ES2718348T3 - Método para detectar cáncer - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

Método para detectar cáncer

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para detectar cáncer como CAPRINA-1 como marcador tumoral.

Antecedentes de la técnica

El cáncer es la principal causa de muerte. En la actualidad, esta enfermedad se trata principalmente mediante terapia quirúrgica en combinación con radioterapia y/o quimioterapia. Debido a los avances previos en tecnología médica, el cáncer es ahora una enfermedad altamente curable por detección temprana, en función de su tipo. Por lo tanto, existe una demanda de un método para detectar un cáncer que no suponga una carga física ni económica para los pacientes con cáncer y que se pueda lograr mediante pruebas cómodas.

Recientemente, los métodos para analizar productos tumorales, tales como marcadores tumorales, han estado ampliamente disponibles. Los productos tumorales se refieren a, por ejemplo, antígenos relacionados con tumores, enzimas, proteínas particulares, metabolitos, oncogenes, productos oncogénicos y genes supresores de tumores. El antígeno carcinoembrionario CEA, la glicoproteína CA19-9, el antígeno específico de la próstata PSA, la calcitonina (hormona peptídica producida en la glándula tiroides) y similares se explotan como marcadores tumorales en el diagnóstico de cáncer para algunos tipos de cáncer. Para muchos otros tipos de cáncer, sin embargo, aún no se han encontrado marcadores tumorales útiles en el diagnóstico de cáncer. Además, una gran mayoría de los marcadores tumorales conocidos actualmente están presentes solo en cantidades muy pequeñas (del orden de pg/ml) en fluidos corporales y requieren métodos de ensayo altamente sensibles o técnicas especiales para detectar estos marcadores. En estas circunstancias, puede esperarse que las puertas se abran para el uso de diagnóstico para varios tipos de cáncer si se puede proporcionar un nuevo método de prueba de cáncer capaz de detectar con gran sensibilidad varios tipos de cáncer mediante una operación cómoda.

Si bien, a pesar del reciente desarrollo de novedosas técnicas quirúrgicas o el descubrimiento de novedosos agentes anticancerosos, no se ha establecido una técnica de diagnóstico de cáncer eficaz para muchos tipos de cáncer, a excepción de para algunos tipos de cáncer. Por lo tanto, estos tipos de cáncer no se pueden detectar temprano y el tratamiento del cáncer existente tiene un resultado insuficientemente mejorado.

Con los últimos avances en biología molecular o inmunología del cáncer, se han identificado anticuerpos que reaccionan específicamente con el cáncer, fármacos de direccionamiento molecular para antígenos del cáncer relacionados con la transformación maligna o la exacerbación del cáncer, y similares, de modo que se elevan las expectativas sobre la terapia específica contra el cáncer dirigida a antígenos del cáncer. Entre otros, una serie de fármacos de anticuerpos para el tratamiento del cáncer dirigidos a las proteínas antigénicas en las células cancerosas se han lanzado y utilizado en el tratamiento del cáncer. Estos fármacos de anticuerpos han recibido atención debido a su cierta eficacia como agentes terapéuticos específicos para el cáncer. Una gran mayoría de las proteínas antigénicas utilizadas como diana por los fármacos, sin embargo, también se expresa en células normales. Como resultado de la administración de anticuerpos, las células cancerosas, así como las células normales que expresan los antígenos están dañadas, lo que da como resultado reacciones adversas no deseadas. Además, los efectos del tratamiento del cáncer difieren en gran medida entre los individuos debido a diversas etiologías que dependen de los pacientes con cáncer. Por ejemplo, cirugía, la quimioterapia o la radioterapia varían en gran medida en el tratamiento y el pronóstico según las etapas de los cánceres. Se sabe que diferentes personas tienen sensibilidades distintivas al mismo fármaco terapéutico para los cánceres debido a la diversidad de individuos. Por lo tanto, un determinado fármaco es eficaz para algunos pacientes pero ineficaz para otros.

Por lo tanto, su administración a pacientes con cáncer se determina midiendo preliminarmente la expresión de genes o proteínas relacionados con la enfermedad en los pacientes y evaluando si un fármaco en particular es eficaz para un paciente con cáncer que expresa un gen o proteína en particular. Específicamente, la presencia de un antígeno cancerígeno en una muestra, por ejemplo, suero o tejido, derivado de un paciente con cáncer se analiza en la práctica clínica mediante el uso de un método de detección para evaluar un gen o proteína relacionada con la enfermedad de un cierto tipo de cáncer. A continuación, se determina la administración de un fármaco terapéutico específico para el antígeno del cáncer. Por ejemplo, los tejidos cancerosos de un paciente con cáncer de intestino grueso se evalúan mediante un método de detección por EGFR con tinción inmunohistoquímica "EGFR pharm (Dako, una compañía de Agilent Technologies)" para predecir la eficacia de Erbitux para el cáncer de intestino grueso. A continuación, se determina la administración de erbitux. Como alternativa, los tejidos cancerosos de un paciente con cáncer de mama se evalúan mediante un método de detección de Her2 con tinción inmunohistoquímica "Prueba Hercep" para predecir la eficacia de Herceptin para el cáncer de mama. A continuación, la aplicación de Herceptin está determinada.

Por casualidad, los animales de compañía se han criado como miembros de la familia y, a menudo, tienen estilos de vida similares a los de sus dueños. Por este motivo, desde la aparición de cánceres en animales de compañía, según se informa, se puede predecir que sus propietarios tienen un alto riesgo de desarrollar cánceres en el futuro.

Se sabe que los perros que son animales de compañía típicos envejecen 7 veces más rápido que los seres humanos. Según se informa, el número de perros actualmente criados es de aproximadamente 6,7 millones en Japón y aproximadamente 17,64 millones en EE. UU. Generalmente se dispone de vacunas contra la rabia, así como de vacunas combinadas, tales como vacunas de combinación quíntuples, séptuples u óctuples, lo que conduce a tasas reducidas de infecciones altamente letales, incluida la infección por parvovirus canino, infección del moquillo canino, infección del virus de la parainfluenza canina (tos de las perreras), infección por adenovirus canino de tipo 2 (tos de las perreras), hepatitis infecciosa canina, infección por coronavirus canino y leptospirosis. Por lo tanto, se ha aumentado la vida útil promedio de un perro, y los perros de 7 años o más representan el 35,5 % del total de perros. Las causas de muerte, tal como cáncer, hipertensión y cardiopatías están aumentando en los perros, como en los seres humanos. En Estados Unidos, aproximadamente 4 millones de perros son diagnosticados anualmente con cáncer. También en Japón, aproximadamente 1,6 millones de perros presuntamente tienen algún tumor potencial. Una exploración de revisión, sin embargo, no es muy común en animales de compañía, a diferencia de en seres humanos. Esto conduce a la detección tardía de la enfermedad. En la mayoría de los casos, sus dueños notan los síntomas de las mascotas por primera vez cuando los tumores ya se han vuelto grandes y acuden a los veterinarios. Si tales tumores grandes son malignos, incluso la terapia quirúrgica (por ejemplo, la operación quirúrgica) o la medicación con agentes anticancerosos o similares es a menudo demasiado tarde para curar los tumores. Los tumores que los veterinarios confirmaron como malignos generalmente se tratan con agentes anticancerosos sin cirugía. Incluso en el caso de realizar cirugía, se requiere asegurar los márgenes quirúrgicos o tomar medidas estrictas para la cirugía, como las medidas contra la propagación de la sangre o las células durante la cirugía. De forma deseable, El tratamiento con agentes anticancerosos se inicia inmediatamente después de la cirugía, y también se realiza un seguimiento a intervalos cortos. Por lo tanto, el fármaco que utiliza fármacos terapéuticos para el cáncer también es esencial para los animales de compañía afectados por cáncer. Un método de detección, si lo hubiera, para analizar un gen o una proteína relacionada con la enfermedad de un cierto tipo de cáncer se permite un tratamiento más eficaz que nunca y es ventajoso tanto para los propietarios como para los veterinarios.

La proteína 1 asociada a la proliferación y el citoplasma (CAPRINA-1) es una proteína intracelular que se sabe que se expresa en la activación o división celular de las células normales en reposo y que forma gránulos de estrés citoplasmático con ARN intracelulares para participar en la regulación del transporte y la traducción de los ARNm. Si bien, los presentes inventores han revelado que: la CAPRINA-1 se expresa altamente en la superficie de la membrana de las células de cáncer de mama; y un anticuerpo contra la CAPRINA-1 ejerce fuertes efectos antitumorales en células de cáncer de mama (Literatura de Patentes 1). Según otro informe, la expresión de CAPRINA-1 en una muestra derivada de un paciente puede medirse utilizando una unión de anticuerpo a CAPRINA-1 expresada en la superficie celular para detectar un cáncer y evaluar el grado del cáncer (Patente de Literatura 2). Específicamente, el informe indica que una proteína de membrana plasmática CAPRINA-1 puede servir como un objetivo para el tratamiento del cáncer o similares. Tal como se ha mencionado anteriormente, debido a la diversidad de pacientes con cáncer, se requiere probar la expresión de CAPRINA-1 en una muestra derivada de un paciente con cáncer para determinar la administración de un fármaco terapéutico dirigido a CAPRINA-1, por ejemplo, un anticuerpo. No obstante, no existe ningún informe sobre un método para detectar CAPRINA-1 para la aplicación de un fármaco terapéutico específico, o no existe ningún reactivo para detectar un cáncer utilizando una muestra derivada de un paciente con cáncer.

La literatura de patentes 3 desvela una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención del cáncer, que comprende anticuerpos contra una secuencia parcial de CAPRINA-1.

Bibliografía de Patente 4, que es la técnica anterior según el Art. 54 (3) EPC con respecto al objeto en la presente solicitud que no tiene derecho a su fecha de prioridad reclamada del 19 de julio de 2012, desvela anticuerpos anti-CAPRINA-1 para su uso en el tratamiento del cáncer de hígado.

Lista de citas

Literatura de patente

Bibliografía de patente 1: documento WO2010/016526

Bibliografía de patente 2: documento WO2010/016527

Bibliografía de patente 3: documento WO2011/096528

Bibliografía de patente 4: documento EP 2832365

Sumario de la invención

Problema técnico

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un enfoque de detección de cáncer útil en el diagnóstico de un cáncer. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método para detectar un cáncer que implique detectar CAPRINA-1 en una muestra de un paciente con cáncer y determinar el nivel de expresión del mismo para determinar la administración de un fármaco terapéutico dirigido a CAPRINA-1 paciente con cáncer, y un fármaco y un kit para usar en el diagnóstico de un cáncer.

Solución al problema

Como resultado de realizar estudios diligentes, los presentes inventores han obtenido ADNc que codifica proteínas a las que los anticuerpos presentes en el suero derivado del organismo que lleva el cáncer se unen mediante SEREX utilizando una biblioteca de ADNc derivado de testículo de perro y el suero de perros portadores de cáncer. La CAPRINA-1 de perro que tiene cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 y 14 se prepararon sobre la base de los ADNc. Los presentes inventores también han preparado CAPRINA-1 humana que tiene cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO: 2 y 4 sobre la base de genes homólogos humanos de los genes obtenidos. Por consiguiente, los presentes inventores han descubierto que: los genes que codifican CAPRINA-1 se expresan específicamente en perros y testículos humanos, respectivamente, y en células cancerosas malignas (véase el Ejemplo 1 que se menciona más adelante); y anticuerpos monoclonales preparados utilizando, como antígenos, Los polipéptidos recombinantes preparados sobre la base de las secuencias de aminoácidos de CAPRINA-1 pueden unirse a CAPRINA-1 en varios tejidos cancerosos y dañar las células cancerosas que tienen CAPRINA-1 en su superficie. Como resultado, los presentes inventores han obtenido el hallazgo de que CAPRINA-1 puede usarse como un objetivo para el tratamiento del cáncer. Los presentes inventores han encontrado además que la CAPRINA-1 puede detectarse específicamente a partir de muestras derivadas de pacientes con cáncer mediante el uso de los anticuerpos monoclonales mencionados anteriormente. Específicamente, la presente invención proporciona un método para detectar un cáncer en una muestra biológica, que comprende medir la expresión de CAPRINA-1. Además, la presente invención ha establecido un método para detectar CAPRINA-1 en una muestra derivada de un paciente con cáncer y evaluar su nivel de expresión mediante un método de ensayo inmunológico utilizando cualquiera de los anticuerpos monoclonales mencionados anteriormente, es decir, mediante ELISA para el suero derivado de pacientes con cáncer y/o un método de tinción inmunohistoquímica para tejidos cancerosos, etc. Como resultado de la evaluación de una muestra derivada de cáncer mediante el uso de este método, también se ha encontrado que un fármaco terapéutico dirigido a CAPRINA-1 es aplicable a un paciente en el que CAPRINA-1 se expresa en un nivel alto. Sobre la base de estos hallazgos, se ha completado la presente invención.

La presente invención proporciona: métodos para detectar el cáncer, usos de un fármaco o kit para el diagnóstico de cáncer, fármacos para su uso en el diagnóstico de cáncer, y métodos para seleccionar un fármaco terapéutico específico para el cáncer, todo tal como se define en las reivindicaciones.

Efectos ventajosos de la invención

La presente invención proporciona un nuevo método para detectar un cáncer para medir el nivel de expresión de CAPRINA-1 en una muestra separada de un paciente con cáncer. Como se muestra específicamente en los ejemplos mencionados más adelante, los anticuerpos preparados utilizando, como antígenos, los polipéptidos recombinantes preparados sobre la base de la secuencia de aminoácidos de CAPRINA-1 (también denominada CAPRINA-1) reaccionan específicamente con CAPRINA-1 en el suero o tejidos de pacientes con cáncer. Como también se describe más adelante en los Ejemplos, la propia CAPRINA-1 se expresa específicamente en niveles altos en diversos tejidos cancerosos. La presencia y el nivel de expresión de CAPRINA-1 en una muestra separada de un paciente con cáncer se pueden medir para detectar un cáncer. Además, la presencia o ausencia de sensibilidad a un fármaco dirigido a CAPRINA-1 como un fármaco de anticuerpos, puede determinarse preliminarmente para seleccionar de ese modo un paciente al que se aplica este fármaco terapéutico. Específicamente, la presencia y el nivel de expresión de CAPRINA-1 pueden medirse preliminarmente mediante la aplicación de la presente invención a un paciente con cáncer para proporcionar así un tratamiento más eficaz usando un anticuerpo anti-CAPRINA-1.

Descripción breve del dibujo

[Figura 1] La figura 1 es un diagrama que muestra los patrones de expresión de un gen que codifica CAPRINA-1 en tejidos normales y líneas de células tumorales. El número de referencia 1 representa los patrones de expresión del gen que codifica la proteína CAPRINA-1. El número de referencia 2 representa los patrones de expresión del gen GAPDH. El panel superior muestra los resultados sobre los tejidos normales del perro. El panel central izquierdo muestra los resultados sobre tejidos de cáncer de mama de perro. El panel central derecho muestra los resultados sobre las líneas celulares del cáncer de mama humano. El panel inferior muestra los resultados sobre varias líneas celulares de cáncer humano.

DESCRIPCIÓN DE LAS REALIZACIONES

El método para detectar un cáncer de acuerdo con la presente invención comprende detectar CAPRINA-1 en una muestra biológica y medir su nivel de expresión. El nivel de expresión de CAPRINA-1 en una muestra de un paciente con cáncer se puede medir mediante un método de análisis basado en, por ejemplo, un método de ensayo inmunológico utilizando un anticuerpo anti-CAPRINA-1. La mayoría de estos métodos son conocidos en la técnica, y cualquiera de los métodos de ensayo inmunológico que utilizan el anticuerpo tal como análisis inmunohistoquímico, análisis de transferencia de tipo Western, inmunoprecipitación, ensayo de unión molecular, ELISA y ensayo bioquímico de actividad enzimática se pueden usar. En este contexto, el "nivel de expresión" usado en el presente documento incluye la acumulación intracelular y la abundancia de la proteína.

La expresión de CAPRINA-1 en la muestra se puede diferenciar por clasificación en las puntuaciones que se muestran en los Ejemplos. Una puntuación más alta indica que la CAPRINA-1 que se va a medir está contenida en una mayor cantidad en el tejido canceroso o suero de cáncer de un paciente con cáncer. En la presente invención, el término "medición" o "ensayo" abarca todos los aspectos de detección y abordajes cualitativos, cuantitativos y semicuantitativos.

La secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 o 14 es la secuencia de aminoácidos de la CAPRINA-1 de perro. La CAPRINA-1 de perro que tiene esta secuencia de aminoácidos ha sido descubierta por SEREX usando una biblioteca de ADNc derivado de testículo de perro y suero derivado de perros portadores de cáncer, y se ha identificado como un polipéptido que se une a un anticuerpo presente específicamente en el suero derivado de perros portadores de cáncer. (véase el Ejemplo 1). La propia CAPRINA-1 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 o 14 puede analizarse como un antígeno en tejidos de perros mediante el método mencionado anteriormente para diagnosticar la presencia o ausencia de sensibilidad del paciente a un fármaco terapéutico dirigido a CAPRINA-1 (véanse los Ejemplos). En este contexto, la frase "que tiene una (la) secuencia de aminoácidos" utilizada en el presente documento significa que los residuos de aminoácidos se disponen en el orden presentado en la información predeterminada de la secuencia de aminoácidos. Por lo tanto, por ejemplo, el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2" significa un polipéptido de 709 residuos de aminoácidos de tamaño en el que los residuos de aminoácidos están unidos en el orden presentado en la secuencia de aminoácidos Met Pro Ser Ala ... (snip) ... Gln Gln Val Asn como se muestra en la SEQ ID NO: 2. En la presente memoria descriptiva, el "polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2" también puede abreviarse como "polipéptido de la SEQ ID NO: 2". Lo mismo se aplica a la frase "que tiene una (la) secuencia de nucleótidos". En este caso, el término "que tiene" se puede usar indistintamente con el término "que comprende" o "que consiste en".

El "polipéptido" utilizado en el presente documento se refiere a una molécula que se forma a través de los enlaces peptídicos de una pluralidad de aminoácidos, y abarca no solo una molécula polipeptídica constituida por un gran número de aminoácidos sino una molécula de bajo peso molecular que tiene una pequeña número de aminoácidos (oligopéptido) y una proteína de longitud completa. El polipéptido de acuerdo con la presente invención también abarca la proteína de longitud completa de CAPRINA-1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por cualquier SEQ ID NO con número par mostrado en las Se Q ID NO: 2 a 30.

En el método de la presente invención, CAPRINA-1 de mamífero adicional, distinta de la CAPRINA-1 de perro mostrada en la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, o 14 también se puede usar como analito. En la presente memoria descriptiva, tal CAPRINA-1 de mamífero no perro también se conoce como un "homólogo" de la CAPRINA-1 de perro. El término "CAPRINA-1" abarca CAPRINA-1 derivada no solo de los perros, sino de otros mamíferos. Los ejemplos de CAPRINA-1 de mamífero adicionales que se pueden usar como un analito en el método de la presente invención incluyen, aunque sin limitación, CAPRINA-1 humana y CAPRINA-1 de gato. Como se describe específicamente a continuación en los ejemplos, el ARNm que codifica CAPRINA-1 humano se expresa significativamente en niveles altos en testículos humanos y células cancerosas, como con la CAPRINA-1 de perro que se muestra en la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 o 14. Un anticuerpo anti-CAPRINA-1 humana, sin embargo, no se detecta en los cuerpos de seres humanos sanos. Un anticuerpo anti- CAPRINA-1 de gato no se detecta en los cuerpos de gatos sanos, pero se detecta solo en gatos con cáncer. Por lo tanto, la aplicabilidad de un fármaco terapéutico dirigido a CAPRINA-1 de un mamífero distinto de perro también se puede determinar mediante la medición del nivel de expresión de CAPRINA-1 derivada del mamífero distinto de perro.

La secuencia de nucleótidos que codifica la CAPRINA-1 humana y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestran en la SEQ ID NO: 1 y 3 y la SEQ ID NO: 2 y 4, respectivamente, en el Listado de Secuencias. La identidad de la secuencia de CAPRINA-1 humana frente a la de CAPRINA-1 de perro es del 94 % para la secuencia de nucleótidos y del 98 % para la secuencia de aminoácidos. Dado que la secuencia de aminoácidos de la CAPRINA-1 es tan alta como del 98 %, incluso entre perros y seres humanos, que son mamíferos genéticamente distantes, la secuencia de aminoácidos de la CAPRINA-1 probablemente tiene una secuencia alta (aproximadamente el 85 % o más alta) entre CAPRINA-1 de mamífero no humano y la CAPRINA-1 de perro. En el método de la presente invención, la CAPRINA-1, cuyo nivel de expresión se va a medir, no está particularmente limitada y es una que tiene, preferentemente, un 85 % o más, más preferentemente, un 95 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la CAPRINA-1 de perro mostrada en la SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, or14.

Una sustancia antigénica, tal como una proteína, que tiene una estructura complicada con un gran peso molecular, por lo general contiene una pluralidad de epítopos que difieren en estructura en su molécula. Por lo tanto, se producen in vivo diversos tipos de anticuerpos que reconocen y se unen respectivamente a una pluralidad de epítopos en dicha sustancia antigénica. En otras palabras, los anticuerpos producidos in vivo contra la sustancia antigénica (por ejemplo, proteína) son anticuerpos policlonales, que son mezclas de tipos plurales de anticuerpos. Los anticuerpos descubiertos por los presentes inventores que están presentes específicamente en el suero derivado de organismos afectados por cáncer y que se unen específicamente a CAPRINA-1 recombinante a través de la reacción antígeno-anticuerpo también son anticuerpos policlonales. El término "anticuerpo policlonal" usado en la presente invención se refiere a un anticuerpo que se encuentra en el suero derivado de un organismo que contiene una sustancia antigénica en el cuerpo y se ha inducido en el organismo contra la sustancia antigénica.

Los ejemplos específicos de un polipéptido preferido para su uso como antígeno incluyen polipéptidos de SEC ID NO de número par de SEQ ID NO: 2 a 30 y fragmentos de las mismas.

Las secuencias de nucleótidos de los polinucleótidos que codifican los polipéptidos que consisten en las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEQ ID NO de números pares de las de las SEQ ID NO: 2 a 30 (es decir, las SEQ ID NO: 2, 4, 6, ... 28 y 30) se muestran en las SEQ ID NO con números impares de las SEQ ID n O: 1 a 29 (es decir, las SEQ ID NO: 1, 3, 5,... 27 y 29), respectivamente.

Es ampliamente conocido por los expertos en la técnica que incluso una proteína derivada de un antígeno proteico por la sustitución, deleción, adición, o inserción de un pequeño número de residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos que constituye la proteína generalmente puede tener casi la misma antigenicidad que la de la proteína original. Por lo tanto, un polipéptido que tiene una secuencia derivada de la secuencia de aminoácidos de CAPRINA-1 mediante sustitución, deleción, adición y/o inserción de un pequeño número de (preferentemente 1 o varios) residuos de aminoácidos también se puede usar en la detección del cáncer, al igual que con los polipéptidos que consisten en las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO de números pares de las SEQ iD NO: 2 a 30 anteriores, siempre que el polipéptido tenga un 80 % o más o un 85 % o más, preferentemente del 90 % o mayor, más preferentemente un 95 % o más, además, preferentemente un 98 % o más de identidad de secuencia de la secuencia original y se une específicamente a un anticuerpo policlonal contra CAPRINA-1 a través de la reacción antígenoanticuerpo (de en el presente documento en adelante, este polipéptido también se conocerá como un "polipéptido modificado específicamente reactivo" por comodidad). Preferentemente, el polipéptido modificado específicamente reactivo tiene una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de CAPRINA-1 mediante la sustitución, deleción, adición, y/o inserción de 1 o varios residuos de aminoácidos. El término "varios" utilizado en el presente documento se refiere a un número entero de 2 a 10, preferentemente un número entero de 2 a 6, más preferentemente un número entero de 2 a 4.

La "identidad de secuencia" utilizada en el presente documento para la secuencia de aminoácidos se refiere al porcentaje de un valor determinado dividiendo el número de residuos de aminoácidos idénticos por el número total de residuos de aminoácidos en las alineaciones de mejor coincidencia de los residuos de aminoácidos en dos secuencias de aminoácidos a comparar. Para las alineaciones, si es necesario, una o ambas de estas dos secuencias a comparar pueden estar separadas. Dichas alineaciones de secuencia pueden llevarse a cabo utilizando un programa bien conocido, por ejemplo, BLAST, FASTA, o CLUSTAL W (Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 2264-2268, 1993; y Altschul y col., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402, 1997).

Veinte tipos de aminoácidos que constituyen una proteína natural se pueden dividir de acuerdo con propiedades similares en los siguientes grupos: aminoácidos neutros que tienen una cadena lateral polar baja (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met y Pro); aminoácidos neutros que tienen una cadena lateral hidrofílica (Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr y Cys); aminoácidos ácidos (Asp y Glu); aminoácidos básicos (Arg, Lys e His); y aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp e His). Se sabe que la sustitución dentro de cada uno de estos grupos, es decir, sustitución conservadora, no cambia las propiedades del polipéptido en la mayoría de los casos. Por lo tanto, en el caso de la sustitución de los residuos de aminoácidos de CAPRINA-1, un miembro de cada uno de estos grupos puede estar sustituido por otro miembro del mismo grupo, de modo que la actividad de unión contra el anticuerpo apropiado es probable que se mantenga. En la presente invención, sin embargo, la forma modificada puede tener una sustitución no conservadora siempre que la forma modificada tenga una actividad inductora de inmunidad equivalente o sustancialmente equivalente a la de la forma no modificada.

El polipéptido utilizado en la presente invención se puede sintetizar de acuerdo con métodos de síntesis química, por ejemplo, los métodos de Fmoc (fluorenilmetiloxicarbonilo) y tBoc (t-butiloxicarbonilo) (Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimentation Course en inglés) 1, the Japanese Biochemical Society ed., Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd. (Japón), 1981). Asimismo, el polipéptido se puede sintetizar por métodos de rutina usando varios sintetizadores de péptidos disponibles comercialmente. Como alternativa, el polipéptido se puede preparar fácilmente utilizando métodos de ingeniería genética conocidos en la técnica (Sambrook et al., Molecular Cloning, 2a edición, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3a edición, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons; etc.). Por ejemplo, el ARN se extrae de un tejido que expresa un gen que codifica la CAPRINA-1 humana mostrada en la SEQ ID NO:2 o un factor homólogo de la misa. A partir de este a Rn , el ADNc del gen se prepara mediante RT-PCR. El ADNc de longitud completa o un fragmento parcial deseado del mismo se incorpora en los vectores de expresión, que después puede transferirse a las células huésped para obtener el polipéptido de interés. Las secuencias de nucleótidos de los ADNc que codifican las proteínas CAPRINA-1 de perro que se muestran en las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 y 14 se muestran en las SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11 y 13, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos de los ADNc que codifican las proteínas CAPRINA-1 humanas se muestran en las SEQ ID NO: 2 y 4 como factores homólogos humanos de los mismos se muestran en las SEQ ID NO: 1 y 3, respectivamente. Por lo tanto, los cebadores para su uso en la RT-PCR se pueden diseñar fácilmente con referencia a estas secuencias de nucleótidos. Tal como se menciona más adelante, un gen que codifica la CAPRINA-1 de mamífero no humano se puede amplificar con cebadores diseñados con referencia a la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquier SEQ ID NO: con números impares de las SEQ ID NO: 5 a 29. Por lo tanto, el ADNc que codifica, por ejemplo, la CAPRINA-1 de gato, también se puede preparar fácilmente con el mismo enfoque que el anterior. La extracción de ARN, RT-PCR, la incorporación del ADNc en vectores, y la transferencia de los vectores a las células huésped puede llevarse a cabo, por ejemplo, por métodos conocidos como se describe a continuación. Asimismo, los vectores o células huésped utilizados son bien conocidos, y varios productos están disponibles comercialmente.

Las células huésped pueden ser cualquier célula capaz de expresar el polipéptido anterior. Los ejemplos de células procariotas incluyen E. coli. Los ejemplos de células eucariotas incluyen: células de mamíferos cultivadas, tales como células de riñón de mono COS1, células de ovario de hámster chino CHO, una línea celular de riñón embrionario humano HEK293 y una línea celular de piel embrionaria de ratón NIH3T3; y levadura en germinación, células de levadura de fisión, células de gusano de seda y células de huevo de Xenopus.

En caso de usar células procariotas como células huésped, los vectores de expresión usados tienen un origen que permita la replicación en las células procariotas, un promotor, un sitio de unión al ribosoma, un sitio de clonación múltiple, un terminador, un gen de resistencia a fármacos, un gen complementario auxótrofo, etc. Los ejemplos de vectores de expresión para E. co li pueden incluir la serie pUC, pBluescript II, sistemas de expresión pET y sistemas de expresión pGEX. El ADN que codifica el polipéptido anterior puede incorporarse en dichos vectores de expresión, con los que posteriormente se transforman las células huésped procariotas, seguido del cultivo de los transformantes obtenidos de tal forma que el polipéptido codificado por el ADN se expresa en las células huésped procariotas. A este respecto, El polipéptido puede expresarse como una proteína de fusión con una proteína adicional. En este contexto, se puede obtener el ADN que codifica el polipéptido anterior, por ejemplo, mediante la preparación de ADNc mediante RT-PCR como se ha mencionado anteriormente. Como alternativa, el ADN se puede sintetizar mediante métodos de rutina utilizando sintetizadores de ácido nucleico disponibles en el mercado como se menciona más adelante. Las secuencias de nucleótidos de los ADNc de los genes que codifican las proteínas CAPRINA-1 se muestran en las SEQ ID NO: 2 y 4 se muestran en las SEQ ID NO: 1 y 3, respectivamente, en el Listado de Secuencias.

En caso de usar células eucariotas como células huésped, se pueden usar vectores de expresión para células eucarióticas que tengan un promotor, una región de cote y empalme, un sitio de adición de poli (A), etc. se utilizan como vectores de expresión. Ejemplos de tales vectores de expresión pueden incluir los vectores pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, vector EBV, pRS, pcDNA3 y pYES2. De la misma manera que anteriormente, el ADN que codifica el polipéptido anterior utilizado en la presente invención puede incorporarse en dichos vectores de expresión, con los que posteriormente se transforman las células huésped eucariotas, seguido del cultivo de los transformantes obtenidos de tal forma que el polipéptido codificado por el ADN se expresa en las células huésped eucariotas. En el caso de utilizar vectores de expresión tales como pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-Nl o pEGFP-Cl, el polipéptido puede expresarse como varias proteínas de fusión marcadas con el marcador His (por ejemplo, (His)a a (His)10), el marcador FLAG, el marcador myc, el marcador HA, GFP o similares.

Los vectores de expresión se pueden transferir a las células huésped mediante métodos bien conocidos, tales como electroporación, un procedimiento de fosfato de calcio, un procedimiento de liposomas, un procedimiento de DEAE dextrano, microinyección, infección viral, lipofección y unión con péptidos que penetran en las células.

El polipéptido de interés puede aislarse y purificarse a partir de las células hospedadoras mediante una combinación de operación de separación conocidos en la materia. Sus ejemplos incluyen el tratamiento con un desnaturalizante (por ejemplo, urea) o un tensioactivo, ultrasonidos, digestión enzimática, extracción por saturación de sal, fraccionamiento y precipitación de disolventes, diálisis, centrifugación, ultrafiltración, filtración en gel, SDS-PAGE, electroforesis de isoelectroenfoque, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, cromatografía de afinidad y cromatografía de fase inversa.

Los polipéptidos obtenidos mediante estos métodos también incluyen sus formas de proteínas de fusión con otras proteínas arbitrarias. Sus ejemplos pueden incluir proteínas de fusión con glutatión-S-transferasa (GST) o marcador His. Los polipéptidos expresados en células transformadas pueden sufrir varias modificaciones intracelulares después de la traducción. Dichos polipéptidos modificados postraduccionalmente pueden usarse siempre que estos polipéptidos tengan actividad de unión contra el anticuerpo policlonal contra CAPRINA-1. Los ejemplos de dichas modificaciones postraduccionales pueden incluir la eliminación de la metionina N-terminal, acetilación N-terminal, glicosilación, degradación limitada mediada por proteasa intracelular, miristoilación, isoprenilación y fosforilación.

En el método de la presente invención, se analiza la CAPRINA-1 que puede estar contenida en la muestra biológica. Tal como se ha mencionado anteriormente, se ha descubierto que las células cancerosas tienen un nivel de expresión significativamente alto de CAPRINA-1 como antígeno. Como se describe específicamente a continuación en los ejemplos, La propia CAPRINA-1 puede analizarse en células cancerosas o en tejidos cancerosos para determinar así la aplicabilidad de un fármaco terapéutico dirigido contra la CAPRINA-1 en pacientes con un alto nivel de expresión de CAPRINA-1.

El polipéptido en la muestra puede analizarse fácilmente mediante un método de ensayo inmunológico bien conocido. Específicamente, la CAPRINA-1 que puede estar presente en la muestra puede analizarse mediante inmunoensayo usando, por ejemplo, un anticuerpo preparado capaz de una reacción antígeno-anticuerpo con CAPRINA-1 o un fragmento preparado de unión a antígeno del mismo. No solo la CAPRINA-1 de perro mostrada en la SEQ ID NO:6, sino sus factores homólogos en otros mamíferos, por ejemplo, CAPRINA-1 humana mostrada en la SEQ ID NO:2 o 4 o CAPRINA-1 de gato, pueden analizarse utilizando un anticuerpo capaz de reaccionar antígeno-anticuerpo con, por ejemplo, la CAPRINA-1 mostrada en la SEQ ID NO: 6 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, porque el anticuerpo tiene reactividad cruzada.

Tal método de inmunoensayo en sí mismo es un método de rutina bien conocido, tal como se ha mencionado anteriormente. El anticuerpo que reconoce CAPRINA-1 puede analizarse inmunohistoquímicamente para determinar su reactividad con CAPRINA-1 mediante un método bien conocido por los expertos en la técnica usando una sección congelada fijada en paraformaldehído o acetona o una sección de tejido incrustada en parafina fijada en paraformaldehído obtenida de un paciente durante una operación quirúrgica o de un animal que porta un tejido de xenoinjerto inoculado con una línea celular que expresa CAPRINA-1 de forma espontánea o después de la transfección.

El nivel de expresión de CAPRINA-1 en la muestra teñida inmunohistoquímicamente de este modo puede determinarse cuantitativamente por puntuación numérica que refleja patrones de tinción. Dos o más puntuaciones se establecen preferentemente. En el aspecto más preferido, los patrones de tinción se clasifican en 4 puntuaciones. Por ejemplo, la CAPRINA-1 expresada en la superficie de las células cancerosas se tiñe mediante un método de tinción inmunohistoquímica habitual, y se le asigna cualquiera de las 4 puntuaciones que reflejan su patrón de tinción. En dicho caso, cada puntuación se establece de la siguiente manera:

Puntuación 0 (sin sobreexpresión de CAPRINA-1): La tinción positiva de la membrana celular no se observa o se observa en menos del 10 % de las células cancerosas.

Puntuación 1 (sin sobreexpresión de CAPRINA-1): se observa una tinción débil casi imperceptible de la membrana celular en el 10 % o más de las células cancerosas, y estas células cancerosas se tiñen parcialmente solo en sus membranas celulares.

Puntuación 2 (con sobreexpresión de CAPRINA-1): Se observa una tinción positiva completa de débil a moderada de la membrana celular en el 10 % o más de las células cancerosas, o se observa una tinción positiva fuerte completa de la membrana celular en el 10 % o más y en un 30 % o menos de las células cancerosas.

Puntuación 3 (con sobreexpresión de CAPRINA-1): Se observa una fuerte tinción positiva completa de la membrana celular en el 30 % o más de las células cancerosas.

Dicho sistema de puntuación está especificado por la Sociedad Americana de Oncología Clínica (EE. UU.) y aprobado por la Sociedad Japonesa de Patología (Japón). Un sistema de puntuación similar también se explota en "HercepTest" para determinar cuantitativamente la abundancia de un antígeno del cáncer Her2 en muestras de pacientes. La cuantificación de Her2 se especifica mediante las pautas de prueba de ASCO/CAP Her2. En Japón, el comité patológico para trastuzumab también especifica una guía para las pruebas de Her2 que incluye este sistema de puntuación.

La proporción de células cancerosas teñidas después de la tinción inmunohistoquímica descrita en cada puntuación puede determinarse mediante: recuento de al menos 500 células en el campo de visión usando un microscopio de luz con sensibilidad aumentada a 4 veces, 10 veces o 20 veces; medición de células que muestran imágenes de tinción de sus membranas celulares como se describe en cada puntuación; y cálculo de prueba según la siguiente expresión:

El número de células positivas/El número total de células (aproximadamente 500 células) x 100

Para la tinción inmunohistoquímica, El anticuerpo que tiene reactividad con CAPRINA-1 puede teñirse por varios métodos. Por ejemplo, el anticuerpo se puede visualizar a través de la reacción con un anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante o un anticuerpo anti-pollo de cabra.

El anticuerpo capaz de una reacción antígeno-anticuerpo con CAPRINA-1 o un fragmento de unión a su antígeno para su uso en el inmunoensayo de CAPRINA-1 también puede proporcionarse como un fármaco o kit para el diagnóstico de un cáncer. En este caso, el fármaco o kit para el diagnóstico de un cáncer también puede consistir en el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno o puede comprender, además, por ejemplo, diversos aditivos útiles en la estabilización o similares del anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno pueden conjugarse con un metal, tal como manganeso o hierro. Dicho anticuerpo conjugado con metal o fragmento de unión a antígeno, cuando se administra al cuerpo, se acumula en un sitio que contiene la proteína antigénica. En consecuencia, la presencia de células cancerosas que producen la proteína antigénica puede detectarse mediante la medición de MRI o similar del metal.

Se ha encontrado que CAPRINA-1 es una proteína de membrana plasmática que se expresa en la superficie de las células cancerosas. Dado que los cuerpos de los pacientes con cáncer contienen muchas enzimas proteolíticas, la región extracelular en la secuencia CAPRINA-1 en las células cancerosas se separa de las células cancerosas tras la degradación. La región extracelular separada de este modo está, por lo tanto, presente en cantidades más grandes en sangre, en comparación con la región intracelular en la secuencia de la CAPRINA-1 en las células cancerosas. En consecuencia, la CAPRINA-1 presente no solo en tejidos de cáncer fijados en portaobjetos de vidrio, sino en el suero de pacientes con cáncer puede detectarse mediante el ensayo de acuerdo con la presente invención usando un anticuerpo anti-CAPRINA-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo capaz de unirse más fuertemente a la región extracelular de CAPRINA-1. Además, este método de detección, que emplea tal anticuerpo que se une a la región extracelular de CAPRINA-1, es capaz de identificar con precisión a un paciente con cáncer que se puede esperar que obtenga efectos terapéuticos mediante la administración de un fármaco terapéutico dirigido a CAPRINA-1, particularmente, un fármaco anticuerpo anti-CAPRINA-1 y, por lo tanto, puede proporcionar un tratamiento más eficaz contra el cáncer. Por lo tanto, en la presente invención, se usa, preferentemente, un anticuerpo que se une a la región extracelular de CAPRINA-1 en células cancerosas. Los ejemplos del péptido parcial de la proteína CAPRINA-1 que contiene un epítopo reconocido por tal anticuerpo incluyen péptidos correspondientes a regiones extracelulares en las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID No de las SEQ ID NO: 2 a 30 en el listado de secuencias, excepto las SEQ ID NO: 6 y 18. Los ejemplos específicos de los mismos incluyen péptidos que comprenden una secuencia de 7 o más aminoácidos consecutivos en la región de los residuos de aminoácidos 50 a 98 los residuos de aminoácidos 233 a 344 en la SEQ ID NO:2 y péptidos que comprenden una secuencia de 7 o más aminoácidos consecutivos en una región homóloga a estos residuos de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquier SEQ ID NO de número par de las SEQ ID: 4 a 30, excepto las SEQ ID NO: 6 y 18. Sus ejemplos más específicos incluyen la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NO: 43 o 61, preferentemente la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:62 en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:61 y las secuencias de aminoácidos que tienen un 80 % o más, preferentemente un 85 % o más, más preferentemente un 90 % o más, aún más preferentemente un 95 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos. El anticuerpo usado en la presente invención abarca todos los anticuerpos que se unen a cualquiera de estos péptidos. Los ejemplos específicos de los mismos incluyen anticuerpos que se unen a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:63 o fragmentos de unión a antígeno de la misma, y anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno que tienen la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo monoclonal que tiene las secuencias de aminoácidos que se muestran en la SEQ ID NO: 70 y 71 o un fragmento de unión a antígeno de los mismos.

El "fragmento de unión a antígeno" usado en el presente documento significa cualquier fragmento de anticuerpo que tenga la capacidad de unirse al antígeno, tal como un fragmento Fab o F(ab')2 contenido en una molécula de anticuerpo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o puede ser un anticuerpo monoclonal. Se prefiere un anticuerpo monoclonal altamente reproducible para inmunoensayo o similares. Estos anticuerpos policlonales y monoclonales pueden prepararse mediante un método bien conocido utilizando un péptido como inmunógeno y pueden obtenerse fácilmente mediante un método de rutina. El método de inmunización implica inmunizar al animal con, por ejemplo, CAPRINA-1 conjugada con una proteína portadora como la hemocianina de lapa californiana (KLH), caseína, o seroalbúmina como inmunógeno junto con un adyuvante para inducir así un anticuerpo contra CAPRINA-1. Las células productoras de anticuerpos (por ejemplo, células de bazo o linfocitos) recogidas del animal inmunizado se fusionan con células de mieloma para preparar hibridomas. A continuación, los hibridomas que producen anticuerpos que se unen a CAPRINA-1 se seleccionan y proliferan. Los anticuerpos monoclonales adaptables a CAPRINA-1 como antígeno pueden obtenerse del sobrenadante del cultivo. Este método es un método de rutina bien conocido.

El cáncer que se detectará mediante el método de la presente divulgación es un cáncer que sobreexpresa CAPRINA-1. Sus ejemplos incluyen cáncer de mama, tumor cerebral, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de riñón, cáncer de la glándula tiroidea, cáncer de bazo, cáncer de páncreas, cáncer de intestino grueso, cáncer de piel, cáncer de ovarios, cáncer de útero (cáncer del cuello uterino y cáncer del cuerpo uterino), cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de testículo y osteosarcoma. Otros ejemplos de los mismos pueden incluir, aunque sin limitación, cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, melanoma, diversos tipos de adenocarcinomas, cáncer hepatocelular, cáncer de células basales, tumor gingival parecido a acantoma, masa tumoral en la cavidad oral, cáncer de glándula perianal, masa tumoral del saco anal, adenocarcinoma apocrino del saco anal, carcinoma de células de Sertoli, cáncer de vestíbulo vaginal, cáncer sebáceo, epitelioma sebáceo, adenoma sebáceo, cáncer de glándula sudorípara, adenocarcinoma en la cavidad nasal, adenocarcinoma de la nariz, adenocarcinoma bronquial, cáncer ducal, cáncer de glándula mamaria, carcinoma complejo mamario, tumor maligno mixto de la glándula mamaria, adenocarcinoma papilar intraductal, fibrosarcoma, hemangiopericitoma, condrosarcoma, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma histiocítico, mixosarcoma, sarcoma primitivo, mastocitoma, leiomioma cutáneo, leiomioma intraperitoneal, leiomioma, linfoma, leucemia linfocítica crónica, linfoma gastrointestinal, linfoma del órgano digestivo, linfoma de células pequeñas/medianas, tumor medular suprarrenal, tumor de células granulosas y feocromocitoma.

De acuerdo con la invención, el cáncer es al menos un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de hígado, cáncer de páncreas y cáncer de próstata.

La muestra biológica a la que se aplica el método de la presente invención se deriva de un mamífero y, preferentemente, de un ser humano, un perro o un gato.

Los ejemplos de la muestra que se somete al método de la presente invención incluyen fluidos corporales, tejidos y células. El "fluido corporal" utilizado en el presente documento se refiere a una muestra biológica en estado líquido. Sus ejemplos incluyen sangre (incluido suero, plasma y fluido intersticial), linfa, ascitis, derrame pleural, líquido espinal, esputo, fluido lagrimal, secreción nasal, saliva, orina, fluido vaginal y semen. El fluido corporal puede incluir, por ejemplo, lavados peritoneales con solución salina. Se prefiere suero, plasma, ascitis, o derrame pleural.

En el método de la presente invención, cuando el nivel de expresión de CAPRINA-1 medido en la muestra biológica es más alto (preferentemente, estadísticamente significativamente más alto) que el de un individuo sano, la presencia de un cáncer que puede unirse específicamente por el anticuerpo anti-CAPRINA-1 utilizado en la medición (es decir, un cáncer al que se puede dirigir el anticuerpo como fármaco terapéutico para el cáncer) se determina en el organismo (individuo) del cual se deriva la muestra biológica. Mediante el uso de esto, el nivel de expresión de CAPRINA-1 en una muestra biológica derivada de un paciente con cáncer puede medirse mediante el método de la presente invención y compararlo con el de un individuo sano para confirmar si un fármaco terapéutico contra CAPRINA-1 es aplicable al cáncer en el paciente (por ejemplo, si el anticuerpo puede atacar o no el cáncer en el paciente como un fármaco terapéutico para el cáncer).

Por lo tanto, el método de la presente invención puede identificar a un paciente con cáncer que puede esperarse que obtenga efectos terapéuticos mediante la administración de un fármaco terapéutico que incluya un anticuerpo dirigido contra CAPRINA-1 y, por lo tanto, proporcionar un tratamiento más eficaz contra el cáncer.

De acuerdo con una realización, la presente invención se refiere a un método para seleccionar un fármaco terapéutico específico individual para un cáncer, que comprende: medir el nivel de expresión de CAPRINA-1 en una muestra biológica utilizando un anticuerpo que tiene reactividad inmunológica con un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:63; y, cuando el nivel de expresión es más alto (preferentemente, estadísticamente significativamente más alto) que el de un individuo sano, seleccionando un fármaco dirigido a CAPRINA-1, preferentemente un anticuerpo que tenga reactividad inmunológica con CAPRINA-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, como un fármaco terapéutico dirigido a CAPRINA-1 para un cáncer adecuado para la administración al individuo del cual se deriva la muestra biológica. Esta selección del fármaco terapéutico específico para un cáncer se realiza mediante el llamado fármaco hecho a medida, que ofrece una terapia contra el cáncer optimizada para un paciente individual.

El término "estadísticamente significativo" usado en el presente documento significa que la diferencia cuantitativa tratada estadísticamente entre los dos es una diferencia significativa. Específicamente, sus ejemplos incluyen el caso en el que un nivel de significación es inferior al 5 %, 1 % o 0,1 %. El método de verificación no está particularmente limitado siempre que el método sea conocido en la técnica y sea capaz de determinar la presencia o ausencia de importancia. Por ejemplo, se puede utilizar una prueba t de Student o un método de prueba de comparación múltiple.

Ejemplos

A partir de ahora en el presente documento, la presente invención se describirá más específicamente con referencia a los Ejemplos. Sin embargo, el alcance de la presente invención no pretende estar limitado por estos ejemplos.

<Ejemplo 1: Análisis de la expresión de CAPRINA-1 en cada tejido>

La expresión del gen de CAPRINA-1 en tejidos normales humanos y de perro y diversos tejidos cancerosos o líneas celulares de cáncer se examinó mediante RT-PCR de acuerdo con el Ejemplo 1 (4) del documento WO2010/016526. El resultado se muestra en la Figura 1. Como resultado, su fuerte expresión se observó en el testículo entre los tejidos normales del perro sano. Asimismo, la expresión se observó en el cáncer de mama de perro. Adicionalmente, la expresión del gen también se confirmó utilizando tejidos humanos. Como resultado, la expresión se confirmó solo en el testículo entre los tejidos normales, al igual que con el gen de CAPRINA-1 de perro, pero se detectó en muchos tipos de líneas celulares de cáncer, tales como 8 líneas celulares de cáncer de mama humano (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V y MRK-nu-1), así como 4 líneas celulares de tumores cerebrales, 3 líneas celulares derivadas de leucemia, 1 línea celular de cáncer de pulmón y 2 líneas celulares de cáncer de esófago. Estos resultados demostraron que CAPRINA-1 no se expresa en tejidos normales, excepto en el testículo, pero se expresa en muchas células cancerosas, incluidas las células de cáncer de mama.

<Ejemplo 2: Preparación de anticuerpo anti-CAPRINA-1>

(1) Preparación de anticuerpo monoclonal anti- CAPRINA-1 humana de ratón

Se mezclaron 100 |jg de CAPRIN-1 humana con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 como se prepara en el Ejemplo 3 del documento WO2010/016526 con una cantidad igual de adyuvante MPL+TDM (Sigma-Aldrich Corp.). Esta mezcla se usó como una solución de antígeno por ratón. Dicha solución de antígeno se administró por vía intraperitoneal a cada ratón Balb/c de 6 semanas de edad (Japan SLC, Inc.). A continuación, se realizaron 3 refuerzos cada 1 semana. Tres días después de la última inyección, se extrajo el bazo de cada ratón y se molió entre dos portaobjetos de vidrio esterilizados. Los procedimientos de lavado con p Bs (-) (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) y la eliminación del sobrenadante por centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos se repitieron tres veces para obtener células de bazo. Los esplenocitos obtenidos se mezclaron con células de mieloma de ratón SP2/0 (adquiridas de la ATCC) en una proporción de 10:1.200 j l de un medio RPMI1640 que contenía FBS al 10 % se calentaron a 37 °C y se mezclaron con 800 j l de PEG1500 (Boehringer Ingelheim GmbH), y la solución de PEG preparada de este modo se añadió a la mezcla de células, que luego se dejó reposar durante 5 minutos para la fusión celular. Después de la eliminación del sobrenadante mediante centrifugación a 1700 rpm durante 5 minutos, las células se suspendieron en 150 ml de un medio RPMI1640 que contenía 15 % de FBS suplementado con 2 % de equivalente de una solución HAT (Gibco) (medio selectivo HAT). Esta suspensión se inoculó en quince placas de 96 pocillos (Nunc) a 100 jl/pocillo. Las células de bazo y las células de mieloma se fusionaron mediante cultivo en condiciones a 37 °C durante 7 días en 5 % de CO2 para obtener hibridomas.

Los hibridomas preparados se seleccionaron con la afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas contra CAPRINA-1 como indicador. La solución de CAPRINA-1 de 1 jg/m l se añadió a una placa de 96 pocillos a 100 jl/pocillo y se dejó reposar a 4 °C durante 18 horas. Cada pocillo se lavó tres veces con p BS-T. Después, se añadió una solución de seroalbúmina bovina al 0,5 % (BSA) (Sigma-Aldrich Corp.) a 400 jl/pocillo y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. Se eliminó la solución en cada pocillo y se lavó cada pocillo tres veces con 400 j l de PBS-T. A continuación, se añadió el sobrenadante de cultivo de cada hibridoma obtenido anteriormente a los mismos a 100 jl/pocillo y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. Después, Se añadieron anticuerpos IgG (H L) anti-ratón marcados con HRP (Life Technologies, Inc.) diluidos 5000 veces con PBS a 100 jl/pocillo y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. Después, se añadió una solución de sustrato de TMB (Thermo Fisher Scientific Inc.) a 100 jl/pocillo y se dejó reposar durante 15 a 30 minutos para provocar la reacción de color. Después del desarrollo del color, se terminó la reacción mediante la adición de ácido sulfúrico 1 N a 100 jl/pocillo. Se midió la absorbancia a 450 nm y 595 nm con un espectrómetro de absorción. Como resultado, se seleccionaron varios hibridomas productores de anticuerpos con alta absorbancia como líneas candidatas del hibridoma de interés.

Los hibridomas seleccionados se añadieron a una placa de 96 pocillos a una densidad de 0,5 células/pocillo y se cultivaron en la placa. Una semana después, se observaron los hibridomas que forman colonias únicas en los pocillos. Las células en estos pocillos se cultivaron adicionalmente y los hibridomas clonados se seleccionaron de la misma manera que antes con la afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas contra CAPRINA-1 como indicador. Se obtuvo una pluralidad de líneas de hibridoma productoras de anticuerpos monoclonales reactivos con la proteína CAPRINA-1. Los sobrenadantes de cultivo de estos hibridomas se purificaron utilizando un portador de proteína G para obtener 150 anticuerpos monoclonales que se unen a CAPRINA-1.

A continuación, los anticuerpos monoclonales anteriores fueron seleccionados para detectar anticuerpos reactivos con la superficie de las células de cáncer de mama que expresan CAPRINA-1. Específicamente, se centrifugaron 106 células de una línea celular de cáncer de mama humana MDA-MB-231 V en un tubo para microcentrifugación de 1,5 ml. Se añadieron 100 j l del sobrenadante de cada hibridoma obtenido anteriormente y se dejó reposar durante 1 hora en hielo. Después de lavar con PBS, se añadieron anticuerpos IgG anti-ratón de cabra marcados con FITC (Invitrogen) diluidos 500 veces con PBS que contenía suero fetal bovino al 0,1 % y se dejaron en reposo durante 1 hora en hielo. Después de lavar con PBS, se midió la intensidad de fluorescencia usando FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Por otro lado, la misma operación que la anterior se realizó mediante la adición de un medio en lugar de los anticuerpos para preparar un control. Como resultado, se seleccionaron 10 anticuerpos monoclonales (n.° 1 a n.° 10) que tienen una intensidad de fluorescencia más fuerte que la del control, es decir, reactivos con la superficie de células de cáncer de mama. Las secuencias amino respectivas de las regiones variables de cadena pesada y ligera de estos anticuerpos monoclonales se muestran en las SEQ ID NO: 44 a 60. El anticuerpo monoclonal n.° 1 comprende la región variable de cadena pesada mostrada en la SEQ ID NO: 44 y la región variable de cadena ligera mostrada en la SEQ ID NO: 45; el anticuerpo monoclonal n.° 2 comprende la región variable de cadena pesada mostrada en la SEQ ID NO: 44 y la región variable de cadena ligera mostrada en la SEQ ID NO: 46; el anticuerpo monoclonal n.° 3 comprende la región variable de cadena pesada mostrada en la SEQ ID NO: 44 y la región variable de cadena ligera mostrada en la SEQ ID NO: 47; el anticuerpo monoclonal n.° 4 comprende la región variable de cadena pesada mostrada en la SEQ ID NO: 44 y la región variable de cadena ligera mostrada en la SEQ ID NO: 48; el anticuerpo monoclonal n.° 5 comprende la región variable de cadena pesada mostrada en la SEQ ID NO: 49 y la región variable de cadena ligera mostrada en la SEQ ID NO: 50; el anticuerpo monoclonal n.° 6 comprende la región variable de cadena pesada mostrada en la SEQ ID NO: 51 y la región variable de cadena ligera mostrada en la SEQ ID NO: 52; el anticuerpo monoclonal n.° 7 comprende la región variable de cadena pesada mostrada en la SEQ ID NO: 53 y la región variable de cadena ligera mostrada en la SEQ ID NO: 54; el anticuerpo monoclonal n.° 8 comprende la región variable de cadena pesada mostrada en la SEQ ID NO: 55 y la región variable de cadena ligera mostrada en la SEQ ID NO: 56; el anticuerpo monoclonal n.° 9 comprende la región variable de cadena pesada mostrada en la SEQ ID NO: 57 y la región variable de cadena ligera mostrada en la SEQ ID NO: 58; y el anticuerpo monoclonal n.° 10 comprende la región variable de cadena pesada mostrada en la SEQ ID NO: 59 y la región variable de cadena ligera mostrada en la SEQ ID NO: 60.

(2) Identificación del péptido en CAPRINA-1 al que se une el anticuerpo anti-CAPRINA-1 humana de ratón con la superficie de la célula cancerosa

Los anticuerpos monoclonales anti-CAPRINA-1 humana de ratón reactivo en la superficie de células cancerosas n.° 1 a n.° 10 obtenidos anteriormente se usaron para identificar secuencias parciales en CAPRINA-1 reconocidas de este modo.

En primer lugar, se añadió DTT (Fluka) a una concentración final de 10 mM a 100 pl de una solución de 1 pg/pl que contenía CAPRINA-1 recombinante disuelta en PBS, y se hizo reaccionar a 95 °C durante 5 minutos para reducir los enlaces disulfuro en la CAPRINA-1. A continuación, se añadió yodoacetamida 20 mM (concentración final) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), seguido de la reacción de alquilación de los grupos tiol a 37 °C durante 30 minutos en condiciones de sombra. Se añadieron 50 pg de cada uno de los anticuerpos monoclonales anti-CAPRINA-1 humana de ratón n.° 1 a n.° 10 a 40 pg de la CAPRINA-1 alquilada reducida obtenida. La cantidad total de cada mezcla se ajustó a 1 ml con una solución tampón de fosfato 20 mM (pH 7,0). La mezcla resultante se hizo reaccionar durante la noche a 4°C mientras se mezclaba agitando.

A continuación, se añadió tripsina (Promega K.K.) a una concentración final de 0,2 pg a cada mezcla de reacción y se hizo reaccionar a 37 ° C durante 1 hora, 2 horas, 4 horas y 12 horas. A continuación, la mezcla de reacción se mezcló con perlas de vidrio de proteína A (GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.) bloqueadas con PBS que contenían BSA al 1 % (Sigma-Aldrich Corp.) y se lavaron con PBS por adelantado, carbonato de calcio 1 mM y solución tampón NP-40 (solución tampón fosfato 20 mM (pH 7,4), EDt A 5 mM, NaCl 150 mM, 1 % de NP-40) y reaccionó durante 30 minutos.

Cada solución de reacción se lavó con una solución tampón de carbonato de amonio 25 mM (pH 8,0), seguido de la elución de los complejos antígeno-anticuerpo usando 100 pl de ácido fórmico al 0,1 %. El eluato se analizó mediante LC-MS utilizando Q-TOF Premier (Waters-MicroMass). Este análisis siguió el protocolo adjunto al instrumento.

Como resultado, el polipéptido mostrado en la SEQ ID NO: 61 se identificó como la secuencia parcial de CAPRINA-1 reconocida por todos los anticuerpos monoclonales n.° 1 a 10 anti-CAPRINA-1 humana de ratón. En el polipéptido mostrado en la SEQ ID NO:61, el péptido mostrado en la SEQ ID NO: 62 se identificó además como una secuencia amino parcial reconocida por los anticuerpos monoclonales N.° 1 a N.° 4, N.° 5 a N.° 7, y N.° 9. El péptido mostrado en la SEQ ID NO: 63 se descubrió además que era reconocido por el anticuerpo monoclonal N.° 10.

(3) Preparación de anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana de pollo

Se mezclaron 300 pg de CAPRIN-1 humana con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 como se prepara en el Ejemplo 3 del documento WO2010/016526 con una cantidad igual de adyuvante completo de Freund. Esta mezcla se usó como una solución de antígeno por pollo. La solución de antígeno se administró por vía intraperitoneal a cada pollo de 7 semanas de edad. A continuación, se realizaron 7 refuerzos cada 4 semanas para completar la inmunización. Cuatro días después de la última inyección, el bazo de cada pollo se escindió y se molió entre dos portaobjetos de vidrio esterilizados. Los procedimientos de lavado con PBS (-) (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) y la eliminación del sobrenadante por centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos se repitieron tres veces para obtener células de bazo. Los esplenocitos obtenidas se mezclaron con células de mieloma de pollo deficientes en cadena ligera establecidas a partir de pollos mediante transformación utilizando virus de la reticuloendoteliosis aviar, en una proporción de 5:1. se calentaron 200 pl de un medio IMDM que contenía FBS al 10 % a 37 °C y se mezclaron con 800 pl de PEG1500 (Boehringer Ingelheim GmbH), y la solución de PEG preparada de este modo se añadió a la mezcla de células, que luego se dejó reposar durante 5 minutos para la fusión celular. Después de la eliminación del sobrenadante mediante centrifugación a 1700 rpm durante 5 minutos, las células se suspendieron en 300 ml de un medio IMDM que contenía 10 % de FBS suplementado con 2 % de equivalente de una solución HAT (Gibco) (medio selectivo HAT). Esta suspensión se inoculó en treinta placas de 96 pocillos (Nunc) a 100 pl/pocillo. Las células de bazo y las células de mieloma de pollo se fusionaron mediante cultivo a 37 °C durante 7 días en condiciones de CO2 al 5 % para obtener hibridomas.

Los hibridomas preparados se seleccionaron con la afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas contra CAPRINA-1 como indicador. La solución de CAPRINA-1 de 1 pg/ml se añadió a una placa de 96 pocillos a 100 pl/pocillo y se dejó reposar a 4 °C durante 18 horas. Cada pocillo se lavó tres veces con p BS-T. Después, se añadió una solución de seroalbúmina bovina al 0,5 % (BSA) (Sigma-Aldrich Corp.) a 400 pl/pocillo y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. Se eliminó la solución en cada pocillo y se lavó cada pocillo tres veces con 400 pl de PBS-T. A continuación, se añadió el sobrenadante de cultivo de cada hibridoma obtenido anteriormente a los mismos a 100 pl/pocillo y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. Después, Se añadieron anticuerpos anti-IgY de pollo marcados con HRP (Sigma-Aldrich Corp.) diluidos 5000 veces con PBS a 100 pl/pocillo y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. Después, se añadió una solución de sustrato de TMB (fabricada por Thermo Fisher Scientific Inc.) a 100 pl/pocillo y se dejó reposar durante 15 a 30 minutos para provocar la reacción de color. Después del desarrollo del color, se terminó la reacción mediante la adición de ácido sulfúrico 1 N a 100 pl/pocillo. Se midió la absorbancia a 450 nm y 595 nm con un espectrómetro de absorción. Como resultado, se seleccionaron varios hibridomas productores de anticuerpos con alta absorbancia como líneas candidatas del hibridoma de interés.

Los hibridomas seleccionados se añadieron a una placa de 96 pocillos a una densidad de 0,5 células/pocillo y se cultivaron en la placa. Una semana después, se observaron los hibridomas que forman colonias únicas en los pocillos. Las células de estos pocillos se cultivaron adicionalmente y los hibridomas clonados se sometieron a detección selectiva para determinar la afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas frente a la proteína CAPRINA-1 como indicador. Como resultado, se obtuvo una pluralidad de líneas de hibridoma productoras de anticuerpos monoclonales reactivos con proteínas CAPRINA-1.

A continuación, se exploraron estos anticuerpos monoclonales respecto a los anticuerpos reactivos con la superficie de las células de cáncer de mama que expresan CAPRINA-1. Específicamente, se centrifugaron 5 x 105 células de una línea celular de cáncer de mama humana MDA-MB-231 V en un tubo para microcentrifugación de 1,5 ml. se añadieron 100 pl del sobrenadante de cultivo de cada hibridoma obtenido anteriormente y se dejó reposar durante 1 hora sobre hielo. Después de lavar con PBS, se añadieron lo anticuerpos IgG (H+L) de cabra anti-pollo marcados con FITC (Southern Biotech) diluidos 30 veces con PBS que contenía FBS al 0,1 % y se dejó reposar durante 1 hora sobre hielo. Después de lavar con PBS, se midió la intensidad de fluorescencia usando FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Por otro lado, se realizó la misma operación que la anterior utilizando un medio para cultivo de hibridomas para preparar una muestra de control. Como resultado, se seleccionó 1 anticuerpo monoclonal (anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana de pollo n.° 11)) que tienen una intensidad de fluorescencia más fuerte que la del control, es decir, reactivo con la superficie de células de cáncer de mama que expresan CAPRINA-1.

(4) Preparación de anticuerpo recombinante quimérico de ratón-pollo

El fragmento de amplificación génica de la regio'n variable de la cadena pesada (SEQ ID NO: 64) del anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana de pollo n.° 11 obtenido en el párrafo (3) anterior se trató en ambos extremos con enzimas de restricción, después se purificó e insertó de acuerdo con un método de rutina en un vector pcDNA4/myc-His (life Technologies, Inc.) que ya tiene insertos génicos de una secuencia líder derivada de anticuerpo de pollo y una región constante de la cadena IgGl H de ratón. Asimismo, el fragmento de amplificación génica de la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO: 65) del anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana de pollo n.° 11 obtenido se trató en ambos extremos con enzimas de restricción, luego se purificó e insertó de acuerdo con un método de rutina en un vector pcDNA3.1/myc-His (life Technologies, Inc.) que ya tiene insertos génicos de una secuencia líder derivada de anticuerpo de pollo y una región constante de la cadena IgGl L de ratón.

A continuación, el vector recombinante que tiene el inserto del gen de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 de pollo n°11 y el vector recombinante que tiene el inserto del gen de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana de pollo N.° 11 se introdujo en células CHO-K1 (obtenidas de Riken Cell Bank). Específicamente, se cultivaron 2 x 105 células CHO-K1 en 1 ml de un medio F12 de Ham (life Technologies, Inc.) que contenía un 10 % de FBS por pocillo de una placa de cultivo de 12 pocillos y se lavaron con PBS (-). A continuación, se añadió un medio F12 de Ham fresco que contenía 1 ml de FBS al 10 % por pocillo. se mezclaron 250 ng de cada uno de los vectores disueltos en 30 pl de OptiMEM (life Technologies, Inc.) con 30 pl de reactivo de transfección Polyfect (Qiagen N.V.), y esta mezcla se añadió a cada pocillo. Las células CHO-K1 cotransfectadas con los vectores recombinantes se cultivaron en un medio F12 de Ham que contenía FBS al 10 % suplementado con 200 pg/ml de ceocina (life Technologies, Inc.) y 200 pg/ml de geneticina (Roche Diagnostics KK) y luego se inocularon en una placa de 96 pocillos a una densidad de 0,5 células/pocillo para preparar una línea celular que produce de forma estable un anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana quimérico de ratón-pollo n.° 12 que tiene las regiones variables del anticuerpo monoclonal n.° 11 de pollo y las regiones constantes de IgG1 de ratón. La línea celular preparada se cultivó durante 5 días en un matraz de 150 cm2 a una densidad de 5 x 105 células/ml usando 30 ml de un medio OptiCHO libre de suero (life Technologies, Inc.) para obtener un sobrenadante de cultivo que contenía n.° 12 .

(5) Identificación del epítopo de CAPRINA-1 reconocido por el anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana quimérico de ratón-pollo n.° 12

El anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana quimérica de ratón-pollo reactivo a la superficie de células cancerosas n.° 12 obtenido en el párrafo (4) se usó para identificar una región de epítopo de CAPRINA-1 reconocida por el mismo. Se disolvieron 100 pg de proteínas CAPRINA-1 recombinantes en un tampón de disolución sin inhibidor de proteínas y se hizo reaccionar con el anticuerpo monoclonal n.° 12. A esta solución, se añadió una enzima digestiva tripsina o quimotripsina, seguido de una reacción de digestión a una temperatura adecuada. Después de la reacción, se añadió un portador de proteína G Sepharose, luego reaccionó, y precipitó por operación de centrifugación. Después de la retirada del sobrenadante, el vehículo se lavó con un tampón de disolución y PBS y se disolvió en ácido fórmico al 0,1 %, y se recuperó el sobrenadante. La muestra de sobrenadante recuperada se aplicó a una columna de fase inversa (cartucho de extracción HLB (Waters-OASIS)) para obtener una solución de muestra libre de anticuerpos. La muestra obtenida se sometió a cromatografía de líquidos de fase inversa (Chromatography Nanosystem (KYA Tech Corp.)) para recuperar una solución que solo contenía péptidos. La solución se introdujo en un espectrómetro de masas de tándem espectrómetro de masas cuadrupolo-TOF (Waters-MicroMass) y se analizó por MS/MS para detectar los péptidos contenidos en la muestra. Como resultado, se identificó un péptido que consistía en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 66 como una secuencia parcial de CAPRINA-1 reconocida por el anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana quimérico de ratón-pollo n.° 12. Asimismo, este péptido se refiere a una secuencia parcial de CAPRINA-1 reconocida por el anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana de pollo n.° 11 que constituye las regiones variables del anticuerpo n.° 12.

(6) Preparación de anticuerpo anti-CAPRINA-1 humana quimérico

El fragmento de amplificación génica de la regio'n variable de la cadena pesada (SEQ ID NO: 64) del anticuerpo monoclonal anti-CApRINA-1 humana de pollo n.° 11 obtenido en el párrafo (3) anterior se trató en ambos extremos con enzimas de restricción, después se purificó e insertó de acuerdo con un método de rutina en un vector pcDNA4/myc-His (life Technologies, Inc.) que ya tiene insertos génicos de una secuencia líder derivada de anticuerpo de pollo que comprende la SEQ ID NO:67 y una región constante de la cadena H de la IgGI humana que comprende la SEQ iD NO: 68. Asimismo, el fragmento de amplificación génica de la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO: 65) del anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana de pollo n.° 11 se trató en ambos extremos con enzimas de restricción, después se purificó e insertó de acuerdo con un método de rutina en un vector pcDNA3.1/myc-His (life Technologies, Inc.) que ya tiene insertos génicos de una secuencia líder derivada de anticuerpo de pollo que comprende la SEQ ID NO:68 y una región constante de la cadena L de la IgGI humana que comprende la SEQ ID NO: 69.

A continuación, el vector recombinante que tiene el inserto del gen de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo N.° 11 anterior y el vector recombinante que tiene el inserto del gen de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo N.° 11 anterior se introdujeron en las células CHO-K1 (obtenidas del Banco de células de Riken). Específicamente, se cultivaron 2 x 105 células CHO-K1 en 1 ml de un medio F12 de Ham (life Technologies, Inc.) que contenía un 10 % de FBS por pocillo de una placa de cultivo de 12 pocillos y se lavaron con PBS (-). A continuación, se añadió un medio F12 de Ham fresco que contenía 1 ml de FBS al 10 % por pocillo. se mezclaron 250 ng de cada uno de los vectores disueltos en 30 pl de OptiMEM (life Technologies, Inc.) con 30 pl de reactivo de transfección Polyfect (Qiagen N.V.), y esta mezcla se añadió a cada pocillo. Las células CHO-K1 cotransfectadas con los vectores recombinantes se cultivaron en un medio F12 de Ham que contenía FBS al 10 % suplementado con 200 pg/ml de ceocina (life Technologies, Inc.) y 200 pg/ml de geneticina (Roche Diagnostics KK) y luego se inocularon en una placa de 96 pocillos a una densidad de 0,5 células/pocillo para preparar una línea celular que produce de manera estable un anticuerpo anti-CAPRINA-1 humana quimérico de humano-pollo n.° 13 que tiene las regiones variables del anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana de pollo n.° 11 y las regiones constantes de la IgG1 humana. La línea celular preparada se cultivó durante 5 días en un matraz de 150 cm2 a una densidad de 5 x 105 células/ml usando 30 ml de un medio OptiCHO libre de suero (life Technologies, Inc.) para obtener un sobrenadante de cultivo que contenía el anticuerpo n.° 13 anterior.

(7) Preparación de anticuerpo monoclonal anti- CAPRINA-1 humana de ratón n.° 14

Del mismo modo que en el párrafo (1) se mezcló una proteína de fusión de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:63 identificada en el párrafo (2) y una proteína vehículo KLH (hemocianina de lapa californiana) como un inmunógeno con una cantidad igual de un adyuvante TiterMax Gold(R) (CytRx Corp.) y esta mezcla se administró por vía subcutánea a una dosis de 20 pg/inyección a cada ratón a intervalos de 7 días. Después de la administración con cuatro inyecciones en total, se obtuvieron esplenocitos del ratón 3 días después de la inmunización final y se fusionaron con células de mieloma de ratón de la misma manera que en el párrafo (1) para producir hibridomas. A continuación, los anticuerpos se seleccionaron utilizando, como indicador, la reactividad de cada anticuerpo contenido en los sobrenadantes de cultivo de los hibridomas preparados con una solución de 1 pg/ml de CAPRINA-1 preparada en el ejemplo 3 del documento WO2010/016526 o una proteína de fusión de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 63 usada como inmunógeno y una proteína portadora de KLH. La solución CAPRINA-1 de 1 pg/ml preparada en el Ejemplo 3 del documento WO2010/016526 y la proteína de fusión (30 pg/ml) de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:63 y una proteína transportadora de BSA se añadieron por separado a placas de 96 pocillos a 100 pg/pocillo y se dejaron reposar a 4 °C durante 18 horas. Cada pocillo se lavó con PBS-T. Después, se añadió una solución Block Ace (DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) a 400 pl/pocillo y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. Se eliminó la solución en cada pocillo y se lavó cada pocillo con PBS-T. A continuación, se añadió el sobrenadante de cultivo de cada hibridoma obtenido anteriormente a los mismos a 100 pl/pocillo y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Cada pocillo se lavó con PBS-T. Después, Se añadieron anticuerpos IgG (H L) anti-ratón marcados con HRP (life Technologies, Inc.) diluidos 5000 veces con PBS a 100 pl/pocillo y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lavó con PBS-T. Después, se añadió una solución de sustrato de TMB (Thermo Fisher Scientific Inc.) a 100 pl/pocillo y se dejó reposar durante 5 a 30 minutos para provocar la reacción de color. Después del desarrollo del color, se terminó la reacción mediante la adición de ácido sulfúrico 1 N a 100 pl/pocillo. Se midió la absorbancia a 450 nm y 595 nm con un espectrómetro de absorción. Como resultado, se seleccionaron los hibridomas que producían anticuerpos que tenían una alta absorbancia.

Los hibridomas seleccionados se añadieron a una placa de 96 pocillos a una densidad de 0,3 células/pocillo y se cultivaron en la placa. Una semana después, se observaron los hibridomas que forman colonias únicas en los pocillos.

Las células en estos pocilios se cultivaron adicionalmente y los hibridomas clonados se seleccionaron de la misma manera que antes con la afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas contra la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 63 como una secuencia parcial de CAPRINA-1 como indicador para obtener hibridomas que producen anticuerpos contra el aminoácido de la SEQ ID NO: 63.

Los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas obtenidos se exploraron para detectar los anticuerpos reactivos con la superficie de las células de cáncer de mama que expresan CAPRINA-1. Específicamente, se centrifugaron 106 células de una línea celular de cáncer de mama humana MDA-MB-231 V en un tubo para microcentrifugación de 1,5 ml. se añadieron 100 pl del sobrenadante de cultivo de cada hibridoma obtenido anteriormente y se dejó reposar durante 1 hora sobre hielo. Después de lavar con PBS, se añadieron anticuerpos IgG anti-ratón de cabra marcados con FITC (Life Technologies, Inc.) diluidos 500 veces con PBS que contenían 0,1 % de FBS y se dejaron en reposo durante 1 hora en hielo. Después de lavar con PBS, se midió la intensidad de fluorescencia usando FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Por otro lado, la misma operación que la anterior se realizó utilizando, en lugar de los anticuerpos, una muestra compuesta por el suero de cada ratón Balb/c de 6 semanas de edad sin tratar, diluido 500 veces con un medio para el cultivo de hibridomas y una muestra de control negativo compuesta de células que reaccionaron solo con anticuerpos secundarios. Como resultado, se obtuvo un anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana de ratón n.° 14 que tenían una intensidad de fluorescencia mayor que la del control, es decir, reactivo con la superficie de las células de cáncer de mama. El anticuerpo n.° 14 comprende la región variable de cadena pesada mostrada en la SEQ ID NO: 70 y la región variable de cadena ligera mostrada en la SEQ ID NO: 71.

El anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana de ratón n.° 14 obtenido se examinó para determinar su reacción específica con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO:63 como una secuencia parcial de CAPRINA-1 usada como inmunógeno. Una solución de 30 pg/ml que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 63 preparada con una solución acuosa de carbonato de sodio 0,1 M y una similar de 30 pg/ml que consiste en una secuencia parcial de CAPRINA-1 libre de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 63 se añadieron por separado a las placas de 96 pocillos Inmovilizador Amino para ELISA (Thermo Fisher Scientific Inc./Nunc) a 100 pg/ml y se hicieron reaccionar toda la noche y todo el día a 4 °C para unir los péptidos a los pocillos. Se añadió una solución acuosa de carbonato de sodio 0,1 M que contenía etanolamina 10 mM a los pocillos unidos a péptido y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Se eliminó la solución en cada pocillo y después se lavó cada pocillo con PBS-T. A continuación, Se añadió una solución Block Ace a 400 pl/pocillo y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. Se eliminó la solución en cada pocillo y se lavó cada pocillo con PBS-T. A continuación, se añadió el sobrenadante de cultivo que contenía el anticuerpo monoclonal n.° 14 de ratón a los mismos a 50 pl/pocillo y se hizo reaccionar temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, cada pocillo se lavó con PBS-T y se añadieron anticuerpos IgG (H L) marcados con HRP (life Technologies, Inc.) diluidos 5000 veces con una solución Block Ace a 50 pl/pocillo y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lavó completamente con PBS-T. Después, se añadió una solución de sustrato de TMB (Thermo Fisher Scientific Inc.) a 100 pl/pocillo y se dejó reposar durante 5 a 30 minutos para provocar la reacción de color. Después del desarrollo del color, se terminó la reacción mediante la adición de ácido sulfúrico 1 N a 100 pl/pocillo. Se midió la absorbancia a 450 nm y 595 nm con un espectrómetro de absorción. Como resultado, el anticuerpo monoclonal de ratón N.° 14 no reaccionó con la secuencia parcial de CAPRINA-1 libre de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:63, pero reaccionó específicamente solo con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO:63. Por lo tanto, se confirmó que el polipéptido mostrado en la SEQ ID NO: 63 contenía una región epítopo reconocida por el anticuerpo anti-CAPRINA-1 n.° 14.

<Ejemplo 3: Selección del anticuerpo óptimo para la detección de CAPRINA-1>

(1) Selección de anticuerpo usando tejido de cáncer de mama humano

31 muestras de tejido de cáncer de mama de matrices de tejido de cáncer de mama humano incrustadas en parafina (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd.) se utilizaron en tinción inmunohistoquímica. Cada conjunto de tejido de cáncer de mama humano se trató a 60 °C durante 3 horas y luego se colocó en un frasco de tinción lleno con dicho xileno y se realizaron tres veces los procedimientos de reemplazo de xileno por uno nuevo cada 5 minutos. Posteriormente, la misma operación que en el xileno se realizó utilizando etanol y p BS-T. La matriz de tejido de cáncer de mama humano se colocó en un frasco de tinción lleno con una solución amortiguadora de citrato 10 mM (pH 6,0) que contenía Tween 20 al 0,05 %, se trató a 125 °C durante 5 minutos y luego se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 40 minutos o más. El exceso de agua alrededor de las secciones se limpió con Kimwipe. La sección de cada portaobjetos de vidrio se rodeó con una pluma Dako (Dako, una compañía de Agilent Technologies), y se añadió gota a gota una cantidad apropiada de Bloque de Peroxidasa (Dako, una Compañía de Agilent Technologies). El portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos y luego se colocó en una botella de tinción llena con PBS-T, y se realizaron tres veces los procedimientos de reemplazo de PBS-T con uno nuevo cada 5 minutos. Se aplicó una solución de PBS-T que contenía FBS al 10 % como solución de bloqueo, y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora en una cámara húmeda. A continuación, se aplicaron 10 pg/ml del anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana de ratón n.° 8 o n.° 14 preparado en el Ejemplo 2 en una solución de PBS - T que contenía 5 % de FBS. El portaobjetos de vidrio se dejó reposar durante una noche a 4 °C en una cámara húmeda. Después de lavar tres veces con PBS-T durante 10 minutos, se añadió gota a gota una cantidad apropiada de Conjugado de Polímero marcado con Peroxidasa (Dako, una compañía de Agilent Technologies), y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos en una cámara húmeda. Después de lavar tres veces con PBS-T durante 10 minutos, se aplicó una solución de tinción DAB (Dako, una compañía de Agilent Technologies) y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos. A continuación, la solución de tinción se descartó y el portaobjetos de vidrio se lavó con PBS-T durante 10 minutos tres veces. Después de enjuagar con agua destilada, el portaobjetos de vidrio se colocó en soluciones de etanol al 70 %, 80 %, 90 %, 95 % y 100 % en este orden durante 1 minuto por solución y, después, se dejó reposar durante la noche en xileno. El portaobjetos de vidrio se retiró y la sección se incrustó en medio de montaje Glycergel (Dako, una compañía de Agilent Technologies), seguido de observación. El nivel de expresión de CAPRINA-1 en los tejidos se evaluó de acuerdo con los criterios que se indican a continuación. Se seleccionó un portaobjetos que mostraba resultados positivos y se observó su imagen de tinción de CAPRINA-1. En primer lugar, la imagen de la tinción de CAPRINA-1 de células cancerosas en los tejidos, la intensidad de la tinción positiva y la proporción de células positivas se observaron mediante el uso de una lente de objetivo x 4 de un microscopio óptico. A continuación, la lente del objetivo se cambió a una lente x 10 o x 20, y se realizó un examen para determinar si los resultados positivos se localizaban en la membrana celular o en el citoplasma. Los resultados de detección se evaluaron mediante estos métodos y se clasificaron en puntuaciones de 0 a 3.

Los detalles de las puntuaciones son los siguientes:

Puntuación 0 (sin sobreexpresión de CAPRINA-1): La tinción positiva de la membrana celular no se observa o se observa en menos del 10 % de las células cancerosas.

Puntuación 1 (sin sobreexpresión de CAPRINA-1): se observa una tinción débil casi imperceptible de la membrana celular en el 10 % o más de las células cancerosas, y estas células cancerosas se tiñen parcialmente solo en sus membranas celulares.

Puntuación 2 (con sobreexpresión de CAPRINA-1): Se observa una tinción positiva completa de débil a moderada de la membrana celular en el 10 % o más de las células cancerosas, o se observa una tinción positiva fuerte completa de la membrana celular en el 10 % o más y en un 30 % o menos de las células cancerosas.

Puntuación 3 (con sobreexpresión de CAPRINA-1): Se observa una fuerte tinción positiva completa de la membrana celular en el 30 % o más de las células cancerosas.

Un tejido se determina como tejido canceroso positivo para CAPRINA-1, cuando los resultados de su ensayo tienen una puntuación de 2 y 3.

Como resultado, la expresión de CAPRINA-1 en los tejidos de cáncer de mama se observó con éxito utilizando ambos anticuerpos. Los resultados de la tinción inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo n.° 8 mostraron una puntuación de 2 para 14 muestras y una puntuación de 3 para 1 muestra, y el número de muestras positivas para CAPRINA-1 fue de 15 muestras. Por el contrario, el resultado de la tinción inmunohistoquímica con el anticuerpo n.° 14 mostró una puntuación de 2 para 12 muestras y una puntuación de 3 para 8 muestras, y el número de muestras positivas para CAPRINA-1 fue de 20 muestras. Por lo tanto, el anticuerpo n.° 14 más altamente sensible fue seleccionado para la detección de CAPRINA-1 usando tejidos de cáncer humano.

(2) Detección de CAPRINA-1 en varios tejidos normales humanos mediante el método de tinción inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo n.° 14

Se usó un grupo de tejidos humanos normales (US Biomax, Inc.) (incluidos tejidos de cerebro, glándula tiroides, pulmón, bazo, riñón, esófago, estómago, intestino grueso, páncreas, músculo, piel, glándulas salivales, ovario, útero, glándula mamaria, placenta, médula ósea, testículos y próstata) en la tinción inmunohistoquímica. El exceso de agua alrededor de una sección se limpió con Kimwipe. La sección del portaobjetos de vidrio se rodeó con una pluma Dako (Dako, una compañía de Agilent Technologies), y se añadió gota a gota una cantidad apropiada de Bloque de Peroxidasa (Dako, una Compañía de Agilent Technologies). El portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos y luego se colocó en una botella de tinción llena con PBS-T, y se realizaron tres veces los procedimientos de reemplazo de PBS-T con uno nuevo cada 5 minutos. Se aplicó una solución de PBS-T que contenía FBS al 10 % como solución de bloqueo, y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora en una cámara húmeda. A continuación, 10 pg/ml del anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana de ratón n.° 14 preparados en el Ejemplo 2 en una solución de PBS - T que contenía 5 % de FBS y se aplicó esta solución. El portaobjetos de vidrio se dejó reposar durante una noche a 4 °C en una cámara húmeda. Después de lavar tres veces con PBS-T durante 10 minutos, se añadió gota a gota una cantidad apropiada de Conjugado de Polímero marcado con Peroxidasa (Dako, una compañía de Agilent Technologies), y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos en una cámara húmeda. Después de lavar tres veces con p BS-T durante 10 minutos, se aplicó una solución de tinción DAB (Dako, una compañía de Agilent Technologies) y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos. A continuación, la solución de tinción se descartó y el portaobjetos de vidrio se lavó con PBS-T durante 10 minutos tres veces. Después de enjuagar con agua destilada, el portaobjetos de vidrio se colocó en soluciones de etanol al 70 %, 80 %, 90 %, 95 % y 100 % en este orden durante 1 minuto por solución y, después, se dejó reposar durante la noche en xileno. El portaobjetos de vidrio se sacó y se introdujo en medio de montaje Glycergel (Dako, una compañía de Agilent Technologies), seguido de observación.

El nivel de expresión de CAPRINA-1 en los tejidos se evaluó de acuerdo con los criterios que se indican a continuación. Se seleccionó un portaobjetos que mostraba resultados positivos y se confirmó su imagen de tinción CAPRINA-1. En primer lugar, la imagen de la tinción de CAPRINA-1 de células cancerosas en los tejidos, la intensidad de la tinción positiva y la proporción de células positivas se observaron mediante el uso de una lente de objetivo x 4 de un microscopio óptico. A continuación, la lente del objetivo se cambió a una lente x 10 o x 20, y se realizó un examen para determinar si los resultados positivos derivaban de la membrana celular o estaban localizados en el citoplasma. Los resultados de detección se evaluaron mediante estos métodos y se clasificaron en puntuaciones de 0 a 3. Los detalles de las puntuaciones son los siguientes:

Puntuación 0 (sin sobreexpresión de CAPRINA-1): La tinción positiva de la membrana celular no se observa o se observa en menos del 10 % de las células cancerosas.

Puntuación 1 (sin sobreexpresión de CAPRINA-1): se observa una tinción débil casi imperceptible de la membrana celular en el 10 % o más de las células cancerosas, y estas células cancerosas se tiñen parcialmente solo en sus membranas celulares.

Puntuación 2 (con sobreexpresión de CAPRINA-1): Se observa una tinción positiva completa de débil a moderada de la membrana celular en el 10 % o más de las células cancerosas, o se observa una tinción positiva fuerte completa de la membrana celular en el 10 % o más y en un 30 % o menos de las células cancerosas.

Puntuación 3 (con sobreexpresión de CAPRINA-1): Se observa una fuerte tinción positiva completa de la membrana celular en el 30 % o más de las células cancerosas.

Un tejido se determinó como tejido canceroso positivo para CAPRINA-1, cuando los resultados de su detección obtuvieron una puntuación de 2 o 3.

El útero y los tejidos de la próstata recibieron puntuación 1, mientras que los otros tejidos recibieron una puntuación de 0. Por lo tanto, la expresión de CAPRINA-1 no se observó en los tejidos normales humanos.

(3) Detección de CAPRINA-1 en varios tejidos cancerosos humanos mediante el método de tinción inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo anti-CAPRINA-1 humana n.° 14

Se usaron diversos tejidos de cáncer de matrices de tejido de cáncer humano incluidas en parafina (US Biomax, Inc.) en la tinción inmunohistoquímica. Cada conjunto de tejido de cáncer humano se trató a 60 °C durante 3 horas y luego se colocó en un frasco de tinción lleno de xileno y los procedimientos de reemplazo de dicho xileno por uno nuevo cada 5 minutos se realizaron tres veces. Posteriormente, la misma operación que en el xileno se realizó utilizando etanol y PBS-T. La matriz de tejido de cáncer humano se colocó en un frasco de tinción lleno con una solución amortiguadora de citrato 10 mM (pH 6,0) que contenía Tween 20 al 0,05 %, se trató a 125 °C durante 5 minutos y luego se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 40 minutos o más. El exceso de agua alrededor de las secciones se limpió con Kimwipe. La sección de cada portaobjetos de vidrio se rodeó con una pluma Dako (Dako, una compañía de Agilent Technologies), y se añadió gota a gota una cantidad apropiada de Bloque de Peroxidasa (Dako, una Compañía de Agilent Technologies). El portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos y luego se colocó en una botella de tinción llena con PBS-T, y se realizaron tres veces los procedimientos de reemplazo de PBS-T con uno nuevo cada 5 minutos. Se aplicó una solución de PBS-T que contenía FBS al 10 % como solución de bloqueo, y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora en una cámara húmeda. A continuación, 10 pg/ml del anticuerpo monoclonal n.° 14 preparados en el Ejemplo 2 en una solución de PBS - T que contenía 5 % de FBS y se aplicó esta solución. El portaobjetos de vidrio se dejó reposar durante una noche a 4 °C en una cámara húmeda. Después de lavar tres veces con PBS-T durante 10 minutos, se añadió gota a gota una cantidad apropiada de Conjugado de Polímero marcado con Peroxidasa (Dako, una compañía de Agilent Technologies), y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos en una cámara húmeda. Después de lavar tres veces con PBS-T durante 10 minutos, se aplicó una solución de tinción DAB (Dako, una compañía de Agilent Technologies) y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos. A continuación, la solución de tinción se descartó y el portaobjetos de vidrio se lavó con PBS-T durante 10 minutos tres veces. El portaobjetos de vidrio se enjuagó con agua destilada y se colocó en un 70 %, 80 %, 90 %, 95 % y 100 % en este orden durante 1 minuto por solución y, después, se dejó reposar durante la noche en xileno. El portaobjetos de vidrio se sacó y se introdujo en medio de montaje Glycergel (Dako, una compañía de Agilent Technologies), seguido de observación.

El nivel de expresión de CAPRINA-1 en los tejidos se evaluó de acuerdo con los criterios que se indican a continuación. Se seleccionó un portaobjetos que mostraba resultados positivos y se confirmó su imagen de tinción CAPRINA-1. En primer lugar, la imagen de la tinción de CAPRINA-1 de células cancerosas en los tejidos, la intensidad de la tinción positiva y la proporción de células positivas se observaron mediante el uso de una lente de objetivo x 4 de un microscopio óptico. A continuación, la lente del objetivo se cambió a una lente x 10 o x 20, y se realizó un examen para determinar si los resultados positivos derivaban de la membrana celular o estaban localizados en el citoplasma. Los resultados de detección se evaluaron mediante estos métodos y se clasificaron en puntuaciones de 0 a 3. Los detalles de las puntuaciones son los siguientes:

Puntuación 0 (sin sobreexpresión de CAPRINA-1): La tinción positiva de la membrana celular no se observa o se observa en menos del 10 % de las células cancerosas.

Puntuación 1 (sin sobreexpresión de CAPRINA-1): se observa una tinción débil casi imperceptible de la membrana celular en el 10 % o más de las células cancerosas, y estas células cancerosas se tiñen parcialmente solo en sus membranas celulares.

Puntuación 2 (con sobreexpresión de CAPRINA-1): Se observa una tinción positiva completa de débil a moderada de la membrana celular en el 10 % o más de las células cancerosas, o se observa una tinción positiva fuerte completa de la membrana celular en el 10 % o más y en un 30 % o menos de las células cancerosas.

Puntuación 3 (con sobreexpresión de CAPRINA-1): Se observa una fuerte tinción positiva completa de la membrana celular en el 30 % o más de las células cancerosas.

Un tejido se determina como tejido canceroso positivo para CAPRINA-1, cuando los resultados de su ensayo tienen una puntuación de 2 o 3.

Como resultado, se confirmó que CAPRINA-1 era positiva en cada una de 16 de las 22 muestras de tejido de tumor cerebral (64 %), 19 de 32 muestras de tejido de cáncer de pulmón (59 %), 18 de 21 muestras de tejido de cáncer de útero (86 %), 10 de 16 muestras de tejido de cáncer de esófago (63 %), 27 de 30 muestras de tejido de cáncer de riñón (90 %), 14 de 17 muestras de tejido de cáncer de hígado (82 %), 11 de 15 muestras de tejido canceroso de la glándula tiroides (73 %), 10 de 14 muestras de tejido de cáncer de estómago (71 %), 17 de 19 muestras de tejido de cáncer de páncreas (89 %), 13 de 13 muestras de tejido de cáncer de próstata (100 %), 12 de 14 muestras de tejido de cáncer de vejiga (86 %), 11 de 14 muestras de tejido de cáncer de intestino grueso (79 %), 24 de 30 muestras de tejido de cáncer de piel (80 %) y 16 de 21 muestras de tejido de cáncer de mama (76 %).

(4) Detección de la proteína CAPRINA-1 en tejido de cáncer de mama de perro mediante el método de tinción inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo anti-CAPRINA-1 humana n.° 14 (Ejemplo anterior)

Se usaron 100 muestras de tejido de cáncer de mama congelado de perros diagnosticados patológicamente como cáncer de mama maligno en la tinción inmunohistoquímica. Cada tejido de cáncer de mama de perro congelado se cortó en 10 a 20 pm usando Cryostat (Leica Biosystems), se colocó en un portaobjetos de vidrio, y se secó al aire, junto con el portaobjetos de vidrio, durante 30 minutos con un secador de pelo, para preparar un portaobjetos de vidrio con una lámina de tejido colocada sobre el mismo. A continuación, el portaobjetos de vidrio se colocó en una botella de tinción llena con PBS-T (solución salina que contenía 0,05 % de Tween 20) y los procedimientos de sustitución de PBS-T por uno recién preparado cada 5 minutos se llevaron a cabo tres veces. El exceso de agua alrededor de las secciones se limpió con Kimwipe. La sección del portaobjetos de vidrio estaba rodeada por una pluma Dako (Dako, una compañía de Agilent Technologies). A continuación, se aplicó una solución de PBS-T que contenía suero bovino fetal al 10 % como solución de bloqueo, y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora en una cámara húmeda. A continuación, 10 pg/ml del anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana de ratón n.° 8 o n.° 14 preparado en el Ejemplo 2 en una solución de bloque y se aplicó esta solución. El portaobjetos de vidrio se dejó reposar durante una noche a 4 °C en una cámara húmeda. Después de lavar tres veces con PBS-T durante 10 minutos, se aplicaron anticuerpos anti-IgG marcados con biotina MOM (Vectastain) diluidos 250 veces con una solución de bloqueo y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora en una cámara de humedad. Después de lavar tres veces con PBS-T durante 10 minutos, se aplicó el reactivo avidina-biotina ABC (Vectastain) y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos en una cámara de humedad. Después de lavar tres veces con PBS-T durante 10 minutos, se aplicó una solución de tinción de DAB (10 mg de DAB 10 pl de 30 % de H2O2/50 ml de tris-HCl 0,05 M (pH 7,6)) y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos en una cámara de humedad. El portaobjetos de vidrio se enjuagó con agua destilada. Se aplicó un reactivo de hematoxilina (Dako, una compañía de Agilent Technologies) y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 minuto y luego se enjuagó con agua destilada. El portaobjetos de vidrio se colocó en soluciones de etanol al 70 %, 80 %, 90 %, 95 % y 100 % en este orden durante 1 minuto por solución y, después, se dejó reposar durante la noche en xileno. El portaobjetos de vidrio se sacó y se introdujo en medio de montaje Glycergel (Dako, una compañía de Agilent Technologies), seguido de observación. El nivel de expresión de CAPRINA-1 en los tejidos se evaluó de acuerdo con los criterios que se indican a continuación. Se seleccionó un portaobjetos que mostraba resultados positivos y se confirmó su imagen de tinción CAPRINA-1. En primer lugar, la imagen de la tinción de CAPRINA-1 de células cancerosas en los tejidos, la intensidad de la tinción positiva y la proporción de células positivas se observaron mediante el uso de una lente de objetivo x 4 de un microscopio óptico. A continuación, la lente del objetivo se cambió a una lente x 10 o x 20, y se realizó un examen para determinar si los resultados positivos derivaban de la membrana celular o estaban localizados en el citoplasma. Los resultados de detección se evaluaron mediante estos métodos y se clasificaron en puntuaciones de 0 a 3. Los detalles de las puntuaciones son los siguientes:

Puntuación 0 (sin sobreexpresión de CAPRINA-1): La tinción positiva de la membrana celular no se observa o se observa en menos del 10 % de las células cancerosas.

Puntuación 1 (sin sobreexpresión de CAPRINA-1): se observa una tinción débil casi imperceptible de la membrana celular en el 10 % o más de las células cancerosas, y estas células cancerosas se tiñen parcialmente solo en sus membranas celulares.

Puntuación 2 (con sobreexpresión de CAPRINA-1): Se observa una tinción positiva completa de débil a moderada de la membrana celular en el 10 % o más de las células cancerosas, o se observa una tinción positiva fuerte completa de la membrana celular en el 10 % o más y en un 30 % o menos de las células cancerosas.

Puntuación 3 (con sobreexpresión de CAPRINA-1): Se observa una fuerte tinción positiva completa de la membrana celular en el 30 % o más de las células cancerosas.

Se confirmó que un tejido de perro portador de cáncer era positivo para CAPRINA-1 y que obtenía efectos terapéuticos eficaces mediante la administración de un fármaco terapéutico dirigido a CAPRINA-1, cuando sus resultados del ensayo fueron una puntuación de 2 o 3.

Como resultado, la expresión de CAPRINA-1 en los tejidos de cáncer de mama de perro se observó con éxito utilizando ambos anticuerpos. Específicamente, los resultados de la tinción inmunohistoquímica con el anticuerpo n.° 8 mostró una puntuación de 2 para 69 muestras y una puntuación de 3 para 11 muestras, y el número de muestras positivas para CAPRINA-1 fue de 80 muestras ( 80 %). Por el contrario, el resultado de la tinción inmunohistoquímica con el anticuerpo n.° 14 mostró una puntuación de 2 para 50 muestras y una puntuación de 3 para 32 muestras, y el número de muestras positivas para CAPRINA-1 fue de 82 muestras ( 82 %).

(5) Detección de CAPRINA-1 en tejido de cáncer de mama de gato mediante el método de tinción inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana de ratón n.° 14 (Ejemplo anterior)

Se usaron 30 muestras de tejido de cáncer de mama congelado de gatos diagnosticados patológicamente como cáncer de mama maligno en la tinción inmunohistoquímica. Cada tejido de cáncer de gato congelado se cortó en láminas de 10 a 20 |jm usando Cryostat (Leica Biosystems), se colocó en un portaobjetos de vidrio, y se secó al aire, junto con el portaobjetos de vidrio, durante 30 minutos con un secador de pelo, para preparar un portaobjetos de vidrio con una lámina de tejido colocada sobre el mismo. A continuación, el portaobjetos de vidrio se colocó en una botella de tinción llena con PBS-T (solución salina que contenía 0,05 % de Tween 20) y los procedimientos de sustitución de PBS-T por uno recién preparado cada 5 minutos se llevaron a cabo tres veces. El exceso de agua alrededor de las secciones se limpió con Kimwipe. La sección del portaobjetos de vidrio estaba rodeada por una pluma Dako (Dako, una compañía de Agilent Technologies). A continuación, se aplicó una solución de PBS-T que contenía suero bovino fetal al 10 % como solución de bloqueo, y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora en una cámara húmeda. A continuación, 10 jg/m l del anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana de ratón n.° 8 o n.° 14 preparado en el Ejemplo 2 en una solución de bloque y se aplicó esta solución. El portaobjetos de vidrio se dejó reposar durante una noche a 4 °C en una cámara húmeda. Después de lavar tres veces con PBS-T durante 10 minutos, se aplicaron anticuerpos anti-IgG marcados con biotina MOM (Vectastain) diluidos 250 veces con una solución de bloqueo y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora en una cámara de humedad. Después de lavar tres veces con PBS-T durante 10 minutos, se aplicó el reactivo avidina-biotina ABC (Vectastain) y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos en una cámara de humedad. Después de lavar tres veces con PBS-T durante 10 minutos, se aplicó una solución de tinción de DAB (10 mg de DAB 10 |jl de 30 % de H2O2/50 ml de tris-HCl 0,05 M (pH 7,6)) y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos en una cámara de humedad. El portaobjetos de vidrio se enjuagó con agua destilada. Se aplicó un reactivo de hematoxilina (Dako, una compañía de Agilent Technologies) y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 minuto y luego se enjuagó con agua destilada. El portaobjetos de vidrio se colocó en soluciones de etanol al 70 %, 80 %, 90 %, 95 % y 100 % en este orden durante 1 minuto por solución y, después, se dejó reposar durante la noche en xileno. El portaobjetos de vidrio se sacó y se introdujo en medio de montaje Glycergel (Dako, una compañía de Agilent Technologies), seguido de observación. El nivel de expresión de CAPRINA-1 en los tejidos se evaluó de acuerdo con los criterios que se indican a continuación. Se seleccionó un portaobjetos que mostraba resultados positivos y se confirmó su imagen de tinción CAPRINA-1. En primer lugar, la imagen de la tinción de CAPRINA-1 de células cancerosas en los tejidos, la intensidad de la tinción positiva y la proporción de células positivas se observaron mediante el uso de una lente de objetivo x 4 de un microscopio óptico. A continuación, la lente del objetivo se cambió a una lente x 10 o x 20, y se realizó un examen para determinar si los resultados positivos derivaban de la membrana celular o estaban localizados en el citoplasma. Los resultados de detección se evaluaron mediante estos métodos y se clasificaron en puntuaciones de 0 a 3. Los detalles de las puntuaciones son los siguientes:

Puntuación 0 (sin sobreexpresión de CAPRINA-1): La tinción positiva de la membrana celular no se observa o se observa en menos del 10 % de las células cancerosas.

Puntuación 1 (sin sobreexpresión de CAPRINA-1): se observa una tinción débil casi imperceptible de la membrana celular en el 10 % o más de las células cancerosas, y estas células cancerosas se tiñen parcialmente solo en sus membranas celulares.

Puntuación 2 (con sobreexpresión de CAPRINA-1): Se observa una tinción positiva completa de débil a moderada de la membrana celular en el 10 % o más de las células cancerosas, o se observa una tinción positiva fuerte completa de la membrana celular en el 10 % o más y en un 30 % o menos de las células cancerosas.

Puntuación 3 (con sobreexpresión de CAPRINA-1): Se observa una fuerte tinción positiva completa de la membrana celular en el 30 % o más de las células cancerosas.

Se confirmó que un tejido de gato portador de cáncer era positivo para CAPRINA-1 y que obtenía efectos terapéuticos eficaces mediante la administración de un fármaco terapéutico dirigido a CAPRINA-1, cuando sus resultados del ensayo fueron una puntuación de 2 o 3.

Como resultado, la expresión de CAPRINA-1 en los tejidos de cáncer de mama de gato se observó con éxito utilizando ambos anticuerpos. Específicamente, los resultados de la tinción inmunohistoquímica con el anticuerpo n.° 8 mostró una puntuación de 2 para 20 muestras y una puntuación de 3 para 4 muestras, y el número de muestras positivas para CAPRINA-1 fue de 24 muestras ( 80 %). Por el contrario, el resultado de la tinción inmunohistoquímica con el anticuerpo n.° 14 mostró una puntuación de 2 para 18 muestras y una puntuación de 3 para 6 muestras, y el número de muestras positivas para CAPRINA-1 fue de 27 muestras ( 90 %).

<Ejemplo 4: Correlación de la expresión de CAPRINA-1 evaluada utilizando una muestra de cáncer con efecto antitumoral del anticuerpo anti-CAPRINA-1> (Ejemplo anterior)

(1) Detección de CAPRINA-1 mediante el método de tinción inmunohistoquímica utilizando tejido de cáncer derivado de ratón portador de cáncer en el que se transplantó una célula cancerosa de ratón

Dos líneas celulares de cáncer derivadas de ratón (B16F10 y EMT-6) se trasplantaron por vía subcutánea (cada una para 5 ratones) en las regiones dorsales de 26 ratones Balb/c (Japan SLC, Inc.) y se cultivaron hasta que el tamaño del tumor alcanzó aproximadamente 7 mm de diámetro. Se seleccionaron tres sujetos de cada uno de estos dos grupos de ratones que tenían respectivamente los 2 tipos de trasplantes de células cancerosas. Se extrajo una masa tumoral de cada ratón, se abrieron en PBS y se fijaron por perfusión durante la noche en una solución tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,4) que contiene un 4 % de paraformaldehído (PFA). Se desechó el perfundido y la superficie tisular de cada órgano se aclaró con PBS. Se añadió una solución de PBS que contenía un 10 % de sacarosa a un tubo de centrífuga de 50 ml, en el que cada tejido canceroso se colocó y agitó a 4 °C durante 2 horas usando un rotor. La solución se reemplazó con una solución de PBS que contenía un 20 % de sacarosa y, nuevamente, la solución resultante se dejó en reposo a 4 °C hasta que el tejido canceroso se precipitó. A continuación, la solución se sustituyó con una solución de PBS que contenía un 30 % de sacarosa y la solución resultante se dejó en reposo a 4 °C hasta que el tejido de cáncer se precipitó. El tejido canceroso se extrajo y las porciones necesarias se escindieron con un escalpelo. A continuación, se aplicó un compuesto OCT (Tissue Teck) y se esparció por toda la superficie. A continuación, el tejido se dispuso en Cryomold. El Cryomold se colocó en hielo seco y el tejido se congeló rápidamente, a continuación se cortó en láminas en 10 a 20 pm usando Cryostat (Leica Biosystems), se colocó en un portaobjetos de vidrio, y se secó al aire, junto con el portaobjetos de vidrio, durante 30 minutos con un secador de pelo, para preparar un portaobjetos de vidrio con una lámina de tejido colocada sobre el mismo. Al día siguiente, el portaobjetos de vidrio se lavó con PBS (-) tres veces. Se aplicó p Bs (-) que contenía suero de cabra al 5 % como solución de bloqueo y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora en una cámara húmeda. A continuación, 10 pg/ml del anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 humana n.° 8 o n.° 14 de ratón preparado en el Ejemplo 2 en una solución de PBS (-), y esta solución se aplicó a los mismos. El portaobjetos de vidrio se dejó reposar durante una noche a 4 °C en una cámara húmeda. Después de lavar con PBS (-) durante 5 minutos cinco veces, se añadió gota a gota una cantidad apropiada de Conjugado de Polímero marcado con Peroxidasa (Dako, una compañía de Agilent Technologies), y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos en una cámara húmeda. Después de lavar con PBS-T durante 5 minutos seis veces, se aplicó una solución de tinción DAB (Dako, una compañía de Agilent Technologies) y el portaobjetos de vidrio se dejó reposar a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos. A continuación, la solución de tinción se desechó y el portaobjetos de vidrio se lavó con PBS (-) durante 5 minutos tres veces. A continuación, el portaobjetos de vidrio se incluyó en medio de montaje Glycergel (Dako, una compañía de Agilent Technologies), seguido de observación. Como resultado de la puntuación como se describe en el Ejemplo 3, los resultados de la tinción inmunohistoquímica con el anticuerpo n. ° 8 mostraron una puntuación de 1 tanto para las células cancerosas derivadas de melanoma B16F10 como para las células derivadas de cáncer de mama EMT-6. Por lo tanto, no se detectó expresión CAPRINA-1. Por otro lado, los resultados de la tinción inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo n.° 14 mostraron una puntuación de 1 para las células cancerosas B16F10, al igual que con el anticuerpo n.° 8, pero exhibió una puntuación de 3 para las células cancerosas EMT-6.

(2) Efecto antitumoral del anticuerpo anti-CAPRINA-1

El anticuerpo anti-CAPRINA-1 humana quimérico de pollo n.° 13 fue estudiado por su efecto antitumoral utilizando ratones con cáncer preparados en el párrafo anterior (1). De 10 ratones portadores cáncer en los que se transplantó cada línea celular de cáncer (B16F10 y EMT-6), 5 ratones con cáncer en cada grupo se sometieron a la administración intraperitoneal del anticuerpo n.° 13 a una dosis de 200 pg (200 pl) por ratón. A continuación, el anticuerpo se administró por vía intraperitoneal a la misma dosis que la anterior a cada ratón portador de cáncer un total de 3 veces durante 2 días para preparar un grupo de estudio. El tamaño del tumor se midió todos los días y se observó el efecto antitumoral del anticuerpo n.° 13. Por otro lado, se administró PBS (-) en lugar del anticuerpo a los 5 ratones con

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar un cáncer, que comprende medir el nivel de expresión de CAPRINA-1 en una muestra biológica a través de la reacción antígeno-anticuerpo usando un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene reactividad inmunológica con un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 63; y

determinar la presencia del cáncer, al que va dirigido el anticuerpo, cuando un nivel de expresión de CAPRINA-1 medido es significativamente más alto que el de un individuo sano,

en donde el cáncer es al menos un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de hígado, cáncer de páncreas y cáncer de próstata.

2. El método para detectar el cáncer de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la CAPRINA-1 que se va a medir es

(a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquier SEQ ID NO con número par que se muestra en las SEQ ID NO: 2 a 30 en el Listado de Secuencias, o

(b) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 85 % o superior con el polipéptido.

3. El método para detectar el cáncer de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que la muestra biológica deriva de un ser humano, un perro o un gato.

4. El método para detectar el cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra biológica deriva de un perro, y la CAPRINA-1 que se va a medir tiene una secuencia de aminoácidos que se muestra en las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 o 14.

5. El método para detectar el cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra biológica deriva de un ser humano, y la CAPRINA-1 que se va a medir tiene una secuencia de aminoácidos que se muestra en las SEQ ID NO: 2 o 4.

6. El método para detectar el cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la medición del nivel de expresión de CAPRINA-1 se lleva a cabo utilizando un método de ensayo inmunológico.

7. El método para detectar el cáncer de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el método de ensayo inmunológico es ELISA y/o un método de tinción inmunohistoquímica.

8. El método para detectar el cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la muestra biológica es un fluido corporal, un tejido o una célula.

9. El método para detectar el cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, es un anticuerpo monoclonal que tiene una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:70, y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:71, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

10. Uso de un fármaco o un kit para el diagnóstico de un cáncer, comprendiendo el fármaco o el kit un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene reactividad inmunológica con un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:63, en donde el uso no constituye un método de diagnóstico practicado en el cuerpo humano o animal y en donde el cáncer es al menos un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de hígado, cáncer de páncreas y cáncer de próstata.

11. Un fármaco para su uso en el diagnóstico de un cáncer por administración al cuerpo, que comprende un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene reactividad inmunológica con un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:63

en donde el cáncer es al menos un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de hígado, cáncer de páncreas y cáncer de próstata.

12. El uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:70 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:71.

13. El fármaco para su uso en el diagnóstico del cáncer según la reivindicación 11, en el que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo son un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tienen una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:70, y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:71.

14. Un método para seleccionar un fármaco terapéutico específico del individuo para un cáncer, que comprende: medir el nivel de expresión de CAPRINA-1 en una muestra biológica utilizando un anticuerpo que tiene reactividad inmunológica con un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:63 o un fragmento de unión a antígeno del mismo; y, cuando el nivel de expresión es, estadísticamente, significativamente más alto que en una muestra de control de un individuo sano, seleccionar un fármaco dirigido a CAPRINA-1 como un fármaco terapéutico adecuado para la administración al individuo del cual deriva la muestra biológica en donde el cáncer es al menos un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de hígado, cáncer de páncreas y cáncer de próstata.

15. El método para seleccionar un fármaco terapéutico específico del individuo para el cáncer de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el fármaco dirigido a CAPRINA-1 es un anticuerpo que tiene reactividad inmunológica con CAPRINA-1, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.