pStrep-VT4-T_BLS plasmid 내의 T7 promoter, T_BLS 유전자 및 T7 terminator 유전자를 포함한 영역에 대한 in-fusion primer를 제작하여 PCR을 진행하여 상기 영역의 PCR product를 수득하였다. 상기 선형화된 PCM4 2B plasmid와 상기 pStrep-VT4-T_BLS plasmid 일부 영역의 PCR product를 사용하여 in-fusion cloning을 실시하여 3종의 단백질을 각각 발현하는 PCM4 3B plasmid (서열번호 20)를 제작하였다. Afterwards, in order to proceed with cloning, the PCM4 2B plasmid was linearized by treating it with Sacl restriction enzyme. An in-fusion primer was created for the region containing the T7 promoter, T_BLS gene, and T7 terminator gene in the pStrep-VT4-T_BLS plasmid, and PCR was performed to obtain a PCR product for the region. In-fusion cloning was performed using the linearized PCM4 2B plasmid and a PCR product of a partial region of the pStrep-VT4-T_BLS plasmid to produce a PCM4 3B plasmid (SEQ ID NO: 20) expressing each of the three proteins.
이후, 클로닝을 진행하기 위해 PCM4 3B plasmid를 Spel 제한효소로 처리하여 PCM4 3B plasmid를 선형화하였다. in-fusion primer design tool을 이용하여 pFLAG-VT1-p65 plasmid 내의 T7 promoter, p65 유전자 및 T7 terminator 유전자를 포함한 영역에 대한 in-fusion primer를 제작하고, 상기 primer로 PCR을 진행하여 상기 영역의 PCR product를 수득하였다. 상기 선형화된 PCM4 3B와 상기 pFLAG-VT1-p65 plasmid 일부 영역의 PCR product를 사용하여 in-fusion cloning을 실시하여 4종의 단백질을 각각 발현하는 PCM4 4B plasmid (서열번호 21)를 제작하였다. Afterwards, in order to proceed with cloning, the PCM4 3B plasmid was linearized by treating it with Spel restriction enzyme. Using the in-fusion primer design tool, create an in-fusion primer for the region containing the T7 promoter, p65 gene, and T7 terminator gene in the pFLAG-VT1-p65 plasmid, and perform PCR with the primer to produce the PCR product of the region. was obtained. In-fusion cloning was performed using the linearized PCM4 3B and a PCR product of a partial region of the pFLAG-VT1-p65 plasmid to produce PCM4 4B plasmid (SEQ ID NO: 21) expressing each of the four proteins.
상기 제작 방법을 도 2에 간략하게 나타내고, 하기 표 6에 서열번호 19 내지 21의 염기서열을 나타내었다.The production method is briefly shown in Figure 2, and the base sequences of SEQ ID NOs: 19 to 21 are shown in Table 6 below.
[시험예 1][Test Example 1]
PCM4 4B plasmid를 이용한 4종 단백질 발현용 균체 제작 및 재조합항원 발현 확인Production of bacteria for expression of 4 types of proteins using PCM4 4B plasmid and confirmation of recombinant antigen expression
상기 4종 항원 발현용 PCM4 4B plasmid를 대장균(Escherichia coli) BL21(DE3) competent cell에 transformation 한 후 고체 LB-amp 배지에 도말하여 37도에서 16시간 배양하였다. 이후 상기 배지에서 colony를 수득한 후, 다시 LB-amp 액체 배지에 접종하여 37℃, 200rpm에서 14시간 진탕 배양하였다. 배양된 균체를 50% glycerol과 1:1로 혼합한 후 500ul씩 소분하여 -80℃에 보관하였다. The PCM4 4B plasmid for expressing the four types of antigens was transformed into Escherichia coli BL21(DE3) competent cells, plated on solid LB-amp medium, and cultured at 37 degrees for 16 hours. After obtaining colonies from the medium, they were again inoculated into LB-amp liquid medium and cultured with shaking at 37°C and 200 rpm for 14 hours. The cultured bacteria were mixed 1:1 with 50% glycerol, then divided into 500 ul portions and stored at -80°C.
동결 보존 중인 균주를 꺼내 상온에 녹인 후, LB-amp 배지에 0.1%(v/v)가 되도록 접종하여 37℃, 200rpm에서 약 12시간 배양하였다. 멸균된 TY배지(24g/L yeast extract, 12g/L bacto tryptone, 5g/L glycerol, 0.005% Antifoam 204)에 ampicillin 100㎍/mL를 첨가한 후 배양한 균을 5%(v/v)가 되도록 접종하여 37℃, 350rpm 조건으로 배양하였다. Fermentor 작동 시 pH 조건은 6.9∼7.3로 조정하고, aeration 조건은 압축 공기 유입량을 1.6vvm(air volume/medium volume/minute)으로 유지하여 균을 배양하였다. Fermentor에서 배양 4시간부터 균의 증식 정도를 30분 간격으로 무균적으로 채취하고 흡광도를 600nm에서 측정하였다. 측정된 값이 약 4.2~4.5이 되는 시점에서 Fermentor 배양온도를 27℃로 변경한 후 배양액의 온도가 27℃가 되는 시점에 최종 0.1mM이 되도록 IPTG를 첨가한 후, 27℃, 350rpm에서 약 7시간 추가 배양하였다.The strain in cryopreservation was taken out and thawed at room temperature, then inoculated into LB-amp medium at 0.1% (v/v) and cultured at 37°C and 200rpm for about 12 hours. Add 100㎍/mL of ampicillin to sterilized TY medium (24g/L yeast extract, 12g/L bacto tryptone, 5g/L glycerol, 0.005% Antifoam 204) and then culture the bacteria to 5% (v/v). Inoculated and cultured at 37°C and 350 rpm. When operating the fermentor, the pH condition was adjusted to 6.9-7.3, and the aeration condition was maintained at 1.6 vvm (air volume/medium volume/minute) to cultivate the bacteria. Starting from 4 hours of incubation in Fermentor, bacterial growth was aseptically collected at 30-minute intervals and absorbance was measured at 600 nm. When the measured value is about 4.2 to 4.5, the Fermentor culture temperature is changed to 27℃, and when the temperature of the culture medium reaches 27℃, IPTG is added to a final concentration of 0.1mM, and then at 27℃ and 350rpm, about 7℃. Additional time was cultured.
배양 종료된 E. coli 배양액을 8,000×g로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후 PBS로 희석하여 OD 600nm에서 50이 되도록 부유하였다. 부유액을 고압 파쇄기를 사용하여 1,250 bar (약 18,000psi)로 총 4회 반복 압력 파쇄하여 대장균으로부터 항원을 추출하였다. 파쇄 종료 후 파쇄액을 10,000×g에서 15분간 원심분리하고 상층액만 회수하고 0.8㎛ pore size의 depth filter로 여과한 후, 최종 0.45㎛ pore size의 필터로 여과한 후 4종의 발현된 단백질에 대해 western-blot을 진행하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.The cultured E. coli culture was centrifuged at 8,000 × g for 10 minutes to remove the supernatant, then diluted with PBS and suspended at OD 50 at 600 nm. The suspension was repeatedly pressure-disrupted at 1,250 bar (approximately 18,000 psi) four times using a high-pressure crusher to extract antigens from E. coli. After completion of lysis, the lysate was centrifuged at 10,000 Western-blot was performed on this and the results are shown in Figure 3.
도 3에 나타난 바와 같이, A)는 PCV2 polyclonal antibody(VMRD, PCV2 polyclonal antibody, Cat.No. PAB-PCV2)를 이용하여 진행된 western blot 결과 사진으로, 약 28kDa 밴드에서 PCV2d 단백질, 약 28.5kDa 밴드에서 PCV2a 단백질을 확인하였다. As shown in Figure 3, A) is a photograph of the western blot results performed using PCV2 polyclonal antibody (VMRD, PCV2 polyclonal antibody, Cat. No. PAB-PCV2). PCV2d protein in the approximately 28 kDa band and PCV2d protein in the approximately 28.5 kDa band. PCV2a protein was identified.
6xHis monoclonal antibody (TaKaRa, anti-6xHis monoclonal antibody, Cat.No. 631212)를 이용하여 western blot을 진행하여, 도 3의 B)에서 나타낸 바와 같이, PCV2d 단백질을 확인하였다. Western blot was performed using 6xHis monoclonal antibody (TaKaRa, anti-6xHis monoclonal antibody, Cat. No. 631212), and PCV2d protein was confirmed, as shown in Figure 3B).
HA monoclonal antibody (Abcam, anti-HA monoclonal antibody, Cat.No. ab18181)를 이용하여 western blot을 진행하여, 도 3의 C)에서 나타낸 바와 같이, PCV2a 단백질을 확인하였다. Western blot was performed using HA monoclonal antibody (Abcam, anti-HA monoclonal antibody, Cat.No. ab18181), and PCV2a protein was confirmed, as shown in Figure 3C).
Strep monoclonal antibody (IBA Lifescience, StrepMAB classic, Cat.No. 2-1507-001)를 이용하여 western blot을 진행하여, 도 3의 D)에서 나타낸 바와 같이, T_BLS 단백질(약 33.7kDa)을 확인하였다. Western blot was performed using Strep monoclonal antibody (IBA Lifescience, StrepMAB classic, Cat.No. 2-1507-001), and T_BLS protein (about 33.7kDa) was confirmed, as shown in Figure 3D).
Mhp p65 monoclonal antibody (ID Screen® Mycoplasma hyopneumoniae Competition kit, “Ready to use conjugate 1X”, ID Vet, Cat. No. 5112-009)를 이용하여 western blot을 진행하여, 도 3의 E)에서 나타낸 바와 같이, p65 단백질(약 78kDa)을 확인하였다.Western blot was performed using Mhp p65 monoclonal antibody (ID Screen® Mycoplasma hyopneumoniae Competition kit, “Ready to use conjugate 1X”, ID Vet, Cat. No. 5112-009), as shown in Figure 3E). , p65 protein (about 78 kDa) was confirmed.
FLAG monoclonal antibody (Abcam, anti-DDDDK tag antibody, Cat.No. ab125243) 를 이용하여 western blot을 진행하였다. 도 3의 F)에서 나타낸 바와 같이, 상기 도 3의 F)와 동일한 위치에서 p65 단백질(약 78kDa)을 확인하였다. Western blot was performed using FLAG monoclonal antibody (Abcam, anti-DDDDK tag antibody, Cat.No. ab125243). As shown in Figure 3F), p65 protein (about 78 kDa) was confirmed at the same location as Figure 3F).
상기 시험예 1의 결과들을 통해, 본원발명의 PCM 4B plasmid는 안정적으로 4종의 항원을 발현시킬 수 있음을 확인하였다.Through the results of Test Example 1, it was confirmed that the PCM 4B plasmid of the present invention can stably express four types of antigens.
[시험예 2][Test Example 2]
PCV2d, PCV2a, PCM4 2B(PCV2d+PCV2a), T_BLS 및 p65 재조합 항원에 대한 면역원성 평가Immunogenicity evaluation for PCV2d, PCV2a, PCM4 2B (PCV2d+PCV2a), T_BLS and p65 recombinant antigens
pHis-VT2-PCV2d, pHA-VT3-PCV2a, pStrep-VT4-T_BLS, pFLAG-VT1-p65 및 PCM4 2B plasmid를 대장균 BL21(DE3) competent cell에 각각 transformation 한 후 고체 LB-amp 배지에 도말하여 37도에서 16시간 배양하였다. 이후 상기 배지에서 colony를 수득한 후, 다시 LB-amp 액체 배지에 접종하여 37℃, 200rpm에서 14시간 진탕 배양하였다. 배양된 균체를 50% glycerol과 1:1로 혼합한 후 500ul씩 소분하여 -80℃에 보관하였다. pHis-VT2-PCV2d, pHA-VT3-PCV2a, pStrep-VT4-T_BLS, pFLAG-VT1-p65 and PCM4 2B plasmids were each transformed into E. coli BL21(DE3) competent cells and then plated on solid LB-amp medium at 37 degrees. was cultured for 16 hours. After obtaining colonies from the medium, they were again inoculated into LB-amp liquid medium and cultured with shaking at 37°C and 200 rpm for 14 hours. The cultured bacteria were mixed 1:1 with 50% glycerol, then divided into 500 ul portions and stored at -80°C.
서로 다른 5종의 BL21(DE3) 동결 균주를 LB-amp 액체배지에 0.1%(v/v)가 되도록 접종하여 37℃, 200rpm에서 약 12시간 배양하였다. 배양한 각각의 균을 LB-amp 배지에 0.1%(v/v)가 되도록 접종하여 37℃, 200rpm에서 약 12시간 배양하였다. 멸균한 TY배지(24g/L yeast extract, 12g/L bacto tryptone, 5g/L glycerol, 0.005% Antifoam 204)에 멸균 후 ampicillin 100㎍/mL 첨가 후 배양한 균을 5%(v/v)가 되도록 접종하여 37℃, 350rpm 조건으로 배양하였다. Fermentor 작동 시 pH 조건은 6.9∼7.3로 조정하고, aeration 조건은 압축 공기 유입량을 1.6vvm(air volume/medium volume/minute)으로 유지하여 균을 배양하였다. Fermentor에서 배양 4시간 후부터 균의 증식정도를 30분 간격으로 무균적으로 채취하고 흡광도를 600nm에서 측정하였다. 측정된 값이 약 4.2~4.5이 되는 시점에서 fermentor 배양액의 온도를 27℃로 변경한 후 배양액의 온도가 27℃가 되는 시점에 최종 0.1mM이 되도록 IPTG를 첨가한 후, 27℃, 350rpm에서 약 7시간 추가 배양하였다. Five different frozen strains of BL21 (DE3) were inoculated into LB-amp liquid medium at a concentration of 0.1% (v/v) and cultured at 37°C and 200 rpm for about 12 hours. Each cultured bacteria was inoculated into LB-amp medium at a concentration of 0.1% (v/v) and cultured at 37°C and 200 rpm for about 12 hours. After sterilizing the TY medium (24g/L yeast extract, 12g/L bacto tryptone, 5g/L glycerol, 0.005% Antifoam 204), add 100㎍/mL ampicillin and culture the bacteria to 5% (v/v). Inoculated and cultured at 37°C and 350 rpm. When operating the fermentor, the pH condition was adjusted to 6.9-7.3, and the aeration condition was maintained at 1.6 vvm (air volume/medium volume/minute) to cultivate the bacteria. After 4 hours of incubation in Fermentor, the degree of bacterial growth was aseptically collected at 30-minute intervals and absorbance was measured at 600 nm. When the measured value reaches about 4.2 to 4.5, the temperature of the fermentor culture medium is changed to 27℃. When the temperature of the culture medium reaches 27℃, IPTG is added to a final concentration of 0.1mM, and then the temperature is adjusted to about 27℃ at 350 rpm. The culture was continued for an additional 7 hours.
배양 종료된 각 대장균 배양액을 8,000×g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후 PBS로 희석하여 OD 600nm에서 50이 되도록 부유하였다. 부유액을 고압 파쇄기를 사용하여 1,250 bar(약 18,000psi)로 총 4회 반복 압력 파쇄하여 5종의 E. coli로부터 항원을 추출하였다. 파쇄 종료 후 파쇄액을 10,000×g에서 15분간 원심분리하고 상층액만 회수하고 0.8㎛ pore size의 depth filter로 여과한 후, 최종 0.45㎛ pore size의 필터로 여과하여 5종의 서로 다른 균체로부터 각각의 항원을 추출하였다. 추출된 서로 다른 5종의 항원조성에 대하여 12%의 면역증강제 (MVP adjuvant, Emulcigen-BCL)를 포함시켜 표 7와 같이 백신(2ml/두)을 제작하였다.After the culture was completed, each E. coli culture was centrifuged at 8,000 × g for 10 minutes to remove the supernatant, then diluted with PBS and suspended to an OD of 50 at 600 nm. The suspension was pressure-disrupted a total of four times at 1,250 bar (approximately 18,000 psi) using a high-pressure disruptor to extract antigens from five types of E. coli. After completion of crushing, the crushing liquid was centrifuged at 10,000 Antigens were extracted. A vaccine (2ml/head) was prepared by including 12% of the adjuvant (MVP adjuvant, Emulcigen-BCL) for the five different antigen compositions extracted, as shown in Table 7.
표 7에 나타낸 바와 같이, 제작된 5종의 백신을 이용하여 3∼4 주령 자돈 3~4두에 2.0mL씩 이근부, 그리고 음성대조군에는 PBS를 3∼4주령 자돈의 이근부에 2.0mL씩 근육 주사를 실시하였다. 백신 접종 전 및 백신 접종 후 3주와 5주에 채혈을 실시하여 혈청을 분리한 후 ELISA 항체가 검사를 실시하였으며, 그룹 3과 4에서는 혈액으로부터 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 분리하여 세포성면역 개선 효과를 평가하였다. PCV2 ELISA 항체가는 PCV2 (Porcine Circovirus type 2 Antibody Test, BioChek B.V., Reeuwijk, Holland) 키트를 이용하여 PCV2 항체 여부를 확인하고, Mhp의 p65 항원에 대한 ELISA 항체는 ID Screen® Mycoplasma hyopneumoniae Competition ELISA(ID.Vet, ELISA 판정 기준; 양성: 
PCV2 항체진단키트를 이용하여 항체가를 측정한 결과를 도 4 및 표 8에 나타내었다.The results of measuring antibody titers using the PCV2 antibody diagnostic kit are shown in Figure 4 and Table 8.
상기 표 8에 나타낸 바와 같이, 그룹 1 내지 4에서 백신접종 3주째부터 항체가가 양성으로 관찰되었으며, 백신 접종 후 5주까지 항체가가 상승하는 것을 확인하였다. As shown in Table 8 above, positive antibody titers were observed from the 3rd week of vaccination in groups 1 to 4, and the antibody titer was confirmed to increase up to 5 weeks after vaccination.
또한, 그룹 1(PCV2d 백신) 및 그룹 2(PCV2a 백신)의 서로 다른 항원에 대해서 PCV2 항체진단 키트를 이용하여 항체가를 비교하였으나, 두 그룹 간 항체형성 우월에 대한 상대적인 유의성을 관찰할 수 없었다. In addition, antibody titers were compared using a PCV2 antibody diagnostic kit for different antigens in Group 1 (PCV2d vaccine) and Group 2 (PCV2a vaccine), but the relative significance of superiority in antibody formation between the two groups could not be observed.
단일항원(그룹 1 및 그룹 2), 2가(그룹 3), 및 3가(그룹 4) 항원 백신 그룹 간 PCV2 항체가를 조사한 결과, 다가 항원 백신 그룹(그룹 3 및 그룹 4)은 PCV2에 대한 항체 형성이 단일항원 백신과 유사한 것을 확인하였다. 그러나, p65(그룹 5) 및 대조군(그룹 6)은 PCV2에 대한 항체형성이 관찰되지 않았다. As a result of examining the PCV2 antibody titers among the single-antigen (Group 1 and Group 2), bivalent (Group 3), and trivalent (Group 4) antigen vaccine groups, the multivalent antigen vaccine group (Group 3 and Group 4) had It was confirmed that antibody formation was similar to that of single antigen vaccine. However, no antibody formation against PCV2 was observed in p65 (Group 5) and the control group (Group 6).
따라서, 백신 내 재조합 항원의 종류가 증가하더라도 PCV2에 대한 면역원성에서는 크게 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있다.Therefore, it can be seen that even if the type of recombinant antigen in the vaccine increases, the immunogenicity against PCV2 is not significantly affected.
돼지유행성폐렴을 예방하기 위해 Mhp의 p65 항원에 대한 상업적 항체진단키트(ID Vet)를 이용하여 항체가를 측정한 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, Mhp-p65 백신을 접종 한 그룹(그룹 5)은 다른 그룹과 비교 시, 백신 접종 3주부터 Mhp에 대한 면역원성이 관찰되었고(S/N ratio, 33.15±3.97), 백신 접종 후 5주차에는 항체가가 추가적으로 상승된 것을 관찰하였다(S/N ratio, 25.71±2.47).The results of measuring the antibody titer against the Mhp p65 antigen using a commercial antibody diagnostic kit (ID Vet) to prevent porcine epidemic pneumonia are shown in Figure 5. As shown in Figure 5, compared to the other groups in the group vaccinated with Mhp-p65 vaccine (group 5), immunogenicity against Mhp was observed starting 3 weeks after vaccination (S/N ratio, 33.15 ± 3.97); At 5 weeks after vaccination, an additional increase in antibody titer was observed (S/N ratio, 25.71±2.47).
따라서, Mhp 표면항원 재조합 단백질인 p65는 유행성폐렴을 예방하는 데 있어, Mhp에 대한 항체를 형성시킬 수 있으므로, 백신으로서의 가치가 있다는 것을 입증하였다.Therefore, it has been proven that p65, a recombinant Mhp surface antigen protein, is valuable as a vaccine because it can form antibodies against Mhp in preventing epidemic pneumonia.
PCV2에 대한 세포성면역 결과를 분석하기 위해, 상기 표 8의 그룹 3, 그룹 4 및 그룹 6에서 혈액을 채취하고, 상기 혈액에서 lymphocyte separation 시약을 이용하여 PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell)를 분리한 후 상기 세포에서 세포성면역능을 평가하였다. 우선 PBMC를 5.0×106.0cells/mL 농도로 준비한 후, Porcine IFN-gamma ELISpot Kit(R&D Systems, Inc.)의 프로토콜대로 IFN-γ 분비세포 수 측정을 진행하였다. 각 PBMC 세포에 대한 stimulator는 orf1 및 orf3 T-cell epitope peptide(각 peptide 당 20㎍/mL)를 사용하였고, 상기 자극제로 PBMC를 자극하였다. To analyze the results of cellular immunity against PCV2, blood was collected from groups 3, 4, and 6 in Table 8, and PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cell) was separated from the blood using a lymphocyte separation reagent. Cellular immunity was evaluated in the cells. First, PBMCs were prepared at a concentration of 5.0 orf1 and orf3 T-cell epitope peptides (20 μg/mL for each peptide) were used as stimulators for each PBMC cell, and PBMC were stimulated with the above stimulators.
그룹 3 및 그룹 4의 경우 백신접종 후 3주부터 세포성 면역 자극이 관찰되었지만, 백신접종 5주 후 그룹 3의 인터페론 감마 분비세포 수(21.88±9.30) 보다 T_BLS 항원이 포함된 그룹 4의 인터페론 감마 분비세포 수(36.38±10.47)가 유의수준 5% 이내 보다 약간 높은 p값 0.08로 차이가 나타났다. 평균값으로는 T_BLS 항원이 포함된 개체에서 세포성면역 자극이 도 6 및 표 9에 나타난 바와 같이, 약 1.7배 향상된 것을 확인할 수 있었다. 이 결과를 바탕으로 PCV2 백신의 세포성면역능을 개선시키고자 T_BLS 항원을 백신 조성에 포함시켰다. In groups 3 and 4, stimulation of cellular immunity was observed starting 3 weeks after vaccination, but 5 weeks after vaccination, the number of interferon gamma-secreting cells in group 4 containing the T_BLS antigen was higher than that of group 3 (21.88±9.30). There was a difference in the number of secretory cells (36.38 ± 10.47) with a p value of 0.08, slightly higher than the significance level of 5%. As an average value, it was confirmed that cellular immune stimulation in individuals containing the T_BLS antigen was improved by about 1.7 times, as shown in Figure 6 and Table 9. Based on these results, T_BLS antigen was included in the vaccine composition to improve the cellular immunity of the PCV2 vaccine.
[시험예 3][Test Example 3]
제작된 PCM4 백신에 대한 유효성 평가Efficacy evaluation of the produced PCM4 vaccine
상기 PCM 4B plasmid를 사용하여 제조된 재조합 항원 4종 및 2종의 마이코플라즈마 균체항원(Mhp 및 Mhr)을 이용하여 표 10의 조성으로 백신을 제작한 후, 3주령 자돈 이근부에 2.0mL씩 근육 접종하였다. 양성 대조군(백신 미접종 후 공격접종)과 음성 대조군(백신 및 병원성 균주 미접종)에는 PBS를 2.0mL씩 접종하였다.After producing a vaccine with the composition shown in Table 10 using four types of recombinant antigens and two types of mycoplasma antigens (Mhp and Mhr) prepared using the PCM 4B plasmid, inoculate 2.0 mL each intramuscularly into the ear root of 3-week-old piglets. did. The positive control group (unvaccinated and then challenged) and the negative control group (unvaccinated and non-vaccinated with pathogenic strains) were inoculated with 2.0 mL of PBS.
* Mhp 및 Mhr의 pp는 Sartorius virus counter 장비로 측정한 protein particles 측정 수치임* pp of Mhp and Mhr are protein particles measurement values measured with Sartorius virus counter equipment.
백신접종 3주 후, 각 그룹별로 각기 야외 병원성 균주인 PCV2d형 바이러스(그룹 1), PCV2a형 바이러스 (그룹 2), Mycoplasma hyopneumoniae (그룹 3) 및 Mycoplasma hyorhinis와 PCV2d형 바이러스 (그룹 4)로 공격접종을 실시하였으며, 백신접종부터 공격접종 후 3주까지 항체가, 공격접종에 따른 임상증상 및 병리조직학적 병변까지 비교 평가하였다.Three weeks after vaccination, each group was challenged with the field pathogenic strains PCV2d virus (group 1), PCV2a virus (group 2), Mycoplasma hyopneumoniae (group 3), and Mycoplasma hyorhinis and PCV2d virus (group 4). was conducted, and antibody titers, clinical symptoms and histopathological lesions following the challenge were compared and evaluated from vaccination to three weeks after challenge.
공격접종용 PCV2d(strain SNUVR202003: d형 타입, GenBank no. MZ440695)와 PCV2a(strain SNUVR000032: a형 타입, GenBank no. KF871067)는 1.2×105.0TCID50/mL으로 준비하여 백신접종 3주 후인 6주령 시점에 3.0mL을 비강에 접종하였다. Mhp는 1×107.0 color changing units(CCU)/mL 농도로 7.0mL을 기관지 내 접종(intratracheal inoculation)을 실시하였다. Mhr은 1.0×109.0 color changing units(CCU)/mL 농도로 4.0mL을 복강내(intraperitoneal)와 기관내(intratracheal)로 각각 2.0mL씩 접종하였다. PCV2d (strain SNUVR202003: type d type, GenBank no. MZ440695) and PCV2a (strain SNUVR000032: type a type, GenBank no. KF871067) for challenge vaccination were prepared at 1.2 × 10 5.0 TCID 50 /mL and administered at 6 days after vaccination. At 1 week of age, 3.0 mL was inoculated into the nasal cavity. 7.0 mL of Mhp was administered by intratracheal inoculation at a concentration of 1 × 10 7.0 color changing units (CCU)/mL. 4.0 mL of Mhr was inoculated intraperitoneally and intratracheally at a concentration of 1.0
임상증상은 Jeong et al(Vet Microbiol 177: 43-52, 2015) 문헌을 참고로 임상지수를 0 ~ 6으로 구분하여 측정하였다. 채취한 혈액을 이용하여 PCV2에 대한 특이적인 항체는 상업화된 ELISA kit(Porcine Circovirus type 2 Antibody Test, BioCheck, B.B., Reeuwijk, Holland)를 그리고 혈액의 PCV2에 대한 특이적인 중화항체 검사는 Seo et al(Vaccine 30:6671-6677, 2012) 문헌에 따라 수행하였다. PCV2 및 마이코플라즈마 특이적인 INF-γ 분비세포 측정법은 Seo et al(Vet Res 45:13, 2014) 문헌에 따라 실시하였다. 채취한 혈액의 Mhp에 대한 특이적인 항체는 상용화된 ID Screen® Mycoplasma hyopneumoniae Competition ELISA(ID.Vet)으로 측정하였다. 채취한 혈액의 M. hyorhinis에 대한 특이적인 항체는 ㈜케어사이드에서 자체 제작한 in-house ELISA 키트를 이용하여 측정하였다. PCV2d에 대한 Real time PCR은 Jeong et al(Vet Microbiol 177: 43-52, 2015) 문헌에 따라 수행하였다. PCV2a에 대한 Real time PCR은 Gagnon et al(J Vet Diagn Invest 20:545-558, 2008) 문헌에 따라 수행하였다. Mhp에 대한 Real time PCR은 Marois et al(J Appl Microbiol 108: 1523-1533, 2010) 문헌에 따라 수행하였다. Mhr에 대한 Real time PCR은 Clavijo et al(J Vet Diagn invest 26:755-760, 2014) 문헌에 따라 수행하였다. Clinical symptoms were measured with a clinical index ranging from 0 to 6, referring to Jeong et al (Vet Microbiol 177: 43-52, 2015). Using collected blood, specific antibodies against PCV2 were tested using a commercial ELISA kit (Porcine Circovirus type 2 Antibody Test, BioCheck, B.B., Reeuwijk, Holland), and specific neutralizing antibodies against PCV2 in blood were tested by Seo et al ( Vaccine 30:6671-6677, 2012) was performed according to the literature. The measurement method for PCV2 and mycoplasma-specific INF-γ secreting cells was performed according to Seo et al (Vet Res 45:13, 2014). Specific antibodies against Mhp in the collected blood were measured using the commercially available ID Screen® Mycoplasma hyopneumoniae Competition ELISA (ID.Vet). Specific antibodies against M. hyorhinis in the collected blood were measured using an in-house ELISA kit produced by Careside Co., Ltd. Real time PCR for PCV2d was performed according to Jeong et al (Vet Microbiol 177: 43-52, 2015). Real time PCR for PCV2a was performed according to Gagnon et al (J Vet Diagn Invest 20:545-558, 2008). Real time PCR for Mhp was performed according to Marois et al (J Appl Microbiol 108: 1523-1533, 2010). Real time PCR for Mhr was performed according to Clavijo et al (J Vet Diagn invest 26:755-760, 2014).
PCV2 관련 병리조직학적 검사의 경우 서혜림프절 림프구의 감소(lymphoid depletion)와 육아종성 염증 관찰 정도 Kim et al(J Comp Pathol 131, 121-126, 2004)에 따라 0∼5등급으로 구분하여 측정하였다. In the case of PCV2-related histopathological examination, the degree of inguinal lymph node lymphocyte depletion and granulomatous inflammation was classified into grades 0 to 5 according to Kim et al (J Comp Pathol 131, 121-126, 2004).
Mhp로 인한 육안적 폐렴 병변은 폐의 각각의 엽의 부피비와 폐의 ventral과 dorsal 부분으로 나누어서 각각 배점을 정하여 하기와 같이 스코어를 측정하였다. ventral Lt-anterior는 5점, ventral Rt-anterior는 5점, ventral Lt-middle는 5점, ventral Rt-middle는 5점, ventral Lt-causal는 12.5점, vental Rt-causal는 12.5점, ventral accessory는 5점, dorsal Lt-anterior는 5점, dorsal Rt-anterior는 5점, dorsal Lt-middle는 5점, dorsal Rt-middle는 5점, dorsal Lt-causal는 15점, dorsal Rt-causal는 15점으로 배점하여 각각의 부위에서 병변의 스코어를 측정하였다. Macroscopic pneumonia lesions caused by Mhp were divided into the volume ratio of each lobe of the lung and the ventral and dorsal parts of the lung, respectively, and the score was determined as follows. Ventral Lt-anterior is 5 points, ventral Rt-anterior is 5 points, ventral Lt-middle is 5 points, ventral Rt-middle is 5 points, ventral Lt-causal is 12.5 points, ventral Rt-causal is 12.5 points, ventral accessory is 5 points, dorsal Lt-anterior is 5 points, dorsal Rt-anterior is 5 points, dorsal Lt-middle is 5 points, dorsal Rt-middle is 5 points, dorsal Lt-causal is 15 points, dorsal Rt-causal is 15 points. The lesion score was measured in each area by assigning dots.
Mhp에 의한 폐렴의 조직학적 병변은 병변의 정도에 따라 0∼6등급으로 구분하였다. 등급 판정은 폐포벽의 비후 정도, 페포강의 염증 정도, 세기관지와 기관지 주의 림프구의 비후 등을 기준으로 병변이 없는 정상인 경우 ‘스코어 0’, 경미한 다발성(mild multifocal)의 경우 ‘스코어 1’, 경미한 미만성(mild diffuse)의 경우 ‘스코어 2’, 중증도 다발성(moderate multifocal)의 경우 ‘스코어 3’, 중증도 미만성(moderate diffuse)의 경우 ‘스코어 4’, 심한 다발성(moderate multifocal)의 경우 ‘스코어 5’, 심한 미만성(severe diffuse)의 경우 ‘스코어 6’으로 표시하였다. Histological lesions of pneumonia caused by Mhp were classified into grades 0 to 6 depending on the severity of the lesion. The grading is based on the degree of alveolar wall thickening, the degree of inflammation in the alveolar space, and the thickening of lymphocytes in the bronchioles and bronchioles. 'Score 0' for normal without lesions, 'Score 1' for mild multifocal, and 'score 1' for mild diffuse. ‘Score 2’ for mild diffuse, ‘Score 3’ for moderate multifocal, ‘Score 4’ for moderate diffuse, ‘Score 5’ for moderate multifocal, In case of severe diffusion, it was indicated as 'score 6'.
Mhr 감염에 대한 육안적 간장의 장막에서 관찰되는 섬유소성 장막염에 대한 육안적 병변 스코어링은 Chen et al(Vet Microbiol. 182: 123-130, 2016)의 방법에 따라 0∼3등급으로 구분하며 측정하였다. Scoring of macroscopic lesions for fibrinous serositis observed in the liver's serosa for Mhr infection is graded from 0 to 3 according to the method of Chen et al (Vet Microbiol. 182: 123-130, 2016). did.
Mhr에 의해 간장에서 관찰되는 섬유소성 간장염(fibrinous hepatitis)은 병리조직학적 병변의 정도에 따라 0∼6등급으로 구분하였다. 등급 판정은 섬유소성 염증을 기준으로 병변이 없는 정상인 경우 ‘스코어 0’, 경미한 다발성(mild multifocal)의 경우 ‘스코어 1’, 경미한 미만성(mild diffuse)의 경우 ‘스코어 2’, 중증도 다발성(moderate multifocal)의 경우 ‘스코어 3’, 중증도 미만성(moderate diffuse)의 경우 ‘스코어 4’, 심한 다발성(moderate multifocal)의 경우 ‘스코어 5’, 심한 미만성(severe diffuse)의 경우 ‘스코어 6’으로 표시하였다.Fibrinous hepatitis observed in the liver by MHR was classified into grades 0 to 6 depending on the degree of histopathological lesion. Grading is based on fibrinous inflammation: ‘Score 0’ for normal without lesions, ‘Score 1’ for mild multifocal, ‘Score 2’ for mild diffuse, and ‘Score 2’ for moderate multifocal. ), 'Score 3' for moderate diffuse, 'Score 4' for moderate diffuse, 'Score 5' for moderate multifocal, and 'Score 6' for severe diffuse.
통계자료는 Shapiro-Wilk test를 시행하여 정규분포(normal distribution) 여부를 테스트하였다. 만약 통계자료가 정규분포하면, ANOVA test를 시행하여 그룹 간 유의성 여부를 분석하였다. 만약 ANOVA test에서 그룹 간 유의성이 존재하면, Tukey's adjustment를 이용하여 그룹 간의 유의성 차이를 분석하였다. 만약 통계자료가 정규분포를 하지 않으면 Kruskal-Wallis test를 시행하여 그룹 간 유의성 여부를 분석하였다. 만약 Kruskal-Wallis test에서 그룹 간 유의성이 존재하면, Mann-Whitney test를 이용하여 그룹 간의 유의성 차이를 분석하였다. 0.05 이하의 p값을 유의하다고 간주하여 통계학적 유의성 지표를 a, b, c 구분하여 그룹간 유의성을 표시하였다.Statistical data were tested for normal distribution using the Shapiro-Wilk test. If the statistical data were normally distributed, an ANOVA test was performed to analyze significance between groups. If there was significance between groups in the ANOVA test, the significance difference between groups was analyzed using Tukey's adjustment. If the statistical data were not normally distributed, the Kruskal-Wallis test was performed to analyze significance between groups. If there was significance between groups in the Kruskal-Wallis test, the significance difference between groups was analyzed using the Mann-Whitney test. A p value of 0.05 or less was considered significant, and statistical significance indicators were classified into a, b, and c to indicate significance between groups.
PCM4 백신에 대한 평가항목으로는 공격접종 전 및 공격접종 후의 임상증상, PCV2에 대한 면역반응(PCV2에 대한 IgG, PCV2a와 PCV2d에 대한 중화항체, IFN-γ 분비세포), Mhp에 대한 면역반응(IgG와 IFN-γ 분비세포), Mhr에 대한 면역반응(IgG와 IFN-γ 분비세포) 그리고 미생물학적 분석으로 혈중 및 조직 내 PCV2d 및 PCV2a 항원 수준, 비강 및 조직 내 Mhp와 Mhr의 항원 수준 등을 비교평가 하였다. Evaluation items for the PCM4 vaccine include clinical symptoms before and after challenge, immune response to PCV2 (IgG to PCV2, neutralizing antibodies to PCV2a and PCV2d, and IFN-γ secreting cells), and immune response to Mhp ( IgG and IFN-γ secreting cells), immune response to Mhr (IgG and IFN-γ secreting cells), and microbiological analysis to determine PCV2d and PCV2a antigen levels in the blood and tissues, Mhp and Mhr antigen levels in the nasal cavity and tissues, etc. A comparative evaluation was conducted.
3.1 공격접종에 따른 임상증상 비교3.1 Comparison of clinical symptoms according to challenge vaccination
PCV2d 공격접종 후, 백신군과 양성대조군의 임상증상을 관찰하였다. 그 결과, 공격접종 후 2주 및 3주차에서 백신군은 각각 0.6±0.5 및 1.0±0.7, 양성대조군은 각각 1.8±0.4 및 2.4±0.9로 하기 표 11에 나타난 바와 같이, 백신군이 공격접종 후 2주 및 3주 모두에서 임상증상 지수가 유의적으로 낮았다. PCV2a 공격접종 후 백신군과 양성대조군의 임상증상 관찰 결과, 공격접종 후 2주 및 3주차에서 백신군은 각각 0.4±0.9 및 0.8±0.8이였고, 양성대조군은 각각 1.8±0.4 및 2.4±0.9로, 하기 표 11에 나타난 바와 같이, 백신군이 공격접종 후 2주 및 3주 모두에서 임상증상 지수가 유의적으로 낮았다. Mhp 공격접종 후, 백신군과 양성대조군의 임상증상 관찰 결과 공격접종 후 2주 및 3주차에서 백신군은 각각 0.6±0.5 및 1.6±0.5, 양성대조군은 각각 1.8±0.4 및 3.2±1.1로 백신군이 공격접종 후 2주 및 3주 모두에서 하기 표 11에 나타난 바와 같이, 임상증상 지수가 유의적으로 낮았다. Mhr 및 PCV2d 혼합 공격접종 후, 백신군과 양성대조군의 임상증상 관찰 결과 공격접종 후 2주 및 3주차에서 백신군은 각각 1.8±0.4 및 2.8±1.1, 양성대조군은 각각 3.2±1.1 및 4.8±1.1로 하기 표 11에 나타난 바와 같이, 백신군이 공격접종 후 2주 및 3주 모두에서 임상증상 지수가 유의적으로 낮았다. After PCV2d challenge, clinical symptoms of the vaccine group and positive control group were observed. As a result, at the 2nd and 3rd weeks after challenge vaccination, the vaccine group had 0.6±0.5 and 1.0±0.7, respectively, and the positive control group had 1.8±0.4 and 2.4±0.9, respectively, as shown in Table 11 below. The clinical symptom index was significantly lower at both 2 and 3 weeks. As a result of observing clinical symptoms in the vaccine group and positive control group after PCV2a challenge, at 2 and 3 weeks after challenge, the vaccine group had 0.4±0.9 and 0.8±0.8, respectively, and the positive control group had 1.8±0.4 and 2.4±0.9, respectively. , As shown in Table 11 below, the clinical symptom index in the vaccine group was significantly lower at both 2 and 3 weeks after challenge. As a result of observing clinical symptoms in the vaccine group and the positive control group after the Mhp challenge vaccination, the vaccine group had 0.6 ± 0.5 and 1.6 ± 0.5, respectively, and the positive control group had 1.8 ± 0.4 and 3.2 ± 1.1, respectively, at the 2nd and 3rd weeks after the challenge vaccination. As shown in Table 11 below, the clinical symptom index was significantly low at both 2 and 3 weeks after the challenge vaccination. After the Mhr and PCV2d mixed challenge, the clinical symptoms of the vaccine group and the positive control group were observed at 2 and 3 weeks after the challenge. The vaccine group had 1.8 ± 0.4 and 2.8 ± 1.1, respectively, and the positive control group had 3.2 ± 1.1 and 4.8 ± 1.1, respectively. As shown in Table 11 below, the clinical symptom index in the vaccine group was significantly lower at both 2 and 3 weeks after challenge.
*a, b, c는 통계학적 유의성을 나타냄(p < 0.05) *a, b, c indicate statistical significance ( p < 0.05)
3.2 공격접종에 따른 일령별 체중(Kg) 비교3.2 Comparison of weight (Kg) by age according to challenge vaccination
PCV2d, PCV2a, Mhp 또는 Mhr 공격접종 후, 백신군과 양성대조군의 일령별 체중을 측정하였다. 하기 표 12에 나타난 바와 같이, PCV2d 공격접종 그룹의 경우 공격접종 3주 후 각 그룹간 체중(kg) 비교 시 평균 체중은 백신군(20.4±1.6)이 양성대조군(19.1±2.8) 보다 높았지만 통계학적 유의성은 관찰되지 않았다. 그리고 PCV2a 공격접종 그룹의 경우 공격접종 3주 후 각 그룹간 체중(kg) 비교 시 평균 체중은 백신군(20.5±0.7)이 양성대조군(19.2±2.9) 보다 높았지만 통계학적 유의성은 관찰되지 않았다. 그러나 Mhp 공격접종 그룹의 경우 공격접종 3주 후 각 그룹간 체중(kg) 비교 시 백신군(20.9±1.4)의 평균 체중은 양성대조군(17.1±1.5) 보다 유의적으로 높았으며, 백신군은 음성 대조군(21.1±14) 수준으로 체중이 측정되었다. 그리고 Mhr과 PCV2d 바이러스 혼합 공격접종 3주 후 각 그룹간 체중(kg) 비교 시 백신군(14.9±0.6)의 평균 체중은 양성대조군(11.9±0.8) 보다 유의적으로 높았으나 백신군은 음성 대조군(21.1±1.4) 보다 유의적으로 낮게 측정되었다. 이는 PCV2d와 Mhr 동시 공격접종에 의한 높은 병원성으로 백신군에서 체중감소의 영향이 나타났으며, 백신을 접종하지 않은 그룹(양성 대조군)에서는 더 심각한 체중감소로 볼 때 PCM4 백신의 효과가 있음을 입증한다고 볼 수 있다. After PCV2d, PCV2a, Mhp or Mhr challenge, body weight by day was measured for the vaccine group and positive control group. As shown in Table 12 below, in the case of the PCV2d challenge vaccination group, when comparing body weight (kg) between each group 3 weeks after challenge, the average body weight in the vaccine group (20.4 ± 1.6) was higher than the positive control group (19.1 ± 2.8), but statistics No scientific significance was observed. And in the case of the PCV2a challenge vaccination group, when comparing body weight (kg) between each group 3 weeks after challenge vaccination, the average body weight in the vaccine group (20.5 ± 0.7) was higher than the positive control group (19.2 ± 2.9), but statistical significance was not observed. However, in the case of the Mhp challenge vaccination group, when comparing body weight (kg) between each group 3 weeks after challenge vaccination, the average weight of the vaccine group (20.9 ± 1.4) was significantly higher than the positive control group (17.1 ± 1.5), and the vaccine group was negative. Body weight was measured at the control level (21.1±14). And when comparing body weight (kg) between each group 3 weeks after mixed vaccination with Mhr and PCV2d viruses, the average body weight of the vaccine group (14.9 ± 0.6) was significantly higher than the positive control group (11.9 ± 0.8), but the vaccine group was significantly higher than the negative control group (11.9 ± 0.8). It was measured significantly lower than 21.1±1.4). This showed the effect of weight loss in the vaccine group due to the high pathogenicity caused by PCV2d and Mhr simultaneous challenge, and more severe weight loss in the non-vaccinated group (positive control group), demonstrating the effectiveness of the PCM4 vaccine. It can be seen that it does.
*a, b, c는 통계학적 유의성을 나타냄(p < 0.05)*a, b, c indicate statistical significance ( p < 0.05)
3.3 면역학적 평가3.3 Immunological evaluation
PCV2d 공격접종 그룹에서, 백신군은 양성대조군과 PCV2 IgG 항체 수준 비교 시 백신접종 3주 후, 공격접종 1, 2, 3주 후 모두에서 양성대조군보다 유의적으로 하기 표 13에 나타난 바와 같이, PCV2 IgG 항체 수준이 높았다. In the PCV2d challenge group, the vaccine group had significantly higher PCV2 IgG antibody levels than the positive control group at 3 weeks after vaccination and 1, 2, and 3 weeks after challenge when comparing PCV2 IgG antibody levels with the positive control group, as shown in Table 13 below. IgG antibody levels were high.
*a, b, c는 통계학적 유의성을 나타냄(p < 0.05) *a, b, c indicate statistical significance ( p < 0.05)
또한, 혈중 PCV2d 바이러스 중화항체 수준을 평가한 결과, 하기 표 14에 나타난 바와 같이, 백신군의 혈청은 양성대조군 혈청보다 PCV2d 중화항체 수준이 백신접종 3주 후, 공격접종 1, 2, 3주 후 모두에서 유의적으로 높았다.In addition, as a result of evaluating the level of PCV2d virus neutralizing antibodies in the blood, as shown in Table 14 below, the level of PCV2d neutralizing antibodies in the vaccine group's serum was higher than that of the positive control group's serum 3 weeks after vaccination and 1, 2, and 3 weeks after challenge. It was significantly high in all cases.
*a, b, c는 통계학적 유의성을 나타냄(p < 0.05)*a, b, c indicate statistical significance ( p < 0.05)
PCV2a 공격접종 그룹에서, 백신군은 양성대조군과의 PCV2 IgG 항체 수준 비교에서, 하기 표 15에 나타난 바와 같이, 백신접종 3주 후, 공격접종 1, 2, 3주 후 모두 양성대조군보다 유의적으로 PCV2 IgG 항체 수준이 높았다.In the PCV2a challenge group, the vaccine group was significantly higher than the positive control group 3 weeks after vaccination and 1, 2, and 3 weeks after challenge, as shown in Table 15 below, in comparing the PCV2 IgG antibody level with the positive control group. PCV2 IgG antibody levels were high.
*a, b, c는 통계학적 유의성을 나타냄(p < 0.05)*a, b, c indicate statistical significance ( p < 0.05)
또한, 혈중의 PCV2a 중화항체 수준을 평가한 결과, 하기 표 16에 나타난 바와 같이, 백신군의 혈청은 양성대조군 혈청보다 PCV2a 중화항체 수준이 백신접종 3주 후, 공격접종 1, 2, 3주 후 모두에서 유의적으로 높았다.In addition, as a result of evaluating the level of PCV2a neutralizing antibodies in the blood, as shown in Table 16 below, the serum of the vaccine group had a higher PCV2a neutralizing antibody level than the serum of the positive control group 3 weeks after vaccination and 1, 2, and 3 weeks after challenge. It was significantly high in all cases.
*a, b, c는 통계학적 유의성을 나타냄(p < 0.05)*a, b, c indicate statistical significance ( p < 0.05)
Mhp 공격접종 그룹에서, 백신군과 양성대조군의 Mhp IgG 항체 수준을 비교한 결과, 하기 표 17에 나타난 바와 같이, 백신접종 3주 후, 공격접종 1, 2, 3주 후 모두에서 양성대조군보다 유의적으로 Mhp IgG 항체 수준이 높았다.In the Mhp challenge vaccination group, as a result of comparing the Mhp IgG antibody levels of the vaccine group and the positive control group, as shown in Table 17 below, it was significantly higher than the positive control group at 3 weeks after vaccination and 1, 2, and 3 weeks after challenge. In fact, the Mhp IgG antibody level was high.
*a, b, c는 통계학적 유의성을 나타냄(p < 0.05)*a, b, c indicate statistical significance ( p < 0.05)
*a, b, c는 통계학적 유의성을 나타냄(p < 0.05) 그리고 혈중의 PCV2d 바이러스를 중화항체 수준을 평가하였다. 그 결과, 하기 표 20에 나타난 바와 같이, 백신군의 혈청은 양성대조군 혈청보다 PCV2d 중화항체 수준이 백신접종 3주 후, 공격접종 1, 2, 3주 후 모두에서 유의적으로 높았다.*a, b, c indicate statistical significance ( p < 0.05) and the level of neutralizing antibodies against the PCV2d virus in the blood was evaluated. As a result, as shown in Table 20 below, the level of PCV2d neutralizing antibodies in the vaccine group's serum was significantly higher than the positive control group's serum at 3 weeks after vaccination and 1, 2, and 3 weeks after challenge.
*a, b, c는 통계학적 유의성을 나타냄(p < 0.05)*a, b, c indicate statistical significance ( p < 0.05)
3.4 세포성면역 관련 IFN-γ 분비세포 측정3.4 Measurement of cellular immunity-related IFN-γ secreting cells
PCV2d 공격접종 그룹에서, 백신군과 양성대조군의 PCV2d 관련 IFN-γ-분비세포(PCV2d IFN-γ-SC) 수준을 비교한 결과, 하기 표 21에 나타난 바와 같이, 백신접종 3주 후 및 공격접종 1, 2, 3주 후 모두에서 백신군의 PCV2d 관련 IFN-γ-분비세포(PCV2d IFN-γ-SC) 수준이 양성대조군보다 유의적으로 높았다.In the PCV2d challenge group, as a result of comparing the levels of PCV2d-related IFN-γ-secreting cells (PCV2d IFN-γ-SC) in the vaccine group and the positive control group, as shown in Table 21 below, 3 weeks after vaccination and after challenge. After 1, 2, and 3 weeks, the level of PCV2d-related IFN-γ-secreting cells (PCV2d IFN-γ-SC) in the vaccine group was significantly higher than that in the positive control group.
*a, b, c는 통계학적 유의성을 나타냄(p < 0.05)*a, b, c indicate statistical significance ( p < 0.05)
PCV2a 공격접종 그룹에서, 백신군과 양성대조군의 PCV2a 관련 IFN-γ-분비세포(PCV2a IFN-γ-SC) 수준을 비교한 결과, 하기 표 22에 나타난 바와 같이, 백신접종 3주 후 및 공격접종 1, 2, 3주 후 모두에서 백신군의 PCV2a 관련 IFN-γ-분비세포(PCV2a IFN-γ-SC) 수준이 양성대조군보다 유의적으로 높았다.In the PCV2a challenge vaccination group, as a result of comparing the levels of PCV2a-related IFN-γ-secreting cells (PCV2a IFN-γ-SC) in the vaccine group and the positive control group, as shown in Table 22 below, 3 weeks after vaccination and challenge vaccination. After 1, 2, and 3 weeks, the level of PCV2a-related IFN-γ-secreting cells (PCV2a IFN-γ-SC) in the vaccine group was significantly higher than that in the positive control group.
*a, b, c는 통계학적 유의성을 나타냄(p < 0.05)*a, b, c indicate statistical significance ( p < 0.05)
Mhp 공격접종 그룹에서, 백신군과 양성대조군의 Mhp 관련 IFN-γ-분비세포(Mhp IFN-γ-SC) 수준을 비교한 결과, 하기 표 23에 나타난 바와 같이, 백신접종 3주 후 및 공격접종 1, 2, 3주 후 모두에서 백신군의 Mhp 관련 IFN-γ-분비세포(Mhp IFN-γ-SC) 수준이 양성대조군보다 유의적으로 높았다.In the Mhp challenge vaccination group, as a result of comparing the levels of Mhp-related IFN-γ-secreting cells (Mhp IFN-γ-SC) in the vaccine group and the positive control group, as shown in Table 23 below, 3 weeks after vaccination and challenge vaccination After 1, 2, and 3 weeks, the level of Mhp-related IFN-γ-secreting cells (Mhp IFN-γ-SC) in the vaccine group was significantly higher than that in the positive control group.
마지막으로 Mhr 및 PCV2d 혼합 공격접종 그룹에서, 백신군과 양성대조군의 PCV2d 관련 IFN-γ-분비세포(PCV2d IFN-γ-SC) 및 Mhr 관련 IFN-γ-분비세포(Mhr IFN-γ-SC) 수준을 비교한 결과, 하기 표 24에 나타난 바와 같이, 백신접종 3주 후 및 공격접종 1, 2, 3주 후 모두에서 백신군의 PCV2d 관련 IFN-γ-분비세포 수준이 양성대조군보다 유의적으로 높았으며, 백신군의 Mhr IFN-γ-분비세포 수준 역시 하기 표 25에 나타난 바와 같이, 백신접종 3주 후 및 공격접종 1, 2, 3주 후 모두에서 양성대조군보다 유의적으로 높았다.Lastly, in the Mhr and PCV2d mixed vaccination group, PCV2d-related IFN-γ-secreting cells (PCV2d IFN-γ-SC) and Mhr-related IFN-γ-secreting cells (Mhr IFN-γ-SC) in the vaccine group and positive control group. As a result of comparing the levels, as shown in Table 24 below, the level of PCV2d-related IFN-γ-secreting cells in the vaccine group was significantly higher than that in the positive control group both 3 weeks after vaccination and 1, 2, and 3 weeks after challenge. It was high, and the level of Mhr IFN-γ-secreting cells in the vaccine group was also significantly higher than that of the positive control group both 3 weeks after vaccination and 1, 2, and 3 weeks after challenge, as shown in Table 25 below.
*a, b, c는 통계학적 유의성을 나타냄(p < 0.05)*a, b, c indicate statistical significance ( p < 0.05)
*a, b, c는 통계학적 유의성을 나타냄(p < 0.05)*a, b, c indicate statistical significance ( p < 0.05)
3.5 혈중 PCV2 항원 및 비강 내 마이코플라즈마 항원 미생물 평가3.5 Microbiological evaluation of blood PCV2 antigen and intranasal mycoplasma antigen
백신군, 양성대조군, 및 음성대조군에서 혈액을 채취한 후, Real time PCR을 이용하여 채취한 혈액 내의 PCV2a 또는 PCV2d를 정량분석 하였다. 또한, 비강 스왑 면봉을 이용하여 비강 내의 시료를 채취한 후, Real time PCR을 이용하여 시료 내의 Mhp 및 Mhr을 정량분석 하였다.After blood was collected from the vaccine group, positive control group, and negative control group, PCV2a or PCV2d in the collected blood was quantitatively analyzed using real time PCR. In addition, after collecting samples from the nasal cavity using a nasal swab, Mhp and Mhr in the samples were quantitatively analyzed using real time PCR.
PCV2d 공격접종 그룹에서, 백신군과 양성대조군의 혈중 PCV2d 양을 비교한 결과, 하기 표 26에 나타난 바와 같이, 공격접종 1주 후부터 백신군의 PCV2d 함량이 양성대조군보다 유의적으로 낮았으며, 공격접종 2주 및 3주 후까지 지속적으로 백신군의 혈중 PCV2d 항원양이 양성대조군보다 유의적으로 낮았다.In the PCV2d challenge vaccination group, as a result of comparing the amount of PCV2d in the blood of the vaccine group and the positive control group, as shown in Table 26 below, the PCV2d content of the vaccine group was significantly lower than that of the positive control group from 1 week after the challenge vaccination. The amount of PCV2d antigen in the blood of the vaccine group continued to be significantly lower than that of the positive control group until 2 and 3 weeks later.
PCV2a 공격접종 그룹에서, 백신군과 양성대조군의 혈중 PCV2a 양을 비교한 결과, 하기 표 27에 나타난 바와 같이, 공격접종 1주 후부터 백신군의 항원함량이 양성대조군보다 유의적으로 낮았으며, 공격접종 2주 및 3주 후까지 지속적으로 백신군의 혈중 PCV2a 항원이 양성 대조군보다 유의적으로 낮았다.In the PCV2a challenge vaccination group, as a result of comparing the amount of PCV2a in the blood of the vaccine group and the positive control group, as shown in Table 27 below, the antigen content of the vaccine group was significantly lower than that of the positive control group from 1 week after the challenge vaccination, and the challenge vaccination group's antigen content was significantly lower than that of the positive control group. The PCV2a antigen in the blood of the vaccine group continued to be significantly lower than that of the positive control group until 2 and 3 weeks later.
*a, b, c는 통계학적 유의성을 나타냄(p < 0.05)*a, b, c indicate statistical significance ( p < 0.05)
Mhp 공격접종 그룹에서, Mhp를 기관 내 공격접종한 후, 2주차부터 비강 내 Mhp 항원이 관찰되었다. 하기 표 28에 나타난 바와 같이, 공격접종 2주 및 3주 후 모두에서 백신군의 비강 Mhp 항원 수준이 양성대조군보다 유의적으로 낮았다.In the Mhp challenge group, Mhp antigen was observed in the nasal cavity from 2 weeks after intratracheal challenge with Mhp. As shown in Table 28 below, the nasal Mhp antigen level of the vaccine group was significantly lower than that of the positive control group both 2 and 3 weeks after challenge.
*a, b, c는 통계학적 유의성을 나타냄(p < 0.05)*a, b, c indicate statistical significance ( p < 0.05)
마지막으로 Mhr 및 PCV2d 혼합 공격접종 그룹에서, 백신군과 양성대조군의 혈중 PCV2d 양을 비교한 결과, 하기 표 29에 나타난 바와 같이, 공격접종 1주 후부터 백신군의 항원함량이 양성대조군보다 유의적으로 낮았으며, 공격접종 2주 및 3주 후까지 지속적으로 백신군의 혈중 PCV2d 항원은 양성대조군보다 유의적으로 낮았다.Lastly, in the Mhr and PCV2d mixed challenge vaccination group, the amount of PCV2d in the blood of the vaccine group and the positive control group was compared. As shown in Table 29 below, the antigen content of the vaccine group was significantly higher than that of the positive control group from 1 week after the challenge vaccination group. It was low, and the PCV2d antigen in the blood of the vaccine group continued to be significantly lower than that of the positive control group until 2 and 3 weeks after challenge.
*a, b, c는 통계학적 유의성을 나타냄(p < 0.05)*a, b, c indicate statistical significance ( p < 0.05)
그리고 비강 내 Mhr 항원양을 확인하였다. Mhr은 Mhp와 달리 공격접종 1주 후부터 비강 내에서 항원이 관찰되었다. 공격접종 1주 후에는 백신군과 양성대조군의 Mhr 항원양이 유의한 차이를 보이지 않았다. 그러나, 하기 표 30에 나타난 바와 같이, Mhr 공격접종 2주 및 3주 후에서 백신군의 비강 Mhr 항원양은 양성대조군보다 유의적으로 낮았다.And the Mhr antigen content in the nasal cavity was confirmed. Unlike Mhp, Mhr antigen was observed in the nasal cavity one week after challenge. One week after challenge vaccination, there was no significant difference in the amount of Mhr antigen between the vaccine group and the positive control group. However, as shown in Table 30 below, the amount of nasal Mhr antigen in the vaccine group was significantly lower than that in the positive control group 2 and 3 weeks after Mhr challenge.
*a, b, c는 통계학적 유의성을 나타냄(p < 0.05)*a, b, c indicate statistical significance ( p < 0.05)
7.6 병리조직학적 평가7.6 Histopathological evaluation
PCV2d 공격접종 3주 후의 림프절 병변을 확인한 결과, 하기 표 31에 나타난 바와 같이, 백신군의 림프절 병변지수가 양성대조군보다 유의적으로 낮았다. As a result of confirming lymph node lesions 3 weeks after PCV2d challenge, as shown in Table 31 below, the lymph node lesion index of the vaccine group was significantly lower than that of the positive control group.
*a, b, c는 통계학적 유의성을 나타냄(p < 0.05)*a, b, c indicate statistical significance ( p < 0.05)
또한 림프절 내 항원수준을 평가한 결과, 하기 표 32에 나타난 바와 같이, 백신군이 양성대조군보다 PCV2d 항원 수준이 유의적으로 낮았다.Additionally, as a result of evaluating the antigen level in the lymph nodes, as shown in Table 32 below, the PCV2d antigen level in the vaccine group was significantly lower than the positive control group.
*a, b, c는 통계학적 유의성을 나타냄(p < 0.05*a, b, c indicate statistical significance ( p < 0.05
PCV2a 공격접종 3주 후 림프절 병변을 조사한 결과, 하기 표 33에 나타난 바와 같이, 백신군의 림프절 병변지수가 양성대조군보다 유의적으로 낮았다.As a result of examining lymph node lesions 3 weeks after PCV2a challenge, as shown in Table 33 below, the lymph node lesion index of the vaccine group was significantly lower than that of the positive control group.
*a, b, c는 통계학적 유의성을 나타냄(p < 0.05)*a, b, c indicate statistical significance ( p < 0.05)
그리고 림프절 내 항원수준을 평가한 결과 백신군이 양성대조군 보다 PCV2a 항원수준이 유의적으로 낮았다(표 34).And as a result of evaluating the antigen level in the lymph nodes, the PCV2a antigen level in the vaccine group was significantly lower than the positive control group (Table 34).
*a, b, c는 통계학적 유의성을 나타냄(p < 0.05)*a, b, c indicate statistical significance ( p < 0.05)
Mhp 공격접종 후 육안적 폐렴 병변 변화를 관찰한 결과, 하기 표 35에 나타낸 바와 같이, 백신군의 육안 폐렴 병변지수는 양성대조군보다 유의적으로 낮았다.As a result of observing changes in gross pneumonia lesions after Mhp challenge vaccination, as shown in Table 35 below, the gross pneumonia lesion index of the vaccine group was significantly lower than that of the positive control group.
*a, b, c는 통계학적 유의성을 나타냄(p < 0.05)*a, b, c indicate statistical significance ( p < 0.05)
또한, 폐장 내 병리조직학적 검사에서 하기 표 36에 나타낸 바와 같이, 백신군의 병리조직학적 폐렴 병변 스코어는 양성대조군에 비해 유의적으로 낮았다.In addition, as shown in Table 36 below, in the histopathological examination of the lungs, the histopathological pneumonia lesion score of the vaccine group was significantly lower than that of the positive control group.
*a, b, c는 통계학적 유의성을 나타냄(p < 0.05)*a, b, c indicate statistical significance ( p < 0.05)
Mhr 및 PCV2d 혼합 공격접종 3주 후 림프절 병변을 조사한 결과, 하기 표 37에 나타낸 바와 같이, 백신군의 림프절 병변지수는 양성대조군보다 유의적으로 낮았다.As a result of examining lymph node lesions 3 weeks after Mhr and PCV2d combined challenge, as shown in Table 37 below, the lymph node lesion index of the vaccine group was significantly lower than that of the positive control group.
또한 상기 혼합 공격접종 3주 후, 림프절 내 항원수준을 평가한 결과, 하기 표 38에 나타낸 바와 같이, 백신군의 림프절 PCV2d 항원수준은 양성대조군보다 유의적으로 낮았다.In addition, as a result of evaluating the antigen level in the lymph nodes 3 weeks after the combined challenge vaccination, as shown in Table 38 below, the PCV2d antigen level in the lymph nodes of the vaccine group was significantly lower than that of the positive control group.
*a, b, c는 통계학적 유의성을 나타냄(p < 0.05)*a, b, c indicate statistical significance ( p < 0.05)
상기 혼합 공격접종에 의한 Mhr 관련 육안적 병변 변화를 간장의 장막 병변으로 비교한 결과, 하기 표 39에 나타낸 바와 같이, 백신군의 육안적 간장의 장막염 병변 정도는 양성대조군보다 유의적으로 낮았다.As a result of comparing the changes in Mhr-related gross lesions due to the above mixed challenge with the serosal lesions of the liver, as shown in Table 39 below, the degree of gross liver serositis lesions in the vaccine group was significantly lower than that in the positive control group.
*a, b, c는 통계학적 유의성을 나타냄(p < 0.05)*a, b, c indicate statistical significance ( p < 0.05)
또한, Mhr 관련 간장의 장막염에 대한 병리조직학적 병변을 조사한 결과, 하기 표 40에 나타낸 바와 같이, 백신군의 간장 장막염의 병변 정도는 양성대조군보다 유의적으로 낮았다.In addition, as a result of examining histopathological lesions for Mhr-related liver serositis, as shown in Table 40 below, the lesion severity of liver serositis in the vaccine group was significantly lower than that in the positive control group.
*a, b, c는 통계학적 유의성을 나타냄(p < 0.05)*a, b, c indicate statistical significance ( p < 0.05)
Claims (36)
A vector for producing a recombinant antigen related to porcine wasting disease, comprising the base sequence of any one of SEQ ID NOs: 19 to 21.
The method of claim 26, wherein the vector is capable of producing porcine circovirus type 2a (PCV2a) and porcine circovirus type 2d (PCV2d). Vector for disease-related manufacturing.
The vector for producing a recombinant antigen related to porcine wasting disease according to claim 26, comprising the base sequence of SEQ ID NO: 21.
The method of claim 28, wherein the vector is capable of producing porcine circovirus type 2a (PCV2a), porcine circovirus type 2d (PCV2d), T_BLS, and p65. A manufacturing vector related to porcine wasting disease.
A peptide prepared with the vector of claim 26.
The method of claim 30, wherein the peptide is two or more selected from the group consisting of Porcine circovirus type 2a (PCV2a), Porcine circovirus type 2d (PCV2d), T_BLS, and p65. Characterized by multivalent peptides.
A vaccine composition for preventing or treating porcine wasting disease, comprising the multivalent peptide of claim 31.
The vaccine for preventing or treating porcine wasting disease according to claim 32, further comprising one or more of Mycoplasma hyopneumoniae cells and inactivated Mycoplasma hyorhinis cells. Composition.
The vaccine composition of claim 32, wherein the vaccine composition may further include an adjuvant.
The vaccine composition of claim 32, wherein the vaccine composition is capable of preventing or treating porcine circovirus type 2 infection, mycoplasma pneumonia, or mycoplasma peritonitis.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020230100515A KR102640730B1 (en) | 2023-08-01 | 2023-08-01 | Novel vector for producing recombinant antigens related with porcine wasting disease and vaccine composition using the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020230100515A KR102640730B1 (en) | 2023-08-01 | 2023-08-01 | Novel vector for producing recombinant antigens related with porcine wasting disease and vaccine composition using the same |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102640730B1 true KR102640730B1 (en) | 2024-02-29 |
Family
ID=90041285
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020230100515A KR102640730B1 (en) | 2023-08-01 | 2023-08-01 | Novel vector for producing recombinant antigens related with porcine wasting disease and vaccine composition using the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102640730B1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20130141001A (en) * | 2012-06-15 | 2013-12-26 | 한국표준과학연구원 | A novel vector system for isolation and purification of target proteins |
| KR20150027836A (en) * | 2012-07-10 | 2015-03-12 | 히프라 사이언티픽, 에스.엘.유 | Vectors for transforming mycoplasma hyopneumoniae, transformed m. hyopneumoniae strains, and use thereof |
-
2023
- 2023-08-01 KR KR1020230100515A patent/KR102640730B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20130141001A (en) * | 2012-06-15 | 2013-12-26 | 한국표준과학연구원 | A novel vector system for isolation and purification of target proteins |
| KR20150027836A (en) * | 2012-07-10 | 2015-03-12 | 히프라 사이언티픽, 에스.엘.유 | Vectors for transforming mycoplasma hyopneumoniae, transformed m. hyopneumoniae strains, and use thereof |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| NCBI 서열번호 GenBank: ABV21950.1* * |
| NCBI 서열번호 GenBank: AF097413.1* * |
| NCBI 서열번호 GenBank: AOS90034.1* * |
| NCBI 서열번호 GenBank: MN562750* * |
| NCBI 서열번호 GenBank: QLK02384.1* * |
| NCBI 서열번호 GenBank: WP_002965946.1* * |
| NCBI 서열번호 GenBank: WP_011284378.1* * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9855327B2 (en) | Live attenuated chimeric porcine circovirus vaccine | |
| US9770501B2 (en) | Porcine circovirus type 2 (PCV2), immunogenic composition containing the same, test kit, and application thereof | |
| EP1487483B1 (en) | Chimeric infectious dna clones of porcine circovirus and uses thereof | |
| US10174084B2 (en) | Fusion polypeptides and vaccines | |
| KR102319843B1 (en) | Pcv2b divergent vaccine composition and methods of use | |
| CN109195623A (en) | 2 type of chimeric porcine circovirus type (PCV2) vaccine | |
| KR102157911B1 (en) | Vectors for transforming mycoplasma hyopneumoniae, transformed m. hyopneumoniae strains, and use thereof | |
| Li et al. | Surface Display of porcine circovirus type 2 antigen protein cap on the spores of bacillus subtilis 168: An effective mucosal vaccine candidate | |
| KR102640730B1 (en) | Novel vector for producing recombinant antigens related with porcine wasting disease and vaccine composition using the same | |
| KR20190014263A (en) | ORF2 recombinant gene of porcine circovirus type 2 and vaccine composition using the same | |
| CN115243715A (en) | Vaccine for protection against serotype 9, serotype 16 streptococcus suis | |
| KR100889375B1 (en) | A heterologous antigen-expressing live attenuated Bordetella bronchiseptica strain and method for producing thereof, an immunogenic composition comprising the strain and a method of treating or preventing heterologous antigen-originated pathogen infection from mammals using the same | |
| TWI361695B (en) | Pcv-2 vaccine | |
| CN117304338A (en) | Fusion protein antigen composition and preparation method and application thereof | |
| KR20060062832A (en) | Recombinant protein, vaccine and prevention method for pmws using the same | |
| CN110343670A (en) | The virus attenuated strain of recombinant porcine pseudorabies of expression pig circular ring virus Cap protein gene, and its preparation method and application |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |