ES2720255T3 - Procedimiento de purificación de un anticuerpo monoclonal - Google Patents

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Abstract

Procedimiento de purificación de un anticuerpo monoclonal o de una proteína de fusión entre el fragmento Fc de un anticuerpo y un segundo polipéptido, que comprende: a) una etapa de cromatografía de afinidad sobre una resina que tiene por matriz un gel de polímero de metacrilato reticulado, sobre el cual se injerta la proteína A, b) una etapa de inactivación viral, c) una etapa de cromatografía intercambiadora de cationes sobre una resina que tiene por matriz un gel de agarosa reticulado, sobre el cual se injertan unos grupos sulfonato (-SO3-) por medio de brazos espaciadores a base de dextrano, d) una etapa de cromatografía intercambiadora de aniones sobre una membrana hidrófila de polietersulfona revestida de un polímero reticulado sobre el cual se injertan unos grupos amina cuaternaria (Q), y e) una etapa de nanofiltración con un filtro que tiene una doble membrana de polietersulfona de una porosidad de aproximadamente 20 nm, caracterizado por que el tampón de elución utilizado en la etapa a) para eluir el anticuerpo es un tampón formiato utilizado a una molaridad de 5 a 10 mM y a un pH comprendido entre 2,6 y 3,6.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento de purificación de un anticuerpo monoclonal
Campo de la invención
La presente invención se sitúa en el campo de los procedimientos de purificación de anticuerpos monoclonales o de proteínas de fusión Fc destinados a aplicaciones farmacéuticas. Se refiere a un procedimiento de purificación de un anticuerpo monoclonal o de una proteína de fusión entre el fragmento Fc de un anticuerpo y un segundo polipéptido, que comprende a) una etapa de cromatografía de afinidad sobre una resina que tiene por matriz un gel de polímero de metacrilato reticulado, en el que se injerta la proteína A, b) una etapa de inactivación viral, c) una etapa de cromatografía intercambiadora de cationes sobre una resina que tiene por matriz un gel de agarosa reticulado, en el que se injertan unos grupos sulfonato (-SO3-) por medio de brazos espaciadores a base de dextrano, d) una etapa de cromatografía intercambiadora de aniones sobre una membrana hidrófila de polietersulfona revestida con un polímero reticulado sobre el cual se injertan unos grupos amina cuaternaria (Q), y e) una etapa de nanofiltración con un filtro que tiene una doble membrana de polietersulfona de una porosidad de aproximadamente 20 nm, caracterizado por que el tampón de elución utilizado en la etapa a) para eluir el anticuerpo es un tampón formiato utilizado a una molaridad de 5 a 10 mM y a un pH comprendido entre 2,6 y 3,6.
Técnica anterior
Se ha asistido durante la última década a un alto desarrollo de los tratamientos de inmunoterapia pasiva con la ayuda de anticuerpos, frecuentemente monoclonales, en diferentes campos terapéuticos: cánceres, prevención de la aloinmunización en las mujeres embarazadas Rhesus negativas, enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias y especialmente autoinmunes.
Con el fin de poder utilizarse como medicamento, un anticuerpo debe responder a unas exigencias astringentes en términos de calidad, de pureza, y de seguridad sanitaria. En consecuencia, se han desarrollado diferentes procedimientos de purificación de anticuerpos a fin de satisfacer estas exigencias. Estos procedimientos implican generalmente varias etapas de purificación por cromatografía, así como una o varias etapas de eliminación o de inactivación viral (Fahrner et al. Biotechnol Genet Eng Rev. 2001;18:301-27; Liu et al. MAbs. 2010 Sep-Oct;2(5):480-99).
A pesar de que se hayan descrito numerosos procedimientos que permiten obtener unos anticuerpos purificados que satisfacen las exigencias de las autoridades sanitarias, existe no obstante una necesidad para unos procedimientos de purificación optimizados. En efecto, los procedimientos existentes imponen a los fabricantes unos costes significativos de producción, que es importante reducir al máximo a fin de disminuir el coste de los tratamientos por anticuerpos monoclonales.
El coste global de un procedimiento de producción de anticuerpos varía en función de un cierto número de factores, tales como en particular el coste de cada uno de los productos utilizados para la purificación, la cantidad de anticuerpos susceptible de tratarse de una sola vez, la duración de realización de cada una de las etapas del procedimiento, y el rendimiento de cada una de las etapas del procedimiento.
Además, estos factores son interdependientes, es decir que la elección de un producto particular para una de las etapas de purificación impactará diferentemente cada uno de estos factores.
Ahora bien, para cada una de las etapas de purificación susceptibles de utilizarse en un procedimiento de purificación de un anticuerpo monoclonal, el experto en la materia debe realizar una elección entre numerosos productos disponibles comercialmente, teniendo cada uno sus ventajas y sus inconvenientes. Así, en el ámbito de una etapa de purificación por cromatografía, el experto en la materia debe realizar unas elecciones a nivel de la resina de cromatografía (base y ligando) y de los tampones utilizados. Ahora bien, existen numerosas resinas de cromatografías, fundadas sobre diferentes bases (agarosa, dextrano, polímeros sintéticos, etc.) y diferentes ligandos (afinidad, intercambio de cationes, intercambio de iones, interacciones hidrófobas, etc.), y varios tampones son susceptibles de utilizarse para cada resina de cromatografía.
Por lo tanto, es particularmente difícil para el experto en la materia seleccionar una combinación de etapas y de productos específicos capaces de reducir significativamente los costes de purificación de un anticuerpo monoclonal, manteniendo al mismo tiempo el nivel de calidad, de pureza y de seguridad sanitaria del anticuerpo purificado. Resumen de la invención
En el ámbito de la presente invención, los inventores han puesto en evidencia que una combinación particular de etapas de purificación y de eliminación o de inactivación viral permite disminuir de un factor 3 los costes de purificación de un anticuerpo monoclonal, manteniendo al mismo tiempo el nivel de calidad, de pureza, y de seguridad sanitaria del anticuerpo purificado. Esta fuerte disminución del coste de purificación de un anticuerpo monoclonal ha sido permitida por la selección de productos menos costosos, que permiten tratar una cantidad de anticuerpos más elevada de una sola vez, y por la optimización de las condiciones de realización de cada etapa a fin de mantener el nivel de calidad, de pureza, y de seguridad sanitaria del anticuerpo purificado.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere por lo tanto a un procedimiento de purificación de un anticuerpo monoclonal o de una proteína de fusión entre el fragmento Fc de un anticuerpo y un segundo polipéptido, tal como se reivindica en las reivindicaciones 1 a 10.
Más generalmente, la presente descripción divulga un procedimiento de purificación de un anticuerpo monoclonal o de una proteína de fusión entre el fragmento Fc de un anticuerpo y un segundo polipéptido, que comprende: a) una etapa de cromatografía de afinidad sobre una resina que tiene por matriz un gel de polímero de metacrilato reticulado, en el que se injerta la proteína A,
b) una etapa de inactivación viral,
c) una etapa de cromatografía intercambiadora de cationes sobre una resina que tiene por matriz un gel de agarosa reticulado, en el que se injertan unos grupos sulfonato (-SO3-) por medio de brazos espaciadores a base de dextrano,
d) una etapa de cromatografía intercambiadora de aniones sobre una membrana hidrófila de polietersulfona revestida de un polímero reticulado en el que se injertan unos grupos amina cuaternaria (Q), y
e) una etapa de nanofiltración con un filtro que tiene una doble membrana de polietersulfona de una porosidad de aproximadamente 20 nm.
Ventajosamente, el gel de polímero de metacrilato reticulado en el que se injerta la proteína A utilizado en la etapa a) está en forma de bolas que tienen un diámetro medio comprendido entre 30 y 60 |im, ventajosamente entre 40 y 50 |im. En la invención, el tampón de elución utilizado en la etapa a) para eluir el anticuerpo es un tampón formiato, utilizándose este a una molaridad de 5 a 10 mM y a un pH comprendido entre 2,6 y 3,6.
Ventajosamente, la etapa b) se realiza por incubación durante 30 a 120 minutos a una temperatura de 20 a 25°C en un medio que comprende del 0,5 al 2% (v/v) de polioxietilen-p-t-octilfenol (Triton X-100, N° Ca s 9002-93-1).
Ventajosamente, el tampón utilizado durante la etapa d) es un tampón trishidroximetilaminometano (TRIS) a una concentración de 15 a 25 mM, un pH de 7,5 a 8,5 y una conductividad de 5 a 15 mS/cm.
Ventajosamente, la etapa e) comprende además una filtración previa a través de un pre-filtro VPF (Viresolve PreFilter, filtro en profundidad que comprende unas fibras de celulosa, tierra de diatomea y una resina cargada negativamente) o Viresolve pro Shield (membrana de polietersulfona de una porosidad de 0,22 |im funcionalizada por unos grupos SO3").
Ventajosamente, el procedimiento comprende además una etapa de ultrafiltración y/o de diafiltración.
Ventajosamente, el procedimiento según la invención se realiza en un sobrenadante de cultivo de un clon productor del anticuerpo monoclonal o de la proteína de fusión entre el fragmento Fc de un anticuerpo y un segundo polipéptido.
Ventajosamente, el procedimiento según la invención se utiliza para la purificación de un anticuerpo monoclonal, en particular de un anticuerpo dirigido contra uno de los antígenos siguientes: Rhesus D, CD2, CD3, CD4, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD40, CD51 (Integrina alfa-V), CD52, CD80, CTLA-4 (CD152), SLAMF7 (CD319), Her2/neu, EGFR, EPCAM, CCR4, CEA, FR-alfa, GD2, GD3, HLA-DR, IGF1R (CD221), fosfatidilserina, TRAIL-R1, TRAIL-R2, antígenos de Clostridium difficile, antígenos de Staphylococcus aureus (especialmente ClfA y ácido lipoteicoico), antígenos del citomegalovirus (especialmente la flicoproteína B), antígenos de Escherichia coli (en particular toxina Shiga-like, sub-unidad IIB), antígenos del virus respiratorio sincitial (proteína F en particular), antígenos del virus de la hepatitis B, antígenos del virus Influenza A (Hemaglutinina en particular), antígenos de Pseudomonas aeruginosa serotipo IATS O11, antígenos del virus de la rabia (glicoproteína en particular), o fosfatidilserina.
Descripción de las figuras
Figura 1. Determinación del volumen inyectado en el punto 10%BT para una purificación por cromatografía de afinidad sobre proteína A sobre unas resinas de tipo MabSelect SuRe™ (A), Poros GoPure™(B), Toyopearl AF-rProtein A-650F (C) y Amsphere™ Protein A JWT203 (D).
Figura 2. Análisis por el programa Design-Expert® Software de la turbiedad de los eluatos neutralizados (justo después de la neutralización, A a D) y de los eluatos neutralizados estabilizados (1 hora después de la neutralización, E a H) tras una elución de la columna de proteína A por un tampón maleato (A y E), acetato (B y F), formiato (C y G) o citrato (D y H), en función del pH (representado en las abscisas) y de la molaridad (representado en las ordenadas) del tampón. Para una pareja (pH/molaridad) dada, la turbiedad de cada eluato se anota por un valor que varía entre 0 y 3, correspondiendo un valor de 0 a un eluato límpido y un valor de 3 a un eluato altamente turbio (opalescencia). Se representan las curvas que representan las parejas (pH/molaridad) que corresponden a un valor de turbiedad.
Figura 3. Análisis del porcentaje de monómeros en unos eluatos neutralizados tras una elución de la columna de proteína A por un tampón maleato (A), acetato (B), formiato (C) o citrato (D), en función del pH (representado en las abscisas) y de la molaridad (representada en las ordenadas) del tampón. Se representan las curvas que representan las parejas (pH/molaridad) que corresponden a un valor de porcentaje de formas monoméricas del anticuerpo en el eluato neutralizado.
Figura 4. Caudal de filtración (g/h/m2 ) en función de la carga de anticuerpos (g/m2) para una nanofiltración sobre un filtro Planova® 15N (A), Planova® 20N (B), o Viresolve® Pro 20N (C).
Figura 5. Carga de anticuerpos (g/m2 ) nanofiltrada en función del tiempo de filtración (minutos) para una nanofiltración sobre un filtro Panova® 15N, Planova® 20N, o Viresolve® Pro 20n .
Figura 6. Variación del rendimiento medio en función del pH de elución utilizado para la columna A3-JSR.
Figura 7. Variación de la eliminación media de HCP en función del pH de elución utilizado para la columna A3-JSR. Figura 8. Variación de la eliminación media de HCP en función de la concentración en NaCl en la solución de lavado para la columna A3-JSR.
Descripción detallada de la invención
Como se ha indicado anteriormente, los procedimientos de purificación de anticuerpos monoclonales imponen a los fabricantes unos costes significativos de producción, que es importante reducir al máximo a fin de disminuir el coste de los tratamientos por anticuerpos monoclonales. Ahora bien, la existencia de numerosos productos comerciales distintos susceptibles de utilizarse para la purificación de anticuerpos monoclonales y la posibilidad muy importante de variaciones de las condiciones de realización de cada etapa hace la selección de una combinación de etapas, de productos y de condiciones de realización apropiadas para reducir el coste global de purificación extremadamente difícil para el experto en la materia.
Sin embargo, los inventores han puesto en evidencia ahora que una combinación particular de etapas de purificación y de eliminación o de inactivación viral permite disminuir de un factor 3 los costes de purificación de un anticuerpo monoclonal, manteniendo al mismo tiempo el nivel de calidad, de pureza, y de seguridad sanitaria del anticuerpo purificado. Esta fuerte disminución del coste de purificación de un anticuerpo monoclonal ha sido posible debido a la selección de productos menos costosos, de productos que permiten tratar una cantidad de anticuerpos más elevada de una sola vez, y por la optimización de las condiciones de realización de cada etapa a fin de mantener el nivel de calidad, de pureza y de seguridad sanitaria del anticuerpo purificado.
La presente invención se refiere por lo tanto a un procedimiento de purificación de un anticuerpo monoclonal o de una proteína de fusión entre el fragmento Fc de un anticuerpo y un segundo polipéptido, tal como se reivindica en las reivindicaciones 1 a 10.
Más generalmente, la presente descripción divulga un procedimiento de purificación de un anticuerpo monoclonal o de una proteína de fusión entre el fragmento Fc de un anticuerpo y un segundo polipéptido, que comprende: a) una etapa de cromatografía de afinidad sobre una resina que tiene por matriz un gel de polímero de metacrilato reticulado, en el que se injerta la proteína A,
b) una etapa de inactivación viral,
c) una etapa de cromatografía intercambiadora de cationes sobre una resina que tiene por matriz un gel de agarosa reticulado, en el que se injertan unos grupos sulfonato (-SO3-) por medio de brazos espaciadores a base de dextrano,
d) una etapa de cromatografía intercambiadora de aniones sobre una membrana hidrófila de poliétersulfna revestida de un polímero reticulado sobre el cual se injertan unos grupos amina cuaternaria (Q), y
e) una etapa de nanofiltración con un filtro que tiene una doble membrana de polietersulfona de una porosidad de aproximadamente 20 nm.
Material de partida
El procedimiento según la invención es aplicable tanto a la purificación de un anticuerpo monoclonal como a una proteína de fusión entre el fragmento Fc de un anticuerpo y un segundo polipéptido. En efecto, la primera etapa (etapa a)) es una etapa de cromatografía de afinidad sobre una resina portadora de proteína A, una proteína de Staphylococcus aureus que se une específicamente al fragmento Fc de los anticuerpos, y en particular al fragmento Fc humano.
Anticuerpos
Por “anticuerpo” o “inmunoglobulina” se entiende una molécula que comprende al menos un dominio de unión a un antígeno dado y un dominio constante que comprende un fragmento Fc capaz de unirse a los receptores FcR. En la mayoría de los mamíferos, como el hombre y el ratón, un anticuerpo está compuesto de 4 cadenas polipeptídicas: 2 cadenas pesadas y 2 cadenas ligeras unidas entre sí por un número variable de puentes disúlfuros que aseguran una flexibilidad a la molécula. Cada cadena ligera está constituida de un dominio constante (CL) y de un dominio variable (VL); estando las cadenas pesadas compuestas de un dominio variable (VH) y de 3 o 4 dominios constantes (CH1 a CH3 o CH1 a CH4) según el isotipo del anticuerpo. En algunos mamíferos raros, como los camellos y los llamas, los anticuerpos están constituidos de solamente dos cadenas pesadas, comprendiendo cada cadena pesada un dominio variable (VH) y una región constante.
Los dominios variables están implicados en el reconocimiento del antígeno, mientras que los dominios constantes están implicados en las propiedades biológicas, farmacocinéticas y efectoras del anticuerpo.
Al contrario de los dominios variables cuya secuencia varía fuertemente de un anticuerpo a otro, los dominios constantes se caracterizan por una secuencia en aminoácidos muy próxima de un anticuerpo al otro, característica de la especie y del isotipo, con eventualmente algunas mutaciones somáticas. El fragmento Fc está naturalmente compuesto de la región constante de la cadena pesada con la exclusión del dominio CH1, es decir de la región bisagra inferior y de los dominios constantes CH2 y CH3 o CH2 a CH4 (según el isotipo). En las IgG1 humanas, el fragmento Fc completo está compuesto de la parte C-terminal de la cadena pesada a partir del resto de cisteína en posición 226 (C226), siendo la numeración de los restos de aminoácidos en el fragmento Fc a lo largo de la presente descripción la del índice EU descrito en Edelman et al. (Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969)) y Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Los fragmentos Fc correspondientes de otros tipos de inmunoglobulinas pueden identificarse fácilmente por el experto en la materia por unas alineaciones de secuencias. El fragmento Fcy está glicosilado a nivel del dominio CH2 con la presencia, en cada una de las 2 cadenas pesadas, de un W-glicano unido al resto de asparagina en posición 297 (Asn 297).
Los dominios de unión siguientes, situados en el Fcy, son importantes para las propiedades biológicas del anticuerpo:
- dominio de unión al receptor FcRn, implicado en las propiedades farmacocinéticas (vida media in vivo) del anticuerpo:
Diferentes datos sugieren que algunos restos situados en el interfaz de los dominios CH2 y CH3 están implicados en la unión al receptor FcRn.
- dominio de unión a la proteína del complemento C1q, implicado en la respuesta CDC (por “citotoxicidad dependiente del complemento”): situado en el dominio CH2;
- dominio de unión a los receptores FcR, implicado en las respuestas de tipo fagocitosis o ADCC (por “citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo”): situado en el domino CH2.
En el sentido de la invención, el fragmento Fc de un anticuerpo puede ser natural, tal como se ha definido anteriormente, o bien haberse modificado de diversas maneras, con la condición de ser capaz de unirse a la proteína A. Las modificaciones pueden incluir la deleción de algunas partes del fragmento Fc, siempre que el fragmento Fc así obtenido sea capaz de unirse a la proteína A. Las modificaciones pueden también incluir diferentes sustituciones de aminoácidos susceptibles de afectar a las propiedades biológicas del anticuerpo, siempre que el fragmento Fc así obtenido sea capaz de unirse a la proteína A. En particular, cuando el anticuerpo es un IgG, este puede comprender unas mutaciones destinadas a aumentar la unión al receptor FcyRIII (CD16), tales como se describen en WO00/42072, Shields et al.-2001, Lazar et al. (Lazar, G. A., et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 103(11): 4005-10), WO2004/029207, WO/2004063351, WO2004/074455. Unas mutaciones que permiten aumentar la unión al receptor FcRn y por lo tanto la vida media in vivo pueden también estar presentes, como se describe por ejemplo en Shields et al. (Shields RL, et al. J Biol Chem. 2001 Mar 2;276(9):6591-604), Dall'Acqua et al.-2002, Hinton et al.-2004, Dall'Acqua et al.-2006(a), WO00/42072, WO02/060919A2, WO2010/045193, o WO2010/106180A2. Otras mutaciones, como las que permiten disminuir o aumentar la unión a las proteínas del complemento y por lo tanto la respuesta CDC, pueden o no estar presentes (véanse WO99/51642; WO2004074455A2; Idusogie EE et al. J Immunol. 2001; 166:2571-5; Dall'Acqua et al. J Immunol 2006; 177:1129-1138; y Moore GL. et al. mAbs 2:2, 181­ 189; Marzo/abril, 2010).
Por “anticuerpo monoclonal” o “composición de anticuerpo monoclonal” se entiende una composición que comprende unas moléculas de anticuerpos que poseen una especificidad antigénica idéntica y única. Las moléculas de anticuerpos presentes en la composición son susceptibles de variar a nivel de sus modificaciones posttraduccionales, y especialmente a nivel de sus estructuras de glicosilación o de su punto isoeléctrico, pero han sido codificadas todas por las mismas secuencias de cadenas pesada y ligera y tienen por lo tanto, antes de cualquier modificación post-traduccional, la misma secuencia proteica. Algunas diferencias de secuencias proteica, relacionadas con modificaciones post-traduccionales (como por ejemplo la escisión de la lisina C-terminal de la cadena pesada, la desamidación de restos de asparagina y/o la isomerización de restos de aspartato) pueden no obstante existir entre las diferentes moléculas de anticuerpos presentes en la composición.
El anticuerpo monoclonal purificado en el ámbito de la invención puede ventajosamente ser quimérico, humanizado o humano. En efecto, la proteína A de Staphylococcus aureus posee una afinidad particular de unión a los fragmentos Fc humanos, y en particular al fragmento Fcy humano.
Por anticuerpo “quimérico” se entiende designar un anticuerpo que contiene una región variable (cadena ligera y cadena pesada) natural derivada de un anticuerpo de una especie dada en asociación con las regiones constantes de cadena ligera y de cadena pesada de un anticuerpo de una especie heteróloga a dicha especie dada. Ventajosamente, si la composición de anticuerpo monoclonal para su utilización como medicamento según la invención comprende un anticuerpo monoclonal quimérico, éste comprende unas regiones constantes humanas. Partiendo de un anticuerpo no humano, un anticuerpo quimérico puede prepararse utilizando las técnicas de recombinación genética bien conocidas por el experto en la materia. Por ejemplo, el anticuerpo quimérico podrá realizarse clonando para la cadena pesada y la cadena ligera un ADN recombinante que comprende un promotor y una secuencia que codifica para la región variable del anticuerpo no humano, y una secuencia que codifica la región constante de un anticuerpo humano. Para los métodos de preparación de anticuerpos quiméricos, se podrá, por ejemplo, referirse al documento Verhoeyn et al. (Verhoeyn et al. BioEssays, 8: 74, 1988).
Por anticuerpo “humanizado”, se entiende designar un anticuerpo que contiene unas regiones CDRs derivadas de un anticuerpo de origen no humano, derivándose las otras partes de la molécula de anticuerpo de uno (o de varios) anticuerpos humanos. Además, algunos de los restos de los segmentos del esqueleto (denominados FR) pueden ser modificados para conservar la afinidad de unión (Jones et al. Nature, 321: 522-525, 1986; Verhoeyen et al.-1988; Riechmann et al. Nature, 332: 323-327, 1988). Los anticuerpos humanizados según la invención pueden prepararse mediante unas técnicas conocidas por el experto en la técnica tales como las tecnologías de “CDR grafting”, de “resurfacing”, de SuperHumanización, de “Human string content”, de “FR libraries”, de “Guided selection”, de “FR shuffling” y de “Humaneering”, como se resume en la revista de Almagro et al. (Almagro et al. Frontiers in Bioscience 13, 1619-1633, 1 de enero de 2008).
Por anticuerpo “humano” se entiende un anticuerpo del cual toda la secuencia es de origen humano, es decir cuyas secuencias codificantes se han producido por recombinación de genes humanos que codifican los anticuerpos. En efecto, es ahora posible producir unos animales transgénicos (por ejemplo unos ratones) que son capaces, en inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulina (véanse Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); Duchosal et al. Nature 355:258 (1992); las patentes US5,591,669; US 5,598,369; US 5,545,806; US 5,545,807; US 6,150,584). Los anticuerpos humanos pueden también obtenerse a partir de bancos de presentación de fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581- 5597 (1991); Vaughan et al. Nature Biotech 14:309 (1996)).
Los anticuerpos pueden ser varios isotipos, en función de la naturaleza de su región constante: las regiones constantes y, a, |i, s y 8 corresponden respectivamente a las inmunoglobulinas IgG, IgA, IgM, IgE e IgD. Ventajosamente, el anticuerpo monoclonal presente en una composición utilizada como medicamento en el ámbito de la invención es de isotipo IgG. En efecto, este isotipo muestra una capacidad para generar una actividad ADCC (“Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity”, es decir citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo) en el mayor número de individuos (humanos) y se utiliza por lo tanto principalmente para las aplicaciones farmacéuticas de anticuerpos monoclonales. Además, la proteína A posee una afinidad particular de unión al fragmento Fcy humano.
Las regiones constantes y comprenden varios sub-tipos: y1, y2, y3, presentando estos tres tipos de regiones constantes la particularidad de fijar el complemento humano, e y4, creando así los sub-isotipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Ventajosamente, el anticuerpo monoclonal presenta en una composición utilizada como medicamento en el ámbito de la invención es de isotipo IgG1. En efecto, el fragmento Fcy1 posee una afinidad de unión particularmente importante para la proteína A.
La composición de anticuerpo monoclonal a purificar por el procedimiento según la invención puede producirse por un clon celular, un animal no humano transgénico o una planta transgénica, mediante tecnologías bien conocidas por el experto en la materia.
Especialmente, se pueden obtener unos clones celulares que producen la composición de anticuerpos a purificar por 3 tecnologías principales:
1) obtención de un hibridoma por fusión de un linfocito B que produce el anticuerpo de interés con una línea inmortalizada,
2) inmortalización de un linfocito B que produce el anticuerpo de interés por el virus Estein-Barr (EBV),
3) Aislamiento de las secuencias que codifican para un anticuerpo de interés (generalmente a partir de un hibridoma o de un linfocito B inmortalizado), clonación en uno o varios vectores de expresión de las secuencias que codifican para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, transformación de una línea celular por el o los vectores de expresión, y separación de los diferentes clones celulares obtenidos. Un vector de expresión de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo comprende los elementos necesarios para la expresión de las secuencias que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, y especialmente un promotor, un codón de iniciación de la transcripción, unas secuencias de terminación, y unas secuencias de regulación de la transcripción apropiadas. Estos elementos varían en función del hospedante que sirve para la expresión y se seleccionan fácilmente por el experto en la materia a la vista de sus conocimientos generales. El vector puede ser especialmente plasmídico o viral. Las técnicas de transformaciones son también bien conocidas por el experto en la materia.
La trasformación de líneas celulares por uno o varios vectores de expresión de las secuencias que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo es la más comúnmente utilizada, en particular para la obtención de anticuerpos quiméricos o humanizados.
La línea celular transformada es preferentemente de origen eucariota, y puede seleccionarse especialmente entre las células de insecto, de plantas, de levadura o de mamíferos. La composición de anticuerpo puede producirse entonces cultivando la célula hospedante en condiciones apropiadas. Unas líneas celulares apropiadas para la producción de anticuerpos incluyen especialmente las líneas seleccionadas entre SP2/0; YB2/0; IR983F; el mieloma humano Namalwa; PERC6; las líneas CHO, especialmente CHO-K-1, CHO-Lec10, CHO-Lec1, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, o la línea CHO eliminada para los dos alelos que codifican el gen FUT8 y/o el gen GMD; Wil-2; Jurkat; Vero; Molt-4; COS-7; 293-HEK; BHK; K6H6; NSO; SP2/0-Ag 14, P3X63Ag8.653, la línea de célula de pato embrionaria EB66® (Vivalis); y líneas de hepatoma de rata H4-II-E (DSM ACC3129), H4-II-Es (DSM ACC3130) (véase el documento WO2012/041768) En un modo de realización preferido, el anticuerpo se produce en una de las líneas siguientes: YB2/0; línea CHO eliminada para los dos alelos que codifican el gen FUT8 y/o el gen GMD; línea de célula de pato embrionaria EB66® (Vivalis); y líneas de hepatoma de rata H4-II-E (DSM ACC3129), H4-II-Es (DSM ACC3130). En un modo de realización preferido, el anticuerpo se produce en YB2/0 (ATCC CRL-1662).
Alternativamente, la composición de anticuerpos a purificar puede producirse en un animal no humano transgénico. Un animal no humano transgénico se puede obtener por inyección directa del o de los genes de interés (aquí, los genes reorganizados que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo) en un huevo fertilizado (Gordon et al.,1980). Un animal no humano transgénico puede también obtenerse por introducción del o de los genes de interés (aquí, los genes reorganizados que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo) en una célula cepa embrionaria y preparación del animal mediante un método de agregación quimérica o un método de inyección quimérica (véase Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)). Un animal no humano transgénico puede también obtenerse por una técnica de clonación en la que un núcleo, en el que el o los genes de interés (aquí los genes reorganizados que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo) se han introducido, se trasplanta en un huevo enucleado (Ryan et al., 1997 Science; 278: 873 - 876; Cibelli et al., 1998 Science, 280: 1256-1258; WO0026357A2). Un animal no humano transgénico que produce un anticuerpo de interés puede prepararse por los métodos anteriores. El anticuerpo puede entonces acumularse en el animal transgénico y recogido, especialmente a partir de la leche o de los huevos del animal. Para la producción de anticuerpos en la leche de animales no humanos transgénicos, unos procedimientos de preparación se describen especialmente en los documentos WO9004036A1, WO9517085A1, WO0126455A1, WO2004050847A2, WO2005033281A2, WO2007048077A2. También se conocen unos procedimientos de purificación de proteínas de interés a partir de leche (véanse los documentos WO0126455A1, WO2007106078A2). Los animales no humanos transgénicos de interés incluyen especialmente el ratón, el conejo, la rata, la cabra, los bovinos (especialmente la vaca) y las aves de corral (especialmente el pollo).
La composición de anticuerpos a purificar puede también producirse en una planta transgénica. Numerosos anticuerpos ya se han producido en unas plantas transgénicas y las tecnologías necesarias para la obtención de una planta transgénica que expresa un anticuerpo de interés y a la recuperación del anticuerpo son bien conocidas por el experto en la materia (véanse Stoger E, et al. Molecular Breeding 9: 149-158, 2002; Fisher R, et al. Vaccine 21 (2003) 820-825; Ma JK, et al. Nat Rev Genet. 2003 Oct;4(10):794-805; Schillberg S, et al. Vaccine 23 (2005) 1764­ 1769). Es también posible influir la glicosilación obtenida en las plantas para obtener una glicosilación próxima de la de los anticuerpos humanos naturales (sin xilosa), pero con además una baja fucosilación, por ejemplo con la ayuda de pequeños ARNs interferentes (Forthal et al., J Immunol 2010;185;6876-6882).
El anticuerpo monoclonal a purificar puede dirigirse contra cualquier antígeno de interés, y especialmente contra los antígenos siguientes:
* Rhesus D, siendo los anticuerpos anti-Rhesus D útiles para la prevención de la aloinmunización en los individuos Rhesus-negativos,
* Antígenos expresados por unas células cancerosas, susceptibles de dirigirse al tratamiento de cánceres, y especialmente: CD20, Her2/neu, CD52, EGFR, EPCAM, CCR4, CTLA-4 (CD152), CD19, CD22, CD3, CD30, CD33, CD4, CD40, CD51 (Integrina alfa-V), CD80, CEA, FR-alfa, GD2, GD3, HLA-DR, IGF1R (CD221), fosfatidilserina, SLAMF7 (CD319), TRAIL-R1, TRAIL-R2.
* antígenos expresados por unas células infectadas por unos agentes patógenos, susceptibles de dirigirse al tratamiento de infecciones por unos agentes patógenos, y especialmente : antígenos de Clostridium difficile, antígeno de Staphylococcus aureus (especialmente ClfA y ácido lipoteicoico), antígenos del cetomegalovirus (especialmente la glicoproteína B), antígenos de Escherichia coli (especialmente toxina Shiga-like, sub-unidad IIB), antígenos del virus respiratorio sincitial (proteínas F especialmente), antígenos del virus de la hepatitis B, antígenos del virus Influenza A (Hemaglutinina especialmente ), antígenos de Pseudomonas aeruginosa serotipo IATS O11, antígenos del virus de la rabia (Glicoproteína especialmente), fosfatidilserina.
* antígenos expresados por unas células inmunitarias, susceptibles de dirigirse al tratamiento de enfermedades autoinmunes, y especialmente: CD20, CD52, CD25, CD2, CD22, CD3, y CD4.
Proteína de fusión Fc
Por “proteína de fusión entre el fragmento Fc de un anticuerpo y un segundo polipéptido” o “proteína de fusión Fc”, se entiende una proteína que comprende un fragmento Fc de anticuerpos unido de manera operacional a un segundo polipéptido. Tal proteína de fusión Fc comprende un fragmento Fc que le confiere las propiedades efectoras y farmacológicas de un anticuerpo (así como la capacidad para unirse a la proteína A), y un segundo polipéptido (pareja de fusión), que le confiere otras propiedades biológicas.
Las proteínas de fusión Fc comprenden, al igual que los anticuerpos monoclonales, un fragmento Fc que se une a la proteína A. En consecuencia, las enseñanzas técnicas obtenidas por los inventores sobre unos anticuerpos monoclonales se aplican directamente a las proteínas de fusión Fc.
El segundo polipéptido o pareja de fusión se puede seleccionar especialmente entre un receptor (o el dominio de unión de un receptor a su ligando), un ligando (o el dominio de unión de un ligando a su receptor), una molécula de adhesión, una citoquina, una quemoquina, o cualquier otra proteína o dominio de una proteína.
La fusión entre el fragmento Fc y el segundo polipéptido puede ser directo o indirecto a través de un enlazador, que puede estar constituido especialmente de uno o varios aminoácidos de tipo glicina o serina.
Tales proteínas de fusión Fc se han desarrollado para diferentes aplicaciones terapéuticas. Especialmente, las proteínas de fusión Fc siguientes son susceptibles de purificarse con la ayuda del procedimiento según la invención: * abatacept y belatacept: proteínas de fusión entre el ectodominio de CTLA-4 y el Fc de una IgG1, utilizadas en la inmunosupresión en la poliartritis reumatoide (abatacept) y trasplantación (belatacept)
* etanercept: proteína de fusión entre el ectodominio del receptor TNF-RII y el Fc de una IgG1, utilizada en el tratamiento de la poliartritis reumatoide y de la psoriasis,
* alefacept: proteína de fusión entre el ectodominio de LFA-3 (CD58) y el Fc de una IgG1, utilizada en terapéutica en el tratamiento del psoriasis, o
* rilonacept: proteína de fusión dimérica constituida de los dominios de unión de las partes extracelulares del receptor de tipo I de la interleucina-1 (IL-1RI) y de una proteína accesorio del receptor de IL-1 (IL-1RAcP) unidas linealmente a la porción Fc de la inmunoglobulina humana IgG1, utilizada en el tratamiento de las formas severas de los síndromes periódicos asociados a la criopirina (CAPS), que incluye el síndrome familiar auto-inflamatorio al frío (FCAS) y el síndrome de Muckle-Wells (MWS).
* atacicept: de fusión recombinante que contiene el receptor soluble TACI asociado al fragmento Fc de una IgG1 humana, utilizado en el tratamiento de la poliartritis reumatoide, el lupus sistémico y la esclerosis múltiple.
* briobacept: proteína de fusión constituida del receptor BAFF y de un fragmento constante de IgG1, utilizada en el tratamiento de la poliartritis reumatoide.
Tales proteínas de fusión Fc se producen de manera recombinante, mediante cualquier tecnología apropiada seleccionada especialmente entre las descritas anteriormente para la producción de anticuerpos monoclonales recombinantes (clon celular transformado, animal no humano transgénico, planta transgénica especialmente).
Producto a purificar
El procedimiento de purificación según la invención se realiza ventajosamente a partir de una composición que comprende el anticuerpo en forma no purificada, es decir que comprende además otros productos contaminantes (otras proteínas, ADN, azúcares, etc.).
El procedimiento según la invención se puede realizar así especialmente a partir de los materiales siguientes:
* sobrenadante de cultivo de un clon productor del anticuerpo monoclonal o de la proteína de fusión entre el fragmento Fc de un anticuerpo y un segundo polipéptido,
* leche de un animal no humano transgénico que expresa el anticuerpo monoclonal o la proteína de fusión entre el fragmento Fc de un anticuerpo y un segundo polipéptido, o
* extracto celular de una planta transgénica que expresa el anticuerpo monoclonal o la proteína de fusión entre el fragmento Fc de un anticuerpo y un segundo polipéptido.
Numerosos anticuerpos monoclonales o proteínas de fusión entre el fragmento Fc de un anticuerpo y un segundo polipéptido se producen en unos clones celulares transformados, y el procedimiento según la invención puede por lo tanto realizarse ventajosamente sobre un sobrenadante de cultivo de un clon productor de anticuerpo monoclonal o de la proteína de fusión entre el fragmento Fc de un anticuerpo y un segundo polipéptido. Por “clon productor del anticuerpo monoclonal o de la proteína de fusión entre el fragmento Fc de un anticuerpo y un segundo poliéptido” se entiende una célula transformada (que puede seleccionarse especialmente entre las descritas anteriormente) por un vector de expresión del anticuerpo monoclonal o de la proteína de fusión entre el fragmento Fc de un anticuerpo y un segundo polipéptido. Por “sobrenadante de cultivo”, se entiende la composición obtenida por centrifugación del medio de cultivo de las células del clon productor y exclusión de las células o restos presentes en el medio de cultivo, pudiendo dicho medio de cultivo opcionalmente haberse sometido previamente y a una etapa de lisis de las células del clon productor.
Etapa a)
La etapa a) del procedimiento según la invención es una etapa de cromatografía de afinidad sobre una resina que tiene por matriz un gel de polímero de metacrilato reticulado, en el que se injerta la proteína A. Esta etapa permite purificar de manera muy importante el anticuerpo o la proteína de fusión Fc, debido a una fuerte afinidad y a la fuerte especificidad de la proteína A para el fragmento Fc de los anticuerpos.
Proteína A
La cromatografía de afinidad permite separar específicamente las moléculas que se unen a un ligando particular. En el ámbito de la purificación de anticuerpos, una etapa de cromatografía de afinidad a la proteína A se utiliza habitualmente, uniéndose esta proteína específicamente al fragmento Fc de los anticuerpos, en particular al fragmento Fc humano, y más particularmente al fragmento Fcy y especialmente Fcy1 humano.
Por “proteína A” se entiende la proteína de Staphylococcus aureus codificada por el gen spa, o un derivado o un fragmento de esta proteína capaz de unirse al fragmento Fc de un anticuerpo monoclonal. La proteína A de Staphylococcus aureus codificada por el gen spa es una proteína membranaria de Staphylococcus aureus que comprende en N-terminal 5 dominios homólogos (E-D-A-B-C) capaces cada uno de unirse al fragmento Fc de los anticuerpos, sirviendo la región C-terminal (X) para anclar la proteína en la membrana bacteriana. Una proteína A nativa puede aislarse directamente de cultivos de Staphylococcus aureus que segregan proteína A, o de cultivo de bacterias de Escherichia coli (E. coli) recombinantes que expresa la proteína A (Lofdahl et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1983 Feb;80(3):697-701; Uhlén et al. J Biol Chem. 1984 Feb 10;259(3):1695-702). A fin de optimizar su utilización para la cromatografía de afinidad, se han propuesto diferentes fragmentos o variantes de proteínas A capaces de unirse específicamente y con una fuerte afinidad al fragmento Fc de los anticuerpos. En particular, se han propuesto diferentes dominios de la proteína A nativa o derivados y/o fragmentos de estos dominios en forma repetida (dímeros, tetrámeros o hexámeros en particular) para la purificación de anticuerpos. Así, se ha propuesto un fragmento “Z” del dominio B de la proteína A para utilizarse en la purificación de anticuerpos (US 6,013,763). Se han descritos también diferentes variantes de proteína A recombinante o de fragmento de proteína A recombinante que comprenden un resto de cisteína o un resto de arginina en N-terminal que permiten un enganche más fácil a la matriz de cromatografía (US5,084,559; US5,260,373; US6,399,750). También se han descrito unas variantes de proteína A o de fragmentos funcionales de proteína A que tienen una estabilidad mejorada en condiciones alcalinas (US7,709,209; WO2012/083425), siendo estas variantes útiles para permitir una desinfección repetida de las columnas de cromatografía de afinidad con la proteína A sin liberación demasiado importante de proteína A.
Matriz de cromatografía de afinidad
En el procedimiento según la invención, la proteína A está unida a una matriz de cromatografía de afinidad constituida de un gel de polímero de metacrilato reticulado.
Por “polímero de metacrilato reticulado” se entiende cualquier polímero o copolímero reticulado que comprende unos monómeros de metacrilatos. Por “metacrilato” se entiende el ion metacrilato de fórmula (CH2=C(CH3)COO"), así como las sales y los ésteres de este ion.
En efecto, los inventores han puesto en evidencia que este tipo particular de resina permite aumentar la carga de anticuerpo purificado de una sola vez, garantizar un buen rendimiento (al menos 90%) y obtener un eluato con aspecto límpido (véase el ejemplo 1).
El gel de polímero de metacrilato reticulado en el que se injerta la proteína A utilizada en la etapa a) puede ventajosamente presentarse en forma de bolas que tienen un diámetro medio comprendido entre 30 y 60 pm, ventajosamente entre 40 y 50 pm, y especialmente de aproximadamente 45, 49 o 50 pm.
Según la proteína A utilizada, esta puede unirse a la matriz de cromatografía de afinidad mediante diferentes tipos de acoplamientos habituales, como el acoplamiento multipunto por CNBr (acoplamiento entre unas funciones primarias de la proteína A y una matriz activada por CNBr), el acoplamiento de punto único por una unión tioéter entre la matriz y un resto de cisteína de la proteína A, obtenido en particular por activación de la matriz por un epóxido o por una epiclorohidrina.
Unos ejemplos de matrices constituidas de un gel de polímero de metacrilato reticulado en forma de bolas que tienen un diámetro medio comprendido entre 40 y 50 pm, en el que se injerta la proteína A, incluyen las matrices siguientes: TOYOPEARL® AF-rProtein A HC-650F (matriz de polímero de metacrilato hidroxilado en forma de bolas de un diámetro medio de 45 pm, en el que se injerta la proteína A recombinante, comercializada por TOSOH BIOSCIENCE), Amsphere™ Protein A JWT203 (resina de polímero de metacrilato en forma de bolas de un diámetro medio de 49 pm, en la que se injerta un tetrámero de dominio C modificado estable en condiciones alcalinas producido en E. coli, comercializada por JSR Corporation), Amsphere™ Protein A A3 (resina de copolímero de metacrilato y de un monómero hidrófilo en forma de bolas de un diámetro medio comprendido entre 20 y 80 pm, preferentemente entre 30 y 70 pm, entre 40 y 60 pm, o entre 40 y 50 pm, en la que se injerta un tetrámero de dominio C modificado estable en condiciones alcalinas producidos en E. coli., comercializada por JSR Corporation). Ventajosamente, la resina que tiene por matriz un gel de polímero de metacrilato reticulado, en el que se injerta la proteína A se selecciona entre:
* una matriz de polímero de metacrilato hidroxilado en forma de bolas de un diámetro medio de 45 pm, en la que se injerta la proteína A recombinante (en particular la resina TOYOPEARL® AF-rProtein A HC-650F);
* una resina de polímero de metacrilato en forma de bolas de un diámetro medio de 49 pm, en la que se injerta un tetrámero de dominio C modificado estable en condiciones alcalinas producido en E. coli (especialmente la resina Amsphere™ Protein A JWT203), y
* una resina de copolímero de metacrilato y de un monómero hidrófilo en forma de bolas de un diámetro medio comprendido entre 20 y 80 pm, preferentemente entre 30 y 70 pm, entre 40 y 60 pm, o entre 40 y 50 pm, en la que se injerta un tetrámero de dominio C modificado estable en condiciones alcalinas producido en E. coli (especialmente la resina Amsphere™ Protein A A3).
Más ventajosamente, la resina es:
* una resina de polímero de metacrilato en forma de bolas de un diámetro medio de 49 pm, en la que se injerta un tetrámero de dominio C modificado estable en condiciones alcalinas producido en E. coli (especialmente la resina Amsphere™ Protein A JWT203), o
* una resina de copolímero de metacrilato y de un monómero hidrófilo en forma de bolas de un diámetro medio comprendido entre 20 y 80 |jm, preferentemente entre 30 y 70 |jm, entre 40 y 60 |jm, o entre 40 y 50 |jm, en la que se injerta un tetrámero de dominio C modificado estable en condiciones alcalinas producido en E. coli (especialmente la resina Amsphere™ Protein A A3).
Aún más ventajosamente, la resina es una resina de copolímero de metacrilato y de un monómero hidrófilo en forma de bolas de un diámetro medio comprendido entre 20 y 80 jim, preferentemente entre 30 y 70 jim, entre 40 y 60 jim, o entre 40 y 50 jim, en la que se injerta un tetrámero de dominio C modificado estable en condiciones alcalinas producido en E. coli (especialmente la resina Amsphere™ Protein A A3). Tal resina posee en efecto una fuerte capacidad de carga y permite obtener unos eluatos con un buen rendimiento, una baja turbiedad, y una buena eliminación de las impurezas y especialmente de otras proteínas producidas por la célula de producción (denominadas “HCP” por “Host cell proteins”), y un ADN de la célula de producción (denominado “HC-DNA” por “Host cell DNA”) (véase el ejemplo 4).
Lavado (opcional)
La etapa a) del procedimiento según la invención puede comprender además, de manera opcional pero preferida, una subetapa de lavado de la resina que tiene por matriz un gel de polímero de metacrilato reticulado, en el que se injerta la proteína A, en la que se fija el anticuerpo monoclonal o la proteína de fusión entre el fragmento Fc de un anticuerpo y un segundo poliéptido.
Tal lavado permite especialmente mejorar la eliminación de las impurezas, y especialmente de las otras proteínas producidas por la célula de producción (denominadas “HCP” por “Host cell proteins”), y un ADN de la célula de producción (denominado “HC-DNA” por “Host cell DNA”).
Este lavado se realiza ventajosamente con la ayuda de una solución salina que comprende una concentración en NaCl de al menos 1M, ventajosamente al menos 1,2M, al menos 1,3M, al menos 1,4M, al menos 1,5M, al menos 1,6M, incluso al menos 1,7M. Ventajosamente, la concentración en NaCl de la solución salina utilizada para el lavado está comprendida entre 1M y 2,5M, entre 1M y 2,1M, entre 1M y 2M, entre 1M y 1,9M, entre 1M y 1,8M, entre
1M y 1,7M, entre 1,1M y 2,5M, entre 1,1M y 2,1M, entre 1,1M y 2M, entre 1,1M y 1,9M, entre 1,1M y 1,8M, entre
1,1M y 1,7M, entre 1,2M y 2,5M, entre 1,2M y 2,1M, entre 1,2M y 2M, entre 1,2M y 1,9M, entre 1,2M y 1,8 1,2M y 1,7M, entre 1,3M y 2,5M, entre 1,3M y 2M, entre 1,3M y 1,9M, entre 1,3M y 1,8M, entre 1,3M y 1,7 1,4M y 2,5M, entre 1,4M y 2M, entre 1,4M y 1,9M, entre 1,4M y 1,8M, entre 1,4M y 1,7M, entre 1,5M y 2,5 1,5M y 2M, entre 1,5M y 1,9M, entre 1,5M y 1,8M, entre 1,5M y 1,7M, entre 1,6M y 2,5M, entre 1,6M y 2M, entre
1,6M y 1,9M, entre 1,6M y 1,8M, entre 1,6M y 1,7M, entre 1,7M y 2,5M, entre 1,7M y 2M, entre 1,7M y 1,9M, entre
1,7M y 1,8M, y en particular de aproximadamente 1,7M. Se podrá utilizar especialmente una solución que tiene la composición siguiente: Tampón Tris 25 mM, EDTA 5 mM, pH 7,1, y NaCl en uno delos intervalos de concentraciones descritas anteriormente.
A pesar de que tal lavado pueda utilizarse para cualquier matriz de cromatografía de afinidad constituida de un gel de polímero de metacrilato reticulado, es particularmente ventajoso cuando la matriz de cromatografía de afinidad es una resina de copolímero de metacrilato y de un monómero hidrófilo en forma de bolas de un diámetro medio comprendido entre 20 y 80 |im, preferentemente entre 30 y 70 |im, entre 40 y 60 |im, o entre 40 y 50 |im, en la que se injerta un tetrámero de dominio C modificado estable en condiciones alcalinas producido en E. coli, tal como la resina Amsphere™ Protein A A3 comercializada por JSR Corporation.
Tampón de elución
Durante la etapa a), la composición de anticuerpo monoclonal o de proteína de fusión Fc a purificar se inyecta sobre una resina que tiene por matriz un gel de polímero de metacrilato reticulado, en el que se injerta la proteína A, equilibrada por un tampón de pH neutro, a la que el anticuerpo monoclonal o la proteína de fusión Fc se unirá por medio del fragmento Fc.
La resina se lava después para eliminar los contaminantes no unidos a la resina, después el anticuerpo monoclonal o la proteína de fusión Fc se eluye con la ayuda de un tampón que permite romper la unión entre la proteína A y el fragmento fc del anticuerpo o de la proteína de fusión Fc.
En la presente descripción, se pueden utilizar diferentes tipos de tampones para la elución. Especialmente, la elución puede obtenerse a pH ácido, y pueden utilizarse, por lo tanto, unos tampones que utilizan diferentes ácidos débiles para la elución.
Sin embargo, en el ámbito de la presente invención, se utiliza un tampón formiato de sodio. En el ámbito de la invención, el tampón formiato de sodio se utiliza a una molaridad de 5 a 10 mM, ventajosamente de 5 a 9 mM, de 5 a
8 mM, de 5 a 7 mM, de 5 a 6 mM, de 6 a 10 mM, de 6 a 9 mM, de 6 a 8 mM, de 6 a 7 mM, de 7 a 10 mM, de 7 a 9 mM, de 7 a 8 mM, de 8 a 10 mM, de 8 a 9 mM, o de 9 a 10 mM, más ventajosamente de 5 a 9 mM, de 5 a 8 mM, de
5 a 7 mM, de 5 a 6 mM y especialmente de aproximadamente 5 mM. En el ámbito de la invención, el tampón formiato de sodio se utiliza a un pH comprendido entre 2,6 y 3,6, entre 2,7 y 3,6, entre 2,8 y 3,6, entre 2,9 y 3,6, entre 3,0 y 3,6, entre 3,1 y 3,6, entre 3,2 y 3,6, entre 3,3 y 3,6, entre 3,4 y 3,6, entre 3,5 y 3,6, entre 2,6 y 3,5, entre 2.7 y 3,5, entre 2,8 y 3,5, entre 2,9 y 3,5, entre 3,0 y 3,5, entre 3,1 y 3,5, entre 3,2 y 3,5, entre 3,3 y 3,5, entre 3,4 y 3,5, entre 2,6 y 3,4, entre 2,7 y 3,4, entre 2,8 y 3,4, entre 2,9 y 3,4, entre 3,0 y 3,4, entre 3,1 y 3,4, entre 3,2 y 3,4, entre 3,3 y 3,4, entre 2,6 y 3,3, entre 2,7 y 3,3, entre 2,8 y 3,3, entre 2,9 y 3,3, entre 3,0 y 3,3, entre 3,1 y 3,3, entre 3,2 y 3,3, entre 2,6 y 3,2, entre 2,7 y 3,2, entre 2,8 y 3,2, entre 2,9 y 3,2, entre 3,0 y 3,2, entre 3,1 y 3,2, entre 2,6 y 3.1, entre 2,7 y 3,1, entre 2,8 y 3,1, entre 2,9 y 3,1, entre 3,0 y 3,1, entre 2,6 y 3,0, entre 2,7 y 3,0, entre 2,8 y 3,0, entre 2,9 y 3,0, entre 2,6 y 2,9, entre 2,7 y 2,9, entre 2,8 y 2,9, entre 2,6 y 2,8, entre 2,7 y 2,8, o entre 2,6 y 2,7, más ventajosamente entre 2,7 y 3,5, entre 2,8 y 3,4, entre 2,9 y 3,3, entre 3,0 y 3,2, incluso de aproximadamente 3,1, o entre 3,6 y 4, o también entre 3,1 y 3,6.
Cuando la matriz de cromatografía de afinidad es una resina de polímero de metacrilato en forma de bolas de un diámetro medio de 49 |im, sobre la cual se injerta un tetrámero de dominio C modificado estable en condiciones alcalinas producido en E. coli, tal como la resina Amsphere™ Protein A JWT203 comercializada por JSR Corporation, el pH óptimo de elución se ha determinado a aproximadamente 3,1, y se prefiere cualquier intervalo de pH de elución mencionado anteriormente que enmarca este valor óptimo. Cuando la matriz de cromatografía de afinidad es una resina de copolímero de metacrilato y de un monómero hidrófilo en forma de bolas de un diámetro medio comprendido entre 20 y 80 pm, preferentemente entre 30 y 70 pm, entre 40 y 60 pm, o entre 40 y 50 pm, en la que se injerta un tetrámero de dominio C modificado estable en condiciones alcalinas producido en E. coli, tal como la resina Amsphere™ Protein A A3 comercializada por JSR Corporation, el pH óptimo de elución se ha determinado a aproximadamente 3,6, y se prefiere cualquier intervalo de pH de elución mencionado anteriormente que enmarca este valor óptimo.
En el ámbito de la invención, se utiliza el tampón formiato de sodio:
* a une molaridad de 5 a 10 mM, ventajosamente de 5 a 9 mM, de 5 a 8 mM, de 5 a 7 mM, de 5 a 6 mM, de 6 a 10 mM, de 6 a 9 mM, de 6 a 8 mM, de 6 a 7 mM, de 7 a 10 mM, de 7 a 9 mM, de 7 a 8 mM, de 8 a 10 mM, de 8 a 9 mM, o de 9 a 10 mM, más ventajosamente de 5 a 9 mM, de 5 a 8 mM, de 5 a 7 mM, de 5 a 6 mM y especialmente de aproximadamente 5 mM, y
* a un pH comprendido entre 2,6 y 3,6, entre 2,7 y 3,6, entre 2,8 y 3,6, entre 2,9 y 3,6, entre 3,0 y 3,6, entre 3,1 y 3,6, entre 3,2 y 3,6, entre 3,3 y 3,6, entre 3,4 y 3,6, entre 3,5 y 3,6, entre 2,6 y 3,5, entre 2,7 y 3,5, entre 2,8 y 3,5, entre 2,9 y 3,5, entre 3,0 y 3,5, entre 3,1 y 3,5, entre 3,2 y 3,5, entre 3,3 y 3,5, entre 3,4 y 3,5, entre 2,6 y 3,4, entre 2,7 y 3,4, entre 2,8 y 3,4, entre 2,9 y 3,4, entre 3,0 y 3,4, entre 3,1 y 3,4, entre 3,2 y 3,4, entre 3,3 y 3,4, entre 2,6 y 3,3, entre 2,7 y 3,3, entre 2,8 y 3,3, entre 2,9 y 3,3, entre 3,0 y 3,3, entre 3,1 y 3,3, entre 3,2 y 3,3, entre 2,6 y 3,2, entre 2.7 y 3,2, entre 2,8 y 3,2, entre 2,9 y 3,2, entre 3,0 y 3,2, entre 3,1 y 3,2, entre 2,6 y 3,1, entre 2,7 y 3,1, entre 2,8 y 3.1, entre 2,9 y 3,1, entre 3,0 y 3,1, entre 2,6 y 3,0, entre 2,7 y 3,0, entre 2,8 y 3,0, entre 2,9 y 3,0, entre 2,6 y 2,9, entre 2,7 y 2,9, entre 2,8 y 2,9, entre 2,6 y 2,8, entre 2,7 y 2,8, o entre 2,6 y 2,7, más ventajosamente entre 2,7 y 3,5, entre 2,8 y 3,4, entre 2,9 y 3,3, entre 3,0 y 3,2, incluso de aproximadamente 3,1, o entre 3,6 y 4, o también entre 3,1 y 3,6.
En efecto, este tipo de tampón permite obtener un rendimiento satisfactorio, un eluato límpido o débilmente opalescente y de un volumen satisfactorio, así como una muy débil proporción de agregados de anticuerpos. No es el caso de tampones como los tampones acetato de sodio dihidratato o citrato trisódico dihidratato, que conducen a unos eluatos media o fuertemente opalescentes, o el tampón ácido maleico, NaOH 0,5M que conduce a una formación significativa de agregados de anticuerpos (véase el ejemplo 1).
Además, este tipo de tampón permite una buena eliminación de las impurezas, y especialmente de las otras proteínas producidas por la célula de producción (denominadas “HCP” por “Host cell proteins”), y un ADN de la célula de producción (denominado “HC-DNA” por “Host cell DNA”) (véase el ejemplo 4).
Al final de la elución del anticuerpo o de la proteína de fusión Fc, el eluato puede neutralizarse, es decir llevado a un pH comprendido entre 5 y 7, especialmente entre 5,5 y 6,5, y en particular de aproximadamente 6,0. Esta neutralización se puede realizar especialmente añadiendo una cantidad apropiada de tampón Tris 1M a pH 7,5 o de sosa (NaOH) 1M.
Así, las elecciones específicas realizadas por los inventores que se refieren a la matriz de cromatografía de afinidad y el tampón de elución permiten disminuir significativamente el coste de esta etapa (carga aumentada, muy buen rendimiento, matriz relativamente barata), garantizando al mismo tiempo una fuerte purificación y una buena calidad del anticuerpo purificado (eluato límpido o débilmente opalescente, muy débil proporción de agregados).
Etapa b)
La etapa b) del procedimiento según la invención es una etapa de inactivación viral.
Por “etapa de inactivación viral” se entiende una etapa en la que los virus no se eliminan de la solución (unos antígenos pueden todavía detectarse), pero se hacen inactivos y por lo tanto inofensivos. Estas etapas incluyen especialmente articular el calentamiento en seco, la pasteurización y el tratamiento disolvente-detergente o por un detergente solo. Estas diferentes etapas de inactivación viral son bien conocidas por el experto en la materia (véanse especialmente las directivas de la OMS que se refieren a los procedimientos de inactivación y de eliminación viral destinados a asegurar la seguridad viral de los productos derivados del plasma sanguíneo humano, disponibles en la página internet de la OMS).
Ventajosamente, en el procedimiento según la invención, la etapa de inactivación viral es una etapa de tratamiento disolvente-detergente o de tratamiento por un detergente solo. Un tratamiento disolvente-detergente se realiza por un tratamiento de la solución por una mezcla de disolvente, especialmente el tri-(N-butil)-fosfato (TnBP), y de un detergente, especialmente el polisorbato 80 (polioxietileno (20) sorbitán monooleato) o el polioxietilen-p-t-octilfenol (Triton X-100, N° CAS 9002-93-1), en condiciones apropiadas. Un ejemplo de etapa de tratamiento disolventedetergente se realiza en presencia del 1% (peso/volumen) de polisorbato 80 y el 0,3% (volumen/volumen) de TnBP durante al menos 7 horas a 25+ 1°C. La etapa de inactivación viral puede también realizarse por tratamiento por un detergente solo, tal como el polisorbato 80 (polioxietileno (20) sorbitán monooleato) o el polioxietilen-p-t-octilfenol (Triton X-100, N° CAS 9002-93-1). Un ejemplo de tal tratamiento es una incubación durante 30 a 120 minutos (especialmente durante aproximadamente 1 hora) a una temperatura de 20 a 25°C (especialmente a una temperatura de aproximadamente 21 o 22°C) en un medio que comprende del 0,5 al 2% (v/v) (especialmente aproximadamente 1% v/v) de polioxietilen-p-t-octilfenol (Triton X-100, N° CAS 9002-93-1).
Etapa c)
La etapa c) tiene como objetivo mejorar la purificación del anticuerpo monoclonal o de la proteína de fusión Fc eliminando diferentes contaminantes, tales como las proteínas o los ácidos nucleicos residuales del hospedante de producción, la proteína A susceptible de haberse liberado durante la etapa a) o el disolvente y/o el detergente susceptible de haberse utilizado en la etapa b).
La etapa c) del procedimiento según la invención es una etapa de cromatografía intercambiadora de cationes sobre una resina que tiene por matriz un gel de agarosa reticulado, en el que se injertan unos grupos sulfonato (-SO3-) por medio de brazos espaciadores a base de dextrano.
En efecto, los inventores han puesto en evidencia que la utilización de tal resina permite aumentar la carga de anticuerpo monoclonal o de proteína de fusión Fc susceptible de tratarse de una sola vez, reduciendo así los costes de purificación (véase el ejemplo 2).
En esta etapa, la composición de anticuerpo monoclonal o de proteína de fusión Fc procedente de la etapa b) de inactivación viral se aplica sobre una resina que tiene por matriz un gel de agarosa reticulado, en el que se injertan unos grupos sulfonato (-SO3-) por medio de brazos espaciadores a base de dextrano.
La conductividad y/o el pH de la composición procedente de la etapa b) de inactivación viral puede ventajosamente ajustarse antes de la aplicación sobre la resina. Especialmente, la conductividad puede ajustarse a un valor comprendido entre 3 y 7 mS/cm, especialmente entre 4 y 6 mS/cm y en particular de aproximadamente 5 mS/cm. El ajuste de la conductividad puede realizarse especialmente añadiendo una cantidad apropiada de agua purificada, de un tampón acetato de sodio o ventajosamente de un tampón formiato. El pH puede ajustarse a un valor comprendido entre 5 y 7, en particular entre 5,5 y 6,5, y especialmente de aproximadamente 6,0. El ajuste del pH puede realizarse especialmente añadiendo una cantidad apropiada de sosa (NaOH) 0,5M.
El gel de agarosa reticulado, en el que se injertan unos grupos sulfonato (-SO3-) por medio de brazos espaciadores a base de dextrano utilizado en la etapa c) puede ventajosamente presentarse en forma de bolas que tienen un diámetro medio comprendido entre 10 y 200 | i m, ventajosamente entre 50 y 150 |i m, y en particular de aproximadamente 90 |i m.
Unos ejemplos de matrices constituidas de un gel de agarosa reticulado, en el que se injertan unos grupos sulfonato (-SO3-) por medio de brazos espaciadores incluyen las matrices siguientes: Capto™ S (matriz de gel de agarosa reticulado, en el que se injertan unos grupos sulfonato (-SO3-) por medio de brazos espaciadores a base de dextrano en forma de bolas de un diámetro medio de 90 |i m, comercializada por GE Healthcare Life Sciences), Fractogel® EMD SO3" (matriz de polímero de metacrilato, en el que se injertan unos grupos sulfonato (-SO3 ) por medio de largas cadenas de polímero lineal de acrilamida que comprende 15 a 50 unidades de acrilamida, en forma de bolas de un diámetro medio de 30 (tipo S) o de 65 (tipo M) |i m), y Eshmuno®S (matriz de poliviniléter reticulado hidrófilo, en la que se injertan unos grupos sulfonato (-SO3-) por medio de brazos espaciadores, en forma de bolas de un diámetro medio de 75-95 |i m). Ventajosamente, la resina que tiene por matriz un gel de agarosa reticulado, en el que se injertan se selecciona entre una matriz de gel de agarosa reticulado, en el que se injertan unos grupos sulfonato (-SO3-) por medio de brazos espaciadores a base de dextrano en forma de bolas de un diámetro medio de 90 |i m (resina Capto™ S especialmente), una matriz de polímero de metacrilato, en la que se injertan unos grupos sulfonato (-SO3-) por medio de largas cadenas de polímero lineal de acrilamida que comprende 15 a 50 unidades de acrilamida, en forma de bolas de un diámetro medio de 30 (tipo S) o 65 (tipo M) pm (resina Fractogel® EMD SO3" especialmente) y una matriz de poliviniléter reticulado hidrófilo, en la que se injertan unos grupos sulfonato (-SO3-) por medio de brazos espaciadores, en forma de bolas de un diámetro medio de 75-95 pm (resina Eshmuno® S especialmente), más ventajosamente la resina es una matriz de gel de agarosa reticulado, en el que se injertan unos grupos sulfonato (-SO3-) por medio de brazos espaciadores a base de dextrano en forma de bolas de un diámetro medio de 90 pm (resina Capto™ S especialmente).
La elución se puede realizar especialmente aumentando la conductividad y/o el pH. En particular, el tampón de elución puede poseer una conductividad comprendida entre 16 y 20 mS/cm, especialmente entre 17 y 19 mS/cm y en particular de aproximadamente 18 mS/cm. El tampón de elución puede poseer un pH comprendido entre 6 y 8, especialmente entre 6,5 y 7,5 y en particular de aproximadamente 7,0. Puede tratarse en particular de un tampón Tris 20 mM, NaCl csp conductividad 18 mS/cm y pH 7,0.
El caudal de la etapa de cromatografía se ajusta ventajosamente a un valor que corresponde a un tiempo de estancia comprendido entre 1 y 3 minutos, ventajosamente entre 1,5 y 2,5 minutos y especialmente de aproximadamente 2 minutos. En función del volumen de gel, el caudal apropiado puede calcularse en base a la fórmula siguiente: caudal (ml/min) = volumen de gel (ml)/tiempo de residencia (min).
Etapa d)
La etapa d) del procedimiento según la invención tiene como objetivo mejorar aún más la purificación del anticuerpo monoclonal o de la proteína de fusión Fc eliminando diferentes contaminantes, tales como las proteínas o los ácidos nucleicos residuales del hospedante de producción, la proteína A susceptible de haberse liberado durante la etapa a) o el disolvente y/o el detergente susceptible de haberse utilizado en la etapa b). Es particularmente eficaz para eliminar los ácidos nucleicos residuales.
Se trata de una etapa de cromatografía intercambiadora de aniones en una membrana hidrófila de polietersulfona revestida de un polímero reticulado en el que se injertan unos grupos amina cuaternaria (Q).
La membrana posee ventajosamente un tamaño medio de poros comprendido entre 0,5 y 1 pm, ventajosamente entre 0,6 y 0,9 pm, entre 0,7 y 0,9 pm, y en particular de aproximadamente 0,8 pm.
La membrana comprende ventajosamente varias capas de polietersulfona revestida de un polímero reticulado en el que se injertan unos grupos amina cuaternaria (Q), ventajosamente entre 10 y 20 capas, especialmente entre 14 y 18 capas, y en particular 16 capas.
Un ejemplo de tal membrana es la membrana Mustang® Q (membrana hidrófila de 16 capas de polietersulfona que tiene un tamaño medio de poros de 0,8 pm, revestida de un polímero reticulado en el que se injertan unos grupos amina cuaternaria (Q)), comercializada por Pall.
En esta etapa d), la composición de anticuerpo monoclonal o de proteína de fusión Fc procedente de la etapa c) de cromatografía intercambiadora de cationes se aplica sobre una membrana hidrófila de polietersulfona revestida de un polímero reticulado en el que se injertan unos grupos amina cuaternaria (Q).
La conductividad y/o el pH de la composición procedente de la etapa c) de cromatografía intercambiadora de cationes puede ventajosamente ajustarse antes de la aplicación sobre la membrana. En particular, la conductividad se puede ajustar a un valor comprendido entre 8 y 12 mS/cm, en particular entre 9 y 11 mS/cm y en particular de aproximadamente 10 mS/cm. El ajuste de la conductividad se puede realizar añadiendo una cantidad apropiada de un tampón fosfato 20 mM o ventajosamente de un tampón Tris 20 mM. El pH puede, en lo que se refiere a él, ajustarse a un valor comprendido entre 6 y 10, especialmente entre 7,0 y 9,0, entre 7,5 y 8,5, y en particular de aproximadamente 8,0.
El ajuste del pH se puede realizar especialmente añadiendo una cantidad apropiada de sosa (NaOH) 0,5M.
La membrana se equilibra ventajosamente por un tampón Tris, en particular un tampón Tris que tiene las características siguientes:
* una concentración comprendida entre 15 y 25 mM, entre 16 y 24 mM, entre 17 y 23 mM, entre 18 y 22 mM, entre 19 y 21 mM, en particular de aproximadamente 20 mM,
* un pH comprendido entre 6 y 10, entre 7,0 y 9,0, entre 7,5 y 8,5, en particular de aproximadamente 8,0,
* una conductividad comprendida entre 8 y 12 mS/cm, especialmente entre 9 y 11 mS/cm y en particular de aproximadamente 10 mS/cm.
Etapa e)
La etapa d) del procedimiento según la invención tiene como objetivo eliminar los virus, y especialmente los pequeños virus no recubiertos más resistentes a los tratamientos de inactivación viral, susceptibles de encontrarse en la composición purificada de anticuerpos o de proteína de fusión Fc, a fin de garantizar la seguridad viral del producto farmacéutico final.
En efecto, los tratamientos clásicos de inactivación viral, y especialmente el tratamiento disolvente-detergente o detergente solo, tienen una eficacia limitada en lo que se refiere a los virus no recubiertos, tales como los parvovirus o el virus de la hepatitis A.
Ahora bien, la nanofiltración, que se basa en un mecanismo de exclusión en función del tamaño de las partículas, se conoce por ser eficaz sobre los virus no recubiertos. Los filtros más habitualmente utilizados para excluir los pequeños virus no recubiertos son los filtros Planova® comercializados por Asah Kasei, en particular los filtros Planova® 15N y Planova® 20N, que tienen respectivamente un tamaño medio de poros de 15 y 19 nm. Estos filtros, constituidos de una membrana de fibras huecas formada de celulosa regenerada con cupramonio se caracterizan por una baja dispersabilidad del tamaño de los poros (+2 nm alrededor del tamaño medio). Sin embargo, estos filtros son muy costosos y no permiten el tratamiento de una fuerte carga proteica en un plazo de tiempo restringido (por ejemplo: tiempo de tratamiento aceptable de 4 horas), salvo si se aumenta considerablemente la superficie de filtración (y por lo tanto al final el coste de esta etapa).
En el ámbito de la presente invención, los inventores han puesto en evidencia que era muy ventajoso utilizar un filtro Viresolve® Pro (filtro que tiene una doble membrana asimétrica de polietersulfona que retiene al menos 4 logs decimales de virus que tiene un tamaño de al menos 20 nm) en lugar de un filtro Planova® 15N o Planova® 20N, permitiendo el filtro Viresolve® Pro nanofiltrar una carga de anticuerpo mucho más importante que los filtros Planova® 15N y planova® 20N (véase el ejemplo 4).
La etapa e) consiste por lo tanto en una etapa de nanofiltración con un filtro que tiene una doble membrana de polietersulfona de una porosidad de aproximadamente 20 nm.
Tales filtros incluyen en particular el filtro Viresolve® Pro (filtro que tiene una doble membrana asimétrica de polietersulfona de una porosidad de aproximadamente 20 nm, comercializado por Merck-Millipore) y el filtro Virosart® CPV (filtro que tiene una doble membrana simétrica de polietersulfona de una porosidad de aproximadamente 20 nm, comercializado por Sartorius). La nanofiltración de la etapa e) se realiza ventajosamente utilizando un filtro que tiene una doble membrana asimétrica de polietersulfona de una porosidad de aproximadamente 20 nm, tal como el filtro Viresolve® Pro comercializado por Merck-Millipore. Por “porosidad de aproximadamente 20 nm” se entiende que el tamaño medio de los poros del filtro está comprendido entre 17 y 25 nm, ventajosamente entre 17 y 24 nm, entre 17 y 23 nm, entre 17 y 22 nm, entre 17 y 21 nm, entre 17 y 20 nm, entre 18 y 25 nm, entre 18 y 24 nm, entre 18 y 23 nm, entre 18 y 22 nm, entre 18 y 21 nm, entre 18 y 20 nm, entre 19 y 25 nm, entre 19 y 24 nm, entre 19 y 23 nm, entre 19 y 22 nm, entre 19 y 21 nm, entre 19 y 20 nm, entre 20 y 25 nm, entre 20 y 24 nm, entre 20 y 23 nm, entre 20 y 22 nm, o entre 20 y 21 nm.
En un modo de realización ventajoso, la etapa e) comprende, entre otras, una etapa previa de filtración a través de un filtro en profundidad que comprende unas fibras de celulosa, tierra de diatomea y una resina cargada negativamente (pre-filtro Viresolve PreFilter o VPF) o una membrana de polietersulfona de una porosidad de 0,22 |im funcionalizada por unos grupos SO3' (pre-filtro Viresolve Pro Shield especialmente).
Etapas opcionales
El procedimiento según la invención puede comprender además una etapa de ultrafiltración y/o de diafiltración, que puede situarse bien entre la etapa d) de cromatografía intercambiadora de aniones y la etapa e) de nanofiltración, o bien después de la etapa e) de nanofiltración. Tal etapa puede realizarse especialmente utilizando unos casetes de tipo Centramate 50 kDa (comercializados por Pall) o Pellicon 2 (comercializados por Merck Millipore) con un tampón de diálisis que comprende polisorbato 80 en el caso en el que la ultrafiltración se sitúa después de la etapa e) de nanofiltración.
Además, una o varias etapas de filtración esterilizante a través de los filtros que tienen una porosidad del orden de 0,1 a 0,5 |im (en particular de aproximadamente 0,2 |im) pueden estar presentes a diferentes etapas del procedimiento según la invención. Estas etapas pueden realizarse especialmente utilizando un filtro Millipak de 0,22 |im.
Los ejemplos siguientes tienen como objetivo ilustrar la presente invención.
Ejemplos
Ejemplo 1: Optimización de la etapa a) de cromatografía de afinidad a la proteína A
La etapa de cromatografía de afinidad a la proteína A es una etapa indispensable en la purificación de anticuerpos, pero también la etapa más costosa de los procedimientos de purificación de anticuerpos.
A fin de reducir significativamente el coste de esta etapa y manteniendo al mismo tiempo la pureza y la calidad del producto, los inventores han ensayado diferentes resinas de cromatografía de afinidad a la proteína A y diferentes tampones de eluciones, y medido la influencia de la resina y del tampón de elución sobre un cierto número de parámetros.
Materiales y métodos
Comparación de cuatro resinas de cromatografía de afinidad a la proteína A
Columnas ensayadas y preparación
Las características de las columnas ensayadas son:
Tabla 1. Características de las columnas ensayadas
Figure imgf000016_0001
Las columnas se desinfectan según la secuencia siguiente:
Tabla 2. Secuencia de desinfección de las columnas
Figure imgf000016_0002
Determinación del punto de "Breakthrough"
Se inyecta una solución de anticuerpos descongelada filtrada 0,2 pm a 2,3 g/l en el aparato de cromatografía (Akta Basic) sin pasar por la columna. La DO 280 nm así leída corresponde a la DO 280nm máxima. Esta última es de 664 mAU. El punto que corresponde al 10% de una pérdida de carga de la columna, denominado “Breakthrough” (10%BT), se determina así a 66,4 mAU. La célula UV así como el circuito del aparato se aclaran después con agua y después en un tampón de equilibrado.
Determinación de la capacidad dinámica de fijación al 10% de paso (DBCio%bt)
Una vez conectada, la columna se equilibra con un Tampón A (Tris 25 mM; NaCl 25 mM; EDTA 5 mM; pH7,1). Cuando la columna se equilibra, se efectúa una etapa de “pump wash” con la solución de anticuerpos para llenar los conductos aguas arriba de la columna. Sea cual sea la columna, la solución de anticuerpos descongelada filtrada 0,2 pm se inyecta a un caudal de 3 ml/min (es decir un tiempo de estancia de aproximadamente 1,6 min) y se realiza un seguimiento de la DO 280 nm.
Comparación de cuatro tampones de elución
Cuatro tampones de elución de la cromatografía de afinidad a la proteína A se ensayaron a diferentes concentraciones y diferentes pH, y se analizaron su impacto sobre el aspecto del eluato y sobre el porcentaje de IgG monomérica (y por lo tanto sobre la presencia de agregados).
Composición de los tampones ensayados
Los cuatro tampones ensayados son los siguientes:
Tabla 3. Tampones ensayados
Figure imgf000017_0001
Análisis del aspecto del eluato
Una vez el eluato neutralizado, se realiza un análisis visual por el operario con la escala de apreciación siguiente: 0-Aspecto límpido; 1- Ligera turbiedad aparente; 2- Turbiedad media; 3- Turbiedad fuerte (Opalescencia). El eluato neutralizado se conserva después a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lleva a cabo una segunda observación por el mismo operario según la misma escala de apreciación.
Análisis del porcentaje de IgG monomérica
Se analiza un volumenn de 500 pl procedente del eluato neutralizado por HPLC-SEC (High Performance Liquid Chromatography - Size Exclusion Chromatography) sobre una columna de Superose 12. Los picos generados por lectura de la densidad óptica a 280 nm se integran por el programa Breeze y las áreas transformadas en porcentajes.
Resultados
Comparación de cuatro resinas de cromatografía de afinidad a la proteína A
Los resultados obtenidos para las cuatro columnas ensayadas se presentan en la figura 1.
La Figura 1A muestra que para la columna MabSelect SuRe™, un volumen de 47 ml se ha inyectado sobre la columna hasta la obtención de una DO 280 nm de 66,4 mAU. La capacidad de fijación de columna a 10% del BT (DBC10%bt) es por lo tanto de 23 mg/ml de gel MabSelect SuRe™.
La Figura 1B muestra que para la columna Poros GoPure™, un volumen de 95 ml se ha inyectado sobre la columna hasta la obtención de una DO 280nm de 66,4 mAU. La capacidad de fijación de columna al 10% del BT (DBC10%bt) es por lo tanto de 38,64 mg/ml de gel Poros GoPure™.
La Figura 1C muestra que para la columna Toyopearl AF-rProtein A-650F, un volumen de 80 ml se ha inyectado sobre la columna hasta la obtención de una DO 280nm de 66,4 mAU. La capacidad de fijación de columna al 10% del BT (DBC10%bt) es por lo tanto de 36,65 mg/ml de gel Toyopearl AF-rProtein A-650F.
La Figura 1D muestra que para la columna Amsphere™ Protein A JWT203, un volumen de 93,4 ml se ha inyectado sobre la columna hasta la obtención de una DO 280 nm de 66,4 mAU. La capacidad de fijación de columna a 10% del BT (DBC10%bt) es por lo tanto de 42,95 mg/ml de gel Amsphere™ Protein A JWT203.
La Tabla 4 siguiente sintetiza los datos obtenidos con las cuatro columnas y muestra que las columnas Poros GoPure™ (matriz de poli(estiren-divinilbenceno) reticulado revestido polímero polihidroxilado reticulado), Toyopearl AF-rProtein A-650F (matriz de polímero metacrílico), y Amsphere™ Protein A JWT203 (matriz de polímero metacrílico) aceptan una carga de anticuerpos significativamente más elevada que la columna MabSelect SuRe™ (matriz de agarosa fuertemente reticulada).
Tabla 4. Carga de anticuerpos aceptada por las diferentes columnas ensayadas.
Figure imgf000017_0002
Con el fin de confirmar la carga máxima de las tres columnas que permiten la carga más alta de anticuerpos, se ha inyectado un sobrenadante clarificado filtrado sobre cada columna con una carga de anticuerpo igual al 90% del valor de DBC10%bt. Las cargas así aplicadas son las siguientes:
Tabla 5. Cargas aplicadas a las diferentes columnas
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Se han realizado dos ensayos para cada una de las tres columnas ensayadas.
Los resultados obtenidos se sintetizan en la tabla 6 siguiente, y muestran que la columna Amsphere™ Protein A JWT203 da los mejores resultados, tanto en términos de carga de anticuerpos como de pureza, de aspecto del eluato e incluso de pH del eluato (ajustándose este después a un pH de aproximadamente 6,0 para la continuación del procedimiento). El rendimiento de esta columna es por otro lado similar al de las otras columnas.
A pesar de que la carga de anticuerpos aceptada por la columna Toyopearl AF-rProtein A-650F sea ligeramente más débil que la de la columna Amsphere™ Protein A JWT203, ésta permite no obstante una carga de anticuerpos superior a 30 mg/ml de gel y da unos resultados satisfactorios en términos de pureza, de aspecto del eluato, y de pH el eluato. A pesar de que permite una carga de anticuerpos elevada (al menos 35 mg/ml de gel), la columna Poros GoPure™ da lugar, por su parte, a un mal comportamiento de los eluatos que han aparecido todos turbios. Además, los resultados son menos buenos en términos de rendimiento y de pureza.
Tabla 6. Comparación de tres columnas de cromatografía de afinidad a la proteína A
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Por comparación con el gel MabSelect SuRe™ habitualmente utilizado en la primera etapa de purificación de anticuerpos por cromatografía de afinidad a la proteína A, el gel Amsphere™ Protein A JWT203 se presenta como un producto que tiene un precio por litro dos veces menos caro y una capacidad de carga aproximadamente dos veces superior. Esta columna permite por lo tanto disminuir por cuatro el coste de la primera etapa de purificación por cromatografía de afinidad a la proteína A.
Comparación de cuatro tampones de elución
Los resultados que se refieren al aspecto del eluato se presentan en la figura 2 y muestran que los tampones maleato y formiato permiten obtener un eluato neutralizado estabilizado límpido o ligeramente opalescente para unas concentraciones comprendidas entre 5 y 10 mM (particularmente a 5 mM) y un pH comprendido entre 2,6 y 3.6.
El tampón acetato no permite obtener unos eluatos límpidos y puede incluso llevar, a bajo pH y molaridad media, a unos eluatos fuertemente turbios 1 hora después de la neutralización. En cuanto al tampón citrato, los resultados son muy malos en términos de aspecto para el eluato neutralizado estabilizado.
Los resultados que se refieren al porcentaje de formas monoméricas del anticuerpo en el eluato neutralizado se presentan en la figura 3, y muestran que más del 98% de los anticuerpos están en forma monomérica en el eluato neutralizado después de la elución por un tampón citrato o formiato a una molaridad de 5 mM y a un pH entre 2,6 y 3.6.
A pesar de que permiten obtener unos eluatos límpidos o solamente débilmente opalescentes, el tampón maleato conduce a una formación significativa de agregados de anticuerpos (siempre más del 5%), lo que no es deseable. En cuanto al tampón acetato, los resultados son menos buenos que con un tampón citrato o formiato.
En total, el tampón que da los mejores resultados, tanto en términos de aspecto del eluato neutralizado como de porcentaje de formas monoméricas de anticuerpos en el eluato neutralizado es el tampón formiato, utilizado preferentemente a una molaridad de 5 a 10 mM (preferiblemente 5 mM) y a un pH entre 2,6 y 3,6 (especialmente a un pH de 3,1).
Conclusiones
Por comparación con el gel MabSelect SuRe™ habitualmente utilizado en la primera etapa de purificación de anticuerpos por cromatografía de afinidad a la proteína A, los inventores han podido seleccionar una columna que permite disminuir por cuatro el coste de la primera etapa de purificación por cromatografía de afinidad a la proteína A, manteniendo al mismo tiempo la pureza y la calidad del producto purificado.
Además, los inventores han seleccionado también un tampón de elución particularmente interesante para garantizar un eluato neutralizado límpido o débilmente opalescente y que comprende una muy alta mayoría de formas monoméricas del anticuerpo.
La combinación específica de columna y de tampón seleccionada por los inventores permite así disminuir fuertemente el coste de la purificación y garantizar al mismo tiempo un producto de alta pureza y calidad.
Ejemplo 2: Optimización de la etapa c) de cromatografía intercambiadora de cationes
Un eluato viralmente inactivado procedente de la etapa b) del procedimiento se ha purificado por cromatografía intercambiadora de cationes sobre dos tipos de columnas distintas: una columna SP Sepharose y una columna Capto™ S.
Materiales y métodos
Cromatografía intercambiadora de cationes sur SP Sepharose®
Se ha ajustado un eluato viralmente inactivado procedente de la etapa b) del procedimiento a 50 mosm/kg y pH 7,2, y se ha inyectado sobre una columna SP Sepharose® a una carga de aproximadamente 30,5 g/L de gel según la secuencia:
Tabla 7. Secuencia de purificación de un eluato viralmente inactivado procedente de la etapa b) del procedimiento según la invención por cromatografía intercambiadora de cationes sobre SP Sepharose®
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Cromatografía intercambiadora de cationes sur Capto™ S
1° ensayo, en paralelo con SP Sepharose®
Un eluato viralmente inactivado procedente de la etapa b) del procedimiento se ha ajustado a 5,09 mS/cm gracias a la adición de tampón acetato de sodio 5mM pH 6,0, y a pH 5,98, y se ha inyectado sobre una columna Capto™ S a una carga de aproximadamente 67,3 g/l de gel según la secuencia:
Tabla 8. Secuencia de purificación de un eluato viralmente inactivado procedente de la etapa b) del procedimiento según la invención por cromatografía intercambiadora de cationes sobre Capto™ S
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2° ensayo
Se ha ajustado un eluato viralmente inactivado procedente de la etapa b) del procedimiento a 5,04 mS/cm gracias a la adición de 103,8 ml de agua purificada y a pH 6,02 por adición de NaOH 0,5 M. Para esta etapa, se comprime un gel de Capto S en una columna de 1 cm de diámetro obteniendo así un volumen de columna de 4,8 ml para una altura de 6,1 cm. La inyección sobre la columna intercambiadora de cationes Capto S se ha desarrollado de la siguiente manera:
Tabla 9. Secuencia de purificación de un eluato viralmente inactivado procedente de la etapa b) del procedimiento según la invención por cromatografía intercambiadora de cationes sobre Capto™ S en un segundo ensayo.
Figure imgf000020_0002
La columna se carga a razón de 120 gramos de IgG/L de gel a fin de determinar la capacidad máxima de fijación del gel de Capto S.
Determinación del punto de "Breakthrough" y de la capacidad dinámica de fijación al 10% de paso (DBC10%bt) Se ha ajustado un eluato viralmente inactivado procedente de la etapa b) del procedimiento a 5,05 mS/cm y a pH 6,04 por adición de una solución HCl 6N y de EPA (Agua purificada Apyrogéne).
Para esta etapa, se comprime un gel de Capto S en una columna de 0,5 cm de diámetro obteniendo así un volumen de columna de 3,8 ml para una altura de 19,5 cm. La solución de anticuerpos se inyecta después en el aparato de cromatografía (Akta Basic) sin pasar por la columna. La DO 280 nm así leída corresponde a la DO 280 nm máxima. La célula UV así como el circuito del aparato se aclaran después con agua y después en un tampón de equilibrado. La capacidad dinámica de fijación al 10% de paso (DBC10%bt) se ha determinado después para tres tiempos de estancia (1, 2 y 3 minutos) inyectando sobre la columna la solución de anticuerpos a diferentes caudales (3,8 ml/min; 1,9 ml/min; y 1,3 ml/min, respectivamente) y siguiendo la DO 280.
Resultados
Comparación cromatografía intercambiadora de cationes sobre SP Sepharose® y cromatografía intercambiadora de cationes sobre Capto™ S
SP Sepharose®: el volumen de eluato recogido es de 150 ml, con una concentración proteica estimada de 25,96 g/l así como una osmolalidad de 273 mosm/kG y un pH de 7,09.
La cantidad de anticuerpos presente en el eluato era de 3894 mg. El rendimiento de etapa es del 88,6%. El producto es límpido con algunas partículas.
Capto™ S: al final de elución, se obtiene un volumen de 174 ml, es decir 7,3 VC. La concentración final es de 9,0 g/l y de aspecto límpido en la salida de la columna. El rendimiento de etapa es entonces del 94,3% y el pH y la conductividad del eluato son respectivamente de 6,66 y 17,11 mS/cm.
El eluato se filtra después sobre una cápsula Millipak 20 de 0,22 pm previamente acondicionada con un tampón Tris 20mM; NaCl csp conductividad 18 mS/cm; pH 7,0. La filtración se efectúa con la bomba “pomp L02” a una velocidad de 30 rpm a través de un conducto 184. El filtro se aclara después con un tampón Tris 20mM; NaCl csp conductividad 18mS/cm; pH 7,0. Al final de esta filtración, se obtiene un volumen de 208,8 ml con una concentración de 6,8 g/l y un rendimiento de etapa de filtración del 90,7%. La pureza del eluato filtrado es del 99,6% (en proteínas). Tabla 10. Datos comparativos para la purificación par cromatografía intercambiadora de cationes sobre SP Sepharose® y Capto™ S.
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La Tabla 10 anterior muestra que la columna Capto™ S permite una carga de anticuerpos dos veces superior a la columna SP Sepharose® (por lo tanto una reducción de los costes), un mejor rendimiento (por lo tanto una reducción de los costes), garantizando al mismo tiempo un aspecto límpido y una muy buena pureza.
2° ensayo de cromatografía intercambiadora de cationes sobre Capto™ S
El punto de inflexión de la curva de DO se encuentra a 110 ml, la DO 280 nm que hasta ahora era de 1650 mAU sube progresivamente, traduciendo una fuga de IgG a través de la columna. Lo que da una capacidad máxima de fijación de aproximadamente 84 g/l.
Al final de la elución, se obtiene un volumen de 57,2 ml, es decir 11,9 VC. La elución es, en una primera fase, muy rápida, pero tarda después en el tiempo (bajada muy lenta de la DO280 nm). La concentración final del eluato es de 7,30 g/l y de aspecto límpido en salida de columna. Sin embargo, unas partículas aparecen al final de algunos minutos. El rendimiento de etapa, si se basa en los 110 ml de producto inyectado, es del 100%. Además, después de la cromatografía intercambiadora de cationes sobre gel Capto S, la solución de IgG aparece pura al 100% (en proteínas).
Así, este 2° ensayo confirma que la carga máxima en anticuerpos de la columna Capto™ S es ampliamente superior a la de la columna SP Sepharose®.
Punto de "Breakthrough" (BT) y capacidad dinámica de fijación al 10% de paso (DBC10%bt) de la columna Capto™ S La DO 280 nm máxima - leída inyectando la solución de anticuerpos en el aparato de cromatografía (Akta Basic) sin pasar por la columna - es de 535 mAU. El punto que corresponde al 10% de una pérdida de carga de la columna, denominado “Breakthrough” (10%BT), se determina así a 54 mAU.
La medición de la capacidad dinámica de fijación al 10% de paso (DBC-io% bt) para unos tiempos de estancia de 1, 2 y 3 minutos ha dado los resultados presentados en la tabla 11 siguiente:
Tabla 11. Resultados de medición de la capacidad dinámica de fijación al 10% de paso (DBC-io% bt) para unos tiempos de estancia de 1, 2 y 3 minutos.
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Estos resultados confirman la capacidad de fijación muy superior de la columna Capto™ S con respecto a la columna SP Sepharose®.
Conclusiones
La selección por los inventores de la columna Capto™ S para la etapa c) de cromatografía intercambiadora de cationes, en lugar de la columna SP Sepharose® habitualmente utilizada en esta etapa de purificación de un anticuerpo, permite también disminuir los costes de purificación.
Ejemplo 3: Optimización de la etapa e) de nanofiltración
La etapa e) de nanofiltración es esencial para garantizar la seguridad viral de la composición de anticuerpos final, en particular frente a pequeños virus no recubiertos. Sin embargo, esta etapa es también una etapa muy costosa, siendo los nanofiltros unos productos muy caros.
Al utilizarse cada nanofiltro solo una sola vez, los inventores han ensayado varios nanofiltrados distintos a fin de optimizar la carga de anticuerpos susceptible de tratarse de una sola vez, a fin de disminuir el coste de esta etapa. Además, el interés de utilizar un prefiltro con una porosidad más importante para aumentar la carga en anticuerpos también se ha estudiado.
Materiales y métodos
Comparación de tres filtros distintos
Producto de partida
El filtrado mustang Q (etapa d)) se diluye al 2/3 con la ayuda de un tampón Citrato trisódico dihidratado 22,05 g/l; NaCl 18,23 g/l; pH 6,5; 800 mosm/kg es decir un volumen final de 555 ml. Se realiza después una filtración 0,2 pm sobre un filtro Millipak 40 de 0,02 m2 seguida de un aclarado con tampón K es decir un volumen final de 672 ml, una concentración de 5,28 g/l, un pH de 7,14 y una osmolalidad de 367 mosm/kg.
El producto se filtra después sobre un filtro Pall de PVDF hidrófilo de grado 0,1 pm, seguido de un aclarado con tampón K, es decir un volumen final de 643 ml, una concentración de 5,16 g/l., un pH de 7,12 y una osmolalidad de 366 mosm/kg.
Filtros utilizados
Las características de los nanofiltros ensayados son las siguientes:
Tabla 12. Características de los filtros ensayados
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Nanofiltración sobre Planova® 15N
La etapa de nanofiltración se realiza sobre filtro Planova® 15N de 0,001m2 equilibrado en tampón Citrato trisódico 7,35 g/l; NaCl 9 g/l; pH 6,5; 360 mosm/kg a una presión de 300 ± 50 mbars. El caudal medio era de 0,15 ml/min. El filtrado estaba límpido al final de la nanofiltración.
Nanofiltración sobre Planova® 20N
La etapa de nanofiltración se realiza sobre filtro Planova® 20N de 0,001 m2 equilibrado en tampón Citrato trisódico 7.35 g/l; NaCl 9 g/l; pH 6,5; 360 mosm/kg a una presión de 800 ± 50 mbars.
Nanofiltración sobre Viresolve pro 20N
La etapa de nanofiltración se realiza sobre filtro Viresolve pro 20N de 3,1 cm2 equilibrado en tampón citrato trisódico 7.35 g/l; NaCl 9 g/l; pH 6,5; 360 mosm/kg a una presión de 2 bars.
Validación de la utilización del filtro Viresolve pro 20N
El filtro Viresolve pro 20N se ha ensayado sobre varias composiciones de anticuerpos purificadas, a fin de validar la carga de anticuerpos susceptible de filtrarse de una sola vez.
Ensayo 1
La totalidad del eluato de cromatografía intercambiadora de cationes (etapa c) del procedimiento según la invención) se ha filtrado sobre una cápsula Mini Kleenpak de 0,22 pm con un aclarado del filtro con la ayuda de tampón fosfato 20 mM; pH 6,9; conductividad 5 mS/cm. Al final de esta filtración, se obtiene un volumen de 64,3 ml con una concentración de 5,9 g/l. El rendimiento de filtración es del 90,7%, esto se explica por el hecho de que el filtro se ha aclarado con poco tampón para evitar reducir demasiado baja la concentración de IgG para la etapa siguiente de nanofiltración. El producto es estable después de la filtración 0,22 pm. Se almacena después 24h a 4°C.
Los 64,3 ml de material de partida se inyectan a 2 bars sobre el nanofiltro Viresolve Pro+ de 3,1 cm2 equilibrado en tampón Fosfato de sodio 20 mM; conductividad de 5 mS/cm; pH 6,9. El aspecto del producto almacenado 24h a 4°C antes de la nanofiltración estaba límpido. La etapa de nanofiltración se ha realizado por lo tanto directamente sobre el producto no filtrado sobre 0,1 pm previamente.
Ensayo 2
El aspecto del producto procedente de la cromatografía intercambiadora de anión sobre Mustang Q (etapa d) del procedimiento según la invención), sometido a una etapa de diálisis, y almacenado 24h a 4°C estaba límpido. Antes de la nanofiltración, este último se filtró sobre una cápsula Mini Kleenpak de 0,1 pm con un aclarado del filtro con la ayuda de tampón Citrato trisódico dihidratado 8,82 g/l, NaCl 3,25 g/l; Manitol 17 g/l; pH 6,5; 300 mosm/kg. Al final de esta filtración, se obtiene un volumen de 264 ml con una concentración de 5,1 g/l. El rendimiento de filtración es del 100%.
La solución dializada filtrada se inyecta a 2 bars sobre el nanofiltro Viresolve® Pro de 3,1 cm2 equilibrado previamente en tampón Citrato trisódico dihidratato 8,82 g/l, NaCl 3,25 g/l; Manitol 17 g/l; pH 6,5; 300 mosm/kg. Ensayo 3
El eluato Mustang Q® (etapa d) del procedimiento según la invención) se inyecta a 2 bars sobre el nanofiltro Viresolve® Pro de 3,1 cm2 equilibrado previamente en tampón Tris 20 mM; pH 6,5; 10 mS/cm.
Utilización de un prefiltro
Se ha ensayado la nanofiltración de un mismo eluato Mustang® Q (etapa d) del procedimiento según la invención directamente sobre el filtro Viresolve® Pro, o después del paso por un prefiltro Sartorius® o Millipore®.
Nanofiltración directa
Se inyecta el eluato Mustang® Q (etapa d) del procedimiento según la invención) a 2 bars sobre el nanofiltro Viresolve® Pro de 3,1 cm2 equilibrado previamente en tampón Tris 20 mM; pH 6,5; 10 mS/cm. Este experimento corresponde al ensayo 3 anterior del filtro Viresolve® Pro.
Nanofiltración después del paso por un prefiltro Sartorius®
Se realiza un montaje en serie de un prefiltro Sartorius® sobre el nanofiltro Viresolve® Pro. Se inyecta el eluato Mustang® Q (etapa d) del procedimiento según la invención) a 2 bars sobre el nanofiltro Viresolve® Pro de 3,1 cm2 equilibrado previamente en tampón Tris 20 mM; pH 6,5; 10 mS/cm.
Nanofiltración después del paso por un prefiltro Millipore®
Se realiza un montaje en serie de un prefiltro Millipore® (optiscale®-40 Viresolve prefilter ref SSPVA40NB9) sobre el nanofiltro Viresolve® Pro de 3,1 cm2 El eluato Mustang® Q se inyecta a 2 bars sobre el nanofiltro Viresolve® Pro de 3.1 cm2 equilibrado previamente en tampón Tris 20 mM; pH 6,5; 10 mS/cm.
Nanofiltración después del paso por un prefiltro Millipore® (validación sobre un 2° producto)
Se realiza un montaje en serie de un prefiltro Millipore (Viresolve Pro ref C2NA74678) sobre el nanofiltro Viresolve Pro de 3,1 cm2. El producto procedente de la cromatografía intercambiadora de anión sobre Mustang Q (etapa d) del procedimiento según la invención) y de la etapa de diálisis se inyecta a 2 bars sobre el montaje Viresolve Pro+ de 3.1 cm2 equilibrado previamente con un tampón Citrato trisódico dihidratato 8,82 g/l, NaCl 3,25 g/l; Manitol 17 g/l; pH 6,5.
Nanofiltración después del paso por un prefiltro Millipore® (validación sobre un 2° producto)
Un montaje en paralelo de dos prefiltros Millipore (Viresolve Pro Shield ref C2NA74678) está aguas arriba del nanofiltro Viresolve Pro de 3,1 cm2. El montaje se equilibra previamente en su integralidad bajo una presión de 2 bars con EPA después en tampón Citrato trisódico dihidratato 8,82 g/l, NaCl 3,25 g/l; Manitol 17 g/l; pH 6,5. El segundo prefiltro permanece fijado al principio de la inyección del producto, debiendo éste despinzarse en caso de obstrucción del primer prefiltro. Este montaje permite determinar el Vmax del nanofiltro sin que el prefiltro esté eventualmente limitante.
Caudal medio sobre 10 min a EPA = 2,18 g/min
Caudal medio sobre 10 min en tampón Citrato = 2,52 g/min
Resultados
Comparación de tres filtros distintos
Nanofiltración sobre Planova® 15N
La Figura 4A represente el caudal de filtración en función de la carga de anticuerpos. El caudal medio era de 0,15 ml/min para una carga en anticuerpo que iba casi hasta 200 g/m2. El filtrado estaba límpido al final de la nanofiltración.
Nanofiltración sobre Planova® 20N
La Figura 4B represente el caudal de filtración en función de la carga de anticuerpos. El caudal medio era de 0,8 ml/min para una carga en anticuerpo que iba casi hasta 1100 g/m2. El filtrado estaba límpido al final de la nanofiltración.
Nanofiltración sobre Viresolve® pro 20N
La Figura 4C represente el caudal de filtración en función de la carga de anticuerpos. El caudal medio era de 2,4 ml/min para una carga en anticuerpo que iba casi hasta aproximadamente 5500 g/m2. El filtrado estaba límpido al final de la nanofiltración.
Comparación de la carga de anticuerpos nanofiltrada en función del tiempo de filtración
La Figura 5 represente la carga de anticuerpos nanofiltrada en función del tiempo de filtración, e ilustra muy claramente la alta superioridad del filtro Viresolve® pro 20N con respecto a los filtros Planova® 15N y Planova® 20N.
Por extrapolación se tendría al final de 4 horas:
Planova® 15N ^ 200 g de IgG / m2
Planova® 20N ^ 1000 g de IgG / m2
Viresolve® pro+ ^ 5000 g de IgG / m2
Validación de la utilización del filtro Viresolve pro 20N
Ensayo 1
Se observa una obstrucción del filtro Viresolve® Pro+ al final de 30 min. Una carga de 141 mg de producto ha podido por lo tanto nanofiltrarse sobre 3,1 cm2 de superficie filtrante, es decir una cantidad de anticuerpos de 455 g/m2 de nanofiltro. Esta carga es significativamente inferior a la obtenida anteriormente durante la comparación de los tres filtros Planova® 15N, Planova® 20N y Viresolve® Pro+ (4865 g/m2).
Sin embargo, la disminución puede relacionarse con las características del producto filtrado (diferente del filtrado durante la comparación de los tres filtros) y la carga máxima sigue siendo ampliamente superior a la posible con el filtro Planova® 15N.
Ensayo 2
Se observa una obstrucción del filtro Viresolve® Pro al final de 26,41 ml, es decir una cantidad de 135,48 mg de anticuerpos y una carga de 437 g/m2 de nanofiltro. La carga es de aproximadamente 300 g/m2 a V75 y de 425 g/m2 a V90. La carga máxima es similar a la obtenida en el ensayo 1 y confirma el interés del filtro Viresolve® Pro con respecto a los filtros Planova®.
La pureza del producto nanofiltrado se determina por cromatografía de exclusión de tamaño (HPSEC). Se estima al 98,83% en esta etapa del procedimiento.
Ensayo 3
La filtración se detiene tras la obstrucción del nanofiltro después de 7,21 ml de producto, es decir una cantidad de 25.96 mg de anticuerpos y una carga de 84 g/m2. Esta carga máxima es mucho más baja que las anteriormente observadas e ilustra una posible variabilidad de la carga máxima en función del estado del producto a nanofiltrar. Esta variabilidad justifica el ensayo de la utilización de un prefiltro.
Utilización de un prefiltro
Nanofiltración directa
La filtración se detiene tras el taponamiento del nanofiltro después de 7,21 ml de producto, es decir una cantidad de 25.96 mg de anticuerpos y una carga de 84 g/m2.
Nanofiltración después del paso por un prefiltro Sartorius®
Se observa una obstrucción del prefiltro al final de 23,82 ml, es decir una cantidad de 85,75 mg de anticuerpos filtrada y una carga de 277 g/m2. En el presente caso, el límite de carga se impone por el prefiltro. El prefiltro Sartorius® mejora por lo tanto la carga máxima en anticuerpos, pero no permite restaurar una muy alta carga de anticuerpos.
Nanofiltración después del paso por un prefiltro Millipore®
Se observa una obstrucción del prefiltro al final de 97 ml, es decir una cantidad de 349,2 mg de anticuerpos y una carga de 1126 g/m2. En el presente caso, el límite de carga se impone por el prefiltro.
El prefiltro Millipore® “optiscale®-40 Viresolve® prefilter” mejora por lo tanto la carga máxima den anticuerpos, permitiendo obtener una carga superior a la ya elevada de los ensayos de validación 1 y 2 descritos anteriormente con el nanofiltro Viresolve® Pro solo.
Nanofiltración después del paso por un prefiltro Millipore® (validación sobre un 2° producto)
Se observa una obstrucción del montaje al final de 2h25 min después de que hayan pasado 193,2 ml (a 3,23 g/l después de la filtración 0,22 pm) es decir una cantidad de aproximadamente 624 mg de anticuerpos y una carga de 2013 g/m2. El montaje se sujeta y se pone en espera hasta el día siguiente.
Después del reemplazo del prefiltro y recogida de la filtración, se observa una obstrucción del montaje al final de 24 min con 14,0 ml es decir una cantidad de 45,2 mg de anticuerpos (carga de 146 g/m2). La carga total de la solución Viresolve® Pro+ es por lo tanto de 2159 g/m2. Cabe señalar que la desestabilización del producto durante la noche no permite saber qué prefiltro o filtro es el origen de esta obstrucción.
En todos los casos, este experimento valida el interés de utilizar un prefiltro antes de la nanofiltración sobre el filtro Viresolve® Pro+, para garantizar una muy alta carga de anticuerpos.
Nanofiltración después del paso por un prefiltro Millipore® (validación sobre un 3° producto)
Los 418,6 ml de producto procedentes de la diálisis, es decir 938 mg (3Kg/m2) se han nanofiltrado integralmente en 217 minutos con un caudal final equivalente al 71,5% del caudal inicial. El volumen de nanofiltrado obtenido era de 407,5 ml a una concentración de 2,25 g/l, es decir 917 mg de proteínas, lo que da un rendimiento de etapa sin aclarado del nanofiltro del 97,8%.
El montaje utilizado ha permitido obtener una carga de 2958 g/m2, es decir una carga 2,6 veces superior a la del primer ensayo y 1,4 vez superior a la obtenida con el 2° producto.
Tabla recapitulativa de los resultados obtenidos
Los diferentes resultados obtenidos se sintetizan en la Tabla 13 siguiente:
Tabla 13. Síntesis de los resultados obtenidos para la etapa e) de nanofiltración.
Figure imgf000026_0001
Conclusiones
Los experimentos realizados por los inventores muestran claramente el interés de utilizar un filtro Viresolve® Pro para la nanofiltración de una composición purificada de anticuerpos, a fin de aumentar fuertemente la carga de anticuerpos tratada de una sola vez y así disminuir significativamente los costes asociados a esta etapa particularmente costosa. Además, la adición de un prefiltro permite mejorar aún más la carga de anticuerpos tratada de una sola vez.
En total, con respecto a una etapa de nanofiltración que utiliza un filtro Planova® 15N y una carga de anticuerpos de 50 g/m2 (procedimiento anterior del depositante), las modificaciones relacionadas con la selección del filtro Viresolve® Pro y con la adición de un prefiltro permiten obtener una ganancia de carga de un factor superior a 40. Ejemplo 4. Optimización de la eliminación de las impurezas durante la etapa a) de cromatografía de afinidad a la proteína A
A fin de optimizar la eliminación de las impurezas durante la etapa a) de cromatografía de afinidad a la proteína A, se han ensayado diferentes condiciones sobre una nueva columna con una resina que comprende una resina a base de polímero de metacrilato en forma de bolas de un diámetro medio de aproximadamente 40-50 pm, en la que se injerta un tetrámero de dominio C modificado estable en condiciones alcalinas producido en E. coli (columna Amsphere™ Protein A A3, denominada “A3-JSR” a continuación).
Esta columna es particularmente ventajosa ya que permite obtener unos eluatos con un buen rendimiento, una baja turbiedad, y una buena eliminación de las impurezas y especialmente de las otras proteínas producidas por la célula de producción (denominadas “HCP” por “Host cell proteins”), y un ADN de la célula de producción (denominado “HC-DNA” por “Host cell DNA”) (véanse las tablas 16 y 17 a continuación), y eso con una carga elevada. En efecto, el valor del 90% del DBC10%bt de esta columna es de 58 mg/ml. Especialmente, diferentes concentraciones en NaCl de la solución salina de lavado y diferentes pH de elución se ensayaron por la columna A3-JSR (véase la tabla 15 a continuación).
Las condiciones ensayadas por la columna A3-JSR se resumen en las tablas 14 y 15 a continuación:
Tabla 14. Condiciones generales ensayadas por la columna A3-JSR.
Figure imgf000027_0001
Tabla 15. Fuerza iónica de la solución de lavado y pH de la solución de elución ensayados por la columna A3-JSR.
Figure imgf000027_0002
Los resultados obtenidos hasta el final de la elución se resumen en la tabla Tabla 16 y los obtenidos después de la neutralización en la Tabla 17 siguiente:
Tabla 16. Resultados obtenidos justo después de la elución, antes de la neutralización.
Figure imgf000027_0003
17A |_________1700_________| 2,6 | 2,66 | 16,01 | 42,59 | 73,4% | 3,05 | 0,023
Tabla 17. Resultados obtenidos después de la elución y de la neutralización.
Figure imgf000028_0001
La variación del rendimiento medio en función del pH de elución utilizado se representa en la Figura 6. Asimismo, la variación de la eliminación media de los HCP en función de la concentración en NaCl en la solución de lavado y del pH de elución se representan en las Figuras 7 y 8.
Los resultados presentados en las tablas 16 y 17 anteriores y en las figuras 6 a 8 muestran que las condiciones óptimas de rendimiento corresponden a un pH de elución entre 2,6 y 3,6, y que las condiciones óptimas para la eliminación de los HCP corresponden a un pH de elución entre 3,1 y 4 y a una solución de lavado que comprende al menos 1,2 M de NaCl.
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Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento de purificación de un anticuerpo monoclonal o de una proteína de fusión entre el fragmento Fc de un anticuerpo y un segundo polipéptido, que comprende:
a) una etapa de cromatografía de afinidad sobre una resina que tiene por matriz un gel de polímero de metacrilato reticulado, sobre el cual se injerta la proteína A,
b) una etapa de inactivación viral,
c) una etapa de cromatografía intercambiadora de cationes sobre una resina que tiene por matriz un gel de agarosa reticulado, sobre el cual se injertan unos grupos sulfonato (-SO3-) por medio de brazos espaciadores a base de dextrano,
d) una etapa de cromatografía intercambiadora de aniones sobre una membrana hidrófila de polietersulfona revestida de un polímero reticulado sobre el cual se injertan unos grupos amina cuaternaria (Q), y
e) una etapa de nanofiltración con un filtro que tiene una doble membrana de polietersulfona de una porosidad de aproximadamente 20 nm,
caracterizado por que el tampón de elución utilizado en la etapa a) para eluir el anticuerpo es un tampón formiato utilizado a una molaridad de 5 a 10 mM y a un pH comprendido entre 2,6 y 3,6.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que el gel de polímero de metacrilato reticulado sobre el cual se injerta la proteína A utilizado en la etapa a) está en forma de bolas que tienen un diámetro medio comprendido entre 30 y 60 pm, ventajosamente entre 40 y 50 pm.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado por que la etapa a) comprende una subetapa de lavado de la resina con una solución salina que comprende una concentración en NaCl de al menos 1M.
4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que la etapa b) se realiza por incubación durante 30 a 120 minutes a una temperatura de 20 a 25°C en un medio que comprende del 0,5 al 2% (v/v) de polioxietilen-p-t-octilfenol (Triton X-100, N° CAS 9002-93-1).
5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que el tampón utilizado durante la etapa d) es un tampón trishidroximetilaminometano (TRIS) a una concentración de 15 a 25 mM, un pH de 7,5 a 8,5 y una conductividad de 5 a 15 mS/cm.
6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que la etapa e) comprende además una filtración previa a través de un filtro en profundidad que comprende unas fibras de celulosa, tierra de diatomea y una resina cargada negativamente o una membrana de polietersulfona de una porosidad de 0,22 pm funcionalizada por unos grupos SO3 '.
7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que comprende además una etapa de ultrafiltración y/o de diafiltración.
8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que se realiza sobre un sobrenadante de cultivo de un clon producto del anticuerpo monoclonal o de la proteína de fusión entre el fragmento Fc de un anticuerpo y un segundo polipéptido.
9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para la purificación de un anticuerpo monoclonal.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado por que el anticuerpo se dirige contra uno de los antígenos siguientes: Rhesus D, CD2, CD3, CD4, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD40, CD51 (Integrina alfa-V), CD52, CD80, CTLA-4 (CD152), SLAMF7 (CD319), Her2/neu, EGFR, EPCAM, CCR4, CEA, FR-alfa, GD2, GD3, HLA-DR, IGF1R (CD221), fosfatidilserira, TRAlL-R1, TRAIL-R2, antígenos de Clostridium diffiále, antígenos de Staphylococcus aureus, antígenos del citomegalovirus, antígenos de Escherichia coli, antígenos del virus respiratorio sincitial, antígenos del virus de la hepatitis B, antígenos del virus de Influenza A, antígenos de Pseudomonas aeruginosa serotipo IATS O11, antígenos del virus de la rabia, o fosfatidilserina.
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